CN101970638A - 用于高水平生产二十碳五烯酸的优化解脂耶氏酵母菌株 - Google Patents

用于高水平生产二十碳五烯酸的优化解脂耶氏酵母菌株 Download PDF

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Abstract

本发明描述了工程化的含油酵母解脂耶氏酵母菌株，该菌株能够生产在总油级分大于50重量％的二十碳五烯酸[“EPA”]，这是一种ω-3多不饱和脂肪酸。这些菌株过表达异源Δ9延伸酶、Δ8去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ17去饱和酶、Δ12去饱和酶和C16/18延伸酶，并且任选地过表达二酰基甘油胆碱磷酸转移酶。也描述了优选的基因敲除菌株。来自优化的解脂耶氏酵母菌株的生产宿主细胞、用于在所述宿主细胞中生产EPA的方法、和包含EPA的产物是受权利要求书保护的。

Description

用于高水平生产二十碳五烯酸的优化解脂耶氏酵母菌株
本专利申请要求提交于2007年10月3日的美国临时申请60/977,174和60/977,177的优先权，它们全文以引用方式并入本文。
发明领域
本发明属于生物技术领域。更具体地讲，本发明涉及工程化的含油酵母解脂耶氏酵母菌株，该菌株能够高水平有效地生产二十碳五烯酸-一种ω-3多不饱和脂肪酸。
发明背景
二十碳五烯酸(“EPA”；顺式-5，8，11，14，17-二十碳五烯酸；ω-3)是生物活性前列腺素的生物合成过程中的一种重要中间体。此外，认为EPA具有临床和药用价值。例如，已知EPA具有以下药理学作用：1)血小板凝集抑制作用(溶血栓作用)；2)血液中性脂肪降低作用；3)血液VLDL-胆固醇和LDL-胆固醇降低作用和HDL-胆固醇提高作用(抗动脉硬化作用)；4)血液粘度降低作用；5)降血压作用；6)抗炎作用；和7)抗肿瘤作用。同样，EPA提供一种降低血液胆固醇和甘油三酯的天然方法。增加EPA的摄取已经显示是有益的，或者对冠心病、高血压、炎性病症(例如类风湿性关节炎)、肺病和肾病、II型糖尿病、肥胖症、溃疡性结肠炎、克隆氏病、神经性厌食症、烧伤、骨关节炎、骨质疏松、注意力缺乏/多动症、以及早期结直肠癌具有积极效果。参见例如综述McColl，J.，NutraCos，2(4)：35-40(2003)；Sinclair，A.，等人，In Healthful Lipids；C.C.Akoh and O.-M.Lai，编辑；AOCS：Champaign，IL，2005；Chapter 16。近来的发现也已经证实EPA在治疗精神病症方面的用途，例如精神分裂症(美国专利公开6,331,568；美国专利公开6,624,195)。最后，也可将EPA用于涉及功能性食品(保健品)、婴儿营养品、批量营养物质、化妆品和动物健康的产品。
期望使用重组方法用微生物生产EPA，该方法与从天然微生物来源生产的EPA(例如异养生物硅藻小环藻属和菱形藻属；假单胞菌属、交替单胞菌属或希瓦氏菌菌种；丝状真菌属或腐霉属；或长被孢霉、根结线虫、或水蓑衣线虫)或分离自鱼油和海洋浮游生物的EPA相比具有若干个优点。例如，能够使用具有优选的产油特性的重组微生物，因为宿主天然存在的微生物脂肪酸特征能通过将新生物合成途径导入宿主和/或抑制不可取的途径而被改变。这导致所需多不饱和脂肪酸[“PUFA”]或其共轭形式的生产水平提高并且减少不可取PUFA的生产。第二，重组微生物能够提供特殊形式的PUFA，该PUFA可具有特别的用途。此外，能通过控制培养条件操纵微生物油生产，要注意的是通过向微生物表达的酶提供特定的底物源，或通过加入化合物/基因工程以抑制不可取的生物化学途径。因此例如改变由此生产的ω-3对ω-6脂肪酸的比率或工程化生产不显著积聚其它下游或上游PUFA产物的特殊PUFA(例如EPA)是可能的。在重组微生物中的EPA生产也避免使用非持续性的海洋来源物质，这些物质会产生令人讨厌的风味和污染物，它们很难去除并且去除费用昂贵。分离自发酵重组微生物的所得EPA油不需要纯化这些生物积聚的化合物。
文献报道了许多最近的实例，其中负责EPA生产的ω-3/ω-6PUFA生物合成途径的不同部分已经被导入植物(例如Qi，B.等人，NatureBiotech.，22：739-745(2004))和啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)(非含油酵母)(参见Dyer，J.M.等人，Appl.Eniv.Microbiol.，59：224-230(2002)；美国专利公开6,136,574；Domergue，F.等人，Eur.J.Biochem.，269：4105-4113(2002))。
解脂耶氏酵母具有许多使其尤其可用于PUFA生产的特性(参见例如共有的美国专利公开7,238,482)。将含油酵母定义为那些天然能够合成并积聚油的酵母，其中积聚的油为细胞干重的至少25％。EPA的商业生产将需要生产按总脂肪酸重量％计高产量EPA的菌株。申请人通过工程化高度优化的解脂耶氏酵母菌株已经解决了所述问题，该菌株能够生产在总油级分中大于53.2％的EPA。
发明简述
本发明提供在微生物油中合成EPA的生产宿主。所述菌株是重组耶氏酵母菌种，该菌株在其基因组内掺入许多基因元件和修饰，使其就EPA生产而言具有独特的吸引力。
因此，本发明提供了用于生产二十碳五烯酸的重组耶氏酵母菌种生产宿主细胞，所述细胞包含：
a)至少一种编码Δ9延伸酶的基因，所述延伸酶具有选自SEQ IDNO：5、7、9、11、13、15和17的氨基酸序列；
b)至少一种编码Δ8去饱和酶的基因，所述去饱和酶具有选自SEQ ID NO：19、21、23、25、27、29、31和33的氨基酸序列；并且
其中耶氏酵母菌种生产宿主细胞生产按生产宿主细胞中总脂肪酸重量％计至少约43.3重量％的二十碳五烯酸。
在另一个实施方案中，本发明提供用于生产包含二十碳五烯酸的微生物油的方法，所述方法包括：
a)培养本发明的生产宿主，其中生产包含二十碳五烯酸的微生物油；并且
b)任选地回收步骤(a)的微生物油。
在另一个实施方案中，本发明提供微生物油组合物，所述微生物油组合物具有按总脂肪酸重量％计至少约25重量％的二十碳五烯酸，或者具有按总脂肪酸重量％计至少约30重量％的二十碳五烯酸和小于约25重量％的亚油酸，或者具有按总脂肪酸重量％计至少约50重量％的ω-3多不饱和脂肪酸。
在另一个实施方案中，本发明提供了按总脂肪酸重量％计的以下脂肪酸浓度的微生物油：
a)约48至约55重量％的二十碳五烯酸；
b)约1.5至约3.0重量％的二十碳四烯酸；
c)约0.1至0.7重量％的花生四烯酸；
d)约1.0至约2.5重量％的二高-y-亚麻酸；
e)约2.0至约3.5重量％的二十碳二烯酸；
f)约2.0至约3.0重量％的α-亚麻酸；
g)约17.0至约20.0重量％的亚油酸(18:2)；
h)约3.5至约6.5重量％的油酸(18:1)；
i)约1.0至约2.0重量％的硬脂酸(18:0)；
j)约0.5至约3.5重量％的棕榈油酸(16:1)；和
k)约2.5至约4.5重量％的棕榈酸(16:0)。
在另一个实施方案中，本发明的微生物油具有按总脂肪酸重量％计如下的脂肪酸浓度：
a)至少约43.3重量％的二十碳五烯酸；
b)小于约23.6重量％的亚油酸(18:2)；和
c)小于约9.4重量％的油酸(18:1)。
Figure GPA00001143582600041
附图简述和序列描述
图1A和图1B示出了ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径，并且当考虑下文对该途径的描述时应被视为一起。
图2A提供了解脂耶氏酵母Pex10p(即，SEQ ID NO：104[GenBank保藏号CAG81606]的氨基酸327-364)、解脂耶氏酵母Pex2p(即，SEQID NO：96[GenBank保藏号CAG77647]的氨基酸266-323)和解脂耶氏酵母Pex12p(即，SEQ ID NO：105[GenBank保藏号CAG81532]的氨基酸342-391)的C3HC4环状锌指基序的比对，它们具有星号指示的保守C3HC4环状锌指基序的半胱氨酸和组氨酸残基。图2B示出了解脂耶氏酵母Pex10p C3HC4指状基序的不同氨基酸残基之间和它们结合的两个锌离子之间的本发明相互作用。
图3图示了解脂耶氏酵母菌株Y4305的发育，该菌株在总脂质级分中生产大于53.2％的EPA。
图4是GC色谱，显示在解脂耶氏酵母菌株Y4305中的脂肪酸分布型，该菌株在总脂质级分中生产53.2％的EPA。
图5提供了下列质粒的质粒图谱：(A)pZP3-Pa777U；和(B)pY117。
图6提供了下列质粒的质粒图谱：(A)pZP2-2988；和(B)pZKUE3S。
图7提供了下列质粒的质粒图谱：(A)pZKL2-5U89GC；和(B)pZKL1-2SP98C。
图8提供了如下质粒的质粒图谱：(A)pZKUM；和(B)pZKD2-5U89A2。
图9提供了下列质粒的质粒图谱：(A)pFBAIN-MOD-1；和(B)pFBAIN-PEX10。
图10提供了下列质粒的质粒图谱：(A)pEXP-MOD-1；和(B)pPEX10-1。
图11A图示了解脂耶氏酵母菌株Y4184的发育，该菌株在总脂质级分中生产30.7％的EPA。图11B提供了pYPS161的质粒图谱。
根据下面的详细描述和附带的序列描述可以更充分地理解本发明，下面的详细描述和附带的序列描述形成了本申请的一部分。
下面的序列遵循37C.F.R.§1.821-1.825(“对包含核苷酸序列和/或氨基酸序列公开内容的专利申请的要求-序列规则”(“Requirements forPatent Applications Containing Nuceotide Sequences and/or Amino AcidSequence Disclosures-the Sequence Rules”))，并且符合世界知识产权组织(World Intellectual Property Organization)(WIPO)ST.25标准(1998)以及EPO和PCT的序列表要求(规则5.2和49.5(a-bis)以及行政指令(Administrative Instructions)的208节和附录C)。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循在37C.F.R.§1.822中列出的规则。
SEQ ID NO：1-135、150、151、155-158、173-189和196-201是编码引物、基因或蛋白(或它们的片段)的ORF或质粒，如表1所述。
表1
基因和蛋白质SEQ ID号汇总
  描述   核酸SEQ ID NO.   蛋白SEQ ID NO.
  解脂耶氏酵母Δ12去饱和酶(“YlD12”)   1(1936bp)   2(419AA)
  用于基因在耶氏酵母菌种中最优表达的经密码子优化的翻译起始位点   3(10bp)   --
  小眼虫、Δ9延伸酶(“EgD9e”)   4(777bp)   5(258AA)
  合成Δ9延伸酶来源于小眼虫，其密码子经最优化以在解脂耶氏酵母(“EgD9eS”)中表达   6(777bp)   7(258AA)
  小型绿藻属CCMP389 Δ9延伸酶(“E389D9e”)   8(792bp)   9(263AA)
  合成Δ9延伸酶，该酶来源于小型绿藻属CCMP389，其密码子经优化以在解脂耶氏酵母(“E389D9eS”)中表达   10(792bp)   11(263AA)
  Euglena anabaena UTEX 373 Δ9延伸酶(美国专利公开申请12/102879)(“EaD9Elo1”)   12(774bp)   13(258AA)
  合成Δ9延伸酶，该酶来源于Euglena anabaenaUTEX 373(美国专利公开申请12/102879)，其密码子经优化以在解脂耶氏酵母中表达(“EaD9eS”)   14(774bp)   15(258AA)
  Euglena anabaena UTEX 373 Δ9延伸酶(美国专利公开申请12/102879)(“EaD9Elo2”)   16(774bp)   17(258AA)
  小眼虫Δ8去饱和酶(“Eg5”或“EgD8”)   18(1271bp)   19(421AA)
  合成Δ8去饱和酶，该酶来源于小眼虫，其密码子经优化以在解脂耶氏酵母(“D8SF”或“EgD8S”)中表达   20(1272bp)   21(422AA)
合成突变型Δ8去饱和酶(“EgD8M”)，该酶来源于小眼虫(“EgD8S”)(美国专利公开7,256,033)   22(1272bp)   23(422AA)
Euglena anabaena UTEX 373 Δ8去饱和酶(美国专利公开申请12/099811)(“EaD8es3”)   24(1260bp)   25(420AA)
合成Δ8去饱和酶，该酶来源于Euglena anabaenaUTEX 373(美国专利公开申请12/099811)，其密码子经优化以在解脂耶氏酵母中表达(“EaD8S”)   26(1260bp)   27(420AA)
Euglena anabaena UTEX 373 Δ8去饱和酶(美国专利公开申请12/099811)(“EaD8es1”)   28(1260bp)   29(420AA)
Euglena anabaena UTEX 373 Δ8去饱和酶(美国专利公开申请12/099811)(“EaD8es2”)   30(1260bp)   31(420AA)
Euglena anabaena UTEX 373 Δ8去饱和酶(美国专利公开申请12/099811)(“EaD8es4”)   32(1260bp)   33(420AA)
小眼虫Δ5去饱和酶(“EgD5”)   34(1350bp)   35(449AA)
合成Δ5去饱和酶，该酶来源于小眼虫，其密码子经优化以在解脂耶氏酵母(“EgD5S”)中表表达   36(1350bp)   37(449AA)
多甲藻属CCMP626 Δ5去饱和酶(“RD5”)   38(1392bp)   39(463AA)
合成Δ5去饱和酶，该酶来源于多甲藻属CCMP626，其密码子经优化以在解脂耶氏酵母(“RD5S”)中表达   40(1392bp)   41(463AA)
Euglena anabaena UTEX 373 Δ5去饱和酶(美国专利公开申请12/111237)(“EaD5Des1”)   42(1362bp)   43(454AA)
合成Δ5去饱和酶，该酶来源于Euglena anabaenaUTEX 373(美国专利公开申请12/111237)，其密码子经优化以在解脂耶氏酵母中表达(“EaD5S”)   44(1362bp)   45(454AA)
合成突变型Δ5去饱和酶(“EgD5S-HXGG”包含一种HGGG或一种HHGG基序)，该酶来源于小眼虫(“EgD5S”)(美国临时专利申请号61/098333)   122(449AA)
  合成突变型Δ5去饱和酶(“EgD5S-HPGS”包含一种HPGS基序)，该酶来源于小眼虫(“EgD5S”)(美国临时专利申请号61/098333)   124(449AA)
  合成突变型Δ5去饱和酶(“EaD5S-HCGG”包含一种HCGG基序)，该酶来源于Euglena anabaenaUTEX 373(“EaD5S”)(美国临时专利申请号61/098333)   125(454AA)
  合成突变型Δ5去饱和酶(“RD5S-HXGG”包含一种HCGG或一种HWGG基序)，该酶来源于多甲藻属CCMP626(“RD5S”)(美国临时专利申请号61/098333)   126(463AA)
  栎树猝死病菌(Phytophthora ramorum)Δ17去饱和酶(“PrD17”)   46(1086bp)   47(361AA)
  合成Δ17去饱和酶，该酶来源于栎树猝死病菌(Phytophthora ramorum)，其密码子经优化以在解脂耶氏酵母中表达(“PrD17S”)   48(1086bp)   49(361AA)
  瓜果腐霉菌(Pythium aphanidermatum)Δ17去饱和酶(“PaD17”)   50(1080bp)   51(359AA)
  合成Δ17去饱和酶，该酶来源于瓜果腐霉菌(Pythium aphanidermatum)，其密码子经优化以在解脂耶氏酵母中表达(“PaD17S”)   52(1080bp)   53(359AA)
  串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)Δ12去饱和酶(“FmD12”)   54(1434bp)   55(477AA)
  合成Δ12去饱和酶，该酶来源于串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)，其密码子经优化以在解脂耶氏酵母(“FmD12S”)中表达   56(1434bp)   57(477AA)
  高山被孢霉(Mortierella alpina)C16/18延伸酶   58(828bp)   59(275AA)
  合成C16/18延伸酶，该酶来源于高山被孢霉(Mortierella alpina)ELO3，其密码子经优化以在解脂耶氏酵母中表达(“ME3S”)   60(828bp)   61(275AA)
  串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)Δ15去饱和酶(“FmD15”)   62(1209bp)   63(402AA)
  合成Δ15去饱和酶，该酶来源于串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)，其密码子经优化以在解脂耶氏酵母(“FmD15S”)中表达   64(1209bp)   65(402AA)
  解脂耶氏酵母Δ9去饱和酶(“YID9”)   66(1449bp)   67(482AA)
  解脂耶氏酵母二酰基甘油胆碱磷酸转移酶基因(“YlCPT1”)   68(1185bp)   69(394AA)
  解脂耶氏酵母Ura3(GenBank保藏号AJ306421)   70(4844bp)   71(284AA)
  解脂耶氏酵母Leu2(GenBank保藏号AF260230)   72(5194bp)   73(405AA)
  解脂耶氏酵母Lys5(GenBank保藏号M34929)   74(2569bp)   --
  解脂耶氏酵母Pox1(GenBank保藏号XP_504703)   --   75(677AA)
  解脂耶氏酵母Pox2(GenBank保藏号XP_505264)   --   76(700AA)
解脂耶氏酵母Pox3(GenBank保藏号XP_503244) --   77(700AA)
  解脂耶氏酵母Pox4(GenBank保藏号XP_504475)   --   78(701AA)
  解脂耶氏酵母Pox5(GenBank保藏号XP_502199)   --   79(699AA)
  解脂耶氏酵母Lip1(GenBank保藏号Z50020)   80(3278bp)   81(486AA)
  解脂耶氏酵母Lip2(GenBank保藏号AJ012632)   82(5304bp)   83(334AA)
  解脂耶氏酵母Lip3(GenBank保藏号AJ249751)   84(3630bp)   85(498AA)
  解脂耶氏酵母Lip4a(GenBank保藏号XP_503825)   --   86(406AA)
  解脂耶氏酵母SCP2(GenBank保藏号XM_503410)   87(390bp)   88(129AA)
  解脂耶氏酵母YALI0C18711g(GenBank保藏号XM_501987)   89(546bp)   90(181AA)
  解脂耶氏酵母YALI0F24167g(GenBank保藏号XM_505819)   91(1556bp)   92(351AA)
  解脂耶氏酵母二酰基甘油酰基转移酶(DGAT2)(美国专利公开7,267,976)   93(2119bp)   94(514AA)
  解脂耶氏酵母Pex1p(GenBank保藏号CAG82178) --   95(1024AA)
  解脂耶氏酵母Pex2p(GenBank保藏号CAG77647)   --   96(381AA)
  解脂耶氏酵母Pex3p(GenBank保藏号CAG78565)   --   97(431AA)
  解脂耶氏酵母Pex3Bp(GenBank保藏号CAG83356)   --   98(395AA)
  解脂耶氏酵母Pex4p(GenBank保藏号CAG79130)   --   99(153AA)
  解脂耶氏酵母Pex5p(GenBank保藏号CAG78803) --   100(598AA)
  解脂耶氏酵母Pex6p(GenBank保藏号CAG82306)   --   101(1024AA)
  解脂耶氏酵母Pex7p(GenBank保藏号CAG78389)   --   102(356AA)
  解脂耶氏酵母Pex8p(GenBank保藏号CAG80447)   --   103(671AA)
  解脂耶氏酵母Pex10p(GenBank保藏号CAG81606) --   104(377AA)
 解脂耶氏酵母Pex12p(GenBank保藏号CAG81532)   --   105(408AA)
 解脂耶氏酵母Pex13p(GenBank保藏号CAG81789) --   106(412AA)
 解脂耶氏酵母Pex14p(GenBank保藏号CAG79323)   --   107(380AA)
 解脂耶氏酵母Pex16p(GenBank保藏号CAG79622)   --   108(391AA)
 解脂耶氏酵母Pex17p(GenBank保藏号CAG84025)   --   109(225AA)
 解脂耶氏酵母Pex19p(GenBank保藏号AAK84827)   --   110(324AA)
 解脂耶氏酵母Pex20p(GenBank保藏号CAG79226)   --   111(417AA)
 解脂耶氏酵母Pex22p(GenBank保藏号CAG77876) --   112(195AA)
 解脂耶氏酵母Pex26p(GenBank保藏号NC_006072，核苷酸117230-118387的反义翻译)   113(386AA)
 包含解脂耶氏酵母Pex10基因的重叠群，该基因编码过氧化物酶体生物合成因子蛋白(Pex10p)(GenBank保藏号AB036770)   114(3387bp)
 解脂耶氏酵母Pex10(GenBank保藏号AB036770，核苷酸1038-2171)(蛋白序列与SEQ ID NO：104100％相同)   115(1134bp)   116(377AA)
 解脂耶氏酵母Pex10(GenBank保藏号AJ012084，它对应于GenBank保藏号AB036770的核苷酸11072171)(相对于SEQ ID NO：104和116的蛋白序列截短了最初的23个氨基酸)   117(1065bp)   118(354AA)
 解脂耶氏酵母Pex10p C3HC4环状锌指基序(即，SEQ ID NO：104的氨基酸327-364)   --   119(38AA)
  解脂耶氏酵母截短Pex10p(GenBank保藏号CAG81606[SEQ ID NO：104]，删除了C-末端的32个氨基酸)   120(345AA)
  解脂耶氏酵母乙酰羟酸合酶(AHAS)突变基因，该基因包含一种W497L突变   121(2987bp)
  大肠杆菌LoxP重组位点，被Cre重组酶重组   123(34bp)
  质粒pZP3-Pa777U   127(13,066bp)   --
  质粒pY117   128(9570bp)   --
  质粒pZP2-2988   129(15,743bp)   --
  质粒pZKUE3S   130(6303bp) --
  质粒pZKL2-5U89GC   131(15,812bp)   --
  质粒pZKL1-2SP98C   132(15,877bp)   --
  质粒pZKUM   133(4313bp)   --
  合成的突变型Ura3基因包含对耶氏酵母属的从+21至+53的33bp的删除、+376的1bp删除、和从+400至+403的3bp删除Ura3编码区(GenBank保藏号AJ306421)   134(1459bp) --
  质粒pZKD2-5U89A2   135(15,966bp)   --
  质粒pFBAIN-MOD-1   150(7222bp) --
  质粒pFBAIn-PEX10   151(8133bp) --
  质粒pEXP-MOD1   155(7277bp)   --
  质粒pPEX10-1   156(7559bp)   --
  质粒pPEX10-2   157(8051bp)   --
  质粒pYPS161   158(7966bp)   --
  嵌合片段：DNA来自染色体E、未知DNA和pZKD2-5U89A2的5′-末端   173(844bp)   --
  未知DNA位于pZKD2-5U89A2的5′-末端和染色体E之间   174(303bp)   --
  嵌合片段：染色体F，未知DNA和pZP3-PA777U的5′-末端   175(2365bp)   --
  未知DNA位于pZP3-PA777U和染色体F之间的5′-末端   176(1729bp)   --
  嵌合片段：染色体F和pZP3-PA777U的AscIIPacI片段的3′-末端之间   177(326bp)   --
  嵌合片段：染色体C和pZKL2-5U89GC的AscIISphI片段的5′-末端   178(519bp)   --
  未知DNA位于染色体C和pZKL2-5U89GC的AscIISphI片段的5′-末端的接合处   179(66bp)   --
  片段包含来自染色体C和pZKL2-5U89GC的AscIISphI片段的3′-末端的DNA   180(711bp)
  未知DNA位于染色体C和pZKL2-5U89GC的Asc\/Sph\片段的3′-末端的接合处   181(65bp)    --
  HPGG基序   --   182
  HXGG基序   --   183
  HPGX基序   --   184
  HGGG基序   --   185
  HHGG基序   --   186
  HPGS基序   --   187
  HCGG基序   --   188
  HWGG基序   --   189
  合成突变型Δ5去饱和酶(“EgD5S-HGGG”)，该酶来源于小眼虫(“EgD5S”)(美国临时专利申请号61/098333)   196(1350bp)
  合成突变型Δ5去饱和酶(“EgD5S-HHGG”)，该酶来源于小眼虫(“EgD5S”)(美国临时专利申请号61/098333)   197(1350bp)
  合成突变型Δ5去饱和酶(“EgD5S-HPGS”)，该酶来源于小眼虫(“EgD5S”)(美国临时专利申请号61/098333)   198(1350bp) --
  合成突变型Δ5去饱和酶(“EaD5S-HCGG”)，该酶来源于Euglena anabaena UTEX 373(“EaD5S”)(美国临时专利申请号61/098333)   199(1365bp) --
  合成突变型Δ5去饱和酶(“RD5S-HCGG”)，该酶来源于多甲藻属CCMP626(“RD5S”)(美国临时专利申请号61/098333)   200(1392bp) --
  合成突变型Δ5去饱和酶(“RD5S-HWGG”)，该酶来源于多甲藻属CCMP626(“RD5S”)(美国临时专利申请号61/098333)   201(1392bp) --
SEQ ID NO：136-143分别对应于引物pZP-GW-5-1、pZP-GW-5-2、pZP-GW-5-3、pZP-GW-5-4、pZP-GW-3-1、pZP-GW-3-2、pZP-GW-3-3和pZP-GW-3-4，所述引物用于执行基因组步移以测定菌株Y4128中的pZP2-2988基因组整合位点。
SEQ ID NO：144和145分别对应于基因组步移法接头引物，而SEQID NO：146分别对应于巢式接头引物。
SEQ ID NO：147和148分别对应于引物Per10 F1和ZPGW-5-5，所述引物用于测定pZP2-2988的基因组整合位点的5′末端。
SEQ ID NO：149对应于引物Per10 R，该引物用于扩增解脂耶氏酵母Pex10基因的编码区。
SEQ ID NO：152-154分别对应于引物PEX10-R-BsiW\、PEX10-F1-Sal\和PEX10-F2-Sal\，所述引物用于构建pPEX10-1和pPEX10-2。
SEQ ID NO：159和160分别对应于Pex-10del1 3′.正向引物和Pex-10del2 5′.反向引物，所述引物用于鉴定具有Pex10删除的细胞。
SEQ ID NO：161-164分别对应于引物KL2-3-1、KD2-3-2、SCP-5-2和KD2-5-3，所述引物用于执行基因组步移以测定菌株Y4305中的pZKD2-5U89A2的基因组整合位点。
SEQ ID NO：165-168分别对应于引物79-5-POX-1、79-5-POX-2、4305ZP3-3-2和79-3-POX-3，所述引物用于执行基因组步移以测定菌株Y4305中的pZP3-PA777U的基因组整合位点。
SEQ ID NO：169-172分别对应于引物KL2-5-2、KL2-5-3、KL2-3-2和KL2-3-3，所述引物用于执行基因组步移以测定菌株Y4305中的pZKL2-5U89GC的基因组整合位点。
SEQ ID NO：190-195分别对应富含His的基序，该富含His的基序是属于双铁膜蛋白超家族的膜结合脂肪酸去饱和酶的特征。
发明详述
本文所引用的以下专利、专利申请和出版物均以引用的方式将其全文并入本文：美国专利公开申请11/265761(提交于2005年11月2日)、美国临时申请60/977,174(提交于2007年10月3日)和美国临时申请60/977,177(提交于2007年10月3日)。
本文所述的是生产宿主菌株解脂耶氏酵母，该菌株能够生产大于25％的二十碳五烯酸(EPA；20:5ω-3)。积聚这种特定多不饱和脂肪酸[“PUFA”]通过导入功能性ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径完成，该途径包含的蛋白具有Δ9延伸酶、Δ8去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ17去饱和酶、Δ12去饱和酶和C16/18延伸酶活性，从而能够生产缺乏γ-亚麻酸[“GLA”]的EPA油。因此，该公开证明解脂耶氏酵母能被工程化以商业生产EPA及其衍生物。生产方法也是受权利要求书保护的。
PUFA或其衍生物可用作膳食替代品或补充剂，尤其是婴儿代乳品(formula)，用于接受静脉内营养法的患者或用来预防或治疗营养不良。作为另外一种选择，可将纯化的PUFA(或其衍生物)掺入食用油、脂肪或调配的人造黄油中，以便食用者在正常使用中将获得所需量的膳食补充。PUFA还可被掺入到婴儿代乳品、营养补充剂或其它食品中，并且可用作抗炎或降胆固醇剂。任选地，该组合物可以用于药用(人药或兽药)。
给人或动物补充以重组手段产生的PUFA可导致加入的PUFA以及它们的代谢物的水平升高。例如，用EPA处理不但会导致EPA含量提高，而且会导致EPA下游产物如类二十烷酸(即，前列腺素、白三烯、血栓素)、二十二碳五烯酸[“DPA”]和二十二碳六烯酸[“DHA”]水平提高。复杂的调节机制使得期望组合多种PUFA或者添加不同的PUFA缀合物，以便预防、控制或克服这种机制来在个体中实现所需水平的特定PUFA。
作为另外一种选择，PUFA或其通过本文公开的方法制备的衍生物能应用于动物或水产饲料的合成中，如干饲料、半湿饲料和湿饲料，因为这些制剂一般需要至少1-2％的营养物质组合物是ω-3和/或ω-6PUFA。
定义
在本公开中，使用了大量术语和缩写。给出了如下定义。
“开放阅读框”缩写为“ORF”。“聚合酶链反应”缩写为“PCR”。
“美国典型培养物保藏中心”缩写为“ATCC”。
“多不饱和脂肪酸”缩写为“PUFA”。
“二酰基甘油酰基转移酶”缩写为“DAG AT”或“DGAT”。
“三酰基甘油”缩写为“TAG”。
“辅酶A”缩写为“CoA”。
“总脂肪酸”缩写为“TFA”。
“脂肪酸甲酯”缩写为“FAME”。
“干细胞重量”缩写为“DCW”。
如本文所用，“术语”发明或“本发明”旨在指如本文中的权利要求和说明书中所描述的本发明的所有方面和所有实施方案，并无意于局限于任一具体实施方案或方面。
术语“食品”指一般适于人类消耗的任何食物。一般的食品包括但不限于：肉类产品、谷类食物、烘焙食物、小吃食物、乳类产品、饮料等。术语“食物类似物”、“功能性食物”、“医疗食物”和“医疗营养物质”在专利公布US 2006-0115881-A1中定义。
如本文所用，术语“药物”指一种化合物或物质，如果它在美国售卖，将受Federal Food，Drug and Cosmetic Act的Section 503或505控制。
术语“婴儿代乳品”指设计专用于人类婴儿消耗的食品，因为它模拟人类母乳。婴儿代乳品的一般商业实例包括但不限于：Similac
Figure GPA00001143582600171
和I\somil
Figure GPA00001143582600172
。
术语“饮食补充剂”指一种产品，该产品：(i)旨在补充饮食并因此不用作常规食品或用作膳食或饮食的单独一项；(ii)包含一种或多种膳食成分(包括例如维生素、矿物质、香草或其它植物制剂、氨基酸、酶和腺体)或它们的组分；(iii)旨在以药丸、胶囊、片剂、或液体形式口服；和(iv)被标记为饮食补充剂。
术语“临床状况”将指人或动物的状况，该状况损害人或动物的健康状态和健康，并且能通过补充PUFA尤其是ω-3和/或ω-6脂肪酸进行治疗。临床状况可采用大量文献证明了的疾病状态形式如冠心病或由营养不良引起的健康状态不良的常见状况。
术语“动物饲料”指旨在专用于动物消耗的饲料，动物包括家畜如宠物、农场动物等，或用于为了生产食品而喂养的动物，如养鱼场。术语“水产养殖饲料”、“水产饲料”和“饲料营养物质”在专利公布US 2006-0115881-A1中定义。
如本文所用，术语“生物质”具体地讲是指耗费的或使用的酵母细胞物质，该物质由以商业显著量生产PUFA的重组生产宿主发酵产生，其中优选的生产宿主是含油酵母的重组菌株，解脂耶氏酵母。生物质可以是以下形式：全细胞、全细胞溶解产物、匀化细胞、部分水解细胞物质、和/或部分纯化细胞物质(例如微生物产生的油)。
术语“脂质”指任何脂溶性的(即，亲脂的)、天然存在的分子。脂质是具有多种关键生物学功能的化合物的各种不同基团，所述功能例如细胞膜的结构组分、能量贮存来源和信号途径的中间体。可以将脂质广泛定义为疏水性或两亲性小分子，它们完全地或部分地起源于酮类或异戊二烯基团。表2显示了对脂质的综述，它基于LipidMetabolites and Pathways Strategy(LIPID MAPS)分类体系(NationalIn stitute of General Medical Sciences，Bethesda，MD)。
表2
脂质类别综述
Figure GPA00001143582600181
本文术语细胞的“总脂质级分”指细胞的所有酯化脂肪酸。能分离在总脂质级分中的不同亚级分，包括三酰基甘油[“油”]级分、磷脂酰胆碱级分和磷脂酰乙醇胺级分，但是这并不包括所有亚级分。
“脂质体”指通过单层磷脂以及通常通过特异性蛋白结合的脂质小滴。这些细胞器是大多数生物运输/贮存中性脂类的位点。认为脂质体来源于包含TAG生物合成酶的内质网的微区。它们的合成及尺寸受特异性蛋白组分的控制。
“中性脂类”指那些一般以贮存脂肪和油形式存在于细胞中的脂质体中的脂质，它们的名称是因为在细胞pH下，所述脂质无带电基团。它们一般是完全非极性的，对水无亲和力。中性脂类一般指脂肪酸的单酯、二酯、和/或三酯，也分别称为单酰基甘油、二酰基甘油或三酰基甘油，或统称为酰基甘油。为了从酰基甘油中释放游离脂肪酸，必须发生水解反应。
术语“三酰基甘油”[“TAG”]和“油”是可互换的，它们指由酰化甘油分子的三个脂肪酰残基组成的中性脂类。TAG能够包含长链PUFA，以及较短的饱和的和不饱和的脂肪酸以及较长链的饱和脂肪酸。细胞的TAG级分也称作“油级分”，并且“油的生物合成”一般指在细胞中合成TAG。油或TAG级分是总脂质级分的亚级分，虽然它也是构成总脂质含量的主要部分，总脂质含量以含油生物细胞中的总脂肪酸重量占干细胞重量[参见下文]的百分比表示。油[“TAG”]级分中的脂肪酸组合物和总脂质级分的脂肪酸组合物一般是相似的。因此，总脂质级分中的PUFA浓度的提高或降低将对应于油[“TAG”]级分中的PUFA浓度的升高或降低，反之亦然。
术语“磷脂酰胆碱”或“PC”指磷脂，它是细胞膜的主要组分。一般能描述PC的化学结构包含以下组分：一种胆碱分子、一种磷酸基和甘油，其中脂肪酰链是R基在甘油分子的sn-1和sn-2位点上连接起来形成的。
术语“总脂肪酸”[“TFA”]本文指所有细胞脂肪酸的总量，所述脂肪酸在给定实例中能过碱酯交换方法(本领域已知的方法)被衍生化成脂肪酸甲酯[“FAME”]，例如它可以是总脂质级分或油级分。因此，总脂肪酸包括来自中性和极性脂质级分的脂肪酸，包括磷脂酰胆碱级分、磷脂酰乙醇胺级分和二酰基甘油、单酰基甘油和三酰基甘油[“TAG或油”]级分，但是不包括游离脂肪酸。
术语细胞的“总脂质含量”是TFA的量度，以干细胞重量[“DCW”]百分比的形式表示。因此，总脂质含量[“TFA％DCW”]等同于例如每100毫克DCW的总脂肪酸毫克数。
脂肪酸浓度本文一般表示为TFA的重量百分比[“％TFA”]，例如每100毫克TFA的给定脂肪酸毫克数。除非在本文公开内容中另作具体说明，给定脂肪酸相对于总脂质的百分比等同于按％TFA计的脂肪酸浓度(例如总脂质的％EPA等同于EPA％TFA)。
在一些情况下，可使用细胞中给定脂肪酸占干细胞重量的百分比[“％DCW”]形式表达其含量。因此例如二十碳五烯酸％DCW将根据下式进行测定：(二十碳五烯酸％TFA)*(TFA％DCW)]/100。
术语“脂质特征”和“脂质组合物”是可互换的，并且指在特定脂质级分(例如在总脂质级分或油[“TAG”]级分中)中包含的单个脂肪酸的量，其中所述量用TFA百分比形式表示混合物中存在的各个脂肪酸的总量应当是100。
术语“脂肪酸”指不同链长的长链脂族酸(链烷酸)，链长为约C12至C22(尽管更长和更短链长的酸均是已知的)。主要的链长介于C16和C22之间。脂肪酸的结构可用简单的记号系统“X:Y”来表示，其中X表示具体脂肪酸中碳(“C”)原子的总数，而Y表示双键的数目。另外的关于“饱和脂肪酸”对“不饱和脂肪酸”、“单不饱和脂肪酸”对“多不饱和脂肪酸”(“PUFA”)、以及“ω-6脂肪酸”(ω-6或n-6)对“ω-3脂肪酸”(ω-3或n-3)之间的区别的详细信息在美国专利7,238,482中有所提供，该专利以引用方式并入本文。
表3提供了用于描述本文PUFA的命名。在标题为“简化符号”一栏中，ω-指代系统用于表明碳数目、双键的数目和最接近ω碳的双键位置，双键位置的计数从ω碳开始(为此ω碳的编号为1)。该表的其余部分汇总了ω-3和ω-6脂肪酸及其前体的俗名、将在整个说明书中使用的缩写以及每种化合物的化学名称。
表3
多不饱和脂肪酸及其前体的命名
Figure GPA00001143582600211
  二十二碳五烯酸   DPA   -顺式-7，10，13，16，19-二十二碳五烯酸   22:5ω-3
  二十二碳六烯酸   DHA   -顺式-4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸   22:6ω-3
术语“高水平EPA生产”是指生产占微生物宿主总脂质至少约25％的EPA，优选占微生物宿主总脂质至少约30％的EPA，更优选占微生物宿主总脂质至少约35％的EPA 5，更优选占微生物宿主总脂质至少约40％的EPA，更优选占微生物宿主总脂质至少约40-45％的EPA，更优选占微生物宿主总脂质至少约45-50％的EPA，更优选占微生物宿主总脂质至少约50-60％，并且最优选占微生物宿主总脂质至少约60-70％的EPA。EPA的结构形式不受限制；因此例如EPA可在总脂质中以游离脂肪酸形式或酯化形式存在，例如酰基甘油、磷脂、硫脂或糖脂。
术语“缺乏GLA”是指当使用具有约0.1％可检测水平下限的设备进行GC分析测量时，在微生物宿主的总脂质中可检测到的GLA小于约1％。
术语“无任何DHA”是指当使用具有约0.1％可检测水平下限的设备进行GC分析测量时，在微生物宿主的总脂质中无任何可检测到的DHA。
代谢途径或生物合成途径在生物化学意义上可认为是发生于细胞内由酶催化的一系列化学反应，以实现细胞待使用的或待贮存的代谢产物的形成，或启动另一代谢途径(称作流量产生步骤)。很多此类途径均很精细，并涉及对起始物质的逐步修饰以使之形成具有期望的精确化学结构的产物。
术语“PUFA生物合成途径”是指将油酸转化成诸如LA、EDA、GLA、DGLA、ARA、DRA、DTA和DPAn-6之类的ω-6脂肪酸和诸如ALA、STA、ETrA、ETA、EPA、DPA和DHA之类的ω-3脂肪酸的代谢过程。该过程在文献中已有很好的描述(如参见PCT公开No.WO2006/052870)。简而言之，该过程涉及通过添加碳原子来延长碳链和通过加入双键来使分子去饱和这通过存在于内质网膜内的一系列特异性去饱和酶和延伸酶(称为“PUFA生物合成途径酶”)进行。更具体地讲，“PUFA生物合成途径酶”是指如下与PUFA生物合成相关的任何酶(以及编码该酶的基因)，包括：Δ4去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ12去饱和酶、Δ15去饱和酶、Δ17去饱和酶、Δ9去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ9延伸酶、C14/16延伸酶、C16/18延伸酶、C18/20延伸酶和/或C20/22延伸酶。
术语“ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径”是指在合适条件下表达时编码催化ω-3和ω-6脂肪酸二者之一或两者产生的酶的一组基因。通常，参与ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径的基因编码PUFA生物合成途径酶。图1A和图1B示出了代表性的途径，提供了肉豆蔻酸经过多种中间产物向DHA的转化，这展示了ω-3和ω-6脂肪酸两者是如何可以从共同来源而产生。该途径自然分成两部分，其中一部分将产生ω-3脂肪酸而另一部分只产生ω-6脂肪酸。只产生ω-3脂肪酸的部分在本文中将称作ω-3脂肪酸生物合成途径，而只产生ω-6脂肪酸的部分在本文中将称作ω-6脂肪酸生物合成途径。
如本文中关于ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径所用的，术语“功能性的”是指该途径中的一些(或全部)基因表达活性酶，导致体内催化或底物转化。应当理解，“ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径”或“功能性ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径”并不意味着上文中所有PUFA生物合成途径酶基因都是必需的，因为许多脂肪酸产物将仅要表达该途径中的一亚组基因。
术语“Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径”将指最低程度包括至少一种Δ9延伸酶和至少一种Δ8去饱和酶的PUFA生物合成途径，从而使得能分别从LA和ALA开始，以EDA和/或ETrA作为脂肪酸中间产物来生物合成DGLA和/或ETA。当表达其它去饱和酶和延伸酶时，也可合成ARA、DTA、DPAn-6、EPA、DPA、和DHA。
术语“Δ6去饱和酶/Δ6延伸酶途径”将指最低程度包括至少一种Δ6去饱和酶和至少一种C18/20延伸酶的PUFA生物合成途径，从而使得能分别从LA和ALA开始，以GLA和/或STA作为脂肪酸中间产物来生物合成DGLA和/或ETA。当表达其它去饱和酶和延伸酶时，也可合成ARA、DTA、DPAn-6、EPA、DPA、和DHA。
术语“脂肪酸中间产物”是指在脂肪酸代谢途径中产生的任何脂肪酸，其可以通过其他代谢途径酶的作用进一步转化成本途径的目的脂肪酸产物。例如，当利用Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径产生EPA时，可以产生EDA、ETrA、DGLA、ETA和ARA并被认为是“脂肪酸中间产物”，因为这些脂肪酸可通过其他代谢途径酶的作用进一步转化成EPA。
术语“脂肪酸副产物”是指在脂肪酸代谢途径中产生的既非该途径的目的脂肪酸产物又非该途径的“脂肪酸中间产物”的任何脂肪酸。例如，当利用Δ9延伸酶M8去饱和酶途径中产生EPA时，金松烯酸(sciadonic)和杜松烯酸(juniperonic)也可通过Δ5去饱和酶分别作用于EDA或ETrA而产生。它们被认为是“脂肪酸副产物”，因为两者均不能通过其他代谢途径酶的作用进一步转化成EPA。
术语“去饱和酶”是指可以在一种或多种脂肪酸中去饱和(即引入双键)而产生所关注的脂肪酸或前体的多肽。尽管在整个说明书中使用ω-指代系统来指代特定的脂肪酸，但使用Δ-系统从底物的羧基端计数来表示去饱和酶的活性更方便。本文特别关注的脂肪酸是：1)Δ8去饱和酶，它催化EDA转化成DGLA和/或催化ETrA转化成ETA；2)Δ5去饱和酶，它催化DGLA转化为ARA和/或催化ETA转化为EPA；3)Δ17去饱和酶，它在分子羧基末端编号为17th和18th的碳原子之间去饱和脂肪酸，并且它例如催化底物脂肪酸ARA转化成EPA和/或催化底物脂肪酸DGLA转化成ETA；和4)Δ12去饱和酶，它催化油酸转化成LA。
偶尔也将Δ-17(Δ17)去饱和酶和Δ15去饱和酶称作“ω-3去饱和酶”、“w-3去饱和酶”、和/或“ω-3去饱和酶”，这是基于它们将ω-6脂肪酸转化成它们的ω-3对应物的能力(如分别将LA转化成ALA或将DGLA转化成ETA以及将ARA转化成EPA)。
一些去饱和酶对两种或多种底物有活性。基于这一能力，能根据它们的去饱和酶活性将这些酶进一步分类为“一官能的”或“双官能的”。所期望的是通过用脂肪酸去饱和酶的基因来转化合适的宿主并测定它对该宿主脂肪酸概况的作用，从而经验性地测定脂肪酸去饱和酶的特异性。“酶底物”是指去饱和酶多肽在底物活性位点与之结合并以反应方式作用于底物。
术语“EgD8”是指分离自小眼虫的Δ8去饱和酶(SEQ ID NO：18和19)；EgD8与描述于美国专利公开7,256,033的、命名为“Eg5”的蛋白100％相同并且功能等同。术语“EgD8S”是指来源于小眼虫的合成Δ8去饱和酶(SEQ ID NO：20和21)Δ8去饱和酶称为“EgD8”，其中EgD8S的密码子经优化以在解脂耶氏酵母中表达。EgD8S与描述于美国专利公开7,256,033中的“D8SF”100％相同并且功能等同。
术语“EgD8M”指突变型Δ8去饱和酶(SEQ ID NO：22和23)，它有至少一种相对于来源于小眼虫的合成Δ8去饱和酶的突变，该合成去饱和酶经密码子最优化以在解脂耶氏酵母中表达(即，EgD8S)。更具体地讲，虽然“突变”可包括任何删除、插入、和点突变(或它们的组合)，在优选的实施方案中将突变型EgD8M描述为突变型EgD8S-23(SEQ ID NO：23)。具体地讲，突变型EgD8S-23(描述于专利公布US 20080138868 A1中)相对于如SEQ ID NO：21所示的合成的密码子优化EgD8S序列包含以下24个氨基酸突变：4S突变成A、5K突变成S、12T突变成V、16T突变成K、17T突变成V、66P突变成Q、67S突变成A、108S突变成L、117G突变成A、118Y突变成F、120L突变成M、121M突变成L、125Q突变成H、126M突变成L、132V突变成L、133L突变成V、162L突变成V、163V突变成L、293L突变成M、407A突变成S、408V突变成Q、418A突变成G、419G突变成A和422L突变成Q。使用Vector NTI
Figure GPA00001143582600251
′s AlignX程序(InvitrogenCorporation，Carlsbad，CA)的预设参数成对比对突变型EgD8S-23氨基酸序列(SEQ ID NO：23)和合成的经密码子优化的序列SEQ IDNO：21，结果揭示在两种蛋白长度为422个氨基酸的序列之间有94.3％的序列同一性和97.9％的共有序列。突变型EgD8S-23(SEQ ID NO：23)的Δ8去饱和酶活性至少约功能上等同于合成的经密码子优化的EgD8S(SEQ ID NO：21)的Δ8去饱和酶活性。
术语“EaD8Des3”指从Euglena anabaena UTEX 373中分离的由本文SEQ ID NO：24编码的Δ8去饱和酶(SEQ ID NO：25)。同样地，术语“EaD8S”是指来源于Euglena anabaena UTEX 373的、经密码子优化以便在解脂耶氏酵母中表达的合成Δ8去饱和酶(即SEQ ID NO：26和27)。EaD8和EaD8S描述于美国专利公开申请12/099811(提交于4/09/2008)中；在该专利申请中将EaD8命名为“EaD8Des3”。
术语“EgD5”是指从小眼虫中分离的由本文SEQ ID NO：34编码的Δ5去饱和酶(SEQ ID NO：35)。同样，术语“EgD5S”是指来源于小眼虫的合成Δ5去饱和酶，其密码子经优化以在解脂耶氏酵母中表达(即SEQ ID NO：36和37)。EgD5和EgD5S描述于PCT公开WO2007/136671。
就本文目的而言，术语“RD5”是指Δ5去饱和酶(SEQ ID NO：39)，该酶分离自多甲藻属CCMP626，由本文的SEQ ID NO：38编码。同样地，术语“RD5S”是指合成Δ5去饱和酶，该酶来源于多甲藻属CCMP626，其密码子经优化以在解脂耶氏酵母中表达(即，SEQ IDNO：40和41)。RD5和RD5S描述于美国专利公开申请11/748637(提交于5/15/2007)。
术语“EaD5”是指从Euglena anabaena UTEX 373中分离的由本文SEQ ID NO：42编码的Δ5去饱和酶(SEQ ID NO：43)。同样地，术语“EaD5S”是指来源于Euglena anabaena UTEX 373的、经密码子优化以便在解脂耶氏酵母中表达的合成Δ5去饱和酶(即SEQ ID NO：44和45)。EaD5和EaD5S描述于美国专利公开申请12/111237(提交于4/29/2008)中；在该专利申请中将EaD5命名为“EaD5Des1”。
术语“突变型Δ5去饱和酶”是指如本文所述的Δ5去饱和酶，该酶在细胞色素b5结构域的His-Pro-Gly-Gly(HPGG；SEQ ID NO：182)基序中具有至少一种突变，其中所述突变导致氨基酸取代(保守的或者非保守的)。虽然所述突变可包括任何氨基酸取代，突变型Δ5去饱和酶优选地包含至少一种选自His-Xaa-Gly-Gly(SEQ ID NO：182)和His-Pro-Gly-Xaa(SEQ ID NO：184)的突变基序，并且突变型Δ5去饱和酶的Δ5去饱和酶活性至少约功能上等同于野生型Δ5去饱和酶的Δ5去饱和酶活性。更优选的，突变基序选自：His-Gly-Gly-Gly(HGGG；SEQ ID NO：185)、His-His-Gly-Gly(HHGG；SEQ ID NO：186)、His-Cys-Gly-Gly(HCGG；SEQ ID NO：188)、His-Trp-Gly-Gly(HWGG；SEQ ID NO：189)和His-Pro-Gly-Ser(HPGS；SEQ ID NO：187)；参见例如如SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：124、SEQ ID NO：125、SEQ IDNO：126、SEQ ID NO：196、SEQ ID NO：197、SEQ ID NO：198、SEQ IDNO：199、SEQ ID NO：200和SEQ ID NO：201所示的Δ5去饱和酶。
每个“突变型Δ5去饱和酶”具有一种“对应的野生型Δ5去饱和酶”。具体地讲，突变型Δ5去饱和酶和对应的野生型Δ5去饱和酶具有相同的氨基酸序列，除了野生型将包含一种在细胞色素b5结构域内的HPGG(SEQ ID NO：182)基序，然而突变型将包含至少一种在此基序内的突变(如上所述)。
当突变型Δ5序列的酶活性和特异选择性比得上对应的野生型Δ5去饱和酶的酶活性和特异选择性时(或活性更高时)，突变型Δ5去饱和酶“至少约功能上等同”于对应的野生型Δ5去饱和酶。因此，当比较每种酶的“转化效率”时，功能上等同的突变型Δ5去饱和酶将具有Δ5去饱和酶活性，该酶活性相对于对应的野生型Δ5去饱和酶活性基本上不降低(即，突变型Δ5去饱和酶将具有至少约50％，优选至少约75％，更优选至少约85％，最优选至少约95％的野生型Δ5去饱和酶活性)。两种多肽的Δ5去饱和酶活性可以是基本上相同的。优选地，突变型Δ5去饱和酶在与对应的野生型Δ5去饱和酶进行比较时将具有提高的酶活性和特异选择性，即，具有至少约101-105％，更优选至少约106-115％以及最优选至少约116-125％的野生型Δ5去饱和酶活性。
术语“PaD17”是指分离自瓜果腐霉菌的由SEQ ID NO：50编码的Δ17去饱和酶(SEQ ID NO：51)。同样地，术语“PaD17S”是指经密码子优化以用于在解脂耶氏酵母中表达的来源于瓜果腐霉菌的合成Δ17去饱和酶(即SEQ ID NO：52和53)。基于在美国专利公开申请11/779915(提交于7/19/2007)中描述的分析，将PaD17和PaD17S进一步分成双官能的Δ17去饱和酶。具体地讲，“双官能的Δ17去饱和酶”、“双官能的Δ17去饱和酶活性”或“主要的Δ17去饱和酶活性”是指优先将ARA转化成EPA和/或将DGLA转化成ETA但是另外还具有将LA转化成ALA的有限能力(因而展示出主要的Δ17去饱和酶活性和有限的Δ15去饱和酶活性)的Δ17去饱和酶。相比之下，“一官能的Δ17去饱和酶”、“一官能的Δ17去饱和酶活性”或“专一的Δ17去饱和酶活性”是指能够将ARA转化成EPA和/或将DGLA转化成ETA但不能将LA转化成ALA的Δ17去饱和酶。
术语“PrD17”是指鉴定自栎树猝死病菌的由SEQ ID NO：46编码的Δ17去饱和酶(SEQ ID NO：47)。相比之下，术语“PrD17S”是指经密码子最优化以用于在解脂耶氏酵母中表达的来源于栎树猝死病菌的合成的Δ17去饱和酶(即SEQ ID NO：48和49)。PrD17和PrD17S被鉴定为双官能的Δ17去饱和酶；它们描述于美国专利公开申请11/787772(提交于4/18/2007)和美国专利公开申请11/779915(提交于7/19/2007)。
术语“串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)”与“串珠镰刀菌(Fusarium verticillioides)”同义，并且也与“藤仓赤霉(Gibberellafujikuroi)”同义。术语“FmD12”指分离自串珠镰刀菌(Fusariummoniliforme)的由SEQ ID NO：54编码的Δ12去饱和酶(SEQ IDNO：55)。FmD12与如GenBank保藏号DQ272515所述的藤仓赤霉(Gibberella fujikuroi)Δ12去饱和酶相同。同样地，术语“FmD12S”是指经密码子优化以用于在解脂耶氏酵母中表达的来源于串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)的合成Δ12去饱和酶(即SEQ ID NO：56和57)。FmD12描述于PCT公开WO 2005/047485中。
本文特别关注的其它去饱和酶包括：1)Δ15去饱和酶，该酶催化LA转化成ALA和/或催化GLA转化成STA；和2)Δ9去饱和酶，该酶催化棕榈酸转化成棕榈油酸(16:1)和/或催化硬脂酸转化成油酸(18:1)。
术语“FmD15”是指分离自串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)的由SEQ ID NO：62编码的Δ15去饱和酶(SEQ ID NO：63)。FmD15与如GenBank保藏号DQ272516所述的藤仓赤霉(Gibberella fujikuroi)Δ15去饱和酶相同。同样地，术语“FmD15S”指经密码子优化以用于在解脂耶氏酵母中表达的来源于串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)的合成Δ15去饱和酶(即SEQ ID NO：64和65)。基于在PCT公开WO2005/047480中描述的分析，将FmD15进一步分成双官能的Δ15去饱和酶；预期FmD15S是功能相似的。具体地讲，“双官能的Δ15去饱和酶”、“双官能的Δ15去饱和酶活性”或“主要的Δ15去饱和酶活性”是指优先将LA转化成ALA但是另外还具有将油酸转化成LA的有限能力(因而展示出主要的Δ15去饱和酶活性和有限的Δ12去饱和酶活性)的Δ15去饱和酶。相比之下，“一官能的Δ15去饱和酶”、“一官能的Δ15去饱和酶活性”或“专一的Δ15去饱和酶活性”是指能够将LA转化成ALA但不能将油酸转化成LA的Δ15去饱和酶。
术语“YlD9”是指Δ9去饱和酶(SEQ ID NO：67)，该酶分离自解脂耶氏酵母，由SEQ ID NO：66编码(也参见GenBank保藏号XM_501496)。
其它有用的PUFA去饱和酶包括：1)Δ6去饱和酶，该酶催化LA转化成GLA和/或催化ALA转化成STA；和2)Δ4去饱和酶，该酶催化DPA转化成DHA和/或催化DTA转化成DPAn-6。
术语“延伸酶”是指能延长脂肪酸碳链从而产生比该延伸酶作用于其上的脂肪酸底物长2个碳原子的酸的多肽。该延长过程在与脂肪酸合酶相关的多步骤机制中发生，如PCT公开WO 2005/047480中所述。延伸酶体系催化反应的实例如GLA转化成DGLA、STA转化成ETA、ARA转化成DTA以及EPA转化成DPA。通常，延伸酶的底物选择性有些广泛，但由链长度和不饱和的程度及类型两者来区分。例如，C14/16延伸酶将利用C14底物(如肉豆蔻酸)，C16/18延伸酶将利用C16底物(如棕榈酸)，C18/20延伸酶(也称为Δ6延伸酶，两个术语可以互换使用)将利用C18底物(如GLA、STA)，而C20/22延伸酶将利用C20底物(如ARA、EPA)。以类似方式，Δ9延伸酶能够催化LA和ALA分别转化成EDA和ETrA。
重要的是，须注意一些延伸酶具有广泛的特异性并因而单个延伸酶可能能催化几种延伸酶反应(如，从而可作为C16/18延伸酶和C18/20延伸酶起作用)。可能理想的是，通过用脂肪酸延伸酶的基因来转化合适的宿主并测定它对该宿主脂肪酸概况的作用，从而经验性地测定脂肪酸延伸酶的特异性。
术语“EgD9e”指从小眼虫中分离的由SEQ ID NO：4编码的Δ9延伸酶(SEQ ID NO：5)。相比之下，术语“EgD9eS”是指来源于小眼虫的合成Δ9延伸酶，其密码子经优化以在解脂耶氏酵母中表达(即SEQID NO：6和7)。EgD9e和EgD9eS描述于PCT公开WO 2007/061742。
术语“E389D9e”是指Δ9延伸酶(SEQ ID NO：9)，该酶分离自小型绿藻属CCMP389，由SEQ ID NO：8编码。相比之下，术语“E389D9eS”是指合成Δ9延伸酶，该酶来源于小型绿藻属CCMP389，其密码子经优化以在解脂耶氏酵母中表达(即，SEQ ID NO：10和11)。E389D9e和E389D9eS描述于PCT公开WO 2007/061742。
术语“EaD9e”是指从Euglena anabaena UTEX 373中分离的由SEQID NO：12编码的Δ9延伸酶(SEQ ID NO：13)。同样地，术语“EaD9eS”是指来源于Euglena anabaena UTEX 373的合成Δ9延伸酶，其密码子经优化以在解脂耶氏酵母中表达(即SEQ ID NO：14和15)。EaD9e和EaD9eS描述于美国专利公开申请12/102879(提交于4/15/2008)中；在该专利申请中将EaD9e命名为“EaD9Elo1”。
术语“ELO3”指高山被孢霉(Mortierella alpina)C16/18脂肪酸延伸酶(SEQ ID NO：59)，该酶由elo3基因(SEQ ID NO：58)编码，优先催化棕榈酸(16:0)转化成硬脂酸(18:0)。ELO3描述于PCT公开WO 2007/046817中。相关地，术语“ME3S”是指来源于高山被孢霉(Mortierella alpina)的合成C16/18脂肪酸延伸酶，其密码子经优化以在解脂耶氏酵母中表达(即，SEQ ID NO：60和61)。
术语“转化效率”和“底物转化百分比”是指特定酶(如去饱和酶或延伸酶)能够将底物转化成产物的效率。转化效率根据下面的公式测量：([产物]/[底物+产物])×100，其中‘产物’包括源于它的途径中的中间产物和所有产物。
术语“酰基转移酶”指负责转移除氨基-酰基(EC 2.3.1.-)之外的基团的酶。
术语“DAG AT”指二酰基甘油酰基转移酶(也称为酰基-CoA-二酰基甘油酰基转移酶或二酰基甘油O-酰基转移酶)(EC 2.3.1.20)。该酶负责将酰基-CoA和1，2-二酰基甘油转化成TAG和CoA，因此它涉及TAG生物合成的最终步骤。存在两个DAG AT酶家族：DGAT1和DGAT2。前一个家族与酰基-CoA:胆固醇酰基转移酶[“ACAT”]基因家族具有同源性，而后一个家族与之不相关(Lardizabal等人，J.Biol.Chem.，276(42)：38862-38869(2001))。
术语“YlDGAT2”指DGAT2酶(SEQ ID NO：94)，该酶分离自解脂耶氏酵母，由SEQ ID NO：93编码。YlDGAT2是5，描述于美国专利公开7,267,976中。已经测定了YlDGAT2蛋白的长度是514氨基酸残基(对应于SEQ ID NO：93的核苷酸+291至+1835)，并且因此在SEQ IDNO：93内的两种附加巢式ORF仅编码完整蛋白的截短形式。
术语“二酰基甘油胆碱磷酸转移酶”是指酶(EC 2.7.8.2)，它催化从CDP-胆碱和1，2-二酰基甘油合成磷脂酰胆碱。这种酶是CDP-胆碱途径的组成部分，负责磷脂酰胆碱[“PC”]生物合成。
术语“YlCPT1”是指二酰基甘油胆碱磷酸转移酶(SEQ ID NO：69)，该酶分离自解脂耶氏酵母，由SEQ ID NO：68编码。YlCPT1描述于PCT公开WO 2006/052870中(也参见GenBank保藏号XM_501703(YALI0C10989g))。
术语“过氧化物酶体”是指普遍存在于所有真核细胞中的细胞器。它们具有单独的脂双层膜，该膜将它们的内容物与细胞溶质分离开来，并且包含下文所述功能必需的多种膜蛋白。过氧化物酶体经由“扩展的穿梭机制”选择性输入蛋白。更具体地讲，存在着至少32个已知的过氧化物酶体蛋白(称为peroxin)，它们参与通过ATP水解穿过过氧化物酶体膜输入蛋白的过程。一些过氧化物酶体蛋白在其N-末端或C-末端包含特异蛋白信号，即，过氧化物酶体靶信号或“PTS”，它们引导蛋白通过过氧化物酶体膜。一旦细胞蛋白进入过氧化物酶体，它们通常经过一些方法降解。例如，过氧化物酶体包含氧化酶，例如过氧化氢酶、D-氨基酸氧化酶和尿酸氧化酶，这些酶能够降解对细胞有毒的物质。作为另外一种选择，过氧化物酶体降解脂肪酸分子以生成乙酰-CoA游离分子，它们被回输到细胞溶质中，该过程称为β-氧化。
术语“过氧化物酶体生物合成因子蛋白”、“过氧化物酶体蛋白”和“Pex蛋白”是可互换的，并且指涉及过氧化物酶体生物合成的和/或参与通过ATP水解使细胞蛋白穿过过氧化物酶体膜的过程的蛋白。编码这些蛋白的基因的首字母缩写是“Pex基因”。命名体系描述于Distel等人，J.Cell Biol.，135：1-3(1996)。迄今已经在多种真核生物中鉴定了至少32个不同的Pex基因。已经从对突变体的分析中分离了多种Pex基因，所述突变体显示具有异常的过氧化物酶体功能或结构。根据Kiel，J.A.K.W.等人的文献(Traffic，7：1291-1303(2006))，其中对17个不同真菌中的基因组序列进行了电脑模拟的信息学分析(silico analysis)，鉴定了以下Pex蛋白：Pex1p、Pex2p、Pex3p、Pex3Bp、Pex4p、Pex5p、Pex5Bp、Pex5Cp、Pex5/20p、Pex6p、Pex7p、Pex8p、Pex10p、Pex12p、Pex13p、Pex14p、Pex15p、Pex16p、Pex17p、Pex14/17p、Pex18p、Pex19p、Pex20p、Pex21p、Pex21Bp、Pex22p、Pex22p样和Pex26p。这些蛋白本文将统称为由“Pex基因”编码的“Pex蛋白”。
术语“保守结构域”或“基序”指进化上相关的蛋白质的比对序列中在特定位置保守的一组氨基酸。虽然同源蛋白质之间在其他位置的氨基酸可以发生变化，但在特定位置高度保守的氨基酸表明对蛋白质的结构、稳定性或活性来说是必需的氨基酸。因为它们可通过它们在蛋白质同系物家族的比对序列中的高度保守来鉴定，所以它们可用作识别标签或“签名”来确定具有新的测定序列的蛋白质是否属于以前鉴定的蛋白质家族。参考本文相关部分，存在于Δ5去饱和酶(即，动物、植物和真菌)中的基序在N末端包括三个组氨酸框(即，H(X)3-4H[SEQ ID NO：190和191]、H(X)2-3HH[SEQ 33 ID NO：192和193]和H/Q(X)2-3HH[SEQ ID NO：194和195])和一种血红素结合基序(即，His-Pro-Gly-Gly或HPGG；SEQ ID NO：182)，它们在融合细胞色素Jb5结构域内。同样地，Pex2p、Pex10p和Pex12p在它们的羧基末端都有一种富含半胱氨酸的基序，已知该基序是C3HC4环状锌指基序。该基序是它们的活性必需的，涉及蛋白停靠并转移到过氧化物酶体中(Kiel，J.A.K.W.，等人，Traffic，7：1291-1303(2006))。
术语“C3HC4环状锌指基序”或“C3HC4基序”一般指结合两个锌离子的保守半胱氨酸富含基序，它们通过如式I所示的氨基酸序列进行鉴定：
式I：CX2CX9-27CX1-3HX2CX2CX4-48CX2C
在解脂耶氏酵母编码过氧化物酶体生物合成因子10蛋白的基因中的C3HC4环状锌指基序(即YlPex10p)位于SEQ ID NO：104的氨基酸327-364之间，并且由CX2CX11CX1HX2CX2CX10CX2C基序(SEQ IDNO：119)限定。在解脂耶氏酵母编码过氧化物酶体生物合成因子2蛋白的基因中的C3HC4环状锌指基序(即YlPex2p)，位于SEQ ID NO：96的氨基酸266-323之间。解脂耶氏酵母过氧化物酶体生物合成因子12蛋白(即YlPex12p)包含位于SEQ ID NO：105的氨基酸342-391之间的不完全C3HC4环指基序。图2A列出了对应于YlPex10、YlPex2和YlPex12的C3HC4环状锌指基序的蛋白序列；星号表示基序的保守半胱氨酸或组氨酸残基。
认为YlPex10、YlPex2和YlPex12通过蛋白-蛋白相互作用形成环指复合物。本发明的YlPex10p C3HC4指状基序(具有两个锌残基)的胱氨酸和组氨酸残基间相互作用在图2B中用图表示出。
术语“Pex10”指编码过氧化物酶体生物合成因子10蛋白或过氧化物酶体装配蛋白Peroxin 10的基因，其中peroxin蛋白将在下文中称为“Pex10p”。Pex10p功能尚未被清楚的阐明，虽然对其它生物的研究已经揭示Pex10产物位于过氧化物酶体膜内并且是细胞器正常功能所必需的。C3HC4环状锌指基序在Pex10p的C-末端区域是保守的(Kalish，J.E.等人，Mol.CellBiol.，15：64065 6419(1995)；Tan，X.等人，J.CellBiol.，128：307-319(1995)；Warren，D.S.，等人，Am.J.Hum.Genet.，63：347-359(1998))，并且是酶活性所必需的。
术语“YlPex10”指编码解脂耶氏酵母过氧化物酶体生物合成因子10蛋白的基因，其中所述蛋白将在下文中称为“YlPex10p”。该特定的peroxin近来由Sumita等人(FEMS Microbiol.Lett.，214：31-38(2002))进行了研究。YlPex10的核苷酸序列在GenBank中注册了多个保藏号，包括GenBank保藏号CAG81606(SEQ ID NO：104)、AB036770(SEQID NO：114、115和116)以及AJ012084(SEQ ID NO：117和118)。如SEQ ID NO：118所示的YlPex10p的序列长度为354个氨基酸。相比之下，如SEQ ID NO：104和SEQ ID NO：116所示的YlPex10p序列每个长度为377个氨基酸，它们100％相同的序列在蛋白N-末端具有附加地23个氨基酸(对应于与GenBank保藏号AJ012084(SEQ ID NO：118)中鉴定的起始密码子不同的起始密码子)。
在天然Pex基因中的或与之相关的术语“中断”是指在一部分该基因中的插入、删除、或定向突变，所述中断导致基因敲除使得该基因从基因组中删除并且不翻译蛋白，或者导致翻译的Pex蛋白具有插入、删除、氨基酸取代或其它定向突变。蛋白中的中断位置可以是在例如蛋白的N-末端部分中或在蛋白的C-末端部分中。中断的Pex蛋白相对于未中断的Pex蛋白将具有减弱的活性，并且可能是无功能的。在编码Pex蛋白的天然基因中的中断也包括导致Pex蛋白低表达或少表达的替代方法，例如能够经由操纵调控序列、转录和翻译因子和/或信号转导途径或使用有义、反义或RNAi技术等方法导致中断。
术语“含油生物”指那些往往以油形式贮存它们的能源的生物(Weete，In：Fungal Lipid Biochemistry，第2版，Plenum，1980)。术语“含油酵母”指那些能制造油(即TAG)的、分类为酵母的微生物。通常，含油微生物的细胞油或TAG含量符合S形曲线，其中脂质浓度增加直至在晚对数培育生长期或早稳定培育生长期时它达到最高浓度，随后在晚稳定培育生长期和死亡期期间逐渐下降(Yongrmanitchai和Ward，Appl.Environ.Microbiol.，57：419-25(1991))。含油微生物积累油超过它们的干细胞重量的约25％的情形并不鲜见。含油酵母的实例包括但不限于如下属：耶氏酵母属、假丝酵母属、红酵母属、红冬孢酵母属、隐球酵母属、丝孢酵母属和油脂酵母属。
术语“可发酵碳源”指微生物将其代谢以获取能量的碳源。一般的碳源包括但不限于：单糖、低聚糖、多糖、烷烃、脂肪酸、脂肪酸酯、单酸甘油酯、甘油二酯、甘油三酸酯、二氧化碳、甲醇、甲醛、甲酸盐和含碳胺。
如本文所用，术语“分离的核酸片段”、“分离的核酸分子”和“基因构建体”将可以互换使用，并将指单链或双链的RNA或DNA聚合体，任选含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。DNA聚合物形式的分离的核酸片段可由cDNA、基因组DNA或合成DNA的一个或多个片段构成。
氨基酸或核苷酸序列的“基本部分”指这样的部分，该部分包括的多肽的氨基酸序列或基因的核苷酸序列足以通过推定而鉴定所述多肽或基因，所述鉴定或者可以由本领域技术人员通过人工评价序列来完成，或者可以利用诸如BLAST(Basic Local Alignment Search Tool；Altschul，S.F.等人，J.Mol.Biol.，215：403-410(1993))。一般来讲，为了推测鉴定多肽或核酸序列是否与已知的蛋白质或基因同源，需要有10个或更多邻接氨基酸或者30个或更多核苷酸的序列。此外，对于核苷酸序列，包含20-30个邻接核苷酸的基因特异性寡核苷酸探针可用于序列依赖性的基因鉴定(如DNA杂交)和基因分离(如细菌菌落或噬斑的原位杂交)的方法中。此外，12至15个碱基的短寡核苷酸可在PCR中用作扩增引物，以便获得包含该引物的特定核酸片段。因此，核苷酸序列的“基本部分”包含的序列足以特异性地鉴定和/或分离包含该序列的核酸片段。
术语“互补的”用于描述核苷酸碱基之间能够彼此杂交的关系。例如，对于DNA，腺嘌呤与胸腺嘧啶互补，而胞嘧啶与鸟嘌呤互补。
“密码子简并性”指允许核苷酸序列在不影响所编码的多肽的氨基酸序列的情况下发生变化的遗传密码的性质。技术人员非常了解具体宿主细胞在使用核苷酸密码子以确定给定氨基酸时所表现出的“密码子偏倚性”。因此，当合成基因用以改善在宿主细胞中的表达时，希望对基因进行设计，使得其密码子使用频率接近该宿主细胞优选的密码子使用频率。
“合成的基因”可由使用本领域技术人员已知的方法化学合成的寡核苷酸构件装配而成。将这些寡核苷酸基本单位进行退火并随后连接以形成基因节段，该基因节段随后在酶促作用下装配而构建成完整的基因。因此，基于最优化核苷酸序列以反映宿主细胞的密码子偏倚性，可以定制基因用以最优化基因表达。如果密码子使用偏向于宿主偏好的那些密码子，则技术人员会理解成功的基因表达的可能性。优选的密码子的确定可基于对来源于宿主细胞的基因(其中序列信息可获得)的检测。例如在美国专利公开7,125,672中提供了解脂耶氏酵母的密码子使用特制。
“基因”指表达特定蛋白质的核酸片段，并且该核酸片段可以指单独的编码区或可以包含位于编码序列之前的调节序列(5′非编码区)和之后的调节序列(3′非编码区)。“天然基因”是指天然存在的具有其自己的调控序列的基因。“嵌合基因”指不是天然基因的任何基因，包含在天然情况下不是一起存在的调控序列和编码序列。因此，嵌合基因可包括源于不同来源的调控序列和编码序列，或者包括源于同一来源但以不同于天然存在的方式排列的调控序列和编码序列。“内源性基因”指位于生物的基因组内它的天然位置的天然基因。“外来”基因指通过基因转移导入到宿主生物内的基因。外来基因可包括插入到非天然生物内的天然基因、导入到天然宿主内的新位置的天然基因，或嵌合基因。“转基因”是已通过转化方法导入基因组内的基因。“经密码子最优化的基因”是其密码子使用频率经设计用以模仿宿主细胞优选的密码子使用频率的基因。
“编码序列”指编码特定氨基酸序列的DNA序列。“合适的调控序列”指位于编码序列的上游(5′非编码序列)、中间或下游(3′非编码序列)的核苷酸序列，其可影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或者翻译。调控序列可包括启动子、增强子、静默子、5’不翻译前导序列(例如在转录起始位点和翻译启动密码子之间的序列)、内含子、多腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎-环结构。
“启动子”指能够控制编码序列或功能性RNA表达的DNA序列。一般来讲，编码序列位于启动子序列的3′端。启动子可整个源于天然基因，或者由源于不同的天然存在的启动子的不同元件组成，或者甚至包含合成的DNA片段。本领域内的技术人员应当理解，不同的启动子可在不同的组织或细胞类型中，或者在不同的发育阶段，或者响应不同的环境条件或生理条件而引导基因的表达。通常将在大多数细胞类型中、在大多数情况下引起基因表达的启动子称为“组成型启动子”。还应认识到，因为在大多数情况下还不能完全确定调控序列的确切范围，不同长度的DNA片段可能具有相同的启动子活性。
术语“GPD启动子”或“GPD启动子区”指位于由gpd基因编码的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(E.C.1.2.1.12)的′ATG′翻译起始密码子之前的5′上游未翻译区，它是表达必需的。合适的解脂耶氏酵母GPD启动子区实例描述于美国专利公开7,259,255中。
术语“GPDIN启动子”或“GPDIN启动子区”指位于gpd基因的′ATG′翻译起始密码子之前的5′上游未翻译区(它是表达必需的)，加上具有gpd基因的内含子的一部分5′编码区。合适的解脂耶氏酵母GPDIN启动子区实例描述于专利公布US 2006/0019297-A1中。
术语“GPM启动子”或“GPM启动子区”指位于由gpm基因编码的磷酸甘油酸变位酶(EC 5.4.2.1)的′ATG′翻译起始密码子之前的5′上游未翻译区，它是表达必需的。合适的解脂耶氏酵母GPM启动子区实例描述于美国专利公开7,259,255中。
术语“GPM/FBAIN启动子”或“GPM/FBAIN启动子区”指一种嵌合启动子，该启动子包含“GPM启动子”和FBAIN启动子(下文)中包含的内含子的融合。合适的解脂耶氏酵母GPM/FBAIN启动子区实例描述于美国专利公开7,202,356中。
术语“FBA启动子”或“FBA启动子区”指位于由fbal基因编码的果糖二磷酸醛缩酶(E.C.4.1.2.13)的′ATG′翻译起始密码子之前的5′上游未翻译区，它是表达必需的。合适的解脂耶氏酵母FBA启动子区实例描述于美国专利公开7,202,356中。术语“FBAIN启动子”或“FBAIN启动子区”指位于fbal基因的′ATG′翻译起始密码子之前的5′上游未翻译区(它是表达必需的)，加上具有gpd基因的内含子的一部分5′编码区。合适的解脂耶氏酵母FBAIN启动子区实例描述于美国专利公开7,202,356中。
术语“FBAINm启动子”或“FBAINm启动子区”指FBAIN启动子的修饰版本，其中FBAINm具有在ATG翻译启动密码子和FBAIN启动子的内含子之间的52bp删除(因此仅包括N末端的22个氨基酸)，以及在内含子后的新翻译共有基序。此外，虽然FBAIN启动子当与表达基因的编码区融合时生成融合蛋白，FBAINm启动子不生成此类融合蛋白。合适的解脂耶氏酵母FBAINm启动子区实例描述于美国专利公开7,202,356中。
术语“GPAT启动子”或“GPAT启动子区”指位于由gpat基因编码的甘油3-磷酸O-酰基转移酶(E.C.2.3.1.15)的′ATG′翻译起始密码子之前的5′上游未翻译区，它是表达必需的。合适的解脂耶氏酵母GPAT启动子区实例描述于美国专利公开7,264,949中。
术语“YAT1启动子”或“YAT1启动子区”指位于由yat1基因编码的铵转运酶(TC 2.A.49；GenBank保藏号XM_504457)的′ATG′翻译起始密码子之前的55′上游未翻译区，它是表达必需的。合适的解脂耶氏酵母YAT1启动子区实例描述于专利公布US 2006/009410210 A1中。
术语“EXP1启动子”或“EXP1启动子区”指位于由解脂耶氏酵母TALI0C12034g”基因(GenBank保藏号XM_501745)编码蛋白的、在′ATG′翻译起始密码子之前的5′上游未翻译区，它是表达所必需的。基于TALI0C12034g”与sp|Q12207啤酒糖酵母非经典输出蛋白2(其功能涉及缺乏断裂信号序列的新蛋白输出途径)的显著同源性，本文将该基因命名为exp1基因，它编码命名为EXP1的蛋白。合适的解脂耶氏酵母EXP1启动子区的实例描述于PCT公开WO 2006/052870中。
“内含子”是存在于大多数真核细胞中的基因序列中的非编码DNA序列(位于编码区、5′非编码区、或3′非编码区)。它们的完整功能是未知的；然而，一些增强子位于内含子中(Giacopelli F.等人，Gene Expr.，11：95-104(2003))。这些内含子序列被转录，但是在mRNA被翻译成蛋白之前被从mRNA转录物前体中移除。该内含子移除过程通过序列(即，外显子)的自主拼接在内含子两端进行。
术语“增强子”指能从邻近的真核启动子处提高转录水平并因此提高基因转录水平的-顺式-调控序列。增强子能在长度为几万碱基的DNA上作用于启动子，并且可以是它们调节的启动子的5′或3′。增强子也可位于内含子内。
术语“3′非编码序列”和“转录终止子”指位于编码序列下游的DNA序列。这包括多腺苷酸化识别序列和编码能影响mRNA加工或基因表达的调节信号的其它序列。多腺苷酸化信号通常表征为影响多腺苷酸片添加到mRNA前体的3′末端。3′区可影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或翻译。
“RNA转录物”指由RNA聚合酶催化的DNA序列的转录所产生的产物。当RNA转录物是DNA序列的完全互补的拷贝时，它被称为初级转录物，或者它可以是源自初级转录物的转录后加工的RNA序列并被称作成熟RNA。“信使RNA”或“mRNA”指无内含子并且可以由细胞翻译成蛋白质的RNA。“cDNA”指与mRNA互补并源于mRNA的双链DNA。“有义”RNA指包含mRNA并因而能由细胞翻译成蛋白质的RNA转录物。“反义RNA”指与全部或部分靶初级转录物或mRNA互补，并阻止靶基因表达的RNA(美国专利5,107,065；PCT公开WO 99/28508)。反义RNA可以与特定基因转录物的任何部分，即5′非编码序列、3′非编码序列或编码序列互补。“功能性RNA”指反义RNA、核酶RNA或其它不能翻译可是对细胞过程有影响作用的RNA。
术语“可操作地连接”是指单个核酸片段上的核酸序列的关联，使得其中一种核酸序列的功能受到另一种核酸序列的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达时，它可操作地连接编码序列。即，编码序列处于启动子的转录控制下。编码序列可以以有义或反义的取向可操作地连接至调节序列。
如本文所用，术语“表达”是指转录和有义(mRNA)或反义RNA的稳定积聚。表达也可指将mRNA翻译成多肽。
“成熟”蛋白质指经翻译后加工的多肽(即已经去除了存在于初始翻译产物中的任何前肽或肽原的多肽)。“前体”蛋白质是指mRNA的初级翻译产物，即前肽和肽原仍然存在。前肽和肽原可以是(但不限于)细胞内定位信号。
术语“重组酶”是指进行位点特异性重组以改变DNA结构的酶，它包括转座酶、γ整合/剪切酶、以及位点特异性重组酶。
“重组酶位点”或“位点特异性重组酶序列”是指重组酶将识别并与之结合的DNA序列。应当理解，这可以是野生型或突变型重组酶位点，只要保持有官能团，重组酶仍可识别该位点、结合到DNA序列上并且催化两个邻近重组酶位点之间发生重组。
“转化”是指将核酸分子转移至宿主生物中，导致在遗传上稳定遗传。例如，核酸分子可以是自主复制的质粒，例如，或者它可以整合进宿主生物的基因组中。含有转化核酸片段的宿主生物被称为“转基因”或“重组”或“转化”生物体。
术语“质粒”和“载体”是指通常携带有不属于细胞中心代谢的部分的基因的染色体外元件，并且常常是环状双链DNA片段的形式。这类元件可以是源自任何来源的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或单链或双链DNA或RNA的核苷酸序列(线性或环状)，其中多个核苷酸序列已连接或重组为一种独特构建体，该独特构建体能够将表达盒引入细胞中。
术语“表达盒”是指包含如下序列的DNA片段：所选基因的编码序列和所选基因产物表达所需的位于编码序列之前(5′非编码序列)和之后(3′非编码序列)的调控序列。因此，表达盒通常由如下序列构成：1)一种启动子序列；2)一种编码序列(即，ORF)和3)一种3′不翻译区域(即，终止子)，它在真核细胞中通常包含聚腺苷酸位点。表达盒通常包含于载体中以有利于克隆和转化。可以将不同表达盒转化进包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞在内的不同生物体中，只要能针对每种宿主使用正确的调控序列。
术语“同源重组”是指两个DNA分子之间的DNA片段交换(在杂交期间)。被交换的片段通过在两个DNA分子之间的相同核苷酸序列位点(即，“同源区”)侧接。术语“同源区”是指在参与同源重组的、彼此具有同源性的核酸片段上的核苷酸序列区。有效的同源重组将一般发生在这些同源区长度为至少约10bp的地方，优选地发生在同源区长度为至少约50bp的地方。意欲进行重组的片段通常包含至少两个同源区，其中期望具有定向基因分裂或置换。
术语“序列分析软件”是指可用于分析核苷酸或氨基酸序列的任何计算机算法或软件程序。“序列分析软件”可商购获得或独立开发。典型的序列分析软件包括但不限于：1)GCG程序包(Wisconsin PackageVersion 9.0，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，WI)；2)BLASTP、BLASTN、BLASTX(Altschul等人，J.Mol.Biol.，215：403-410(1990))；3)DNASTAR(DNASTAR，Inc.Madison，WI)；4)Sequencher(Gene Codes Corporation，Ann Arbor，MI)；和5)整合了Smith-Waterman算法的FASTA程序(W.R.Pearson，Comput.MethodsGenome Res.，[Proc.Int.Symp.](1994)，Meeting Date 1992，111-20.编辑：Suhai，Sandor.Plenum：New York，NY)。在本专利申请案的上下文中应当理解，使用序列分析软件进行分析时，除非另外指明，否则分析结果将基于所参考程序的“默认值”。在此所用的“默认值”是指在首次初始化软件时软件最初加载的任何值或参数集。
本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域熟知的并且已经在如下文献中有过描述：Sambrook，J.，Fritsch，E.和Maniatis，T.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring HarborLaboratory：Cold Spring Harbor，NY(1989)(下文称为“Maniatis”)；Silhavy、T.J.、Bennan，M.L.和Enquist，L.W.，Experiments with GeneFusions，Cold Spring Harbor Laboratory：Cold Spring Harbor，NY(1984)；以及Ausubel，F.M.等人，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Assoc.and Wiley-Interscience，Hoboken，NJ(1987).AnOverview：Microbial Biosynthesis Of Fatty Acids and Triacylglycerols
通常，含油微生物的脂质蓄积是响应存在于生长培养基中的总的碳氮比而触发。该过程(导致含油微生物中游离棕榈酸(16:0)的从头合成)在美国专利7,238,482中有详细描述。棕榈酸是长链饱和的和不饱和脂肪酸衍生物的前体，这些脂肪酸衍生物通过延伸酶和去饱和酶的作用形成(图1A和图1B)。
TAG(脂肪酸的主要贮存单位)通过涉及如下反应的一系列反应形成：1)一分子的酰基辅酶A和甘油-3-磷酸通过酰基转移酶酯化而生成溶血磷脂酸；2)第二分子的酰基辅酶A通过酰基转移酶酯化而生成1，2-二酰基甘油磷酸(通常称为磷脂酸)；3)通过磷脂酸磷酸酶移除磷酸以生成1，2-二酰基甘油[“DAG”]；和4)通过酰基转移酶加入第三脂肪酸以形成5TAG。
广谱的脂肪酸可被整合进TAG中，包括饱和的和不饱和的脂肪酸以及短链和长链的脂肪酸。一些能通过酰基转移酶被掺入TAG的脂肪酸非限制性实例包括：癸酸(10:0)、月桂酸(12:0)、肉豆蔻酸(14:0)、棕榈酸(16:0)、棕榈油酸(16:1)、硬脂酸(18:0)、油酸(18:1)、异油酸(18:1)、LA、桐油酸(18:3)、ALA、GLA、花生酸(20:0)、EDA、ETrA、DGLA、ETA、ARA、EPA、二十二烷酸(22:0)、DPA、DHA、木蜡酸(24:0)、神经酸(24:1)、蜡酸(26:0)和褐煤酸(28:0)脂肪酸。在本文所述的方法和宿主细胞中，最期望将EPA掺入TAG中。
虽然大多数PUFA以中性脂类的形式掺入TAG并贮存于脂质体中，但是重要的是认识到在含油生物中测量总PUFA应包括那些位于磷脂酰胆碱级分、磷脂酰乙醇胺级分、和三酰基甘油(也称为TAG或油)级分中的PUFA。
最优化生物合成EPA-一种ω-3脂肪酸
其中油酸转化成EPA的代谢过程涉及通过添加碳原子使碳链延长和通过加入双键使分子去饱和。这需要存在于内质网膜内的一系列特殊去饱和酶和延伸酶。然而，如在图1A和图1B中看到的和如下所述的，存在多个用于EPA生产的替代途径。
具体地讲，图1A和图1B描述了下文所述的途径。所有途径都需要最初通过Δ12去饱和酶将油酸转化成亚油酸[“LA”](第一种ω-6脂肪酸)。然后，利用“Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径”并将LA用作底物来如下形成长链ω-6脂肪酸：1)通过Δ9延伸酶将LA转化成二十碳二烯酸[“EDA”]；2)通过Δ8去饱和酶将EDA转化成二高-y-亚麻酸[“DGLA”]；3)通过Δ5去饱和酶将DGLA转化成花生四烯酸[“ARA”]；4)通过C20/22延伸酶将ARA转化成二十二碳四烯酸[“DTA”]；以及，5)通过Δ4去饱和酶将DTA转化成二十二碳五烯酸[“DPAn-6”]。
“Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径”也能够如下使用α-亚麻酸[“ALA”]作底物生产长链ω-3脂肪酸：1)通过Δ15去饱和酶将LA转化成ALA，第一种ω-3脂肪酸；2)通过Δ9延伸酶将ALA转化成二十碳三烯酸[“ETrA”]；3)通过Δ8去饱和酶将ETrA转化成二十碳四烯酸[“ETA”]；4)通过Δ5去饱和酶将ETA转化成二十碳五烯酸[“EPA”]；5)通过C20/22延伸酶将EPA转化成二十二碳五烯酸[“DPA”]；以及，6)通过Δ4去饱和酶将DPA转化成二十二碳六烯酸[“DHA”]。任选地，可以将ω-6脂肪酸转化成ω-3脂肪酸。例如，ETA和EPA通过Δ17去饱和酶活性分别从DGLA和ARA生成。就本文目的而言，有利地是Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径能够生产缺少显著量y-亚麻酸[“GLA”]的EPA油。
用于ω-3/ω-6脂肪酸生物合成的替代途径利用Δ6去饱和酶和C18/20延伸酶，即“Δ6去饱和酶/Δ6延伸酶途径”。更具体地讲，LA和ALA可通过Δ6去饱和酶被分别转化成GLA和十八碳四烯酸[“STA”]；然后，C18/20延伸酶将GLA转化成DGLA和/或将STA转化成ETA。
用于EPA生产的优选微生物宿主：解脂耶氏酵母
预期需要导入解脂耶氏酵母以生产EPA的特定官能团将取决于宿主生物、它的天然PFUA概况和/或去饱和酶/延伸酶概况、底物的可利用性和期望的终产物。相对于天然宿主细胞，已知解脂耶氏酵母能天然生产18:2脂肪酸并因此具有天然的Δ12去饱和酶(SEQ ID NO：1和2；参见美国专利公开7,214,491)。
如PCT公开WO 2006/052870所述，制备能够生产高浓度EPA并且不同合成GLA的重组解脂耶氏酵母菌株最少需要表达以下基因：Δ9延伸酶、Δ8去饱和酶、Δ5去饱和酶和Δ17去饱和酶或Δ15去饱和酶(或两种都有)，其中可任选地附加表达至少一种以下基因：Δ9去饱和酶、Δ12去饱和酶、C14/16延伸酶和C16/18延伸酶。该处提供的选择具有去饱和酶或延伸酶活性的特定多肽时的考虑事项包括：1)多肽的底物特异性；2)多肽或其组分是否为限速酶；3)去饱和酶或延伸酶是否是合成所需PUFA所必需的；4)多肽所需的辅因子；5)多肽在其产生后是否被修饰，例如，通过激酶或异戊烯转移酶修饰；和/或，6)每种特定去饱和酶和/或延伸酶的转化效率。
在本专利申请中，其中制备了重组解脂耶氏酵母的最优化菌株，该菌株具有生产例如在总脂质级分中的14％至大于53.2％的EPA的能力，它最少包含ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径的以下基因：
a)至少一种编码Δ9延伸酶的基因；和
b)至少一种编码Δ8去饱和酶的基因；和
c)至少一种编码Δ5去饱和酶的基因；和
d)至少一种编码Δ17去饱和酶的基因；和
e)至少一种编码Δ12去饱和酶的基因；和
f)至少一种编码C16/18延伸酶的基因。
更优选地，重组解脂耶氏酵母菌株还包含至少一种编码二酰基甘油胆碱磷酸转移酶(CPT1)的基因。最优选地，重组解脂耶氏酵母菌株还包含至少一种编码Δ15去饱和酶的基因；和/或至少一种编码Δ9去饱和酶的基因。在能够生产高水平EPA的解脂耶氏酵母最优化菌株中所需元件的附加方面在下文中进行了详细阐述，其中最优化菌株将生产占重组解脂耶氏酵母宿主细胞总脂质至少约25％的EPA，优选地占总脂质至少约30％的EPA，更优选地占总脂质至少约35％的EPA，更优选地占总脂质至少约40％的EPA，更优选地占总脂质至少约40-45％的EPA，更优选地占总脂质至少约45-50％的EPA，更优选地占总脂质至少约50-60％，并且最优选地占总脂质至少约60-70％的EPA。
在另一个实施方案中，本文所述的最优化重组解脂耶氏酵母菌株将生产包含占总脂质至少约25％的EPA的微生物油，并且该微生物油包含占总脂质小于约1％的GLA以及不含任何DHA。
在另一个实施方案中，本文所述的最优化重组解脂耶氏酵母菌株将生产包含占总脂质至少约30％的EPA的微生物油，并且该微生物油包含占总脂质小于约25％的LA。
在一个优选的实施方案中，本文所述的最优化重组解脂耶氏酵母菌株将生产相对于干细胞重量至少约12％的微生物油。
在另一个优选的实施方案中，本文所述的最优化重组解脂耶氏酵母菌株将生产按总脂肪酸百分比计至少约50％的ω-3PUFA。
用于最优化的EPA生物合成的优选去饱和酶和延伸酶基因
申请人已经对多种Δ9延伸酶、Δ8去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ17去饱和酶、Δ12去饱和酶和C16/18延伸酶进行了相当多的分析，以测定那些酶当在解脂耶氏酵母中表达时是否具有最佳的底物特异性和/或底物选择性。基于这些分析，由此得到的基因和密码子优化的基因描述于表4，本文认为它们优选在解脂耶氏酵母中表达以构建ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径，该途径能够进行高水平的EPA生物合成。在下文中详细阐述了涉及每个基因的附加细节。
如下文图4所示，所述的多个优选EPA生物合成基因的密码子已经经过优化以在解脂耶氏酵母中表达，如美国专利公开7,125,672中所述。这是本领域技术人员熟知的：能通过在选定宿主微生物中用那些用于最佳基因表达的密码子置换天然基因中的密码子来提高编码mRNA的翻译效率，从而增加异源基因的表达。此外，为了包括有效的酵母翻译启动序列并获取最佳的基因表达，围绕经密码子优化的合成基因的翻译起始密码子′ATG′的核苷酸序列被频繁改变以包括以下在′ATG′启动密码子周围的共有序列：′MAMMATGNHS′(SEQ ID NO：3)，其中该核酸简并密码如下使用：M＝A/C；S＝C/G；H＝A/C/T；和N＝A/C/G/T。
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至少一种编码Δ9延伸酶的基因，该酶将LA转化成EDA和/或将ALA转化成ETrA：在专利公布US 2007-0117190 A1和PCT公开WO2007/061742中来自小眼虫的Δ9延伸酶被分离并定性。在那些文献中将其命名为EgD9e，其编码区长777bp(SEQ ID NO：4)并编码258个氨基酸的蛋白(SEQ ID NO：5)。如引用的公布所述，EgD9e的Δ9延伸酶活性与来自绿光等鞭金藻(Isochrysis galbana)的合成Δ9延伸酶基因[“IgD9eS”](IgD9e；NCBI保藏号AAL37626[GI 17226123]，locusAAL37626，CDS AF390174；GenBank保藏号AF390174)(CDS＝核苷酸2-793))进行比较并且其密码子经优化以在解脂耶氏酵母中表达。EgD9e当将LA转化成EDA时具有比IgD9eS更大的底物转化效率(10.0％对6.9％)。
EgD9e的密码子最优化导致产生EgD9eS(SEQ ID NO：6)。除了修饰翻译起始位点之外，还修饰了777bp的编码区的117bp(15.1％)并最优化了106个密码子(然而由密码子优化的基因[即，SEQ ID NO：7]编码的蛋白序列与野生型蛋白序列[即，SEQ ID NO：5]相同)。当在解脂耶氏酵母中表达时，EgD9eS与野生型EgD9e相比其将LA延伸成EDA的效率要高约16.2％。
小型绿藻属CCMP389 Δ9延伸酶的分离和表征也在专利公布US2007-0117190 A1和PCT公开WO 2007/061742中进行了描述。E389D9e编码区长792bp(SEQ ID8 NO：4)并编码263个氨基酸的蛋白(SEQ IDNO：9)。E389D9e和EgD9e蛋白序列具有65.1％的同一性，这使用Clustal V分析方法(Higgins、D.G.和Sharp，P.M.，Comput..Appl.Biosci.，5：151-153(1989)；Higgins等人，Comput..Appl.Biosci.，8：189-191(1992))通过LASERGENETM计算生物信息学程序包(DNASTARTMInc.，Madison，WI)的MegAlignTM v6.1程序完成，该程序使用双序列比对的预设参数(KTUPLE＝1，GAP PENALTY＝3，WINDOW＝5，DIAGONALS SAVED＝5，GAP LENGTH PENALTY＝10)。当在解脂耶氏酵母中表达时，E389D9e将约11％的LA转化成EDA。
E389D9e的密码子优化导致792bp编码区的128bp修饰(16.2％)并优化了113个密码子。这将E389D9e(SEQ ID NO：10)内的GC含量从45.7％提高到50.1％。由经密码子最优化的基因编码的蛋白质序列(即SEQ ID NO：11)与野生型蛋白质序列(即SEQ ID NO：9)相同。当在解脂耶氏酵母中表达时，E389D9eS将约12％的LA延伸成EDA。
最近在美国专利公开申请12/102879中描述了Euglena anabaenaUTEX 373 Δ9延伸酶(EaD9e)的分离和表征(在该专利申请中将其命名为EaD9Elo1)。EaD9e编码区长774bp(SEQ ID8 NO：12)并编码258个氨基酸的蛋白(SEQ ID NO：13)。依照Clustal V分析方法(同上)，使用LASERGENE计算生物信息学程序包(DNASTAR Inc.)的MegAlignTM v6.1程序，用预设参数进行成对比对(同上)，结果EaD9e与IgD9e具有32.9％的序列同一性并与EgD9e具有77.1％的序列同一性。当在解脂耶氏酵母中表达EaD9e时，基于以下公式报道了22.7％的Δ9延伸：([EDA]/[LA+EDA])*100。随后在申请人的实验室中，EaD9e在解脂耶氏酵母中的替代克隆载体中的表达导致12％的Δ9延伸。
在合成EaD9eS(SEQ ID NO：14)期间除了修饰翻译起始位点之外，还修饰了774bp EaD9e编码区的106bp(13.7％)并最优化了98个密码子(38.0％)。由经密码子最优化的基因编码的蛋白质序列(即SEQ IDNO：15)与野生型蛋白质序列(即SEQ ID NO：13)相同。当在解脂耶氏酵母中表达时，EaD9eS将约13％的LA延伸成EDA。
至少一种编码Δ8去饱和酶的基因，该酶将EDA转化成DGLA和/或将ETrA转化成ETA：分离自并来源于小眼虫的若干个Δ8去饱和酶是本文优选的。美国专利公开7,256,033公开了小眼虫Δ8去饱和酶，该酶能够将EDA和EtrA 5去饱和(在该文献中命名为“Eg5”)。虽然与Eg5的核苷酸序列和氨基酸序列100％相同并且功能上等同，本文将野生型小眼虫Δ8去饱和酶称为“EgD8”。EgD8编码区长1263bp(即，SEQ ID NO：18的核苷酸4-1269)并编码421个氨基酸的蛋白(SEQ IDNO：19)。
美国专利公开7,256,033也公开了来源于EgD8并经密码子优化以在解脂耶氏酵母中表达的合成Δ8去饱和酶(在该文献中命名为“D8SF”)。虽然与D8SF的核苷酸序列和氨基酸序列100％相同并且功能上等同，本文将密码子优化的小眼虫Δ8去饱和酶称为“EgD8S”(SEQ ID NO：20和21)。具体地讲，EgD8的1263bp编码区中有207bp(16.4％)被修饰，对应于192个密码子的密码子优化。此外，EgD8S另外有一种插入到野生型EgD8的氨基酸残基1和2之间的缬氨酸；因此，EgD8S的全长为422个氨基酸(SEQ ID NO：21)。EgD8S在解脂耶氏酵母中的表达证明其与EgD8相比能更有效地将EDA去饱和成DGLA。
尽管可以使用EgD8和EgD8S，本文鉴定为EgD8M(SEQ ID NO：22和23)的合成工程化突变型Δ8去饱和酶优先用于本文所述的耶氏酵母属工程化菌株。如专利公布US 2008-0138868 A1所详细阐述，EgD8M(本文鉴定为“EgD8S-23”)通过在EgD8S内制造多轮定向突变制备。筛选每个突变对所得突变型Δ8去饱和酶活性的效应以确保与EgD8S(SEQ ID NO：21)的Δ8去饱和酶活性功能等同。作为该工作的结果，突变型EgD8M(SEQ ID NO：23)相对于如SEQ ID NO：21所示的合成的密码子优化EgD8S序列包含以下24个氨基酸突变：4S突变成A、5K突变成S、12T突变成V、16T突变成K、17T突变成V、66P突变成Q、67S突变成A、108S突变成L、117G突变成A、118Y突变成F、120L突变成M、121M突变成L、125Q突变成H、126M突变成L、132V突变成L、133L突变成V、162L突变成V、163V突变成L、293L突变成M、407A突变成S、408V突变成Q、418A突变成G、419G突变成A和422L突变成Q。使用Vector NTI
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的AlignX程序(InvitrogenCorporation，Carlsbad，CA)的预设参数成对比对EgD8M和EgD8S蛋白序列，结果揭示在两种蛋白长度为422个氨基酸的序列之间有94.3％的序列同一性和97.9％的共有序列。
最近在美国专利公开申请12/099811中描述了Euglena anabaenaUTEX 373 Δ8去饱和酶(“EaD8”)的分离和表征(在该专利申请中将其命名为“EaD8Des3”)。EaD8编码区长1260bp(SEQ ID8NO：24)并编码420个氨基酸的蛋白(SEQ ID NO：25)。基于Clustal V分析方法(同上)，使用LASERGENE计算生物信息学程序包(DNASTAR Inc.)的MegAlignTM v6.1程序，用预设参数进行成对比对(同上)，结果EaD8与EgD8具有71.9％的序列同一性。当在解脂耶氏酵母中表达EaD8时，酶在用DGLA作底物时报道了平均52.3％的C20去饱和度，在用ETrA作底物时报道了平均45.5％的C20去饱和度。
随后确认EaD8的Δ8去饱和酶活性，基于EaD8的编码序列设计EaD8S(SEQ ID NO：26)。除了修饰翻译起始位点之外，还对1260bp编码区中的231bp进行了修饰(18.3％)并最优化了208个密码子(49.5％)。GC含量从EaD8中的56.8％减少到EaD8S中的54.8％。由密码子优化的基因(即，SEQ ID NO：27)编码的蛋白序列与野生型蛋白序列(即，SEQ ID NO：25)相同。
至少一种编码Δ5去饱和酶的基因，该酶将DGLA转化成ARA和/或将ETA转化成EPA：在PCT公开WO 2007/136671中分离并表征了来自小眼虫的Δ5去饱和酶(即，EgD5)。如SEQ ID NO：34所示的EgD5的1350bp编码区编码449个氨基酸的蛋白(SEQ ID NO：35)，它将DGLA转化成ARA，平均转化效率为约33％。
EgD5的Δ5去饱和酶活性与充分表征的高山被孢霉(Mortierellaalpina)Δ5去饱和酶(即，“MaD5”；美国专利公开6,075,183和PCT公开WO 2004/071467以及WO 2005/047479)当在解脂耶氏酵母中表示时进行比较。当用DGLA、EDA和ETA作底物时，EgD5在解脂耶氏酵母中的活性比MaD5高大约2.6-至2.9-倍，然而去饱和酶对ETrA的活性大约相同(活性通过EgD5对特定底物的％Δ5去饱和度除以MaD5对相同底物的％Δ5去饱和度进行计算)。EgD5和MaD5对DGLA(对EDA)的底物特异性在耶氏酵母属中大约相同，但是EgD5对ETA(对ETrA)比MaD5优先大约2.5-倍；底物特异性通过DGLA或ETA的％Δ5去饱和度分别除以EDA或ETrA的％Δ5去饱和度进行计算。EgD5对ω-6底物(即，EDA和DGLA)比对ω-3底物(即，ETrA和ETA)也分别具有优先度。尽管已有这些结果，当体内使用底物时可观察到一些EgD5活性的变化；因此可能需要进一步的实验。
EgD5的密码子最优化导致1350bp编码区中的196bp被修饰(14.5％)并最优化了总计449个密码子中的189个密码子(42％)。由经密码子最优化的EgD5S基因编码的蛋白质序列(即SEQ ID NO：37)与野生型蛋白质序列(即SEQ ID NO：35)相同。当在解脂耶氏酵母中表达时，鉴定为EgD5S(SEQ ID NO：36)的密码子优化的基因比野生型基因对DGLA去饱和成ARA的效率高36％。
多甲藻属CCMP626 Δ5去饱和酶(RD5)在PCT公开WO2007/136646中被分离和表征。RD5的1392bp编码序列如SEQ IDNO：38所示，而编码的蛋白是463个氨基酸(SEQ ID NO：39)。该Δ5去饱和酶在解脂耶氏酵母中将DGLA转化成ARA，转化效率为35％(平均值)。RD5也与高山被孢霉(Mortierella alpina)Δ5去饱和酶进行比较(MaD5；同上)。当用DGLA、EDA、ETrA和ETA作底物时，RD5在耶氏酵母属中比MaD5的活性高大约3.0-至9.7-倍。RD5与MaD5相比，对适宜的ω-6底物(即，DGLA对EDA)的底物特异性为大约0.4，对ω-3底物(即，ETA对ETrA)的底物特异性为大约0.6。RD5对ω-6底物(即，EDA和DGLA)比对ω-3底物(即，ETrA和ETA)分别具有大约1.4倍的优先度。关于EgD5，当体内使用底物时可观察到一些RD5活性的变化；因此可能需要进一步的实验。
RD5的密码子最优化除了修饰翻译起始位点外，还导致1392bp编码区中的247bp发生修饰(17.7％；)并且优化了229个密码子(49.4％)。GC含量从RD5中的49.3％提高到合成基因(即，RD5S)内的54.2％。分别将WcoI位点和WotI位点整合到RD5S(SEQ ID NO：40)的翻译起始密码子的周围和终止密码子之后。由经密码子最优化的基因编码的蛋白质序列(即SEQ ID NO：41)与野生型蛋白质序列(即SEQ IDNO：39)相同。RD5S将DGLA转化成ARA的效率比野生型RD5高约8.9％。
Euglena anabaena UTEX 373 Δ5去饱和酶(EaD5)在美国专利公开申请12/111237中进行了分离和表征(在该文献中称为EaD5Des1)。其编码区长1362bp(SEQ ID NO：42)并编码454个氨基酸的蛋白(SEQID NO：43)，依照Clustal V分析方法(同上)，使用LASERGENE计算生物信息学程序包(DNASTAR Inc.)的MegAlignTM v6.1程序，用预设参数成对比对EaD5和EgD5(同上)，结果它们具有77.1％的序列同一性。EaD5显示具有Δ5去饱和酶活性，其DGLA或ETA对EDA或ETrA分别具有3.5倍的优先度。此外，EaD5相对于ω-3底物优选ω-6底物。
随后确认EaD5的Δ5去饱和酶活性，基于EaD5的编码序列设计EaD5S(SEQ ID NO：44)。除了修饰翻译起始位点之外，还对1362bp编码区中的183bp进行了修饰(13.4％)并最优化了174个密码子(38.3％)。GC含量从野生型基因(即，EaD5)中的57.6％降低到EaD5S中的54.6％。Ncol位点和Notl位点分别被掺入翻译启动密码子周围和EaD5S(SEQ ID NO：44)的终止密码子之后。由经密码子最优化的基因编码的蛋白质序列(即SEQ ID NO：45)与野生型蛋白质序列(即SEQID NO：43)相同。
最近美国临时专利申请号61/098333(以引用方式并入本文)描述了突变型Δ5去饱和酶，当该酶在解脂耶氏酵母中异源表达时相对于它们的EgD5S、EaD5S和RD5S对应物具有改善的酶活性。尽管Δ5去饱和酶包含若干个保守序列(即，三个组氨酸框[SEQ ID NO：190-195]和细胞色素b5结构域)，选择血红素结合基序(即，His-Pro-Gly-Gly或HPGG；SEQ ID NO：182)作为用于突变研究的靶序列。结果证明在EgD5S、EaD5S或RD5S中的HPGG基序的脯氨酸残基和第二甘氨酸残基都不是Δ5去饱和酶功能必需的。然而更令人惊讶地是鉴定出若干个突变酶相对于非突变去饱和酶具有提高的Δ5去饱和酶活性。EgD5S-HXGG(SEQ ID NO：122)具有一种HGGG(SEQ ID NO：185)基序和与EgD5S相比104.6％的Δ5去饱和酶活性，或具有一种HHGG(SEQ ID NO：186)基序和与EgD5S相比103.6％的Δ5去饱和酶活性。EgD5S-HPGS(SEQ ID NO：124)包含一种HPGS(SEQ ID NO：187)基序，具有与EgD5S相比106.9％的Δ5去饱和酶活性。RD5S-HXGG(SEQ ID NO：126)具有一种HCGG(SEQ ID NO：188)基序和与RD5S相比138.6％的Δ5去饱和酶活性，或具有一种HWGG(SEQ IDNO：189)基序和与RD5S相比113.5％的Δ5去饱和酶活性(虽然RD5S-HXGG结果基于最初的分析结果并且不是定量分析)。并且EaD5S-HCGG(SEQ ID NO：125)包含一种HCGG(SEQ ID NO：188)基序，显示与EaD5S相比107.9％的Δ5去饱和酶活性。优选的突变型Δ5去饱和酶具有如SEQ ID NO：196(对应于如SEQ ID NO：122所示的氨基酸序列)、SEQ ID NO：197(对应于如SEQ ID NO：122所示的氨基酸序列)、SEQ ID NO：198(对应于如SEQ ID NO：124所示的氨基酸序列)、SEQ ID NO：199(对应于如SEQ ID NO：125所示的氨基酸序列)、SEQ ID NO：200(对应于如SEQ ID NO：126所示的氨基酸序列)和SEQID NO：201(对应于如SEQ ID NO：126所示的氨基酸序列)所示的核酸序列。
至少一种编码Δ17去饱和酶的基因，该酶将ARA转化成EPA和/或将DGLA转化成ETA：美国专利公开申请11/787772提供关于分离和表征栎树猝死病菌(Phytophthora ramorum)Δ17去饱和酶(“PrD17”)的细节。PrD17是361个氨基酸的酶(SEQ ID NO：47)，由如SEQ IDNO：46所示的1086bp ORF编码。PrD17进行最优化以在解脂耶氏酵母中表达；具体地讲，除了修饰翻译起始位点之外还修饰了168bp的编码区(15.5％)并且优化了160个密码子(44.2％)。GC含量从PrD17中的64.4％减少到合成基因(即PrD17S)中的54.5％。分别将NcoI位点和NotI位点整合到PrD17S(SEQ ID NO：48)的翻译起始密码子的周围和终止密码子之后。由经密码子最优化的基因编码的蛋白质序列(即SEQ ID NO：49)与野生型蛋白质序列(即SEQ ID NO：47)相同。
当在解脂耶氏酵母中表达PrD17S时，将ARA转化成EPA的平均比率是约49％。在美国专利公开申请11/779915中对PrD17S底物特异性的进一步分析也测定出PrD17S能利用EDA和DGLA作有效底物，导致每种底物有大于25％的转化效率。
在美国专利公开申请11/779915中分离并表征了来自瓜果腐霉菌(Pythium aphanidermatum)的Δ17去饱和酶。PaD17编码区长1080bp(SEQ ID8 NO：50)并编码359个氨基酸的蛋白(SEQ ID NO：51)。成对比对来自致病疫霉菌(Phytophthora infestans)(PiD17；GenBank保藏号CAJ30870；PCT公开WO 2005/083053)、大豆疫霉菌(Phytophthorasojae)(PsD17；PCT公开WO 2006/100241；PCT公开WO2007/123999)、栎树猝死病菌(Phytophthora ramorum)(PrD17；SEQ IDNO：47；同上)的Δ17去饱和酶蛋白和PaD 17，所述比对使用Clustal W分析(描述于Higgins和Sharp，CABlOS，5：151-153(1989)；Higgins，D.G.等人，Comput.Appl.Biosci.，8：189-191(1992))进行，它存在于LASERGENE计算生物信息学程序包(DNASTAR Inc.)的MegAlignTMv6.1程序中，使用预设参数，结果显示具有以下百分比相似性：PiD17和PaD17之间为74.5％；PrD17和PaD17之间为75.0％；而PsD17和PaD17之间为75.3％。
除了修饰翻译起始位点，PaD17的优化还导致对1080bp编码区中的188bp进行了修饰(包括终止密码子)(17.4％)并且优化了175个密码子(48.6％)。GC含量从PaD17中的61.8％降低到PaD17S(SEQID NO：52)中的54.5％。分别将Ncol位点和Ncol位点整合到PaD17S的翻译起始密码子的周围和终止密码子之后。由经密码子最优化的基因编码的蛋白质序列(即SEQ ID NO：53)与野生型蛋白质序列(即SEQID NO：51)相同。与野生型PaD17的18.4％至19.5％的转化效率范围相比，PaD17S的转化效率的范围是54.1％至55.6％。
PaD17S(SEQ ID NO：52)的底物特异性相对于PsD17S(合成Δ17去饱和酶，该酶来源于PsD17并且其密码子经优化以在解脂耶氏酵母中表达；美国专利公开申请11/787772)和PrD17S(SEQ ID NO：48)进行进一步评估。尽管所有三个Δ17去饱和酶都具有对ARA的最强优先度、对EDA和DGLA相对较低的活性、和对GLA最低的活性，发现PaD17S10具有对ARA最强的总体活性。此外，PaD17S对C18底物LA具有显著的Δ15去饱和酶活性，其中所述活性比得上Δ17去饱和酶对C20底物EDA和DGLA的活性。
至少一种编码Δ12去饱和酶的基因，该酶将油酸转化成LA：解脂耶氏酵母具有编码Δ12去饱和酶的天然基因(“YlD12”；SEQ ID NO：1和2)，该基因在美国专利公开7,214,491中被鉴定和表征。然而，如PCT公开WO 2005/047485和WO 2006/052870所述，串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)Δ12去饱和酶(“FmD12”；由SEQ ID NO：54和55编码)在解脂耶氏酵母中生产18:2时具有比YlD12更高的效率。更具体地讲，虽然两种Δ12去饱和酶都催化油酸转化成LA，但是两种酶的总体特异性不同(这从而影响每种酶的底物转化百分比)。FmD12具有比YlD12更高的将LA载入磷脂酰胆碱底物的sn-2位点的能力。当测定出在解脂耶氏酵母的翻译延伸因子EF1-a启动子(TEF；美国专利公开6,265,185)控制下表达FmD12比以前在TEF启动子控制下表达编码YlD12的嵌合基因(59％的LA产物积聚)生产更高水平的18:2(68％的LA产物积聚)时，这一点得到了证明。这分别对应于底物转化百分比的差异(按照([18:2+18:3]/[18:1+18:2+18:3])*100计算)：85％对74％。基于这些结果，作为一种工程化解脂耶氏酵母高EPA生产菌株的方法，表达真菌FmD12相对于表达天然YlD12是优选的。此外，超表达FmD12同时敲除YlD12可尤其有利于Δ9延伸产物LA。
FmD12优化导致1434bp编码区的182bp被修饰(12.7％)和172个密码子被优化(36％)，10从而产生如FmD12S(SEQ ID NO：56)所示的基因。由经密码子最优化的FmD12S基因编码的蛋白质序列(即SEQ ID NO：57)与野生型蛋白质序列(即SEQ ID NO：55)相同。
至少一种编码用于将棕榈酸转化成硬脂酸(18:0)的C16/18延伸酶的基因：虽然解脂耶氏酵母确实具有天然C16/18延伸酶(在PCT公开WO 2006/052870中称为“YE2”并被表征)，但是在本专利申请中优选的C16/18延伸酶是高山被孢霉(Mortierella alpina)C16/18延伸酶(ELO3)。ELO3(SEQ ID NO：59)是一种275个氨基酸的酶，由如SEQID NO：58所示的828bp ORF编码，在专利公布US 2007-0087420 A1和PCT公开WO 2007/046817中分离并表征该酶。如该文献所述，ELO3在解脂耶氏酵母中，在强天然启动子(即，FBAIN)的控制下超表达，从而产生一种转化体，该转化体生产比无ELO3的对照菌株多35％的C18脂肪酸(即，18:0、C18:1、C18:2和GLA)和少31％的C16脂肪酸。这些数据证明ELO3使用C16脂肪酸作底物以生产C18脂肪酸。
ELO3优化导致828bp编码区的114bp被修饰(13.8％)和111个密码子被优化(40.2％)，从而产生命名为ME3S(SEQ ID NO：60)的基因。由经密码子最优化的ME3S基因编码的蛋白质序列(即SEQ IDNO：61)与野生型蛋白质序列(即SEQ ID NO：59)相同。
至少一种编码Δ15去饱和酶的基因，该酶将LA转化成ALA和/或将GLA转化成STA：本文所述的串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)Δ15去饱和酶(FmD15)以SEQ ID NO：62和63表示，它们是用于提高ALA产量的优选Δ15去饱和酶。所述酶包含402个氨基酸，由1209bp的编码序列编码。
该特定Δ15去饱和酶与以前已知的Δ15去饱和酶(PCT公开WO2005/047480和WO 2006/052870)相比具有若干个独有特性。第一，FmD15以其显著的Δ12去饱和酶活性为特征(因此用双官能表征该酶)。以前的研究已经测定出用编码SEQ ID NO：62的嵌合基因转化的解脂耶氏酵母的Δ12去饱和酶中断菌株能够将24％的油酸转化成LA(按照([18:2+18:3]/[18:1+18:2+18:3])*100计算底物转化百分比)，此外能将96％的LA转化成ALA(按照[18:3]/[18:2+18:3]*100)计算底物转化百分比)。第二，相对于其它异源表达的Δ15去饱和酶，FmD15当在解脂耶氏酵母中表达时能以非常高的水平合成ALA[即，用编码SEQ ID NO：62的嵌合基因转化过的解脂耶氏酵母能显示具有占转化宿主细胞总脂肪酸31％的ALA产物积聚，这等同于83％的ALA转化效率(按照[18:3]/[18:2+18:3]*100)计算]。例如，当在非含油酵母酿酒酵母(Sacchromyces cerevisiae)中表达线虫Δ15去饱和酶时，％ALA产物积聚是仅仅4.1％(Meesapyodsuk等人，Biochem.，39：11948-11954(2000))，然而当在啤酒糖酵母中表达油菜Δ15去饱和酶时，％ALA产物积聚是仅仅1.3％(Reed.，D.W.等人，Plant Physiol.，122：715-720(2000))。最后，FmD15对18:2的下游ω-6衍生物具有相对广泛的底物特异性。具体地讲，Δ15去饱和酶能够催化GLA转化成STA、DGLA转化成ETA、以及ARA转化成EPA。
FmD15优化导致1209bp编码区的135bp被修饰(11.2％)和128个密码子被优化(31.8％)，如SEQ ID NO：64的FmD15S基因所示。由密码子最优化的基因编码的所得FmD15S蛋白序列(即SEQ ID NO：65)与野生型蛋白质序列(即SEQ ID NO：63)相同。
至少一种编码Δ9去饱和酶用于将棕榈酸转化成棕榈油酸(16:1)和/或将硬脂酸转化成油酸(18:1)的基因：将位于解脂耶氏酵母CLIB122(GenBank保藏号XM_501496)基因组序列中的位点标记YALI0C05951g鉴定为解脂耶氏酵母Δ9去饱和酶。YlD9是482个氨基酸的酶(SEQ ID NO：67)，由如SEQ ID NO：66所示的1449bp ORF编码。当YlD9在YAT1启动子的控制下在解脂耶氏酵母中过表达时，在转化子中的油与在用对照DNA片段转化过的宿主细胞中的油相比提高约6％。
虽然提供了编码PUFA生物合成途径酶的优选去饱和酶和延伸酶基因的序列(所述酶适于在解脂耶氏酵母中生产EPA)，但是这些基因并不意指受限。许多其它编码PUFA生物合成途径酶的基因将适于本文的目的，能从多种来源分离这些基因，例如分离自天然来源如细菌、藻类、真菌、植物、动物等，以及经由半合成途径或从头合成途径生成。此外，替代酶可以是野生型酶、密码子优化的酶、融合酶、合成酶和/或突变酶，它们具有合适的去饱和酶或延伸酶活性。这些替代酶的特征将在于能够：1)将LA延伸成EDA和/或将ALA延伸成ETrA(Δ9延伸酶)；2)催化EDA转化成DGLA和/或催化ETrA转化成ETA(Δ8去饱和酶)；3)催化DGLA转化成ARA和/或催化ETA转化成EPA(Δ5去饱和酶)；4)催化ARA转化成EPA和/或催化DGLA转化成ETA(Δ17去饱和酶)；5)催化油酸转化成LA(Δ12去饱和酶)；6)延伸C16底物以生产C18产物(C16/18延伸酶)；7)催化LA转化成ALA(Δ15去饱和酶)；和/或，8)催化棕榈酸转化成棕榈油酸和/或催化硬脂酸转化成油酸(Δ9去饱和酶)。
作为另外一种选择，能使用与表4所示的去饱和酶和延伸酶基本上相同的其它DNA在解脂耶氏酵母中生产EPA。“基本上相同”意指氨基酸序列或核酸序列以提高的优先度顺序表现出与选择的多肽或编码氨基酸序列的核酸序列至少80％，90％或95％的同源性。就多肽而言，比对序列的长度一般为至少16个氨基酸，优选地至少20个氨基酸或最优选地35个氨基酸。就核酸而言，比对序列的长度一般为至少50个核苷酸，优选地至少60个核苷酸，更优选地至少75个核苷酸，最优选地110个核苷酸。
同源性通常使用序列分析软件进行测量，其中术语“序列分析软件”指可用于分析核苷酸或氨基酸序列的任何计算机算法或软件程序。“序列分析软件”可商购获得或独立开发。典型的序列分析软件包括但不限于：1)GCG程序包(Wisconsin Package Version 9.0，GeneticsComputer Group(GCG)，Madison，WI)；2)BLASTP，BLASTN，BLASTX(Altschul等人，J.Mol.Biol.，215：403-410(1990))；3)DNASTAR(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)；和4)整合了Smith-Waterman算法的FASTA程序(W.R.Pearson，Comput.Methods Genome Res.，[Proc.Int.Symp.](1994)，Meeting Date 1992，111-20.Suhai，Sandor，编辑，Plenum：New York，NY)。在这一描述中，除非另外指明，只要序列分析软件用于分析，分析结果都基于所用程序的“默认值”。在此所用的“默认值”是指在首次初始化软件时软件最初加载的任何值或参数集。通常，这种计算机软件通过将同源程度赋予多种置换、缺失和其他修饰来匹配相似的序列。
其它DNA，虽然不与表4所示的优选去饱和酶和延伸酶基本上相同，但如果所述替代去饱和酶和延伸酶以与上述优选去饱和酶和延伸酶基本上相同的方式行使功能，也能被用于本文目的。
预期本领域的技术人员能制备具有双管能或三官能活性的嵌合融合蛋白。因此，能生产嵌合融合蛋白，它具有：延伸酶和去饱和酶活性(例如，如提交于2008年4月3日的美国专利公开申请12/061738所述的Δ9延伸酶Δ8去饱和酶融合基因)；双-或三-延伸酶活性(例如C16/18延伸酶Δ9延伸酶融合基因)；或双-或三-去饱和酶活性(例如Δ5去饱和酶Δ12去饱和酶融合基因)。例如，嵌合融合蛋白具有适于本文目的的Δ12去饱和酶和Δ5去饱和酶活性，它能通过将Δ12去饱和酶和Δ5去饱和酶用连接接头融合到一起而合成。Δ12去饱和酶或Δ5去饱和酶可能位于融合蛋白的N-末端部分。设计并合成合适接头分子的方法易于为本领域技术人员所知，例如连接子可能是丙氨酸或赖氨酸序列并且将不影响融合酶的活性。优选的去饱和酶和延伸酶基因能被融合到一起，它们将从表4所述的那些基因中选择，同上。
最后，用于合成序列并将序列连接到一起的方法是本领域所熟知的，并且在文献中进行了充分描述。因此，体外诱变和选择、定点诱变、化学诱变、“基因改组(gene shuffling)”法或其它手段可用于获得天然存在的去饱和酶和/或延伸酶基因的突变，例如那些在表4中描述的基因。这将5使得能分别在体内产生具有去饱和酶或延伸酶活性的多肽，该多肽在宿主细胞内具有更佳的物理参数和动力参数(例如更长的半衰期或更高的所需PUFA的产生速率)。
表达二酰基甘油胆碱磷酸转移酶用于最优化EPA生物合成
本文所述的最优化重组解脂耶氏酵母菌株具有生产例如占总脂质大于25％的EPA的能力，该菌株最少包含Δ9延伸酶、Δ8去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ17去饱和酶、Δ12去饱和酶和C16/18延伸酶。然而除了那些去饱和酶和延伸酶之外，优选的解脂耶氏酵母菌株还包含至少一种编码二酰基甘油胆碱磷酸转移酶[“CPT1”]的基因。
二酰基甘油胆碱磷酸转移酶(EC 2.7.8.2)是一种在负责磷脂酰胆碱生物合成的CDP-胆碱途径中催化以下反应的酶：CDP-胆碱+1，2-二酰基甘油＝胞苷-5′-单磷酸(CMP)+磷脂酰胆碱。解脂耶氏酵母的二酰基甘油胆碱磷酸转移酶(YlCPT1)如GenBank保藏号XM_501703(YALI0C10989g)所示；该酶具有394个氨基酸(SEQ IDNO：69)，由SEQ ID NO：68的1185bp编码序列编码。如前文的WO2006/052870所述，在强解脂耶氏酵母启动子控制下超表达YlCPT1证明与不超表达其天然YlCPT1的亲本菌株相比，会导致EPA相对于EPA生产菌株中的总脂肪酸的百分比提高。
在最优化的EPA菌株中的优选基因敲除菌株
除了调控多种优选去饱和酶、延伸酶和二酰基甘油胆碱磷酸转移酶基因的表达(同上)，重组耶氏酵母菌种同时缺失多个天然酶活性也可以是有用的。这常常通过定向基因敲除，在将线性DNA整合到宿主基因组中期间完成。并不令人惊讶地是，优选的敲除包括那些用于选择转化子(例如乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶[Ura3-]、酵母氨酸脱氢酶[Lys5-]、异丙基苹果酸脱氢酶[Leu2-])和那些减少脂肪酸降解和TAG降解(例如酰基CoA氧化酶同功酶[POX1-、POX2-、POX3-、POX4-和POX5-]、脂肪酶[Lip1-、Lip2-、Lip3-、Lip4a-])的敲除。其它优选的基因敲除菌株是那些显示导致表型“中性”突变的菌株，其中耶氏酵母属宿主细胞似乎不受影响(例如YALI0F24167g[GenBank保藏号XM_505819]、YALI0C18711g-[GenBank保藏号XP_501987]、SCP2-[YALI0E01298g；GenBank保藏号XM_503410])。相比之下，已经证明一些优选的基因敲除导致总油含量和/或EPA占总脂肪酸的百分比提高(例如二酰基甘油酰基转移酶2[DGAT2-]、过氧化物酶体生物合成因子蛋白3[Pex3p-]、过氧化物酶体生物合成因子蛋白10[Pex10p-]、过氧化物酶体生物合成因子蛋白16[Pex16p-])。在下文中将附加地详细描述基因敲除的这些广泛类别中的每一种(下文将不会重申解脂耶氏酵母Δ12去饱和酶敲除的作用，因为在以前描述串珠镰刀菌Δ12去饱和酶期间已经提供了该原因)。
重要的是注意到尽管下文为特定基因提供了示例性的SEQ IDNO，关于基因敲除的讨论不以任何方式受本文提供的具体序列的限制。本领域熟知的是可以使用与下文所述的编码序列基本上相同的其它DNA(因此，将期望例如在不同菌株和宿主之间的些微序列不同)。
用于选择转化子的基因敲除：如前文PCT公开WO 2006/052870所述，将包含表达盒的质粒DNA整合到乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶基因位点(Ura3；GenBank保藏号AJ306421[SEQ ID NO：70])、异丙基苹果酸盐脱氢酶基因位点(Leu2；GenBank保藏号AF260230[SEQ IDNO：72])和酵母氨酸脱氢酶基因位点(Lys5；GenBank保藏号M34929[SEQ ID NO：74])中是可能的。这通常导致整合位点处的基因敲除，基于细胞在分别缺乏尿嘧啶、亮氨酸或赖氨酸的培养基上生长的能力，易于利用基因敲除作为区分转化细胞和未转化细胞的手段。
在一些优选的方法中，能重复使用Ura3基因与5-氟乳清酸(5-氟尿嘧啶-6-羧酸一水合物或“5-FOA”)的组合进行选择。5-FOA对具有编码乳清苷5′-单磷酸脱羧酶(OMP脱羧酶)的功能性URA3基因的酵母细胞有毒性；基于这种毒性，5-FOA特别可用于选择和鉴定Ura-突变酵母菌株(Bartel，P.L.和Fields，S.，Yeast 2-Hybrid System，OxfordUniversity：New York，第7卷，第109-147页，1997)。更具体地讲，技术人员可以首先敲除天然Ura3基因以产生具有Ura-显型的菌株，其中基于5-FOA抗性进行选择。然后，可将多个嵌合基因和新的Ura3基因整合到耶氏酵母属基因组的不同位点以产生具有Ura+显型的新菌株。当敲除导入的Ura3基因时，随后的整合将产生新的Ura3-菌株(再次使用5-FOA选择进行鉴别)。因此，能将Ura3基因(与5-FOA选择组合使用)用作多轮转化的选择标记并从而以方便的方式容易地将基因修饰整合进耶氏酵母属基因组。
用于减少脂肪酸和TAG降解的基因敲除：在本文所述的最优化解脂耶氏酵母中故意中断影响脂肪酸5降解和TAG降解的那些途径(例如当将多个表达盒整合进细胞中时)也是有用的。这最小化在汇集的酰基-CoA中或在细胞的TAG级分中积聚的EPA的降解(PCT公开WO 2006/052870)。这些途径分别通过酰基-CoA氧化酶和脂肪酶基因代表。更具体地讲，酰基-CoA氧化酶(EC 1.3.3.6)催化过氧化物酶体β-氧化反应，其中每循环的降解产生一种乙酰-CoA分子和一种脂肪酸，该脂肪酸比脂肪酸底物短两个碳原子。在解脂耶氏酵母中存在五个酰基-CoA氧化酶同功酶，它们由POX1、POX2、POX3、POX4和POX5基因编码(也称作Aco1、Aco2、Aco3、Aco4和Aco5基因)，分别对应于GenBank保藏号AJ001299-AJ001303(也参见对应的GenBank保藏号XP_504703[SEQ ID NO：75]、XP_505264[SEQ IDNO：76]、XP_503244[SEQ ID NO：77]、XP_504475[SEQ ID NO：78]和XP_502199[SEQ ID NO：79])。每个同功酶具有不同的底物特异性。例如，POX3基因编码酰基-CoA氧化酶，该酶对短链脂肪酸具有活性，然而POX2基因编码酰基-CoA氧化酶，该酶对长链脂肪酸具有活性(Wang H.J.，等人，J.Bacteriol.，181：5140-5148(1999))。为了避免任何混淆，申请人将把上述的酰基-CoA氧化酶称作POX基因，然而根据一些公开可用的文献，该术语能与Aco基因命名法互换使用。
同样地，在解脂耶氏酵母中已经检测到若干个脂肪酶(EC 3.1.1.3)，包括细胞内的、膜结合的和细胞外的酶(Choupina，A.，等人，Curr.Genet.，35：297(1999)；Pignede，G.，等人，J.Bacteriol.，182：2802-2810(2000))。例如，Lip1(GenBank保藏号Z50020[SEQ ID NO：80])和Lip3(GenBank保藏号AJ249751[SEQ ID NO：84])是细胞内的或膜结合的，然而Lip2(GenBank保藏号AJ012632[SEQ ID NO：82])编码细胞外脂肪酶。Lip4a(GenBank保藏号XP_503825[SEQ ID NO：86])是耶氏酵母属脂肪酶4(GenBank保藏号XP_503697)同源物。它与变形假丝酵母的细胞外三酰基甘油脂肪酶(GenBank保藏号CAD21430)具有高度同源性。这些脂肪酶中的每一种都是合适的中断靶标，因为该酶催化其中TAG和水直接降解成DAG和脂肪酸阴离子的反应。
因此，如前文的PCT公开WO 2006/052870所述，将包含表达盒的质粒DNA整合进任何以下基因位点并从而导致基因敲除是有利地：Pox1(Aco1)、Pox2(Aco2)、Pox3(Aco3)、Pox4(Aco4)、Pox5(Aco5)、Lip1、Lip2、Lip3和Lip4a。
其它基因敲除：因为在解脂耶氏酵母中的同源重组频率相对较低，将表达盒整合进解脂耶氏酵母的基因组可能不时发生，导致无意的中断除那些最初被定向的基因之外的解脂耶氏酵母基因。这提供在转化子中筛选EPA生产提高的转化子并鉴定附加的有用基因敲除的机会。通过这些手段鉴定以下三个基因敲除，以及在下文中描述Pex10-基因敲除。
解脂耶氏酵母SCP2(YALI0E01298g[SEQ ID NO：87])编码甾醇载体蛋白，该蛋白参与脂质传送和代谢(Ferreyra R.G.等人，Arch.Biochem.Biophys.，453：197-206(2006))。已证实SCP2蛋白位于过氧化物酶体并通过促进酶和底物的相互作用参与氧化长链脂肪酸。SCP2已经显示结合脂肪酸和它们的CoA酯。因此，中断该基因可能是有益的，会降低EPA和其它途径中间体的氧化水平。在本文实施例中，在菌株Y4305中鉴定了SCP2-基因敲除。
也发现ORF YALI0C18711g(GenBank保藏号XP_501987[SEQ IDNO：89])发生基因中断，这当在其反应起始密码子中插入表达盒时发生。YALI0C18711g与啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)基因YLR050C同源，其基因功能是未知的。由GFP和YLR050C组成的嵌合蛋白显示位于内质网区域(Huh W.K.，等人，Nature，425(6959)：686-691(2003))，说明它可能与脂肪酸去饱和或脂质生产有关。在本文实施例中，首先在菌株Y4217中鉴定了YALI0C18711g基因敲除。
有时表达盒的整合发生在基因编码区外部，但是在特定编码区之前(5′非编码序列)和之后(3′非编码序列)的调控序列中。这种类型的插入可能影响ORF的表达。在本专利申请中，表达盒插入菌株Y4086中的YALI0F24167g(GenBank保藏号XM_505819[SEQ ID NO：91])的5′-区域，位于起始密码子上游154bp处。YALI0F24167g与啤酒糖酵母SPS4基因同源，它显示在孢子形成期间被表达(尽管不清楚其确切功能)(Hepworth SR等人，Mol.Cell.Biol.，15(7)：3934-3944(1995))。
二酰基甘油酰基转移酶基因敲除：酰基转移酶与TAG的生物合成紧密相关，并且在PCT公开WO 2006/052870中已经描述了四个真核酰基转移酶基因家族。这些家族包括酰基-CoA:胆固醇酰基转移酶[“ACAT”]家族，一般称为甾醇酰基转移酶；卵磷脂:胆固醇酰基转移酶[“LCAT”]家族；甘油3-磷酸酰基转移酶和酰基-CoA溶血磷脂酸酰基转移酶[“GPAT/LPAAT”]家族；和二酰基甘油酰基转移酶[“DAG AT”]家族。也参见引用文献D.Sorger和G.Daum，Appl.Microbiol.Biotechnol.，61：289-299(2003)，以及H.Mullner和G.Daum，ActaBiochimica Polonica，51(2)：323-347(2004)。DAG AT家族(EC 2.3.1.20)包括DGAT2，它涉及TAG生物合成的最终步骤；具体地讲，该酶催化将第三脂肪酸加到1，2-二酰基甘油[“DAG”]的sn-3位点上以形成TAG。
在PCT公开WO 2006/052870中敲除解脂耶氏酵母基因，该基因编码DGAT1(在PCT公开WO 2006/052914中表征)、DGAT2(SEQ IDNO：93和94；在美国专利公开7,267,976中表征)和PDAT(在美国专利公开7,267,976中表征)(参见该文献实施例29和30)。具体地讲，在包含中断DGAT2和/或DGAT1和/或PDAT基因的菌株中发现总油含量降低而EPA百分比提高。例如，与天然DGAT2不发生中断的亲本菌株相比，DGAT2敲除导致％EPA(占总脂肪酸[“TFA”])加倍而脂质含量(TFA％干细胞重量)减半。如PCT公开WO 2006/052912详细阐述的进一步实验导致这一假说：能调控宿主生物的天然DAG AT的活性并从而能操纵在宿主脂质和油中的PUFA百分比。具体地讲，因为期望油的生物合成在产油期间与多不饱和化竞争，减少或失活生物的一种或多种酰基转移酶的活性(例如PDAT和/或DGAT1和/或DGAT2)并从而降低油的生物合成的总体速率、同时增加掺入脂质或油级分的PUFA百分比(相对于总脂肪酸)是可能的。这一结果因为多不饱和化效率更高；或者换句话说通过下调特定DAG AT的活性，在油的生物合成和多不饱和化之间的底物竞争减少，在产油期间有利于多不饱和化。
基于上文概述的数据，期望重组耶氏酵母属生产宿主缺乏其编码DGAT2(SEQ ID NO：93)的天然基因。
过氧化物酶体生物合成因子蛋白(PEX)基因敲除：
过氧化物酶体是普遍存在于所有真核细胞中的细胞器。它们的主要作用是降解细胞定位的细胞器中的多种物质，例如毒性化合物、脂肪酸等。例如，在过氧化物酶体中能够发生β-氧化过程，其中脂肪酸分子发生降解，最后产生乙酰-CoA的游离分子(它被回输到细胞溶质中)。虽然线粒体中的β-氧化过程导致ATP合成，在过氧化物酶体中的β-氧化引起高电位电子转移到O2中并导致形成H2O2，H2O2随后被过氧化物酶体过氧化氢酶转化成水和O2。长链(如C18-C22)脂肪酸在过氧化物酶体中经过初始β-氧化，然后经过线粒体β-氧化。
已知负责通过水解ATP使蛋白穿过过氧化物酶体膜的蛋白是过氧化物酶体生物合成因子蛋白，或“peroxins”。这些过氧化物酶体生物合成因子蛋白也包括那些涉及过氧化物酶体生物合成/装配的蛋白。过氧化物酶体生物合成因子蛋白的基因首字母缩写Pex；并且命名体系描述于Distel等人，J.Cell Biol.，135：1-3(1996)。迄今已经在多种真核生物中鉴定了至少32个不同的Pex基因。然而在真菌中，Kiel等人近来的文献(Traffic，7：1291-1303(2006))提出过氧化物酶体生物合成/基质蛋白输入所需的最小数目是17，因此仅需要Pex1p、Pex2p、Pex3p、Pex4p、Pex5p、Pex6p、Pex7p、Pex8p、Pex10p、Pex12p、Pex13p、Pex14p、Pex17p、Pex19p、Pex20p、Pex22p和Pe26p。这些蛋白以协同方式作用以完成增生(复制)过氧化物酶体并经由转移进入过氧化物酶体以输入蛋白(参见Waterham，H.R.和J.M.Cregg.BioEssays，19(1)：57-66(1996))。
在酵母解脂耶氏酵母中，基于5过氧化物酶体生物合成机制的同源性和强保守性(Kiel等人，同上)已经鉴定了多种不同的Pex基因，包括：YlPex1p(GenBank保藏号CAG82178[SEQ ID NO：95])、YlPex2p(GenBank保藏号CAG77647[SEQ ID NO：96])、YlPex3p(GenBank保藏号CAG78565[SEQ ID NO：97])、YlPex3Bp(GenBank保藏号CAG83356[SEQ ID NO：98])、YlPex4p(GenBank保藏号CAG79130[SEQID NO：99])、YlPex5p(GenBank保藏号CAG78803[SEQ ID NO：100])、YlPex6p(GenBank保藏号CAG82306[SEQ ID NO：101])、YlPex7p(GenBank保藏号CAG78389[SEQ ID NO：102])、YlPex8p(GenBank保藏号CAG80447[SEQ ID NO：103])、YlPex10p(GenBank保藏号CAG81606[SEQ ID NO：104])、YlPex12p(GenBank保藏号CAG81532[SEQ ID NO：105])、YlPex13p(GenBank保藏号CAG81789[SEQ ID NO：106])、YlPex14p(GenBank保藏号CAG79323[SEQ ID NO：107])、YlPex16p(GenBank保藏号CAG79622[SEQ ID NO：108])、YlPex17p(GenBank保藏号CAG84025[SEQ ID NO：109])、YlPex19p(GenBank保藏号AAK84827[SEQ ID NO：110])、YlPex20p(GenBank保藏号CAG79226[SEQ ID NO：111])、YlPex22p(GenBank保藏号CAG77876[SEQ ID NO：112])和YlPex26p(GenBank保藏号NC_006072的反义翻译，核苷酸117230-118387[SEQ ID NO：113])。此外，以及分离并表征了这些基因中的一些基因。Bascom，R.A.等人(Mol.Biol.Cell，14：939-957(2003))描述了YlPex3p；Szilard，R.K.等人(J.Cell Biol.，131：1453-1469(1995))描述了YlPex5p；Nuttley，W.M.等人(J.Biol.Chem.，269：556-566(1994))描述了YlPex6p；Elizen G.A.，等人(J.Biol.Chem.，270：1429-1436(1995))描述了YlPex9p；Elizen G.A.等人(J.Cell Biol.，137：1265-1278(1997))和Titorenko，V.I.等人(Mol.Cell Biol.，17：5210-5226(1997))描述了YlPex16p；Lambkin，G.R.和R.A.Rachubinski(Mol.Biol.Cell.，12(11)：3353-3364(2001))描述了YlPex19；以及Titorenko V.I.等人(J.Cell Biol.，142：403-420(1998))和Smith J.J.以及R.A.Rachubinski(J.Cell Biol.，276：1618-1625(2001))描述了YlPex20p。然而本文最初关注的基因是5YlPex10p(GenBank保藏号CAG81606、AB036770和AJ012084)。表征于Sumita等人(FEMS Microbiol.Lett.，214：31-38(2002))，它证明：1)YlPex10p用作过氧化物酶体的组分；和2)YlPex10p的C3HC4环状锌指基序是蛋白功能必需的，这经由制造C341S、C346S和H343W点突变并随后进行生长分析来测定。
已经提出过氧化物酶体是脂质的分解代谢和合成代谢所必需的(Lin，Y.等人，Plant Physiology，135：814-827(2004))；然而，该假说是基于对Pex16p的同源物的研究。更具体地讲，Lin，Y.等人(同上)报道拟南芥Shrunken种子1(sse1)突变体具有异常的过氧化物酶体生物合成和脂肪酸合成，这基于sse1种子中的油与野生型相比减少了10％至16％。相关的，Binns，D.等人(J.Cell Biol.，173(5)：719-731(2006))检查了啤酒糖酵母中的过氧化物酶体-脂质体相互作用并测定两个细胞器之间的广泛物理接触促进脂质体内的结合脂解及过氧化物酶体脂肪酸氧化。更具体地讲，检查不同Pex基因敲除菌株的TAG游离脂肪酸的比率，发现比率相对于野生型提高。然而，在申请人的受让人的工作之前，尚未在生产PUFA的生物中进行过对Pex敲除的研究。
在本文所述的一些优选重组耶氏酵母属生产宿主中，宿主缺乏编码过氧化物酶体生物合成因子蛋白的天然基因，所述蛋白选自：Pex1p、Pex2p、Pex3p、Pex3Bp、Pex4p、Pex5p、Pex5Bp、Pex5Cp、Pex5/20p、Pex6p、Pex7p、Pex8p、Pex10p、Pex12p、Pex13p、Pex14p、Pex15p、Pex16p、Pex17p、Pex14/17p、Pex18p、Pex19p、Pex20p、Pex21p、Pex21B、Pex22p、Pex22p样和Pex26p。更优选的，中断的过氧化物酶体生物合成因子蛋白是Pex2p、Pex10p和/或Pex12p，因为这三个Pex蛋白在靠近它们C末端处都具有相似的C3HC4环状锌指基序，该基序据推测是它们活性必需的(图2A)。作为另外一种选择，中断的过氧化物酶体生物合成因子蛋白选自：Pex3p、Pex10p和Pex16p。
在编码过氧化物酶体生物合成因子蛋白的天然基因中的中断可能是在部分基因中的插入、删除、或定向突变，例如在蛋白N-末端部分或在蛋白C-末端部分。作为另外一种选择，该中断能导致完全的基因敲除，使得基因从宿主细胞基因组中除去。或者该中断可能是导致无功能蛋白的定向突变。在任何情况下，中断导致与天然过氧化物酶体生物合成因子蛋白未被中断的亲本菌株相比，在重组耶氏酵母属生产宿主的总脂质级分和油级分中以总脂肪酸百分比形式表示的PUFA量增加。
如实施例所证明并如表5所概述的(下文)那样，中断YlPex10p的C3HC4环状锌指基序的C-末端部分(实施例4和5)、删除整个染色体YlPex10基因(实施例8)都导致产生458解脂耶氏酵母的工程化EPA生产菌株，相对于尚未中断天然Pex10p的亲本菌株，该菌株在总脂质级分和油级分中具有以总脂肪酸百分比形式表示的、提高量的PUFA。此外，在解脂耶氏酵母的工程化EPA生产菌株中表达染色体外的YlPex10p逆转该效应，所述菌株在基因组Pex10p中具有中断并提高总脂质级分和油级分中的PUFA量(实施例6)。
更具体地讲，表5汇编了来自实施例4、5、6和8的数据，使得关于总脂质含量[“TFA％DCW”]、以总脂肪酸重量％表达的给定脂肪酸浓度[“％TFA”]、和干细胞重量百分比形式表达的给定脂肪酸含量[“％DCW”]的趋势能基于存在/不存在Pex10p中断或敲除被推论出来。“所需PUFA％TFA”和“所需PUFA％DCW”分别定量所需PUFA产物(即，EPA)的特定浓度或含量，所述产物通过设计工程化PUFA生物合成途径进行生产。“所有PUFA”包括LA、ALA、EDA、DGLA、ETrA、ETA和EPA、然而“C20 PUFA”被限定为EDA、DGLA、ETrA、ETA和EPA。
Figure GPA00001143582600691
Figure GPA00001143582600701
能得出以下结论(相对于天然Pex蛋白未被中断的亲本菌株或表达中断天然Pex蛋白的“后备”基因的亲本菌株)：
1)在生产PUFA的耶氏酵母属中的Pex中断导致总脂质级分和油级分中的单个PUFA(例如EPA或DLGA)的重量％相对于总脂肪酸的重量％(％TFA)提高；
2)在生产PUFA的耶氏酵母属中的Pex中断导致总脂质级分和油级分中的C20 PUFA的重量％相对于总脂肪酸的重量％(％TFA)提高；
3)通过延伸点1)，在生产PUFA的耶氏酵母属中的Pex中断导致总脂质级分和油级分中的任何PUFA和所有PUFA组合的量相对于总脂肪酸的重量％提高；和
4)在生产PUFA的耶氏酵母属中的Pex中断导致单个PUFA(例如EPA或DLGA)相对于干细胞重量的百分比提高。
当比较在“所有PUFA％DCW”、“C20 PUFA％DCW”和TFA％DCW中的Pex中断的效应时，能观察到不同的结果。具体地讲，在一些情况下，在生产PUFA的耶氏酵母属中的Pex中断导致总脂质级分和油级分中的C20 PUFA或所有PUFA的量(以干细胞重量百分比形式表示)提高(相对于天然Pex蛋白未被中断的亲本菌株)。在其它情况下，在总脂质级分和油级分中有以干细胞重量百分比形式表示的减少量的C20 PUFA或所有PUFA(相对于天然Pex蛋白未被中断的亲本菌株)。也观察到相对于总脂质含量(TFA％DCW)的类似结果，因此Pex中断的效应可能导致总脂质含量提高或降低。
基于过氧化物酶体生物合成因子蛋白在细胞内以受调控功能作用的能力，不希望受任何具体说明或理论的限制，假定在含油酵母细胞中的Pex基因中断或敲除影响过氧化物酶体中天然存在的脂质分解代谢和合成代谢，或受过氧化物酶体的影响。与尚未中断其天然过氧化物酶体生物合成因子蛋白的含油酵母相比，中断或基因敲除导致总脂质级分和油级分中的PUFA量增加，所述PUFA量以总脂肪酸百分比形式表示。在一些情况下，也观察到在总脂质级分和油级分中以干细胞重量百分比形式表示的PUFA量增加，和/或以干细胞重量百分比形式表示的总脂质含量增加。假定这种通用机制可应用于所有真核生物中，如藻类、真菌、卵菌、酵母、类眼虫、原生藻菌、植物和一些哺乳动物系统，因为所有这些生物都包含过氧化物酶体。
基因敲除的中断方法
虽然本领域的技术人员可使用多种技术中断天然耶氏酵母属基因，所述基因选自Ura3、Lys5、Leu2、Pox1、Pox2、Pox3、Pox4、Pox5、Lip1、Lip2、Lip3、Lip4a、YALI0F24167g、YALI0C18711g、SCP2[YALI0E01298g]、DGAT2、Pex1p、Pex2p、Pex3p、Pex3Bp Pex4p、Pex5p、Pex5Bp、Pex5Cp、Pex5/20p、Pex6p、Pex7p、Pex8p、Pex10p、Pex12p、Pex13p、Pex14p、Pex15p、Pex16p、Pex17p、Pex14/17p、Pex18p、Pex19p、Pex20p、Pex21p、Pex21B、Pex22p、Pex22p-like、Pex26p和Δ12去饱和酶，一般特定基因的内源活性能通过以下技术降低或消除，例如：1)通过插入、取代和/或删除所有或部分靶基因中断所述基因；或，2)操纵控制蛋白表达的调控序列。这些技术将都在下文中简要讨论；然而本领域的技术人员将了解这些技术在现有的文献中已有详细描述，并且不受本文所述的方法、宿主细胞、和产物的限制。本领域的技术人员也将认识到大多数适用的技术使用任何特定的含油酵母。
经由插入、取代和/或删除的中断：为了中断基因，将外源DNA片段(通常是一种选择性标记基因，但是任选地是嵌合基因或嵌合基因串，它们传送所期望的表型使之表达)插入靶基因以打断它的编码区或启动子序列并从而在功能上失活基因。将中断盒转化到宿主细胞中导致外源DNA片段通过同源重组置换功能性天然基因(参见例如：Hamilton等人，J.Bacteriol.，171：4617-4622(1989)；Balbas等人，Gene，136：211-213(1993)；Gueldener等人，Nucleic Acids Res.，24：2519-2524(1996)；和Smith等人，Methods Mol.Cell.Biol.，5：270-277(1996))。本领域的技术人员将会知道基因定向常规方法的许多改良方法，所述方法容许有阳性选择和阴性选择、生成基因敲除、以及插入外来DNA序列到例如哺乳动物系统、植物细胞、丝状真菌、和/或微生物系统的特定基因组位点中。申请人优选这一方法作为在解脂耶氏酵母中制备基因中断的手段(例如在本文实施例中，在多种高水平EPA生产重组菌株中通过上述手段中断编码Leu-和Ura-的天然基因)。
然而，如上文所提到的那样，解脂耶氏酵母表现出相当低的同源重组频率并因此常常将在除那些最初定向的位点之外的位点上表达盒插入到解脂耶氏酵母基因组中，尽管在载体中存在定向位点。这可能导致随机中断解脂耶氏酵母的基因，例如本文通过中断编码YALI0C18711g、SCP2和Pex10p的天然基因证明了这一点。
替代基因中断的非特异性方法是使用转座元件或转座子。转座子是随机插入DNA但随后能根据序列进行检索以测定插入位点的基因元件。体内和体外转座技术是已知的，并且涉及转座元件与转座酶的组合使用。当转座元件或转座子与核酸片段在存在转座酶的情况下接触时，转座元件将随机插入核酸片段中。该技术用于随机诱变和基因分离，因为中断基因可基于转座元件的序列进行鉴定。用于体外转座的试剂盒是可商购获得的并包括：1)Primer Island Transposition Kit，得自Perkin Elmer Applied Biosystems，Branchburg，NJ，基于酵母的Ty1元件；2)Genome Priming System，得自New England Biolabs，Beverly，MA，基于细菌转座子Tn7；和3)EZ::TN转座子插入系统，得自EpicentreTechnologies，Madison，WI，基于Tn5细菌转座元件。
调控序列的操纵：特定基因的内源活性一般能通过操纵调控序列控制蛋白表达来减少或消除。本领域熟知与编码序列附连的调控序列包括转录和翻译“控制”核苷酸序列，所述序列位于编码序列的上游(5′非编码序列)、内部、或下游(3′非编码序列)，并且影响附连的编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或翻译。因此，操纵Pex基因调控序列可以指操纵特定Pex基因的启动子、静默子、5’非转录前导序列(介于转录起始位点好翻译启动密码子之间)、内含子、增强子、启动控制区、多腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎-环结构。然而在所有情况下，操纵的结果是下调基因的表达。
因此例如鉴定为YALI0F24167g的耶氏酵母属ORF的启动子在一些本文所述的优化高水平EPA生产菌株中被中断。显而易见的是，类似的操纵可以在对应于耶氏酵母属基因的调控序列中进行，所述基因编码Ura3、Lys5、Leu2、Pox1、Pox2、Pox3、Pox4、Pox5、Lip1、Lip2、Lip3、Lip4a、YALI0C18711g、SCP2[YALI0E01298g]、DGAT2、Pex1p、Pex2p、Pex3p、Pex3Bp Pex4p、Pex5p、5Pex5Bp、Pex5Cp、Pex5/20p、Pex6p、Pex7p、Pex8p、Pex10p、Pex12p、Pex13p、Pex14p、Pex15p、Pex16p、Pex17p、Pex14/17p、Pex18p、Pex19p、Pex20p、Pex21p、Pex21B、Pex22p、Pex22p样、Pex26p和/或Δ12去饱和酶，从而导致基因下调或敲除。作为另外一种选择，驱动其中一种上述基因表达的天然启动子可以用与天然启动子相比启动子活性减弱的异源启动子取代。用于操纵调控序列的方法是本领域技术人员熟知的。
技术人员将能够使用这些方法和本领域熟知的其它方法中断在含油酵母细胞中的天然Ura3、Lys5、Leu2、Pox1、Pox2、Pox3、Pox4、Pox5、Lip1、Lip2、Lip3、Lip4a、YALI0F24167g、YALI0C18711g、SCP2[YALI0E01298g]、DGAT2、Pex1p、Pex2p、Pex3p、Pex3Bp Pex4p、Pex5p、Pex5Bp、Pex5Cp、Pex5/20p、Pex6p、Pex7p、Pex8p、Pex10p、Pex12p、Pex13p、Pex14p、Pex15p、Pex16p、Pex17p、Pex14/17p、Pex18p、Pex19p、Pex20p、Pex21p、Pex21B、Pex22p、Pex22p样、Pex26p和/或Δ12去饱和酶。
用于外源基因表达的常规表达系统、表达盒、载体和转化
含有引导外来蛋白质高水平表达的调控序列的微生物表达系统和表达载体是本领域技术人员熟知的。能使用这些表达系统和表达载体中的任何一种构建编码优选去饱和酶、延伸酶和CPT1蛋白的嵌合基因。然后能使用标准转化方法将这些嵌合基因导入解脂耶氏酵母以提供高水平表达的编码酶。
可用于转化耶氏酵母属宿主细胞的载体(如构建体、质粒)和DNA表达盒是本领域熟知的。存在于构建体中的序列的具体选择取决于所需的表达产物、宿主细胞的性质以及提出的相对于未转化细胞分离转化细胞的手段。然而，通常载体含有至少一个表达盒、选择标记和允许自主复制或染色体整合的序列。合适的表达盒通常包含基因控制转录起始的5′区(如启动子)、基因编码序列和控制转录终止的DNA片段3′区(如终止子)。最优选的是当2个控制区都来源于来自转化的宿主细胞的基因，尽管它们无需来源于对生产宿主是天然的基因(例如解脂耶氏酵母)。
如果两种或更多种基因从独立的复制载体表达，则希望每个载体具有不同的选择手段并且应该缺乏与其它构建体的同源性以便维持稳定表达和防止元件在构建体之间重配(reassortment)。可用实验方法确定对调控区、选择手段和所引入的构建体的增殖方法的正确选择，以便所有导入的基因均以需要的水平表达从而提供所需产品的合成。
构建体或载体包含受关注的基因，可通过任何标准技术将其导入宿主细胞如耶氏酵母属细胞。这些技术包括转化(如醋酸锂转化[Methods in Enzymology，194：186-187(1991)])、原生质体融合、基因枪轰击(bolistic impact)、电穿孔、显微注射或将所关注的基因引入宿主细胞中的任何其他方法。本文用于解脂耶氏酵母的较优选方法是基于DNA线性片段的整合技术，如美国专利公开4,880,741和5,071,764以及Chen，D.C.等人(Appl.Microbiol.Biotechnol.，48(2)：232-235(1997))所述。
为方便起见，已经通过任何方法操纵来摄取DNA序列(如表达盒)的宿主细胞在本文中称为“转化的”、“转化子”、或“重组体”。转化的宿主将具有至少一个拷贝的表达盒，而且可以具有两个或更多个拷贝，这取决于该表达盒是整合进基因组内还是存在于具有多拷贝数的染色体外元件上。转化的宿主细胞可以通过多种选择技术来鉴定，如美国专利7,238,482和美国专利7,259,255所述。
用于本文的优选选择方法是对卡那霉素、潮霉素和氨基糖苷G418抗性以及在缺乏尿嘧啶、亮氨酸、赖氨酸、色氨酸或组氨酸的培养基上生长的能力。在另一个实施方案中，5-氟乳清酸(5-氟尿嘧啶-6-羧酸一水合物；“5-FOA”)可用于选择酵母Ura-突变体。该化合物对酵母细胞具有毒性，酵母细胞具有编码乳清酸核苷5′-单磷酸脱羧酶(OMP脱羧酶)的功能性URA3基因(Bartel，P.L.和Fields，S.，Yeast 2-HybridSystem，Oxford University：New York，第7卷，第109-147页，1997)。
更具体地讲，技术人员可以首先敲除天然Ura3基因以产生具有Ura-显型的菌株，其中基于5-FOA抗性进行选择。然后，可将多个嵌合基因和新的Ura3基因整合到耶氏酵母属基因组的不同位点以产生具有Ura+显型的新菌株。当敲除导入的Ura3基因时，随后的整合将产生新的Ura3-菌株(再次使用5-FOA选择进行鉴别)。因此，能将Ura3基因(与5-FOA选择组合使用)用作多轮转化的选择标记并从而以方便的方式容易地将基因修饰整合进耶氏酵母属基因组。
本文利用的备选的优选选择方法依赖于用于解脂耶氏酵母的基于磺酰脲抗性。更具体地讲，该标记基因是具有单个氨基酸改变(W497L)的天然乙酰羟酸合酶(“AHAS”或乙酰乳酸合酶；E.C.4.1.3.18)，从而赋予了磺酰脲除草剂抗性(SEQ ID NO：121；PCT公开WO2006/052870)。AHAS是支链氨基酸生物合成途径中最常见的酶并且它是磺酰脲类和咪唑啉酮类除草剂的靶标。
本文在耶氏酵母属中利用的用于回收选择标记的附加方法依赖位点特异性重组酶系统。简而言之，位点特异性重组系统由两个元件组成：1)具有特定DNA序列[例如LoxP]的重组位点；和2)当两个或更多个重组位点在相同DNA分子上以给定间隔取向相同时，特异性结合到DNA序列上并催化DNA序列间重组(即，切除)的重组酶[例如Cre]。该方法可用作选择的一种手段，因为“回收利用”一对优选的选择标记用于多个连续转化是可能的。
更具体地讲，制备包含靶基因以及第一选择标记(例如Ura3、潮霉素磷酸转移酶[HPT])的整合构建体，所述靶基因是期望插入耶氏酵母属基因组中的基因(例如去饱和酶、延伸酶、CPT1)，所述选择标记通过重组位点侧接。在转化和选择转化体后，通过引入携带第二选择标记(例如AHAS)的复制型质粒和适用于识别引入基因组中的位点特异性重组位点的重组酶来将第一选择标记从染色体切除。当选择那些携带第二标记的转化子并确认第一选择标记从耶氏酵母属基因组中切除时，然后在不进行选择的情况下从宿主中获取复制质粒。这产生了既不具有第一选择标记又不具有第二选择标记的转化体，因而该去除了质粒的菌株可用于另一轮转化。本领域的技术人员将认识到该方法不受本文所用的特定选择标记或位点特异性重组系统的限制。
在解脂耶氏酵母中超表达外源基因
本领域的技术人员熟知的一点是仅仅将基因(例如去饱和酶、延伸酶、CPT1)插入克隆载体不确保它能以所需速率、浓度、量等表达。期望操纵许多控制转录、RNA稳定性、翻译、蛋白质稳定性和位置、氧限制和从宿主细胞分泌的不同遗传元件。更具体地讲，通过改变以下几个方面可控制基因表达：相关转录启动子和终止子序列的性质；所克隆基因的拷贝数目；该基因是质粒携带的还是整合到了宿主细胞的基因组中；所合成的外来蛋白质的最终细胞定位；蛋白质在宿主生物内的翻译效率；所克隆基因的蛋白质在宿主细胞内的固有稳定性；以及所克隆基因中的密码子使用，以使得其频率与宿主细胞的优选密码子使用频率接近。这些超表达的若干个方法将在下文讨论，并且作为超表达例如去饱和酶、延伸酶和CPT1蛋白的手段用于重组耶氏酵母属宿主细胞。
通过使用更强的启动子(调控型的或组成型的)引起表达增加、通过从mRNA或编码蛋白中移除/删除去稳定化序列、或通过将稳定序列加到mRNA(美国专利申请4,910,141)上，能在转录水平上提高所需基因的表达。
可用于驱动异源基因或其部分在耶氏酵母属宿主细胞中表达的起始控制区或启动子有很多，并且为本领域技术人员所知。表达能以诱导型或组成型完成。诱导型表达可通过诱导可操作地连接至所关注的基因的可调节启动子的活性来完成，而组成型表达可通过利用可操作地连接至所关注的基因的组成型启动子来实现。事实上，能够引导去饱和酶、延伸酶和CPT1基因在耶氏酵母属中表达的任何启动子(即天然的、合成的或嵌合的启动子)将均是适用的，但来自宿主物种的转录和翻译区是尤其有用的。虽然存在许多能在耶氏酵母属中表达基因的调控序列(例如取决于是期望组成型转录还是诱导型转录、启动子在表达所关注的ORF中的效率、构建的容易性等)，但在优选的实施方案中启动子选自表6显示的那些启动子(或它们的衍生物)。在PCT公开WO 2006/052870中提供了下文启动子的活性比较。
表6
用于在解脂耶氏酵母中超表达的优选启动子
  启动子名称   天然基因   参照序列
  GPD   甘油醛-3-磷酸-脱氢酶   美国专利公开7,259,255
GPDIN* 甘油醛-3-磷酸-脱氢酶   专利公布US2006/0019297-A1
  GPM   磷酸甘油酸变位酶   美国专利公开7,259,255
  GPM/FBAIN   磷酸甘油酸变位酶**   美国专利公开7,202,356
  FBA   果糖-二磷酸醛缩酶   美国专利公开7,202,356
  FBAIN***   果糖-二磷酸醛缩酶   美国专利公开7,202,356
  FBAINm****   果糖-二磷酸醛缩酶   美国专利公开7,202,356
  GPAT   甘油3-磷酸O-酰基转移酶   美国专利公开7,264,949
YAT1 铵转运酶   专利公布US2006/0094102-A1
EXP1 输出蛋白   PCT公开WO2006/052870
*GPDIN启动子包含一个GPD启动子区，加上一部分5’编码区，该编码区具有编码甘油醛-3-磷酸-脱氢酶的gpd基因的内含子。
**GPM/FBAIN启动子是一种嵌合启动子，该启动子包含“GPM启动子”和FBAIN启动子(下文)中包含的内含子的融合。
***FBAIN启动子包含一个FBA启动子区，加上一部分5’编码区，该编码区具有编码果糖-二磷酸醛缩酶的fba1基因的内含子。
****FBAINm启动子指FBAIN启动子的修饰版本，其中FBAINm具有在ATG翻译启动密码子和FBAIN启动子的内含子之间的52bp删除(因此仅包括N末端的22个氨基酸)，以及在内含子后的新翻译共有基序。此外，虽然FBAIN启动子当与表达基因的编码区融合时生成融合蛋白，FBAINm启动子不生成此类融合蛋白。
当然在另一个实施方案中，也能使用来源于表6所述的任何启动子区的其它启动子用于在解脂耶氏酵母中的异源表达，以有利于EPA在TAG和总脂质级分中的高水平生产和积聚。具体地讲，上述任何启动子的长度的改变可能导致突变启动子具有相同的或改变的活性；然而该启动子将仍旧具有驱动耶氏酵母属中基因表达的功能。
终止区通常可源于起始区从其获得的基因的3′区或来自不同的基因。大量的终止区是已知的并且(在用于与它们源自的属和物种相同和不同的属和物种两者时)在多种宿主中发挥的功能令人满意。终止区的选择通常更多是为了方便而不是因为任何特殊的性质。优选地，终止区来源于酵母基因，尤其是糖酵母属、裂殖糖酵母属、假丝酵母属、耶氏酵母属或克鲁维氏酵母属。编码γ-干扰素和α-2干扰素的哺乳动物基因的3′区域也是酵母中功能已知的区域。3′-区也可以是合成的，因为本领域的技术人员可利用可用的信息来设计和合成用作转录终止子的3′-区序列。终止位点可以是非必需的，但是是高度优选的。
虽然不意味着受限，在本文公开内容中使用的终止区来源于多种耶氏酵母属天然基因并包括：解脂耶氏酵母细胞外蛋白酶～100bp的3′区域(XPR；GenBank保藏号M17741)；酰基-coA氧化酶(Aco3：GenBank保藏号AJ001301和CAA04661；Pox3：GenBank保藏号XP_503244)终止子；Pex20(GenBank保藏号AF054613)终止子；Pex16(GenBank保藏号U75433)终止子；Lip1(GenBank保藏号Z50020)终止子；Lip2(GenBank保藏号AJ012632)终止子；和3-氧酰基-coA硫解酶(OCT；GenBank保藏号X69988)5终止子。
可以将PUFA生物合成途径去饱和酶和延伸酶基因和/或CPT1基因另外的拷贝(即，一种以上的拷贝)导入解脂耶氏酵母，从而提高EPA生产和积聚。具体地讲，另外的基因拷贝可以被克隆到单个表达构建体中；和/或克隆基因另外的拷贝可以通过增加质粒拷贝数或通过将克隆基因多次整合进基因组中来导入宿主细胞中(下文)。例如在一个实施方案中，将解脂耶氏酵母菌株(即，菌株Y4128)工程化以生产按总脂肪酸百分比计大于37.6％的EPA，通过将嵌合基因导入并整合到耶氏酵母属基因组中，所述基因包括：4拷贝的Δ9延伸酶、4拷贝的Δ8去饱和酶、3拷贝的Δ5去饱和酶、3拷贝的Δ17去饱和酶、3拷贝的Δ12去饱和酶和1拷贝的C16/18延伸酶。
同样地，在另一个实施方案中，将解脂耶氏酵母菌株Y4305工程化以生产按总脂肪酸百分比计大于53.2％的EPA，通过将嵌合基因导入并整合到耶氏酵母属基因组中，所述基因包括：7拷贝的Δ9延伸酶、7拷贝的Δ8去饱和酶、5拷贝的Δ5去饱和酶、3拷贝的Δ17去饱和酶、5拷贝的Δ12去饱和酶、3拷贝的C16/18延伸酶和2拷贝的二酰基甘油胆碱磷酸转移酶(CPT1)。
重要的是注意到当按照本文方法制备最优化的解脂耶氏酵母菌株时，常常涉及多个去饱和酶、延伸酶、和CPT1的拷贝。例如如果需要2拷贝的Δ9延伸酶，这可能涉及：1)分离自单个菌种的特定Δ9延伸酶的两拷贝的相同编码序列；或，2)分离自菌种“A”的Δ9延伸酶的一种编码序列和分离自菌种“B”的Δ9延伸酶的一种编码序列，因此一共产生两种Δ9延伸酶。
一般来讲，一旦已经获得适用于在含油酵母中表达的DNA盒(例如包含启动子、ORF和终止子的嵌合基因)，则将其置于能够在宿主细胞中自主复制的质粒载体中，或将其直接整合进宿主细胞的基因组中。表达盒的整合可以在宿主基因组中随机地发生或者可以通过使用这样的构建体来靶向，即该构建体含有足以靶向宿主基因座中的重组的与宿主基因组同源的区。虽然不依赖本文，如果构建体靶向内源性基因座，则转录和翻译调控区的全部或某些可以由内源性基因座提供。
在解脂耶氏酵母中表达基因的优选方法是通过将线性DNA片段整合到宿主基因组中；当期望基因高水平表达时，整合到基因组中的多个位置可以是尤其有用的为此目的，希望鉴定在基因组中以多拷贝存在的序列，如Ylt1和solo zeta元件，这些序列以分散方式遍布于一些解脂耶氏酵母菌株的基因组中，它们为至少35个拷贝/基因组和50-60个拷贝/基因组(Schmid-Berger等人，J.Bact.，176(9)：2477-2482(1994))。然而遗憾的是，不是所有解脂耶氏酵母菌株都具有zeta区域(例如ATCC #20362菌株)。当菌株缺乏此类区域时，将包含表达盒的线性DNA片段整合进替代位点以达到所需拷贝数也是可能的。例如，优选的替代位点包括：Ura3位点(GenBank保藏号AJ306421)、Leu2基因位点(GenBank保藏号AF260230)、Lys5基因位点(GenBank保藏号M34929)、Aco2基因位点(GenBank保藏号AJ001300)、Pox3基因位点(Pox3：GenBank保藏号XP_503244；或Aco3：GenBank保藏号AJ001301)、Δ12去饱和酶基因位点(美国专利公开7,214,491)、Lip1基因位点(GenBank保藏号Z50020)和/或Lip2基因位点(GenBank保藏号AJ012632)。在另一个实施方案中，如前文所述Pox1、Pox4、Pox5、Lip3、Lip4a、YALI0F24167g、YALI0C18711g、SCP2[YALI0E01298g]、DGAT2、Pex1p、Pex2p、Pex3p、Pex3Bp Pex4p、Pex5p、Pex5Bp、Pex5Cp、Pex5/20p、Pex6p、Pex7p、Pex8p、Pex10p、Pex12p、Pex13p、Pex14p、Pex15p、Pex16p、Pex17p、Pex14/17p、Pex18p、Pex19p、Pex20p、Pex21p、Pex21B、Pex22p、Pex22p样、Pex26p和Δ12去饱和酶基因位点可用于构建体整合。
Juretzek等人(Yeast，18：97-113(2001)提出在解脂耶氏酵母中的整合DNA片段的稳定性取决于单个转化子、受体菌株和所用的靶向平台。因此，技术人员将认识到必须筛选多个转化子以获取显示所需表达水平和、调节和模式的菌株或植物品系。这种筛选可以通过DNA印迹的Southern分析(Southern，J.Mol.Biol.，98：503(1975))、mRNA表达的Northern分析(Kroczek，J.Chromatogr.Biomed.Appl.，618(1-2)：133-145(1993))、蛋白质表达的Western分析、PUFA产物的表型分析或GC分析来完成。
EPA生产的发酵过程
转化过的微生物宿主细胞在能最优化嵌合酶基因(例如编码去饱和酶、延伸酶、CPT1等的基因)表达的条件下增殖，产生最大的和最经济的PUFA产量。通常，可通过改变碳源的类型和量、氮源的类型和量、碳氮比、不同矿物离子的量、氧水平、生长温度、pH、生物量生产期的时长、油积聚期的时长以及细胞收获的时间和方法优化培养基条件。解脂耶氏酵母通常生长在复合培养基(如酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖液体培养基(YPD))或缺乏生长所必需的成分并由此强迫选择所需表达盒的确定成分的极限培养基中(如Yeast Nitrogen Base(DIFCOLaboratories，Detroit，MI))。
用于本文所述方法和宿主细胞的发酵培养基必须包含合适的碳源如在美国专利7,238,482中提出的碳源。尽管预期本发明中利用的碳源可以涵盖许多种含碳源，但优选的碳源是糖类、甘油和/或脂肪酸。最优选的碳源是葡萄糖和/或包含介于10-22个碳之间的脂肪酸。
氮可以由无机源(如(NH4)2SO4)或有机源(如尿素或谷氨酸)提供。除了合适的碳源和氮源，发酵培养基还必须含有合适的矿物质、盐、辅因子、缓冲液、维生素和本领域技术人员已知的适合高水平EPA生产的含油酵母生长并促进EPA产生的酶促途径的其它组分。要特别注意促进脂质和PUFA合成的几种金属离子(如Fe+2、Cu+2、Mn+2、Co+2、Zn+2和Mg+2)(Nakahara，T.等人，Ind.Appl.Single Cell Oils，D.J.Kyle和R.Colin(编辑).第61-97页(1992))。
用于本文所述方法和宿主细胞的优选生长培养基是常规的商业制备培养基，如酵母氮源培养基(Yeast Nitrogen Base，DIFCOLaboratories，Detroit，MI)。也可以使用其它确定成分的生长培养基或合成的生长培养基，且适于解脂耶氏酵母生长的培养基对微生物学或发酵科学领域的技术人员来说将是已知的。适于发酵的pH范围通常介于约pH4.0至pH8.0之间，其中优选将pH5.5至pH7.5作为初始生长条件的范围。发酵可以在有氧或厌氧条件下进行，其中优选为微好氧条件。
通常，在含油酵母细胞中积聚高水平的PUFA需要两个阶段的过程，因为代谢状态必须在生长和脂肪的合成/贮存之间达到“平衡”。因此，最优选的是，两个阶段的发酵过程是在解脂耶氏酵母中产生EPA所必需的。这种方法在美国专利7,238,482中有所描述，其也描述了多种合适的发酵工艺设计(即分批式、补料分批式和连续式)和生长过程中的注意事项。
EPA纯化和处理
在本文的一些方面中，主要产品是含油酵母生物质。同样地，从生物质中分离和纯化包含EPA的油可能是不必要的(即，其中全细胞生物质是产品)。
然而，某些最终用途和/或产品形式可能需要来自生物质的部分和/或全部分离/纯化的包含EPA的油，以产生部分纯化的生物质、纯化油、和/或纯化EPA。包括EPA在内的PUFA可以游离脂肪酸或酯化形式如酰基甘油、磷脂、硫脂或糖脂形式存在于宿主生物(例如耶氏酵母属)中。这些脂肪酸可通过本领域熟知的多种方法从宿主细胞中提取。关于酵母脂质的提取技术、质量分析和可接受标准的一篇综述是Z.Jacobs(Critical Reviews in Biotechnology，12(5/6)：463-491(1992))的综述。有关下游加工的简述也可由A.Singh和O.Ward(Adv.Appl.Microbiol.，45：271-312(1997))。
一般来讲，用于纯化来自耶氏酵母属生物质的EPA和其它PUFA的手段可包括用有机溶剂萃取(例如美国专利6,797,303和美国专利5,648,564)、超声处理、超临界流体萃取(如使用二氧化碳)、皂化和物理手段例如挤压、珠粒打浆机或或它们的组合。另外的详细信息可参考美国专利7,238,482的教导内容。
包含已经精炼过的和/或纯化过的EPA的油可被氢化，从而产生具有多种熔炼特性和质地的脂肪。多种经加工的脂肪(包括涂脂、糖脂、硬黄油、人造黄油、烘焙起酥油等)需要室温下不同的硬度，并且仅能通过改变来源油的物理特性来制备。这最普遍地通过催化氢化完成(参见PCT公开WO 2006/052870以获得另外的细节和参考内容)。
使用包含EPA的组合物
本文提供包含具有EPA的含油酵母生物质的食品、婴儿代乳品、功能性食物、医疗食物、医疗营养品、饮食补充剂、药物组合物、动物饲料、和个人护理产品。同样地，也提供包含具有分离自重组含油酵母生物质的EPA的EPA或微生物油的食品、婴儿代乳品、饮食补充剂、药物组合物、动物饲料、和个人护理产品。
食物加工和食物配制领域的技术人员将了解生物质、部分纯化生物质、纯化油、和/或纯化EPA的量和组成是如何根据目的物种和/或最终用途加入特定产品中的。更具体地讲，“有效”量将被掺入产品制剂，然而该量将取决于食物或饲料产品、期望补充该产品的膳食或医疗食物或医疗营养品打算纠正或治疗的医学状况。最期望地是有效量的EPA将足以提供与ω-3/ω-6 PUFA消耗相关的期望健康特性。举例来说，通常掺入产品的EPA量考虑了与加工条件、一般处理和贮藏条件、EPA在产品中的稳定性、以及目的物种的生物利用/生物吸收效率相关的损失。
加工和配制领域的技术人员将熟悉浓缩从本文所述的重组耶氏酵母属生产宿主细胞中生产的油、从而提高EPA在总脂质级分中的浓度的方法，该方法使得它包含至少约60％，至少约70％，至少约80％或甚至至少约90％的EPA。本领域的技术人员也熟知混合本文所述的纯化油与其它纯化脂肪酸(例如LA、GLA、EDA、DGLA、ARA、DTA、DPAn-6、ALA、STA、ETrA、ETA、DPA和DHA)、或包含优选浓度的替代脂肪酸的油的方法。这些技术使得能够制备包含独特定制的脂肪特征的油。
个人护理产品：在个人护理产品的上下文中，ω-3脂肪酸在护肤制剂中具有特别的应用，其中它们可用于提高皮肤调理的效果。技术人员应当了解如何提供有效量的有关ω-3脂肪酸或包含与护肤组合物相同组分的油。除了PUFA油或ω-3脂肪酸之外，护肤组合物还可包含护肤组合物的美容上可接受的介质，其实例描述于Philippe等人的美国专利公开6,280,747中。例如，美容上可接受的介质可以是无水组合物，该组合物包含的脂肪物质比例一般为按重量计约10％至约90％(相对于组合物总重)，其中的脂相包含至少一种液体、固体或半固体脂肪物质。脂肪物质包括但不限于油、蜡、树胶、和所谓的糊状脂肪物质。作为另外一种选择，组合物可以是稳定的分散体形式如油包水或水包油乳液。此外，组合物可包含一种或多种常规化妆品或护肤添加剂或辅剂，包括但不限于抗氧化剂、防腐剂、填料、表面活性剂、UVA和/或UVB防晒剂、芳香剂、增稠剂、润湿剂和阴离子、非离子或两性聚合物、以及染料。
食品：市场目前支持各种掺入了ω-3和/或ω-6脂肪酸(尤其是LA、GLA、ARA、EPA、DPA和DHA)的食物和饲料产品。预期本文所述的酵母生物质、部分纯化的生物质、纯化油、和/或纯化EPA将在食品中发挥功能以赋予本发明制剂的健康有益效果。
本文所述的酵母宿主生产的耶氏酵母属生物质、部分纯化的生物质、纯化油、和/或纯化EPA将适用于多种食品，包括但不限于：食物类似物、饮料、肉类产品、谷类食品、烘焙食物、小吃食物和乳类产品。
食品类似物能使用本领域技术人员熟知的方法制备。提到的有肉类类似物、干酪类似物、乳品类似物等。由大豆制成的肉类类似物包含大豆蛋白或豆腐以及其它成分，混合在一起以模拟各种肉类。这些肉类替代物以冷冻、罐头或干燥食品的形式销售。通常使用它们的方法与它们替代的食品相同。肉类类似物的实例包括但不限于：火腿类似物、香肠类似物、熏肉类似物等。
取决于食品类似物的功能和组成特性，可将它们分成仿造品或替代品。例如，仿造干酪仅需类似它设计替代的干酪。然而，仅仅假如一种产品的营养等同于它替代的干酪并符合干酪的最低组成要求时，才能将其称之为替代干酪。因此，替代干酪将通常具有比仿造干酪更高的蛋白水平，并用维生素和矿物质进行强化。
乳品类似物或非乳品食品包括但不限于：仿造乳品和非乳品冷冻甜点(例如那些由大豆和/或大豆蛋白产品制成的食品)。
肉类产品包括多种产品。在美国“肉类”包括产自牛、猪和羊的“红肉”。除了红肉之外还有家禽类肉产品，包括鸡、火鸡、鹅、珠鸡、鸭和鱼以及贝类。调味和加工肉制品有多种类别：新鲜的、腌制的和油炸的、以及腌制的和煮熟的。肠和热狗是加工肉制品的实例。因此，如本文所用，术语“肉类产品”包括但不限于加工肉制品产品。
谷类食品是来自谷物加工的食物。谷物包括来自生产可食用谷物(种子)的草本植物家族的任何植物。最常见的谷物是大麦、玉米、小米、燕麦、奎奴亚藜、大米、裸麦、高粱、黑小麦、小麦和野生稻。
谷类食品的实例包括但不限于：整谷粒、粉碎谷粒、粗磨粉、面粉、麸皮、胚芽、早餐谷类食物、挤出食物、意大利面食等。
烘焙食品包括上文提到的任何谷类食物并已被烘焙或用类似于烘焙的方法进行加工(即，通过受热进行干燥或硬化)。烘焙食品的实例包括但不限于：面包、粉饼、油炸圈饼、巴、意大利面食、面包瓤、烘焙小吃、小点心、小薄脆饼干、小饼干、和小脆饼干。如上文所述，来自重组EPA生产宿主细胞的油可用作一种成分。
小吃食品包括上文或下文所述的任何食物。
油炸食品包括上文或下文所述的任何油炸食物。
饮料可以是液体或干粉形式。例如，提到了：非碳酸盐饮料；新鲜的、冷冻的、罐装的或浓缩的果汁；调味奶或原奶饮料等等。成人和婴儿营养代乳品是本领域熟知的和可商购获得的(例如Similac
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、Ensure
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、Jevity
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、和Alimentum
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，来自Ross Products Division，AbbottLaboratories)。
乳品产品是来源于乳品的产品。乳品类似物或非乳品产品来源于除乳品之外的其它来源，例如上文讨论的豆奶。这些产品包括但不限于：全脂乳、脱脂乳、发酵乳产品如酸奶或酸乳、奶油、黄油、炼乳、奶粉、咖啡增白剂、咖啡伴侣、冰淇淋、干酪等。
其中有耶氏酵母属生物质、部分纯化生物质、纯化油、和/或纯化EPA的附加食品可包括例如：口香糖、糖果盒白糖、明胶和布丁、硬糖和软糖、果酱和凝胶剂、白砂糖、糖替代品、甜沙司、浇头和糖浆、以及干混粉末混合物。
婴儿代乳品：婴儿代乳品是喂给婴儿或儿童的液体或再生粉末。本文将“婴儿代乳品”定义为肠营养产品，它能取代人母乳来喂养婴儿并通常由所需百分比的脂肪与所需百分比的碳水化合物及蛋白质在水溶液中混合组成(例如参见美国专利公开4,670,285)。根据世界范围内的组合物研究，以及专家组指出的水平，平均人母乳通常包含约0.20％至0.40％的总脂肪酸(约占50％的来自脂肪的卡路里)；并且一般DHA对ARA的比率在约1∶1至1∶2的范围内(参见例如来自Enfamil LIPILTM[Mead Johnson & Company]和Similac AdvanceTM[RossProducts Division，Abbott Laboratories]的制剂)。婴儿代乳品在婴儿饮食中起到特殊作用，因为它们经常是婴儿唯一的营养来源。虽然母乳仍旧是婴儿最好的食物，但婴儿代乳品足以成为使婴儿不仅存活而且健康成长的第二食品。
健康食品和药品：本发明的生物质、部分纯化生物质、纯化油、和/或纯化EPA可用于制剂以赋予健康食品健康有益效果，包括功能性食品、医疗食物、医疗营养品和饮食补充剂。此外，本发明的耶氏酵母属生物质、部分纯化生物质、纯化油、和/或纯化EPA可用于标准药物组合物。能将本发明的解脂耶氏酵母工程化菌株或由此制备的包含EPA的微生物油轻易地掺入上文提到的任何食品以制备例如功能性食品或医疗食物。例如包括EPA的更高浓度的制剂包括胶囊、粉末、片剂、软凝胶、胶囊锭、液体浓缩物和乳液，它们能在人或除人之外的动物中用作饮食补充剂。
动物饲料产品：动物饲料本文一般定义为旨在用作饲料或混入饲料的产品，用于除人之外的动物。本文所述的耶氏酵母属生物质、部分纯化生物质、纯化油、和/或纯化EPA可用作多种动物饲料的成分。
更具体地讲，尽管不受本文的限制，期望来自重组耶氏酵母属宿主细胞的EPA能用于宠物食品、反刍动物和家禽食品以及水产养殖食品。宠物食品是那些旨在饲喂给宠物(例如狗、猫、鸟类、爬行动物、和啮齿动物)的食物。这些产品可包括上文的谷类和健康食物、以及肉类和肉类副产品、大豆蛋白产品、草和干草产品(例如苜蓿、梯牧草、燕麦或雀麦草、蔬菜)。反刍动物和家禽食品是那些旨在饲喂给动物(例如火鸡、鸡、牛、和猪)的食物。关于上文的宠物食物，这些产品可包括上文列出的谷类和健康食物、大豆蛋白产品、肉类和肉类副产品、以及草和干草产品。水产养殖食品(或“水产品饲料”)是那些旨在用于水产养殖场的食物，即，关于在淡水或海水中繁殖、饲养、或养殖水生生物和/或动物的食物。
预期本发明的生产高浓度EPA的工程化解脂耶氏酵母菌株在动物饲料制剂中将是尤其有用的。除了提供必需的ω-3PUFA之外，酵母本身是有用的蛋白和其它营养物质来源(例如维生素、矿物质、核酸、络合碳水化合物等)，它能有助于动物的总体健康状态和营养，以及提高制剂的口味。因此预期加入包含重组耶氏酵母属生产宿主的酵母生物质将是动物饲料制剂中的饲料营养物质的优异附加来源。更具体地讲，解脂耶氏酵母(ATCC #20362)基因按相对于干细胞重量的百分比计大约具有以下化学组合物：35％蛋白、40％脂质、10％碳水化合物、5％核酸、5％灰分和5％水分。此外，在碳水化合物级分中包含大约45.6mg/gβ-葡聚糖、大约11.4mg/g甘露聚糖、和大约52.6mg/g甲壳质(而海藻糖是最少的组分[大约0.7mg/g])。
已有相当多的文献检查了β-葡聚糖、甘露聚糖和甲壳质的免疫调节效应(参见PCT公开WO 2006/052870)。基于解脂耶氏酵母的特有蛋白∶脂质∶碳水化合物组合物以及特有络合碳水化合物特征(包含大约1∶4∶4.6比率的甘露聚糖β-葡聚糖:甲壳质)，预期本文所述的遗传工程化酵母细胞(或其部分)将是对动物饲料制剂有用的添加剂。这可通过例如加入全[冻干]酵母细胞、纯化细胞壁、纯化酵母碳水化合物或多个其它部分发生。
在水产养殖中，随着对不同鱼类的营养需求的了解增加和饲料制造业中的技术进步，已经发展并使用制造的或人工的饮食(配制饲料)来补充或替代天然饲料。然而一般来讲，在用于鱼类的水产养殖饲料中包括的不同营养物质的一般比例包括(对干燥饮食的百分比)：32-45％的蛋白，428％的脂肪(其中至少有1-2％的ω-3和/或ω-6PUFA)，10-30％的碳水化合物，1.0-2.5％的矿物质和1.0-2.5％的维生素。制剂中可任选地加入多种其它成分。这些成分包括：1)类胡萝卜素，它尤其适用于鲑鱼和观赏的“水族柜”鱼，分别用以促进肉和皮肤的着色；2)粘合剂，它用于提供饲料小丸的稳定性并减少将营养物质过滤到水中(例如牛心、淀粉、纤维素果胶、胶质、阿拉伯树胶、刺槐菜豆、琼脂、卡拉胶和其它海藻酸盐)；3)防腐剂如抗微生物剂和抗氧化剂，用于延长鱼食的储存寿命并减少脂肪的臭味(例如维生素E、丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯、乙氧喹啉以及丙酸、苯甲酸或山梨酸的钠盐和钾盐)；4)化学吸引剂和调味剂，用于提高饲料的适口性及其摄取；和5)其它饲料成分。这些其它饲料成分能够包括以下物质：如纤维和灰分，它们用作填料并分别用作钙源和磷源，以及植物性物质和/或鱼粉或鱿鱼粉(例如活的、冷冻的、或干燥的藻类、盐水虾、轮虫或其它浮游生物)，它们用于提高鱼食的营养价值并提高它的接受度。Nutrient Requirements of Fish(National Research Council，National Academy：Washington D.C.，1993)提供了对鱼类的基本营养物质和不同成分的营养成分的详细描述。
水产饲料制剂的制造商需要考虑多种因素，因为完整饮食必须是营养平衡的、可口的、水稳定的、并且具有合适的大小和质地。关于水产饲料的营养物质组合物可以参考：Handbook on Ingredients forAquaculture Feeds(Hertrampf，J.W.和F.Piedad-Pascual.KluwerAcademic：Dordrecht，The Netherlands，2000)和Standard Methods forthe Nutrition and Feeding of Farmed Fish and Shrimp(Tacon，A.G.J.Argent Laboratories：Redmond，1990)。一般来讲，将饲料配制成干的(即，最终含水量为610％)，半湿的(即，35-40％的含水量)或湿的(即，50-70％的含水量)。干饲料包括以下形式：干燥成分的简单松散混合物(即，“捣碎品”或“粗粉”)；压缩小丸、胶粒或颗粒；和薄片。根据鱼的饲喂需求，能将小丸制成沉于水的或浮于水的。半湿饲料和湿饲料由单一成分或混合成分制成，例如杂鱼或煮熟的豆类，并且能被制成饼状或球状。
然后清楚地是本发明的生产高浓度EPA的工程化解脂耶氏酵母菌株在大多数水产品饲料制剂中将是尤其有用的。除了提供必需的ω-3和/或ω-6PUFA之外，酵母本身是一种有用的蛋白来源，它能提高制剂的适口性。在替代实施方案中，能将由本发明的解脂耶氏酵母菌株制备的油经过从细胞群中提取并纯化后直接加入水产品饲料制剂中。
由补充EPA引起的临床健康有益效果
虽然EPA饮食补充剂已经显示可用于降低血清胆固醇和甘油三酸酯，并且对例如对冠心病、高血压、炎性病症(例如类风湿性关节炎)、肺病和肾病、II型糖尿病、肥胖症、溃疡性结肠炎、克隆氏病、神经性厌食症、烧伤、骨关节炎、骨质疏松、注意力缺乏/多动症、早期结直肠癌和精神失常(例如精神分裂症)具有有益功效(参见例如McColl，J.，NutraCos，2(4)：35-40(2003)；Sinclair，A.等人In Healthful Lipids；C.C.Akoh and O.-M.Lai，编辑；AOCS：Champaign，IL(2005)，Chapter16)，但是仍未阐明这些临床观察的分子和生物化学机制。要注意的是，许多过去的研究不能识别代谢上和功能上彼此不同的单个长链ω-3脂肪酸(例如EPA和DHA)，因此每种脂肪酸可具有特异的生理机能。这种机制上的不了解很大程度上是使用鱼油作PUFA源的结果，与之相反的是在临床研究中使用纯EPA或纯DHA[例如来自鲱鱼、鳕鱼肝脏、沙丁鱼和凤尾鱼的油的脂肪酸组合物包含的油具有大约0.9∶1至1.6∶1的EPA∶DHA比率(基于在The Lipid Handbook，第2版；F.D.Gunstone，J.L.Harwood和F.B.Padley，编辑；Chapman和Hall，1994)中的数据]。虽然如此，逐渐认识到EPA本质上是一种重要的ω-3脂肪酸。因此，本文期望本文所述的重组耶氏酵母属生产宿主的富含EPA的油将在多种治疗应用中具有非常广泛的用途，例如炎症、心血管病、基因表达的营养物质调节和血脂异常，并且具体地讲应用于治疗临床状况，包括：冠心病、高血压、炎性病症、II型糖尿病、溃疡性结肠炎、克隆氏病、神经性厌食症、烧伤、骨关节炎、骨质疏松、和注意力缺乏/多动症。
虽然涉及这些应用的每一种的下述结果基于临床上对人类的研究，这不应理解为限制性的；具体地讲，申请人预见了使用富含EPA的油治疗多种其它动物的相似健康问题(例如家养宠物、反刍动物、家禽、鱼等)。
EPA和炎症：已经提出了许多生物化学机制解释鱼油的抗炎特性。当前的一个流行机制提出ω-3脂肪酸减少在炎性细胞膜中的ω-6脂肪酸量并抑制ω-6脂肪酸代谢，该脂肪酸能够合成来源于ω-6脂肪酸的促炎介质(例如前列腺素系列2和白三烯系列4)。此外，ω-3脂肪酸产生强炎性调节剂(例如前列腺素系列3和白三烯系列5)。然而，近来的研究已经鉴定了一个新的脂质抗炎调节剂家族，称为resolvin(“resolution phase interaction product”)，它们在低纳摩尔范围内的生物活性指示它们是非常强的抗炎调节剂。在该家族中有EPA来源的resolvin(即，E系列resolvin或“RvE”)和DHA来源的resolvin(即，D系列resolvin或“RvD”)(参见Serhan，C.N.，Pharma.& Therapeutics，105：7-21(2005))。RvE1(5S，12R，18R-三羟基-6Z，8E，10E，14Z，16E-EPA)的不同作用在Arita，M.等人(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，102(21)：7671-7676(2005))中证明，提供了可形成EPA对人类健康和疾病起到一些有益作用的基础的机制证据。
这一新生物学发现强调了富含EPA的产品对炎性过程的营养和医学管理的潜在用途。此外，因为炎症导致从心血管病到代谢系统疾病(例如代谢综合症X、肥胖症、糖尿病)、到神经系统疾病(例如阿尔茨海默病)范围的许多疾病，期望富含EPA的油(如本文所述的那些油)将具有非常广泛的用途。期望的医疗用途可来源于：1)使用EPA或RvEs作医疗食物中的生物活性成分；和/或，2)将EPA加入非处方或处方药物作治疗助剂。最后，EPA可作为合成RvEs的前体和医药优化的新化学个体。
EPA和心血管病：鱼油及其相关ω-3脂肪酸在心血管病的二次预防管理中已经显示出相当强的心肌保护能力(即，受试者已经出现心血管症状或者受试者已经患过心血管疾病)。然而与这些研究的光明前景同样的是，它们留下了许多未答复的关键问题；要注意的是，EPA对DHA的相对重要性和这些脂肪酸在初次预防中的功效[例如对以下情况的患者：1)无心肌梗塞或心绞痛病史并且无血管成形/支架植入以及无冠状动脉搭桥的患者；和2)临床不显示心绞痛或心电图异常的患者]。
日本EPA脂质干预研究(Japanese EPA Lipid Intervention Study，“JELIS”)致力于在大规模随机对照试验中解决这些问题，使用＞98％的纯化EPA-乙酯与斯达汀的组合(Yokoyama，M.和H.Origasa，Amer.Heart J.，146：613-620(2003)；Yokoyama，M.等人，Lancet，369：1090-1098(2007))。如同预测的那样，作者发现接受EPA加斯达汀的患者的心血管事件相对于那些只接受斯达汀的患者减少了19％。这为了EPA本质上是心肌保护性的提供了强力支持，因此有助于开放富含EPA的油的市场。它也提供了将EPA/resolvin型混合物与斯达汀组合的机会，和/或提供了将来源于本文所述的重组耶氏酵母属的油用作高纯度来源的EPA生产EPA-乙酯药物的机会，该药物目前来源于鱼油并从鱼油中制造(例如来自Mochida Pharmaceutical Co.，Ltd.，Tokyo，Japan的EPADEL)。
长期以来已经确定C-反应蛋白(CRP)是用于跟踪不同炎性状况和代谢状况的有用的生物标记，例如心血管代谢疾病(例如代谢综合症、非酒精性脂肪性肝炎、非酒精性脂肪性肝病、糖尿病前状况如“胰岛素抵抗”，糖尿病)、神经行为状况(例如阿尔茨海默病、注意力缺乏/多动症、抑郁症、双极情感障碍、精神分裂症、产后抑郁症、绝经后失调、例如热潮红)、炎性病症如结肠炎、克隆氏病、肠易激综合症、和resolvin相关的病症，其中提高的血清CRP浓度与疾病风险提高有关(N.Engl.J.Med.，343(7)：512(2000)；Diabetes Care，28：878-881(2005)；Digestive and Liver Disease，40(3)：194-199(2008)；AppliedPhysiology，Nutrition，and Metabolism，32(6)：1008-1024(2007)；American Journal of Physiology，294(1，Pt.1)：G27-G38(2008)；Progressin Nutrition，9(2)：124-133(2007)；Nutrients，Stress，and MedicalDisorders，317-324(2006).Editor(s)：Yehuda，Shlomo；Mostofsky，David I.Publisher：Humania Press Inc.，Totowa，NJ)。提出并详细描述了用于测试C-反应蛋白血清浓度的方法。许多研究已经得出结论：施用ω-3脂肪酸能够与C-反应蛋白的血清水平减少相关联(NutritionResearch(New York，NY，United States)，28(5)：309-314(2008)；Journal of Biological Sciences(Faisalabad，Pakistan)，7(8)：1368-1374(2007)；Nephrology，Dialysis，Transplantation，22(12)：3561-3567(2007))。因此，经由施用本文所述的可消耗形式(其中治疗临床状况或减少C-反应蛋白)的重组微生物油提供用于治疗临床状况(如那些上文提到的状况)的方法以及用于减少C-反应蛋白血清水平的方法在本发明的范围内。
ω-3PUFA和营养物质调节基因表达：这是为人们熟知的：长链ω-3 PUFA具有推动分配的功能，它能够引导：1)葡萄糖从脂肪酸生物合成转向糖原贮藏；和2)脂肪酸从甘油三酸酯合成转向氧化。这一再分配的净效应是减少循环的甘油三酸酯并且在一些菌种中减少脂肪沉积。有增加的科学证据证明这些长链ω-3 PUFA对代谢发挥效应的分子机制是不同配体活化的转录因子相互作用的结果，所述转录因子继而调控基因表达。
迄今通过脂肪酸调控的基因转录似乎是由于至少4个转录因子家族活性或丰度的改变：PPAR(过氧化物酶体增殖物活化受体)、LXR(肝脏x受体)、HNF-4α(肝细胞核因子4)和SREBP(固醇调节元件结合蛋白)(参见Clarke，S.D.，J Nutr.，131(4)：1129-1132(2001)和Curr.Opin.Lipidology，15：13-18(2004)；Pegorier，J.-P.等人，J Nutr.，134：2444S-2449S(2004))。例如这种相互作用，据信EPA在肝脏中通过活化PPARα降低血清甘油三酸酯；并且它的一些抗炎活性(尤其是在血管壁水平上)也可通过动脉巨噬细胞中的PPAR生物调节。
对脂肪酸控制特异基因表达机制的了解可提供发展新治疗策略的方向，所述治疗策略用于更好地管理全身脂质代谢并控制甘油三酸酯和胆固醇血清水平、冠心病和其它慢性病的确定的风险因素。同样地，期望未来的研究将会知道EPA对DHA作为营养物质-基因相互作用的调节子，在保持并促进最佳人类健康过程中起到的作用的差别。
ω-3 PUFA和血脂异常：已经常常将摄取鱼油与低密度脂蛋白(LDL)胆固醇的轻度增加联系起来，这是导致心脏病风险增加的不利事件。Theobald，H.E.等人近来的研究(Amer.J.Clinical Nutrition，79：558-563(2004))提出该LDL胆固醇升高可能实际上是由DHA(与EPA相反)引起。具体地讲，在3个月中每日摄取～0.7g DHA将中年男人和妇女的LDL胆固醇提高7％；相比之下，使用纯化EPA或富含EPA的油的研究已经一般不报道LDL胆固醇的类似增加(Harris，W.S.，Amer.J.Clinical Nutrition，65(Supplement)：1645S-1654S(1997))。虽然需要进一步研究以阐明由低剂量DHA导致的LDL胆固醇提高的原因，本发明富含EPA、不包含DHA的油的效用可能潜在具有显著的临床优势。
虽然期望纯化本文所述的重组微生物油以生产包含相对纯的EPA的油，但是在替代实施方案中，使用富集EPA和至少一种其它PUFA的最终油产品可能具有观察得到的优势。例如，证据指示补充EPA和GLA的组合可对血清脂质产生有利影响。具体地讲，M.Laidlaw和B.J.Holub(Amer.J.Clinical Nutrition，77：37-42(2003))报道了包含EPA和DHA(总计4g)以及GLA(2g)的混合物的每日补充剂，该补充剂经过28天有利地改变了健康妇女的血液脂质和脂肪酸特征。在接受EPA、DHA和GLA的那些患者中，除了将患者的LDL胆固醇减少11.3％之外，还将计算的心肌梗塞10年风险减少了43％。因此，加入GLA抵消了EPA和DHA引起LDL胆固醇轻微升高的趋势(Theobald等人，同上)。合在一起，Laidlaw和Holub以及Theobald等人进行的研究可证明富含EPA和GLA但是不含DHA的油的临床有益效果。
GLA和EPA补充剂组合的用途也已经作为减少或抗慢性炎症的手段被广泛普及，因为它涉及疾病如关节炎、糖尿病和心脏病(F.Chilton和L.Tucker，Inflammation Nation：The First Clinically Proven EatingPlan to End Our Nation′s Secret Epidemic.Fireside Books)。具体地讲，虽然GLA补充以前显示能减少生成的炎症脂质调节剂并减轻慢性炎性病症的临床症状(例如类风湿性关节炎)，但是也已知补充钙相同脂肪酸会引起血清ARA水平的显著增加，这是一种具有潜在危害的副作用。这些双重效应的基本原理据信是由于在肝脏中存在Δ5去饱和酶活性，它能够将基本的ω-6脂肪酸LA完全转化成ARA(经由ω-6 Δ6去饱和酶Δ6延伸酶途径并通过GLA和DGLA中间体)，然而炎性细胞如嗜中性粒细胞缺少将DGLA转化成ARA的代谢能力。因此假设EPA共补充将阻止在肝脏中合成ARA，然而能够合成DGLA。该原则的临床证据在人类饮食研究中由J.B.Barham等人(J.Nutr.，130：1925-1931(2000))中建立，其中证明了保持GLA减少脂质调节剂能力的补充策略(不引起血清ARA水平的升高)需要加入EPA。因此，这些涉及炎症的研究进一步支持包含GLA和EPA的油的效用(然而在缺乏EPA补充情况下使用GLA可能是禁忌的)。在PCT公开2006/033723中提出在解脂耶氏酵母中生产GLA的方法。
优选实施方案的描述
本文证明的是在含油酵母，解脂耶氏酵母的总脂质级分中合成了按总脂肪酸百分比计大于53.2％EPA。如图3所示，通过将不同基因整合到野生型ATCC #20362解脂耶氏酵母中制备了多个解脂耶氏酵母菌株，其中每个转化菌株能够生产不同量的PUFA(包括EPA)。一些表达Δ9延伸酶Δ8去饱和酶途径的代表性转化生物体的基因型和完整脂质特征在下表7和8中显示。将脂肪酸鉴定为16:0、16:1、18:0、18:1(油酸)、18:2(LA)、18:3(ALA)、GLA、20:2(EDA)、DGLA、ARA、ETA和EPA；并且每个组合物以％总脂肪酸形式表示。“TFA％DCW”表示细胞中的总脂肪酸，以干细胞重量百分比形式表示。
通过GC分析从在发酵培养基(FM)中生长2天以及在高葡萄糖培养基(HGM)中生长5天的耶氏酵母属菌株中获取含油特征(参见一般方法的培养基配方)。因为生长条件不同，GC特征可能稍微不同于那些实施例中提供的GC特征(例如不同培养基、培养烧瓶或管、以及生长时间长度等)。
Figure GPA00001143582600941
Figure GPA00001143582600951
如上表所见，表达Δ9延伸酶Δ8去饱和酶途径并生产最多EPA的菌株是解脂耶氏酵母的重组菌株Y4305。该生物的GC色谱图在图4中显示。下文描述了在菌株Y4305中包含的基因修饰的更详细概述(其中在实施例中提供了全部细节)：
(1)在GPD::FmD12::Pex20和YAT1::FmD12::OCT嵌合基因中表达2拷贝串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)Δ12去饱和酶；
(2)在GPM/FBAIN::FmD12S::OCT、EXP1::FmD12S::Aco和YAT1::FmD12S::Lip2嵌合基因中表达3拷贝合成Δ12去饱和酶基因(其密码子经优化以在解脂耶氏酵母中表达)，该基因来源于串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)Δ12去饱和酶；
(3)在YAT1::ME3S::Pex16和EXP1::ME3S::Pex20嵌合基因中表达3拷贝合成C16/18延伸酶基因(其密码子经优化以在解脂耶氏酵母中表达)，该基因来源于高山被孢霉(Mortierellaalpina)C16/18延伸酶；
(4)在GPAT::EgD9e::Lip2嵌合基因中表达1拷贝小眼虫Δ9延伸酶；
(5)表达5拷贝的合成Δ9延伸酶基因(其密码子经优化以在解脂耶氏酵母中表达)，该基因来源于小眼虫Δ9延伸酶，在EXP1::EgD9eS::Lip1、FBAINm::EgD9eS::Lip2、FBA::EgD9eS::Pex20、GPD::EgD9eS::Lip2和YAT1::EgD9eS::Lip2嵌合基因中表达；
(6)表达1拷贝的合成Δ9延伸酶基因(其密码子经优化以在解脂耶氏酵母中表达)，该基因来源于小型绿藻属CCMP389Δ9延伸酶，在YAT1::E389D9eS::Oct嵌合基因中表达；
(7)表达7拷贝的突变型Δ8去饱和酶基因，该基因来源于合成Δ8去饱和酶(来源于小眼虫Δ8去饱和酶并且其密码子经优化以在解脂耶氏酵母中表达)，在FBAINm::EgD8M::Pex20、EXP1::EgD8M::Pex16、GPDIN::EgD8M::Lip1、YAT1::EgD8M::Aco、和FBAIN::EgD8M::Lip1嵌合基因中表达；
(8)在FBAIN::EgD5::Aco嵌合基因中表达1拷贝的小眼虫Δ5去饱和酶；
(9)表达3拷贝的合成Δ5去饱和酶基因(其密码子经优化以在解脂耶氏酵母)，该基因来源于小眼虫Δ5去饱和酶，在EXP1::EgD5S::Pex20、YAT1::RD5S::OCT、YAT1::EgD5S::Aco和EXP1::EgD5S::Aco嵌合基因中表达；
(10)表达1拷贝的合成Δ5去饱和酶基因(其密码子经优化以在解脂耶氏酵母中表达)，该基因来源于多甲藻属CCMP626Δ5去饱和酶，在YAT1::RD5S::OCT嵌合基因中表达；
(11)在EXP1::PaD17::Pex16和FBAINm::PaD17::Aco嵌合基因中表达2拷贝的瓜果腐霉菌(Pythium aphanidermatum)Δ17去饱和酶；
(12)在YAT1::PaD17S::Lip1嵌合基因中表达1拷贝的合成Δ17去饱和酶基因(其密码子经优化以在解脂耶氏酵母中表达)，该基因来源于瓜果腐霉菌(Pythium aphanidermatum)Δ17去饱和酶；
(13)在YAT1::YlCPT1::Aco和GPD::YlCPT1::Aco嵌合基因中表达2拷贝的解脂耶氏酵母二酰基甘油胆碱磷酸转移酶；
(14)中断天然解脂耶氏酵母基因，该基因编码过氧化物酶体生物合成因子10蛋白(PEX10)；
(15)中断天然解脂耶氏酵母基因，该基因编码SCP2(YALI0E01298g；GenBank保藏号XM_503410)；
(16)中断天然解脂耶氏酵母基因，该基因编码YALI0C18711g(GenBank保藏号XP_501987)；以及，
(17)中断天然解脂耶氏酵母基因，该基因编码YALI0F24167g(GenBank保藏号XM_505819)。
因此，描述了具有以下按总脂肪酸重量％计的脂肪酸浓度的微生物油：
a)约48％至约55％EPA；
b)约1.5％至约3.0％ETA；
c)约0.1％至0.7％ARA；
d)约1.0％至约2.5％DGLA；
e)约2.0％至约3.5％EDA；
f)约2.0％至约3.0％ALA；
g)约17.0％至约20.0％亚油酸(18:2)；
h)约3.5％至约6.5％油酸(18:1)；
i)约1.0％至约2.0％硬脂酸(18:0)；
j)约0.5％至约3.5％棕榈油酸(16:1)；和
k)约2.5％至约4.5％棕榈酸(16:0)。
在另一个实施方案中，提供本文的微生物油，其中所述油具有以下按总脂肪酸重量％计的脂肪酸浓度：
a)至少约43.3％EPA；
b)小于约23.6％LA(18:2)；和
c)小于约9.4％油酸(18:1)。
在较优选的实施方案中，微生物油还包含按总脂肪酸重量％计小于约4.2％的EDA。
虽然申请人证明在这些特定重组解脂耶氏酵母菌株中生产按总脂肪酸重量％计多达55.6％的EPA，预期在宿主细胞中EPA的浓度能经由如本文所述的附加基因修饰被显著地改变。这可能导致EPA产量提高或包含EPA和至少一种其它ω-3和/或ω-6 PUFA的解脂耶氏酵母油产量提高。
此外基于本文所述的教导和结果，期望本领域的技术人员将认识到使用含油酵母作为生产平台合成多种ω-3和/或ω-6 PUFA的可行性和商业用途，该方法使用Δ9延伸酶Δ8去饱和酶途径。
实施例
在下面的实施例中将进一步限定本发明。应该理解，这些实施例尽管说明了本发明的优选实施方案，但仅是以例证的方式给出的。根据上面的论述和这些实施例，本领域的技术人员能确定本发明的基本特征，并在不脱离本发明的精神和范围的情况下，能够对本发明做出多种改变和修饰，以使其适用于多种用法和条件。
一般方法
实施例中使用的标准的重组DNA技术和分子克隆技术是本领域所熟知的并且在如下文献中有描述：
1)Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.Molecular Cloning：ALaboratory Manual；Cold Spring Harbor Laboratory：Cold Spring Harbor，NY(1989)(Maniatis)；2)T.J.Silhavy，M.L.Bennan和L.W.Enquist，Experiments with Gene Fusions；Cold Spring Harbor Laboratory：ColdSpring Harbor，NY(1984)；和3)Ausubel，F.M.等人，Current Protocolsin Molecular Biology，Greene Publishing Assoc.和Wiley-Interscience出版，Hoboken，NJ(1987)。
适用于微生物培养物的维持和生长的材料和方法是本领域熟知的。适用于下面实施例的技术可在Manual of Methods for GeneralBacteriology(Phillipp Gerhardt，R.G.E.Murray，Ralph N.Costilow，Eugene W.Nester，Willis A.Wood，Noel R.Krieg和G.Briggs Phillips编辑)，American Society for Microbiology：Washington，D.C.(1994))；或Thomas D.Brock in Biotechnology：A Textbook of IndustrialMicrobiology，第2版，Sinauer Associates：Sunderland，MA(1989)的描述中找到。用于生长和维持微生物细胞的所有试剂、限制性酶和材料得自Aldrich Chemicals(Milwaukee，WI)、DIFCO Laboratories(Detroit，MI)、New England Biolabs，Inc.(Beverly，MA)、GIBCO/BRL(Gaithersburg，MD)、或Sigma Chemical Company(St.Louis，MO)。通常于37℃下在Luria Bertani(LB)平板上培养大肠杆菌(E.coli)菌株。
一般的分子克隆根据标准方法(Sambrook等人，同上)来完成。通过Sigma-Genosys(Spring，TX)合成低聚核苷酸。单个PCR扩增反应在50μL总体积下进行，它包含：除非另外指明，PCR缓冲液(包含10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，20mM Tris-HCl(pH 8.75)，2mMMgSO4，0.1％Triton X-100)，100μg/mL BSA(终浓度)，200μm各种脱氧核苷酸三磷酸腺苷，10pmole各种引物和1μL Pfu DNA聚合酶(Stratagene，San Diego，CA)。定点诱变使用Stratagene′s QuickChangeTMSite-Directed Mutagenesis试剂盒，按照制造商的说明书进行。当PCR或定点诱变涉及亚克隆时，测序构建体以确认未将错配导入序列。将PCR产物克隆到Promega′s pGEM-T-easy载体(Madison，WI)中。
DNA序列是在ABI自动测序仪上采用染料终止剂技术(美国专利5,366,860；EP 272,007)使用载体和插入片段特异性引物的组合来产生的。序列编辑是在Sequencher(Gene Codes Corporation，Ann Arbor，MI)中进行的。所有序列在两个方向上覆盖至少两次。基因序列的比较是使用DNASTAR软件(DNA Star，Inc.)完成。作为另外一种选择，使用得自Genetics Computer Group Inc.(Wisconsin Package Version 9.0，Genetics Computer Group  (GCG)，Madison，WI)的程序包完成对遗传序列的操纵。GCG程序“Pileup”使用的空位形成预设值为12，而空位延伸预设值为4。GCG“Gap”或“Bestfit”程序使用的预设空位形成罚分为50，而预设空位延伸罚分为3。除非另外指明，在所有其他情况下使用GCG程序的预设参数。
BLAST(Basic Local Alignment Search Tool；Altschul，S.F.，等人，J.Mol.Biol.，215：403-410(1993)和Nucleic Acids Res.，25：3389-3402(1997))研究以确定与BLAST“nr”数据库(包含所有非丰余GenBankCDS的翻译序列，来源于3维结构Brookhaven Protein Data Bank、SWISS-PROT蛋白质序列数据库、EMBL和DDBJ数据库的序列)中含有的序列具有相似性的分离的序列。将序列在所有可读框内翻译并采用由NCBI提供的BLASTX算法(Gish，W.和States，D.J.，NatureGenetics，3：266-272(1993))，比较该序列与包含在“nr”数据库中的所有可公开获得的蛋白质序列的相似性。
根据百分比同一性、百分比相似性和期望值(expectation value)，报告了BLASTX比较的结果，该结果总结了与查询序列具有最大相似性的序列。“百分比同一性”定义为两种蛋白质之间相同的氨基酸的百分比。“百分比相似性”定义为两种蛋白质之间相同的或保守的氨基酸的百分比。“期望值”用给定分值估计限定匹配数的匹配的统计显著性，该匹配数是在完全偶然地搜索数据库中这种大小片段时所预期的。
缩写的含义如下：“sec”表示秒，“min”表示分钟，“h”表示小时，“d”表示天，“μL”表示微升，“mL”表示毫升，“L”表示升，“μM”表示微摩尔，“mM”表示毫摩尔，“M”表示摩尔，“mmol”表示毫摩尔，“μmole”表示微摩尔，“g”表示克，“μg”表示微克，“ng”表示纳克，“U”表示单位，“bp”表示碱基对，“kB”表示千碱基对，“DCW”表示干细胞重量，而“TFA”表示总脂肪酸。
表达盒的命名
表达盒的结构将通过简单的记号系统“X::Y::Z”表示，其中X描述启动子片段，Y描述基因片段而Z描述终止子片段，它们均彼此可操作地连接。
解脂耶氏酵母的转化和培养
解脂耶氏酵母菌株ATCC #20362购自美国典型培养物保藏中心(Rockville，MD)。解脂耶氏酵母菌株通常是在根据下面所示的配方的数种培养基中于28-30℃下培育。根据标准方法，按需要通过将20g/L琼脂添加到每种液体培养基中来制备琼脂平板。
YPD琼脂培养基(每升)：10g酵母提取物[Difco]，20g Bacto蛋白胨[Difco]，和20g葡萄糖。
基本培养基(MM)(每升)：20g葡萄糖，1.7g酵母氮源，无氨基酸，1.0g脯氨酸，pH6.1(不需要调节)。
基本培养基+尿嘧啶(MM+尿嘧啶或MMU)(每升)：如上制备MM培养基并加入0.1g尿嘧啶和0.1g尿苷。
基本培养基+尿嘧啶+磺酰脲类(MMU+SU)(每升)：如上制备MMU培养基并加入280mg磺酰脲类。
基本培养基+亮氨酸+亮氨酸(MMLeuLys)(每升)：如上制备MM培养基并添加0.1g亮氨酸和0.1g赖氨酸。
基本培养基+5-氟乳清酸(MM+5-FOA)(每升)：20g葡萄糖、6.7g酵母氮源、75mg尿嘧啶、75mg尿苷，并且基于对一系列从100mg/L至1000mg/L的浓度的FOA活性试验(因为供应商提供的每批料中会发生改变)，选用适量的FOA(Zymo Research Corp.，Orange，CA)。
高糖培养基(HGM)(每升)：80葡萄糖，2.58g KH2PO4和5.36gK2HPO4，pH7.5(不需要调节)。
无酵母提取物的发酵培养基(FM无YE)(每升)：6.70g/L酵母氮源，6.00g KH2PO4，2.00g K2HPO4，1.50g MgSO4*7H2O，和20g葡萄糖。
发酵培养基(FM)(每升)：如上制备无YE培养基的FM并加入5.00g酵母提取物(BBL)。
除非另外说明，否则解脂耶氏酵母的转化根据Chen，D.C.等人(Appl.Microbiol Biotechnol.，48(2)：232-235(1997))的方法完成。简而言之，将耶氏酵母划线到YPD平板上，并在30℃下生长大约18小时。从平板上刮掉几大环量的细胞并将其重悬浮于含有下面成分的1mL转化缓冲液中：2.25mL 50％PEG，平均分子量为3350；0.125mL 2M醋酸锂，pH6.0；以及0.125mL 2M DTT。然后，将大约500ng线性化的质粒DNA在100μl重悬浮的细胞中孵育，并将其在39℃下维持1小时，每间隔15分钟进行涡旋混合。将细胞铺在选择培养基平板上并在30℃下维持2至3天。
解脂耶氏酵母的脂肪酸分析
为了进行脂肪酸分析，将细胞通过离心收集并如Bligh，E.G.&Dyer，W.J.(Can.J.Biochem.Physiol.，37：911-917(1959))中所述提取脂质。通过将脂质提取物与甲醇钠进行酯交换反应而制备脂肪酸甲酯[“FAME”](Roughan，G.和Nishida I.，Arch Biochem Biophys.，276(1)：38-46(1990))并随后将其用配有30m×0.25mm(内径)HP-INNOWAX(Hewlett-Packard)柱的Hewlett-Packard 6890气相色谱仪(GC)进行分析。烘箱温度以3.5℃/分钟从170℃(保持25分钟)升到185℃。
为了进行直接的碱催化酯交换反应，收获耶氏酵母培养物(3mL)，在蒸馏水中洗涤一次，并在Speed-Vac中在真空下干燥5-10分钟。将甲醇钠(100μL，浓度为1％)加入样本中，然后将样本涡旋振荡20分钟。在加入3滴1M氯化钠和400μL己烷后，涡旋并离心样本。移出上层并如上所述用GC进行分析。
实施例1
产生解脂耶氏酵母菌株Y4086以通过Δ9延伸酶/A8去饱和酶途径 生产占总脂质约14％的EPA
本实施例描述了来源于解脂耶氏酵母ATCC #20362的菌株Y4086的构建，该菌株能通过Δ9延伸酶Δ8去饱和酶途径的表达生产相对于总脂质而言约14％的EPA(图3)。
菌株Y4086的产生需要构建菌株Y2224(由野生型耶氏酵母菌株ATCC #20362的Ura3基因的自主突变而产生的FOA抗性突变体)、菌株Y4001(产生17％EDA，具有Leu-表型)、菌株Y4001U(产生12％EDA，具有Leu-和Ura表型)、菌株Y4036(产生18％DGLA，具有Leu-表型)、菌株Y4036U(具有Leu-和Ura-表型)和菌株Y4070(产生12％ARA，具有Ura-表型)。关于构建菌株Y2224、Y4001、Y4001U、Y4036、Y4036U和Y4070的更多细节描述于PCT公开WO 2008/073367的实施例7中，该文献以引用方式并入本文。
相对于野生型解脂耶氏酵母ATCC #20362的菌株Y4070的最终基因型是Ura-、unknown 1-、unknown 3-、Leu+、Lys+、GPD::FmD12::Pex20、YAT1::FmD12::OCT、YAT1::ME3S::Pex16、GPAT::EgD9e::Lip2、EXP1::EgD9eS::Lip1、FBAINm::EgD9eS::Lip2、FBAINm::EgD8M::Pex20、EXP1::EgD8M::Pex16、FBAIN::EgD5::Aco、EXP1::EgD5S::Pex20、YAT1::RD5S::OCT。
产生菌株Y4086以生产占总脂质约14％的EPA
生成构建体pZP3-Pa777U(图5A；SEQ ID NO：127)以将三个Δ17去饱和酶基因整合到菌株Y4070的Pox3位点中(GenBank保藏号AJ001301)，从而能够生产EPA。pZP3-Pa777U质粒含有如下组分：
表9
描述质粒pZP3-Pa777U(SEQ ID NO：127)
  RE位点和核苷酸   片段和嵌合基因组分的描述
  在SEQ ID NO：127中
  AscI/BsiWI(3527-4297)   770bp的耶氏酵母Pox3基因(GenBank保藏号AJ001301)的5′部分
  PacI/SphI(1-827)   827bp的耶氏酵母Pox3基因(GenBank保藏号AJ001301)的3′部分
  ClaI/SwaWI(6624-4457)   YAT1::PaD17S::Lip1包含：·YAT1：解脂耶氏酵母YAT1启动子(图中标记为“YAT”；专利公布US 2006/0094102-A1)；·PaD17S：密码子优化的Δ17去饱和酶(SEQ ID NO：52)，来源于瓜果腐霉菌(Pythium aphanidermatum)(PCT公开WO 2008/054565)；·Lip1：来自耶氏酵母Lip1基因(GenBank保藏号Z50020)的Lip1终止子序列
  EcoRI/PmeI(8359-10611)   EXP1::PaD17::Pex16包含：·EXP1：解脂耶氏酵母输出蛋白(EXP1)启动子(在图中标记为“Exp”；PCT公开WO 2006/052870)；·PaD17：瓜果腐霉菌(Pythium aphanidermatum)Δ17去饱和酶基因(SEQ ID NO：50)(图中标记为“PaD17WT”；PCT公开WO2008/054565)；·Pex16：来自耶氏酵母Pex16基因(GenBank保藏号U75433)的Pex16终止子序列
  PmeI/PacI(10611-1)   FBAINm::PaD17::Aco包含：·FBAINm：解脂耶氏酵母FBAINm启动子(美国专利7,202,356)；·PaD17：瓜果腐霉菌(Pythium aphanidermatum)Δ17去饱和酶基因(SEQ ID NO：50)(图中标记为“PaD17WT”；PCT公开WO2008/054565)；·Aco：耶氏酵母Aco基因(GenBank保藏号AJ001300)的Aco终止子序列
  ClaI/EcoRI(6624-8359)   LoxP::Ura3::LoxP包含：·LoxP序列(SEQ ID NO：123)；·耶氏酵母Ura3基因(GenBank保藏号AJ306421)；·LoxP序列(SEQ ID NO：123)
将pZP3-Pa777U质粒用AscI/SphI消化，然后根据“一般方法”将其用于转化菌株Y4070。将转化细胞铺在MM平板上并在30℃下维持2至3天。然后将单菌落再次划线至MM平板上，随后将其在30℃下接种至液体MMLeuLys中并以250rpm/min摇动2天。离心收集细胞，提取脂质，通过酯交换反应来制备FAME，并随后用Hewlett-Packard6890GC进行分析。
GC分析显示，EPA存在于含有pZP3-Pa777U的3种嵌合基因的转化体中，但不存在于亲本Y4070菌株中。所选的96个菌株中大部分产生占总脂质约10-13％的EPA。有2个菌株(即#58和#79)产生了占总脂质约14.2％和13.8％的EPA。将这两个菌株分别命名为Y4085和Y4086。
相对于野生型10解脂耶氏酵母ATCC #20362的菌株Y4086的最终基因型是Ura3+、Leu+、Lys+、unknown 1-、unknown 2-、YALI0F24167g-、GPD::FmD12::Pex20、YAT1::FmD12::OCT、YAT1::ME3S::Pex16、GPAT::EgD9e::Lip2、EXP1::EgD9eS::Lip1、FBAINm::EgD9eS::Lip2、FBAINm::EgD8M::Pex20、EXP1::EgD8M::Pex16、FBAIN::EgD5::Aco、EXP1::EgD5S::Pex20、YAT1::RD5S::OCT、YAT1::PaD17S::Lip1、EXP1::PaD17::Pex16、FBAINm::PaD17::Aco。
实施例2
产生解脂耶氏酵母菌株Y4128以通过Δ9延伸酶Δ8去饱和酶途径 生产占总脂质约37％的EPA
本实施例描述来源于解脂耶氏酵母ATCC #20362的菌株Y4128的构建，该菌株能够占总脂约37.6％的EPA(即，以总脂肪酸相对于Y4086的百分比表示的EPA浓度有大于2倍的提高)。
菌株Y4128的产生需要构建菌株Y2224、Y4001、Y4001U、Y4036、Y4036U、Y4070和Y4086(如实施例1所述)，以及构建菌株Y4086U1(Ura-)。
产生菌株Y4086U1(Ura-)
菌株Y4086U1经由在菌株Y4086的构建体pY117中暂时表达Cre重组酶(图5B；SEQ ID NO：128；描述于PCT公开WO 2008/073367)制备Ura-表型。这从基因组释放出LoxP夹着的Ura3基因。突变的耶氏酵母属乙酰羟酸合酶(即，“AHAS”；E.C.4.1.3.18；GenBank保藏号XP_501277，包含W497L突变，如SEQ ID NO：121所示；参见PCT公开WO 2006/052870)在质粒pY117中，赋予其磺酰脲类抗除草剂性(SUR)，该抗性用作阳性筛选标记。
质粒pY117来源于质粒pY116(描述于PCT公开WO 2008/073367的实施例7中)，这通过将侧接PacI-SwaI位点的突变型AHAS基因插入用PacI-SwaI消化的pY116中从而用磺酰脲类标记置换LEU选择性标记完成。构建体pY117因此包含以下组分：
表10
描述质粒pY117(SEQ ID NO：128)
  SEQ ID NO：128内的RE位点和核苷酸   片段和嵌合基因组分的描述
  1328至448   ColE1质粒复制起点
  2258至1398   用于在大肠杆菌中选择的氨苄青霉素抗性基因(AmpR)
  2438-2838   大肠杆菌f1复制起点
  3157至4461   耶氏酵母自主复制序列(ARS18；GenBank保藏号Z17608)
  Pacl/Swal4504-7498   解脂耶氏酵母AHAS基因(GenBank保藏号XP_501277)，该基因包含W497L突变(SEQ ID NO：121；PCT公开WO2006/052870)
  Swal-Pmel7498-218   GPAT::Cre::XPR包含：·GPAT：解脂耶氏酵母GPAT启动子(美国专利4,264,949)；·Cre：重组酶蛋白的肠杆菌噬菌体P1 Cre基因(GenBank保藏号X03453)，除了一种碱基变化(T4G)，其导致一种氨基酸改变(S2A)而产生了Ncol位点以方便克隆；·XPR：耶氏酵母Xpr基因(GenBank保藏号M17741)的约100bp的3’区
根据“一般方法”将质粒pY117用于转化菌株Y4086。在转化后，将细胞置于MMU+SU(280μg/mL磺酰脲类；也称作氯嘧磺隆，E.I.duPont de Nemours & Co.，Inc.，Wilmington，DE)平板上并在30℃下保持2至3天。挑取在MMU+SU平板上生长的SUR单菌落，将其在30℃下划线至YPD液体培养基中并以250rpm/min摇动1天以清除pY117质粒。将生长培养基划线接种在MMU平板上。在30℃下保持两天后，将单克隆再划线接种在MM和MMU平板上。选择可以在MMU平板上生长但不在MM平板上生长的那些菌落。将这些菌株中具有Ura-表型的两个菌株命名为Y4086U1和Y4086U2。
产生菌株Y4128以生产占总脂质约37％的EPA
制备构建体pZP2-2988(图6A；SEQ ID NO：129)以将一种Δ12去饱和酶基因、两种Δ8去饱和酶基因和一种Δ9延伸酶基因整合到菌株Y4086U1的Pox2位点(GenBank保藏号AJ001300)中，从而在较高水平上生产EPA。pZP2-2988质粒含有如下组分：
表11
描述质粒pZP2-2988(SEQ ID NO：129)
  SEQ ID NO：129中的RE位点和核苷酸   片段和嵌合基因组分的描述
  AscI/BsiWI(3083-2273)   803bp的耶氏酵母Pox2基因(GenBank保藏号AJ001300)的5′部分
  PacI/SphI(6446-5791)   649bp的耶氏酵母Pox2基因(GenBank保藏号AJ001300)的3′部分
  PmeI/BsiWI(347-2273)   FBA::EgD9eS::Pex20包含：·FBA：解脂耶氏酵母FBA启动子(美国专利7,202,356)；·EgD9eS：密码子优化的Δ9延伸酶(SEQ ID NO：6)，该酶来源于小眼虫(PCT公开WO 2007/061742)；·Pex20：来自耶氏酵母Pex20基因(GenBank保藏号AF054613)的Pex20终止子序列
  ClaI/PmeI(13318-347)   GPM/FBAIN::FmD12S::OCT包含：·GPM/FBAIN：嵌合的解脂耶氏酵母GPM/FBAIN启动子(图中分别标记为“GPM”和“FBA内含子”)(美国专利公开7,202,356)；·FmD12S：密码子优化的Δ12去饱和酶(SEQ ID NO：56)，该酶来源于串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)，图中标记为“F.D12S”；PCT公开WO 2005/04785)；·OCT：耶氏酵母OCT基因(GenBank保藏号X69988)的OCT终止子序列
  Clal/EcoRI(13318-11581)   LoxP::Ura3::LoxP包含：·LoxP序列(SEQ ID NO：123)；·耶氏酵母Ura3基因(基因库编号AJ306421)；·LoxP序列(SEQ ID NO：123)
  EcoRII/Swal(11581-8884)   GPDIN::EgD8M::Lip1包含：·GPDIN：解脂耶氏酵母GPDIN启动子(专利公布US2006/0019297-A1)；·EgD8M：合成突变型Δ8去饱和酶(SEQ ID NO：22；专利公布US2008-0138868 A1)，它来源于小眼虫(“EgD8S”；美国专利公开7,256,033)；
  ·Lip1：来自耶氏酵母Lip1基因(GenBank保藏号Z50020)的Lip1终止子序列
  Swal/Pacl(8884-6446)   YAT1::EgD8M::ACO包含：·YAT1：解脂耶氏酵母YAT1启动子(图中标记为“YAT”；专利公布US 2006/0094 102-A1)；·EgD8M：合成突变型Δ8去饱和酶(SEQ ID NO：22；专利公布US2008-0138868 A1)，该酶来源于小眼虫(“EgD8S”：美国专利公开4,256,033)；·Aco：耶氏酵母Aco基因(GenBank保藏号AJ001300)的Aco终止子序列
将pZP2-2988质粒用AscI/SphI消化，然后根据“一般方法”将其用于转化菌株Y4086U1。将转化细胞铺在MM平板上并在30℃下维持2至3天。将单菌落再次划线至MM平板上，随后将其在30℃下接种至液体MMLeuLys中并以250rpm/min摇动2天。通过离心收集细胞，将其重悬浮于HGM中，然后以250rpm/min摇动5天。离心收集细胞，提取脂质，通过酯交换反应来制备FAME，并随后用Hewlett-Packard6890 GC进行分析。
GC分析显示大多数选择的96个菌株生产占总脂12-15.6％的EPA。有2个菌株(即，Group I中的#37和Group II中的#33)生产占总脂约37.6％和16.3％的EPA。将这两个菌株分别命名为Y4128和Y4129。
相对于野生型解脂耶氏酵母ATCC #20362的菌株Y4128的最终基因型是：YALI0F24167g-、PexIO-、unknown 1-、unknown 2-、GPD::FmD12::Pex20、YAT1::FmD12::OCT、GPM/FBAIN::FmD12S::OCT、YAT1::ME3S::Pex16、GPAT::EgD9e::Lip2、EXP1::EgD9eS::Lip1、FBAINm::EgD9eS::Lip2、FBA::EgD9eS::Pex20、FBAINm::EgD8M::Pex20、EXP1::EgD8M::Pex16、GPDIN::EgD8M::Lip1、YAT1::EgD8M::Aco、FBAIN::EgD5::Aco、EXP1::EgD5S::Pex20、YAT1::RD5S::OCT、YAT1::PaD 17S::Lip1、EXP1::PaD17::Pex16、FBAINm::PaD17::Aco。在2007年8月23日将解脂耶氏酵母菌株Y4128保藏于美国典型培养物保藏中心，并且命名为ATCC PTA-8614。
实施例3
产生优化的解脂耶氏酵母菌株Y4305以通过Δ9延伸酶A8去饱和 酶途径生产占总脂质大于53％的EPA
本实施例描述了来源于解脂耶氏酵母ATCC #20362的菌株Y4305的构建，该菌株能通过Δ9延伸酶Δ8去饱和酶途径的表达生产相对于总脂质大于53％的EPA(图3)。
菌株Y4305的产生需要构建菌株Y2224、菌株Y4001、菌株Y4001U、菌株Y4036、菌株Y4036U、Y4070和菌株Y4086(如上文实施例1所述)、菌株Y4086U1和Y4128(如上文实施例2所述)、以及菌株Y4128U3(Ura-)、Y4217(生产占总脂质42％的EPA)、Y4217U2(lira-)、Y4259(生产占总脂质46.5％的EPA)和Y4259U2(lira-)。
产生Y4128U菌株
为了中断菌株Y4128中的Ura3基因，制备构建体pZKUE3S(图6B；SEQ ID NO：130)以将EXP1::ME3S::Pex20嵌合基因整合到菌株Y4128的Ura3基因中。质粒pZKUE3S包含以下组分：
表12
描述质粒pZKUE3S(SEQ ID NO：130)
  SEQ ID NO：130中的RE位点和核苷酸   片段和嵌合基因组分的描述
  BsiWI/PacI(318-1038)   721bp的耶氏酵母Ura3基因(GenBank登陆号AJ306421)的5′部分
  SphI/PmeI(3915-4594)   729bp的耶氏酵母Ura3基因(GenBank登陆号AJ306421)的3′部分
  EcoRI/BsiWI(4628-318)   EXP1::ME3S::Pex20包含：·EXP1：解脂耶氏酵母输出蛋白(EXP1)启动子(在图中标记为“Exp”；PCT公开WO 2006/052870)；·ME3S：源于高山被孢霉的经密码子最优化的C16/18延伸酶基因(SEQ ID NO：60)(PCT公布WO 2007/046817)；·Pex20：耶氏酵母Pex20基因(GenBank保藏号AF054613)的Pex20终止子序列
  2149-1269   ColEI质粒复制起点
  3079-2219   用于在大肠杆菌中选择的氨苄青霉素抗性基因(AmpR)
  3659-3259   f1起点
将质粒pZKUE3S用SphI/PacI消化，然后根据“一般方法”将其用于转化菌株Y4128。转化后，将细胞铺至MM+5-FOA选择平板上并在30℃下维持2至3天。
挑取在MM+5-FOA选择平板上生长的总共24个转化子，并且再次划线接种到新MM+5-FOA平板上。从板上剥离细胞，提取脂质，通过酯交换反应来制备FAME，并随后用Hewlett-Packard 6890 GC进行分析。
GC分析显示来自平板的具有pZKUE3S的所有转化子中存在占总脂质10-15％的EPA。鉴定为#3、#4、#10、#12、#19和#21的菌株分别生产占总脂12.9％、14.4％、15.2％、15.4％、14％和10.9％的EPA，将它们分别命名为Y4128U1、Y4128U2、Y4128U3、Y4128U4、Y4128U5和Y4128U6(统称为Y4128U)。
Y4128(37.6％)对Y4128U(平均13.8％，如实施例2所述)％EPA定量差异是因为不同的生长条件。具体地讲，前者的培养基在液体培养基中生长两天后进行分析，而后者的培养基在琼脂平板上生长后进行分析。申请人已经观察到当比较琼脂平板与液体培养基中的结果时，总脂质中的％EPA提高了2-3倍。因此，虽然不能直接比较结果，Y4128和Y4128U菌株证明都产生高水平的EPA。
产生菌株Y4217以生产占总脂质约42％的EPA
制备构建体pZKL2-5U89GC(图7A；SEQ ID NO：131)以将一种Δ9延伸酶基因、一种Δ8去饱和酶基因、一种Δ5去饱和酶基因和一种解脂耶氏酵母二酰基甘油胆碱磷酸转移酶基因(CPT1)整合到菌株Y4128U3的Lip2位点(GenBank保藏号AJ012632)中，从而在较高水平上生产EPA。pZKL2-5U89GC质粒含有如下组分：
表13
描述质粒pZKL2-5U89GC(SEQ ID NO：131)
  SEQ ID NO：131中的RE位点和核苷酸   片段和嵌合基因组分的描述
  AscI/BsiWI(730-1)   722bp的耶氏酵母Lip2基因5′部分(图中标记为“Lip2.5N”；GenBank保藏号AJ012632)
  PacI/SphI(4141-3438)   697bp的耶氏酵母Lip2基因3′部分(图中标记为“Lip2.3N”；GenBank保藏号AJ012632)
  SwaI/BsiWI(13382-1)   YAT1::YlCPT1::Aco包含：·YAT1：解脂耶氏酵母YAT1启动子(图中标记为“YAT”；专利公布US 2006/0094102-A1)；·YlCPT1：解脂耶氏酵母二酰基甘油胆碱磷酸转移酶基因(SEq ID NO：68)(图中标记为“CPT1”；PCT公开WO2006/052870)；·Aco：耶氏酵母Aco基因(GenBank保藏号AJ001300)的Aco终止子序列
  PmeI/SwaI(10745-13382)   FBAIN::EgD8M::Lip1，它包含：·FBAIN：解脂耶氏酵母FBAIN启动子(美国专利公开7,202,356)；·EgD8M：合成突变型Δ8去饱和酶(SEQ ID NO：22)(图中标记为“D8S-23”；专利公布US 2008-0138868 A1)，该酶来源于小眼虫(“EgD8S”；美国专利公开7,256,033)；·Lip1：来自耶氏酵母Lip1基因(GenBank保藏号Z50020)的Lip1终止子序列
  PmeI/ClaI(10745-8650)   GPD::EgD9eS::Lip2包含：·GPD：解脂耶氏酵母GPD启动子(图中标记为“GPD Pro”；美国专利公开7,259,255)；·EgD9eS：密码子优化的D9延伸酶基因(SEQ ID NO：6)，该基因来源于小眼虫(图中标记为“EgD9ES”；PCT公开WO 2007/061742)；·Lip2：来自耶氏酵母Lip2基因(GenBank保藏号AJ012632)的Lip2终止子序列
  ClaI/EcoRI(8650-6581)   耶氏酵母Ura3基因(GenBank保藏号AJ306421)
  EcoRI/PacI(6581-4141)   YAT1::EgDD5S::ACO包含：·YAT1：解脂耶氏酵母YAT1启动子(图中标记为“YAT”；专利公布US 2006/0094102-A1)；·EgD5S：密码子优化的Δ5去饱和酶(SEQ ID NO：36)，该酶来源于小眼虫(PCT公开WO 2007/136671)；·Aco：耶氏酵母Aco基因(GenBank保藏号AJ001300)的Aco终止子序列
将pZKL2-5U89GC质粒用AscI/SphI消化，然后根据“一般方法”将其用于转化菌株Y4128U3。将转化细胞铺在MM平板上并在30℃下维持4至3天。将单菌落再次划线至MM平板上，随后将其在30℃下接种至液体MM中并以250rpm/min摇动2天。通过离心收集细胞，将其重悬浮于HGM中，然后以250rpm/min摇动5天。离心收集细胞，提取脂质，通过酯交换反应来制备FAME，并随后用Hewlett-Packard6890GC进行分析。
GC分析显示大多数选择的96个菌株生产占总脂32-39.9％的EPA。有6个菌株(即，第二组的#35、#38、#40、#71、#76和#81)产生了占总脂质约41.1％、41.8％、41.7％、41.1％、41％和41.1％的EPA。这六个菌株分别命名为Y4215、Y4216、Y4217、Y4218、Y4219和Y4220。
相对于野生型解脂耶氏酵母ATCC#20362的菌株Y4215、Y4216、Y4217、Y4218、Y4219和Y4220的最终基因型是：YALI0C18711g-、PexIO-、YALI0F24167g-、unknown 1-、unknown 3-、GPD::FmD12::Pex20、YAT1::FmD12::OCT、GPM/FBAIN::FmD12S::OCT、YAT1::ME3S::Pex16、EXP1::ME3S::Pex20、GPAT::EgD9e::Lip2、EXP1::EgD9eS::Lip1、FBAINm::EgD9eS::Lip2、FBA::EgD9eS::Pex20、GPD::EgD9eS::Lip2、FBAINm::EgD8M::Pex20、FBAIN::EgD8M::Lip1、EXP1::EgD8M::Pex16、GPDIN::EgD8M::Lip1、YAT 1::EgD8M::Aco、FBAIN::EgD5::Aco、EXP1::EgD5S::Pex20、YAT1::EgD5S::Aco、YAT1::RD5S::OCT、YAT1::PaD17S::Lip1、EXP1::PaD17::Pex16，FBAINm::PaD17::Aco、YAT1::YlCPT1::ACO。
生成菌株Y4217U2(Ura-)
为了中断菌株Y4217中的Ura3基因，使用构建体pZKUE3S(图6B；SEQ ID NO：130)以将EXP1::ME3S::Pex20嵌合基因整合到菌株Y4217的Ura3基因中。转化后，将细胞铺至MM+5-FOA选择平板上并在30℃下维持4至3天。
挑取在MM+5-FOA平板上生长的总共6个转化子，并且再次分别划线接种到MM平板和MM+5-FOA平板上。所有6个菌株具有Ura-表型(即，细胞能在MM+5-FOA平板上生长，但是不能在MM平板上生长)。从MM+5-FOA板上剥离细胞，提取脂质，通过酯交换反应来制备FAME，并随后用Hewlett-Packard 6890 GC进行分析。
GC分析显示在MM+5-FOA平板上生长的具有pZKUE3S的所有转化子中存在占总脂质18.7％至28.6％的EPA。将生产占总脂质22.5％和28.6％的EPA的两个菌株(即，#4和#5)分别命名为菌株Y4217U1和Y4217U2。
产生菌株Y4259以生产占总脂质约46.5％的EPA
制备构建体pZKL1-2SP98C(图7B；SEQ ID NO：132)以将一种Δ9延伸酶基因、一种Δ8去饱和酶基因、一种Δ12去饱和酶基因和一种解脂耶氏酵母二酰基甘油胆碱磷酸转移酶基因(CPT1)整合到菌株Y4217U2的Lip1位点(GenBank保藏号Z50020)中，从而在较高水平上生产EPA。pZKL1-2SP98C质粒含有如下组分：
表14
描述质粒pZKL1-2SP98C(SEQ ID NO：132)
  SEQ ID NO：132中的RE位点和核苷酸   片段和嵌合基因组分的描述
  AscI/BsiWI(3474-2658)   809bp的耶氏酵母Lip1基因5′部分(图中标记为“Lip1-5′N”；GenBank保藏号Z50020)
  PacI/SphI(6951-6182)   763bp的耶氏酵母Lip1基因3′部分(图中标记为“Lip1.3N”；GenBank保藏号Z50020)
  SwaI/BsiWI(1-2658)   GPD::YlCPT1::Aco包含：·GPD：解脂耶氏酵母GPD启动子(美国专利7,259,255)；·YlCPT1：解脂耶氏酵母二酰基甘油胆碱磷酸转移酶基因(SEq ID NO：68)(图中标记为“CPT1”；PCT公开WO2006/052870)；·Aco：耶氏酵母Aco基因(GenBank保藏号AJ001300)的Aco终止子序列
  PmeI/SwaI(13241-1)   FBAIN::EgD8M::Lip1，它包含：·FBAIN：解脂耶氏酵母FBAIN启动子(美国专利公开7,202,356)；·EgD8M：合成突变型Δ8去饱和酶(SEQ ID NO：22；专利公布US 2008-0138868 A1)，该酶来源于小眼虫(“EgD8S”：美国专利公开7,256,033)；·Lip1：来自耶氏酵母Lip1基因的Lip1终止子序列(GenBank保藏号Z50020)
  PmeI/ClaI(13241-11385)   YAT1::EgD9eS::Lip2包含：·YAT1：解脂耶氏酵母YAT1启动子(图中标记为“YAT”；专利公布US 2006/0094102-A1)；·EgD9eS：密码子优化的Δ9延伸酶基因(SEQ ID NO：6)，该基因来源于小眼虫(图中标记为“EgD9ES”；PCT公开WO 2007/061742)；·Lip2：来自耶氏酵母Lip2基因(GenBank保藏号AJ012632)的Lip2终止子序列
  ClaI/EcoRI(11385-9648)   LoxP::Ura3::LoxP，它包含：·LoxP序列(SEQ ID NO：123)；·耶氏酵母Ura3基因(GenBank保藏号AJ306421)；·LoxP序列(SEQ ID NO：123)
  EcoRI/PacI(9648-6951)   EXP1::FmD12S::ACO包含：·EXP1：解脂耶氏酵母输出蛋白(EXP1)启动子(在图中标记为“Exp”；PCT公开WO 2006/052870)；·FmD12S：密码子优化的Δ12延伸酶(SEQ ID NO：56)，该酶来源于串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)(图中标记为“FD12S”；PCT公开WO 2005/047485)；·Aco：耶氏酵母Aco基因(GenBank保藏号AJ001300)的Aco终止子序列
将pZKL1-2SP98C质粒用AscI/SphI消化，然后根据“一般方法”将其用于转化菌株Y4217U2。将转化细胞铺在MM平板上并在30℃下维持4至3天。将单菌落再次划线至MM平板上，随后将其在30℃下接种至液体MM中并以250rpm/min摇动2天。通过离心收集细胞，将其重悬浮于HGM中，然后以250rpm/min摇动5天。离心收集细胞，提取脂质，通过酯交换反应来制备FAME，并随后用Hewlett-Packard6890GC进行分析。
GC分析显示大多数选择的72个菌株生产占总脂40-44％的EPA。有6个菌株(即，#2、#4、#8、#9、#48和#58)产生了占总脂质约46.5％、44.5％、44.5％、44.8％、44.5％and 44.3％的EPA。这六个菌株分别命名为Y4259、Y4260、Y4261、Y4262、Y4263和Y4264。
相对于野生型解脂耶氏酵母ATCC #20362的菌株Y4259的最终基因型是：YALI0C18711g-、Pex10-、5 YALI0F24167g-、unknown 1-、unknown 3-、unknown 8-、GPD::FmD12::Pex20、YAT1::FmD12::OCT、GPM/FBAIN::FmD12S::OCT、EXP1::FmD12S::Aco、YAT1::ME3S::Pex16、EXP1::ME3S::Pex20(2 copies)、GPAT::EgD9e::Lip2、EXP1::EgD9eS::Lip1、FBAINm::EgD9eS::Lip2、FBA::EgD9eS::Pex20、GPD::EgD9eS::Lip2、YAT1::EgD9eS::Lip2、FBAINm::EgD8M::Pex20、FBAIN::EgD8M::Lip1(2 copies)、EXP1::EgD8M::Pex16、GPDIN::EgD8M::Lip1、YAT1::EgD8M::Aco、FBAIN::EgD5::Aco、EXP1::EgD5S::Pex20、YAT1::EgD5S::Aco、YAT1::RD5S::OCT、YAT1::PaD17S::Lip1、EXP1::PaD17::Pex16、FBAINm::PaD17::Aco、YAT1::YlCPT1::ACO、15GPD::YlCPT1::ACO。
生成菌株Y4259U2(Ura-)
为了中断菌株Y4259中的Ura3基因，使用构建体pZKUM(图8A；SEQ ID NO：133)以将Ura3突变基因整合到菌株Y4259的Ura3基因中。质粒pZKUM包含以下组分：
表15
描述质粒pZKUM(SEQ ID NO：133)
  SEQ ID NO：133中的RE位点和核苷酸   片段和嵌合基因组分的描述
  SalI/PacI(32845-1)   合成突变型Ura3基因(SEQ ID NO：134，其中1459bp的DNA片段包含对耶氏酵母Ura3编码区域(GenBank登陆号AJ306421)从+21至+53的33bp删除、+376的1bp删除、和从+400至+403的3bp删除)
  1112-232   ColE1质粒复制起点
  2042-1182   用于在大肠杆菌中选择的氨苄青霉素抗性基因(AmpR)
挑取在MM+5-FOA平板上生长的总共3个转化子，并且再次分别划线接种到MM平板和MM+5-FOA平板上。所有3个菌株具有Ura-表型(即，细胞能在MM+5-FOA平板上生长，但是不能在MM平板上生长)。从MM+5-FOA板上剥离细胞，提取脂质，通过酯交换反应来制备FAME，并随后用Hewlett-Packard 6890 GC进行分析。
GC分析显示在MM+5-FOA平板上生长的pZKUM转化子#1、#2和#3中存在占总脂质31.4％，31％和31.3％的EPA。这三个菌株分别命名为菌株Y4259U1、Y4259U2和Y4259U3(统称为Y4259U)。
产生菌株Y4305以生产占总脂质大于53％的EPA
制备构建体pZKD2-5U89A2(图8B；SEQ ID NO：135)以将一种Δ9延伸酶基因、一种Δ5去饱和酶基因、一种Δ8去饱和酶基因和一种Δ12去饱和酶基因整合到菌株Y4259U2的二酰基甘油酰基转移酶(DGAT2)位点中，从而在较高水平上生产EPA。pZKD2-5U89A2质粒含有如下组分：
表16
描述质粒pZKD2-5U89A2(SEQ ID NO：135)
  SEQ ID NO：135中的RE位点和核苷酸   片段和嵌合基因组分的描述
  AscI/BsiWI(1-736)   728bp的耶氏酵母DGAT2基因5′部分(SEQ ID NO：93)(图中标记为“YLDGAT5′”；美国专利公开7,267,976)
  PacI/SphI(4164-3444)   714bp的耶氏酵母DGAT2基因3′部分(SEQ ID NO：93)(图中标记为“YLDGAT3′”；美国专利公开7,267,976)
  SwaI/BsiWI(13377-1)   YAT1::FmD12S::Lip2，它包含：·YAT1：解脂耶氏酵母YAT1启动子(图中标记为“YAT”；专利公布US 2006/0094102-A1)；·FmD12S：密码子优化的Δ12延伸酶(SEQ ID NO：56)，该酶来源于串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)(图中标记为“F.D12S”；PCT公开WO 2005/047485)；·Lip2：来自耶氏酵母Lip2基因(GenBank保藏号AJ012632)的Lip2终止子序列
  PmeI/SwaI(10740-13377)   FBAIN::EgD8M::Lip1，它包含：·FBAIN：解脂耶氏酵母FBAIN启动子(美国专利公开7,202,356)；·EgD8M：合成突变型Δ8去饱和酶(SEQ ID NO：22；专利公布US2008-0138868 A1)，该酶来源于小眼虫(“EgD8S”：美国专利公开7,256,033)；·Lip1：来自耶氏酵母Lip1基因(GenBank保藏号Z50020)的Lip1终止子序列
  ClaI/PmeI(8846-10740)   YAT1::E389D9eS::OCT，它包含：·YAT1：解脂耶氏酵母YAT1启动子(图中标记为“YAT”；专利公布US 2006/0094102-A1)；·E389D9eS：密码子优化的Δ9延伸酶(SEQ ID NO：10)，该酶来源于小型绿藻属CCMP389(图中标记为“D9ES-389”；PCT公开WO2007/061742)；
  ·OCT：耶氏酵母OCT基因(GenBank保藏号X69988)的OCT终止子序列
  ClaI/EcoRI(8846-6777)   耶氏酵母Ura3基因(GenBank保藏号AJ306421)
  EcoRI/PacI(6777-4164)   EXP1::EgD5S::ACO，它包含：·EXP1：解脂耶氏酵母输出蛋白(EXP1)启动子(在图中标记为“Exp”；PCT公开WO 2006/052870)；·EgD5S：密码子优化的Δ5去饱和酶(SEQ ID NO：36)，该酶来源于小眼虫(PCT公开WO 2007/136671)；·Aco：耶氏酵母Aco基因(GenBank保藏号AJ001300)的Aco终止子序列
将pZKD2-5U89A2质粒用AscI/SphI消化，然后根据“一般方法”将其用于转化菌株Y4259U2。将转化细胞铺在MM平板上并在30℃下维持4至3天。将单菌落再次划线至MM平板上，随后将其在30℃下接种至液体MM中并以250rpm/min摇动2天。通过离心收集细胞，将其重悬浮于HGM中，然后以250rpm/min摇动5天。离心收集细胞，提取脂质，通过酯交换反应来制备FAME，并随后用Hewlett-Packard6890GC进行分析。
GC分析显示大多数选择的96个菌株生产占总脂40-46％的EPA。有4个菌株(即，#12、#44、#56and#93)分别产生了占总脂质约53.2％、46.4％、46.8％和47.8％的EPA。这四个菌株分别命名为Y4305、Y4306、Y4307和Y4308。
相对于野生型解脂耶氏酵母ATCC #20362的菌株Y4305的最终基因型是SCP2-(YALI0E01298g)、YALI0C18711g-、Pex10-、YALI0F24167g-，unknown 1-、unknown 3-、unknown 8-、GPD::FmD12::Pex20、YAT1::FmD12::OCT、GPM/FBAIN::FmD12S::OCT、EXP1::FmD12S::Aco、YAT1::FmD12S::Lip2、YAT1::ME3S::Pex16、EXP1::ME3S::Pex20(3copies)、GPAT::EgD9e::Lip2、EXP1::EgD9eS::Lip1、FBAINm::EgD9eS::Lip2、FBA::EgD9eS::Pex20、GPD::EgD9eS::Lip2、YAT1::EgD9eS::Lip2、YAT1::E389D9eS::OCT、FBAINm::EgD8M::Pex20、FBAIN::EgD8M::Lip1(2个拷贝)、EXP1::EgD8M::Pex16、GPDIN::EgD8M::Lip1、YAT1::EgD8M::Aco、FBAIN::EgD5::Aco、EXP1::EgD5S::Pex20、YAT1::EgD5S::Aco、EXP1::EgD5S::ACO、YAT1::RD5S::OCT、YAT1::PaD 17S::Lip1、EXP1::PaD17::Pex16、FBAINm::PaD17::Aco、YAT1::YlCPT1::ACO、GPD::YlCPT1::ACO。
实施例4
测定解脂耶氏酵母菌株Y4128的总脂质含量
菌株Y4128生产的脂质总量和脂质中的每种脂肪酸的百分比通过GC分析进行测量。具体地讲，如一般方法所述，提取总脂，通过酯交换反应来制备FAME，并随后用Hewlett-Packard 6890 GC进行分析。
干细胞重量如下进行测定：从10mL培养物中经由离心收集细胞，用水洗涤细胞一次以移除残余培养基，在80℃真空炉中干燥细胞过夜，称量干细胞重量。样本中的FAME总量通过比较GC特征图中的所有峰面积与加入的已知量内部标准品C15:0脂肪酸的峰面积进行测定。
基于上述分析，测定菌株Y4086和Y4128的以干细胞重量百分比形式表示的脂质含量(DCW)和脂质组合物。菌株Y4128与菌株Y4086相比脂质含量降低(11.2TFA％DCW对28.6TFA％DCW)。相反地，菌株Y4128与菌株Y4086相比脂质中的EPA浓度提高，如下表17所示。将脂肪酸鉴定为18:0(硬脂酸)、18:1(油酸)、LA、ALA、EDA、DGLA、ETrA、ETA和EPA；脂肪酸组成表示为总脂肪酸的重量百分比(wt.％)(TFA)。
表17
在解脂耶氏酵母菌株Y4086和Y4128中的脂质组合物
样本 18:0 18:1 18:2[LA] 18:3(n-3)[ALA] 20:2[EDA]   20:3(n-6)[DGLA]   20:3(n-3)[ETrA]   20:4(n-3)[ETA] 20:5(n-3)[EPA]
  Y4086   4.6   26.8   28.0   6.9   7.6   0.9   4.9   2.0   9.8
  Y4128   1.8   6.7   19.6   1.8   4.2   3.4   1.5   6.0   42.8
细胞中的EPA含量以mg EPA/g干细胞形式表示，并且按照下式计算：(％EPA/脂质)*(％脂质/干细胞重量)*0.1，从菌株Y4086中的28mg EPA/g DCW提高到菌株Y4128中的47.9mg EPA/g DCW。
因此，表17中的结果显示与亲本菌株Y4086相比，菌株Y4128具有更低的总脂质含量(TFA％DCW)(11.2％对28.6％)，更高的EPA％TFA(42.8％对9.8％)，和更高的EPA％DCW(4.8％对2.8％)。此外，菌株Y4128的EPA相对于总PUFA的量提高了3.3倍(54％的PUFA[％TFA]对16.3％的PUFA[％TFA])，而C20PUFA相对于总PUFA的量提高了1.7倍(73％的PUFA[％TFA]对42％的PUFA[％TFA])。
实施例5
测定在解脂耶氏酵母菌株Y4128中的整合位点pZP2-2988发生 Pex10整合
菌株Y4128中的pZP2-2988基因组整合位点通过基因组步移法，使用来自Clontech(Palo Alto，CA)的Universal GenomeWalkerTM试剂盒，按照制造商推荐的规程进行测定。基因质粒序列，设计以下引物10用于基因组步移法：pZP-GW-5-1(SEQ ID NO：136)、pZP-GW-5-2(SEQ ID NO：137)、pZP-GW-5-3(SEQ ID NO：138)、pZP-GW-5-4(SEQID NO：139)、pZP-GW-3-1(SEQ ID NO：140)、pZP-GW-3-2(SEQ IDNO：141)、pZP-GW-3-3(SEQ ID NO：142)和pZP-GW-3-4(SEQ IDNO：143)。
使用Qiagen Miniprep试剂盒用改进规程从菌株Y4128中制备基因组DNA。从YPD培养基平板上刮除细胞并置于1.5mL微管中。将细胞沉淀物(100μL)用250μL缓冲液P1重悬，该缓冲液P1包含0.125Mβ-巯基乙醇和1mg/mL酵母裂解酶20T(MP Biomedicals，Inc.，Solon，OH)。细胞悬浮液在37℃培养30分钟。然后将缓冲液P2(250μL加到管中。在将管颠倒几次进行混合后，加入350μL缓冲液N3。然后将微管中的混合物在14,000rpm下离心5分钟。将上清液注入Qiagen小量制备离心柱中，离心1分钟。加入0.75mL缓冲液PE洗涤一次柱子，然后在14,000rpm下离心1分钟。在14,000rpm下再离心1分钟干燥该柱。通过加入50μL的缓冲液EB到柱中洗脱基因组DNA，允许静置1分钟并在14,000rpm下离心1分钟。
使用纯化的基因组DNA进行基因组步移法。按照GenomeWalker试剂盒的规程，用限制性酶DraI、EcoRV、PvuII和StuI分别消化DNA。就每次消化而言，反应混合物包含10μL 10X限制缓冲液，10μL适用的限制性酶和8μg基因组DNA，总体积为100μL。反应混合物在37℃下培养4小时。然后使用Qiagen PCR纯化试剂盒，严格按照制造商规程纯化经消化的DNA样本。DNA样本用16μL水洗脱。然后将纯化的经消化基因组DNA样本连接到基因组步移接头上(下文)。每个连接混合物包含1.9μL基因组步移接头，1.6μL 10X连接缓冲液，0.5μL T4DNA连接酶和4μL消化过的DNA。反应混合物在16℃下培养过夜。然后将72μL的50mM TrisHCl，1mM EDTA，pH7.5加到每个连接混合物中。
就5’末端基因组步移法而言，使用1μL的每个连接混合物作模板进行四个PCR反应。此外，每个反应混合物包含1μL的10μM引物pZP-GW-5-1(SEQ ID NO：136)，1μL的10μM试剂盒配送的GenomeWalker接头，41μL水，5μL 10X cDNA PCR反应缓冲液和1μL来自Clontech的Advantage cDNA聚合酶混合物。Genome Walker接头序列(SEQ ID NOs：144[顶链]和145[底链])显示如下：
5′-GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTCGACGGCCCGGGCTGGT-3′
                                    3′-H2N-CCCGACCA-5′
PCR条件如下：95℃1分钟，随后是30个95℃20秒和68℃3分钟的循环，最后在68℃延伸7分钟。将PCR产物每个进行1∶100的稀释，并且将1μL稀释PCR产物用作模板进行第二轮PCR。条件是完全相同的，不同的是pZP-GW-5-2(SEQ ID NO：137)置换pZP-GW-5-1(SEQ ID NO：136)。
就3’-末端基因组步移而言，如上文所述进行四个PCR反应，不同的是使用引物pZP-GW-3-1(SEQ ID NO：140)和巢式接头引物(SEQID NO：146)。PCR产物同样进行稀释并用作第二轮PCR的模板，使用pZP-GW-3-2(SEQ ID NO：141)置换pZP-GW-3-1(SEQ ID NO：140)。
通过凝胶电泳分析PCR产物。使用EcoRV消化的基因组DNA作模板和引物pZP-GW-3-2以及巢式接头引物，一种反应产物生成～1.6kB的片段。分离该片段，用Qiagen凝胶纯化试剂盒纯化并克隆到pCR2.1-TOPO中。序列分析显示该片段包括两部分：质粒pZP2-2988和耶氏酵母属来自染色体C的基因组DNA。它们在染色体C的核苷酸位点139826上接合。这位于Pex10基因的编码区内部(GenBank保藏号CAG81606)。
为了测定接合的5’末端，使用来自菌株Y4128的基因组DNA作模板以及引物Per10 F1(SEQ ID NO：147)和ZPGW-5-5(SEQ IDNO：148)进行PCR扩增。反应混合物包括1μL的每个均为20μM的引物，1μL基因组DNA，22μL水和25μL TaKaRa ExTaq 2X预混物(TaKaRa Bio Inc.，Otsu Shiga，Japan)。热循环仪条件是：94℃1分钟，然后为30个循环的94℃20秒、55℃20秒和72℃2分钟，随后在72℃进行7分钟最后的延伸反应。扩增了1.6kB的DNA片段并将其克隆到pCR2.1-TOPO中。序列分析显示它是一个嵌合片段，该片段位于耶氏酵母属来自染色体C的基因组DNA和pZP2-2988之间。接合位于染色体C的核苷酸位点139817。因此，染色体C的10个核苷酸的片段被来自菌株Y4128中的pZP2-2988(图6A)的AscI/SphI片段置换。因此，菌株Y4128中的Pex10缺少编码蛋白(SEQ ID NO：120)的最后32个氨基酸。
基于上述结论，实施例3中分离的Y4128U菌株(同上)后来将称为Δpex10菌株。为清楚起见，菌株Y4128U1等同于菌株Y4128U1(Δpex10)。
实施例6
在解脂耶氏酵母菌株Y4128U1(Δpex10)中的Pex10质粒表达
构建递送解脂耶氏酵母Pex10基因的三个质粒：1)pFBAIn-PEX10允许Pex10 ORF在FBAINm启动子控制下表达；和2)pPEX10-1和pPEX10-2允许在天然Pex10启动子控制下表达Pex10，虽然pPEX10-1使用较短版本(～500bp)的启动子而pPEX10-2使用较长版本(～900bp)的启动子。在构建这些表达质粒并转化后，测定Pex10质粒表达对解脂耶氏酵母菌株Y4128U1(Δpex10)总油和EPA水平的效应。删除Pex10导致细胞中以TFA百分比形式表示的EPA的量提高，但是以DCW百分比形式表示的总脂质的量降低。
构建pFBAIn-PEX10、pPEX10-1和pPEX10-2
为了构建pFBAIn-PEX10，使用引物Per10 F1(SEQ ID NO：147)和Per10 R(SEQ ID NO：149)，使用解脂耶氏酵母基因组DNA作模板扩增Pex 10基因的编码区。PCR反应混合物包含1μL的每个均为20μM的引物，1μL解脂耶氏酵母基因组DNA(～100ng)，25μL ExTaq2X预混物和22μL水。反应如下进行：94℃1分钟，然后为30个循环的94℃20秒、55℃20秒和72℃90秒，之后在72℃进行7分钟最终延伸反应。PCR产物是一个1168bp的DNA片段，它用Qiagen PCR纯化试剂盒进行纯化，用WcoI和WotI消化，并克隆到用相同的两种限制性酶消化的pFBAIn-MOD-1(SEQ ID NO：150；图9A)中。
8个单克隆进行序列分析，2个具有无错的正确Pex10序列。pFBAIn-PEX10(SEQ ID NO：151；图9B)组分在下表18中列出。
表18
质粒pFBAIn-PEX10(SEQ ID NO：151)的组分
  SEQ ID NO：151中的RE位点和核苷酸   片段和嵌合基因组分的描述
  SglII-SsiWI(6040-318)   FBAINm::Pex10::Pex20，它包含：·FBAINm：解脂耶氏酵母FBAINm启动子(美国专利7,202,356)；·Pex10：解脂耶氏酵母Pex10 ORF(GenBank保藏号AB036770，核苷酸1038-2171；SEQ ID NO：104)；·Pex20：来自耶氏酵母Pex20基因(GenBank保藏号AF054613)的Pex20终止子序列
  PacI-SglII(4530-6040)   耶氏酵母属URA3(GenBank保藏号AJ306421)
  (3123-4487)   耶氏酵母自主复制序列18(ARS18；GenBank保藏号A17608)
  (2464-2864)   f1复制起点
  (1424-2284)   用于在大肠杆菌中选择的氨苄青霉素抗性基因(AmpR)
  (474-1354)   ColEI质粒复制起点
为了构建pPEX10-1和pPEX10-2，设计并合成引物PEX10-R-BsiWI(SEQ ID NO：152)、PEX10-F1-SalI(SEQ ID NO：153)和PEX10-F2-SalI(SEQ ID NO：154)。使用基因组解脂耶氏酵母DNA和引物PEX10-R-BsiWI和PEX10-F1-SalI进行的PCR扩增生成一个1873bp的片段，该片段包含Pex10 ORF，Pex10基因的500bp的5’上游区域和215bp的3’下游区域，该基因的两端侧接SalI和SsiWI限制性位点。该片段用Qiagen PCR纯化试剂盒进行纯化，用SalI和SsiWI消化，并克隆到用相同的两种酶消化的pEXP-MOD-1(SEQ ID NO：155；图10A)中以生成pPEX10-1(SEQ ID NO：156；图12B)。质粒pEXP-MOD1类似于pFBAIn-MOD-1(SEQ ID NO：150；图9A)，不同的是后者的FBAINm启动子被EXP1启动子置换。表19列出pPEX10-1的组分。
表19
质粒pPEX10-1(SEQ ID NO：156)的组分
  SEQ ID NO：156中的RE位点和核苷酸   片段和嵌合基因组分的描述
  SalI-SsiWI(5705-1)   Pex10-5′::Pex10::Pex10-3′包含：·Pex10-5′：500bp的解脂耶氏酵母Pex10基因的5′启动子区(GenBank保藏号AB036770)；·Pex10：解脂耶氏酵母Pex10 ORF(GenBank保藏号AB036770，核苷酸1038-2171；SEQ ID NO：104)；·Pex10-3′：来自耶氏酵母属Pex10基因的215bp的Pex10终止子序列(GenBank保藏号AB036770)[注意图中的整个Pex10-5’::Pex10::Pex10-3’表达盒统一标记成“PEX10”]
  PacI-SalI(4216-5703)   耶氏酵母属URA3基因(GenBank保藏号AJ306421)
  (2806-4170)   耶氏酵母自主复制序列18(ARS18；GenBank保藏号M91600)(GenBank保藏号A17608)
  (2147-2547)   f1复制起点
  (1107-1967)   用于在大肠杆菌中选择的氨苄青霉素抗性基因(AmpR)
  (157-1037)   ColEI质粒复制起点
使用PEX10-R-BsiWI(SEQ ID NO：152)和PEX10-F2-SalI(SEQ IDNO：154)对解脂耶氏酵母基因组DNA进行PCR扩增生成一个2365bp的片段，该片段包含Pex10 ORF，Pex10基因的991bp的5’上游区域和215bp的3’下游区域，该基因的两端侧接SalI和SsiWI限制性位点。用Qiagen PCR纯化试剂盒纯化该片段，用SalI和SsiWI进行消化，然后将其克隆到进行了相似消化的pEXP-MOD-1中。这导致合成pPEX10-2(SEQ ID NO：157)，其构建类似于质粒pPEX10-1的构建(表19，同上)，除了在嵌合Pex10-5’::Pex10::Pex10-3’基因中有更长的Pex10-5’启动子。
在菌株Y4128U1(Δpex10)中表达Pex10
按照一般方法中的规程将质粒pFBAIN-MOD-1(对照；SEQ IDNO：150)、pFBAIn-PEX10(SEQ ID NO：151)、pPEX10-1(SEQ IDNO：156)和pPEX10-2(SEQ ID NO：157)转化到Y4128U1(Δpex10)中。将转化子置于MM平板上。递送上述质粒的总脂质含量和转化子的脂肪酸组合物如实施例4所述进行分析。
下表20显示以干细胞重量(TFA％DCW)百分比显示的脂质含量和脂质组合物。具体地讲，将脂肪酸鉴定为18:0(硬脂酸)、18:1(油酸)、LA、ALA、EDA、DGLA、ETrA、ETA和EPA；脂肪酸组成表示为总脂肪酸的重量百分比(wt.％)。
Figure GPA00001143582601271
表20中的结果显示在Y4128U1(Δpex10)中从天然解脂耶氏酵母Pex10启动子或从解脂耶氏酵母FBAINm启动子表达Pex10，将EPA百分比降低至Y4086的水平，同时提高总脂质含量(TFA％DCW)5到Y4086的水平(参见表17数据用于比较)。每克干细胞的EPA含量从对照样本中(即，递送pFBAIn-MOD-1的细胞)的63.2mg变成递送pFBAIn-PEX10的细胞中的31.5m g、递送pPEX10-1的细胞中的29mg以及递送pPEX10-2的细胞中的30.8mg。这些结果证明中断Pex10的环指结构域提高细胞中的EPA的量但降低细胞中的总脂质含量。
因此，表20的结果显示与具有对照质粒的Y4128U1(Δpex10)转化子相比，所有具有Pex10表达质粒的转化子显示更高的脂质含量(TFA％DCW)(＞27％对22.8％)，更低的EPA％TFA(ca.10.8％对27.7％)，和更低的EPA％DCW(＜3.1％对6.3％)。此外，具有对照质粒的菌株Y4128U1(Δpex10)转化子与那些具有Pex10表达质粒的转化子相比，EPA相对于总PUFA的量提高了2.5倍(44％的PUFA[％TFA]对17.5％(avg)的PUFA[％TFA])，C20PUFA相对于总PUFA的量提高了1.5倍(67％的PUFA[％TFA]对44％(avg)的PUFA[％TFA])。
实施例7
产生解脂耶氏酵母菌株Y4184U以生产EPA
解脂耶氏酵母菌株Y4184U用作实施例8中的宿主，下文菌株Y4184U来源于解脂耶氏酵母ATCC #20362，并且能够经由Δ9延伸酶/A8去饱和酶途径的表达生产相对于总脂质的高水平EPA。该菌株具有Ura-表型并且其构建如PCT公开WO 2008/073367的实施例7所述，该文献以引用方式并入本文。
然而概括地说，菌株Y4184U的产生需要构建菌株Y2224、菌株Y4001、菌株Y4001U、菌株Y4036、菌株Y4036U和菌株Y4069(如上文实施例1所述)。进一步产生菌株Y4184U(在图11B用图表表示)需要生成菌株Y4084、菌株Y4084U1、菌株Y4127(在2007年11月29日保藏于美国典型培养物保藏中心，保藏号ATCC PTA-8802)、菌株Y4127U2、菌株Y4158、菌株Y4158U1和菌株Y4184。
相对于野生型解脂耶氏酵母ATCC #20362的菌株Y4184(生产占总脂质31％的EPA)的最终基因型是unknown 1-、unknown 2-、unknown4-、unknown 5-、unknown 6-、unknown 7-、YAT1::ME3S::Pex16、EXP1::ME3S::Pex20(2拷贝)、GPAT::EgD9e::Lip2、FBAINm::EgD9eS::Lip2、EXP1::EgD9eS::Lip1、FBA::EgD9eS::Pex20、YAT1::EgD9eS::Lip2、GPD::EgD9eS::Lip2、GPDIN::EgD8M::Lip1、YAT 1::EgD8M::Aco、EXP1::EgD8M::Pex16、FBAINm::EgD8M::Pex20、FBAIN::EgD8M::Lip1(2拷贝)、GPM/FBAIN::FmD12S::Oct、EXP1::FmD12S::Aco、YAT1::FmD12::Oct、GPD::FmD 12::Pex20、EXP1::EgD5S::Pex20、YAT1::EgD5S::Aco、YAT1::Rd5S::Oct、FBAIN::EgD5::Aco、FBAINm::PaD17::Aco、EXP1::PaD17::Pex16、YAT1::PaD17S::Lip1、YAT1::YlCPT1::Aco、GPD::YlCPT1::Aco。
最后，为了中断菌株Y4184中的Ura3基因，制备构建体pZKUE3S(图6B；SEQ ID NO：130)以将EXP1::ME3S::Pex20嵌合基因整合到菌株Y4184的Ura3基因中以分别生成菌株Y4184U1(占总脂质11.2％的EPA)、Y4184U2(占总脂质10.6％的EPA)和Y4184U4(占总脂质15.5％的EPA)(统称为Y4184U)。
实施例8
解脂耶氏酵母菌株Y4184U4中的Pex10染色体删除提高EPA积聚 和总脂质含量
构建体pYPS161(图11B，SEQ ID NO：158)用于从生产EPA的耶氏酵母属菌株Y4184U4中敲除染色体Pex10基因(实施例7)。用Pex10敲除构建体转化解脂耶氏酵母菌株Y4184U4导致生成菌株Y4184(Δpex10)。测定并比较Pex10敲除对总油和EPA水平的效应。具体地讲，敲除Pex10导致细胞中EPA(％TFA和％DCW)百分比提高和总脂质含量提高。
构建体pYSP161
构建体pYPS161包含以下组分：
表21
质粒pYPS161(SEQ ID NO：158)的描述
  SEQ ID NO：158中的RE位点和核苷酸   片段和嵌合基因组分的描述
  AscI/BsiWI(1521-157)   耶氏酵母属Pex10基因的1364bp的Pex10敲除片段#1(GenBank保藏号AB036770)
  PacI/SphI(5519-4229)   耶氏酵母属Pex10基因的1290bp的Pex10敲除片段#2(GenBank保藏号AB036770)
  SalI/EcoRI(7170-5551)   耶氏酵母属URA3基因(GenBank保藏号AJ306421)
  2451-1571   ColEI质粒复制起点
  3369-2509   用于在大肠杆菌中选择的氨苄青霉素抗性基因(AmpR)
  3977-3577   f1复制起点
生成解脂耶氏酵母基因敲除菌株Y4184(ΔPex10)
用于转化解脂耶氏酵母菌株Y4184U4(实施例7)的如一般方法所述的标准规程使用Pex10敲除构建体pYPS161的纯化5.3kBAscI/SphI片段(同上)，并且还制备了细胞单独对照。在每个转化实验中有～200至250个菌落存在，然而在细胞单独平板上无菌落存在(每期望值)。
菌落PCR用于筛选具有Pex10删除的细胞。具体地讲，PCR反应使用MasterAmp Taq聚合酶(Epicentre Technologies，Madison，WI)，使用PCR引物Pex-10del1 3’.正向(SEQ ID NO：159)和Pex-10del2 5’.反向(SEQ ID NO：160)，按照标准20规程进行。PCR反应条件为94℃5分钟，然后30个循环的94℃30秒、60℃30秒和72℃2分钟，之后在72℃进行6分钟的最终延伸反应。该反应然后保持在4℃。如果Pex10基因敲除构建体在Pex10区域整合，期望生成长度为2.8KB的单一PCR产物。相反地，如果该菌株在除Pex10区域之外的染色体区域内整合Pex10基因敲除构建体，然后将生成两个PCR片段，即2.8kB和1.1kB的片段。在288个筛选的菌落中，大部分菌落具有在随机位点整合的Pex10基因敲除构建体。288个菌落中仅有一个菌落包含Pex10敲除。将该菌株命名为Y4184(Δpex10)。
评估解脂耶氏酵母菌株Y4184和Y4184(ΔPex10)的总油和EPA 产量
为了评估Pex10基因敲除对总脂质级分中的PUFA百分比和细胞中的总脂质含量的效应，菌株Y4184和Y4184(ΔPex10)在可比较的含油条件下生长。具体地讲，培养物在初始OD600为～0.1的情况下开始生长，在含有25mL发酵培养基(FM)或无酵母提取物(FM无YE)的FM培养基的250mL烧瓶中生长48小时。在50mL圆锥管中，以8000rpm离心10分钟收获细胞。弃去上清液，将细胞重悬于25mL HGM中并转移到新的250mL烧瓶中。细胞在30℃透气培养另外120小时。
为了测定干细胞重量(DCW)，处理来自5mL FM生长培养基和10mL无YE生长培养物的FM的细胞。培养的细胞在4300rpm下离心10分钟。使用10mL生理盐水重悬沉淀物并在相同条件下二次离心。然后用1mL无菌H20(第三次)重悬沉淀物，将其转移到预先称重的铝盘中。细胞在80℃真空炉中干燥过夜。测量细胞重量。
递送上述质粒的总脂质含量和转化子的脂肪酸组合物如实施例4所述进行分析。
DCW、总脂质含量(TFA％DCW)、总EPA％TFA、和EPA％DCW在下表25中显示。
表22
在解脂耶氏酵母菌株Y4184和Y4184中的脂质组合物(ΔPex10)
Figure GPA00001143582601311
表22中的结果显示敲除Y4184(ΔPex10)中的染色体Pex10基因与菌株Y4184中的EPA百分比和总油含量相比提高EPA百分比(％TFA和％DCW)并提高总油含量，菌株Y4184的天然Pex10p未被敲除。更具体地讲，在FM培养基中，EPA(％TFA)有约109％的提高，EPA产量(％DCW)有约216％的提高，总油量(TFA％DCW)有约49％的提高。在无YE的FM培养基中，EPA(％TFA)有约100％的提高，EPA产量(％DCW)有约205％的提高，总油量(TFA％DCW)有约50％的提高。
因此，表22中的结果显示与亲本菌株Y4184相比，Y4184(ΔPex10)菌株在FM培养基中具有更高的脂质含量(TFA％DCW)(17.6％对11.8％)，更高的EPA％TFA(43.2％对20.6％)，和更高的EPA％DCW(7.6％对2.4％)。同样的，与亲本菌株Y4184相比，Y4184(ΔPex10)菌株在无YE的FM培养基中具有更高的脂质含量(TFA％DCW)(13.2％％对8.8％)，更高的EPA％TFA(46.1％对23.2％)，和更高的EPA％DCW(6.1％对2.0％)。
本领域的技术人员能够容易地工程化合适的基因敲除构建体(类似于pYPS161)以使得替代染色体Pex敲除基因通过转化进入亲本解脂耶氏酵母菌株。优选的Pex基因将包括：Pex1p(GenBank保藏号CAG82178；SEQ ID NO：95)、Pex2p(GenBank保藏号CAG77647；SEQID NO：96)、Pex3p(GenBank保藏号CAG78565；SEQ ID NO：97)、Pex3Bp(GenBank保藏号CAG83356；SEQ ID NO：98)、Pex4p(GenBank保藏号CAG79130；SEQ ID NO：99)、Pex5p(GenBank保藏号CAG78803；SEQ ID NO：100)、Pex6p(GenBank保藏号CAG82306；SEQ ID NO：101)、Pex7p(GenBank保藏号CAG78389；SEQ IDNO：102)、Pex8p(GenBank保藏号CAG80447；SEQ ID NO：103)、Pex12p(GenBank保藏号CAG81532；SEQ ID NO：105)、Pex13p(GenBank保藏号CAG81789；SEQ ID NO：106)、Pex14p(GenBank保藏号CAG79323；SEQ ID NO：107)、Pex16p(GenBank保藏号CAG79622；SEQ ID NO：108)、Pex17p(GenBank保藏号CAG84025；SEQ IDNO：109)、Pex19p(GenBank保藏号AAK84827；SEQ ID NO：110)、Pex20p(GenBank保藏号CAG79226；SEQ ID NO：111)、Pex22p(GenBank保藏号15CAG77876；SEQ ID NO：112)和Pex26p(GenBank保藏号NC_006072，核苷酸117230-118387的反义翻译；SEQ IDNO：113)。
期望的是染色体中断Pex基因将导致与天然过氧化物酶体生物合成因子蛋白未被中断的真核生物相比，在总脂质级分和油级分中积聚的以总脂肪酸百分比形式表示的PUFA量增加，其中所述PUFA量可能是：1)以功能性PUFA生物合成途径所需终产品形式产生的PUFA，与以中间体或副产品形式(例如EPA)产生的PUFA相反，2)C20和C22PUFA，和/或3)总PUFA。优选的结果是与天然过氧化物酶体生物合成因子蛋白未被中断的真核生物相比，不但以总脂肪酸百分比表示的PUFA量提高，而且以干细胞重量百分比形式表示的PUFA量也提高。此外，PUFA量可能是：1)以功能性PUFA生物合成途径所需终产品形式产生的PUFA，与以中间体或副产品形式产生的PUFA相反，2)C20和C22PUFA，和/或3)总PUFA。在一些情况下，相对于未中断天然过氧化物酶体生物合成因子蛋白的真核生物，总脂质含量也将提高。
实施例9
测定解脂耶氏酵母菌株Y4305中的整合位点pZKD2-5U89A2、 pZP3-PA777U和pZKL2-5U89GC
解脂耶氏酵母菌株Y4305中的基因组整合位点pZKD2-5U89A2、pZP3-PA777U和pZKL2-5U89GC通过基因组步移法，使用来自Clontech的Universal GenomeWalkerTM试剂盒进行测定，该方法类似于实施例5所述的用于鉴定解脂耶氏酵母菌株Y4128中的整合位点pZP2-2988的方法。
基因组步移法鉴定pZKD2-5U89A2整合位点
基于pZKD2-5U89A2序列(SEQ ID NO：135)设计引物KL2-3-1(SEQ ID NO：161)和KD2-3-2(SEQ ID NO：162)以鉴定整合构建体3′-末端的整合位点(即，解脂耶氏酵母DGAT2基因[SEQ ID NO：93]的3′侧接区)。
使用Qiagen Miniprep试剂盒，用实施例5中所述的改进规程从菌株Y4305中制备基因组DNA。在分离基因组DNA后，依照实施例5的方法用DraI、EcoRV、PvuII和StuI进行限制性酶消化，随后进行纯化并连接到基因组步移法接头上(SEQ ID NO：144和145)。
就基因组步移法而言，使用1μL的每个连接混合物作模板进行四个PCR反应。此外，每个反应混合物包含1μL的10μm引物KL2-3-1(SEQ ID NO：161)，1μL的10μm试剂盒配送的接头引物(SEQ IDNO：144 and 145)，41μL水，5μL 10X cDNA PCR反应缓冲液和1μL来自Clontech的Advantage cDNA聚合酶混合物。PCR条件如下：95℃1分钟，随后是30个95℃20秒和68℃3分钟的循环，最后在68℃延伸7分钟。将PCR产物每个进行1∶100的稀释，并且将1μL稀释PCR产物用作模板进行第二轮PCR。条件是完全相同的，不同的是KD2-3-2(SEQ ID NO：162)置换KL2-3-1(SEQ ID NO：161)。
来自第二轮的PCR产物用凝胶电泳进行分析。一种反应产物包含一个～560bp的片段。将该片段用Qiagen凝胶纯化试剂盒分离、纯化，克隆进pCR2.1-TOPO(Invitrogen)中。序列分析显示该片段包括两部分：质粒pZKD2-5U89A2和一部分解脂耶氏酵母来自染色体E的基因组DNA。它们在染色体E的核苷酸位点150905上接合。这位于SCP2基因的编码区内部(SEQ ID NO：87；GenBank保藏号XM_503410)。
为了测定接合的5’末端，使用来自菌株Y4305的基因组DNA作模板以及引物SCP-5-2(SEQ ID NO：163)和KD2-5-3(SEQ ID NO：164)进行PCR扩增。反应混合物包括1μL的每个均为20μM的引物，1μL基因组DNA，22μL水和25μL TaKaRa ExTaq 2X预混物(TaKaRaBio.Inc.，Shiga，Japan)。热循环仪条件是：94℃1分钟，然后为30个循环的94℃20秒、55℃20秒和72℃1分钟，随后在72℃进行7分钟最后的延伸反应。扩增了～900kB的DNA片段并将其克隆到pCR2.1-TOPO中。
序列分析揭示存在一个844bp的嵌合片段(SEQ ID NO：173)，该片段包含：1)一部分来自染色体E的解脂耶氏酵母基因组DNA；2)长度为303个核苷酸的未知DNA片段(SEQ ID NO：174)，该片段与NCBI数据库中的任何已知序列无同源性；和3)来自pZKD2-5U89A2(SEQ ID NO：135)的AscI/SphI片段的5′末端。接合位于染色体E的核苷酸位点150901。因此，染色体E的三bp核苷酸的片段被未知DNA片段和来自菌株Y4305的pZD2-5U89A2的AscI/SphI片段置换。因此，SCP2基因在长度为129个氨基酸的蛋白的密码子71后被中断。所得截短的SCP2 ORF在C末端缺少58个密码子。
基因组步移法鉴定pZP3-PA777U整合位点
为pZP3-PA777U设计以下引物：79-5-POX-1(SEQ ID NO：165)和79-5-POX-2(SEQ ID NO：166)。在pZKD2-5U89A2的情况下使用如上所述的相同一组Y4305基因组DNA连接混合物进行用于5′插入接合的基因组步移法，该方法使用相同的条件，不同的是：1)在第一轮PCR中引物79-5-POX-1置换KL2-3-1；和2)在第二轮PCR中引物79-POX-5-2置换KD2-3-2。～2350bp的片段获取自其中一种PCR反应(SEQ ID NO：175)。该片段进行测序并显示包含来自染色体F的解脂耶氏酵母基因组DNA，未知DNA的一个1729bp的片段(SEQ IDNO：176)，和来自pZP3-PA777U5′末端的DNA(SEQ ID NO：127)。插入接合位于染色体F上的核苷酸位点3159605。插入位点在ORFYALi0F24167g(SEQ ID NO：91)起始密码子上游154bp处，ORF与啤酒糖酵母ORF YOR313C(SPS4)弱相似，编码孢子形成特异蛋白。
3′末端接合通过PCR获得，使用引物4305ZP3-3-2(SEQ IDNO：167)和79-3-POX-3(SEQ ID NO：168)。反应混合物包括1μL的每个均为20μM的引物，1μL基因组DNA，22μL水和25μL TaKaRaExTaq 2X预混物(TaKaRa Bio.Inc.，Shiga，Japan)。热循环仪条件是：94℃1分钟，然后为30个循环的94℃20秒、55℃20秒和72℃1分钟，随后在72℃进行7分钟最后的延伸反应。扩增了～300kB的DNA片段并将其克隆到pCR2.1-TOPO中。
序列分析显示一个326bp的嵌合片段(SEQ ID NO：177)位于解脂耶氏酵母来自染色体F的基因组DNA和pZP3-PA777U(SEQ IDNO：127)之间。接合位于染色体F的核苷酸位点3159605。
基于5′和3′分析，将包含pZP3-PA777U的AscI/PacI片段和1729bp的未知DNA的DNA片段在位点3159605上插入染色体F，该位点在YALi0F24167g ORF(SEQ ID NO：91)上游154bp处。
基因组步移法鉴定pZKL2-5U89GC整合位点
设计以下因为用于pZKL2-5U89GC的基因组步移：KL2-5-2(SEQID NO：169)、KL2-5-3(SEQ ID NO：170)、KL2-3-2(SEQ ID NO：171)、和KL2-3-3(SEQ ID NO：172)。使用所述用于pZKD2-5U89A2的相同一组Y4305基因组DNA连接混合物进行用于5′插入接合的基因组步移法，该方法使用相同的条件，不同的是：1)在第一轮PCR中引物KL2-5-2置换KL2-3-1；和2)在第二轮PCR中引物KL2-5-3置换KD2-3-2。将来自其中一种反应产物的519bp的片段克隆到pCR2.1-TOPO中并测序。BLAST分析显示该519bp的片段(SEQ ID NO：178)包含来自解脂耶氏酵母染色体C和pZKL2-5U89GC的AscI/SphI片段5′末端的DNA。接合位于位点2568793。更具体地讲，将66bp的未知DNA(SEQID NO：179)插入染色体C和pZKL2-5U89GC(SEQ ID NO：131)之间。
用于3′插入接合的基因组步移法与用于5′插入接合的基因组步移法确切相同，不同的是：1)在第一轮PCR中引物KL2-3-2置换KL2-5-2；和2)在第二轮PCR中引物KL2-3-3置换KL2-5-3。将来自其中一种PCR产物的711bp的片段克隆到pCR2.1-TOPO中并测序。BLAST分析显示该711bp的片段(SEQ ID NO：180)包含来自解脂耶氏酵母染色体C和pZKL2-5U89GC的DNA。接合位于位点2568787。因此，将65bp的未知DNA(SEQ ID NO：181)插入染色体C和pZKL2-5U89GC之间。
基于5′和3′接合分析，将来自pZKL2-5U89GC的AscI/SphI片段插入解脂耶氏酵母染色体C。它置换染色体C介于2568787和2568793之间的5bp核苷酸片段。将六十六(66)bp的未知DNA插入位点2568793和pZKL2-5U89GC的AscI/SphI片段5′末端之间，并且将66bp的未知DNA插入位点2568787和pZKL2-5U89GC的AscI/SphI片段3′末端之间。该插入删除了ORF YALi0C18711g(SEQ ID NO：89)翻译起始密码子的第一种核苷酸′A′，该基因是啤酒糖酵母基因YLR050C的同源物。该插入因此破坏了起始密码子并将启动子区从无功能的ORF中分开。
实施例10
解脂耶氏酵母菌株Y4305的发酵
本实施例描述了解脂耶氏酵母菌株Y4305(实施例3)的2-L发酵，发酵时间历时162小时。每隔4至15小时监控脂质特征。EPA最多占在148小时后生产的总脂质55.6％，对应于12.1的EPA％DCW。
种子培养物：为了在摇瓶中制备种子培养物，将遗传工程菌株解脂耶氏酵母Y4305的解冻的冰冻甘油原液(0.1mL)转移到500mL摇瓶中，瓶中包含50mL复合培养基，它包含D-葡萄糖(20g/L)，无氨基酸的酵母氮源(3.4g/L)，KH2PO4(6.0g/L)，Na2HPO4′12H2O(3.3g/L)，MgSO4′7 H2O(1.5g/L)和盐酸噻胺(1.5mg/L)。将摇瓶培养物在30℃下培养48小时至600nm(OD600)的光密度为约2。
发酵：使用2升的Biostat
Figure GPA00001143582601361
 B发酵罐(B.Braun Biotech International，Germany)进行发酵实验。将上文的摇瓶种子培养物(50mL，OD600～2)转移到2升的Biostat
Figure GPA00001143582601371
 B发酵罐中开始发酵(t＝0小时)，发酵罐包含950mL新鲜发酵培养基。新鲜的发酵培养基包括酵母提取物(5.0g)，无氨基酸的酵母氮源(6.7g)，KH2PO4(6.0g)，Na2HPO412H2O(3.3g)，MgSO47 H2O(1.5g)，盐酸噻胺(1.5mg)，D-葡萄糖(50g)，痕量金属溶液(100X)(24mL)，和消泡剂204(0.2mL；Sigma Aldrich，St.Louis，MO)。痕量金属溶液(100X)包含柠檬酸(10g/L)、CaCl22 H2O(1.5g/L)、FeSO4 7H2O(10g/L)、ZnSO4 7H2O(0.39g/L)、CuSO4 5H2O(0.38g/L)、CoCl2 6H2O(0.20g/L)、和MnCl2 4H2O(0.30g/L)。通过将叶轮速度级联控制在80和1200rpm之间，将溶解氧的浓度(pO2)控制在零点以上。将通气速率控制在介于1.0L/min至2.0L/min之间。当葡萄糖在培养基中的浓度低于20g/L时，开始给料葡萄糖(600g/L)。在整个发酵过程中将葡萄糖浓度保持在20-60g/L范围内。
用于控制pH的酸是H3PO4(20％，w/v)。用于控制pH的碱在生长期是NH4OH(28％NH3，w/v)，然后在脂质生产期换成KOH(56％，w/v)。分别将温度控制在30-32℃，将pH值控制在5-7。
发酵实验运行162小时。每隔4-15小时采集发酵样本(10-20mL)测量细胞内脂质浓度、脂质特征、细胞光密度、干细胞重量(DCW)、葡萄糖浓度、主要阳离子、和有机15酸。按照一般方法将耶氏酵母细胞的细胞内脂质用甲醇和氯仿抽提出来，通过GC测定其浓度和特征。
结果：下表23显示在162小时的发酵期间，在15个时间点中的每个时间点上的每种单个脂肪酸的干细胞重量(DCW)、总脂质(TFA％DCW)和组合物，脂肪酸用％总20脂肪酸表示。
Figure GPA00001143582601381
因此，在89.9小时时的发酵结果显示生产了具有按％TFA计至少约43.3％的EPA、小于约23.6％的LA(18:2)和小于约9.4％的油酸(18:1)的微生物油。微生物油可附加地5包含按％TFA计小于约4.2％的EDA。
按％TFA计的总ω-3含量通过把ALA、ETrA、杜松烯酸(c/s-5，11，14，17-二十碳四烯酸，20:4)、ETA和EPA的％TFA相加进行测定。从89.9小时至162.1小时的发酵期间的ω-3含量按TFA百分比计大于50.7％，达到最高含量61％(147.8小时)。
同样地，在每个时间点上的EPA％DCW按下式计算：[(二十碳五烯酸％TFA)*(TFA％DCW)]/100。在发酵89.9小时时，EPA％DCW是9.35；在发酵期间所有其它后续时间点，EPA％DCW增高，最高水平为在137.9小时时的12.13EPA％DCW。
发酵领域的技术人员将了解取决于发酵运行本身、培养基条件、工艺参数、发酵规模等，以及其中进行培养物采样的特定时间点，特定耶氏酵母属菌株(例如Y4305)的含油特征将发生变化(如表23所示)。因此例如人们可以预想来自菌株Y4305的微生物油可包含至少约43％的EPA、小于约24％的LA(18:2)、小于约10％的油酸(18:1)、小于约4％的EDA、小于约2％的ETA、小于约1％的ARA、小于约4％的硬脂酸(18:0)和小于约4％的棕榈酸(16:0)，其中每种脂肪酸按％TFA计。

Claims (46)

1.用于生产二十碳五烯酸的重组耶氏酵母菌种生产宿主细胞，所述细胞包含：
a)至少一种编码Δ9延伸酶的基因，所述延伸酶具有选自SEQ IDNO：5、7、9、11、13、15和17的氨基酸序列；
b)至少一种编码Δ8去饱和酶的基因，所述去饱和酶具有选自SEQ ID NO：19、21、23、25、27、29、31和33的氨基酸序列；
并且
其中所述耶氏酵母菌种生产宿主细胞生产按所述生产宿主细胞中总脂肪酸重量％计至少约43.3重量％的二十碳五烯酸。
2.根据权利要求1的重组生产宿主，其中所述至少一种编码Δ9延伸酶的基因或所述至少一种编码Δ8去饱和酶的基因在解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)启动子的控制下。
3.根据权利要求2的重组生产宿主，其中所述解脂耶氏酵母启动子选自：GPD、GPDIN、GPM、GPM/FBAIN、FBA、FBAIN、FBAINm、GPAT、YAT1和EXP1。
4.根据权利要求1的重组生产宿主，其中所述至少一种编码Δ9延伸酶的基因或所述至少一种编码Δ8去饱和酶的基因在耶氏酵母终止子的控制下，所述终止子选自：Aco3、Pox3、Pex20、Pex16、Lip1、Lip2和OCT。
5.根据权利要求1的重组耶氏酵母菌种生产宿主细胞，其中所述至少一种编码Δ9延伸酶的基因有至少五个拷贝。
6.根据权利要求1的重组耶氏酵母菌种生产宿主细胞，其中所述至少一种编码Δ8去饱和酶的基因有至少五个拷贝。
7.用于生产包含二十碳五烯酸的微生物油的方法，所述方法包括：
a)培养权利要求1的生产宿主，其中生产包含二十碳五烯酸的微生物油；以及
b)任选地回收步骤(a)的微生物油。
8.具有按总脂肪酸的重量％计至少约25重量％的二十碳五烯酸的微生物油。
9.权利要求8的微生物油，所述微生物油具有按总脂肪酸的百分比计小于1重量％的γ-亚麻酸。
10.包含按总脂肪酸的重量％计至少约30重量％的二十碳五烯酸和小于约25重量％的亚油酸的微生物油。
11.包含按总脂肪酸的重量％计至少约50重量％的ω-3多不饱和脂肪酸的微生物油。
12.具有按总脂肪酸的重量％计的以下脂肪酸浓度的微生物油：
a)约48至约55重量％的二十碳五烯酸；
b)约1.5至约3.0重量％的二十碳四烯酸；
c)约0.1至0.7重量％的花生四烯酸；
d)约1.0至约2.5重量％的二高-γ-亚麻酸；
e)约2.0至约3.5重量％的二十碳二烯酸；
f)约2.0至约3.0重量％的α-亚麻酸；
g)约17.0至约20.0重量％的亚油酸(18:2)；
h)约3.5至约6.5重量％的油酸(18:1)；
i)约1.0至约2.0重量％的硬脂酸(18:0)；
j)约0.5至约3.5重量％的棕榈油酸(16:1)；和
k)约2.5至约4.5重量％的棕榈酸(16:0)。
13.具有按总脂肪酸的重量％计的以下脂肪酸浓度的微生物油：
a)至少约43.3重量％的二十碳五烯酸；
b)小于约23.6重量％的亚油酸(18:2)；和
c)小于约9.4重量％的油酸(18:1)。
14.权利要求13的微生物油，所述微生物油还包含按总脂肪酸的重量％计小于约4.2重量％的二十碳二烯酸。
15.油浓缩物，其来源于权利要求13的油。
16.权利要求15的油浓缩物，其中所述油包含按总脂肪酸的重量％计至少约60重量％的二十碳五烯酸。
17.权利要求15的油浓缩物，其中所述油包含按总脂肪酸的重量％计至少约70重量％的二十碳五烯酸。
18.权利要求15的油浓缩物，其中所述油包含按总脂肪酸的重量％计至少约80重量％的二十碳五烯酸。
19.权利要求15的油浓缩物，其中所述油包含按总脂肪酸的重量％计至少约90重量％的二十碳五烯酸。
20.包含权利要求13的油和附加量的脂肪酸的混合油，所述脂肪酸选自：亚油酸、γ-亚麻酸、二十碳二烯酸、二高-γ-亚油酸、花生四烯酸、二十二碳四烯酸、ω-6二十二碳五烯酸、α-亚麻酸、十八碳四烯酸、二十碳三烯酸、二十碳四烯酸、ω-3二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸。
21.包含权利要求15的油浓缩物和附加量的脂肪酸的混合油，所述脂肪酸选自：亚油酸、γ-亚麻酸、二十碳二烯酸、二高-γ-亚油酸、花生四烯酸、二十二碳四烯酸、ω-6二十二碳五烯酸、α-亚麻酸、十八碳四烯酸、二十碳三烯酸、二十碳四烯酸、ω-3二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸。
22.包含权利要求13的油或其衍生物的食品。
23.权利要求22的食品，所述食品选自食物类似物、功能性食物、医疗食物和医疗营养物质。
24.包含权利要求13的油或其衍生物的药物组合物。
25.包含权利要求13的油或其衍生物的婴儿代乳品。
26.包含权利要求13的油或其衍生物的饮食补充剂。
27.包含权利要求13的油或其衍生物的医疗食物。
28.包含权利要求13的油或其衍生物的动物饲料。
29.包含权利要求13的油的微生物生物质。
30.包含权利要求29的微生物生物质的动物饲料。
31.根据权利要求30的动物饲料，其中所述饲料是水产养殖饲料。
32.根据权利要求31的水产养殖饲料，其中所述饲料包含以下改良剂：
a)32-45％的蛋白，
b)4-28％的脂肪，
c)10-30％的碳水化合物，
d)1.0-2.5％的矿物质；和
e)1.0-2.5％的维生素。
33.根据权利要求32的水产养殖饲料，所述水产养殖饲料任选地包含选自下组的改良剂：
a)类胡萝卜素，
b)粘合剂，
c)防腐剂，
d)化学吸引剂；和
e)调味剂。
34.包含权利要求13的油或其衍生物的个人护理产品。
35.权利要求34的个人护理产品，其中所述产品是皮肤调理剂。
36.提供富含二十碳五烯酸的人类、动物或水产养殖生物饮食补充剂的方法，所述方法包括提供权利要求13的微生物油，所述微生物油包含可供人或动物消耗或使用形式的二十碳五烯酸。
37.治疗人或动物的临床状况的方法，所述方法包括向人或动物提供可消耗形式的权利要求13的油，其中所述临床状况被治疗。
38.根据权利要求37的方法，其中所述临床状况选自代谢疾病、神经行为状况、和炎性病症。
39.根据权利要求38的方法，其中所述临床状况选自：代谢综合症、非酒精性脂肪性肝炎、非酒精性脂肪性肝病、糖尿病前状况、冠心病、高血压、炎性病症、II型糖尿病、溃疡性结肠炎、克隆氏病、肠易激综合症、神经性厌食症、烧伤、骨关节炎、骨质疏松、血脂异常、resolvin相关的病症、阿尔茨海默病、注意力缺乏/多动症、抑郁症、双极情感障碍、精神分裂症、产后抑郁症、和绝经后失调。
40.用于改变人或动物中C-反应蛋白的血清水平的方法，所述方法包括向人或动物提供可消耗形式的权利要求13的油，其中改变了C-反应蛋白的含量。
41.权利要求13的油用于纠正临床状况的用途。
42.权利要求15的浓缩物用于纠正临床状况的用途。
43.权利要求20的混合油用于纠正临床状况的用途。
44.权利要求21的混合油用于纠正临床状况的用途。
45.用于治疗动物或人的二十碳五烯酸缺乏的方法，所述方法包括提供由权利要求30的方法生产的微生物油来治疗所述缺乏，所述微生物油包含可供人或动物消耗或使用形式的二十碳五烯酸。
46.如ATCC PTA-8802所示的耶氏酵母菌种生产宿主。
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