DE17825464T1 - Verfahren zur herstellung von fettalkoholen und derivaten davon in hefe - Google Patents
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Abstract
Ölhaltige Hefezelle, die in der Lage ist, einen ungesättigten Fettalkohol zu produzieren, wobei die Zelle:i) mindestens eine heterologe Desaturase exprimiert, die in der Lage ist, mindestens eine Doppelbindung in ein Fettsäure-Acyl-CoA einzuführen; undii) mindestens eine heterologe Fettsäure-Acyl-CoA-Reduktase exprimiert, die in der Lage ist, mindestens einen Teil des ungesättigten Fettsäure-Acyl-CoA in einen ungesättigten Fettalkohol umzuwandeln; undiii) eine Mutation, die zu einer verringerten Aktivität von Fao1 (SEQ ID NO: 22) führt, und eine Mutation aufweist, die zu einer verringerten Aktivität von mindestens einem aus Hfd1 (SEQ ID NO: 4), Hfd4 (SEQ ID NO: 6), Pex10 (SEQ ID NO: 8) und GPAT (SEQ ID NO: 10) führt, oder eine Mutation, die zu einer verringerten Aktivität von mindestens einem Protein führt, das eine Homologie von mindestens 90 % mit Fao1 (SEQ ID NO: 22) aufweist, und eine Mutation aufweist, die zu einer verringerten Aktivität von mindestens einem aus Hfd1 (SEQ ID NO: 4), Hfd4 (SEQ ID NO: 6), Pex10 (SEQ ID NO: 8) und GPAT (SEQ ID NO: 10) führt, wie etwa eine Homologie von mindestens 91 %, wie etwa eine Homologie von mindestens 92 %, wie etwa eine Homologie von mindestens 93 %, wie etwa eine Homologie von mindestens 94 %, wie etwa eine Homologie von mindestens 95 %, wie etwa eine Homologie von mindestens 96 %, wie etwa eine Homologie von mindestens 97 %, wie etwa eine Homologie von mindestens 98 %, wie etwa eine Homologie von mindestens 99 % mit Fao1 (SEQ ID NO: 22) und mindestens einem aus Hfd1 (SEQ ID NO: 4), Hfd4 (SEQ ID NO: 6), Pex10 (SEQ ID NO: 8) und GPAT (SEQ ID NO: 10), wobei die Zelle in der Lage ist, ungesättigte Fettalkohole mit einem Titer von mindestens 5 mg/l zu produzieren, wie etwa mindestens 10 mg/l, wie etwa mindestens 25 mg/l, wie etwa mindestens 50 mg/l, wie etwa mindestens 100 mg/l, wie etwa mindestens 250 mg/l, wie etwa mindestens 500 mg/l, wie etwa mindestens 1 g/l, wie etwa mindestens 2 g/l, wie etwa mindestens 3 g/l, wie etwa mindestens 4 g/l, wie etwa mindestens 5 g/l, wie etwa mindestens 6 g/l, wie etwa mindestens 7 g/l, wie etwa mindestens 8 g/l, wie etwa mindestens 9 g/l, wie etwa mindestens 10 g/l.
Claims (16)
- Ölhaltige Hefezelle, die in der Lage ist, einen ungesättigten Fettalkohol zu produzieren, wobei die Zelle: i) mindestens eine heterologe Desaturase exprimiert, die in der Lage ist, mindestens eine Doppelbindung in ein Fettsäure-Acyl-CoA einzuführen; und ii) mindestens eine heterologe Fettsäure-Acyl-CoA-Reduktase exprimiert, die in der Lage ist, mindestens einen Teil des ungesättigten Fettsäure-Acyl-CoA in einen ungesättigten Fettalkohol umzuwandeln; und iii) eine Mutation, die zu einer verringerten Aktivität von Fao1 (SEQ ID NO: 22) führt, und eine Mutation aufweist, die zu einer verringerten Aktivität von mindestens einem aus Hfd1 (SEQ ID NO: 4), Hfd4 (SEQ ID NO: 6), Pex10 (SEQ ID NO: 8) und GPAT (SEQ ID NO: 10) führt, oder eine Mutation, die zu einer verringerten Aktivität von mindestens einem Protein führt, das eine Homologie von mindestens 90 % mit Fao1 (SEQ ID NO: 22) aufweist, und eine Mutation aufweist, die zu einer verringerten Aktivität von mindestens einem aus Hfd1 (SEQ ID NO: 4), Hfd4 (SEQ ID NO: 6), Pex10 (SEQ ID NO: 8) und GPAT (SEQ ID NO: 10) führt, wie etwa eine Homologie von mindestens 91 %, wie etwa eine Homologie von mindestens 92 %, wie etwa eine Homologie von mindestens 93 %, wie etwa eine Homologie von mindestens 94 %, wie etwa eine Homologie von mindestens 95 %, wie etwa eine Homologie von mindestens 96 %, wie etwa eine Homologie von mindestens 97 %, wie etwa eine Homologie von mindestens 98 %, wie etwa eine Homologie von mindestens 99 % mit Fao1 (SEQ ID NO: 22) und mindestens einem aus Hfd1 (SEQ ID NO: 4), Hfd4 (SEQ ID NO: 6), Pex10 (SEQ ID NO: 8) und GPAT (SEQ ID NO: 10), wobei die Zelle in der Lage ist, ungesättigte Fettalkohole mit einem Titer von mindestens 5 mg/l zu produzieren, wie etwa mindestens 10 mg/l, wie etwa mindestens 25 mg/l, wie etwa mindestens 50 mg/l, wie etwa mindestens 100 mg/l, wie etwa mindestens 250 mg/l, wie etwa mindestens 500 mg/l, wie etwa mindestens 1 g/l, wie etwa mindestens 2 g/l, wie etwa mindestens 3 g/l, wie etwa mindestens 4 g/l, wie etwa mindestens 5 g/l, wie etwa mindestens 6 g/l, wie etwa mindestens 7 g/l, wie etwa mindestens 8 g/l, wie etwa mindestens 9 g/l, wie etwa mindestens 10 g/l.
- Hefezelle nach
Anspruch 1 , die eine Mutation, die zu einer verringerten Aktivität von Fao1 (SEQ ID NO: 22) oder einem Protein, das eine Homologie von mindestens 90 % damit aufweist, führt, und eine Mutation aufweist, die zu einer verringerten Aktivität von mindestens einem aus Hfd1 (SEQ ID NO: 4) und Pex10 (SEQ ID NO: 8) oder einem Protein, das eine Homologie von mindestens 90 % damit aufweist, führt. - Hefezelle nach einem der vorstehenden Ansprüche, die eine Mutation, die zu einer verringerten Aktivität von Fao1 (SEQ ID NO: 22) oder einem Protein, das eine Homologie von mindestens 90 % damit aufweist, führt, und eine Mutation aufweist, die zu einer verringerten Aktivität von Hfd1 (SEQ ID NO: 4), Hfd4 (SEQ ID NO: 6), Pex10 (SEQ ID NO: 8) und GPAT (SEQ ID NO: 10) oder Proteinen, die eine Homologie von mindestens 90 % damit aufweisen, führt.
- Hefezelle nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Hefe zu der Art Yarrowia gehört, wobei die Hefe vorzugsweise Yarrowia lipolytica ist.
- Hefezelle nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die mindestens eine heterologe Desaturase aus der Gruppe ausgewählt ist die aus einer Δ3-Desaturase, einer Δ5-Desaturase, einer Δ6-Desaturase, einer Δ7-Desaturase, einer Δ8-Desaturase, einer Δ9-Desaturase, einer Δ10-Desaturase, einer Δ11-Desaturase, einer Δ12-Desaturase, einer Δ13-Desaturase und einer Δ14-Desaturase besteht.
- Hefezelle nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Verringerung der Aktivität von Hfd1, Hfd4, Pex10 und Fao1 oder eines Proteins, das eine Homologie von mindestens 90 % damit aufweist, teilweise oder vollständig ist, und/oder wobei die Verringerung der Aktivität von GPAT oder eines Proteins, das eine Homologie von mindestens 90 % damit aufweist, teilweise ist.
- Hefezelle nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Desaturase von einem Organismus eines Insektes abgeleitet ist, wie etwa von der Ordnung Lepidoptera, wobei die Desaturase vorzugsweise eine Δ11-pesaturase ist, die eine Homologie von mindestens 60 % mit der Δ11-Desaturase von Amyelois transitella wie in SEQ ID NO: 2 aufweist, oder eine Δ9-Desaturase ist, die eine Homologie von mindestens 60 % mit der Δ9-Desaturase von Drosophila melanogaster wie in SEQ ID NO: 18 aufweist.
- Hefezelle nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die FAR ausgewählt ist aus: i) einer FAR, die eine Homologie von mindestens 80 % mit der FAR von Helicoverpa armigera wie in SEQ ID NO: 14 aufweist; ii) einer FAR, die eine Homologie von mindestens 80 % mit der FAR von Helicoverpa assulta wie in SEQ ID NO: 16 aufweist; iii) einer FAR, die eine Homologie von mindestens 80 % mit der FAR von Heliothis subflexa wie in SEQ ID NO: 12 aufweist; und iv) einer FAR, die eine Homologie von mindestens 80 % mit der FAR von Bicyclus anynana wie in SEQ ID NO: 24 aufweist.
- Hefezelle nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die FAR eine Homologie von mindestens 80 % mit der FAR von Helicoverpa armigera wie in SEQ ID NO: 14 oder mit der FAR von Heliothis subflexa wie in SEQ ID NO: 12 aufweist.
- Hefezelle nach einem der vorstehenden Ansprüche, ferner exprimierend eine Acetyltransferase, die in der Lage ist, mindestens einen Teil des ungesättigten Fettalkohols in ein ungesättigtes Fettsäure-Acyl-Acetat umzuwandeln.
- Hefezelle nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Zelle in der Lage ist, Fettalkohole mit einem Gesamttiter von mindestens 5 mg/l zu produzieren, wie etwa mindestens 10 mg/l, wie etwa mindestens 25 mg/l, wie etwa mindestens 50 mg/l, wie etwa mindestens 100 mg/l, wie etwa mindestens 250 mg/l, wie etwa mindestens 500 mg/l, wie etwa mindestens 1 g/l, wie etwa mindestens 2 g/l, wie etwa mindestens 3 g/l, wie etwa mindestens 4 g/l, wie etwa mindestens 5 g/l, wie etwa mindestens 6 g/l, wie etwa mindestens 7 g/l, wie etwa mindestens 8 g/l, wie etwa mindestens 9 g/l, wie etwa mindestens 10 g/l, wobei der Gesamttiter die Summe des Titers ungesättigter Fettalkohole und des Titers gesättigter Fettalkohole ist.
- Hefezelle nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Zelle in der Lage ist, (Z)11-C16:OH mit einem Titer von mindestens 0,5 mg/l zu produzieren, wie etwa mindestens 1 mg/l, wie etwa mindestens 5 mg/l, wie etwa mindestens 10 mg/l, wie etwa mindestens 25 mg/l, wie etwa mindestens 50 mg/l, wie etwa mindestens 100 mg/l, wie etwa mindestens 250 mg/l, wie etwa mindestens 500 mg/l, wie etwa mindestens 1 g/l, wie etwa mindestens 2 g/l, wie etwa mindestens 3 g/l, wie etwa mindestens 4 g/l, wie etwa mindestens 5 g/l, wie etwa mindestens 6 g/l, wie etwa mindestens 7 g/l, wie etwa mindestens 8 g/l, wie etwa mindestens 9 g/l, wie etwa mindestens 10 g/l (Z)11-C16:OH.
- Verfahren zum Produzieren eines ungesättigten Fettalkohols in einer ölhaltigen Hefezelle mit einem Titer von mindestens 5 mg/l, wobei das Verfahren die Schritte des Bereitstellens einer Hefezelle und des Inkubierens der Hefezelle in einem Medium umfasst, wobei die Hefezelle: i) mindestens eine heterologe Desaturase exprimiert, die in der Lage ist, mindestens eine Doppelbindung in ein Fettsäure-Acyl-CoA einzuführen, wodurch mindestens ein Teil des Fettsäure-Acyl-CoA in ein ungesättigtes Fettsäure-Acyl-CoA umgewandelt wird; und ii) mindestens eine heterologe Fettsäure-Acyl-CoA-Reduktase exprimiert, die in der Lage ist, mindestens einen Teil des ungesättigten Fettsäure-Acyl-CoA in einen ungesättigten Fettalkohol umzuwandeln, wodurch der ungesättigte Fettalkohol produziert wird; und iii) eine Mutation, die zu einer verringerten Aktivität von Fao1 (SEQ ID NO: 22) führt, und eine Mutation aufweist, die zu einer verringerten Aktivität von mindestens einem aus Hfd1 (SEQ ID NO: 4), Hfd4 (SEQ ID NO: 6), Pex10 (SEQ ID NO: 8) und GPAT (SEQ ID NO: 10) führt, oder eine Mutation, die zu einer verringerten Aktivität von mindestens einem Protein führt, das eine Homologie von mindestens 90 % mit Fao1 (SEQ ID NO: 22) aufweist, und eine Mutation aufweist, die zu einer verringerten Aktivität von mindestens einem aus Hfd1 (SEQ ID NO: 4), Hfd4 (SEQ ID NO: 6), Pex10 (SEQ ID NO: 8) und GPAT (SEQ ID NO: 10) führt, wie etwa eine Homologie von mindestens 90 %, wie etwa eine Homologie von mindestens 91 %, wie etwa eine Homologie von mindestens 92 %, wie etwa eine Homologie von mindestens 93 %, wie etwa eine Homologie von mindestens 94 %, wie etwa eine Homologie von mindestens 95 %, wie etwa eine Homologie von mindestens 96 %, wie etwa eine Homologie von mindestens 97 %, wie etwa eine Homologie von mindestens 98 %, wie etwa eine Homologie von mindestens 99 % mit Fao1 (SEQ ID NO: 22) und mindestens einem aus Hfd1 (SEQ ID NO: 4), Hfd4 (SEQ ID NO: 6), Pex10 (SEQ ID NO: 8) und GPAT (SEQ ID NO: 10) .
- Verfahren nach
Anspruch 13 , wobei die Hefezelle wie in einem derAnsprüche 1 bis12 definiert ist. - Nukleinsäurekonstrukt zum Modifizieren einer Hefezelle, wobei das Konstrukt Folgendes umfasst: i) ein erstes Polynucleotid, das mindestens eine heterologe Desaturase kodiert, die in der Lage ist, mindestens eine Doppelbindung in ein Fettsäure-Acyl-CoA einzuführen; und ii) ein zweites Polynucleotid, das mindestens eine heterologe Fettsäureacyl-CoA-Reductase (FAR) kodiert, die in der Lage ist, mindestens einen Teil des ungesättigten Fettsäure-Acyl-CoA in einen ungesättigten Fettalkohol umzuwandeln; und iii) zusätzliche Polynucleotide zum Verringern der Aktivität von mindestens einem aus Fao1 (SEQ ID NO: 22) oder von mindestens einem Protein, das eine Homologie von mindestens 90 % mit Fao1 (SEQ ID NO: 22) aufweist; vorzugsweise zum Verringern der Aktivität von mindestens Fao1 (SEQ ID NO: 22) oder einem Protein, das eine Homologie von mindestens 90 % damit aufweist, und zum Verringern der Aktivität von mindestens einem aus Hfd1 (SEQ ID NO: 4), Hfd4 (SEQ ID NO: 6), Pex10 (SEQ ID NO: 8) und GPAT (SEQ ID NO: 10) oder einem Protein, das eine Homologie von mindestens 90 % damit aufweist; wobei optional das erste Polynucleotid und/oder das zweite Polynucleotid und/oder die zusätzlichen Polynucleotide durch einen Promoter gesteuert wird/werden.
- Teilesatz, umfassend: a) die Hefezelle nach einem der
Ansprüche 1 bis12 und Gebrauchsanweisungen; und/oder b) ein Nukleinsäurekonstrukt nachAnspruch 15 , wobei das Konstrukt der Modifizierung einer Hefezelle dient, und c) optional die zu modifizierende Hefezelle.
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