CN102071185A

CN102071185A - 恶臭假单胞菌kt2440高效的基因敲除方法

Info

Publication number: CN102071185A
Application number: CN 201010575202
Authority: CN
Inventors: 尚广东; 杨运文; 宋杰; 高九彩
Original assignee: Nanjing Normal University
Current assignee: Nanjing Normal University
Priority date: 2010-12-06
Filing date: 2010-12-06
Publication date: 2011-05-25
Anticipated expiration: 2030-12-06
Also published as: CN102071185B

Abstract

本发明涉及一种通过重组工程手段对恶臭假单胞菌KT2440进行基因敲除的方法。具体方法是首先通过重叠－延伸聚合酶链式反应的手段扩增而获得左右两侧分别为待敲除的靶基因上下游各约500个碱基对的同源基因，中间为卡那霉素抗性基因的DNA片段。再将此DNA片段电转化至以终浓度为2mM间甲基苯甲酸诱导重组酶表达的恶臭假单胞菌KT2440电转化感受态细胞中，通过重组酶介导的同源片段之间的同源重组，卡那霉素抗性基因取代了靶基因而直接获得了靶基因敲除的突变株。本发明所述方法简便快捷，可成为在生物降解有机化合物等方面有着重要应用价值的环境微生物恶臭假单胞菌KT2440的遗传操作手段。

Description

恶臭假单胞菌KT2440高效的基因敲除方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体是涉及一种高效地对恶臭假单胞菌KT2440进行基因敲除的方法。

背景技术

恶臭假单胞菌KT2440（Pseudomonas putida KT2440）是重要的模式环境微生物菌株，广泛应用于生理、生态、生物化学、遗传学等研究，也是表达异源基因的良好宿主菌。恶臭假单胞菌KT2440的基因组在2002年被解析，也是第一个被美国卫生部重组DNA委员会认定对环境安全的革兰氏阴性菌株。恶臭假单胞菌KT2440是迄今遗传研究阐述得最为清晰、代谢多样性研究得最为透彻的腐生假单胞菌，它保留了在环境中生存和发挥功能的特点，在重要的环境活动如元素循环、生物体和非生物体污染物的降解及在生物催化、生物排污、生物塑料等方面有很大的发展潜力。通过遗传操作，使恶臭假单胞菌KT2440为降解多种环境污染物的“超级工程菌”，将对环境保护和生物防治具有重要意义。基因敲除是菌株遗传操作的主要方式，也是进行基因和蛋白功能的研究、阐述生物降解的途径和调控的主要方法，因此发展快速、简便、高效和可以高通量化的基因敲除是充分利用恶臭假单胞菌KT2440的重要前提。

常规的恶臭假单胞菌KT2440基因敲除方法是利用菌株本身所具有的recA重组系统。首先利用聚合酶链式反应（PCR）扩增待敲除的靶基因上游和下游的同源基因，克隆测序正确后，随后将抗性基因克隆至上下游的同源基因中间，接着克隆至不能在恶臭假单胞菌KT2440中自我复制的“自杀”载体中。将重组质粒转化至恶臭假单胞菌KT2440，在抗生素的抗性作用之下，菌株本身所具有的recA重组系统催化同源片段之间的同源重组而将重组质粒整合至基因组，最后通过重组质粒上所携带的编码蔗糖 6-果糖转移酶的sacB基因所行使的负筛选作用，在含10%蔗糖的培养基中促使再发生一次同源重组而去除整合至基因组上的质粒骨架部分，如此抗性基因取代靶基因而实现了基因敲除。

此方法虽然行之有效，但克隆、测序多个步骤耗时、耗力，也增加了实验的费用。也未见采用此方法实现大片段基因敲除的报道，此方法还有着需要特殊的载体、难以高通量化等等缺点。

重组工程是上世纪八十年代末兴起而逐渐成熟的一种DNA克隆和修饰的基因工程技术。它利用重组酶催化的DNA片段之间的同源重组而形式作用。目前所广泛使用的重组酶是来自于lambda噬菌体的exo，bet和gam基因，exo(reda) 　基因编码DNA 5'->3外切酶，其作用于双链DNA得到 3'端突出的DNA分子，bet(redb)基因编码DNA单链结合蛋白，其结合在突出的DNA分子上，Bet兼有重组酶活性，即可催化同源片段之间发生同源重组。gam(redg) 基因编码抑制内源性核酸酶的Gam蛋白，Gam可保护外源的、转化至所研究的宿主菌中的双链DNA片段免受内源性DNA酶的降解。

在大肠杆菌中同源片段的长度可短至36个碱基对，这使得通过简便易行的PCR的手段来获得线性双链DNA分子并用于转化大肠杆菌而实现基因敲除成为可能。Datsenko等研究人员于2000年报道了利用重组工程手段来实现大肠杆菌的基因敲除（Datsenko, K.A. and B.L. Wanner, One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci U S A, 2000. 97(12): 6640-5）。他们将通过PCR获得的、两侧含有同源臂（即与靶基因上下游5' 端或3'端序列一致的一段碱基序列）的抗性基因电转化至经L-阿拉伯糖诱导而表达重组酶的大肠杆菌细胞中，通过一步抗性筛选直接得到了靶基因敲除的大肠杆菌突变株。此研究产生了广泛而深远的影响，促进了重组工程的研究和开发。

重组工程在常规的基因克隆和修饰方法难以进行或效率极低（如DNA片段过大、难以寻找合适的酶切位点、DNA凝胶回收难以进行等等）时有着显著的优势。重组工程避免了电泳、紫外照射（可引入异常突变）、凝胶回收、DNA连接、转化、克隆筛选等等烦琐耗时的操作步骤，可实现高效的基因克隆和修饰。重组工程已逐渐成为常规基因克隆和修饰手段。

重组工程最初是在大肠杆菌的遗传操作中发生、发展和成熟，研究人员不断地将此技术运用于更多地用重要研究价值和实际应用价值的微生物菌种中，多数取得了令人满意的效果。但在不同的微生物中，同源片段的长度需加以调整，且需开发出不同的诱导和表达重组酶的系统。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种通过重组工程的方法来实现恶臭假单胞菌KT2440高效快捷的基因敲除的方法。

在本发明提供了一种运用简便快捷的重组工程法来实现恶臭假单胞菌KT2440基因敲除。含待敲除靶基因上下游的抗性基因的获得是通过重叠－延伸PCR来获得的。首先分别采用PCR的方法扩增待敲除靶基因上游的同源基因、抗性基因和下游的同源基因，分别在上游同源基因和抗性基因之间、抗性基因和下游基因之间设计重叠的碱基序列。将所得的三个片段合并后作为模板，再用两侧的引物扩增得到融合的DNA片段。运用这种重叠－延伸PCR技术可快速地获得用于转化至恶臭假单胞菌KT2440的线性DNA分子。在设计基因敲除的引物时，考虑到待敲除的靶基因两侧的基因分布情形，实现靶基因的读码框内敲除，使得靶基因敲除后所留下的卡那霉素抗性基因不造成极性效应，即不破坏靶基因的相邻基因的表达。

本发明所采用的技术方案包括以下步骤：

（1）通过重叠－延伸聚合酶链式反应的手段扩增而获得左右两侧分别为待敲除的靶基因上下游各500个碱基对的同源基因、中间为卡那霉素抗性基因的DNA片段；

（2）将含重组酶基因的质粒pLS512转化至恶臭假单胞菌KT2440中，制成电转化感受态细胞；

（3）将步骤（1）的得到的DNA片段电转化至以终浓度为2mM间甲基苯甲酸诱导重组酶表达的步骤（2）的恶臭假单胞菌KT2440电转化感受态细胞中，通过重组酶介导的同源片段之间的同源重组，卡那霉素抗性基因取代了靶基因而直接获得了靶基因敲除的突变株。

在得到的突变株中，可能会残余微量的重组酶表达载体pLS512，对此，可通过浓度为10%的蔗糖负筛选作用去除突变株中残余的pLS512质粒。pLS512中含有编码蔗糖 6-果糖转移酶的sacB基因，sacB基因为负筛选标记，通过在培养基中添加浓度为10%的蔗糖去除含sacB基因的重组酶表达载体。

重组酶基因选择是来自于lambda噬菌体的exo，bet和gam，将这三个基因从lambda噬菌体DNA中扩增后，克隆至常规的高拷贝大肠杆菌克隆载体pBluescript KS(-)，待测序正确后，从重组质粒上酶切回收，随后与编码6-果糖基转移酶的sacB基因一起克隆至可在恶臭假单胞菌KT2440中呈游离形式存在的、可自主复制的载体pJB866之上，最终得到重组酶表达载体pLS512。pLS512中重组酶基因置于受间甲基苯甲酸诱导的Pm启动子之下，这样保证了重组酶短暂的、严谨性的诱导表达，避免了过分表达重组酶而导致的异常重组的发生。sacB基因起到负筛选标记的作用，在含10%蔗糖培养基的情况下，sacB基因编码的6-果糖基转移酶催化蔗糖形成对菌株有毒害的聚蔗糖，因此含有sacB基因表达的菌株不能生存。如此可有效地去除突变株中残余的微量pLS512，获得具有良好遗传背景的突变株。

优选实施例中的敲除恶臭假单胞菌KT2440基因组中的1.0kb, 7.3kb和9.3kb三个实验充分证明了本发明方法较常规所使用的方法的优越性即：简便、快捷和可同时进行多个基因敲除的高通量操作。类似的，可采取与基因敲除同样的策略实现基因敲入和基因突变等等研究。

附图说明

图1是11910个碱基对的间甲基苯甲酸诱导重组酶表达的质粒pLS512的图谱。其中：

469-598是受间甲基苯甲酸诱导的Pm启动子序列；

599-1015是编码抑制内源性核酸酶的gam基因的开放阅读框序列；

1021-1806是编码DNA单链结合蛋白的bet基因的开放阅读框序列；

1803-2483是编码DNA 5'->3外切酶的exo基因的开放阅读框序列；

2491-3912是编码6-果糖基转移酶的基因的sacB基因的开放阅读框序列；

4349-4958是双向终止子区域；

5009-6157是调节基因trfA的开放阅读框序列，trfA为质粒复制所必须；

6555-7080是质粒的复制子区域；

7654-8853是四环素抗性基因tetA的开放阅读框序列；

8959-9609是调节基因tetR的开放阅读框序列，tetR为tetA表达所必须；

10064-10174 RK2是质粒结合转移功能片段

10714-11679是调节基因xylS的开放阅读框序列，xylS为Pm活性所必须；

质粒图上的XbaI，NsiI，EcoRI等为限制性酶切位点，括号内的数字表示限制性酶切位点在质粒上的相对位置。

图2是扩增同源基因和抗性基因的重叠－延伸聚合酶链式反应（OE-PCR）以及此片段用于恶臭假单胞菌KT2440基因敲除示意图。

基因表示待敲除的靶基因；上游和下游表示靶基因上游和下游的同源基因， P1和P2为扩增靶基因上游同源基因的引物，P3和P4为扩增卡那霉素抗性基因片段的引物，P5和P6为扩增靶基因下游同源基因的引物，P2和P3、P4和P5含有重叠的碱基以利于重叠－延伸PCR反应的进行；PCR表示聚合酶链式反应；重叠区以含斜线的方框表示；粗线条表示基因组上靶基因两侧片段。首先以P1至P6为引物，PCR扩增出上游同源基因、卡那霉素抗性基因和下游同源基因，随后以三个片段为模板，P1和P6为引物以重叠－延伸PCR扩增出三个片段融合的DNA产物。DNA产物电转化经2mM间甲基苯甲酸诱导重组酶表达的恶臭假单胞菌KT2440/pLS512的电转化感受态细胞，在卡那霉素的筛选作用下，经过转化的DNA与恶臭假单胞菌KT2440的基因组上的靶基因两侧的同源基因发生同源重组，卡那霉素抗性基因取代了靶基因，最终获得靶基因敲除的突变株。

图3是实施例2中PP_3948基因敲除所得突变株的基因型分析的凝胶电泳结果

1. DL2000分子量标准：2.0,1.0,0.75,0.5,0.25,0.1 kb；

2. 以变株的基因组为模板，扩增得到2.2 kb片段；

3. 以原株的基因组为模板，扩增得到2.25 kb片段；

4. 2.2 kb以PstI酶切得到 0.9kb和1.3kb；

5. 2.25 kb以PstI酶切得到 0.7kb和1.5kb。

图4是实施例3中PP_1384基因敲除所得突变株的基因型分析的凝胶电泳结果

1. DL2000分子量标准：2.0,1.0,0.75,0.5,0.25,0.1 kb；

2. 以变株的基因组为模板，扩增得到2.1 kb片段；

3. 2.1 kb以PstI酶切得到0.3, 0.6kb和1.2kb；

4. 2.1 kb以NcoI酶切得到0.8kb和1.3kb；

（注：在所使用的PCR条件下，引物从原株KT2440的基因组中不能扩增出产物，故未加原株的PCR结果）。

图5是实施例4中PP_2064 基因敲除所得突变株的基因型分析的凝胶电泳结果

1. DL2000分子量标准：2.0,1.0,0.75,0.5,0.25,0.1 kb；

2. 以变株的基因组为模板，扩增得到2.1 kb片段；

3. 2.1 kb以NcoI酶切得到0.9kb和1.2kb；

4. 2.1kb以PstI酶切得到0.8kb和1.3kb；

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。

实施例中所用到的菌株和质粒，均为已公开的菌株和质粒：

1. Escherichia coli DH10B。基因型F^- mcrA D(mrr-hsdRMS-mcrBC)f80　　　　　　　　　dlacZDM15 DlacX74 deoR recA1 araD139D(ara, leu)7697 galU galK rpsL endA1 nupG. 。文献：Life Technologies, Inc. Focus, 1990, 12:19。购自美国Invitrogen公司。

2. Pseudomonas putida KT2440。文献：Nelson KE, Weinel C, Paulsen IT et al. Complete genome sequence and comparative analysis of the metabolically versatile Pseudomonas putida KT2440. Environ Microbiol 2002, 4:799-808。来自美国The Institute for Genomic Research的Karen Nelson 博士。

3. pBluescript II KS(-)。文献：Alting-Mees MA, Short JM. pBluescript II: gene mapping vectors. Nucleic Acids Res. 1989, 17(22):9494.购自美国Novagen公司。

4.pEX100Tlink。文献：Quenee L, Lamotte D, Polack B. Combined sacB-based negative selection and cre-lox antibiotic marker recycling for efficient gene deletion in pseudomonas aeruginosa. Biotechniques. 2005, 38(1):63-7. 来自法国Centre Hospitalier Universitaire的Benoit Polack教授。

5. pJB866。文献：Blatny JM, Brautaset T, Winther-Larsen HC, et al. Improved broad-host-range RK2 vectors useful for high and low regulated gene expression levels in gram-negative bacteria.Plasmid. 1997, 38(1):35-51.来自挪威Norwegian University of Science and Technology的Svein Valla教授。

6. pKD4。文献：Datsenko KA, Wanner BL. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci U S A. 2000, 97(12):6640-5. 来自美国Purdue大学Barry Wanner的教授。

7. pGEM-T easy，购自美国Promega公司。

实施例1. 间甲基苯甲酸诱导重组酶表达的质粒的构建

1.大肠杆菌DH10B的电转化感受态的制备和DNA转化

　　自平板上接种新鲜划线培养的单菌落至2ml LB液体培养基中37^oC振荡过夜,以1/50体积转至50 ml LB,振荡培养至菌体OD₆₀₀约为0.6。将菌液倒入预冷的离心管，冰浴10分钟，4^oC，5000rpm离心5分钟，弃上清。以10%的甘油洗涤沉淀两次，最后悬浮于200ml的10%甘油中，50ml每管分装。

　　将溶解于TE缓冲液或双蒸水的DNA加至50ml冰上融化的DH10B的电转化感受态细胞中，轻弹混匀。将混合液转移至冰上预冷的1mm电转杯中，电击转化。电转化条件：200Ω，1800 V，Bio-Rad公司Gene Pulser II^R电转化仪。加1ml LB液体培养基至电转杯，吹打混匀，将溶液转移至一个无菌的1.5ml eppendorf管中，37^oC振荡培养60分钟后，转化液涂布在相应抗生素的抗性平板上，37^oC培养。挑取单菌落，在含相应抗生素的液体培养基中培养，提取质粒进行酶切和测序鉴定。

LB培养基的组成（%）：蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，氯化钠1g，固体培养时加1.5%（w/v）的琼脂。115^oC灭菌20min。

TE缓冲液的组成：10mM三羟甲基氨基甲烷的盐酸盐，1mM二胺四乙酸的二钠盐，pH 8.0。

聚合酶链式反应（PCR）

设立50ml的PCR反应体系，分别加入：

37.7 ml dd H₂O；

5 ml 10×PCR 反应缓冲液；

4 ml 25 mM MgCl₂；

1 ml 10 mM dNTP；

0.5 ml 上游引物（终浓度0. 5mM）；

0.5 ml 下游引物（终浓度0. 5mM）；

1 ml模板（质粒50ng，基因组DNA 200ng）；

0.3ml Ex-Taq聚合酶（5U/ml）。

PCR反应程序为：首先在97°C变性处理5分钟，循环的条件为：97°C 45 秒，60°C 1分钟，72°C 1-2 分钟（视目的产物大小而定），共30个循环。最后在72 °C延伸10分钟。使用仪器为Bio-rad公司的PTC-200型号的PCR仪。

反应完毕后，以1%的琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶中加入20 mg/ml的溴化乙锭的。PCR产物沉淀回收：加1/10体积3M pH 5.2 醋酸钠及2倍体积冰乙醇，混匀，-80^oC冷冻5 min，13200 rpm离心10分钟，弃上清，加500 ml 70%乙醇洗涤，13200 rpm离心5分钟，弃上清，室温至干，加适量体积的无菌水溶解。

质粒构建

设计引物NR1：5'- GGGGAGCTCCATGGATATTAATACTGAAACTG-3'，（SEQ ID NO.1）；NR2：5'-GGGTCTAGAGTCATCGCCATTGCTCCCCAAATAC -3'，（SEQ ID NO.2）。以lambda 噬菌体DNA（购自大连宝生物公司）为模板，PCR扩增出1.9kb的重组酶基因（gam，exo和bet）片段，以SacI和XbaI酶切后克隆至pBluescript II KS(-)的SacI和XbaI位点，得到重组克隆pNcRed。

设计引物SAK1：5'- GGGTCTAGATTATTTGTTAACTGTTAATTGTC-3'，（SEQ ID NO.3）；SAK2：5'- GGGGGATCCGGCAACTTTATGCCCATGCAAC-3'，（SEQ ID NO.4）。以pEX100Tlink为模板，PCR扩增出1.9kb的sacB基因片段，以XbaI-BamHI酶切后克隆至pBluescript II KS(-)的XbaI和BamHI位点，得到重组克隆pKsacB。

NcoI和XbaI酶切pNcRed，分离1.9kb的重组酶基因片段；XbaI和BamHI酶切pKsacB，分离1.9kb的sacB基因片段。两片段和以AflIII和BamHI酶切并通过碱性磷酸酯酶去磷酸化的载体pJB866相连。NcoI和AflIII为同尾酶，二者所作用于DNA所产生的粘性碱基末端相连后，二个的酶切位点均消失。经四环素抗性筛选，提质粒酶切验证，最终得到间甲基苯甲酸诱导重组酶表达的质粒pLS512。pLS512的质粒图谱如说明书附图中的图1所示。

实施例2. 恶臭假单胞菌KT2440基因组PP_3948基因1.0kb片段的敲除

1.恶臭假单胞菌KT2440电转化感受态细胞的制备和pLS512的转化

从储存于-70^oC的恶臭假单胞菌KT2440冻存管中划线至LB固体培养基，过夜培养，挑取单菌落至2ml EM液体培养基中30^oC振荡过夜，以1/50体积转至50 ml EM培养基，振荡培养至菌体OD₆₀₀约为0.6。将菌液倒入预冷的离心管，冰浴10分钟，4^oC，7000rpm离心5分钟，弃上清。以冰冷的3 mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES，pH=7.0）液洗涤菌体3次，菌体浓缩300倍，50ml分装并用于一次电转化。

pLS512的转化：将溶解于TE缓冲液的pLS512加至50ml的感受态细胞，轻弹混匀。将混合液转移至冰上预冷的1mm电转杯中，电击转化。电转化条件：1.2 kV，200 Ω，Bio-Rad公司Gene Pulser II^R电转化仪。电转化后，以1 mL SOC培养基悬浮，转至15 ml聚丙烯离心管，30^oC振荡培养培养2 h，涂布至含10mg/ml四环素的LB平板。

EM培养基的组成（%）：蛋白胨2g，酵母膏5g，氯化钠5g，葡萄糖 5g，pH7.3， 115^oC灭菌20min。

SOC培养基的组成（%）：蛋白胨2.0g；酵母提取物0.5g；氯化钠0.05g，氯化钾0.019g，pH 7.0。115^oC灭菌20min。使用前加入单独无菌的1M氯化镁溶液1ml，单独无菌的1M硫酸镁溶液1ml和过滤除菌的20%葡萄糖溶液2ml。

诱导重组酶表达的恶臭假单胞菌KT2440/pLS512的电转化感受态细胞的制备和DNA转化

自含10mg/ml四环素的LB平板上挑取KT2440/pLS512单菌落，接至2ml 含10mg/ml四环素的EM液体培养基中30^oC振荡过夜，以1/50体积转至相同培养基，振荡培养至菌体OD₆₀₀约为0. 2时，加入终浓度为2mM的间甲基苯甲酸，继续培养至OD600约为0.6。后续的操作与KT2440电转化感受态细胞的制备和DNA的转化的方法相同。

3. PP_3948基因敲除

设计引物PCR扩增含同源片段的卡那霉素抗性基因。R401：5'-GC CGGCGCCGCCGGCCGCAATATC，（SEQ ID NO. 5）；R402：5'-CCGGTTCGCTT GCTGTCCATACAGCGAGGTACGGATGCCAGT，（SEQ ID NO. 6）；R403：5'-CA CTGGCATCCGTACCTCGCTGTATGGACAGCA AGCGAACCGG，（SEQ ID NO. 7）；R404：5'-CTGCACCGCACGCGACAGCAGCATCAGAAGAACTCGTCA AGA AG，（SEQ ID NO. 8）；R405：5'-CTTCTTGACGAGTTCTTCTGATGCTGCTGTC GCGTGCGGTGCAG，（SEQ ID NO. 9）； R406：5'-GGGCCGGGTATGCGGCTGC CATTG，（SEQ ID NO. 10）。 R402与R403有43个碱基对的重叠，R404与R405有44个碱基对的重叠，均以反向互补的形式呈现。

以恶臭假单胞菌KT2440基因组DNA为模板，R401和R402为引物，PCR扩增得到PP_3948基因上游500bp的DNA片段；R405和 R406为引物，PCR扩增得到PP_3948基因下游500bp的DNA片段。以含卡那霉素抗性基因的pKD4质粒为模板，R403和 R404为引物，PCR扩增得到0.9kb的卡那霉素抗性基因片段。分别凝胶回收这三个片段，各20ng的三个片段为模板，R401和R406为引物，通过重叠－延伸聚合酶链式反应（OE-PCR）扩增得到三个片段融合的1.9kb的DNA片段。

转化2mg的1.9kb的DNA片段，在卡那霉素抗性筛选之下，得到抗性转化子。经三次实验，平均可获得210个转化子。在没有加间甲基苯甲酸进行诱导的对照实验中，没有或仅有一两个抗性转化子的出现，这表明间甲基苯甲酸诱导表达的重组酶所催化的同源重组是得到重组菌株的决定因素。

设计引物以菌落PCR的方法来验证卡那霉素抗性敲入至基因组所得变株的基因型。R407：5'-GGCCCCAAGTACGGCTGCGGC，（SEQ ID NO. 11）；R408：5'-CCACGCGGGTACGCCACTTC，（SEQ ID NO. 12。R407位于R401上游100bp，R408位于R406下游200p。随机挑取10个抗性菌落，以其基因组为模板， R407和 R408为引物，PCR扩增发现所用的菌落均得到2.2 kb的扩增片段，而以原株的基因组为模板扩增得到2.25 kb片段。2.2 kb和2.25 kb两个片段的酶切结果与预期完全一致。

扩增同源片段和抗性基因的重叠－延伸聚合酶链式反应（OE-PCR）以及此片段用于恶臭假单胞菌KT2440基因敲除示意图见图2。PP_3948基因敲除的实验结果图见图3。

随机挑取两个变株的扩增产物，克隆至pGEM-T easy后，测序发现序列与预期完全一致。证明恶臭假单胞菌KT2440基因组中PP_3948基因中1.0kb的片段被敲除。

从重组菌株中的消除

pLS512中sacB基因编码6-果糖基转移酶，此酶催化蔗糖为对假单胞菌有毒害作用的果聚糖，含有pLS512的菌株不能在含有蔗糖的培养基上生长，因此在蔗糖的负筛选作用下可得到pLS512消除的菌株。

将含有pLS512的重组菌株划线于含10%蔗糖的LB固体平板上，30^oC培养过夜，挑取单菌落至LB液体培养基中培养至对数生长期，以1x10^-6稀释后涂布LB固体平板，随机挑取30个单菌落至无抗LB平板和含四环素的抗性LB平板，过夜培养发现所有的菌落均只能在无抗LB平板上生长，而不能在含四环素抗性的LB平板上生长，这些四环素敏感性菌株即为pLS512消除的菌株。

实施例3. 恶臭假单胞菌KT2440基因组PP_1384至PP_1388 7.3kb片段的敲除

诱导重组酶表达的恶臭假单胞菌KT2440/pLS512的电转化感受态细胞的制备和DNA转化同实施例2。

设计引物PCR扩增含同源片段的卡那霉素抗性基因。KSD1：5'- GTCGACGA AGTTGCGGTTGATG，（SEQ ID NO.13）；KSD2：5'-CCGGTTCGCTTGCTGTC CATATGATCGGCCTTGTTGCAAAAGC，（SEQ ID NO.14）； KSD3：5'-GCTTTT GCAACAAGGCCGATCATATGGACAGCAAGCGAACCGG，（SEQ ID NO.15）；KSD4：5'- GAC AAAACAAGGTATTCCCGTGTCAGAAGAACTCGTCAAGAA G，（SEQ ID NO.16）；KSD5：5'-CTTCTTGACGAGTTCTTCTGACACGGGAATA CCTTGTTTTGTC，（SEQ ID NO.17）； KSD6：5'-GCGTGCCGACATTGGGTCG AAC，（SEQ ID NO.18）。KSD2与KSD3之间以及KSD4与KSD5之间均有43个碱基对的重叠，且均以反向互补的形式呈现。

以恶臭假单胞菌KT2440基因组DNA为模板， KSD1和KSD2为引物，PCR扩增得到PP_1384基因上游500bp的DNA片段；KSD5和KSD6为引物，PCR扩增得PP_1388基因下游500bp的DNA片段。以含卡那霉素抗性基因的pKD4质粒为模板，KSD3和KSD4为引物，PCR扩增得到0.9kb的卡那霉素抗性基因片段。分别凝胶回收这三个片段，以分别为20ng的这三个片段为模板，KSD1和KSD6为引物，通过重叠－延伸聚合酶链式反应（OE-PCR）扩增得到三个片段融合的1.9kb的DNA片段。

转化2mg的DNA片段，在卡那霉素抗性筛选之下，得到抗性转化子。经三次实验，平均可获得156个转化子。在没有加间甲基苯甲酸进行诱导的对照实验中，没有或仅有一两个抗性转化子的出现，与实施例2相同，这表明了间甲基苯甲酸诱导表达的重组酶所催化的同源重组是得到重组菌株的决定因素。设计引物以菌落PCR的方法来验证卡那霉素抗性敲入至基因组所得变株的基因型。KSD7：5'- TGAAACCGGAACGGGCATCGAG，（SEQ ID NO. 19）；KSD8： 5'- AGGGTGATCAGAGCGAAGTCC，（SEQ ID NO. 20）。KSD7位于KSD1上游100bp，KSD8位于KSD6下游100bp。

随机挑取10个抗性菌落，以其基因组为模板，KSD7和KSD8为引物，PCR扩增发现所用的菌落均得到2.1 kb的扩增片段，而以原株的基因组为模板不能扩增出产物。2.1 kb酶切结果与预期完全一致。PP_1384至PP_1388之间 7.3kb片段敲除的实验结果图见图4。

随机挑取两个变株的扩增产物，克隆至pGEM-T easy后，测序发现序列与预期完全一致。证明恶臭假单胞菌KT2440基因组中PP_1384至PP_1388 之间的7.3kb片段被完全的敲除。

pLS512从重组菌株中的消除同实施例2。

实施例4. 恶臭假单胞菌KT2440基因组PP_2064至PP_2069 9.3kb片段的敲除

设计引物PCR扩增含同源片段的卡那霉素抗性基因。KAE1：5'- TGTGTCTG CGCTTATGAATCG，（SEQ ID NO. 21）；KAE2：5'-CCGGTTCGCTTGCTGTCC ATACATGCACAGCTCCGATCACAGG，（SEQ ID NO. 22）；KAE3：5'- CCTGT GATCGGAGCTGTGCATGTATGGACAGCAAGCGAACCGG，（SEQ ID NO. 23）；KAE4：5'- CGACCTTTGAGCGACAATCGTGTCAGAAGAACTCGTCAAG AAG，（SEQ ID NO. 24）；KAE5：5'- CTTCTTGACGAGTTCTTCTGACACGATTGTCG CTCAAAGGTCG，（SEQ ID NO. 25）；KAE6：5'-TGATCCTGTACGAACTCGCC G，（SEQ ID NO. 26）。KAE2与KSD3之间以及KAE 4与KAE 5之间均有43个碱基对的重叠，且均以反向互补的形式呈现。

以恶臭假单胞菌KT2440基因组DNA为模板， KAE1和KAE2为引物，PCR扩增得到PP_1384基因上游500bp的DNA片段；KAE5和KAE 6为引物，PCR扩增得PP_1388基因下游500bp的DNA片段。以含卡那霉素抗性基因的pKD4质粒为模板，KAE3和KAE4为引物，PCR扩增得到0.9kb的卡那霉素抗性基因。分别凝胶回收这三个片段，以分别为20ng的这三个片段为模板， KAE1和KAE6为引物，通过重叠－延伸聚合酶链式反应（OE-PCR）扩增得到三个片段融合的1.9kb的DNA片段。

转化2mg的DNA片段，在卡那霉素抗性筛选之下，得到抗性转化子。经三次实验，平均可获得92个转化子。在没有加间甲基苯甲酸进行诱导的对照实验中，没有或仅有一两个抗性转化子的出现，与实施例2和实施例3相同，这表明了间甲基苯甲酸诱导表达的重组酶所催化的同源重组是得到重组菌株的决定因素。

设计引物以菌落PCR的方法来验证卡那霉素抗性敲入至基因组所得变株的基因型。KAE7：5'-GATTGGGTCGTTCAGGCAGTAG，（SEQ ID NO. 27）；KAE8：5'-TGCTGCGCGAACTGATCCTGG，（SEQ ID NO. 28）。KAE7位于KAE 1上游100bp，KAE8位于KAE 6下游100bp。

随机挑取10个抗性菌落，以其基因组为模板，KAE 7和KAE 8为引物，PCR扩增发现所用的菌落均得到2.1 kb的扩增片段，而以原株的基因组为模板不能扩增出产物。2.1 kb酶切结果与预期完全一致。PP_2064至PP_2069之间的9.3kb片段敲除的实验结果图见图4。

随机挑取两个变株的扩增产物，克隆至pGEM-T easy后，测序发现序列与预期完全一致。证明恶臭假单胞菌KT2440基因组中PP_2064至PP_2069之间的9.3kb片段被完全的敲除。

pLS512从重组菌株中的消除同实施例2。

Claims

1.一种恶臭假单胞菌KT2440高效的基因敲除方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：将步骤（3）得到的靶基因敲除的突变株通过浓度为10%的蔗糖负筛选作用去除突变株中残余的质粒pLS512。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，重组酶基因是来自于lambda噬菌体的exo，bet和gam基因，重组酶基因是克隆在受间甲基苯甲酸诱导的启动子之下，含重组酶基因的质粒pLS512游离于恶臭假单胞菌KT2440的基因组。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，重组酶表达载体中含有编码蔗糖 6-果糖转移酶的sacB基因，sacB基因为负筛选标记，通过在培养基中添加浓度为10%的蔗糖去除含sacB基因的重组酶表达载体。