KR102602060B1 - 부산물 생성이 저감된 2,3-부탄다이올 생산용 재조합 미생물 및 이를 이용한 2,3-부탄다이올 생산방법 - Google Patents

부산물 생성이 저감된 2,3-부탄다이올 생산용 재조합 미생물 및 이를 이용한 2,3-부탄다이올 생산방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 2,3-부탄다이올 생합성 경로를 갖는 미생물에 있어서, 글루탐산을 폴리글루탐산으로 전환하는 경로, 슈크로즈를 레반으로 전환하는 경로, 피루브산을 젖산으로 전환하는 경로 및 글리세로포스페이트를 글리세롤로 전환하는 경로로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상이 억제된, 2,3-부탄다이올 생산용 재조합 미생물에 대한 것이다. 또한 본 발명은 상기 2,3-부탄다이올 생산용 재조합 미생물을 이용한 2,3-부탄다이올의 생산 방법에 대한 것이다.

Description

부산물 생성이 저감된 2,3-부탄다이올 생산용 재조합 미생물 및 이를 이용한 2,3-부탄다이올 생산방법{RECOMBINANT MICROORGANISM FOR PRODUCING 2,3-BUTANEDIOL WITH REDUCED BY-PRODUCT PRODUCTION AND METHOD FOR PRODUCING 2,3-BUTANEDIOL USING THE SAME}
본 발명은 부산물 생성이 저감된 2,3-부탄다이올 생산용 재조합 미생물 및 이를 이용한 2,3-부탄다이올 생산방법에 대한 것이다.
네 개의 탄소와 두 개의 하이드록시기(-OH)를 가지는 알코올의 하나(CH3CHOHCHOHCH3)인 2,3-부탄다이올은 합성고무 제조 공정의 원료물질인 1,3-부타디엔(1,3-Butadiene)과 연료 첨가제 및 용매로 사용되는 메틸에틸케톤(Methyl ethyl ketone, MEK)으로 화학적 촉매 전환이 가능하다 (Ji et al., Biotechnol. Adv., 29: 351, 2011). 또한, 2,3-부탄다이올은 가솔린(Gasoline)과 혼합하여 octane booster로 적용할 수 있어 산업적으로 매우 중요한 중간체이다(Celinska et al., Biotechnol. Adv., 27: 715, 2009).
미생물을 통해 생산한 2,3-부탄다이올은 경제성 및 산업용 이용가능성에서 그 가치가 매우 큰 화학물질이다. 화학촉매공정을 통한 생산의 경우 복잡하고 높은 공정비용이 소요되는 반면 생물학적인 발효 및 분리정제 공정을 통해 생산하게 되면 경제적인 생산이 가능할 뿐만 아니라 식품, 의약, 농업제품, 화장품 등 다양한 고부가제품 원료로 적용가능하다는 장점이 있다. 역사적으로, 2,3-부탄다이올은 클렙지엘라 (Klebsiella), 엔테로박터 (Enterobacter), 세라시아 (Serratia), 대장균 (Escherichia coli), 바실러스 (Bacillus) 등 다양한 미생물을 통해 생산가능함이 검증되었다. 이중에서 Bacillus licheniformis는 균주개량을 위한 유전체도구 (genetic toolbox)가 잘 갖춰져 있고, 고온배양 (thermophlic) 특성으로 인하여 발효생산시 오염방지, 냉각비용 감소, 동시당화발효 가능 등의 장점이 있으며, 무엇보다도 GRAS (generally recognized as safe) 특성으로 인하여 산업적 이용가치가 큰 미생물이라고 할 수 있다.
2,3-부탄다이올 생산에 관련된 미생물 개발 연구는 주로 부산물을 감소시키는 방향으로 진행되어 왔다. 대표적으로 Ji 등은 야생형 클렙시엘라 옥시토카 균주에 물리/화학적 돌연변이 방법의 일종인 UV를 노출시켜 부산물인 유기산들의 생성을 일부 억제시키는 것에 성공하였다(Ji et al., Biotechnol. Lett., 30: 731, 2008). 그 외, 이온 주사(Ion beam) 방식을 클렙시엘라 뉴모니에 균주에 적용하여 바이오매스의 소모 속도를 증가시킴으로써 2,3-부탄다이올 생산을 향상시키는 시도도 있다(Ma et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 82: 49, 2009). 또한, 야생형 클렙지엘라 미생물의 주요 부산물 생성 대사경로인 ldh 와 pflB 경로를 대사공학적으로 억제시킴으로써, 2,3-부탄다이올 생성능을 증대시킨 연구결과도 있다.
반면, 바실러스 리케니포미스 (Bacillus licheniformis)의 경우 야생형 바실러스 리케니포미스는 점액성을 띄는 경향이 강하며, 주요대사화학물질 또한 클렙시엘라 미생물 군과 다른 특성을 보이므로, 미생물 개발 전략에 있어서도 다른 접근 방법이 필요하다고 할 수 있다.
그러므로 본 발명자들은 부산물 생성이 억제된 재조합 바실러스 리케니포미스를 연구하였다.
본 발명의 목적은 부산물 생성이 억제된 2,3-부탄다이올 생산용 재조합 미생물, 바람직하게는 재조합 바실러스 리케니포미스를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은,
2,3-부탄다이올 생합성 경로를 갖는 미생물에 있어서,
폴리글루탐산 생합성 경로, 레반 생합성 경로, 젖산 생합성 경로 및 글리세롤 생합성 경로로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상이 억제된,
2,3-부탄다이올 생산용 재조합 미생물을 제공한다.
또한 본 발명은,
2,3-부탄다이올 생합성 경로를 갖는 미생물에 있어서,
글루탐산을 폴리글루탐산으로 전환하는 경로, 슈크로즈를 레반으로 전환하는 경로, 피루브산을 젖산으로 전환하는 경로 및 글리세로포스페이트를 글리세롤로 전환하는 경로로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상이 억제된,
2,3-부탄다이올 생산용 재조합 미생물을 제공한다.
또한 본 발명은,
본 발명의 2,3-부탄다이올 생산용 재조합 미생물을 배양하는 단계;및
상기 배양물로부터 2,3-부탄다이올을 회수하는 단계를 포함하는,
2,3-부탄다이올의 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 재조합 미생물은 부산물 생성이 억제되어 2,3-부탄다이올 생산에 적합하다.
도 1은 본 발명의 재조합 미생물에서 2,3-부탄다이올의 생합성 경로 및 재조합 미생물 제작 전략을 나타낸다.
도 2는 야생형 및 점액성 고분자제거 미생물을 균체 형상을 나타낸다.
도 3은 포도당 포함 배지 및 원당 포함 배지에서 각각 배양하였을 때, 비교예 1의 야생형 미생물, 제조예 1 및 2의 재조합 미생물의 세포외고분자 생성량을 나타낸다
도 4는 포도당 포함 배지 및 원당 포함 배지에서 각각 배양하였을 때, 비교예 1의 야생형 미생물, 제조예 1 및 2의 재조합 미생물의 2,3-부탄다이올 생성량 및 수율을 나타낸다
도 5는 비교예 1의 야생형 미생물, 제조예 1 및 2의 재조합 미생물의 배양 시 배양물 내 폴리글루탐산 및 레반 NMR 분석 결과이다
도 6은 제조예 2 내지 4의 재조합 미생물의 젖산 및 글리세롤 생성량 분석결과이다
도 7은 제조예 2 내지 4의 재조합 미생물의 2,3-부탄다이올 생성량 및 수율 분석 결과이다.
도 8은 포도당 배지에서 발효하였을 때, 제조예 4의 재조합 미생물의 2,3-부탄다이올 및 주요 부산물 생성량 분석 결과 이다.
도 9는 원당 배지에서 발효하였을 때, 제조예 4의 재조합 미생물의 2,3-부탄다이올 및 주요 부산물 생성량 분석 결과 이다.
본 발명은,
2,3-부탄다이올 생합성 경로를 갖는 미생물에 있어서,
폴리글루탐산 생합성 경로, 레반 생합성 경로, 젖산 생합성 경로 및 글리세롤 생합성 경로로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상이 억제된,
2,3-부탄다이올 생산용 재조합 미생물에 대한 것이다.
본 발명은
2,3-부탄다이올 생합성 경로를 갖는 미생물에 있어서,
글루탐산을 폴리글루탐산으로 전환하는 경로, 슈크로즈를 레반으로 전환하는 경로, 피루브산을 젖산으로 전환하는 경로 및 글리세로포스페이트를 글리세롤로 전환하는 경로로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상이 억제된,
2,3-부탄다이올 생산용 재조합 미생물에 대한 것이다.
또한 본 발명은
본 발명의 2,3-부탄다이올 생산용 재조합 미생물을 배양하는 단계;및
상기 배양물로부터 2,3-부탄다이올을 회수하는 단계를 포함하는,
2,3-부탄다이올의 생산 방법에 대한 것이다.
이하, 본 발명을 자세히 설명한다.
2,3-부탄다이올 생합성 경로를 갖는 미생물
본 발명의 미생물은 2,3-부탄다이올 생합성 경로를 갖는다. 상기 2,3-부탄다이올 생합성 경로는 미생물 내 특정 대사산물로부터 2,3-부탄다이올이 합성되는 경로를 의미한다. 본 발명의 2,3-부탄다이올 생합성 경로는 피루베이트, 알파-아세토락테이트 및/또는 아세토인으로부터 직접적 또는 간접적으로 2,3-부탄다이올이 합성되는 경로 등이 될 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 미생물은 아세토인으로부터 2,3-부탄다이올이 합성되는 경로를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 미생물은 2,3-부탄다이올 생합성 경로를 야생형으로 갖고 있는 미생물 또는 유전자 재조합에 의하여 갖게 되는 재조합 미생물일 수 있다. 바람직하게는 상기 미생물은 2,3-부탄다이올 생성능을 갖는 미생물이다. 상기 미생물은 클렙시엘라(Klebsiella) 속, 바실러스(Bacillus) 속, 세라티아(Serratia) 속 또는 엔테로벡터 (Enterobacter) 속의 미생물일 수 있으며, 바람직하게는 바실러스 리케니포미스(B. licheniformis), 바실러스 서브틸리스(B. subtilis), 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 (B. amyloliquefaciens), 패니바실러스 폴리믹사 (P. polymyxa) 등이 될 수 있고, 가장 바람직하게는 바실러스 리케니포미스(B. licheniformis)일 수 있다. 이때 바실러스 리케니포미스를 이용하는 것이 2,3 부탄다이올의 산업적 규모의 생산에 유리하다.
폴리글루탐산 생합성 경로
본 발명의 재조합 미생물은 폴리글루탐산 생합성 경로가 억제될 수 있다. 본 발명의 폴리글루탐산 생합성 경로는 미생물 내 특정 대사산물로부터 폴리글루탐산이 합성되는 경로를 의미한다. 폴리글루탐산 생합성 경로는 글루탐산(glutamate)으로부터 폴리글루탐산(polyglutamate)이 합성되는 경로, 즉 글루탐산을 폴리글루탐산으로 전환하는 경로일 수 있다. 상기 글루탐산으로부터 폴리글루탐산이 합성되는 경로는 폴리글루타메이트 신타아제에 의하여 글루탐산으로부터 폴리글루탐산이 합성되는 경로일 수 있다.
폴리글루타메이트 신타아제(polyglutamate synthase)는 글루탐산의 폴리글루탐산으로의 전환을 조절한다. 상기 폴리글루타메이트 신타아제를 억제함으로써 글루탐산을 폴리글루탐산으로 전환하는 경로가 억제될 수 있다. 상기 폴리글루타메이트 신타아제의 억제는 폴리글루타메이트 신타아제의 발현억제, 폴리글루타메이트 신타아제의 효소활성 억제 등에 의하여 이루어질 수 있다. 예컨대, 폴리글루타메이트 신타아제를 코드하는 유전자인 pgsBCAE를 결실시키거나 상기 유전자에 돌연변이(일부 염기를 변이, 치환 또는 삭제하거나 일부 염기를 도입하여 정상적인 유전자의 발현을 억제시키는 등의 돌연변이)를 일으키거나, 전사 과정 또는 번역 과정에서의 유전자 발현 조절 등, 당업자는 적절한 방법을 선택하여 폴리글루타메이트 신타아제를 억제할 수 있다. 상기 pgsBCAE 유전자는 서열번호 1과 80% 이상의 상동성을 갖는 염기서열일 수 있고, 바람직하게는 85% 이상의 상동성을 갖는 염기서열일 수 있고, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 갖는 염기서열일 수 있고, 더더욱 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 염기서열일 수 있고, 가장 바람직하게는 100%의 상동성을 갖는 염기서열일 수 있다.
레반 생합성 경로
본 발명의 재조합 미생물은 레반 생합성 경로가 억제될 수 있다. 본 발명의 레반 생합성 경로는 미생물 내 특정 대사산물로부터 레반이 합성되는 경로를 의미한다. 레반 생합성 경로는 슈크로즈(sucrose)로부터 레반(levan)이 합성되는 경로, 즉 슈크로즈를 레반으로 전환하는 경로일 수 있다. 상기 슈크로즈로부터 레반이 합성되는 경로는 레반 슈크라아제에 의하여 슈크로즈로부터 레반이 합성되는 경로일 수 있다.
레반 슈크라아제(levansucrase)는 슈크로즈의 레반으로의 전환을 조절한다. 상기 레반 슈크라아제를 억제함으로써 슈크로즈를 레반으로 전환하는 경로가 억제될 수 있다. 상기 레반 슈크라아제의 억제는 레반 슈크라아제의 발현억제, 레반 슈크라아제의 효소활성 억제 등에 의하여 이루어질 수 있다. 예컨대, 레반 슈크라아제를 코드하는 유전자인 sacB를 결실시키거나 상기 유전자에 돌연변이(일부 염기를 변이, 치환 또는 삭제하거나 일부 염기를 도입하여 정상적인 유전자의 발현을 억제시키는 등의 돌연변이)를 일으키거나, 전사 과정 또는 번역 과정에서의 유전자 발현 조절 등, 당업자는 적절한 방법을 선택하여 폴리글루타메이트 신타아제를 억제할 수 있다. 상기 sacB 유전자는 서열번호 9와 80% 이상의 상동성을 갖는 염기서열일 수 있고, 바람직하게는 85% 이상의 상동성을 갖는 염기서열일 수 있고, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 갖는 염기서열일 수 있고, 더더욱 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 염기서열일 수 있고, 가장 바람직하게는 100%의 상동성을 갖는 염기서열일 수 있다.
젖산 생합성 경로
본 발명의 재조합 미생물은 젖산 생합성 경로가 억제될 수 있다. 본 발명의 젖산(lactate) 생합성 경로는 미생물 내 특정 대사산물로부터 젖산이 합성되는 경로를 의미한다. 젖산 생합성 경로는 피루브산(pyruvate)으로부터 젖산(lactate)이 합성되는 경로, 즉 피루브산을 젖산으로 전환하는 경로일 수 있다. 상기 피루브산으로부터 젖산이 합성되는 경로는 락테이트 디하이드로게나제에 의하여 피루브산으로부터 젖산이 합성되는 경로일 수 있다.
락테이트 디하이드로게나제(lactate dehydrogenase)는 피루브산의 젖산으로의 전환을 조절한다. 상기 락테이트 디하이드로게나제를 억제함으로써 피루베이트를 락테이트로 전환하는 경로가 억제될 수 있다. 상기 락테이트 디하이드로게나제의 억제는 락테이트 디하이드로게나제의 발현 억제, 락테이트 디하이드로게나제의 효소 활성 억제 등에 의하여 이루어질 수 있다. 예컨대, 락테이트 디하이드로게나제를 코드하는 유전자인 ldh를 결실시키거나 상기 유전자에 돌연변이(일부 염기를 변이, 치환 또는 삭제하거나 일부 염기를 도입하여 정상적인 유전자의 발현을 억제시키는 등의 돌연변이)를 일으키거나, 전사 과정 또는 번역 과정에서의 유전자 발현 조절 등, 당업자는 적절한 방법을 선택하여 락테이트 디하이드로게나제를 억제할 수 있다. 상기 ldh 유전자는 서열번호 17과 80% 이상의 상동성을 갖는 염기서열일 수 있고, 바람직하게는 85% 이상의 상동성을 갖는 염기서열일 수 있고, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 갖는 염기서열일 수 있고, 더더욱 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 염기서열일 수 있고, 가장 바람직하게는 100%의 상동성을 갖는 염기서열일 수 있다.
글리세롤 생합성 경로
본 발명의 재조합 미생물은 글리세롤 생합성 경로가 억제될 수 있다. 본 발명의 글리세롤(glycerol) 생합성 경로는 미생물 내 특정 대사산물로부터 글리세롤이 합성되는 경로를 의미한다. 글리세롤 생합성 경로는 글리세로포스페이트(glycerophosphate)로부터 글리세롤(glycerol)을 합성하는 경로, 즉 글리세로포스페이트를 글리세롤로 전환하는 경로일 수 있다. 상기 글리세로포스페이트를 글리세롤로 전환하는 경로는 글리세로포스파타아제에 의하여 글리세로포스페이트의 글리세롤로의 전환이 조절되는 경로일 수 있다.
글리세로포스파타아제(glycerophosphatase)는 글리세로포스페이트의 글리세롤로의 전환을 조절한다. 상기 글리세로포스파타아제를 억제함으로써 글리세로포스페이트를 글리세롤로 전환하는 경로가 억제될 수 있다. 상기 글리세로포스파타아제의 억제는 글리세로포스파타아제의 발현 억제, 글리세로포스파타아제의 효소 활성 억제 등에 의하여 이루어질 수 있다. 예컨대, 글리세로포스파타아제를 코드하는 유전자인 dgp를 결실시키거나 상기 유전자에 돌연변이(일부 염기를 변이, 치환 또는 삭제하거나 일부 염기를 도입하여 정상적인 유전자의 발현을 억제시키는 등의 돌연변이)를 일으키거나, 전사 과정 또는 번역 과정에서의 유전자 발현 조절 등, 당업자는 적절한 방법을 선택하여 글리세로포스파타아제를 억제할 수 있다. 상기 dgp 유전자는 서열번호 25와 80% 이상의 상동성을 갖는 염기서열일 수 있고, 바람직하게는 85% 이상의 상동성을 갖는 염기서열일 수 있고, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 갖는 염기서열일 수 있고, 더더욱 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 염기서열일 수 있고, 가장 바람직하게는 100%의 상동성을 갖는 염기서열일 수 있다.
2,3-부탄다이올 생산용 재조합 미생물
본 발명의 2,3-부탄다이올 생산용 재조합 미생물은 글루탐산을 폴리글루탐산으로 전환하는 경로는 억제되고, 슈크로즈를 레반으로 전환하는 경로, 피루브산을 젖산으로 전환하는 경로 및 글리세로포스페이트를 글리세롤로 전환하는 경로는 억제되지 않은 것을 특징으로 하는 2,3-부탄다이올 생산용 재조합 미생물일 수 있다.
본 발명의 2,3-부탄다이올 생산용 재조합 미생물은 글루탐산을 폴리글루탐산으로 전환하는 경로 및 슈크로즈를 레반으로 전환하는 경로는 억제되고 피루브산을 젖산으로 전환하는 경로 및 글리세로포스페이트를 글리세롤로 전환하는 경로는 억제되지 않은 것을 특징으로 하는 2,3-부탄다이올 생산용 재조합 미생물일 수 있다.
본 발명의 2,3-부탄다이올 생산용 재조합 미생물은 글루탐산을 폴리글루탐산으로 전환하는 경로, 슈크로즈를 레반으로 전환하는 경로 및 피루브산을 젖산으로 전환하는 경로는 억제되고 글리세로포스페이트를 글리세롤로 전환하는 경로는 억제되지 않은 것을 특징으로 하는 2,3-부탄다이올 생산용 재조합 미생물일 수 있다.
본 발명의 2,3-부탄다이올 생산용 재조합 미생물은 2,3-부탄다이올 생산용 재조합 미생물은 글루탐산을 폴리글루탐산으로 전환하는 경로, 슈크로즈를 레반으로 전환하는 경로, 피루브산을 젖산으로 전환하는 경로 및 글리세로포스페이트를 글리세롤로 전환하는 경로가 억제된 것을 특징으로 하는 2,3-부탄다이올 생산용 재조합 미생물일 수 있다.
본 발명의 2,3-부탄다이올 생산용 재조합 미생물은 2,3-부탄다이올의 생산성(단위 시간, 단위 부피 당 생산되는 2,3-부탄다이올의 양), 생산능(단위 부피 당 생산되는 2,3-부탄다이올의 양, 즉 발효액 내 2,3-부탄다이올의 농도), 수율(탄소원 양에 대비한 2,3-부탄다이올의 생산량)이 높을 수 있고, 특히, 상기 재조합 미생물은 발효 시 야생형 미생물에 비하여 발효액 내 2,3-부탄다이올의 농도가 높을 수 있다.
본 발명의 상기 재조합 미생물을 배양 시 야생형 미생물에 비하여 점액성 고분자, 젖산 또는 글리세롤의 생산량이 적을 수 있다.
본 발명의 재조합 미생물에서 2,3-부탄다이올의 생합성 경로 및 재조합 미생물 제작 전략은 도 1에 나타나 있다.
2,3-부탄다이올 생산용 재조합 미생물을 배양하는 단계
본 발명의 2,3-부탄다이올 생산 방법은 본 발명의 2,3-부탄다이올 생산용 재조합 미생물을 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 배양은 호기 조건에서 수행되며, 바람직하게는 미세호기적 조건(microaerobic condition)에서 수행될 수 있다. 예컨대, 상기 배양은 배양 시 산소, 즉 공기를 공급하면서 수행되며, 구체적인 예로서, 이는 교반을 통하여 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 재조합 미생물은 복합 배지에서 배양될 수 있으며, 복합 배지의 종류는 특별히 제한되지 않고 당업자는 일반적으로 시판, 사용되는 복합 배지를 적절히 선택하여 사용할 수 있다는 것은 자명하다.
상기 배양물로부터 2,3-부탄다이올을 회수하는 단계
본 발명의 2,3-부탄다이올 생산 방법은 상기 배양물로부터 2,3-부탄다이올을 회수하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 회수 단계는 특별히 제한되지 않으며 미생물을 이용하여 배양물로부터 특정 산물을 회수하는 통상의 방법에 의하여 수행되면 된다.
2,3-부탄다이올의 생산 방법
본 발명은 본 발명의 2,3-부탄다이올 생산용 재조합 미생물을 이용하여 2,3-부탄다이올을 생산하는 방법을 포함한다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나, 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
<재료 및 방법>
대전 인근 토양 샘플로부터 분리한 야생형 균주인 바실러스 리케니포미스 GSC4071 (KCTC 14485BP) 을 준비하였다. 하기 실험예들에서 점액성 고분자(Viscous polymer)는 배양 후 세포를 제거하고, 에탄올침전에 의해서 얻어지는 고형물을 총칭하며, 구체적으로는 폴리글루탐산 및 레반을 포함하며 그 외 다른 점액성 고분자들도 포함하는 여러 종류의 점액성 고분자의 총칭이다.
2,3-부탄다이올의 농도(g/L), 수율(g/g) 및 생산성(g/L/h)은 하기와 같이 계산하였다.
-2,3-부탄다이올 농도(g/L): 단위 부피당 생산되는 2,3-부탄다이올의 양
-2,3-부탄다이올 수율(g/g): (2,3-부탄다이올 생산량(g)/탄소원(g)) × 100
-2,3-부탄다이올 생산성(g/L/h): 단위 시간(hour), 단위 부피(L)당 생산되는 2,3-부탄다이올의 양(g)
<실험예 1>
바실러스 리케니포미스 GSC4071를 이용하여 재조합 균주들을 제조하였다.
<1-1> pgsBCAE, sacB, ldh, dgp가 결실된 재조합 B. 리케니포미스의 제조
표적 유전자의 상동 부위를 포함하는 DNA 단편 제작
바실러스 리케니포미스의 표적 유전자를 불활성화 시키기 위하여 박테리아의 재조합 기작을 이용하였고, 제거하고자 하는 유전자의 상동 부위 (homologous region)를 PCR로 증폭하였다. 그 후 상동 부위를 포함하는 해당 DNA 단편을 박테리아에 전달한 후, DNA 단편에 있는 유전자의 상동 부위와 바실러스 리케니포니스의 염색체에 있는 유전자 사이에 재조합 효소 (recombinase)에 의한 재조합 기작으로 표적 유전자를 제거하게 된다.
먼저, 바실러스 리케니포미스의 폴리글루타메이트 신타아제를 클로닝하기 위해 표적 유전자인 pgsBCAE (서열번호 1)의 상동 부위 1(서열번호 2)을 서열번호 3 및 4의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 또한 상동 부위 2(서열번호 5)를 서열번호 6 및 7의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 그 후, 상동 부위 1과 2를 동시에 주형으로 하여 PCR로 증폭하여 상동 부위 1과 2가 포함된 DNA 단편(서열번호 8)을 완성하였다.
한편, 바실러스 리케니포미스의 레반 슈크라아제의 상동 부위를 클로닝하기 위하여 표적 유전자인 sacB(서열번호 9)의 상동 부위 1(서열번호 10)을 서열번호 11 및 12의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 또한, 상동 부위 2(서열번호 13)를 서열번호 14 및 15의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 그 후, 상동 부위 1과 2를 동시에 주형으로 하여 PCR로 증폭하여 상동 부위 1과 2가 포함된 DNA 단편(서열번호 16)을 완성하였다.
한편, 바실러스 리케니포미스의 락테이트 디하이드로제나아제의 상동 부위를 클로닝하기 위하여 표적 유전자인 ldh(서열번호 17)의 상동 부위 1(서열번호 18)을 서열번호 19 및 20의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 또한, 상동 부위 2(서열번호 21)를 서열번호 22 및 23의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 그 후, 상동 부위 1과 2를 동시에 주형으로 하여 PCR로 증폭하여 상동 부위 1과 2가 포함된 DNA 단편(서열번호 24)을 완성하였다.
한편, 바실러스 리케니포미스의 글리세로포스파타아제의 상동 부위를 클로닝하기 위하여 표적 유전자인 dgp(서열번호 25)의 상동 부위 1(서열번호 26)을 서열번호 27 및 28의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 또한, 상동 부위 2(서열번호 29)를 서열번호 30 및 31의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 그 후, 상동 부위 1과 2를 동시에 주형으로 하여 PCR로 증폭하여 상동 부위 1과 2가 포함된 DNA 단편(서열번호 32)을 완성하였다(표 1).
<1-2> pgsBCAE, sacB, ldh, dgp가 결실된 재조합 B. 리케니포미스의 제조
상기 제작된 DNA 단편들을 전기 천공법 (electroporation, 25 uF, 200 Ω, 2.5 kV/cm)을 이용하여 바실러스 리케니포미스 GSC4071에 전달하였으며, 미생물의 재조합 기작을 이용하여 표적 유전자를 제거할 수 있었다.
바실러스 리케니포미스 GSC4071 (야생형)에 pgsBCAE 유전자의 상동 부위를 포함하는 DNA 단편(서열번호 8)을 전달하여 pgsBCAE 유전자를 제거한 재조합 바실러스 리케니포미스를 제조하였다. 이렇게 제조된 pgsBCAE가 결실된 재조합 미생물을 제조예 1의 균주 (B. licheniformis 4071 ΔpgsBCAE) 로 사용하였다.
한편, 전술한 바와 같이, 바실러스 리케니포미스 GSC4071 (야생형)에서 pgsBCAE 유전자를 제거한 후, sacB 유전자의 상동 부위를 포함하는 DNA 단편(서열번호 16)을 전달하여 pgsBCAE 유전자에 추가로 sacB 유전자가 제거된 바실러스 리케니포미스를 제조하였다. 이렇게 제조된 pgsBCAE, sacB가 결실된 재조합 미생물을 제조예 2의 균주 (B. licheniformis 4071 ΔpgsBCAE ΔsacB) 로 사용하였으며, 그 균체 형상은 도 2의 아래 패널에 나타나 있다.
한편, 전술한 바와 같이, 바실러스 리케니포미스 GSC4071 (야생형)에서 pgsBCAE, sacB 유전자를 제거한 후, ldh 유전자의 상동 부위를 포함하는 DNA 단편(서열번호 24)을 전달하여 pgsBCAE, sacB 유전자에 추가로 ldh 유전자가 제거된 바실러스 리케니포미스를 제조하였다. 이렇게 제조된 pgsBCAE, sacB, ldh가 결실된 재조합 미생물을 제조예 3의 균주 (B. licheniformis 4071 ΔpgsBCAE ΔsacB Δldh) 로 사용하였다.
한편, 전술한 바와 같이, 바실러스 리케니포미스 GSC4071 (야생형)에서 pgsBCAE, sacB, ldh 유전자를 제거한 후, dgp 유전자의 상동 부위를 포함하는 DNA 단편(서열번호 32)을 전달하여 pgsBCAE, sacB, ldh 유전자에 추가로 dgp 유전자가 제거된 바실러스 리케니포미스를 제조하였다. 이렇게 제조된 pgsBCAE, sacB, ldh, dgp가 결실된 재조합 미생물을 제조예 4의 균주 (B. licheniformis 4071 ΔpgsBCAE ΔsacB Δldh Δdgp) 로 사용하였다.
하기 실험예들에서는 이렇게 제조된 재조합 미생물을 이용하여 이렇게 제조된 재조합 미생물을 이용하여 하기 배양 및 분석 실험을 수행하였다. 이때, 야생형 균주인 바실러스 리케니포미스 GSC4071는 비교예 1로 사용하였으며, 그 균체 형상은 도 2의 윗 패널에 나타나 있다.
<실험예 2> 제조예 1 및 2의 재조합 미생물의 2,3-부탄다이올 생산능
비교예 1의 바실러스 리케니포미스 GSC4071, 제조예 1 및 2의 재조합 바실러스 리케니포미스에 대하여 2,3-부탄다이올의 생산능 및 부산물 저감능을 평가하였다.
먼저 상기 미생물들에 대하여 하기와 같이 플라스크 배양을 수행하였다. 상기 미생물들을 50 g/L 포도당 (glucose) 또는 동일한 농도의 원당 (sucrose)를 포함한 50 ml의 복합배지를 포함하는 250 ml의 플라스크에 접종하여 45 ℃에서 16 시간 동안 180 rpm 조건에서 배양하였다. 배양 조건은 미세호기조건이 유지될 수 있도록 하였고, 초기 pH 7.0으로 진행하였다. 상기 야생형 및 재조합 바실러스에 대해 배양 종료 후 샘플을 채취하였으며, 채취된 시료는 13,000 rpm에서 10 분 동안 원심분리한 후, 상층액의 2,3-부탄다이올 농도를 액체크로마토그래피(HPLC)로 분석하였다. 상층액의 점액성 고분자 농도는 하기와 같이 측정하였다. 먼저 상층액을 에탄올 1:2 비율로 혼합한 후 24시간 동안 에탄올침전 (ethanol precipitation) 시키고, 원심분리하여 고분자를 회수하였다. 회수된 고분자는 투석 (membrane dialysis, 10kDa)를 통해 저분자를 제거하였으며, 마지막으로 동결건조 (freeze drying)을 통해 건조중량을 측정하였다. 건조된 점액성 고분자 중 폴리글루탐산과 레반을 특정하기 위하여 NMR 분석을 통해 동정하였다.
그 결과, 포도당에서 배양시 비교예 1의 야생형 바실러스의 2,3-부탄다이올 생산량은 16.7 g/L 였으며, 수율은 0.37 g/g, 점액성 고분자 생성량은 3.5 g/L 였다. 제조예 1의 재조합 미생물의 경우, 2,3-부탄다이올 생산량은 18.9 g/L, 수율은 0.39 g/g, 점액성 고분자 생성량은 1.7 g/L 이었다.
원당에서 배양시 비교예 1의 야생형 바실러스의 2,3-부탄다이올 생성량은 13.8 g/L, 수율은 0.26 g/g, 점액성 고분자 생성량은 14.8 g/L 이었다. 제조예 1의 재조합 미생물의 경우, 2,3-부탄다이올 생산량은 15.6 g/L, 수율은 0.29 g/g, 점액성 고분자는 8.5 g/L 이었다. 제조예 2의 재조합 미생물의 경우, 2,3-부탄다이올 생산량은 14.6 g/L, 수율은 0.38 g/g, 점액성 고분자는 1.8 g/L 이었다.
포도당 배지에서는 pgsBCAE 유전자 제거를 통해 제조예 1의 재조합 미생물의 경우 점액성 고분자가 51% 감소하고, 2,3-부탄다이올 생산량과 수율이 각각 13%, 5% 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 제조예 2의 재조합 미생물의 경우, 원당배지에서만 영향이 나타나는 것을 예측할 수 있으나, 포도당배지에서도 점액성 고분자 생성량이 제조예 1의 재조합 미생물에 대비하여 35% 감소하는 것으로 확인되었다. 이는 Biofilm을 구성하는 다양한 점액성 고분자의 생성이 서로 유기적으로 연관되어 있을 수 있으며, 포도당 이외에 첨가되는 다른 배지성분에 의한 영향일 수 있다.
원당배지에서는 제조예 1의 재조합 미생물의 경우 점액성 고분자가 43% 감소하고, 2,3-부탄다이올 생산량과 수율이 각각 13%, 12% 증가하였다. 또한, 추가적으로 sacB 유전자 제거를 통해 제조예 2의 재조합 미생물의 경우 야생형 바실러스인 비교예 1에 대비하여 점액성 고분자가 88% 감소하였고, 2,3-부탄다이올 생산량과 수율이 각각 6%, 46% 증가하였다. 전체적으로 점액성고분자 생성관련 유전자인 pgsBCAE와 sacB를 순차적으로 제거함에 따라 제조예 1 및 2의 재조합 균주에서 점액성 고분자 생성량이 점진적으로 감소하였으며, 2,3-부탄다이올 수율은 포도당과 원당 배지에서 모두 개선되었다. pgsBCAE 가 제거된 제조예 1의 재조합 미생물에서는 폴리글루탐산 생성이 억제되는 것을 확인할 수 있으며, sacB가 추가로 제거된 제조예 2의 재조합 미생물에서는 레반 생성이 억제되는 것을 NMR 분석을 통해 확인하였다 (표 2 및 표 3, 도 3, 도 4 및 도 5).
<실험예 3> 제조예 2 내지 4의 재조합 미생물의 2,3-부탄다이올 생산능
제조예 2 내지 4의 재조합 미생물들에 대하여 2,3-부탄다이올의 생산능 및 부산물 저감을 평가하였다.
비교예 1의 야생형 바실러스 리케니포미스, 제조예 2 내지 4의 재조합 바실러스 리케니포미스들에 대하여 하기와 같이 플라스크 배양을 수행하였다. 먼저, 상기 미생물들을 50 g/L 포도당 (glucose)를 포함한 50 ml의 복합배지를 포함하는 250 ml의 플라스크에 접종하여 45℃에서 16 시간 동안 180 rpm 조건에서 배양하였다. 배양 조건은 미세호기조건 이 유지될 수 있도록 하였고, 초기 pH 7.0으로 진행하였다. 상기 야생형 및 재조합 바실러스 미생물들에 대해 배양 종료 후 샘플을 채취하였으며, 채취된 시료는 13,000 rpm에서 10 분 동안 원심분리한 후, 상층액의 2,3-부탄다이올, 젖산, 글리세롤 농도를 액체크로마토그래피(HPLC)로 분석하였다.
그 결과, 비교예 1의 재조합 비생물의 경우 2,3-부탄다이올 생산량은 16.7 g/L 였으며, 수율은 0.37 g/g, 젖산 생산량은 5.25 g/L, 글리세롤 생산량은 4.97 g/L 였다. 제조예 2의 재조합 미생물의 2,3-부탄다이올 생산량은 19.0 g/L 였으며, 수율은 0.39 g/g, 젖산 생산량은 5.13 g/L, 글리세롤 생산량은 3.47 g/L 이었다. 폴리글루탐산 및 레반의 제거를 통한 젖산 및 글리세롤 생산량의 유의미한 감소는 관찰되지 않았다. 제조예 3의 재조합 미생물의 경우, 2,3-부탄다이올 생산량은 20.14 g/L, 수율은 0.39 g/g, 젖산 생산량은 0.832 g/L, 글리세롤 생산량은 8.45 g/L 이었다. 제조예 4의 재조합 미생물의 경우, 2,3-부탄다이올 생산량은 20.42 g/L, 수율은 0.45 g/g, 젖산 생산량은 1.25 g/L, 글리세롤 생산량은 0.04 g/L 이었다. 제조예 3의 재조합 미생물은 제조예 2의 재조합 미생물에 대비하여 2,3-부탄다이올 생산량이 증가하였고 젖산 생산량은 84% 감소하였으나, 글리세롤 생산량은 144% 증가함으로써 2,3-부탄다이올 수율 개선에는 효과가 미미하였다. 제조예 4의 재조합 미생물은 제조예 2의 재조합 미생물에 대비하여 수율이 약 13% 증가하였으며, 젖산생산량이 75% 감소하였으며, 글리세롤이 거의 생산되지 않았다. 이를 통해 ldh 및 dgp 유전자 각각을 제거함으로써 젖산과 글리세롤 생산량이 크게 감소하는 것을 확인할 수 있으며, 두 유전자가 모두 결실되었을 때 2,3-부탄다이올 생산량뿐만 아니라, 수율도 크게 개선되는 것이 확인되었다. (표 4, 도 6 및 도 7).
<실험예 4>
제조예 4의 재조합 미생물을 이용하여 포도당 및 원당 배지조건에서 유가식 발효 성능을 평가하였다.
미생물의 발효실험은 하기와 같이 수행하였다. 먼저, 상기 미생물을 300 ml의 복합배지를 포함하는 1L의 플라스크에 접종하여 45 ℃에서 16 시간 동안 180 rpm 조건에서 배양하였다. 배양한 미생물은 최종배양액의 부피가 3 L가 되도록 7.5 L 용량의 발효기에 접종하였다. 초기 조건으로 pH 7.0, 온도 45 ℃, 550 rpm, 산소 1 vvm 조건으로 진행하였다. 초기 포도당 또는 원당의 농도는 100 g/L 로 진행하였다. 배양 진행 중 아세토인 (acetoin) 양이 10g/L 이상이 되면 교반 속도를 350 rpm으로 낮추는 2단계 발효를 진행하였으며, 배양액 내 당의 농도가 20 g/L 이하로 내려갈 시 150 g의 포도당 또는 원당 파우더를 추가 피딩 (feeding)하여 진행하였다. 상기 재조합 바실러스에 대해 배양 종료 후 샘플을 채취하였으며, 세포 생장은 spectrophotometer를 통해 OD600 값으로 측정하였고, 채취된 시료는 13,000 rpm에서 10 분 동안 원심분리한 후, 상층액의 포도당, 원당, 2,3-부탄다이올, 유기대사물질 농도를 액체크로마토그래피(HPLC)로 분석하였다.
그 결과, 포도당에서 유가식 발효를 진행하였을 때, 2,3-부탄다이올 생산량은 119.6 g/L, 수율은 0.42 g/g, 생산성은 1.87 g/L/h 이었다. 비슷하게, 원당에서 유가식 발효를 진행하였을 때, 2,3-부타다이올 생산량은 120.1 g/L, 수율은 0.42 g/g, 생산성은 2.14 g/L/h 이었다. 점액성 고분자 및 유기대사물질은 2,3-부탄다이올 발효에 영향을 미치지 않는 미량 수준으로만 생성되었다. 유가식 발효를 통해 재조합 미생물은 포도당과 원당배지 모두에서 산업적 수준의 고농도 2,3-부탄다이올 생산이 가능함을 확인 할 수 있었다 (표 5, 도 8 및 도 9).
<서열목록 프리텍스트>
서열번호 1: pgsBCAE의 염기서열이다.
서열번호 2: pgsBCAE의 상동 부위 1의 염기서열이다.
서열번호 3: pgsBCAE의 상동 부위 1을 PCR로 증폭하기 위한 프라이머의 염기서열이다.
서열번호 4: pgsBCAE의 상동 부위 1을 PCR로 증폭하기 위한 프라이머의 염기서열이다.
서열번호 5: pgsBCAE의 상동 부위 2의 염기서열이다.
서열번호 6: pgsBCAE의 상동 부위 2를 PCR로 증폭하기 위한 프라이머의 염기서열이다.
서열번호 7: pgsBCAE의 상동 부위 2를 PCR로 증폭하기 위한 프라이머의 염기서열이다.
서열번호 8: pgsBCAE의 상동 부위 1 및 2가 포함된 DNA 단편의 염기서열이다.
서열번호 9: sacB의 염기서열이다.
서열번호 10: sacB의 상동 부위 1의 염기서열이다.
서열번호 11: sacB의 상동 부위 1을 PCR로 증폭하기 위한 프라이머의 염기서열이다.
서열번호 12: sacB의 상동 부위 1을 PCR로 증폭하기 위한 프라이머의 염기서열이다.
서열번호 13: sacB의 상동 부위 2의 염기서열이다.
서열번호 14: sacB의 상동 부위 2를 PCR로 증폭하기 위한 프라이머의 염기서열이다.
서열번호 15: sacB의 상동 부위 2를 PCR로 증폭하기 위한 프라이머의 염기서열이다.
서열번호 16: sacB의 상동 부위 1 및 2가 포함된 DNA 단편의 염기서열이다.
서열번호 17: ldh의 염기서열이다.
서열번호 18: ldh의 상동 부위 1의 염기서열이다.
서열번호 19: ldh의 상동 부위 1을 PCR로 증폭하기 위한 프라이머의 염기서열이다.
서열번호 20: ldh의 상동 부위 1을 PCR로 증폭하기 위한 프라이머의 염기서열이다.
서열번호 21: ldh의 상동 부위 2의 염기서열이다.
서열번호 22: ldh의 상동 부위 2를 PCR로 증폭하기 위한 프라이머의 염기서열이다.
서열번호 23: ldh의 상동 부위 2를 PCR로 증폭하기 위한 프라이머의 염기서열이다.
서열번호 24: ldh의 상동 부위 1 및 2가 포함된 DNA 단편의 염기서열이다.
서열번호 25: dgp의 염기서열이다.
서열번호 26: dgp의 상동 부위 1의 염기서열이다.
서열번호 27: dgp의 상동 부위 1을 PCR로 증폭하기 위한 프라이머의 염기서열이다.
서열번호 28: dgp의 상동 부위 1을 PCR로 증폭하기 위한 프라이머의 염기서열이다.
서열번호 29 dgp의 상동 부위 2의 염기서열이다.
서열번호 30: dgp의 상동 부위 2를 PCR로 증폭하기 위한 프라이머의 염기서열이다.
서열번호 31: dgp의 상동 부위 2를 PCR로 증폭하기 위한 프라이머의 염기서열이다.
서열번호 32: dgp의 상동 부위 1 및 2가 포함된 DNA 단편의 염기서열이다.
기탁기관명 : 한국생명공학연구원
수탁번호 : KCTC14485BP
수탁일자 : 20210305
<110> GS CALTEX <120> RECOMBINANT MICROORGANISM FOR PRODUCING 2,3-BUTANEDIOL WITH REDUCED BY-PRODUCT PRODUCTION AND METHOD FOR PRODUCING 2,3-BUTANEDIOL USING THE SAME <130> DNP200344 <160> 32 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 3001 <212> DNA <213> Bacillus licheniformis <400> 1 atgtgggtaa tgctattagc ctgtgtgatc gttgttggga tcggcattta tgaaaaaagg 60 cgccaccagc aaaatatcga tgcgctgcct gtccgagtga acatcaacgg tatacgcgga 120 aagtccacgg tgacaagatt aacaacaggg atattaatcg aagcaggcta caaaacagta 180 ggaaaaacaa ccgggacaga cgcaaggatg atttattggg acacaccgga agagaagccg 240 atcaaaagaa agccgcaagg gccgaatatc ggagagcaga aggaggttat gaaagaaacg 300 gtggaaagag gggccaatgc gattgtcagt gagtgcatgg ccgttaatcc tgattaccaa 360 atcatctttc aggaagaatt gcttcaggct aatatcggcg tgatcgtgaa cgtgctggag 420 gatcacatgg atgtgatggg accgactttg gatgaaatcg cagaagcatt cacagcaacc 480 attccttata atggacattt ggttattact gatagtgagt ataccgattt ctttaagcaa 540 attgcaaaag aaaggaacac aaaagtcatc gtcgcagaca attctaaaat aacagatgaa 600 tacctcagac agtttgagta 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gattttatat atccggtgat gccgtttgag 1500 attgccgaat tcaggggaat cggaatcatc gtgccggggc tgatcgccaa taccattcaa 1560 agacagggat taacgattac gcttggaagt acgcttttat tgagcggagc aacattcgtc 1620 attatgtatg cttactatct aatctaaagt taggtgtgtc aaatcgatga aaaaacaact 1680 gaactttcag gaaaaactgc tgaagttgac gaagcaggag aaaaagaaaa caaacaagca 1740 cgtctttatc gtattgcccg ttattttctg tttaatgttt gtctttactt gggtcggaag 1800 cgccaaaact ccttcgcaaa tggacaaaaa agaagatgcc aagcttacag ctacttttgt 1860 tggcgatatc atgatgggaa gaaacgtaga aaaagtgaca aacttgcacg gttcggaaag 1920 tgtcttcaaa aatgtgaagc cgtactttaa tgtgtcagat tttatcacag gaaactttga 1980 aaaccctgta accaatgcaa aggactatca agaggcagaa aagaacatcc atctgcaaac 2040 gaatcaagaa tcagtcgaaa cattgaaaaa gctgaacttc agcgtactga attttgccaa 2100 caaccatgcg atggactacg gggaagacgg tttgaaggat acgctcaata aattttcaaa 2160 tgagaatctg gagcttgtcg gagcaggaaa taatcttgaa gacgcgaaac agcacgtatc 2220 ctatcagaat gtgaacggcg taaaaattgc aacgctcggt tttacagacg tctacacaaa 2280 gaactttaca gccaaaaaga acagaggcgg agtgctgccg ctcagtccga aaatctttat 2340 tccaatgatt gcggaagcat cgaaaaaagc ggatcttgtc cttgtccatg tgcactgggg 2400 acaagaatat gacaatgaac cgaacgacag acagaaggat ctggccaagg cgattgcaga 2460 tgccggagca gatgtcatca tcggcgctca tccccatgtt ctcgaaccga tcgaagtgta 2520 taacggtact gtgattttct acagcctcgg caactttgta tttgatcagg gctggtcaag 2580 aacacgggac agcgcgcttg tacaatacca tttaatgaat gacggcaaag ggcgttttga 2640 ggtaacgcct ctcaacattc gcgaagcaac gccgacgcct ttaggcaaga gcgacttctt 2700 aaaacgaaaa gcgatcttcc gtcaattgac aaaaggaaca aacctcgact ggaaagaaga 2760 gaacggaaaa ttaacgtttg aagtcgatca tgcggacaag ctgaaaaaat aataaaaacg 2820 gagtggtgaa caaatgaaat ttgtcagagc catttggccg ttcgtaggtt tagttttgat 2880 cattgcattc atgtctgctt tcaagtattc tgatgaattg tcaaacgatg aaaaagctaa 2940 aatctctacg gagatccaaa aagtgaatca gcaggatcaa acaacagaaa acaagcaata 3000 a 3001 <210> 2 <211> 792 <212> DNA <213> Bacillus licheniformis <400> 2 aagccttctc ctctctattt gtgtaaccgt ttacataaag attatcacga tccatttaaa 60 atcacaataa aaaaatggat gaacactgaa attttagacc gggctgggat atcgagacat 120 atataggggc gtttaatggc gaatacagta acaatgagaa tagtaagaaa aattaaaaat 180 gttaaagttt gatgaattat cattgaaaaa aattaatggc tttttaaatc ctaggatttt 240 aacctaaaat ctgaagaaat aaggtggatc gaacgactca caaaatattt ggatttgtca 300 atgaatcccg ctttatgcta aaagagattt tcattttttg atagatggtc tgattgtcat 360 aggacggatt tgttttgaag agggaacatt ggtgactttt taacctgttc gaaaagagcg 420 aaaatactaa aagaaaagag agatcccggc tgacagccca tttaaagggg attgcggacg 480 ggggaaaaaa gagatcctga atccatcctt caacctttca tctgaaatag ggagaaaagt 540 acaaaaatca taatgtcgaa ttttgaaagc gcatacttaa aacgctgaca aaaatctgat 600 aggaattaag aactttcgat ttccaaaaat atcaataaaa agataggcat taatgactcg 660 ggcgaggtga tctttgtcac ggaaaatttc gtcgtcttct gttacataat gccgattgtg 720 atttcatagt gaacctatat actgatgaat gaatttacat atcagattcc aagaaggaga 780 tgtagacaaa ca 792 <210> 3 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of primer for amplifying homologous region 1 of pgsBCAE <400> 3 agacagggcc aacgaggcca 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aacctaaaat ctgaagaaat aaggtggatc gaacgactca caaaatattt ggatttgtca 300 atgaatcccg ctttatgcta aaagagattt tcattttttg atagatggtc tgattgtcat 360 aggacggatt tgttttgaag agggaacatt ggtgactttt taacctgttc gaaaagagcg 420 aaaatactaa aagaaaagag agatcccggc tgacagccca tttaaagggg attgcggacg 480 ggggaaaaaa gagatcctga atccatcctt caacctttca tctgaaatag ggagaaaagt 540 acaaaaatca taatgtcgaa ttttgaaagc gcatacttaa aacgctgaca aaaatctgat 600 aggaattaag aactttcgat ttccaaaaat atcaataaaa agataggcat taatgactcg 660 ggcgaggtga tctttgtcac ggaaaatttc gtcgtcttct gttacataat gccgattgtg 720 atttcatagt gaacctatat actgatgaat gaatttacat atcagattcc aagaaggaga 780 tgtagacaaa cacagtgcaa aagagagtgc cgccggcgct ctcttttttg tgtgctgatc 840 ccggttataa aagacctgtg aaaagcgacc ggtttgaaag ggaaacacga caattttctt 900 aaccggtcag tgtataaagt tttatagaaa atcaggagga tatatacatg gttttggggt 960 tcatgtttat tgtattcttt tgaagggaat aaaaactgac aaatttcgac tgaagcaaaa 1020 tttgaaaatg catcacctta ccaattcggg atgggaaccg cacctcatgt tcatgacctc 1080 tttagaatat ttcccttcat ctttttaatc tgcgcttagg tgaaaaagct gatcatgctg 1140 tgctgagcgt ttcttctcgc tatgacgctg ctgtacatgc aaaaaaagtc ctttaaatat 1200 cccagttgaa tgacgatgaa agaggaaaga agaggaggaa cagatcaatt gataaaaaaa 1260 gcggcaaaca aaaagttggt tttgttttgt ggaattgcgg tgctttggat gtctttattt 1320 ttaacgaatc ataatgatgt acgcgccgat acgatcggcg agaaaatagc ggaaactgcc 1380 agacagcttg agggtgcgaa atacagctac ggcggagaga agccgaaaac ggggtttgac 1440 tcgtcaggct ttgtgcaata tgtgtttcaa tcgctcgata ttacgcttcc gagaacggta 1500 aaggaacaat cgactcttgg gagcagt 1527 <210> 9 <211> 1449 <212> DNA <213> Bacillus licheniformis <400> 9 atgaacatca aaaacattgc taaaaaagcg tcagccttaa ccgttgctgc ggcactgctg 60 gccggaggtg cgccgcaaac ctttgcaaaa gaaacgcagg attacaagaa aagctacgga 120 ttttctcata tcacaagaca tgacatgctg aaaattcccg agcagcaaaa gagcgaacaa 180 tttaaagttc ctcaattcga tccgaaaaca atcaaaaaca tcccttctgc aaaagggtat 240 aacaaaaatg gagagctgat cgatttagac gtatgggaca gctggccgct gcaaaatgcc 300 gacgggacgg ttgctacata ccacggctac aatcttgttt tcgcgctggc gggcgatccg 360 aaagacgtcg atgacacatc catctatttg ttctatcaaa agaaaggcga aacttctatc 420 gacagctgga aaaacgccgg cagagtgttt aaagacagcg acaaatttgt tccagacgat 480 ccgtacctca aacatcaaac acaggaatgg tcaggttctg ccacgctgac aaaagacgga 540 aaagtccgac tgttttacac agctttttcc ggcacgcaat acggcaagca gacgctgaca 600 acagctcagg tcaatttctc tcagccggat tcggacacgc tcaaaattga cggtgtagaa 660 gatcataaat cggtctttga cggcgccgac ggcacggtat accaaaacgt tcagcaattc 720 attgacgaag gaaactacag ctccggcgac aaccatacga tgagagaccc gcattatgtg 780 gaagaccgcg gccataaata tctcgtattt gaagccaata cgggaacaaa aaccggctac 840 caaggagaag actccctatt caacagagcc tactacgggg gcagcaagaa gttctttaaa 900 gaagaaagca gcaagctgct gcaaggtgcg aacaaaaaga acgcttcgct ggctaacggc 960 gctctcggaa tcatcgaatt aaataacgat tatacactga aaaaagtcat gaagcctttg 1020 atcgcctcca atacggtgac agatgaaatc gaacgggcca acctcttcaa aatgaatgga 1080 aaatggtatc tgttcacaga ttcaagagga tcaaaaatga caattgacgg catcggttca 1140 aaagacattt atatgctcgg ctatgtatca ggttcattaa ccggaccatt caagccttta 1200 aacaaatccg gacttgtttt gcatatggac caggattaca atgacatcac gtttacttat 1260 tcacactttg ccgtaccgca gaaaaaaggc gacgaagtcg tcattacaag ctacatcaca 1320 aacagaggga tttcgaacga gcatcacgcc acgtttgcac caagcttttt gctgaagatc 1380 aaaggatcaa aaacatccgt tgtcaaaaac agcatccttg aacagggaca actaacggta 1440 aacaaataa 1449 <210> 10 <211> 697 <212> DNA <213> Bacillus licheniformis <400> 10 gattacctgc acgtatcact ggttgatttc cggtccttgc cgcgcagggg tgcagacaga 60 tcccgcgcaa ggatggaact gatcaaagaa gccgtccaag accgtctccc actgatcgga 120 gccgggcaag tacacacacc ggaagacgcc cttcaagcgc tggaaacagg agccgatctc 180 atcggaatcg ggcggggtct cctgatggat ccggagtggc tacaaaaagt tcgagccgga 240 aaagaggacg atattcaaac aaccctgtca agacatgatc agcggaagct cgcaattcca 300 gatgcctttt gggaaagtat accgatgtat attgatttca gcgattgacg attcccgctt 360 atacagacta tagattcata taaaaaaggt gtctttccgc ttaaaatcgg tgtcatttgc 420 ataaaaatgt ataggaaaag aggaacttag accagttgag tcccagagat gagtatatta 480 gaatgatggt aattcaatat cgtcgggatt gttactgtct aagcaggcaa gacctaaaat 540 gtgtgaaggg cgaaatctat cttttgccta tatgaacttg cacattttag gtcttttttc 600 tgttcttcag gacaatgccg cagttaggag ggatgattgg gaacgttcat gttgtcagaa 660 gcaatctatt acatattgaa aaagggagga aatattg 697 <210> 11 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of primer for amplifying homologous region 1 of sacB <400> 11 agacagggcc aacgaggccg ctagcgatta cctgcacgta tcactg 46 <210> 12 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of primer for amplifying homologous region 1 of sacB <400> 12 tttccttcgt tcgttcaata tttcctccct ttttcaatat g 41 <210> 13 <211> 644 <212> DNA <213> Bacillus licheniformis <400> 13 aacgaacgaa ggaaaatgcc ggtgaacatc ggcattttct ttcgtatgtc atcttagaat 60 aaagcgggga attttcttga agaaggcagt atataagcgg atcagcattt taactgtttg 120 tcttggaatc ttcatcatga tatttctttc agtccgggaa acagaaaaaa agggagaatc 180 tccggataca ccggaatatc gtgcagcttt ccatttgaca acccctgaca aatggaaaaa 240 cgaccctcaa aaacccgtct atttcaatgg agaatatcat tactactacc tctataaccg 300 agactatccg gacggcaatg gaacagagtg gcgccacgca gtatcagatg atctcgtcca 360 ctggcaggat aaaggggttg ccattccgaa atatacgaat aaaaatggcg atccctggtc 420 cggttctgtc gttgtcgact caaaaaacac agccggcttc ggcaaaggga cgatcgtggc 480 ggttatgacg cagccgtcgg ccaatgacgg gaaggaagag caatttttat ggtacagcca 540 aaatggagga aaaacattta aaccttacgg tgaagagccg gtcttgccta atccgggcac 600 cgtcgatttc agagatccga aagtgatctg ggatgaacag gatg 644 <210> 14 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of primer for amplifying homologous region 2 of sacB <400> 14 agggaggaaa tattgaacga acgaaggaaa atgcc 35 <210> 15 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of primer for amplifying homologous region 2 of sacB <400> 15 agacagggcc ttattggccc ttaagcatcc tgttcatccc agatc 45 <210> 16 <211> 1341 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of DNA fragment comprising homologous region 1 and 2 of sacB <400> 16 gattacctgc acgtatcact ggttgatttc cggtccttgc cgcgcagggg tgcagacaga 60 tcccgcgcaa ggatggaact gatcaaagaa gccgtccaag accgtctccc actgatcgga 120 gccgggcaag tacacacacc ggaagacgcc cttcaagcgc tggaaacagg agccgatctc 180 atcggaatcg ggcggggtct cctgatggat ccggagtggc tacaaaaagt tcgagccgga 240 aaagaggacg atattcaaac aaccctgtca agacatgatc agcggaagct cgcaattcca 300 gatgcctttt gggaaagtat accgatgtat attgatttca gcgattgacg attcccgctt 360 atacagacta tagattcata taaaaaaggt gtctttccgc ttaaaatcgg tgtcatttgc 420 ataaaaatgt ataggaaaag aggaacttag accagttgag tcccagagat gagtatatta 480 gaatgatggt aattcaatat cgtcgggatt gttactgtct aagcaggcaa gacctaaaat 540 gtgtgaaggg cgaaatctat cttttgccta tatgaacttg cacattttag gtcttttttc 600 tgttcttcag gacaatgccg cagttaggag ggatgattgg gaacgttcat gttgtcagaa 660 gcaatctatt acatattgaa aaagggagga aatattgaac gaacgaagga aaatgccggt 720 gaacatcggc attttctttc gtatgtcatc ttagaataaa gcggggaatt ttcttgaaga 780 aggcagtata taagcggatc agcattttaa ctgtttgtct tggaatcttc atcatgatat 840 ttctttcagt ccgggaaaca gaaaaaaagg gagaatctcc ggatacaccg gaatatcgtg 900 cagctttcca tttgacaacc cctgacaaat ggaaaaacga ccctcaaaaa cccgtctatt 960 tcaatggaga atatcattac tactacctct ataaccgaga ctatccggac ggcaatggaa 1020 cagagtggcg ccacgcagta tcagatgatc tcgtccactg gcaggataaa ggggttgcca 1080 ttccgaaata tacgaataaa aatggcgatc cctggtccgg ttctgtcgtt gtcgactcaa 1140 aaaacacagc cggcttcggc aaagggacga tcgtggcggt tatgacgcag ccgtcggcca 1200 atgacgggaa ggaagagcaa tttttatggt acagccaaaa tggaggaaaa acatttaaac 1260 cttacggtga agagccggtc ttgcctaatc cgggcaccgt cgatttcaga gatccgaaag 1320 tgatctggga tgaacaggat g 1341 <210> 17 <211> 960 <212> DNA <213> Bacillus licheniformis <400> 17 atgagaaacc aaaaagtcaa tcgtacagtt ttgatcggtg cgggttttgt tggaagcagc 60 tatgcattta cgttaattaa ccaaggtatc acagacgaac ttgtgatcat tgatttaaat 120 aaagacaaag caatgggcga tgttatggat ctcaaccacg gtaaagcatt tgctccgcat 180 cctgtgaaaa catggtacgg cacatatgat gactgcaaag aagctgatat tgtctgcgta 240 tgcgccggag cgaaccaaaa gccgggtgaa acccgccttg atctagtcga aaagaacttg 300 aaaattttta aaggaatcat cggagaagtc atggccagcg gttttgacgg catcttcctc 360 gtcgctacaa accctgtcga catcttgact tatgcgactt ggaaattcag cggccttccg 420 aaagaacgcg tcatcggaag cggcacaacg cttgacactg cccgtttccg ctacttgctc 480 agcgagtatt tcggtgtcgc tgcccacaat gcgcacggct atatcattgg tgaacacgga 540 gatacggagc tgcctgtctg gagccatgcg aatatcggcg gagttcccgt cagcgacttg 600 ctgaaaagaa atgagaaata caaagcggaa gatctagatg aactgtttga caatgtaaaa 660 aacgccgctt accacattat tgagaaaaaa ggcgcgacat actacggagt tgccatgagc 720 ctcgcacgta ttacgaaagc gatttatcga aatgaagaag caattttgac cgtgagcgct 780 catcttgatg gtgaatttgg agaaaatgat gtttatatcg gagttccggc ggttgtcggc 840 cgatgcggag cgagggaaat tgttgagctc gatctgaacg aaaaggaaaa acaacaattc 900 aagcatagcg caggtgtgtt aaaagcaatt ctaaaaccgc attttgaact gcaggcgtaa 960 960 <210> 18 <211> 730 <212> DNA <213> Bacillus licheniformis <400> 18 cataacaacg gaatcatcgt caccagcatt ccgccaacag ccgtcttttt cggtccgaaa 60 cggtcggtta aaatgccgag cgcaatccgg aaaaacgatc cggccaaagt aggtatggcg 120 acaatcaatc cgacctgtga aggcgataaa tcaaaatcag ccgtaacata aacaccaagc 180 gcccccagca acacccaaat cataaagctg acatcgaaat ataaaaaaga tgacaacaag 240 gaaggcgcgt gtccgctctt cctcaaatcc gccaatttca attgcaacac tccccatccg 300 atagattcta gaatttatca tgacaaaatc gaatagggtt ggcagtattt ttgtaagctt 360 tactaacaaa ctaaaagatt gaatatttaa aatgttagtt tggacagcac tatagcaggc 420 gataattgaa ttatgctgaa gaatagtggt gttatgagcg ctgaaaatgg gaaaccttat 480 attgatatag gcccgatgca cttgcagata aaaccgtctt ttgcaacgcg tttatcaatt 540 tttctttaga cataaggcat atttttacca gaaaatgtac aaatttaagg aagaaatacg 600 tggagacaca aaatagacat aaataaaaat gtatatcact tgaaaaagta tgtgaagtat 660 tgcacaatat gaatgtgaag aatttcacaa acagcttagt ttaaaacaaa cggcaaagga 720 atgatgagtc 730 <210> 19 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of primer for amplifying homologous region 1 of ldh <400> 19 agacagggcc aacgaggccc ataacaacgg aatcatcgtc acc 43 <210> 20 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of primer for amplifying homologous region 1 of ldh <400> 20 cttcatggtg ttcaggactc atcattcctt tgccgtttg 39 <210> 21 <211> 699 <212> DNA <213> Bacillus licheniformis <400> 21 ctgaacacca tgaagatact aacatcatga agattgcgag atgatgaaaa tgtggcagca 60 gatatacgat ccgtttggaa atctgtttat cagcgctttt gccgccatac tgccgattct 120 tttctttctt cttgcactga ccgtgttgaa gatgaaagga atcattgcgt catttttgac 180 gctggcggtc agctttattg tagcggtgtt cttctttcac atgccggctg cgaaagctgt 240 ctccgccgtt ttacttggaa ttgctaacgg cctttggccg atcggatata ttgtcctgat 300 ggctgtatgg ctttacaaaa tttctgtcaa aaccggaaag tttaaagtga tcagagcgag 360 cattgccgga atttcgtccg accagcggct tcagctattg ctgatcgggt tcagttttaa 420 cgcctttttg gaaggtgcgg caggcttcgg tgtgccgatt gcgatcagcg ccgttcttct 480 tgtcgagctt ggttttaaac ctttgaaagc ggcatcccta tgtttaatag cgaatgcggc 540 atccggagcc tttggagcca tcggaattcc ggttatcaca ggagcgcaga tgggaggctt 600 aacaccggtt gagctttcca gaacgctcgc tttgatgctg ccggtcatcg ctttctttgt 660 cccgttcctg ctcgttttca tattggacgg gtttaaagg 699 <210> 22 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of primer for amplifying homologous region 2 of ldh <400> 22 aaggaatgat gagtcctgaa caccatgaag atactaacat catg 44 <210> 23 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of primer for amplifying homologous region 2 of ldh <400> 23 agacagggcc ttattggccc ctttaaaccc gtccaatatg aaaac 45 <210> 24 <211> 1429 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of DNA fragment comprising homologous region 1and 2 of ldh <400> 24 cataacaacg gaatcatcgt caccagcatt ccgccaacag ccgtcttttt cggtccgaaa 60 cggtcggtta aaatgccgag cgcaatccgg aaaaacgatc cggccaaagt aggtatggcg 120 acaatcaatc cgacctgtga aggcgataaa tcaaaatcag ccgtaacata aacaccaagc 180 gcccccagca acacccaaat cataaagctg acatcgaaat ataaaaaaga tgacaacaag 240 gaaggcgcgt gtccgctctt cctcaaatcc gccaatttca attgcaacac tccccatccg 300 atagattcta gaatttatca tgacaaaatc gaatagggtt ggcagtattt ttgtaagctt 360 tactaacaaa ctaaaagatt gaatatttaa aatgttagtt tggacagcac tatagcaggc 420 gataattgaa ttatgctgaa gaatagtggt gttatgagcg ctgaaaatgg gaaaccttat 480 attgatatag gcccgatgca cttgcagata aaaccgtctt ttgcaacgcg tttatcaatt 540 tttctttaga cataaggcat atttttacca gaaaatgtac aaatttaagg aagaaatacg 600 tggagacaca aaatagacat aaataaaaat gtatatcact tgaaaaagta tgtgaagtat 660 tgcacaatat gaatgtgaag aatttcacaa acagcttagt ttaaaacaaa cggcaaagga 720 atgatgagtc ctgaacacca tgaagatact aacatcatga agattgcgag atgatgaaaa 780 tgtggcagca gatatacgat ccgtttggaa atctgtttat cagcgctttt gccgccatac 840 tgccgattct tttctttctt cttgcactga ccgtgttgaa gatgaaagga atcattgcgt 900 catttttgac gctggcggtc agctttattg tagcggtgtt cttctttcac atgccggctg 960 cgaaagctgt ctccgccgtt ttacttggaa ttgctaacgg cctttggccg atcggatata 1020 ttgtcctgat ggctgtatgg ctttacaaaa tttctgtcaa aaccggaaag tttaaagtga 1080 tcagagcgag cattgccgga atttcgtccg accagcggct tcagctattg ctgatcgggt 1140 tcagttttaa cgcctttttg gaaggtgcgg caggcttcgg tgtgccgatt gcgatcagcg 1200 ccgttcttct tgtcgagctt ggttttaaac ctttgaaagc ggcatcccta tgtttaatag 1260 cgaatgcggc atccggagcc tttggagcca tcggaattcc ggttatcaca ggagcgcaga 1320 tgggaggctt aacaccggtt gagctttcca gaacgctcgc tttgatgctg ccggtcatcg 1380 ctttctttgt cccgttcctg ctcgttttca tattggacgg gtttaaagg 1429 <210> 25 <211> 651 <212> DNA <213> Bacillus licheniformis <400> 25 atgaagaaat gggcatttgt atcagacttt gatgggacga tttccaaaca ggatttttac 60 tggatggtca ttgataaata ttttcccgaa ggccgtgaat tgttcaagaa gtggaagtcc 120 ggagaattaa aagatatcga atttttggga accgtttttg cttcgattaa tcaaagcgaa 180 caaaaaatca ttgatgacat ccattccata ccgattgatg aatatgtgcc tgacttcatt 240 cagcatgtcc agaaaagcgg cggcgacttc tacattttaa gcgccggcac ggattattac 300 attcattata ttttaaagaa atacgggatt acagacgttg aggtctattc aaataaaggc 360 ttttttaaag aagacaatgt tcatatggac attgatgaga atcattggca ttactctgag 420 cgctatggga ttgataaatc aaaggtcatt caaaagctga aagaagagta tgagacggtt 480 tattttgcag gcgacagtga accggattcg cacccggcta aatttgcgga tgttacgttt 540 gcaaaggatg cgctccagga tttgctgcgt cagcaggggg tgccatttgt agccgttgaa 600 acatttgaag acattgaaca atatcttaaa gaaaaagggc ggatcgtcta a 651 <210> 26 <211> 746 <212> DNA <213> Bacillus licheniformis <400> 26 cctaagtgat aatgattcgc attatcaatg taaatatagc agatcaatcc ctctctcgtc 60 tatcactttt tttgctaagt atgattagtg tggttttggt taatttgtta ctataaacag 120 aaaaaggact gatgagagat ggcagaaacg aacccggtga tcaaaaaatt gcagttcaag 180 gataatggac agcctgtact gattgtgaat ccgcctgagg catacagcgg cgtcatcgct 240 gaatttcaag gccctgttca tcatcacgcc gaatcggacc aatatgattt tgttcaggta 300 ttcgcagcga ccaacgcaaa gctgcaggct ttagccaagg aggctgaacg tcatttggcg 360 gaagacggtc tgttttggct ttgctacccg aaaaaatcat cgaaagtcta caaaggatcg 420 gactgcagcc gcgatacagt agccggactg cttgcagacc agggctatga accggttcgc 480 caaattgcaa ttgatgaaga ctggtctgcg ctcagatttc gcaaggcgga aaacatcaaa 540 acgatgaagc ggaaatttgc cgtaacagag aaaggtaagc agcgtacaga tcaagaatga 600 ttatatacgc ctcctttcag ggggacgaat attcagcttg tgaacgaaag tacacaaaaa 660 agaaataata ttatgttcaa tgattcacaa actttttgta taatgaatct aatcttttaa 720 aataccatag aaaagaggta tgcagc 746 <210> 27 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of primer for amplifying homologous region 1 of dgp <400> 27 agacagggcc aacgaggccc ctaagtgata agtattcgca ttatc 45 <210> 28 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of primer for amplifying homologous region 1 of dgp <400> 28 cggcattaga cgatcgctgc atacctcttt tctatgg 37 <210> 29 <211> 723 <212> DNA <213> Bacillus licheniformis <400> 29 gatcgtctaa tgccgcgcca ggttaccagc atagccatcc ccgcggtttt ggacattagt 60 gagggcgtgc ttggccggtt ggatgagata ttgagaaaac atcagtttga caaggcgatc 120 atgttttttg acgatttttc ctatcagcag tatgagcatt cactgaaaac cgcatttcaa 180 catgttaaag ttgaagccgt tctgctgccg tccaatctgg acatacagga gcttttgaag 240 cgggcatttt cgatcgggaa ttgcgatgtc attattgcca tgggcggcgg gtatgttgtg 300 gactgcggaa aatacatcgc cttttccaag cggaccccgt tcatcagcat tccgacgtcg 360 gcatccaatg acgggtttgc gagcagcaat tgctcgcttc aggtcgaagg aaaaaaaaca 420 accgttccgg caagggttcc ctacggaatc atagctgatt tgagcattat tcaaaaagcg 480 ccggattgct ttattttggc ggggatcgga gatttgatgt ccaatattac ggccctttat 540 gattgggagt ttgaggagcg gcacggggtc ggcgatgtaa atgcgtttgc gtcgatgctc 600 agcaagaaag cggtcaacag ctttgtccgt acgccgatgc aggatattaa acagccgatc 660 ttcttaaaag agcttgtcag ttctttgaca atgggcggca tcgctacgga aatcagcgga 720 aac 723 <210> 30 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of primer for amplifying homologous region 2 of dgp <400> 30 aaagaggtat gcagcgatcg tctaatgccg cgc 33 <210> 31 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of primer for amplifying homologous region 2 of dgp <400> 31 agacagggcc ttattggccg tcaaagaact gacaagctct tttaag 46 <210> 32 <211> 1469 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of DNA fragment comprising homologous region 1 and 2 of dgp <400> 32 cctaagtgat aatgattcgc attatcaatg taaatatagc agatcaatcc ctctctcgtc 60 tatcactttt tttgctaagt atgattagtg tggttttggt taatttgtta ctataaacag 120 aaaaaggact gatgagagat ggcagaaacg aacccggtga tcaaaaaatt gcagttcaag 180 gataatggac agcctgtact gattgtgaat ccgcctgagg catacagcgg cgtcatcgct 240 gaatttcaag gccctgttca tcatcacgcc gaatcggacc aatatgattt tgttcaggta 300 ttcgcagcga ccaacgcaaa gctgcaggct ttagccaagg aggctgaacg tcatttggcg 360 gaagacggtc tgttttggct ttgctacccg aaaaaatcat cgaaagtcta caaaggatcg 420 gactgcagcc gcgatacagt agccggactg cttgcagacc agggctatga accggttcgc 480 caaattgcaa ttgatgaaga ctggtctgcg ctcagatttc gcaaggcgga aaacatcaaa 540 acgatgaagc ggaaatttgc cgtaacagag aaaggtaagc agcgtacaga tcaagaatga 600 ttatatacgc ctcctttcag ggggacgaat attcagcttg tgaacgaaag tacacaaaaa 660 agaaataata ttatgttcaa tgattcacaa actttttgta taatgaatct aatcttttaa 720 aataccatag aaaagaggta tgcagcgatc gtctaatgcc gcgccaggtt accagcatag 780 ccatccccgc ggttttggac attagtgagg gcgtgcttgg ccggttggat gagatattga 840 gaaaacatca gtttgacaag gcgatcatgt tttttgacga tttttcctat cagcagtatg 900 agcattcact gaaaaccgca tttcaacatg ttaaagttga agccgttctg ctgccgtcca 960 atctggacat acaggagctt ttgaagcggg cattttcgat cgggaattgc gatgtcatta 1020 ttgccatggg cggcgggtat gttgtggact gcggaaaata catcgccttt tccaagcgga 1080 ccccgttcat cagcattccg acgtcggcat ccaatgacgg gtttgcgagc agcaattgct 1140 cgcttcaggt cgaaggaaaa aaaacaaccg ttccggcaag ggttccctac ggaatcatag 1200 ctgatttgag cattattcaa aaagcgccgg attgctttat tttggcgggg atcggagatt 1260 tgatgtccaa tattacggcc ctttatgatt gggagtttga ggagcggcac ggggtcggcg 1320 atgtaaatgc gtttgcgtcg atgctcagca agaaagcggt caacagcttt gtccgtacgc 1380 cgatgcagga tattaaacag ccgatcttct taaaagagct tgtcagttct ttgacaatgg 1440 gcggcatcgc tacggaaatc agcggaaac 1469

Claims (13)

  1. 2,3-부탄다이올 생합성 경로를 갖는 미생물에 있어서,
    글루탐산을 폴리글루탐산으로 전환하는 경로가 억제된,
    2,3-부탄다이올 생산용 재조합 미생물.
  2. 제 1항에 있어서,
    슈크로즈를 레반으로 전환하는 경로가 추가로 억제된,
    2,3-부탄다이올 생산용 재조합 미생물.
  3. 제 2항에 있어서,
    피루브산을 젖산으로 전환하는 경로가 추가로 억제된,
    2,3-부탄다이올 생산용 재조합 미생물.
  4. 제 3항에 있어서,
    글리세로포스페이트를 글리세롤로 전환하는 경로가 추가로 억제된,
    2,3-부탄다이올 생산용 재조합 미생물.
  5. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    상기 재조합 미생물을 배양 시 야생형 미생물에 비하여 점액성 고분자의 생산량이 적은 것을 특징으로 하는 2,3-부탄다이올 생산용 재조합 미생물.
  6. 제 2항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 재조합 미생물을 배양 시 야생형 미생물에 비하여 젖산의 생산량이 적은 것을 특징으로 하는 2,3-부탄다이올 생산용 재조합 미생물.
  7. 제 2항 또는 제 4항에 있어서,
    상기 재조합 미생물을 배양 시 야생형 미생물에 비하여 글리세롤의 생산량이 적은 것을 특징으로 하는 2,3-부탄다이올 생산용 재조합 미생물.
  8. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서,
    야생형 미생물에 비하여 2,3-부탄다이올의 생산능이 증가된 것을 특징으로 하는 2,3-부탄다이올 생산용 재조합 미생물.
  9. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항의 2,3-부탄다이올 생산용 재조합 미생물을 배양하는 단계;및
    상기 배양물로부터 2,3-부탄다이올을 회수하는 단계를 포함하는,
    2,3-부탄다이올의 생산 방법.
  10. 제 9항에 있어서,
    상기 배양은 원당 또는 포도당을 포함하는 배지에서 수행하는 것을 특징으로 하는,
    2,3-부탄다이올의 생산 방법.
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR101581504B1 (ko) * 2013-03-18 2015-12-31 지에스칼텍스 주식회사 2,3-부탄디올의 생성능이 증강된 재조합 미생물 및 이를 이용한 2,3-부탄디올의 생산 방법
KR101748930B1 (ko) * 2015-02-09 2017-06-20 지에스칼텍스 주식회사 다이올 생산용 재조합 미생물

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Biotechnology and Bioengineering, 2012, Vol. 109, No. 7, pp. 1-12.*
Metabolic Engineering, 2020, Vol. 61, pp. 381-388.*

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