CN104805027B - 一种重组耶氏解脂酵母菌株及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体公开了一种重组耶氏解脂酵母菌株及其构建方法和应用。本发明所述重组耶氏解脂酵母菌株基因组包含SEQ ID NO:1‑3任意一项所示的核苷酸序列。本发明通过OE‑PCR方法构建单基因表达盒表达的菜油甾醇生物合成途径中关键基因dhcr7，用限制性内切酶将单基因表达盒切下并一次性转入酵母进行片段间的同源重组和基因组特定erg5位点的整合，通过营养缺陷型培养基和基因组PCR筛选完整组装的转化子，获得一种新颖的重组耶氏解脂酵母菌株，能够应用于菜油甾醇的生物合成中，并保持较高产量。

Description

一种重组耶氏解脂酵母菌株及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，更具体的说是涉及一种重组耶氏解脂酵母菌株及其构建方法和应用。

背景技术

人类健康、能源、环境等领域的重大需求牵引着合成生物学的迅猛发展。合成生物技术在合成重要产品、生产清洁能源、维护人类健康等方面均取得了令人瞩目的成果。利用合成生物技术构建菜油甾醇人工细胞可以弥补化学法和酶促法的不足，且生产过程绿色清洁，有很大的优势。将基因原件(启动子、转录调控区域、核糖体结合位点、开放阅读框、终止子等)依据工程化目标需要，有机重构和连接起来，便形成了功能基因模块。通过对已有生物网络加以利用，同时引入新的功能基因模块，表达出天然细胞不能合成或含量极低的产物。

菜油甾醇作为甾体类药物的关键前体，它的合成具有重要意义。菜油甾醇作为一般的植物甾醇是在植物中提取的，但植物提取周期长，副产物和污染较大。微生物中目前尚无菜油甾醇作为产物的合成报道，但有以此为中间产物最终合成黄体酮和氢化可的松的研究。

目前人们对解脂酵母的研究愈来愈多，解脂酵母作为一种非常规的安全酵母被更多的拿来生产。解脂酵母在生产柠檬酸，脂肪酸以及番茄红素上都有巨大的优势。由于解脂酵母中的油滴比酿酒酵母大，所以可以更好的容纳一些疏水产品，这些疏水产品储存在油滴中减轻对细胞的毒害作用。解脂酵母可以将很多物质作为自己的碳源，并且在各种碳源中都能获得较大的生物量。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种重组耶氏解脂酵母菌株，使得所述菌株能够应用于菜油甾醇的生物合成中，并保持较高产量，同时提供所述菌株的构建方法。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

一种重组耶氏解脂酵母菌株，基因组包含SEQ ID NO:1-3任意一项所示的核苷酸序列。

本发明将包含蟾蜍、水稻或褐家鼠来源的基因dhcr7基因的核苷酸序列利用耶氏解脂酵母自身的同源重组，整合到耶式解脂酵母基因组erg5位点上，获得所述重组耶氏解脂酵母菌株，具体的核苷酸序列如SEQ ID NO:1-3，三者区别在仅于dhcr7基因来源不同，依次为褐家鼠来源、水稻来源和蟾蜍来源。

同时，本发明还提供了所述重组耶氏解脂酵母菌株的构建方法，包括

步骤1、将SEQ ID NO:4所示、SEQ ID NO:5所示或SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列连接到由启动子和终止子组成的表达盒中，获得单基因表达盒；

步骤2、将SEQ ID NO:7所示、SEQ ID NO:8所示和SEQ ID NO:9的核苷酸序列通过OE-PCR连接，获得片段1，SEQ ID NO:8所示和SEQ ID NO:9的核苷酸序列均位于SEQ ID NO:7所示核苷酸序列下游，SEQ ID NO:9所示核苷酸序列位于SEQ ID NO:8所示核苷酸序列下游；

步骤3、将SEQ ID NO:10所示和SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列通过OE-PCR连接，获得片段2，SEQ ID NO:11所示核苷酸序列位于SEQ ID NO:10所示核苷酸序列下游；

步骤4、将单基因表达盒、片段1以及片段2采用醋酸锂法进行耶式解脂酵母转化，然后采用SC-drop培养基进行筛选，获得所述重组耶氏解脂酵母菌株；

其中，步骤1、步骤2和步骤3不分先后顺序。

步骤1中，SEQ ID NO:4所示、SEQ ID NO:5所示以及SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列即为经过优化后的褐家鼠来源、水稻来源和蟾蜍来源的dhcr7基因。作为优选，步骤1包括：

步骤1.1、在SEQ ID NO:4所示、SEQ ID NO:5所示或SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列两端加上BsaI酶切位点，获得外源靶基因，并连接到载体上；

选用耶式解脂酵母内源启动子EXP1和终止子XPR2，在两者之间构建一对反向BsaI酶切位点组成表达盒，同时在表达盒两端加上NotI酶切位点，并连接到载体上；

步骤1.2、对连接有外源靶基因的载体和连接有表达盒的载体进行BsaI酶切，将外源靶基因连接到表达盒上，而后进行NotI酶切，获得单基因表达盒，序列如SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14所示。单基因表达盒具体的合成示意图见图1，所述载体优选为pUC57-simple质粒，该质粒可通过金斯瑞公司购买获得。

上述序列片段的合成、酶切位点的加入等操作均可以通过人工合成手段完成，本发明后续的技术方案中涉及的相关序列也可以通过人工合成完成，但不排除本领域其他常规手段。

为了顺利通过同源重组整合到erg5位点，本发明在外源dhcr7基因两端引入erg5位点上、下游基因片段，同时附加筛选标记基因。erg5位点上、下游基因片段具体构建的方法采用OE-PCR，即步骤2和步骤3。其中，SEQ ID NO:7所示核苷酸序列为耶氏解脂酵母内源erg5基因上游700bp序列，SEQ ID NO:8所示核苷酸序列为筛选标记ura3，SEQ ID NO:9所示核苷酸序列为来源酿酒酵母基因组且与单基因表达盒同源的200bp序列，SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列为来源酿酒酵母基因组且与单基因表达盒同源的208bp序列，SEQ ID NO:11所示核苷酸序列为耶氏解脂酵母内源erg5基因下游670bp序列。

作为优选，步骤2包括：

采用SEQ ID NO:15-20所示核苷酸序列为引物，通过OE-PCR将SEQ ID NO:7-9所示核苷酸序列连接起来，得到两端包含NotI酶切位点的片段，连入载体，进行NotI酶切，获得片段1，如SEQ ID NO:21所示。更优选地，所述载体为pEASY-Blunt质粒，该质粒可用过全式金公司购买获得。

作为优选，步骤3包括：

采用SEQ ID NO:22-25所示核苷酸序列为引物，通过OE-PCR将SEQ ID NO:10-11所示核苷酸序列连接起来，得到两端包含NotI酶切位点的片段，连入载体，进行NotI酶切，获得片段2，如SEQ ID NO:26所示。

步骤4中，本发明利用耶式解脂酵母自身的同源重组原理将各片段通过片段间的同源序列连接起来获得两端包含NotI酶切位点的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，然后通过与耶式解脂酵母基因组上erg5位点的同源序列发生重组而将SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列整合到耶式解脂酵母基因组上，同源重组示意图见图4。

此外，本发明还提供由本发明任意一项技术方案构建的重组耶氏解脂酵母菌株。采用本发明构建的重组耶氏解脂酵母菌株应用于菜油甾醇的发酵生产中时，根据采用的发酵培养基碳源的不同可达到55-325mg/L的产量水平。基于此技术效果，本发明提供了所述重组耶氏解脂酵母菌株在生产菜油甾醇中的应用。

根据提供的应用，本发明提供一种生产菜油甾醇的方法，将本发明所述重组耶氏解脂酵母菌株经种子培养基活化后接种于发酵培养基中培养，培养后收集菌体细胞提取菜油甾醇。

作为优选，所述提取菜油甾醇为：

将收集的菌体细胞水洗两次，收集在10ml离心管中，并采用液氮研磨进行破壁，破壁完成后，加入过量甲醇配置的1.5M KOH，在60℃水浴锅中皂化4小时以上，皂化结束后加入2ml正己烷，在涡旋振荡器上震荡10min，将产物完全萃取在正己烷中，最后冻干获得产物菜油甾醇。

作为优选，所述种子培养基为：

合成酵母氮源YNB6.7g/L，葡萄糖20g/L，混合氨基酸粉末2g/L(具体配方参考[美]D.C.安伯格等酵母遗传学方法试验指南)，组氨酸38mg/L，色氨酸38mg/L，亮氨酸190mg/L。

作为优选，所述发酵培养基选自以下之一：

(1)葡萄糖50g/L，酵母粉15g/L，蛋白胨30g/L；

(2)葡萄糖50g/L，酵母粉15g/L，蛋白胨30g/L，KH₂PO₄8g/L，MgSO₄6g/L；

(3)与50g/L葡萄糖等碳摩尔数的甘油，酵母粉15g/L，蛋白胨30g/L，KH₂PO₄8g/L，MgSO₄6g/L；

(4)葵花籽油20％(占发酵培养基体积的20％)，酵母粉15g/L，蛋白胨30g/L，KH₂PO₄8g/L，MgSO₄6g/L；

(5)葵花籽油150mL，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L。

作为优选，所述培养为在28℃、220-400rpm条件下培养120-150h。

由以上技术方案可知，本发明通过OE-PCR方法构建单基因表达盒表达的菜油甾醇生物合成途径中关键基因dhcr7，用限制性内切酶将单基因表达盒切下并一次性转入酵母进行片段间的同源重组和基因组特定erg5位点的整合，通过营养缺陷型培养基和基因组PCR筛选完整组装的转化子，获得一种新颖的重组耶氏解脂酵母菌株，能够应用于菜油甾醇的生物合成中，并保持较高产量。

附图说明

图1所示为单基因表达盒构建示意图；

图2所示为单基因表达载体质粒图谱；

图3所示为单基因表达盒的酶切验证凝胶图；其中，泳道1-3分别表示蟾蜍来源dhcr7单基因表达盒、水稻来源dhcr7单基因表达盒、褐家鼠来源dhcr7单基因表达盒；

图4所示为同源重组示意图；其中，erg5(700)即为SEQ ID NO:7所示核苷酸序列，代表耶氏解脂酵母内源erg5基因上游700bp序列；UAR3即为SEQ ID NO:8所示核苷酸序列，代表筛选标记ura3；t0即为SEQ ID NO:9所示核苷酸序列，代表与单基因表达盒同源的200bp序列；t1即为SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列，代表与单基因表达盒同源的208bp序列；erg5(670)即为SEQ ID NO:11所示核苷酸序列，代表耶氏解脂酵母内源erg5基因下游670bp序列；

图5所示为SyBE_Yl1070028-SyBE_Yl1070030三种菌株的摇瓶发酵菜油甾醇产量柱形图，纵坐标为菜油甾醇产量；

图6所示为SyBE_Yl1070028菌株在不同碳源下的摇瓶发酵菜油甾醇产量柱形图，纵坐标为菜油甾醇产量；Glycerol表示甘油，Glucose表示葡萄糖，Sunflower seed oil表示葵花籽油；

图7所示为SyBE_Yl1070028菌株以葡萄糖作为碳源的发酵罐批式补料发酵生长曲线、葡萄糖浓度变化曲线与菜油甾醇产量变化曲线图；曲线A代表细胞生长曲线，曲线B代表葡萄糖浓度，曲线C代表菜油甾醇产量，左侧纵坐标表示菌株OD₆₀₀值，右侧表示菜油甾醇产量；

图8所示为SyBE_Yl1070028菌株以菜籽油作为碳源的发酵罐批式补料发酵生长曲线与菜油甾醇产量变化曲线图；曲线A代表细胞生长曲线，曲线B代表菜油甾醇产量，左侧纵坐标表示菌株OD₆₀₀值，右侧表示菜油甾醇产量。

具体实施方式

本发明公开了一种重组耶氏解脂酵母菌株及其构建方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述方法和应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

下面结合实施例，进一步阐述本发明。

实施例1：单基因表达盒的构建

在SEQ ID NO:4所示(优化后的褐家鼠来源dhcr7基因)、SEQ ID NO:5所示(优化后的水稻来源dhcr7基因)以及SEQ ID NO:6所示(优化后的蟾蜍来源的dhcr7基因)的核苷酸序列两端加上BsaI酶切位点，获得外源靶基因，并连接到pUC57-simple质粒上；

选用耶式解脂酵母内源启动子EXP1(SEQ ID NO:27所示序列)和终止子XPR2(SEQID NO:28所示序列)，在两者之间构建一对反向BsaI酶切位点组成表达盒，同时在表达盒两端加上NotI酶切位点，并连接到pUC57-simple质粒上；

对连接有外源靶基因的pUC57-simple质粒和连接有表达盒的pUC57-simple质粒进行BsaI酶切，将外源靶基因连接到表达盒上，构成单基因表达载体(质粒图谱见图2)，转入大肠杆菌DH5α中，菌落PCR筛选，提质粒，进行NotI酶切验证，验证结果见图3，结果与预期一致，表明单基因表达载体载体构建成功，通过NotI酶切可获得单基因表达盒，序列如SEQID NO:12、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14所示，依次表示为褐家鼠来源、水稻来源和蟾蜍来源的单基因表达盒。

本实施例构建的三种不同来源dhcr7基因的单基因表达载体序列参见SEQ ID NO:29-31所示，依次为褐家鼠来源、水稻来源和蟾蜍来源。

实施例2：片段1(erg5位点上游基因片段)和片段2(erg5位点下游基因片段)的获得

用SEQ ID NO:15-20所示核苷酸序列为引物，通过OE-PCR将SEQ ID NO:7-9所示核苷酸序列连接起来，得到两端包含NotI酶切位点的片段，连入pEASY-Blunt质粒，进行NotI酶切，获得片段1，如SEQ ID NO:21所示。

采用SEQ ID NO:22-25所示核苷酸序列为引物，通过OE-PCR将SEQ ID NO:10-11所示核苷酸序列连接起来，得到两端包含NotI酶切位点的片段，连入pEASY-Blunt质粒，进行NotI酶切，获得片段2，如SEQ ID NO:26所示。

表1 OE-PCR引物

实施例3：重组耶氏解脂酵母菌株的构建

将实施例1中的单基因表达盒，实施例2中的片段1以及片段2采用醋酸锂法进行耶式解脂酵母转化，利用酵母自身的同源重组原理将上述各片段通过片段间的同源序列连接起来并通过与酵母基因组上erg5位点的同源序列发生重组而整合到基因组上。转化后酵母采用SC-drop固体培养基(合成酵母氮源YNB6.7g/L，葡萄糖20g/L，混合氨基酸粉末2g/L，固体补加2％的琼脂粉)进行筛选，得到的转化子进行划线分纯后转移至液体培养基中培养24h，提取酵母基因组作为模板，进行PCR验证，确认正确的重组菌株，平板划线或甘油菌保存，由此获得3种不同来源dhcr7基因的重组耶氏解脂酵母菌株，分别命名为SyBE_Yl1070028(蟾蜍来源)、SyBE_Yl1070029(水稻来源)、SyBE_Yl1070030(褐家鼠来源)

实施例4：SyBE_Yl1070028-SyBE_Yl1070030三种菌株的菜油甾醇发酵能力试验

1、试验材料：菌株SyBE_Yl1070028-SyBE_Yl1070030

2、试验方法：

种子培养基：SC-drop培养基，即合成酵母氮源YNB6.7g/L，葡萄糖20g/L，混合氨基酸粉末2g/L(具体配方参考[美]D.C.安伯格等酵母遗传学方法试验指南)，组氨酸38mg/L，色氨酸38mg/L，亮氨酸190mg/L，115℃灭菌15min。

发酵培养基A：葡萄糖50g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，121℃灭菌20min。

将上述菌株接种于5mL种子培养基中，在28℃、220rpm培养24h，以初始菌体浓度OD₆₀₀＝0.2转接于新鲜的5mL种子培养基中，于28℃、220rpm条件下培养18h，以初始菌体浓度OD₆₀₀＝0.1分别接种于50mL发酵培养基A中，于28℃、220rpm条件下培养120h，测定菌体生长曲线。发酵结束后收集细胞，10000rpm离心10min，收集细胞。

3、提取产物方法

将收集的细胞水洗两次，收集在10ml离心管中，并采用液氮研磨进行破壁，破壁完成后，加入过量甲醇配置的1.5M KOH，在60℃水浴锅中皂化4小时以上，皂化结束后加入2ml正己烷，在涡旋振荡器上震荡10min，将产物完全萃取在正己烷中，最后使用冷冻干燥机进行冷冻干燥，待正己烷完全蒸出。可-20℃保存，以备上样。上样前需在冻干样品中加入MSTFA试剂进行衍生化，稀释浓度，方可上样。

4、分析方法

以722型分光光度计在600nm处测定的菌体吸光值(OD₆₀₀)表征菌体浓度。

菜油甾醇浓度采用GC-TOF/MS(Waters Corp.，USA)测定，硅胶毛细管柱为30m×0.25mm×0.25μm DB-5MS，J&W Scientific，Folsom，电离方式为电子轰击电离EI+，电子束能量70eV，离子化电流40μA。质谱扫描范围在50～800m/z，离子源温度为250℃，进样口温度为280℃，氦气(99.9995％)用作载气，91KPa恒压模式下操作。分流比为40:1。柱温在70℃保持1min，以20℃·min^-1的速度升至250℃，在250℃维持2min，然后以15℃·min^-1的速度升到280℃，在280℃维持15min。

菜油甾醇标准品，采用和样品一样的处理方法，并配置浓度梯度，运用GC-TOF/MS绘制标准曲线确定线性范围为100mg/L-2000mg/L。功能菌株发酵后萃取得到的样品进行测定得到的GC-MS结果，按拟合曲线公式计算产量。

5、试验结果

菌株SyBE_Yl1070028-SyBE_Yl1070030在发酵培养基A中生长趋势一致，生长状况无明显差别，发酵结束时菌体最终OD600达到55左右。三株菌株都是在耶式解脂酵母erg5基因上对外源基因dhcr7进行整合。由于不同来源的dhcr7在解脂酵母中的差异，导致菜油甾醇的产量产生一定差异。如图5所示，可以看出构建的褐家鼠来源dhcr7基因有较好的发酵结果(即SyBE_Yl1070028菌株)菜油甾醇产量最高，达到106mg/L。

实施例5：不同的碳源发酵培养基条件下SyBE_Yl1070028菌株的发酵性能

1、试验材料：SyBE_Yl1070028；

2、试验方法

种子培养基的制备同实施例4。

发酵培养基B：葡萄糖50g/L，酵母粉15g/L，蛋白胨30g/L，KH₂PO₄8g/L，MgSO₄6g/L；

发酵培养基C：甘油(依照葡萄糖50g/L等碳摩尔数配置)，酵母粉15g/L，蛋白胨30g/L，KH₂PO₄8g/L，MgSO₄6g/L；

发酵培养基D：葵花籽油20％(占发酵体积50ml的20％)，酵母粉15g/L，蛋白胨30g/L，KH₂PO₄8g/L，MgSO₄6g/L；

其中，葡萄糖、甘油、葵花籽油与酵母粉和蛋白胨分开灭菌，121℃灭菌20min，KH₂PO₄和MgSO₄过滤除菌。

将SyBE_Yl1070028菌株接种于5mL种子培养基中，在28℃、220rpm培养24h，以初始菌体浓度OD600＝0.2转接于新鲜的50mL种子培养基中，于28℃、220rpm条件下培养18h，以初始菌体浓度OD600＝0.1分别接种于3种不同的培养基的摇瓶中。于28℃，220rpm培养150h。发酵结束后收集细胞，10000rpm离心10min，收集细胞。

3、分析方法和提取产物方法

同实施例4。

4、试验结果

结果显示，菌株SyBE_Sc1070028在甘油作为碳源的培养基中在发酵45h后OD600大概在22时达到稳定期，在葡萄糖作为碳源的培养基中在120h在OD600大概在50时达到稳定期，而在葵花籽油作为碳源的培养基中到140h菌体浓度仍然缓慢上升。OD600最终大概达到120。三种碳源下各自生物量是不同的，同时产量也是不同的，由图6所示，以葡萄糖为碳源的摇瓶发酵中最终产量为106mg/L，以甘油为碳源的摇瓶发酵中最终产量为55mg/L，以菜籽油为碳源的摇瓶发酵中最终产量为143mg/L。

实施例6：批式补料发酵罐条件下SyBE_Yl1070028菌株的发酵性能试验

1、试验材料：SyBE_Yl1070028；

2、试验方法

种子培养基的制备同实施例4。

发酵培养基：葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L；

其中，葡萄糖与酵母粉和蛋白胨分开灭菌，115℃灭菌15min。

补料用葡萄糖溶液：400g/L，115℃灭菌20min。

将SyBE_Yl1070028菌株接种于5mL种子培养基中，在28℃、220rpm培养24h，以初始菌体浓度OD₆₀₀＝0.2转接于新鲜的50mL种子培养基中，于28℃、220rpm条件下培养18h，以10％的接种量接种于2.7L发酵培养基B(5L发酵罐)中，培养条件为400rpm，28℃，pH5.5，通气量1vvm，培养132h。做流加葡萄糖培养，控制培养基中葡萄糖浓度在0-1g/L。每12小时取出15ml发酵液对其进行生长测定，并对其中10ml发酵液离心，蒸馏水清洗后待处理上样。

3、分析方法和提取产物方法

同实施例4。

4、试验结果

由图7可知，在接种量为10％的情况下，初始OD由原来的0.1提高到1.4左右。在发酵48h左右菌体生长到达稳定期，稳定期菌体OD达到55左右，明显高于无补料发酵。菌株SyBE_Yl1070028发酵过程中，从12h时即菌体生长对数期的前期即可以检测到菜油甾醇的积累，其菜油甾醇的积累在细胞生长迅速时产量变化并不大，在生长速度明显缓慢之后积累越来越多，流加补料发酵菜油甾醇产量最高达到225mg/L。

实施例7：葵花籽油作为碳源发酵罐条件下SyBE_Yl1070028菌株的发酵性能试验

1、试验材料：SyBE_Yl1070028；

2、试验方法：

种子培养基的制备同实施例4。

发酵培养基：葵花籽油150ml，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L；

其中，菜籽油与酵母粉和蛋白胨分开灭菌，115℃灭菌15min。

补料菜籽油：150ml

将SyBE_Yl1070028菌株接种于5mL种子培养基中，在28℃、220rpm培养24h，以初始菌体浓度OD₆₀₀＝0.2转接于新鲜的50mL种子培养基中，于28℃、220rpm条件下培养18h，以10％的接种量接种于3L上述发酵培养基(5L发酵罐)中，培养条件为400rpm，28℃，pH5.5，通气量1vvm，培养132h。做流加菜籽油，在菜籽油目测吃完时，56小时到发酵结束132小时匀速加入。每12小时取出15ml发酵液对其进行生长测定，并对其中10ml发酵液离心，蒸馏水清洗后待处理上样。

3、分析方法和提取产物方法

同实施例4。

4、试验结果

由图8可知，在菜籽油作为碳源的培养基中，细胞生长并没有明显的对数期，一直按照一定速度生长，在细胞生长的同时，菜油甾醇同时按照一定速度进行积累。在发酵到132h，细胞生长到OD大约为110左右，流加补料发酵菜油甾醇产量最高达到325mg/L。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (13)

1.一种重组耶氏解脂酵母菌株，其特征在于，基因组erg5位点上整合有SEQ ID NO:12-14任意一项所示的核苷酸序列。

2.权利要求1所述重组耶氏解脂酵母菌株在生产菜油甾醇中的应用。

3.权利要求1所述重组耶氏解脂酵母菌株的构建方法，其特征在于，包括：

步骤1、将SEQ ID NO:4所示、SEQ ID NO:5所示或SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列连接到由启动子和终止子组成的表达盒中，获得单基因表达盒；

步骤2、将SEQ ID NO:7所示、SEQ ID NO:8所示和SEQ ID NO:9的核苷酸序列通过OE-PCR连接，获得片段1，SEQ ID NO:8所示和SEQ ID NO:9的核苷酸序列均位于SEQ ID NO:7所示核苷酸序列下游，SEQ ID NO:9所示核苷酸序列位于SEQ ID NO:8所示核苷酸序列下游；

步骤3、将SEQ ID NO:10所示和SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列通过OE-PCR连接，获得片段2，SEQ ID NO:11所示核苷酸序列位于SEQ ID NO:10所示核苷酸序列下游；

步骤4、将单基因表达盒、片段1以及片段2采用醋酸锂法进行耶式解脂酵母转化，然后采用SC-drop培养基进行筛选，获得所述重组耶氏解脂酵母菌株；

其中，步骤1、步骤2和步骤3不分先后顺序。

4.根据权利要求3所述构建方法，其特征在于，步骤1包括：

步骤1.1、在SEQ ID NO:4所示、SEQ ID NO:5所示或SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列两端加上BsaI酶切位点，获得外源靶基因，并连接到载体上；

选用耶式解脂酵母内源启动子EXP1和终止子XPR2，在两者之间构建一对反向BsaI酶切位点组成表达盒，同时在表达盒两端加上NotI酶切位点，并连接到载体上；

步骤1.2、对连接有外源靶基因的载体和连接有表达盒的载体进行BsaI酶切，将外源靶基因连接到表达盒上，而后进行NotI酶切，获得单基因表达盒，序列如SEQ ID NO:12、SEQID NO:13或SEQ ID NO:14所示。

5.根据权利要求4所述构建方法，其特征在于，所述载体为pUC57-simple质粒。

6.根据权利要求3所述构建方法，其特征在于，步骤2包括：

采用SEQ ID NO:15-20所示核苷酸序列为引物，通过OE-PCR将SEQ ID NO:7-9所示核苷酸序列连接起来，得到两端包含NotI酶切位点的片段，连入载体，进行NotI酶切，获得片段1，如SEQ ID NO:21所示。

7.根据权利要求3所述构建方法，其特征在于，步骤3包括：

采用SEQ ID NO:22-25所示核苷酸序列为引物，通过OE-PCR将SEQ ID NO:10-11所示核苷酸序列连接起来，得到两端包含NotI酶切位点的片段，连入载体，进行NotI酶切，获得片段2，如SEQ ID NO:26所示。

8.根据权利要求6或7所述构建方法，其特征在于，所述载体为pEASY-Blunt质粒。

9.权利要求3-8任意一项所述构建方法构建的重组耶氏解脂酵母菌株。

10.一种生产菜油甾醇的方法，其特征在于，将权利要求1或权利要求9所述解脂酵母菌株经种子培养基活化后接种于发酵培养基中培养，培养后收集菌体细胞提取菜油甾醇。

11.根据权利要求10所述方法，其特征在于，所述种子培养基为SC-drop培养基。

12.根据权利要求10所述方法，其特征在于，所述发酵培养基选自以下之一：

(1)葡萄糖50g/L，酵母粉15g/L，蛋白胨30g/L；

(2)葡萄糖50g/L，酵母粉15g/L，蛋白胨30g/L，KH₂PO₄ 8g/L，MgSO₄ 6g/L；

(3)与50g/L葡萄糖等碳摩尔数的甘油，酵母粉15g/L，蛋白胨30g/L，KH₂PO₄ 8g/L，MgSO₄6g/L；

(4)占发酵培养基体积20％的葵花籽油，酵母粉15g/L，蛋白胨30g/L，KH₂PO₄ 8g/L，MgSO₄ 6g/L；

(5)葵花籽油150mL，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L。

13.根据权利要求10所述方法，其特征在于，所述培养为在28℃、220-400rpm条件下培养120-150h。