KR20230039826A - 폴리올 또는 점액성 고분자의 생성능이 조절된 재조합 미생물 - Google Patents
폴리올 또는 점액성 고분자의 생성능이 조절된 재조합 미생물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 폴리올 또는 점액성 고분자의 생성능이 조절된 재조합 미생물에 대한 것이다. 또한 본 발명은 본 발명의 재조합 미생물을 이용한 폴리올 또는 점액성 고분자의 생산 방법에 대한 것이다.
Description
본 발명은 폴리올 또는 점액성 고분자의 생성능이 조절된 재조합 미생물에 대한 것이다. 또한 본 발명은 상기 재조합 미생물을 이용한 폴리올 또는 점액성 고분자의 생산 방법에 대한 것이다.
바실러스 리케니포미스(Bacilluls licheniformis) 미생물은 GRAS (generally regarded as safe) 미생물로 분류되며, 아밀레이즈(amylase), 프로테이즈(protease) 등 산업용 효소와 폴리글루탐산(polyglutamic acid), 레반(levan), 엑소폴리사카라이드(exopolysaccharide) 등 다양한 점액성 고분자와 2,3-부탄다이올(2,3-BDO), 글리세롤 등의 다양한 폴리올을 생산할 수 있는 미생물이다. 점액성 고분자로 분류되는 폴리글루탐산, 레반, 엑소폴리사카라이드는 화장품, 농업제품, 식품 등에서 보습제 등의 용도로 광범위하게 이용가능한 고부가 소재이다. 바실러스 리케니포미스가 생성할 수 있는 폴리올은 크게 2,3-부탄다이올과 글리세롤이다. 네 개의 탄소와 두 개의 하이드록시기(-OH)를 갖는 알코올 중 하나(CH3CHOHCHOHCH3)인 2,3-부탄다이올은 (2R,3S)-부탄다이올, (2R,3S)-부탄다이올, (2S,3S)-부탄다이올로 구성된 세가지 이성질체가 존재하며 화장품, 농업제품, 식품 등에서 보습제, 식물병 억제제, 면역력 강화제 등으로 광범위하게 이용가능한 고부가 소재이다. 또한, 글리세롤은 세 개의 탄소와 세 개의 하이드록시기(-OH)를 가지는 폴리올이며 화장품 등의 보습제 원료로 많이 이용된다.
바실러스 미생물을 이용하여 폴리글루탐산, 레반, 엑소폴리사카라이드 등으로 대표되는 각각의 점액성 고분자를 생산하고자 하는 연구는 오래 전부터 수행되어 왔다 (Birrer et al., Int. J. Biol. Macromol., 16:265-275, 1994; Gojgic et al., Int. J. Biol. Macromol., 121:142-151, 2019;Asgher et al., Int. J. Biol. Macromol., 151:984-992,2020). 2,3-부탄다이올 생산에 대한 연구는 Klebsiella pneumoniae, K. oxytoca, Bacillus licheniformis, B. subtils 등 다양한 미생물에 의한 생산연구가 보고되어 왔다 (Song et al. J. Ind. Microbial. Biotechnol., 46:1583-1601, 2019). 2,3-부탄다이올 생산수율 및 선택도 등 개선을 위한 다양한 재조합 미생물 개발 연구가 수행되어 왔다. 예컨대, 미생물을 UV에 노출시키거나, 주요 부산물 생성경로를 억제시키는 등 주로 부산물 저감을 통한 미생물 개발 연구가 활발하게 수행되어 왔다 (Song et al. J. Ind. Microbial. Biotechnol., 46:1583-1601, 2019).
본 발명의 목적은 폴리올 또는 점액성 고분자의 생성능이 조절된 재조합 미생물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 상기 재조합 미생물을 이용한 폴리올의 생산 방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 상기 재조합 미생물을 이용한 점액성 고분자의 생산 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은,
폴리올 또는 점액성 고분자의 생합성 경로를 갖는 미생물에 있어서, 글루코오즈-6-포스페이트를 엑소폴리사카라이드로 전환하는 경로, 글리세로포스페이트를 글리세롤로 전환하는 경로, 아세토인을 (2R,3S)-부탄다이올로 전환하는 경로, 아세토인을 (2R,3R)-부탄다이올로 전환하는 경로 및 글루탐산을 폴리글루탐산으로 전환하는 경로로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상이 억제된 것을 특징으로 하는, 폴리올 또는 점액성 고분자의 생성능이 조절된 재조합 미생물을 제공한다.
또한 본 발명은,
본 발명의 재조합 미생물을 준비하는 단계;및
상기 재조합 미생물을 탄소원을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는,
폴리올의 생산 방법을 제공한다.
또한 본 발명은,
본 발명의 재조합 미생물을 준비하는 단계;및
상기 재조합 미생물을 탄소원을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는,
점액성 고분자의 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 재조합 미생물은 폴리올 및 점액성 고분자를 동시에 생산할 수 있으며, 선택적으로 특정 종류의 폴리올 및/또는 점액성 고분자의 생산을 억제하거나 생산을 하지 않거나 생산을 증가시킬 수 있다.
도 1은 주요하게 생산되는 점액성 고분자와 폴리올의 대사회로와 상응하는 효소반응을 나타낸다.
도 2는 발효액으로부터 생성된 점액성 고분자와 폴리올의 동시회수방법을 나타낸다.
도 3은 점액성 고분자 중에서 레반과 폴리글루탐산의 13C-NMR 기반
분석방법을 나타낸다.
도 4는 점액성 고분자 중에서 Exopolysaccharide의 13C-NMR, 1H-NMR, 31P-NMR에 기반하여 단량체 동정방법을 나타낸다.
도 5는 저온조건 (30℃) 플라스크 배양에서 탄소원에 따라 비교예 1의 야생형 미생물과 실시예 1의 재조합 미생물의 폴리올 생성량 및 비율을 나타낸다.
도 6는 저온조건 (30℃) 플라스크 배양에서 탄소원에 따라 비교예 1의 야생형 미생물과 실시예 1의 재조합 미생물의 점액성 고분자 생성량 및 비율을 나타낸다.
도 7은 고온조건 (45℃) 플라스크 배양에서 탄소원에 따라 비교예 1의 야생형 미생물과 실시예 1의 재조합 미생물의 폴리올 생성량 및 비율을 나타낸다.
도 8은 고온조건 (45℃) 플라스크 배양에서 탄소원에 따라 비교예 1의 야생형 미생물과 실시예 1의 재조합 미생물의 폴리글루탐산, Exopolysaccharide, 폴리올의 생성량 변화를 나타낸다.
도 9은 자당(Sucrose)을 탄소원으로하는 저온조건 (30℃) 플라스크 배양에서 재조합 미생물의 폴리올 생성량 및 비율을 나타낸다.
도 10은 자당을 탄소원으로 하는 저온조건 (30℃) 플라스크 배양에서 재조합 미생물의 레반 생성량 및 비율을 나타낸다.
도 11은 포도당과 글루탐산을 탄소원으로하는 고온조건 (45℃) 플라스크 배양에서 재조합 미생물의 폴리올 생성량 및 비율을 나타낸다.
도 12은 포도당과 글루탐산을 탄소원으로하는 고온조건 (45℃) 플라스크 배양에서 재조합 미생물의 폴리글루탐산 생성량 및 비율을 나타낸다.
도 13은 포도당을 탄소원으로하는 저온조건 (30℃) 플라스크 배양에서 재조합 미생물의 폴리올 생성량 및 비율을 나타낸다.
도 14은 포도당을 탄소원으로하는 저온조건 (30℃) 플라스크 배양에서 재조합 미생물의 EPS 생성량 및 비율을 나타낸다.
도 15는 자당을 탄소원으로 하여 30℃ 저온배양 조건에서 실시예 8의 재조합 미생물의 발효를 통한 (2R,3S)-부탄다이올과 레반의 동시생산 결과이다.
도 16는 자당을 탄소원으로하여 45℃ 고온배양 조건에서 실시예 8의 재조합 미생물의 발효를 통한 (2R,3S)-부탄다이올과 레반의 동시생산 결과이다.
도 2는 발효액으로부터 생성된 점액성 고분자와 폴리올의 동시회수방법을 나타낸다.
도 3은 점액성 고분자 중에서 레반과 폴리글루탐산의 13C-NMR 기반
분석방법을 나타낸다.
도 4는 점액성 고분자 중에서 Exopolysaccharide의 13C-NMR, 1H-NMR, 31P-NMR에 기반하여 단량체 동정방법을 나타낸다.
도 5는 저온조건 (30℃) 플라스크 배양에서 탄소원에 따라 비교예 1의 야생형 미생물과 실시예 1의 재조합 미생물의 폴리올 생성량 및 비율을 나타낸다.
도 6는 저온조건 (30℃) 플라스크 배양에서 탄소원에 따라 비교예 1의 야생형 미생물과 실시예 1의 재조합 미생물의 점액성 고분자 생성량 및 비율을 나타낸다.
도 7은 고온조건 (45℃) 플라스크 배양에서 탄소원에 따라 비교예 1의 야생형 미생물과 실시예 1의 재조합 미생물의 폴리올 생성량 및 비율을 나타낸다.
도 8은 고온조건 (45℃) 플라스크 배양에서 탄소원에 따라 비교예 1의 야생형 미생물과 실시예 1의 재조합 미생물의 폴리글루탐산, Exopolysaccharide, 폴리올의 생성량 변화를 나타낸다.
도 9은 자당(Sucrose)을 탄소원으로하는 저온조건 (30℃) 플라스크 배양에서 재조합 미생물의 폴리올 생성량 및 비율을 나타낸다.
도 10은 자당을 탄소원으로 하는 저온조건 (30℃) 플라스크 배양에서 재조합 미생물의 레반 생성량 및 비율을 나타낸다.
도 11은 포도당과 글루탐산을 탄소원으로하는 고온조건 (45℃) 플라스크 배양에서 재조합 미생물의 폴리올 생성량 및 비율을 나타낸다.
도 12은 포도당과 글루탐산을 탄소원으로하는 고온조건 (45℃) 플라스크 배양에서 재조합 미생물의 폴리글루탐산 생성량 및 비율을 나타낸다.
도 13은 포도당을 탄소원으로하는 저온조건 (30℃) 플라스크 배양에서 재조합 미생물의 폴리올 생성량 및 비율을 나타낸다.
도 14은 포도당을 탄소원으로하는 저온조건 (30℃) 플라스크 배양에서 재조합 미생물의 EPS 생성량 및 비율을 나타낸다.
도 15는 자당을 탄소원으로 하여 30℃ 저온배양 조건에서 실시예 8의 재조합 미생물의 발효를 통한 (2R,3S)-부탄다이올과 레반의 동시생산 결과이다.
도 16는 자당을 탄소원으로하여 45℃ 고온배양 조건에서 실시예 8의 재조합 미생물의 발효를 통한 (2R,3S)-부탄다이올과 레반의 동시생산 결과이다.
본 발명은,
폴리올 또는 점액성 고분자의 생합성 경로를 갖는 미생물에 있어서, 글루코오즈-6-포스페이트를 엑소폴리사카라이드로 전환하는 경로, 글리세로포스페이트를 글리세롤로 전환하는 경로, 아세토인을 (2R,3S)-부탄다이올로 전환하는 경로, 아세토인을 (2R,3R)-부탄다이올로 전환하는 경로 및 글루탐산을 폴리글루탐산으로 전환하는 경로로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상이 억제된 것을 특징으로 하는, 폴리올 또는 점액성 고분자의 생성능이 조절된 재조합 미생물에 대한 것이다.
또한 본 발명은,
본 발명의 재조합 미생물을 준비하는 단계;및
상기 재조합 미생물을 탄소원을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는,
폴리올의 생산 방법에 대한 것이다.
또한 본 발명은,
본 발명의 재조합 미생물을 준비하는 단계;및
상기 재조합 미생물을 탄소원을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는,
점액성 고분자의 생산 방법에 대한 것이다.
이하, 본 발명을 자세히 설명한다.
폴리올 또는 점액성 고분자의 생성능이 조절된 재조합 미생물
본 발명은 폴리올 또는 점액성 고분자의 생합성 경로를 갖는 미생물에 있어서, 글루코오즈-6-포스페이트를 엑소폴리사카라이드로 전환하는 경로, 글리세로포스페이트를 글리세롤로 전환하는 경로, 아세토인을 (2R,3S)-부탄다이올로 전환하는 경로, 아세토인을 (2R,3R)-부탄다이올로 전환하는 경로 및 글루탐산을 폴리글루탐산으로 전환하는 경로로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상이 억제된 것을 특징으로 하는, 폴리올 또는 점액성 고분자의 생성능이 조절된 재조합 미생물에 대한 것이다.
상기 재조합 미생물은 재조합 바실러스일 수 있으며, 바람직하게는 재조합 바실러스 리케니포미스(Bacilluls licheniformis)일 수 있다.
본 발명의 재조합 미생물은 폴리올 및 점액성 고분자의 동시 생성능을 가질 수 있다.
상기 폴리올은 글리세롤, (2R, 3R)-부탄다이올, (2R,3S)-부탄다이올로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.
상기 점액성 고분자는 폴리글루탐산, 레반 및 엑소폴리사카라이드로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 상기 엑소폴리사카라이드는 글루코오스, 갈락토오스, 포스페이트, 글리세롤 및 아세트산으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 모노머를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 재조합 미생물은 폴리올 및 점액성 고분자를 동시에 생산할 수 있으며, 선택적으로 특정 종류의 폴리올 및/또는 점액성 고분자의 생산을 억제하거나 생산을 하지 않거나 생산을 증가시킬 수 있다. 그러므로 본 발명의 재조합 미생물은 폴리올 및 점액성 고분자의 동시 생산 및 선택적 생산이 가능하다.
본 발명의 재조합 미생물은 야생형 미생물에 비하여 글리세롤, (2R, 3R)-부탄다이올 및 (2R,3S)-부탄다이올로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리올의 생성능이 억제되거나 상기 하나 이상의 폴리올의 생성능이 없는 재조합 미생물일 수 있다.
한 구현예에서, 본 발명의 재조합 미생물은 글루코오즈-6-포스페이트를 엑소폴리사카라이드로 전환하는 경로가 억제되고,
글리세로포스페이트를 글리세롤로 전환하는 경로, 아세토인을 (2R,3S)-부탄다이올로 전환하는 경로, 아세토인을 (2R,3R)-부탄다이올로 전환하는 경로 및 글루탐산을 폴리글루탐산으로 전환하는 경로로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상이 억제된 것을 특징으로 하는, 폴리올 또는 점액성 고분자의 생성능이 조절된 재조합 미생물일 수 있다.
한 구현예에서, 본 발명의 재조합 미생물은 글루코오즈-6-포스페이트를 엑소폴리사카라이드로 전환하는 경로가 억제된 재조합 미생물로, 글리세로포스페이트를 글리세롤로 전환하는 경로, 아세토인을 (2R,3S)-부탄다이올로 전환하는 경로, 아세토인을 (2R,3R)-부탄다이올로 전환하는 경로 및 글루탐산을 폴리글루탐산으로 전환하는 경로는 억제되지 않는 재조합 미생물일 수 있다. 이때 상기 재조합 미생물은 야생형 미생물보다 총 폴리올, 글리세롤, (2R,3R)-부탄다이올, (2R,3S)-부탄다이올, 총 점액성 고분자 및/또는 레반의 생성능이 높을 수 있다. 또한 이때 상기 재조합 미생물은 야생형 미생물보다 EPS의 생성능이 낮을 수 있다.
한 구현예에서, 본 발명의 재조합 미생물은 글루코오즈-6-포스페이트를 엑소폴리사카라이드로 전환하는 경로, 및 글리세로포스페이트를 글리세롤로 전환하는 경로가 억제된 재조합 미생물로, 아세토인을 (2R,3S)-부탄다이올로 전환하는 경로, 아세토인을 (2R,3R)-부탄다이올로 전환하는 경로 및 글루탐산을 폴리글루탐산으로 전환하는 경로는 억제되지 않는 재조합 미생물일 수 있다. 이때 상기 재조합 미생물은 야생형 미생물보다 (2R,3R)-부탄다이올 및/또는 (2R,3S)-부탄다이올의 생성능이 높을 수 있다. 또한 이때 상기 재조합 미생물은 야생형 미생물보다 총 폴리올, 글리세롤, 총 점액성 고분자, 레반 및/또는 EPS의 생성능이 낮을 수 있다.
한 구현예에서, 본 발명의 재조합 미생물은 글루코오즈-6-포스페이트를 엑소폴리사카라이드로 전환하는 경로, 및 아세토인을 (2R,3S)-부탄다이올로 전환하는 경로가 억제된 재조합 미생물로, 글리세로포스페이트를 글리세롤로 전환하는 경로, 아세토인을 (2R,3R)-부탄다이올로 전환하는 경로 및 글루탐산을 폴리글루탐산으로 전환하는 경로는 억제되지 않는 재조합 미생물일 수 있다. 이때 상기 재조합 미생물은 야생형 미생물보다 (2R,3R)-부탄다이올, 총 점액성 고분자 및/또는 레반의 생성능이 높을 수 있다. 또한 이때 상기 재조합 미생물은 야생형 미생물보다 총 폴리올, 글리세롤, (2R,3S)-부탄다이올 및/또는 EPS의 생성능이 낮을 수 있다.
한 구현예에서, 본 발명의 재조합 미생물은 글루코오즈-6-포스페이트를 엑소폴리사카라이드로 전환하는 경로, 및 아세토인을 (2R,3R)-부탄다이올로 전환하는 경로가 억제된 재조합 미생물로, 글리세로포스페이트를 글리세롤로 전환하는 경로, 아세토인을 (2R,3S)-부탄다이올로 전환하는 경로 및 글루탐산을 폴리글루탐산으로 전환하는 경로는 억제되지 않는 재조합 미생물일 수 있다. 이때 상기 재조합 미생물은 야생형 미생물보다 (2R,3S)-부탄다이올의 생성능이 높을 수 있다. 또한 이때 상기 재조합 미생물은 야생형 미생물보다 총 폴리올, 글리세롤, (2R,3R)-부탄다이올, 총 점액성 고분자, 레반 및/또는 EPS의 생성능이 낮을 수 있다.
한 구현예에서, 본 발명의 재조합 미생물은 글루코오즈-6-포스페이트를 엑소폴리사카라이드로 전환하는 경로, 글리세로포스페이트를 글리세롤로 전환하는 경로, 및 글루탐산을 폴리글루탐산으로 전환하는 경로가 억제된 재조합 미생물로, 아세토인을 (2R,3S)-부탄다이올로 전환하는 경로 및 아세토인을 (2R,3R)-부탄다이올로 전환하는 경로는 억제되지 않는 재조합 미생물일 수 있다. 이때 상기 재조합 미생물은 야생형 미생물보다 (2R,3R)-부탄다이올, 총 점액성 고분자 및/또는 레반의 생성능이 높을 수 있다. 또한 이때 상기 재조합 미생물은 야생형 미생물보다 총 폴리올, 글리세롤, (2R,3S)-부탄다이올 및/또는 EPS의 생성능이 낮을 수 있다.
한 구현예에서, 본 발명의 재조합 미생물은 글루코오즈-6-포스페이트를 엑소폴리사카라이드로 전환하는 경로, 아세토인을 (2R,3R)-부탄다이올로 전환하는 경로 및 글루탐산을 폴리글루탐산으로 전환하는 경로가 억제된 재조합 미생물로, 글리세로포스페이트를 글리세롤로 전환하는 경로 및 아세토인을 (2R,3S)-부탄다이올로 전환하는 경로는 억제되지 않는 재조합 미생물일 수 있다. 이때 상기 재조합 미생물은 야생형 미생물보다 (2R,3S)-부탄다이올, 총 점액성 고분자 및/또는 레반의 생성능이 높을 수 있다. 또한 이때 상기 재조합 미생물은 야생형 미생물보다 총 폴리올, 글리세롤, (2R,3R)-부탄다이올 및/또는 EPS의 생성능이 낮을 수 있다.
한 구현예에서, 본 발명의 재조합 미생물은 글루코오즈-6-포스페이트를 엑소폴리사카라이드로 전환하는 경로, 글리세로포스페이트를 글리세롤로 전환하는 경로, 글루탐산을 폴리글루탐산으로 전환하는 경로 및 아세토인을 (2R,3S)-부탄다이올로 전환하는 경로가 억제된 재조합 미생물로, 아세토인을 (2R,3R)-부탄다이올로 전환하는 경로는 억제되지 않는 재조합 미생물일 수 있다. 이때 상기 재조합 미생물은 야생형 미생물보다 (2R,3R)-부탄다이올, 총 점액성 고분자 및/또는 레반의 생성능이 높을 수 있다. 또한 이때 상기 재조합 미생물은 야생형 미생물보다 총 폴리올, 글리세롤, (2R,3S)-부탄다이올 및/또는 EPS의 생성능이 낮을 수 있다.
한 구현예에서, 본 발명의 재조합 미생물은 글루코오즈-6-포스페이트를 엑소폴리사카라이드로 전환하는 경로, 글리세로포스페이트를 글리세롤로 전환하는 경로, 글루탐산을 폴리글루탐산으로 전환하는 경로 및 아세토인을 (2R,3R)-부탄다이올로 전환하는 경로가 억제된 재조합 미생물로, 아세토인을 (2R,3S)-부탄다이올로 전환하는 경로는 억제되지 않는 재조합 미생물일 수 있다. 이때 상기 재조합 미생물은 야생형 미생물보다 (2R,3S)-부탄다이올, 총 점액성 고분자 및/또는 레반의 생성능이 높을 수 있다. 또한 이때 상기 재조합 미생물은 야생형 미생물보다 총 폴리올, 글리세롤, (2R,3R)-부탄다이올, 및/또는 EPS의 생성능이 낮을 수 있다.
폴리올의 생합성 경로
본 발명의 폴리올의 생합성 경로는 미생물 내 특정 대사산물로부터 폴리올이 합성되는 경로를 의미한다. 예컨대, 미생물 내 특정 대사산물로부터 글리세롤이 합성되는 경로, 미생물 내 특정 대사산물로부터 (2R, 3R)-부탄다이올이 합성되는 경로, 미생물 내 특정 대사산물로부터 (2R,3S)-부탄다이올이 합성되는 경로 등일 수 있다.
점액성 고분자의 생합성 경로
본 발명의 점액성 고분자의 생합성 경로는 미생물 내 특정 대사산물로부터 점액성 고분자가 합성되는 경로를 의미한다. 예컨대, 미생물 내 특정 대사산물로부터 폴리글루탐산이 합성되는 경로, 미생물 내 특정 대사산물로부터 레반이 합성되는 경로, 미생물 내 특정 대사산물로부터 엑소폴리사카라이드가 합성되는 경로 등일 수 있다.
폴리올 또는 점액성 고분자의 생합성 경로를 갖는 미생물
본 발명의 폴리올 또는 점액성 고분자의 생합성 경로를 갖는 미생물은 상기 생합성 경로를 갖는 미생물이며, 바람직하게는 폴리올 및 점액성 고분자의 생합성 경로를 갖는 미생물이다. 상기 미생물은 폴리올 또는 점액성 고분자의 생합성 경로를 야생형으로 갖고 있는 미생물 또는 유전자 재조합에 의하여 갖게 되는 재조합 미생물일 수 있다. 예컨대, 본 발명의 미생물은 클렙시엘라(Klebsiella) 속, 바실러스(Bacillus) 속, 세라티아(Serratia) 속 또는 엔테로벡터 (Enterobacter) 속의 미생물일 수 있으며, 바람직하게는 바실러스 리케니포미스(B. licheniformis), 바실러스 서브틸리스(B. subtilis), 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 (B. amyloliquefaciens), 패니바실러스 폴리믹사 (P. polymyxa) 등이며, 가장 바람직하게는 바실러스 리케니포미스(B. licheniformis)이다. 바실러스 리케니포미스를 이용하여 본 발명의 재조합 미생물을 제조하는 것이 점액성 고분자 및/또는 폴리올의 산업적 규모의 생산에 유리하다.
도 1은 본 발명의 미생물, 바람직하게는 바실러스 리케니포미스에 있어서, 주요하게 생산되는 점액성 고분자와 폴리올의 대사회로, 그리고 이에 상응하는 효소반응을 나타낸다.
글루코오즈-6-포스페이트를 엑소폴리사카라이드로 전환하는 경로의 억제
엑소폴리사카라이드 합성효소 (Exopolysaccharide synthesis genes) 는 글루코오즈-6-포스페이트의 EPS로 전환을 조절한다. 엑소폴리사카라이드 합성효소를 코딩하는 유전자 중 epsAB 유전자를 결실시킴으로써 글루코오즈-6-포스페이트를 엑소폴리사카라이드로 전환하는 경로가 억제될 수 있다. 상기 epsAB의 억제는 엑소폴리사카라이드 합성효소의 발현억제, 엑소폴리사카라이드 합성효소의 효소활성 억제 등에 의하여 이루어질 수 있다. 예컨대, 엑소폴리사카라이드 합성효소를 코딩하는 유전자 중 epsAB를 결실시키거나 상기 유전자에 돌연변이(일부 염기를 변이, 치환 또는 삭제하거나 일부 염기를 도입하여 정상적인 유전자의 발현을 억제시키는 등의 돌연변이)를 일으키거나, 전사 과정 또는 번역 과정에서의 유전자 발현 조절 등, 당업자는 적절한 방법을 선택하여 엑소폴리사카라이드 합성효소를 억제할 수 있다.
글리세로포스페이트를 글리세롤로 전환하는 경로의 억제
글리세로포스파타아제(glycerophosphatase)는 글리세로포스페이트의 글리세롤로의 전환을 조절한다. 상기 글리세로포스파타아제를 억제함으로써 글리세로포스페이트를 글리세롤로 전환하는 경로가 억제될 수 있다. 상기 글리세로포스파타아제의 억제는 글리세로포스파타아제의 발현 억제, 글리세로포스파타아제의 효소 활성 억제 등에 의하여 이루어질 수 있다. 예컨대, 글리세로포스파타아제를 코딩하는 유전자인 dgp를 결실시키거나 상기 유전자에 돌연변이(일부 염기를 변이, 치환 또는 삭제하거나 일부 염기를 도입하여 정상적인 유전자의 발현을 억제시키는 등의 돌연변이)를 일으키거나, 전사 과정 또는 번역 과정에서의 유전자 발현 조절 등, 당업자는 적절한 방법을 선택하여 글리세로포스파타아제를 억제할 수 있다.
아세토인을 (2R,3S)-부탄다이올로 전환하는 경로의 억제
(2R,3S)-부탄다이올 디하드로제나아제 ((2R,3S)-butanediol dehydrogenase)는 아세토인의 (2R,3S)-부탄다이올로의 전환을 조절한다. 상기(2R,3S)-부탄다이올 디하드로제나아제를 억제함으로써 아세토인을 (2R,3S)-부탄다이올로 전환하는 경로가 억제될 수 있다. 상기 (2R,3S)-부탄다이올 디하드로제나아제의 억제는 (2R,3S)-부탄다이올 디하드로제나아제의 발현 억제, (2R,3S)-부탄다이올 디하드로제나아제의 효소 활성 억제 등에 의하여 이루어질 수 있다. 예컨대, (2R,3S)-부탄다이올 디하드로제나아제를 코딩하는 유전자인 budC를 결실시키거나 상기 유전자에 돌연변이(일부 염기를 변이, 치환 또는 삭제하거나 일부 염기를 도입하여 정상적인 유전자의 발현을 억제시키는 등의 돌연변이)를 일으키거나, 전사 과정 또는 번역 과정에서의 유전자 발현 조절 등, 당업자는 적절한 방법을 선택하여 글리세로포스파타아제를 억제할 수 있다.
아세토인을 (2R,3R)-부탄다이올로 전환하는 경로의 억제
(2R,3R)-부탄다이올 디하드로제나아제 ((2R,3R)-butanediol dehydrogenase)는 아세토인의 (2R,3R)-부탄다이올로의 전환을 조절한다. 상기(2R,3S)-부탄다이올 디하드로제나아제를 억제함으로써 아세토인을 (2R,3R)-부탄다이올로 전환하는 경로가 억제될 수 있다. 상기 (2R,3R)-부탄다이올 디하드로제나아제의 억제는 (2R,3R)-부탄다이올 디하드로제나아제의 발현 억제, (2R,3S)-부탄다이올 디하드로제나아제의 효소 활성 억제 등에 의하여 이루어질 수 있다. 예컨대, (2R,3R)-부탄다이올 디하드로제나아제를 코딩하는 유전자인 gdh를 결실시키거나 상기 유전자에 돌연변이(일부 염기를 변이, 치환 또는 삭제하거나 일부 염기를 도입하여 정상적인 유전자의 발현을 억제시키는 등의 돌연변이)를 일으키거나, 전사 과정 또는 번역 과정에서의 유전자 발현 조절 등, 당업자는 적절한 방법을 선택하여 글리세로포스파타아제를 억제할 수 있다.
글루탐산을 폴리글루탐산으로 전환하는 경로의 억제
폴리글루타메이트 신타아제(polyglutamate synthase)는 글루탐산의 폴리글루탐산으로의 전환을 조절한다. 상기 폴리글루타메이트 신타아제를 억제함으로써 글루탐산을 폴리글루탐산으로 전환하는 경로가 억제될 수 있다. 상기 폴리글루타메이트 신타아제의 억제는 폴리글루타메이트 신타아제의 발현억제, 폴리글루타메이트 신타아제의 효소활성 억제 등에 의하여 이루어질 수 있다. 예컨대, 폴리글루타메이트 신타아제를 코딩하는 유전자인 pgsBCAE를 결실시키거나 상기 유전자에 돌연변이(일부 염기를 변이, 치환 또는 삭제하거나 일부 염기를 도입하여 정상적인 유전자의 발현을 억제시키는 등의 돌연변이)를 일으키거나, 전사 과정 또는 번역 과정에서의 유전자 발현 조절 등, 당업자는 적절한 방법을 선택하여 폴리글루타메이트 신타아제를 억제할 수 있다.
폴리올의 생산 방법 및 점액성 고분자의 생산 방법
본 발명은 재조합 미생물을 준비하는 단계;및 상기 재조합 미생물을 탄소원을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 폴리올의 생산 방법에 대한 것이다.
또한 본 발명은 재조합 미생물을 준비하는 단계;및 상기 재조합 미생물을 탄소원을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 점액성 고분자의 생산 방법에 대한 것이다.
또한 본 발명은 재조합 미생물을 준비하는 단계;및 상기 재조합 미생물을 탄소원을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 폴리올 및 점액성 고분자의 동시 생산 방법에 대한 것이다.
상기 배양은 호기 조건에서 수행되며, 바람직하게는 미세호기적 조건(microaerobic condition)에서 수행된다. 예컨대, 상기 배양은 배양 시 산소, 즉 공기를 공급하면서 수행되며, 구체적인 예로서, 이는 교반을 통하여 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 재조합 미생물은 복합 배지에서 배양될 수 있으며, 복합 배지의 종류는 특별히 제한되지 않고 통상의 기술자는 일반적으로 시판, 사용되는 복합 배지를 적절히 선택하여 사용할 수 있다는 것은 자명하다.
상기 탄소원은 자당, 포도당 및 글루탐산으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다. 한 예에서 상기 탄소원은 자당, 포도당 및 글루탐산으로 구성되는 군으로부터 선택되는 둘 이상을 포함할 수 있다.
한 예에서, 엑소폴리사카라이드 생산을 위하여 탄소원으로 포도당을 이용할 수 있다. 한 예에서, 폴리글루탐산 생산을 위하여 포도당과 글루탐산을 동시에 탄소원으로 이용할 수 있다. 한 예에서 레반 생산을 위하여 자당을 탄소원으로 이용할 수 있다.
상기 배양은 25 내지 55 ℃에서 수행될 수 있다. 통상의 기술자는 원하는 폴리올 또는 점액성 고분자의 종류에 따라 배양 온도를 적절히 선택할 수 있다. 예컨대, 엑소폴리사카라이드를 높은 선택도로 생산하기 위하여 25 ℃ 이상 37 ℃ 이하의 온도에서 배양할 수 있다. 예컨대, 폴리글루탐산을 높은 선택도로 생산하기 위하여 37 ℃ 이상 55 ℃ 이하의 온도에서 배양할 수 있다. 레반은 25 내지 55 ℃의 전체 온도 범위에서 높은 선택도로 생산될 수 있다.
상기 폴리올의 생산 방법은 재조합 미생물을 배양하여 수득한 배양액으로부터 폴리올을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 또한 상기 점액성 고분자의 생산 방법은 재조합 미생물을 배양하여 수득한 배양액으로부터 폴리올을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또한 본 발명은 도 2와 같이 배양액으로부터 폴리올 및 점액성 고분자를 동시에 회수할 수 있다.
점액성 고분자를 회수하기 위하여 배양액의 원심분리를 통해 세포를 제거하고, 상등액에 2~3배수의 에탄올을 첨가하여 침전시킴으로써 고형물의 Crude 점액성 고분자를 얻고, 추가로 세척, 막투석 (Memebrane dialysis), 동결건조 (Lyophilization) 등의 후단 공정을 통해 고순도의 점액성 고분자를 얻을 수 있다. 또한 2,3-부탄다이올, 글리세롤과 같은 폴리올은 높은 비점 (180℃ 이상)의 특성을 이용하여 증류공정을 통해 최종적으로 고순도 폴리올 제품을 얻을 수 있다. 따라서, 세포가 제거된 발효액으로부터 침전을 통해 점액성 고분자는 회수하고, 남은 상등액으로부터 증류공정을 통해 폴리올을 회수하는 방식으로 두가지 다른 물질을 동시에 회수할 수 있다.
한 구현예에서, 배양액으로부터 원심분리 (3,500 rpm, 10분)를 통해 세포를 제거하고, 세포가 제거된 상등액에 2 내지 3배 부피의 에탄올을 첨가하여 점액성고분자를 침전시킨다. 침전된 점액성 고분자는 막여과 (membrane dialysis), 동결건조 (lyphylization) 등을 통해 가루분말 형태로 회수하고, 폴리올은 높은 비점의 특성을 이용하여 점액성 고분자가 제거된 잔여액으로부터 증류를 통해 회수할 수 있다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나, 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
<재료 및 방법>
대전 인근 토양 샘플로부터 분리한 야생형 균주인 바실러스 리케니포미스 GSC4071 (KCTC 14485BP) 을 준비하였다. 하기 실험예들에서 점액성 고분자(Viscous polymer)는 배양 후 세포를 제거하고, 에탄올 침전에 의해서 얻어지는 고형물을 총칭하며, 구체적으로는 폴리글루탐산 및 레반을 포함하며 그 외 다른 점액성 고분자들도 포함하는 여러 종류의 점액성 고분자의 총칭이다.
점액성 고분자 또는 폴리올의 농도(g/L), 수율(g/g) 및 선택도 (%)는 하기와 같이 계산하였다.
-점액성 고분자 또는 폴리올 농도(g/L): 단위 부피당 생산되는 점액성 고분자 또는 폴리올의 양
-점액성 고분자 또는 폴리올 수율(g/g): (점액성 고분자 또는 폴리올 생산량(g)/탄소원(g)) × 100
-점액성 고분자 또는 폴리올 선택도 (%): (특정 점액성 고분자 또는 폴리올 생산량(g)/전체 점액성 고분자 또는 폴리올 생산량(g)) × 100
<실험예 1>
바실러스 리케니포미스 GSC4071를 이용하여 재조합 균주들을 제작하였다.
<1-1> epsAB, dgp, budC, gdh, pgsBCAE가 결실된 재조합 B. 리케니포미스의 제작
표적 유전자의 상동 부위를 포함하는 DNA 단편 제작
바실러스 리케니포미스의 표적 유전자를 불활성화 시키기 위하여 박테리아의 재조합 기작을 이용하였고, 제거하고자 하는 유전자의 상동 부위 (homologous region)를 PCR로 증폭하였다. 그 후 상동 부위를 포함하는 해당 DNA 단편을 박테리아에 전달한 후, DNA 단편에 있는 유전자의 상동 부위와 바실러스 리케니포니스의 염색체에 있는 유전자 사이에 재조합 효소 (recombinase)에 의한 재조합 기작으로 표적 유전자를 제거하게 된다.
먼저, 바실러스 리케니포미스의 EPS 합성효소의 상동부위를 클로닝하기 위해 표적 유전자인 epsAB (서열번호 1)의 상동 부위 1(서열번호 2)을 서열번호 3 및 4의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 또한 epsAB의 상동 부위 2 (서열번호 5)를 서열번호 6 및 7의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 그 후, 상동 부위 1 및 2를 동시에 주형으로 하여 PCR로 증폭하여 상동 부위 1과 2가 포함된 DNA 단편(서열번호 8)을 완성하였다.
한편, 바실러스 리케니포미스의 폴리글루타메이트 신타제의 상동 부위를 클로닝하기 위하여 표적 유전자인 pgsBCAE(서열번호 9)의 상동 부위 1(서열번호 10)을 서열번호 11 및 12의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 또한, 상동 부위 2(서열번호 13)를 서열번호 14 및 15의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 그 후, 상동 부위 1 및 2를 동시에 주형으로 하여 PCR로 증폭하여 상동 부위 1과 2가 포함된 DNA 단편(서열번호 16)을 완성하였다.
한편, 바실러스 리케니포미스의 글리세로포스파타아제의 상동 부위를 클로닝하기 위하여 표적 유전자인 dgp (서열번호 17)의 상동 부위 1 (서열번호 18)을 서열번호 19 및 20의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 또한, 상동 부위 2 (서열번호 21)를 서열번호 22 및 23의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 그 후, 상동 부위 1 및 2를 동시에 주형으로 하여 PCR로 증폭하여 상동 부위 1과 2가 포함된 DNA 단편(서열번호 24)을 완성하였다.
한편, 바실러스 리케니포미스의 (2R, 3S)-부탄다이올 디하드로제나아제의 상동 부위를 클로닝하기 위하여 표적 유전자인 budC(서열번호 25)의 상동 부위 1(서열번호 26)을 서열번호 27 및 28의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 또한, 상동 부위 2(서열번호 29)를 서열번호 30 및 31의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 그 후, 상동 부위 1 및 2를 동시에 주형으로 하여 PCR로 증폭하여 상동 부위 1과 2가 포함된 DNA 단편(서열번호 32)을 완성하였다.
한편, 바실러스 리케니포미스의 (2R, 3R)-부탄다이올 디하드로제나아제의 상동 부위를 클로닝하기 위하여 표적 유전자인 gdh(서열번호 33)의 상동 부위 1(서열번호 34)을 서열번호 35 및 36의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 또한, 상동 부위 2(서열번호 37)를 서열번호 38 및 39의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 그 후, 상동 부위 1 및 2를 동시에 주형으로 하여 PCR로 증폭하여 상동 부위 1과 2가 포함된 DNA 단편(서열번호 40)을 완성하였다(표 1).
| 서열번호 | 서열 |
| 1 | atgaaagaaaatattgattttagagaactgattgcaatcttgcgaaaaagaacggttcttattctcgttttgacaataggtgtaacattgacgaccggaatcattcagttctatgtgctgacacctgtctatcaggcatcgacgcagatcttggtgcatcaagtaggggagaaaaaggggagcgccacatacagcgatattcaaatcaatcttcaatacacacggacattccaagcgcttttgaaaaacccggtgattttggagcaagtcaagagagagcttgatttaccttactctgcgggccggttgggtgaaaaaattgcaacgagcagtgaaagcgaatctgagattataaatatttcggtccaagatgaaaatcagaaacgggcggccgatatagcgaacactttaactgcggtgctcaaaaaagagattaagcaaattatgaacaccgatcgggtaaccgtcctgtcaaaagccgaaatagtcgattcgccgacacctgtcagaccgaattacaaaatgaatattttgctggcattcggcgccgcattaatgaccggaatcgctttggcgttctttttggactttatcgatgatacggttgcaagaccgtctcaagtcgaaaaggaagcgggattcatttatttgggaagtattgagcaaatgaagcataaaaaaagtctgtttcgcggggaccccgatatgaatatccgcgtaaaagcaggaaggagtgagccgcttgggtattagaaaaaaacgctctcgcaaatatcaatcggcgcttgtcgcattgcatcagccgaacacgccgatcgtcgaacagtatcggacgatcaggacgaacattgagttttcatcatttgagaagccgttcaagtcattgctcattacatcgggcctgccgggagaaggcaaatcattctcggcttcaaacttggcgatcgtattttcgcaacaggaaaaaaaggtccttttgatcgacgcagatttaagaaagccgacgatccataaaatttttgagctcgataaccattcaggcgtcacaaatgtattaatgaaaaaatcgacgctggaaaatgtcgtccagcaaagccaggcggaaaatctccatgtgctgacaagcggtccgattcctccgaatccgtccgagcttttgtcgtcgcaggcgatggaggacctgcttgcggaagcgtacgaccaatacgatttagtcatccttgattcgccgccgcttttgccggtcgcagacgcgcaaatattggcgaatcaggtggatggaagcattcttgtcatcctcagcggaaaaacaaagcttgataacgcgatcaagtctcgggacgcgctgaattcttccaaaagcgaactgctcggcgccgtgctgaacgggcggaaagtgaagaaagcgcgccaatataattacgcaaccatgtaa |
| 2 | gtacaagatgggttctccactcatcttcctgctcagtccggcgataaaggatcacttcggtatcaaacaattcctttaattcgactttcagcgcccgggagatttttttcaggaattcgactgacggatttctgtgaacgccgcgttcaattttgcttaaatatgattttgatacgcctgctatatcagcaagctggttaatggagtagccttttctctttctgtacattcggatgactcttccgatcatactgaatcctccccttcccttgccattcatataaaacgctttcctgttcattataagaaataatttgttctttataaaattcaaaaatttaagatatcgacagaaaataaaagaaaacgaacgaatttgttctctaaaaagaactatatagctaaattcagcatttttcaattcaaattttttcttttataatccaatcattaacaaacggcattcctgaggaggcagtcaagc |
| 3 | agacagggccaacgaggccgtacaagatgggttctccac |
| 4 | agccgcttcataagagcttgactgcctcctcag |
| 5 | tcttatgaagcggctgcagccgctttaggtgatgtctccttgcctttaccgatggaggcactcggctctaccgtgggcagactacctgtctgccttagacgcaagtcgtcgatggcggggcgtgaggacgggttaaatgcccatctttatttaatttacgtgctcggtttaaatttgaaaatcgcccgtatctttttagctcatgggattttgccctgaaagatcctatcagctagaaagatacattaggaggtaggaaattgacatatcggagaaggctttccattattaccgcactcgattcgtacttggttttgctgtccatctttatcggatatcagctgattttgccatcatatgatttatacccttcggaaatgctgctgatgacttcactgatactgcttggcgctcagcatttattcgcccattgcttccacctttataaaaaagtatgggagtatgcaagcatcggtgaattgtatgtgctgcttaaatcgattacattgtcccatcttgtgacggcggccctcgagctgtttttctttcaaaacgttccggttcgtcttttatgtttaagctggctgttccagctcattttgatcggcggatcgcggatgatgtggcgcatcatcagggaacaggtgaacaaagaaagcaaaggatctctaagggcgcttatcatcggagcgggctctgccggcagtttgattgcaaaacagcttgtg |
| 6 | aggaggcagtcaagctcttatgaagcggctgc |
| 7 | agacagggccttattggccgtcacaagatgggacaatg |
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| 38 | tgaaggggaattacctagacgaaaagccgtttccgtgaag |
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| 40 | aatgctgaagcgatttccaacaaggcgatccattggggtttttcaaaaagcaaaaaccatcagccggcagatgcgggtcaagagctgaacaaccttttacagcagtacgacgccttttatttgggcaacacaaaggaaaaaacgatctatctgacctttgataacggctatgaaaacggctacacccctcaggtgctcgatgttctgaaaaaacaaaacgtcaaagcggccttttttgtgacgggccattttgtcaaagatcagccggagctgatcaagcgaatggccgaggaggggcatatcatcgggaatcattcatatcaccatccggatctgacgacgaaaacaagccgcgtcattcaagaggaattggaatcggtcgatgaggaggtttacaaaatcacaggcgaaaaaaacaacctctacctgagaccgcctcggggcattttcagcgagcgggtgctcgaagaaacgaaaaagctcggctatcaaacggtattctggtctgttgcttttgtcgattggaaaatcaatgcccaaaaagggtggcgctatgcgtacgacaatatgatgaaacaggctcaccccggcgccatctatctgcttcacaccgtctcgagagacaatgccgaagcgcttgatcaggcgatcaccgacttgaaaaaagaaggttatacatttaaaagcctcgatgacctgatgtttgaaaaatctatgatgcttgagaccctttgaaagaacaatgccccggccgctttgccggggttttgctttggctgaaaaaattgatgcttcaggctctttttatttcccctagtcaattctatagaataaaaatccattttatatacatatattactagatttaaaaagaaaataggtatatcattgatagtgaaggggaattacctagacgaaaagccgtttccgtgaaggagcggctttctgctttgggttagtatattagtttgtgaatcggcggtctgtccgtgcttttgaatatgaattgtgtggtacgtttcccagagtaaaattatgaatttcttttatagcagtttcccaaaaacgagctgtttgactcgtgtgacagccgttcatttcaccactttaatcttcaacctcggctcttcttcaattccggatgcaaatgcatcctcatttcccggagccgtaaaggtgacgctgtacgtttcctgtgaatgcggcgacagttccagctcttccggctgaaagtcaaattcatttattatatcaggggtgagctggacgcgttcggtctttttcccgtagttgttgactttcacctcacagtccatgcttcctgcttccatatcgccctgatagctgcaagcgcttccccttttcatatattccacggcgctatcgccttgtgcattccatttttgaaagaacatcagctgttctgtgaccagcgggtaaaatactgaaataccgatgataaacaaaaacagcttaaagcggatccacggtactccataataatggcgccacgccataatgaagccggcgatgatcataaacatgcagatcagaaccactaaattccggatgggcagttttaaaaagcccgaaagcgcgtctgctacagacgcgccttgatgattctcggcgctgatcaacaggccgataacaatcatgatgatgccggcaagccctgtatgtaccttcatttctttccctcctcagttgtagaaatagtcgaacagagaggaaaaaggtttccggttttacttgaaaatgtcaaaccatcctttatgccggaaccagaagatcat |
<1-2> epsAB, pgsBCAE, dgp, budC, gdh가 결실된 재조합 B. 리케니포미스의 제작
상기 <1-1>에서 제작한 DNA 단편들을 전기 천공법 (electroporation, 25 uF, 200 Ω, 2.5 kV/cm)을 이용하여 바실러스 리케니포미스 GSC4071에 전달하였으며, 미생물의 재조합 기작을 이용하여 표적 유전자를 제거할 수 있었다.
야생형 바실러스 리케니포미스 GSC4071에 epsAB 유전자의 상동 부위를 포함하는 DNA 단편을 전달하여 epsAB 유전자를 제거한 재조합 바실러스 리케니포미스를 제작하였다. 이렇게 제작된 epsAB가 결실된 재조합 미생물을 실시예 1의 재조합 균주 (B. licheniformis 4071 ΔepsAB)로 사용하였다.
한편, 바실러스 리케니포미스 야생형에서 epsAB 유전자를 제거한 후, dgp 유전자의 상동 부위를 포함하는 DNA 단편을 전달하여 epsAB 유전자에 추가로 dgp 유전자가 제거된 바실러스 리케니포미스를 제작하였다. 이렇게 제작된 epsAB, dgp가 결실된 재조합 미생물을 실시예 2 균주 (B. licheniformis 4071 ΔepsAB Δdgp)로 사용하였다.
그리고, 바실러스 리케니포미스 야생형에서 epsAB 유전자를 제거한 후, budC 유전자의 상동 부위를 포함하는 DNA 단편을 전달하여 epsAB 유전자에 추가로 budC 유전자가 제거된 바실러스 리케니포미스를 제작하였다. 이렇게 제작된 epsAB, budC가 결실된 재조합 미생물을 실시예 3 균주 (B. licheniformis 4071 ΔepsAB ΔbudC)로 사용하였다.
그리고, 바실러스 리케니포미스 야생형에서 epsAB 유전자를 제거한 후, gdh 유전자의 상동 부위를 포함하는 DNA 단편을 전달하여 epsAB 유전자에 추가로 gdh 유전자가 제거된 바실러스 리케니포미스를 제작하였다. 이렇게 제작된 epsAB, gdh가 결실된 재조합 미생물을 실시예 4 균주 (B. licheniformis 4071 ΔepsAB Δgdh)로 사용하였다.
그리고, 바실러스 리케니포미스 야생형에서 epsAB, dgp 유전자를 제거한 후, pgsBCAE 유전자의 상동 부위를 포함하는 DNA 단편을 전달하여 epsAB, dgp 유전자에 추가로 pgsBCAE 유전자가 제거된 바실러스 리케니포미스를 제작하였다. 이렇게 제작된 epsAB, dgp, pgsBCAE가 결실된 재조합 미생물을 실시예 5 균주 (B. licheniformis 4071 ΔepsAB Δdgp ΔpgsBCAE)로 사용하였다.
그리고, 바실러스 리케니포미스 야생형에서 epsAB, gdh 유전자를 제거한 후, pgsBCAE 유전자의 상동 부위를 포함하는 DNA 단편을 전달하여 epsAB, gdh 유전자에 추가로 pgsBCAE 유전자가 제거된 바실러스 리케니포미스를 제작하였다. 이렇게 제작된 epsAB, gdh, pgsBCAE가 결실된 재조합 미생물을 실시예 6 균주 (B. licheniformis 4071 ΔepsAB Δgdh ΔpgsBCAE)로 사용하였다.
그리고, 바실러스 리케니포미스 야생형에서 epsAB, dgp, pgsBCAE 유전자를 제거한 후, budC 유전자의 상동 부위를 포함하는 DNA 단편을 전달하여 epsAB, dgp, pgsBCAE 유전자에 추가로 budC 유전자가 제거된 바실러스 리케니포미스를 제작하였다. 이렇게 제작된 epsAB, dgp, pgsBCAE, budC가 결실된 재조합 미생물을 실시예 7 균주 (B. licheniformis 4071 ΔepsAB Δdgp ΔpgsBCAE ΔbudC)로 사용하였다.
그리고, 바실러스 리케니포미스 야생형에서 epsAB, dgp, pgsBCAE 유전자를 제거한 후, gdh 유전자의 상동 부위를 포함하는 DNA 단편을 전달하여 epsAB, dgp, pgsBCAE 유전자에 추가로 gdh 유전자가 제거된 바실러스 리케니포미스를 제작하였다. 이렇게 제작된 epsAB, dgp, pgsBCAE, gdh 결실된 재조합 미생물을 실시예 8 균주 (B. licheniformis 4071 ΔepsAB Δdgp ΔpgsBCAE Δgdh)로 사용하였다.
그리고, 바실러스 리케니포미스 야생형에서 dgp 유전자의 상동 부위를 포함하는 DNA 단편을 전달하여 dgp 유전자를 제거한 후, budC 유전자의 상동 부위를 포함하는 DNA 단편을 전달하여, dgp 유전자 및 budC 유전자가 제거된 바실러스 리케니포미스를 제작하였다. 이렇게 제작된 dgp, budC가 결실된 재조합 미생물을 실시예 9 균주 (B. licheniformis 4071 Δdgp ΔbudC)로 사용하였다.
그리고, 바실러스 리케니포미스 야생형에서 dgp 유전자의 상동 부위를 포함하는 DNA 단편을 전달하여 dgp 유전자를 제거한 후, gdh 유전자의 상동 부위를 포함하는 DNA 단편을 전달하여, dgp 유전자 및 gdh 유전자가 제거된 바실러스 리케니포미스를 제작하였다. 이렇게 제작된 dgp, gdh가 결실된 재조합 미생물을 실시예 10 균주 (B. licheniformis 4071 Δdgp Δ gdh)로 사용하였다.
하기 실험예들에서는 이렇게 제작된 재조합 미생물을 이용하여 이렇게 제작된 재조합 미생물을 이용하여 하기 배양 및 분석 실험을 수행하였다. 이때, 야생형 균주인 바실러스 리케니포미스 GSC4071는 비교예 1로 사용하였다.
| 비교예 1 | 야생형 바실러스 리케니포미스 GSC4071 |
| 실시예 1 | B. 리케니포미스 4071 ΔepsAB |
| 실시예 2 | B. 리케니포미스 4071 ΔepsAB Δdgp |
| 실시예 3 | B. 리케니포미스 4071 ΔepsAB ΔbudC |
| 실시예 4 | B. 리케니포미스 4071 ΔepsAB Δgdh |
| 실시예 5 | B. 리케니포미스 4071 ΔepsAB Δdgp ΔpgsBCAE |
| 실시예 6 | B. 리케니포미스 4071 ΔepsAB Δgdh ΔpgsBCAE |
| 실시예 7 | B. 리케니포미스 4071 ΔepsAB Δdgp ΔpgsBCAE ΔbudC |
| 실시예 8 | B. 리케니포미스 4071 ΔepsAB Δdgp ΔpgsBCAE Δgdh |
| 실시예 9 | B. 리케니포미스 4071 Δdgp ΔbudC |
| 실시예 10 | B. 리케니포미스 4071 Δdgp Δgdh |
<실험예 2> 비교예 1 및 실시예 1의 미생물의 30℃ 저온배양을 통한 점액성 고분자 및 폴리올 생산능 평가
비교예 1의 야생형 바실러스 및 실시예 1의 재조합 바실러스 균주를 이용하여, 점액성 고분자 및 폴리올의 동시생산능을 평가하였다.
이들 미생물들에 대해 플라스크 배양을 수행하였다. 상기 미생물들의 배양은 하기와 같이 수행하였다.
먼저, 탄소원에 따른 점액성 고분자 생성영향을 확인하기 위하여, 포도당, 포도당+글루탐산, 자당, 자당+글루탐산을 각각 첨가한 배지에서 배양을 진행하였다.
상기 미생물들을 100 g/L 포도당 (glucose) 또는 동일한 농도의 자당 (sucrose)를 포함한 50 ml의 복합배지를 포함하는 250 ml의 플라스크에 접종하여 30℃에서 48 시간 동안 180 rpm 조건에서 배양하였다. 또한, 폴리글루탐산 생산을 위해서는 20 g/L 글루탐산을 배지에 추가로 첨가하였다. 배양 조건은 미세호기조건 이 유지될 수 있도록 하였고, 초기 pH 7.0으로 진행하였다. 상기 야생형 및 재조합 미생물에 대해 배양 종료 후 샘플을 채취하였으며, 채취된 시료는 13,000 rpm에서 10 분 동안 원심분리한 후 세포를 제거하고, 상층액은 액체크로마토그래피 (HPLC)로 분석하여 2,3-부탄다이올 및 글리세롤을 분석하였고, 상층액의 점액성 고분자 농도는 먼저 상층액을 에탄올 1:2 비율로 혼합한 후 24시간 동안 에탄올 침전 (ethanol precipitation) 시키고, 원심분리하여 고분자를 회수하였다. 투석 (membrane dialysis, 10kDa)을 통해 회수된 고분자로부터 저분자를 제거하였으며, 마지막으로 동결건조 (freeze drying)을 통해 건조중량을 측정하였다. 건조된 점액성 고분자 중 폴리글루탐산, 레반, EPS를 특정하기 위하여 NMR 분석을 통해 동정하였다.
그 결과, 비교예 1의 야생형 미생물을 포도당에서 배양시 총 폴리올은 38.87 g/L 였으며, 글리세롤 8.09 g/L, (2R,3R)-부탄다이올 16.48 g/L, (2R,3S)-부탄다이올 14 g/L 였다. 총 점액성고분자는 9.71 g/L 였으며, 모두 EPS로 확인되었다. 그러므로 비교예 1의 야생형 미생물을 포도당에서 30 ℃ 저온배양시 세가지 폴리올이 모두 생산되었으며, 점액성고분자는 EPS만 선택적으로 생산되는 것이 확인되었다.
비교예 1의 야생형 미생물을 포도당+글루탐산 배지에서 배양하였을 때는, 총 폴리올은 38.12 g/L 였으며, 글리세롤 8.24 g/L, (2R,3R)-부탄다이올 13.80 g/L, (2R,3S)-부탄다이올 16.08 g/L 였다. 총 점액성고분자는 10.71 g/L 였으며, 이중 PGA가 7.22 g/L (67.4%), EPS가 3.49 g/L (32.6%)로 생성되었다. 그러므로 비교예 1의 야생형 미생물을 30 ℃ 저온배양시 글루탐산을 배지에 첨가해야, PGA가 고선택도로 생성가능한 것을 확인 할 수 있었다.
비교예 1의 야생형 미생물을 자당에서 배양하였을 때, 총 폴리올은 35.61 g/L 였으며, 이중 글리세롤 7.97 g/L, (2R, 3R)-부탄다이올 13.78 g/L, (2R, 3S)-부탄다이올 13.85 g/L 였다. 총 점액성 고분자는 13.65 g/L 였으며, 이중 레반 11.18 g/L (81.9%), EPS 2.47 g/L (18.1%) 였다. 그러므로 비교예 1의 야생형 미생물을 자당에서 배양하였을 때, 레반이 우세하게 생성되는 것을 확인할 수 있었다.
마지막으로 비교예 1의 야생형 미생물을 자당+글루탐산 배지에서 배양하였을 때, 총 폴리올은 37.51 g/L 였으며, 이중 글리세롤 9.76 g/L, (2R, 3R)-부탄다이올 11.23 g/L, (2R, 3S)-부탄다이올 16.52 g/L 였다. 총 점액성고분자는 16.18 g/L 였으며, 이중 PGA 1.65 g/L (10.2%), 레반 10.40 g/L (64.3%), EPS 4.13 g/L (25.5%) 였다. 본 배양 조건에서는 세가지 폴리올과 세가지 점액성 고분자가 모두 생성되는 것을 확인할 수 있었다.
이어서, 실시예 1의 재조합 미생물을 이용한 배양시험을 진행하였다.
실시예 1의 재조합 미생물을 포도당 배지에서 배양하였을 때, 총 폴리올은 39.72 g/L 였으며, 이중 글리세롤 6.77 g/L, (2R, 3R)-부탄다이올 17.87 g/L, (2R, 3S)-부탄다이올 15.09 g/L 였다. 총 점액성 고분자는 0.88 g/L 수준이었으며 모두 EPS로 확인되었다. 이는 epsAB 유전자 결실을 통해 EPS 생성이 거의 억제될 수 있음을 보여준다.
실시예 1의 재조합 미생물을 포도당+글루탐산 배지에서 배양한 결과 총 폴리올은 41.67 g/L 였으며, 이중 글리세롤 8.31 g/L, (2R, 3R)-부탄다이올 16.22 g/L, (2R, 3S)-부탄다이올 17.14 g/L 였다. 총 점액성고분자는 1.82 g/L 였으며, 이중 PGA 1.30 g/L (71.4%), EPS 0.52 g/L (28.6%) 였다. epsAB 유전자를 제거함으로써 PGA 생성 비율은 소폭 상승하였으나, 전체적인 점액성 고분자 생성량이 줄어든 것을 확인할 수 있다. 이는 30℃ 저온배양의 영향으로 판단하고, 실험예 2에서 추가 시험을 진행하였다.
마지막으로 실시예 1의 재조합 미생물을 자당 배지에서 배양한 결과, 총 폴리올은 41.23 g/L 였으며, 이중 글리세롤 8.73 g/L, (2R, 3R)-부탄다이올 16.66 g/L, (2R, 3S)-부탄다이올 15.83 g/L 였다. 총 점액성고분자는 19.29 g/L 였으며, 이중 레반 18.72 g/L (97%), EPS 0.58 g/L (3%) 였다. 따라서 epsAB 유전자 결실을 통해 레반의 선택도 및 생성량이 크게 증가한 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해 30℃ 저온배양 조건에서 배지성분 및 epsAB 유전자 결실에 따른 폴리올 생성량의 변화는 크지 않았으나, 점액성 고분자는 크게 영향을 받는 것을 확인하였다.
결과적으로 비교예 1의 야생형 미생물은 포도당 배지에서 폴리올와 EPS를 선택적을 생성할 수 있었다. 30℃ 저온배양 조건에서 PGA의 경우 epsAB 유전자 결실에 따른 선택도 개선이 관찰되었으며, 그 생성량이 높지 않음을 알 수 있었다. 그러나 epsAB 유전자가 결실된 실시예 1의 재조합 미생물에 대하여 자당 포함 배지에서 30℃ 저온배양을 수행한 결과 고선택도 레반 생성이 가능한 것을 확인하였다. (표 3 및 표 4, 도 5 및 도 6).
| 탄소원 | 포도당 | 포도당+글루탐산 | 자당 | 자당+글루탐산 |
| 총 폴리올 (g/L) | 38.57 | 38.12 | 35.61 | 37.51 |
| 글리세롤 | 8.09 | 8.24 | 7.97 | 9.76 |
| (2R,3R)-부탄다이올 | 16.48 | 13.80 | 13.78 | 11.23 |
| (2R,3S)-부탄다이올 | 14.00 | 16.08 | 13.85 | 16.52 |
| 총 점액성고분자 (g/L) | 9.71 | 10.71 | 13.65 | 16.18 |
| PGA | 0.00 | 7.22 | 0.00 | 1.65 |
| 레반 | 0.00 | 0.00 | 11.18 | 10.40 |
| EPS | 9.71 | 3.49 | 2.47 | 4.13 |
비교예 1의 야생형 미생물의 탄소원에 따른 배양물 분석
| 탄소원 | 포도당 | 포도당+글루탐산 | 자당 |
| 총 폴리올 (g/L) | 39.72 | 41.67 | 41.23 |
| 글리세롤 | 6.77 | 8.31 | 8.73 |
| (2R,3R)-부탄다이올 | 17.87 | 16.22 | 16.66 |
| (2R,3S)- 부탄다이올 | 15.09 | 17.14 | 15.83 |
| 총 점액성고분자 (g/L) | 0.88 | 1.82 | 19.29 |
| PGA | 0.00 | 1.30 | 0.00 |
| 레반 | 0.00 | 0.00 | 18.72 |
| EPS | 0.88 | 0.52 | 0.58 |
실시예 1의 재조합 미생물의 탄소원에 따른 배양물 분석
<실험예 3> 비교예 1 및 실시예 1의 미생물의 45℃ 고온배양을 통한 점액성 고분자 및 폴리올 생산능 평가
비교예 1의 야생형 바실러스 및 실시예 1의 재조합 바실러스 균주를 45℃ 고온조건에서 배양하여 폴리올과 점액성 고분자 생성량 변화를 평가하였다. 모든 기본 조건은 실시예 1과 동일하게 진행하였으며, 배양 온도만 45 ℃로 변경하여 진행하였다.
그 결과, 비교예 1의 야생형 미생물은 포도당 배지에서 고온배양하였을 때 총 폴리올은 45.15 g/L 였으며, 이중 글리세롤 8.85 g/L, (2R, 3R)-부탄다이올 13.6 g/L, (2R, 3S)-부탄다이올 22.7 g/L 였다. 이로써 고온 배양에 따른 폴리올 총 생성량은 저온배양에 비해 증가하는 것을 확인하였다. 총 점액성 고분자는 5.06 g/L 였으며, 이중 PGA 는 3.69 g/L, EPS는 1.37 g/L 였다.
비교예 1의 야생형 미생물을 포도당+글루탐산 배지에서 고온 배양하였을 때 총 폴리올은 44.81 g/L 였으며, 이중 글리세롤 8.85 g/L, (2R, 3R)-부탄다이올 10.6 g/L, (2R, 3S)-부탄다이올 25.2 g/L 였다. 총 점액성 고분자는 5.47 g/L 였으며, 이중 PGA 는 3.98 g/L, EPS는 1.49 g/L 였다. 비교예 1의 야생형 미생물에 대한 저온 배양에서는 글루탐산 미첨가 배지 이용시 PGA가 전혀 생성되지 않았으나, 고온 배양에서는 글루탐산 첨가 없이도 PGA 생성이 가능함을 확인하였다.
이어서 실시예 1의 재조합 미생물을 이용하여 배양시험을 진행하였다.
실시예 1의 재조합 미생물을 포도당 배지에서 생산한 결과, 총 폴리올 생산량은 50.1 g/L, 이중 글리세롤 11.5 g/L, (2R, 3R)-부탄다이올 12.8 g/L, (2R, 3S)-부탄다이올 25.2 g/L 였다. 총 점액성 고분자는 2.64 g/L 였으며, 이중 PGA는 1.59 g/L, EPS 1.05 g/L 였다. 고온배양에 따라 epsAB가 결실되고, 글루탐산이 첨가되지 않은 배지에서도 PGA가 생성되는 것을 확인하였다.
실시예 1의 재조합 미생물을 포도당+글루탐산 배지에서 배양한 결과, 총 폴리올은 48.12 g/L, 이중 글리세롤 10.02 g/L, (2R,3R)-부탄다이올 11.5 g/L, (2R,3S)-부탄다이올 26.6 g/L 였다. 총 점액성 고분자는 5.45 g/L 였으며, 이중 PGA 5.10 g/L, EPS 0.35 g/L 였다. 포도당+글루탐산 배지에서 실시예 1의 재조합 미생물을 배양하였을 때 PGA의 선택도는 93%였으며, 비교예 1의 야생형 미생물의 73%보다 증가한 것을 확인할 수 있었다. 또한, 실시예 1의 재조합 미생물을 고온배양하였을 때, PGA의 선택도 뿐만 아니라 생산량도 크게 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
마지막으로 실시예 1의 재조합 미생물을 자당에서 배양한 결과, 총 폴리올 46 g/L, 이중 글리세롤 10.2 g/L, (2R, 3R)-부탄다이올 11.5 g/L, (2R, 3S)-부탄다이올 24.3 g/L 였다. 총 점액성 고분자는 15.47 g/L, 이중 15.31 g/L, EPS 0.154 g/L 였다. 레반의 경우, 저온 및 고온 조건 모두에서 고선택도 및 높은 생성량을 보이는 것을 확인할 수 있었다. (표 5, 도 7 및 8).
| 비교예 1 | 실시예 1 | ||||
| 포도당 | 포도당+글루탐산 | 포도당 | 포도당+글루탐산 | 자당 | |
| 총 폴리올 (g/L) | 45.15 | 44.81 | 50.1 | 48.12 | 46.00 |
| 아세토인(Acetoin) (g/L) | 1.68 | 3.45 | 1.29 | 2.48 | 2.30 |
| 글리세롤 | 8.85 | 9.01 | 11.5 | 10.02 | 10.20 |
| (2R,3R)-부탄다이올 | 13.6 | 10.6 | 12.8 | 11.5 | 11.50 |
| (2R,3S)-부탄다이올 | 22.7 | 25.2 | 25.8 | 26.6 | 24.30 |
| 총 점액성 고분자(Viscous polymer) (g/L) | 5.06 | 5.47 | 2.65 | 5.45 | 15.47 |
| PGA | 3.69 | 3.98 | 1.59 | 5.10 | 0 |
| 레반 | 0 | 0 | 0 | 0 | 15.31 |
| EPS | 1.37 | 1.49 | 1.05 | 0.35 | 0.154 |
<실험예 4> 레반 및 폴리올 선택도가 개선된 재조합 미생물 배양 평가
실험예 2과 3에서 점액성 고분자 생산량 및 선택도 개선에 대한 평가를 진행하였으며, 점액성 고분자 중 레반의 생산량 및 선택도가 가장 높은 것을 확인하였다. 이에, 비교예 1의 야생형 미생물에 추가적인 유전자 재조합을 수행하여 레반과 특정 폴리올의 선택적 동시생산 가능 여부를 확인하고자 하였다. 배양 시 탄소원은 자당을 이용하였으며, 그 외 실험조건은 실험예 1과 동일한 조건에서 수행하였다.
그 결과, 실시예 2의 재조합 미생물은 글리세롤 생성 억제를 위해 제작되었는데, 배양 결과 폴리올 중 글리세롤을 전혀 생산하지 않는 것이 확인되었다. 실시예 3의 재조합 미생물은 (2R, 3S)-부탄다이올 생성 억제를 위해 제작되었는데, 배양 결과 폴리올 중 (2R, 3S)-부탄다이올을 거의 생산하지 않는 것으로 확인되었다. 실시예 4의 재조합 미생물은 (2R, 3R)-부탄다이올 생성 억제를 위해 제작되었는데, 배양 결과 폴리올 중 (2R, 3R)-부탄다이올을 거의 생산하지 않는 것으로 확인되었다.
실시예 3의 재조합 미생물은 23.85 g/L의 레반 생성이 확인되었으나, 실시예 2 및 실시예 4의 재조합 미생물은 특정 폴리올 생성 유전자를 결실시킴에 따라 레반 생성량이 크게 억제되는 것이 확인되었다. 이로써 바이오필름(Biofilm)을 구성하는 요소들간의 조절기작에 의해 특정 폴리올 생성에 관여하는 유전자의 제거가 점액성 고분자 생성억제와 연결되어 있는 것이 확인되었다.
이러한 문제는 실시예 2의 재조합 미생물에서 pgsBCAE 유전자를 추가로 결실시킨 실시예 5의 재조합 미생물을 제작함으로써 해결하였다. pgsBCAE 유전자는 PGA 합성효소이며 PGA는 바이오필름을 형성하는 구성성분 중 하나이다. 실험적으로 pgsBCAE 유전자를 추가로 결실시키는 것이 점액성 고분자 생성능을 회복시킬 수 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 5의 재조합 미생물을 배양한 결과, 총 폴리올 29.87 g/L, 이중 (2R, 3R)-부탄다이올 16.15 g/L, (2R, 3S)-부탄다이올 13.71 g/L가 생성된 것이 확인되었으며, 글리세롤은 전혀 생성되지 않았다. 총 점액성 고분자는 22.18 g/L, 이중 레반 21.91 g/L, EPS 0.266 g/L가 생성되는 것이 확인되었다. 실시예 5의 재조합 미생물을 통하여 글리세롤이 제거된 폴리올과 레반의 선택적 동시생산이 가능하다는 것을 확인하였다.
실시예 6의 재조합 미생물은 실시예 4의 재조합 미생물에 pgsBCAE를 추가로 결실시켜 제작하였다. 그 결과, 총 폴리올 35.4 g/L, 이중 글리세롤 7.29 g/L, (2R,3S)-부탄다이올 28.1 g/L 가 생성되었다. 총 점액성 고분자는 25.59 g/L, 이중 레반 24.82 g/L, EPS 0.77 g/L가 생성되었다. (2R,3R)-부탄다이올을 제외한 폴리올과 레반을 선택적으로 동시생산할 수 있음을 확인하였다.
실시예 7의 재조합 미생물은 글리세롤 생성능이 억제되고, 점액성 고분자 생산능이 회복된 실시예 5의 재조합 미생물에서 budC 유전자를 추가로 결실하여 제작하였다. 실시예 7의 재조합 미생물의 배양 결과, 총 폴리올 25.47 g/L, 이중 글리세롤 0, (2R, 3R)-부탄다이올 25.34 g/L (99.5%), (2R, 3S)-부탄다이올 0.14 g/L (0.5%) 였다. 실시예 7의 재조합 미생물의 배양 결과, 점액성 고분자는 총 23.94 g/L, 이중 레반 23.15 g/L (96.7%), EPS 0.79 g/L (3.3%) 였다. 최종적으로 실시예 7의 재조합 미생물을 배양하여, 고선택도 (2R, 3R)-부탄다이올과 고선택도 레반을 동시에 생산할 수 있는 것을 확인하였다.
실시예 8의 재조합 미생물은 글리세롤 생성능이 억제되고, 점액성 고분자 생산능이 회복된 실시예 5의 재조합 미생물에서 gdh 유전자를 추가로 결실하여 제작 하였다. 실시예 8의 재조합 미생물의 배양 결과, 총 폴리올 25.4 g/L, 이중 글리세롤 0, (2R, 3R)-부탄다이올 0, (2R, 3S)-부탄다이올 25.4 g/L (100%) 였다. 실시예 8의 재조합 미생물의 배양 결과, 총 점액성 고분자 23.59 g/L, 이중 레반 22.41 g/L (95%), EPS 1.18 g/L (5%) 였다. 최종적으로 실시예 8의 재조합 미생물을 배양하여 고선택도 (2R, 3S)-부탄다이올과 고선택도 Levan을 동시에 생산할 수 있는 것이 확인되었다 (표 6, 도 9 및 10).
| 비교예 1 | 실시예 1 | 실시예 2 | 실시예 3 | 실시예 4 | 실시예 5 | 실시예 6 | 실시예 7 | 실시예 8 | |
| 총 폴리올 (g/L) | 35.61 | 41.23 | 32.85 | 28.72 | 30.95 | 29.87 | 35.40 | 25.47 | 25.40 |
| 글리세롤 (g/L) | 7.97 | 8.73 | 0.00 | 5.13 | 6.59 | 0.00 | 7.29 | 0.00 | 0.00 |
| (2R,3R)-부탄다이올(g/L) | 13.78 | 16.66 | 18.35 | 23.36 | 0.00 | 16.15 | 0.00 | 25.34 | 0.00 |
| (2R,3S)-부탄다이올(g/L) | 13.85 | 15.83 | 14.50 | 0.23 | 24.36 | 13.71 | 28.10 | 0.14 | 25.40 |
| 총 점액성 고분자(g/L) | 13.65 | 19.29 | 0.89 | 24.59 | 0.76 | 22.18 | 25.59 | 23.94 | 23.59 |
| PGA | 0.00 | 0.00 | - | - | - | - | - | - | - |
| 레반 | 11.18 | 18.72 | 0.36 | 23.85 | 0.51 | 21.91 | 24.82 | 23.15 | 22.41 |
| EPS | 2.47 | 0.58 | 0.54 | 0.74 | 0.26 | 0.27 | 0.77 | 0.79 | 1.18 |
<실험예 5> PGA 및 폴리올 선택도가 개선된 재조합 미생물 배양 평가
실험예 3에서 미생물의 45℃ 고온배양을 통한 점액성 고분자 및 폴리올 생산능 평가를 진행하였다. 포도당 배지에서 배양하였을 때, 실시예 1의 경우 글루탐산 첨가 없이도 PGA 생성이 가능하였으며, 글루탐산 첨가시 점액성 고분자 중 PGA를 높은 선택도 및 생산량을 얻을 수 있음을 확인하였다. 실시예 1 미생물을 기반으로 PGA와 폴리올의 선택적 동시생산 가능성을 확인하기 위한 실험을 진행하였다. 본 실험은 글루탐산을 첨가한 포도당 배지에서 45℃ 고온배양을 통해 진행하였다. 실시예 2, 실시예 3 및 실시예 4에 대해 비교 평가를 진행하였다.
실시예 2의 재조합 미생물을 배양한 결과, 총 폴리올 31.8 g/L, 이중 (2R, 3R)-부탄다이올 10.6 g/L, (2R, 3S)-부탄다이올 21.2 g/L가 생성된 것이 확인되었으며, 글리세롤은 전혀 생성되지 않았다. 총 점액성 고분자는 0.35 g/L이며 모두 EPS 가 생성되는 것이 확인되었다. 글리세롤 생성유전자인 dgp를 결실하였을 때, PGA를 포함한 점액성 고분자 생성량이 크게 억제되는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3의 재조합 미생물을 배양한 결과, 총 폴리올 48.3 g/L, 이중 (2R, 3R)-부탄다이올 35.4 g/L, (2R, 3S)-부탄다이올 1.1 g/L, 글리세롤 11.8 g/L가 생성되었다. (2R,3R)-부탄다이올을 높은 선택도로 생산할 수 있음을 확인하였다. 총 점액성 고분자는 6.35 g/L, 이중 PGA 6.15 g/L, EPS 0.20 g/L가 생성되는 것이 확인되었다. 전체적으로 (2R,3S)-부탄다이올 생성유전자인 budC를 결실하였을 때, (2R,3R)-부탄다이올 및 글리세롤과 PGA를 선택적으로 동시생산 가능함을 확인할 수 있었다.
실시예 4의 재조합 미생물을 배양한 결과, 총 폴리올 37.2 g/L, 이중 (2R, 3S)-부탄다이올 35.0 g/L, 글리세롤 2.2 g/L가 생성되었다. (2R,3R)-부탄다이올은 전혀 생성되지 않았다. 총 점액성 고분자는 0.45 g/L이며, 모두 EPS가 생성되는 것이 확인되었다. 실시예 4의 경우, (2R,2R)-부탄다이올 생성유전자인 gdh를 결실하였을 때, PGA를 포함한 점액성 고분자 생성이 크게 억제되는 것을 확인할 수 있었다 (표7, 도 11 및 도 12).
| 실시예 2 | 실시예 3 | 실시예 4 | |
| 총 폴리올 (g/L) | 31.8 | 48.3 | 37.2 |
| 글리세롤 (g/L) | 0 | 11.8 | 2.2 |
| (2R,3R)-부탄다이올 (g/L) | 10.6 | 35.4 | 0 |
| (2R,3S)-부탄다이올 (g/L) | 21.2 | 1.1 | 35 |
| 총 점액성 고분자 (g/L) | 0.35 | 6.35 | 0.45 |
| PGA | 0 | 6.15 | 0 |
| 레반 | 0 | 0 | 0 |
| EPS | 0.35 | 0.20 | 0.45 |
<실험예 6> EPS 및 폴리올 선택도가 개선된 재조합 미생물 배양 평가
실험예 2에서 비교예 1 미생물을 포도당 배지에서 30℃도 저온배양하였을 때 점액성 고분자 중 EPS만 생성가능함을 확인하였다. EPS와 (2R,3R)-부탄다이올 또는 (2R,3S)-부탄다이올의 선택적 동시생산 가능성을 확인하기 위해 실시예 9 및 실시예 10 미생물을 이용하여 배양시험을 진행하였다. 본 실험은 포도당 배지에서 30℃ 저온배양을 통해 진행하였다.
실시예 9의 재조합 미생물을 배양한 결과, 총 폴리올 28.1 g/L, 이중 (2R, 3R)-부탄다이올 27.8 g/L 및 (2R, 3S)-부탄다이올 0.3 g/L 가 생성되었다. 글리세롤은 전혀 생성되지 않았으며, (2R,3R)-부탄다이올을 높은 선택도로 생성할 수 있음을 확인하였다. 총 점액성 고분자는 7.22 g/L 였으며 모두 EPS로 확인되었다. 이를 통해 (2R,3R)-부탄다이올과 EPS를 선택적으로 동시생산할 수 있음을 확인하였다.
실시예 10의 재조합 미생물을 배양한 결과, 총 폴리올 26.1 g/L 이었으며, 모두 (2R, 3S)-부탄다이올로 확인되었다. (2R,3R)-부탄다이올 및 글리세롤은 전혀 생성되지 않았으며, (2R,3S)-부탄다이올을 높은 선택도로 생성할 수 있음을 확인하였다. 총 점액성 고분자는 6.56 g/L 였으며 모두 EPS로 확인되었다. 이를 통해 (2R,3S)-부탄다이올과 EPS를 선택적으로 동시생산할 수 있음을 확인하였다 (표 8, 도 13 및 도 14).
| 실시예 9 | 실시예 10 | |
| 총 폴리올 (g/L) | 28.1 | 26.1 |
| 글리세롤 (g/L) | 0 | 0 |
| (2R,3R)-부탄다이올 (g/L) | 27.8 | 0 |
| (2R,3S)-부탄다이올 (g/L) | 0.3 | 26.1 |
| 총 점액성 고분자 (g/L) | 7.22 | 6.56 |
| PGA | 0 | 0 |
| 레반 | 0 | 0 |
| EPS | 7.22 | 6.56 |
<실험예 7> 레반 및 (2R, 3S)-부탄다이올의 선택적 동시생산을 위한 유가식 발효 배양
레반 및 (2R, 3S)-부탄다이올의 고선택도 동시생산능 검증을 위해 실시예 8의 재조합 미생물을 자당 배지 조건에서 유가식 발효하여 발효 성능을 평가하였다.
미생물의 발효실험은 하기와 같이 수행하였다.
먼저, 실시예 8의 재조합 미생물을 300 ml의 복합배지를 포함하는 1L의 플라스크에 접종하여 30℃ 또는 45℃에서 16 시간 동안 180 rpm 조건에서 배양하였다. 배양한 미생물은 최종배양액의 부피가 3L가 되도록 7.5L 용량의 발효기에 접종하였다. 초기 조건으로 pH 7.0, 온도 30℃ 또는 45℃, 550 rpm, 산소 1vvm 조건으로 진행하였다. 초기 자당의 농도는 100 g/L 로 진행하였다. 배양 진행 중 아세토인 (acetoin) 양이 10g/L 이상이 되면 교반속도를 350 rpm으로 낮추는 2단계 발효를 진행하였으며, 배양액 내 당의 농도가 20 g/L 이하로 내려갈 시 150 g의 자당 파우더를 추가 피딩(feeding)하여 진행하였다. 발효 진행 중 4시간 간격으로 샘플을 채취하였으며, 세포 생장은 spectrophotometer를 통해 OD600 값으로 측정하였고, 채취된 시료는 13,000 rpm에서 10 분 동안 원심분리한 후, 상층액의 (2R, 3S)-부탄다이올 농도를 액체크로마토그래피(HPLC)로 분석하였다. 레반은 에탄올 침전을 통한 회수 및 NMR 분석을 통해 정량하였다. 그 결과, 30℃ 저온배양 유가식 발효를 진행하였을 때, (2R, 3S)-부탄다이올 생산량은 41.8 g/L, 레반 생산량은 27 g/L 였다. 반면, 45℃ 고온배양 유가식 발효를 진행하였을 때는, (2R, 3S)-부타다이올 생산량은 88.6 g/L, 레반은 71 g/L 이었다. 저온 및 고온배양 조건 모두에서 점액성 고분자 및 폴리올 중 레반과 (2R, 3S)-부탄다이올은 99% 이상의 선택도로 생산되었다. 저온배양에 비해 고온배양에서 레반 및 (2R, 3S)-부탄다이올 생산량이 2배 가량 높았다. 이는 실시예 8의 재조합 미생물이 고온에서 빠르게 생장하고 대사속도가 월등이 빠르기 때문으로 파악되었다. 또한 점액성 고분자와 폴리올을 선택적으로 동시생산하는데 있어 산업적 수준의 고농도 생산이 가능한 것으로 확인되었다. (표 9, 도 15 및 16).
| (2R,3S)-부탄다이올 (g/L) |
폴리올 선택도 (%) | 레반 (g/L) |
점액성 고분자 선택도 (%) | |
| 30℃ 발효 | 41.8 | >99% | 27 g/L | >99% |
| 45℃ 발효 | 88.6 g/L | >99% | 71 g/L | >99% |
<서열목록 프리텍스트>
서열번호 1: epsAB의 염기서열이다.
서열번호 2: epsAB의 상동 부위 1의 염기서열이다.
서열번호 3: epsAB의 상동 부위 1을 PCR로 증폭하기 위한 프라이머의 염기서열이다.
서열번호 4: epsAB의 상동 부위 1을 PCR로 증폭하기 위한 프라이머의 염기서열이다.
서열번호 5: epsAB의 상동 부위 2의 염기서열이다.
서열번호 6: epsAB의 상동 부위 2를 PCR로 증폭하기 위한 프라이머의 염기서열이다.
서열번호 7: epsAB의 상동 부위 2를 PCR로 증폭하기 위한 프라이머의 염기서열이다.
서열번호 8: epsAB의 상동 부위 1 및 2가 포함된 DNA 단편의 염기서열이다.
서열번호 9: pgsBCAE의 염기서열이다.
서열번호 10: pgsBCAE의 상동 부위 1의 염기서열이다.
서열번호 11: pgsBCAE의 상동 부위 1을 PCR로 증폭하기 위한 프라이머의 염기서열이다.
서열번호 12: pgsBCAE의 상동 부위 1을 PCR로 증폭하기 위한 프라이머의 염기서열이다.
서열번호 13: pgsBCAE의 상동 부위 2의 염기서열이다.
서열번호 14: pgsBCAE의 상동 부위 2를 PCR로 증폭하기 위한 프라이머의 염기서열이다.
서열번호 15: pgsBCAE의 상동 부위 2를 PCR로 증폭하기 위한 프라이머의 염기서열이다.
서열번호 16: pgsBCAE의 상동 부위 1 및 2가 포함된 DNA 단편의 염기서열이다.
서열번호 17: dgp의 염기서열이다.
서열번호 18: dgp의 상동 부위 1의 염기서열이다.
서열번호 19: dgp의 상동 부위1을 PCR로 증폭하기 위한 프라이머의 염기서열이다.
서열번호 20: dgp의 상동 부위1을 PCR로 증폭하기 위한 프라이머의 염기서열이다.
서열번호 21: dgp의 상동 부위 2의 염기서열이다.
서열번호 22: dgp의 상동 부위 2를 PCR로 증폭하기 위한 프라이머의 염기서열이다.
서열번호 23: dgp의 상동 부위 2를 PCR로 증폭하기 위한 프라이머의 염기서열이다.
서열번호 24: dgp의 상동 부위 1 및 2가 포함된 DNA 단편의 염기서열이다.
서열번호 25: budC의 염기서열이다.
서열번호 26: budC의 상동 부위 1의 염기서열이다.
서열번호 27: budC의 상동 부위 1을 PCR로 증폭하기 위한 프라이머의 염기서열이다.
서열번호 28: budC의 상동 부위 1을 PCR로 증폭하기 위한 프라이머의 염기서열이다.
서열번호 29: budC의 상동 부위 2의 염기서열이다.
서열번호 30: budC의 상동 부위 2를 PCR로 증폭하기 위한 프라이머의 염기서열이다.
서열번호 31: budC의 상동 부위 2를 PCR로 증폭하기 위한 프라이머의 염기서열이다.
서열번호 32: budC의 상동 부위 1 및 2가 포함된 DNA 단편의 염기서열이다.
서열번호 33: gdh의 염기서열이다.
서열번호 34: gdh의 상동 부위 1의 염기서열이다.
서열번호 35: gdh의 상동 부위 1을 PCR로 증폭하기 위한 프라이머의 염기서열이다.
서열번호 36: gdh의 상동 부위 1을 PCR로 증폭하기 위한 프라이머의 염기서열이다.
서열번호 37: gdh의 상동 부위 2의 염기서열이다.
서열번호 38: gdh의 상동 부위 2를 PCR로 증폭하기 위한 프라이머의 염기서열이다.
서열번호 39: gdh의 상동 부위 2를 PCR로 증폭하기 위한 프라이머의 염기서열이다.
서열번호 40: gdh의 상동 부위 1 및 2가 포함된 DNA 단편의 염기서열이다.
기탁기관명 : 한국생명공학연구원
수탁번호 : KCTC14485BP
수탁일자 : 20210305
<110> GS CALTEX CORPORATION
<120> RECOMBINANT MICROORGANISM WITH CONTROLLED PRODUCTION ABILITY OF
POLYOL AND VISCOUS POLYMER
<130> DNP210109
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<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 1435
<212> DNA
<213> Bacillus licheniformis
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atgaaagaaa atattgattt tagagaactg attgcaatct tgcgaaaaag aacggttctt 60
attctcgttt tgacaatagg tgtaacattg acgaccggaa tcattcagtt ctatgtgctg 120
acacctgtct atcaggcatc gacgcagatc ttggtgcatc aagtagggga gaaaaagggg 180
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ctcaaaaaag agattaagca aattatgaac accgatcggg taaccgtcct gtcaaaagcc 480
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gtacaagatg ggttctccac tcatcttcct gctcagtccg gcgataaagg atcacttcgg 60
tatcaaacaa ttcctttaat tcgactttca gcgcccggga gatttttttc aggaattcga 120
ctgacggatt tctgtgaacg ccgcgttcaa ttttgcttaa atatgatttt gatacgcctg 180
ctatatcagc aagctggtta atggagtagc cttttctctt tctgtacatt cggatgactc 240
ttccgatcat actgaatcct ccccttccct tgccattcat ataaaacgct ttcctgttca 300
ttataagaaa taatttgttc tttataaaat tcaaaaattt aagatatcga cagaaaataa 360
aagaaaacga acgaatttgt tctctaaaaa gaactatata gctaaattca gcatttttca 420
attcaaattt tttcttttat aatccaatca ttaacaaacg gcattcctga ggaggcagtc 480
aagctcttat gaagcggctg cagccgcttt aggtgatgtc tccttgcctt taccgatgga 540
ggcactcggc tctaccgtgg gcagactacc tgtctgcctt agacgcaagt cgtcgatggc 600
ggggcgtgag gacgggttaa atgcccatct ttatttaatt tacgtgctcg gtttaaattt 660
gaaaatcgcc cgtatctttt tagctcatgg gattttgccc tgaaagatcc tatcagctag 720
aaagatacat taggaggtag gaaattgaca tatcggagaa ggctttccat tattaccgca 780
ctcgattcgt acttggtttt gctgtccatc tttatcggat atcagctgat tttgccatca 840
tatgatttat acccttcgga aatgctgctg atgacttcac tgatactgct tggcgctcag 900
catttattcg cccattgctt ccacctttat aaaaaagtat gggagtatgc aagcatcggt 960
gaattgtatg tgctgcttaa atcgattaca ttgtcccatc ttgtgacggc ggccctcgag 1020
ctgtttttct ttcaaaacgt tccggttcgt cttttatgtt taagctggct gttccagctc 1080
attttgatcg gcggatcgcg gatgatgtgg cgcatcatca gggaacaggt gaacaaagaa 1140
agcaaaggat ctctaagggc gcttatcatc ggagcgggct ctgccggcag tttgattgca 1200
aaacagcttg tg 1212
<210> 9
<211> 3001
<212> DNA
<213> Bacillus licheniformis
<400> 9
atgtgggtaa tgctattagc ctgtgtgatc gttgttggga tcggcattta tgaaaaaagg 60
cgccaccagc aaaatatcga tgcgctgcct gtccgagtga acatcaacgg tatacgcgga 120
aagtccacgg tgacaagatt aacaacaggg atattaatcg aagcaggcta caaaacagta 180
ggaaaaacaa ccgggacaga cgcaaggatg atttattggg acacaccgga agagaagccg 240
atcaaaagaa agccgcaagg gccgaatatc ggagagcaga aggaggttat gaaagaaacg 300
gtggaaagag gggccaatgc gattgtcagt gagtgcatgg ccgttaatcc tgattaccaa 360
atcatctttc aggaagaatt gcttcaggct aatatcggcg tgatcgtgaa cgtgctggag 420
gatcacatgg atgtgatggg accgactttg gatgaaatcg cagaagcatt cacagcaacc 480
attccttata atggacattt ggttattact gatagtgagt ataccgattt ctttaagcaa 540
attgcaaaag aaaggaacac aaaagtcatc gtcgcagaca attctaaaat aacagatgaa 600
tacctcagac agtttgagta catggtattc cctgataatg cgtctcttgc gctcggtgta 660
gctcaagcgt tgggcattga cgaagaaacc gcctttaaag gcatgctgaa tgcgccgcct 720
gatccgggag ccatgagaat tctgccgctg atgaacgcca agaatcccgg acatttcgtc 780
aacggttttg cggccaatga cgcagcttcc actttaaaca tttggaagcg tgtaaaagaa 840
ataggctatc ctacggatca gccgatcgtc attatgaact gccgcgccga cagggtagac 900
agaacacagc agtttgcgga agatgtcctt ccttatattg aagcaagtga acttgtgctg 960
attggagaaa caacagagcc gatcgtcaaa gcatatgaag caggcaaaat tcctgcggac 1020
aagctgtttg attttgagca caaatcaacg gaagaaatca tgttcatgct gaaaaacaag 1080
cttgagggcc gcgttattta cggagtcgga aatatccacg gagcagcgga gcctctcatt 1140
gaaaaaatac aagattacaa gattaagcag ctcgttagct aggaggaaga aaacacaatg 1200
tttggatcag atttatatat cgccctcatt ttaggagtct tactcagttt gatttttgcg 1260
gagaaaacgg gaattgtacc agccggcctc gtcgtaccgg gttatttggg acttgtcttc 1320
aatcagccga ttttcatgct gctcgttctt tttgtcagtt tgctgacgta tgtcatcgtg 1380
aaattcggac tttccaaaat tatgattcta tacggacgca gaaaattcgc agcaatgctg 1440
attacgggaa ttcttttgaa aatcggtttt gattttatat atccggtgat gccgtttgag 1500
attgccgaat tcaggggaat cggaatcatc gtgccggggc tgatcgccaa taccattcaa 1560
agacagggat taacgattac gcttggaagt acgcttttat tgagcggagc aacattcgtc 1620
attatgtatg cttactatct aatctaaagt taggtgtgtc aaatcgatga aaaaacaact 1680
gaactttcag gaaaaactgc tgaagttgac gaagcaggag aaaaagaaaa caaacaagca 1740
cgtctttatc gtattgcccg ttattttctg tttaatgttt gtctttactt gggtcggaag 1800
cgccaaaact ccttcgcaaa tggacaaaaa agaagatgcc aagcttacag ctacttttgt 1860
tggcgatatc atgatgggaa gaaacgtaga aaaagtgaca aacttgcacg gttcggaaag 1920
tgtcttcaaa aatgtgaagc cgtactttaa tgtgtcagat tttatcacag gaaactttga 1980
aaaccctgta accaatgcaa aggactatca agaggcagaa aagaacatcc atctgcaaac 2040
gaatcaagaa tcagtcgaaa cattgaaaaa gctgaacttc agcgtactga attttgccaa 2100
caaccatgcg atggactacg gggaagacgg tttgaaggat acgctcaata aattttcaaa 2160
tgagaatctg gagcttgtcg gagcaggaaa taatcttgaa gacgcgaaac agcacgtatc 2220
ctatcagaat gtgaacggcg taaaaattgc aacgctcggt tttacagacg tctacacaaa 2280
gaactttaca gccaaaaaga acagaggcgg agtgctgccg ctcagtccga aaatctttat 2340
tccaatgatt gcggaagcat cgaaaaaagc ggatcttgtc cttgtccatg tgcactgggg 2400
acaagaatat gacaatgaac cgaacgacag acagaaggat ctggccaagg cgattgcaga 2460
tgccggagca gatgtcatca tcggcgctca tccccatgtt ctcgaaccga tcgaagtgta 2520
taacggtact gtgattttct acagcctcgg caactttgta tttgatcagg gctggtcaag 2580
aacacgggac agcgcgcttg tacaatacca tttaatgaat gacggcaaag ggcgttttga 2640
ggtaacgcct ctcaacattc gcgaagcaac gccgacgcct ttaggcaaga gcgacttctt 2700
aaaacgaaaa gcgatcttcc gtcaattgac aaaaggaaca aacctcgact ggaaagaaga 2760
gaacggaaaa ttaacgtttg aagtcgatca tgcggacaag ctgaaaaaat aataaaaacg 2820
gagtggtgaa caaatgaaat ttgtcagagc catttggccg ttcgtaggtt tagttttgat 2880
cattgcattc atgtctgctt tcaagtattc tgatgaattg tcaaacgatg aaaaagctaa 2940
aatctctacg gagatccaaa aagtgaatca gcaggatcaa acaacagaaa acaagcaata 3000
a 3001
<210> 10
<211> 792
<212> DNA
<213> Bacillus licheniformis
<400> 10
aagccttctc ctctctattt gtgtaaccgt ttacataaag attatcacga tccatttaaa 60
atcacaataa aaaaatggat gaacactgaa attttagacc gggctgggat atcgagacat 120
atataggggc gtttaatggc gaatacagta acaatgagaa tagtaagaaa aattaaaaat 180
gttaaagttt gatgaattat cattgaaaaa aattaatggc tttttaaatc ctaggatttt 240
aacctaaaat ctgaagaaat aaggtggatc gaacgactca caaaatattt ggatttgtca 300
atgaatcccg ctttatgcta aaagagattt tcattttttg atagatggtc tgattgtcat 360
aggacggatt tgttttgaag agggaacatt ggtgactttt taacctgttc gaaaagagcg 420
aaaatactaa aagaaaagag agatcccggc tgacagccca tttaaagggg attgcggacg 480
ggggaaaaaa gagatcctga atccatcctt caacctttca tctgaaatag ggagaaaagt 540
acaaaaatca taatgtcgaa ttttgaaagc gcatacttaa aacgctgaca aaaatctgat 600
aggaattaag aactttcgat ttccaaaaat atcaataaaa agataggcat taatgactcg 660
ggcgaggtga tctttgtcac ggaaaatttc gtcgtcttct gttacataat gccgattgtg 720
atttcatagt gaacctatat actgatgaat gaatttacat atcagattcc aagaaggaga 780
tgtagacaaa ca 792
<210> 11
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of primer for amplifying homologous region 1
of pgsBCAE
<400> 11
agacagggcc aacgaggcca agccttctcc tctctatttg tgtaac 46
<210> 12
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of primer for amplifying homologous region 1
of pgsBCAE
<400> 12
cggcactctc ttttgcactg tgtttgtcta catctccttc 40
<210> 13
<211> 735
<212> DNA
<213> Bacillus licheniformis
<400> 13
cagtgcaaaa gagagtgccg ccggcgctct cttttttgtg tgctgatccc ggttataaaa 60
gacctgtgaa aagcgaccgg tttgaaaggg aaacacgaca attttcttaa ccggtcagtg 120
tataaagttt tatagaaaat caggaggata tatacatggt tttggggttc atgtttattg 180
tattcttttg aagggaataa aaactgacaa atttcgactg aagcaaaatt tgaaaatgca 240
tcaccttacc aattcgggat gggaaccgca cctcatgttc atgacctctt tagaatattt 300
cccttcatct ttttaatctg cgcttaggtg aaaaagctga tcatgctgtg ctgagcgttt 360
cttctcgcta tgacgctgct gtacatgcaa aaaaagtcct ttaaatatcc cagttgaatg 420
acgatgaaag aggaaagaag aggaggaaca gatcaattga taaaaaaagc ggcaaacaaa 480
aagttggttt tgttttgtgg aattgcggtg ctttggatgt ctttattttt aacgaatcat 540
aatgatgtac gcgccgatac gatcggcgag aaaatagcgg aaactgccag acagcttgag 600
ggtgcgaaat acagctacgg cggagagaag ccgaaaacgg ggtttgactc gtcaggcttt 660
gtgcaatatg tgtttcaatc gctcgatatt acgcttccga gaacggtaaa ggaacaatcg 720
actcttggga gcagt 735
<210> 14
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of primer for amplifying homologous region 2
of pgsBCAE
<400> 14
gaaggagatg tagacaaaca cagtgcaaaa gagagtgccg 40
<210> 15
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of primer for amplifying homologous region 2
of pgsBCAE
<400> 15
agacagggcc ttattggcca ctgctcccaa gagtcgattg ttc 43
<210> 16
<211> 1527
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence comprising homologous region 1 and 2 of
pgsBCAE
<400> 16
aagccttctc ctctctattt gtgtaaccgt ttacataaag attatcacga tccatttaaa 60
atcacaataa aaaaatggat gaacactgaa attttagacc gggctgggat atcgagacat 120
atataggggc gtttaatggc gaatacagta acaatgagaa tagtaagaaa aattaaaaat 180
gttaaagttt gatgaattat cattgaaaaa aattaatggc tttttaaatc ctaggatttt 240
aacctaaaat ctgaagaaat aaggtggatc gaacgactca caaaatattt ggatttgtca 300
atgaatcccg ctttatgcta aaagagattt tcattttttg atagatggtc tgattgtcat 360
aggacggatt tgttttgaag agggaacatt ggtgactttt taacctgttc gaaaagagcg 420
aaaatactaa aagaaaagag agatcccggc tgacagccca tttaaagggg attgcggacg 480
ggggaaaaaa gagatcctga atccatcctt caacctttca tctgaaatag ggagaaaagt 540
acaaaaatca taatgtcgaa ttttgaaagc gcatacttaa aacgctgaca aaaatctgat 600
aggaattaag aactttcgat ttccaaaaat atcaataaaa agataggcat taatgactcg 660
ggcgaggtga tctttgtcac ggaaaatttc gtcgtcttct gttacataat gccgattgtg 720
atttcatagt gaacctatat actgatgaat gaatttacat atcagattcc aagaaggaga 780
tgtagacaaa cacagtgcaa aagagagtgc cgccggcgct ctcttttttg tgtgctgatc 840
ccggttataa aagacctgtg aaaagcgacc ggtttgaaag ggaaacacga caattttctt 900
aaccggtcag tgtataaagt tttatagaaa atcaggagga tatatacatg gttttggggt 960
tcatgtttat tgtattcttt tgaagggaat aaaaactgac aaatttcgac tgaagcaaaa 1020
tttgaaaatg catcacctta ccaattcggg atgggaaccg cacctcatgt tcatgacctc 1080
tttagaatat ttcccttcat ctttttaatc tgcgcttagg tgaaaaagct gatcatgctg 1140
tgctgagcgt ttcttctcgc tatgacgctg ctgtacatgc aaaaaaagtc ctttaaatat 1200
cccagttgaa tgacgatgaa agaggaaaga agaggaggaa cagatcaatt gataaaaaaa 1260
gcggcaaaca aaaagttggt tttgttttgt ggaattgcgg tgctttggat gtctttattt 1320
ttaacgaatc ataatgatgt acgcgccgat acgatcggcg agaaaatagc ggaaactgcc 1380
agacagcttg agggtgcgaa atacagctac ggcggagaga agccgaaaac ggggtttgac 1440
tcgtcaggct ttgtgcaata tgtgtttcaa tcgctcgata ttacgcttcc gagaacggta 1500
aaggaacaat cgactcttgg gagcagt 1527
<210> 17
<211> 651
<212> DNA
<213> Bacillus licheniformis
<400> 17
atgaagaaat gggcatttgt atcagacttt gatgggacga tttccaaaca ggatttttac 60
tggatggtca ttgataaata ttttcccgaa ggccgtgaat tgttcaagaa gtggaagtcc 120
ggagaattaa aagatatcga atttttggga accgtttttg cttcgattaa tcaaagcgaa 180
caaaaaatca ttgatgacat ccattccata ccgattgatg aatatgtgcc tgacttcatt 240
cagcatgtcc agaaaagcgg cggcgacttc tacattttaa gcgccggcac ggattattac 300
attcattata ttttaaagaa atacgggatt acagacgttg aggtctattc aaataaaggc 360
ttttttaaag aagacaatgt tcatatggac attgatgaga atcattggca ttactctgag 420
cgctatggga ttgataaatc aaaggtcatt caaaagctga aagaagagta tgagacggtt 480
tattttgcag gcgacagtga accggattcg cacccggcta aatttgcgga tgttacgttt 540
gcaaaggatg cgctccagga tttgctgcgt cagcaggggg tgccatttgt agccgttgaa 600
acatttgaag acattgaaca atatcttaaa gaaaaagggc ggatcgtcta a 651
<210> 18
<211> 746
<212> DNA
<213> Bacillus licheniformis
<400> 18
cctaagtgat aatgattcgc attatcaatg taaatatagc agatcaatcc ctctctcgtc 60
tatcactttt tttgctaagt atgattagtg tggttttggt taatttgtta ctataaacag 120
aaaaaggact gatgagagat ggcagaaacg aacccggtga tcaaaaaatt gcagttcaag 180
gataatggac agcctgtact gattgtgaat ccgcctgagg catacagcgg cgtcatcgct 240
gaatttcaag gccctgttca tcatcacgcc gaatcggacc aatatgattt tgttcaggta 300
ttcgcagcga ccaacgcaaa gctgcaggct ttagccaagg aggctgaacg tcatttggcg 360
gaagacggtc tgttttggct ttgctacccg aaaaaatcat cgaaagtcta caaaggatcg 420
gactgcagcc gcgatacagt agccggactg cttgcagacc agggctatga accggttcgc 480
caaattgcaa ttgatgaaga ctggtctgcg ctcagatttc gcaaggcgga aaacatcaaa 540
acgatgaagc ggaaatttgc cgtaacagag aaaggtaagc agcgtacaga tcaagaatga 600
ttatatacgc ctcctttcag ggggacgaat attcagcttg tgaacgaaag tacacaaaaa 660
agaaataata ttatgttcaa tgattcacaa actttttgta taatgaatct aatcttttaa 720
aataccatag aaaagaggta tgcagc 746
<210> 19
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of primer for amplifying homologous region 1
of dgp
<400> 19
agacagggcc aacgaggccc ctaagtgata agtattcgca ttatc 45
<210> 20
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of primer for amplifying homologous region 1
of dgp
<400> 20
cggcattaga cgatcgctgc atacctcttt tctatgg 37
<210> 21
<211> 723
<212> DNA
<213> Bacillus licheniformis
<400> 21
gatcgtctaa tgccgcgcca ggttaccagc atagccatcc ccgcggtttt ggacattagt 60
gagggcgtgc ttggccggtt ggatgagata ttgagaaaac atcagtttga caaggcgatc 120
atgttttttg acgatttttc ctatcagcag tatgagcatt cactgaaaac cgcatttcaa 180
catgttaaag ttgaagccgt tctgctgccg tccaatctgg acatacagga gcttttgaag 240
cgggcatttt cgatcgggaa ttgcgatgtc attattgcca tgggcggcgg gtatgttgtg 300
gactgcggaa aatacatcgc cttttccaag cggaccccgt tcatcagcat tccgacgtcg 360
gcatccaatg acgggtttgc gagcagcaat tgctcgcttc aggtcgaagg aaaaaaaaca 420
accgttccgg caagggttcc ctacggaatc atagctgatt tgagcattat tcaaaaagcg 480
ccggattgct ttattttggc ggggatcgga gatttgatgt ccaatattac ggccctttat 540
gattgggagt ttgaggagcg gcacggggtc ggcgatgtaa atgcgtttgc gtcgatgctc 600
agcaagaaag cggtcaacag ctttgtccgt acgccgatgc aggatattaa acagccgatc 660
ttcttaaaag agcttgtcag ttctttgaca atgggcggca tcgctacgga aatcagcgga 720
aac 723
<210> 22
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of primer for amplifying homologous region 2
of dgp
<400> 22
aaagaggtat gcagcgatcg tctaatgccg cgc 33
<210> 23
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of primer for amplifying homologous region 2
of dgp
<400> 23
agacagggcc ttattggccg tcaaagaact gacaagctct tttaag 46
<210> 24
<211> 1469
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence comprising homologous region 1 and 2 of dgp
<400> 24
cctaagtgat aatgattcgc attatcaatg taaatatagc agatcaatcc ctctctcgtc 60
tatcactttt tttgctaagt atgattagtg tggttttggt taatttgtta ctataaacag 120
aaaaaggact gatgagagat ggcagaaacg aacccggtga tcaaaaaatt gcagttcaag 180
gataatggac agcctgtact gattgtgaat ccgcctgagg catacagcgg cgtcatcgct 240
gaatttcaag gccctgttca tcatcacgcc gaatcggacc aatatgattt tgttcaggta 300
ttcgcagcga ccaacgcaaa gctgcaggct ttagccaagg aggctgaacg tcatttggcg 360
gaagacggtc tgttttggct ttgctacccg aaaaaatcat cgaaagtcta caaaggatcg 420
gactgcagcc gcgatacagt agccggactg cttgcagacc agggctatga accggttcgc 480
caaattgcaa ttgatgaaga ctggtctgcg ctcagatttc gcaaggcgga aaacatcaaa 540
acgatgaagc ggaaatttgc cgtaacagag aaaggtaagc agcgtacaga tcaagaatga 600
ttatatacgc ctcctttcag ggggacgaat attcagcttg tgaacgaaag tacacaaaaa 660
agaaataata ttatgttcaa tgattcacaa actttttgta taatgaatct aatcttttaa 720
aataccatag aaaagaggta tgcagcgatc gtctaatgcc gcgccaggtt accagcatag 780
ccatccccgc ggttttggac attagtgagg gcgtgcttgg ccggttggat gagatattga 840
gaaaacatca gtttgacaag gcgatcatgt tttttgacga tttttcctat cagcagtatg 900
agcattcact gaaaaccgca tttcaacatg ttaaagttga agccgttctg ctgccgtcca 960
atctggacat acaggagctt ttgaagcggg cattttcgat cgggaattgc gatgtcatta 1020
ttgccatggg cggcgggtat gttgtggact gcggaaaata catcgccttt tccaagcgga 1080
ccccgttcat cagcattccg acgtcggcat ccaatgacgg gtttgcgagc agcaattgct 1140
cgcttcaggt cgaaggaaaa aaaacaaccg ttccggcaag ggttccctac ggaatcatag 1200
ctgatttgag cattattcaa aaagcgccgg attgctttat tttggcgggg atcggagatt 1260
tgatgtccaa tattacggcc ctttatgatt gggagtttga ggagcggcac ggggtcggcg 1320
atgtaaatgc gtttgcgtcg atgctcagca agaaagcggt caacagcttt gtccgtacgc 1380
cgatgcagga tattaaacag ccgatcttct taaaagagct tgtcagttct ttgacaatgg 1440
gcggcatcgc tacggaaatc agcggaaac 1469
<210> 25
<211> 783
<212> DNA
<213> Bacillus licheniformis
<400> 25
atgagtaaag tatctggaaa aattgctttt gttactggcg gcggtcaagg aattggagaa 60
gcaatctgca aacgattggc agaggacgga ttcgcagttg cagttgccga ttataatgta 120
gaaactgcaa cacaagttgc tgaggacatc aataagctta acggcaaagc aattgcggtt 180
aaagtggatg ttgctgatcg cgatgatgtt tttaaagctg tcgatgaaac agtaaaacgt 240
cttggcggtc ttgatgtggt gattaataat gcgggtcttg gaccaaccac ccctattgaa 300
agcattacat atgaagatta tcggaaagtc tatgatgtta acgttggcgg tacttattgg 360
ggaatacaag cagctgtaaa agcctttaaa gaacttggac acggcgggaa aatcattaat 420
gcatcttctc aagccggcca agtcggcaac ccgggcttag cggtttacgg aggaacaaag 480
ttcgctgttc gcgggattac ccaaactgcg gcaaaagatc tagctgaatt aggtattact 540
gtaaacgcct tttgtccggg tatcgttaaa actcctatga tgatggggat tgcacagcaa 600
accgctgatg aagcaggcaa gccgtttgaa tggggcatgg aacaattcgc taaaaatatt 660
gcattaaaac gcttatccga gccggaagat gtagcagcat gcgtttctta ccttgcaggg 720
ccagattcag attatatgac tggtcaagct cttatcattg atggcggaat ggtatttaat 780
taa 783
<210> 26
<211> 751
<212> DNA
<213> Bacillus licheniformis
<400> 26
actccatgaa ctgacagtcg gaaaatatgg tgaagaaaag gcgaaatcat tatggaattc 60
actcggtttc ggagctgaat ccgtccttct cttaatctta gctgccgctt ccggtcaagc 120
gttcatgatg aacaggcgga aagagcatct gaaggcattt atgctcgcgg tgttctatca 180
ctcttcttat ttcgataaag cgcatgtttt aaaaccataa ccatacaaaa aaagcgggag 240
gttttaacat gttatttatc ataagaatgg tgattattgg cctattttca ttgacagcaa 300
tcaatctgtt tgtttttcaa ggaattgaat tcatgcacgc gattaccgat cttttcaatc 360
gccaggacag ctgaatttga agcgatttga aaaagctaga caataaaatt tcatgaagca 420
gtttgtttgg catgaatccg gcattgtgcg ggttcatgcc ttttcatttg gtcttcatcc 480
gtttagcgat gactgaatcg ctgttttata gcagaacatc ccttttatag ttttacatac 540
agttcttcct ccctctttca aaaactatta aattttttcg aaaaatttta aacatatttt 600
caacaaatgc cgcggcttta cttcaaatct acaaatataa gatataatat tcctgtacca 660
attaaatacc aattacttat agaaagaaga tgtttatatg agtaaagtat ctggaaaaat 720
tgcttttgtt actggcggcg gtcaaggaat t 751
<210> 27
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of primer for amplifying homologous region 1
of budC
<400> 27
agacagggcc aacgaggcca ctccatgaac tgacagtcg 39
<210> 28
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of primer for amplifying homologous region 1
of budC
<400> 28
catcaatgat aagagaattc cttgaccgcc gccagtaac 39
<210> 29
<211> 776
<212> DNA
<213> Bacillus licheniformis
<400> 29
ctcttatcat tgatggcgga atggtattta attaatttta aaattatatt ctatatggag 60
ggaggagttt tcccctccat atttagtatt gaataatcag ctatatagca tggcttaaaa 120
ccgtgtaata cgaaacggcc acggcgtcca accacgcctt gatttatggt tcacgtttaa 180
aaaacaaaga acgcaggccg ttggttcctc ccccatcggc aaatcgtggc gtccatgaat 240
ttcgaatcgc atcaatactt agcgtttact gccaaattgt cattctaaac gcccttcttc 300
ttgaagtttt cccaattttt tatgattgcc caggtccctt tatctgttga aggacggctc 360
catcatttag gatataacga agcgggacaa ttgagcggaa atgatacaaa caagaggcta 420
attttaatta aaaaaaggcc gaagtgagca acttcgccct caagcaaggc gccgtgagga 480
aatccatatg tttacgatct tttgaacccc tgtttcaaaa tgcactagtg cgaggatttc 540
ccctgcgata agcggcaccc aagatatctt ctttgaattc tactccaagc ctccataggt 600
tttatttacg cgctttttcc gtcaactcgt ttattttctc catttttttc gatttcctct 660
aaactgcgac ctcgagtttc agggacgcgt gtccggataa atacaactcc aagcaaacaa 720
atcacaccga agattgcaaa cacagcttct tgagacatcg aagcggtcat aacagg 776
<210> 30
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of primer for amplifying homologous region 2
of budC
<400> 30
ggcggtcaag gaattctctt atcattgatg gcggaatg 38
<210> 31
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of primer for amplifying homologous region 2
of budC
<400> 31
agacagggcc ttattggccc ctgttatgac cgcttcgatg 40
<210> 32
<211> 1527
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence comprising homologous region 1 and 2 of budC
<400> 32
actccatgaa ctgacagtcg gaaaatatgg tgaagaaaag gcgaaatcat tatggaattc 60
actcggtttc ggagctgaat ccgtccttct cttaatctta gctgccgctt ccggtcaagc 120
gttcatgatg aacaggcgga aagagcatct gaaggcattt atgctcgcgg tgttctatca 180
ctcttcttat ttcgataaag cgcatgtttt aaaaccataa ccatacaaaa aaagcgggag 240
gttttaacat gttatttatc ataagaatgg tgattattgg cctattttca ttgacagcaa 300
tcaatctgtt tgtttttcaa ggaattgaat tcatgcacgc gattaccgat cttttcaatc 360
gccaggacag ctgaatttga agcgatttga aaaagctaga caataaaatt tcatgaagca 420
gtttgtttgg catgaatccg gcattgtgcg ggttcatgcc ttttcatttg gtcttcatcc 480
gtttagcgat gactgaatcg ctgttttata gcagaacatc ccttttatag ttttacatac 540
agttcttcct ccctctttca aaaactatta aattttttcg aaaaatttta aacatatttt 600
caacaaatgc cgcggcttta cttcaaatct acaaatataa gatataatat tcctgtacca 660
attaaatacc aattacttat agaaagaaga tgtttatatg agtaaagtat ctggaaaaat 720
tgcttttgtt actggcggcg gtcaaggaat tctcttatca ttgatggcgg aatggtattt 780
aattaatttt aaaattatat tctatatgga gggaggagtt ttcccctcca tatttagtat 840
tgaataatca gctatatagc atggcttaaa accgtgtaat acgaaacggc cacggcgtcc 900
aaccacgcct tgatttatgg ttcacgttta aaaaacaaag aacgcaggcc gttggttcct 960
cccccatcgg caaatcgtgg cgtccatgaa tttcgaatcg catcaatact tagcgtttac 1020
tgccaaattg tcattctaaa cgcccttctt cttgaagttt tcccaatttt ttatgattgc 1080
ccaggtccct ttatctgttg aaggacggct ccatcattta ggatataacg aagcgggaca 1140
attgagcgga aatgatacaa acaagaggct aattttaatt aaaaaaaggc cgaagtgagc 1200
aacttcgccc tcaagcaagg cgccgtgagg aaatccatat gtttacgatc ttttgaaccc 1260
ctgtttcaaa atgcactagt gcgaggattt cccctgcgat aagcggcacc caagatatct 1320
tctttgaatt ctactccaag cctccatagg ttttatttac gcgctttttc cgtcaactcg 1380
tttattttct ccattttttt cgatttcctc taaactgcga cctcgagttt cagggacgcg 1440
tgtccggata aatacaactc caagcaaaca aatcacaccg aagattgcaa acacagcttc 1500
ttgagacatc gaagcggtca taacagg 1527
<210> 33
<211> 1104
<212> DNA
<213> Bacillus licheniformis
<400> 33
atgtcaaaat cagtaaaatc agtcacatca cctaaaaaat ttattacagg aaaacgactg 60
ctggagaact tgaacgacta cattgaagat tttggcgaca acgcatatat catttgcgat 120
gaattcattt tggaacgcgc tcaaaaagaa gcggggaatt cgattcagaa agccggcaat 180
caagccgttt ttgaaaaatt caattacgaa tgcacacagg aagaaatcga tcgcaaccgg 240
gagcttgcac gcaatgcagg cgctaatatc atcgttggga tcggaggcgg taaaacgctt 300
gataccgcaa aagccaccgc ttattacgag aagctgccgg ttgtgatttt cccgacaatt 360
gcttctacgg atgctccatg tacggccctt gccgtcattt ataaacacga cggatcgttt 420
gaccgctatc tgtttttgcc gacgaaccca gatgtcgttc ttgcggactc tgagattttg 480
gcatccgcgc cgccgcgctt tttcgcagcc ggtatcggtg acgccttggc gacgtatttt 540
gaagcgcgcg cctgctttaa agcaaacggc gataacctcg tgctgatgaa gccttcaaca 600
actggattgg gacttgcccg tctttgctat gatacgctgt tggaaaacgg tgtgaaagcg 660
atgcaggcgg ttaagcacgg cgtttccaca cgagcggtcg aagatacaat cgaggcgacc 720
atctatttaa gcggcgtcgg tgccgaatca ggcggtcttg ccgccgcaca cgcgatccac 780
aacggaatga cagccgttcc ttctctgcac agggctcagc acggcgaaaa agtcacgttc 840
ggccttttgg cgcagcttgt tcttgaaaac gcgccggccg aagaattgga gaccgttatt 900
gactttatca aaggcgtcgg tcttccgttg acattaaaag acctcggagt cgacgaattt 960
gtcgaagaag aatggcgcca agtcgctcaa agcgcttgcg cggaaggcga cacaatgggc 1020
aacatgccgt tcccagtcac ccctgacgac gtctacaatg cgatcgtcgc cgccaacgcg 1080
attgcagaat cttatcacga ttaa 1104
<210> 34
<211> 910
<212> DNA
<213> Bacillus licheniformis
<400> 34
aatgctgaag cgatttccaa caaggcgatc cattggggtt tttcaaaaag caaaaaccat 60
cagccggcag atgcgggtca agagctgaac aaccttttac agcagtacga cgccttttat 120
ttgggcaaca caaaggaaaa aacgatctat ctgacctttg ataacggcta tgaaaacggc 180
tacacccctc aggtgctcga tgttctgaaa aaacaaaacg tcaaagcggc cttttttgtg 240
acgggccatt ttgtcaaaga tcagccggag ctgatcaagc gaatggccga ggaggggcat 300
atcatcggga atcattcata tcaccatccg gatctgacga cgaaaacaag ccgcgtcatt 360
caagaggaat tggaatcggt cgatgaggag gtttacaaaa tcacaggcga aaaaaacaac 420
ctctacctga gaccgcctcg gggcattttc agcgagcggg tgctcgaaga aacgaaaaag 480
ctcggctatc aaacggtatt ctggtctgtt gcttttgtcg attggaaaat caatgcccaa 540
aaagggtggc gctatgcgta cgacaatatg atgaaacagg ctcaccccgg cgccatctat 600
ctgcttcaca ccgtctcgag agacaatgcc gaagcgcttg atcaggcgat caccgacttg 660
aaaaaagaag gttatacatt taaaagcctc gatgacctga tgtttgaaaa atctatgatg 720
cttgagaccc tttgaaagaa caatgccccg gccgctttgc cggggttttg ctttggctga 780
aaaaattgat gcttcaggct ctttttattt cccctagtca attctataga ataaaaatcc 840
attttatata catatattac tagatttaaa aagaaaatag gtatatcatt gatagtgaag 900
gggaattacc 910
<210> 35
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of primer for amplifying homologous region 1
of gdh
<400> 35
agacagggcc aacgaggcca atgctgaagc gatttccaac aaggcgatc 49
<210> 36
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of primer for amplifying homologous region 1
of gdh
<400> 36
acggcttttc gtctaggtaa ttccccttca ctatc 35
<210> 37
<211> 886
<212> DNA
<213> Bacillus licheniformis
<400> 37
tagacgaaaa gccgtttccg tgaaggagcg gctttctgct ttgggttagt atattagttt 60
gtgaatcggc ggtctgtccg tgcttttgaa tatgaattgt gtggtacgtt tcccagagta 120
aaattatgaa tttcttttat agcagtttcc caaaaacgag ctgtttgact cgtgtgacag 180
ccgttcattt caccacttta atcttcaacc tcggctcttc ttcaattccg gatgcaaatg 240
catcctcatt tcccggagcc gtaaaggtga cgctgtacgt ttcctgtgaa tgcggcgaca 300
gttccagctc ttccggctga aagtcaaatt catttattat atcaggggtg agctggacgc 360
gttcggtctt tttcccgtag ttgttgactt tcacctcaca gtccatgctt cctgcttcca 420
tatcgccctg atagctgcaa gcgcttcccc ttttcatata ttccacggcg ctatcgcctt 480
gtgcattcca tttttgaaag aacatcagct gttctgtgac cagcgggtaa aatactgaaa 540
taccgatgat aaacaaaaac agcttaaagc ggatccacgg tactccataa taatggcgcc 600
acgccataat gaagccggcg atgatcataa acatgcagat cagaaccact aaattccgga 660
tgggcagttt taaaaagccc gaaagcgcgt ctgctacaga cgcgccttga tgattctcgg 720
cgctgatcaa caggccgata acaatcatga tgatgccggc aagccctgta tgtaccttca 780
tttctttccc tcctcagttg tagaaatagt cgaacagaga ggaaaaaggt ttccggtttt 840
acttgaaaat gtcaaaccat cctttatgcc ggaaccagaa gatcat 886
<210> 38
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of primer for amplifying homologous region 2
of gdh
<400> 38
tgaaggggaa ttacctagac gaaaagccgt ttccgtgaag 40
<210> 39
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of primer for amplifying homologous region 2
of gdh
<400> 39
agacagggcc ttattggcca tgatcttctg gttccggc 38
<210> 40
<211> 1796
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence comprising homologous region 1 and 2 of gdh
<400> 40
aatgctgaag cgatttccaa caaggcgatc cattggggtt tttcaaaaag caaaaaccat 60
cagccggcag atgcgggtca agagctgaac aaccttttac agcagtacga cgccttttat 120
ttgggcaaca caaaggaaaa aacgatctat ctgacctttg ataacggcta tgaaaacggc 180
tacacccctc aggtgctcga tgttctgaaa aaacaaaacg tcaaagcggc cttttttgtg 240
acgggccatt ttgtcaaaga tcagccggag ctgatcaagc gaatggccga ggaggggcat 300
atcatcggga atcattcata tcaccatccg gatctgacga cgaaaacaag ccgcgtcatt 360
caagaggaat tggaatcggt cgatgaggag gtttacaaaa tcacaggcga aaaaaacaac 420
ctctacctga gaccgcctcg gggcattttc agcgagcggg tgctcgaaga aacgaaaaag 480
ctcggctatc aaacggtatt ctggtctgtt gcttttgtcg attggaaaat caatgcccaa 540
aaagggtggc gctatgcgta cgacaatatg atgaaacagg ctcaccccgg cgccatctat 600
ctgcttcaca ccgtctcgag agacaatgcc gaagcgcttg atcaggcgat caccgacttg 660
aaaaaagaag gttatacatt taaaagcctc gatgacctga tgtttgaaaa atctatgatg 720
cttgagaccc tttgaaagaa caatgccccg gccgctttgc cggggttttg ctttggctga 780
aaaaattgat gcttcaggct ctttttattt cccctagtca attctataga ataaaaatcc 840
attttatata catatattac tagatttaaa aagaaaatag gtatatcatt gatagtgaag 900
gggaattacc tagacgaaaa gccgtttccg tgaaggagcg gctttctgct ttgggttagt 960
atattagttt gtgaatcggc ggtctgtccg tgcttttgaa tatgaattgt gtggtacgtt 1020
tcccagagta aaattatgaa tttcttttat agcagtttcc caaaaacgag ctgtttgact 1080
cgtgtgacag ccgttcattt caccacttta atcttcaacc tcggctcttc ttcaattccg 1140
gatgcaaatg catcctcatt tcccggagcc gtaaaggtga cgctgtacgt ttcctgtgaa 1200
tgcggcgaca gttccagctc ttccggctga aagtcaaatt catttattat atcaggggtg 1260
agctggacgc gttcggtctt tttcccgtag ttgttgactt tcacctcaca gtccatgctt 1320
cctgcttcca tatcgccctg atagctgcaa gcgcttcccc ttttcatata ttccacggcg 1380
ctatcgcctt gtgcattcca tttttgaaag aacatcagct gttctgtgac cagcgggtaa 1440
aatactgaaa taccgatgat aaacaaaaac agcttaaagc ggatccacgg tactccataa 1500
taatggcgcc acgccataat gaagccggcg atgatcataa acatgcagat cagaaccact 1560
aaattccgga tgggcagttt taaaaagccc gaaagcgcgt ctgctacaga cgcgccttga 1620
tgattctcgg cgctgatcaa caggccgata acaatcatga tgatgccggc aagccctgta 1680
tgtaccttca tttctttccc tcctcagttg tagaaatagt cgaacagaga ggaaaaaggt 1740
ttccggtttt acttgaaaat gtcaaaccat cctttatgcc ggaaccagaa gatcat 1796
Claims (12)
- 폴리올 또는 점액성 고분자의 생합성 경로를 갖는 미생물에 있어서, 글루코오즈-6-포스페이트를 엑소폴리사카라이드로 전환하는 경로, 글리세로포스페이트를 글리세롤로 전환하는 경로, 아세토인을 (2R,3S)-부탄다이올로 전환하는 경로, 아세토인을 (2R,3R)-부탄다이올로 전환하는 경로 및 글루탐산을 폴리글루탐산으로 전환하는 경로로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상이 억제된 것을 특징으로 하는, 폴리올 또는 점액성 고분자의 생성능이 조절된 재조합 미생물.
- 제 1항에 있어서,
상기 재조합 미생물은 재조합 바실러스인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
- 제 1항에 있어서,
상기 폴리올은 글리세롤, (2R, 3R)-부탄다이올, (2R,3S)-부탄다이올로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
- 제 1항에 있어서,
상기 점액성 고분자는 폴리글루탐산, 레반 및 엑소폴리사카라이드로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
- 제 4항에 있어서,
상기 엑소폴리사카라이드는 글루코오스, 갈락토오스, 포스페이트, 글리세롤 및 아세트산으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 모노머를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
- 제 1항에 있어서,
야생형 미생물에 비하여 글리세롤, (2R, 3R)-부탄다이올 및 (2R,3S)-부탄다이올로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리올의 생성능이 억제되거나 상기 하나 이상의 폴리올의 생성능이 없는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
- 제 1항에 있어서,
글루코오즈-6-포스페이트를 엑소폴리사카라이드로 전환하는 경로가 억제되고,
글리세로포스페이트를 글리세롤로 전환하는 경로, 아세토인을 (2R,3S)-부탄다이올로 전환하는 경로, 아세토인을 (2R,3R)-부탄다이올로 전환하는 경로 및 글루탐산을 폴리글루탐산으로 전환하는 경로로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상이 억제된 것을 특징으로 하는, 폴리올 또는 점액성 고분자의 생성능이 조절된 재조합 미생물.
- 제 1항에 있어서,
상기 재조합 미생물은 폴리올 및 점액성 고분자의 동시 생성능을 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
- 제 1항의 재조합 미생물을 준비하는 단계;및
상기 재조합 미생물을 탄소원을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는,
폴리올의 생산 방법.
- 제 1항의 재조합 미생물을 준비하는 단계;및
상기 재조합 미생물을 탄소원을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는,
점액성 고분자의 생산 방법.
- 제 9항 또는 제 10항에 있어서,
상기 탄소원은 자당, 포도당 및 글루탐산으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 생산 방법.
- 제 9항 또는 제 10항에 있어서,
상기 배양은 25 내지 55 ℃에서 수행되는 것을 특징으로 하는 생산 방법.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210121930A KR20230039826A (ko) | 2021-09-13 | 2021-09-13 | 폴리올 또는 점액성 고분자의 생성능이 조절된 재조합 미생물 |
| PCT/KR2022/009268 WO2023038250A1 (ko) | 2021-09-13 | 2022-06-28 | 폴리올 또는 점액성 고분자의 생성능이 조절된 재조합 미생물 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210121930A KR20230039826A (ko) | 2021-09-13 | 2021-09-13 | 폴리올 또는 점액성 고분자의 생성능이 조절된 재조합 미생물 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20230039826A true KR20230039826A (ko) | 2023-03-22 |
Family
ID=85506569
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020210121930A KR20230039826A (ko) | 2021-09-13 | 2021-09-13 | 폴리올 또는 점액성 고분자의 생성능이 조절된 재조합 미생물 |
Country Status (2)
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|---|---|
| KR (1) | KR20230039826A (ko) |
| WO (1) | WO2023038250A1 (ko) |
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2021
- 2021-09-13 KR KR1020210121930A patent/KR20230039826A/ko not_active Application Discontinuation
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2022
- 2022-06-28 WO PCT/KR2022/009268 patent/WO2023038250A1/ko active Application Filing
Also Published As
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| WO2023038250A1 (ko) | 2023-03-16 |
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