CN110300799B - 在酵母中产生脂肪醇及其衍生物的方法 - Google Patents

在酵母中产生脂肪醇及其衍生物的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于产生脂肪醇及其衍生物、特别是去饱和脂肪醇、去饱和脂肪醇乙酸酯和去饱和脂肪醛的产油酵母细胞。还提供了用于获得可用于信息素组合物的此类化合物的方法。

Description

在酵母中产生脂肪醇及其衍生物的方法
技术领域
本发明涉及用于产生脂肪醇及其衍生物、特别是去饱和脂肪醇、去饱和脂肪醇乙酸酯和去饱和脂肪醛的产油酵母细胞。还提供了用于获得可用于信息素组合物的此类化合物的方法。
背景技术
脂肪醇是一组具有广泛应用的化学物质。脂肪醇通常是链长不同(C6-C26)的直链伯醇，并且可以带有饱和或不饱和的碳键。取决于上述特征，脂肪醇可以用作燃料、洗涤剂和表面活性剂、化妆品、昆虫害虫治理等等。
自从50多年前DDT出现以来，广谱神经毒性杀虫剂已经为防治农业和公共卫生项目中经济上重要的昆虫提供了主要手段。尽管合成杀虫剂的使用最初导致作物产量的显著增加和一些重要的人类和动物疾病媒介的抑制，但是昆虫害虫群体中杀虫剂抗性的发展和由杀虫剂引起的环境损害已经被广泛认为是它们的使用的严重弊端。与制造和使用杀虫剂相关的最显著的环境问题包括1)它们对非靶标生物(包括人类)的直接毒性；2)它们在它们可能积累并在高等生物中引起不幸的发育和生殖影响的生物圈中的持久性；3)与它们的制造和分销相关的显著点源污染；4)它们的全球分散。
信息素可以取代农药用作害虫防治。例如，已经发现(Z)19-14:OAc在单独施用(即没有其他信息素组分)时以86％的效率干扰秋粘虫的交配效率。信息素通过交配干扰来防治昆虫害虫的商业用途具有优于常规杀虫剂的若干优点。信息素：1)无毒且对环境无害；2)对一种靶标物种具有特异性，而不会不利地影响非靶标有益昆虫，使得它们非常适合用于综合害虫治理项目；并且3)不太可能(并且从未显示过)在靶标昆虫中产生抗性。与自然界中的信息素合成相反，当前用于商业生产信息素的方法采用传统的合成化学途径。因为信息素需要非常高的纯度来引发昆虫的反应，所以这些合成是昂贵且困难的，并且产生大量需要处理的有机废物。
因此，阻碍使用性信息素的主要障碍仍然是生产成本。因此，全球农业用地中很小一部分采用了信息素(估计低于0.05％)。预期从细胞工厂产生信息素将显著降低信息素的生产成本。
脂肪醇通常基于石油化学或天然原料以化学方式产生。已经采用一些方法使用可再生原料(例如像葡萄糖)在微生物(如大肠杆菌(Escherichia coli)和酵母)中产生脂肪醇。用于微生物油脂化学生产的优选宿主是产油酵母，其专门用于积累和消耗脂质衍生的化合物。在产油酵母中，已经对酵母解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)进行了最深入的研究。
需要方法和宿主菌株来改善脂肪醇及其衍生物的产生。
发明内容
本发明是如在权利要求中所限定的。
脂肪醇可以通过酶脂肪酰基还原酶的异源表达在微生物中产生，所述酶将天然产生的脂肪酰基-CoA酯还原成脂肪醇。在微生物中，脂肪酰基-CoA酯用于膜脂质产生或储存在脂质体中。一些微生物能够降解脂肪醇。解脂耶氏酵母通过发生在过氧化物酶体中的β-氧化或通过发生在内质网处的ω-氧化途径来降解脂肪酸衍生的化学物质。
本公开文本提供了通过降低竞争性脂质生物合成途径的活性和通过降低脂肪醇降解来增加脂肪醇产生的方法和宿主菌株。这些方法和宿主菌株特别适用于产生去饱和脂肪醇及其衍生物(例如，脂肪醇乙酸酯)，如鳞翅目(Lepidoptera)信息素。
具有不同碳链长的脂肪酰基-CoA酯由脂肪酰基-CoA合成酶复合物(FAS1和2)从乙酰基-CoA和丙二酰基-CoA合成，并且用作储存和膜脂质的底物。朝向脂质的初始反应是脂肪酰基-CoA转移至甘油-3-磷酸，由甘油-3-磷酸1-O-酰基转移酶(GPAT)催化并导致溶血磷脂酸的形成。已经显示解脂耶氏酵母中GPAT的过表达增加脂质积累。
已知产油酵母解脂耶氏酵母能够利用疏水性化合物作为脂肪醇作为唯一的能量和碳源。认为脂肪醇被存在于ER和过氧化物酶体中的脂肪醇脱氢酶和存在于过氧化物酶体中的脂肪醇氧化酶(FAO)氧化成脂肪醛。脂肪醛被脂肪醛脱氢酶(HFD)进一步氧化成脂肪酸。已经提出解脂耶氏酵母的Adh1p、Adh3p和Fao1p在外源脂肪醇的降解中起作用，同时已经提出由烷烃降解产生的脂肪醇被Adh1p-Adh7p、Fadhp和Fao1p氧化(Iwama,2015)。解脂耶氏酵母编码四种脂肪醛脱氢酶Hfd1p至Hfd4p，已经显示它们为正构烷烃的生长所必需(Iwama,2014)。PEX10基因编码过氧化物酶体生物合成因子Peroxin 10。在解脂耶氏酵母中使PEX10缺失导致过氧化物酶体缺乏和正癸烷同化缺陷(Sumita等人,2002)。
本发明描述了GPAT、Hfd1、Hfd4、Fao1和/或Pex10表达的下调作为将脂肪酰基-CoA酯前体的流从储存和膜脂质合成重定向至脂肪醇产生的策略。与引入异源去饱和酶和脂肪酰基-CoA还原酶组合，这允许在产油酵母细胞(如解脂耶氏酵母细胞)中产生具有高滴度的脂肪醇及其衍生物、特别是包含在鳞翅目信息素中的此类脂肪醇和衍生物。
本文提供了能够产生去饱和脂肪醇的产油酵母细胞，所述细胞：
i)表达至少一种能够在脂肪酰基-CoA中引入至少一个双键的异源去饱和酶；并且
ii)表达至少一种能够将至少一部分的所述去饱和脂肪酰基-CoA转化为去饱和脂肪醇的异源脂肪酰基-CoA还原酶；并且
iii)具有降低的Hfd1(SEQ ID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ ID NO:10)中的至少一种的活性或具有降低的如下至少一种蛋白质的活性，所述至少一种蛋白质与Hfd1(SEQ ID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ ID NO:10)中的一种具有至少60％同源性，如与Hfd1(SEQ ID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQ IDNO:22)和GPAT(SEQ ID NO:10)中的一种具有至少65％同源性、如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。
还提供了在产油酵母细胞中产生脂肪醇的方法，所述方法包括提供酵母细胞以及在培养基中孵育所述酵母细胞的步骤，其中所述酵母细胞：
i)表达至少一种能够在脂肪酰基-CoA中引入至少一个双键的异源去饱和酶，从而将至少一部分的所述脂肪酰基-CoA转化为去饱和脂肪酰基-CoA；并且
ii)表达至少一种能够将至少一部分的所述去饱和脂肪酰基-CoA转化为去饱和脂肪醇的异源脂肪酰基-CoA还原酶，从而产生所述去饱和脂肪醇；并且
iii)具有降低的Hfd1(SEQ ID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ ID NO:10)中的至少一种的活性或降低的如下至少一种蛋白质的活性，所述至少一种蛋白质与Hfd1(SEQ ID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ ID NO:10)中的一种具有至少60％同源性，如与Hfd1(SEQ ID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ ID NO:10)中的一种具有至少65％同源性、如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。
还提供了用于修饰酵母细胞的核酸构建体，所述构建体包含：
i)编码至少一种能够在脂肪酰基-CoA中引入至少一个双键的异源去饱和酶的第一多核苷酸；和
ii)编码至少一种能够将至少一部分的所述去饱和脂肪酰基-CoA转化为去饱和脂肪醇的异源脂肪酰基-CoA还原酶(FAR)的第二多核苷酸；以及
iii)任选地，用于降低Hfd1(SEQ ID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ IDNO:8)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ ID NO:10)中的至少一种的活性或与Hfd1(SEQ IDNO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ IDNO:10)中的一种具有至少60％同源性的至少一种蛋白质的活性的另外的多核苷酸，
其中任选地，所述第一多核苷酸和/或所述第二多核苷酸和/或所述另外的多核苷酸处于启动子的控制下。
还提供了部件试剂盒(kit of parts)，其包含：
a)如本文定义的酵母细胞和使用说明书；和/或
b)如本文定义的核酸构建体，其中所述构建体用于修饰酵母细胞；以及
c)任选地，待修饰的酵母细胞。
还提供了通过本文公开的方法可获得的去饱和脂肪醇、去饱和脂肪醇乙酸酯或去饱和脂肪醛。
还提供了通过本文公开的方法可获得的去饱和脂肪醇、去饱和脂肪醇乙酸酯或去饱和脂肪醛的用途。
附图说明
图1：朝向Z9-C14:OAc的途径。(1)十四烷酰基-CoA(肉豆蔻酰基-CoA)，14:CoA；(2)(Z)9-十四碳烯-1-基-CoA，Z9-14:CoA；(3)(Z)9-十四碳烯-1-醇，Z9-14:OH；(4)(Z)9-十四碳烯-1-基乙酸酯，Z9-14:OAc；(5)(Z)9-十四碳烯醛，Z9-14:Ald。Δ9FAD-Z9-脂肪酰基去饱和酶；FAR-脂肪酰基-CoA还原酶；AcT-乙酰基-CoA转移酶。
图2：BB1963(LEU2选择标记盒)的图谱。Leu2 term.：Leu2终止子。
图3：BB1360(pex10和lip2终止子)的图谱。ECS：易克隆位点。pex10 term.：pex10终止子。lip2 term.：lip2终止子。
图4：Dmd9和HarFAR的表达盒的图谱。pex20 term：pex20终止子。TefI prom.：Tefintron启动子。lip2 term.：lip2终止子。
图5：Atf1的表达盒。Atf1 YL优化密码子(codon opt)：针对解脂耶氏酵母优化的Atf1密码子
图6：各种解脂耶氏酵母菌株中脂肪醇的产生；除了在X轴上指示的基因型之外，菌株也都表达脐橙螟(Amyelois transitella)Δ11去饱和酶和Heliothis subflexa还原酶(Hs_FAR)。Sat.：饱和脂肪醇(15:OH和16:OH)。Desat.：去饱和脂肪醇((Z)9-16:OH和(Z)11-16:OH)。
具体实施方式
定义
生物农药：术语“生物农药(biopesticide)”是“生物农药(biologicalpesticide)”的缩写，是指几种类型的害虫治理干预：通过捕食、寄生或化学关系。在欧盟，生物农药已经被定义为“一种基于微生物或天然产物的农药”。在美国，EPA将其定义为“包括防治害虫的天然存在的物质(生物化学农药)、防治害虫的微生物(微生物农药)以及含有添加的遗传材料(植物结合保护剂(plant-incorporated protectant))或PIP的植物产生的杀虫物质”。本公开文本更具体地涉及包含天然产物或天然存在的物质的生物农药。它们通常通过使天然存在的生物和/或其代谢物(包括细菌和其他微生物、真菌、线虫、蛋白质等)生长和浓缩而产生。它们通常被认为是害虫综合治理(IPM)计划的重要组成部分，并且作为合成化学植物保护产品(PPP)的替代品已经受到很大的实际关注。生物防治剂手册(2009年：以前的生物农药手册)对可用的生物杀虫剂(和其他基于生物学的防治)产品进行了综述。
去饱和的：术语“去饱和的(desaturated)”在本文中将可与术语“不饱和的(unsaturated)”互换使用，是指含有一个或多个碳-碳双碳或碳-碳三键的化合物。
脂肪酸：术语“脂肪酸”是指具有长脂肪族链(即4与28个之间的碳原子(如4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28个碳原子)的脂肪族链)的羧酸。大多数天然存在的脂肪酸是无支链的。它们可以是饱和的或去饱和的。
脂肪醇乙酸酯：所述术语在本文中将可与“脂肪乙酸酯”互换使用，是指具有脂肪碳链(即4与28个之间的碳原子(如4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28个碳原子)的脂肪族链)的乙酸酯。脂肪醇乙酸酯可以是饱和的或去饱和的。
脂肪酰基-CoA：所述术语在本文中将可与“脂肪酰基-CoA酯”互换使用，是指通式R-CO-SCoA的化合物，其中R是脂肪碳链。脂肪碳链通过硫酯键与辅酶A的-SH基团连接。脂肪酰基-CoA可以是饱和的或去饱和的，这取决于衍生出它的脂肪酸是饱和的还是去饱和的。
脂肪醇：术语“脂肪醇”在本文中是指衍生自脂肪酰基-CoA的醇，其具有4至28个碳原子(如4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28个碳原子)的碳链长。脂肪醇可以是饱和的或去饱和的。
脂肪醛：所述术语在本文中是指衍生自脂肪酰基-CoA的醛，其具有4至28个碳原子(如4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28个碳原子)的碳链长。脂肪醛可以是饱和的或去饱和的。
异源的：当提及多肽(如蛋白质或酶)或多核苷酸时，术语“异源的”在本文中应解释为指代不天然存在于野生型细胞中的多肽或多核苷酸。例如，当应用于解脂耶氏酵母时，术语“异源Δ9去饱和酶”是指不天然存在于野生型解脂耶氏酵母细胞中的Δ9去饱和酶，例如衍生自黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)的Δ9去饱和酶。
天然的：当提及多肽(如蛋白质或酶)或多核苷酸时，术语“天然的”在本文中应解释为指代天然存在于野生型细胞中的多肽或多核苷酸。
害虫：如本文所用，术语“害虫”应指代对人类或人类关怀(特别是在农业或畜牧生产的背景下)有害的生物，特别是动物。害虫是对植物或动物、人类或人类关怀、牲畜、人类结构、野生生态系统等具侵入性或多产、有害、有麻烦、有毒、有破坏性、惹人讨厌的任何活生物。所述术语经常与相关术语害虫(vermin)、杂草、植物和动物寄生虫和病原体重叠。有可能生物在一种环境中是害虫，而在另一种环境中是有益的、驯化的或可接受的。
信息素：信息素是由以醇、醛或乙酸酯官能团结尾并且在脂肪族主链中含有最多3个双键的无支链的脂肪族链(9与18个之间的碳)指定的天然存在的化合物。信息素组合物能以化学或生物化学方式产生，例如如本文所述。因此，信息素可以包含去饱和脂肪醇、脂肪醛或脂肪醇乙酸酯，例如可以通过本文所述的方法和细胞获得。
降低的活性：术语“降低的活性”在本文中可以指代给定肽(如蛋白质或酶)的活性的完全或部分丧失。在一些情况下，肽由不能被缺失的必需基因编码。在这些情况下，可以通过本领域已知的方法(例如下调转录或翻译、或抑制肽)降低肽的活性。在其他情况下，肽由非必需基因编码，并且活性可能降低或者可能完全丧失，例如由于使编码肽的基因缺失。
饱和的：术语“饱和的”是指不含碳-碳双碳或碳-碳三键的化合物。
本公开文本涉及可用于产生鳞翅目信息素的产油酵母细胞。诸位发明人已经发现下调产油酵母细胞中(特别是解脂耶氏酵母细胞中)的HFD1、HFD4、PEX10、FAO1和GPAT中的一种或多种与异源表达至少一种异源去饱和酶和至少一种异源脂肪酰基-CoA还原酶相结合导致产生例如可用于配制用于害虫治理的信息素组合物的去饱和脂肪醇。特别是，下调PEX10以及HFD1、HFD4、FAO1或GPAT中的一种或多种是令人感兴趣的。可以进一步工程化细胞以允许产生也可用于此类信息素组合物的脂肪醇衍生物，如醛和乙酸酯，特别是去饱和脂肪醇衍生物，如去饱和醛和去饱和乙酸酯。
在一个方面，提供了产油酵母细胞，其能够产生去饱和脂肪醇，所述细胞：
i)表达至少一种能够在脂肪酰基-CoA中引入至少一个双键的异源去饱和酶；并且
ii)表达至少一种能够将至少一部分的所述去饱和脂肪酰基-CoA转化为去饱和脂肪醇的异源脂肪酰基-CoA还原酶；并且
iii)具有降低的Hfd1(SEQ ID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ ID NO:10)中的至少一种的活性或具有降低的如下至少一种蛋白质的活性，所述至少一种蛋白质与Hfd1(SEQ ID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ ID NO:10)中的一种具有至少60％同源性，如与Hfd1(SEQ ID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQ IDNO:22)和GPAT(SEQ ID NO:10)中的一种具有至少65％同源性、如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。
在一些实施方案中，所述酵母细胞：
i)表达至少一种能够在脂肪酰基-CoA中引入至少一个双键的异源去饱和酶；并且
ii)表达至少一种能够将至少一部分的所述去饱和脂肪酰基-CoA转化为去饱和脂肪醇的异源脂肪酰基-CoA还原酶；并且
iii)具有导致Pex10(SEQ ID NO:8)的活性降低的突变和导致Hfd1(SEQ ID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ ID NO:10)中的至少一种的活性降低的突变，或者具有导致与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的至少一种蛋白质的活性降低的突变和导致Hfd1(SEQ ID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ ID NO:10)中的至少一种的活性降低的突变，所述至少一种蛋白质与Pex10(SEQ ID NO:8)以及Hfd1(SEQ ID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ ID NO:10)中的至少一种具有如至少65％同源性、如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。
还提供了在产油酵母细胞中产生脂肪醇的方法，所述方法包括提供酵母细胞以及在培养基中孵育所述酵母细胞的步骤，其中所述酵母细胞：
i)表达至少一种能够在脂肪酰基-CoA中引入至少一个双键的异源去饱和酶，从而将至少一部分的所述脂肪酰基-CoA转化为去饱和脂肪酰基-CoA；并且
ii)表达至少一种能够将至少一部分的所述去饱和脂肪酰基-CoA转化为去饱和脂肪醇的异源脂肪酰基-CoA还原酶，从而产生所述去饱和脂肪醇；并且
iii)具有降低的Hfd1(SEQ ID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ ID NO:10)中的至少一种的活性或降低的如下至少一种蛋白质的活性，所述至少一种蛋白质与Hfd1(SEQ ID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ ID NO:10)中的一种具有至少60％同源性，如与Hfd1(SEQ ID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ ID NO:10)中的一种具有至少65％同源性、如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。
在一些实施方案中，所述方法包括提供酵母细胞和在培养基中孵育所述酵母细胞的步骤，其中所述酵母细胞：
i)表达至少一种能够在脂肪酰基-CoA中引入至少一个双键的异源去饱和酶；并且
ii)表达至少一种能够将至少一部分的所述去饱和脂肪酰基-CoA转化为去饱和脂肪醇的异源脂肪酰基-CoA还原酶；并且
iii)具有导致Pex10(SEQ ID NO:8)的活性降低的突变和导致Hfd1(SEQ ID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ ID NO:10)中的至少一种的活性降低的突变，或者具有导致与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的至少一种蛋白质的活性降低的突变和导致Hfd1(SEQ ID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ ID NO:10)中的至少一种的活性降低的突变，所述至少一种蛋白质与Pex10(SEQ ID NO:8)以及Hfd1(SEQ ID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ ID NO:10)中的至少一种具有如至少65％同源性、如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。
还提供了用于修饰酵母细胞的核酸构建体，所述构建体包含：
i)编码至少一种能够在脂肪酰基-CoA中引入至少一个双键的异源去饱和酶的第一多核苷酸；和
ii)编码至少一种能够将至少一部分的所述去饱和脂肪酰基-CoA转化为去饱和脂肪醇的异源脂肪酰基-CoA还原酶(FAR)的第二多核苷酸；以及
iii)任选地，用于降低Hfd1(SEQ ID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ IDNO:8)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ ID NO:10)中的至少一种的活性或与Hfd1(SEQ IDNO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ IDNO:10)中的一种具有至少60％同源性的至少一种蛋白质的活性的另外的多核苷酸，
其中任选地，所述第一多核苷酸和/或所述第二多核苷酸和/或所述另外的多核苷酸处于启动子的控制下。
还提供了部件试剂盒，其包含如本文所述的酵母细胞和使用说明书；和/或如本文所述的核酸构建体，其中所述构建体用于修饰酵母细胞；以及任选地，待修饰的酵母细胞。
还提供了通过本文所述的方法可获得的去饱和脂肪醇、去饱和脂肪醇乙酸酯或去饱和脂肪醛。
还提供了通过本发明方法可获得的去饱和脂肪醇、去饱和脂肪醇乙酸酯或去饱和脂肪醛的用途。
去饱和酶(FAD)
在本公开文本中，术语“脂肪酰基-CoA去饱和酶”、“去饱和酶”、“脂肪酰基去饱和酶”和“FAD”将可互换使用。所述术语是指能够在链长为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个碳原子的酰基-CoA中引入至少一个E/Z构象的双键的酶。可以在任何位置中引入双键。例如，在位置3中引入双键的去饱和酶被称为Δ3去饱和酶。在位置5中引入双键的去饱和酶被称为Δ5去饱和酶。在位置6中引入双键的去饱和酶被称为Δ6去饱和酶。在位置7中引入双键的去饱和酶被称为Δ7去饱和酶。在位置8中引入双键的去饱和酶被称为Δ8去饱和酶。在位置9中引入双键的去饱和酶被称为Δ9去饱和酶。在位置10中引入双键的去饱和酶被称为Δ10去饱和酶。在位置11中引入双键的去饱和酶被称为Δ11去饱和酶。在位置12中引入双键的去饱和酶被称为Δ12去饱和酶。在位置13中引入双键的去饱和酶被称为Δ13去饱和酶。在位置14中引入双键的去饱和酶被称为Δ14去饱和酶。在位置15中引入双键的去饱和酶被称为Δ15去饱和酶。在位置16中引入双键的去饱和酶被称为Δ16去饱和酶。在位置17中引入双键的去饱和酶被称为Δ17去饱和酶。在位置18中引入双键的去饱和酶被称为Δ18去饱和酶。在位置19中引入双键的去饱和酶被称为Δ19去饱和酶。在位置20中引入双键的去饱和酶被称为Δ20去饱和酶。
还原酶将酰基-CoA还原成对应链长的醇。
在一个实施方案中，细胞能够表达至少一种异源Δ5去饱和酶。在另一个实施方案中，细胞能够表达至少一种异源Δ6去饱和酶。在另一个实施方案中，细胞能够表达至少一种异源Δ7去饱和酶。在另一个实施方案中，细胞能够表达至少一种异源Δ8去饱和酶。在另一个实施方案中，细胞能够表达至少一种异源Δ9去饱和酶。在另一个实施方案中，细胞能够表达至少一种异源Δ10去饱和酶。在另一个实施方案中，细胞能够表达至少一种异源Δ11去饱和酶。在另一个实施方案中，细胞能够表达至少一种异源Δ12去饱和酶。在另一个实施方案中，细胞能够表达至少一种异源Δ13去饱和酶。在另一个实施方案中，细胞能够表达至少一种异源Δ14去饱和酶。在另一个实施方案中，细胞能够表达至少一种异源Δ15去饱和酶。在另一个实施方案中，细胞能够表达至少一种异源Δ16去饱和酶。在另一个实施方案中，细胞能够表达至少一种异源Δ17去饱和酶。在另一个实施方案中，细胞能够表达至少一种异源Δ18去饱和酶。在另一个实施方案中，细胞能够表达至少一种异源Δ19去饱和酶。在另一个实施方案中，细胞能够表达至少一种异源Δ20去饱和酶。
技术人员将根据所需的去饱和脂肪醇知道使用哪种去饱和酶。例如，为了产生在位置11中去饱和的脂肪醇，可以使用与如SEQ ID NO:2中所示的来自脐橙螟的Δ11去饱和酶具有至少60％同源性的Δ11去饱和酶、与如SEQ IDNO:19中所示的来自玫瑰色卷蛾(Choristoneura rosaceana)的Δ11去饱和酶具有至少60％同源性的Δ11去饱和酶或与如SEQ ID NO:20中所示的来自斑点色卷蛾(Choristoneura parallela)的Δ11去饱和酶具有至少60％同源性的Δ11去饱和酶。优选地，与如SEQ ID NO:2中所示的来自脐橙螟的Δ11去饱和酶具有至少60％同源性的Δ11去饱和酶。如果需要在位置9中去饱和的脂肪醇，可以使用与如SEQ ID NO:18中所示的来自黑腹果蝇的Δ9去饱和酶具有至少60％同源性的Δ9去饱和酶。可以出于任何目的针对给定宿主细胞(例如解脂耶氏酵母)对编码异源去饱和酶的基因进行密码子优化，如本领域所已知的。在一个实施方案中，编码异源去饱和酶的核酸如SEQ ID NO:63中所示或是与其具有至少60％同源性的其同源物，所述同源物与SEQ ID NO:63具有如至少61％同源性、如至少62％同源性、如至少63％同源性、如至少64％同源性、如至少65％同源性、如至少66％同源性、如至少67％同源性、如至少68％同源性、如至少69％同源性、如至少70％同源性、如至少71％同源性、如至少72％、如至少73％、如至少74％、如至少75％、如至少76％、如至少77％、如至少78％、如至少79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％同源性。
因此，在一个实施方案中，所述至少一种异源去饱和酶是与如SEQ ID NO:2中所示的来自脐橙螟的Δ11去饱和酶具有至少60％同源性的Δ11去饱和酶，所述Δ11去饱和酶与如SEQ ID NO:2中所示的来自脐橙螟的Δ11去饱和酶具有如至少61％同源性、如至少62％同源性、如至少63％同源性、如至少64％同源性、如至少65％同源性、如至少66％同源性、如至少67％同源性、如至少68％同源性、如至少69％同源性、如至少70％同源性、如至少71％同源性、如至少72％、如至少73％、如至少74％、如至少75％、如至少76％、如至少77％、如至少78％、如至少79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％、如100％同源性。
在一个实施方案中，所述至少一种异源去饱和酶由与如SEQ ID NO:1中所示的编码来自脐橙螟的Δ11去饱和酶的核酸具有至少60％同源性的核酸编码，所述核酸与如SEQID NO:1中所示的编码来自脐橙螟的Δ11去饱和酶的核酸具有如至少61％同源性、如至少62％同源性、如至少63％同源性、如至少64％同源性、如至少65％同源性、如至少66％同源性、如至少67％同源性、如至少68％同源性、如至少69％同源性、如至少70％同源性、如至少71％同源性、如至少72％、如至少73％、如至少74％、如至少75％、如至少76％、如至少77％、如至少78％、如至少79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％、如100％同源性。
在另一个实施方案中，所述至少一种异源去饱和酶由与如SEQ ID NO:64中所示的编码来自脐橙螟的Δ11去饱和酶的核酸具有至少60％同源性的核酸编码，所述核酸与如SEQ ID NO:64中所示的编码来自脐橙螟的Δ11去饱和酶的核酸具有如至少61％同源性、如至少62％同源性、如至少63％同源性、如至少64％同源性、如至少65％同源性、如至少66％同源性、如至少67％同源性、如至少68％同源性、如至少69％同源性、如至少70％同源性、如至少71％同源性、如至少72％、如至少73％、如至少74％、如至少75％、如至少76％、如至少77％、如至少78％、如至少79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％、如100％同源性。
在另一个实施方案中，所述至少一种异源去饱和酶是与如SEQ ID NO:18中所示的来自黑腹果蝇的Δ9去饱和酶具有至少60％同源性的Δ9去饱和酶，所述Δ9去饱和酶与如SEQ ID NO:18中所示的来自黑腹果蝇的Δ9去饱和酶具有如至少61％同源性、如至少62％同源性、如至少63％同源性、如至少64％同源性、如至少65％同源性、如至少66％同源性、如至少67％同源性、如至少68％同源性、如至少69％同源性、如至少70％同源性、如至少71％同源性、如至少72％、如至少73％、如至少74％、如至少75％、如至少76％、如至少77％、如至少78％、如至少79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％、如100％同源性。
在一个实施方案中，所述至少一种异源去饱和酶由与如SEQ ID NO:17中所示的编码来自黑腹果蝇的Δ9去饱和酶的核酸具有至少60％同源性的核酸编码，所述核酸与如SEQID NO:17中所示的编码来自黑腹果蝇的Δ9去饱和酶的核酸具有如至少61％同源性、如至少62％同源性、如至少63％同源性、如至少64％同源性、如至少65％同源性、如至少66％同源性、如至少67％同源性、如至少68％同源性、如至少69％同源性、如至少70％同源性、如至少71％同源性、如至少72％、如至少73％、如至少74％、如至少75％、如至少76％、如至少77％、如至少78％、如至少79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％、如100％同源性。
在另一个实施方案中，所述至少一种异源去饱和酶由与如SEQ ID NO:63中所示的编码来自黑腹果蝇的Δ9去饱和酶的核酸具有至少60％同源性的核酸编码，所述核酸与如SEQ ID NO:63中所示的来自黑腹果蝇的Δ9去饱和酶具有如至少61％同源性、如至少62％同源性、如至少63％同源性、如至少64％同源性、如至少65％同源性、如至少66％同源性、如至少67％同源性、如至少68％同源性、如至少69％同源性、如至少70％同源性、如至少71％同源性、如至少72％、如至少73％、如至少74％、如至少75％、如至少76％、如至少77％、如至少78％、如至少79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％、如100％同源性。
异源去饱和酶可以优选地衍生自昆虫，例如来自鳞翅目。在一个实施方案中，异源去饱和酶衍生自脐橙螟。在另一个实施方案中，异源去饱和酶衍生自烟夜蛾(Helicoverpaassulta)。在另一个实施方案中，异源去饱和酶衍生自棉铃虫(Helicoverpa armigera)。在另一个实施方案中，异源去饱和酶衍生自玫瑰色卷蛾。在另一个实施方案中，异源去饱和酶衍生自斑点色卷蛾。
异源去饱和酶可以从在细胞中(例如在诸如质粒等载体上)引入的核酸表达，或通过基因组整合表达。可以出于任何目的针对所用的特定酵母细胞对核酸进行密码子优化，如本领域所已知的。
待修饰的酵母细胞可以表达天然去饱和酶，其可能对去饱和脂肪醇和/或去饱和脂肪醇乙酸酯的产生具有负面影响。因此，如果待修饰的酵母细胞表达这种天然去饱和酶，则可以修饰细胞使得天然去饱和酶的活性降低或不存在。
为了确保缺乏天然去饱和酶的活性，可以使用本领域已知的方法。可以使编码天然去饱和酶的基因缺失或部分缺失，以便确保不表达天然去饱和酶。可替代地，可以使基因突变，使得表达天然去饱和酶但缺乏活性，例如通过使酶的催化位点突变。可替代地，可以通过诸如沉默RNA或siRNA等方法来阻止mRNA翻译为活性蛋白。可替代地，可以在包含抑制天然去饱和酶活性的抑制剂的培养基中孵育酵母细胞。还可以提供抑制编码天然去饱和酶的基因转录的化合物，使得当存在所述化合物时使转录失活。
因此，天然去饱和酶的失活可以是永久的或长期的，即经修饰的酵母细胞在稳定条件下不表现出天然去饱和酶的活性，或者它可以是瞬时的，即经修饰的酵母细胞可以在一段时间内表现出天然去饱和酶的活性，但可以在其他时间段内抑制此活性。
成醇脂肪酰基-CoA还原酶(EC 1.2.1.84)
术语“成醇脂肪酰基-CoA还原酶”、“脂肪酰基-CoA还原酶”和“FAR”在本文中将可互换使用。术语“异源FAR”是指不是酵母细胞天然表达的FAR。
FAR催化两步反应(图1)：
酰基-CoA+2NADPH<＝>CoA+醇+2NADP(+)
其中在第一步中，脂肪酰基-CoA被还原成脂肪醛，之后在第二步中脂肪醛被进一步还原成脂肪醇。脂肪酰基-CoA可以是去饱和脂肪酰基-CoA。
能够催化这种反应的FAR是EC编号为1.2.1.84的成醇脂肪酰基-CoA还原酶。本公开文本的酵母细胞表达至少一种如上所述的能够在脂肪酰基-CoA中引入至少一个双键的异源去饱和酶和至少一种能够将至少一部分的所述去饱和脂肪酰基-CoA转化为去饱和脂肪醇的异源脂肪酰基-CoA还原酶，并且此外，具有降低的Hfd1(SEQ ID NO:4)、Hfd4(SEQ IDNO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ ID NO:10)中的至少一种的活性或具有降低的如下至少一种蛋白质的活性，所述至少一种蛋白质与Hfd1(SEQ ID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ ID NO:10)中的一种具有至少60％同源性，如与Hfd1(SEQ ID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ ID NO:10)中的一种具有至少65％同源性、如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。在一些实施方案中，酵母细胞表达至少一种异源去饱和酶、至少一种异源脂肪酰基-CoA还原酶，并且具有降低的Pex10以及Hfd1、Hfd4、GPAT和Fao1中的至少一种或其同源物的活性。
在一些实施方案中，所述至少一种异源FAR衍生自属于鳞翅目的生物。
异源脂肪酰基-CoA还原酶可以从在细胞中(例如在诸如质粒等载体上)引入的核酸表达，或通过基因组整合表达。可以出于任何目的针对所用的特定酵母细胞对核酸进行密码子优化，如本领域所已知的。
在一个实施方案中，所述至少一种异源FAR能够将Δ3脂肪酰基-CoA转化为Δ3脂肪醇。在另一个实施方案中，所述至少一种异源FAR能够将Δ5脂肪酰基-CoA转化为Δ5脂肪醇。在另一个实施方案中，所述至少一种异源FAR能够将Δ6脂肪酰基-CoA转化为Δ6脂肪醇。在另一个实施方案中，所述至少一种异源FAR能够将Δ7脂肪酰基-CoA转化为Δ7脂肪醇。在另一个实施方案中，所述至少一种异源FAR能够将Δ8脂肪酰基-CoA转化为Δ8脂肪醇。在另一个实施方案中，所述至少一种异源FAR能够将Δ9脂肪酰基-CoA转化为Δ9脂肪醇。在另一个实施方案中，所述至少一种异源FAR能够将Δ10脂肪酰基-CoA转化为Δ10脂肪醇。在另一个实施方案中，所述至少一种异源FAR能够将Δ11脂肪酰基-CoA转化为Δ11脂肪醇。在另一个实施方案中，所述至少一种异源FAR能够将Δ12脂肪酰基-CoA转化为Δ12脂肪醇。在另一个实施方案中，所述至少一种异源FAR能够将Δ13脂肪酰基-CoA转化为Δ13脂肪醇。在另一个实施方案中，所述至少一种异源FAR能够将Δ14脂肪酰基-CoA转化为Δ14脂肪醇。在另一个实施方案中，所述至少一种异源FAR能够将Δ15脂肪酰基-CoA转化为Δ15脂肪醇。在另一个实施方案中，所述至少一种异源FAR能够将Δ16脂肪酰基-CoA转化为Δ16脂肪醇。在另一个实施方案中，所述至少一种异源FAR能够将Δ17脂肪酰基-CoA转化为Δ17脂肪醇。在另一个实施方案中，所述至少一种异源FAR能够将Δ18脂肪酰基-CoA转化为Δ18脂肪醇。在另一个实施方案中，所述至少一种异源FAR能够将Δ19脂肪酰基-CoA转化为Δ19脂肪醇。在另一个实施方案中，所述至少一种异源FAR能够将Δ20脂肪酰基-CoA转化为Δ20脂肪醇。在另一个实施方案中，所述至少一种异源FAR能够将Δ21脂肪酰基-CoA转化为Δ21脂肪醇。在另一个实施方案中，所述至少一种异源FAR能够将Δ22脂肪酰基-CoA转化为Δ22脂肪醇。
在一些实施方案中，所述FAR选自与如SEQ ID NO:14中所示的衍生自棉铃虫的FAR具有至少80％同源性的FAR、与如SEQ ID NO:16中所示的来自烟夜蛾的FAR具有至少80％同源性的FAR、与如SEQ ID NO:12中所示的来自Heliothis subflexa的FAR具有至少80％同源性的FAR和与如SEQ ID NO:24中所示的来自Bicyclus anynana的FAR具有至少80％同源性的FAR。优选地，所述FAR选自与衍生自棉铃虫的FAR具有至少80％同源性的FAR和与如SEQID NO:12中所示的来自Heliothis subflexa的FAR具有至少80％同源性的FAR。
在一个实施方案中，所述FAR是Har_FAR(SEQ ID NO:14，来自棉铃虫的FAR)或与Har_FAR具有至少75％同源性的其变体，所述变体与Har_FAR(SEQ ID NO:14)具有如至少76％、如至少77％、如至少78％、如至少79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％、如100％同源性。
在另一个实施方案中，所述FAR是Has_FAR(SEQ ID NO:16，来自烟夜蛾的FAR)或与Has_FAR具有至少75％同源性的其变体，所述变体与Has_FAR(SEQ ID NO:16)具有如至少76％、如至少77％、如至少78％、如至少79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％、如100％同源性。
在另一个实施方案中，所述FAR是Hs_FAR(SEQ ID NO:12，来自Heliothissubflexa的FAR)或与Hs_FAR具有至少75％同源性的其变体，所述变体与Hs_FAR(SEQ IDNO:12)具有如至少76％、如至少77％、如至少78％、如至少79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％、如100％同源性。
在另一个实施方案中，所述FAR是Ban_FAR(SEQ ID NO:24，来自Bicyclus anynana的FAR)或与Ban_FAR具有至少75％同源性的其变体，所述变体与Ban_FAR(SEQ ID NO:24)具有如至少76％、如至少77％、如至少78％、如至少79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％、如100％同源性。
在一些实施方案中，可以诱导去饱和酶和/或FAR的表达，例如如果编码这些酶的基因处于诱导型启动子的控制下的话，如本领域所已知的。将酵母细胞在合适的条件下(如在适当的培养基中且在适当的温度下)孵育，如本领域技术人员所已知的。支持酵母生长的合适培养基在本领域是已知的，并且包括但不限于：成分不明确的完全培养基，如YEPD(或YPD，Yeast Extract Peptone Dextrose)；成分明确的完全培养基，如SC(SyntheticComplete)；缺乏一种或多种要素(如氨基酸或诱导物)的成分明确的补偿(drop-out)培养基，如SD(Synthetic Dextrose)；或由盐、维生素和碳源组成的矿物质培养基等。
降低的Hfd1、Hfd4、Pex10、Fao1、GPAT或其同源物的活性
贯穿本公开文本，术语“降低的活性”可以指代部分或完全丧失活性。可以通过本领域已知的方法(例如通过使编码显示所述活性的肽的基因突变或缺失、通过使用阻抑型启动子阻遏转录、通过抑制活性或通过在翻译水平上沉默)实现活性的降低。
过氧化物酶体生物合成因子10Pex10
在解脂耶氏酵母中，PEX10(YALI0C01023g，SEQ ID NO:7)编码过氧化物酶体生物合成因子10(SEQ ID NO:8)。它参与过氧化物酶体基质蛋白的输入并定位于过氧化物酶体膜。
诸位发明人发现，Pex10的活性降低导致解脂耶氏酵母中去饱和脂肪醇的滴度增高。
因此，本公开文本的产油酵母细胞表达至少一种如上所述的能够在脂肪酰基-CoA中引入至少一个双键的异源去饱和酶、至少一种如上所述的能够将至少一部分的所述去饱和脂肪酰基-CoA转化为去饱和脂肪醇的异源脂肪酰基-CoA还原酶，并且具有降低的Pex10或如下蛋白质的活性，所述蛋白质与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性，如与Pex10(SEQ ID NO:8)之一具有至少65％同源性、如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。
可以通过本领域已知的方法获得Pex10或与其具有至少60％同源性的蛋白质的活性的降低或完全丧失。在一个实施方案中，降低的活性是活性的完全丧失。例如，可以使编码Pex10或与其具有至少60％同源性的蛋白质的基因敲除或缺失，或者可以如本领域所已知的那样阻止其转录，例如通过在基因上游引入阻抑性启动子，导致在阻遏化合物的存在下转录完全失活。
在一些实施方案中，使编码Pex10或与其具有至少60％同源性的蛋白质的基因缺失。在一个实施方案中，所述基因是PEX10(SEQ ID NO:7)，并且产油酵母细胞是解脂耶氏酵母。
在一个实施方案中，酵母细胞表达：
-至少一种选自以下的异源去饱和酶：与如SEQ ID NO:2中所示的来自脐橙螟的Δ11去饱和酶具有至少60％同源性的Δ11去饱和酶、与如SEQ ID NO:18中所示的来自黑腹果蝇的Δ9去饱和酶具有至少60％同源性的Δ9去饱和酶、与如SEQ ID NO:19中所示的来自玫瑰色卷蛾的Δ11去饱和酶具有至少60％同源性的Δ11去饱和酶和与如SEQ ID NO:20中所示的来自斑点色卷蛾的Δ11去饱和酶具有至少60％同源性的Δ11去饱和酶；以及
-至少一种选自以下的异源脂肪酰基-CoA还原酶：与如SEQ ID NO:14中所示的来自棉铃虫的FAR具有至少80％同源性的FAR、与如SEQ ID NO:16中所示的来自烟夜蛾的FAR具有至少80％同源性的FAR、与如SEQ ID NO:12中所示的来自Heliothis subflexa的FAR具有至少80％同源性的FAR和与如SEQ ID NO:24中所示的来自Bicyclus anynana的FAR具有至少80％同源性的FAR；优选地，所述FAR选自与如SEQ ID NO:14中所示的衍生自棉铃虫的FAR具有至少80％同源性的FAR和与如SEQ ID NO:12中所示的来自Heliothissubflexa的FAR具有至少80％同源性的FAR；并且
-具有降低的Pex10或与其具有至少65％同源性的蛋白质的活性或活性的完全丧失，所述蛋白质与Pex10(SEQ ID NO:8)具有如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。
在一个实施方案中，酵母细胞表达：
-至少一种与如SEQ ID NO:2中所示的来自脐橙螟的Δ11去饱和酶具有至少60％同源性的异源去饱和酶；以及
-至少一种与如SEQ ID NO:14中所示的来自棉铃虫的FAR具有至少80％同源性的异源脂肪酰基-CoA还原酶；并且
-具有降低的Pex10或与其具有至少65％同源性的蛋白质的活性或活性的完全丧失，所述蛋白质与Pex10(SEQ ID NO:8)具有如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。
在另一个实施方案中，酵母细胞表达：
-至少一种与如SEQ ID NO:18中所示的来自黑腹果蝇的Δ9去饱和酶具有至少60％同源性的异源去饱和酶；以及
-至少一种与如SEQ ID NO:14中所示的来自棉铃虫的FAR具有至少80％同源性的异源脂肪酰基-CoA还原酶；并且
-具有降低的Pex10或与其具有至少65％同源性的蛋白质的活性或活性的完全丧失，所述蛋白质与Pex10(SEQ ID NO:8)具有如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。
在另一个实施方案中，酵母细胞表达：
-至少一种与如SEQ ID NO:2中所示的来自脐橙螟的Δ11去饱和酶具有至少60％同源性的异源去饱和酶；以及
-至少一种与如SEQ ID NO:16中所示的来自烟夜蛾的FAR具有至少80％同源性的异源脂肪酰基-CoA还原酶；并且
-具有降低的Pex10或与其具有至少65％同源性的蛋白质的活性或活性的完全丧失，所述蛋白质与Pex10(SEQ ID NO:8)具有如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。
在另一个实施方案中，酵母细胞表达：
-至少一种与如SEQ ID NO:18中所示的来自黑腹果蝇的Δ9去饱和酶具有至少60％同源性的异源去饱和酶；以及
-至少一种与如SEQ ID NO:16中所示的来自烟夜蛾的FAR具有至少80％同源性的异源脂肪酰基-CoA还原酶；并且
-具有降低的Pex10或与其具有至少65％同源性的蛋白质的活性或活性的完全丧失，所述蛋白质与Pex10(SEQ ID NO:8)具有如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。
在另一个实施方案中，酵母细胞表达：
-至少一种与如SEQ ID NO:2中所示的来自脐橙螟的Δ11去饱和酶具有至少60％同源性的异源去饱和酶；以及
-至少一种与如SEQ ID NO:12中所示的来自Heliothis subflexa的FAR具有至少80％同源性的异源脂肪酰基-CoA还原酶；并且
-具有降低的Pex10或与其具有至少65％同源性的蛋白质的活性或活性的完全丧失，所述蛋白质与Pex10(SEQ ID NO:8)具有如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。
在另一个实施方案中，酵母细胞表达：
-至少一种与如SEQ ID NO:18中所示的来自黑腹果蝇的Δ9去饱和酶具有至少60％同源性的异源去饱和酶；以及
-至少一种与如SEQ ID NO:12中所示的来自Heliothis subflexa的FAR具有至少80％同源性的异源脂肪酰基-CoA还原酶；并且
-具有降低的Pex10或与其具有至少65％同源性的蛋白质的活性或活性的完全丧失，所述蛋白质与Pex10(SEQ ID NO:8)具有如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。
在另一个实施方案中，酵母细胞表达：
-至少一种与如SEQ ID NO:2中所示的来自脐橙螟的Δ11去饱和酶具有至少60％同源性的异源去饱和酶；以及
-至少一种与如SEQ ID NO:24中所示的来自Bicyclus anynana的FAR具有至少80％同源性的异源脂肪酰基-CoA还原酶；并且
-具有降低的Pex10或与其具有至少65％同源性的蛋白质的活性或活性的完全丧失，所述蛋白质与Pex10(SEQ ID NO:8)具有如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。
在另一个实施方案中，酵母细胞表达：
-至少一种与如SEQ ID NO:18中所示的来自黑腹果蝇的Δ9去饱和酶具有至少60％同源性的异源去饱和酶；以及
-至少一种与如SEQ ID NO:24中所示的来自Bicyclus anynana的FAR具有至少80％同源性的异源脂肪酰基-CoA还原酶；并且
-具有降低的Pex10或与其具有至少65％同源性的蛋白质的活性或活性的完全丧失，所述蛋白质与Pex10(SEQ ID NO:8)具有如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。
在优选的实施方案中，酵母细胞是耶氏酵母属(Yarrowia)细胞，如解脂耶氏酵母细胞。
脂肪醛脱氢酶Hfd1
在解脂耶氏酵母中，HFD1(YALI0F23793g，SEQ ID NO:3)编码脂肪醛脱氢酶(SEQID NO:4)。它催化脂肪醛氧化成脂肪酸。
诸位发明人发现，Hfd1的活性降低导致产油酵母细胞(如解脂耶氏酵母)中去饱和脂肪醇的滴度增高。在具体的实施方案中，如上所述，酵母细胞还具有Pex10或与Pex10(SEQID NO:8)具有至少60％同源性的蛋白质的活性的降低或完全丧失。
因此，本公开文本的产油酵母细胞表达至少一种如上所述的能够在脂肪酰基-CoA中引入至少一个双键的异源去饱和酶、至少一种如上所述的能够将至少一部分的所述去饱和脂肪酰基-CoA转化为去饱和脂肪醇的异源脂肪酰基-CoA还原酶，并且具有降低的Hfd1或如下蛋白质的活性，所述蛋白质与Hfd1(SEQ ID NO:4)具有至少60％同源性，如与Hfd1(SEQID NO:4)具有至少65％同源性、如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。
在具体的实施方案中，如上所述，酵母细胞还具有Pex10或与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的蛋白质的活性的降低或完全丧失。
可以通过本领域已知的方法获得Hfd1或与其具有至少60％同源性的蛋白质的活性的降低。在一个实施方案中，降低的活性是活性的完全丧失。例如，可以使编码Hfd1或与其具有至少60％同源性的蛋白质的基因敲除或缺失，或者可以如本领域所已知的那样阻止其转录，例如通过在基因上游引入阻抑性启动子，导致在阻遏化合物的存在下转录完全失活。
在一些实施方案中，使编码Hfd1或与其具有至少60％同源性的蛋白质的基因缺失。在一个实施方案中，所述基因是HFD1(SEQ ID NO:3)，并且产油酵母细胞是解脂耶氏酵母。
在一个实施方案中，酵母细胞表达：
-至少一种选自以下的异源去饱和酶：与如SEQ ID NO:2中所示的来自脐橙螟的Δ11去饱和酶具有至少60％同源性的Δ11去饱和酶、与如SEQ ID NO:18中所示的来自黑腹果蝇的Δ9去饱和酶具有至少60％同源性的Δ9去饱和酶、与如SEQ ID NO:19中所示的来自玫瑰色卷蛾的Δ11去饱和酶具有至少60％同源性的Δ11去饱和酶和与如SEQ ID NO:20中所示的来自斑点色卷蛾的Δ11去饱和酶具有至少60％同源性的Δ11去饱和酶；优选地，所述至少一种异源去饱和酶是与如SEQ ID NO:2中所示的来自脐橙螟的Δ11去饱和酶具有至少60％同源性的Δ11去饱和酶或与如SEQ ID NO:18中所示的来自黑腹果蝇的Δ9去饱和酶具有至少60％同源性的Δ9去饱和酶；以及
-至少一种选自以下的异源脂肪酰基-CoA还原酶：与如SEQ ID NO:14中所示的来自棉铃虫的FAR具有至少80％同源性的FAR、与如SEQ ID NO:16中所示的来自烟夜蛾的FAR具有至少80％同源性的FAR、与如SEQ ID NO:12中所示的来自Heliothis subflexa的FAR具有至少80％同源性的FAR和与如SEQ ID NO:24中所示的来自Bicyclus anynana的FAR具有至少80％同源性的FAR；优选地，所述FAR选自与如SEQ ID NO:14中所示的衍生自棉铃虫的FAR具有至少80％同源性的FAR和与如SEQ ID NO:12中所示的来自Heliothissubflexa的FAR具有至少80％同源性的FAR；并且
-具有降低的Hfd1或与其具有至少65％同源性的蛋白质的活性或活性的完全丧失，所述蛋白质与Hfd1(SEQ ID NO:4)具有如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。
在具体的实施方案中，酵母细胞具有至少Pex10或与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的蛋白质的活性的降低或完全丧失。
在一个实施方案中，酵母细胞表达：
-至少一种与如SEQ ID NO:2中所示的来自脐橙螟的Δ11去饱和酶具有至少60％同源性的异源去饱和酶；以及
-至少一种与如SEQ ID NO:14中所示的来自棉铃虫的FAR具有至少80％同源性的异源脂肪酰基-CoA还原酶；并且
-具有降低的Hfd1或与其具有至少65％同源性的蛋白质的活性或活性的完全丧失，所述蛋白质与Hfd1(SEQ ID NO:4)具有如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。
在具体的实施方案中，如上所述，酵母细胞还具有Pex10或与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的蛋白质的活性的降低或完全丧失。
在另一个实施方案中，酵母细胞表达：
-至少一种与如SEQ ID NO:18中所示的来自黑腹果蝇的Δ9去饱和酶具有至少60％同源性的异源去饱和酶；以及
-至少一种与如SEQ ID NO:14中所示的来自棉铃虫的FAR具有至少80％同源性的异源脂肪酰基-CoA还原酶；并且
-具有降低的Hfd1或与其具有至少65％同源性的蛋白质的活性或活性的完全丧失，所述蛋白质与Hfd1(SEQ ID NO:4)具有如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。
在具体的实施方案中，如上所述，酵母细胞还具有Pex10或与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的蛋白质的活性的降低或完全丧失。
在另一个实施方案中，酵母细胞表达：
-至少一种与如SEQ ID NO:2中所示的来自脐橙螟的Δ11去饱和酶具有至少60％同源性的异源去饱和酶；以及
-至少一种与如SEQ ID NO:16中所示的来自烟夜蛾的FAR具有至少80％同源性的异源脂肪酰基-CoA还原酶；并且
-具有降低的Hfd1或与其具有至少65％同源性的蛋白质的活性或活性的完全丧失，所述蛋白质与Hfd1(SEQ ID NO:4)具有如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。
在具体的实施方案中，如上所述，酵母细胞还具有Pex10或与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的蛋白质的活性的降低或完全丧失。
在另一个实施方案中，酵母细胞表达：
-至少一种与如SEQ ID NO:18中所示的来自黑腹果蝇的Δ9去饱和酶具有至少60％同源性的异源去饱和酶；以及
-至少一种与如SEQ ID NO:16中所示的来自烟夜蛾的FAR具有至少80％同源性的异源脂肪酰基-CoA还原酶；并且
-具有降低的Hfd1或与其具有至少65％同源性的蛋白质的活性或活性的完全丧失，所述蛋白质与Hfd1(SEQ ID NO:4)具有如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。
在具体的实施方案中，如上所述，酵母细胞还具有Pex10或与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的蛋白质的活性的降低或完全丧失。
在另一个实施方案中，酵母细胞表达：
-至少一种与如SEQ ID NO:2中所示的来自脐橙螟的Δ11去饱和酶具有至少60％同源性的异源去饱和酶；以及
-至少一种与如SEQ ID NO:12中所示的来自Heliothis subflexa的FAR具有至少80％同源性的异源脂肪酰基-CoA还原酶；并且
-具有降低的Hfd1或与其具有至少65％同源性的蛋白质的活性或活性的完全丧失，所述蛋白质与Hfd1(SEQ ID NO:4)具有如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。
在具体的实施方案中，如上所述，酵母细胞还具有Pex10或与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的蛋白质的活性的降低或完全丧失。
在另一个实施方案中，酵母细胞表达：
-至少一种与如SEQ ID NO:18中所示的来自黑腹果蝇的Δ9去饱和酶具有至少60％同源性的异源去饱和酶；以及
-至少一种与如SEQ ID NO:12中所示的来自Heliothis subflexa的FAR具有至少80％同源性的异源脂肪酰基-CoA还原酶；并且
-具有降低的Hfd1或与其具有至少65％同源性的蛋白质的活性或活性的完全丧失，所述蛋白质与Hfd1(SEQ ID NO:4)具有如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。
在具体的实施方案中，如上所述，酵母细胞还具有Pex10或与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的蛋白质的活性的降低或完全丧失。
在另一个实施方案中，酵母细胞表达：
-至少一种与如SEQ ID NO:2中所示的来自脐橙螟的Δ11去饱和酶具有至少60％同源性的异源去饱和酶；以及
-至少一种与如SEQ ID NO:24中所示的来自Bicyclus anynana的FAR具有至少80％同源性的异源脂肪酰基-CoA还原酶；并且
-具有降低的Hfd1或与其具有至少65％同源性的蛋白质的活性或活性的完全丧失，所述蛋白质与Hfd1(SEQ ID NO:4)具有如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。
在具体的实施方案中，如上所述，酵母细胞还具有Pex10或与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的蛋白质的活性的降低或完全丧失。
在另一个实施方案中，酵母细胞表达：
-至少一种与如SEQ ID NO:18中所示的来自黑腹果蝇的Δ9去饱和酶具有至少60％同源性的异源去饱和酶；以及
-至少一种与如SEQ ID NO:24中所示的来自Bicyclus anynana的FAR具有至少80％同源性的异源脂肪酰基-CoA还原酶；并且
-具有降低的Hfd1或与其具有至少65％同源性的蛋白质的活性或活性的完全丧失，所述蛋白质与Hfd1(SEQ ID NO:4)具有如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。
在具体的实施方案中，如上所述，酵母细胞还具有Pex10或与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的蛋白质的活性的降低或完全丧失。
脂肪醛脱氢酶Hfd4
在解脂耶氏酵母中，HFD4(YALI0B01298g，SEQ ID NO:5)编码脂肪醛脱氢酶(SEQID NO:6)。它催化脂肪醛氧化成脂肪酸。
诸位发明人发现，Hfd4的活性降低导致解脂耶氏酵母中去饱和脂肪醇的滴度增高。在具体的实施方案中，如上所述，酵母细胞还具有Pex10或与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的蛋白质的活性的降低或完全丧失。
因此，本公开文本的产油酵母细胞表达至少一种如上所述的能够在脂肪酰基-CoA中引入至少一个双键的异源去饱和酶、至少一种如上所述的能够将至少一部分的所述去饱和脂肪酰基-CoA转化为去饱和脂肪醇的异源脂肪酰基-CoA还原酶，并且具有降低的Hfd4或如下蛋白质的活性，所述蛋白质与Hfd4(SEQ ID NO:6)具有至少60％同源性，如与Hfd4(SEQID NO:6)具有至少65％同源性、如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。
可以通过本领域已知的方法获得Hfd4或与其具有至少60％同源性的蛋白质的活性的降低。在一个实施方案中，降低的活性是活性的完全丧失。例如，可以使编码Hfd4或与其具有至少60％同源性的蛋白质的基因敲除或缺失，或者可以如本领域所已知的那样阻止其转录，例如通过在基因上游引入阻抑性启动子，导致在阻遏化合物的存在下转录完全失活。
在一些实施方案中，使编码Hfd4或与其具有至少60％同源性的蛋白质的基因缺失。在一个实施方案中，所述基因是HFD4(SEQ ID NO:5)，并且产油酵母细胞是解脂耶氏酵母。
在一个实施方案中，酵母细胞表达：
-至少一种选自以下的异源去饱和酶：与如SEQ ID NO:2中所示的来自脐橙螟的Δ11去饱和酶具有至少60％同源性的Δ11去饱和酶、与如SEQ ID NO:18中所示的来自黑腹果蝇的Δ9去饱和酶具有至少60％同源性的Δ9去饱和酶、与如SEQ ID NO:19中所示的来自玫瑰色卷蛾的Δ11去饱和酶具有至少60％同源性的Δ11去饱和酶和与如SEQID NO:20中所示的来自斑点色卷蛾的Δ11去饱和酶具有至少60％同源性的Δ11去饱和酶；优选地，所述至少一种异源去饱和酶是与如SEQ ID NO:2中所示的来自脐橙螟的Δ11去饱和酶具有至少60％同源性的Δ11去饱和酶或与如SEQ ID NO:18中所示的来自黑腹果蝇的Δ9去饱和酶具有至少60％同源性的Δ9去饱和酶；以及
-至少一种选自以下的异源脂肪酰基-CoA还原酶：与如SEQ ID NO:14中所示的来自棉铃虫的FAR具有至少80％同源性的FAR、与如SEQ ID NO:16中所示的来自烟夜蛾的FAR具有至少80％同源性的FAR、与如SEQ ID NO:12中所示的来自Heliothis subflexa的FAR具有至少80％同源性的FAR和与如SEQ ID NO:24中所示的来自Bicyclus anynana的FAR具有至少80％同源性的FAR；优选地，所述FAR选自与如SEQ ID NO:14中所示的衍生自棉铃虫的FAR具有至少80％同源性的FAR和与如SEQ ID NO:12中所示的来自Heliothissubflexa的FAR具有至少80％同源性的FAR；并且
-具有降低的Hfd4或与其具有至少65％同源性的蛋白质的活性或活性的完全丧失，所述蛋白质与Hfd4(SEQ ID NO:6)具有如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。
在具体的实施方案中，如上所述，酵母细胞还具有Pex10或与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的蛋白质的活性的降低或完全丧失。
在一个实施方案中，酵母细胞表达：
-至少一种与如SEQ ID NO:2中所示的来自脐橙螟的Δ11去饱和酶具有至少60％同源性的异源去饱和酶；以及
-至少一种与如SEQ ID NO:14中所示的来自棉铃虫的FAR具有至少80％同源性的异源脂肪酰基-CoA还原酶；并且
-具有降低的Hfd4或与其具有至少65％同源性的蛋白质的活性或活性的完全丧失，所述蛋白质与Hfd4(SEQ ID NO:6)具有如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。
在具体的实施方案中，如上所述，酵母细胞还具有Pex10或与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的蛋白质的活性的降低或完全丧失。
在另一个实施方案中，酵母细胞表达：
-至少一种与如SEQ ID NO:18中所示的来自黑腹果蝇的Δ9去饱和酶具有至少60％同源性的异源去饱和酶；以及
-至少一种与如SEQ ID NO:14中所示的来自棉铃虫的FAR具有至少80％同源性的异源脂肪酰基-CoA还原酶；并且
-具有降低的Hfd4或与其具有至少65％同源性的蛋白质的活性或活性的完全丧失，所述蛋白质与Hfd4(SEQ ID NO:6)具有如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。
在具体的实施方案中，如上所述，酵母细胞还具有Pex10或与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的蛋白质的活性的降低或完全丧失。
在另一个实施方案中，酵母细胞表达：
-至少一种与如SEQ ID NO:2中所示的来自脐橙螟的Δ11去饱和酶具有至少60％同源性的异源去饱和酶；以及
-至少一种与如SEQ ID NO:16中所示的来自烟夜蛾的FAR具有至少80％同源性的异源脂肪酰基-CoA还原酶；并且
-具有降低的Hfd4或与其具有至少65％同源性的蛋白质的活性或活性的完全丧失，所述蛋白质与Hfd4(SEQ ID NO:6)具有如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。
在具体的实施方案中，如上所述，酵母细胞还具有Pex10或与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的蛋白质的活性的降低或完全丧失。
在另一个实施方案中，酵母细胞表达：
-至少一种与如SEQ ID NO:18中所示的来自黑腹果蝇的Δ9去饱和酶具有至少60％同源性的异源去饱和酶；以及
-至少一种与如SEQ ID NO:16中所示的来自烟夜蛾的FAR具有至少80％同源性的异源脂肪酰基-CoA还原酶；并且
-具有降低的Hfd4或与其具有至少65％同源性的蛋白质的活性或活性的完全丧失，所述蛋白质与Hfd4(SEQ ID NO:6)具有如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。
在具体的实施方案中，如上所述，酵母细胞还具有Pex10或与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的蛋白质的活性的降低或完全丧失。
在另一个实施方案中，酵母细胞表达：
-至少一种与如SEQ ID NO:2中所示的来自脐橙螟的Δ11去饱和酶具有至少60％同源性的异源去饱和酶；以及
-至少一种与如SEQ ID NO:12中所示的来自Heliothis subflexa的FAR具有至少80％同源性的异源脂肪酰基-CoA还原酶；并且
-具有降低的Hfd4或与其具有至少65％同源性的蛋白质的活性或活性的完全丧失，所述蛋白质与Hfd4(SEQ ID NO:6)具有如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。
在具体的实施方案中，如上所述，酵母细胞还具有Pex10或与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的蛋白质的活性的降低或完全丧失。
在另一个实施方案中，酵母细胞表达：
-至少一种与如SEQ ID NO:18中所示的来自黑腹果蝇的Δ9去饱和酶具有至少60％同源性的异源去饱和酶；以及
-至少一种与如SEQ ID NO:12中所示的来自Heliothis subflexa的FAR具有至少80％同源性的异源脂肪酰基-CoA还原酶；并且
-具有降低的Hfd4或与其具有至少65％同源性的蛋白质的活性或活性的完全丧失，所述蛋白质与Hfd4(SEQ ID NO:6)具有如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。
在具体的实施方案中，如上所述，酵母细胞还具有Pex10或与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的蛋白质的活性的降低或完全丧失。
在另一个实施方案中，酵母细胞表达：
-至少一种与如SEQ ID NO:2中所示的来自脐橙螟的Δ11去饱和酶具有至少60％同源性的异源去饱和酶；以及
-至少一种与如SEQ ID NO:24中所示的来自Bicyclus anynana的FAR具有至少80％同源性的异源脂肪酰基-CoA还原酶；并且
-具有降低的Hfd4或与其具有至少65％同源性的蛋白质的活性或活性的完全丧失，所述蛋白质与Hfd4(SEQ ID NO:6)具有如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。
在具体的实施方案中，如上所述，酵母细胞还具有Pex10或与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的蛋白质的活性的降低或完全丧失。
在另一个实施方案中，酵母细胞表达：
-至少一种与如SEQ ID NO:18中所示的来自黑腹果蝇的Δ9去饱和酶具有至少60％同源性的异源去饱和酶；以及
-至少一种与如SEQ ID NO:24中所示的来自Bicyclus anynana的FAR具有至少80％同源性的异源脂肪酰基-CoA还原酶；并且
-具有降低的Hfd4或与其具有至少65％同源性的蛋白质的活性或活性的完全丧失，所述蛋白质与Hfd4(SEQ ID NO:6)具有如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。
在具体的实施方案中，如上所述，酵母细胞还具有Pex10或与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的蛋白质的活性的降低或完全丧失。
在优选的实施方案中，酵母细胞是耶氏酵母属细胞，如解脂耶氏酵母细胞。
脂肪醇氧化酶Fao1
在解脂耶氏酵母中，FAO1(YALI0B14014g，SEQ ID NO:21)编码脂肪醇氧化酶(SEQID NO:22)。其缺失导致ω-羟基脂肪酸的积累增加。
诸位发明人发现，Fao1的活性降低导致解脂耶氏酵母中去饱和脂肪醇的滴度增高。在具体的实施方案中，如上所述，酵母细胞还具有Pex10或与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的蛋白质的活性的降低或完全丧失。
因此，本公开文本的产油酵母细胞表达至少一种如上所述的能够在脂肪酰基-CoA中引入至少一个双键的异源去饱和酶、至少一种如上所述的能够将至少一部分的所述去饱和脂肪酰基-CoA转化为去饱和脂肪醇的异源脂肪酰基-CoA还原酶，并且具有降低的Fao1或如下蛋白质的活性，所述蛋白质与Fao1(SEQ ID NO:22)具有至少60％同源性，如与Fao1(SEQ ID NO:22)之一具有至少65％同源性、如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。
可以通过本领域已知的方法获得Fao1或与其具有至少60％同源性的蛋白质的活性的降低。在一个实施方案中，降低的活性是活性的完全丧失。例如，可以使编码Fao1或与其具有至少60％同源性的蛋白质的基因敲除或缺失，或者可以如本领域所已知的那样阻止其转录，例如通过在基因上游引入阻抑性启动子，导致在阻遏化合物的存在下转录完全失活。
在一些实施方案中，使编码Fao1或与其具有至少60％同源性的蛋白质的基因缺失。在一个实施方案中，所述基因是Fao1(SEQ ID NO:21)，并且产油酵母细胞是解脂耶氏酵母。
在一个实施方案中，酵母细胞表达：
-至少一种选自以下的异源去饱和酶：与如SEQ ID NO:2中所示的来自脐橙螟的Δ11去饱和酶具有至少60％同源性的Δ11去饱和酶、与如SEQ ID NO:18中所示的来自黑腹果蝇的Δ9去饱和酶具有至少60％同源性的Δ9去饱和酶、与如SEQ ID NO:19中所示的来自玫瑰色卷蛾的Δ11去饱和酶具有至少60％同源性的Δ11去饱和酶和与如SEQ ID NO:20中所示的来自斑点色卷蛾的Δ11去饱和酶具有至少60％同源性的Δ11去饱和酶；优选地，所述至少一种异源去饱和酶是与如SEQ ID NO:2中所示的来自脐橙螟的Δ11去饱和酶具有至少60％同源性的Δ11去饱和酶或与如SEQ ID NO:18中所示的来自黑腹果蝇的Δ9去饱和酶具有至少60％同源性的Δ9去饱和酶；以及
-至少一种选自以下的异源脂肪酰基-CoA还原酶：与如SEQ ID NO:14中所示的来自棉铃虫的FAR具有至少80％同源性的FAR、与如SEQ ID NO:16中所示的来自烟夜蛾的FAR具有至少80％同源性的FAR、与如SEQ ID NO:12中所示的来自Heliothis subflexa的FAR具有至少80％同源性的FAR和与如SEQ ID NO:24中所示的来自Bicyclus anynana的FAR具有至少80％同源性的FAR；优选地，所述FAR选自与如SEQ ID NO:14中所示的衍生自棉铃虫的FAR具有至少80％同源性的FAR和与如SEQ ID NO:12中所示的来自Heliothissubflexa的FAR具有至少80％同源性的FAR；并且
-具有降低的Fao1或与其具有至少65％同源性的蛋白质的活性或活性的完全丧失，所述蛋白质与Fao1(SEQ ID NO:22)具有如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。
在具体的实施方案中，如上所述，酵母细胞还具有Pex10或与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的蛋白质的活性的降低或完全丧失。
在一个实施方案中，酵母细胞表达：
-至少一种与如SEQ ID NO:2中所示的来自脐橙螟的Δ11去饱和酶具有至少60％同源性的异源去饱和酶；以及
-至少一种与如SEQ ID NO:14中所示的来自棉铃虫的FAR具有至少80％同源性的异源脂肪酰基-CoA还原酶；并且
-具有降低的Fao1或与其具有至少65％同源性的蛋白质的活性或活性的完全丧失，所述蛋白质与Fao1(SEQ ID NO:22)具有如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。
在具体的实施方案中，如上所述，酵母细胞还具有Pex10或与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的蛋白质的活性的降低或完全丧失。
在另一个实施方案中，酵母细胞表达：
-至少一种与如SEQ ID NO:18中所示的来自黑腹果蝇的Δ9去饱和酶具有至少60％同源性的异源去饱和酶；以及
-至少一种与如SEQ ID NO:14中所示的来自棉铃虫的FAR具有至少80％同源性的异源脂肪酰基-CoA还原酶；并且
-具有降低的Fao1或与其具有至少65％同源性的蛋白质的活性或活性的完全丧失，所述蛋白质与Fao1(SEQ ID NO:22)具有如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。
在具体的实施方案中，如上所述，酵母细胞还具有Pex10或与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的蛋白质的活性的降低或完全丧失。
在另一个实施方案中，酵母细胞表达：
-至少一种与如SEQ ID NO:2中所示的来自脐橙螟的Δ11去饱和酶具有至少60％同源性的异源去饱和酶；以及
-至少一种与如SEQ ID NO:16中所示的来自烟夜蛾的FAR具有至少80％同源性的异源脂肪酰基-CoA还原酶；并且
-具有降低的Fao1或与其具有至少65％同源性的蛋白质的活性或活性的完全丧失，所述蛋白质与Fao1(SEQ ID NO:22)具有如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。
在具体的实施方案中，如上所述，酵母细胞还具有Pex10或与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的蛋白质的活性的降低或完全丧失。
在另一个实施方案中，酵母细胞表达：
-至少一种与如SEQ ID NO:18中所示的来自黑腹果蝇的Δ9去饱和酶具有至少60％同源性的异源去饱和酶；以及
-至少一种与如SEQ ID NO:16中所示的来自烟夜蛾的FAR具有至少80％同源性的异源脂肪酰基-CoA还原酶；并且
-具有降低的Fao1或与其具有至少65％同源性的蛋白质的活性或活性的完全丧失，所述蛋白质与Fao1(SEQ ID NO:22)具有如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。
在具体的实施方案中，如上所述，酵母细胞还具有Pex10或与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的蛋白质的活性的降低或完全丧失。
在另一个实施方案中，酵母细胞表达：
-至少一种与如SEQ ID NO:2中所示的来自脐橙螟的Δ11去饱和酶具有至少60％同源性的异源去饱和酶；以及
-至少一种与如SEQ ID NO:12中所示的来自Heliothis subflexa的FAR具有至少80％同源性的异源脂肪酰基-CoA还原酶；并且
-具有降低的Fao1或与其具有至少65％同源性的蛋白质的活性或活性的完全丧失，所述蛋白质与Fao1(SEQ ID NO:22)具有如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。
在具体的实施方案中，如上所述，酵母细胞还具有Pex10或与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的蛋白质的活性的降低或完全丧失。
在另一个实施方案中，酵母细胞表达：
-至少一种与如SEQ ID NO:18中所示的来自黑腹果蝇的Δ9去饱和酶具有至少60％同源性的异源去饱和酶；以及
-至少一种与如SEQ ID NO:12中所示的来自Heliothis subflexa的FAR具有至少80％同源性的异源脂肪酰基-CoA还原酶；并且
-具有降低的Fao1或与其具有至少65％同源性的蛋白质的活性或活性的完全丧失，所述蛋白质与Fao1(SEQ ID NO:22)具有如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。
在具体的实施方案中，如上所述，酵母细胞还具有Pex10或与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的蛋白质的活性的降低或完全丧失。
在另一个实施方案中，酵母细胞表达：
-至少一种与如SEQ ID NO:2中所示的来自脐橙螟的Δ11去饱和酶具有至少60％同源性的异源去饱和酶；以及
-至少一种与如SEQ ID NO:24中所示的来自Bicyclus anynana的FAR具有至少80％同源性的异源脂肪酰基-CoA还原酶；并且
-具有降低的Fao1或与其具有至少65％同源性的蛋白质的活性或活性的完全丧失，所述蛋白质与Fao1(SEQ ID NO:22)具有如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。
在具体的实施方案中，如上所述，酵母细胞还具有Pex10或与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的蛋白质的活性的降低或完全丧失。
在另一个实施方案中，酵母细胞表达：
-至少一种与如SEQ ID NO:18中所示的来自黑腹果蝇的Δ9去饱和酶具有至少60％同源性的异源去饱和酶；以及
-至少一种与如SEQ ID NO:24中所示的来自Bicyclus anynana的FAR具有至少80％同源性的异源脂肪酰基-CoA还原酶；并且
-具有降低的Fao1或与其具有至少65％同源性的蛋白质的活性或活性的完全丧失，所述蛋白质与Fao1(SEQ ID NO:22)具有如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。
在具体的实施方案中，如上所述，酵母细胞还具有Pex10或与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的蛋白质的活性的降低或完全丧失。
在优选的实施方案中，酵母细胞是耶氏酵母属细胞，如解脂耶氏酵母细胞。
甘油-3-磷酸酰基转移酶GPAT
在解脂耶氏酵母中，GPAT(YALI0C00209g，SEQ ID NO:9)编码甘油-3-磷酸酰基转移酶(SEQ ID NO:10)。GPAT催化朝向甘油脂生物合成的第一反应。所述基因在解脂耶氏酵母中是必需的。
诸位发明人发现，Fao1的活性降低导致解脂耶氏酵母中去饱和脂肪醇的滴度增高。在具体的实施方案中，如上所述，酵母细胞还具有Pex10或与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的蛋白质的活性的降低或完全丧失。
因此，本公开文本的产油酵母细胞表达至少一种如上所述的能够在脂肪酰基-CoA中引入至少一个双键的异源去饱和酶、至少一种如上所述的能够将至少一部分的所述去饱和脂肪酰基-CoA转化为去饱和脂肪醇的异源脂肪酰基-CoA还原酶，并且具有降低的Fao1或如下蛋白质的活性，所述蛋白质与GPAT(SEQ ID NO:10)具有至少60％同源性，如与GPAT(SEQ ID NO:10)之一具有至少65％同源性、如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。
可以通过本领域已知的方法获得GPAT或与其具有至少60％同源性的蛋白质的活性的降低。在一个实施方案中，降低的活性是活性的部分丧失。例如，可以使编码GPAT或与其具有至少60％同源性的蛋白质的基因突变，或者可以如本领域所已知的那样减少其转录，例如通过在基因上游引入阻抑性启动子，导致在阻遏化合物的存在下转录部分失活。如果酵母细胞是解脂耶氏酵母，则在不使所述基因缺失的情况下降低GPAT活性。
在一个实施方案中，酵母细胞表达：
-至少一种选自以下的异源去饱和酶：与如SEQ ID NO:2中所示的来自脐橙螟的Δ11去饱和酶具有至少60％同源性的Δ11去饱和酶、与如SEQ ID NO:18中所示的来自黑腹果蝇的Δ9去饱和酶具有至少60％同源性的Δ9去饱和酶、与如SEQ ID NO:19中所示的来自玫瑰色卷蛾的Δ11去饱和酶具有至少60％同源性的Δ11去饱和酶和与如SEQ ID NO:20中所示的来自斑点色卷蛾的Δ11去饱和酶具有至少60％同源性的Δ11去饱和酶；优选地，所述至少一种异源去饱和酶是与如SEQ ID NO:2中所示的来自脐橙螟的Δ11去饱和酶具有至少60％同源性的Δ11去饱和酶或与如SEQ ID NO:18中所示的来自黑腹果蝇的Δ9去饱和酶具有至少60％同源性的Δ9去饱和酶；以及
-至少一种选自以下的异源脂肪酰基-CoA还原酶：与如SEQ ID NO:14中所示的来自棉铃虫的FAR具有至少80％同源性的FAR、与如SEQ ID NO:16中所示的来自烟夜蛾的FAR具有至少80％同源性的FAR、与如SEQ ID NO:12中所示的来自Heliothis subflexa的FAR具有至少80％同源性的FAR和与如SEQ ID NO:24中所示的来自Bicyclus anynana的FAR具有至少80％同源性的FAR；优选地，所述FAR选自与如SEQ ID NO:14中所示的衍生自棉铃虫的FAR具有至少80％同源性的FAR和与如SEQ ID NO:12中所示的来自Heliothissubflexa的FAR具有至少80％同源性的FAR；并且
-具有降低的GPAT或与其具有至少65％同源性的蛋白质的活性或活性的完全丧失，所述蛋白质与GPAT(SEQ ID NO:10)具有如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。
在具体的实施方案中，如上所述，酵母细胞还具有Pex10或与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的蛋白质的活性的降低或完全丧失。
在一个实施方案中，酵母细胞表达：
-至少一种与如SEQ ID NO:2中所示的来自脐橙螟的Δ11去饱和酶具有至少60％同源性的异源去饱和酶；以及
-至少一种与如SEQ ID NO:14中所示的来自棉铃虫的FAR具有至少80％同源性的异源脂肪酰基-CoA还原酶；并且
-具有降低的GPAT或与其具有至少65％同源性的蛋白质的活性或活性的完全丧失，所述蛋白质与GPAT(SEQ ID NO:10)具有如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。
在具体的实施方案中，如上所述，酵母细胞还具有Pex10或与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的蛋白质的活性的降低或完全丧失。
在另一个实施方案中，酵母细胞表达：
-至少一种与如SEQ ID NO:18中所示的来自黑腹果蝇的Δ9去饱和酶具有至少60％同源性的异源去饱和酶；以及
-至少一种与如SEQ ID NO:14中所示的来自棉铃虫的FAR具有至少80％同源性的异源脂肪酰基-CoA还原酶；并且
-具有降低的GPAT或与其具有至少65％同源性的蛋白质的活性或活性的完全丧失，所述蛋白质与GPAT(SEQ ID NO:10)具有如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。
在具体的实施方案中，如上所述，酵母细胞还具有Pex10或与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的蛋白质的活性的降低或完全丧失。
在另一个实施方案中，酵母细胞表达：
-至少一种与如SEQ ID NO:2中所示的来自脐橙螟的Δ11去饱和酶具有至少60％同源性的异源去饱和酶；以及
-至少一种与如SEQ ID NO:16中所示的来自烟夜蛾的FAR具有至少80％同源性的异源脂肪酰基-CoA还原酶；并且
-具有降低的GPAT或与其具有至少65％同源性的蛋白质的活性或活性的完全丧失，所述蛋白质与GPAT(SEQ ID NO:10)具有如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。
在具体的实施方案中，如上所述，酵母细胞还具有Pex10或与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的蛋白质的活性的降低或完全丧失。
在另一个实施方案中，酵母细胞表达：
-至少一种与如SEQ ID NO:18中所示的来自黑腹果蝇的Δ9去饱和酶具有至少60％同源性的异源去饱和酶；以及
-至少一种与如SEQ ID NO:16中所示的来自烟夜蛾的FAR具有至少80％同源性的异源脂肪酰基-CoA还原酶；并且
-具有降低的GPAT或与其具有至少65％同源性的蛋白质的活性或活性的完全丧失，所述蛋白质与GPAT(SEQ ID NO:10)具有如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。
在具体的实施方案中，如上所述，酵母细胞还具有Pex10或与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的蛋白质的活性的降低或完全丧失。
在另一个实施方案中，酵母细胞表达：
-至少一种与如SEQ ID NO:2中所示的来自脐橙螟的Δ11去饱和酶具有至少60％同源性的异源去饱和酶；以及
-至少一种与如SEQ ID NO:12中所示的来自Heliothis subflexa的FAR具有至少80％同源性的异源脂肪酰基-CoA还原酶；并且
-具有降低的GPAT或与其具有至少65％同源性的蛋白质的活性或活性的完全丧失，所述蛋白质与GPAT(SEQ ID NO:10)具有如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。
在具体的实施方案中，如上所述，酵母细胞还具有Pex10或与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的蛋白质的活性的降低或完全丧失。
在另一个实施方案中，酵母细胞表达：
-至少一种与如SEQ ID NO:18中所示的来自黑腹果蝇的Δ9去饱和酶具有至少60％同源性的异源去饱和酶；以及
-至少一种与如SEQ ID NO:12中所示的来自Heliothis subflexa的FAR具有至少80％同源性的异源脂肪酰基-CoA还原酶；并且
-具有降低的GPAT或与其具有至少65％同源性的蛋白质的活性或活性的完全丧失，所述蛋白质与GPAT(SEQ ID NO:10)具有如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。
在具体的实施方案中，如上所述，酵母细胞还具有Pex10或与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的蛋白质的活性的降低或完全丧失。
在另一个实施方案中，酵母细胞表达：
-至少一种与如SEQ ID NO:2中所示的来自脐橙螟的Δ11去饱和酶具有至少60％同源性的异源去饱和酶；以及
-至少一种与如SEQ ID NO:24中所示的来自Bicyclus anynana的FAR具有至少80％同源性的异源脂肪酰基-CoA还原酶；并且
-具有降低的GPAT或与其具有至少65％同源性的蛋白质的活性或活性的完全丧失，所述蛋白质与GPAT(SEQ ID NO:10)具有如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。
在具体的实施方案中，如上所述，酵母细胞还具有Pex10或与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的蛋白质的活性的降低或完全丧失。
在另一个实施方案中，酵母细胞表达：
-至少一种与如SEQ ID NO:18中所示的来自黑腹果蝇的Δ9去饱和酶具有至少60％同源性的异源去饱和酶；以及
-至少一种与如SEQ ID NO:24中所示的来自Bicyclus anynana的FAR具有至少80％同源性的异源脂肪酰基-CoA还原酶；并且
-具有降低的GPAT或与其具有至少65％同源性的蛋白质的活性或活性的完全丧失，所述蛋白质与GPAT(SEQ ID NO:10)具有如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。
在具体的实施方案中，如上所述，酵母细胞还具有Pex10或与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的蛋白质的活性的降低或完全丧失。
在优选的实施方案中，酵母细胞是耶氏酵母属细胞，如解脂耶氏酵母细胞。
Hfd1、Hfd4、Pex10、Fao1和GPAT中的两种或更多种的活性的降低
降低多于一种上文所列出的蛋白质的活性可能是有利的。在一些实施方案中，酵母细胞具有Pex10或与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的蛋白质(如上所述)以及Hfd1、Hfd4、Fao1和GPAT中的两种或更多种或与其具有至少65％同源性的其同源物的活性的降低或完全丧失，所述同源物与如SEQ ID NO:4中所示的Hfd1、与如SEQ ID NO:6中所示的Hfd4、与如SEQ ID NO:22中所示的Fao1或与如SEQ ID NO:10中所示的GPAT具有如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。
因此，在一些实施方案中，酵母细胞具有降低的Hfd1、Hfd4、Pex10、Fao1和GPAT中的两种或更多种或与其具有至少65％同源性的同源物的活性，所述同源物与如SEQ ID NO:4中所示的Hfd1、与如SEQ ID NO:6中所示的Hfd4、与如SEQ ID NO:8中所示的Pex10、与如SEQ ID NO:22中所示的Fao1或与如SEQ ID NO:10中所示的GPAT具有如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。
在一个实施方案中，酵母细胞表达至少一种如上所述的异源去饱和酶和至少一种如上所述的脂肪酰基-CoA还原酶，并且具有降低的Hfd1和Hfd4或与其具有至少65％同源性的同源物的活性，所述同源物与如SEQ ID NO:4中所示的Hfd1或如SEQ ID NO:6中所示的Hfd4具有如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。
在另一个实施方案中，酵母细胞表达至少一种如上所述的异源去饱和酶和至少一种如上所述的脂肪酰基-CoA还原酶，并且具有降低的Hfd1和Pex10或与其具有至少65％同源性的同源物的活性，所述同源物与如SEQ ID NO:4中所示的Hfd1或与如SEQ ID NO:8中所示的Pex10具有如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。
在另一个实施方案中，酵母细胞表达至少一种如上所述的异源去饱和酶和至少一种如上所述的脂肪酰基-CoA还原酶，并且具有降低的Hfd1和Fao1或与其具有至少65％同源性的同源物的活性，所述同源物与如SEQ ID NO:4中所示的Hfd1或与如SEQ ID NO:22中所示的Fao1具有如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。
在另一个实施方案中，酵母细胞表达至少一种如上所述的异源去饱和酶和至少一种如上所述的脂肪酰基-CoA还原酶，并且具有降低的Hfd1和GPAT或与其具有至少65％同源性的同源物的活性，所述同源物与如SEQ ID NO:4中所示的Hfd1或与如SEQ ID NO:10中所示的GPAT具有如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。
在另一个实施方案中，酵母细胞表达至少一种如上所述的异源去饱和酶和至少一种如上所述的脂肪酰基-CoA还原酶，并且具有降低的Hfd4和Pex10或与其具有至少65％同源性的同源物的活性，所述同源物与如SEQ ID NO:6中所示的Hfd4或与如SEQ ID NO:8中所示的Pex10具有如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。
在另一个实施方案中，酵母细胞表达至少一种如上所述的异源去饱和酶和至少一种如上所述的脂肪酰基-CoA还原酶，并且具有降低的Hfd4和Fao1或与其具有至少65％同源性的同源物的活性，所述同源物与如SEQ ID NO:6中所示的Hfd4或与如SEQ ID NO:22中所示的Fao1具有如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。
在另一个实施方案中，酵母细胞表达至少一种如上所述的异源去饱和酶和至少一种如上所述的脂肪酰基-CoA还原酶，并且具有降低的Hfd4和GPAT或与其具有至少65％同源性的同源物的活性，所述同源物与如SEQ ID NO:6中所示的Hfd4或与如SEQ ID NO:10中所示的GPAT具有如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。
在另一个实施方案中，酵母细胞表达至少一种如上所述的异源去饱和酶和至少一种如上所述的脂肪酰基-CoA还原酶，并且具有降低的Pex10和Fao1或与其具有至少65％同源性的同源物的活性，所述同源物与如SEQ ID NO:8中所示的Pex10或与如SEQ ID NO:22中所示的Fao1具有如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。
在另一个实施方案中，酵母细胞表达至少一种如上所述的异源去饱和酶和至少一种如上所述的脂肪酰基-CoA还原酶，并且具有降低的Pex10和GPAT或与其具有至少65％同源性的同源物的活性，所述同源物与如SEQ ID NO:8中所示的Pex10或与如SEQ ID NO:10中所示的GPAT具有如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。
在另一个实施方案中，酵母细胞表达至少一种如上所述的异源去饱和酶和至少一种如上所述的脂肪酰基-CoA还原酶，并且具有降低的Fao1和GPAT或与其具有至少65％同源性的同源物的活性，所述同源物与如SEQ ID NO:22中所示的Fao1或与如SEQ ID NO:10中所示的GPAT具有如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。
在其他实施方案中，酵母细胞具有降低的Hfd1、Hfd4、Pex10、Fao1和GPAT中的三种或更多种或与其具有至少65％同源性的同源物的活性，所述同源物与如SEQ ID NO:4中所示的Hfd1、与如SEQ ID NO:6中所示的Hfd4、与如SEQ ID NO:8中所示的Pex10、与如SEQ IDNO:22中所示的Fao1或与如SEQ ID NO:10中所示的GPAT具有如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。
在一个实施方案中，酵母细胞表达至少一种如上所述的异源去饱和酶和至少一种如上所述的脂肪酰基-CoA还原酶，并且具有降低的Hfd1、Hfd4和Pex10或与其具有至少65％同源性的其同源物的活性。
在另一个实施方案中，酵母细胞表达至少一种如上所述的异源去饱和酶和至少一种如上所述的脂肪酰基-CoA还原酶，并且具有降低的Hfd1、Hfd4和Fao1或与其具有至少65％同源性的其同源物的活性。
在另一个实施方案中，酵母细胞表达至少一种如上所述的异源去饱和酶和至少一种如上所述的脂肪酰基-CoA还原酶，并且具有降低的Hfd1、Hfd4和GPAT或与其具有至少65％同源性的其同源物的活性。
在另一个实施方案中，酵母细胞表达至少一种如上所述的异源去饱和酶和至少一种如上所述的脂肪酰基-CoA还原酶，并且具有降低的Hfd1、Pex10和Fao1或与其具有至少65％同源性的其同源物的活性。
在另一个实施方案中，酵母细胞表达至少一种如上所述的异源去饱和酶和至少一种如上所述的脂肪酰基-CoA还原酶，并且具有降低的Hfd1、Pex10和GPAT或与其具有至少65％同源性的其同源物的活性。
在另一个实施方案中，酵母细胞表达至少一种如上所述的异源去饱和酶和至少一种如上所述的脂肪酰基-CoA还原酶，并且具有降低的Hfd1、Fao1和GPAT或与其具有至少65％同源性的其同源物的活性。
在另一个实施方案中，酵母细胞表达至少一种如上所述的异源去饱和酶和至少一种如上所述的脂肪酰基-CoA还原酶，并且具有降低的Hfd4、Pex10和Fao1或与其具有至少65％同源性的其同源物的活性。
在另一个实施方案中，酵母细胞表达至少一种如上所述的异源去饱和酶和至少一种如上所述的脂肪酰基-CoA还原酶，并且具有降低的Hfd4、Pex10和GPAT或与其具有至少65％同源性的其同源物的活性。
在另一个实施方案中，酵母细胞表达至少一种如上所述的异源去饱和酶和至少一种如上所述的脂肪酰基-CoA还原酶，并且具有降低的Hfd4、Fao1和GPAT或与其具有至少65％同源性的其同源物的活性。
在另一个实施方案中，酵母细胞表达至少一种如上所述的异源去饱和酶和至少一种如上所述的脂肪酰基-CoA还原酶，并且具有降低的Pex10、Fao1和GPAT或与其具有至少65％同源性的其同源物的活性。
在其他实施方案中，酵母细胞具有降低的Hfd1、Hfd4、Pex10、Fao1和GPAT中的四种或更多种或与其具有至少65％同源性的同源物的活性，所述同源物与如SEQ ID NO:4中所示的Hfd1、与如SEQ ID NO:6中所示的Hfd4、与如SEQ ID NO:8中所示的Pex10、与如SEQ IDNO:22中所示的Fao1或与如SEQ ID NO:10中所示的GPAT具有如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。
在一个实施方案中，酵母细胞表达至少一种如上所述的异源去饱和酶和至少一种如上所述的脂肪酰基-CoA还原酶，并且具有降低的Hfd1、Hfd4、Pex10和Fao1或与其具有至少65％同源性的其同源物的活性。
在另一个实施方案中，酵母细胞表达至少一种如上所述的异源去饱和酶和至少一种如上所述的脂肪酰基-CoA还原酶，并且具有降低的Hfd1、Hfd4、Pex10和GPAT或与其具有至少65％同源性的其同源物的活性。
在另一个实施方案中，酵母细胞表达至少一种如上所述的异源去饱和酶和至少一种如上所述的脂肪酰基-CoA还原酶，并且具有降低的Hfd1、Pex10、Fao1和GPAT或与其具有至少65％同源性的其同源物的活性。
在另一个实施方案中，酵母细胞表达至少一种如上所述的异源去饱和酶和至少一种如上所述的脂肪酰基-CoA还原酶，并且具有降低的Hfd1、Hfd4、Fao1和GPAT或与其具有至少65％同源性的其同源物的活性。
在另一个实施方案中，酵母细胞表达至少一种如上所述的异源去饱和酶和至少一种如上所述的脂肪酰基-CoA还原酶，并且具有降低的Hfd4、Pex10、Fao1和GPAT或与其具有至少65％同源性的其同源物的活性。
在其他实施方案中，酵母细胞具有降低的Hfd1、Hfd4、Pex10、Fao1和GPAT中的全部或与其具有至少65％同源性的同源物的活性，所述同源物与如SEQ ID NO:4中所示的Hfd1、与如SEQ ID NO:6中所示的Hfd4、与如SEQ ID NO:8中所示的Pex10、与如SEQ ID NO:22中所示的Fao1或与如SEQ ID NO:10中所示的GPAT具有如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。
乙酰基转移酶(EC 2.3.1.84)
术语“乙酰基转移酶”是指EC编号2.3.1.84的酶，也可以称为“醇-O-乙酰基转移酶”或“AcT”。它作用于脂肪族醇，并且催化如下反应：
乙酰基-CoA +醇<＝>CoA +乙酰基酯。
本公开文本的酵母细胞可以表达或过表达乙酰基转移酶。乙酰基转移酶可以是待修饰的细胞已经能够表达的天然乙酰基转移酶，或者它可以是异源乙酰基转移酶。如果酵母细胞表达天然乙酰基转移酶，则优选地修饰酵母细胞使得增加天然乙酰基转移酶的表达。这可以通过本领域已知的方法完成，如但不限于在基因组中或在载体上引入编码乙酰基转移酶的核酸的另外拷贝、将启动子修饰为具有高表达水平的组成型启动子或修饰为在诱导后导致高表达水平的诱导型启动子。异源乙酰基转移酶可以从在细胞中(例如在诸如质粒等载体上)引入的核酸表达，或通过基因组整合表达。可以出于任何目的针对所用的特定酵母细胞对核酸进行密码子优化，如本领域所已知的。
如果酵母细胞不表达天然乙酰基转移酶，则可以在基因组位置中或在载体上将编码异源乙酰基转移酶的核酸引入细胞中，以使能够表达乙酰基转移酶。优选地，以高水平表达乙酰基转移酶，例如通过引入编码乙酰基转移酶的核酸的多个拷贝，或通过利用具有高表达水平的组成型启动子或利用在诱导后导致高表达水平的诱导型启动子。
因此，术语“过表达”是指与未经修饰以过表达乙酰基转移酶的酵母细胞(即亲本菌株)相比，酵母细胞中乙酰基转移酶的过表达。
在一些实施方案中，乙酰基转移酶是SEQ ID NO:62的AcT(Atf1，酿酒酵母(S.cerevisiae)AcT)或与Sc_Atf1具有至少75％同源性的其变体，所述变体与SEQ ID NO:62具有如至少76％、如至少77％、如至少78％、如至少79％、如至少80％、如至少81％、如至少82％、如至少83％、如至少84％、如至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％、如100％同源性。
在其他实施方案中，以化学方式完成至少一部分的去饱和脂肪醇向去饱和脂肪醇乙酸酯的转化，如技术人员所已知的。例如，可以将乙酰氯添加到脂肪醇中，并且在混合后将混合物在室温下孵育。
信息素化合物的产生
本公开文本的酵母细胞可以用于产生天然地包含在信息素(特别是鳞翅目信息素)中的化合物。此类化合物通常不是由产油酵母细胞天然产生的。
信息素化合物包括去饱和和饱和脂肪醇、去饱和和饱和脂肪醇乙酸酯以及去饱和和饱和脂肪醛。优选地，由本公开文本的细胞和方法产生的化合物是去饱和的。
使用本发明细胞通过本发明方法可获得的化合物可以是许多鳞翅目物种的天然存在的信息素化合物。许多鳞翅目物种的幼虫是农业中的主要害虫。一些主要害虫包括卷蛾科(Tortricidae)、夜蛾科(Noctuidae)和螟蛾科(Pyralidae)。夜蛾科粘虫属(Spodoptera)(粘虫)、铃夜蛾属(Helicoverpa)(玉米铃虫)或大菜粉蝶(Pierisbrassicae)的幼虫可以对某些作物造成广泛的破坏。玉米穗虫(Helicoverpa zea)幼虫(棉铃虫(cotton bollworm)或番茄果虫(tomato fruitworm))是杂食性的，这意味着它们吃各种作物，包括番茄和棉花。
在一些实施方案中，使用本发明细胞通过本发明方法可获得的化合物可以是卷蛾科、夜蛾科和螟蛾科属的天然存在的信息素化合物。例如，所述化合物天然存在于粘虫属或铃夜蛾属中。在一些实施方案中，所述化合物天然存在于番茄斑潜蝇(Tuta absoluta)(番茄蛾)、葡萄花翅小卷蛾(Lobesia botrana)(葡萄蛾)、石榴螟(Ectomyelois ceratoniae)(角豆蛾)或苹果褐卷蛾(Epiphyas postvittana)(浅褐色苹果蛾)中。
去饱和脂肪醇的产生
本公开文本的酵母细胞可以用于产生去饱和脂肪醇。如上所详述，此类化合物天然地包含在信息素(特别是鳞翅目信息素)中。
本发明产油酵母细胞表达至少一种能够在脂肪酰基-CoA中引入至少一个双键的异源去饱和酶和至少一种能够将至少一部分的所述去饱和脂肪酰基-CoA转化为去饱和脂肪醇的异源脂肪酰基-CoA还原酶，并且具有降低的Hfd1(SEQ ID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ ID NO:10)中的至少一种的活性或降低的如下至少一种蛋白质的活性，所述至少一种蛋白质与Hfd1(SEQ ID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ ID NO:10)中的一种具有至少60％同源性，如与Hfd1(SEQ ID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ ID NO:10)中的一种具有至少65％同源性、如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。在具体的实施方案中，如上所述，酵母细胞还具有Pex10或与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的蛋白质的活性的降低或完全丧失。
因此，本文提供了用于在产油酵母细胞中产生去饱和脂肪醇的方法，所述方法包括提供酵母细胞以及在培养基中孵育所述酵母细胞的步骤，其中所述酵母细胞：
i)表达至少一种能够在脂肪酰基-CoA中引入至少一个双键的异源去饱和酶，从而将至少一部分的所述脂肪酰基-CoA转化为去饱和脂肪酰基-CoA；并且
ii)表达至少一种能够将至少一部分的所述去饱和脂肪酰基-CoA转化为去饱和脂肪醇的异源脂肪酰基-CoA还原酶，从而产生所述去饱和脂肪醇；并且
iii)具有降低的Hfd1(SEQ ID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ ID NO:10)中的至少一种的活性或降低的如下至少一种蛋白质的活性，所述至少一种蛋白质与Hfd1(SEQ ID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ ID NO:10)中的一种具有至少60％同源性，如与Hfd1(SEQ ID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ ID NO:10)中的一种具有至少65％同源性、如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。
在具体的实施方案中，如上所述，酵母细胞具有至少Pex10或与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的蛋白质以及Hfd1、Hfd4、Fao1或GPAT中的至少一种的活性的降低或完全丧失。
酵母细胞、去饱和酶、脂肪酰基-CoA还原酶、Hfd1、Hfd4、Pex10、Fao1和GPAT或其同源物可以如本文其他地方所定义。
通过此类方法产生的脂肪醇可以是饱和的或去饱和的。通常，去饱和脂肪醇是最理想的，并且本公开文本的目的是提供用于获得具有高滴度的去饱和脂肪醇及其衍生物的方法。
因此，本公开文本的酵母细胞可以用于产生一系列去饱和脂肪醇，如：
-碳链长为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的(Z)-Δ3去饱和脂肪醇；
-碳链长为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的(E)-Δ3去饱和脂肪醇；
-碳链长为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的(Z)-Δ5去饱和脂肪醇；
-碳链长为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的(E)-Δ5去饱和脂肪醇；
-碳链长为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的(Z)-Δ6去饱和脂肪醇；
-碳链长为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的(E)-Δ6去饱和脂肪醇；
-碳链长为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的(Z)-Δ7去饱和脂肪醇；
-碳链长为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的(E)-Δ7去饱和脂肪醇；
-碳链长为9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的(Z)-Δ8去饱和脂肪醇；
-碳链长为9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的(E)-Δ8去饱和脂肪醇；
-碳链长为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的(Z)-Δ9去饱和脂肪醇；
-碳链长为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的(E)-Δ9去饱和脂肪醇；
-碳链长为11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的(Z)-Δ10去饱和脂肪醇；
-碳链长为11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的(E)-Δ10去饱和脂肪醇；
-碳链长为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的(Z)-Δ11去饱和脂肪醇；
-碳链长为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的(E)-Δ11去饱和脂肪醇；
-碳链长为13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的(Z)-Δ12去饱和脂肪醇；
-碳链长为13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的(E)-Δ12去饱和脂肪醇；
-碳链长为14、15、16、17、18、19、20、21或22的(Z)-Δ13去饱和脂肪醇；以及
-碳链长为14、15、16、17、18、19、20、21或22的(E)-Δ13去饱和脂肪醇。
在一个实施方案中，脂肪醇的链长为8。在另一个实施方案中，脂肪醇的链长为9。在另一个实施方案中，脂肪醇的链长为10。在另一个实施方案中，脂肪醇的链长为11。在另一个实施方案中，脂肪醇的链长为12。在另一个实施方案中，脂肪醇的链长为13。在另一个实施方案中，脂肪醇的链长为14。在另一个实施方案中，脂肪醇的链长为15。在另一个实施方案中，脂肪醇的链长为16。在另一个实施方案中，脂肪醇的链长为17。在另一个实施方案中，脂肪醇的链长为18。在另一个实施方案中，脂肪醇的链长为19。在另一个实施方案中，脂肪醇的链长为20。在另一个实施方案中，脂肪醇的链长为21。在另一个实施方案中，脂肪醇的链长为22。
因此，本文公开的酵母细胞可以表达异源Δ9去饱和酶和脂肪酰基-CoA还原酶，并且可以用于产生在位置9处具有Z构象的去饱和的脂肪醇，例如碳链长为14((Z)9-14:OH)。此脂肪醇是(Z)9-C14:OAc的前体，(Z)9-C14:OAc是衍生自多种物种(例如秋粘虫草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda))的信息素的重要组分。
在其他实施方案中，酵母细胞表达异源Δ11去饱和酶和脂肪酰基-CoA还原酶，并且可以用于产生在位置9处具有Z构象的去饱和的脂肪醇。例如，可以产生(Z)11-C14:OH，即碳链长为14的在位置9处具有Z构象的去饱和的脂肪醇。此脂肪醇是(Z)11-C14:OAc的前体，(Z)11-C14:OAc是衍生自多种物种(例如欧洲玉米螟(European corn borer Ostrinianubilalis)和红带卷蛾(red-banded leafroller Argyrotaenia velutinana))的信息素的重要组分。
因此，本文公开的酵母细胞可以表达异源Δ11去饱和酶、脂肪酰基-CoA还原酶和乙酰基转移酶，并且可以用于产生在位置11处具有Z构象的去饱和的脂肪醇乙酸酯，例如碳链长为16((Z)11-16:OH)。此脂肪醇可以被氧化成(Z)11-16:Ald，它是衍生自多种物种(例如棉铃虫(cotton bollworm Helicoverpa armigera))的信息素的重要组分。
在其他实施方案中，酵母细胞表达异源Δ11去饱和酶和脂肪酰基-CoA还原酶，并且可以用于产生在位置9处具有E构象的去饱和的脂肪醇。例如，可以产生(E)11-C14:OH，即碳链长为14的在位置9处具有E构象的去饱和的脂肪醇。此脂肪醇是(E)11-C14:OAc的前体，(E)11-C14:OAc是衍生自多种物种(例如浅褐色苹果蛾苹果褐卷蛾)的信息素的重要组分。
由本发明酵母细胞产生的去饱和脂肪醇也可以在多于一个位置中去饱和。去饱和脂肪醇可以在至少两个位置(如至少三个位置、如四个位置)中去饱和。
例如，可以产生碳链长为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的(E)7,(Z)9去饱和脂肪醇。可以产生碳链长为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22(例如14)的(E)3,(Z)8,(Z)11去饱和脂肪醇。可以产生碳链长为14、15、16、17、18、19、20、21或22的(Z)9,(E)11,(E)13去饱和脂肪醇。
由此产生的去饱和脂肪醇可以如本领域所已知的那样进一步修饰，例如通过碳链缩短。
在一些实施方案中，可以产生碳链长为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的(E)7,(Z)9去饱和脂肪醇。在其他实施方案中，可以产生碳链长为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的(E)3,(Z)8,(Z)11去饱和脂肪醇。在又另一个实施方案中，可以产生碳链长为14、15、16、17、18、19、20、21或22的(Z)9,(E)11,(E)13去饱和脂肪醇。
去饱和脂肪醇乙酸酯的产生
脂肪醇乙酸酯(特别是去饱和脂肪醇乙酸酯)也天然地包含在信息素(特别是由属于鳞翅目的物种产生的信息素)中。本公开文本的酵母细胞和方法也可以用于获得此类脂肪醇乙酸酯。
这可以通过引入编码乙酰基转移酶的基因来完成，如上所详述；或者可以通过化学方法完成，如技术人员所已知的。例如，可以将乙酰氯添加到脂肪醇中，并且在混合后将混合物在室温下孵育。
本公开文本的酵母细胞可以任选地表达或过表达能够将至少一部分的由细胞产生的去饱和脂肪醇转化为去饱和脂肪醇乙酸酯的乙酰基转移酶，并且因此可以用于产生一系列碳链长为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的去饱和脂肪乙酸酯，如：
-碳链长为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的(Z)-Δ3去饱和脂肪醇；
-碳链长为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的(E)-Δ3去饱和脂肪醇；
-碳链长为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的(Z)-Δ5去饱和脂肪乙酸酯；
-碳链长为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的(E)-Δ5去饱和脂肪乙酸酯；
-碳链长为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的(Z)-Δ6去饱和脂肪乙酸酯；
-碳链长为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的(E)-Δ6去饱和脂肪乙酸酯；
-碳链长为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的(Z)-Δ7去饱和脂肪乙酸酯；
-碳链长为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的(E)-Δ7去饱和脂肪乙酸酯；
-碳链长为9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的(Z)-Δ8去饱和脂肪乙酸酯；
-碳链长为9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的(E)-Δ8去饱和脂肪乙酸酯；
-碳链长为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的(Z)-Δ9去饱和脂肪乙酸酯；
-碳链长为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的(E)-Δ9去饱和脂肪乙酸酯；
-碳链长为11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的(Z)-Δ10去饱和脂肪乙酸酯；
-碳链长为11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的(E)-Δ10去饱和脂肪乙酸酯；
-碳链长为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的(Z)-Δ11去饱和脂肪乙酸酯；
-碳链长为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的(E)-Δ11去饱和脂肪乙酸酯；
-碳链长为13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的(Z)-Δ12去饱和脂肪乙酸酯；
-碳链长为13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的(E)-Δ12去饱和脂肪乙酸酯；
-碳链长为14、15、16、17、18、19、20、21或22的(Z)-Δ13去饱和脂肪乙酸酯；以及
-碳链长为14、15、16、17、18、19、20、21或22的(E)-Δ13去饱和脂肪乙酸酯。
在一个实施方案中，脂肪醇乙酸酯的链长为8。在另一个实施方案中，脂肪醇乙酸酯的链长为9。在另一个实施方案中，脂肪醇乙酸酯的链长为10。在另一个实施方案中，脂肪醇乙酸酯的链长为11。在另一个实施方案中，脂肪醇乙酸酯的链长为12。在另一个实施方案中，脂肪醇乙酸酯的链长为13。在另一个实施方案中，脂肪醇乙酸酯的链长为14。在另一个实施方案中，脂肪醇乙酸酯的链长为15。在另一个实施方案中，脂肪醇乙酸酯的链长为16。在另一个实施方案中，脂肪醇乙酸酯的链长为17。在另一个实施方案中，脂肪醇乙酸酯的链长为18。在另一个实施方案中，脂肪醇乙酸酯的链长为19。在另一个实施方案中，脂肪醇乙酸酯的链长为20。在另一个实施方案中，脂肪醇乙酸酯的链长为21。在另一个实施方案中，脂肪醇乙酸酯的链长为22。
因此，在一个实施方案中，酵母细胞表达异源Δ9去饱和酶、异源FAR和乙酰基转移酶，并且具有降低的Hfd1(SEQ ID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ ID NO:10)中的至少一种的活性或降低的与Hfd1(SEQ ID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ ID NO:10)中的一种具有至少60％同源性的至少一种蛋白质的活性，并且可以用于获得(Z)9-C14:OAc，即碳链长为14的在位置9处具有Z构象的去饱和的脂肪醇乙酸酯。此脂肪醇乙酸酯是衍生自多种物种(例如秋粘虫草地贪夜蛾)的信息素的重要组分。在具体的实施方案中，如上所述，酵母细胞具有至少Pex10或与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的蛋白质以及Hfd1、Hfd4、Fao1或GPAT中的至少一种的活性的降低或完全丧失。
在其他实施方案中，酵母细胞表达异源Δ11去饱和酶、异源FAR和乙酰基转移酶，并且具有降低的Hfd1(SEQ ID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQID NO:22)和GPAT(SEQ ID NO:10)中的至少一种的活性或降低的与Hfd1(SEQ ID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ ID NO:10)中的一种具有至少60％同源性的至少一种蛋白质的活性，并且可以用于产生(Z)11-C14:OAc，即碳链长为14的在位置9处具有Z构象的去饱和的脂肪醇乙酸酯。此脂肪醇乙酸酯是衍生自多种物种(例如欧洲玉米螟(European corn borer Ostrinia nubilalis)和红带卷蛾(red-banded leafroller Argyrotaenia velutinana))的信息素的重要组分。在具体的实施方案中，如上所述，酵母细胞具有至少Pex10或与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的蛋白质以及Hfd1、Hfd4、Fao1或GPAT中的至少一种的活性的降低或完全丧失。
在另一个实施方案中，酵母细胞表达异源Δ11去饱和酶、异源FAR，并且具有降低的Hfd1(SEQ ID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ ID NO:10)中的至少一种的活性或降低的与Hfd1(SEQ ID NO:4)、Hfd4(SEQ IDNO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ ID NO:10)中的一种具有至少60％同源性的至少一种蛋白质的活性，并且可以用于获得(Z)11-C16:OH。此脂肪醇可以被氧化成(Z)11-C16:Ald，它是衍生自多种物种(例如棉铃虫(cotton bollwormHelicoverpa armigera))的信息素的重要组分。在具体的实施方案中，如上所述，酵母细胞具有至少Pex10或与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的蛋白质以及Hfd1、Hfd4、Fao1或GPAT中的至少一种的活性的降低或完全丧失。
在其他实施方案中，酵母细胞表达异源Δ11去饱和酶、异源FAR和乙酰基转移酶，并且具有降低的Hfd1(SEQ ID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQID NO:22)和GPAT(SEQ ID NO:10)中的至少一种的活性或降低的与Hfd1(SEQ ID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ ID NO:10)中的一种具有至少60％同源性的至少一种蛋白质的活性，并且可以用于产生(E)11-C14:OAc，即碳链长为14的在位置9处具有E构象的去饱和的脂肪醇乙酸酯。此脂肪醇乙酸酯是衍生自多种物种(例如浅褐色苹果蛾苹果褐卷蛾)的信息素的重要组分。在具体的实施方案中，如上所述，酵母细胞具有至少Pex10或与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的蛋白质以及Hfd1、Hfd4、Fao1或GPAT中的至少一种的活性的降低或完全丧失。
在其他实施方案中，酵母细胞表达异源Δ10去饱和酶、异源FAR和乙酰基转移酶，并且具有降低的Hfd1(SEQ ID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQID NO:22)和GPAT(SEQ ID NO:10)中的至少一种的活性或降低的与Hfd1(SEQ ID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ ID NO:10)中的一种具有至少60％同源性的至少一种蛋白质的活性，并且可以用于产生(Z)10-C14:OAc，即碳链长为14的在位置10处具有Z构象的去饱和的脂肪醇乙酸酯。可以缩短此化合物以获得(Z)8-C12:OAc，它是衍生自多种物种(例如东方果蛾梨小食心虫(Grapholita molesta))的信息素的重要组分。在具体的实施方案中，如上所述，酵母细胞具有至少Pex10或与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的蛋白质以及Hfd1、Hfd4、Fao1或GPAT中的至少一种的活性的降低或完全丧失。
由本发明酵母细胞产生的去饱和脂肪乙酸酯也可以在多于一个位置中去饱和。去饱和脂肪乙酸酯可以在至少两个位置(如至少三个位置、如四个位置)中去饱和。
例如，可以产生碳链长为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的(E)7,(Z)9去饱和脂肪乙酸酯。可以产生碳链长为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的(E)3,(Z)8,(Z)11去饱和脂肪乙酸酯。可以产生碳链长为14、15、16、17、18、19、20、21或22的(Z)9,(E)11,(E)13去饱和脂肪乙酸酯。
由此产生的去饱和脂肪乙酸酯可以如本领域所已知的那样进一步修饰，例如通过碳链缩短。因此，可以从碳链长为14的脂肪乙酸酯开始产生碳链长为12的(E)7,(Z)9去饱和脂肪乙酸酯，可以从碳链长为14的脂肪乙酸酯开始产生碳链长为12的(E)3,(Z)8,(Z)11去饱和脂肪乙酸酯，并且可以从碳链长为14的脂肪乙酸酯开始产生碳链长为12的(Z)9,(E)11,(E)13去饱和脂肪乙酸酯。
在一些实施方案中，酵母细胞表达异源Δ9去饱和酶、Δ11去饱和酶、异源FAR和乙酰基转移酶，并且具有降低的Hfd1(SEQ ID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ ID NO:10)中的至少一种的活性或降低的与Hfd1(SEQID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ IDNO:10)中的一种具有至少60％同源性的至少一种蛋白质的活性，并且可以用于产生(E)9,(Z)11-C14:OAc，即碳链长为14的在位置9处具有E构象的去饱和并且在位置11处具有Z构象的去饱和的脂肪醇乙酸酯。可以缩短此化合物以获得(E)7,(Z)9:OAc，它是衍生自多种物种(例如葡萄蛾葡萄花翅小卷蛾)的信息素的重要组分。在具体的实施方案中，如上所述，酵母细胞具有至少Pex10或与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的蛋白质以及Hfd1、Hfd4、Fao1或GPAT中的至少一种的活性的降低或完全丧失。
去饱和脂肪醛的产生
虽然本公开文本提供了用于产生去饱和脂肪醇和去饱和脂肪醇乙酸酯的方法，但是可能感兴趣的是将所述脂肪醇进一步转化为对应的醛。因此，在一些实施方案中，所述方法还可以包括将至少一部分的脂肪醇转化为脂肪醛的步骤，从而产生脂肪醛。这可以通过化学方法或通过进一步工程化酵母细胞来实现。
在一些实施方案中，将至少一部分的脂肪醇转化为对应的醛的步骤是化学转化的步骤。化学转化是基于将脂肪醇氧化成对应的醛。用于进行这种转化的方法在本领域是已知的。优选的方法是环境友好的并且使有害废物的量最小化。在一些实施方案中，所述方法包括铜(I)/ABNO催化的需氧醇氧化反应(Steves&Stahl,2013)。
因此，在一些实施方案中，化学转化可以是不含金属的，避免有毒的重金属基试剂，如氧化锰、氧化铬(Jones ox.PDC、PCC)或钌化合物(TPAP、Ley-Griffith ox.)。在一些实施方案中，转化不涉及与活化的二甲基亚砜的反应，例如Swern氧化或Pfitzner-Moffat类型。此类反应可能涉及刻板形成痕量的可能难以从目标产物中除去的有强烈气味的有机硫化合物，如二甲基硫醚。
在一些实施方案中，所述方法包括Dess-Martin反应(Yadav等人,2004；Meyer等人,1994)。
在其他实施方案中，化学转化包括在水/有机两相条件下用次氯酸钠氧化(Okada等人,2014；Tamura等人,2012；Li等人,2009)。
在一些实施方案中，可以在含有25％吡啶的二氯甲烷介质中用1-氯苯并三唑进行化学氧化(Ferrell和Yao,1972)。
可替代地，脂肪醇氧化成对应的脂肪醛可以通过醇脱氢酶酶促地进行。技术人员将知道如何进行酶促氧化。例如，可以通过使经纯化的酶、细胞提取物或全细胞与脂肪醇接触来进行酶促氧化。
通过引入编码成醛脂肪酰基-CoA还原酶EC 1.2.1.50(FAR')的基因，可以将通过本文所述的细胞和方法可获得的脂肪醇进一步转化为脂肪醛。以这种方式，至少一部分的去饱和脂肪酰基-CoA可以被成醛脂肪酰基-CoA还原酶(FAR')转化为对应的脂肪醛。能够催化此转化的酶可以催化还原反应，其中脂肪酰基-CoA被还原成脂肪醛。此类酶是EC编号为1.2.1.50的成醛脂肪酰基-CoA还原酶，在本文中也称为FAR'或“成醛FAR'”。它们催化以下反应：
脂肪酰基-CoA+NADPH＝脂肪醛+NADP++辅酶A。
在一些实施方案中，可以诱导成醛FAR'的表达，例如如果编码此酶的基因处于诱导型启动子的控制下的话，如本领域所已知的。将酵母细胞在合适的条件下(如在适当的培养基中且在适当的温度下)孵育，如本领域技术人员所已知的。支持酵母生长的合适培养基在本领域是已知的，并且包括但不限于：成分不明确的完全培养基，如YEPD(或YPD，YeastExtract Peptone Dextrose)；成分明确的完全培养基，如SC(Synthetic Complete)；或缺乏一种或多种要素(如氨基酸或诱导物)的成分明确的补偿培养基，如SD(SyntheticDextrose)。
因此，可以获得以下去饱和脂肪醛：
-碳链长为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的(Z)-Δ3去饱和脂肪醇；
-碳链长为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的(E)-Δ3去饱和脂肪醇；
-碳链长为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的(Z)-Δ5去饱和脂肪醛；
-碳链长为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的(E)-Δ5去饱和脂肪醛；
-碳链长为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的(Z)-Δ6去饱和脂肪醛；
-碳链长为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的(E)-Δ6去饱和脂肪醛；
-碳链长为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的(Z)-Δ7去饱和脂肪醛；
-碳链长为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的(E)-Δ7去饱和脂肪醛；
-碳链长为9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的(Z)-Δ8去饱和脂肪醛；
-碳链长为9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的(E)-Δ8去饱和脂肪醛；
-碳链长为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的(Z)-Δ9去饱和脂肪醛；
-碳链长为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的(E)-Δ9去饱和脂肪醛；
-碳链长为11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的(Z)-Δ10去饱和脂肪醛；
-碳链长为11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的(E)-Δ10去饱和脂肪醛；
-碳链长为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的(Z)-Δ11去饱和脂肪醛；
-碳链长为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的(E)-Δ11去饱和脂肪醛；
-碳链长为13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的(Z)-Δ12去饱和脂肪醛；
-碳链长为13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的(E)-Δ12去饱和脂肪醛；
-碳链长为14、15、16、17、18、19、20、21或22的(Z)-Δ13去饱和脂肪醛；以及
-碳链长为14、15、16、17、18、19、20、21或22的(E)-Δ13去饱和脂肪醛。
在一个实施方案中，脂肪酰基醛的链长为8。在另一个实施方案中，脂肪酰基醛的链长为9。在另一个实施方案中，脂肪酰基醛的链长为10。在另一个实施方案中，脂肪酰基醛的链长为11。在另一个实施方案中，脂肪酰基醛的链长为12。在另一个实施方案中，脂肪酰基醛的链长为13。在另一个实施方案中，脂肪酰基醛的链长为14。在另一个实施方案中，脂肪酰基醛的链长为15。在另一个实施方案中，脂肪酰基醛的链长为16。在另一个实施方案中，脂肪酰基醛的链长为17。在另一个实施方案中，脂肪酰基醛的链长为18。在另一个实施方案中，脂肪酰基醛的链长为19。在另一个实施方案中，脂肪酰基醛的链长为20。在另一个实施方案中，脂肪酰基醛的链长为21。在另一个实施方案中，脂肪酰基醛的链长为22。
由本发明酵母细胞产生的去饱和脂肪醛也可以在多于一个位置中去饱和。去饱和脂肪醛可以在至少两个位置(如至少三个位置、如四个位置)中去饱和。
例如，可以产生碳链长为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22(如14)的(E)7,(Z)9去饱和脂肪醛。可以产生碳链长为14的(E)3,(Z)8,(Z)11去饱和脂肪醛。可以产生碳链长为14、15、16、17、18、19、20、21或22(如14)的(Z)9,(E)11,(E)13去饱和脂肪醛。
由此产生的去饱和脂肪醛可以如本领域所已知的那样进一步修饰，例如通过碳链缩短。因此，可以从碳链长为14的脂肪醛开始产生碳链长为12的(E)7,(Z)9去饱和脂肪醛，可以从碳链长为14的脂肪醛开始产生碳链长为12的(E)3,(Z)8,(Z)11去饱和脂肪醛，并且可以从碳链长为14的脂肪醛开始产生碳链长为12的(Z)9,(E)11,(E)13去饱和脂肪醛。
脂肪酰基-CoA
为了使酵母细胞产生如本文所述的去饱和脂肪醇和去饱和脂肪醇乙酸酯，酵母细胞需要脂肪酰基-CoA作为底物。优选地，脂肪酰基-CoA的碳链长为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22。在一个实施方案中，脂肪酰基-CoA的碳链长为8。在另一个实施方案中，脂肪酰基-CoA的碳链长为9。在另一个实施方案中，脂肪酰基-CoA的碳链长为10。在另一个实施方案中，脂肪酰基-CoA的碳链长为11。在另一个实施方案中，脂肪酰基-CoA的碳链长为12。在另一个实施方案中，脂肪酰基-CoA的碳链长为13。在另一个实施方案中，脂肪酰基-CoA的碳链长为14。在另一个实施方案中，脂肪酰基-CoA的碳链长为15。在另一个实施方案中，脂肪酰基-CoA的碳链长为16。在另一个实施方案中，脂肪酰基-CoA的碳链长为17。在另一个实施方案中，脂肪酰基-CoA的碳链长为18。在另一个实施方案中，脂肪酰基-CoA的碳链长为19。在另一个实施方案中，脂肪酰基-CoA的碳链长为20。在另一个实施方案中，脂肪酰基-CoA的碳链长为21。在另一个实施方案中，脂肪酰基-CoA的碳链长为22。在一些实施方案中，提供了具有不同碳链长的脂肪酰基-CoA的混合物。
此类脂肪酰基-CoA可以在孵育酵母细胞的培养基中提供，或者酵母细胞可以天然地能够产生这种脂肪酰基-CoA，或者可以将酵母细胞工程化以便产生或以便增加此类脂肪酰基-CoA的产生。
在一些实施方案中，酵母细胞不能天然地产生碳链长为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的脂肪酰基-CoA或其混合物。在这种情况下，可以如本领域所已知的那样工程化酵母细胞，例如通过引入异源硫酯酶。因此，在一些实施方案中，将编码硫酯酶的核酸引入酵母细胞中、引入载体上或通过基因组整合引入。硫酯酶基因可以处于诱导型启动子的控制下，或者处于组成型启动子的控制下。可以出于任何目的针对酵母细胞对编码硫酯酶的核酸进行密码子优化，如本领域所已知的。特别地，可以出于任何目的针对耶氏酵母属细胞(如解脂耶氏酵母细胞)对核酸进行密码子优化。
在一些实施方案中，硫酯酶衍生自选自湿地萼距花(Cuphea palustris)、萼距花(Cuphea hookeriana)、香樟(Cinnamomum camphora)或选自大肠杆菌(Escherichia coli)的生物。
酵母细胞
本公开文本提供了酵母细胞，其已经经修饰以产生去饱和脂肪醇和任选地去饱和脂肪醇乙酸酯。去饱和脂肪醇和去饱和脂肪醇乙酸酯是信息素的组分，特别是蛾信息素的组分。因此，本文公开的酵母细胞为环境友好的蛾信息素生产提供了平台。
在一些实施方案中，细胞已经在基因组水平上进行了修饰，例如通过在基因组中进行基因编辑。还可以通过插入至少一种核酸构建体(如至少一种载体)来修饰细胞。可以如技术人员所已知的那样设计载体，以使核酸序列能够整合到基因组中，或者能够在不进行基因组整合的情况下表达由包含在载体中的核酸序列编码的多肽。
在本公开文本的某些实施方案中，采用以下属的酵母或真菌，包括但不限于布拉霉属(Blakeslea)、假丝酵母属(Candida)、隐球菌属(Cryptococcus)、小克银汉霉属(Cunninghamella)、油脂酵母属(Lipomyces)、被孢霉属(Mortierella)、毛霉属(Mucor)、须霉属(Phycomyces)、腐霉属(Pythium)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、红酵母属(Rhodotorula)、丝孢酵母属(Trichosporon)和耶氏酵母属。在某些特定实施方案中，使用以下物种的生物，包括但不限于三孢布拉霉(Blakeslea trispora)、铁红假丝酵母(Candida pulcherrima)、C.revkaufi、热带假丝酵母(C.tropicalis)、弯曲隐球菌(Cryptococcus curvatus)、刺孢小克银汉霉(Cunninghamella echinulata)、雅致小克银汉霉(C.elegans)、山茶小克银汉霉(C.japonica)、斯达油脂酵母(Lipomyces starkeyi)、产油油脂酵母(L.lipoferus)、高山被孢霉(Mortierella alpina)、深黄被孢霉(M.isabellina)、拉曼被孢霉(M.ramanniana)、葡酒色被孢霉(M.vinacea)、卷枝毛霉(Mucor circinelloides)、布拉克须霉(Phycomyces blakesleanus)、畸雌腐霉(Pythiumirregulare)、圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)、黏红酵母(Rhodotorulaglutinis)、瘦弱红酵母(R.gracilis)、禾本红酵母(R.graminis)、胶红酵母(R.mucilaginosa)、R.pinicola、普鲁兰丝孢酵母(Trichosporon pullans)、皮状丝孢酵母(T.cutaneum)和解脂耶氏酵母。在一个优选的实施方案中，产油酵母细胞是解脂耶氏酵母细胞。
待修饰的酵母细胞(也称为宿主细胞)可以表达天然酶，其与产生去饱和脂肪醇和去饱和脂肪醇乙酸酯所必需的酶属于相同类别。然而，在一些情况下，此类天然酶可能对可以获得的去饱和脂肪醇和/或去饱和脂肪醇乙酸酯的滴度产生负面影响；因此，可以通过本领域已知的方法(如基因编辑)使天然酶失活。例如，可以使编码对滴度具有负面影响的天然酶的基因缺失或突变，从而导致天然酶的活性完全或部分丧失。
本公开文本的酵母细胞表达至少一种如本文所述的能够在碳链长为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的脂肪酰基-CoA中引入至少一个双键的异源去饱和酶、至少一种如本文所述的能够将至少一部分的所述去饱和脂肪酰基-CoA转化为去饱和脂肪醇的异源脂肪酰基-CoA还原酶以及任选地能够将至少一部分的所述去饱和脂肪醇转化为去饱和脂肪醇乙酸酯的乙酰基转移酶，并且具有降低的Hfd1(SEQ ID NO:4)、Hfd4(SEQID NO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ ID NO:10)中的至少一种的活性或降低的与Hfd1(SEQ ID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ ID NO:10)中的一种具有至少60％同源性的至少一种蛋白质的活性。在一些实施方案中，酵母细胞还表达乙酰基转移酶。在一些实施方案中，酵母细胞还表达硫酯酶。在具体的实施方案中，如上所述，酵母细胞具有至少Pex10或与Pex10(SEQID NO:8)具有至少60％同源性的蛋白质以及Hfd1、Hfd4、Fao1或GPAT中的至少一种的活性的降低或完全丧失。
在一个实施方案中，酵母细胞：
i)表达至少一种能够在脂肪酰基-CoA中引入至少一个双键的异源去饱和酶，从而能够将至少一部分的所述脂肪酰基-CoA转化为去饱和脂肪酰基-CoA；并且
ii)表达至少一种能够将至少一部分的所述去饱和脂肪酰基-CoA转化为去饱和脂肪醇的异源脂肪酰基-CoA还原酶，从而产生所述去饱和脂肪醇；并且
iii)具有降低的Hfd1(SEQ ID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ ID NO:10)中的至少一种的活性、或降低的如下至少一种蛋白质的活性，所述至少一种蛋白质与Hfd1(SEQ ID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ ID NO:10)中的一种具有至少60％同源性，如与Hfd1(SEQ ID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ ID NO:10)中的一种具有至少65％同源性、如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。
在具体的实施方案中，如上所述，酵母细胞具有至少Pex10或与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的蛋白质以及Hfd1、Hfd4、Fao1或GPAT中的至少一种的活性的降低或完全丧失。
在一个实施方案中，酵母细胞：
i)表达至少一种能够在脂肪酰基-CoA中引入至少一个双键的异源Δ3去饱和酶；并且
ii)表达至少一种异源脂肪酰基-CoA还原酶；并且
iii)具有降低的Hfd1(SEQ ID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ ID NO:10)中的至少一种的活性、或降低的与Hfd1(SEQID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ IDNO:10)中的一种具有至少60％同源性的至少一种蛋白质的活性。
在具体的实施方案中，如上所述，酵母细胞具有至少Pex10或与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的蛋白质以及Hfd1、Hfd4、Fao1或GPAT中的至少一种的活性的降低或完全丧失。
在一些实施方案中，所述FAR与如SEQ ID NO:14中所示的来自棉铃虫的FAR具有至少80％同源性。在其他实施方案中，所述FAR与如SEQ ID NO:16中所示的来自烟夜蛾的FAR具有至少80％同源性。在其他实施方案中，所述FAR与如SEQ ID NO:12中所示的来自Heliothis subflexa的FAR具有至少80％同源性。在其他实施方案中，所述FAR与如SEQ IDNO:24中所示的来自Bicyclus anynana的FAR具有至少80％同源性。在具体的实施方案中，如上所述，酵母细胞具有至少Pex10或与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的蛋白质以及Hfd1、Hfd4、Fao1或GPAT中的至少一种的活性的降低或完全丧失。
在另一个实施方案中，酵母细胞：
i)表达至少一种能够在脂肪酰基-CoA中引入至少一个双键的异源Δ5去饱和酶；并且
ii)表达至少一种异源脂肪酰基-CoA还原酶；并且
iii)具有降低的Hfd1(SEQ ID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ ID NO:10)中的至少一种的活性、或降低的与Hfd1(SEQID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ IDNO:10)中的一种具有至少60％同源性的至少一种蛋白质的活性。
在具体的实施方案中，如上所述，酵母细胞具有至少Pex10或与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的蛋白质以及Hfd1、Hfd4、Fao1或GPAT中的至少一种的活性的降低或完全丧失。
在一些实施方案中，所述FAR与如SEQ ID NO:14中所示的来自棉铃虫的FAR具有至少80％同源性。在其他实施方案中，所述FAR与如SEQ ID NO:16中所示的来自烟夜蛾的FAR具有至少80％同源性。在其他实施方案中，所述FAR与如SEQ ID NO:12中所示的来自Heliothis subflexa的FAR具有至少80％同源性。在其他实施方案中，所述FAR与如SEQ IDNO:24中所示的来自Bicyclus anynana的FAR具有至少80％同源性。
在具体的实施方案中，如上所述，酵母细胞具有至少Pex10或与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的蛋白质以及Hfd1、Hfd4、Fao1或GPAT中的至少一种的活性的降低或完全丧失。
在另一个实施方案中，酵母细胞：
i)表达至少一种能够在脂肪酰基-CoA中引入至少一个双键的异源Δ6去饱和酶；并且
ii)表达至少一种异源脂肪酰基-CoA还原酶；并且
iii)具有降低的Hfd1(SEQ ID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ ID NO:10)中的至少一种的活性、或降低的与Hfd1(SEQID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ IDNO:10)中的一种具有至少60％同源性的至少一种蛋白质的活性。
在具体的实施方案中，如上所述，酵母细胞具有至少Pex10或与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的蛋白质以及Hfd1、Hfd4、Fao1或GPAT中的至少一种的活性的降低或完全丧失。
在一些实施方案中，所述FAR与如SEQ ID NO:14中所示的来自棉铃虫的FAR具有至少80％同源性。在其他实施方案中，所述FAR与如SEQ ID NO:16中所示的来自烟夜蛾的FAR具有至少80％同源性。在其他实施方案中，所述FAR与如SEQ ID NO:12中所示的来自Heliothis subflexa的FAR具有至少80％同源性。在其他实施方案中，所述FAR与如SEQ IDNO:24中所示的来自Bicyclus anynana的FAR具有至少80％同源性。
在具体的实施方案中，如上所述，酵母细胞具有至少Pex10或与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的蛋白质以及Hfd1、Hfd4、Fao1或GPAT中的至少一种的活性的降低或完全丧失。
在另一个实施方案中，酵母细胞：
i)表达至少一种能够在脂肪酰基-CoA中引入至少一个双键的异源Δ7去饱和酶；并且
ii)表达至少一种异源脂肪酰基-CoA还原酶；并且
iii)具有降低的Hfd1(SEQ ID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ ID NO:10)中的至少一种的活性、或降低的与Hfd1(SEQID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ IDNO:10)中的一种具有至少60％同源性的至少一种蛋白质的活性。
在具体的实施方案中，如上所述，酵母细胞具有至少Pex10或与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的蛋白质以及Hfd1、Hfd4、Fao1或GPAT中的至少一种的活性的降低或完全丧失。
在一些实施方案中，所述FAR与如SEQ ID NO:14中所示的来自棉铃虫的FAR具有至少80％同源性。在其他实施方案中，所述FAR与如SEQ ID NO:16中所示的来自烟夜蛾的FAR具有至少80％同源性。在其他实施方案中，所述FAR与如SEQ ID NO:12中所示的来自Heliothis subflexa的FAR具有至少80％同源性。在其他实施方案中，所述FAR与如SEQ IDNO:24中所示的来自Bicyclus anynana的FAR具有至少80％同源性。
在具体的实施方案中，如上所述，酵母细胞具有至少Pex10或与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的蛋白质以及Hfd1、Hfd4、Fao1或GPAT中的至少一种的活性的降低或完全丧失。
在另一个实施方案中，酵母细胞：
i)表达至少一种能够在脂肪酰基-CoA中引入至少一个双键的异源Δ8去饱和酶；并且
ii)表达至少一种异源脂肪酰基-CoA还原酶；并且
iii)具有降低的Hfd1(SEQ ID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ ID NO:10)中的至少一种的活性、或降低的与Hfd1(SEQID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ IDNO:10)中的一种具有至少60％同源性的至少一种蛋白质的活性。
在具体的实施方案中，如上所述，酵母细胞具有至少Pex10或与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的蛋白质以及Hfd1、Hfd4、Fao1或GPAT中的至少一种的活性的降低或完全丧失。
在一些实施方案中，所述FAR与如SEQ ID NO:14中所示的来自棉铃虫的FAR具有至少80％同源性。在其他实施方案中，所述FAR与如SEQ ID NO:16中所示的来自烟夜蛾的FAR具有至少80％同源性。在其他实施方案中，所述FAR与如SEQ ID NO:12中所示的来自Heliothis subflexa的FAR具有至少80％同源性。在其他实施方案中，所述FAR与如SEQ IDNO:24中所示的来自Bicyclus anynana的FAR具有至少80％同源性。
在具体的实施方案中，如上所述，酵母细胞具有至少Pex10或与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的蛋白质以及Hfd1、Hfd4、Fao1或GPAT中的至少一种的活性的降低或完全丧失。
在另一个实施方案中，酵母细胞：
i)表达至少一种能够在脂肪酰基-CoA中引入至少一个双键的异源Δ9去饱和酶；并且
ii)表达至少一种异源脂肪酰基-CoA还原酶；并且
iii)具有降低的Hfd1(SEQ ID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ ID NO:10)中的至少一种的活性、或降低的与Hfd1(SEQID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ IDNO:10)中的一种具有至少60％同源性的至少一种蛋白质的活性。
在具体的实施方案中，如上所述，酵母细胞具有至少Pex10或与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的蛋白质以及Hfd1、Hfd4、Fao1或GPAT中的至少一种的活性的降低或完全丧失。
在一些实施方案中，所述FAR与如SEQ ID NO:14中所示的来自棉铃虫的FAR具有至少80％同源性。在其他实施方案中，所述FAR与如SEQ ID NO:16中所示的来自烟夜蛾的FAR具有至少80％同源性。在其他实施方案中，所述FAR与如SEQ ID NO:12中所示的来自Heliothis subflexa的FAR具有至少80％同源性。在其他实施方案中，所述FAR与如SEQ IDNO:24中所示的来自Bicyclus anynana的FAR具有至少80％同源性。
在具体的实施方案中，如上所述，酵母细胞具有至少Pex10或与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的蛋白质以及Hfd1、Hfd4、Fao1或GPAT中的至少一种的活性的降低或完全丧失。
在一个特定实施方案中，所述Δ9去饱和酶与如SEQ ID NO:18中所示的来自黑腹果蝇的Δ9去饱和酶具有至少60％同源性。
在具体的实施方案中，如上所述，酵母细胞具有至少Pex10或与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的蛋白质以及Hfd1、Hfd4、Fao1或GPAT中的至少一种的活性的降低或完全丧失。
在另一个实施方案中，酵母细胞：
i)表达至少一种能够在脂肪酰基-CoA中引入至少一个双键的异源Δ10去饱和酶；并且
ii)表达至少一种异源脂肪酰基-CoA还原酶；并且
iii)具有降低的Hfd1(SEQ ID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ ID NO:10)中的至少一种的活性、或降低的与Hfd1(SEQID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ IDNO:10)中的一种具有至少60％同源性的至少一种蛋白质的活性。
在具体的实施方案中，如上所述，酵母细胞具有至少Pex10或与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的蛋白质以及Hfd1、Hfd4、Fao1或GPAT中的至少一种的活性的降低或完全丧失。
在一些实施方案中，所述FAR与如SEQ ID NO:14中所示的来自棉铃虫的FAR具有至少80％同源性。在其他实施方案中，所述FAR与如SEQ ID NO:16中所示的来自烟夜蛾的FAR具有至少80％同源性。在其他实施方案中，所述FAR与如SEQ ID NO:12中所示的来自Heliothis subflexa的FAR具有至少80％同源性。在其他实施方案中，所述FAR与如SEQ IDNO:24中所示的来自Bicyclus anynana的FAR具有至少80％同源性。
在具体的实施方案中，如上所述，酵母细胞具有至少Pex10或与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的蛋白质以及Hfd1、Hfd4、Fao1或GPAT中的至少一种的活性的降低或完全丧失。
在另一个实施方案中，酵母细胞：
i)表达至少一种能够在脂肪酰基-CoA中引入至少一个双键的异源Δ11去饱和酶；并且
ii)表达至少一种异源脂肪酰基-CoA还原酶；并且
iii)具有降低的Hfd1(SEQ ID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ ID NO:10)中的至少一种的活性、或降低的与Hfd1(SEQID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ IDNO:10)中的一种具有至少60％同源性的至少一种蛋白质的活性。
在具体的实施方案中，如上所述，酵母细胞具有至少Pex10或与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的蛋白质以及Hfd1、Hfd4、Fao1或GPAT中的至少一种的活性的降低或完全丧失。
在一些实施方案中，所述FAR与如SEQ ID NO:14中所示的来自棉铃虫的FAR具有至少80％同源性。在其他实施方案中，所述FAR与如SEQ ID NO:16中所示的来自烟夜蛾的FAR具有至少80％同源性。在其他实施方案中，所述FAR与如SEQ ID NO:12中所示的来自Heliothis subflexa的FAR具有至少80％同源性。在其他实施方案中，所述FAR与如SEQ IDNO:24中所示的来自Bicyclus anynana的FAR具有至少80％同源性。
在具体的实施方案中，如上所述，酵母细胞具有至少Pex10或与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的蛋白质以及Hfd1、Hfd4、Fao1或GPAT中的至少一种的活性的降低或完全丧失。
在一个特定实施方案中，所述去饱和酶与如SEQ ID NO:2中所示的来自脐橙螟的Δ11去饱和酶具有至少60％同源性。在另一个特定实施方案中，所述去饱和酶与如SEQ IDNO:19中所示的来自玫瑰色卷蛾的Δ11去饱和酶具有至少60％同源性。在另一个特定实施方案中，所述去饱和酶与如SEQ ID NO:20中所示的来自斑点色卷蛾的Δ11去饱和酶具有至少60％同源性。
在具体的实施方案中，如上所述，酵母细胞具有至少Pex10或与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的蛋白质以及Hfd1、Hfd4、Fao1或GPAT中的至少一种的活性的降低或完全丧失。
在另一个实施方案中，酵母细胞：
i)表达至少一种能够在脂肪酰基-CoA中引入至少一个双键的异源Δ12去饱和酶；并且
ii)表达至少一种异源脂肪酰基-CoA还原酶；并且
iii)具有降低的Hfd1(SEQ ID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ ID NO:10)中的至少一种的活性、或降低的与Hfd1(SEQID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ IDNO:10)中的一种具有至少60％同源性的至少一种蛋白质的活性。
在具体的实施方案中，如上所述，酵母细胞具有至少Pex10或与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的蛋白质以及Hfd1、Hfd4、Fao1或GPAT中的至少一种的活性的降低或完全丧失。
在一些实施方案中，所述FAR与如SEQ ID NO:14中所示的来自棉铃虫的FAR具有至少80％同源性。在其他实施方案中，所述FAR与如SEQ ID NO:16中所示的来自烟夜蛾的FAR具有至少80％同源性。在其他实施方案中，所述FAR与如SEQ ID NO:12中所示的来自Heliothis subflexa的FAR具有至少80％同源性。在其他实施方案中，所述FAR与如SEQ IDNO:24中所示的来自Bicyclus anynana的FAR具有至少80％同源性。
在具体的实施方案中，如上所述，酵母细胞具有至少Pex10或与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的蛋白质以及Hfd1、Hfd4、Fao1或GPAT中的至少一种的活性的降低或完全丧失。
在另一个实施方案中，酵母细胞：
i)表达至少一种能够在脂肪酰基-CoA中引入至少一个双键的异源Δ13去饱和酶；并且
ii)表达至少一种异源脂肪酰基-CoA还原酶；并且
iii)具有降低的Hfd1(SEQ ID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ ID NO:10)中的至少一种的活性、或降低的与Hfd1(SEQID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ IDNO:10)中的一种具有至少60％同源性的至少一种蛋白质的活性。
在具体的实施方案中，如上所述，酵母细胞具有至少Pex10或与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的蛋白质以及Hfd1、Hfd4、Fao1或GPAT中的至少一种的活性的降低或完全丧失。
在一些实施方案中，所述FAR与如SEQ ID NO:14中所示的来自棉铃虫的FAR具有至少80％同源性。在其他实施方案中，所述FAR与如SEQ ID NO:16中所示的来自烟夜蛾的FAR具有至少80％同源性。在其他实施方案中，所述FAR与如SEQ ID NO:12中所示的来自Heliothis subflexa的FAR具有至少80％同源性。在其他实施方案中，所述FAR与如SEQ IDNO:24中所示的来自Bicyclus anynana的FAR具有至少80％同源性。
在具体的实施方案中，如上所述，酵母细胞具有至少Pex10或与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的蛋白质以及Hfd1、Hfd4、Fao1或GPAT中的至少一种的活性的降低或完全丧失。
在另一个实施方案中，酵母细胞：
i)表达至少一种能够在脂肪酰基-CoA中引入至少一个双键的异源Δ14去饱和酶；并且
ii)表达至少一种异源脂肪酰基-CoA还原酶；并且
iii)具有降低的Hfd1(SEQ ID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ ID NO:10)中的至少一种的活性、或降低的与Hfd1(SEQID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ IDNO:10)中的一种具有至少60％同源性的至少一种蛋白质的活性。
在具体的实施方案中，如上所述，酵母细胞具有至少Pex10或与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的蛋白质以及Hfd1、Hfd4、Fao1或GPAT中的至少一种的活性的降低或完全丧失。
在一些实施方案中，所述FAR与如SEQ ID NO:14中所示的来自棉铃虫的FAR具有至少80％同源性。在其他实施方案中，所述FAR与如SEQ ID NO:16中所示的来自烟夜蛾的FAR具有至少80％同源性。在其他实施方案中，所述FAR与如SEQ ID NO:12中所示的来自Heliothis subflexa的FAR具有至少80％同源性。在其他实施方案中，所述FAR与如SEQ IDNO:24中所示的来自Bicyclus anynana的FAR具有至少80％同源性。
在具体的实施方案中，如上所述，酵母细胞具有至少Pex10或与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的蛋白质以及Hfd1、Hfd4、Fao1或GPAT中的至少一种的活性的降低或完全丧失。
核酸
应理解，贯穿本公开文本，术语“编码活性的核酸”应指代能够编码具有所述活性的肽、蛋白质或其片段的核酸分子。此类核酸分子可以是开放阅读框或基因或其片段。核酸构建体也可以是一组核酸分子，它们一起可以编码具有目标活性的几种肽、蛋白质或其片段。术语“目标活性”是指以下活性中的一种：如本文所述的去饱和酶、脂肪酰基-CoA还原酶、成醛脂肪酰基-CoA还原酶、硫酯酶和/或乙酰基转移酶活性。所述一种或多种目标活性的性质将取决于希望用本发明方法获得的所需产物的性质。
在本发明方法的一些实施方案中，编码本发明活性中的每一种(即如本文所述的去饱和酶、脂肪酰基-CoA还原酶、成醛脂肪酰基coA还原酶、硫酯酶和/或乙酰基转移酶)的核酸中的每一种可以包含在酵母细胞的基因组内或包含在酵母细胞内包含的载体内。
在一些实施方案中，编码本发明活性中的每一种的核酸中的每一种可以存在于所述酵母细胞的基因组中，或者因为核酸编码天然蛋白质，或者因为它已经通过基因组工程或基因组编辑或者通过使不同交配类型的酵母细胞杂交整合在其中。用于整合核酸的方法在本领域是熟知的。因此，在一些实施方案中，通过在酵母细胞中引入异源核酸来编码目标活性。可以出于任何目的对编码所述活性的异源核酸进行密码子优化，或者所述异源核酸可以包含可以帮助改善活性的特征。例如，可以修饰异源核酸以编码经修饰的蛋白质。此类修饰包括但不限于引入定位信号、功能获得或功能丧失突变、蛋白质与标记或标签(如荧光标签)的融合、插入诱导型启动子、引入赋予提高的稳定性和/或半衰期的修饰。
编码目标活性的异源核酸的引入可以通过本领域已知的方法进行。技术人员将认识到此类方法包括但不限于：基于克隆和同源重组的方法。克隆方法可以涉及在诸如大肠杆菌等生物中设计和构建质粒。质粒可以是整合型或非整合型载体。无克隆方法包括基于同源重组的方法，如适配体介导的PCR或缺口修复。此类方法通常导致异源核酸整合到酵母细胞的基因组中。
编码目标活性的核酸能以高拷贝数存在。
用于产生脂肪醇、脂肪醇乙酸酯或脂肪醛的方法
本公开文本的酵母细胞可以用于产生去饱和脂肪醇和任选地其衍生物，如去饱和脂肪醇乙酸酯和/或去饱和脂肪醛。因此，本文还提供了在产油酵母细胞中产生脂肪醇的方法，所述方法包括提供酵母细胞以及在培养基中孵育所述酵母细胞的步骤，其中所述酵母细胞：
i)表达至少一种能够在脂肪酰基-CoA中引入至少一个双键的异源去饱和酶，从而将至少一部分的所述脂肪酰基-CoA转化为去饱和脂肪酰基-CoA；并且
ii)表达至少一种能够将至少一部分的所述去饱和脂肪酰基-CoA转化为去饱和脂肪醇的异源脂肪酰基-CoA还原酶，从而产生所述去饱和脂肪醇；并且
iii)具有降低的Hfd1(SEQ ID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ ID NO:10)中的至少一种的活性，或具有降低的如下至少一种蛋白质的活性，所述至少一种蛋白质与Hfd1(SEQ ID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ ID NO:10)中的一种具有至少60％同源性，如与Hfd1(SEQ ID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQ IDNO:22)和GPAT(SEQ ID NO:10)中的一种具有至少65％同源性、如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。
在具体的实施方案中，如上所述，酵母细胞具有至少Pex10或与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的蛋白质以及Hfd1、Hfd4、Fao1或GPAT中的至少一种的活性的降低或完全丧失。
在一些实施方案中，酵母细胞能够产生总滴度为至少1mg/L(如至少5mg/L、如至少10mg/L、如至少25mg/L、如至少50mg/L、如至少100mg/L、如至少250mg/L、如至少500mg/L、如至少1g/L、如至少2g/L、如至少3g/L、如至少4g/L、如至少5g/L、如至少6g/L、如至少7g/L、如至少8g/L、如至少9g/L、如至少10g/L)的脂肪醇，其中总滴度是去饱和脂肪醇的滴度和饱和脂肪醇的滴度之和。
在一些实施方案中，酵母细胞能够产生滴度为至少1mg/L(如至少5mg/L、如至少10mg/L、如至少25mg/L、如至少50mg/L、如至少100mg/L、如至少250mg/L、如至少500mg/L、如至少1g/L、如至少2g/L、如至少3g/L、如至少4g/L、如至少5g/L、如至少6g/L、如至少7g/L、如至少8g/L、如至少9g/L、如至少10g/L)的去饱和脂肪醇。
在一个实施方案中，本发明方法能够产生脂肪醇，其中由细胞产生的去饱和脂肪醇占由细胞产生的总脂肪醇的至少20％，如由细胞产生的总脂肪醇的至少30％、如至少40％、如至少50％、如至少60％、如至少70％、如至少80％、如至少90％。
在一个特定实施方案中，细胞能够产生滴度为至少0.5mg/L的(Z)11-C16:OH，如至少1mg/L、如至少5mg/L、如至少10mg/L、如至少25mg/L、如至少50mg/L、如至少100mg/L、如至少250mg/L、如至少500mg/L、如至少1g/L、如至少2g/L、如至少3g/L、如至少4g/L、如至少5g/L、如至少6g/L、如至少7g/L、如至少8g/L、如至少9g/L、如至少10g/L的(Z)11-C16:OH。
在另一个实施方案中，由细胞产生的(Z)11-C16:OH占由细胞产生的总脂肪醇的至少20％，如由细胞产生的总脂肪醇的至少30％、如至少40％、如至少50％、如至少60％、如至少70％、如至少80％、如至少90％。
在又另一个实施方案中，由细胞产生的(Z)11-C16:OH占由细胞产生的总去饱和脂肪醇的至少20％，如由细胞产生的去饱和脂肪醇的至少30％、如至少40％、如至少50％、如至少60％、如至少70％、如至少80％、如至少90％。
在优选的实施方案中，所述脂肪醇是如下脂肪醇，其天然地存在于由鳞翅目的物种产生的信息素中。
酵母细胞可以如本文所述。在一些实施方案中，酵母细胞是耶氏酵母属细胞，如解脂耶氏酵母细胞。
回收
可能需要回收通过本文公开的方法获得的产物。因此，本发明方法可以包括回收由本发明酵母细胞产生的去饱和脂肪醇和/或去饱和脂肪醇乙酸酯和/或去饱和脂肪醛的另外的步骤。
在一些实施方案中，所述方法包括回收去饱和脂肪醇的步骤。在一个特定实施方案中，所述方法包括回收碳链长为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的去饱和脂肪醇的步骤。在其他实施方案中，所述方法包括回收碳链长为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的脂肪醇乙酸酯的步骤。在一个特定实施方案中，所述方法包括回收碳链长为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的脂肪醇乙酸酯的步骤。
用于回收通过本发明获得的产物的方法在本领域是已知的，并且可以包括用疏水性溶剂(如癸烷、己烷或植物油)进行提取。
可以进一步修饰所回收的产物，例如如上所述，可以将去饱和脂肪醇转化为对应的去饱和脂肪醛。
也可以将所回收的产物(即去饱和脂肪醇和/或去饱和脂肪醇乙酸酯)配制成信息素组合物。所述组合物还可以包含一种或多种另外的化合物，如液体或固体载体或基质。由所述去饱和脂肪醇得到的脂肪醛也可以包含在此类组合物中。
试剂盒
本文提供了用于进行本发明方法的部件试剂盒。所述部件试剂盒可以包含如本文所述的“即用型”的产油酵母细胞。在一个实施方案中，酵母细胞是耶氏酵母属细胞，如解脂耶氏酵母细胞。
在另一个实施方案中，所述部件试剂盒包含编码待引入酵母细胞中的目标活性的核酸构建体。所述部件试剂盒可以包含用于降低Hfd1(SEQ ID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ ID NO:10)中的至少一种的活性或与Hfd1(SEQ ID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ ID NO:10)中的一种具有至少60％同源性的至少一种蛋白质的活性的核酸构建体。核酸构建体可以作为多种核酸构建体来提供，如多种载体，其中每种载体编码一种或几种所需活性，或者其中每种载体允许降低Hfd1、Hfd4、Pex10、Fao1和GPAT中的一种或多种的活性。在具体的实施方案中，如上所述，酵母细胞具有至少Pex10或与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的蛋白质以及Hfd1、Hfd4、Fao1或GPAT中的至少一种的活性的降低或完全丧失。
所述部件试剂盒可以任选地包含待修饰的酵母细胞。在一些实施方案中，待修饰的酵母细胞已经具有降低的Hfd1(SEQ ID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ ID NO:10)中的至少一种的活性或降低的与Hfd1(SEQID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ IDNO:10)中的一种具有至少60％同源性的至少一种蛋白质的活性。在具体的实施方案中，如上所述，酵母细胞具有至少Pex10或与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的蛋白质以及Hfd1、Hfd4、Fao1或GPAT中的至少一种的活性的降低或完全丧失。
在一些实施方案中，所述部件试剂盒包含所有上述项。
信息素组合物
因此，本公开文本提供了化合物(特别是去饱和脂肪醇和脂肪醇乙酸酯)以及它们的衍生物和它们的用途。特别地，使用本发明细胞和方法可获得的化合物可用作信息素组合物的组分。此类信息素组合物可用于综合害虫治理。它们可以如本领域所已知的那样用于例如交配干扰。
可以将通过本发明方法或使用本发明酵母细胞可获得的去饱和脂肪醇和去饱和脂肪醇乙酸酯配制在信息素组合物中。
此类信息素组合物可以用作综合害虫治理产品，其可以用于监测害虫存在的方法中或用于干扰害虫交配的方法中。
如本文公开的信息素组合物可以用作生物农药。可以将此类组合物喷洒或分配在培养物上、在田间或在果园中。如本领域所已知的，也可以将它们浸泡在例如橡胶隔垫上，或者与其他组分混合。这可以导致交配干扰，从而防止害虫繁殖，或者它可以与诱捕装置组合使用以捕获害虫。可以使用本发明信息素组合物对抗的害虫的非限制性例子是：棉铃虫(cotton bollworm/Helicoverpa armigera)、条纹螟虫(striped stemborer)(二化螟(Chilo suppressalis))、小菜蛾(diamond back moth/Plutella xylostella)、甘蓝夜蛾(cabbage moth/Mamestra brassicae)、大甘蓝心毛毛虫(large cabbage-heartcaterpillar)(大菜螟(Crocidolomia binotalis))、欧洲玉米秆蛀虫(European cornstalk borer)(蛀茎夜蛾(Sesamia nonagrioides))、醋栗透翅蛾(currant clearwing)(茶藨子透翅蛾(Synanthedon tipuliformis))和洋蓟羽蛾(artichoke plume moth/Platyptilia carduidactylal)。因此，将本发明组合物用于培养物可以提高作物产量，基本上没有环境影响。
本发明信息素组合物中脂肪醇和脂肪醇乙酸酯的相对量可以根据作物的性质和/或待控制的害虫而变化；也可能存在地理差异。因此，确定最佳相对量可能需要常规优化。所述信息素组合物还可包含脂肪醛。
用作驱虫剂的组合物的例子可见于Kehat&Dunkelblum,1993(针对棉铃虫)；Alfaro等人,2009(针对二化螟)；Eizaguirre等人,2002(针对蛀茎夜蛾)；Wu等人,2012(针对小菜蛾)；Bari等人,2003(针对洋蓟羽蛾)。
在一些实施方案中，所述信息素组合物还可以包含一种或多种另外的化合物，如液体或固体载体或基质。例如，合适的载体或基质包括植物油、精制矿物油或其馏分、橡胶、塑料、二氧化硅、硅藻土、蜡模和纤维素粉末。
可以如本领域所已知的那样配制信息素组合物。例如，它可以呈溶液、凝胶、粉末的形式。可以配制信息素组合物使得其易于分配，如本领域所已知的。
实施例
实施例1：质粒的构建
通过PCR扩增所有生物砖(BioBrick)以获得用于克隆到载体和基因敲除的DNA片段。引物列于表1中，并且得到的DNA片段列于表2中。在含有(iNtRONBiotechnology)的1％琼脂糖凝胶上分离PCR产物。从凝胶上切下正确大小的PCR产物，并使用凝胶和PCR清理试剂盒(Macherey-Nagel)纯化。
表1：引物。
表2：使用所指示模板和引物通过PCR获得的DNA片段。
根据制造商的说明用切口核酸内切酶Nb.BsmI(New England Biolabs)处理生物砖BB1135，并在使用前使用凝胶和PCR清理试剂盒(Macherey-Nagel)纯化。经由以下方案通过USER-克隆组装DNA片段：将1-1.3μl每种生物砖(列于表3中)、0.5μl(New England BioLabs)和0.5μl USER酶(New England Biolabs)混合并在37℃下孵育25min且在25℃下孵育25min。将反应转化到化学感受态大肠杆菌DHα细胞中并且将细胞铺板在含100mg/L氨苄青霉素的Lysogeny Broth(LB)琼脂板上。将板在37℃下孵育过夜，并且通过菌落PCR筛选得到的菌落。从过夜大肠杆菌培养物中纯化质粒，并且通过测序确认正确的克隆。所构建的载体列于表3中。
如Jensen等人,2014中所述的消化亲本质粒pCfB4778、pCfB5219和pCfB4781，然后通过USER-克隆进行组装。经由以下方案通过USER-克隆组装DNA片段：将1-1.3μl每种生物砖(列于表8中)、0.5μl(New England BioLabs)和0.5μl USER酶(New EnglandBiolabs)混合并在37℃下孵育25min且在25℃下孵育25min。将反应转化到化学感受态大肠杆菌DHα细胞中并且将细胞铺板在含100mg/L氨苄青霉素的Lysogeny Broth(LB)琼脂板上。将板在37℃下孵育过夜，并且通过菌落PCR筛选得到的菌落。从过夜大肠杆菌培养物中纯化质粒，并且通过测序确认正确的克隆。所构建的载体列于表3中。
表3：载体。
实施例2：菌株的构建
所构建的菌株列于表4和5中。在转化到解脂耶氏酵母中前，将表达质粒用NotI线性化。使用基于乙酸锂的方案(Chen,1997)，将线性化质粒或生物砖转化到解脂耶氏酵母GB20中(Angerer,2014)。转化后，将细胞在500μlYPD培养基中于30℃下回收2小时。在缺乏尿嘧啶或亮氨酸的合成完全(SC)培养基(Sigma-Aldrich)上或在含有潮霉素(50mg/L)或诺尔丝菌素(250mg/L)的YPD培养基上选择阳性转化体。通过菌落PCR确认敲除构建体在解脂耶氏酵母基因组中的整合。
使用基于Cre重组酶的系统如下从菌株ST5255中除去侧翼为loxP位点的Ura3、NatSyn、HphSyn标记盒。使用基于乙酸锂的方案(Chen,1997)，用表达Cre重组酶的载体pCfB4158转化菌株5255。转化后，将细胞在500μl YPD培养基中于30℃下回收2小时并且铺板在不含亮氨酸的SC培养基上。通过在不含尿嘧啶的SC培养基和补充有潮霉素或诺尔丝菌素的YPD上重复铺板针对成功标记去除筛选菌落。在这些板上没有细胞生长表明标记去除成功。
菌株ST6527表达来自染色体C上的基因间区的Atrd11和HarFAR。基因表达盒与pCfB5929中的基因表达盒相同。另外，使基因HFD4(YALI0B01298g)和HFD1(YALI0F23793g)的开放阅读框以及GPAT(YALI0C00209g)编码序列上游的核苷酸-1130至-100缺失。将过早终止密码子和移码引入PEX10(YALI0C01023g)和FAO1(YALI0B14014g)的开放阅读框中，产生非功能性基因。
菌株ST7394表达来自染色体C和D上的基因间区的如pCfB6969和pCfB7600中所述的Dmd9、HarFAR和Atf1(图4)。另外，使基因HFD4、HFD2、HFD3和HFD1的开放阅读框以及GPAT(YALI0C00209g)编码序列上游的核苷酸-1130至-100缺失。将过早终止密码子和移码引入PEX10和FAO1中，产生非功能性基因。
表4：菌株。Atrd11＝来自脐橙螟的Δ11去饱和酶；HsFAR＝来自Heliothissubflexa的脂肪酰基-CoA还原酶
表5：菌株和脂肪醇产量
实施例3：通过酵母产生脂肪醇
将每种菌株的一个单独克隆接种到带有金属labocap盖(Lüdiswiss，瑞士弗拉维尔)的12-ml玻璃管(Duran，德国沃特海姆)中的含8％葡萄糖的5ml YPD(10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨、80g/L右旋糖)中，并且在30℃下伴随以250rpm振荡孵育过夜。第二天，将过夜培养物离心，弃去上清液，并且将沉淀重悬于2ml氮限制培养基(2.9g/L(NH4)2SO4、1.7g/LYNB(不含氨基酸和硫酸铵)、240mg/L亮氨酸、76mg/L赖氨酸、20mg/L尿嘧啶和60g/L葡萄糖)中。将培养物在30℃下孵育48小时并以250rpm振荡。
为了提取，将1mL培养物转移到4-mL玻璃小瓶中，并且添加10μL内标原液(1μg/μL(Z)-10-庚-1-基甲酯的100％乙醇溶液)。用小块铝箔覆盖小瓶，我们用针刺穿箔盖上的小孔。将样品涡旋并置于-80℃下储存直至分析。将样品在冷冻干燥系统(Freezone6 andStoppening盘式干燥器，Labconco，美国堪萨斯城)中于-40℃下冷冻干燥，然后添加1mL氯仿:甲醇2:1以破坏细胞。将混合物涡旋45s并在室温下放置4小时。在氮气流下缓慢蒸发有机溶剂。添加1ml己烷，将样品涡旋10s，离心并且将200μl转移到新的玻璃小瓶中。在与质量选择检测器HP 5973连接的Hewlett Packard 6890GC上进行GC-MS分析。GC配备有INNOWax柱(30m×0.25mm×0.25μm)，并且将氦气用作载气(平均速度：33cm/s)。以电子撞击模式(70eV)操作MS，在m/z 30与400之间扫描，并且在220℃下以不分流模式配置注射器。烘箱温度设定如下：在80℃下持续1min，然后以10℃/min的速率增加至210℃，随后在210℃下保持15min，然后以10℃/min的速率增加至230℃，随后在230℃下保持20min。通过将保留时间和质谱与实验室收集中可获得的参考化合物的保留时间和质谱进行比较来鉴定化合物。通过记录的总离子电流(TIC)定量化合物。通过Agilent ChemStation软件和iWork Numbers分析数据。基于内标计算脂肪醇的浓度(表4)。
使可能参与脂肪醇降解的基因(HFD1、HFD4、FAO1、PEX10)缺失改善了总脂肪醇的产生，但降低了去饱和醇与总脂肪醇的比率。降低编码催化朝向甘油脂生物合成的第一反应的甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)的基因的表达增加了去饱和醇的产量，将去饱和醇(Z11-16:OH)与总醇的比率从23％提高到46％。同时，脂质和游离脂肪酸(以总脂肪酸甲酯测量)的浓度从1.8g/L降至0.9g/L。
将来自表4的菌株接种到24孔深孔板(EnzyScreen，NL)中的3mL矿物质培养基中至光密度(600nm)为1。矿物质培养基的组成如Jensen等人,2014中所述，但葡萄糖被70g/L甘油代替。所述培养基补充有760mg/L赖氨酸、760mg/L亮氨酸和200mg/L尿嘧啶。将培养物在30℃下孵育67小时，以250rpm振荡。
为了提取脂肪醇，将1mL培养物转移到4-mL玻璃小瓶中，并且添加10μL内标溶液(2μg/μL(Z)-10-庚-1-基甲酯的100％乙醇溶液)。用小块铝箔覆盖小瓶，并且用针刺穿箔盖上的小孔。将样品涡旋并置于-80℃下储存直至分析。将样品在冷冻干燥系统(Freezone6 andStoppening盘式干燥器，Labconco，美国堪萨斯城)中于-40℃下冷冻干燥，然后添加1mL氯仿:甲醇2:1以破坏细胞。将混合物涡旋45s并在室温下放置4小时。在氮气流下缓慢蒸发有机溶剂。添加1ml己烷，将样品涡旋10s，离心并且将200μl转移到新的玻璃小瓶中。用配备有INNOWax 30m×0.25mm×0.25μm柱的SCION TQ GC-MS(Bruker)进行定量，其中氦气作为载气。在250℃下以不分流模式配置注射器，烘箱温度设定如下：在80℃下持续1min，然后以10℃/min的速率增加至210℃，随后在210℃下保持10min，然后以10℃/min的速率增加至230℃，随后在230℃下保持5min。以电子撞击模式(70eV)操作MS，在m/z 30与350之间扫描。通过将保留时间和质谱与参考化合物的保留时间和质谱进行比较来鉴定化合物。通过记录的总离子电流(TIC)定量化合物。通过BrukerMSWorkstation软件分析数据。基于内标计算脂肪醇的浓度(图6)。
表达来自脐橙螟的Δ11去饱和酶的Δ11去饱和酶(Atrd11)和来自Heliothissubflexa的脂肪酰基-CoA还原酶(HsFAR)的所有菌株都产生(Z)11-16:OH。在研究单基因敲除时，观察到FAO1和PEX10敲除的最显著效果(去饱和脂肪醇改善265％和406％)。双重缺失要有效得多，例如，敲除FAO1和PEX10使去饱和脂肪醇滴度升高877％，而GPAT下调和PEX10敲除的组合使滴度升高1083％。组合几种成功的处理导致去饱和脂肪醇的滴度升高1475％。
实施例4：在受控发酵中产生脂肪醇
在配备有14L容器(10L最大工作体积)的BioFlo 415生物反应器(Eppendorf/NewBrunswick)中进行发酵。通过自动添加2N H2SO4溶液和4NNaOH溶液将pH控制在5.0±0.1。使用极谱电极测量溶解氧，并且将其通过改变三个6叶片Rushton涡轮机的搅拌速度自动控制在20％饱和度。将菌株解脂耶氏酵母ST6379接种到发酵培养基(2g/L酵母提取物、13.4g/L酵母氮基、0.76g/L赖氨酸、0.76g/L尿嘧啶、0.024mg/L硫胺素、0.002g/L生物素和50g/L甘油)中。发酵25小时后，将发酵培养基(6L)补充上750ml富含营养素的进料(由16.2g/L酵母提取物、108.6g/L酵母氮基、6.2g/L赖氨酸、0.2mg/L硫胺素、0.02g/L生物素和326g/L甘油组成)，随后在32h时在反应器中脉冲甘油至浓度为50g/L。从36小时开始连续给料甘油，保持稳定的甘油浓度为20-30g/L。发酵持续总共48小时。表6中给出了发酵结束时的脂肪醇浓度。
总共产生了2.86g/L去饱和脂肪醇。
表6：通过菌株ST6379产生脂肪醇
实施例5：产生鳞翅目信息素的方法
如实施例3中所述，在基本培养基中培养菌株ST6527、ST6360和ST7394。菌株ST7394的培养基另外补充有1g/L肉豆蔻酸甲酯。
通过表达不同的去饱和酶和脂肪醇还原酶，平台酵母菌株可以用于产生不同的去饱和脂肪醇(表7)。
表7
实施例6：产生鳞翅目信息素的方法
在具有PEX10、HFD1、HFD4和FAO1基因的缺失并且具有降低的GPAT表达的解脂耶氏酵母细胞中表达编码脂肪酰基-CoA去饱和酶的基因和编码脂肪酰基-CoA还原酶的基因。当在发酵培养基中培养时，得到的细胞产生去饱和脂肪醇。这些脂肪醇回收自发酵液并以化学方式氧化成对应的脂肪醛。
在过表达乙酰基转移酶、具有PEX10、HFD1、HFD4和FAO1基因的缺失并且具有降低的GPAT表达的解脂耶氏酵母细胞中表达编码脂肪酰基-CoA去饱和酶的基因、编码脂肪酰基-CoA还原酶的基因。当在发酵培养基中培养时，得到的细胞产生去饱和脂肪醇乙酸酯。
表8.基因组合和得到的产物的例子。
序列
SEQ ID NO:1-脐橙螟Δ11去饱和酶的酿酒酵母密码子优化的核苷酸序列；mRNA编码序列。
SEQ ID NO:2-脐橙螟Δ11去饱和酶的氨基酸序列(翻译)
SEQ ID NO:3解脂耶氏酵母脂肪醛脱氢酶hfd1的核苷酸序列(YALI0F23793g)
SEQ ID NO:4：解脂耶氏酵母脂肪醛脱氢酶HFD1的氨基酸序列
SEQ ID NO:5：解脂耶氏酵母脂肪醛脱氢酶hfd4的核苷酸序列(YALI0B01298g)
SEQ ID NO:6解脂耶氏酵母脂肪醛脱氢酶HFD4的氨基酸序列
SEQ ID NO:7解脂耶氏酵母过氧化物酶体生物合成因子pex10的核苷酸序列(YALI0C01023g)PEX10
SEQ ID NO:8解脂耶氏酵母过氧化物酶体生物合成因子PEX10的氨基酸序列
SEQ ID NO:9解脂耶氏酵母甘油-3-磷酸o-酰基转移酶gpat的核苷酸序列(YALI0C00209g)
SEQ ID NO:10解脂耶氏酵母甘油-3-磷酸o-酰基转移酶GPAT的氨基酸序列
SEQ ID NO:11-H.subflexa脂肪酰基还原酶的酿酒酵母密码子优化的核苷酸序列；mRNA编码序列。
SEQ ID NO:12-H.subflexa脂肪酰基还原酶的氨基酸
SEQ ID NO:13：HarFAR DNA
SEQ ID NO:14：HarFAR
SEQ ID NO:15：HasFAR DNA
SEQ ID NO:16：HasFAR
SEQ ID NO:17：Dmed9 DNA
SEQ ID NO:18：Dmed9
SEQ ID NO:19：Cro_Δ11Z
SEQ ID NO:20：Cpa_Δ11E
SEQ ID NO:21FAO1 DNA
SEQ ID NO:22Fao1蛋白
SEQ ID NO:23：Ban_FAR DNA
SEQ ID NO:24：Ban_FAR
SEQ ID NO:25PR-141
SEQ ID NO:26PR-142
SEQ ID NO:27PR-10851(Atrd11表达盒_fw)
SEQ ID NO:28PR-10853(Hs_Far表达盒_fw)
SEQ ID NO:29PR-10655(EpiVecYL_fw)
SEQ ID NO:30PR-10656(EpiVecYL_rev)
SEQ ID NO:31PR-10702(Δpex10YL_上游_fw)
SEQ ID NO:32PR-10703(Δpex10YL_上游_rev)
SEQ ID NO:33PR-10704(Δpex10YL_下游_fw)
SEQ ID NO:34PR-10705(Δpex10YL_下游_rev)
SEQ ID NO:35PR-10767(NatMxSynYL-起始_rev_新)
SEQ ID NO:36PR-11047(NatMxSynYL-终止_rev_新)
SEQ ID NO:37PR-11110(大肠杆菌主链USER_fw)
SEQ ID NO:38PR-11111(大肠杆菌主链USER_rev)
SEQ ID NO:39PR-11138(Hphsyn_fw)
SEQ ID NO:40PR-11139(Hphsyn_rev)
SEQ ID NO:41PR-11694(GPAT_上游_USER_fw)
SEQ ID NO:42PR-11695(GPAT_下游_USER_rev)
SEQ ID NO:43PR-13494(Nat-Tcyc-loxP_fw)
SEQ ID NO:44PR-13549(loxP-PrTefIntron_fw)
SEQ ID NO:45PR-14269(UraYL_fw)
SEQ ID NO:46PR-14270(UraYL_rev)
SEQ ID NO:47PR-15426(Δhfd1_上游_fw)
SEQ ID NO:48PR-15427(Δhfd1_上游_rev)
SEQ ID NO:49PR-15428(Δhfd1_下游_fw)
SEQ ID NO:50PR-15429(Δhfd1_下游_rev)
SEQ ID NO:51PR-15438(Δhfd4_上游_fw)
SEQ ID NO:52PR-15439(Δhfd4_上游_rev)
SEQ ID NO:53PR-15440(Δhfd4_下游_fw)
SEQ ID NO:54PR-15441(Δhfd4_下游_rev)
SEQ ID NO:55PR-16463(Δfao1YL_上游_fw)
SEQ ID NO:56PR-16464(Δfao1YL_上游_rev)
SEQ ID NO:57PR-16465(Δfao1YL_下游_fw)
SEQ ID NO:58PR-16466(Δfao1YL_下游_rev)
SEQ ID NO:59PR-16696(GPAT_上游_rev)
SEQ ID NO:60PR-16698(GPAT_100bpPr_下游_fw)
SEQ ID NO:61来自酿酒酵母的醇乙酰基转移酶ATF1的解脂耶氏酵母密码子优化的核苷酸序列
SEQ ID NO:62酿酒酵母ATF1p氨基酸序列
SEQ ID NO:63来自黑腹果蝇的Δ9去饱和酶Dmd9的解脂耶氏酵母密码子优化的核苷酸序列
SEQ ID NO:64来自棉铃虫的脂肪酰基还原酶Har_FAR的解脂耶氏酵母密码子优化的核苷酸序列
SEQ ID NO:65来自斜纹夜蛾的Δ9去饱和酶Des11的解脂耶氏酵母密码子优化的核苷酸序列
SEQ ID NO:66来自斜纹夜蛾的Δ9去饱和酶Des11
SEQ ID NO:67来自脐橙螟的Δ11去饱和酶的解脂耶氏酵母密码子优化的核苷酸序列
SEQ ID NO:68来自脐橙螟的Δ11去饱和酶的氨基酸序列
SEQ ID NO:69来自棉铃虫的脂肪酰基还原酶的解脂耶氏酵母密码子优化的核苷酸序列
SEQ ID NO:70来自棉铃虫的脂肪酰基还原酶的氨基酸序列
SEQ ID NO:71 PR-10714
SEQ ID NO:72 PR-10766
SEQ ID NO:73 PR-10767
SEQ ID NO:74 PR-11047
SEQ ID NO:75 PR-13338
SEQ ID NO:76 PR-141
SEQ ID NO:77 PR-14148
SEQ ID NO:78 PR-14149
SEQ ID NO:79 PR-142
SEQ ID NO:80 PR-14565
SEQ ID NO:81 PR-14566
SEQ ID NO:82 PR-14567
SEQ ID NO:83 PR-14568
SEQ ID NO:84 PR-14589
SEQ ID NO:85 PR-14590
SEQ ID NO:86 PR-14591
SEQ ID NO:87 PR-14592
SEQ ID NO:88 PR-15430
SEQ ID NO:89 PR-15431
SEQ ID NO:90 PR-15432
SEQ ID NO:91 PR-15433
SEQ ID NO:92 PR-15434
SEQ ID NO:93 PR-15435
SEQ ID NO:94 PR-15436
SEQ ID NO:95 PR-15437
SEQ ID NO:96 PR-15930
SEQ ID NO:97 PR-16592
SEQ ID NO:98 PR-16593
SEQ ID NO:99 PR-16594
SEQ ID NO:100 PR-16595
SEQ ID NO:101 PR-14149
SEQ ID NO:102 PR-14279
SEQ ID NO:103 PR-14395
SEQ ID NO:104 PR-14396
SEQ ID NO:105 PR-14397
SEQ ID NO:106 PR-14398
SEQ ID NO:107 PR-15521
SEQ ID NO:108 PR-15522
SEQ ID NO:109 PR-18486
SEQ ID NO:110 PR-18487
SEQ ID NO:111 PR-18490
SEQ ID NO:112 PR-18489
SEQ ID NO:113 PR-18499
SEQ ID NO:114 PR-18500
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项目
1.一种能够产生去饱和脂肪醇的产油酵母细胞，所述细胞：
i)表达至少一种能够在脂肪酰基-CoA中引入至少一个双键的异源去饱和酶；并且
ii)表达至少一种能够将至少一部分的所述去饱和脂肪酰基-CoA转化为去饱和脂肪醇的异源脂肪酰基-CoA还原酶；并且
iii)具有降低的Hfd1(SEQ ID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ ID NO:10)中的至少一种的活性或具有降低的如下至少一种蛋白质的活性，所述至少一种蛋白质与Hfd1(SEQ ID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ ID NO:10)中的一种具有至少60％同源性，如与Hfd1(SEQ ID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQ IDNO:22)和GPAT(SEQ ID NO:10)中的一种具有至少65％同源性、如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。
2.根据项目1的酵母细胞，其中所述酵母细胞具有降低的Pex10(SEQ ID NO:8)以及Hfd1(SEQ ID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ ID NO:10)中的至少一种的活性、或降低的Pex10(SEQ ID NO:8)以及Hfd1(SEQ ID NO:4)、Hfd4(SEQID NO:6)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ ID NO:10)中的至少一种的活性，如与Pex10(SEQ ID NO:8)以及Hfd1(SEQ ID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ ID NO:10)中的至少一种具有至少65％同源性、如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。
3.根据项目2的酵母细胞，其中所述酵母属于耶氏酵母属物种，优选地所述酵母是解脂耶氏酵母。
4.根据前述项目中任一项的酵母细胞，其中所述至少一种异源去饱和酶选自Δ3去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ7去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ9去饱和酶、Δ10去饱和酶、Δ11去饱和酶、Δ12去饱和酶、Δ13去饱和酶和Δ14去饱和酶。
5.根据前述项目中任一项的酵母细胞，其中Hfd1、Hfd4、Pex10和Fao1或与其具有至少60％同源性的蛋白质的活性的降低是部分的或完全的，和/或其中GPAT或与其具有至少60％同源性的蛋白质的活性的降低是部分的。
6.根据前述项目中任一项的酵母细胞，其中所述去饱和酶衍生自昆虫的生物，如来自鳞翅目。
7.根据前述项目中任一项的酵母细胞，其中所述去饱和酶是与如SEQ ID NO:2中所示的来自脐橙螟的Δ11去饱和酶具有至少60％同源性的Δ11去饱和酶。
8.根据前述项目中任一项的酵母细胞，其中所述去饱和酶是与如SEQ ID NO:18中所示的来自黑腹果蝇的Δ9去饱和酶具有至少60％同源性的Δ9去饱和酶。
9.根据前述项目中任一项的酵母细胞，其中所述去饱和酶是与如SEQ ID NO:19中所示的来自玫瑰色卷蛾的Δ11去饱和酶具有至少60％同源性的Δ11去饱和酶。
10.根据前述项目中任一项的酵母细胞，其中所述去饱和酶是与如SEQ ID NO:20中所示的来自斑点色卷蛾的Δ11去饱和酶具有至少60％同源性的Δ11去饱和酶。
11.根据前述项目中任一项的酵母细胞，其中所述FAR选自：
i)与如SEQ ID NO:14中所示的来自棉铃虫的FAR具有至少80％同源性的FAR；
ii)与如SEQ ID NO:16中所示的来自烟夜蛾的FAR具有至少80％同源性的FAR；
iii)与如SEQ ID NO:12中所示的来自Heliothis subflexa的FAR具有至少80％同源性的FAR；以及
iv)与如SEQ ID NO:24中所示的来自Bicyclus anynana的FAR具有至少80％同源性的FAR。
12.根据前述项目中任一项的酵母细胞，其还表达能够将至少一部分的所述去饱和脂肪醇转化为去饱和脂肪醇乙酸酯的乙酰基转移酶。
13.根据前述项目中任一项的酵母细胞，其中编码去饱和酶、脂肪酰基-CoA还原酶或乙酰基转移酶的基因中的至少一种以高拷贝数存在。
14.根据前述项目中任一项的酵母细胞，其中编码去饱和酶、脂肪酰基-CoA还原酶或乙酰基转移酶的基因中的至少一种处于诱导型启动子的控制下。
15.根据前述项目中任一项的酵母细胞，其中编码去饱和酶、脂肪酰基-CoA还原酶或乙酰基转移酶的基因中的至少一种针对所述酵母细胞进行了密码子优化。
16.根据前述项目中任一项的酵母细胞，其中编码去饱和酶、脂肪酰基-CoA还原酶或乙酰基转移酶的基因包含在所述细胞的基因组内或包含在所述细胞内包含的载体内。
17.根据前述项目中任一项的酵母细胞，其中所述细胞包含HFD1(SEQ ID NO:3)、HFD4(SEQ ID NO:5)、PEX10(SEQ ID NO:7)、FAO1(SEQ ID NO:21)中的至少一种的缺失或突变和/或GPAT(SEQ ID NO:9)的突变、与其具有至少60％同源性的至少一种核酸序列的缺失或突变，所述至少一种核酸序列与其具有如至少65％同源性、如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性，导致Hfd1、Hfd4、Pex10、Fao1和GPAT中的至少一种的活性降低。
18.根据项目17的酵母细胞，其包含PEX10(SEQ ID NO:7)以及HFD1(SEQ ID NO:3)、HFD4(SEQ ID NO:5)、FAO1(SEQ ID NO:21)和/或GPAT(SEQ ID NO:9)中的至少一种或其同源物的突变。
19.根据前述项目中任一项的酵母细胞，其中使HFD1(SEQ ID NO:3)、HFD4(SEQ IDNO:5)、PEX10(SEQ ID NO:7)和/或FAO1(SEQ ID NO:21)或与其具有至少60％同源性的同源物缺失或突变，导致Hfd1、Hfd4、Pex10和/或Fao1的活性完全丧失，和/或其中使GPAT(SEQID NO:9)或与其具有至少60％同源性的同源物突变，导致GPAT的活性降低。
20.根据前述项目中任一项的酵母细胞，其中所述细胞具有Hfd1(SEQ ID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQ IDNO:22)和GPAT(SEQ ID NO:10)中的至少两种的活性的降低或完全丧失。
21.根据前述项目中任一项的酵母细胞，其中所述细胞具有Hfd1(SEQ ID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ ID NO:10)中的至少三种的活性的降低或完全丧失。
22.根据前述项目中任一项的酵母细胞，其中所述细胞具有Hfd1(SEQ ID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ ID NO:10)中的四种的活性的降低或完全丧失。
23.根据前述项目中任一项的酵母细胞，其中所述细胞具有Hfd1(SEQ ID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ ID NO:10)中的全部的活性的降低或完全丧失。
24.根据前述项目中任一项的酵母细胞，其中所述脂肪酰基-CoA还原酶由与SEQID NO:11、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:15相同或具有至少90％同源性的核酸序列编码，所述核酸序列与SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:15具有如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性、如100％同源性。
25.根据前述项目中任一项的酵母细胞，其中所述细胞能够产生总滴度为至少1mg/L如至少5mg/L、如至少10mg/L、如至少25mg/L、如至少50mg/L、如至少100mg/L、如至少250mg/L、如至少500mg/L、如至少1g/L、如至少2g/L、如至少3g/L、如至少4g/L、如至少5g/L、如至少6g/L、如至少7g/L、如至少8g/L、如至少9g/L、如至少10g/L的脂肪醇，其中总滴度是去饱和脂肪醇的滴度和饱和脂肪醇的滴度之和。
26.根据前述项目中任一项的酵母细胞，其中由所述细胞产生的去饱和脂肪醇占由所述细胞产生的总脂肪醇的至少20％，如由所述细胞产生的总脂肪醇的至少30％、如至少40％、如至少50％、如至少60％、如至少70％、如至少80％、如至少90％。
27.根据前述项目中任一项的酵母细胞，其中所述细胞能够产生滴度为至少0.5mg/L的(Z)11-C16:OH，如至少1mg/L、如至少5mg/L、如至少10mg/L、如至少25mg/L、如至少50mg/L、如至少100mg/L、如至少250mg/L、如至少500mg/L、如至少1g/L、如至少2g/L、如至少3g/L、如至少4g/L、如至少5g/L、如至少6g/L、如至少7g/L、如至少8g/L、如至少9g/L、如至少10g/L的(Z)11-C16:OH。
28.根据前述项目中任一项的酵母细胞，其中由所述细胞产生的(Z)11-C16:OH占由所述细胞产生的总脂肪醇的至少20％，如由所述细胞产生的总脂肪醇的至少30％、如至少40％、如至少50％、如至少60％、如至少70％、如至少80％、如至少90％。
29.一种在产油酵母细胞中产生去饱和脂肪醇和/或去饱和脂肪醇乙酸酯的方法，所述方法包括提供酵母细胞以及在培养基中孵育所述酵母细胞的步骤，其中所述酵母细胞：
i)表达至少一种能够在脂肪酰基-CoA中引入至少一个双键的异源去饱和酶，从而将至少一部分的所述脂肪酰基-CoA转化为去饱和脂肪酰基-CoA；并且
ii)表达至少一种能够将至少一部分的所述去饱和脂肪酰基-CoA转化为去饱和脂肪醇的异源脂肪酰基-CoA还原酶，从而产生所述去饱和脂肪醇；并且
iii)具有降低的Hfd1(SEQ ID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ ID NO:10)中的至少一种的活性或降低的如下至少一种蛋白质的活性，所述至少一种蛋白质与Hfd1(SEQ ID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ ID NO:10)中的一种具有至少60％同源性，如与Hfd1(SEQ ID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ ID NO:10)中的一种具有至少65％同源性、如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。
30.根据项目27的方法，其中所述酵母细胞具有导致Pex10(SEQ ID NO:8)的活性降低的突变和导致Hfd1(SEQ ID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ ID NO:10)中的至少一种的活性降低的突变，或者具有导致与Pex10(SEQ ID NO:8)具有至少60％同源性的至少一种蛋白质的活性降低的突变和导致Hfd1(SEQ ID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ ID NO:10)中的至少一种的活性降低的突变，所述至少一种蛋白质与Pex10(SEQ ID NO:8)以及Hfd1(SEQ ID NO:4)、Hfd4(SEQ IDNO:6)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ ID NO:10)中的至少一种具有如至少65％同源性、如至少70％同源性、如至少75％同源性、如至少80％同源性、如至少81％同源性、如至少82％同源性、如至少83％同源性、如至少84％同源性、如至少85％同源性、如至少86％同源性、如至少87％同源性、如至少88％同源性、如至少89％同源性、如至少90％同源性、如至少91％同源性、如至少92％同源性、如至少93％同源性、如至少94％同源性、如至少95％同源性、如至少96％同源性、如至少97％同源性、如至少98％同源性、如至少99％同源性。
31.根据项目29至30中任一项的方法，其中所述酵母细胞如项目1至29中任一项所定义。
32.根据项目29至31中任一项的方法，其还包括将步骤ii)的去饱和脂肪醇转化为脂肪醇乙酸酯或脂肪醛的步骤。
33.根据项目29至32中任一项的方法，其还包括回收所述去饱和脂肪醇、所述脂肪醇乙酸酯和/或所述醛的步骤。
34.根据项目29至33中任一项的方法，其还包括在信息素组合物中配制所述去饱和脂肪醇、所述脂肪醇乙酸酯和/或所述醛的步骤。
35.根据项目29至34中任一项的方法，其中所述信息素组合物还包含一种或多种另外的化合物，如液体或固体载体或基质。
36.根据项目29至33中任一项的方法，其中至少一部分的所述去饱和脂肪醇是Z11-16:OH。
37.一种用于修饰酵母细胞的核酸构建体，所述构建体包含：
i)编码至少一种能够在脂肪酰基-CoA中引入至少一个双键的异源去饱和酶的第一多核苷酸；和
ii)编码至少一种能够将至少一部分的所述去饱和脂肪酰基-CoA转化为去饱和脂肪醇的异源脂肪酰基-CoA还原酶(FAR)的第二多核苷酸；以及
iii)任选地，用于降低Hfd1(SEQ ID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ IDNO:8)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ ID NO:10)中的至少一种的活性或与Hfd1(SEQ IDNO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ IDNO:10)中的一种具有至少60％同源性的至少一种蛋白质的活性的另外的多核苷酸，
其中任选地，所述第一多核苷酸和/或所述第二多核苷酸和/或所述另外的多核苷酸处于启动子的控制下。
38.根据项目37的核酸构建体，其还包含编码至少一种能够将至少一部分的所述去饱和脂肪醇转化为去饱和脂肪醇乙酸酯的乙酰基转移酶的第三多核苷酸。
39.一种部件试剂盒，其包含：
a)根据项目1至28中任一项的酵母细胞和使用说明书；和/或
b)根据项目37或38中任一项的核酸构建体，其中所述构建体用于修饰酵母细胞；以及
c)任选地，待修饰的酵母细胞。
40.根据项目39的部件试剂盒，其中所述待修饰的酵母细胞具有降低的Hfd1(SEQID NO:4)、Hfd4(SEQ ID NO:6)、Pex10(SEQ ID NO:8)、Fao1(SEQ ID NO:22)和GPAT(SEQ IDNO:10)中的至少一种的活性。
41.一种通过根据项目29至36中任一项的方法可获得的去饱和脂肪醇、去饱和脂肪醇乙酸酯或去饱和脂肪醛。
42.通过根据项目29至36中任一项的方法可获得的去饱和脂肪醇、去饱和脂肪醇乙酸酯或去饱和脂肪醛的用途。
序列表
<110> 丹麦技术大学（Danmarks Tekniske Universitet）
<120> 在酵母中产生脂肪醇及其衍生物的方法
<130> P4260PC00
<160> 114
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 981
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密码子优化的核苷酸序列
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(981)
<223> 脐橙螟Δ11去饱和酶的酿酒酵母密码子优化的核苷酸序列；mRNA编码序列。
<400> 1
atggttccaa acaagggttc ctctgatgtt ttgtctgaac attctgaacc acaattcacc 60
aagttgattg ctccacaagc tggtccaaga aagtacaaaa tcgtttacag aaacttgttg 120
accttcggtt actggcattt gtctgctgtt tatggtttgt acttgtgttt cacttgtgct 180
aagtgggcta ctattttgtt cgctttcttc ttgtacgtta tcgccgaaat tggtattact 240
ggtggtgctc atagattatg ggctcataga acttacaaag ccaagttgcc attggaaatc 300
ttgttgttga tcatgaactc cattgccttc caagatactg cttttacttg ggctagagat 360
catagattgc atcacaagta ctctgatact gatgctgatc cacataatgc tactagaggt 420
ttcttctact ctcatgttgg ttggttgttg gttaagaaac acccagaagt taaggctaga 480
ggtaagtact tgtctttgga tgacttgaag aacaaccctt tgttgaagtt ccaaaagaag 540
tacgccattt tggtcattgg tactttgtgc tttttgatgc caactttcgt tccagtttac 600
ttttggggtg aaggtatttc tactgcctgg aacattaact tgttaagata cgtcatgaac 660
ttgaacatga cctttttggt taactccgct gctcatattt ttggtaacaa gccatacgat 720
aagtctatcg cctctgttca aaacatctct gtttctttgg ctactttcgg tgaaggtttc 780
cataactacc atcatactta tccatgggat tacagagctg ctgaattggg taacaataga 840
ttgaatatga ccaccgcctt cattgatttc tttgcttgga ttggttgggc ctacgatttg 900
aaatctgttc cacaagaagc tattgctaag agatgtgcta aaactggtga tggtactgat 960
atgtggggta gaaagagatg a 981
<210> 2
<211> 326
<212> PRT
<213> 脐橙螟
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(326)
<223> 脐橙螟Δ11去饱和酶的氨基酸序列（翻译）
<400> 2
Met Val Pro Asn Lys Gly Ser Ser Asp Val Leu Ser Glu His Ser Glu
1 5 10 15
Pro Gln Phe Thr Lys Leu Ile Ala Pro Gln Ala Gly Pro Arg Lys Tyr
20 25 30
Lys Ile Val Tyr Arg Asn Leu Leu Thr Phe Gly Tyr Trp His Leu Ser
35 40 45
Ala Val Tyr Gly Leu Tyr Leu Cys Phe Thr Cys Ala Lys Trp Ala Thr
50 55 60
Ile Leu Phe Ala Phe Phe Leu Tyr Val Ile Ala Glu Ile Gly Ile Thr
65 70 75 80
Gly Gly Ala His Arg Leu Trp Ala His Arg Thr Tyr Lys Ala Lys Leu
85 90 95
Pro Leu Glu Ile Leu Leu Leu Ile Met Asn Ser Ile Ala Phe Gln Asp
100 105 110
Thr Ala Phe Thr Trp Ala Arg Asp His Arg Leu His His Lys Tyr Ser
115 120 125
Asp Thr Asp Ala Asp Pro His Asn Ala Thr Arg Gly Phe Phe Tyr Ser
130 135 140
His Val Gly Trp Leu Leu Val Lys Lys His Pro Glu Val Lys Ala Arg
145 150 155 160
Gly Lys Tyr Leu Ser Leu Asp Asp Leu Lys Asn Asn Pro Leu Leu Lys
165 170 175
Phe Gln Lys Lys Tyr Ala Ile Leu Val Ile Gly Thr Leu Cys Phe Leu
180 185 190
Met Pro Thr Phe Val Pro Val Tyr Phe Trp Gly Glu Gly Ile Ser Thr
195 200 205
Ala Trp Asn Ile Asn Leu Leu Arg Tyr Val Met Asn Leu Asn Met Thr
210 215 220
Phe Leu Val Asn Ser Ala Ala His Ile Phe Gly Asn Lys Pro Tyr Asp
225 230 235 240
Lys Ser Ile Ala Ser Val Gln Asn Ile Ser Val Ser Leu Ala Thr Phe
245 250 255
Gly Glu Gly Phe His Asn Tyr His His Thr Tyr Pro Trp Asp Tyr Arg
260 265 270
Ala Ala Glu Leu Gly Asn Asn Arg Leu Asn Met Thr Thr Ala Phe Ile
275 280 285
Asp Phe Phe Ala Trp Ile Gly Trp Ala Tyr Asp Leu Lys Ser Val Pro
290 295 300
Gln Glu Ala Ile Ala Lys Arg Cys Ala Lys Thr Gly Asp Gly Thr Asp
305 310 315 320
Met Trp Gly Arg Lys Arg
325
<210> 3
<211> 1560
<212> DNA
<213> 解脂耶氏酵母
<400> 3
atgtctacct ttgattggga atccattgtg cctgccactc ctctcgacca gattcctggc 60
gacatccagc gactgcgaaa gggcttccga tccggaaaga ccctcgatct caactaccga 120
ctggaccaga ttcgaaactt gcactacgtc ctcagagaca atgtcgaggc catcaaggac 180
gccgtgtaca aggatctcgg ccgacccaag cacgagactg acctgtgcga ggtgggtttc 240
ctgtggggcg agtttaacaa cgtggttgcc aacctcaaga agtgggccgc cgacgaggac 300
gtcaagacca acctgcagta ctccatctcc tcccccaaga tccgaaagcg acctcttgga 360
aacgtgctca tcatctcgcc ctggaactac ccctttatgc tgaccgtgtc tcctctcatt 420
ggagctctgg ctgccggtaa cactgtggct gtcaagttct ccgaaatggc cccccacact 480
tccaaaattg ttggcgactt gtgcaccaag gccctcgacc ccgacgtctt ccaggccatc 540
cagggaggtg tccccgtcgt caccaagacc ctcgagcaga agttcgacaa gattatgtac 600
actggtaacc acactgtcgg taagatcatt gccactgccg ccaacaagta cctgacaccc 660
gtcatcctcg agctcggagg taagtcgccc gtttttgtca ccaagaactg caagaacatc 720
aagcttgccg ctaagcgagc cctgtggggt aaggtggtaa acgctggcca gacctgtgtg 780
gctcccgact acgtgattgt cgagcccgag gtggagcagg agtttatcga cgcctgcaag 840
tactggatta acgagttcta cagtggtaag attgaccagt acaaccccga ctttgccaag 900
atcgccaccc ccaaccactg gaaccgactt acctccatgt tgagcaagtc caagggagag 960
atcattactg gaggtaacac tgacgagaag actcgattca tcgctcctac tgtcgtcgca 1020
aaggtccccg acaatgattc cctgatggag gacgagattt tcggccctct tctgcccatt 1080
ctcactgccc gatccgtcga ggagggtatc aagtacgtgc acgagaacca cgacacccct 1140
cttgccatgt acgtcttcac tgacaaggcc tctgagggcg actacatcca gtcccagatc 1200
aactctggtg gccttatctt caatgacact ctgatccacg ttggatgtgt ccaggctccg 1260
tttggtggtg tcggcatgtc cggttacggt gcttaccatg gcgaggactc cttcctggcc 1320
ttcacccacc gacaaaccta cctcaaccag cccaagcttc tggagcctct tcaggacgtg 1380
cgatacgccc cctacaccaa aaccaagcga agcatggtca agaacctgct gctggtcggc 1440
cccattttcc cccgaaccgg ctccgtatac cccaacgtgc tgatccgaat cttccgaaag 1500
atttggttct gggtccttat tgtcgccatc ggagctgctg gtgccaaggc tctgctctag 1560
<210> 4
<211> 519
<212> PRT
<213> 解脂耶氏酵母
<400> 4
Met Ser Thr Phe Asp Trp Glu Ser Ile Val Pro Ala Thr Pro Leu Asp
1 5 10 15
Gln Ile Pro Gly Asp Ile Gln Arg Leu Arg Lys Gly Phe Arg Ser Gly
20 25 30
Lys Thr Leu Asp Leu Asn Tyr Arg Leu Asp Gln Ile Arg Asn Leu His
35 40 45
Tyr Val Leu Arg Asp Asn Val Glu Ala Ile Lys Asp Ala Val Tyr Lys
50 55 60
Asp Leu Gly Arg Pro Lys His Glu Thr Asp Leu Cys Glu Val Gly Phe
65 70 75 80
Leu Trp Gly Glu Phe Asn Asn Val Val Ala Asn Leu Lys Lys Trp Ala
85 90 95
Ala Asp Glu Asp Val Lys Thr Asn Leu Gln Tyr Ser Ile Ser Ser Pro
100 105 110
Lys Ile Arg Lys Arg Pro Leu Gly Asn Val Leu Ile Ile Ser Pro Trp
115 120 125
Asn Tyr Pro Phe Met Leu Thr Val Ser Pro Leu Ile Gly Ala Leu Ala
130 135 140
Ala Gly Asn Thr Val Ala Val Lys Phe Ser Glu Met Ala Pro His Thr
145 150 155 160
Ser Lys Ile Val Gly Asp Leu Cys Thr Lys Ala Leu Asp Pro Asp Val
165 170 175
Phe Gln Ala Ile Gln Gly Gly Val Pro Val Val Thr Lys Thr Leu Glu
180 185 190
Gln Lys Phe Asp Lys Ile Met Tyr Thr Gly Asn His Thr Val Gly Lys
195 200 205
Ile Ile Ala Thr Ala Ala Asn Lys Tyr Leu Thr Pro Val Ile Leu Glu
210 215 220
Leu Gly Gly Lys Ser Pro Val Phe Val Thr Lys Asn Cys Lys Asn Ile
225 230 235 240
Lys Leu Ala Ala Lys Arg Ala Leu Trp Gly Lys Val Val Asn Ala Gly
245 250 255
Gln Thr Cys Val Ala Pro Asp Tyr Val Ile Val Glu Pro Glu Val Glu
260 265 270
Gln Glu Phe Ile Asp Ala Cys Lys Tyr Trp Ile Asn Glu Phe Tyr Ser
275 280 285
Gly Lys Ile Asp Gln Tyr Asn Pro Asp Phe Ala Lys Ile Ala Thr Pro
290 295 300
Asn His Trp Asn Arg Leu Thr Ser Met Leu Ser Lys Ser Lys Gly Glu
305 310 315 320
Ile Ile Thr Gly Gly Asn Thr Asp Glu Lys Thr Arg Phe Ile Ala Pro
325 330 335
Thr Val Val Ala Lys Val Pro Asp Asn Asp Ser Leu Met Glu Asp Glu
340 345 350
Ile Phe Gly Pro Leu Leu Pro Ile Leu Thr Ala Arg Ser Val Glu Glu
355 360 365
Gly Ile Lys Tyr Val His Glu Asn His Asp Thr Pro Leu Ala Met Tyr
370 375 380
Val Phe Thr Asp Lys Ala Ser Glu Gly Asp Tyr Ile Gln Ser Gln Ile
385 390 395 400
Asn Ser Gly Gly Leu Ile Phe Asn Asp Thr Leu Ile His Val Gly Cys
405 410 415
Val Gln Ala Pro Phe Gly Gly Val Gly Met Ser Gly Tyr Gly Ala Tyr
420 425 430
His Gly Glu Asp Ser Phe Leu Ala Phe Thr His Arg Gln Thr Tyr Leu
435 440 445
Asn Gln Pro Lys Leu Leu Glu Pro Leu Gln Asp Val Arg Tyr Ala Pro
450 455 460
Tyr Thr Lys Thr Lys Arg Ser Met Val Lys Asn Leu Leu Leu Val Gly
465 470 475 480
Pro Ile Phe Pro Arg Thr Gly Ser Val Tyr Pro Asn Val Leu Ile Arg
485 490 495
Ile Phe Arg Lys Ile Trp Phe Trp Val Leu Ile Val Ala Ile Gly Ala
500 505 510
Ala Gly Ala Lys Ala Leu Leu
515
<210> 5
<211> 1590
<212> DNA
<213> 解脂耶氏酵母
<400> 5
atgactacca ctgccacaga gacccccacg acaaacgtga cccccaccac gtcactgccc 60
aaggagaccg cctccccagg agggaccgct tctgtcaaca cgtcattcga ctgggagagc 120
atctgcggca agacgccgtt ggaggagatc gagtcggaca tttcgcgtct caaaaagacc 180
ttccgatcgg gcaaaactct ggatctggac taccgactcg accagatccg aaacctggcg 240
tatgcgatcc gcgataacga aaacaagatc cgcgacgcca tcaaggcgga cctgaaacga 300
cctgacttcg aaaccatggc ggccgagttc tcggtccaga tgggcgaatt caactacgtg 360
gtcaaaaacc tgccgaaatg ggtcaaggac gaaaaagtca agggaaccag catggcgtac 420
tggaactcgt cgccaaagat ccggaaacgg cccctgggct ccgtgcttgt catcacgccc 480
tggaactacc cactgattct ggccgtgtcg cctgttctgg gcgccattgc cgcaggcaac 540
accgtggcgc tgaaaatgtc agaaatgtca cccaacgcgt caaaggtgat tggcgacatt 600
atgacagctg ccctggaccc ccagctcttt caatgcttct tcggaggagt ccccgaaacc 660
accgagatcc tcaaacacag atgggacaag atcatgtaca ccggaaacgg caaagtgggc 720
cgaatcatct gtgaggctgc caacaagtac ttgacacctg tggagctcga actcggagga 780
aagtcgcctg ttttcgtcac caaacactgc tccaacctgg aaatggccgc ccgccgaatc 840
atctggggca aattcgtcaa cggaggacaa acctgcgtgg ctccagacta cgttctggtg 900
tgtcccgagg tccacgacaa atttgtggct gcctgtcaaa aggtgctgga caagttctac 960
cctaacaact ctgccgagtc cgagatggcc catatcgcca cccctctcca ttacgagcgt 1020
ttgacgggcc tgctcaattc cacccgaggt aaggtcgttg ctggaggcac tttcaactcg 1080
gccacccggt tcattgctcc tacgattgtc gacggagtgg atgccaacga ttctctgatg 1140
cagggagaac tgtttggtcc tcttctcccc attgtcaagg ccatgagcac cgaggctgcc 1200
tgcaactttg tgcttgagca ccaccccacc cccctggcag agtacatctt ttcagataac 1260
aattctgaga ttgattacat ccgagatcga gtgtcgtctg gaggtctcgt gatcaacgac 1320
actctgatcc acgtgggatg cgtacaggcg ccctttggag gtgtcggaga cagtggaaat 1380
ggaggatacc atggcaagca cactttcgat ttgttcagcc attctcagac ggtcctcaga 1440
caacccggat gggtcgaaat gctgcagaag aaacggtatc ctccgtacaa caagagcaac 1500
gagaagtttg tccggagaat ggtggtcccc agccctggtt ttccccggga gggtgacgtg 1560
agaggatttt ggtcgagact cttcaactag 1590
<210> 6
<211> 529
<212> PRT
<213> 解脂耶氏酵母
<400> 6
Met Thr Thr Thr Ala Thr Glu Thr Pro Thr Thr Asn Val Thr Pro Thr
1 5 10 15
Thr Ser Leu Pro Lys Glu Thr Ala Ser Pro Gly Gly Thr Ala Ser Val
20 25 30
Asn Thr Ser Phe Asp Trp Glu Ser Ile Cys Gly Lys Thr Pro Leu Glu
35 40 45
Glu Ile Glu Ser Asp Ile Ser Arg Leu Lys Lys Thr Phe Arg Ser Gly
50 55 60
Lys Thr Leu Asp Leu Asp Tyr Arg Leu Asp Gln Ile Arg Asn Leu Ala
65 70 75 80
Tyr Ala Ile Arg Asp Asn Glu Asn Lys Ile Arg Asp Ala Ile Lys Ala
85 90 95
Asp Leu Lys Arg Pro Asp Phe Glu Thr Met Ala Ala Glu Phe Ser Val
100 105 110
Gln Met Gly Glu Phe Asn Tyr Val Val Lys Asn Leu Pro Lys Trp Val
115 120 125
Lys Asp Glu Lys Val Lys Gly Thr Ser Met Ala Tyr Trp Asn Ser Ser
130 135 140
Pro Lys Ile Arg Lys Arg Pro Leu Gly Ser Val Leu Val Ile Thr Pro
145 150 155 160
Trp Asn Tyr Pro Leu Ile Leu Ala Val Ser Pro Val Leu Gly Ala Ile
165 170 175
Ala Ala Gly Asn Thr Val Ala Leu Lys Met Ser Glu Met Ser Pro Asn
180 185 190
Ala Ser Lys Val Ile Gly Asp Ile Met Thr Ala Ala Leu Asp Pro Gln
195 200 205
Leu Phe Gln Cys Phe Phe Gly Gly Val Pro Glu Thr Thr Glu Ile Leu
210 215 220
Lys His Arg Trp Asp Lys Ile Met Tyr Thr Gly Asn Gly Lys Val Gly
225 230 235 240
Arg Ile Ile Cys Glu Ala Ala Asn Lys Tyr Leu Thr Pro Val Glu Leu
245 250 255
Glu Leu Gly Gly Lys Ser Pro Val Phe Val Thr Lys His Cys Ser Asn
260 265 270
Leu Glu Met Ala Ala Arg Arg Ile Ile Trp Gly Lys Phe Val Asn Gly
275 280 285
Gly Gln Thr Cys Val Ala Pro Asp Tyr Val Leu Val Cys Pro Glu Val
290 295 300
His Asp Lys Phe Val Ala Ala Cys Gln Lys Val Leu Asp Lys Phe Tyr
305 310 315 320
Pro Asn Asn Ser Ala Glu Ser Glu Met Ala His Ile Ala Thr Pro Leu
325 330 335
His Tyr Glu Arg Leu Thr Gly Leu Leu Asn Ser Thr Arg Gly Lys Val
340 345 350
Val Ala Gly Gly Thr Phe Asn Ser Ala Thr Arg Phe Ile Ala Pro Thr
355 360 365
Ile Val Asp Gly Val Asp Ala Asn Asp Ser Leu Met Gln Gly Glu Leu
370 375 380
Phe Gly Pro Leu Leu Pro Ile Val Lys Ala Met Ser Thr Glu Ala Ala
385 390 395 400
Cys Asn Phe Val Leu Glu His His Pro Thr Pro Leu Ala Glu Tyr Ile
405 410 415
Phe Ser Asp Asn Asn Ser Glu Ile Asp Tyr Ile Arg Asp Arg Val Ser
420 425 430
Ser Gly Gly Leu Val Ile Asn Asp Thr Leu Ile His Val Gly Cys Val
435 440 445
Gln Ala Pro Phe Gly Gly Val Gly Asp Ser Gly Asn Gly Gly Tyr His
450 455 460
Gly Lys His Thr Phe Asp Leu Phe Ser His Ser Gln Thr Val Leu Arg
465 470 475 480
Gln Pro Gly Trp Val Glu Met Leu Gln Lys Lys Arg Tyr Pro Pro Tyr
485 490 495
Asn Lys Ser Asn Glu Lys Phe Val Arg Arg Met Val Val Pro Ser Pro
500 505 510
Gly Phe Pro Arg Glu Gly Asp Val Arg Gly Phe Trp Ser Arg Leu Phe
515 520 525
Asn
<210> 7
<211> 1134
<212> DNA
<213> 解脂耶氏酵母
<400> 7
atgtggggaa gttcacatgc attcgctggt gaatctgatc tgacactaca actacacacc 60
aggtccaaca tgagcgacaa tacgacaatc aaaaagccga tccgacccaa accgatccgg 120
acggaacgcc tgccttacgc tggggccgca gaaatcatcc gagccaacca gaaagaccac 180
tactttgagt ccgtgcttga acagcatctc gtcacgtttc tgcagaaatg gaagggagta 240
cgatttatcc accagtacaa ggaggagctg gagacggcgt ccaagtttgc atatctcggt 300
ttgtgtacgc ttgtgggctc caagactctc ggagaagagt acaccaatct catgtacact 360
atcagagacc gaacagctct accgggggtg gtgagacggt ttggctacgt gctttccaac 420
actctgtttc catacctgtt tgtgcgctac atgggcaagt tgcgcgccaa actgatgcgc 480
gagtatcccc atctggtgga gtacgacgaa gatgagcctg tgcccagccc ggaaacatgg 540
aaggagcggg tcatcaagac gtttgtgaac aagtttgaca agttcacggc gctggagggg 600
tttaccgcga tccacttggc gattttctac gtctacggct cgtactacca gctcagtaag 660
cggatctggg gcatgcgtta tgtatttgga caccgactgg acaagaatga gcctcgaatc 720
ggttacgaga tgctcggtct gctgattttc gcccggtttg ccacgtcatt tgtgcagacg 780
ggaagagagt acctcggagc gctgctggaa aagagcgtgg agaaagaggc aggggagaag 840
gaagatgaaa aggaagcggt tgtgccgaaa aagaagtcgt caattccgtt cattgaggat 900
acagaagggg agacggaaga caagatcgat ctggaggacc ctcgacagct caagttcatt 960
cctgaggcgt ccagagcgtg cactctgtgt ctgtcataca ttagtgcgcc ggcatgtacg 1020
ccatgtggac actttttctg ttgggactgt atttccgaat gggtgagaga gaagcccgag 1080
tgtcccttgt gtcggcaggg tgtgagagag cagaacttgt tgcctatcag ataa 1134
<210> 8
<211> 377
<212> PRT
<213> 解脂耶氏酵母
<400> 8
Met Trp Gly Ser Ser His Ala Phe Ala Gly Glu Ser Asp Leu Thr Leu
1 5 10 15
Gln Leu His Thr Arg Ser Asn Met Ser Asp Asn Thr Thr Ile Lys Lys
20 25 30
Pro Ile Arg Pro Lys Pro Ile Arg Thr Glu Arg Leu Pro Tyr Ala Gly
35 40 45
Ala Ala Glu Ile Ile Arg Ala Asn Gln Lys Asp His Tyr Phe Glu Ser
50 55 60
Val Leu Glu Gln His Leu Val Thr Phe Leu Gln Lys Trp Lys Gly Val
65 70 75 80
Arg Phe Ile His Gln Tyr Lys Glu Glu Leu Glu Thr Ala Ser Lys Phe
85 90 95
Ala Tyr Leu Gly Leu Cys Thr Leu Val Gly Ser Lys Thr Leu Gly Glu
100 105 110
Glu Tyr Thr Asn Leu Met Tyr Thr Ile Arg Asp Arg Thr Ala Leu Pro
115 120 125
Gly Val Val Arg Arg Phe Gly Tyr Val Leu Ser Asn Thr Leu Phe Pro
130 135 140
Tyr Leu Phe Val Arg Tyr Met Gly Lys Leu Arg Ala Lys Leu Met Arg
145 150 155 160
Glu Tyr Pro His Leu Val Glu Tyr Asp Glu Asp Glu Pro Val Pro Ser
165 170 175
Pro Glu Thr Trp Lys Glu Arg Val Ile Lys Thr Phe Val Asn Lys Phe
180 185 190
Asp Lys Phe Thr Ala Leu Glu Gly Phe Thr Ala Ile His Leu Ala Ile
195 200 205
Phe Tyr Val Tyr Gly Ser Tyr Tyr Gln Leu Ser Lys Arg Ile Trp Gly
210 215 220
Met Arg Tyr Val Phe Gly His Arg Leu Asp Lys Asn Glu Pro Arg Ile
225 230 235 240
Gly Tyr Glu Met Leu Gly Leu Leu Ile Phe Ala Arg Phe Ala Thr Ser
245 250 255
Phe Val Gln Thr Gly Arg Glu Tyr Leu Gly Ala Leu Leu Glu Lys Ser
260 265 270
Val Glu Lys Glu Ala Gly Glu Lys Glu Asp Glu Lys Glu Ala Val Val
275 280 285
Pro Lys Lys Lys Ser Ser Ile Pro Phe Ile Glu Asp Thr Glu Gly Glu
290 295 300
Thr Glu Asp Lys Ile Asp Leu Glu Asp Pro Arg Gln Leu Lys Phe Ile
305 310 315 320
Pro Glu Ala Ser Arg Ala Cys Thr Leu Cys Leu Ser Tyr Ile Ser Ala
325 330 335
Pro Ala Cys Thr Pro Cys Gly His Phe Phe Cys Trp Asp Cys Ile Ser
340 345 350
Glu Trp Val Arg Glu Lys Pro Glu Cys Pro Leu Cys Arg Gln Gly Val
355 360 365
Arg Glu Gln Asn Leu Leu Pro Ile Arg
370 375
<210> 9
<211> 2184
<212> DNA
<213> 解脂耶氏酵母
<400> 9
atgtccgaaa ccgaccatct gctggccgcc gagcccgtgg ctgagtaccc ccagtacacg 60
ccttggccca actcccgaaa atcagtggac acggagtttt ccgcaacctc gtggatttac 120
gacttggttc tgtggatttt cacggcttgc tttgacattt ttttcagaga aatccggcca 180
cgtggtgcct tccgaatccc cagaaagggc cccgtgctgt tcgtggctgc cccccacgca 240
aaccagtttg tggaccccgt catcctcatg aaccaggtca aacaggaggc cggacgacga 300
atctccttcc ttgtggccga gaagtccatg cgacgagctg cagtcggacg aatggcccga 360
agcatgaact caattcctgt cgtgcgagct caggacaatg caaaaaaggg agagggaaag 420
atttacgtcg acgcagagga ccccacaaag atccacggaa tcggcaccca gttcacgaag 480
cagtgcgagg tgcgaggcct cgtggtctgc tcgtcctctg tcggctcaat tgacgtggct 540
gagattgtgt ccgacactct gctcattgca agaaaggaat tcaagggccc caaagccaag 600
gaggctctca aggaatccaa cggaggaatc acatacaagt acgccgacta cgtcaaccag 660
gccacagtct accgatccgt attcgacaaa ttgcaccatg gaggctgtgt gggtatcttc 720
ccagagggag gatctcatga ccgaaccgaa ctgctgcccc ttaaggccgg tgttgctatc 780
atggctctgg gggctctcgc agaggacccc tcttgtggtg tgcgaatcgt cccctgtggt 840
ctcaactact tccacgccca caagttccga tctcgggccg tggtggagtt tggctctcct 900
attgccattc ctccggatct cgtggagaag tacaaggcag gaggagaggc caagcgggag 960
gctgtcaaga ccgttctaga cattactgcc gctggtctca agtctgtgac tgttcaggtg 1020
caggatttcg acaccctgat gctgatccag gccattcgac gactctaccg acctcccgga 1080
aagaagattc ctctgcccat ggttgtagag ctcaaccgtc gacttgtata cgcctacaac 1140
cactacaagg acgatccccg tatcgaggag atgaagcagg agattcgaaa gtacaacaag 1200
ttcctgcagg ccatgggtct caaggaccat caggtagaga aggcccgaat ctccaagatt 1260
gagattctgg gccggcttct gtaccggtcc atcaagcttg tgttcttgtc cattggctgt 1320
ctccccggtc tgcttttgtt ttctcccatc ttcatcattt ctaagtccat ttccaaaacc 1380
aaggccaagg aggctctcaa ggcctccagt gtcaaaatca aggctaacga tgtggttgcc 1440
acttggaagg tgctggttgc aatgggtctg accccagttc tttacattct ctattcactg 1500
gttggatctg tggtgattcg aaagctcgat ctcatctcct ggttccccac aattcttctt 1560
cccggcctcg ttttaagcat catcatcaca acctcatacg ccgccctggc tatgggagag 1620
gccggtatgg acattttcaa gtctcttcga ccacttgcat tggctctcaa cccttccacc 1680
aaaaactctc tgctcaagct gcaaaatgaa cgaaagcgac ttgtgctcaa gtcttccgag 1740
ctcgttacct ctttgggccc tgagctgttc cccgacttcc ccgagaactc cattctgcag 1800
ggaagcgata agtttgagga cgaggagaac tacgaaaacg agaagcgatc gcattccaga 1860
tccacttctg ccacttctct atctgccatg agcgagggag acggtgatga gcttgttcgg 1920
gaggtccgaa agggtgctag ctacttccct gtgagtacca tttctgagga cgaagaccaa 1980
gccatctcgc gagtgggctc tgaggcatct cttgctgaca ttcctctgtt tggtatgtcc 2040
cgatcacaat ctggagcttc tctttcggaa gcctccacac acggctcttc tactggagct 2100
gatgccgagg aggctaagac ggaggtgact cgcagaattg cattggcgat ggaggaaaaa 2160
cgacgagagc aggatgagga ataa 2184
<210> 10
<211> 727
<212> PRT
<213> 解脂耶氏酵母
<400> 10
Met Ser Glu Thr Asp His Leu Leu Ala Ala Glu Pro Val Ala Glu Tyr
1 5 10 15
Pro Gln Tyr Thr Pro Trp Pro Asn Ser Arg Lys Ser Val Asp Thr Glu
20 25 30
Phe Ser Ala Thr Ser Trp Ile Tyr Asp Leu Val Leu Trp Ile Phe Thr
35 40 45
Ala Cys Phe Asp Ile Phe Phe Arg Glu Ile Arg Pro Arg Gly Ala Phe
50 55 60
Arg Ile Pro Arg Lys Gly Pro Val Leu Phe Val Ala Ala Pro His Ala
65 70 75 80
Asn Gln Phe Val Asp Pro Val Ile Leu Met Asn Gln Val Lys Gln Glu
85 90 95
Ala Gly Arg Arg Ile Ser Phe Leu Val Ala Glu Lys Ser Met Arg Arg
100 105 110
Ala Ala Val Gly Arg Met Ala Arg Ser Met Asn Ser Ile Pro Val Val
115 120 125
Arg Ala Gln Asp Asn Ala Lys Lys Gly Glu Gly Lys Ile Tyr Val Asp
130 135 140
Ala Glu Asp Pro Thr Lys Ile His Gly Ile Gly Thr Gln Phe Thr Lys
145 150 155 160
Gln Cys Glu Val Arg Gly Leu Val Val Cys Ser Ser Ser Val Gly Ser
165 170 175
Ile Asp Val Ala Glu Ile Val Ser Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg Lys
180 185 190
Glu Phe Lys Gly Pro Lys Ala Lys Glu Ala Leu Lys Glu Ser Asn Gly
195 200 205
Gly Ile Thr Tyr Lys Tyr Ala Asp Tyr Val Asn Gln Ala Thr Val Tyr
210 215 220
Arg Ser Val Phe Asp Lys Leu His His Gly Gly Cys Val Gly Ile Phe
225 230 235 240
Pro Glu Gly Gly Ser His Asp Arg Thr Glu Leu Leu Pro Leu Lys Ala
245 250 255
Gly Val Ala Ile Met Ala Leu Gly Ala Leu Ala Glu Asp Pro Ser Cys
260 265 270
Gly Val Arg Ile Val Pro Cys Gly Leu Asn Tyr Phe His Ala His Lys
275 280 285
Phe Arg Ser Arg Ala Val Val Glu Phe Gly Ser Pro Ile Ala Ile Pro
290 295 300
Pro Asp Leu Val Glu Lys Tyr Lys Ala Gly Gly Glu Ala Lys Arg Glu
305 310 315 320
Ala Val Lys Thr Val Leu Asp Ile Thr Ala Ala Gly Leu Lys Ser Val
325 330 335
Thr Val Gln Val Gln Asp Phe Asp Thr Leu Met Leu Ile Gln Ala Ile
340 345 350
Arg Arg Leu Tyr Arg Pro Pro Gly Lys Lys Ile Pro Leu Pro Met Val
355 360 365
Val Glu Leu Asn Arg Arg Leu Val Tyr Ala Tyr Asn His Tyr Lys Asp
370 375 380
Asp Pro Arg Ile Glu Glu Met Lys Gln Glu Ile Arg Lys Tyr Asn Lys
385 390 395 400
Phe Leu Gln Ala Met Gly Leu Lys Asp His Gln Val Glu Lys Ala Arg
405 410 415
Ile Ser Lys Ile Glu Ile Leu Gly Arg Leu Leu Tyr Arg Ser Ile Lys
420 425 430
Leu Val Phe Leu Ser Ile Gly Cys Leu Pro Gly Leu Leu Leu Phe Ser
435 440 445
Pro Ile Phe Ile Ile Ser Lys Ser Ile Ser Lys Thr Lys Ala Lys Glu
450 455 460
Ala Leu Lys Ala Ser Ser Val Lys Ile Lys Ala Asn Asp Val Val Ala
465 470 475 480
Thr Trp Lys Val Leu Val Ala Met Gly Leu Thr Pro Val Leu Tyr Ile
485 490 495
Leu Tyr Ser Leu Val Gly Ser Val Val Ile Arg Lys Leu Asp Leu Ile
500 505 510
Ser Trp Phe Pro Thr Ile Leu Leu Pro Gly Leu Val Leu Ser Ile Ile
515 520 525
Ile Thr Thr Ser Tyr Ala Ala Leu Ala Met Gly Glu Ala Gly Met Asp
530 535 540
Ile Phe Lys Ser Leu Arg Pro Leu Ala Leu Ala Leu Asn Pro Ser Thr
545 550 555 560
Lys Asn Ser Leu Leu Lys Leu Gln Asn Glu Arg Lys Arg Leu Val Leu
565 570 575
Lys Ser Ser Glu Leu Val Thr Ser Leu Gly Pro Glu Leu Phe Pro Asp
580 585 590
Phe Pro Glu Asn Ser Ile Leu Gln Gly Ser Asp Lys Phe Glu Asp Glu
595 600 605
Glu Asn Tyr Glu Asn Glu Lys Arg Ser His Ser Arg Ser Thr Ser Ala
610 615 620
Thr Ser Leu Ser Ala Met Ser Glu Gly Asp Gly Asp Glu Leu Val Arg
625 630 635 640
Glu Val Arg Lys Gly Ala Ser Tyr Phe Pro Val Ser Thr Ile Ser Glu
645 650 655
Asp Glu Asp Gln Ala Ile Ser Arg Val Gly Ser Glu Ala Ser Leu Ala
660 665 670
Asp Ile Pro Leu Phe Gly Met Ser Arg Ser Gln Ser Gly Ala Ser Leu
675 680 685
Ser Glu Ala Ser Thr His Gly Ser Ser Thr Gly Ala Asp Ala Glu Glu
690 695 700
Ala Lys Thr Glu Val Thr Arg Arg Ile Ala Leu Ala Met Glu Glu Lys
705 710 715 720
Arg Arg Glu Gln Asp Glu Glu
725
<210> 11
<211> 1362
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密码子优化的核苷酸序列
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(1362)
<223> H. subflexa脂肪酰基还原酶的酿酒酵母密码子优化的核苷酸序列；mRNA编码序列。
<400> 11
atggttgtct tgacctccaa agaaactaag ccatctgttg ctgaatttta cgctggtaag 60
tctgttttca ttactggtgg tactggtttc ttgggtaagg ttttcattga aaagttgttg 120
tactcctgcc cagatatcgg taatatctac atgttgatca gagaaaagaa gggtttgtcc 180
gtttccgaaa gaatcaagca ctttttggat gatcctttgt tcaccagatt gaaagaaaaa 240
agaccagccg acttggaaaa gatcgttttg attccaggtg atattactgc tccagatttg 300
ggtattacct ccgaaaacga aaagatgttg atcgaaaagg tcagtgtcat tattcattct 360
gctgctaccg ttaagttcaa cgaaccattg ccaactgctt ggaagattaa cgttgaaggt 420
actagaatga tgttggcctt gtctagaaga atgaagagaa tcgaagtttt catccatatc 480
tctaccgctt acactaacac caacagagaa gttgttgacg aaatcttgta tccagctcca 540
gctgatattg atcaagttca ccaatatgtt aaggacggta tctctgaaga agaaactgaa 600
aaaatcttga acggtagacc aaacacttac actttcacta aggctttgac cgaacatttg 660
gttgctgaaa atcaagctta cgttccaacc attatcgtta gaccatcagt tgttgctgcc 720
attaaggatg aacctattaa gggttggttg ggtaattggt atggtgctac aggtttgact 780
gtttttactg ctaagggttt gaacagagtt atctacggtc actcttctaa catcgttgat 840
ttgatcccag ttgattacgt tgccaacttg gttattgctg ctggtgctaa atcttctaag 900
tctactgaat tgaaggtcta caactgctgt tcttctgctt gtaacccaat tactatcggt 960
aagttgatgt ccatgtttgc tgaagatgct atcaagcaaa agtcttacgc tatgccattg 1020
ccaggttggt acatttttac taagtacaag tggttggtct tgttgttgac cattttgttc 1080
caagttattc cagcctacat taccgacttg tacagacatt tgattggtaa gaacccaaga 1140
tatatcaagt tgcaatcctt ggtcaatcaa accagatcct ccattgattt cttcaccaac 1200
cattcttggg ttatgaaggc tgatagagtc agagaattat tcgcttcttt gtctccagca 1260
gataagtact tgtttccatg tgatccagtc aacatcaatt ggagacaata tatccaagat 1320
tactgctggg gtgttagaca tttcttggaa aaaaagactt aa 1362
<210> 12
<211> 453
<212> PRT
<213> Heliothis subflexa
<400> 12
Met Val Val Leu Thr Ser Lys Glu Thr Lys Pro Ser Val Ala Glu Phe
1 5 10 15
Tyr Ala Gly Lys Ser Val Phe Ile Thr Gly Gly Thr Gly Phe Leu Gly
20 25 30
Lys Val Phe Ile Glu Lys Leu Leu Tyr Ser Cys Pro Asp Ile Gly Asn
35 40 45
Ile Tyr Met Leu Ile Arg Glu Lys Lys Gly Leu Ser Val Ser Glu Arg
50 55 60
Ile Lys His Phe Leu Asp Asp Pro Leu Phe Thr Arg Leu Lys Glu Lys
65 70 75 80
Arg Pro Ala Asp Leu Glu Lys Ile Val Leu Ile Pro Gly Asp Ile Thr
85 90 95
Ala Pro Asp Leu Gly Ile Thr Ser Glu Asn Glu Lys Met Leu Ile Glu
100 105 110
Lys Val Ser Val Ile Ile His Ser Ala Ala Thr Val Lys Phe Asn Glu
115 120 125
Pro Leu Pro Thr Ala Trp Lys Ile Asn Val Glu Gly Thr Arg Met Met
130 135 140
Leu Ala Leu Ser Arg Arg Met Lys Arg Ile Glu Val Phe Ile His Ile
145 150 155 160
Ser Thr Ala Tyr Thr Asn Thr Asn Arg Glu Val Val Asp Glu Ile Leu
165 170 175
Tyr Pro Ala Pro Ala Asp Ile Asp Gln Val His Gln Tyr Val Lys Asp
180 185 190
Gly Ile Ser Glu Glu Glu Thr Glu Lys Ile Leu Asn Gly Arg Pro Asn
195 200 205
Thr Tyr Thr Phe Thr Lys Ala Leu Thr Glu His Leu Val Ala Glu Asn
210 215 220
Gln Ala Tyr Val Pro Thr Ile Ile Val Arg Pro Ser Val Val Ala Ala
225 230 235 240
Ile Lys Asp Glu Pro Ile Lys Gly Trp Leu Gly Asn Trp Tyr Gly Ala
245 250 255
Thr Gly Leu Thr Val Phe Thr Ala Lys Gly Leu Asn Arg Val Ile Tyr
260 265 270
Gly His Ser Ser Asn Ile Val Asp Leu Ile Pro Val Asp Tyr Val Ala
275 280 285
Asn Leu Val Ile Ala Ala Gly Ala Lys Ser Ser Lys Ser Thr Glu Leu
290 295 300
Lys Val Tyr Asn Cys Cys Ser Ser Ala Cys Asn Pro Ile Thr Ile Gly
305 310 315 320
Lys Leu Met Ser Met Phe Ala Glu Asp Ala Ile Lys Gln Lys Ser Tyr
325 330 335
Ala Met Pro Leu Pro Gly Trp Tyr Ile Phe Thr Lys Tyr Lys Trp Leu
340 345 350
Val Leu Leu Leu Thr Ile Leu Phe Gln Val Ile Pro Ala Tyr Ile Thr
355 360 365
Asp Leu Tyr Arg His Leu Ile Gly Lys Asn Pro Arg Tyr Ile Lys Leu
370 375 380
Gln Ser Leu Val Asn Gln Thr Arg Ser Ser Ile Asp Phe Phe Thr Asn
385 390 395 400
His Ser Trp Val Met Lys Ala Asp Arg Val Arg Glu Leu Phe Ala Ser
405 410 415
Leu Ser Pro Ala Asp Lys Tyr Leu Phe Pro Cys Asp Pro Val Asn Ile
420 425 430
Asn Trp Arg Gln Tyr Ile Gln Asp Tyr Cys Trp Gly Val Arg His Phe
435 440 445
Leu Glu Lys Lys Thr
450
<210> 13
<211> 1368
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密码子优化的核苷酸序列
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(1368)
<223> 棉铃虫脂肪酰基还原酶的酿酒酵母密码子优化的核苷酸序列；mRNA编码序。
<400> 13
atggttgtct tgacctccaa agaaactaag ccatctgttg ctgaatttta cgctggtaag 60
tctgttttca ttactggtgg tactggtttc ttgggtaagg ttttcattga aaagttgttg 120
tactcctgcc cagatatcgg taatatctac atgttgatca gagaaaagaa gggtttgtcc 180
gtttccgaaa gaatcaagca ctttttggat gatcctttgt tcaccagatt gaaagaaaaa 240
agaccagccg acttggaaaa gatcgttttg attccaggtg atattactgc tccagatttg 300
ggtattacct ccgaaaacga aaagatgttg atcgaaaagg tcagtgtcat tattcattct 360
gctgctaccg ttaagttcaa cgaaccattg ccaactgctt ggaagattaa cgttgaaggt 420
actagaatga tgttggcctt gtctagaaga atgaagagaa tcgaagtttt catccatatc 480
tctaccgctt acactaacac caacagagaa gttgttgacg aaatcttgta tccagctcca 540
gctgatattg atcaagttca cagatatgtt aaggacggta tctctgaaga agaaactgaa 600
aaaatcttga acggtagacc aaacacttac actttcacta aggctttgac cgaacatttg 660
gttgctgaaa atcaagctta cgttccaacc attatcgtta gaccatcagt tgttgctgcc 720
attaaggatg aacctattaa gggttggttg ggtaattggt atggtgctac aggtttgact 780
gtttttactg ctaagggttt gaacagagtt atctacggtc actcttctaa catcgttgat 840
ttgatcccag ttgattacgt tgccaacttg gttattgctg ctggtgctaa atcttctaag 900
tctactgaat tgaaggtcta caactgctgt tcttctgctt gtaacccaat tactatcggt 960
aagttgatgt ccatgtttgc tgaagatgct atcaagcaaa agtcttacgc tatgccattg 1020
ccaggttggt acatttttac taagtacaag tggttggtct tgttgttgac cattttgttc 1080
caagttattc cagcctacat taccgacttg tacagacatt tgattggtaa gaacccaaga 1140
tatatcaagt tgcaatcctt ggtcaatcaa accagatcct ccattgattt cttcacctct 1200
cattcttggg ttatgaaggc tgatagagtc agagaattat tcgcttcttt gtctccagca 1260
gataagtact tgtttccatg tgatccaacc gatattaact ggacccatta cattcaagat 1320
tactgctggg gtgttagaca tttcttggaa aaaaaaagct acgaataa 1368
<210> 14
<211> 455
<212> PRT
<213> 棉铃虫
<400> 14
Met Val Val Leu Thr Ser Lys Glu Thr Lys Pro Ser Val Ala Glu Phe
1 5 10 15
Tyr Ala Gly Lys Ser Val Phe Ile Thr Gly Gly Thr Gly Phe Leu Gly
20 25 30
Lys Val Phe Ile Glu Lys Leu Leu Tyr Ser Cys Pro Asp Ile Gly Asn
35 40 45
Ile Tyr Met Leu Ile Arg Glu Lys Lys Gly Leu Ser Val Ser Glu Arg
50 55 60
Ile Lys His Phe Leu Asp Asp Pro Leu Phe Thr Arg Leu Lys Glu Lys
65 70 75 80
Arg Pro Ala Asp Leu Glu Lys Ile Val Leu Ile Pro Gly Asp Ile Thr
85 90 95
Ala Pro Asp Leu Gly Ile Thr Ser Glu Asn Glu Lys Met Leu Ile Glu
100 105 110
Lys Val Ser Val Ile Ile His Ser Ala Ala Thr Val Lys Phe Asn Glu
115 120 125
Pro Leu Pro Thr Ala Trp Lys Ile Asn Val Glu Gly Thr Arg Met Met
130 135 140
Leu Ala Leu Ser Arg Arg Met Lys Arg Ile Glu Val Phe Ile His Ile
145 150 155 160
Ser Thr Ala Tyr Thr Asn Thr Asn Arg Glu Val Val Asp Glu Ile Leu
165 170 175
Tyr Pro Ala Pro Ala Asp Ile Asp Gln Val His Arg Tyr Val Lys Asp
180 185 190
Gly Ile Ser Glu Glu Glu Thr Glu Lys Ile Leu Asn Gly Arg Pro Asn
195 200 205
Thr Tyr Thr Phe Thr Lys Ala Leu Thr Glu His Leu Val Ala Glu Asn
210 215 220
Gln Ala Tyr Val Pro Thr Ile Ile Val Arg Pro Ser Val Val Ala Ala
225 230 235 240
Ile Lys Asp Glu Pro Ile Lys Gly Trp Leu Gly Asn Trp Tyr Gly Ala
245 250 255
Thr Gly Leu Thr Val Phe Thr Ala Lys Gly Leu Asn Arg Val Ile Tyr
260 265 270
Gly His Ser Ser Asn Ile Val Asp Leu Ile Pro Val Asp Tyr Val Ala
275 280 285
Asn Leu Val Ile Ala Ala Gly Ala Lys Ser Ser Lys Ser Thr Glu Leu
290 295 300
Lys Val Tyr Asn Cys Cys Ser Ser Ala Cys Asn Pro Ile Thr Ile Gly
305 310 315 320
Lys Leu Met Ser Met Phe Ala Glu Asp Ala Ile Lys Gln Lys Ser Tyr
325 330 335
Ala Met Pro Leu Pro Gly Trp Tyr Ile Phe Thr Lys Tyr Lys Trp Leu
340 345 350
Val Leu Leu Leu Thr Ile Leu Phe Gln Val Ile Pro Ala Tyr Ile Thr
355 360 365
Asp Leu Tyr Arg His Leu Ile Gly Lys Asn Pro Arg Tyr Ile Lys Leu
370 375 380
Gln Ser Leu Val Asn Gln Thr Arg Ser Ser Ile Asp Phe Phe Thr Ser
385 390 395 400
His Ser Trp Val Met Lys Ala Asp Arg Val Arg Glu Leu Phe Ala Ser
405 410 415
Leu Ser Pro Ala Asp Lys Tyr Leu Phe Pro Cys Asp Pro Thr Asp Ile
420 425 430
Asn Trp Thr His Tyr Ile Gln Asp Tyr Cys Trp Gly Val Arg His Phe
435 440 445
Leu Glu Lys Lys Ser Tyr Glu
450 455
<210> 15
<211> 1371
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密码子优化的核苷酸序列
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(1371)
<223> 烟夜蛾脂肪酰基还原酶的酿酒酵母密码子优化的核苷酸序列；mRNA编码序列。
<400> 15
atggttgtct tgacctccaa agaaactaag ccatctgttg ctgaatttta cgctggtaag 60
tctgttttca ttactggtgg tactggtttc ttgggtaaga tcttcattga aaagttgttg 120
tactcctgcc cagatatcgg taatatctac atgttgatca gagaaaagaa gggtttgtcc 180
gtttccgaaa gaatcaagca atttttggat gaccctttgt tcaccagatt gaaagaaaaa 240
agaccagccg acttggaaaa gatcgttttg attccaggtg atattactgc tccagatttg 300
ggtattacct ccgaaaacga aaagatgttg atcgaaaagg tcagtgtcat tattcattct 360
gctgctaccg ttaagttcaa cgaaccattg ccaactgctt ggaagattaa cgttgaaggt 420
actagaatga tgttggcctt gtctagaaga atgaagagaa tcgaagtttt catccatatc 480
tctaccgctt acactaacac caacagagaa gttgttgacg aaatcttgta tccagctcca 540
gctgatattg atcaagttca ccaatatgtt aaggacggta tctctgaaga agaaactgaa 600
aaaatcttga acggtagacc aaacacttac actttcacta aggctttgac cgaacatttg 660
gttgctgaaa atcaagctta cgttccaacc attatcgtta gaccatcagt tgttgctgcc 720
attaaggatg aacctattaa gggttggttg ggtaattggt atggtgctac aggtttgact 780
gtttttactg ctaagggttt gaacagagtt atctacggtc attcctctta catcgttgat 840
ttgatcccag ttgattacgt tgccaacttg gttattgctg ctggtgctaa atcttctaag 900
tctactgaat tgaaggtcta caactgctgt tcttctgctt gtaacccaat tactatcggt 960
aagttgatgt ccatgtttgc tgaagatgct atcaagcaaa agtcttacgc tatgccattg 1020
ccaggttggt atgtttttac aaagtacaag tggttggtct tgttgttgac cattttgttc 1080
caagttattc cagcctacat taccgacttg tacagacatt tgattggtaa gaacccaaga 1140
tatatcaagt tgcaatcctt ggtcaatcaa accagatcct ccattgattt cttcacctct 1200
cattcttggg ttatgaaggc tgatagagtc agagaattat tcgcttcttt gtctccagca 1260
gataagtact tgtttccatg tgatccaacc gatattaact ggacccatta cattcaagat 1320
tactgctggg gtgttagaca cttcttggaa aaaaagacta ccaacaagta a 1371
<210> 16
<211> 456
<212> PRT
<213> 烟夜蛾
<400> 16
Met Val Val Leu Thr Ser Lys Glu Thr Lys Pro Ser Val Ala Glu Phe
1 5 10 15
Tyr Ala Gly Lys Ser Val Phe Ile Thr Gly Gly Thr Gly Phe Leu Gly
20 25 30
Lys Ile Phe Ile Glu Lys Leu Leu Tyr Ser Cys Pro Asp Ile Gly Asn
35 40 45
Ile Tyr Met Leu Ile Arg Glu Lys Lys Gly Leu Ser Val Ser Glu Arg
50 55 60
Ile Lys Gln Phe Leu Asp Asp Pro Leu Phe Thr Arg Leu Lys Glu Lys
65 70 75 80
Arg Pro Ala Asp Leu Glu Lys Ile Val Leu Ile Pro Gly Asp Ile Thr
85 90 95
Ala Pro Asp Leu Gly Ile Thr Ser Glu Asn Glu Lys Met Leu Ile Glu
100 105 110
Lys Val Ser Val Ile Ile His Ser Ala Ala Thr Val Lys Phe Asn Glu
115 120 125
Pro Leu Pro Thr Ala Trp Lys Ile Asn Val Glu Gly Thr Arg Met Met
130 135 140
Leu Ala Leu Ser Arg Arg Met Lys Arg Ile Glu Val Phe Ile His Ile
145 150 155 160
Ser Thr Ala Tyr Thr Asn Thr Asn Arg Glu Val Val Asp Glu Ile Leu
165 170 175
Tyr Pro Ala Pro Ala Asp Ile Asp Gln Val His Gln Tyr Val Lys Asp
180 185 190
Gly Ile Ser Glu Glu Glu Thr Glu Lys Ile Leu Asn Gly Arg Pro Asn
195 200 205
Thr Tyr Thr Phe Thr Lys Ala Leu Thr Glu His Leu Val Ala Glu Asn
210 215 220
Gln Ala Tyr Val Pro Thr Ile Ile Val Arg Pro Ser Val Val Ala Ala
225 230 235 240
Ile Lys Asp Glu Pro Ile Lys Gly Trp Leu Gly Asn Trp Tyr Gly Ala
245 250 255
Thr Gly Leu Thr Val Phe Thr Ala Lys Gly Leu Asn Arg Val Ile Tyr
260 265 270
Gly His Ser Ser Tyr Ile Val Asp Leu Ile Pro Val Asp Tyr Val Ala
275 280 285
Asn Leu Val Ile Ala Ala Gly Ala Lys Ser Ser Lys Ser Thr Glu Leu
290 295 300
Lys Val Tyr Asn Cys Cys Ser Ser Ala Cys Asn Pro Ile Thr Ile Gly
305 310 315 320
Lys Leu Met Ser Met Phe Ala Glu Asp Ala Ile Lys Gln Lys Ser Tyr
325 330 335
Ala Met Pro Leu Pro Gly Trp Tyr Val Phe Thr Lys Tyr Lys Trp Leu
340 345 350
Val Leu Leu Leu Thr Ile Leu Phe Gln Val Ile Pro Ala Tyr Ile Thr
355 360 365
Asp Leu Tyr Arg His Leu Ile Gly Lys Asn Pro Arg Tyr Ile Lys Leu
370 375 380
Gln Ser Leu Val Asn Gln Thr Arg Ser Ser Ile Asp Phe Phe Thr Ser
385 390 395 400
His Ser Trp Val Met Lys Ala Asp Arg Val Arg Glu Leu Phe Ala Ser
405 410 415
Leu Ser Pro Ala Asp Lys Tyr Leu Phe Pro Cys Asp Pro Thr Asp Ile
420 425 430
Asn Trp Thr His Tyr Ile Gln Asp Tyr Cys Trp Gly Val Arg His Phe
435 440 445
Leu Glu Lys Lys Thr Thr Asn Lys
450 455
<210> 17
<211> 1086
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密码子优化的核苷酸序列
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(1086)
<223> 来自黑腹果蝇的Δ9去饱和酶Dmd9的酿酒酵母密码子优化的核苷酸序列
<400> 17
atggctccat actctagaat ctaccaccaa gataagtcct ctagagaaac tggtgttttg 60
ttcgaagatg atgctcaaac cgttgattct gatttgacta ccgatagatt ccaattgaag 120
agagccgaaa aaagaagatt gccattggtt tggagaaaca tcatcttgtt cgctttggtt 180
catttggctg ccttgtatgg tttacattcc attttcacta gagctaagtt ggctactact 240
ttgtttgctg ctggtttgta cattatcggt atgttgggtg ttactgctgg tgctcataga 300
ttgtgggctc atagaactta caaagctaaa tggcctttga gattgttgtt ggtcatcttc 360
aacaccattg ctttccaaga tgctgtttat cattgggcca gagatcatag agttcatcac 420
aaatactctg aaaccgatgc tgatccacat aatgctacta gaggtttctt cttctctcat 480
gttggttggt tgttgtgcaa gaaacaccca gatatcaaag aaaagggtag aggtttggat 540
ttgtccgatt tgagagctga tccaatcttg atgtttcaaa gaaagcacta ctacatcttg 600
atgccattgg cttgttttgt tttgccaacc gttattccaa tggtctactg gaacgaaact 660
ttggcttctt cttggtttgt tgctactatg ttcagatggt gcttccaatt gaatatgacc 720
tggttggtta attccgctgc tcataagttt ggtaatagac catacgataa gaccatgaac 780
ccaactcaaa atgctttcgt ttctgctttc acttttggtg aaggttggca taattaccat 840
catgcttttc catgggatta caagactgct gaatggggtt gttactcttt gaacattact 900
accgccttca ttgatttgtt cgctaaaatt ggttgggcct acgatttgaa aactgttgct 960
ccagatgtta tccaaagaag agttttgaga actggtgatg gttctcatga attgtggggt 1020
tggggtgata aggatttgac cgctgaagat gctagaaacg ttttgttggt tgacaagtcc 1080
agataa 1086
<210> 18
<211> 361
<212> PRT
<213> 黑腹果蝇
<400> 18
Met Ala Pro Tyr Ser Arg Ile Tyr His Gln Asp Lys Ser Ser Arg Glu
1 5 10 15
Thr Gly Val Leu Phe Glu Asp Asp Ala Gln Thr Val Asp Ser Asp Leu
20 25 30
Thr Thr Asp Arg Phe Gln Leu Lys Arg Ala Glu Lys Arg Arg Leu Pro
35 40 45
Leu Val Trp Arg Asn Ile Ile Leu Phe Ala Leu Val His Leu Ala Ala
50 55 60
Leu Tyr Gly Leu His Ser Ile Phe Thr Arg Ala Lys Leu Ala Thr Thr
65 70 75 80
Leu Phe Ala Ala Gly Leu Tyr Ile Ile Gly Met Leu Gly Val Thr Ala
85 90 95
Gly Ala His Arg Leu Trp Ala His Arg Thr Tyr Lys Ala Lys Trp Pro
100 105 110
Leu Arg Leu Leu Leu Val Ile Phe Asn Thr Ile Ala Phe Gln Asp Ala
115 120 125
Val Tyr His Trp Ala Arg Asp His Arg Val His His Lys Tyr Ser Glu
130 135 140
Thr Asp Ala Asp Pro His Asn Ala Thr Arg Gly Phe Phe Phe Ser His
145 150 155 160
Val Gly Trp Leu Leu Cys Lys Lys His Pro Asp Ile Lys Glu Lys Gly
165 170 175
Arg Gly Leu Asp Leu Ser Asp Leu Arg Ala Asp Pro Ile Leu Met Phe
180 185 190
Gln Arg Lys His Tyr Tyr Ile Leu Met Pro Leu Ala Cys Phe Val Leu
195 200 205
Pro Thr Val Ile Pro Met Val Tyr Trp Asn Glu Thr Leu Ala Ser Ser
210 215 220
Trp Phe Val Ala Thr Met Phe Arg Trp Cys Phe Gln Leu Asn Met Thr
225 230 235 240
Trp Leu Val Asn Ser Ala Ala His Lys Phe Gly Asn Arg Pro Tyr Asp
245 250 255
Lys Thr Met Asn Pro Thr Gln Asn Ala Phe Val Ser Ala Phe Thr Phe
260 265 270
Gly Glu Gly Trp His Asn Tyr His His Ala Phe Pro Trp Asp Tyr Lys
275 280 285
Thr Ala Glu Trp Gly Cys Tyr Ser Leu Asn Ile Thr Thr Ala Phe Ile
290 295 300
Asp Leu Phe Ala Lys Ile Gly Trp Ala Tyr Asp Leu Lys Thr Val Ala
305 310 315 320
Pro Asp Val Ile Gln Arg Arg Val Leu Arg Thr Gly Asp Gly Ser His
325 330 335
Glu Leu Trp Gly Trp Gly Asp Lys Asp Leu Thr Ala Glu Asp Ala Arg
340 345 350
Asn Val Leu Leu Val Asp Lys Ser Arg
355 360
<210> 19
<211> 335
<212> PRT
<213> 玫瑰色卷蛾
<400> 19
Met Ala Pro Asn Val Glu Asp Met Glu Ser Asp Leu Pro Glu Ser Glu
1 5 10 15
Glu Lys Leu Glu Lys Leu Val Ala Pro Gln Ala Ala Pro Arg Lys Tyr
20 25 30
Gln Ile Ile Tyr Thr Asn Leu Leu Thr Phe Gly Tyr Trp His Ile Ala
35 40 45
Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Leu Cys Phe Thr Ser Ala Lys Trp Gln Thr
50 55 60
Ile Ile Leu Ala Leu Ile Leu Asn Glu Met Ala Ile Leu Gly Ile Thr
65 70 75 80
Ala Gly Ala His Arg Leu Trp Ala His Arg Ser Tyr Lys Ala Thr Val
85 90 95
Pro Leu Gln Ile Ile Leu Ile Ile Phe Asn Ser Leu Ser Phe Gln Asn
100 105 110
Ser Ala Ile His Trp Ile Arg Asp His Arg Met His His Lys Tyr Ser
115 120 125
Asp Thr Asp Gly Asp Pro His Asn Ala Ser Arg Gly Phe Phe Tyr Ser
130 135 140
His Val Gly Trp Leu Leu Val Lys Lys His Pro Glu Val Lys Lys Arg
145 150 155 160
Ala Lys Thr Ile Asp Met Ser Asp Ile Tyr Ser Asn Pro Ile Leu Arg
165 170 175
Phe Gln Lys Lys Tyr Ala Ile Pro Phe Ile Gly Met Ile Cys Phe Val
180 185 190
Leu Pro Thr Ile Ile Pro Met Tyr Phe Trp Gly Glu Thr Leu Ser Asn
195 200 205
Ala Trp His Ile Thr Met Leu Arg Tyr Val Phe Ser Leu Asn Ser Ile
210 215 220
Phe Leu Val Asn Ser Ala Ala His Leu Tyr Gly Tyr Arg Pro Tyr Asp
225 230 235 240
Lys Asn Ile Leu Pro Ala Glu Asn Lys Met Thr Phe Ile Ala Cys Leu
245 250 255
Gly Glu Asn Phe His Asn Tyr His His Val Phe Pro Trp Asp Tyr Arg
260 265 270
Ala Ser Glu Leu Gly Asn Ile Gly Met Asn Trp Thr Ala Lys Phe Ile
275 280 285
Asp Phe Phe Ala Trp Ile Gly Trp Ala Tyr Asp Leu Lys Thr Ala Ser
290 295 300
Asp Glu Asn Ile Lys Ser Arg Met Lys Arg Thr Gly Asp Gly Thr Asp
305 310 315 320
Val Ser Gly Gln Lys Tyr Ser Cys Glu Ser Ser Glu Val Leu Gln
325 330 335
<210> 20
<211> 334
<212> PRT
<213> 斑点色卷蛾
<400> 20
Met Ala Pro Asn Val Glu Asp Met Glu Ser Asp Met Pro Glu Ser Glu
1 5 10 15
Lys Trp Glu Lys Leu Val Ala Pro Gln Ala Ala Pro Arg Lys Tyr Glu
20 25 30
Ile Ile Tyr Thr Asn Leu Leu Thr Phe Gly Tyr Gly His Ile Ala Gly
35 40 45
Leu Tyr Gly Leu Tyr Leu Cys Phe Thr Ser Ala Lys Trp Gln Thr Val
50 55 60
Ile Leu Ala Ile Ile Leu Asn Glu Met Ala Ile Leu Gly Ile Thr Ala
65 70 75 80
Gly Ala His Arg Leu Trp Ser His Arg Ser Tyr Lys Ala Ala Val Pro
85 90 95
Leu Gln Ile Ile Leu Met Ile Phe Asn Ser Leu Ala Phe Gln Asn Ser
100 105 110
Ala Ile Asn Trp Val Arg Asp His Arg Met His His Lys Tyr Ser Asp
115 120 125
Thr Asp Gly Asp Pro His Asn Ala Ser Arg Gly Phe Phe Tyr Ser His
130 135 140
Val Gly Trp Leu Leu Val Lys Lys His Pro Glu Val Lys Lys Arg Gly
145 150 155 160
Lys Met Ile Asp Met Ser Asp Ile Tyr Ser Asn Pro Val Leu Arg Phe
165 170 175
Gln Lys Lys Tyr Ala Ile Pro Phe Ile Gly Met Ile Cys Phe Val Leu
180 185 190
Pro Thr Ile Ile Pro Met Tyr Phe Trp Gly Glu Thr Leu Ser Asn Ala
195 200 205
Trp His Ile Thr Met Leu Arg Tyr Val Phe Ser Leu Asn Ser Ile Phe
210 215 220
Leu Val Asn Ser Ala Ala His Leu Tyr Gly Tyr Arg Pro Tyr Asp Lys
225 230 235 240
Asn Ile Leu Pro Ala Glu Asn Lys Ile Ala Leu Ile Ala Cys Leu Gly
245 250 255
Asp Ser Phe His Asn Tyr His His Val Phe Pro Trp Asp Tyr Arg Ala
260 265 270
Ser Glu Leu Gly Asn Ile Gly Met Asn Trp Thr Ala Gln Phe Ile Asp
275 280 285
Phe Phe Ala Trp Ile Gly Trp Ala Tyr Asp Leu Lys Thr Ala Ser Asp
290 295 300
Glu Asn Ile Asn Ser Arg Met Lys Arg Thr Gly Asp Gly Thr Asp Ile
305 310 315 320
Ser Gly Gln Lys Tyr Ser Cys Glu Ser Ser Glu Val Leu Gln
325 330
<210> 21
<211> 1830
<212> DNA
<213> 解脂耶氏酵母
<400> 21
atgtctgacg acaagcacac tttcgacttt atcattgtcg gtggaggaac cgccggcccc 60
actctcgccc ggcgactggc cgatgcctgg atctccggta agaagctcaa ggtgctcctg 120
ctcgagtccg gcccctcttc cgagggtgtt gatgatattc gatgccccgg taactgggtc 180
aacaccatcc actccgagta cgactggtcc tacgaggtcg acgagcctta cctgtctact 240
gatggcgagg agcgacgact ctgtggtatc ccccgaggcc attgtctggg tggatcctct 300
tgtctgaaca cctctttcgt catccgagga acccgaggtg atttcgaccg aatcgaagag 360
gagaccggcg ctaagggctg gggttgggat gatctgttcc cctacttccg aaagcacgag 420
tgttacgtgc cccagggatc tgcccacgag cccaagctca ttgacttcga cacctacgac 480
tacaagaagt tccacggtga ctctggtcct atcaaggtcc agccttacga ctacgcgccc 540
atctccaaga agttctctga gtctctggct tctttcggct acccttataa ccccgagatc 600
ttcgtcaacg gaggagcccc ccagggttgg ggtcacgttg ttcgttccac ctccaacggt 660
gttcgatcca ccggctacga cgctcttgtc cacgccccca agaacctcga cattgtgact 720
ggccacgctg tcaccaagat tctctttgag aagatcggtg gcaagcagac cgccgttggt 780
gtcgagacct acaaccgagc tgccgaggag gctggcccta cctacaaggc ccgatacgag 840
gtggttgtgt gctgcggctc ttatgcctct ccccagcttc tgatggtttc cggtgttgga 900
cccaagaagg agctcgagga ggttggtgtc aaggacatca ttttggactc tccttacgtt 960
ggaaagaacc tgcaggacca tcttatctgc ggtatctttg tcgaaattaa ggagcccgga 1020
tacacccgag accaccagtt cttcgacgac gagggactcg acaagtccac cgaggagtgg 1080
aagaccaagc gaaccggttt cttctccaat cctccccagg gcattttctc ttacggccga 1140
atcgacaacc tgctcaagga tgatcccgtc tggaaggagg cctgcgagaa gcagaaggct 1200
ctcaaccctc gacgagaccc catgggtaac gatccctctc agccccattt cgagatctgg 1260
aatgctgagc tctacatcga gctagagatg acccaggctc ccgacgaggg ccagtccgtc 1320
atgaccgtca tcggtgagat tcttcctcct cgatccaagg gttacgtcaa gctgctgtcc 1380
cccgacccta tggagaaccc cgagattgtc cacaactacc tgcaggaccc tgttgacgct 1440
cgagtcttcg ctgccatcat gaagcacgcc gccgacgttg ccaccaacgg tgctggcacc 1500
aaggacctcg tcaaggctcg atggcccccg gagtccaagc ccttcgagga aatgtccatc 1560
gaggaatggg agacttacgt ccgagacaag tctcacacct gtttccaccc ctgtggtact 1620
gtcaagcttg gtggtgctaa tgataaggag gccgttgttg acgagcgact ccgagtcaag 1680
ggtgtcgacg gcctgcgagt tgccgacgtc tctgtccttc cccgagtccc caacggacac 1740
acccaggctt ttgcctacgc tgttggtgag aaggctgccg acctcatcct tgccgacatt 1800
gctggaaagg atctccgacc tcgaatctaa 1830
<210> 22
<211> 609
<212> PRT
<213> 解脂耶氏酵母
<400> 22
Met Ser Asp Asp Lys His Thr Phe Asp Phe Ile Ile Val Gly Gly Gly
1 5 10 15
Thr Ala Gly Pro Thr Leu Ala Arg Arg Leu Ala Asp Ala Trp Ile Ser
20 25 30
Gly Lys Lys Leu Lys Val Leu Leu Leu Glu Ser Gly Pro Ser Ser Glu
35 40 45
Gly Val Asp Asp Ile Arg Cys Pro Gly Asn Trp Val Asn Thr Ile His
50 55 60
Ser Glu Tyr Asp Trp Ser Tyr Glu Val Asp Glu Pro Tyr Leu Ser Thr
65 70 75 80
Asp Gly Glu Glu Arg Arg Leu Cys Gly Ile Pro Arg Gly His Cys Leu
85 90 95
Gly Gly Ser Ser Cys Leu Asn Thr Ser Phe Val Ile Arg Gly Thr Arg
100 105 110
Gly Asp Phe Asp Arg Ile Glu Glu Glu Thr Gly Ala Lys Gly Trp Gly
115 120 125
Trp Asp Asp Leu Phe Pro Tyr Phe Arg Lys His Glu Cys Tyr Val Pro
130 135 140
Gln Gly Ser Ala His Glu Pro Lys Leu Ile Asp Phe Asp Thr Tyr Asp
145 150 155 160
Tyr Lys Lys Phe His Gly Asp Ser Gly Pro Ile Lys Val Gln Pro Tyr
165 170 175
Asp Tyr Ala Pro Ile Ser Lys Lys Phe Ser Glu Ser Leu Ala Ser Phe
180 185 190
Gly Tyr Pro Tyr Asn Pro Glu Ile Phe Val Asn Gly Gly Ala Pro Gln
195 200 205
Gly Trp Gly His Val Val Arg Ser Thr Ser Asn Gly Val Arg Ser Thr
210 215 220
Gly Tyr Asp Ala Leu Val His Ala Pro Lys Asn Leu Asp Ile Val Thr
225 230 235 240
Gly His Ala Val Thr Lys Ile Leu Phe Glu Lys Ile Gly Gly Lys Gln
245 250 255
Thr Ala Val Gly Val Glu Thr Tyr Asn Arg Ala Ala Glu Glu Ala Gly
260 265 270
Pro Thr Tyr Lys Ala Arg Tyr Glu Val Val Val Cys Cys Gly Ser Tyr
275 280 285
Ala Ser Pro Gln Leu Leu Met Val Ser Gly Val Gly Pro Lys Lys Glu
290 295 300
Leu Glu Glu Val Gly Val Lys Asp Ile Ile Leu Asp Ser Pro Tyr Val
305 310 315 320
Gly Lys Asn Leu Gln Asp His Leu Ile Cys Gly Ile Phe Val Glu Ile
325 330 335
Lys Glu Pro Gly Tyr Thr Arg Asp His Gln Phe Phe Asp Asp Glu Gly
340 345 350
Leu Asp Lys Ser Thr Glu Glu Trp Lys Thr Lys Arg Thr Gly Phe Phe
355 360 365
Ser Asn Pro Pro Gln Gly Ile Phe Ser Tyr Gly Arg Ile Asp Asn Leu
370 375 380
Leu Lys Asp Asp Pro Val Trp Lys Glu Ala Cys Glu Lys Gln Lys Ala
385 390 395 400
Leu Asn Pro Arg Arg Asp Pro Met Gly Asn Asp Pro Ser Gln Pro His
405 410 415
Phe Glu Ile Trp Asn Ala Glu Leu Tyr Ile Glu Leu Glu Met Thr Gln
420 425 430
Ala Pro Asp Glu Gly Gln Ser Val Met Thr Val Ile Gly Glu Ile Leu
435 440 445
Pro Pro Arg Ser Lys Gly Tyr Val Lys Leu Leu Ser Pro Asp Pro Met
450 455 460
Glu Asn Pro Glu Ile Val His Asn Tyr Leu Gln Asp Pro Val Asp Ala
465 470 475 480
Arg Val Phe Ala Ala Ile Met Lys His Ala Ala Asp Val Ala Thr Asn
485 490 495
Gly Ala Gly Thr Lys Asp Leu Val Lys Ala Arg Trp Pro Pro Glu Ser
500 505 510
Lys Pro Phe Glu Glu Met Ser Ile Glu Glu Trp Glu Thr Tyr Val Arg
515 520 525
Asp Lys Ser His Thr Cys Phe His Pro Cys Gly Thr Val Lys Leu Gly
530 535 540
Gly Ala Asn Asp Lys Glu Ala Val Val Asp Glu Arg Leu Arg Val Lys
545 550 555 560
Gly Val Asp Gly Leu Arg Val Ala Asp Val Ser Val Leu Pro Arg Val
565 570 575
Pro Asn Gly His Thr Gln Ala Phe Ala Tyr Ala Val Gly Glu Lys Ala
580 585 590
Ala Asp Leu Ile Leu Ala Asp Ile Ala Gly Lys Asp Leu Arg Pro Arg
595 600 605
Ile
<210> 23
<211> 1437
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密码子优化的核苷酸序列
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(1437)
<223> 来自Bicyclus anynana的脂肪酰基还原酶Ban-wFAR2的解脂耶氏酵母密码子优化的核苷酸序列
<400> 23
atgtaccgaa acgtgaacaa caactacaag ggccactctg tgtacaccaa cggcgctggc 60
tctcgagtga agtctctgct gtcctctgcc accgacaaca ccaacgagta ccagtctatc 120
gccgagtgct acaagggaca gtccgtgttc atcaccggcg gcaccggctt cgtcggcaag 180
gtgctgctcg agaagctgct gtactcttgc cccggcatcg acaaggtgta cctgctggtg 240
cgagagactc agggcgccac cgctcaccag cgaatgcaga agctcctgga agaacccgcc 300
ttctcgcgaa tcaaggaaga gaaccctcag gccttcgaga aggtgatccc catcgtgggc 360
gacatcaccc agcctcagct gggcatcatg gccgagaacg aggaactgct gattaaggaa 420
gtgtctttcg tctaccacgt ggccgccacc accaagttca acgagactct ggacattgcc 480
atgaacgtga acgtggccgg aaccggacga gtgctggacc tgtctaagcg aatggaaaac 540
atcaaggcct tcgtgtacgt gtctaccgcc tactctaaca ccgaccgaga ggtggtggaa 600
gaggtgctgt accccgctcc tgtgtctctg aacgaggtgc acaagctgct gaagatcggc 660
atcaccgacg ctcaggtgaa ggaactgatc aagggacgac ccaacaccta caccttcacc 720
aaggctctgg ctgagaacct ggtggccgac aaccacggac acgtgcccgc catcatcgtg 780
cgaccctcta tcgtgtcctc gtctaagaag gaacccatca ccggatggat cgactcttgg 840
tacggcgcca ccttcctggc caccgtgacc atgaagggct tcaaccgagt gttcgtgtcg 900
tcttacgagt acaacctgga cttcatcccc gtggactacg tgtccaacct gatcatcgtg 960
gccgctgctc gatgcaagtg ctctgacaag gtggacgtgt acaactcttc tacctccggc 1020
gaaaaccctc tgaagattgg cgccttcttc gacgacatca ttgcctactc ttgcaagcac 1080
aagttctacg acatccctct gcctatggcc tacctgactc gataccgatg ggtcatgttc 1140
ctgatcaccc tgctgctgca gaccctgcct gcctatatcg ccgacctgtt cctgctgatc 1200
gtgggcaaga agccccgata cgtcaagctg gcctctaaga tctctgccgc tcacgaggtc 1260
ctggactact tcccctctcg aacctggtct atgtctgccc gacagaccac cgctctgttc 1320
cagtctctgt ctccctcgga ccgagatcag tttccttgcg accccaccga catcgactgg 1380
aaggagtaca tcgtcaccta ctgccaggga atccgacagt tcctgtgcaa gtcttaa 1437
<210> 24
<211> 478
<212> PRT
<213> Bicyclus anynana
<400> 24
Met Tyr Arg Asn Val Asn Asn Asn Tyr Lys Gly His Ser Val Tyr Thr
1 5 10 15
Asn Gly Ala Gly Ser Arg Val Lys Ser Leu Leu Ser Ser Ala Thr Asp
20 25 30
Asn Thr Asn Glu Tyr Gln Ser Ile Ala Glu Cys Tyr Lys Gly Gln Ser
35 40 45
Val Phe Ile Thr Gly Gly Thr Gly Phe Val Gly Lys Val Leu Leu Glu
50 55 60
Lys Leu Leu Tyr Ser Cys Pro Gly Ile Asp Lys Val Tyr Leu Leu Val
65 70 75 80
Arg Glu Thr Gln Gly Ala Thr Ala His Gln Arg Met Gln Lys Leu Leu
85 90 95
Glu Glu Pro Ala Phe Ser Arg Ile Lys Glu Glu Asn Pro Gln Ala Phe
100 105 110
Glu Lys Val Ile Pro Ile Val Gly Asp Ile Thr Gln Pro Gln Leu Gly
115 120 125
Ile Met Ala Glu Asn Glu Glu Leu Leu Ile Lys Glu Val Ser Phe Val
130 135 140
Tyr His Val Ala Ala Thr Thr Lys Phe Asn Glu Thr Leu Asp Ile Ala
145 150 155 160
Met Asn Val Asn Val Ala Gly Thr Gly Arg Val Leu Asp Leu Ser Lys
165 170 175
Arg Met Glu Asn Ile Lys Ala Phe Val Tyr Val Ser Thr Ala Tyr Ser
180 185 190
Asn Thr Asp Arg Glu Val Val Glu Glu Val Leu Tyr Pro Ala Pro Val
195 200 205
Ser Leu Asn Glu Val His Lys Leu Leu Lys Ile Gly Ile Thr Asp Ala
210 215 220
Gln Val Lys Glu Leu Ile Lys Gly Arg Pro Asn Thr Tyr Thr Phe Thr
225 230 235 240
Lys Ala Leu Ala Glu Asn Leu Val Ala Asp Asn His Gly His Val Pro
245 250 255
Ala Ile Ile Val Arg Pro Ser Ile Val Ser Ser Ser Lys Lys Glu Pro
260 265 270
Ile Thr Gly Trp Ile Asp Ser Trp Tyr Gly Ala Thr Phe Leu Ala Thr
275 280 285
Val Thr Met Lys Gly Phe Asn Arg Val Phe Val Ser Ser Tyr Glu Tyr
290 295 300
Asn Leu Asp Phe Ile Pro Val Asp Tyr Val Ser Asn Leu Ile Ile Val
305 310 315 320
Ala Ala Ala Arg Cys Lys Cys Ser Asp Lys Val Asp Val Tyr Asn Ser
325 330 335
Ser Thr Ser Gly Glu Asn Pro Leu Lys Ile Gly Ala Phe Phe Asp Asp
340 345 350
Ile Ile Ala Tyr Ser Cys Lys His Lys Phe Tyr Asp Ile Pro Leu Pro
355 360 365
Met Ala Tyr Leu Thr Arg Tyr Arg Trp Val Met Phe Leu Ile Thr Leu
370 375 380
Leu Leu Gln Thr Leu Pro Ala Tyr Ile Ala Asp Leu Phe Leu Leu Ile
385 390 395 400
Val Gly Lys Lys Pro Arg Tyr Val Lys Leu Ala Ser Lys Ile Ser Ala
405 410 415
Ala His Glu Val Leu Asp Tyr Phe Pro Ser Arg Thr Trp Ser Met Ser
420 425 430
Ala Arg Gln Thr Thr Ala Leu Phe Gln Ser Leu Ser Pro Ser Asp Arg
435 440 445
Asp Gln Phe Pro Cys Asp Pro Thr Asp Ile Asp Trp Lys Glu Tyr Ile
450 455 460
Val Thr Tyr Cys Gln Gly Ile Arg Gln Phe Leu Cys Lys Ser
465 470 475
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(22)
<223> SEQ ID NO: 25 PR-141n = 尿嘧啶
<400> 25
agaacagcng aagcttcgta cg 22
<210> 26
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(25)
<223> PR-142n = 尿嘧啶
<400> 26
aggccacnag tggatctgat atcac 25
<210> 27
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(29)
<223> PR-10851 (Atrd11表达盒 _fw) n = 尿嘧啶
<400> 27
agtgcaggng acgcagtagg atgtcctgc 29
<210> 28
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(23)
<223> PR-10853 (Hs_Far表达盒 _fw)n = 尿嘧啶
<400> 28
acctgcacna gagaccgggt tgg 23
<210> 29
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(33)
<223> PR-10655 (EpiVecYL _fw)n = 尿嘧啶
<400> 29
acccattgcn gtagatatgt cttgtgtgta agg 33
<210> 30
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(32)
<223> PR-10656 (EpiVecYL _rev)n = 尿嘧啶
<400> 30
atcatgtaan tagttatgtc acgcttacat tc 32
<210> 31
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(22)
<223> PR-10702 (Δ-pex10YL_上游 _fw)
<400> 31
cattgtaact agtcctggag gg 22
<210> 32
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(30)
<223> PR-10703 (Δ-pex10YL_上游 _rev)n = 尿嘧啶
<400> 32
acgaagttan tttgagccga ggcagatttg 30
<210> 33
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(31)
<223> PR-10704 (Δ-pex10YL_下游 _fw)n = 尿嘧啶
<400> 33
acgaagttat ntgacgaggt ctggatggaa g 31
<210> 34
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(24)
<223> PR-10705 (Δ-pex10YL_下游 _rev)
<400> 34
cattgctaag aatccaaact ggag 24
<210> 35
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(19)
<223> PR-10767 (NatMxSynYL-起始 _rev_新)
<400> 35
tcatggacat ggcatagac 19
<210> 36
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(51)
<223> PR-11047 (NatMxSynYL-end _rev_新)n = 尿嘧啶
<400> 36
aataacttcg natagcatac attatacgaa gttatcgagc gtcccaaaac c 51
<210> 37
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(31)
<223> PR-11110 (大肠杆菌主链USER _fw)
<400> 37
atcgcgtgca ttcgcggccg catttaaatc c 31
<210> 38
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(36)
<223> PR-11111 (大肠杆菌主链USER _rev)
<400> 38
tcgcacgcat tcgcggccgc aaatttaaat aaaatg 36
<210> 39
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(30)
<223> PR-11138 (Hphsyn _fw)n = 尿嘧啶
<400> 39
agcaatgggn aaaaagcctg aactcaccgc 30
<210> 40
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(30)
<223> PR-11139 (Hphsyn _rev)n = 尿嘧啶
<400> 40
attacatgan tattcctttg ccctcggacg 30
<210> 41
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(30)
<223> PR-11694 (GPAT_上游_USER _fw)n = 尿嘧啶
<400> 41
cgtgcgangc atctaggagc tccattcagc 30
<210> 42
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(24)
<223> PR-11695 (GPAT_下游 _USER_rev)n = 尿嘧啶
<400> 42
cacgcgangg acgagcagac cacg 24
<210> 43
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(25)
<223> PR-13494 (Nat-Tcyc-loxP_fw)n = 尿嘧啶
<400> 43
agggtacnac tttggatgat actgc 25
<210> 44
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(54)
<223> PR-13549 (loxP-PrTefIntron _fw)n= 尿嘧啶
<400> 44
ataacttcgn ataatgtatg ctatacgaag ttatagagac cgggttggcg gcgc 54
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(20)
<223> PR-14269 (UraYL_fw)
<400> 45
atgccctcct acgaggcccg 20
<210> 46
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(22)
<223> PR-14270 (UraYL_rev)
<400> 46
ctagcagttg atcttctggt ag 22
<210> 47
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(24)
<223> PR-15426 (hfd1_上游 _fw)n = 尿嘧啶
<400> 47
cgtgcganat aagaaaaaaa acag 24
<210> 48
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(26)
<223> PR-15427 (Δ-hfd1_上游 _rev)╪ = 尿嘧啶
<400> 48
agctgttcna ctaaccctac ttcctc 26
<210> 49
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(24)
<223> PR-15428 (Δ-hfd1_下游 _fw)n = 尿嘧啶
<400> 49
agtggccntt ttattggtgg tgtg 24
<210> 50
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(28)
<223> PR-15429 (Δ-hfd1_下游 _rev)n = 尿嘧啶
<400> 50
cacgcgangc atagtgcttt tcatattc 28
<210> 51
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(32)
<223> PR-15438 (Δ-hfd4_上游 _fw)n = 尿嘧啶
<400> 51
cgtgcganag tatcgctact gtactaaaat tg 32
<210> 52
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(29)
<223> PR-15439 (Δ-hfd4_上游 _rev)n = 尿嘧啶
<400> 52
agctgttcna gcggacaagt gtcaatgtt 29
<210> 53
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(31)
<223> PR-15440 (Δ-hfd4_下游 _fw)n = 尿嘧啶
<400> 53
agtggccnat gtattttatc agtagtatct c 31
<210> 54
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(28)
<223> PR-15441 (Δ-hfd4_下游 _rev)n = 尿嘧啶
<400> 54
cacgcganat tggataatac atttccta 28
<210> 55
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(28)
<223> PR-16463 (Δ-fao1YL_上游 _fw)n = 尿嘧啶
<400> 55
cgtgcgantg ggggaggatt gcgatggg 28
<210> 56
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(31)
<223> PR-16464 (Δ-fao1YL_上游 _rev)n = 尿嘧啶
<400> 56
agctgttcnt gtcaagtaat caagctaatg c 31
<210> 57
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(31)
<223> PR-16465 (Δ-fao1YL_下游 _fw)n = 尿嘧啶
<400> 57
agtggccngc aagagacgag tttagaaata g 31
<210> 58
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(29)
<223> PR-16466 (Δ-fao1YL_下游 _rev)n = 尿嘧啶
<400> 58
cacgcgangt gttagttcct tgtagtgtg 29
<210> 59
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(29)
<223> PR-16696 (GPAT_上游 _rev)n = 尿嘧啶
<400> 59
agctgttcnt accgcacttc cggaacatc 29
<210> 60
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(28)
<223> PR-16698 (GPAT_100bpPr_下游 _fw)n = 尿嘧啶
<400> 60
agtggccncc gatacttgtt tgtgtgac 28
<210> 61
<211> 1578
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密码子优化的核苷酸序列
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(1578)
<223> 来自酿酒酵母的醇乙酰基转移酶ATF1的解脂耶氏酵母密码子优化的核苷酸序列
<400> 61
atgaacgaga tcgacgagaa gaaccaggct cctgtgcagc aagagtgcct gaaggaaatg 60
atccagaacg gacacgcccg acgaatgggc tctgtcgagg acctgtacgt ggccctgaac 120
cgacagaacc tgtaccgaaa cttctgcacc tacggcgagc tgtctgacta ctgcacccga 180
gatcagctga ccctggctct gcgagagatc tgcctgaaga accctactct gctgcatatc 240
gtgctgccca ctcgatggcc caaccacgag aactactacc gatcttctga gtactactct 300
cgaccccatc ctgtgcacga ctacatctcc gtgctgcaag agctgaagct gtctggcgtg 360
gtgctgaacg agcagcccga gtactctgcc gtgatgaagc agatcctgga agagttcaag 420
aactctaagg gctcttacac cgccaagatc ttcaagctga ctactaccct gaccattcct 480
tacttcggcc ccactggacc ctcttggcga ctgatctgtc tgcccgagga acacaccgag 540
aagtggaaga agttcatctt cgtttctaac cactgcatgt ctgacggacg atcctctatc 600
cacttctttc acgacctgcg agatgagctg aacaacatca agacccctcc aaagaagctg 660
gactacattt tcaagtacga agaggactac cagctgctgc gaaagctgcc cgagcctatc 720
gagaaggtga tcgacttccg acctccttac ctgttcatcc ccaagtctct gctgtctgga 780
ttcatctaca accacctccg attctcttcg aagggcgtgt gcatgcgaat ggacgacgtg 840
gaaaagaccg acgacgttgt gaccgagatc atcaacatct ctcccaccga gttccaggcc 900
atcaaggcca acattaagtc taacatccag ggcaagtgta ccatcactcc ctttctgcac 960
gtgtgctggt tcgtgtctct gcacaagtgg ggcaagttct ttaagcccct gaacttcgag 1020
tggctgaccg acatcttcat ccccgccgac tgccgatctc agctgcctga cgacgacgag 1080
atgcgacaga tgtaccgata cggcgccaac gtgggcttca tcgacttcac cccttggatc 1140
tctgagttcg acatgaacga caacaaggaa aacttctggc ccctgatcga gcactaccac 1200
gaggtgattt ctgaggccct gcgaaacaag aagcacctcc acggcctggg cttcaacatt 1260
cagggcttcg tccagaagta cgtcaacatt gacaaggtga tgtgcgaccg agccatcggc 1320
aagcgacgag gcggcaccct gctgtctaac gtgggcctgt tcaaccagct cgaggaaccc 1380
gacgccaagt actctatctg cgacctggcc ttcggccagt tccaaggctc ttggcaccag 1440
gctttctccc tgggcgtgtg ttctaccaac gtgaagggca tgaacatcgt ggtggcctct 1500
accaagaacg tggtgggctc tcaagagtct ctggaagaac tgtgctctat ctacaaggcc 1560
ctgctgctgg gcccctaa 1578
<210> 62
<211> 525
<212> PRT
<213> 酿酒酵母
<400> 62
Met Asn Glu Ile Asp Glu Lys Asn Gln Ala Pro Val Gln Gln Glu Cys
1 5 10 15
Leu Lys Glu Met Ile Gln Asn Gly His Ala Arg Arg Met Gly Ser Val
20 25 30
Glu Asp Leu Tyr Val Ala Leu Asn Arg Gln Asn Leu Tyr Arg Asn Phe
35 40 45
Cys Thr Tyr Gly Glu Leu Ser Asp Tyr Cys Thr Arg Asp Gln Leu Thr
50 55 60
Leu Ala Leu Arg Glu Ile Cys Leu Lys Asn Pro Thr Leu Leu His Ile
65 70 75 80
Val Leu Pro Thr Arg Trp Pro Asn His Glu Asn Tyr Tyr Arg Ser Ser
85 90 95
Glu Tyr Tyr Ser Arg Pro His Pro Val His Asp Tyr Ile Ser Val Leu
100 105 110
Gln Glu Leu Lys Leu Ser Gly Val Val Leu Asn Glu Gln Pro Glu Tyr
115 120 125
Ser Ala Val Met Lys Gln Ile Leu Glu Glu Phe Lys Asn Ser Lys Gly
130 135 140
Ser Tyr Thr Ala Lys Ile Phe Lys Leu Thr Thr Thr Leu Thr Ile Pro
145 150 155 160
Tyr Phe Gly Pro Thr Gly Pro Ser Trp Arg Leu Ile Cys Leu Pro Glu
165 170 175
Glu His Thr Glu Lys Trp Lys Lys Phe Ile Phe Val Ser Asn His Cys
180 185 190
Met Ser Asp Gly Arg Ser Ser Ile His Phe Phe His Asp Leu Arg Asp
195 200 205
Glu Leu Asn Asn Ile Lys Thr Pro Pro Lys Lys Leu Asp Tyr Ile Phe
210 215 220
Lys Tyr Glu Glu Asp Tyr Gln Leu Leu Arg Lys Leu Pro Glu Pro Ile
225 230 235 240
Glu Lys Val Ile Asp Phe Arg Pro Pro Tyr Leu Phe Ile Pro Lys Ser
245 250 255
Leu Leu Ser Gly Phe Ile Tyr Asn His Leu Arg Phe Ser Ser Lys Gly
260 265 270
Val Cys Met Arg Met Asp Asp Val Glu Lys Thr Asp Asp Val Val Thr
275 280 285
Glu Ile Ile Asn Ile Ser Pro Thr Glu Phe Gln Ala Ile Lys Ala Asn
290 295 300
Ile Lys Ser Asn Ile Gln Gly Lys Cys Thr Ile Thr Pro Phe Leu His
305 310 315 320
Val Cys Trp Phe Val Ser Leu His Lys Trp Gly Lys Phe Phe Lys Pro
325 330 335
Leu Asn Phe Glu Trp Leu Thr Asp Ile Phe Ile Pro Ala Asp Cys Arg
340 345 350
Ser Gln Leu Pro Asp Asp Asp Glu Met Arg Gln Met Tyr Arg Tyr Gly
355 360 365
Ala Asn Val Gly Phe Ile Asp Phe Thr Pro Trp Ile Ser Glu Phe Asp
370 375 380
Met Asn Asp Asn Lys Glu Asn Phe Trp Pro Leu Ile Glu His Tyr His
385 390 395 400
Glu Val Ile Ser Glu Ala Leu Arg Asn Lys Lys His Leu His Gly Leu
405 410 415
Gly Phe Asn Ile Gln Gly Phe Val Gln Lys Tyr Val Asn Ile Asp Lys
420 425 430
Val Met Cys Asp Arg Ala Ile Gly Lys Arg Arg Gly Gly Thr Leu Leu
435 440 445
Ser Asn Val Gly Leu Phe Asn Gln Leu Glu Glu Pro Asp Ala Lys Tyr
450 455 460
Ser Ile Cys Asp Leu Ala Phe Gly Gln Phe Gln Gly Ser Trp His Gln
465 470 475 480
Ala Phe Ser Leu Gly Val Cys Ser Thr Asn Val Lys Gly Met Asn Ile
485 490 495
Val Val Ala Ser Thr Lys Asn Val Val Gly Ser Gln Glu Ser Leu Glu
500 505 510
Glu Leu Cys Ser Ile Tyr Lys Ala Leu Leu Leu Gly Pro
515 520 525
<210> 63
<211> 1086
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密码子优化的核苷酸序列
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(1086)
<223> 来自黑腹果蝇的Δ9去饱和酶Dmd9的解脂耶氏酵母密码子优化的核苷酸序列
<400> 63
atggctccct actctcgaat ctaccaccag gacaagtcgt cccgagagac tggcgtgctg 60
ttcgaggacg acgcccagac cgtggactct gacctgacca ccgaccgatt ccagctgaag 120
cgagccgaga agcgacgact gcccctggtg tggcgaaaca tcatcctgtt cgccctggtg 180
cacctggccg ctctgtacgg cctgcactct atcttcaccc gagccaagct ggccaccact 240
ctgttcgctg ccggcctgta catcatcggc atgctgggcg tgaccgctgg cgcccaccga 300
ctgtgggctc accgaaccta caaggccaag tggcccctgc gactgctgct ggtgatcttc 360
aacaccattg ccttccagga cgccgtgtac cactgggccc gagatcaccg agtgcaccac 420
aagtactctg agactgacgc tgaccctcac aacgctaccc gaggcttctt cttctctcac 480
gtcggctggc tgctgtgcaa gaagcacccc gacatcaagg aaaagggccg aggcctggac 540
ctgtctgacc tgcgagctga ccccatcctg atgttccagc gaaagcacta ctacattctg 600
atgcccctgg cctgcttcgt gctgcccacc gtgattccca tggtgtactg gaacgagact 660
ctggcctctt cctggttcgt ggccaccatg ttccgatggt gcttccagct caacatgacc 720
tggctggtga actctgccgc tcacaagttc ggcaaccgac cttacgacaa gactatgaac 780
cccactcaga acgccttcgt gtctgccttc accttcggcg aaggctggca caactaccac 840
cacgcattcc cttgggacta caagaccgcc gagtggggct gctactctct gaacatcacc 900
accgccttca tcgacctgtt cgctaagatc ggctgggcct acgacctcaa gaccgtggct 960
cccgacgtga tccagcgacg agtgctgcga accggcgacg gctctcacga gctgtggggc 1020
tggggcgaca aggacctgac cgctgaggac gcccgaaacg tcctgctggt ggacaagtct 1080
cgataa 1086
<210> 64
<211> 1368
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密码子优化的核苷酸序列
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(1368)
<223> 来自棉铃虫的脂肪酰基还原酶Har_FAR的解脂耶氏酵母密码子优化的核苷酸序列
<400> 64
atggtggtcc tgacctctaa ggagactaag ccctccgtgg ccgagttcta cgctggcaag 60
tctgtcttca tcaccggcgg aaccggtttc ctgggcaagg tcttcattga gaagctgctg 120
tactcctgtc ccgacatcgg caacatctac atgctgatcc gagagaagaa gggactgtct 180
gtgtccgagc gaattaagca cttcctggac gaccccctgt tcacccgact gaaggagaag 240
cgacccgccg acctggagaa gatcgtgctg attcccggag acatcaccgc tcccgacctg 300
ggtattacct ctgagaacga gaagatgctg atcgagaagg tgtctgtcat cattcactcc 360
gccgctaccg tcaagttcaa cgagcccctg cccaccgcct ggaagatcaa cgtggaggga 420
acccgaatga tgctggctct gtctcgacga atgaagcgaa ttgaggtctt catccacatt 480
tccaccgcct acaccaacac caaccgagag gtggtggacg agatcctgta ccctgctcct 540
gctgacattg accaggtgca ccgatacgtc aaggacggta tctctgagga agagactgag 600
aagattctga acggccgacc caacacctac accttcacca aggccctgac cgagcacctg 660
gtggctgaga accaggctta cgtgcccacc atcattgtcc gaccctccgt ggtcgccgct 720
atcaaggacg agcccattaa gggatggctg ggtaactggt acggagctac cggactgacc 780
gtgttcaccg ctaagggtct gaaccgagtc atctacggcc actcttccaa catcgtggac 840
ctgattcccg tggactacgt cgccaacctg gtcattgccg ctggcgctaa gtcttccaag 900
tccaccgagc tgaaggtgta caactgttgc tcttccgcct gcaaccccat caccattgga 960
aagctgatgt ctatgttcgc cgaggacgct atcaagcaga agtcctacgc tatgcccctg 1020
cccggttggt acatcttcac caagtacaag tggctggtcc tgctgctgac cattctgttc 1080
caggtcatcc ccgcctacat taccgacctg taccgacacc tgatcggcaa gaacccccga 1140
tacattaagc tgcagtctct ggtcaaccag acccgatctt ccattgactt cttcacctct 1200
cactcctggg tcatgaaggc tgaccgagtc cgagagctgt tcgcctctct gtcccccgct 1260
gacaagtacc tgttcccctg tgaccccacc gacatcaact ggacccacta cattcaggac 1320
tactgctggg gagtgcgaca cttcctggag aagaagtcct acgagtag 1368
<210> 65
<211> 1062
<212> DNA
<213> 斜纹夜蛾
<400> 65
atggctccca acatctctga ggacgtgaac ggcgtgctgt tcgagtctga cgccgctact 60
cccgacctgg ctctggcccg acctcctgtg cagaaggccg acaacaagcc caagcagctg 120
gtgtggcgaa acatcatcct gttcgcctac ctgcacctgg ccgctctgta cggcggctac 180
ctgttcctgt tctctgccaa gtggcagacc gacatcttcg cctacatcct gtacgtgatc 240
tctggcctgg gcatcaccgc tggcgcccac cgactgtggg ctcacaagtc ttacaaggct 300
aagtggcccc tgaaggtgat cctgatcatc ttcaacaccg tggccttcca ggacgccgcc 360
atggactggg cccgagatca ccgaatgcac cacaagtact ctgagactga cgctgaccct 420
cacaacgcta cccgaggctt cttcttctct cacatcggct ggctgctggt gcgaaagcac 480
cccgacctga aggaaaaggg caagggcctc gacatgtctg acctgctggc tgaccccgtg 540
ctgcgattcc agaagaagta ctacctgctg ctgatgcccc tggcctgctt cgtcatgccc 600
accgtgattc ccgtgtacct gtggggcgag acttggacca acgccttctt cgtggccgcc 660
atgttccgat acgccttcat tctgaacgtg acctggctgg tgaactctgc tgcccacaag 720
tggggcgaca agccctacga caagtctatc aagccctctg agaacatgtc tgtggccatg 780
ttcgccctcg gcgagggatt ccacaactac caccacacat tcccttggga ctacaagacc 840
gccgagttcg gcaacaacaa gctgaacttc actaccgcct tcatcaactt tttcgccaag 900
atcggctggg cttacgacat gaagaccgtg tctgaggaca tcgtgaagaa ccgagtgaag 960
cgaaccggcg acggctctca ccacctctgg ggctggggcg acgagaacca gcctaaggaa 1020
gagatcgagg ccgccatccg aatcaacccc aaggacgact aa 1062
<210> 66
<211> 353
<212> PRT
<213> 斜纹夜蛾
<400> 66
Met Ala Pro Asn Ile Ser Glu Asp Val Asn Gly Val Leu Phe Glu Ser
1 5 10 15
Asp Ala Ala Thr Pro Asp Leu Ala Leu Ala Arg Pro Pro Val Gln Lys
20 25 30
Ala Asp Asn Lys Pro Lys Gln Leu Val Trp Arg Asn Ile Ile Leu Phe
35 40 45
Ala Tyr Leu His Leu Ala Ala Leu Tyr Gly Gly Tyr Leu Phe Leu Phe
50 55 60
Ser Ala Lys Trp Gln Thr Asp Ile Phe Ala Tyr Ile Leu Tyr Val Ile
65 70 75 80
Ser Gly Leu Gly Ile Thr Ala Gly Ala His Arg Leu Trp Ala His Lys
85 90 95
Ser Tyr Lys Ala Lys Trp Pro Leu Lys Val Ile Leu Ile Ile Phe Asn
100 105 110
Thr Val Ala Phe Gln Asp Ala Ala Met Asp Trp Ala Arg Asp His Arg
115 120 125
Met His His Lys Tyr Ser Glu Thr Asp Ala Asp Pro His Asn Ala Thr
130 135 140
Arg Gly Phe Phe Phe Ser His Ile Gly Trp Leu Leu Val Arg Lys His
145 150 155 160
Pro Asp Leu Lys Glu Lys Gly Lys Gly Leu Asp Met Ser Asp Leu Leu
165 170 175
Ala Asp Pro Val Leu Arg Phe Gln Lys Lys Tyr Tyr Leu Leu Leu Met
180 185 190
Pro Leu Ala Cys Phe Val Met Pro Thr Val Ile Pro Val Tyr Leu Trp
195 200 205
Gly Glu Thr Trp Thr Asn Ala Phe Phe Val Ala Ala Met Phe Arg Tyr
210 215 220
Ala Phe Ile Leu Asn Val Thr Trp Leu Val Asn Ser Ala Ala His Lys
225 230 235 240
Trp Gly Asp Lys Pro Tyr Asp Lys Ser Ile Lys Pro Ser Glu Asn Met
245 250 255
Ser Val Ala Met Phe Ala Leu Gly Glu Gly Phe His Asn Tyr His His
260 265 270
Thr Phe Pro Trp Asp Tyr Lys Thr Ala Glu Phe Gly Asn Asn Lys Leu
275 280 285
Asn Phe Thr Thr Ala Phe Ile Asn Phe Phe Ala Lys Ile Gly Trp Ala
290 295 300
Tyr Asp Met Lys Thr Val Ser Glu Asp Ile Val Lys Asn Arg Val Lys
305 310 315 320
Arg Thr Gly Asp Gly Ser His His Leu Trp Gly Trp Gly Asp Glu Asn
325 330 335
Gln Pro Lys Glu Glu Ile Glu Ala Ala Ile Arg Ile Asn Pro Lys Asp
340 345 350
Asp
<210> 67
<211> 981
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密码子优化的序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(981)
<223> 来自脐橙螟的Δ11去饱和酶的解脂耶氏酵母密码子优化的核苷酸序列
<400> 67
atg gtg ccc aac aag ggt tct tcc gac gtc ctg tct gag cac tcc gag 48
Met Val Pro Asn Lys Gly Ser Ser Asp Val Leu Ser Glu His Ser Glu
1 5 10 15
ccc cag ttc acc aag ctg att gct ccc cag gct ggc ccc cga aag tac 96
Pro Gln Phe Thr Lys Leu Ile Ala Pro Gln Ala Gly Pro Arg Lys Tyr
20 25 30
aag atc gtg tac cga aac ctg ctg acc ttc gga tac tgg cac ctg tct 144
Lys Ile Val Tyr Arg Asn Leu Leu Thr Phe Gly Tyr Trp His Leu Ser
35 40 45
gcc gtc tac ggt ctg tac ctg tgt ttc acc tgc gcc aag tgg gct acc 192
Ala Val Tyr Gly Leu Tyr Leu Cys Phe Thr Cys Ala Lys Trp Ala Thr
50 55 60
att ctg ttc gcc ttc ttc ctg tac gtg atc gct gag atc ggc att acc 240
Ile Leu Phe Ala Phe Phe Leu Tyr Val Ile Ala Glu Ile Gly Ile Thr
65 70 75 80
ggc gga gcc cac cga ctg tgg gct cac cga acc tac aag gcc aag ctg 288
Gly Gly Ala His Arg Leu Trp Ala His Arg Thr Tyr Lys Ala Lys Leu
85 90 95
ccc ctg gag atc ctg ctg ctg att atg aac tct atc gct ttc cag gac 336
Pro Leu Glu Ile Leu Leu Leu Ile Met Asn Ser Ile Ala Phe Gln Asp
100 105 110
acc gcc ttc acc tgg gct cga gat cac cga ctg cac cac aag tac tct 384
Thr Ala Phe Thr Trp Ala Arg Asp His Arg Leu His His Lys Tyr Ser
115 120 125
gac acc gac gct gac cct cac aac gct acc cga ggt ttc ttc tac tcc 432
Asp Thr Asp Ala Asp Pro His Asn Ala Thr Arg Gly Phe Phe Tyr Ser
130 135 140
cac gtg ggc tgg ctg ctg gtc aag aag cac ccc gag gtg aag gcc cgg 480
His Val Gly Trp Leu Leu Val Lys Lys His Pro Glu Val Lys Ala Arg
145 150 155 160
gga aag tac ctg tcc ctg gac gac ctg aag aac aac ccc ctg ctg aag 528
Gly Lys Tyr Leu Ser Leu Asp Asp Leu Lys Asn Asn Pro Leu Leu Lys
165 170 175
ttc cag aag aag tac gct atc ctg gtc att ggc acc ctg tgt ttc ctg 576
Phe Gln Lys Lys Tyr Ala Ile Leu Val Ile Gly Thr Leu Cys Phe Leu
180 185 190
atg ccc acc ttc gtg ccc gtc tac ttc tgg ggt gag ggc att tct acc 624
Met Pro Thr Phe Val Pro Val Tyr Phe Trp Gly Glu Gly Ile Ser Thr
195 200 205
gcc tgg aac atc aac ctg ctg cga tac gtg atg aac ctg aac atg acc 672
Ala Trp Asn Ile Asn Leu Leu Arg Tyr Val Met Asn Leu Asn Met Thr
210 215 220
ttc ctg gtc aac tcc gcc gct cac att ttc ggc aac aag ccc tac gac 720
Phe Leu Val Asn Ser Ala Ala His Ile Phe Gly Asn Lys Pro Tyr Asp
225 230 235 240
aag tct att gcc tcc gtg cag aac atc tct gtc tcc ctg gct acc ttc 768
Lys Ser Ile Ala Ser Val Gln Asn Ile Ser Val Ser Leu Ala Thr Phe
245 250 255
gga gag ggt ttc cac aac tac cac cac acc tac cct tgg gac tac cga 816
Gly Glu Gly Phe His Asn Tyr His His Thr Tyr Pro Trp Asp Tyr Arg
260 265 270
gct gct gag ctg ggc aac aac cga ctg aac atg acc acc gcc ttc att 864
Ala Ala Glu Leu Gly Asn Asn Arg Leu Asn Met Thr Thr Ala Phe Ile
275 280 285
gac ttc ttc gcc tgg atc gga tgg gct tac gac ctg aag tcc gtc ccc 912
Asp Phe Phe Ala Trp Ile Gly Trp Ala Tyr Asp Leu Lys Ser Val Pro
290 295 300
cag gaa gcc atc gct aag cga tgc gct aag acc ggc gac gga acc gac 960
Gln Glu Ala Ile Ala Lys Arg Cys Ala Lys Thr Gly Asp Gly Thr Asp
305 310 315 320
atg tgg gga cga aag cga tag 981
Met Trp Gly Arg Lys Arg
325
<210> 68
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 68
Met Val Pro Asn Lys Gly Ser Ser Asp Val Leu Ser Glu His Ser Glu
1 5 10 15
Pro Gln Phe Thr Lys Leu Ile Ala Pro Gln Ala Gly Pro Arg Lys Tyr
20 25 30
Lys Ile Val Tyr Arg Asn Leu Leu Thr Phe Gly Tyr Trp His Leu Ser
35 40 45
Ala Val Tyr Gly Leu Tyr Leu Cys Phe Thr Cys Ala Lys Trp Ala Thr
50 55 60
Ile Leu Phe Ala Phe Phe Leu Tyr Val Ile Ala Glu Ile Gly Ile Thr
65 70 75 80
Gly Gly Ala His Arg Leu Trp Ala His Arg Thr Tyr Lys Ala Lys Leu
85 90 95
Pro Leu Glu Ile Leu Leu Leu Ile Met Asn Ser Ile Ala Phe Gln Asp
100 105 110
Thr Ala Phe Thr Trp Ala Arg Asp His Arg Leu His His Lys Tyr Ser
115 120 125
Asp Thr Asp Ala Asp Pro His Asn Ala Thr Arg Gly Phe Phe Tyr Ser
130 135 140
His Val Gly Trp Leu Leu Val Lys Lys His Pro Glu Val Lys Ala Arg
145 150 155 160
Gly Lys Tyr Leu Ser Leu Asp Asp Leu Lys Asn Asn Pro Leu Leu Lys
165 170 175
Phe Gln Lys Lys Tyr Ala Ile Leu Val Ile Gly Thr Leu Cys Phe Leu
180 185 190
Met Pro Thr Phe Val Pro Val Tyr Phe Trp Gly Glu Gly Ile Ser Thr
195 200 205
Ala Trp Asn Ile Asn Leu Leu Arg Tyr Val Met Asn Leu Asn Met Thr
210 215 220
Phe Leu Val Asn Ser Ala Ala His Ile Phe Gly Asn Lys Pro Tyr Asp
225 230 235 240
Lys Ser Ile Ala Ser Val Gln Asn Ile Ser Val Ser Leu Ala Thr Phe
245 250 255
Gly Glu Gly Phe His Asn Tyr His His Thr Tyr Pro Trp Asp Tyr Arg
260 265 270
Ala Ala Glu Leu Gly Asn Asn Arg Leu Asn Met Thr Thr Ala Phe Ile
275 280 285
Asp Phe Phe Ala Trp Ile Gly Trp Ala Tyr Asp Leu Lys Ser Val Pro
290 295 300
Gln Glu Ala Ile Ala Lys Arg Cys Ala Lys Thr Gly Asp Gly Thr Asp
305 310 315 320
Met Trp Gly Arg Lys Arg
325
<210> 69
<211> 1368
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密码子优化的序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1368)
<223> 来自棉铃虫的脂肪酰基还原酶的解脂耶氏酵母密码子优化的核苷酸序列
<400> 69
atg gtg gtc ctg acc tct aag gag act aag ccc tcc gtg gcc gag ttc 48
Met Val Val Leu Thr Ser Lys Glu Thr Lys Pro Ser Val Ala Glu Phe
1 5 10 15
tac gct ggc aag tct gtc ttc atc acc ggc gga acc ggt ttc ctg ggc 96
Tyr Ala Gly Lys Ser Val Phe Ile Thr Gly Gly Thr Gly Phe Leu Gly
20 25 30
aag gtc ttc att gag aag ctg ctg tac tcc tgt ccc gac atc ggc aac 144
Lys Val Phe Ile Glu Lys Leu Leu Tyr Ser Cys Pro Asp Ile Gly Asn
35 40 45
atc tac atg ctg atc cga gag aag aag gga ctg tct gtg tcc gag cga 192
Ile Tyr Met Leu Ile Arg Glu Lys Lys Gly Leu Ser Val Ser Glu Arg
50 55 60
att aag cac ttc ctg gac gac ccc ctg ttc acc cga ctg aag gag aag 240
Ile Lys His Phe Leu Asp Asp Pro Leu Phe Thr Arg Leu Lys Glu Lys
65 70 75 80
cga ccc gcc gac ctg gag aag atc gtg ctg att ccc gga gac atc acc 288
Arg Pro Ala Asp Leu Glu Lys Ile Val Leu Ile Pro Gly Asp Ile Thr
85 90 95
gct ccc gac ctg ggt att acc tct gag aac gag aag atg ctg atc gag 336
Ala Pro Asp Leu Gly Ile Thr Ser Glu Asn Glu Lys Met Leu Ile Glu
100 105 110
aag gtg tct gtc atc att cac tcc gcc gct acc gtc aag ttc aac gag 384
Lys Val Ser Val Ile Ile His Ser Ala Ala Thr Val Lys Phe Asn Glu
115 120 125
ccc ctg ccc acc gcc tgg aag atc aac gtg gag gga acc cga atg atg 432
Pro Leu Pro Thr Ala Trp Lys Ile Asn Val Glu Gly Thr Arg Met Met
130 135 140
ctg gct ctg tct cga cga atg aag cga att gag gtc ttc atc cac att 480
Leu Ala Leu Ser Arg Arg Met Lys Arg Ile Glu Val Phe Ile His Ile
145 150 155 160
tcc acc gcc tac acc aac acc aac cga gag gtg gtg gac gag atc ctg 528
Ser Thr Ala Tyr Thr Asn Thr Asn Arg Glu Val Val Asp Glu Ile Leu
165 170 175
tac cct gct cct gct gac att gac cag gtg cac cga tac gtc aag gac 576
Tyr Pro Ala Pro Ala Asp Ile Asp Gln Val His Arg Tyr Val Lys Asp
180 185 190
ggt atc tct gag gaa gag act gag aag att ctg aac ggc cga ccc aac 624
Gly Ile Ser Glu Glu Glu Thr Glu Lys Ile Leu Asn Gly Arg Pro Asn
195 200 205
acc tac acc ttc acc aag gcc ctg acc gag cac ctg gtg gct gag aac 672
Thr Tyr Thr Phe Thr Lys Ala Leu Thr Glu His Leu Val Ala Glu Asn
210 215 220
cag gct tac gtg ccc acc atc att gtc cga ccc tcc gtg gtc gcc gct 720
Gln Ala Tyr Val Pro Thr Ile Ile Val Arg Pro Ser Val Val Ala Ala
225 230 235 240
atc aag gac gag ccc att aag gga tgg ctg ggt aac tgg tac gga gct 768
Ile Lys Asp Glu Pro Ile Lys Gly Trp Leu Gly Asn Trp Tyr Gly Ala
245 250 255
acc gga ctg acc gtg ttc acc gct aag ggt ctg aac cga gtc atc tac 816
Thr Gly Leu Thr Val Phe Thr Ala Lys Gly Leu Asn Arg Val Ile Tyr
260 265 270
ggc cac tct tcc aac atc gtg gac ctg att ccc gtg gac tac gtc gcc 864
Gly His Ser Ser Asn Ile Val Asp Leu Ile Pro Val Asp Tyr Val Ala
275 280 285
aac ctg gtc att gcc gct ggc gct aag tct tcc aag tcc acc gag ctg 912
Asn Leu Val Ile Ala Ala Gly Ala Lys Ser Ser Lys Ser Thr Glu Leu
290 295 300
aag gtg tac aac tgt tgc tct tcc gcc tgc aac ccc atc acc att gga 960
Lys Val Tyr Asn Cys Cys Ser Ser Ala Cys Asn Pro Ile Thr Ile Gly
305 310 315 320
aag ctg atg tct atg ttc gcc gag gac gct atc aag cag aag tcc tac 1008
Lys Leu Met Ser Met Phe Ala Glu Asp Ala Ile Lys Gln Lys Ser Tyr
325 330 335
gct atg ccc ctg ccc ggt tgg tac atc ttc acc aag tac aag tgg ctg 1056
Ala Met Pro Leu Pro Gly Trp Tyr Ile Phe Thr Lys Tyr Lys Trp Leu
340 345 350
gtc ctg ctg ctg acc att ctg ttc cag gtc atc ccc gcc tac att acc 1104
Val Leu Leu Leu Thr Ile Leu Phe Gln Val Ile Pro Ala Tyr Ile Thr
355 360 365
gac ctg tac cga cac ctg atc ggc aag aac ccc cga tac att aag ctg 1152
Asp Leu Tyr Arg His Leu Ile Gly Lys Asn Pro Arg Tyr Ile Lys Leu
370 375 380
cag tct ctg gtc aac cag acc cga tct tcc att gac ttc ttc acc tct 1200
Gln Ser Leu Val Asn Gln Thr Arg Ser Ser Ile Asp Phe Phe Thr Ser
385 390 395 400
cac tcc tgg gtc atg aag gct gac cga gtc cga gag ctg ttc gcc tct 1248
His Ser Trp Val Met Lys Ala Asp Arg Val Arg Glu Leu Phe Ala Ser
405 410 415
ctg tcc ccc gct gac aag tac ctg ttc ccc tgt gac ccc acc gac atc 1296
Leu Ser Pro Ala Asp Lys Tyr Leu Phe Pro Cys Asp Pro Thr Asp Ile
420 425 430
aac tgg acc cac tac att cag gac tac tgc tgg gga gtg cga cac ttc 1344
Asn Trp Thr His Tyr Ile Gln Asp Tyr Cys Trp Gly Val Arg His Phe
435 440 445
ctg gag aag aag tcc tac gag tag 1368
Leu Glu Lys Lys Ser Tyr Glu
450 455
<210> 70
<211> 455
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 70
Met Val Val Leu Thr Ser Lys Glu Thr Lys Pro Ser Val Ala Glu Phe
1 5 10 15
Tyr Ala Gly Lys Ser Val Phe Ile Thr Gly Gly Thr Gly Phe Leu Gly
20 25 30
Lys Val Phe Ile Glu Lys Leu Leu Tyr Ser Cys Pro Asp Ile Gly Asn
35 40 45
Ile Tyr Met Leu Ile Arg Glu Lys Lys Gly Leu Ser Val Ser Glu Arg
50 55 60
Ile Lys His Phe Leu Asp Asp Pro Leu Phe Thr Arg Leu Lys Glu Lys
65 70 75 80
Arg Pro Ala Asp Leu Glu Lys Ile Val Leu Ile Pro Gly Asp Ile Thr
85 90 95
Ala Pro Asp Leu Gly Ile Thr Ser Glu Asn Glu Lys Met Leu Ile Glu
100 105 110
Lys Val Ser Val Ile Ile His Ser Ala Ala Thr Val Lys Phe Asn Glu
115 120 125
Pro Leu Pro Thr Ala Trp Lys Ile Asn Val Glu Gly Thr Arg Met Met
130 135 140
Leu Ala Leu Ser Arg Arg Met Lys Arg Ile Glu Val Phe Ile His Ile
145 150 155 160
Ser Thr Ala Tyr Thr Asn Thr Asn Arg Glu Val Val Asp Glu Ile Leu
165 170 175
Tyr Pro Ala Pro Ala Asp Ile Asp Gln Val His Arg Tyr Val Lys Asp
180 185 190
Gly Ile Ser Glu Glu Glu Thr Glu Lys Ile Leu Asn Gly Arg Pro Asn
195 200 205
Thr Tyr Thr Phe Thr Lys Ala Leu Thr Glu His Leu Val Ala Glu Asn
210 215 220
Gln Ala Tyr Val Pro Thr Ile Ile Val Arg Pro Ser Val Val Ala Ala
225 230 235 240
Ile Lys Asp Glu Pro Ile Lys Gly Trp Leu Gly Asn Trp Tyr Gly Ala
245 250 255
Thr Gly Leu Thr Val Phe Thr Ala Lys Gly Leu Asn Arg Val Ile Tyr
260 265 270
Gly His Ser Ser Asn Ile Val Asp Leu Ile Pro Val Asp Tyr Val Ala
275 280 285
Asn Leu Val Ile Ala Ala Gly Ala Lys Ser Ser Lys Ser Thr Glu Leu
290 295 300
Lys Val Tyr Asn Cys Cys Ser Ser Ala Cys Asn Pro Ile Thr Ile Gly
305 310 315 320
Lys Leu Met Ser Met Phe Ala Glu Asp Ala Ile Lys Gln Lys Ser Tyr
325 330 335
Ala Met Pro Leu Pro Gly Trp Tyr Ile Phe Thr Lys Tyr Lys Trp Leu
340 345 350
Val Leu Leu Leu Thr Ile Leu Phe Gln Val Ile Pro Ala Tyr Ile Thr
355 360 365
Asp Leu Tyr Arg His Leu Ile Gly Lys Asn Pro Arg Tyr Ile Lys Leu
370 375 380
Gln Ser Leu Val Asn Gln Thr Arg Ser Ser Ile Asp Phe Phe Thr Ser
385 390 395 400
His Ser Trp Val Met Lys Ala Asp Arg Val Arg Glu Leu Phe Ala Ser
405 410 415
Leu Ser Pro Ala Asp Lys Tyr Leu Phe Pro Cys Asp Pro Thr Asp Ile
420 425 430
Asn Trp Thr His Tyr Ile Gln Asp Tyr Cys Trp Gly Val Arg His Phe
435 440 445
Leu Glu Lys Lys Ser Tyr Glu
450 455
<210> 71
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(20)
<223> PR-10714
<400> 71
ttgcttgcga acctaattcc 20
<210> 72
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(51)
<223> PR-10766
<400> 72
ataacttcgu ataatgtatg ctatacgaag ttataaggag tttggcgccc g 51
<210> 73
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(19)
<223> PR-10767
<400> 73
tcatggacat ggcatagac 19
<210> 74
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(51)
<223> PR-11047
<400> 74
aataacttcg uatagcatac attatacgaa gttatcgagc gtcccaaaac c 51
<210> 75
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(28)
<223> PR-13338
<400> 75
acctgcacug ttgatgtgtg tttaattc 28
<210> 76
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(22)
<223> PR-141
<400> 76
agaacagcug aagcttcgta cg 22
<210> 77
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(31)
<223> PR-14148
<400> 77
acgtgcaacg ctuacgcaac taacatgaat g 31
<210> 78
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(25)
<223> PR-14149
<400> 78
tgacttcaac attatatcgc tctga 25
<210> 79
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(25)
<223> PR-142
<400> 79
aggccacuag tggatctgat atcac 25
<210> 80
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(28)
<223> PR-14565
<400> 80
agtggccugg ggctggcgtg tgaaggag 28
<210> 81
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(27)
<223> PR-14566
<400> 81
acgcgaucag acctctcaca cggcatc 27
<210> 82
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(21)
<223> PR-14567
<400> 82
taatacgact cactataggg c 21
<210> 83
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(28)
<223> PR-14568
<400> 83
cacgcgaucc ttgagacgtt accagagc 28
<210> 84
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(37)
<223> PR-14589
<400> 84
cgtgcgaugc ggaggagcaa tagacatacg atttgac 37
<210> 85
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> PR-14590
<400> 85
aagcgttgca cgutcccctc cccacggtg 29
<210> 86
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(28)
<223> PR-14591
<400> 86
agtggccuca ccgagggata gggaacac 28
<210> 87
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(27)
<223> PR-14592
<400> 87
acgcgautta acactggacc gtactgc 27
<210> 88
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(23)
<223> PR-15430
<400> 88
cgtgcgaugg ttctatacga tgg 23
<210> 89
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(28)
<223> PR-15431
<400> 89
agctgttcut atgatatttt tactaacc 28
<210> 90
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(29)
<223> PR-15432
<400> 90
agtggccuga ttggcgttgt gttcaaatg 29
<210> 91
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(28)
<223> PR-15433
<400> 91
cacgcgautt gctcattcac cagaaaag 28
<210> 92
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(28)
<223> PR-15434
<400> 92
cgtgcgauat gtacaagtat ttctattg 28
<210> 93
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(29)
<223> PR-15435
<400> 93
agctgttcug aatgataaag agataacag 29
<210> 94
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(28)
<223> PR-15436
<400> 94
agtggccutg tggcggaagt tgtacacc 28
<210> 95
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(30)
<223> PR-15437
<400> 95
acctgcggtu agtactgcaa aaagtgctgg 30
<210> 96
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(30)
<223> PR-15930
<400> 96
acctgcggtu agtactgcaa aaagtgctgg 30
<210> 97
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(35)
<223> PR-16592
<400> 97
agtgcaggug ccacaatggt gcccaacaag ggttc 35
<210> 98
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(27)
<223> PR-16593
<400> 98
cgtgcgauct atcgctttcg tccccac 27
<210> 99
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(26)
<223> PR-16594
<400> 99
aaccgcaggu ggtcctgacc tctaag 26
<210> 100
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(29)
<223> PR-16595
<400> 100
cacgcgauct actcgtagga cttcttctc 29
<210> 101
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(20)
<223> PR-14279
<400> 101
cgtgcgauag agaccgggtt 20
<210> 102
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(30)
<223> PR-16618
<400> 102
agcctgcggu tagtactgca aaaagtgctg 30
<210> 103
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(27)
<223> PR-14395
<400> 103
cgtgcgautt gatatggtgt aacaatg 27
<210> 104
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(33)
<223> PR-14396
<400> 104
aagcgttgca cguaagcact atcctctgct gcg 33
<210> 105
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(28)
<223> PR-14397
<400> 105
agtggccucc gagcgtcgac aagcatac 28
<210> 106
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(28)
<223> PR-14398
<400> 106
cacgcgaugt tagaagcaat tggagaag 28
<210> 107
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(27)
<223> PR-15521
<400> 107
cgtgcgauaa ggagtttggc gcccgtt 27
<210> 108
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(28)
<223> PR-15522
<400> 108
atgacagaut gctgtagata tgtcttgt 28
<210> 109
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(29)
<223> PR-18486
<400> 109
agtgcaggug ccacaatgaa cgagatc 27
<210> 110
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(20)
<223> PR-18487
<400> 110
cgtgcgautt aggggcccag 20
<210> 111
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(23)
<223> PR-18490
<400> 111
accgcaggcu ccctactctc gaa 23
<210> 112
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(24)
<223> PR-18489
<400> 112
cacgcgautt atcgagactt gtcc 24
<210> 113
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(25)
<223> PR-18499
<400> 113
atctgtcaug ccacaatggc tccca 25
<210> 114
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(24)
<223> PR-18500
<400> 114
cacgcgautt agtcgtcctt gggg 24

Claims (18)

1.一种能够产生去饱和脂肪醇的产油酵母细胞，所述酵母细胞为解脂耶氏酵母，所述细胞：
i) 表达至少一种能够在脂肪酰基-CoA中引入至少一个双键的异源去饱和酶；并且
ii) 表达至少一种能够将至少一部分的去饱和脂肪酰基-CoA转化为去饱和脂肪醇的异源脂肪酰基-CoA还原酶(FAR)；并且
iii) 具有导致如SEQ ID NO: 22所示的Fao1的活性降低的突变，以及导致如SEQ IDNO: 4所示的Hfd1、如SEQ ID NO: 6所示的Hfd4、如SEQ ID NO: 8所示的Pex10和如SEQ IDNO: 10所示的GPAT中的至少一种的活性降低的突变，或者
具有导致与如SEQ ID NO: 22所示的Fao1具有至少99%同源性的来自解脂耶氏酵母的至少一种蛋白的活性降低的突变，和导致与如SEQ ID NO: 4所示的Hfd1、如SEQ ID NO: 6所示的Hfd4、如SEQ ID NO: 8所示的Pex10和如SEQ ID NO: 10所示的GPAT中的任一者具有至少99%同源性的来自解脂耶氏酵母的至少一种蛋白的活性降低的突变，
其中所述细胞能够产生滴度为至少5 mg/L的总的去饱和脂肪醇。
2.根据权利要求1所述的酵母细胞，具有导致如SEQ ID NO: 22所示的Fao1或与其具有至少99%的同源性的来自解脂耶氏酵母的蛋白的活性降低的突变，以及具有导致如SEQ IDNO: 4所示的Hfd1和如SEQ ID NO: 8所示的Pex10中的至少一种或与其具有至少99%的同源性的来自解脂耶氏酵母的蛋白的活性降低的突变。
3. 根据权利要求1或2所述的酵母细胞，具有导致如SEQ ID NO: 22所示的Fao1或与其具有至少99%的同源性的来自解脂耶氏酵母的蛋白的活性降低的突变，以及导致如SEQ IDNO: 4所示的Hfd1、如SEQ ID NO: 6所示的Hfd4、如SEQ ID NO: 8所示的Pex10和如SEQ IDNO: 10所示的GPAT中的至少一种或与其具有至少99%的同源性的来自解脂耶氏酵母的蛋白的活性降低的突变。
4.根据权利要求1或2所述的酵母细胞，其中所述至少一种异源去饱和酶选自Δ3去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ7去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ9去饱和酶、Δ10去饱和酶、Δ11去饱和酶、Δ12去饱和酶、Δ13去饱和酶和Δ14去饱和酶。
5. 根据权利要求1或2所述的酵母细胞，其中如SEQ ID NO: 4所示的Hfd1、如SEQ IDNO: 6所示的Hfd4、如SEQ ID NO: 8所示的来自Pex10和如SEQ ID NO: 22所示的Fao1或与其具有至少99%同源性的来自解脂耶氏酵母的蛋白质的活性的降低是部分的或完全的，和/或其中如SEQ ID NO: 10所示的GPAT或与其具有至少99%同源性的来自解脂耶氏酵母的蛋白质的活性的降低是部分的。
6.根据权利要求1或2所述的酵母细胞，其中所述去饱和酶衍生自昆虫的生物。
7.根据权利要求1或2所述的酵母细胞，其中所述去饱和酶衍生自鳞翅目（Lepidoptera）。
8. 根据权利要求1或2所述的酵母细胞，其中所述去饱和酶是与如SEQ ID NO: 2中所示的来自脐橙螟（Amyelois transitella）的Δ11去饱和酶具有至少99%同源性的Δ11去饱和酶或与如SEQ ID NO: 18中所示的来自黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的Δ9去饱和酶具有至少99%同源性的Δ9去饱和酶，其中所述去饱和酶具有去饱和酶活性。
9.根据权利要求1或2所述的酵母细胞，其中所述FAR选自：
i) 与如SEQ ID NO: 14中所示的来自棉铃虫（Helicoverpa armigera）的FAR具有至少99%同源性的FAR，其中所述FAR具有脂肪酰基CoA还原酶活性；
ii) 与如SEQ ID NO: 16中所示的来自烟夜蛾（Helicoverpa assulta）的FAR具有至少99%同源性的FAR，其中所述FAR具有脂肪酰基CoA还原酶活性；
iii) 与如SEQ ID NO: 12中所示的来自Heliothis subflexa的FAR具有至少99%同源性的FAR，其中所述FAR具有脂肪酰基CoA还原酶活性；以及
iv) 与如SEQ ID NO: 24中所示的来自Bicyclus anynana的FAR具有至少99%同源性的FAR，其中所述FAR具有脂肪酰基CoA还原酶活性。
10. 根据权利要求1或2所述的酵母细胞，其中所述FAR与如SEQ ID NO: 14中所示的来自棉铃虫的FAR或与如SEQ ID NO: 12中所示的来自Heliothis subflexa的FAR具有至少99%同源性，其中所述FAR具有脂肪酰基CoA还原酶活性。
11.根据权利要求1或2所述的酵母细胞，其还表达能够将至少一部分的所述去饱和脂肪醇转化为去饱和脂肪醇乙酸酯的乙酰基转移酶。
12. 根据权利要求1或2所述的酵母细胞，其中所述细胞能够产生总滴度为至少10 mg/L的脂肪醇，其中总滴度是去饱和脂肪醇的滴度和饱和脂肪醇的滴度之和。
13. 根据权利要求1或2所述的酵母细胞，其中所述细胞能够产生滴度为至少0.5 mg/L的(Z)11-C16:OH。
14. 一种在滴度为至少5 mg/L的产油酵母细胞中产生总的去饱和脂肪醇的方法，所述方法包括提供酵母细胞以及在培养基中孵育所述酵母细胞的步骤，所述酵母细胞为解脂耶氏酵母，其中所述酵母细胞：
i) 表达至少一种能够在脂肪酰基-CoA中引入至少一个双键的异源去饱和酶，从而将至少一部分的所述脂肪酰基-CoA转化为去饱和脂肪酰基-CoA；并且
ii) 表达至少一种能够将至少一部分的去饱和脂肪酰基-CoA转化为去饱和脂肪醇的异源脂肪酰基-CoA还原酶，从而产生所述去饱和脂肪醇；并且
iii) 具有导致如SEQ ID NO: 22所示的Fao1的活性降低的突变和导致如SEQ ID NO:4所示的Hfd1、如SEQ ID NO: 6所示的Hfd4、如SEQ ID NO: 8所示的Pex10和如SEQ ID NO:10所示的GPAT中的至少一种的活性降低的突变，或者
具有导致与如SEQ ID NO: 22所示的Fao1具有至少99%同源性的来自解脂耶氏酵母的至少一种蛋白的活性降低的突变和导致与如SEQ ID NO: 4所示的Hfd1、如SEQ ID NO: 6所示的Hfd4、如SEQ ID NO: 8所示的Pex10和如SEQ ID NO: 10所示的GPAT中的至少一种具有至少99%同源性的来自解脂耶氏酵母的至少一种蛋白的活性降低的突变。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述酵母细胞如权利要求2所定义。
16. 一种用于修饰酵母细胞的核酸构建体，所述酵母细胞为解脂耶氏酵母，所述构建体包含：
i) 编码至少一种能够在脂肪酰基-CoA中引入至少一个双键的异源去饱和酶的第一多核苷酸；和
ii) 编码至少一种能够将至少一部分的去饱和脂肪酰基-CoA转化为去饱和脂肪醇的异源脂肪酰基-CoA还原酶（FAR）的第二多核苷酸；以及
iii) 另外的多核苷酸，其用于降低如SEQ ID NO: 22所示的Fao1或与其具有至少99%的同源性的来自解脂耶氏酵母的至少一种蛋白质中的至少一种的活性。
17. 根据权利要求16所述的核酸构建体，其中所述另外的多核苷酸用于降低如SEQ IDNO: 22所示的Fao1或与其具有至少99%的同源性的来自解脂耶氏酵母的蛋白中至少一者的活性，以及用于降低如SEQ ID NO: 4所示的Hfd1、如SEQ ID NO: 6所示的Hfd4、如SEQ IDNO: 8所示的Pex10和如SEQ ID NO: 10所示的GPAT中的至少一者或与其具有至少99%同源性的来自解脂耶氏酵母的至少一种蛋白质的活性。
18. 一种部件试剂盒，其包含：
a) 根据权利要求1或2所述的酵母细胞和使用说明书；和/或
b) 根据权利要求16或17所述的核酸构建体，其中所述构建体用于修饰酵母细胞；以及
c) 待修饰的酵母细胞。
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