CN104099363A - 一种BL21(DE3)ΔaroA菌株的构建方法及其应用 - Google Patents
一种BL21(DE3)ΔaroA菌株的构建方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生物载体领域，特别涉及一种BL21(DE3)ΔaroA菌株的构建方法及其应用。构建方法，包括以下步骤：构建aroA基因敲除打靶片段；将pKD46质粒转入BL21(DE3)菌株，获得BL21(DE3)/pKD46菌株；将aroA基因敲除打靶片段转化至该菌株，获得BL21(DE3)ΔaroA菌株。本发明提供的一种BL21(DE3)ΔaroA菌株的构建方法，采用大于500bp的同源侧翼序列，利用Red同源重组技术成功的敲除BL21(DE3)菌株的aroA基因；该菌株既可用于EPSPS功能互补验证，还实现了pET系统重组外源蛋白的大量表达，达到一举两得的效果。
Description
技术领域
本发明涉及生物载体领域，具体而言，涉及一种BL21(DE3)ΔaroA菌株的构建方法及其应用。
背景技术
aroA基因，因其编码产物是5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(5-enolpyruvylshikimate3-phosphate synthase,EPSPS)又被称为EPSPS基因。EPSPS是只存在于细菌、真菌、藻类、顶配位寄生虫和植物中(Herrmann and Weaver,1999；Macheroux and Schmidv,1999；Keeling et al.,1999)的莽草酸途径的关键酶，其功能是是催化PEP和莽草酸-3-磷酸(shikimate3-phosphate,S3P)合成5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸(5-enolpyruvylshikimate3-phosphate,EPSP)。莽草酸途径(shikimate pathway)是连接碳水化合物代谢和芳香族化合物生物合成的重要生物代谢途径，该途径起始于糖酵解中间产物磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate，PEP)和五碳糖磷酸途径中间产物赤藓糖-4-磷酸(erythrose4-phosphate)，到合成分支酸(chorismate)结束，整个过程有7种酶参与，EPSPS是倒数第二步的酶(Herrmann andWeaver,1999)。EPSPS还是世界上使用量最大的广谱灭生性除草剂草甘膦(glyphosate)的唯一靶标酶，EPSPS和PEP的结合因草甘膦在结构上是PEP的类似物而被它竞争性的抑制，从而阻断EPSP的合成，造成分支酸合成受阻，最终导致芳香族氨基酸和芳香族化合物的生物合成代谢失调，最终造成生物体的死亡(Gruys et al.,1992；Mcdowell et al.,2004)。
菌株aroA内源基因的缺失，将造成菌株自身芳香族氨基酸合成受阻，在没有外源芳香族氨基酸添加的基本培养基(如M9、M63等基本培养基)中将不能正常生长，只有将aroA内源基因缺失的菌株转化进完整的能够提供充足的具有活性的EPSPS的aroA基因，该菌株才能够在基本培养基中生长，因此，aroA基因缺失的菌株可用于EPSPS功能的互补验证(Zhou et al.,2006)。
Red同源重组技术是利用噬菌体Red系统介导实现外源线性DNA核苷酸片段与细菌染色体上的目标基因进行同源重组的研究方法，外源线性DNA的两端只需含有与染色体目标基因两侧同源的约50bp的序列，便可实现将目标基因同源敲除的目的。该技术在大肠杆菌K12菌株成功应用的实例很多，但用于K12菌株以外的其他大肠杆菌菌株却鲜有报道。BL21(DE3)菌株是大肠杆菌B菌株，用几十bp的短的同源序列很难实现在该菌株内的靶基因的同源替换，因此，Red同源重组技术应用于BL21(DE3)菌株存在很大的挑战。
发明内容
本发明的目的在于提供一种BL21(DE3)ΔaroA菌株的构建方法及其应用，以解决上述的问题。
在本发明的实施例中提供了一种BL21(DE3)ΔaroA菌株的构建方法，包括以下步骤：
构建aroA基因敲除打靶片段；
将pKD46质粒转入BL21(DE3)菌株，获得BL21(DE3)/pKD46菌株；
将aroA基因敲除打靶片段转化进入BL21(DE3)/pKD46菌株，获得所述BL21(DE3)ΔaroA菌株。
优选地，所述aroA基因敲除打靶片段包括依次连接的aroA-U基因片段、FRT基因片段和aroA-D基因片段；所述aroA-U基因片段和aroA-D基因片段的长度均大于500bp。
优选地，所述FRT基因片段含有Kan抗性基因片段。
优选地，所述aroA基因敲除打靶片段的构建包括以下步骤：
以pKD4质粒为模板，P1和P2为引物进行PCR扩增获得两端含有FRT位点的Kan抗性基因片段FRT，将该片段连入克隆载体pTG19-T，获得pJA1401质粒，其中，P1和P2引物为：
P1：5’-GTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’
P2：5’-ATGGGAATTAGCCATGGTCC-3’；
以BL21(DE3)菌株为模板，P3和P4为引物进行PCR扩增获得两端含有EcoR Ⅰ和Kpn Ⅰ酶切位点的aroA基因上游序列aroA-U，将该片段连入克隆载体pTG19-T，获得所述pJA1402质粒，其中，P3和P4引物为：
P3：5’-CCGgaattcGGCAAAGATGTGGTGGTCGC-3’
P4：5’-CCGggtaccCAGGCTGGCTGTGGGGATTA-3’；
以BL21(DE3)菌株为模板，P5和P6为引物PCR进行扩增获得两端含有Sal Ⅰ和HindIII酶切位点的aroA基因下游序列aroA-D，将该片段连入克隆载体pTG19-T，构建获得pJA1403质粒，其中，P3和P4引物为：
P5：5’-CCGgtcgacACGGGCAATAAATAGCCAAATC-3’
P6：5’-GCGaagcttTCCATCAGGCCACTGTAGACAC-3’；
用EcoR Ⅰ和Kpn Ⅰ分别双酶切pJA1402和pJA1401质粒，将获得的两端含有EcoR Ⅰ和Kpn Ⅰ粘性末端的aroA-U基因片段连入线性化的pJA1401质粒，得到含有aroA-U基因片段和含有Kan抗性的FRT基因片段的pJA1404质粒；
用Sal Ⅰ和HindIII分别双酶切pJA1403和pJA1404质粒，将获得两端含有Sal Ⅰ和HindIII粘性末端的aroA-D基因片段连入线性化的pJA1404质粒，构建获得含有依次连接的aroA-U基因片段、FRT(Kan)基因片段和aroA-D基因片段的pJA1405质粒；
以P3和P6作为引物，pJA1405质粒为模板，PCR扩增即可获得aroA基因敲除打靶片段。
本发明还提供了上述BL21(DE3)ΔaroA菌株的构建方法中得到的含有依次连接的aroA-U基因片段、FRT(Kan)基因片段和aroA-D基因片段的pJA1405质粒。
本发明还提供了上述BL21(DE3)ΔaroA菌株的构建方法中得到的含有依次连接的aroA-U基因片段、FRT(Kan)基因片段和aroA-D基因片段的得aroA基因敲除打靶片段。
本发明还提供了上述BL21(DE3)ΔaroA菌株的构建方法中得到的pJA1405质粒的菌株。
本发明还提供了上述BL21(DE3)ΔaroA菌株的构建方法中得到的BL21(DE3)ΔaroA菌株。
本发明还提供了BLA-(BL21(DE3)ΔaroA)菌株，将pCP20质粒转化入BL21(DE3)ΔaroA菌株，得到BLA-(BL21(DE3)ΔaroA)菌株。
本发明还提供了BL21(DE3)ΔaroA菌株在功能互补中的应用。
本发明的实施例提供的一种BL21(DE3)ΔaroA菌株的构建方法，采用大于500bp的同源侧翼序列，利用Red同源重组技术成功的敲除BL21(DE3)菌株的aroA基因，为该技术在BL21(DE3)菌株基因组成功敲除目标基因提供了可行的方法。aroA基因缺失的BL21(DE3)菌株，既可以用于EPSPS的功能互补验证，同时还实现了pET系统重组外源蛋白的大量表达，达到一举两得的效果。
附图说明
图1示出了本发明实施例1中pJA1405质粒的构建流程示意图；
图2示出了本发明实施例1中aroA-U、aroA-D和含有Kan抗性的FRT基因片段PCR扩增后的琼脂糖电泳结果图；
图3示出了本发明实施例1中质粒pJA1401、pJA1402、pJA1403、pJA1404和pJA1405限制性内切酶双酶切鉴定电泳结果图；
图4示出了本发明实施例2中BL21(DE3)ΔaroA菌株的PCR鉴定电泳结果图；
图5示出了本发明实施例3中BLA-(BL21(DE3)ΔaroA)菌株的PCR鉴定电泳结果图；
图6示出了本发明实施例4中BL21(DE3)菌株和BL21(DE3)ΔaroA菌株在LB培养基中的生长曲线图；
图7示出了本发明实施例4中BL21(DE3)菌株和BL21(DE3)ΔaroA菌株在M9基本培养基中的生长曲线图；
图8示出了本发明实施例4中BL21(DE3)ΔaroA菌株在M9基本培养基和加入芳香族氨基酸的M9基本培养基中的生长曲线图；
图9示出了本发明实施例5中菌株BL21(DE3)ΔaroA和BL21(DE3)ΔaroA/pJA1406在M9基本培养基中的生长曲线图。
具体实施方式
下面通过具体的实施例子并结合附图对本发明做进一步的详细描述。
本发明涉及的实验材料和培养基的配制方法
1、菌株与质粒、引物
用于本发明的细菌菌株和质粒见表1；用于本发明的引物见表2。
表1本发明的细菌菌株和质粒
注：Ap，氨苄青霉素；Kan，卡那霉素；Cm，氯霉素；R，抗性；Δ，删除。
表2本发明涉及的引物
其中，P1和P2引物以pKD4序列(GenBank登录号：AY048743.1)为模板设计，扩增得到两端含有FRT位点的Kan抗性基因，基因片段长度为1496bp。
P3/P4、P5/P6、P7/P8引物以BL21(DE3)基因组序列(GenBank登录号：NC_012892.2)为模板设计。以P3/P4为引物，BL21(DE3)为模板扩增5’端和3’端分别含有EcoR Ⅰ和Kpn Ⅰ酶切位点的aroAE.coli上游序列aroA-U，得到的aroA-U基因片段长度为629bp；以P5/P6为引物，BL21(DE3)为模板扩增5’端和3’端分别含有SalⅠ和HindⅢ酶切位点的aroAE.coli下游序列aroA-D，得到的aroA-D基因片段长度为523bp；P7/P8用来扩增aroAE.coli基因，得到aroAE.coli基因片段长度为1284bp。
2、试剂和试剂盒
一般化学试剂为分析纯级别，购自南京化学试剂有限公司；各种限制性内切酶、DL5000DNA Marker和T4DNA Ligase为TaKaRa产品，购于宝生物工程(大连)有限公司；EasyTaq DNA Polymerase和EasyPfu DNA Polymerase为北京全式金生物技术有限公司产品；D2000DNA Marker为中科瑞泰(北京)生物科技有限公司产品；AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒和AxyPrep质粒DNA小量试剂盒为爱思进生物技术(杭州)有限公司产品；琼脂糖为Biowest Agarose(西班牙琼脂糖)；引物合成在英潍捷基(上海)贸易有限公司(Invitrogen)完成。
3、培养基的配制方法
(1)LB液体培养基(1000ml)：酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，NaCl10g，加入1000ml水，121℃高温高压灭菌20min。
(2)LB固体培养基(1000ml)：酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，NaCl 10g，琼脂15g，121℃高温高压灭菌20min。
(3)Ap抗性筛选培养基：121℃高温高压灭菌的LB固体培养基，待培养基冷却至60℃左右时，加入Ap(100μg//ml)，充分混匀倒入无菌培养皿。
(4)Kan抗性筛选培养基：将LB固体培养基121℃高温高压灭菌后，待培养基冷却至60℃左右时，加入Kan(25μg/ml)，充分混匀倒入无菌培养皿。
(5)M9基本培养基：
①配制1mol/L的MgSO4：称取24.6g MgSO4·7H2O，用去离子水溶解，定容到100ml，高温高压灭菌备用；
②配制1mol/L的CaCl2：称取21.9g CaCl2·6H2O，用去离子水溶解，定容到100ml，高温高压灭菌备用；
③配制5×M9盐溶液：分别称取Na2PO4·7H2O 64g、KH2PO4 15g、NaCl 2.5g和NH4Cl 5.0g置于1L烧杯中，用去离子水充分溶解，定容到1L，高温高压灭菌备用；
④配制20％的葡萄糖溶液：20g葡萄糖用去离子水溶解，定容到100ml，0.22μm滤器过滤除菌；
⑤无菌操作配制M9培养基：分别量取5×M9盐溶液200ml、1mol/L的MgSO4 2ml、20％的葡萄糖溶液20ml和1mol/L的CaCl20.1ml，加无菌去离子水定容至1L；加入芳香族氨基酸的浓度为：L-酪氨酸30mg/L、L-色氨酸20mg/L、L-苯丙氨酸50mg/L。
实施例1
如图1所示，构建aroA基因敲除打靶片段
(1)pJA1401质粒的构建
以pKD4质粒为模板，用引物P1和P2进行PCR扩增，PCR反应体系为(25μl):10×EasyPfu Buffer 2.5μl，2.5mM dNTPs 2.5μl，P1(20μM)0.5μl，P2(20μM)0.5μl，pKD4(2.5ng/μl)1μl，EasyPfu DNAPolymerase 0.5μl，ddH2O 17.5μl；
反应参数为：94℃预变性3min后，按以下程序进行PCR扩增，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min30s，共33个循环，最后72℃延伸5min。反应完成后进行琼脂糖凝胶电泳，得到图2，图2中，M：D2000 Marker；泳道1：aroA-U(aroAE.coli上游序列)片段；泳道2：aroA-D(aroAE.coli下游序列)片段；泳道3：FRT(Kan)片段。如图2中第3泳道所示，FRT(Kan)片段大小正确。
用DNA凝胶回收试剂盒按照试剂盒提供的操作步骤回收PCR产物；回收PCR产物加polyA尾巴，反应体系为(10μl)：10×EasyTaqBuffer 1μl，2.5mM dNTPs 0.8μl，EasyTaq DNA Polymerase 0.2μl，PCR产物8μl，72℃孵育18min，加polyA尾巴的PCR产物。
将加polyA尾巴的PCR产物连接入pTG19-T克隆载体，连接反应体系为(10μl)：10×T4 DNA Ligase 1μl，T4DNA Ligase 1μl，pTG19-T(50ng/μl)载体1μl，加polyA尾巴的PCR产物7μl，16℃孵育过夜。将连接产物转化到E.coli Trans1-T1感受态菌株，在含有氨苄抗性的LB培养基上筛选的阳性单克隆菌落，送到英潍捷基(上海)贸易有限公司测序，测序结果正确的菌落在LB液体培养基中培养后用质粒DNA小量试剂盒提取质粒，所获得的质粒即为带有FRT(Kan)片段的pJA1401。对获得的pJA1401质粒用EcoR Ⅰ/HindⅢ双酶切鉴定，得到图3，图3中泳道从左到右依次为：1：EcoRⅠ/Kpn Ⅰ双酶切(pJA1402)；2：Sal Ⅰ/HindIII双酶切(pJA1403)；3：EcoR Ⅰ/HindⅢ双酶切(pJA1401)；M：DL5000Marker；4：EcoR Ⅰ/HindⅢ双酶切(pJA1404)；5：Kpn Ⅰ/HindⅢ双酶切(pJA1405)。从图3第3泳道可以看出，酶切结果正确，表明质粒构建无误。
(2)pJA1402和pJA1403质粒的构建
以E.coli BL21(DE3)菌液为模板，分别用引物P3/P4和P5/P6进行PCR扩增，PCR反应体系为(20μl)：10×EasyTaq Buffer2μl，10mM dNTPs0.4μl，P3(P5)(20μM)0.4μl，P4(P6)(20μM)0.4μl，菌液(OD600≈0.6)1μl，EasyTaq DNA Polymerase0.2μl，ddH2O15.6μl。
反应参数为：94℃预变性3min后，按以下程序进行PCR扩增，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共33个循环，最后72℃延伸5min，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，得到图2。aroA-U和aroA-D片段的大小分别见图2第1和第2泳道，大小正确。
用DNA凝胶回收试剂盒按照试剂盒提供的操作步骤分别回收PCR产物；将回收的PCR产物分别连接入pTG19-T克隆载体，连接反应体系为(10μl)：10×T4DNA Ligase1μl，T4DNA Ligase1μl，pTG19-T(50ng/μl)载体1μl，PCR产物7μl，16℃孵育过夜。
将连接产物分别转化到E.coli Trans1-T1感受态菌株，在含有氨苄抗性的LB培养基上筛选阳性单克隆菌落，送到英潍捷基(上海)贸易有限公司测序，测序结果正确的菌落在LB液体培养基中培养后用质粒DNA小量试剂盒分别提取质粒，所获得的质粒即为带有aroA-U和aroA-D片段的pJA1402和pJA1403质粒。
对获得的pJA1402和pJA1403质粒分别用EcoR Ⅰ/Kpn Ⅰ和SalⅠ/HindIII双酶切鉴定，如图3中的第1和2泳道，电泳结果显示条带大小正确，表明质粒构建无误。
(3)pJA1404质粒的构建
EcoR Ⅰ/Kpn Ⅰ双酶切pJA1402质粒，反应体系(50μl)：pJA1402质粒(50ng/μl)20μl，10×M Buffer5μl，EcoR Ⅰ1.5μl，Kpn Ⅰ 1.5μl，ddH2O 22μl，37℃孵育4h，琼脂糖凝胶电泳后回收小片段(约600bp)，所回收片段为aroA-U.
EcoR Ⅰ/Kpn Ⅰ双酶切pJA1401质粒，反应体系(50μl)：pJA1401质粒(50ng/μl)20μl，10×M Buffer 5μl，EcoR Ⅰ 1.5μl，Kpn Ⅰ 1.5μl，ddH2O 22μl，37℃孵育8h，琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化酶切产物，所得产物即为线性化的pJA1401质粒。
T4DNA Ligase连接反应，反应体系为(10μl)：10×T4 DNALigase 1μl，T4 DNA Ligase 1μl，pJA1401线性化质粒(50ng/μl)2μl，aroA-U(30ng/μl)6μl，16℃孵育过夜，得到连接产物。
将连接产物转化到E.coli Trans1-T1感受态菌株，在含有Kan抗性的LB培养基上筛选阳性单克隆菌落，在LB液体培养基中培养后用质粒DNA小量试剂盒提取质粒，所获得的质粒用EcoR Ⅰ/HindⅢ双酶切鉴定，见图3第4泳道即为构建成功的pJA1404质粒酶切后的产物，酶切产物正确。
(4)pJA1405质粒的构建
用Sal Ⅰ/HindIII双酶切pJA1403质粒，反应体系(50μl)：pJA1403质粒(50ng/μl)20μl，10×K Buffer 7.5μl，Sal Ⅰ 1.5μl，HindIII 1.5μl，ddH2O 19.5μl，37℃孵育4h，琼脂糖凝胶电泳后回收小片段(约500bp)，所回收片段为aroA-D。
Sal Ⅰ/HindIII双酶切pJA1404质粒，反应体系(50μl)：pJA1404质粒(50ng/μl)20μl，10×K Buffer 7.5μl，Sal Ⅰ 1.5μl，HindIII 1.5μl，ddH2O 19.5μl，37℃孵育8h，琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化酶切产物，所得产物即为线性化的pJA1404质粒。
T4 DNA Ligase连接反应，反应体系为(10μl)：10×T4 DNALigase 1μl，T4 DNA Ligase 1μl，pJA1404线性化质粒(50ng/μl)2μl，aroA-D(25ng/μl)6μl，16℃孵育过夜得到连接产物；将连接产物转化到E.coli Trans1-T1感受态菌株，在含有Kan抗性的LB培养基上筛选阳性单克隆菌落，在LB液体培养基中培养后用质粒DNA小量试剂盒提取质粒，所获得的质粒用Kpn Ⅰ/HindⅢ双酶切鉴定，见图3第5泳道，构建的pJA1405质粒酶切后的产物正确。
(5)PCR获得aroA基因敲除打靶片段
以pJA1405质粒为模板，用引物P3和P6进行PCR扩增，PCR反应体系为(50μl)：10×EasyPfu Buffer 5μl，2.5mM dNTPs 5μl，P3(20M)1μl，P6(20μM)1μl，pJA1405(2.5ng/μl)1μl，EasyPfu DNAPolymerase 1μl，ddH2O 36μl。
反应参数为：94℃预变性3min后，按以下程序进行PCR扩增，94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸3min，共33个循环，最后72℃延伸5min，得到PCR产物。
将PCR产物琼脂糖凝胶电泳后，用DNA凝胶回收试剂盒按照试剂盒提供的操作步骤回收PCR产物，所得PCR产物即为aroA基因敲除打靶片段，依次连接的aroA-U基因片段、含有Kan抗性的FRT基因片段和aroA-D基因片段。
实施例2
BL21(DE3)ΔaroA菌株的获得
将质粒pKD46通过热击法转化到BL21(DE3)感受态细胞中，30℃下在含有Ap抗性的LB培养基上筛选阳性单克隆菌落。挑取单菌落在1ml(1.5ml eppendorf离心管)含有Ap的LB液体培养基中30℃振荡孵育7h，将1ml菌液全部加入50ml(250ml三角瓶)含有Ap的LB液体培养基中30℃振荡孵育4h，加入终浓度为0.2％的阿拉伯糖再培养1.5h，然后收集菌体制备电击感受态细胞BL21(DE3)/pKD46。
将实施例1回收的aroA基因敲除打靶片段通过电击转化进BL21(DE3)/pKD46菌株感受态细胞，先30℃振荡孵育1h，再37℃振荡孵育1.5h后，收集菌体，均匀涂布在含有Kan抗性的LB培养基上，37℃培养筛选阳性单克隆菌落。
挑取单菌落，分别加入到1ml(1.5ml eppendorf离心管)含有Ap和Kan抗性的LB液体培养基中，只能在含有Kan抗性的LB液体培养基中生长的菌落为创建正确的菌株BL21(DE3)ΔaroA菌株。
为进一步验证该菌株的正确，采用P1和P2引物分别对BL21(DE3)和BL21(DE3)ΔaroA菌株进行PCR扩增，电泳结果如图4所示。图4中，M：D2000Marker；泳道1：BL21(DE3)菌株；泳道2BL21(DE3)ΔaroA菌株。从图4中可以看出，BL21(DE3)菌株的无扩增产物；BL21(DE3)ΔaroA菌株的扩增产物在1000bp和2000bp中间位置有特异性条带出现，表明本发明所创建菌株的正确性。
实施例3
BLA-(BL21(DE3)ΔaroA)菌株的获得
BL21(DE3)ΔaroA菌株中Kan抗性基因的消除
制备BL21(DE3)ΔaroA菌株电击感受态细胞，将质粒pCP20电击转化入BL21(DE3)ΔaroA感受态细胞，用1ml加有Ap的LB液体培养基复苏菌体，28℃振荡孵育4h，收集菌体，然后均匀涂布在含有Ap的LB固体培养基上，28℃过夜培养筛选阳性单菌落。
挑取单菌落加入700μl(1.5ml eppendorf离心管)液体LB培养基，42℃振荡孵育2.5h后，取100μl菌液均匀涂布在LB固体培养基表面，42℃过夜培养，筛选单菌落，此时的单菌落就是Kan抗性基因已经消除的BLA-(BL21(DE3)ΔaroA)菌株。
为验证所获得BLA-(BL21(DE3)ΔaroA)菌株的Kan抗性基因和pCP20质粒均已消除，将BLA-(BL21(DE3)ΔaroA)菌株的单菌落分别加入到500μl(1.5ml eppendorf离心管)含有Ap和Kan的LB液体培养基中，37℃过夜培养均没有菌体生长，表明所获得菌株中不再含有Kan抗性基因和pCP20质粒。
为进一步验证，用P7和P8引物对BL21(DE3)和BLA-(BL21(DE3)ΔaroA)菌株分别进行PCR扩增，电泳结果如图5所示。图5中，M：D2000Marker；泳道1：BLA-(BL21(DE3)ΔaroA)菌株；泳道2：BL21(DE3)菌株。从图5可以看出，BLA-(BL21(DE3)ΔaroA)菌株无PCR产物产生，说明aroA基因已被敲除；而BL21(DE3)菌株的PCR产物在1000bp和2000bp之间有特异性条带出现，与aroA基因的大小一致。该结果表明本发明所创建菌株BLA-(BL21(DE3)ΔaroA)菌株中的aroA基因已经被敲除掉。
实施例4
BL21(DE3)ΔaroA菌株在不同培养基的生长情况
(1)LB培养基
挑取BL21(DE3)和BL21(DE3)ΔaroA菌株的单菌落，分别接种到1ml(1.5ml eppendorf离心管)液体LB培养基中，37℃振荡培养，OD600达到0.5左右时，将两个菌液分别加入到50ml(250ml三角瓶)LB液体培养基，使得加入菌液后的OD600为0.005，37℃振荡培养。
分别于培养后的1.5h、3h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、20h和24h取1ml菌液测定OD600，所绘制的生长曲线如图6所示，可以看出，在LB培养基中BL21(DE3)和BL21(DE3)ΔaroA菌株的生长差异不大。
(2)M9基本培养基
挑取BL21(DE3)和BL21(DE3)ΔaroA的单菌落，分别接种到1ml(1.5ml eppendorf离心管)液体LB培养基中，37℃振荡培养，OD600达到0.5左右时，离心收集菌体，用无菌M9基本培养基洗涤菌体3次，然后将用M9基本培养基悬浮的菌液分别加入到50ml(250ml三角瓶)M9基本培养基中，使得加入菌液后的OD600为0.005，37℃振荡培养。
每隔2小时取1ml菌液测定OD600，26h为最后一次取样，绘制生长曲线如图7所示。从图7可以看出，BL21(DE3)ΔaroA菌株在M9基本培养基中不能生长，BL21(DE3)菌株在M9基本培养基中生长正常。
(3)M9基本培养基和添加有芳香族氨基酸的M9基本培养基
挑取BL21(DE3)ΔaroA的单菌落，接种到1ml(1.5ml eppendorf离心管)液体LB培养基中，37℃振荡培养，OD600达到0.5左右时，离心收集菌体，用无菌M9基本培养基洗涤菌体3次，然后将用M9基本培养基悬浮的菌液分别加入到50ml(250ml三角瓶)M9基本培养基和添加有芳香族氨基酸的M9基本培养基中，使得加入菌液后的OD600为0.005，37℃振荡培养。
培养36h前每隔2h取1ml菌液测定OD600，之后42h和48h再分别取1ml菌液测定OD600。根据测定结果绘制生长曲线，如图8所示，BL21(DE3)ΔaroA菌株在M9基本培养基中不能生长，在添加有芳香族氨基酸的M9基本培养基中在16h后迅速生长，之后表现稳定的生长趋势。
实施例5
BL21(DE3)ΔaroA菌株在功能互补的应用
本项目组研究人员先前从苏棉18个品种中克隆陆地棉的GhEPSPS基因(GeneBank登录号：EU797516)的CDS序列，在该序列5’端和3’端分别添加EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点后连入pET32a原核表达载体，构建含有棉花GhEPSPS基因的pET32a质粒，命名为pJA1406。
通过电击法将质粒pJA1406转化入BL21(DE3)ΔaroA菌株，获得BL21(DE3)ΔaroA/pJA1406菌株。
挑取BL21(DE3)ΔaroA和BL21(DE3)ΔaroA/pJA1406菌株的单菌落，分别接种到1ml(1.5ml eppendorf离心管)液体LB培养基中，37℃振荡培养，OD600达到0.5左右时，离心收集菌体，用无菌M9基本培养基洗涤菌体3次，然后将用M9基本培养基悬浮的菌液分别加入到50ml(250ml三角瓶)M9基本培养基中，使得加入菌液后的OD600为0.005，37℃振荡培养。
每隔2小时取1ml菌液测定OD600，26h最后一次取样，绘制生长曲线如图9所示，BL21(DE3)ΔaroA菌株在M9基本培养基中不能生长，BL21(DE3)ΔaroA/pJA1406菌株在M9基本培养基中生长情况基本同BL21(DE3)菌株的一致。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种BL21(DE3)ΔaroA菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
构建aroA基因敲除打靶片段；
将pKD46质粒转入BL21(DE3)菌株，获得BL21(DE3)/pKD46菌株；
将aroA基因敲除打靶片段转化进入BL21(DE3)/pKD46菌株，获得所述BL21(DE3)ΔaroA菌株。
2.根据权利要求1所述的BL21(DE3)ΔaroA菌株的构建方法，其特征在于，所述aroA基因敲除打靶片段包括依次连接的aroA-U基因片段、FRT基因片段和aroA-D基因片段；所述aroA-U基因片段和aroA-D基因片段的长度均大于500bp。
3.根据权利要求2所述的BL21(DE3)ΔaroA菌株的构建方法，其特征在于，所述FRT基因片段含有Kan抗性基因片段。
4.根据权利要求3所述的BL21(DE3)ΔaroA菌株的构建方法，其特征在于，所述aroA基因敲除打靶片段的构建包括以下步骤：
以pKD4质粒为模板，P1和P2为引物进行PCR扩增获得两端含有FRT位点的Kan抗性基因片段FRT，将该片段连入克隆载体pTG19-T，获得pJA1401质粒，其中，P1和P2引物为：
P1：5’-GTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’
P2：5’-ATGGGAATTAGCCATGGTCC-3’；
以BL21(DE3)菌株为模板，P3和P4为引物进行PCR扩增获得两端含有EcoR Ⅰ和Kpn Ⅰ酶切位点的aroA基因上游序列aroA-U，将该片段连入克隆载体pTG19-T，获得所述pJA1402质粒，其中，P3和P4引物为：
P3：5’-CCGgaattcGGCAAAGATGTGGTGGTCGC-3’
P4：5’-CCGggtaccCAGGCTGGCTGTGGGGATTA-3’；
以BL21(DE3)菌株为模板，P5和P6为引物PCR进行扩增获得两端含有Sal Ⅰ和HindIII酶切位点的aroA基因下游序列aroA-D，将该片段连入克隆载体pTG19-T，构建获得pJA1403质粒，其中，P5和P6引物为：
P5：5’-CCGgtcgacACGGGCAATAAATAGCCAAATC-3’
P6：5’-GCGaagcttTCCATCAGGCCACTGTAGACAC-3’；
用EcoR Ⅰ和Kpn Ⅰ分别双酶切pJA1402和pJA1401质粒，将获得的两端含有EcoR Ⅰ和Kpn Ⅰ粘性末端的aroA-U基因片段连入线性化的pJA1401质粒，得到含有aroA-U基因片段和含有Kan抗性的FRT基因片段的pJA1404质粒；
用Sal Ⅰ和HindIII分别双酶切pJA1403和pJA1404质粒，将获得两端含有Sal Ⅰ和HindIII粘性末端的aroA-D基因片段连入线性化的pJA1404质粒，构建获得含有依次连接的aroA-U基因片段、FRT(Kan)基因片段和aroA-D基因片段的pJA1405质粒；
以P3和P6作为引物，pJA1405质粒为模板，PCR扩增即可获得aroA基因敲除打靶片段。
5.一种权利要求4所述的BL21(DE3)ΔaroA菌株的构建方法中得到的含有依次连接的aroA-U基因片段、FRT(Kan)基因片段和aroA-D基因片段的pJA1405质粒。
6.一种权利要求4所述的BL21(DE3)ΔaroA菌株的构建方法中得到的含有依次连接的aroA-U基因片段、FRT(Kan)基因片段和aroA-D基因片段的得aroA基因敲除打靶片段。
7.含有权利要求4所述的BL21(DE3)ΔaroA菌株的构建方法中得到的pJA1405质粒的菌株。
8.权利要求4所述的BL21(DE3)ΔaroA菌株的构建方法得到的BL21(DE3)ΔaroA菌株。
9.BLA-(BL21(DE3)ΔaroA)菌株，其特征在于，将pCP20质粒转化入权利要求8所述的BL21(DE3)ΔaroA菌株，得到BLA-(BL21(DE3)ΔaroA)菌株。
10.BL21(DE3)ΔaroA菌株在功能互补中的应用。
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