CN104046647A - 一种重组工程介导的苜蓿中华根瘤菌Rm1021基因敲除方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种重组工程介导的苜蓿中华根瘤菌Rm1021基因敲除方法。具体实施步骤为首先通过重叠－延伸聚合酶链式反应扩增获得两侧为针对待敲除基因的约500bp同源片段、中间为卡那霉素抗性基因的融合DNA片段。其次将此DNA片段电转化至异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导重组酶表达的Rm1021细胞中，在卡那霉素抗性筛选之下，卡那霉素抗性基因取代目的基因而获得基因敲除变株。最后将菌株在含0.4％蔗糖的固体培养基中培养以消除含重组酶基因的质粒。所使用的重组酶基因来源于λ噬菌体并克隆在质粒pLS2406之上，pLS2406同时含有负筛选标记sacB基因。

Description

一种重组工程介导的苜蓿中华根瘤菌Rm1021基因敲除方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体是涉及一种重组工程介导的苜蓿中华根瘤菌Rm1021基因敲除方法。

背景技术

随着现代社会的发展，能源问题成为日益突出的世界性问题，各国对能源的需求越来越迫切。如何最大效率地获取自然界现存的能源是能源研究和开发领域的关键之一。氮源是重要的资源，农用饲料和肥料中重要成分为氮的铵盐占据很大的比例。78％的空气为氮气，而氮气为惰性气体，N-N健高度不活泼，常规的化学反应难以将氮气转化为有效的铵盐。因此，如能有效地利用空气中的氮资源是获得能源的关键。

固氮微生物是指能够将氮气以化合物的形式固定在与其共生的植物根部并形成根瘤的一类微生物。根瘤菌是最常见的一种生物固氮菌。根瘤菌和紫花苜蓿共生，通过结瘤基因的时序表达，诱导宿主紫花苜蓿形成根瘤，从而将大气中惰性的分子氮转化成可被植物吸收利用的化合物形式的氮。苜蓿中华根瘤菌Rm1021是最为重要的一种根瘤菌，属革兰氏阴性细菌。由于其强大的生物固氮能力，Rm1021的生物学研究较为透彻。

Rm1021的基因组已于2003年测序和解析，但海量的基因组信息远未得到充分利用，仍有许多的基因功能未能阐明。研究基因功能的一个关键方法是构建此基因敲除的变株，通过变株与原株在许多条件下的比较可以得出相应基因的生物学功能。

目前Rm1021基因敲除最为常规的方法是三亲结合转移法。其实验步骤是首先PCR获得并克隆待敲除基因两侧的约1.0kb的同源片段，克隆至含负筛选标记sacB的质粒上后，将含此敲除的重组质粒的大肠杆菌、含tra基因(行使基因的转移的功能)的但不同抗性的大肠杆菌菌株和Rm1021这三个菌株混合，在含重组质粒抗性的平板上，筛选在菌株的重组功能作用下利用一侧同源片段整合至基因组上的整合型菌株。sacB基因编码的蔗糖6-果糖基转移酶催化蔗糖生成对菌株有毒性的聚蔗糖，利用含sacB基因的质粒不能在含蔗糖的培养基上生长的特性，随后将所获得的菌株在含蔗糖的培养基上生长，促使菌株的重组功能催化另外一侧同源片段发生整合而去除质粒骨架部分，最终筛选取抗菌株的基因型而得到基因敲除变株。这种经典的基因敲除方法耗时(涉及多个基因克隆和测序)、繁琐(多菌株和多个操作步骤)且效率较低(最终获得的克隆中可能含有较大比例的原株)。

发明内容

为简便快捷地对Rm1021的基因进行敲除，以高通量地对Rm1021进行功能研究并最终开发出具有更高效率的根瘤固氮微生物基因工程菌株，本发明提供了一种利用重组工程手段对Rm1021进行基因敲除方法。

本发明所涉及的一种重组工程介导的苜蓿中华根瘤菌Rm1021基因敲除方法，包括以下步骤：

(1)通过重叠－延伸聚合酶链式反应扩增获得两侧为针对待敲除基因500bp同源片段、中间为卡那霉素抗性基因的融合DNA片段；

(2)融合DNA片段电转化至由异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导的、克隆在质粒pLS2406中的重组酶基因表达的Rm1021细胞中，在卡那霉素抗性筛选之下，卡那霉素抗性基因取代目的基因而获得基因敲除变株；

(3)将基因敲除变株在含0.4％蔗糖的固体培养基中培养以消除含重组酶基因的质粒pL2S406。

本发明所使用的是重组工程方法来介导所转化的线性片段和基因组上同源片段之间的同源重组。重组工程是上世纪90年代末起源的、利用重组酶催化常常是较短的同源片段之间的同源重组而进行基因克隆和基因修饰的一种生物技术手段。短同源片段可通过碱基合成，因此可通过PCR引物的形式加以合成，这就避免了繁琐的基因克隆操作步骤。最常用的重组酶基因是来源自λ噬菌体的、位于一个操纵元上的exo、bet和gam三个基因。各基因的功能为：exo基因编码DNA5'至3'外切酶，其外切双链DNA分子而得到DNA单链；bet基因编码单链结合蛋白，其结合在DNA单链上并行使同源片段之间的同源重组功能；gam基因编码抑制内源性核酸酶的Gam蛋白，可避免细胞本身对外源基因的降解。

本发明所使用的表达重组酶基因的质粒pLS2406是由如下方法获得：以λ噬菌体DNA为模板，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的序列为引物PCR扩增得到1.9kb的DNA片段，以SacI和XbaI酶切后，克隆至以同样酶切的pBluescript II KS(-)，经测序验证，得到重组克隆pNdRed；pNdRed以NdeI和XbaI酶切，分离1.9kb的DNA片段，与同样酶切的pSRKGm连接，固体培养基中加入25μg/ml庆大霉素，IPTG和X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)进行筛选；挑取白色的克隆提质粒酶切鉴定，得到重组克隆pLS2405；pKsacB以XbaI和BamHI酶切，分离1.8kb的sacB基因片段，与以同样酶切并经碱性磷酸酯酶处理的pLS2405相连，通过酶切鉴定获得重组克隆pLS2406。

将重组酶基因自λ噬菌体扩增后克隆在plac启动子之下，plac启动子由调节基因lacI严谨调控。在没有诱导剂存在时lacI基因编码的LacI为抑制蛋白，抑制plac启动子的表达；当环境中含有诱导剂(如本发明中所使用的IPTG)时，诱导剂和LacI结合以解除抑制，plac启动子得以表达，即驱动下游重组酶基因的表达而行使催化作用。plac启动子的严谨性保证了重组酶的瞬时表达(即只在有IPTG存在时才能表达)，这就最大程度地避免了重组酶所催化的、质粒上的DNA片段和基因组上DNA片段以及基因组DNA片段之间的异常重组。

在获得单一的或多个基因敲除变株后，表达重组酶基因的质粒常常不再需要。

为达到这一目的，pLS2406还克隆有sacB基因，这样将含有pLS2406的菌株在含有0.4％蔗糖的培养基上生长，sacB基因行使负筛选作用，子代细胞中含有sacB基因不能生存，因而通过培养即可获得质粒消除的菌株。

Rm1021基因组上的bacA基因和exoR基因敲除的成功敲除证明本本专利方法的可行性。bacA基因在Rm1021基因组上的基因编号为SM_b20999，bacA基因编码一种内膜蛋白，研究表明BacA蛋白失活直接影响菌体分化，无法形成具有共生固氮能力的成熟类菌体而丧失与宿主植物建立有效共生固氮的能力。因此bacA基因敲除变株将在研究生物固氮的机理及如何提高固氮能力方面有着重要的应用。exoR基因在Rm1021基因组上的基因编号为SMc02078，exoR基因是Rm1021胞外多糖生物合成的关键调节基因。Rm1021的胞外多糖是Rm1021与植物紫花苜蓿形成根瘤的生物学过程中的必需化学成分。

本发明的重组工程介导的基因敲除方法省略了基因克隆等耗时繁琐的步骤，因此简洁省时，且可高通量地(即多个基因的同时)进行敲除。鉴于Rm1021在生物固氮方面的重要性，本发明将在生物能源方面有着重要的应用。

附图说明

图1是重组工程法介导的苜蓿中华根瘤菌Rm1021基因敲除示意图。

neo表示卡那霉素抗性基因，其左右两侧分别为针对目的基因上上游和下游同源片段。pLS2406在IPTG诱导之下表达重组酶，重组酶催化线性底物DNA片段和基因组上同源片段之间的同源重组。在卡那霉素的抗性筛选之下，卡那霉素抗性基因取代目的基因，即敲除目的基因。通过整合位点两侧的引物(Pu和Pd)进行PCR扩增以分析所获得基因敲除变株的基因型。

图2是bacA基因敲除变株基因型分析的凝胶电泳结果

[1]λ/HindIII DNA分子量标准(自上而下)：23.1,9.4,6.6,4.4,2.3,2.0kb

[2]以Rm1021原株基因组DNA为模板，R1327-R1328PCR扩增得到2428bp；

[3]以bacA基因敲除变株基因组DNA为模板，R1327-R1328PC扩增得到2210bp；

[4]bacA基因敲除变株扩增所得2210bp以BglII酶切得到745bp和1465bp；

[5]bacA基因敲除变株扩增所得2210bp以NcoI酶切得到962bp和1248bp；

[6]DL2000DNA分子量标准(自上而下)：2.0,1.0,0.75,0.5,0.25,0.1kb。

图3是exoR基因敲除变株基因型分析的凝胶电泳结果

[1]DL2000DNA分子量标准(自上而下)：2.0,1.0,0.75,0.5,0.25,0.1kb；

[2]以Rm1021原株基因组DNA为模板，R1347-R1348PCR扩增得到2277bp；

[3]以exoR基因敲除变株基因组DNA为模板，R1347-R1348PC扩增得到2039bp。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。

实施例中所用到的菌株和质粒，均为已公开的菌株和质粒：

1.Escherichia coli DH10B。基因型F-mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC)φ80ΔlacZΔM15ΔlacX74deoR recA1araD139Δ(ara,leu)7697galU galK rpsL endA1nupG。文献：LifeTechnologies,Inc.Focus,1990,12:19。购自美国Invitrogen公司。

2.Escherichia coli BW25141和pKD4。文献：Datsenko KA,Wanner BL.One-step inactivation ofchromosomal genes in Escherichia coli K-12using PCR products.Proc Natl Acad Sci USA.2000,97(12):6640-5。来自美国Purdue大学Barry Wanner教授。

3.苜蓿中华根瘤菌Rm1021(Sinorhizobium meliloti Rm1021)。文献：Galibert F,Finan TM,LongSR,Puhler A,Abola P,Ampe F,et al.The composite genome of the legume symbiontSinorhizobium meliloti.Science.2001,293(5530):668-72.来自美国Stanford大学SharonLong教授。

4.pBluescript II KS(-)。文献：Alting-Mees MA,Short JM.pBluescript II:gene mapping vectors.Nucleic Acids Res.1989,17(22):9494.购自美国Novagen公司。

5.pSRKGm。文献：Khan SR,Gaines J,Roop RM,2nd,Farrand SK.Broad-host-range expressionvectors with tightly regulated promoters and their use to examine the influence of TraR andTraM expression on Ti plasmid quorum sensing.Applied and environmental microbiology.2008,4(16):5053-62.来自美国University of Illinois大学Urbana-Champaign分校Stephen Farrand教授。

6.pKsacB。文献：杨运文，蒋伏欢，宋杰，尚广东，重组工程法敲除恶臭假单胞菌KT2440的染色体基因，南京师范大学学报(自然科学版)，2011，34(4):96-101。

实施例1.重组酶表达质粒的构建

设计引物RN1：5'-GAAGAGCTCCATATGGATATTAATACTGAAACTG-3'，(SEQ IDNO.1)，设计的SacI和NdeI位点以下划线表示；RN2：5'-GAATCTAGAGTCATCGCCATTGCTCCCCAAATAC-3'，(SEQ ID NO.2)，设计的XbaI位点以下划线表示。以λ噬菌体DNA(购自上海生工生物公司)为模板，RN1和RN2PCR扩增得到1.9kb的DNA片段，以SacI和XbaI酶切后，克隆至以同样酶切的pBluescript II KS(-)，经测序验证，得到重组克隆pNdRed。pNdRed以NdeI和XbaI酶切，分离1.9kb的DNA片段，与同样酶切的pSRKGm连接，固体培养基中加入25μg/ml庆大霉素，IPTG和X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)进行筛选。挑取白色的克隆提质粒酶切鉴定，得到重组克隆pLS2405。pKsacB以XbaI和BamHI酶切，分离1.8kb的sacB基因片段，与以同样酶切并经碱性磷酸酯酶处理的pLS2405相连，通过酶切鉴定获得重组克隆pLS2406。pLS2406即为最终的用于Rm1021基因敲除的表达重组酶质粒。基因克隆的宿主菌均为Escherichia coli DH10B。

实施例2.苜蓿中华根瘤菌Rm1021基因组上bacA基因的敲除

1.Rm1021电转化感受态细胞的制备和pLS2406的转化

自-80℃冻存管划线至Rm1021至LBMC固体培养基，30℃培养约60h。单菌落转接至3ml LBMC，于30℃，220rpm振荡培养约36h后，2ml转接100ml LBMC，调节OD600约为～0.1，继续培养至OD600约为0.6时，离心，弃上清。菌体沉淀以冰冷的10％甘油洗涤三次，最终悬浮于200μl的冰冷10％甘油中，50μl分装。将100ng的pLS2406加至感受态细胞中，轻弹混匀，转移至冰上冷却的1mm电转杯，以2.1kV电击转化，电转化仪为美国Bio-Rad公司的Gene Pulser^II。电转化后，加入1ml的SOC悬浮，于30℃，220rpm孵育4h。随后铺布于含25μg/ml庆大霉素的LBMC固体培养基，30℃培养约60h，获得转化克隆。

LBMC培养基的配制(％)：蛋白胨1.0g；酵母提取物0.5g；氯化钠0.5g，2.5mM MgSO₄，2.5mM CaCl₂。前三组分混合溶解后，调节至pH7.0。115℃灭菌20min。分别单独灭菌1MMgSO₄和1M CaCl₂，使用前加入。固体培养基加入1.5-2.0％的琼脂。用于质粒消除时的LBMC培养基不加NaCl。

SOC培养基的配制(％)：蛋白胨2.0g；酵母提取物0.5g；氯化钠0.05g，氯化钾0.019g，pH7.0。115℃灭菌20min。使用前加入单独无菌的1M MgCl₂溶液1ml、单独无菌的1M MgSO₄溶液1ml和过滤除菌的20％葡萄糖溶液2ml。

2.诱导重组酶表达的Rm1021/pLS2406的电转化感受态细胞的制备和DNA转化

Rm1021/pLS2406的固体平板和液体培养均加入25μg/ml的庆大霉素。同上扩大培养至OD600约为0.2时，加入1mM的IPTG，进行培养至OD600约为0.6时，离心，弃上清，后续的菌体洗涤至电转化处理同上。

3.bacA基因敲除

重组工程法介导的苜蓿中华根瘤菌Rm1021基因敲除示意图如图1所示。依此示意图所示，首先进行bacA基因敲除。

为简化质粒pKD4上卡那霉素抗性基因的结构，设计引物KD1：5'-GGAATCGATTATGGACAGCAAGCGAACCGG-3'，(SEQ ID NO.3)，设计的ClaI位点以下划线表示；KD2：5'-GGGTCTAGACTCAGAAGAACTCGTCAAGAAG-3'，(SEQ ID NO.4)，设计的XbaI位点以下划线表示。以pKD4为模板,KD1和KD2为引物PCR扩增1.0kb卡那霉素抗性基因，1.0kb以ClaI-XbaI酶切后与pKD4以ClaI-XbaI酶切所得的1.5kb载体部分连接，转化E.coli BW25141，以50μg/ml氨苄青霉素和30μg/ml卡那霉素进行筛选，经提质粒酶切鉴定得到重组质粒pLS1918。

以重叠延伸PCR(OE-PCR)来获得两侧含同源区域的、用于基因敲除的线性底物DNA片段。第一轮的PCR为根据已报道的Rm1021基因组序列(GenBank收录号为NC_003047)扩增目的基因上游和小游各约0.5kb的片段以及扩增卡那霉素抗性基因片段。菌落PCR扩增Rm1021基因组DNA片段的方法如下：Rm1021小菌体块悬浮于50μl裂解缓冲液(5mM Tris.ClpH8.0，2mM EDTA pH8.0，0.5％triton X-100)，100℃热处理3分钟，13200rpm，高速离心3分钟，取5μl上清用于50μl PCR反应。

设计三对引物R1321：5'-AAGAACGGCATCAAGGGCTTTC-3'，(SEQ ID NO.5)，R1322：5'-ATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTAACGGCGGGCATCAGAAGGC-3'，(SEQ ID NO.6)；R1323：5'-GCCTTCTGATGCCCGCCGTTAAACAAATAGGGGTTCCGCGC ACAT-3'，(SEQ ID NO.7)，R1324：5'-GAACTTCGGAATAGGAACTAAGGACAAGGGACGGCACTCTCGTTTC-3'，(SEQ ID NO.8)；R1325：5'-GAAACGAGAGTGCCGTCCCTTG TCCTTAGTTCCTATTCCGAAGTTC-3'，(SEQ ID NO.9)，R1326：5'-TCTATGCGATCGGCCTGCTGG-3'，(SEQ ID NO.10)。其中R1322和R1323以及R1324和R1325为反向互补序列，为第二步的OE-PCR模板之间的重叠序列部分。以Rm1021基因组DNA为模板，R1321和R1322PCR扩增得到bacA基因上游0.5kb，R1325和R1326PCR扩增得到bacA基因下游0.5kb；以pLS1918为模板，R1323和R1324PCR扩增得到1.0kb的卡那霉素抗性基因片段。三个PCR产物乙醇沉淀回收后，各50ng合并为模板，R1321和R1326PCR扩增得到2.1kb的线性底物DNA片段。乙醇沉淀回收后溶于ddH₂O，调节浓度为0.2μg/μl。

制备IPTG诱导重组酶表达的Rm1021电转化感受态细胞，转化1μg的2.1kb DNA片段，1ml SOC悬浮液涂布含25mg/ml庆大霉素的LBMC平板，约得到40个抗性克隆。首先将所得到克隆以相同抗性平板划线扩大培养，再以菌落PCR的方法验证其基因型。

设计引物R1327：5'-GAAGCCTGGAAGAAAGCCGG-3'，(SEQ ID NO.11)和R1328：5'-TCCTTGCCTGGCTGATCACC-3'，(SEQ ID NO.12)。以抗性克隆基因组DNA为模板，R1327和R1328进行PCR扩增，并以Rm1021原株为对照。随机的10个克隆PCR分析表明8个菌株为变株，另外两个为原株，典型的bacA基因敲除变株的基因型分析的结果见图2。Rm1021原株和抗性变株扩增的大小有较为明显的差别，为进一步验证变株扩增序列的正确性，将扩增变株所得2210bp分别以位于卡那霉素抗性基因中两个酶切位点BglII和NcoI进行酶切，所得大小与预期相符，而原株的扩增产物中没有这两个酶切位点。最终通过测序验证变株扩增序列的正确。最后将bacA基因敲除变株命名为LS2423。

4.基因敲除变株中pLS2406的消除

将含有pLS2406的LS2423小块菌体悬浮至1ml LB，铺布含0.4％蔗糖但不含氯化钠的LBMC固体平板上，30℃培养60h。随机挑取25个单菌落影印至无抗LBMC平板和含庆大霉素的抗性LBMC平板，培养60h后，发现20个单菌落只能在无抗LBMC平板上生长，而不能在含庆大霉素的平板上生长，这些庆大霉素敏感性菌株即为pLS2406质粒得以消除的变株。

实施例3.苜蓿中华根瘤菌Rm1021基因组上exoR基因敲除

exoR基因敲除的策略同bacA。设计三对引物R1341：5'-TATCCTGACCAGCGGCAGTTC-3'，(SEQ ID NO.13)，R1342：5'-GTGCGCGGAACCCCTATTTGTTCATAACAATCAGTTTCTTTCGTTC-3'，(SEQ ID NO.14)；R1343：5'-GAACGAAAGAAACTGATTGTTATGAACAAATAGGGGTTCCGCGCAC-3'，(SEQ ID NO.15)，R1344：5'-GTCAGGCCGCACGGGACCTCATCCTTAGTTCCTATTCCGAAGTTC-3'，(SEQ ID NO.16)；R134：5'-GAACTTCGGAATAGGAACTAAGGATGAGGTCCCGTGCGGCCTGAC-3'，(SEQ ID NO.17)，R1346：5'-GGAAAAATACCCCTACAAGCTC-3'，(SEQ ID NO.18)。其中R1342和R1343以及R1344和R1345为反向互补序列，为第二步OE-PCR的模板之间的重叠序列部分。

以Rm1021基因组DNA为模板，分别以R1341和R1342PCR以及R1325和R1326扩增得到exoR基因上游和下游各0.5kb；以pLS1918为模板，R1343和R1344PCR扩增1.0kb的卡那霉素抗性基因片段。三个PCR产物乙醇沉淀回收后，各50ng合并为模板，R1341和R1346PCR扩增得到2.1kb的线性底物DNA片段。乙醇沉淀回收后溶于ddH₂O，调节浓度为0.2μg/μl。

1μg的2.1kb DNA片段电转化IPTG诱导重组酶表达的Rm1021电转化感受态细胞，1mlSOC悬浮液涂布含25mg/ml庆大霉素的LBMC平板，约得到65个抗性克隆。以相同抗性平板划线扩大培养后，随机挑取10个抗性菌落PCR。

设计引物R1347：5'-TCGTGGAACAAGCCAGGGATAC-3'，(SEQ ID NO.19)和R1348：5'-TCAATCGCGGATTGCCGGGAG-3'，(SEQ ID NO.20)。以Rm1021原株为对照，对所获得的抗性克隆菌落PCR分析其基因型。PCR分析表明9个菌株为变株，1个为原株，典型的exoR基因敲除变株的基因型分析的结果见图3。最终通过测序验证变株扩增序列的正确，最后将exoR基因敲除变株命名为LS2424。同上进行质粒消除，在30个克隆中有21个失去庆大霉素抗性，表明pLS2406得以消除。

Claims (4)

1.一种重组工程介导的苜蓿中华根瘤菌Rm1021基因敲除方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)通过重叠－延伸聚合酶链式反应扩增获得两侧为针对待敲除基因500bp同源片段、中间为卡那霉素抗性基因的融合DNA片段；

(2)融合DNA片段电转化至由异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导的、克隆在质粒pLS2406中的重组酶基因表达的Rm1021细胞中，在卡那霉素抗性筛选之下，卡那霉素抗性基因取代目的基因而获得基因敲除变株；

(3)将基因敲除变株在含0.4％蔗糖的固体培养基中培养以消除含重组酶基因的质粒pL2S406。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导重组酶表达的Rm1021细胞中，重组酶基因来源于λ噬菌体，通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导而表达；重组酶基因克隆在质粒pLS406上，pLS2406同时含有负筛选标记sacB基因。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述质粒pLS406通过以下步骤构建得到：以λ噬菌体DNA为模板，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的序列为引物PCR扩增得到1.9kb的DNA片段，以SacI和XbaI酶切后，克隆至以同样酶切的pBluescript II KS(-)，经测序验证，得到重组克隆pNdRed；pNdRed以NdeI和XbaI酶切，分离1.9kb的DNA片段，与同样酶切的pSRKGm连接，固体培养基中加入25μg/ml庆大霉素，IPTG和X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)进行筛选；挑取白色的克隆提质粒酶切鉴定，得到重组克隆pLS2405；pKsacB以XbaI和BamHI酶切，分离1.8kb的sacB基因片段，与以同样酶切并经碱性磷酸酯酶处理的pLS2405相连，通过酶切鉴定获得重组克隆pLS2406。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于：将基因敲除变株在含0.4％蔗糖的固体培养基中培养以消除含重组酶基因的质粒pLS406。