CN109439684A - 一种提高外源基因在真核细胞中进化效率的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用重叠延伸PCR技术提高外源基因在真核细胞中进化效率的简便方法，属于分子生物学技术领域。当前，在真核细胞中表达外源基因存在着操作繁琐、周期较长、成本较高和库容量较低等弊端，严重限制在真核细胞中的进化效率。本发明通过基因重组双点交换原理，利用重叠延伸PCR技术，仅需要200ng突变的线性DNA片段，通过电击转化就可以获得106个/ug的突变库容量，同时周期由原来的72h缩减到4h内完成，中间过程也省去了转入细菌复制和限制性内切酶消化的繁琐操作步骤。本发明的方法步骤简便、经济、高效，为生物酶在真核细胞中的进化提供了高效的操作方法，加快了真核细胞中表达的蛋白酶在医药领域的应用。

Description

一种提高外源基因在真核细胞中进化效率的方法

技术领域：

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种利用重叠延伸PCR技术提高外源基因在真核细胞中进化效率的简便方法。

背景技术：

随着生物酶法在化学转化中的应用，使得部分手性医药中间体的合成变得容易。但现有的大部分生物酶不能满足需求，特别是来自细菌表达的蛋白，缺乏一定的翻译后修饰，导致错误折叠或直接以不可溶的形式存在，这也使得真核细胞成为了生物酶表达的重要场所。在真核细胞中酵母是最简单的一种以单细胞存在的生物，尤其是毕赤酵母。毕赤酵母作为一种表达外源基因的宿主菌，具有真核细胞翻译后修饰、生长快速、无毒素产生等特点，成为各研究学者的首选对象。特别是甲醇营养型的毕赤酵母表达系统，它具有自身分泌蛋白少、糖基化程度低、可使用廉价的无机盐培养基、容易高密度发酵等优点，而得到生产厂家的青睐，用于工业化生产。

尽管毕赤酵母在后期的生产应用上有着重大价值，但作为分子使用的工具，它在操作上有着非常繁琐的过程(见图1A)。首先，外源基因克隆到毕赤酵母的过程中必须要经过细菌的复制过程，通过复制可以提取大量质粒量。根据酵母操作手册要求，转化酵母细胞前需要5～10ug的质粒量，这是细菌转化的千倍用量。其次，获得高浓度的质粒仍需要借助限制性内切酶的消化作用，使质粒线性化后再转入毕赤酵母感受态细胞，整个过程操作顺利，至少需要3天的时间，而且转化后期，时常出现YPD平板上长出的很少克隆。这对于在真核细胞中做定向进化的操作是个严重制约，如果库容量达不到10⁴个/ug，是无法有效完成高容量筛选的操作。另外，突变体基因在经过复制型细菌DH5α富集之后，会使得大量的基因出现重复，导致在后期的筛选中会出现多次获得相同突变的基因，增加筛选难度和工作量。

目前，大量的文献(BioTechniques 36:152-154；Yeast 2004；21:613–617；Yeast2005 22:799–804；Yeast 2008；25:273–278)报道提高库容量的方法，主要是从制备感受态的方法或者电击转化条件入手，并没有从根本上解决真核细胞中的进化效率。

发明内容：

为了克服现有技术存在的上述缺陷，本发明提供一种提高外源基因在真核细胞中进化效率的简便方法。

一种外源基因在真核细胞中高效进化的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(I)以穿梭重组质粒为模板构建两对引物，引物对P₁/P₂和引物对P₃/P₄；

(II)以P₁/P₂为一对引物，扩增出上游片段P₁P₂，以P₃/P₄为另一对引物，扩增出片段P₃P₄；

(III)利用重叠延伸PCR方法，在引物对P₁/P₄作用下，扩增出整个重组基因片段P₁P₄；

(IV)将扩增产物利用脉冲电击转入毕赤酵母感受态细胞，加入预冷1M山梨醇，置于37℃孵育1h，之后的转化液涂布于含有抗性的YPD平板上，等待单克隆的长出。

进一步，引物P₁和引物P₄来自于穿梭质粒上与毕赤酵母染色体发生同源重组基因片段部分，其中引物P₁来自穿梭质粒上同源重组的上游部分，引物P₄来自穿梭质粒上同源重组的下游部分。

进一步，引物P₂和引物P₃包含目的基因定点饱和突变的位点，用NNK/NNM来代表突变的核苷酸，两个饱和突变引物之间至少有15个碱基重叠。

进一步，电击转化时需用到线性质粒，浓度可以控制在10～500ng，优选200ng。

进一步，毕赤酵母感受态细胞选自GS115、X33、KM71或SMD1168细胞，优选GS115细胞。

本发明有益效果：根据真核细胞与外源基因同源重组双点交换的原理，本发明公开两步PCR方法(见图1B)，省去转化细菌复制和限制性内切酶使用的环节，可以将突变基因在体外构建好，直接通过脉冲电击转入毕赤酵母感受态细胞，整个操作只需要4h即可完成，另外，转化所需要的线性质粒在浓度50～200ng即可，库容量最高可以达到106个/ug。

附图说明

图1传统操作路线与发明的操作路线比较

图2构建真核饱和突变库的机理图

图3重叠延伸PCR的电泳图

图4突变体在YPD平板上的单克隆生长图

图5三丁酸甘油酯平板法鉴定突变后单克隆活性的直观图

图6不同诱导时间内目的蛋白表达的电泳图

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术内容作进一步的阐述，其目的是为了更好的理解本发明的内容，但本发明的保护范围不限于此。

实施例1毕赤酵母感受态的制备

在制备酵母感受态前，需要预先配制几种溶液：①醋酸锂溶液，包含10mM pH 7.5Tris-HCl和100mM LiAC，溶液用0.22μm的无菌滤膜过滤，2～8℃下保存。②100mM的DTT溶液，用0.22μm的无菌滤膜过滤，分装到1.5mL的无菌EP管中，-20℃保存。③1MD-山梨醇溶液，用0.22μm的无菌过滤膜过滤，于2～8℃的冰箱中无菌保存。

酵母感受态细胞的制作操作过程，首先将GS115或X33酵母受体菌在无抗性的YPD平板上划线，30℃恒温培养箱中培养3天，长出单个克隆细胞。用无菌牙签从YPD平板上挑取毕赤酵母单菌落，转接于4mL YPD液体培养基中，30℃下振荡培养过夜，约24-48h，OD₆₀₀在1～200均可采用。接下来将培养液分装到1.5mL离心管中，低温下4000rpm离心5min，弃上清，沉淀用冰冷的无菌水洗涤，低温下4000rpm离心5min，弃上清，重复用冰冷无菌水洗涤一次。最后用900μL醋酸锂溶液处理沉淀，沉淀重悬后，加入解冻的DTT溶液100μL。25℃室温下静置放置30～60min。在4℃下，4000rpm离心5min，弃上清。沉淀用冰冷的无菌水洗涤，低温下4000rpm离心5min，弃上清；沉淀用冰冷的1MD-山梨醇洗涤，低温下4000rpm离心5min，弃上清；彻底倒出上清，再加入100uL 1MD山梨醇，准备下一步做转化，或保存于-80℃冰箱中，以备后期使用。

实施例2重叠延伸PCR构建酵母饱和突变库

以重组质粒pPIC9K-PLE为模板，设计的整个过程原理见图2，其中两对引物的序列信息见表1。其中P₁/P₄引物对来自于穿梭质粒pPIC9K上的AOX1基因区域部分，引物P₁起始于质粒pPIC9K上限制性酶BglⅡ识别位点3的右端部分，引物P₄起始于质粒pPIC9K上BglⅡ识别位点6875的左端部分。引物P₂和引物P₃来自外源基因PLE位点104的上下游区域。

表1真核体系进化过程中的引物设计表

引物	饱和引物序列(5’→3’)
		P<sub>1</sub>	GATCTAACATCCAAAGACG
P<sub>2</sub>	CTGCGA<u>MNN</u>AGTGAGCACTGGGAGC
		P<sub>3</sub>	CTCACT<u>NNK</u>TCGCAGGGTGGCTTGG
P<sub>4</sub>	TTGAGATAAATTTCACG

对PLE基因中W104位点进行饱和突变建库，表1中带下划线的位点为W104对应的饱和序列，利用Primer STAR max DNA聚合酶(TaKaRa公司)的快速扩增能力，以引物P₁和引物P₂为一对，扩增出片段P₁P₂。以引物P₃和引物P₄为一对，扩增出片段P₃P₄，具体扩增结果见图3，PCR反应程序参考表2。

表2基因片段扩增的程序

从图3可以明显发现，利用Primer ATARmax DNA聚合酶可以在一样的PCR反应程序下扩增出两条长度不同的片段，前提是延伸时间要根据长片段来设置，整个反应时间在1h内完成。对扩增后的片段利用切胶回收试剂盒进行回收，把回收后得到的片段以等摩尔的比例混合，总量在100ng。第二轮重叠延伸PCR以第一次PCR的产物片段为模板，再加入引物P₁和引物P₄，利用Primer ATARmax DNA聚合酶的作用，再次扩增出完整的基因片段P₁P₄，此时的扩增程序仅需要修改延伸时间为40s即可，其余参数与表2相同。通过核酸凝胶电泳可以发现片段P₁P₄的长度刚好是P₁P₂和P₃P₄长度之和，这也证明重叠延伸PCR将两个片段融为一条完整长片段。再次利用胶回收试剂盒或直接纯化PCR产物，将得到的片段吸取200ng混合到酵母感受态细胞中，控制外源片段与感受态细胞的体积比在1:10，冰上预冷10min，等待电击转化。

实施例3基因电击转入酵母细胞

将体外延伸获得的完整突变片段基因与酵母感受态的混合物一起转入预冷的电转杯中，用手指轻轻弹电转杯使得杯壁上液体流入杯底。用擦镜纸将电转杯外壁擦拭干净，以防带水电击产生火花。将电转杯插入点转移的凹槽里，使得金属外表面与电击相接触，设置电转仪器的选项，设定电转条件为：电压2kV，电容25uF，电阻200Ω。设置完成后，合上电转仪的盖子，手指轻轻按动脉冲按钮，显示屏上会记录本次电击时间，在4.8-5.2ms之间。脉冲结束后，立即向电转杯中加入1mL预冷的1MD山梨醇溶液，用移液枪将转化后的溶液吸取到新的无菌EP管中，置于30℃摇床中振荡孵育1h，之后吸取100uL转化液涂布于含有G418抗性的YPD平板上。30℃倒置培养3天，可以观察到平板上长出酵母单克隆，见图4。

实施例4酵母在YPD单克隆平板上的活性鉴定

为了证明该方法有效，需要对转化后长出的单克隆进行活性鉴定。本实验利用的是脂肪酶PLE为目的基因，可以采用三丁酸甘油酯平板鉴定表达，该平板的配制方法如下：

缓冲液，50mM的pH 7.5Tris-HCl溶液含2％(w/v)的阿拉伯胶(乳化剂和稳定剂)；

底物配制，用上述缓冲液配制成5％(v/v)的三丁酸甘油酯底物溶液；临用前，利用超声乳化(500W，超声3s，间隙3s，超声20min)。

将超声处理好的底物按照10％(V/V)的量加入到YPD液体培养基中，加入2％的琼脂进行高温灭菌，结束后摇匀加入G418抗生素，制备抗性平板。待平板凝固后，用无菌牙签从YPD平板上随机挑去多个单克隆，转移到新制备的三丁酸甘油酯平板上，倒置于30℃培养箱中，并在倒置的培养皿盖子里加入0.3mL的甲醇，作为诱导剂促使PLE表达。培养3h后就可以看见在大部分的单克隆周围产生透明圈(见图5)，这些透明圈是来自于表达的PLE酶作用的结果。PLE基因在甲醇的诱导下，AOX基因启动转录，并最终在穿梭质粒上信号肽α-factor的作用下分泌到细胞外。PLE是一种甘油三酯水解酶，能够将平板上的三丁酸甘油酯催化分解为甘油和丁酸，从而显示出清晰的透明圈。

实施例5酵母突变体的培养和表达

挑选一单菌落，置于装有25mL BMGY培养基的250mL摇瓶中，于30℃，250rpm培养至OD₆₀₀＝2-6(16-18h)。室温下1500g离心5min，收集菌体，用BMMY重悬菌体，使OD₆₀₀＝1.0左右(约100mL)。所得的菌液置于1L的摇瓶中，用双层纱布或粗棉布封口，放置于30℃，250rpm的摇床上继续生长。每24h向培养基中添加100％甲醇至终浓度为0.5％。按时间点分别取菌液样品，取样量为1mL，置于1.5mL EP管中，最大转速离心3min，分别收集上清和菌体，分析目的蛋白的表达量和菌液最佳收获时间，结果见图6。

Claims (6)

1.一种提高外源基因在真核细胞中进化效率的简便方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(I)以穿梭重组质粒为模板构建两对引物，引物对P₁/P₂和引物对P₃/P₄；

(II)以P₁/P₂为一对引物，扩增出上游片段P₁P₂；以P₃/P₄为另一对引物，扩增出下游片段P₃P₄；

(III)利用重叠延伸PCR方法，在P₁/P₄为一对引物的作用下，扩增出整个重组基因片段P₁P₄；

(IV)将扩增产物利用脉冲电击转入毕赤酵母感受态细胞，加入预冷1M山梨醇，置于37℃孵育1h，之后的转化液涂布于含有抗性的YPD平板上，等待单克隆的长出。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的穿梭质粒选自pPIC系列、pPICZα系列或者pGAPZα系列。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述引物对P₁/P₄分别来自于穿梭质粒上与毕赤酵母染色体发生同源重组的基因片段部分，其中引物P₁来自穿梭质粒上同源重组的上游基因部分，引物P₄来自穿梭质粒上同源重组的下游部分。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述引物P₂和引物P₃包含目的基因定点饱和突变的位点，用NNK/NNM来代表突变的核苷酸，两个饱和突变引物之间至少有15个碱基重叠。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述电击转化时需用到线性质粒，浓度可以控制在10～500ng。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的毕赤酵母感受态细胞选自GS115、X33、KM71或SMD1168细胞。