KR20240028439A - 탈포화 화합물의 생산을 위한 방법 및 효모 세포 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 Δ(12) 탈포화 지방 아실-CoA 및 선택적으로 지방 알코올을 생산할 수 있는 효모 세포에 관한 것이고, 상기 효모 세포는 적어도 (13)개의 탄소 사슬 길이를 갖는 포화 또는 탈포화 지방 아실-CoA에서 (12번) 위치에 이중결합, 즉, (12번) 위치의 탄소와 (13번) 위치의 탄소 사이에 이중결합을 도입할 수 있는 이종성 Δ(12) 탈포화효소를 발현시킨다.
Description
본 발명은 Δ12 탈포화 지방 아실-CoA(desaturated fatty acyl-CoA) 및 선택적으로 탈포화 지방 알코올을 생산할 수 있는 효모 세포에 관한 것이며, 상기 효모 세포는 이종성 Δ12 탈포화효소(desaturase)를 발현시킨다. 상기 화합물은 여러 곤충, 예컨대, 플로디아 인터푼텔라(Plodia interpunctella), 스포돕테라 엑시구아(Spodoptera exigua), 카드라 카우텔라(Cadra cautella), 스포돕테라 에리다니아(Spodoptera eridania) 및 기타의 성페로몬 구성성분의 전구체이다.
병충해 집중 관리(Integrated Pest Management: IPM)는 곡물 수확량을 증가시키고 환경적 영향을 최소화하고 유기농 식품 생산을 가능하게 하기 위한 중요한 역할을 하는 것으로 예상된다. IPM은 대안의 해충 방제 방법, 예컨대, 페로몬을 이용하는 교미 교란, 페로몬을 이용하는 대량 포획(mass trapping), 익충 등을 사용한다.
페로몬은 곤충(유사한 다른 유기체)이 짝 유인, 경고 신호, 길잡이 및 집합을 비롯한 다양한 맥락에서 동일한 종의 개체와 소통하기 위해 사용하는 다양한 화학물질 그룹을 구성한다. 장거리 짝 탐색과 관련된 곤충 페로몬은 살충제에 대한 안전하고 환경 친화적인 대안으로서 해충의 모니터링 및 방제를 위해 농업 및 임업 분야에서 이미 사용되고 있다. 해충 방제에서 사용하기 위한 페로몬의 생물학적 생산은 가격, 특이성 및 환경적 영향에 관해 화학 합성보다 유리하다.
관심의 페로몬은 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올, (Z9, E12)-테트라데카다이엔알 및 (Z9, E12)-테트라데카다이엔일 아세테이트이다. 이러한 화합물은 플로디아 인터푼텔라, 스포돕테라 엑시구아, 카드라 카우텔라, 스포돕테라 에리다니아 및 기타와 같은 다수의 인시목(Lepidoptera) 나방의 단독 또는 혼합 페로몬이다. 이러한 나방은 저장 및 원예 작물에서 경제적으로 중요한 해충이다.
문헌[Xia et al. (2019)]은 SexiDes5로 명명되는 스포돕테라 엑시구아로부터의 탈포화효소를 발현시키는 효모 세포를 개시한다. SexiDes5 탈포화효소의 주요 생성물은 (Z11)-헥사데칸산인 한편, 이는 또한 다른 단일- 및 이중-탈포화 지방산 이외의 소량의 (Z9, E12)-테트라데칸산을 생산하는 것으로 발견되었다.
높은 역가를 갖는 Δ12 탈포화 화합물을 생산할 수 있는 미생물 세포 공장(microbial cell factory)에 대한 요구가 남아있다.
본 발명은 청구범위에 규정되는 바와 같다.
본 개시내용은 Δ12 탈포화 지방 아실-CoA 및 선택적으로 Δ12 탈포화 지방 알코올을 생산할 수 있는 효모 세포에 관한 것이며, 상기 효모 세포는 이종성 Δ12 탈포화효소를 발현시킨다. 특히, 본 개시내용은 페로몬 (Z9, E12)-테트라데카다이엔알 및 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 아세테이트의 전구체인 (Z9, E12)-테트라데카다이엔산 또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올을 생산할 수 있는 효모 세포를 제공한다. (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올, (Z9, E12)-테트라데카다이엔알 및 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 아세테이트는 플로디아 인터푼텔라의 성페로몬 구성성분이다. 추가로, (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 아세테이트는 스포돕테라 엑시구아, 카드라 카우텔라, 스포돕테라 에리다니아 및 기타의 페로몬 구성성분이다. 카드라 카우텔라는 에페스티아 카우텔라(Ephestia cautella)로도 알려지고 지칭된다. (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 아세테이트는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-일 아세테이트로도 알려지고 지칭된다.
따라서, 본 명세서에서 n'개의 이중결합(들)을 갖는 탈포화 지방 아실-조효소 A(지방 아실-CoA)를 생산할 수 있는 효모 세포가 제공되되, 상기 이중결합(들) 중 적어도 하나는 12번 위치에 있고,
상기 효모 세포는 이종성 Δ12 지방 아실-CoA 탈포화효소를 발현시키고, 상기 탈포화효소는, 적어도 13개의 탄소 사슬 길이를 갖고 n개의 이중결합(들)을 갖는, 포화 또는 탈포화 지방 아실-CoA, 바람직하게는 탈포화 지방 아실-CoA의 12번 위치에 이중결합을 도입할 수 있고,
n 및 n'는 정수이며,
0 ≤ n ≤ 3이고, 1 ≤ n' ≤ 4이다.
또한 본 명세서에서 n'개의 이중결합(들)을 갖는 탈포화 지방 아실-CoA를 생산하는 방법이 제공되되, 상기 이중결합(들) 중 적어도 하나는 효모 세포의 12번 위치에 있고, 상기 방법은,
i) 본 명세서에 개시된 바와 같은 효모 세포를 생산하는 단계,
ii) 이종성 Δ12 탈포화효소를 발현시키는 조건 하에서 배지에서 상기 효모 세포를 인큐베이션시키는 단계로서, 상기 탈포화효소는 적어도 13개의 탄소 사슬 길이를 갖고 n개의 이중결합을 갖는 포화 또는 탈포화 지방 아실-CoA, 바람직하게는 탈포화 지방-아실-CoA의 12번 위치에 이중결합을 도입할 수 있는, 상기 인큐베이션시키는 단계
를 포함함으로써, n'개의 이중결합(들)을 갖는 탈포화 지방 아실-CoA를 생산하되, 상기 이중결합(들) 중 적어도 하나는 12번 위치에 있고,
n 및 n'는 정수이며,
0 ≤ n ≤ 3이고, 1 ≤ n' ≤ 4이다.
추가로 다음의 단계들을 포함하는 방법에 의해 얻을 수 있는 페로몬 조성물이 본 명세서에 제공된다:
i) 본 명세서에 개시된 바와 같은 방법에 의해 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 및/또는 E12-지방 알코올을 생산하는 단계;
ii) (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 및/또는 E12-지방 알코올을 회수하는 단계;
iii) E12-지방 알코올 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올을 각각 E12-지방 알코올 아세테이트 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 아세테이트로 전환시키는 단계;
iv) E12-지방 알코올 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올을 각각 E12-지방 알데하이드 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔알로 전환시키는 단계;
v) 상기 E12-지방 알코올, (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올, E12-지방 알코올 아세테이트, (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 아세테이트, E12-지방 알데하이드 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔알을 페로몬 조성물로서 제형화하는 단계.
추가로 E12-지방 알코올, (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올, E12-지방 알코올 아세테이트, (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 아세테이트, E12-지방 알데하이드 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔알을 포함하는 페로몬 조성물이 본 명세서에 제공되되, 페로몬 조성물은 적어도 20% 바이오기반 탄소, 예컨대, 적어도 30%, 예컨대, 적어도 40%, 예컨대, 적어도 50%, 예컨대, 적어도 60%, 예컨대, 적어도 70%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 95% 바이오기반 탄소를 포함한다.
또한 E12-지방 알코올, (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올, E12-지방 알코올 아세테이트, (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 아세테이트, E12-지방 알데하이드 및 (Z9, E12)-테트라데카다이엔알로 이루어진 군으로부터 선택되는 페로몬 화합물이 본 명세서에 제공되되, 페로몬 화합물은 적어도 20% 바이오기반 탄소, 예컨대, 적어도 30%, 예컨대, 적어도 40%, 예컨대, 적어도 50%, 예컨대, 적어도 60%, 예컨대, 적어도 70%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 95% 바이오기반 탄소를 포함한다.
추가로 E12-지방 알코올, (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올, E12-지방 알코올 아세테이트, (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 아세테이트, E12-지방 알데하이드 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔알을 포함하는 페로몬 조성물이 본 명세서에 제공되되, 페로몬 조성물은 적어도 20%, 예컨대, 적어도 30%, 예컨대, 적어도 40%, 예컨대, 적어도 50%, 예컨대, 적어도 60%, 예컨대, 적어도 70%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 95%의 방사성 14C 수준을 갖는다.
또한 E12-지방 알코올, (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올, E12-지방 알코올 아세테이트, (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 아세테이트, E12-지방 알데하이드 및 (Z9, E12)-테트라데카다이엔알로 이루어진 군으로부터 선택되는 페로몬 화합물이 본 명세서에 제공되되, 페로몬 화합물은 적어도 20%, 예컨대, 적어도 30%, 예컨대, 적어도 40%, 예컨대, 적어도 50%, 예컨대, 적어도 60%, 예컨대, 적어도 70%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 95%의 방사성 14C 수준을 갖는다.
또한 포화 또는 탈포화 지방 아실-CoA에서 12번 위치에 이중결합을 도입하기 위한 방법에서의, 플로디아 인터푼텔라 탈포화효소의 용도가 본 명세서에 제공되되, 선택적으로 플로디아 인터푼텔라 탈포화효소는 Pid12(서열번호 2), 또는 이와 적어도 70% 유사성 또는 동일성, 예컨대, 이와 적어도 80%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%, 예컨대, 100% 유사성 또는 동일성을 갖는 이의 기능적 변이체이다.
또한 포화 또는 탈포화 지방 아실-CoA에서 12번 위치에 이중결합을 도입하기 위한 방법에서의, 카드라 카우텔라 탈포화효소의 용도가 본 명세서에 제공되되, 선택적으로 카드라 카우텔라 탈포화효소는 EcauDes12(서열번호 55), 또는 이와 적어도 70% 유사성 또는 동일성, 예컨대, 이와 적어도 80%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%, 예컨대, 100% 유사성 또는 동일성을 갖는 이의 기능적 변이체이다.
추가로 본 명세서에서 포화 또는 탈포화 지방 아실-CoA에서 12번 위치에 이중결합을 도입하기 위한 방법에서의, 에페스티아 쿠에니엘라(Ephestia kuehniella) 탈포화효소의 용도가 제공되되, 선택적으로 에페스티아 쿠에니엘라 탈포화효소는 이와 적어도 70% 유사성 또는 동일성, 예컨대, 이와 적어도 80%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%, 예컨대, 100% 유사성 또는 동일성을 갖는 Eku_d12(서열번호 85) 또는 이의 기능성 변이체이다.
도 1. 효모에서 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올(Z9, E12-14:OH)의 생산 및 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 아세테이트 (Z9, E12-14:OAc) 또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔알(Z9, E12-14:Ald)로의 효소적 또는 화학적 전환을 위한 경로. 약어: 14:CoA, 테트라데칸오일-CoA; Z9-14:CoA, (Z9)-테트라데센오일-CoA; Z9,E12-14:CoA, (Z9, E12)-테트라데카다이엔오일-CoA.
도 2. (A) Z9, E12-14:OH 분석 표준, (B) 대조군 균주 ST10628의 추출물, (C) Pid12를 발현시키는 균주 ST10870의 추출물의 GC 크로마토그램 및 (D) 분석 표준 및 (E) 체류 시간 10.2분에 ST10870의 추출물의 질량 스펙트럼. 임의의 단위.
도 3. (A) 실시예 12의 출발 물질 A 및 생성물 B의 GC 크로마토그램 및 (B) 실시예 12의 출발 물질 A 및 생성물 B의 질량 스펙트럼.
도 4. (A) 대조군 균주 ST10748의 추출물, Eku_d12를 발현시키는 균주 ST12596의 추출물, 및 Z9, E12-14:Me 분석 표준의 GC 크로마토그램, 및 (B) ST12596의 추출물 및 (C) 체류 시간 10.39분에 Z9,E12-14:Me의 분석 표준의 질량 스펙트럼. 임의의 단위.
도 2. (A) Z9, E12-14:OH 분석 표준, (B) 대조군 균주 ST10628의 추출물, (C) Pid12를 발현시키는 균주 ST10870의 추출물의 GC 크로마토그램 및 (D) 분석 표준 및 (E) 체류 시간 10.2분에 ST10870의 추출물의 질량 스펙트럼. 임의의 단위.
도 3. (A) 실시예 12의 출발 물질 A 및 생성물 B의 GC 크로마토그램 및 (B) 실시예 12의 출발 물질 A 및 생성물 B의 질량 스펙트럼.
도 4. (A) 대조군 균주 ST10748의 추출물, Eku_d12를 발현시키는 균주 ST12596의 추출물, 및 Z9, E12-14:Me 분석 표준의 GC 크로마토그램, 및 (B) ST12596의 추출물 및 (C) 체류 시간 10.39분에 Z9,E12-14:Me의 분석 표준의 질량 스펙트럼. 임의의 단위.
정의
이종성 Δ12 탈포화효소: 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "이종성 Δ12 탈포화효소"는 "추가 이종성 탈포화효소"와 상이한 탈포화효소를 지칭한다. 이종성 탈포화효소는 포화 또는 탈포화 지방 아실-조효소 A(지방 아실-CoA)에서 12번 위치에 이중결합을 도입할 수 있다.
추가 이종성 탈포화효소: 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "추가 이종성 탈포화효소"는 "이종성 탈포화효소"와 상이한 탈포화효소를 지칭한다. 추가 이종성 탈포화효소는 포화 또는 탈포화 지방 아실-CoA에서 12번 위치보다는 임의의 다른 위치에 이중결합을 도입할 수 있다. 추가 이종성 탈포화효소는 이종성 Δ12 탈포화효소와 동일한 유기체에 대해 천연일 수 있거나, 또는 이종성 Δ12 탈포화효소와 상이한 유기체에 대해 천연일 수 있고, 이종성 Δ12 탈포화효소와 상이한 반응을 촉매한다.
생물농약: 용어 "생물농약"은 '생물학적 살충제'의 축약형이며, 포식성, 기생충 또는 화학적 관계를 통한 여러 유형의 해충 관리 개입을 지칭한다. 유럽에서, 생물농약은 미생물에 기반한 살충제 또는 천연물 형태"로 정의되었다. 미국에서, 이들은 "해충을 방제하는 자연 발생적 물질(생화학적 살충제), 해충을 방제하는 미생물(미생물 살충제) 및 첨가된 유전물질(식물-혼입된 보호제) 또는 PIP를 함유하는 식물에 의해 생산된 살충제 물질을 포함하는" 것으로 EPA에 의해 정의된다. 본 발명은 더 구체적으로는 천연물 또는 자연 발생적 물질을 포함하는 생물농약에 관한 것이다. 본 문맥에서, 이들은 박테리아 및 기타 미생물, 진균, 선충, 단백질 등을 포함하는 자연 발생적 유기체 및/또는 이들의 대사물질을 배양 및 농축시킴으로써 제조된다. 이러한 화합물은 병충해 집중 관리(IPM) 프로그램의 중요한 구성성분으로 간주되고, 합성 화학 식물 보호 생성물(plant protection product: PPP)에 대한 대체물로서 많은 현실적인 관심을 받았다. 문헌[Manual of Biocontrol Agents (2009: 앞에서 Biopesticide Manual)]은 입수 가능한 입수 가능한 생물학적 살충제(및 기타 생물 기반 방제) 제품의 검토를 제공한다.
탈포화: 용어 "탈포화"(desaturated)는 본 명세서에서 용어 "불포화"(unsaturated)와 호환 가능하게 사용될 것이고, 하나 이상의 이중 또는 삼중 탄소-탄소 결합, 바람직하게는 이중 탄소-탄소 결합을 함유하는 화합물을 지칭한다. 다음의 명명법은 본 명세서 전체적으로 사용된다: Δi 탈포화 화합물(i는 정수임)은 탄소 사슬의 i번 위치의 탄소 원자와 탄소 사슬의 i + 1번 위치의 탄소 사이에 이중 또는 삼중 탄소-탄소 결합을 갖는 화합물을 지칭한다. 따라서 탄소 사슬 길이는 적어도 i + 1과 동일하다. 예를 들어, Δ12 탈포화 화합물은 탄소 12와 탄소 13 사이에 이중 또는 삼중 탄소-탄소 결합을 갖는 화합물을 지칭하고, 12번 위치에 탄소-탄소 결합을 갖는 탄소 사슬로서 본 명세서에서 지칭된다. 상기 Δ12 탈포화 화합물은 13개 이상의 탄소 사슬 길이를 가질 수 있다. 이중 또는 삼중 결합은 E 입체배치 또는 Z 입체배치일 수 있다. 따라서, 본 명세서에서, Ei 또는 Zi 탈포화 화합물은 탄소 i와 탄소 사슬의 탄소 i + 1 사이에 각각 E 입체배치 또는 Z 입체배치로 이중 탄소-탄소 결합을 갖는 화합물을 지칭할 것이되, 상기 탈포화 화합물은 총 길이가 적어도 i + 1이다. 예를 들어, E12 탈포화 지방 알코올은 E 입체배치에서 12번 위치에 (즉, 탄소 원자 12와 탄소 원자 13 사이의 이중결합) 불포화를 갖고, 13개 이상의 탄소 사슬 길이를 갖는다.
~로부터 유래된: 용어 "~로부터 유래된"은 유기체로부터 유래된 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 지칭할 때 상기 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드가 상기 유기체에 고유하다는 것, 즉, 상기 유기체에서 자연적으로 발생된다는 것을 의미한다.
12번 위치에 적어도 하나의 이중결합을 갖는 E12-지방 아실-CoA: 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "12번 위치에 적어도 하나의 이중결합을 갖는 E12-지방 아실-CoA"는 E12-지방 아실-CoA가 12번 위치에 1개의 이중결합을 갖는다는 것을 의미한다. 본 발명의 일부 실시형태에서, E12-지방 아실-CoA 단독은 12번 위치에 이중결합을 갖는다. 본 발명의 다른 실시형태에서, E12-지방 아실-CoA는 12번 위치에 이중결합 이외의 추가 이중결합을 갖는다. 추가 이중결합은 12번 위치 이외의 임의의 위치에 있을 수 있다. 이의 일례는 12번 위치에 이중결합을 갖고 9번 위치와 같은 임의의 위치에 추가 이중결합을 갖는 E12-지방 아실-CoA이다.
지방산: 용어 "지방산"은 본 명세서에서 긴 지방족 사슬, 즉, 13 내지 28개의 탄소 원자, 예컨대, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 또는 28개 탄소 원자의 지방족 사슬을 갖는 카복실산을 지칭한다. 대부분의 자연 발생적 지방산은 선형이고, 즉, 비분지된다. 이들은 포화 또는 탈포화될 수 있다.
지방 아실-CoA: 상기 용어는 본 명세서에서 "지방 아실-CoA 에스터"와 호환 가능하게 사용될 것이며, 일반식 R-CO-SCoA의 화합물을 지칭하고, 여기서, R은 13 내지 28개의 탄소 원자, 예컨대, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 또는 28개의 탄소 원자의 탄소 사슬 길이를 갖는 지방 탄소 사슬이다. 지방 탄소 사슬은 티오에스터 결합에 의해 CoA의 -SH에 결합된다. 지방 아실-CoA는, 이것이 유래된 지방산이 포화인지 또는 탈포화인지의 여부에 따라서, 포화 또는 탈포화일 수 있다.
지방 알코올: 상기 용어 "지방 알코올"은 본 명세서에서 13 내지 28개의 탄소 원자, 예컨대, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 또는 28개의 탄소 원자의 탄소 사슬 길이를 갖는, 지방 아실-CoA로부터 유래된 알코올을 지칭한다. 지방 알코올은 포화 또는 탈포화일 수 있다.
지방 알코올 아세테이트: 상기 용어는 지방 탄소 사슬, 즉, 13 내지 28개의 탄소 원자, 예컨대, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 또는 28개의 탄소 원자의 지방족 사슬을 갖는 아세테이트를 지칭한다. 지방 아실 아세테이트는 포화 또는 탈포화일 수 있다.
지방 알데하이드: 상기 용어는 본 명세서에서 13 내지 28개의 탄소 원자, 예컨대, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 또는 28개의 탄소 원자의 탄소 사슬 길이를 갖는, 지방 아실-CoA로부터 유래된 알데하이드를 지칭한다. 지방 알데하이드는 포화 또는 탈포화일 수 있다.
기능적 변이체: 상기 용어는 본 명세서에서 모 효소 활성의 적어도 일부를 보유하는 효소의 기능적 변이체를 지칭한다. 따라서, 아실-CoA 옥시다제, 탈포화효소, 알코올-형성 지방 아실-CoA 환원효소, 알코올 탈수소효소, 알데하이드-형성 지방 아실-CoA 환원효소, 아세틸트랜스퍼라제 또는 NAD(P)H 사이토크롬 b5 산화환원효소(Ncb5or)의 기능적 변이체는 각각 이들이 유래된 아실-CoA 옥시다제, 탈포화효소, 알코올-형성 지방 아실-CoA 환원효소, 알코올 탈수소효소, 알데하이드-형성 지방 아실-CoA 환원효소 또는 아세틸트랜스퍼라제와 동일한 전환을 촉매할 수 있지만, 반응 효율은 상이할 수 있고, 예를 들어, 효율은 모 효소에 비해서 감소 또는 증가되거나, 기질 특이성은 변형된다.
이종성: 상기 용어 "이종성"은, 폴리펩타이드, 예컨대, 단백질 또는 효소, 또는 폴리뉴클레오타이드를 지칭할 때, 본 명세서에서 야생형 세포에 자연적으로 존재하지 않는 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 지칭하는 것으로 해석될 것이다. 예를 들어, 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)에 적용될 때 용어 "이종성 Δ9 탈포화효소"는 야생형 사카로마이세스 세레비시애 세포에 자연적으로 존재하지 않는 Δ9 탈포화효소, 예를 들어, 드로소필라 멜라노가스터로부터 유래된 Δ9 탈포화효소를 지칭한다.
동일성/유사성: 폴리뉴클레오타이드(또는 폴리펩타이드)에 대해 동일성 및 유사성이라는 용어는, 서열을 정렬하고, 필요한 경우, 최대 동일성/유사성/상동성의 백분율을 달성하기 위해 갭을 도입하고, 서열 동일성의 일부로서 NCIUB 규칙에 따른 임의의 보존적 치환을 고려한 후, 상응하는 천연 핵산(또는 아미노산)의 잔기에 대해 각각 동일하거나 유사한 후보 서열의 핵산(또는 아미노산)의 백분율로서 본 명세서에서 정의된다(https://iubmb.qmul.ac.uk/misc/naseq.html; NC-IUB, Eur J Biochem (1985)). 특히, 유사성의 백부율은 유사한 생리화학적 특성을 갖는 보존된 잔기의 백분율을 지칭한다. (핵산의 경우) 5' 또는 3' 연장도 삽입도 또는 (폴리펩타이드의 경우) N' 또는 C' 연장도 삽입도 동일성, 유사성의 감소를 초래하지 않는다. 정렬을 위한 방법 및 컴퓨터 프로그램은 당업계에 잘 알려져 있다. 일반적으로, 두 서열 사이에 주어진 유사성은 이러한 서열 사이의 동일성이 유사성과 적어도 동일하고; 예를 들어, 두 서열이 서로 70% 유사한 경우, 이들은 서로 70% 미만으로 동일할 수 없지만, 80% 동일성을 공유할 수 있었다는 것을 나타낸다.
증가된 활성: 용어 "증가된 활성"은 본 명세서에서 주어진 펩타이드, 예컨대, 단백질 또는 효소 활성의 증가를 지칭한다. 활성의 증가는 당업계에 알려진 방법을 이용해서, 예를 들어, 효소 활성의 증가를 측정하기 위해 효소 분석을 이용해서 측정될 수 있다. 일부 경우에, 활성의 증가는 효소가 생산하는 화합물 또는 화합물들, 즉, 생성물의 더 높은 생산을 초래한다. 따라서, 효소의 증가된 활성은 상기 생성물의 양, 예컨대, 농도를 측정함으로써 측정될 수 있다. 효소가 증가된 활성을 갖는 경우, 생성물의 농도는 증가된 활성을 갖지 않는 동일한 효소, 예를 들어, 모 효소 또는 비변형 효소에 의해 유사한 또는 동일한 조건에서 생성된 생성물의 농도에 비해서 더 높을 것이다. 증가된 활성을 갖는 효소가 세포 내에서 발현되는 경우, 생성물은 생성물 역가로서 측정될 수 있고, 즉, 상기 세포의 생성물의 양이 생성되고, 모 또는 비변형 효소를 발현시키지만 다르게는 증가된 활성을 갖는 효소를 발현시키는 세포와 동일 또는 유사한 유전자형을 갖는 세포와 유사한 또는 동일한 조건에서 얻은 동일한 생성물의 역가 또는 양과 비교될 수 있다.
n개의 이중결합: 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "n개의 이중결합"은 지방 아실-CoA에 존재하는 이중결합의 수를 지칭한다. n개의 이중결합을 갖는 지방 아실-CoA는 0 내지 3개의 이중결합(들)을 갖는다. 따라서, n개의 이중결합을 갖는 지방 아실-CoA는 0개의 이중결합을 갖는 포화된 지방 아실-CoA 또는 하나 이상의 이중결합, 예컨대, 1, 2 또는 3개의 이중결합을 갖는 탈포화 지방 아실-CoA일 수 있다. n개의 이중결합은 12번 위치 이외의 임의의 위치에 있을 수 있다.
n'개의 이중결합: 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "n'개의 이중결합"은 지방 아실-CoA에 존재하는 이중결합의 수를 지칭한다. n'개의 이중결합을 갖는 지방 아실-CoA는 1 내지 4개의 이중결합(들)을 갖는다. 따라서, n'개의 이중결합을 갖는 지방 아실-CoA는 1개 이상의 이중결합, 예컨대, 1, 2, 3 또는 4개의 이중결합을 갖는 탈포화 지방 아실-CoA일 수 있고, 이중 결합 중 하나는 12번 위치에 있다.
천연: 상기 용어 "천연"은, 폴리펩타이드, 예컨대, 단백질 또는 효소, 또는 폴리뉴클레오타이드를 지칭할 때, 본 명세서에서 야생형 세포에 자연적으로 존재하는 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 지칭하는 것으로 해석될 것이다.
해충: 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 '해충'은, 특히 농업 또는 가축 생산과 관련하여 인간 또는 인간 관계에 해로운 유기체, 특히, 동물, 예컨대, 곤충을 지칭할 것이다. 해충은 식물 또는 동물, 인간 또는 인간 관계, 가축, 인간 구조, 야생 생태계 등 중 하나에 대해 침습성 또는 다산성, 유해성, 고질성, 유독성, 파괴성, 성가심이 있는 임의의 살아있는 유기체이다. 상기 용어는 종종 관련 용어 내에서 해충, 잡초, 식물 및 동물 기생충 및 병원균과 중복된다. 한 상황에서는 해충이지만 다른 상황에서는 유익하거나, 길들여지거나 또는 허용 가능한 유기체에 대해서도 가능하다.
페로몬: 페로몬은 자연 발생적 화합물이다. 인시목 페로몬은 알코올, 알데하이드 또는 아세테이트 작용기에서 종결되고 지방족 골격에 최대 3개의 이중 결합, 예컨대, 1, 2 또는 3개의 이중결합을 포함하는 비분지 지방족 사슬(9 내지 18개의 탄소, 예컨대, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18개의 탄소 원자)에 의해 표기된다. 따라서, 탈포화 지방 알코올, 탈포화 지방 알데하이드 및 탈포화 지방 알코올 아세테이트는 전형적으로 페로몬에 포함된다. 페로몬 조성물은, 예를 들어, 본 명세서에 기재되는 바와 같이 화학적 또는 생화학적으로 생산될 수 있다. 따라서, 페로몬은 탈포화 지방 알코올, 탈포화 지방 알데하이드 및/또는 탈포화 지방 알코올 아세테이트를 포함하고, 예컨대, 본 명세서에 기재된 방법 및 세포에 의해 얻을 수 있다.
"PidZ11" 및 "Pid12": 서열번호 2에 제시된 바와 같은 Δ12 탈포화효소는, 효소가 Δ12 활성을 갖는다는 것이 발견되기 전에 내부 명칭 "PidZ11"이 처음에 주어졌다. 따라서, 더 적절한 명칭은 "Pid12"일 수 있다. 용어 PidZ11"과 "Pid12"는 본 명세서에서 상호 호환 가능하게 사용된다.
감소된 활성: 용어 "감소된 활성"은 본 명세서에서, 주어진 펩타이드, 예컨대, 단백질 또는 효소 활성의 전체 또는 부분적 손실을 지칭할 수 있다. 일부 경우에, 펩타이드는 결실될 수 없는 필수 유전자에 의해 암호화된다. 이러한 경우에, 펩타이드의 활성은 당업계에 알려진 방법, 예컨대, 펩타이드의 전사 또는 번역, 저해의 하향조절에 의해 감소될 수 있다. 다른 경우에, 펩타이드는 비필수 유전자에 의해 암호화되고, 활성은 감소될 수 있거나 또는, 예를 들어, 펩타이드를 암호화하는 유전자 결실의 결과로서, 완전히 상실될 수 있다. 부분적이든 또는 전체적이든, 주어진 펩타이드의 활성을 감소시키기 위해, 당업계에 알려진 방법은 상기 펩타이드를 암호화하는 유전자의 돌연변이뿐만 아니라 상기 펩타이드를 암호화하는 유전자의 전사 또는 번역에 관련된 조절 인자를 암호화하는 유전자의 돌연변이, 예를 들어, 전사 인자 유전자의 돌연변이 또는 상기 전사 인자 또는 리프레서의 증가 또는 감소된 발현을 초래하여, 결국 펩타이드를 암호화하는 유전자로부터 전사 수준을 감소시키는 전사 리프레서 유전자의 돌연변이; 예를 들어, 전사 인자 결합 부위를 제거하거나 이들을 상기 전사 인자에 접근 가능하지 않게 만드는 유전자의 천연 프로모터의 절단 또는 돌연변이; 천연 프로모터를 더 약한 프로모터로 대체하여, 펩타이드를 암호화하는 암호화 서열의 감소된 전사를 야기하는 것; 유전자의 천연 종결자의 절단 또는 돌연변이, 또는 유전자의 천연 종결자를 다른 종결자로 대체하는 것; Kozak 서열의 돌연변이를 포함한다. 다른 방법은 RNA 수준의 조절을 수반하며, RNA 간섭 시스템, 예컨대, Dicer 또는 아르고너트(Argonaute), RNA 침묵 방법, 표적화된 RNA 분해를 초래하는 CRISPR/Cas 시스템의 도입을 포함한다. 단백질 수준의 조절은 또한, 예를 들어, 저해제 또는 단백질 분해 서열을 이용하는 것에 의해 예상된다. 열거된 방법은 유도성일 수 있고, 즉, 이들은 당업계에 알려진 바와 같은 일시적 방식으로 활성화될 수 있다.
포화된: 용어 "포화된"은 이중 또는 삼중 탄소-탄소 결합이 결핍된 화합물을 지칭한다.
특이성: 주어진 기질에 대한 효소의 특이성은 상기 기질로부터 시작되는 반응을 촉매하도록 이 효소에 의해 나타나는 선호도이다. 본 개시내용에서, 헥사데칸오일-CoA(팔미토일-CoA)에 대해서보다 테트라데칸오일-CoA(미리스토일-CoA)에 대해 더 큰 특이성을 갖는 탈포화효소 및/또는 지방 아실-CoA 환원효소는 바람직하게는 기질로서 헥사데칸오일-CoA보다는 테트라데칸오일-CoA와의 반응을 촉매한다. 탈포화효소 또는 지방 아실-CoA 환원효소의 특이성을 결정하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 주어진 탈포화효소를 발현시키는 주어진 세포에서의 이러한 탈포화효소의 특이성은 최대 48시간 동안 메틸 미리스테이트를 포함하는 용액 중에서 상기 세포를 인큐베이션시키고, 이어서 생성물을 메탄올로 추출 및 에스터화함으로써 결정될 수 있다. 이어서, 얻어진 지방산 메틸 에스터의 프로파일은 GC-MS에 의해 결정될 수 있다. 미리스토일-CoA에 대해 더 높은 특이성을 갖고 팔미토일-CoA에 대해 더 낮은 특이성을 갖는 탈포화효소는, 예를 들어, (Z)9-C16:Me보다 더 높은 농도의 (Z)9-C14:Me를 생성할 것이다. 예를 들어, 주어진 세포에서 주어진 환원효소의 특이성은 최대 48시간 동안 (Z)9-미리스테이트의 메틸 에스터를 포함하는 용액 중에서 상기 환원효소를 발현시키는 세포를 인큐베이션시킨 후에, GC-MS에 의한 얻어진 지방 알코올의 추출 및 분석에 의해 결정될 수 있다. (Z)9-C14:CoA에 대해 더 높은 특이성 및 (Z)9-C16:CoA에 대해 더 낮은 특이성을 갖는 환원효소는 (Z)9-C16:OH보다 더 높은 농도의 (Z)9-C14:OH를 생성할 것이다.
역가: 화합물의 역가는 본 명세서에서 화합물의 생성된 농도를 지칭한다. 화합물이 세포에 의해 생산될 때, 상기 용어는 세포에 의해 생산되는 총 농도, 즉, 화합물의 총량을 배양 배지의 용적으로 나눈 것을 지칭한다. 이는, 특히 휘발성 화합물의 경우, 역가가 배양 배지로부터 증발될 수 있는 화합물 일부를 포함하고, 따라서 발효 브로스로부터 그리고 발효기로부터의 잠재적 오프 가스로부터 생성된 화합물을 수집함으로써 결정된다는 것을 의미한다.
E12 탈포화 화합물의 생산
본 발명자들은 효모 세포에서 이종성 Δ12 탈포화효소의 발현이 12번 위치에 이중결합을 갖는 지방 아실-CoA의 생산을 초래한다는 것을 발견하였다. 본 명세서에 개시된 이종성 Δ12 탈포화효소는 적어도 13의 탄소 사슬 길이를 갖는 탈포화 또는 포화 지방 아실-CoA에서 12번 위치에 이중결합, 선택적으로 12번 위치 이외의 위치에 이중결합을 도입할 수 있다. 탈포화효소가 12번 위치에 이중결합을 도입할 수 있는 출발 물질은 포화 화합물, 또는 12번 위치가 아닌 위치에 이중결합을 이미 포함하는 탈포화 화합물일 수 있다. 바람직하게는, 출발 화합물은 9번 위치에 이중결합을 포함하는 탈포화 지방 아실-CoA이다. Δ12 탈포화효소는 12번 위치에 이중결합 이외의 추가 이중결합을 도입할 수 있다.
따라서, 본 명세서에서 n'개의 이중결합(들)을 갖는 탈포화 지방 아실-CoA를 생산할 수 있는 효모 세포가 제공되되, 상기 이중결합(들) 중 적어도 하나는 12번 위치에 있고, 상기 효모 세포는 Δ12 이종성 지방 아실-CoA 탈포화효소를 발현시키고, 상기 탈포화효소는 적어도 13개의 탄소 사슬 길이를 갖고 n개의 이중결합(들)을 갖는 포화 또는 탈포화 지방 아실-CoA의 12번 위치에 이중결합을 도입할 수 있고,
n 및 n'는 정수이며,
0 ≤ n ≤ 3이고, 1 ≤ n' ≤ 4이다.
또한 이종성 Δ12 탈포화효소를 발현시키는 효모 세포가 제공되되, 상기 탈포화효소는 적어도 13의 탄소 사슬 길이를 갖고 n개의 이중결합(들)을 갖는 포화 또는 탈포화 지방 아실-CoA에서 12번 위치에 이중결합을 도입하여, n'개의 이중결합(들)을 갖는 탈포화 지방 아실-CoA를 생산할 수 있되, 상기 이중결합(들) 중 적어도 하나는 12번 위치에 있고,
n 및 n'는 정수이며,
0 ≤ n ≤ 3이고, 1 ≤ n' ≤ 4이다.
바람직한 실시형태에서, 적어도 13개의 탄소 사슬 길이를 갖고 n개의 이중결합(들)을 갖는 포화 또는 탈포화 지방 아실-CoA는 14개 길이의 탄소 사슬을 갖는 탈포화 지방 아실-CoA, 예컨대, (Z9)-테트라데센오일-CoA이다.
추가로 본 명세서에서 (Z9, E12)-테트라데카다이엔오일-CoA를 생산할 수 있는 효모 세포가 제공되되, 상기 효모 세포는,
i) 테트라데칸오일-CoA에서 9번 위치에 제1 이중결합을 도입하여, 상기 테트라데칸오일-CoA를 (Z9)-테트라데센오일-CoA로 전환시킬 수 있는, 적어도 1종의 추가 이종성 탈포화효소; 및
ii) (Z9)-테트라데센오일-CoA에서 12번 위치에 제2 이중결합을 도입하여, (Z9)-테트라데센오일-CoA를 (Z9, E12)-테트라데카다이엔오일-CoA로 전환시킬 수 있는, 적어도 1종의 이종성 Δ12 탈포화효소
를 발현시킨다.
또한 본 명세서에서 탈포화 지방 아실-CoA를 생산할 수 있는 효모 세포가 제공되되, 상기 효모 세포는 지방 아실-CoA에서 12번 위치에 트랜스-이중결합을 도입하여, 지방 아실-CoA를 탈포화 E12-지방 아실-CoA로 전환시킬 수 있는 Pid12(서열번호 2) 탈포화효소, EcauDes12(서열번호 55) 탈포화효소, Ee_d12(서열번호 87) 탈포화효소 또는 Eku_d12(서열번호 85) 탈포화효소를 발현시킨다. EcauDes12 탈포화효소는 Ecau_D4(Ding et al., 2021)로도 알려져 있다.
탈포화효소
본 발명에서, 용어 '지방 아실-CoA 탈포화효소', '탈포화효소', '지방 아실 탈포화효소' 및 'FAD'는 호환 가능하게 사용될 것이다. 상기 용어는 일반적으로 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 또는 22개의 탄소 원자의 사슬 길이를 갖는 아실-CoA에서 E/Z 입체배치에 적어도 1개의 이중결합을 도입할 수 있는 효소를 지칭한다. 이중결합은 임의의 위치에 도입될 수 있다. 예를 들어, 12번 위치에 이중결합을 도입하는 탈포화효소는 Δ12 탈포화효소로 지칭된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 탈포화효소는 지방 아실-CoA의 여러 위치에, 예컨대, 12번 위치에 그리고 9번 위치에 이중결합을 도입할 수 있다.
탈포화효소는 하기 반응을 촉매한다:
지방 아실-CoA + 2 페로사이토크롬 b5 + O(2) + 2 H(+) <=> 탈포화 지방 아실-CoA + 2 페리사이토크롬 b5 + 2 H(2)O
이종성 Δ12 탈포화효소 및 선택적으로 다른 이종성 탈포화효소를 발현시키는 효모 세포가 본 명세서에 제공된다.
Δ12 탈포화효소
본 명세서에서 13개 이상의 탄소 사슬 길이를 갖는 지방 아실-CoA의 12번 위치에 이중결합을 도입할 수 있는 Δ12 탈포화효소가 본 명세서에 개시되고, 효모 세포에서 발현될 때 상기 효모 세포가 12번 위치에 이중결합을 갖는 탈포화 지방 아실-CoA를 생산하는 것을 가능하게 한다. 이종성 Δ12 탈포화효소는 탈포화 또는 포화 지방 아실-CoA에서 12번 위치에 이중결합을 도입할 수 있다. 다시 말해서, Δ12 탈포화효소는 12번 위치 이외의 하나 이상의 위치에 이중결합을 갖지 않거나 하나 이상의 이중결합을 갖는 지방 아실-CoA의 12번 위치에, 예를 들어, 8, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 및 21번 위치로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 이중결합을 도입할 수 있다. 일 실시형태에서, Δ12 탈포화효소는 9번 위치에 이중결합을 갖지 않거나 적어도 하나의 이중결합을 갖는 지방 아실-CoA의 12번 위치에 이중결합을 도입할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 이종성 Δ12 탈포화효소는 탈포화 지방 아실-CoA, 예컨대, 9번 위치에 이중결합을 갖는 지방 아실-CoA의 12번 위치에 이중결합을 도입할 수 있다.
일부 실시형태에서, Δ12 탈포화효소는 12번 위치에 적어도 하나의 이중결합을 도입할 수 있고, 또한 지방 아실-CoA 추가 위치에, 예컨대 12번 위치 이외의 임의의 다른 위치에 적어도 하나의 추가 이중 결합을 도입할 수 있다. 다시 말해서, Δ12 탈포화효소는 12번 위치에 그리고 8, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 및 21번 위치로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나 이상의 위치에 이중결합을 도입할 수 있다. 일 실시형태에서, Δ12 탈포화효소는 지방 아실-CoA의 12번 위치에 그리고 9번 위치에 이중결합을 도입할 수 있다.
일 실시형태에서, 이종성 Δ12 탈포화효소는 카드라(Cadra), 플로디아(Plodia), 에페스티아(Ephestia), 마리아르파(Maliarpha) 및 아모르비아(Amorbia)로 이루어진 군으로부터 선택된 속의 유기체에 대해 천연이다. 일 실시형태에서, 이종성 Δ12 탈포화효소는 카드라 카우텔라, 에페스티아 엘루텔라(Ephestia elutella), 에페스티아 쿠에니엘라, 플로디아 인터푼텔라, 마리아르파 세파라텔라(Maliarpha separatella) 및 아모르비아 쿠네아나(Amorbia cuneana)로 이루어진 군으로부터 선택된 종의 유기체에 대해 천연이다. 바람직한 실시형태에서, 이종성 Δ12 탈포화효소는 플로디아 탈포화효소, 예컨대, 플로디아 인터푼텔라 탈포화효소이다. 카드라 카우텔라는 에페스티아 카우텔라(Ephestia cautella)로도 알려지고 지칭된다.
일 실시형태에서, Δ12 탈포화효소는 플로디아 Δ12 탈포화효소이다. 일 실시형태에서, 탈포화효소는 플로디아 인터푼텔라 Δ12 탈포화효소, 예컨대, 서열번호 2에 제시된 Δ12 탈포화효소(Pid12)이다. 일부 실시형태에서, Δ12 탈포화효소는 서열번호 2에 제시된 바와 같은 Pid12 Δ12 탈포화효소와 적어도 60% 동일성 또는 유사성, 예컨대, 적어도 61%, 예컨대, 적어도 62%, 예컨대, 적어도 63%, 예컨대, 적어도 64%, 예컨대, 적어도 65%, 예컨대, 적어도 66%, 예컨대, 적어도 67%, 예컨대, 적어도 68%, 예컨대, 적어도 69%, 예컨대, 적어도 70%, 예컨대, 적어도 71%, 예컨대, 적어도 72%, 예컨대, 적어도 73%, 예컨대, 적어도 74%, 예컨대, 적어도 75%, 예컨대, 적어도 76%, 예컨대, 적어도 77%, 예컨대, 적어도 78%, 예컨대, 적어도 79%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 81%, 예컨대, 적어도 82%, 예컨대, 적어도 83%, 예컨대, 적어도 84%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 86%, 예컨대, 적어도 87%, 예컨대, 적어도 88%, 예컨대, 적어도 89%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%, 예컨대, 100% 동일성 또는 유사성을 갖는 플로디아 Δ12 탈포화효소의 기능적 변이체, 플로디아 인터푼텔라 Δ12 탈포화효소의 기능적 변이체, 또는 서열번호 2(Pid12)에 제시된 바와 같은 Δ12 탈포화효소의 기능적 변이체이다. 이론으로 구속되는 일 없이, Pid12 Δ12 탈포화효소는 적어도 13의 탄소 사슬 길이를 갖는 지방 아실-CoA에 단일 이중결합을 도입하되, 상기 단일 이중결합은 12번 위치에 있다.
이종성 Δ12 탈포화효소를 암호화하는 유전자는 당업계에 알려진 바와 같이, 탈포화효소를 발현시키는 효모 세포에 대해 코돈-최적화될 수 있다. 탈포화효소가 세포에서 발현되는지의 여부를 결정하는 방법은 당업자에게 알려져 있으며, 본 명세서에서 위에 기재되는 바와 같이 그리고 아래의 실시예에 예시되는 바와 같이, 예를 들어, 주어진 기질로부터 주어진 생성물의 검출을 포함한다.
추가로 본 명세서에서 포화 또는 탈포화 지방 아실-CoA에서 12번 위치에 적어도 하나의 이중결합을 도입하는 방법에서의, 플로디아 인터푼텔라 탈포화효소의 용도가 제공된다. 일부 실시형태에서, 플로디아 인터푼텔라 탈포화효소는 지방 아실-CoA에서 12번 위치에 단일 이중결합을 도입한다. 일부 실시형태에서, 플로디아 인터푼텔라 탈포화효소는 Pid12(서열번호 2)이거나, 또는 이와 적어도 70% 유사성 또는 동일성, 예컨대, 이와 적어도 80%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%, 예컨대, 100% 유사성 또는 동일성을 갖는 기능적 변이체이다.
일 실시형태에서, 상기 방법은 시험관내에서, 예를 들어, 위에 기재된 바와 같은 탈포화효소, 특히 서열번호 2에 제시된 바와 같은 Pid12 탈포화효소, 또는 이와 적어도 70% 유사성 또는 동일성을 갖는 기능적 변이체를 제공하는 단계, 및 상기 탈포화효소를 포화 또는 탈포화 지방 아실-CoA와 접촉시키는 단계에 의해 수행된다. 탈포화효소는 당업계에 알려진 바와 같이 상기 탈포화효소를 발현시키는 세포로부터 정제될 수 있다. 일 실시형태에서, 상기 방법은 생체내에서, 바람직하게는 본 명세서에서 부문 "효모 세포"에 정의된 바와 같은 효모 세포에서 수행된다.
일 실시형태에서, Δ12 탈포화효소는 카드라 Δ12 탈포화효소이다. 일 실시형태에서, 탈포화효소는 카드라 카우텔라 Δ12 탈포화효소, 예컨대, 서열번호 55에 제시된 바와 같은 Δ12 탈포화효소(EcauDes12)이다. 일부 실시형태에서, Δ12 탈포화효소는 서열번호 55에 제시된 바와 같은 EcauDes12 Δ12 탈포화효소와 적어도 60% 동일성 또는 유사성, 예컨대, 적어도 61%, 예컨대, 적어도 62%, 예컨대, 적어도 63%, 예컨대, 적어도 64%, 예컨대, 적어도 65%, 예컨대, 적어도 66%, 예컨대, 적어도 67%, 예컨대, 적어도 68%, 예컨대, 적어도 69%, 예컨대, 적어도 70%, 예컨대, 적어도 71%, 예컨대, 적어도 72%, 예컨대, 적어도 73%, 예컨대, 적어도 74%, 예컨대, 적어도 75%, 예컨대, 적어도 76%, 예컨대, 적어도 77%, 예컨대, 적어도 78%, 예컨대, 적어도 79%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 81%, 예컨대, 적어도 82%, 예컨대, 적어도 83%, 예컨대, 적어도 84%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 86%, 예컨대, 적어도 87%, 예컨대, 적어도 88%, 예컨대, 적어도 89%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%, 예컨대, 100% 동일성 또는 유사성을 갖는, 카드라 Δ12 탈포화효소의 기능적 변이체, 카드라 카우텔라 Δ12 탈포화효소의 기능적 변이체 또는 서열번호 55에 제시된 바와 같은 Δ12 탈포화효소의 기능적 변이체(EcauDes12)이다. 이론으로 구속되는 일 없이, EcauDes12 Δ12 탈포화효소는 적어도 13의 탄소 사슬 길이를 갖는 지방 아실-CoA에 단일 이중결합을 도입하되, 상기 단일 이중결합은 12번 위치에 있다.
추가로 본 명세서에서 포화 또는 탈포화 지방 아실-CoA에서 12번 위치에 적어도 하나의 이중결합을 도입하는 방법에서의, 카드라 카우텔라 탈포화효소의 용도가 제공된다. 일부 실시형태에서, 카드라 카우텔라 탈포화효소는 지방 아실-CoA에서 12번 위치에 단일 이중결합을 도입한다. 일부 실시형태에서, 카드라 카우텔라 탈포화효소는 서열번호 55(EcauDes12)이거나, 또는 이와 적어도 70% 유사성 또는 동일성, 예컨대, 이와 적어도 80%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%, 예컨대, 100% 유사성 또는 동일성을 갖는 기능적 변이체이다.
일 실시형태에서, 상기 방법은 시험관내에서, 예를 들어, 위에 기재된 바와 같은 탈포화효소, 특히 서열번호 55에 제시된 바와 같은 EcauDes12 탈포화효소, 또는 이와 적어도 70% 유사성 또는 동일성을 갖는 기능적 변이체를 제공하는 단계, 및 상기 탈포화효소를 포화 또는 탈포화 지방 아실-CoA와 접촉시키는 단계에 의해 수행된다. 탈포화효소는 당업계에 알려진 바와 같이 상기 탈포화효소를 발현시키는 세포로부터 정제될 수 있다. 일 실시형태에서, 상기 방법은 생체내에서, 바람직하게는 본 명세서에서 부문 "효모 세포"에 정의된 바와 같은 효모 세포에서 수행된다.
일 실시형태에서, Δ12 탈포화효소는 에페스티아 Δ12 탈포화효소이다. 일 실시형태에서, 탈포화효소는 에페스티아 쿠에니엘라 Δ12 탈포화효소, 예컨대, 서열번호 85에 제시된 바와 같은 Δ12 탈포화효소(Eku_d12)이다. 일 실시형태에서, 탈포화효소는 에페스티아 엘루텔라 Δ12 탈포화효소, 예컨대, 서열번호 87에 제시된 바와 같은 Δ12 탈포화효소(Ee_d12)이다. 일부 실시형태에서, Δ12 탈포화효소는 서열번호 85에 제시된 바와 같은 Eku_d12 Δ12 탈포화효소 또는 서열번호 87에 제시된 바와 같은 Ee_d12 Δ12 탈포화효소와 적어도 60% 동일성 또는 유사성, 예컨대, 적어도 61%, 예컨대, 적어도 62%, 예컨대, 적어도 63%, 예컨대, 적어도 64%, 예컨대, 적어도 65%, 예컨대, 적어도 66%, 예컨대, 적어도 67%, 예컨대, 적어도 68%, 예컨대, 적어도 69%, 예컨대, 적어도 70%, 예컨대, 적어도 71%, 예컨대, 적어도 72%, 예컨대, 적어도 73%, 예컨대, 적어도 74%, 예컨대, 적어도 75%, 예컨대, 적어도 76%, 예컨대, 적어도 77%, 예컨대, 적어도 78%, 예컨대, 적어도 79%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 81%, 예컨대, 적어도 82%, 예컨대, 적어도 83%, 예컨대, 적어도 84%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 86%, 예컨대, 적어도 87%, 예컨대, 적어도 88%, 예컨대, 적어도 89%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%, 예컨대, 100% 동일성 또는 유사성을 갖는 에페스티아 Δ12 탈포화효소의 기능적 변이체, 에페스티아 쿠에니엘라 Δ12 탈포화효소의 기능적 변이체, 에페스티아 엘루텔라 Δ12 탈포화효소의 기능적 변이체, 또는 서열번호 85(Eku_d12) 또는 서열번호 87(Ee_d12)에 제시된 바와 같은 Δ12 탈포화효소의 기능적 변이체이다. 이론으로 구속되는 일 없이, Eku_d12 Δ12 탈포화효소 및 Ee_d12 Δ12 탈포화효소는 적어도 13의 탄소 사슬 길이를 갖는 지방 아실-CoA에 단일 이중결합을 도입하되, 상기 단일 이중결합은 12번 위치에 있다.
추가로 본 명세서에서 포화 또는 탈포화 지방 아실-CoA에서 12번 위치에 적어도 하나의 이중결합을 도입하는 방법에서의, 에페스티아 쿠에니엘라 탈포화효소의 용도가 제공된다. 일부 실시형태에서, 에페스티아 쿠에니엘라 탈포화효소는 지방 아실-CoA에서 12번 위치에 단일 이중결합을 도입한다. 일부 실시형태에서, 에페스티아 쿠에니엘라 탈포화효소는 Eku_d12(서열번호 85)이거나, 또는 이와 적어도 70% 유사성 또는 동일성, 예컨대, 이와 적어도 80%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%, 예컨대, 100% 유사성 또는 동일성을 갖는 기능적 변이체이다.
추가로 본 명세서에서 포화 또는 탈포화 지방 아실-CoA에서 12번 위치에 적어도 하나의 이중결합을 도입하는 방법에서의, 에페스티아 엘루텔라 탈포화효소의 용도가 제공된다. 일부 실시형태에서, 에페스티아 엘루텔라 탈포화효소는 지방 아실-CoA에서 12번 위치에 단일 이중결합을 도입한다. 일부 실시형태에서, 에페스티아 엘루텔라 탈포화효소는 Eku_d12(서열번호 87)이거나, 또는 이와 적어도 70% 유사성 또는 동일성, 예컨대, 이와 적어도 80%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%, 예컨대, 100% 유사성 또는 동일성을 갖는 기능적 변이체이다.
일 실시형태에서, 상기 방법은 시험관내에서, 예를 들어, 위에 기재된 바와 같은 탈포화효소, 특히 서열번호 85에 제시된 바와 같은 Eku_d12 탈포화효소 또는 서열번호 87에 제시된 바와 같은 Ee_d12 탈포화효소, 또는 이와 적어도 70% 유사성 또는 동일성을 갖는 기능적 변이체를 제공하는 단계, 및 상기 탈포화효소를 포화 또는 탈포화 지방 아실-CoA와 접촉시키는 단계에 의해 수행된다. 탈포화효소는 당업계에 알려진 바와 같이 상기 탈포화효소를 발현시키는 세포로부터 정제될 수 있다. 일 실시형태에서, 상기 방법은 생체내에서, 바람직하게는 본 명세서에서 부문 "효모 세포"에 정의된 바와 같은 효모 세포에서 수행된다.
본 효모 세포는 적어도 1종의 이종성 Δ12 탈포화효소를 발현시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포는 1종의 이종성 Δ12 탈포화효소를 발현시킨다. 그러나, 동일 또는 상이할 수 있는 여러 이종성 Δ12 탈포화효소, 예컨대, 동일 또는 상이할 수 있는 적어도 2종의 이종성 Δ12 탈포화효소를 발현시키는 것이 바람직할 수 있다. 대안적으로, 적어도 1종의 이종성 Δ12 탈포화효소를 암호화하는 핵산의 여러 복제물, 예컨대, 적어도 2개의 복제물, 예컨대, 적어도 3종 이상의 복제물을 발현시키는 것이 바람직할 수 있다. 다른 실시형태에서, 세포는 적어도 2종의 이종성 Δ12 탈포화효소, 예를 들어, 3종의 이종성 Δ12 탈포화효소를 발현시킨다.
일부 실시형태에서, Δ12 탈포화효소는 적어도 2종의 상이한 단백질로부터의 아미노산 서열을 포함하는 Δ12 탈포화효소, 예컨대, 2종의 상이한 탈포화효소, 예컨대, 3종의 상이한 탈포화효소의 기능성 변이체. 이러한 기능적 변이체는, 예를 들어, Δ12 탈포화효소의 융합 단백질, 예컨대, 모자이크 또는 키메라 단백질일 수 있다. 바람직하게는, Δ12 탈포화효소의 이러한 기능적 변이체에 포함된 아미노산 서열 중 적어도 하나는 Δ12 탈포화효소로부터 유래된다. 따라서, 일부 실시형태에서, Δ12 본 명세서에 개시된 탈포화효소는 Δ12 탈포화효소로부터의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 Δ12 탈포화효소 및 적어도 1종의 다른 탈포화효소, 예컨대, Δ9 탈포화효소로부터의 적어도 하나의 아미노산 서열, 예컨대, 2개 이상의 아미노산 서열의 기능적 변이체이다. 다른 실시형태에서, Δ12 탈포화효소의 기능적 변이체는 Δ12 탈포화효소로부터의 아미노산 서열 및 적어도 1종의 다른 탈포화효소로부터의 적어도 2개의 아미노산 서열, 예컨대, Δ9 탈포화효소, Δ11 탈포화효소, 2종의 Δ9 탈포화효소, 2종의 Δ11 탈포화효소 또는 그 이상의 탈포화효소를 포함하거나, 이들로 이루어진다. 추가적인 다른 실시형태에서, Δ12 탈포화효소의 기능적 변이체가 2종의 상이한 Δ12 탈포화효소로부터의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지도록, 본 명세서에 개시된 Δ12 탈포화효소는 Δ12 탈포화효소로부터 유래된 아미노산 서열 및 다른 Δ12 탈포화효소로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하는 Δ12 탈포화효소의 기능적 변이체이다.
일부 실시형태에서, Δ12 탈포화효소 및 적어도 1종의 다른 탈포화효소, 예컨대, Δ9, Δ11 및/또는 Δ12 탈포화효소는 동일한 종으로부터 유래된다. 다시 말해서, Δ12 탈포화효소의 기능적 변이체는 Δ12 탈포화효소 및 동일한 종에 대해 천연인 적어도 1종의 다른 탈포화효소로부터의 아미노산 서열, 예컨대, Δ12 탈포화효소로부터의 아미노산 서열 및 Δ11 탈포화효소로부터의 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어지되, 상기 Δ12 탈포화효소와 Δ11 탈포화효소는 둘 다 플로디아 인터푼텔라로부터 유래된다. 다른 실시형태에서, Δ12 탈포화효소 및 적어도 1종의 다른 탈포화효소는 2개의 상이한 종, 3개의 상이한 종, 또는 더 많은 상이한 종으로부터 유래된다. 다시 말해서, Δ12 탈포화효소의 기능적 변이체는 Δ12 탈포화효소 및 적어도 2종의 상이한 종에 대해 천연인 적어도 1종의 다른 탈포화효소로부터의 아미노산 서열, 예컨대, 플로디아 인터푼텔라 Δ12 탈포화효소로부터의 아미노산 서열 및 카드라 카우텔라 Δ12 탈포화효소로부터의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이루어진다.
일부 실시형태에서, Δ12 탈포화효소의 기능적 변이체는 1종의 탈포화효소로부터의 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어지되, 상기 1종의 탈포화효소의 말단 중 적어도 하나는 대체되었고, 예컨대, 다른 탈포화효소의 말단, 예컨대, 다른 탈포화효소의 상응하는 말단으로 교환되었다. 본 명세서의 상기 1종의 탈포화효소의 N-말단의 상응하는 말단은 상기 다른 탈포화효소의 N-말단을 지칭하고, 동일한 용어가 C-말단에 적용된다. 당업자는 탈포화효소의 다수의 말단이 이들의 천연 서열에 대해 변화될 수 있는 한편, 상기 효소의 기능은 보존되며, 효소가 이의 활성을 느슨하게 하는 일 없이 상기 효소의 기능이 보존된다는 것이 이해될 것이다. 대조적으로, 촉매 부위를 포함하는 잔기 및/또는 효소의 촉매 활성에 중요한 잔기를 변경하는 것은 상기 효소의 기능 및/또는 촉매 활성을 방해하거나 변경하지 않고는 불가능할 수도 있다. 말단에 대해, 당업자는 효소의 특징 및/또는 기능을 보존하기 위해 말단의 가요성, 소수성 및/또는 친수성을 유지하는 데 중요할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 효소가 말단 중 적어도 하나를 통해, 예컨대, 막에 대해 고정(함입 및/또는 삽입으로도 알려짐)되는 경우, 이의 말단의 동일 또는 유사한 소수성을 유지하는 것이 중요할 수 있다.
따라서, 일부 실시형태에서, Δ12 탈포화효소의 기능적 변이체는 이의 천연 N- 및/또는 C-말단에서 제거되고, 다른 탈포화효소, 예컨대, 다른 Δ12 탈포화효소, Δ9 탈포화효소 또는 Δ11 탈포화효소의 N- 및/또는 C-말단에 융합된 Δ12 탈포화효소로부터의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 실시형태에서, Δ12 탈포화효소의 기능적 변이체는 Δ12 탈포화효소의 아미노산 서열의 일부를 포함하거나 이것으로 이루어지되, 상기 Δ12 탈포화효소의 60개의 N-말단 아미노산 잔기는 결실되거나 또는 적어도 1종의 다른 탈포화효소로부터의 아미노산으로 치환되고, 예컨대, 상기 Δ12 탈포화효소의 50개의 N-말단 아미노산 잔기는 결실되거나 또는 적어도 1종의 다른 탈포화효소로부터의 아미노산 서열로 치환되고, 예컨대, 상기 Δ12 탈포화효소의 40개의 N-말단 아미노산 잔기는 결실되거나 또는 적어도 1종의 다른 탈포화효소로부터의 아미노산 서열로 치환되고, 예컨대, 상기 Δ12 탈포화효소의 35개의 N-말단 아미노산 잔기는 결실되거나 또는 적어도 1종의 다른 탈포화효소로부터의 아미노산 서열로 치환되고, 예컨대, 상기 Δ12 탈포화효소의 30개의 N-말단 아미노산 잔기는 결실되거나 또는 적어도 1종의 다른 탈포화효소로부터의 아미노산 서열로 치환되고, 예컨대, 상기 Δ12 탈포화효소의 25개의 N-말단 아미노산 잔기는 결실되거나 또는 적어도 1종의 다른 탈포화효소로부터의 아미노산 서열로 치환되고, 예컨대, 상기 Δ12 탈포화효소의 20개의 N-말단 아미노산 잔기는 결실되거나 또는 적어도 1종의 다른 탈포화효소로부터의 아미노산 서열로 치환되고, 예컨대, 상기 Δ12 탈포화효소의 15개의 N-말단 아미노산 잔기는 결실되거나 또는 적어도 1종의 다른 탈포화효소로부터의 아미노산 서열로 치환되고, 예컨대, 상기 Δ12 탈포화효소의 10개의 N-말단 아미노산 잔기는 결실되거나 또는 적어도 1종의 다른 탈포화효소로부터의 아미노산 서열로 치환되고, 예컨대, 상기 Δ12 탈포화효소의 5개의 N-말단 아미노산 잔기는 결실되거나 또는 적어도 1종의 다른 탈포화효소로부터의 아미노산 서열로 치환되고, 예컨대, 상기 Δ12 탈포화효소의 1 내지 55개의 N-말단 아미노산 잔기는 결실되거나 또는 적어도 1종의 다른 탈포화효소로부터의 아미노산 서열로 치환되고, 예컨대, 상기 Δ12 탈포화효소의 5 내지 45개의 N-말단 아미노산 잔기는 결실되거나 또는 적어도 1종의 다른 탈포화효소로부터의 아미노산 서열로 치환되고, 예컨대, 상기 Δ12 탈포화효소의 10 내지 40개의 N-말단 아미노산 잔기는 결실되거나 또는 적어도 1종의 다른 탈포화효소로부터의 아미노산 서열로 치환되고, 예컨대, 상기 Δ12 탈포화효소의 15 내지 35개의 N-말단 아미노산 잔기는 결실되거나 또는 적어도 1종의 다른 탈포화효소로부터의 아미노산 서열로 치환되고, 예컨대, 상기 Δ12 탈포화효소의 20 내지 35개의 N-말단 아미노산 잔기는 결실되거나 또는 적어도 1종의 다른 탈포화효소로부터의 아미노산 서열로 치환되고, 예컨대, 상기 Δ12 탈포화효소의 25 내지 35개의 N-말단 아미노산 잔기는 결실되거나 또는 적어도 1종의 다른 탈포화효소로부터의 아미노산 서열로 치환되고,
그리고/또는
상기 Δ12 탈포화효소의 50개의 C-말단의 아미노산 잔기는 결실되거나 또는 적어도 1종의 다른 탈포화효소로부터의 아미노산 서열로 치환되고, 예컨대, 상기 Δ12 탈포화효소의 40개의 C-말단의 아미노산 잔기는 결실되거나 또는 적어도 1종의 다른 탈포화효소로부터의 아미노산 서열로 치환되고, 예컨대, 상기 Δ12 탈포화효소의 35개의 C-말단의 아미노산 잔기는 결실되거나 또는 적어도 1종의 다른 탈포화효소로부터의 아미노산 서열로 치환되고, 예컨대, 상기 Δ12 탈포화효소의 30개의 C-말단의 아미노산 잔기는 결실되거나 또는 적어도 1종의 다른 탈포화효소로부터의 아미노산 서열로 치환되고, 예컨대, 상기 Δ12 탈포화효소의 25개의 C-말단의 아미노산 잔기는 결실되거나 또는 적어도 1종의 다른 탈포화효소로부터의 아미노산 서열로 치환되고, 예컨대, 상기 Δ12 탈포화효소의 20개의 C-말단의 아미노산 잔기는 결실되거나 또는 적어도 1종의 다른 탈포화효소로부터의 아미노산 서열로 치환되고, 예컨대, 상기 Δ12 탈포화효소의 15개의 C-말단의 아미노산 잔기는 결실되거나 또는 적어도 1종의 다른 탈포화효소로부터의 아미노산 서열로 치환되고, 예컨대, 상기 Δ12 탈포화효소의 10개의 C-말단의 아미노산 잔기는 결실되거나 또는 적어도 1종의 다른 탈포화효소로부터의 아미노산 서열로 치환되고, 예컨대, 상기 Δ12 탈포화효소의 1 내지 55개의 C-말단의 아미노산 잔기는 결실되거나 또는 적어도 1종의 다른 탈포화효소로부터의 아미노산 서열로 치환되고, 예컨대, 상기 Δ12 탈포화효소의 5 내지 45개의 C-말단의 아미노산 잔기는 결실되거나 또는 적어도 1종의 다른 탈포화효소로부터의 아미노산 서열로 치환되고, 예컨대, 상기 Δ12 탈포화효소의 10 내지 40개의 C-말단의 아미노산 잔기는 결실되거나 또는 적어도 1종의 다른 탈포화효소로부터의 아미노산 서열로 치환되고, 예컨대, 상기 Δ12 탈포화효소의 15 내지 35개의 C-말단의 아미노산 잔기는 결실되거나 또는 적어도 1종의 다른 탈포화효소로부터의 아미노산 서열로 치환되고, 예컨대, 상기 Δ12 탈포화효소의 20 내지 35개의 C-말단의 아미노산 잔기는 결실되거나 또는 적어도 1종의 다른 탈포화효소로부터의 아미노산 서열로 치환되고, 예컨대, 상기 Δ12 탈포화효소의 25 내지 35개의 C-말단의 아미노산 잔기는 결실되거나 또는 적어도 1종의 다른 탈포화효소로부터의 아미노산 서열로 치환된다. 바람직한 실시형태에서, 상기 Δ12 탈포화효소는 서열번호 2(Pid12), 서열번호 55(EcauDes12), 서열번호 85(Eku_d12) 또는 서열번호 87(Ee_d12)에 제시된 Δ12 탈포화효소로부터 선택된다.
바람직하게는, Δ12 탈포화효소의 기능적 변이체에서, 결실된 C- 또는 N-말단 잔기가 다른 탈포화효소로부터의 아미노산 잔기와 동일하거나 거의 동일한 양으로 치환되므로, 예를 들어, Δ12 탈포화효소의 기능적 변이체에서, 30개의 N-말단의 아미노산이 결실되는 경우에, 상기 30개의 아미노산이 Δ11 탈포화효소와 같은 다른 탈포화효소로부터의 20 내지 40개 범위의 N-말단 아미노산 잔기, 예컨대, 다른 탈포화효소로부터의 25 내지 35개 범위의 N-말단 아미노산 잔기, 예컨대, 다른 탈포화효소로부터의 28 내지 32개 범위의 N-말단 아미노산 잔기로 치환된다. 따라서, 예를 들어, Δ12 탈포화효소의 기능적 변이체에서, 30개의 N-말단의 아미노산이 결실되는 경우에, 상기 30개의 아미노산이 Δ11 탈포화효소와 같은 다른 탈포화효소로부터의 20 내지 40개 범위의 C-말단 아미노산 잔기, 예컨대, 다른 탈포화효소로부터의 25 내지 35개 범위의 C-말단 아미노산 잔기, 예컨대, 다른 탈포화효소로부터의 28 내지 32개 범위의 C-말단 아미노산 잔기로 치환된다.
N-말단의 잔기는 본 명세서에서 단백질의 아미노산 서열의 첫 번째 잔기로서 정의되므로, 단백질의 N-말단의 X개의 아미노산 잔기를 결실 또는 대체하는 것이 상기 단백질의 X개의 첫 번째 아미노산을 결실 또는 대체하는 것을 지칭한다. 다시 말해서, 300개 아미노산의 단백질의 N-말단의 30개의 아미노산 잔기를 결실 또는 대체하는 것은 상기 단백질의 아미노산의 1 내지 30개를 결실 또는 대체하는 것을 지칭한다.
C-말단의 잔기는 본 명세서에서 단백질의 아미노산 서열의 마지막 잔기로서 정의되므로, 단백질의 C-말단의 X개의 아미노산 잔기를 결실 또는 대체하는 것이 상기 단백질의 X개의 마지막 아미노산을 결실 또는 대체하는 것을 지칭한다. 다시 말해서, 300개 아미노산의 단백질의ㅊ C-말단의 30개의 아미노산 잔기를 결실 또는 대체하는 것은 상기 단백질의 아미노산의 271 내지 300개를 결실 또는 대체하는 것을 지칭한다.
일부 실시형태에서, Δ12 탈포화효소의 기능적 변이체는 탈포화효소로부터의 아미노산 서열, 예컨대, 서열번호 2(Pid12), 서열번호 55(EcauDes12), 서열번호 85(Eku_d12) 또는 서열번호 87(Ee_d12)을 포함하거나 이들로 이루어지되, 적어도 1개의 아미노산 잔기는 결실되거나, 삽입되거나 또는 다른 아미노산 잔기로 치환되었다. 결실, 삽입 또는 치환은 서열의 C-말단 또는 N-말단에서 찾을 수 있다.
일부 실시형태에서, 서열번호 2(Pid12), 서열번호 55(EcauDes12), 서열번호 85(Eku_d12) 및 서열번호 87(Ee_d12) 중 적어도 하나로부터 선택된 서열과 같은 서열의 N-말단 아미노산 잔기 1 내지 50개, 예컨대, 1 내지 40개, 예컨대, 1 내지 30개, 예컨대, 1 내지 20개 중 적어도 하나는 결실되거나, 삽입되거나 또는 다른 아미노산 잔기로 치환되었다.
일부 실시형태에서, 서열번호 2(Pid12), 서열번호 55(EcauDes12), 서열번호 85(Eku_d12) 및 서열번호 87(Ee_d12)로부터 선택된 서열과 같은 서열의 C-말단의 아미노산 잔기 250 내지 400, 예컨대, 260 내지 390, 예컨대, 270 내지 380, 예컨대, 280 내지 370, 예컨대, 290 내지 350, 예컨대, 300 내지 350 중 적어도 하나는 결실되거나, 삽입되거나 또는 다른 아미노산 잔기로 치환되었다. 일부 실시형태에서, 서열번호 2(Pid12), 서열번호 55(EcauDes12), 서열번호 85(Eku_d12) 및 서열번호 87(Ee_d12)와 같은 서열의 아미노산 잔기 290 내지 400, 예컨대, 290 내지 390, 예컨대, 290 내지 380, 예컨대, 290 내지 370, 예컨대, 290 내지 350 중 적어도 하나는 결실되거나, 삽입되거나, 또는 아미노산 잔기로 치환된다. 일부 실시형태에서, 서열번호 2(Pid12), 서열번호 55(EcauDes12), 서열번호 85(Eku_d12) 및 서열번호 87(Ee_d12)와 같은 서열의 아미노산 잔기 302 내지 348 중 적어도 하나는 결실되거나, 삽입되거나, 또는 아미노산 잔기로 치환된다.
일부 실시형태에서, Δ12 탈포화효소의 기능적 변이체는 플로디아 인터푼텔라 Δ12 탈포화효소로부터의 아미노산 서열, 및 다른 플로디아 인터푼텔라 탈포화효소로부터의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다. 일 실시형태에서, Δ12 탈포화효소의 기능적 변이체는 서열번호 2에 제시된 플로디아 인터푼텔라 탈포화효소 Pid12의 아미노산 서열의 일부 및 서열번호 47에 제시된 플로디아 인터푼텔라 탈포화효소 Desat65의 아미노산 서열의 일부를 포함하거나, 이들로 이루어진다. 일부 실시형태에서, Δ12 탈포화효소의 기능적 변이체는 Pid12(서열번호 2)의 변이체로 이루어지되, N-말단의 아미노산 잔기 1 내지 30 및/또는 C-말단의 아미노산 잔기 300 내지 335는 각각 Desat65(서열번호 47)의 C-말단의 아미노산 잔기 1 내지 29 및 N-말단의 아미노산 잔기 299 내지 344로 치환되었다. 따라서, 일부 실시형태에서, Δ12 탈포화효소의 기능적 변이체는 서열번호 80에 제시된 서열로 이루어진다.
일부 실시형태에서, Δ12 탈포화효소의 기능적 변이체는 카드라 카우텔라 Δ12 탈포화효소로부터의 아미노산 서열 및 플로디아 인터푼텔라 탈포화효소로부터의 아미노산을 포함하거나, 이들로 이루어진다. 일 실시형태에서, Δ12 탈포화효소의 기능적 변이체는 서열번호 55에 제시된 바와 같은 카드라 카우텔라 탈포화효소 EcauDes12의 아미노산 서열의 일부, 및 서열번호 47에 제시된 바와 같은 플로디아 인터푼텔라 탈포화효소 Desat65의 아미노산 서열의 일부를 포함하거나, 이들로 이루어진다. 일부 실시형태에서, Δ12 탈포화효소의 기능적 변이체는 EcauDes12(서열번호 55)의 변이체로 이루어지되, N-말단의 아미노산 잔기 1 내지 30 및 C-말단의 아미노산 잔기 300 내지 338은 각각 Desat65(서열번호 47)의 N-말단의 아미노산 잔기 1 내지 29 및 C-말단의 아미노산 잔기 299 내지 344로 치환되었다. 따라서, 일부 실시형태에서, Δ12 탈포화효소의 기능적 변이체는 서열번호 81에 제시된 서열로 이루어진다.
일부 실시형태에서, Δ12 탈포화효소의 기능적 변이체는 카드라 카우텔라 Δ12 탈포화효소로부터의 아미노산 서열 및 아미엘로이스 트란시텔라(Amyelois transitella) Δ11 탈포화효소로부터의 아미노산을 포함하거나, 이들로 이루어진다. 일 실시형태에서, Δ12 탈포화효소의 기능적 변이체는 서열번호 55에 제시된 바와 같은 카드라 카우텔라 탈포화효소 EcauDes12의 아미노산 서열의 일부, 및 서열번호 83에 제시된 바와 같은 아미엘로이스 트란시텔라 Δ11 탈포화효소 Desat16의 아미노산 서열의 일부를 포함하거나, 이들로 이루어진다. 일부 실시형태에서, Δ12 탈포화효소의 기능적 변이체는 EcauDes12(서열번호 55)의 변이체로 이루어지되, N-말단의 아미노산 잔기 1 내지 30 및 C-말단의 아미노산 잔기 300 내지 338은 각각 Desat16(서열번호 83)의 N-말단의 아미노산 잔기 1 내지 20 및 C-말단의 아미노산 잔기 302 내지 326으로 치환되었다. 따라서, 일부 실시형태에서, Δ12 탈포화효소의 기능적 변이체는 서열번호 82에 제시된 서열로 이루어진다.
추가 탈포화효소
본 명세서에 제공된 효모 세포는 이종성 Δ12 탈포화효소에 추가로, Δ12 탈포화효소가 아닌 적어도 1종의 추가 탈포화효소를 발현시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 추가 탈포화효소는 상동성 탈포화효소, 예컨대, 상동성 Δ9 탈포화효소 또는 상동성 Δ11 탈포화효소이다. 다시 말해서, 효모 세포는 Δ12 탈포화효소가 아닌 적어도 1종의 천연 탈포화효소를 발현시킨다. 예를 들어, 효모 세포는 상동성 Δ9 탈포화효소 Ole1을 발현시키는 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) 효모 세포일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 그러나, 추가 탈포화효소는 이종성 탈포화효소이다. 다시 말해서, 효모 세포는 Δ12 탈포화효소가 아닌 적어도 1종의 추가 이종성 탈포화효소를 발현시킨다.
일 실시형태에서, 추가 탈포화효소는 적어도 13개의 탄소 사슬 길이를 갖는 포화 또는 탈포화 지방 아실-CoA에서 12번 위치가 아닌 임의의 위치에 적어도 1개의 이중결합을 도입할 수 있는 이종성 탈포화효소이다. 다시 말해서, 추가 탈포화효소는 지방 아실-CoA에서 8, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 및 21번 위치로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 적어도 1개의 이중결합을 도입할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 상기 지방 아실-CoA는 포화된 지방 아실-CoA, 예를 들어, 테트라데칸오일-CoA이다. 다른 실시형태에서, 상기 지방 아실-CoA는 탈포화 12번 위치에 이중결합을 갖는 지방 아실-CoA이다. 또 다른 실시형태에서, 상기 지방 아실-CoA는 12번 위치 및 12번 위치 이외의 위치, 예를 들어 12번 위치 및 9번 위치에 이중결합을 갖는 탈포화 지방 아실-CoA이다.
따라서, 일 실시형태에서, 효모 세포는 이종성 Δ5 탈포화효소인 적어도 1종의 추가 이종성 탈포화효소를 발현시킬 수 있다. 다른 실시형태에서, 효모 세포는 이종성 Δ6 탈포화효소인 적어도 1종의 추가 이종성 탈포화효소를 발현시킬 수 있다. 다른 실시형태에서, 효모 세포는 이종성 Δ7 탈포화효소인 적어도 1종의 추가 이종성 탈포화효소를 발현시킬 수 있다. 다른 실시형태에서, 효모 세포는 이종성 Δ8 탈포화효소인 적어도 1종의 추가 이종성 탈포화효소를 발현시킬 수 있다. 다른 실시형태에서, 효모 세포는 이종성 Δ9 탈포화효소인 적어도 1종의 추가 이종성 탈포화효소를 발현시킬 수 있다. 다른 실시형태에서, 효모 세포는 이종성 Δ10 탈포화효소인 적어도 1종의 추가 이종성 탈포화효소를 발현시킬 수 있다. 다른 실시형태에서, 효모 세포는 이종성 Δ11 탈포화효소인 적어도 1종의 추가 이종성 탈포화효소를 발현시킬 수 있다. 다른 실시형태에서, 효모 세포는 이종성 Δ13 탈포화효소인 적어도 1종의 추가 이종성 탈포화효소를 발현시킬 수 있다. 다른 실시형태에서, 효모 세포는 이종성 Δ14 탈포화효소인 적어도 1종의 추가 이종성 탈포화효소를 발현시킬 수 있다. 다른 실시형태에서, 효모 세포는 이종성 Δ15 탈포화효소인 적어도 1종의 추가 이종성 탈포화효소를 발현시킬 수 있다. 다른 실시형태에서, 효모 세포는 이종성 Δ16 탈포화효소인 적어도 1종의 추가 이종성 탈포화효소를 발현시킬 수 있다. 다른 실시형태에서, 효모 세포는 이종성 Δ17 탈포화효소인 적어도 1종의 추가 이종성 탈포화효소를 발현시킬 수 있다. 다른 실시형태에서, 효모 세포는 이종성 Δ18 탈포화효소인 적어도 1종의 추가 이종성 탈포화효소를 발현시킬 수 있다. 다른 실시형태에서, 효모 세포는 이종성 Δ19 탈포화효소인 적어도 1종의 추가 이종성 탈포화효소를 발현시킬 수 있다. 다른 실시형태에서, 효모 세포는 이종성 Δ20 탈포화효소인 적어도 1종의 추가 이종성 탈포화효소를 발현시킬 수 있다. 다른 실시형태에서, 효모 세포는 이종성 Δ21 탈포화효소인 적어도 1종의 추가 이종성 탈포화효소를 발현시킬 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 추가 탈포화효소는 Δ9 탈포화효소 또는 Δ11 탈포화효소이다. 따라서, 추가 탈포화효소는 9번 위치 또는 11번 위치에 각각 이중결합을 도입할 수 있다.
추가 이종성 탈포화효소는 이것이 본 방법에 따라 발현되는 효모 세포와 상이한 임의의 유형의 유기체에 대해 천연일 수 있다. 일부 실시형태에서, 이종성 탈포화효소는 리시누스 코뮌스(Ricinus co㎜unis) 또는 펠라르고늄 호르토룸(Pelargonium hortorum)과 같은 식물에 대해 천연이다. 다른 실시형태에서, 이종성 탈포화효소는 쌍시목(Diptera), 초시목(Coleoptera) 또는 인시목, 예컨대, 아그로티스(Agrotis), 아르기로타에니아(Argyrotaenia), 아미엘로이스(Amyelois), 카울리오그나투스(Chauliognathus), 코리스토네우라(Choristoneura), 시디아(Cydia), 덴드로필루스(Dendrophilus), 드로소필라(Drosophila), 에피피야스(Epiphyas), 그라폴리타(Grapholita), 헬리코베르파(Helicoverpa), 람프로니아(Lampronia), 로베시아(Lobesia), 만덕타(Manducta), 오스트리니아(Ostrinia), 펙티노포라(Pectinophora), 플루텔라(Plutella), 탈라시오시라(Thalassiosira), 타우메토포에아(Thaumetopoea), 트리보리움(Tribolium), 트리코플루시아(Trichoplusia) 또는 스포돕테라(Spodoptera), 예컨대, 아그로티스 세게툼(Agrotis segetum), 아르기로타에니아 벨루티아나(Argyrotaenia velutiana), 아미엘로이스 트란시텔라, 카울리오그나투스 루구브리스(Chauliognathus lugubris), 코리스토네우라 파랄렐라(Choristoneura parallela), 코리스토네우라 로사세아나(Choristoneura rosaceana), 시디아 포모넬라(Cydia pomonella), 덴드로필루스 펀타투스(Dendrophilus punctatus), 드로소필라 아나나사에(Drosophila ananassae), 드로소필라 그림샤위(Drosophila grimshawi), 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster), 드로소필라 모자벤시스(Drosophila mojavensis), 드로소필라 슈도옵쿠라(Drosophila pseudoobscura), 드로소필라 비릴리스(Drosophila virilis), 드로소필라 야쿠바(Drosophila yakuba), 에피피야스 포스트비타나(Epiphyas postvittana), 그라폴리타 몰레스타(Grapholita molesta), 헬리코베르파 아설타(Helicoverpa assulta), 헬리코베르파 제아(Helicoverpa zea), 람프로니아 카피텔라(Lampronia capitella), 로베시아 보트라나(Lobesia botrana), 만덕타 섹스타(Manducta sexta), 오스트리니아 푸르나칼리스(Ostrinia furnacalis), 오스트리니아 누빌라리스(Ostrinia nubilalis), 펙티노포라 고시피엘라(Pectinophora gossypiella), 플루텔라 자일로스텔라(Plutella xylostella), 스포돕테라 엑시구아, 스포돕테라 리토랄리스(Spodoptera littoralis), 스포돕테라 리투라(Spodoptera litura), 탈라시오시라 슈도나나(Thalassiosira pseudonana), 타우메토포에아 피티오캄파(Thaumetopoea pityocampa), 트리보리움 카스타네움(Tribolium castaneum) 또는 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni) 속의 곤충에 대해 천연이다.
바람직한 실시형태에서, 추가 이종성 탈포화효소는 드로소필라 탈포화효소, 예컨대, 드로소필라 멜라노가스터 탈포화효소, 드로소필라 비릴리스 탈포화효소, 드로소필라 그림샤위 탈포화효소, 드로소필라 야쿠바 탈포화효소, 드로소필라 모자벤시스 탈포화효소, 드로소필라 슈도옵쿠라 탈포화효소 또는 드로소필라 아나나사에 탈포화효소이다.
일 실시형태에서, 추가 이종성 탈포화효소는 드로소필라 탈포화효소이다. 일 실시형태에서, 탈포화효소는 드로소필라 비릴리스 탈포화효소, 예컨대, 서열번호 4에 제시된 바와 같은 탈포화효소(Desat61)이다. 일 실시형태에서, 탈포화효소는 드로소필라 멜라노가스터 탈포화효소, 예컨대, 서열번호 6에 제시된 바와 같은 탈포화효소(Desat24)이다. 일 실시형태에서, 탈포화효소는 드로소필라 그림샤위 탈포화효소, 예컨대, 서열번호 8에 제시된 탈포화효소(Desat59)이다. 일 실시형태에서, 탈포화효소는 드로소필라 야쿠바 탈포화효소, 예컨대, 서열번호 57에 제시된 바와 같은 탈포화효소(Desat56)이다. 일 실시형태에서, 탈포화효소는 드로소필라 아나나사에 탈포화효소, 예컨대, 서열번호 59에 제시된 바와 같은 탈포화효소(Desat60)이다. 일부 실시형태에서, 탈포화효소는 적어도 60% 동일성 또는 유사성을 갖는 드로소필라 탈포화효소의 기능적 변이체, 드로소필라 비릴리스 탈포화효소의 기능적 변이체, 드로소필라 멜라노가스터 탈포화효소의 기능적 변이체, 드로소필라 그림샤위 탈포화효소의 기능적 변이체, 서열번호 6에 제시된 바와 같은 탈포화효소(Desat24)의 기능적 변이체, 서열번호 4에 제시된 바와 같은 탈포화효소(Desat61)의 기능적 변이체, 서열번호 59에 제시된 바와 같은 탈포화효소(Desat60)의 기능적 변이체, 서열번호 57에 제시된 바와 같은 탈포화효소(Desat56)의 기능적 변이체 또는 서열번호 8에 제시된 바와 같은 탈포화효소(Desat59)의 기능적 변이체이다.
일 실시형태에서, 추가적인 이종성 탈포화효소는 아미엘로이스 탈포화효소이다. 일 실시형태에서, 탈포화효소는 아미엘로이스 트란시텔라 탈포화효소, 예컨대, 서열번호 10에 제시된 바와 같은 탈포화효소(Desat17) 또는 서열번호 12에 제시된 바와 같은 탈포화효소(Desat18)이다. 일부 실시형태에서, 탈포화효소는 적어도 60% 동일성 또는 유사성을 갖는 아미엘로이스 탈포화효소의 기능적 변이체, 아미엘로이스 트란시텔라 탈포화효소의 기능적 변이체, 서열번호 10에 제시된 바와 같은 탈포화효소(Desat17)의 기능적 변이체 또는 서열번호 12에 제시된 바와 같은 탈포화효소(Desat18)의 기능적 변이체이다.
일 실시형태에서, 추가 이종성 탈포화효소는 코리스토네우라 탈포화효소이다. 일 실시형태에서, 탈포화효소는 코리스토네우라 파랄렐라 탈포화효소, 예컨대, 서열번호 61에 제시된 바와 같은 탈포화효소(Desat74)이다. 일부 실시형태에서, 탈포화효소는 적어도 60% 동일성 또는 유사성을 갖는 코리스토네우라 탈포화효소의 기능적 변이체, 코리스토네우라 파랄렐라 탈포화효소의 기능적 변이체 또는 서열번호 61에 제시된 바와 같은 탈포화효소(Desat74)의 기능적 변이체이다.
일 실시형태에서, 추가 이종성 탈포화효소는 스포돕테라 탈포화효소이다. 일 실시형태에서, 탈포화효소는 스포돕테라 리투라 탈포화효소, 예컨대, 서열번호 18에 제시된 바와 같은 탈포화효소(Desat26)이다. 일부 실시형태에서, 탈포화효소는 적어도 60% 동일성 또는 유사성을 갖는 스포돕테라 탈포화효소의 기능적 변이체, 스포돕테라 리투라 탈포화효소의 기능적 변이체 또는 서열번호 18에 제시된 바와 같은 탈포화효소(Desat26)의 기능적 변이체이다.
일 실시형태에서, 추가 이종성 탈포화효소는 사카로마이세스 탈포화효소이다. 일 실시형태에서, 탈포화효소는 사카로마이세스 세레비시애 탈포화효소, 예컨대, 서열번호 14에 제시된 바와 같은 탈포화효소(Desat42)이다. 일부 실시형태에서, 탈포화효소는 적어도 60% 동일성 또는 유사성을 갖는 사카로마이세스 탈포화효소의 기능적 변이체, 사카로마이세스 세레비시애 탈포화효소의 기능적 변이체, 또는 서열번호 14에 제시된 바와 같은 탈포화효소(Desat42)의 기능적 변이체이다.
일 실시형태에서, 추가 이종성 탈포화효소는 야로위아 탈포화효소이다. 일 실시형태에서, 탈포화효소는 야로위아 리폴리티카 탈포화효소, 예컨대, 서열번호 16에 제시된 바와 같은 탈포화효소(Desat69)이다. 일부 실시형태에서, 탈포화효소는 적어도 60% 동일성 또는 유사성을 갖는 야로위아 탈포화효소의 기능적 변이체, 야로위아 리폴리티카 탈포화효소의 기능적 변이체, 또는 서열번호 16에 제시된 바와 같은 탈포화효소(Desat69)의 기능적 변이체이다.
주어진 효소에 관해 용어 "적어도 60% 동일성 또는 유사성을 갖는 이의 변이체"는 상기 효소와 60% 이상의 동일성 또는 유사성, 예컨대, 효소와 적어도 61% 이상, 예컨대, 적어도 62%, 예컨대, 적어도 63%, 예컨대, 적어도 64%, 예컨대, 적어도 65%, 예컨대, 적어도 66%, 예컨대, 적어도 67%, 예컨대, 적어도 68%, 예컨대, 적어도 69%, 예컨대, 적어도 70%, 예컨대, 적어도 71%, 예컨대, 적어도 72%, 예컨대, 적어도 73%, 예컨대, 적어도 74%, 예컨대, 적어도 75%, 예컨대, 적어도 76%, 예컨대, 적어도 77%, 예컨대, 적어도 78%, 예컨대, 적어도 79%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 81%, 예컨대, 적어도 82%, 예컨대, 적어도 83%, 예컨대, 적어도 84%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 86%, 예컨대, 적어도 87%, 예컨대, 적어도 88%, 예컨대, 적어도 89%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99% 동일성 또는 유사성을 갖는 변이체를 지칭하는 것으로 이해될 것이다.
변형될 효모 세포는 탈포화 지방 알코올 및/또는 탈포화 지방 아실-CoA의 생산에 부정적 영향을 가질 수 있는 천연 탈포화효소를 발현시킬 수 있다. 따라서, 변형될 세포가 이러한 천연 탈포화효소를 발현시키는 경우, 유기체는 천연 탈포화효소의 활성이 감소되거나 존재하지 않도록 변형될 수 있다.
천연 탈포화효소의 활성 결여 또는 적어도 감소를 보장하기 위해, 당업자에 알려진 방법이 사용될 수 있다. 천연 탈포화효소를 암호화하는 유전자는 천연 탈포화효소가 발현되지 않는 것을 보장하기 위해 결실되거나 또는 부분적으로 결실될 수 있다. 대안적으로, 유전자는, 천연 탈포화효소가 발현되지만, 예를 들어, 효소의 촉매 부위의 발현에 의해 활성을 결여하도록, 돌연변이될 수 있다. 대안적으로, mRNA가 활성 단백질로 번역되는 것은 침묵 RNA 또는 siRNA와 같은 방법에 의해 방지될 수 있다. 대안적으로, 세포 천연 탈포화효소의 활성을 저해하는 저해제를 포함하는 배지에서 인큐베이션될 수 있다. 천연 탈포화효소를 암호화하는 유전자의 전사를 저해하는 화합물은 또한, 상기 화합물이 존재하지 않을 때 전사가 비활성화되도록, 제공될 수 있다. 당업계에 알려진 다른 방법이 사용될 수 있다.
따라서 천연 탈포화효소의 비활성화는 영구적이거나 장기간일 수 있고, 즉, 변형된 세포는 안정적인 방식으로 천연 탈포화효소의 감소된 활성을 나타내거나 활성을 나타내지 않거나, 또는 일시적일 수 있고, 즉, 변형된 세포는 일정 시간의 기간 동안 천연 탈포화효소의 활성을 나타낼 수 있지만, 이 활성은 다른 시간의 기간 동안 억제 또는 감소될 수 있다.
일부 실시형태에서, 천연 효모 탈포화효소는 이종성 탈포화효소로 대체된다. 이종성 탈포화효소는, 예를 들어, 원치않는 부산물을 생성하지 않거나, 또는 동일한 조건 하에서 시험할 때 천연 효모 탈포화효소에 비해서 원치않는 부산물을 더 적게 생성하는 탈포화효소일 수 있다. 이러한 원치않는 부산물은, 예를 들어, (Z9)-헥사데센오일-CoA(Z9-16:CoA) 및/또는 (Z9)-헥사데센올(Z9-16:OH)일 수 있다. 야로위아 리폴리티카 OLE1 탈포화효소를 푸시니아 그라미니스(Puccinia graminis) 또는 아륵술라 아데니니보란스(Arxula adeninivorans)로부터의 이종성 탈포화효소로 대체하는 것은 부산물 Z9-16:OH의 감소된 생산을 야기한다는 것이 발견되었다(Tsakraklides et al., 2018).
천연 효모 탈포화효소를 대체하는 이종성 탈포화효소는 C18 화합물, 예컨대, 옥타데칸오일-CoA에 특이적일 수 있고, 옥타데센오일-CoA를 주요 산물로 만들 수 있다(Tsakraklides et al., 2018).
Δ12 탈포화효소 및 추가 탈포화효소
임의의 위의 Δ12 탈포화효소는 임의의 위의 추가 탈포화효소와 함께 발현될 수 있다.
따라서, 일부 실시형태에서, 세포는 하기를 발현시킨다:
- 플로디아 인터푼텔라 Δ12 탈포화효소, 예를 들어, 서열번호 2에 제시된 바와 같은 Pid12, 및
- 드로소필라 탈포화효소, 예컨대, 드로소필라 비릴리스 탈포화효소, 예를 들어 서열번호 4에 제시된 바와 같은 Desat61, 또는 예컨대, 드로소필라 멜라노가스터 탈포화효소, 예를 들어, 서열번호 6에 제시된 바와 같은 Desat24, 또는 예컨대, 드로소필라 그림샤위 탈포화효소, 예를 들어 서열번호 8에 제시된 바와 같은 Desat59, 또는 예컨대, 드로소필라 야쿠바 탈포화효소, 예를 들어, 서열번호 57에 제시된 바와 같은 Desat56, 또는 예컨대 드로소필라 아나나사에 탈포화효소, 예를 들어 서열번호 59에 제시된 바와 같은 Desat60; 아미엘로이스 탈포화효소, 예컨대, 아미엘로이스 트란시텔라 탈포화효소, 예를 들어 서열번호 10에 제시된 바와 같은 Desat17 또는 서열번호 12에 제시된 바와 같은 Desat18; 코리스토네우라 탈포화효소, 예컨대, 코리스토네우라 파랄렐라 탈포화효소, 예를 들어 서열번호 61에 제시된 바와 같은 Desat74; 스포돕테라 탈포화효소, 예컨대, 스포돕테라 리투라 탈포화효소, 예를 들어 서열번호 18에 제시된 바와 같은 Desat26; 사카로마이세스 탈포화효소, 예컨대, 사카로마이세스 세레비시애 탈포화효소, 예를 들어 서열번호 14에 제시된 바와 같은 Desat42; 야로위아(Yarrowia) 탈포화효소, 예컨대, 야로위아 리폴리티카 탈포화효소, 예를 들어, 서열번호 16에 제시된 바와 같은 Desat69로부터 선택된, 추가 탈포화효소;
또는 이들과 적어도 60% 동일성 또는 유사성을 갖는 기능적 변이체.
일부 실시형태에서, 세포는 하기를 발현시킨다:
- 카드라 카우텔라 Δ12 탈포화효소, 예를 들어, 서열번호 55에 제시된 바와 같은 EcauDes12, 및
- 드로소필라 탈포화효소, 예컨대, 드로소필라 비릴리스 탈포화효소, 예를 들어 서열번호 4에 제시된 바와 같은 Desat61, 또는 예컨대, 드로소필라 멜라노가스터 탈포화효소, 예를 들어, 서열번호 6에 제시된 바와 같은 Desat24, 또는 예컨대, 드로소필라 그림샤위 탈포화효소, 예를 들어 서열번호 8에 제시된 바와 같은 Desat59, 또는 예컨대, 드로소필라 야쿠바 탈포화효소, 예를 들어, 서열번호 57에 제시된 바와 같은 Desat56, 또는 예컨대 드로소필라 아나나사에 탈포화효소, 예를 들어 서열번호 59에 제시된 바와 같은 Desat60; 아미엘로이스 탈포화효소, 예컨대, 아미엘로이스 트란시텔라 탈포화효소, 예를 들어 서열번호 10에 제시된 바와 같은 Desat17 또는 서열번호 12에 제시된 바와 같은 Desat18; 코리스토네우라 탈포화효소, 예컨대, 코리스토네우라 파랄렐라 탈포화효소, 예를 들어 서열번호 61에 제시된 바와 같은 Desat74; 스포돕테라 탈포화효소, 예컨대, 스포돕테라 리투라 탈포화효소, 예를 들어 서열번호 18에 제시된 바와 같은 Desat26; 사카로마이세스 탈포화효소, 예컨대, 사카로마이세스 세레비시애 탈포화효소, 예를 들어 서열번호 14에 제시된 바와 같은 Desat42; 야로위아 탈포화효소, 예컨대, 야로위아 리폴리티카 탈포화효소, 예를 들어, 서열번호 16에 제시된 바와 같은 Desat69로부터 선택된, 추가 탈포화효소;
또는 이들과 적어도 60% 동일성 또는 유사성을 갖는 기능적 변이체.
일부 실시형태에서, 세포는 하기를 발현시킨다:
- 에페스티아 쿠에니엘라 Δ12 탈포화효소, 예를 들어, 서열번호 85에 제시된 바와 같은 Eku_d12, 및
- 드로소필라 탈포화효소, 예컨대, 드로소필라 비릴리스 탈포화효소, 예를 들어 서열번호 4에 제시된 바와 같은 Desat61, 또는 예컨대, 드로소필라 멜라노가스터 탈포화효소, 예를 들어, 서열번호 6에 제시된 바와 같은 Desat24, 또는 예컨대, 드로소필라 그림샤위 탈포화효소, 예를 들어 서열번호 8에 제시된 바와 같은 Desat59, 또는 예컨대, 드로소필라 야쿠바 탈포화효소, 예를 들어, 서열번호 57에 제시된 바와 같은 Desat56, 또는 예컨대 드로소필라 아나나사에 탈포화효소, 예를 들어 서열번호 59에 제시된 바와 같은 Desat60; 아미엘로이스 탈포화효소, 예컨대, 아미엘로이스 트란시텔라 탈포화효소, 예를 들어 서열번호 10에 제시된 바와 같은 Desat17 또는 서열번호 12에 제시된 바와 같은 Desat18; 코리스토네우라 탈포화효소, 예컨대, 코리스토네우라 파랄렐라 탈포화효소, 예를 들어 서열번호 61에 제시된 바와 같은 Desat74; 스포돕테라 탈포화효소, 예컨대, 스포돕테라 리투라 탈포화효소, 예를 들어 서열번호 18에 제시된 바와 같은 Desat26; 사카로마이세스 탈포화효소, 예컨대, 사카로마이세스 세레비시애 탈포화효소, 예를 들어 서열번호 14에 제시된 바와 같은 Desat42; 야로위아 탈포화효소, 예컨대, 야로위아 리폴리티카 탈포화효소, 예를 들어, 서열번호 16에 제시된 바와 같은 Desat69로부터 선택된, 추가 탈포화효소;
또는 이들과 적어도 60% 동일성 또는 유사성을 갖는 기능적 변이체.
일부 실시형태에서, 세포는 하기를 발현시킨다:
- 에페스티아 엘루텔라 Δ12 탈포화효소, 예를 들어, 서열번호 87에 제시된 바와 같은 Ee_d12, 및
- 드로소필라 탈포화효소, 예컨대, 드로소필라 비릴리스 탈포화효소, 예를 들어 서열번호 4에 제시된 바와 같은 Desat61, 또는 예컨대, 드로소필라 멜라노가스터 탈포화효소, 예를 들어, 서열번호 6에 제시된 바와 같은 Desat24, 또는 예컨대, 드로소필라 그림샤위 탈포화효소, 예를 들어 서열번호 8에 제시된 바와 같은 Desat59, 또는 예컨대, 드로소필라 야쿠바 탈포화효소, 예를 들어, 서열번호 57에 제시된 바와 같은 Desat56, 또는 예컨대 드로소필라 아나나사에 탈포화효소, 예를 들어 서열번호 59에 제시된 바와 같은 Desat60; 아미엘로이스 탈포화효소, 예컨대, 아미엘로이스 트란시텔라 탈포화효소, 예를 들어 서열번호 10에 제시된 바와 같은 Desat17 또는 서열번호 12에 제시된 바와 같은 Desat18; 코리스토네우라 탈포화효소, 예컨대, 코리스토네우라 파랄렐라 탈포화효소, 예를 들어 서열번호 61에 제시된 바와 같은 Desat74; 스포돕테라 탈포화효소, 예컨대, 스포돕테라 리투라 탈포화효소, 예를 들어 서열번호 18에 제시된 바와 같은 Desat26; 사카로마이세스 탈포화효소, 예컨대, 사카로마이세스 세레비시애 탈포화효소, 예를 들어 서열번호 14에 제시된 바와 같은 Desat42; 야로위아 탈포화효소, 예컨대, 야로위아 리폴리티카 탈포화효소, 예를 들어, 서열번호 16에 제시된 바와 같은 Desat69로부터 선택된, 추가 탈포화효소;
또는 이들과 적어도 60% 동일성 또는 유사성을 갖는 기능적 변이체.
위와 같은 주어진 탈포화효소와 적어도 60% 동일성 또는 유사성을 갖는 탈포화효소의 기능적 변이체는 탈포화효소와 적어도 61%, 예컨대, 적어도 62%, 예컨대, 적어도 63%, 예컨대, 적어도 64%, 예컨대, 적어도 65%, 예컨대, 적어도 66%, 예컨대, 적어도 67%, 예컨대, 적어도 68%, 예컨대, 적어도 69%, 예컨대, 적어도 70%, 예컨대, 적어도 71%, 예컨대, 적어도 72%, 예컨대, 적어도 73%, 예컨대, 적어도 74%, 예컨대, 적어도 75%, 예컨대, 적어도 76%, 예컨대, 적어도 77%, 예컨대, 적어도 78%, 예컨대, 적어도 79%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 81%, 예컨대, 적어도 82%, 예컨대, 적어도 83%, 예컨대, 적어도 84%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 86%, 예컨대, 적어도 87%, 예컨대, 적어도 88%, 예컨대, 적어도 89%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%, 예컨대, 100% 동일성 또는 유사성을 가질 수 있다는 것이 이해될 것이다.
증가된 C14 특이성
다수의 바람직한 페로몬 화합물은 탄소 사슬 길이 14를 갖는다. 따라서, C14 화합물의 생산으로 반응을 유도하는 것에 관심이 있을 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 효모 세포는 헥사데칸오일-CoA에 대해서보다 테트라데칸오일-CoA에 대해서 더 큰 특이성을 갖는 탈포화효소 및/또는 탈포화 헥사데칸오일-CoA(즉, 헥사데칸오일-CoA)에 대해서보다 탈포화 테트라데칸오일-CoA(즉, 테트라데센오일-CoA)에 대해서 더 높은 특이성을 갖는 지방 아실-CoA 환원효소를 발현시킨다. 다시 말해서, 탈포화효소는 사슬 길이 16을 갖는 기질에 대해서보다 탄소 사슬 길이 14를 갖는 기질에 대해 더 특이적이다. 이러한 탈포화효소를 발현시키는 효모 세포의 예는 WO 2018/109167에서, 특히 표제 "탈포화효소" 부문에 개시되어 있다.
효모 세포에서 이러한 탈포화효소(및 본 명세서에서 기재하는 임의의 환원효소)의 발현은 특히 탄소 사슬 길이 16을 갖는 총 탈포화 지방 알코올의 분획에 비해 탄소 사슬 길이 14의 탄소 사슬 길이를 갖는 총 탈포화 지방 알코올의 분획을 증가시킨다. 필요한 특이성을 갖는 탈포화효소는 특히 드로소필라, 스포돕테라, 코리스트네우라 종에 대해 천연인 탈포화효소, 예컨대, 드로소필라 멜라노가스터, 드로소필라 그림샤위, 드로소필라 비릴리스, 스포돕테라 리투라, 코리스토네우라 파랄렐라 또는 코리스토네우라 로사세아나에 대해 천연인 탈포화효소, 또는 이들 종에 적어도 60% 동일성을 갖는 이들의 변이체이다.
일부 실시형태에서, 탈포화효소는,
i) 서열번호 6에 제시된 바와 같이 드로소필라 멜라노가스터로부터의 Δ9 탈포화효소와 적어도 60% 동일성을 갖는 Δ9 탈포화효소;
ii) 서열번호 8에 제시된 바와 같은 드로소필라 그림샤위로부터의 Δ9 탈포화효소와 적어도 60% 동일성을 갖는 탈포화효소;
iii) 서열번호 4에 제시된 바와 같은 드로소필라 비릴리스로부터의 Δ9 탈포화효소와 적어도 60% 동일성을 갖는 탈포화효소;
iv) 서열번호 18에 제시된 바와 같이 스포돕테라 리투라로부터의 Δ9 탈포화효소와 적어도 60% 동일성을 갖는 Δ9 탈포화효소;
및 이들과 적어도 60% 동일성 또는 유사성, 예컨대, 이들과 적어도 61%, 예컨대, 적어도 62%, 예컨대, 적어도 63%, 예컨대, 적어도 64%, 예컨대, 적어도 65%, 예컨대, 적어도 66%, 예컨대, 적어도 67%, 예컨대, 적어도 68%, 예컨대, 적어도 69%, 예컨대, 적어도 70%, 예컨대, 적어도 71%, 예컨대, 적어도 72%, 예컨대, 적어도 73%, 예컨대, 적어도 74%, 예컨대, 적어도 75%, 예컨대, 적어도 76%, 예컨대, 적어도 77%, 예컨대, 적어도 78%, 예컨대, 적어도 79%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 81%, 예컨대, 적어도 82%, 예컨대, 적어도 83%, 예컨대, 적어도 84%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 86%, 예컨대, 적어도 87%, 예컨대, 적어도 88%, 예컨대, 적어도 89%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%, 예컨대, 100% 동일성 또는 유사성을 갖는 기능적 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
이러한 탈포화효소는 효소 세포에서 발현될 때 C14 기질의 탈포화를 우선적으로 촉매하는 것으로 발견되었다.
이러한 세포에서, 탈포화 테트라데칸오일-CoA 대 탈포화 헥사데칸오일-CoA의 비는 적어도 0.1, 예컨대, 적어도 0.2, 예컨대, 적어도 0.3, 예컨대, 적어도 0.4, 예컨대, 적어도 0.5, 예컨대, 적어도 0.75, 예컨대, 적어도 1, 예컨대, 적어도 2, 예컨대, 적어도 3, 예컨대, 적어도 4, 예컨대, 적어도 5, 예컨대, 적어도 6, 예컨대, 적어도 7, 예컨대, 적어도 8, 예컨대, 적어도 9, 예컨대, 적어도 10, 예컨대, 적어도 12.5, 예컨대, 적어도 15 이상이다.
이종성 탈포화효소가 아래에 상세하게 기재하는 바와 같이 지방 아실-CoA 환원효소와 함께 발현될 때, 효모 세포는 탈포화 지방 알코올을 생산한다.
이러한 실시형태에서, 탈포화 테트라데칸오일-CoA로부터 유래된 탈포화 지방 알코올의 역가는 적어도 1㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 1.5㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 5㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 10㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 25㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 50㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 100㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 250㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 500㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 750㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 1g/ℓ, 예컨대, 적어도 2g/ℓ, 예컨대, 적어도 3g/ℓ, 예컨대, 적어도 4g/ℓ, 예컨대, 적어도 5g/ℓ 이상이다.
일부 실시형태에서, 14의 사슬 길이를 갖는 탈포화 테트라데칸오일-CoA로부터 유래된 탈포화 지방 알코올의 역가는 적어도 1㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 1.5㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 5㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 10㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 25㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 50㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 100㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 250㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 500㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 750㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 1g/ℓ, 예컨대, 적어도 2g/ℓ, 예컨대, 적어도 3g/ℓ, 예컨대, 적어도 4g/ℓ, 예컨대, 적어도 5g/ℓ 이상이다.
일부 실시형태에서, 사슬 길이가 14인 탈포화 지방 알코올의 적어도 1%, 예컨대, 적어도 1.5%, 예컨대, 적어도 2%, 예컨대, 적어도 2.5%, 예컨대, 적어도 3%, 예컨대, 적어도 3.5%, 예컨대, 적어도 4%, 예컨대, 적어도 4.5%, 예컨대, 적어도 5%, 예컨대, 적어도 7.5%, 예컨대, 적어도 10% 이상을 포함하는 탈포화 지방 알코올이 수득된다. 일부 실시형태에서, 효모 세포는 14의 탄소 사슬 길이를 갖는 탈포화 지방 알코올 및 16의 탄소 사슬 길이를 갖는 탈포화 지방 알코올을 포함하는, 탄소 사슬 길이 범위를 갖는 탈포화 지방 알코올을 생산한다. 이러한 실시형태에서, 14의 탄소 사슬 길이를 갖는 탈포화 지방 알코올 및 16의 탄소 사슬 길이를 갖는 탈포화 지방 알코올의 합계에 대해 14의 탄소 사슬 길이를 갖는 탈포화 지방 알코올의 비율은 적어도 5%, 예컨대, 적어도 7.5%, 예컨대, 적어도 10%, 예컨대, 적어도 15%, 예컨대, 적어도 20% 이상이다.
주어진 탈포화효소가 필요한 특이성을 갖는지의 여부를 시험하는 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같이 행해질 수 있다.
지방 아실-CoA 환원효소
추가로 지방 아실-CoA 환원효소(FAR)를 발현시키는 효모 세포가 본 명세서에 제공되되, 상기 효모 세포는 (E12)-지방 아실-CoA 또는 (Z9, E12)-지방 아실-CoA의 적어도 일부를 상응하는 지방 알코올로 전환시킬 수 있다. 예를 들어, 효모 세포는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔오일-CoA의 적어도 일부를 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올로 전환시킬 수 있다.
용어 '지방 아실-CoA 환원효소' 및 'FAR'은 본 명세서에서 호환 가능하게 사용될 것이다. 용어 '이종성 FAR'은 유기체에 의해, 예컨대, 효모 세포에 의해 자연적으로 발현되지 않는 FAR을 지칭한다.
FAR은 2단계 반응을 촉매한다:
아실-CoA + 2 NADPH <=> CoA + 알코올 + 2 NADP(+)
제1 단계에서, 지방 아실-CoA는 지방 알데하이드로 환원된 후에, 제2 단계에서 지방 알데하이드가 지방 알코올로 추가로 환원된다. 지방 아실-CoA는 탈포화 또는 포화 지방 아실-CoA일 수 있다.
이러한 반응을 촉매할 수 있는 FAR은 EC 번호 1.2.1.84를 갖는 알코올-형성 지방 아실-CoA 환원효소이다.
일 실시형태에서, FAR은 아그로티스, 아미엘로이스, 바이사이클러스(Bicyclus), 봄버스(Bombus), 칠로(Chilo), 시디아, 헬리코베르파, 헬리오티스(Heliothis), 로베시아, 오스트리니아, 플로디아, 플루텔라, 스포돕테라, 트리코플루시아, 티타(Tyta) 및 이포노메우타(Yponomeuta), 예컨대, 아그로티스 입실론(Agrotis ipsilon), 아그로티스 세게툼, 아미엘로이스 트란시텔라, 바이사이클러스 아니나나(Bicyclus anynana), 봄버스 라피다리우스(Bombus lapidarius), 칠로 서프레살리스(Chilo suppressalis), 시디아 포모넬라, 헬리코베르파 아르미게라(Helicoverpa armigera), 헬리코베르파 아설타, 헬리오티스 서브플렉사(Heliothis subflexa), 헬리오티스 비레센스(Heliothis virescens), 로베시아 보트라나, 오스트리니아 푸르나칼리스, 오스트리니아 누빌라리스, 오스트리니아 자그(Ostrinia zag), 오스트리니아 제아, 플로디아 인터푼텔라, 플루텔라 자일로스텔라, 스포돕테라 엑시구아, 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda), 스포돕테라 리토랄리스, 스포돕테라 리투라, 트리코플루시아 니, 티타 알바(Tyta alba) 및 이포노메우타 로렐루스(Yponomeuta rorellus), 특히 스포돕테라 엑시구아, 헬리코베르파 아르미게라, 스포돕테라 리투라 및 플로디아 인터푼텔라로 이루어진 군으로부터 선택된 속의 유기체에 대해 천연이다.
일 실시형태에서, FAR은 FAR1(서열번호 20), FAR16(서열번호 22), FAR17(서열번호 24), FAR19(서열번호 26), FAR28(서열번호 28), FAR32(서열번호 30), FAR38(서열번호 32), FAR44(서열번호 63), FAR48(서열번호 65), FAR49(서열번호 67); FAR38(서열번호 32), FAR4(서열번호 69), FAR6(서열번호 71), FAR8(서열번호 73), FAR12(서열번호 75), FAR11(서열번호 77) 또는 FAR5(서열번호 79) 또는 이들과 적어도 60% 동일성 또는 유사성, 예컨대, 이들과 적어도 61%, 예컨대, 적어도 62%, 예컨대, 적어도 63%, 예컨대, 적어도 64%, 예컨대, 적어도 65%, 예컨대, 적어도 66%, 예컨대, 적어도 67%, 예컨대, 적어도 68%, 예컨대, 적어도 69%, 예컨대, 적어도 70%, 예컨대, 적어도 71%, 예컨대, 적어도 72%, 예컨대, 적어도 73%, 예컨대, 적어도 74%, 예컨대, 적어도 75%, 예컨대, 적어도 76%, 예컨대, 적어도 77%, 예컨대, 적어도 78%, 예컨대, 적어도 79%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 81%, 예컨대, 적어도 82%, 예컨대, 적어도 83%, 예컨대, 적어도 84%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 86%, 예컨대, 적어도 87%, 예컨대, 적어도 88%, 예컨대, 적어도 89%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%, 예컨대, 100% 동일성 또는 유사성을 갖는 기능적 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 실시형태에서, 이종성 FAR은 아그로티스 FAR이다. 일 실시형태에서, FAR은 아그로티스 세게툼 FAR, 예컨대, 서열번호 75에 제시된 바와 같은 FAR(FAR12)이다. 일부 실시형태에서, FAR은 적어도 60% 동일성을 갖는 아그로티스 FAR의 기능적 변이체, 또는 아그로티스 세게툼 FAR의 기능적 변이체, 예컨대, 서열번호 75에 제시된 FAR(FAR12)의 기능적 변이체이다.
일 실시형태에서, 이종성 FAR은 바이사이클러스 FAR이다. 일 실시형태에서, FAR은 바이사이클러스 아니나나 FAR, 예컨대, 서열번호 77에 제시된 바와 같은 FAR(FAR11)이다. 일부 실시형태에서, FAR은 적어도 60% 동일성을 갖는 바이사이클러스 FAR의 기능적 변이체, 또는 바이사이클러스 아니나나 FAR의 기능적 변이체, 예컨대, 서열번호 77에 제시된 FAR(FAR11)의 기능적 변이체이다.
일 실시형태에서, 이종성 FAR은 헬리코베르파 FAR이다. 일 실시형태에서, FAR은 헬리코베르파 아르미게라 FAR, 예컨대, 서열번호 20에 제시된 바와 같은 FAR(FAR1)이다. 일부 실시형태에서, FAR은 적어도 60% 동일성을 갖는 헬리코베르파 FAR의 기능적 변이체, 또는 헬리코베르파 아르미게라 FAR의 기능적 변이체, 예컨대, 서열번호 20에 제시된 FAR(FAR1)의 기능적 변이체이다.
일 실시형태에서, 이종성 FAR은 헬리코베르파 FAR이다. 일 실시형태에서, FAR은 헬리코베르파 아술타 FAR, 예컨대, 서열번호 71에 제시된 바와 같은 FAR(FAR6)이다. 일부 실시형태에서, FAR은 적어도 60% 동일성을 갖는 헬리코베르파 FAR의 기능적 변이체, 또는 헬리코베르파 아설타 FAR의 기능적 변이체, 예컨대, 서열번호 71에 제시된 FAR(FAR6)의 기능적 변이체이다.
일 실시형태에서, 이종성 FAR은 헬리오티스 FAR이다. 일 실시형태에서, FAR은 헬리오티스 서브플렉사 FAR, 예컨대, 서열번호 69에 제시된 바와 같은 FAR(FAR4)이다. 일부 실시형태에서, FAR은 적어도 60% 동일성을 갖는 헬리오티스 FAR의 기능적 변이체, 또는 헬리오티스 서브플렉사 FAR의 기능적 변이체, 예컨대, 서열번호 69에 제시된 FAR(FAR4)의 기능적 변이체이다.
일 실시형태에서, 이종성 FAR은 헬리오티스 FAR이다. 일 실시형태에서, FAR은 헬리오티스 비레센스 FAR, 예컨대, 서열번호 79에 제시된 바와 같은 FAR(FAR5)이다. 일부 실시형태에서, FAR은 적어도 60% 동일성을 갖는 헬리오티스 FAR의 기능적 변이체, 또는 헬리오티스 비레센스 FAR의 기능적 변이체, 예컨대, 서열번호 79에 제시된 FAR(FAR5)의 기능적 변이체이다.
일 실시형태에서, 이종성 FAR은 오스트리니아 FAR이다. 일 실시형태에서, FAR은 오스트리니아 푸르나칼리스 FAR, 예컨대, 서열번호 63에 제시된 바와 같은 FAR(FAR44)이다. 일부 실시형태에서, FAR은 적어도 60% 동일성을 갖는 오스트리니아 FAR의 기능적 변이체, 또는 오스트리니아 푸르나칼리스 FAR의 기능적 변이체, 예컨대, 서열번호 63에 제시된 FAR(FAR44)의 기능적 변이체이다.
일 실시형태에서, 이종성 FAR은 오스트리니아 FAR이다. 일 실시형태에서, FAR은 오스트리니아 자그 FAR, 예컨대, 서열번호 65에 제시된 바와 같은 FAR(FAR48)이다. 일부 실시형태에서, FAR은 적어도 60% 동일성을 갖는 오스트리니아 FAR의 기능적 변이체, 또는 오스트리니아 자그 FAR의 기능적 변이체, 예컨대, 서열번호 65에 제시된 FAR(FAR48)의 기능적 변이체이다.
일 실시형태에서, 이종성 FAR은 오스트리니아 FAR이다. 일 실시형태에서, FAR은 오스트리니아 제아(Ostrinia zea) FAR, 예컨대, 서열번호 67에 제시된 바와 같은 FAR(FAR49)이다. 일부 실시형태에서, FAR은 적어도 60% 동일성을 갖는 오스트리니아 FAR의 기능적 변이체, 또는 오스트리니아 제아 FAR의 기능적 변이체, 예컨대, 서열번호 67에 제시된 FAR(FAR49)의 기능적 변이체이다.
일 실시형태에서, 이종성 FAR은 플로디아 FAR이다. 일 실시형태에서, FAR은 플로디아 인터푼텔라 FAR, 예컨대, 서열번호 28(FAR28) 또는 서열번호 30(FAR32)에 제시된 바와 같은 FAR이다. 일부 실시형태에서, FAR은 적어도 60% 동일성을 갖는 플로디아 FAR의 기능적 변이체, 또는 플로디아 인터푼텔라 FAR의 기능적 변이체, 예컨대, 서열번호 28(FAR28) 또는 서열번호 30(FAR32)에 제시된 FAR의 기능적 변이체이다.
일 실시형태에서, 이종성 FAR은 스포돕테라 FAR이다. 일 실시형태에서, FAR은 스포돕테라 엑시구아 FAR, 예컨대, 서열번호 22(FAR16) 또는 서열번호 24(FAR17)에 제시된 바와 같은 FAR이다. 일 실시형태에서, FAR은 스포돕테라 리투라 FAR, 예컨대, 서열번호 26에 제시된 바와 같은 FAR(FAR19)이다. 일부 실시형태에서, FAR은 적어도 60%의 동일성을 갖는 스포돕테라 FAR의 기능적 변이체, 스포돕테라 엑시구아 FAR의 기능적 변이체, 스포돕테라 리투라 FAR의 기능적 변이체, 서열번호 22에 제시된 FAR(FAR16)의 기능적 변이체, 서열번호 24(FAR17) 또는 서열번호 26에 제시된 FAR(FAR19)의 기능적 변이체이다.
일 실시형태에서, 이종성 FAR은 트리코플루시아 FAR이다. 일 실시형태에서, FAR은 트리코플루시아 니 FAR, 예컨대, 서열번호 32에 제시된 바와 같은 FAR(FAR38)이다. 일부 실시형태에서, FAR은 적어도 60% 동일성을 갖는 트리코플루시아 FAR의 기능적 변이체, 또는 트리코플루시아 니 FAR의 기능적 변이체, 예컨대, 서열번호 32에 제시된 FAR(FAR38)의 기능적 변이체이다.
일 실시형태에서, 이종성 FAR은 이포노메우타 FAR이다. 일 실시형태에서, FAR은 이포노메우타 로렐루스 FAR, 예컨대, 서열번호 73에 제시된 바와 같은 FAR(FAR8)이다. 일부 실시형태에서, FAR은 적어도 60% 동일성을 갖는 이포노메우타 FAR의 기능적 변이체, 또는 이포노메우타 로렐루스 FAR, 예컨대, 서열번호 73에 제시된 FAR의 기능적 변이체(FAR8)이다.
주어진 효소에 관해 용어 "적어도 60% 동일성 또는 유사성을 갖는 이의 변이체"는 상기 효소와 60% 이상의 동일성 또는 유사성, 예컨대, 효소와 적어도 61% 이상, 예컨대, 적어도 62%, 예컨대, 적어도 63%, 예컨대, 적어도 64%, 예컨대, 적어도 65%, 예컨대, 적어도 66%, 예컨대, 적어도 67%, 예컨대, 적어도 68%, 예컨대, 적어도 69%, 예컨대, 적어도 70%, 예컨대, 적어도 71%, 예컨대, 적어도 72%, 예컨대, 적어도 73%, 예컨대, 적어도 74%, 예컨대, 적어도 75%, 예컨대, 적어도 76%, 예컨대, 적어도 77%, 예컨대, 적어도 78%, 예컨대, 적어도 79%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 81%, 예컨대, 적어도 82%, 예컨대, 적어도 83%, 예컨대, 적어도 84%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 86%, 예컨대, 적어도 87%, 예컨대, 적어도 88%, 예컨대, 적어도 89%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99% 동일성 또는 유사성을 갖는 변이체를 지칭하는 것으로 이해될 것이다.
본 발명의 세포는 적어도 1종의 이종성 FAR을 발현시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포는 1종의 이종성 FAR을 발현시킨다. 그러나, 동일 또는 상이할 수 있는 여러 이종성 FAR, 예컨대, 동일 또는 상이할 수 있는 적어도 2종의 이종성 FAR을 발현시키는 것이 바람직할 수 있다. 대안적으로, 적어도 1종의 이종성 FAR을 암호화하는 핵산의 여러 복제물, 예컨대, 적어도 2개의 복제물, 적어도 3종 이상의 복제물을 발현시키는 것이 바람직할 수 있다. 다른 실시형태에서, 세포는 적어도 2종의 이종성 FAR, 예를 들어, 3종의 이종성 FAR을 발현시킨다.
예를 들어, 상기 세포는 FAR1의 2개의 복제물 또는 이의 변이체; 또는 FAR1의 1개의 복제물 및 FAR16의 1개의 복제물; 또는 FAR1의 2개의 복제물, FAR16의 1개의 복제물 및 FAR19의 1개의 복제물을 발현시킬 수 있다.
탈포화효소 및 FAR
임의의 위의 FAR은 임의의 탈포화효소, 특히 본 명세서에 기재된 임의의 탈포화효소와 함께 발현될 수 있다.
일부 실시형태에서, 세포는 하기를 발현시킨다:
- 플로디아 인터푼텔라 Δ12 탈포화효소, 예를 들어, 서열번호 2에 제시된 바와 같은 Pid12, 및
- 드로소필라 탈포화효소, 예컨대, 드로소필라 비릴리스 탈포화효소, 예를 들어 서열번호 4에 제시된 바와 같은 Desat61, 또는 예컨대, 드로소필라 멜라노가스터 탈포화효소, 예를 들어, 서열번호 6에 제시된 바와 같은 Desat24, 또는 예컨대, 드로소필라 그림샤위 탈포화효소, 예를 들어 서열번호 8에 제시된 바와 같은 Desat59, 또는 예컨대, 드로소필라 야쿠바 탈포화효소, 예를 들어, 서열번호 57에 제시된 바와 같은 Desat56, 또는 예컨대 드로소필라 아나나사에 탈포화효소, 예를 들어 서열번호 59에 제시된 바와 같은 Desat60; 아미엘로이스 탈포화효소, 예컨대, 아미엘로이스 트란시텔라 탈포화효소, 예를 들어 서열번호 10에 제시된 바와 같은 Desat17 또는 서열번호 12에 제시된 바와 같은 Desat18; 코리스토네우라 탈포화효소, 예컨대, 코리스토네우라 파랄렐라 탈포화효소, 예를 들어 서열번호 61에 제시된 바와 같은 Desat74; 스포돕테라 탈포화효소, 예컨대, 스포돕테라 리투라 탈포화효소, 예를 들어 서열번호 18에 제시된 바와 같은 Desat26; 사카로마이세스 탈포화효소, 예컨대, 사카로마이세스 세레비시애 탈포화효소, 예를 들어 서열번호 14에 제시된 바와 같은 Desat42; 야로위아 탈포화효소, 예컨대, 야로위아 리폴리티카 탈포화효소, 예를 들어, 서열번호 16에 제시된 바와 같은 Desat69로부터 선택된, 추가 탈포화효소; 및/또는
- 아그로티스 FAR, 예컨대, 아그로티스 세게툼 FAR, 예를 들어, 서열번호 75에 제시된 바와 같은 FAR12; 바이사이클러스 FAR, 예컨대, 바이사이클러스 아니나나 FAR, 예를 들어, 서열번호 77에 제시된 바와 같은 FAR11; 헬리코베르파 FAR, 예컨대, 헬리코베르파 아르미게라 FAR 또는 헬리코베르파 아설타 FAR, 예를 들어, 서열번호 20에 제시된 바와 같은 FAR1 또는 서열번호 71에 제시된 바와 같은 FAR6; 헬리오티스 FAR, 예컨대, 헬리오티스 서브플렉사 FAR 또는 헬리오티스 비레센스 FAR, 예를 들어 서열번호 69에 제시된 바와 같은 FAR4 또는 서열번호 79에 제시된 바와 같은 FAR5; 오스트리니아 FAR, 예컨대, 오스트리니아 푸르나칼리스 FAR, 오스트리니아 자그 FAR 또는 오스트리니아 제아 FAR, 예를 들어, 서열번호 63에 제시된 바와 같은 FAR44, 서열번호 65에 제시된 바와 같은 FAR48 또는 서열번호 67에 제시된 바와 같은 FAR49; 플로디아 FAR, 예컨대, 플로디아 인터푼텔라 FAR, 예를 들어, 서열번호 28에 제시된 바와 같은 FAR28 또는 서열번호 30에 제시된 바와 같은 FAR32; 스포돕테라 FAR, 예컨대, 스포돕테라 엑시구아 FAR, 예를 들어, 서열번호 22에 제시된 바와 같은 FAR16, 또는 서열번호 24에 제시된 바와 같은 FAR17, 또는 예컨대, 스포돕테라 리투라 FAR, 예를 들어, 서열번호 26에 제시된 바와 같은 FAR19; 트리코플루시아 FAR, 예컨대, 트리코플루시아 니 FAR, 예를 들어, 서열번호 32에 제시된 바와 같은 FAR38; 이포노메우타 FAR, 예컨대, 이포노메우타 로렐루스 FAR, 예를 들어, 서열번호 73에 제시된 바와 같은 FAR8로부터 선택된, FAR;
또는 이들과 적어도 60% 동일성 또는 유사성을 갖는 기능적 변이체.
일부 실시형태에서, 세포는 하기를 발현시킨다:
- 카드라 카우텔라 Δ12 탈포화효소, 예를 들어, 서열번호 55에 제시된 바와 같은 EcauDes12, 및
- 드로소필라 탈포화효소, 예컨대, 드로소필라 비릴리스 탈포화효소, 예를 들어 서열번호 4에 제시된 바와 같은 Desat61, 또는 예컨대, 드로소필라 멜라노가스터 탈포화효소, 예를 들어, 서열번호 6에 제시된 바와 같은 Desat24, 또는 예컨대, 드로소필라 그림샤위 탈포화효소, 예를 들어 서열번호 8에 제시된 바와 같은 Desat59, 또는 예컨대, 드로소필라 야쿠바 탈포화효소, 예를 들어, 서열번호 57에 제시된 바와 같은 Desat56, 또는 예컨대 드로소필라 아나나사에 탈포화효소, 예를 들어 서열번호 59에 제시된 바와 같은 Desat60; 아미엘로이스 탈포화효소, 예컨대, 아미엘로이스 트란시텔라 탈포화효소, 예를 들어 서열번호 10에 제시된 바와 같은 Desat17 또는 서열번호 12에 제시된 바와 같은 Desat18; 코리스토네우라 탈포화효소, 예컨대, 코리스토네우라 파랄렐라 탈포화효소, 예를 들어 서열번호 61에 제시된 바와 같은 Desat74; 스포돕테라 탈포화효소, 예컨대, 스포돕테라 리투라 탈포화효소, 예를 들어 서열번호 18에 제시된 바와 같은 Desat26; 사카로마이세스 탈포화효소, 예컨대, 사카로마이세스 세레비시애 탈포화효소, 예를 들어 서열번호 14에 제시된 바와 같은 Desat42; 야로위아 탈포화효소, 예컨대, 야로위아 리폴리티카 탈포화효소, 예를 들어, 서열번호 16에 제시된 바와 같은 Desat69로부터 선택된, 추가 탈포화효소; 및/또는
- 아그로티스 FAR, 예컨대, 아그로티스 세게툼 FAR, 예를 들어, 서열번호 75에 제시된 바와 같은 FAR12; 바이사이클러스 FAR, 예컨대, 바이사이클러스 아니나나 FAR, 예를 들어, 서열번호 77에 제시된 바와 같은 FAR11; 헬리코베르파 FAR, 예컨대, 헬리코베르파 아르미게라 FAR 또는 헬리코베르파 아설타 FAR, 예를 들어, 서열번호 20에 제시된 바와 같은 FAR1 또는 서열번호 71에 제시된 바와 같은 FAR6; 헬리오티스 FAR, 예컨대, 헬리오티스 서브플렉사 FAR 또는 헬리오티스 비레센스 FAR, 예를 들어 서열번호 69에 제시된 바와 같은 FAR4 또는 서열번호 79에 제시된 바와 같은 FAR5; 오스트리니아 FAR, 예컨대, 오스트리니아 푸르나칼리스 FAR, 오스트리니아 자그 FAR 또는 오스트리니아 제아 FAR, 예를 들어, 서열번호 63에 제시된 바와 같은 FAR44, 서열번호 65에 제시된 바와 같은 FAR48 또는 서열번호 67에 제시된 바와 같은 FAR49; 플로디아 FAR, 예컨대, 플로디아 인터푼텔라 FAR, 예를 들어, 서열번호 28에 제시된 바와 같은 FAR28 또는 서열번호 30에 제시된 바와 같은 FAR32; 스포돕테라 FAR, 예컨대, 스포돕테라 엑시구아 FAR, 예를 들어, 서열번호 22에 제시된 바와 같은 FAR16, 또는 서열번호 24에 제시된 바와 같은 FAR17, 또는 예컨대, 스포돕테라 리투라 FAR, 예를 들어, 서열번호 26에 제시된 바와 같은 FAR19; 트리코플루시아 FAR, 예컨대, 트리코플루시아 니 FAR, 예를 들어, 서열번호 32에 제시된 바와 같은 FAR38; 이포노메우타 FAR, 예컨대, 이포노메우타 로렐루스 FAR, 예를 들어, 서열번호 73에 제시된 바와 같은 FAR8로부터 선택된, FAR;
또는 이들과 적어도 60% 동일성 또는 유사성을 갖는 기능적 변이체.
일부 실시형태에서, 세포는 하기를 발현시킨다:
- 에페스티아 쿠에니엘라 Δ12 탈포화효소, 예를 들어, 서열번호 85에 제시된 바와 같은 Eku_d12, 및
- 드로소필라 탈포화효소, 예컨대, 드로소필라 비릴리스 탈포화효소, 예를 들어 서열번호 4에 제시된 바와 같은 Desat61, 또는 예컨대, 드로소필라 멜라노가스터 탈포화효소, 예를 들어, 서열번호 6에 제시된 바와 같은 Desat24, 또는 예컨대, 드로소필라 그림샤위 탈포화효소, 예를 들어 서열번호 8에 제시된 바와 같은 Desat59, 또는 예컨대, 드로소필라 야쿠바 탈포화효소, 예를 들어, 서열번호 57에 제시된 바와 같은 Desat56, 또는 예컨대 드로소필라 아나나사에 탈포화효소, 예를 들어 서열번호 59에 제시된 바와 같은 Desat60; 아미엘로이스 탈포화효소, 예컨대, 아미엘로이스 트란시텔라 탈포화효소, 예를 들어 서열번호 10에 제시된 바와 같은 Desat17 또는 서열번호 12에 제시된 바와 같은 Desat18; 코리스토네우라 탈포화효소, 예컨대, 코리스토네우라 파랄렐라 탈포화효소, 예를 들어 서열번호 61에 제시된 바와 같은 Desat74; 스포돕테라 탈포화효소, 예컨대, 스포돕테라 리투라 탈포화효소, 예를 들어 서열번호 18에 제시된 바와 같은 Desat26; 사카로마이세스 탈포화효소, 예컨대, 사카로마이세스 세레비시애 탈포화효소, 예를 들어 서열번호 14에 제시된 바와 같은 Desat42; 야로위아 탈포화효소, 예컨대, 야로위아 리폴리티카 탈포화효소, 예를 들어, 서열번호 16에 제시된 바와 같은 Desat69로부터 선택된, 추가 탈포화효소; 및/또는
- 아그로티스 FAR, 예컨대, 아그로티스 세게툼 FAR, 예를 들어, 서열번호 75에 제시된 바와 같은 FAR12; 바이사이클러스 FAR, 예컨대, 바이사이클러스 아니나나 FAR, 예를 들어, 서열번호 77에 제시된 바와 같은 FAR11; 헬리코베르파 FAR, 예컨대, 헬리코베르파 아르미게라 FAR 또는 헬리코베르파 아설타 FAR, 예를 들어, 서열번호 20에 제시된 바와 같은 FAR1 또는 서열번호 71에 제시된 바와 같은 FAR6; 헬리오티스 FAR, 예컨대, 헬리오티스 서브플렉사 FAR 또는 헬리오티스 비레센스 FAR, 예를 들어 서열번호 69에 제시된 바와 같은 FAR4 또는 서열번호 79에 제시된 바와 같은 FAR5; 오스트리니아 FAR, 예컨대, 오스트리니아 푸르나칼리스 FAR, 오스트리니아 자그 FAR 또는 오스트리니아 제아 FAR, 예를 들어, 서열번호 63에 제시된 바와 같은 FAR44, 서열번호 65에 제시된 바와 같은 FAR48 또는 서열번호 67에 제시된 바와 같은 FAR49; 플로디아 FAR, 예컨대, 플로디아 인터푼텔라 FAR, 예를 들어, 서열번호 28에 제시된 바와 같은 FAR28 또는 서열번호 30에 제시된 바와 같은 FAR32; 스포돕테라 FAR, 예컨대, 스포돕테라 엑시구아 FAR, 예를 들어, 서열번호 22에 제시된 바와 같은 FAR16, 또는 서열번호 24에 제시된 바와 같은 FAR17, 또는 예컨대, 스포돕테라 리투라 FAR, 예를 들어, 서열번호 26에 제시된 바와 같은 FAR19; 트리코플루시아 FAR, 예컨대, 트리코플루시아 니 FAR, 예를 들어, 서열번호 32에 제시된 바와 같은 FAR38; 이포노메우타 FAR, 예컨대, 이포노메우타 로렐루스 FAR, 예를 들어, 서열번호 73에 제시된 바와 같은 FAR8로부터 선택된, FAR;
또는 이들과 적어도 60% 동일성 또는 유사성을 갖는 기능적 변이체.
일부 실시형태에서, 세포는 하기를 발현시킨다:
- 에페스티아 엘루텔라 Δ12 탈포화효소, 예를 들어, 서열번호 87에 제시된 바와 같은 Ee_d12, 및
- 드로소필라 탈포화효소, 예컨대, 드로소필라 비릴리스 탈포화효소, 예를 들어 서열번호 4에 제시된 바와 같은 Desat61, 또는 예컨대, 드로소필라 멜라노가스터 탈포화효소, 예를 들어, 서열번호 6에 제시된 바와 같은 Desat24, 또는 예컨대, 드로소필라 그림샤위 탈포화효소, 예를 들어 서열번호 8에 제시된 바와 같은 Desat59, 또는 예컨대, 드로소필라 야쿠바 탈포화효소, 예를 들어, 서열번호 57에 제시된 바와 같은 Desat56, 또는 예컨대 드로소필라 아나나사에 탈포화효소, 예를 들어 서열번호 59에 제시된 바와 같은 Desat60; 아미엘로이스 탈포화효소, 예컨대, 아미엘로이스 트란시텔라 탈포화효소, 예를 들어 서열번호 10에 제시된 바와 같은 Desat17 또는 서열번호 12에 제시된 바와 같은 Desat18; 코리스토네우라 탈포화효소, 예컨대, 코리스토네우라 파랄렐라 탈포화효소, 예를 들어 서열번호 61에 제시된 바와 같은 Desat74; 스포돕테라 탈포화효소, 예컨대, 스포돕테라 리투라 탈포화효소, 예를 들어 서열번호 18에 제시된 바와 같은 Desat26; 사카로마이세스 탈포화효소, 예컨대, 사카로마이세스 세레비시애 탈포화효소, 예를 들어 서열번호 14에 제시된 바와 같은 Desat42; 야로위아 탈포화효소, 예컨대, 야로위아 리폴리티카 탈포화효소, 예를 들어, 서열번호 16에 제시된 바와 같은 Desat69로부터 선택된, 추가 탈포화효소; 및/또는
- 아그로티스 FAR, 예컨대, 아그로티스 세게툼 FAR, 예를 들어, 서열번호 75에 제시된 바와 같은 FAR12; 바이사이클러스 FAR, 예컨대, 바이사이클러스 아니나나 FAR, 예를 들어, 서열번호 77에 제시된 바와 같은 FAR11; 헬리코베르파 FAR, 예컨대, 헬리코베르파 아르미게라 FAR 또는 헬리코베르파 아설타 FAR, 예를 들어, 서열번호 20에 제시된 바와 같은 FAR1 또는 서열번호 71에 제시된 바와 같은 FAR6; 헬리오티스 FAR, 예컨대, 헬리오티스 서브플렉사 FAR 또는 헬리오티스 비레센스 FAR, 예를 들어 서열번호 69에 제시된 바와 같은 FAR4 또는 서열번호 79에 제시된 바와 같은 FAR5; 오스트리니아 FAR, 예컨대, 오스트리니아 푸르나칼리스 FAR, 오스트리니아 자그 FAR 또는 오스트리니아 제아 FAR, 예를 들어, 서열번호 63에 제시된 바와 같은 FAR44, 서열번호 65에 제시된 바와 같은 FAR48 또는 서열번호 67에 제시된 바와 같은 FAR49; 플로디아 FAR, 예컨대, 플로디아 인터푼텔라 FAR, 예를 들어, 서열번호 28에 제시된 바와 같은 FAR28 또는 서열번호 30에 제시된 바와 같은 FAR32; 스포돕테라 FAR, 예컨대, 스포돕테라 엑시구아 FAR, 예를 들어, 서열번호 22에 제시된 바와 같은 FAR16, 또는 서열번호 24에 제시된 바와 같은 FAR17, 또는 예컨대, 스포돕테라 리투라 FAR, 예를 들어, 서열번호 26에 제시된 바와 같은 FAR19; 트리코플루시아 FAR, 예컨대, 트리코플루시아 니 FAR, 예를 들어, 서열번호 32에 제시된 바와 같은 FAR38; 이포노메우타 FAR, 예컨대, 이포노메우타 로렐루스 FAR, 예를 들어, 서열번호 73에 제시된 바와 같은 FAR8로부터 선택된, FAR;
또는 이들과 적어도 60% 동일성 또는 유사성을 갖는 기능적 변이체.
위와 같은 주어진 FAR 또는 탈포화효소와 적어도 60% 동일성 또는 유사성을 갖는 FAR 또는 탈포화효소의 기능적 변이체는 FAR 또는 탈포화효소와 적어도 61%, 예컨대, 적어도 62%, 예컨대, 적어도 63%, 예컨대, 적어도 64%, 예컨대, 적어도 65%, 예컨대, 적어도 66%, 예컨대, 적어도 67%, 예컨대, 적어도 68%, 예컨대, 적어도 69%, 예컨대, 적어도 70%, 예컨대, 적어도 71%, 예컨대, 적어도 72%, 예컨대, 적어도 73%, 예컨대, 적어도 74%, 예컨대, 적어도 75%, 예컨대, 적어도 76%, 예컨대, 적어도 77%, 예컨대, 적어도 78%, 예컨대, 적어도 79%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 81%, 예컨대, 적어도 82%, 예컨대, 적어도 83%, 예컨대, 적어도 84%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 86%, 예컨대, 적어도 87%, 예컨대, 적어도 88%, 예컨대, 적어도 89%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%, 예컨대, 100% 동일성 또는 유사성을 가질 수 있다는 것이 이해될 것이다.
상기 Δ12 탈포화효소, 추가 탈포화효소 및 FAR을 발현시키는 효모 세포는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올을 생산할 수 있다.
효모 세포
본 발명은 탈포화 화합물, 특히, 12번 위치에 적어도 하나의 이중결합을 갖는 탈포화 지방 아실-CoA 및 탈포화 지방 알코올을 생산하도록 변형 또는 조작된 효모 세포를 제공한다. 이들 중 일부는 페로몬의 구성성분이다. 따라서 본 명세서에 개시된 효모 세포는 환경 친화적 페로몬 생산을 위한 개선된 플랫폼을 제공한다.
따라서, 본 명세서에서 n'개의 이중결합(들)을 갖는 탈포화 지방 아실-CoA를 생산할 수 있는 효모 세포가 제공되되, 상기 이중결합(들) 중 적어도 하나는 12번 위치에 있고,
상기 효모 세포는 이종성 Δ12 탈포화효소를 발현시키고, 상기 탈포화효소는, 적어도 13개의 탄소 사슬 길이를 갖고 n개의 이중결합(들)을 갖는, 포화 또는 탈포화 지방 아실-CoA, 바람직하게는 탈포화 지방 아실-CoA의 12번 위치에 이중결합을 도입할 수 있고,
n 및 n'는 정수이며,
0 ≤ n ≤ 3이고, 1 ≤ n' ≤ 4이다.
바람직한 실시형태에서, 기질로서 사용되는 포화 또는 탈포화 지방 아실-CoA 및 n'개의 이중결합을 갖는 탈포화 지방 아실-CoA는 동일한 탄소 사슬 길이를 갖는다.
이종성 Δ12 탈포화효소는 부문 "Δ12 탈포화효소"에 개시되어 있을 수 있다. 예를 들어, Δ12 탈포화효소는 플로디아 Δ12 탈포화효소, 예컨대, 플로디아 인터푼텔라 Δ12 탈포화효소, 예컨대, 서열번호 2에 제시된 바와 같은 Δ12 탈포화효소(Pid12), 또는 이들과 적어도 60% 유사성 또는 동일성을 갖는 이들의 기능적 변이체일 수 있다. 예를 들어, Δ12 탈포화효소는 카우텔라 Δ12 탈포화효소, 예컨대, 카우텔라 Δ12 탈포화효소, 예컨대, 서열번호 55에 제시된 바와 같은 Δ12 탈포화효소(EcauDes12), 또는 이들과 적어도 60% 유사성 또는 동일성을 갖는 이들의 기능적 변이체일 수 있다. 예를 들어, Δ12 탈포화효소는 에페스티아 Δ12 탈포화효소, 예컨대, 에페스티아 쿠에니엘라 Δ12 탈포화효소 또는 에페스티아 엘루텔라 Δ12 탈포화효소, 예컨대, 서열번호 85에 제시된 바와 같은 Δ12 탈포화효소(Eku_d12) 또는 서열번호 87(Ee_d12), 또는 이들과 적어도 60% 유사성 또는 동일성을 갖는 이들의 기능적 변이체일 수 있다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 효모 세포는 부문 "추가 탈포화효소"에서 본 명세서에 개시될 수 있는 추가 탈포화효소를 발현시킨다. 예를 들어, 추가 탈포화효소는 12번 위치 이외의 위치에 포화 또는 탈포화 지방산에 이중결합을 도입할 수 있는 탈포화효소일 수 있다. 일부 실시형태에서, 탈포화효소는 드로소필라 탈포화효소, 예컨대, 드로소필라 비릴리스 탈포화효소, 예를 들어 서열번호 4에 제시된 바와 같은 Desat61, 또는 예컨대, 드로소필라 멜라노가스터 탈포화효소, 예를 들어, 서열번호 6에 제시된 바와 같은 Desat24, 또는 예컨대, 드로소필라 그림샤위 탈포화효소, 예를 들어 서열번호 8에 제시된 바와 같은 Desat59, 또는 예컨대, 드로소필라 야쿠바 탈포화효소, 예를 들어, 서열번호 57에 제시된 바와 같은 Desat56, 또는 예컨대 드로소필라 아나나사에 탈포화효소, 예를 들어 서열번호 59에 제시된 바와 같은 Desat60; 아미엘로이스 탈포화효소, 예컨대, 아미엘로이스 트란시텔라 탈포화효소, 예를 들어 서열번호 10에 제시된 바와 같은 Desat17 또는 서열번호 12에 제시된 바와 같은 Desat18; 코리스토네우라 탈포화효소, 예컨대, 코리스토네우라 파랄렐라 탈포화효소, 예를 들어 서열번호 61에 제시된 바와 같은 Desat74; 스포돕테라 탈포화효소, 예컨대, 스포돕테라 리투라 탈포화효소, 예를 들어 서열번호 18에 제시된 바와 같은 Desat26; 사카로마이세스 탈포화효소, 예컨대, 사카로마이세스 세레비시애 탈포화효소, 예를 들어 서열번호 14에 제시된 바와 같은 Desat42; 야로위아 탈포화효소, 예컨대, 야로위아 리폴리티카 탈포화효소, 예를 들어, 서열번호 16에 제시된 바와 같은 Desat69 또는 이들과 적어도 60% 유사성 또는 동일성을 갖는 이의 기능적 변이체이다.
이종성 Δ12 탈포화효소 및 추가 탈포화효소를 발현시키는 효모 세포는 12번 위치에 이중결합 및 하나의 다른 위치에 이중결합을 갖는 이중 탈포화 지방 아실-CoA를 생산할 수 있다. 일 실시형태에서, 이종성 Δ12 탈포화효소 및 추가 이종성 탈포화효소를 발현시키는 효모 세포는 12번 위치 및 9번 위치에 이중결합을 갖는 지방 아실-CoA, 예를 들어 (Z9, E12)-테트라데카다이엔오일-CoA를 생산할 수 있다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 효모 세포는 부문 "지방 아실-CoA 환원효소"에서 본 명세서에 개시될 수 있는 FAR을 발현시킨다. 예를 들어, FAR은 아그로티스 FAR, 예컨대, 아그로티스 세게툼 FAR, 예를 들어, 서열번호 75에 제시된 바와 같은 FAR12; 바이사이클러스 FAR, 예컨대, 바이사이클러스 아니나나 FAR, 예를 들어, 서열번호 77에 제시된 바와 같은 FAR11; 헬리코베르파 FAR, 예컨대, 헬리코베르파 아르미게라 FAR 또는 헬리코베르파 아설타 FAR, 예를 들어, 서열번호 20에 제시된 바와 같은 FAR1 또는 서열번호 71에 제시된 바와 같은 FAR6; 헬리오티스 FAR, 예컨대, 헬리오티스 서브플렉사 FAR 또는 헬리오티스 비레센스 FAR, 예를 들어 서열번호 69에 제시된 바와 같은 FAR4 또는 서열번호 79에 제시된 바와 같은 FAR5; 오스트리니아 FAR, 예컨대, 오스트리니아 푸르나칼리스 FAR, 오스트리니아 자그 FAR 또는 오스트리니아 제아 FAR, 예를 들어, 서열번호 63에 제시된 바와 같은 FAR44, 서열번호 65에 제시된 바와 같은 FAR48 또는 서열번호 67에 제시된 바와 같은 FAR49; 플로디아 FAR, 예컨대, 플로디아 인터푼텔라 FAR, 예를 들어, 서열번호 28에 제시된 바와 같은 FAR28 또는 서열번호 30에 제시된 바와 같은 FAR32; 스포돕테라 FAR, 예컨대, 스포돕테라 엑시구아 FAR, 예를 들어, 서열번호 22에 제시된 바와 같은 FAR16, 또는 서열번호 24에 제시된 바와 같은 FAR17, 또는 예컨대, 스포돕테라 리투라 FAR, 예를 들어, 서열번호 26에 제시된 바와 같은 FAR19; 트리코플루시아 FAR, 예컨대, 트리코플루시아 니 FAR, 예를 들어, 서열번호 32에 제시된 바와 같은 FAR38; 이포노메우타 FAR, 예컨대, 이포노메우타 로렐루스 FAR, 예를 들어, 서열번호 73에 제시된 바와 같은 FAR8; 또는 이들과 적어도 60% 유사성 또는 동일성을 갖는 이들의 기능적 변이체일 수 있다.
이종성 Δ12 탈포화효소, 추가 탈포화효소 및 FAR을 발현시키는 효모 세포는 이중 탈포화 지방 알코올, 예를 들어 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올을 생산할 수 있다. 다시 말해서, 이종성 Δ12 탈포화효소, 추가 탈포화효소 및 FAR을 발현시키는 효모 세포는 FAR의 작용에 의해 이종성 Δ12 탈포화효소 및 추가 이종성 탈포화효소에 의해 생산된 (Z9, E12)-테트라데카다이엔오일-CoA의 적어도 일부를 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올로 전환시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 이종성 Δ12 탈포화효소, 추가 이종성 탈포화효소 또는 FAR을 암호화하는 유전자는 상기 효모 세포에 대해 코돈 최적화되었다.
일 실시형태에서, 이종성 Δ12 탈포화효소, 추가 이종성 탈포화효소 또는 FAR을 암호화하는 유전자 중 적어도 하나는 효모 세포에서 높은 복제수로 존재한다.
일 실시형태에서, 이종성 Δ12 탈포화효소, 추가 이종성 탈포화효소 또는 FAR을 암호화하는 유전자 중 적어도 하나는 유도성 프로모터의 제어 하에 있다.
일 실시형태에서, 이종성 Δ12 탈포화효소, 추가 이종성 탈포화효소 또는 FAR을 암호화하는 유전자 중 적어도 하나는 각각 독립적으로 세포의 게놈 내에 또는 효모 세포 내에 포함된 벡터 내에 각각 독립적으로 포함된다.
일 실시형태에서, 효모 세포는 사카로마이세스, 피키아, 야로위아, 클루이베로미세스, 칸디다(Candida), 로도토룰라(Rhodotorula), 로도스포리디움(Rhodosporidium), 크립토코커스(Cryptococcus), 트리코스포론(Trichosporon) 및 리포마이세스(Lipomyces)로부터 선택되는 속에 속하되, 선택적으로 효모 세포는 사카로마이세스 세레비시애, 사카로마이세스 보울라디(Saccharomyces boulardi), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 클루이베로미세스 막시아누스(Kluyveromyces marxianus), 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 크립토코커스 알비두스(Cryptococcus albidus), 리포마이세스 리포페라(Lipomyces lipofera), 리포마이세스 스타키(Lipomyces starkeyi), 로도스포리디움 토룰로이데스(Rhodosporidium toruloides), 로도토룰라 글루티니스(Rhodotorula glutinis), 트리코스포론 풀루란(Trichosporon pullulan) 및 야로위아 리폴리티카로부터 선택된 종에 속하며, 바람직하게는 효모 세포는 야로위아 리폴리티카 세포 또는 사카로마이세스 세레비시애 세포이다.
일부 실시형태에서, 효모 세포는 부문 "핵산"에 기재된 바와 같은 핵산 또는 핵산의 시스템을 포함한다.
본 발명에 따른 효모 세포는 발효 브로스, 발효 시스템 및/또는 촉매 시스템에 포함될 수 있다. 다시 말해서, 발효 브로스, 발효 시스템 및/또는 촉매 시스템은 본 발명에 따른 효모 세포를 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 효모 세포는 이종성 NAD(P)H 사이토크롬 b5 옥시도환원효소(Ncb5or)를 추가로 발현시킨다. 용어 'NAD(P)H 사이토크롬 b5 산화환원효소'와 'Ncb5or'은 본 명세서에서 호환 가능하게 사용될 것이다. 용어 '이종성 Ncb5or'은 유기체에 의해, 예컨대, 세포에 의해 자연적으로 발현되지 않는 Ncb5or을 지칭한다.
Ncb5or은 억셉터로서 헴 단백질을 이용하여 NADH 또는 NADPH 상에서 작용하는 산화환원효소이다. 이는 사이토크롬 b5, 사이토크롬 b5 환원효소 및 CHORD-SGT1과 유사한 기능적 도메인을 포함한다 (Deng, et al., 2010). Ncb5or은 하기 반응을 촉매한다:
2 Fe3+ + NAD(P)H <=> 2 Fe2+ + H+ + NAD(P)+
이러한 반응을 촉매할 수 있는 Ncb5or은 EC 번호 1.6.2.2를 갖는다.
탈포화효소 및/또는 FAR을 발현시키는 세포에서 하나 이상의 Ncb5or의 발현은 탈포화효소 및/또는 FAR의 활성에 대해 긍정적 효과를 갖는데, 이것이 탈포화 지방 아실-CoA 및/또는 탈포화 지방 알코올 역가의 증가를 초래하기 때문이다. 따라서, 탈포화효소 및/또는 FAR 및 하나 이상의 Ncb5or을 발현시키는 효모 세포는 동일한 조건에서 배양될 때 동일한 탈포화효소 및/또는 FAR을 발현시키지만 이종성 Ncb5or을 발현시키지 않는 효모 세포에 비해서 더 높은 역가를 갖는 상기 화합물을 생산할 수 있다.
Ncb5or은 식물, 곤충 또는 포유류, 예컨대, 호모 사피엔스에 대해 천연일 수 있다. 일 실시형태에서, Ncb5or은 아그로티스, 아미엘로이스, 아판토푸스(Aphantopus), 아크티아(Arctia), 바이사이클러스, 봄버스, 봄빅스, 칠로, 시디아, 다나우스(Danaus), 드로소필라, 유메타(Eumeta), 갤러리아, 헬리코베르파, 헬리오티스, 하이포스모코마, 렙티데아(Leptidea), 로베시아, 맨듀카, 오페로프테라, 오스트리니아, 파필리오, 파필리오(Papilio), 파필리오, 피에리스(Pieris), 플루텔라, 스포돕테라, 트리코플루시아 및 바네사(Vanessa) 속의 곤충과 같은 곤충에 대해 천연이다. 일 실시형태에서, Ncb5or은 아그로티스 세게툼, 아미엘로이스 트란시텔라, 아판토푸스 하이퍼란투스(Aphantopus hyperantus), 아크티아 플란타기니스(Arctia plantaginis), 바이사이클러스 아니나나, 봄버스 테레스트리스(Bombus terrestris), 봄빅스 만다리나, 봄빅스 모리, 칠로 수프레살리스, 시디아 포모넬라, 다나우스 플렉시푸스(Danaus plexippus), 드로소필라 그림샤위, 드로소필라 멜라노가스터, 유메타 자포니카(Eumeta japonica), 갤러리아 멜로넬라(Galleria mellonella), 헬리코베르파 아르미게라, 헬리오티스 비레센스, 하이포스모코마 카하마노아(Hyposmocoma kahamanoa), 렙티데아 시나피스(Leptidea sinapis), 로베시아 보트라나, 맨듀카 섹스타, 오페로프테라 브루마타(Operophtera brumata), 오스트리니아 푸르나칼리스, 파필리오 마카온(Papilio machaon), 파필리오 폴리테스(Papilio polytes), 파필리오 크수토스(Papilio xuthus), 피에리스 라파에(Pieris rapae), 플루텔라 자일로스텔라, 스포돕테라 프루기페르다, 스포돕테라 리투라, 트리코플루시아 니 및 바네사 타메아메아(Vanessa tameamea)로부터 선택된 곤충에 대해 천연이다.
일 실시형태에서, Ncb5or은 2022년 5월 10일자로 동일한 출원인에 의해 출원된 특허 출원 PCT/EP2022/062641(발명의 명칭: "Improved methods and cells for increasing enzyme activity and production of insect pheromones")의 서열 개요" 부문의 표 "Ncb5or"에 제시된 그룹으로부터 선택된다.
따라서, 일 실시형태에서, Ncb5or은 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41, 서열번호 88, 서열번호 89 및 서열번호 90에 제시된 Ncb5or 또는 이와 적어도 70% 동일성 또는 유사성, 예컨대, 적어도 75% 동일성, 예컨대, 적어도 80% 동일성, 예컨대, 적어도 85% 동일성, 예컨대, 적어도 90% 동일성, 예컨대, 이와 적어도 95% 동일성 또는 유사성을 갖는 기능적 변이체의 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 효모 세포는 WO 2018/109163 및 유럽 특허 3555268, 특히 표제 "Reduced activity of Hfd1, Hfd4, Pex10, Fao1, GPAT 또는 이의 상동체의 감소된 활성" 부문에 개시된 바와 같은 하나 이상의 단백질의 감소된 활성을 갖는다. 예를 들어, 효모 세포는 Pex10, Hfd1, Hfd4, Fao1 및/또는 GPAT의 감소된 활성(즉, 하향조절)을 초래하는 돌연변이를 가질 수 있다. 바람직하게는, 효모 세포는 적어도 Fao1 및 Hfd1, Hfd4, Pex10 및/또는 GPAT 중 하나 이상의 감소된 활성을 초래하는 적어도 하나의 돌연변이를 갖는다. 이러한 돌연변이는 이종성 탈포화효소 및 이종성 지방 아실-CoA 환원효소를 발현시키는 효모 세포에서 탈포화 지방 알코올 및/또는 탈포화 지방 알코올 아세테이트의 생산을 증가시킬 수 있다.
따라서, 일 실시형태에서, 효모 세포는 Hfd1, Hfd4, GPAT, Fao1, Pex10 중 하나 이상의 활성의 부분적 또는 전체적 상실을 야기하는 돌연변이를 갖고, 예컨대, 적어도, Fao1 및 Hfd1, Hfd4, Pex10 또는 GPAT 중 하나 이상의 활성의 부분적 또는 전체적 상실을 야기하는 돌연변이를 갖는다.
일 실시형태에서, 효모 세포는 PEX10(수탁번호: XP_501311.1) 및 HFD1(수탁번호: XP_505802.1), HFD4(수탁번호: XP_500380.1X), FAO1(수탁번호: XP_500864.1) 및/또는 GPAT(수탁번호: XP_501275.1) 중 적어도 하나 또는 이들과 적어도 60% 동일성을 갖는 이들의 상동체의 돌연변이를 갖는다.
일 실시형태에서, 효모 세포는 FAO1(수탁번호: XP_500864.1) 및 HFD1(수탁번호: XP_505802.1), HFD4(수탁번호: XP_500380.1X), PEX10(수탁번호: XP_501311.1) 및/또는 GPAT(수탁번호: XP_501275.1) 중 적어도 하나, 또는 이들과 적어도 60% 동일성을 갖는 이들의 상동체의 돌연변이를 갖는다.
일 실시형태에서, HFD1(수탁번호: XP_505802.1), HFD4(수탁번호: XP_500380.1X), PEX10(수탁번호: XP_501311.1) 및/또는 FAO1(수탁번호: XP_500864.1) 또는 이들과 적어도 60% 동일성을 갖는 이들의 상동체가 결실 또는 돌연변이되어, Hfd1, Hfd4, Pex10 및/또는 Fao1 및/또는 GPAT 또는 이들과 적어도 60% 동일성을 갖는 이들의 상동체 활성의 부분적 상실 또는 전체적 상실이 야기되도록 돌연변이되고, GPAT의 감소된 활성을 초래한다.
일 실시형태에서, 효모 세포는 적어도 하나의 POX 유전자, 예컨대, POX1(수탁번호: O74934.1), POX2(수탁번호: XP_505264.1), POX3(수탁번호: XP_503244.1), POX4(수탁번호: XP_504475.1), POX5(수탁번호: XP_502199.1) 및 POX6(수탁번호: XP_503632.1)으로 이루어진 군으로부터 선택된 POX 유전자의 돌연변이를 포함한다.
일 실시형태에서, 효모 세포는 POX1(수탁번호: O74934.1), POX2(수탁번호: XP_505264.1), POX3(수탁번호: XP_503244.1), POX4(수탁번호: XP_504475.1), POX5(수탁번호: XP_502199.1) 및/또는 POX6(수탁번호: XP_503632.1) 또는 이들과 적어도 60% 동일성을 갖는 이들의 상동체의 결실 또는 돌연변이를 포함하여, Pox1, Pox2, Pox3, Pox4, Pox5 및/또는 Pox6 활성의 부분적 상실 또는 전체적 상실을 초래한다.
효모 세포는 임의의 유형의 단백질을 발현시키도록 추가로 조작될 수 있다. 이러한 다른 단백질의 발현은 본 명세서에 개시된 화합물의 생산, 예컨대, 역가를 개선시킬 수 있다. 일 실시형태에서, 효모 세포는 하기를 발현시킨다:
i) 이종성 사이토크롬 b5;
ii) 이종성 사이토크롬 b5 환원효소;
iii) 헤모글로빈;
iv) 이종성 티오에스터라제 유전자; 및/또는
v) 지방 아실 합성효소 및 티오에스터라제의 융합 단백질.
효모 세포의 천연 유전자가 또한 조작될 수 있다. 일 실시형태에서, 효모 세포는 하기의 비활성화 또는 변형을 갖는다:
i) 활성의 전체적 또는 부분적 상실을 초래하는 천연 신장효소(들);
ii) 활성의 전체적 또는 부분적 상실을 초래하는 티오에스터라제(들); 및/또는
iii) 천연 지방 알데하이드 탈수소효소(들), 지방 알코올 옥시다제(들), 퍼옥시좀 생물발생 인자 및/또는 지방 아실 합성효소(들)의 활성.
일부 실시형태에서, 효모 세포는 14의 사슬 길이를 갖는 지방 아실의 이용 가능성이 증가되거나 또는 추가로 증가되도록, 추가로 변형된다. 예를 들어, 지방산 합성효소 복합체는 테트라데칸오일-CoA의 형성이 증가되도록 조작될 수 있다. 지방산 합성효소 복합체(EC 2.3.1.86)는 2개의 서브유닛, 즉, Fas1(베타 서브유닛) 및 Fas2(알파 서브유닛)로 이루어진다. 알파 서브유닛은 합성된 지방산의 길이를 결정하는 데 연관되는 것으로 가설을 세운 케토아실 합성효소 도메인("결합 포켓")을 포함한다.
따라서, 14개 탄소(C14)의 사슬 길이를 갖는 탈포화 지방 알코올, 아세테이트 또는 알데하이드의 생산에 대해 대사 흐름을 지시하기 위해, 효모 세포는 변형된 케톤 합성효소 도메인을 갖는 지방 아실 합성효소 변이체를 추가로 발현시킬 수 있다. 이론에 의해 구속되는 일 없이, 변형된 케톤 합성효소 도메인이 변형된 결합 포켓을 초래하고, 따라서, C14 기질과 같은 중간 길이 기질을 더욱 용이하게 수용하여, 더 높은 비율의 C14 생성물을 생성한다는 가설을 세운다.
일 실시형태에서, 효모 세포는 본 명세서에 기재된 효모 세포이되, 세포는 변형된 지방산 합성효소 복합체를 추가로 발현시킨다. 일 실시형태에서, 지방산 합성효소 복합체는 복합체의 알파 서브유닛을 암호화하는 유전자를 돌연변이시킴으로써 변형된다. 일부 실시형태에서, 돌연변이는 FAS2를 암호화하는 유전자에 있다. 일 실시형태에서, 효모 세포는 야로위아 리폴리티카 효모 세포이고, 돌연변이는 야로위아 리폴리티카 FAS2의 잔기 1220(I1220), 잔기 1217(M1217) 또는 잔기 1226(M1226) 중 하나 이상의 변형을 초래하여, 변이체 FAS2를 야기할 수 있다. 당업자는 이러한 돌연변이를 설계하는 방법을 알 것이다.
바람직하게는, 돌연변이는 I1220F 변이체, I1220W 변이체, I1220Y 변이체 또는 I1220H 변이체를 초래한다. 구체적 실시형태에서, 돌연변이는 I1220F 변이체를 초래한다. 일부 실시형태에서, 돌연변이는 M1217F 변이체, M1217W 변이체, M1217Y 변이체 또는 M1217H 변이체를 초래한다. 다른 실시형태에서, 돌연변이는 M1226F 변이체, M1226W 변이체, M1226Y 변이체 또는 M1226H 변이체를 초래한다. 위의 돌연변이 중 하나 초과, 예컨대, 잔기 I1220, M1217 또는 M1226에서 2개의 돌연변이 또는 3개의 돌연변이를 갖는 효모 세포가 또한 상정된다.
세포에 의해 생산된 지방 아실-CoA는 세포에 의해 상응하는 지방산으로 추가로 전환될 수 있다. 상기 지방산은 유리 지방산 또는 트라이아실글리세라이드(지질)의 일부일 수 있다.
일 실시형태에서, 효모 세포는 적어도 0.005㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.01㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.02㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.03㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.05㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.06㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.075㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.1㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.2㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.3㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.4㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.5㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.6㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.7㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.8㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.9㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 1㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 2㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 3㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 4㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 5㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 10㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 15㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 20㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 25㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 30㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 35㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 50㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 60㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 70㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 80㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 90㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 100㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 200㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 300㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 400㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 500㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 750㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 1g/ℓ, 예컨대, 적어도 2g/ℓ, 예컨대, 적어도 5g/ℓ, 예컨대, 적어도 10g/ℓ, 예컨대, 적어도 20g/ℓ, 예컨대, 적어도 50g/ℓ, 예컨대, 적어도 100g/ℓ 이상의 역가를 갖는 E12-지방산 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔산을 생산할 수 있다.
일 실시형태에서, 효모 세포는 적어도 0.005㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.01㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.02㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.03㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.05㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.06㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.075㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.1㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.2㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.3㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.4㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.5㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.6㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.7㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.8㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.9㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 1㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 2㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 3㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 4㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 5㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 10㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 15㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 20㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 25㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 30㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 35㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 50㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 60㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 70㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 80㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 90㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 100㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 200㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 300㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 400㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 500㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 750㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 1g/ℓ, 예컨대, 적어도 2g/ℓ, 예컨대, 적어도 5g/ℓ, 예컨대, 적어도 10g/ℓ, 예컨대, 적어도 20g/ℓ, 예컨대, 적어도 50g/ℓ, 예컨대, 적어도 100g/ℓ 이상의 역가를 갖는 E12-지방 알코올 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올을 생산할 수 있다.
이종성 Δ12 탈포화효소, 선택적으로 추가 이종성 탈포화효소, 및 추가로 선택적으로 이종성 FAR을 발현시키는 본 명세서에 개시된 효모 세포는 12번 위치에 이중 결합 및 선택적으로 12번 위치 이외의 위치(들)에 다른 이중결합(들)을 갖는 적어도 13개의 탄소 사슬 길이를 갖는 탈포화 지방 아실-CoA 및/또는 탈포화 지방 알코올을 생산할 수 있다.
따라서, 본 명세서에 제시된 방법에 따라 얻을 수 있는 탈포화 지방 아실-CoA 및 탈포화 지방 알코올이 본 명세서에 제공된다.
또한 본 발명에 따른 페로몬 화합물을 생산할 수 있는 효모 세포가 본 명세서에 제공되되, 효모 세포는 이종성 Δ12 지방 아실-CoA 탈포화효소를 발현시킨다.
일부 실시형태에서, 효모 세포는 추가 이종성 탈포화효소를 발현시킨다.
일부 실시형태에서, 효모 세포는 적어도 1종의 알코올-형성 지방 아실-CoA 환원효소(FAR)를 추가로 발현시킨다.
본 명세서에 제시된 방법에 따라 얻을 수 있는 탈포화 지방 아실-CoA 및/또는 탈포화 지방 알코올의 용도가 본 명세서에 추가로 제공된다. 예를 들어, 해충의 존재를 모니터링하거나 해충의 존재를 교란시키기 위해 이러한 화합물이 사용될 수 있고; 예를 들어, 이들은 페로몬 조성물로서 제형화될 수 있다.
탈포화 지방 아실-CoA
일 실시형태에서, 효모 세포는 이종성 Δ12 탈포화효소, 및 선택적으로 추가 이종성 탈포화효소를 발현시키고, 상기 효모 세포는 탈포화 12번 위치에 이중결합을 갖는 지방 아실-CoA, 및 선택적으로 12번 위치 이외의 위치에 이중결합을 생산할 수 있다.
따라서, 본 명세서에 개시된 효모 세포는 n'개의 이중결합(들)을 갖는 탈포화 지방 아실-CoA를 생산할 수 있되, 상기 이중결합(들) 중 적어도 하나는 12번 위치에 있고,
상기 효모 세포는 이종성 Δ12 탈포화효소를 발현시키고, 상기 탈포화효소는, 적어도 13개의 탄소 사슬 길이를 갖고 n개의 이중결합(들)을 갖는, 포화 또는 탈포화 지방 아실-CoA, 바람직하게는 탈포화 지방 아실-COA의 12번 위치에 이중결합을 도입할 수 있고,
n 및 n'는 정수이며,
0 ≤ n ≤ 3이고, 1 ≤ n' ≤ 4이다.
바람직한 실시형태에서, 기질로서 사용되는 포화 또는 탈포화 지방 아실-CoA 및 n'개의 이중결합을 갖는 탈포화 지방 아실-CoA는 동일한 탄소 사슬 길이를 갖는다.
일 실시형태에서, 효모 세포는 부문 "추가 탈포화효소"에서 본 명세서에 개시되는 추가 탈포화효소를 발현시킨다.
일 실시형태에서, n=0이다. 다시 말해서, 효모 세포는 최대 4개의 이중결합, 예컨대, 1, 2, 3 또는 4개의 이중결합을 이중결합이 없는 포화된 지방 아실-CoA에 도입할 수 있다. 따라서, 상기 효모 세포는 1, 2, 3 또는 4개의 이중결합을 갖는 탈포화 지방 아실-CoA를 생산할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 효모 세포는 이중결합을 테트라데칸오일-CoA에 도입하여, 상기 테트라데칸오일-CoA를 (E12)-테트라데센오일-CoA로 전환시킬 수 있다.
일 실시형태에서, n=1이다. 다시 말해서, 효모는 12번 위치 이외의 위치에서, 예컨대, 8, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 또는 22번 위치에서 최대 3개의 이중결합, 예컨대, 1, 2 또는 3개의 이중결합을 하나의 이중결합을 갖는 탈포화 지방 아실-CoA에 도입할 수 있다. 따라서, 상기 효모 세포는 2, 3 또는 4개의 이중결합을 갖는 탈포화 지방 아실-CoA, 바람직하게는 2개의 이중결합을 갖는 탈포화 지방 아실-CoA를 생산할 수 있다. 일 실시형태에서, 효모 세포는 9번 위치에 이중결합을 갖는 탈포화 지방 아실-CoA에 이중결합을 도입할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 효모 세포는 이중결합을 (Z9)-테트라데센오일-CoA에 도입하여, 상기 (Z9)-테트라데센오일-CoA를 (Z9, E12)-테트라데카다이엔오일-CoA로 전환시킬 수 있다.
일 실시형태에서, n=2이다. 다시 말해서, 효모 세포는 12번 위치 이외의 위치에 2개의 이중결합, 예컨대, 8, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 또는 22번 위치 중 적어도 2개에 이중결합을 갖는 탈포화 지방 아실-CoA에 최대 2개의 이중결합, 예컨대, 1 또는 2 이중결합을 도입할 수 있다. 따라서, 상기 효모 세포는 3 또는 4개의 이중결합을 갖는 탈포화 지방 아실-CoA를 생산할 수 있다.
일 실시형태에서, n=3이다. 다시 말해서, 효모는 12번 위치 이외의 위치에 3개의 이중결합, 예컨대, 8, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 또는 22번 위치 중 적어도 3개에서 1개의 이중결합을 갖는 탈포화 지방 아실-CoA에 1개의 이중결합을 도입할 수 있다. 따라서, 상기 효모 세포는 4개의 이중결합을 갖는 탈포화 지방 아실-CoA를 생산할 수 있다.
일 실시형태에서, n'=1이고, n=0이다. 다시 말해서, 효모 세포는 이중결합이 없는 포화된 지방 아실-CoA를 12번 위치에 하나의 이중결합을 갖는 탈포화 지방 아실-CoA로 전환시킬 수 있다.
일 실시형태에서, n'=2이고, n=0이다. 다시 말해서, 효모 세포는 포화된 지방 아실-CoA를 2개의 이중결합을 갖는 탈포화 지방 아실-CoA로 전환시킬 수 있되, 1개의 이중결합은 12번 위치에 있다.
일 실시형태에서, n'=3이고, n=0이다. 다시 말해서, 효모 세포는 포화된 지방 아실-CoA를 3개의 이중결합을 갖는 탈포화 지방 아실-CoA로 전환시킬 수 있되, 1개의 이중결합은 12번 위치에 있다.
일 실시형태에서, n'=4이고, n=0이다. 다시 말해서, 효모 세포는 포화된 지방 아실-CoA를 4개의 이중결합을 갖는 탈포화 지방 아실-CoA로 전환시킬 수 있되, 1개의 이중결합은 12번 위치에 있다.
바람직한 실시형태에서, n'=2이고, n=1이다. 다시 말해서, 효모 세포는 하나의 이중결합을 갖는 탈포화 지방 아실-CoA를 2개의 이중결합을 갖는 탈포화 지방 아실-CoA로 전환할 수 있되, 하나의 이중결합이 12번 위치에 있다.
일 실시형태에서, n'=3이고, n=1이다. 다시 말해서, 효모 세포는 하나의 이중결합을 갖는 탈포화 지방 아실-CoA를 3개의 이중결합을 갖는 탈포화 지방 아실-CoA로 전환할 수 있되, 하나의 이중결합이 12번 위치에 있다.
일 실시형태에서, n'=4이고, n=1이다. 다시 말해서, 효모 세포는 하나의 이중결합을 갖는 탈포화 지방 아실-CoA를 4개의 이중결합을 갖는 탈포화 지방 아실-CoA로 전환할 수 있되, 하나의 이중결합이 12번 위치에 있다.
일 실시형태에서, n'=3이고, n=2이다. 다시 말해서, 효모 세포는 2개의 이중결합을 갖는 탈포화 지방 아실-CoA를 3개의 이중결합을 갖는 탈포화 지방 아실-CoA로 전환할 수 있되, 하나의 이중결합이 12번 위치에 있다.
일 실시형태에서, n'=4이고, n=2이다. 다시 말해서, 효모 세포는 2개의 이중결합을 갖는 탈포화 지방 아실-CoA를 4개의 이중결합을 갖는 탈포화 지방 아실-CoA로 전환할 수 있되, 하나의 이중결합이 12번 위치에 있다.
일 실시형태에서, n'=4이고, n=3이다. 다시 말해서, 효모 세포는 3개의 이중결합을 갖는 탈포화 지방 아실-CoA를 4개의 이중결합을 갖는 탈포화 지방 아실-CoA로 전환할 수 있되, 하나의 이중결합이 12번 위치에 있다.
일 실시형태에서, 적어도 13의 길이를 갖고 n개의 이중결합을 갖는 포화 또는 탈포화 지방 아실-CoA는 적어도 13, 예컨대, 적어도 14, 예컨대, 적어도 15, 예컨대, 적어도 16, 예컨대, 적어도 17, 예컨대, 적어도 18, 예컨대, 적어도 19, 예컨대, 적어도 20, 예컨대, 적어도 21, 예컨대, 적어도 22개의 탄소 사슬 길이를 갖는다. 바람직한 실시형태에서, 적어도 13개의 탄소 사슬 길이를 갖고 n개의 이중결합을 갖는 포화 또는 탈포화 지방 아실-CoA는 13, 14, 15, 16, 17 또는 18의 탄소 사슬 길이를 갖는다.
일 실시형태에서, 적어도 13의 탄소 사슬 길이를 갖고 n개의 이중결합을 갖는 포화 또는 탈포화 지방 아실-CoA는 14의 길이를 갖고, 테트라데칸오일-CoA 또는 (Z9)-테트라데센오일-CoA이다. 바람직한 실시형태에서, 적어도 13의 탄소 사슬 길이를 갖고 n개의 이중결합을 갖는 포화 또는 탈포화 지방 아실-CoA는 14의 길이를 갖고, (Z9)-테트라데센오일-CoA이다.
일 실시형태에서, n'개의 이중결합(들)을 갖는 탈포화 지방 아실-CoA는 적어도 13, 예컨대, 적어도 14, 예컨대, 적어도 15, 예컨대, 적어도 16, 예컨대, 적어도 17, 예컨대, 적어도 18, 예컨대, 적어도 19, 예컨대, 적어도 20, 예컨대, 적어도 21, 예컨대, 적어도 22개의 탄소 사슬 길이를 갖는다. 일 실시형태에서, n'개의 이중결합(들)을 갖는 탈포화 지방 아실-CoA는 최대 18, 예컨대, 최대 17, 예컨대, 최대 16, 예컨대, 최대 15, 예컨대, 최대 14, 예컨대, 최대 13, 예컨대, 최대 12개의 탄소 사슬 길이를 갖는다. 바람직한 실시형태에서, n'개의 이중결합(들)을 갖는 탈포화 지방 아실-CoA는 13, 14, 15, 16, 17 또는 18개의 탄소 사슬 길이를 갖는다.
일 실시형태에서, n'개의 이중결합(들)을 갖는 탈포화 지방 아실-CoA는 1개의 이중결합이고, (E12)-테트라데센오일-CoA이다.
일 실시형태에서, n'개의 이중결합(들)을 갖는 탈포화 지방 아실-CoA는 2개의 이중결합을 갖고, (Z9, E12)-테트라데카다이엔오일-CoA이다.
따라서, 또한 본 명세서에 제시된 방법에 따라 얻을 수 있는 (E12)-테트라데센오일-CoA 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔오일-CoA가 본 명세서에 제공된다.
탈포화 지방 알코올
일 실시형태에서, Δ12 탈포화효소, 및 선택적으로 추가 탈포화효소를 발현시키는 효모 세포는 또한 본 명세서의 "지방 아실-CoA 환원효소" 부문에 제시되는 바와 같은 FAR을 발현시킨다. 상기 효모 세포는 12번 위치에 이중결합, 선택적으로 12번 위치 이외의 위치, 예컨대, 9번 위치에 이중결합을 갖는 탈포화 지방 알코올을 생산할 수 있다.
탈포화 지방 알코올을 생산하는 데 필요한 상기 FAR은 본 명세서의 "지방 아실-CoA 환원효소" 부문에 기재된 임의의 FAR일 수 있고, 상기 탈포화 지방 알코올은 부문 "탈포화 지방 아실-CoA" 부문에 기재된 지방 아실-CoA에 상응하는 임의의 탈포화 지방 알코올일 수 있다.
일 실시형태에서, 탈포화 지방 알코올은 (E12)-지방 알코올, 예컨대, (E12)-테트라데센-1-올이다. 일 실시형태에서, 탈포화 지방 알코올은 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올이다.
따라서, 추가로 (E12)-지방 알코올, 예컨대, 본 명세서에 제시된 방법에 의해 얻을 수 있는 (E12)-테트라데센-1-올, 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올이 본 명세서에 제공된다.
탈포화 지방 아실-CoA의 생산 방법
본 명세서에서 n'개의 이중결합(들)을 갖는 탈포화 지방 아실-CoA를 생산하는 방법이 제공되되, 상기 이중결합(들) 중 적어도 하나는 효모 세포의 12번 위치에 있고, 상기 방법은,
i) 본 명세서에 정의된 바와 같은 효모 세포를 생산하는 단계,
ii) 이종성 Δ12 탈포화효소를 발현시키는 조건 하에서 배지에서 상기 효모 세포를 인큐베이션시키는 단계로서, 상기 탈포화효소는 적어도 13개의 탄소 사슬 길이를 갖고 n개의 이중결합을 갖는 포화 또는 탈포화 지방 아실-CoA, 바람직하게는 탈포화 지방 아실-CoA의 12번 위치에 이중결합을 도입할 수 있는, 상기 인큐베이션시키는 단계
를 포함함으로써, n'개의 이중결합(들)을 갖는 탈포화 지방 아실-CoA를 생산하되, 상기 이중결합(들) 중 적어도 하나는 12번 위치에 있고,
n 및 n'는 정수이며,
0 ≤ n ≤ 3이고, 1 ≤ n' ≤ 4이다.
바람직한 실시형태에서, 기질로서 사용되는 포화 또는 탈포화 지방 아실-CoA 및 n'개의 이중결합을 갖는 탈포화 지방 아실-CoA는 동일한 탄소 사슬 길이를 갖는다.
일 실시형태에서, 이종성 Δ12 탈포화효소는 "Δ12 탈포화효소" 부문에 본 명세서에 정의된 바와 같다. 예를 들어, Δ12 탈포화효소는 플로디아 Δ12 탈포화효소, 예컨대, 플로디아 인터푼텔라 Δ12 탈포화효소, 예컨대, 서열번호 2에 제시된 바와 같은 Δ12 탈포화효소(Pid12), 또는 이들과 적어도 60% 동일성 또는 유사성을 갖는 이들의 기능적 변이체일 수 있다. 예를 들어, Δ12 탈포화효소는 카우텔라 Δ12 탈포화효소, 예컨대, 카우텔라 Δ12 탈포화효소, 예컨대, 서열번호 55에 제시된 바와 같은 Δ12 탈포화효소(EcauDes12), 또는 이들과 적어도 60% 유사성 또는 동일성을 갖는 이들의 기능적 변이체일 수 있다. 예를 들어, Δ12 탈포화효소는 에페스티아 Δ12 탈포화효소, 예컨대, 에페스티아 쿠에니엘라 Δ12 탈포화효소 또는 에페스티아 엘루텔라 Δ12 탈포화효소, 예컨대, 서열번호 85에 제시된 바와 같은 Δ12 탈포화효소(Eku_d12) 또는 서열번호 87(Ee_d12), 또는 이들과 적어도 60% 유사성 또는 동일성을 갖는 이들의 기능적 변이체일 수 있다.
일 실시형태에서, 추가 이종성 탈포화효소는 "추가 탈포화효소" 부문에 본 명세서에 정의된 바와 같다. 예를 들어, 추가 탈포화효소는 12번 위치 이외의 위치에 포화 또는 탈포화 지방산에 이중결합을 도입할 수 있는 탈포화효소일 수 있다. 일부 실시형태에서, 추가 탈포화효소는 효모 세포, 예컨대, 상동성 탈포화효소에 대해 천연인 탈포화효소이다. 일부 실시형태에서, 추가 탈포화효소는 효모 세포에 대해 천연이 아닌 탈포화효소, 예컨대, 이종성 탈포화효소이다. 일부 실시형태에서, 탈포화효소는 드로소필라 탈포화효소, 예컨대, 드로소필라 비릴리스 탈포화효소, 예를 들어 서열번호 4에 제시된 바와 같은 Desat61, 또는 예컨대, 드로소필라 멜라노가스터 탈포화효소, 예를 들어, 서열번호 6에 제시된 바와 같은 Desat24, 또는 예컨대, 드로소필라 그림샤위 탈포화효소, 예를 들어 서열번호 8에 제시된 바와 같은 Desat59, 또는 예컨대, 드로소필라 야쿠바 탈포화효소, 예를 들어, 서열번호 57에 제시된 바와 같은 Desat56, 또는 예컨대 드로소필라 아나나사에 탈포화효소, 예를 들어 서열번호 59에 제시된 바와 같은 Desat60; 아미엘로이스 탈포화효소, 예컨대, 아미엘로이스 트란시텔라 탈포화효소, 예를 들어 서열번호 10에 제시된 바와 같은 Desat17 또는 서열번호 12에 제시된 바와 같은 Desat18; 코리스토네우라 탈포화효소, 예컨대, 코리스토네우라 파랄렐라 탈포화효소, 예를 들어 서열번호 61에 제시된 바와 같은 Desat74; 스포돕테라 탈포화효소, 예컨대, 스포돕테라 리투라 탈포화효소, 예를 들어 서열번호 18에 제시된 바와 같은 Desat26; 사카로마이세스 탈포화효소, 예컨대, 사카로마이세스 세레비시애 탈포화효소, 예를 들어 서열번호 14에 제시된 바와 같은 Desat42; 야로위아 탈포화효소, 예컨대, 야로위아 리폴리티카 탈포화효소, 예를 들어, 서열번호 16에 제시된 바와 같은 Desat69 또는 이들과 적어도 60% 유사성 또는 동일성을 갖는 이의 기능적 변이체이다.
적어도 13개의 탄소 사슬 길이를 갖고 n개의 이중결합(들)을 갖는 포화 또는 탈포화 지방 아실-CoA는 본 명세서에서 ""탈포화 지방 아실-CoA" 부문에 정의된 바와 같을 수 있다. 일 실시형태에서, 적어도 13의 탄소 사슬 길이를 갖고 n개의 이중결합을 갖는 포화 또는 탈포화 지방 아실-CoA는 테트라데칸오일-CoA 또는 (Z9)-테트라데센오일-CoA이다.
n'개의 이중결합(들)을 갖는 탈포화 지방 아실-CoA는 본 명세서에서 "탈포화된 지방 아실-CoA" 부문에 정의된 바와 같을 수 있다. 일 실시형태에서, n'개의 이중결합(들)을 갖는 탈포화 지방 아실-CoA는 (E12)-테트라데센오일-CoA 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔오일-CoA이다.
일 실시형태에서, 상기 방법은 적어도 0.005㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.01㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.02㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.03㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.05㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.06㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.075㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.1㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.2㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.3㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.4㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.5㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.6㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.7㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.8㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.9㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 1㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 2㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 3㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 4㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 5㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 10㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 15㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 20㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 25㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 30㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 35㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 50㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 60㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 70㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 80㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 90㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 100㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 200㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 300㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 400㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 500㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 750㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 1g/ℓ, 예컨대, 적어도 2g/ℓ, 예컨대, 적어도 5g/ℓ, 예컨대, 적어도 10g/ℓ, 예컨대, 적어도 20g/ℓ, 예컨대, 적어도 50g/ℓ, 예컨대, 적어도 100g/ℓ 이상의 역가에서 n'개의 이중결합(들), 예컨대, (E12)-테트라데센오일-CoA 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔오일-CoA를 갖는 탈포화 지방 아실-CoA를 수득한다.
일 실시형태에서, 효모 세포는 (E12)-테트라데센오일-CoA 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔오일-CoA의 적어도 일부를 각각 (E12)-테트라데센-1-올 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올로 전환시킬 수 있는 적어도 1종의 알코올-형성 지방 아실-CoA 환원효소(FAR)를 추가로 발현시킨다.
FAR은 본 명세서에서 "지방 아실-CoA 환원효소" 부문에 정의된 바와 같을 수 있다. 예를 들어, FAR은 아그로티스 FAR, 예컨대, 아그로티스 세게툼 FAR, 예를 들어, 서열번호 75에 제시된 바와 같은 FAR12; 바이사이클러스 FAR, 예컨대, 바이사이클러스 아니나나 FAR, 예를 들어, 서열번호 77에 제시된 바와 같은 FAR11; 헬리코베르파 FAR, 예컨대, 헬리코베르파 아르미게라 FAR 또는 헬리코베르파 아설타 FAR, 예를 들어, 서열번호 20에 제시된 바와 같은 FAR1 또는 서열번호 71에 제시된 바와 같은 FAR6; 헬리오티스 FAR, 예컨대, 헬리오티스 서브플렉사 FAR 또는 헬리오티스 비레센스 FAR, 예를 들어 서열번호 69에 제시된 바와 같은 FAR4 또는 서열번호 79에 제시된 바와 같은 FAR5; 오스트리니아 FAR, 예컨대, 오스트리니아 푸르나칼리스 FAR, 오스트리니아 자그 FAR 또는 오스트리니아 제아 FAR, 예를 들어, 서열번호 63에 제시된 바와 같은 FAR44, 서열번호 65에 제시된 바와 같은 FAR48 또는 서열번호 67에 제시된 바와 같은 FAR49; 플로디아 FAR, 예컨대, 플로디아 인터푼텔라 FAR, 예를 들어, 서열번호 28에 제시된 바와 같은 FAR28 또는 서열번호 30에 제시된 바와 같은 FAR32; 스포돕테라 FAR, 예컨대, 스포돕테라 엑시구아 FAR, 예를 들어, 서열번호 22에 제시된 바와 같은 FAR16, 또는 서열번호 24에 제시된 바와 같은 FAR17, 또는 예컨대, 스포돕테라 리투라 FAR, 예를 들어, 서열번호 26에 제시된 바와 같은 FAR19; 트리코플루시아 FAR, 예컨대, 트리코플루시아 니 FAR, 예를 들어, 서열번호 32에 제시된 바와 같은 FAR38; 이포노메우타 FAR, 예컨대, 이포노메우타 로렐루스 FAR, 예를 들어, 서열번호 73에 제시된 바와 같은 FAR8; 또는 이들과 적어도 60% 유사성 또는 동일성을 갖는 이들의 기능적 변이체일 수 있다.
일 실시형태에서, 상기 방법은 적어도 0.005㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.01㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.02㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.03㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.05㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.06㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.075㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.1㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.2㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.3㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.4㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.5㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.6㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.7㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.8㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.9㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 1㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 2㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 3㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 4㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 5㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 10㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 15㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 20㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 25㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 30㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 35㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 50㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 60㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 70㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 80㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 90㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 100㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 200㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 300㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 400㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 500㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 750㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 1g/ℓ, 예컨대, 적어도 2g/ℓ, 예컨대, 적어도 5g/ℓ, 예컨대, 적어도 10g/ℓ, 예컨대, 적어도 20g/ℓ, 예컨대, 적어도 50g/ℓ, 예컨대, 적어도 100g/ℓ 이상의 역가에서 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올을 수득한다.
일 실시형태에서, 상기 방법은 E12-지방 알코올 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올을 회수하는 단계를 더 포함한다.
일 실시형태에서, E12-지방 알코올 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올은 각각 E12-지방 알코올 아세테이트 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 아세테이트로 추가로 변형된다.
일 실시형태에서, E12-지방 알코올 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올의 E12-지방 알코올 아세테이트 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 아세테이트로의 전환은 시험관내에서 수행된다.
일 실시형태에서, E12-지방 알코올 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올의 E12-지방 알코올 아세테이트 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 아세테이트로의 전환은 각각 E12-지방 알코올 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올을 E12-지방 알코올 아세테이트 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 아세테이트로 전환시킬 수 있는 아세틸트랜스퍼라제를 세포에서 추가로 발현시킴으로써 생체내에서 수행된다.
일 실시형태에서, 상기 방법은 E12-지방 알코올 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올을 (E12)-지방 알데하이드 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔알로 전환시키는 단계를 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 알데하이드로의 전환은 화학적 또는 효소적 전환이다.
본 개시내용의 화합물은 당업자에게 알려진 또는 동일한 출원인에 의해 2021년 8월 6일자로 출원된 유럽 특허 출원 EP21190097.2에 기재된 바와 같은 방법에 의해 본 명세서에 기재된 바와 같이 산화될 수 있다. 일 실시형태에서, E12-지방 알코올 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올은 (E12)-지방 알데하이드 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔알로 화학적으로 산화된다.
본 개시내용의 화합물은 본 명세서에 기재된 바와 같이 또는 당업자에게 알려진 방법에 의해 아세틸화될 수 있다. 일 실시형태에서, E12-지방 알코올 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올은 E12-지방 알코올 아세테이트 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 아세테이트로 화학적으로 아세틸화된다.
일 실시형태에서, 상기 방법은 본 명세서에서 "페로몬 조성물" 부문에 정의된 바와 같이 페로몬 조성물 중 E12-지방 알코올, 예컨대, (E12)-테트라데센-1-올, (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올, E12-지방 알코올 아세테이트, (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 아세테이트, (E12)-지방 알데하이드 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔알을 제형화하는 단계를 추가로 포함한다.
따라서, 본 명세서에서 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올을 생산하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 하기 단계들을 포함한다:
i) 본 명세서에 개시된 바와 같은 효모 세포를 생산하는 단계,
ii) a. 추가 탈포화효소로서, 테트라데칸오일-CoA에서 9번 위치에 이중결합을 도입하여, 테트라데칸오일-CoA의 적어도 일부를 (Z9)-테트라데센오일-CoA로 전환시킬 수 있는, 상기 탈포화효소;
b. 이종성 Δ12 탈포화효소로서, (Z9)-테트라데센오일-CoA에서 12번 위치에 이중결합을 도입하여, (Z9)-테트라데센오일-CoA의 적어도 일부를 (Z9, E12)-테트라데카다이엔오일-CoA로 전환시킬 수 있는, 상기 탈포화효소;
c. FAR로서, (Z9, E12)-테트라데카다이엔오일-CoA의 적어도 일부를 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올로 전환시킬 수 있는, 상기 FAR
의 발현을 가능하게 하는 조건 하에 배지에서 상기 효모 세포를 인큐베이션시키는 단계;
iii) 선택적으로, (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올을 회수하는 단계;
iv) 선택적으로, (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올을 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 아세테이트로 전환시키는 단계;
v) 선택적으로, (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올을 (Z9, E12)-테트라데카다이엔알로 전환시키는 단계;
vi) 선택적으로, (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올, (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 아세테이트 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔알을 페로몬 조성물로 제형화하는 단계.
핵산
효모 세포를 변형시키기 위한 핵산 또는 핵산의 시스템이 본 명세서에 제공되며, 상기 핵산 또는 시스템은 이종성 Δ12 탈포화효소를 암호화하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 탈포화효소는 적어도 13개의 탄소 사슬 길이를 갖고 n개의 이중결합을 갖는 포화 또는 탈포화 지방 아실-CoA에서 12번 위치에 이중결합을 도입하여 n'개의 이중결합(들)을 갖는 탈포화 지방 아실-CoA를 생산할 수 있되, 상기 이중결합(들) 중 적어도 하나는 12번 위치에 있고,
n 및 n'는 정수이며,
0 ≤ n ≤ 3이고, 1 ≤ n' ≤ 4이다.
일 실시형태에서, 이종성 Δ12 탈포화효소는 서열번호 1에 제시된 바와 같은 플로디아 인터푼텔라 Δ12 탈포화효소를 암호화하는 핵산과 적어도 60% 동일성, 예컨대, 이와 적어도 61% 동일성, 예컨대, 적어도 62% 동일성, 예컨대, 적어도 63% 동일성, 예컨대, 적어도 64% 동일성, 예컨대, 적어도 65% 동일성, 예컨대, 적어도 66% 동일성, 예컨대, 적어도 67% 동일성, 예컨대, 적어도 68% 동일성, 예컨대, 적어도 69% 동일성, 예컨대, 적어도 70% 동일성, 예컨대, 적어도 71% 동일성, 예컨대, 적어도 72%, 예컨대, 적어도 73%, 예컨대, 적어도 74%, 예컨대, 적어도 75%, 예컨대, 적어도 76%, 예컨대, 적어도 77%, 예컨대, 적어도 78%, 예컨대, 적어도 79%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 81%, 예컨대, 적어도 82%, 예컨대, 적어도 83%, 예컨대, 적어도 84%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 86%, 예컨대, 적어도 87%, 예컨대, 적어도 88%, 예컨대, 적어도 89%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99% 동일성, 예컨대, 100% 동일성을 갖는 핵산에 의해 암호화된다.
일 실시형태에서, 이종성 Δ12 탈포화효소는 서열번호 54에 제시된 바와 같은 카드라 카우텔라 Δ12 탈포화효소를 암호화하는 핵산과 적어도 60% 동일성, 예컨대, 이와 적어도 61% 동일성, 예컨대, 적어도 62% 동일성, 예컨대, 적어도 63% 동일성, 예컨대, 적어도 64% 동일성, 예컨대, 적어도 65% 동일성, 예컨대, 적어도 66% 동일성, 예컨대, 적어도 67% 동일성, 예컨대, 적어도 68% 동일성, 예컨대, 적어도 69% 동일성, 예컨대, 적어도 70% 동일성, 예컨대, 적어도 71% 동일성, 예컨대, 적어도 72%, 예컨대, 적어도 73%, 예컨대, 적어도 74%, 예컨대, 적어도 75%, 예컨대, 적어도 76%, 예컨대, 적어도 77%, 예컨대, 적어도 78%, 예컨대, 적어도 79%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 81%, 예컨대, 적어도 82%, 예컨대, 적어도 83%, 예컨대, 적어도 84%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 86%, 예컨대, 적어도 87%, 예컨대, 적어도 88%, 예컨대, 적어도 89%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99% 동일성, 예컨대, 100% 동일성을 갖는 핵산에 의해 암호화된다.
일 실시형태에서, 이종성 Δ12 탈포화효소는 서열번호 84에 제시된 바와 같은 에페스티아 쿠에니엘라 Δ12 탈포화효소를 암호화하는 핵산과 적어도 60% 동일성, 예컨대, 이와 적어도 61% 동일성, 예컨대, 적어도 62% 동일성, 예컨대, 적어도 63% 동일성, 예컨대, 적어도 64% 동일성, 예컨대, 적어도 65% 동일성, 예컨대, 적어도 66% 동일성, 예컨대, 적어도 67% 동일성, 예컨대, 적어도 68% 동일성, 예컨대, 적어도 69% 동일성, 예컨대, 적어도 70% 동일성, 예컨대, 적어도 71% 동일성, 예컨대, 적어도 72%, 예컨대, 적어도 73%, 예컨대, 적어도 74%, 예컨대, 적어도 75%, 예컨대, 적어도 76%, 예컨대, 적어도 77%, 예컨대, 적어도 78%, 예컨대, 적어도 79%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 81%, 예컨대, 적어도 82%, 예컨대, 적어도 83%, 예컨대, 적어도 84%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 86%, 예컨대, 적어도 87%, 예컨대, 적어도 88%, 예컨대, 적어도 89%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99% 동일성, 예컨대, 100% 동일성을 갖는 핵산에 의해 암호화된다.
일 실시형태에서, 이종성 Δ12 탈포화효소는 서열번호 86에 제시된 바와 같은 에페스티아 엘루텔라 Δ12 탈포화효소를 암호화하는 핵산과 적어도 60% 동일성, 예컨대, 이와 적어도 61% 동일성, 예컨대, 적어도 62% 동일성, 예컨대, 적어도 63% 동일성, 예컨대, 적어도 64% 동일성, 예컨대, 적어도 65% 동일성, 예컨대, 적어도 66% 동일성, 예컨대, 적어도 67% 동일성, 예컨대, 적어도 68% 동일성, 예컨대, 적어도 69% 동일성, 예컨대, 적어도 70% 동일성, 예컨대, 적어도 71% 동일성, 예컨대, 적어도 72%, 예컨대, 적어도 73%, 예컨대, 적어도 74%, 예컨대, 적어도 75%, 예컨대, 적어도 76%, 예컨대, 적어도 77%, 예컨대, 적어도 78%, 예컨대, 적어도 79%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 81%, 예컨대, 적어도 82%, 예컨대, 적어도 83%, 예컨대, 적어도 84%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 86%, 예컨대, 적어도 87%, 예컨대, 적어도 88%, 예컨대, 적어도 89%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99% 동일성, 예컨대, 100% 동일성을 갖는 핵산에 의해 암호화된다.
일 실시형태에서, 핵산 또는 핵산의 시스템은 적어도 13개의 탄소 사슬 길이를 갖고 n개의 이중결합을 갖는 포화 또는 탈포화 지방 아실-CoA에서 12번 위치가 아닌 임의의 위치에 이중결합을 도입할 수 있는 추가 이종성 탈포화효소를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 추가 이종성 탈포화효소는 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 56, 서열번호 58 및 서열번호 60에 제시된 탈포화효소의 그룹으로부터 선택된 핵산과 적어도 60% 동일성, 예컨대, 이와 적어도 61% 동일성, 예컨대, 적어도 62% 동일성, 예컨대, 적어도 63% 동일성, 예컨대, 적어도 64% 동일성, 예컨대, 적어도 65% 동일성, 예컨대, 적어도 66% 동일성, 예컨대, 적어도 67% 동일성, 예컨대, 적어도 68% 동일성, 예컨대, 적어도 69% 동일성, 예컨대, 적어도 70% 동일성, 예컨대, 적어도 71% 동일성, 예컨대, 적어도 72%, 예컨대, 적어도 73%, 예컨대, 적어도 74%, 예컨대, 적어도 75%, 예컨대, 적어도 76%, 예컨대, 적어도 77%, 예컨대, 적어도 78%, 예컨대, 적어도 79%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 81%, 예컨대, 적어도 82%, 예컨대, 적어도 83%, 예컨대, 적어도 84%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 86%, 예컨대, 적어도 87%, 예컨대, 적어도 88%, 예컨대, 적어도 89%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99% 동일성, 예컨대, 100% 동일성을 갖는 핵산에 의해 암호화된다.
일 실시형태에서, 추가 이종성 탈포화효소는 서열번호 3에 제시된 바와 같은 드로소필라 비릴리스 탈포화효소를 암호화하는 핵산과 적어도 60% 동일성을 갖는 핵산에 의해 암호화된다.
일 실시형태에서, 추가 이종성 탈포화효소는 서열번호 5에 제시된 바와 같은 드로소필라 멜라노가스터 탈포화효소를 암호화하는 핵산과 적어도 60% 동일성을 갖는 핵산에 의해 암호화된다.
일 실시형태에서, 추가 이종성 탈포화효소는 서열번호 7에 제시된 바와 같은 드로소필라 그림샤위 탈포화효소를 암호화하는 핵산과 적어도 60% 동일성을 갖는 핵산에 의해 암호화된다.
일 실시형태에서, 추가 이종성 탈포화효소는 서열번호 9 또는 서열번호 11에 제시된 바와 같은 아미엘로이스 트란시텔라 탈포화효소를 암호화하는 핵산과 적어도 60% 동일성을 갖는 핵산에 의해 암호화된다.
일 실시형태에서, 추가 이종성 탈포화효소는 서열번호 13에 제시된 바와 같은 사카로마이세스 세레비시애 탈포화효소를 암호화하는 핵산과 적어도 60% 동일성을 갖는 핵산에 의해 암호화된다.
일 실시형태에서, 추가 이종성 탈포화효소는 서열번호 15에 제시된 바와 같은 야로위아 리폴리티카 탈포화효소를 암호화하는 핵산과 적어도 60% 동일성을 갖는 핵산에 의해 암호화된다.
일 실시형태에서, 추가 이종성 탈포화효소는 서열번호 17에 제시된 바와 같은 스포돕테라 리투라 탈포화효소를 암호화하는 핵산과 적어도 60% 동일성을 갖는 핵산에 의해 암호화된다.
일 실시형태에서, 추가 이종성 탈포화효소는 서열번호 56에 제시된 바와 같은 드로소필라 야쿠바 탈포화효소를 암호화하는 핵산과 적어도 60% 동일성을 갖는 핵산에 의해 암호화된다.
일 실시형태에서, 추가 이종성 탈포화효소는 서열번호 58에 제시된 바와 같은 드로소필라 아나나사에 탈포화효소를 암호화하는 핵산과 적어도 60% 동일성을 갖는 핵산에 의해 암호화된다.
일 실시형태에서, 추가 이종성 탈포화효소는 서열번호 60에 제시된 바와 같은 코리스토네우라 파랄렐라 탈포화효소를 암호화하는 핵산과 적어도 60% 동일성을 갖는 핵산에 의해 암호화된다.
일 실시형태에서, 핵산 또는 핵산의 시스템은 이중 탈포화 (Z9, E12)-테트라데카다이엔오일-CoA의 적어도 일부를 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올로 전환시킬 수 있는 FAR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, FAR은 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 29, 서열번호 31, 서열번호 62, 서열번호 64, 서열번호 66, 서열번호 68, 서열번호 70, 서열번호 72, 서열번호 74, 서열번호 76 및 서열번호 78에 제시된 FAR의 그룹으로부터 선택된 핵산과 적어도 60% 동일성, 예컨대, 이와 적어도 61% 동일성, 예컨대, 적어도 62% 동일성, 예컨대, 적어도 63% 동일성, 예컨대, 적어도 64% 동일성, 예컨대, 적어도 65% 동일성, 예컨대, 적어도 66% 동일성, 예컨대, 적어도 67% 동일성, 예컨대, 적어도 68% 동일성, 예컨대, 적어도 69% 동일성, 예컨대, 적어도 70% 동일성, 예컨대, 적어도 71% 동일성, 예컨대, 적어도 72%, 예컨대, 적어도 73%, 예컨대, 적어도 74%, 예컨대, 적어도 75%, 예컨대, 적어도 76%, 예컨대, 적어도 77%, 예컨대, 적어도 78%, 예컨대, 적어도 79%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 81%, 예컨대, 적어도 82%, 예컨대, 적어도 83%, 예컨대, 적어도 84%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 86%, 예컨대, 적어도 87%, 예컨대, 적어도 88%, 예컨대, 적어도 89%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99% 동일성, 예컨대, 100% 동일성을 갖는 핵산에 의해 암호화된다.
일 실시형태에서, FAR는 서열번호 74에 제시된 바와 같은 아그로티스 세게툼 FAR을 암호화하는 핵산과 적어도 60% 동일성을 갖는 핵산에 의해 암호화된다.
일 실시형태에서, FAR는 서열번호 76에 제시된 바와 같은 바이사이클러스 아니나나 FAR을 암호화하는 핵산과 적어도 60% 동일성을 갖는 핵산에 의해 암호화된다.
일 실시형태에서, FAR는 서열번호 19에 제시된 바와 같은 헬리코베르파 아르미게라 FAR을 암호화하는 핵산과 적어도 60% 동일성을 갖는 핵산에 의해 암호화된다.
일 실시형태에서, FAR는 서열번호 70에 제시된 바와 같은 헬리코베르파 아설타 FAR을 암호화하는 핵산과 적어도 60% 동일성을 갖는 핵산에 의해 암호화된다.
일 실시형태에서, FAR는 서열번호 68에 제시된 바와 같은 헬리오티스 서브플렉사 FAR을 암호화하는 핵산과 적어도 60% 동일성을 갖는 핵산에 의해 암호화된다.
일 실시형태에서, FAR는 서열번호 78에 제시된 바와 같은 헬리오티스 비레센스 FAR을 암호화하는 핵산과 적어도 60% 동일성을 갖는 핵산에 의해 암호화된다.
일 실시형태에서, FAR는 서열번호 62에 제시된 바와 같은 오스트리니아 푸르나칼리스 FAR을 암호화하는 핵산과 적어도 60% 동일성을 갖는 핵산에 의해 암호화된다.
일 실시형태에서, FAR는 서열번호 64에 제시된 바와 같은 오스트리니아 자그 FAR을 암호화하는 핵산과 적어도 60% 동일성을 갖는 핵산에 의해 암호화된다.
일 실시형태에서, FAR는 서열번호 66에 제시된 바와 같은 오스트리니아 제아 FAR을 암호화하는 핵산과 적어도 60% 동일성을 갖는 핵산에 의해 암호화된다.
일 실시형태에서, FAR는 서열번호 27 또는 서열번호 29에 제시된 바와 같은 플로디아 인터푼텔라 FAR을 암호화하는 핵산과 적어도 60% 동일성을 갖는 핵산에 의해 암호화된다.
일 실시형태에서, FAR는 서열번호 21 또는 서열번호 23에 제시된 바와 같은 스포돕테라 엑시구아 FAR을 암호화하는 핵산과 적어도 60% 동일성을 갖는 핵산에 의해 암호화된다.
일 실시형태에서, FAR는 서열번호 25에 제시된 바와 같은 스포돕테라 리투라 FAR을 암호화하는 핵산과 적어도 60% 동일성을 갖는 핵산에 의해 암호화된다.
일 실시형태에서, FAR는 서열번호 31에 제시된 바와 같은 트리코플루시아 니 FAR을 암호화하는 핵산과 적어도 60% 동일성을 갖는 핵산에 의해 암호화된다.
일 실시형태에서, FAR는 서열번호 72에 제시된 바와 같은 이포노메우타 로렐루스 FAR을 암호화하는 핵산과 적어도 60% 동일성을 갖는 핵산에 의해 암호화된다.
본 명세서에서, 주어진 핵산과 적어도 60% 동일성을 갖는 핵산은 주어진 핵산과 적어도 61% 동일성, 예컨대, 적어도 62% 동일성, 예컨대, 적어도 63% 동일성, 예컨대, 적어도 64% 동일성, 예컨대, 적어도 65% 동일성, 예컨대, 적어도 66% 동일성, 예컨대, 적어도 67% 동일성, 예컨대, 적어도 68% 동일성, 예컨대, 적어도 69% 동일성, 예컨대, 적어도 70% 동일성, 예컨대, 적어도 71% 동일성, 예컨대, 적어도 72%, 예컨대, 적어도 73%, 예컨대, 적어도 74%, 예컨대, 적어도 75%, 예컨대, 적어도 76%, 예컨대, 적어도 77%, 예컨대, 적어도 78%, 예컨대, 적어도 79%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 81%, 예컨대, 적어도 82%, 예컨대, 적어도 83%, 예컨대, 적어도 84%, 예컨대, 적어도 85%, 예컨대, 적어도 86%, 예컨대, 적어도 87%, 예컨대, 적어도 88%, 예컨대, 적어도 89%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99% 이상의 동일성을 가질 수 있다.
따라서, 핵산의 시스템은 효모 세포에서 발현될 효소, 특히 본 명세서에 기재된 바와 같은 이종성 Δ12 탈포화효소, 및 선택적으로 본 명세서에 기재된 바와 같은 추가 이종성 탈포화효소 및 추가로 선택적으로 FAR 및/또는 추가 효소, 예컨대, Ncb5or를 암호화하는 복수의 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
회수
본 명세서에 개시된 방법에 의해 얻어지는 생성물을 회수하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 본 방법은 본 명세서에 제시된 방법에 따라 생성된 유리 형태 또는 지질로서 탈포화 지방, 탈포화 지방 알코올, 탈포화 지방 알코올 아세테이트 및/또는 탈포화 지방 알데하이드를 회수하는 추가 단계를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 탈포화 지방 알코올을 회수하는 단계를 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 방법은 탈포화 지방 알코올 아세테이트를 회수하는 단계를 포함한다.
본 발명에 의해 얻어지는 생성물을 회수하는 방법은 당업계에 알려져 있으며, 소수성 용매, 예컨대, 데칸, 헥산 또는 식물성 오일에 의한 추출을 포함할 수 있다.
회수된 생성물은 추가로 변형될 수 있고, 예를 들어, 탈포화 지방 알코올은 본 명세서에서 위에 기재된 바와 같은 상응하는 탈포화 지방 알데하이드 또는 지방 아세테이트로 전환될 수 있다. 탈포화 지방 알데하이드 및/또는 지방 아세테이트는, 배양 배지에서, 예를 들어, 생체내에서 또는 세포를 관련 효소와 접촉시킴으로써 직접 생산되는 실시형태에서, 탈포화 지방 알데하이드 및/또는 지방 아세테이트가 또한 회수될 수 있다.
2020년 9월 22일자에 동일한 출원인에 의해 출원되고 발명의 명칭이 "Improved methods for production, recovery and secretion of hydrophobic compounds in a fermentation"인 출원 WO 2021/078452에 기재된 바와 같이, 발효 시스템이 탈포화 지방 알코올, 탈포화 지방 알코올 아세테이트 및/또는 탈포화 지방 알데하이드를 생산할 수 있는 세포, 특히 효모 세포를 배양시키기 위해 사용될 때, 배양 배지에 추출 용매를 첨가하는 것은 역가 및 세포외 분비를 추가로 증가시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 배지는 수용액 중에서 추출 용매를 흐림 농도 이상의 양으로 포함하되, 추출 용매 비이온성 계면활성제, 예컨대, 소포제, 바람직하게는 폴리에톡실화된 계면활성제는 폴리에틸렌 폴리프로필렌 글리콜, 폴리에터 분산물의 혼합물, 폴리에틸렌 글리콜 모노스테아레이트, 예컨대, 시메티콘 및 에톡실화 및 프로폭실화된 C16-C18 알코올계 소포제를 포함하는 소포제 및 이들의 조합물로부터 선택된다. 일부 실시형태에서:
- 비이온성 계면활성제는 에톡실화 및 프로폭실화된 C16-C18 알코올계 소포제, 예컨대, C16-C18 알킬 알코올 에톡실레이트 프로폭실레이트(CAS 번호 68002-96-0)이되, 배양 배지는 C16-C18 알킬 알코올 에톡실레이트 프로폭실레이트의 적어도 1% vol/vol, 예컨대, 적어도 1.5%, 예컨대, 적어도 2%, 예컨대, 적어도 2.5%, 예컨대, 적어도 3%, 예컨대, 적어도 3.5%, 예컨대, 적어도 4%, 예컨대, 적어도 5%, 예컨대, 적어도 6%, 예컨대, 적어도 7%, 예컨대, 적어도 8%, 예컨대, 적어도 9%, 예컨대, 적어도 10%, 예컨대, 적어도 12.5%, 예컨대, 적어도 15%, 예컨대, 적어도 17.5%, 예컨대, 적어도 20%, 예컨대, 적어도 22.5%, 예컨대, 적어도 25%, 예컨대, 적어도 27.5%, 예컨대, 적어도 30% vol/vol 이상의 C16-C18 알킬 알코올 에톡실레이트 프로폭실레이트를 포함하고/하거나,
- 비이온성 계면활성제는 폴리에틸렌 폴리프로필렌 글리콜, 예를 들어, Kollliphor® P407(CAS 번호 9003-11-6)이되, 배양 배지는 폴리에틸렌 폴리프로필렌 글리콜, 예컨대, Kolliphor® P407의 적어도 10% vol/vol, 예컨대, 적어도 11% vol/vol, 예컨대, 적어도 12% vol/vol, 예컨대, 적어도 13% vol/vol, 예컨대, 적어도 14% vol/vol, 예컨대, 적어도 15% vol/vol, 예컨대, 적어도 16% vol/vol, 예컨대, 적어도 17% vol/vol, 예컨대, 적어도 18% vol/vol, 예컨대, 적어도 19% vol/vol, 예컨대, 적어도 20% vol/vol, 예컨대, 적어도 25% vol/vol, 예컨대, 적어도 30% vol/vol, 예컨대, 적어도 35% vol/vol 이상의 폴리에틸렌 폴리프로필렌 글리콜, 예컨대, Kolliphor® P407을 포함하고/하거나,
- 비이온성 계면활성제는 폴리에터 분산물의 혼합물, 예컨대, 거품억제제 204이되, 배양 배지는 적어도 1% vol/vol의 폴리에터 분산물의 혼합물, 예컨대, 거품억제제 204, 예컨대, 적어도 1.5%, 예컨대, 적어도 2%, 예컨대, 적어도 2.5%, 예컨대, 적어도 3%, 예컨대, 적어도 3.5%, 예컨대, 적어도 4%, 예컨대, 적어도 5%, 예컨대, 적어도 6%, 예컨대, 적어도 7%, 예컨대, 적어도 8%, 예컨대, 적어도 9%, 예컨대, 적어도 10%, 예컨대, 적어도 12.5%, 예컨대, 적어도 15%, 예컨대, 적어도 17.5%, 예컨대, 적어도 20%, 예컨대, 적어도 22.5%, 예컨대, 적어도 25%, 예컨대, 적어도 27.5%, 예컨대, 적어도 30% vol/vol 이상의 폴리에터 분산물의 혼합물, 예컨대, 거품억제제 204를 포함하고/하거나;
- 비이온성 계면활성제는 폴리에틸렌 글리콜 모노스테아레이트, 예컨대, 시메티콘을 포함하는 비이온성 계면활성제이되, 배양 배지는 적어도 1% vol/vol의 폴리에틸렌 글리콜 모노스테아레이트 또는 시메티콘, 예컨대, 적어도 1.5%, 예컨대, 적어도 2%, 예컨대, 적어도 2.5%, 예컨대, 적어도 3%, 예컨대, 적어도 3.5%, 예컨대, 적어도 4%, 예컨대, 적어도 5%, 예컨대, 적어도 6%, 예컨대, 적어도 7%, 예컨대, 적어도 8%, 예컨대, 적어도 9%, 예컨대, 적어도 10%, 예컨대, 적어도 12.5%, 예컨대, 적어도 15%, 예컨대, 적어도 17.5%, 예컨대, 적어도 20%, 예컨대, 적어도 22.5%, 예컨대, 적어도 25%, 예컨대, 적어도 27.5%, 예컨대, 적어도 30% vol/vol 이상의 폴리에틸렌 글리콜 모노스테아레이트 또는 시메티콘을 포함한다.
다른 실시형태에서, 배양 배지는 추출 용매를 이의 흐림 농도보다 적어도 50%, 예컨대, 적어도 100%, 예컨대, 적어도 150%, 예컨대, 적어도 200%, 예컨대, 적어도 250%, 예컨대, 적어도 300%, 예컨대, 적어도 350%, 예컨대, 적어도 400%, 예컨대, 적어도 500%, 예컨대, 적어도 750%, 예컨대, 적어도 1000% 이상만큼의 양으로 포함하고, 그리고/또는 배양 배지는 추출 용매를 적어도 2배의 이의 흐림 농도, 예컨대, 적어도 3배의 이의 흐림 농도, 예컨대, 적어도 4배의 이의 흐림 농도, 예컨대, 적어도 5배의 이의 흐림 농도, 예컨대, 적어도 6배의 이의 흐림 농도, 예컨대, 적어도 7배의 이의 흐림 농도, 예컨대, 적어도 8배의 이의 흐림 농도, 예컨대, 적어도 9배의 이의 흐림 농도, 예컨대, 적어도 10배의 이의 흐림 농도, 예컨대, 적어도 12.5배의 이의 흐림 농도, 예컨대, 적어도 15배의 이의 흐림 농도, 예컨대, 적어도 17.5배의 이의 흐림 농도, 예컨대, 적어도 20배의 이의 흐림 농도, 예컨대, 적어도 25배의 이의 흐림 농도, 예컨대, 적어도 30배의 이의 흐림 농도의 양으로 포함한다.
회수된 생성물, 즉, 탈포화 지방 알코올, 탈포화 지방 알코올 아세테이트 및/또는 탈포화 지방 알데하이드는 또한 페로몬 조성물, 예컨대, "페로몬 조성물" 부문에 기재된 것으로 제형화될 수 있다. 일 실시형태에서, 페로몬 조성물로 제형화된 상기 회수된 생성물은 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올, (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 아세테이트 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔알이다. 조성물은 1종 이상의 추가적인 화합물, 예컨대, 액체 또는 고체 담체 또는 기질을 더 포함할 수 있다. 상기 지방 알코올로부터 얻어진 지방 알데하이드는 또한 이러한 조성물에 포함될 수 있다.
지방산은 당업계에 알려진 방법에 의해, 예를 들어, 잎의 균질화 및 당업계에 알려진 방법에 의한 지질의 회수 후에, 회수될 수 있다. 회수된 지질은 유리 지방산으로 가수분해되고, 지방산 알킬 에스터로 에스터화된 후에, 지방 알코올 또는 지방 알데하이드로 환원된다.
키트
본 방법을 수행하기 위한 부품의 키트가 본 명세서에 제공된다. 부품의 키트는 본 명세서에 기재된 바와 같이 "바로 사용할 수 있는" 효모 세포를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 효모 세포는 야로위아 세포, 예컨대, 야로위아 리폴리티카 세포이다. 일 실시형태에서, 효모 세포는사카로마이세스 세포, 예컨대, 사카로마이세스 세레비시애 세포이다.
일 실시형태에서, 부품의 키트는 유기체에 도입될 관심의 활성을 암호화하는 핵산 또는 핵산의 시스템, 예컨대, 본 명세서에서 부문 "핵산"에 기재된 핵산의 시스템을 포함한다. 핵산 또는 핵산의 시스템은 복수의 핵산 작제물, 예컨대, 복수의 벡터로서 제공될 수 있되, 각각의 벡터는 목적하는 활성 중 하나 또는 몇몇을 암호화한다.
부품의 키트는 선택적으로 변형될 효모 세포를 포함할 수 있다.
부품의 키트는 또한 사용 설명서를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 부품의 키트는 상기 모두 또는 조합을 포함한다.
페로몬 조성물
본 발명은 화합물, 특히 탈포화 지방 알코올, 및 탈포화 지방 알코올 아세테이트뿐만 아니라 이들의 유도체, 예컨대, 탈포화 지방 알데하이드, 및 이들의 용도를 제공한다. 특히, 본 세포를 이용하여 얻을 수 있는 탈포화 화합물 및 방법은 페로몬 조성물의 구성성분으로서 유용하다. 이러한 페로몬 조성물은 병충해 집중 관리에 유용할 수 있다. 이들은, 예를 들어, 교미 교란을 위해 당업계에 알려진 바와 같이 사용될 수 있단.
따라서, 본 방법에 의해 또는 본 효모 세포를 이용하여 얻을 수 있는 탈포화 지방 알코올, 탈포화 지방 알코올 아세테이트 및 탈포화 지방 알데하이드는 페로몬 조성물에서 제형화될 수 있다. 일 실시형태에서 (E12)-지방 알코올, (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 및/또는 상응하는 지방 알데하이드 및/또는 지방 아세테이트는 페로몬 조성물에서 제형화된다.
이러한 페로몬 조성물은 해충 존재를 모니터링하는 방법에서 또는 해충의 교미를 교란시키는 방법에서 사용될 수 있는 병충해 집중 관리 제품으로서 사용될 수 있다.
따라서, 해충의 존재를 모니터링하거나 또는 해충의 교미를 교란시키는 방법이 본 명세서에 제공되며, 상기 방법은 하기 단계들을 포함한다:
i) 본 명세서에 기재된 바와 같은 방법에 의해 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 및/또는 E12-지방 알코올을 생산하는 단계;
ii) E12-지방 알코올 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올을 각각 E12-지방 알코올 아세테이트 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 아세테이트로 전환시키는 단계;
iii) E12-지방 알코올 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올을 각각 E12-지방 알데하이드 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔알로 전환시키는 단계;
iv) 상기 E12-지방 알코올, (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올, E12-지방 알코올 아세테이트, (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 아세테이트, E12-지방 알데하이드 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔알을 페로몬 조성물로서 제형화하는 단계; 및
v) 상기 페로몬 조성물을 병충해 집중 관리 조성물로서 사용하는 단계.
또한 다음의 단계들을 포함하는 방법에 의해 얻을 수 있는 페로몬 조성물이 본 명세서에 제공된다:
i) 본 명세서에 기재된 바와 같은 방법에 의해 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 및/또는 (E12)-지방 알코올을 생산하는 단계;
ii) (E12)-지방 알코올 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올을 각각 (E12)-지방 알코올 아세테이트 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 아세테이트로 전환시키는 단계;
iii) (E12)-지방 알코올 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올을 각각 (E12)-지방 알데하이드 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔알로 전환시키는 단계;
iv) 상기 (E12)-지방 알코올, (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올, E12-지방 알코올 아세테이트, (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 아세테이트, (E12)-지방 알데하이드 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔알을 페로몬 조성물로서 제형화하는 단계.
또한 본 명세서에서 E12-지방 알코올, (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올, E12-지방 알코올 아세테이트, (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 아세테이트, E12-지방 알데하이드 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔알을 포함하는 페로몬 조성물이 제공되되, 페로몬 조성물은 적어도 20% 바이오기반 탄소, 예컨대, 적어도 30% 바이오기반 탄소, 예컨대, 적어도 40% 바이오기반 탄소, 예컨대, 적어도 50% 바이오기반 탄소, 예컨대, 적어도 60% 바이오기반 탄소, 예컨대, 적어도 70% 바이오기반 탄소, 예컨대, 적어도 80% 바이오기반 탄소, 예컨대, 적어도 85% 바이오기반 탄소, 예컨대, 적어도 90% 바이오기반 탄소, 예컨대, 적어도 95% 바이오기반 탄소, 예컨대, 100% 바이오기반 탄소를 포함한다.
본 페로몬 조성물에서 E12-지방 알코올, (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올, E12-지방 알코올 아세테이트, (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 아세테이트, E12-지방 알데하이드 및/또는(Z9, E12)-테트라데카다이엔알의 상대량은 작물 및/또는 방제될 해충의 특성에 따라 다를 수 있고; 지리학적 변형이 또한 존재할 수 있다. 따라서 최적의 상대적 양을 결정하는 것은 일상적인 최적화를 필요로 할 수 있다.
따라서, 페로몬 조성물은 1 내지 100% E12-지방 알코올, 1 내지 100%(Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올, 1 내지 100% E12-지방 알코올 아세테이트, 1 내지 100%(Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 아세테이트, 1 내지 100% E12-지방 알데하이드 및/또는 1 내지 100%(Z9, E12)-테트라데카다이엔알을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 페로몬 조성물에서 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 대 E12-지방 알코올, (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 아세테이트 대 E12-지방 알코올 아세테이트 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔알 대 E12-지방 알데하이드의 비는 적어도 0.1, 예컨대, 적어도 0.15, 예컨대, 적어도 0.2, 예컨대, 적어도 0.3, 예컨대, 적어도 0.4, 예컨대, 적어도 0.5, 예컨대, 적어도 0.75, 예컨대, 적어도 1, 예컨대, 적어도 2, 예컨대, 적어도 3, 예컨대, 적어도 4, 예컨대, 적어도 5, 예컨대, 적어도 6, 예컨대, 적어도 7, 예컨대, 적어도 8, 예컨대, 적어도 9, 예컨대, 적어도 10, 예컨대, 적어도 12.5, 예컨대, 적어도 15 이상이다.
일부 실시형태에서, 페로몬 조성물에서 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 대 E12-지방 알코올의 비는 적어도 0.1, 예컨대, 적어도 0.15, 예컨대, 적어도 0.2, 예컨대, 적어도 0.3, 예컨대, 적어도 0.4, 예컨대, 적어도 0.5, 예컨대, 적어도 0.75, 예컨대, 적어도 1, 예컨대, 적어도 2, 예컨대, 적어도 3, 예컨대, 적어도 4, 예컨대, 적어도 5, 예컨대, 적어도 6, 예컨대, 적어도 7, 예컨대, 적어도 8, 예컨대, 적어도 9, 예컨대, 적어도 10, 예컨대, 적어도 12.5, 예컨대, 적어도 15 이상이다.
일부 실시형태에서, 페로몬 조성물에서 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 아세테이트 대 E12-지방 알코올 아세테이트의 비는 적어도 0.1, 예컨대, 적어도 0.15, 예컨대, 적어도 0.2, 예컨대, 적어도 0.3, 예컨대, 적어도 0.4, 예컨대, 적어도 0.5, 예컨대, 적어도 0.75, 예컨대, 적어도 1, 예컨대, 적어도 2, 예컨대, 적어도 3, 예컨대, 적어도 4, 예컨대, 적어도 5, 예컨대, 적어도 6, 예컨대, 적어도 7, 예컨대, 적어도 8, 예컨대, 적어도 9, 예컨대, 적어도 10, 예컨대, 적어도 12.5, 예컨대, 적어도 15 이상이다.
일부 실시형태에서, 페로몬 조성물에서 (Z9, E12)-테트라데카다이엔알 대 E12-지방 알데하이드의 비는 적어도 0.1, 예컨대, 적어도 0.15, 예컨대, 적어도 0.2, 예컨대, 적어도 0.3, 예컨대, 적어도 0.4, 예컨대, 적어도 0.5, 예컨대, 적어도 0.75, 예컨대, 적어도 1, 예컨대, 적어도 2, 예컨대, 적어도 3, 예컨대, 적어도 4, 예컨대, 적어도 5, 예컨대, 적어도 6, 예컨대, 적어도 7, 예컨대, 적어도 8, 예컨대, 적어도 9, 예컨대, 적어도 10, 예컨대, 적어도 12.5, 예컨대, 적어도 15 이상이다.
일부 실시형태에서, 페로몬 조성물에서 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 대 Z9-지방 알코올, (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 아세테이트 대 Z9-지방 알코올 아세테이트 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔알 대 Z9-지방 알데하이드의 비는 적어도 0.1, 예컨대, 적어도 0.15, 예컨대, 적어도 0.2, 예컨대, 적어도 0.3, 예컨대, 적어도 0.4, 예컨대, 적어도 0.5, 예컨대, 적어도 0.75, 예컨대, 적어도 1, 예컨대, 적어도 2, 예컨대, 적어도 3, 예컨대, 적어도 4, 예컨대, 적어도 5, 예컨대, 적어도 6, 예컨대, 적어도 7, 예컨대, 적어도 8, 예컨대, 적어도 9, 예컨대, 적어도 10, 예컨대, 적어도 12.5, 예컨대, 적어도 15 이상이다.
일부 실시형태에서, 페로몬 조성물에서 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 대 Z9-지방 알코올의 비는 적어도 0.1, 예컨대, 적어도 0.15, 예컨대, 적어도 0.2, 예컨대, 적어도 0.3, 예컨대, 적어도 0.4, 예컨대, 적어도 0.5, 예컨대, 적어도 0.75, 예컨대, 적어도 1, 예컨대, 적어도 2, 예컨대, 적어도 3, 예컨대, 적어도 4, 예컨대, 적어도 5, 예컨대, 적어도 6, 예컨대, 적어도 7, 예컨대, 적어도 8, 예컨대, 적어도 9, 예컨대, 적어도 10, 예컨대, 적어도 12.5, 예컨대, 적어도 15 이상이다.
일부 실시형태에서, 페로몬 조성물에서 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 아세테이트 대 Z9-지방 알코올 아세테이트의 비는 적어도 0.1, 예컨대, 적어도 0.15, 예컨대, 적어도 0.2, 예컨대, 적어도 0.3, 예컨대, 적어도 0.4, 예컨대, 적어도 0.5, 예컨대, 적어도 0.75, 예컨대, 적어도 1, 예컨대, 적어도 2, 예컨대, 적어도 3, 예컨대, 적어도 4, 예컨대, 적어도 5, 예컨대, 적어도 6, 예컨대, 적어도 7, 예컨대, 적어도 8, 예컨대, 적어도 9, 예컨대, 적어도 10, 예컨대, 적어도 12.5, 예컨대, 적어도 15 이상이다.
일부 실시형태에서, 페로몬 조성물에서 (Z9, E12)-테트라데카다이엔알 대 Z9-지방 알데하이드의 비는 적어도 0.1, 예컨대, 적어도 0.15, 예컨대, 적어도 0.2, 예컨대, 적어도 0.3, 예컨대, 적어도 0.4, 예컨대, 적어도 0.5, 예컨대, 적어도 0.75, 예컨대, 적어도 1, 예컨대, 적어도 2, 예컨대, 적어도 3, 예컨대, 적어도 4, 예컨대, 적어도 5, 예컨대, 적어도 6, 예컨대, 적어도 7, 예컨대, 적어도 8, 예컨대, 적어도 9, 예컨대, 적어도 10, 예컨대, 적어도 12.5, 예컨대, 적어도 15 이상이다.
일부 실시형태에서, 페로몬 조성물에서 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 대 (Z9, E12)-테트라데카다이엔알 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 대 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 아세테이트의 비는 적어도 0.1, 예컨대, 적어도 0.15, 예컨대, 적어도 0.2, 예컨대, 적어도 0.3, 예컨대, 적어도 0.4, 예컨대, 적어도 0.5, 예컨대, 적어도 0.75, 예컨대, 적어도 1, 예컨대, 적어도 2, 예컨대, 적어도 3, 예컨대, 적어도 4, 예컨대, 적어도 5, 예컨대, 적어도 6, 예컨대, 적어도 7, 예컨대, 적어도 8, 예컨대, 적어도 9, 예컨대, 적어도 10, 예컨대, 적어도 12.5, 예컨대, 적어도 15 이상이다.
일부 실시형태에서, 페로몬 조성물에서 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 대 (Z9, E12)-테트라데카다이엔알의 비는 적어도 0.1, 예컨대, 적어도 0.15, 예컨대, 적어도 0.2, 예컨대, 적어도 0.3, 예컨대, 적어도 0.4, 예컨대, 적어도 0.5, 예컨대, 적어도 0.75, 예컨대, 적어도 1, 예컨대, 적어도 2, 예컨대, 적어도 3, 예컨대, 적어도 4, 예컨대, 적어도 5, 예컨대, 적어도 6, 예컨대, 적어도 7, 예컨대, 적어도 8, 예컨대, 적어도 9, 예컨대, 적어도 10, 예컨대, 적어도 12.5, 예컨대, 적어도 15 이상이다.
일부 실시형태에서, 페로몬 조성물에서 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 대 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 아세테이트의 비는 적어도 0.1, 예컨대, 적어도 0.15, 예컨대, 적어도 0.2, 예컨대, 적어도 0.3, 예컨대, 적어도 0.4, 예컨대, 적어도 0.5, 예컨대, 적어도 0.75, 예컨대, 적어도 1, 예컨대, 적어도 2, 예컨대, 적어도 3, 예컨대, 적어도 4, 예컨대, 적어도 5, 예컨대, 적어도 6, 예컨대, 적어도 7, 예컨대, 적어도 8, 예컨대, 적어도 9, 예컨대, 적어도 10, 예컨대, 적어도 12.5, 예컨대, 적어도 15 이상이다.
일부 실시형태에서, 페로몬 조성물은 적어도 30% 바이오기반 탄소, 대안적으로 40% 바이오기반 탄소, 대안적으로 50% 바이오기반 탄소, 대안적으로 60% 바이오기반 탄소, 대안적으로 70% 바이오기반 탄소, 대안적으로 75% 바이오기반 탄소, 대안적으로 80% 바이오기반 탄소, 대안적으로 85% 바이오기반 탄소, 대안적으로 90% 바이오기반 탄소, 대안적으로 95% 바이오기반 탄소를 포함한다.
일부 실시형태에서, 페로몬 조성물은 적어도 80% 바이오기반 탄소, 대안적으로 85% 바이오기반 탄소, 대안적으로 90% 바이오기반 탄소, 대안적으로 95% 바이오기반 탄소, 대안적으로 96% 바이오기반 탄소, 대안적으로 97% 바이오기반 탄소, 대안적으로 98% 바이오기반 탄소, 대안적으로 99% 바이오기반 탄소를 포함한다.
일부 실시형태에서, 페로몬 조성물은 30 내지 100% 바이오기반 탄소, 대안적으로 40 내지 100% 바이오기반 탄소, 대안적으로 50 내지 100% 바이오기반 탄소, 대안적으로 60 내지 100% 바이오기반 탄소, 대안적으로 70 내지 100% 바이오기반 탄소, 대안적으로 75 내지 100% 바이오기반 탄소, 대안적으로 80 내지 100% 바이오기반 탄소, 대안적으로 85 내지 100% 바이오기반 탄소, 대안적으로 90 내지 100% 바이오기반 탄소, 대안적으로 95 내지 100% 바이오기반 탄소를 포함한다.
일부 실시형태에서, 페로몬 조성물은 80 내지 100% 바이오기반 탄소, 대안적으로 85 내지 100% 바이오기반 탄소, 대안적으로 90 내지 100% 바이오기반 탄소, 대안적으로 95 내지 100% 바이오기반 탄소, 대안적으로 96 내지 100% 바이오기반 탄소, 대안적으로 97 내지 100% 바이오기반 탄소, 대안적으로 98 내지 100% 바이오기반 탄소, 대안적으로 99 내지 100% 바이오기반 탄소를 포함한다.
또한 E12-지방 알코올, (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올, E12-지방 알코올 아세테이트, (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 아세테이트, E12-지방 알데하이드 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔알을 포함하는 페로몬 조성물이 본 명세서에 제공되되, 페로몬 조성물은 적어도 20%의 방사성 14C 수준을 갖는다.
일부 실시형태에서, 페로몬 조성물은 적어도 30%, 대안적으로 40%, 대안적으로 50%, 대안적으로 60%, 대안적으로 70%, 대안적으로 75%, 대안적으로 80%, 대안적으로 85%, 대안적으로 90%, 대안적으로 95%의 방사성 14C 수준을 갖는다.
일부 실시형태에서, 페로몬 조성물은 적어도 80%, 대안적으로 85%, 대안적으로 90%, 대안적으로 95%, 대안적으로 96%, 대안적으로 97%, 대안적으로 98%, 대안적으로 99%의 방사성 14C 수준을 갖는다.
일부 실시형태에서, 페로몬 조성물은 30 내지 100%, 대안적으로 40 내지 100%, 대안적으로 50 내지 100%, 대안적으로 60 내지 100%, 대안적으로 70 내지 100%, 대안적으로 75 내지 100%, 대안적으로 80 내지 100%, 대안적으로 85 내지 100%, 대안적으로 90 내지 100%, 대안적으로 95 내지 100%의 방사성 14C 수준을 갖는다.
일부 실시형태에서, 페로몬 조성물은 80 내지 100%, 대안적으로 85 내지 100%, 대안적으로 90 내지 100%, 대안적으로 95 내지 100%, 대안적으로 96 내지 100%, 대안적으로 97 내지 100%, 대안적으로 98 내지 100% 탄소, 대안적으로 99 내지 100%의 방사성 14C 수준을 갖는다.
또한 다음의 단계들을 포함하는 본 발명에 따른 페로몬 조성물의 생산 방법이 본 명세서에 제공된다:
i) 본 명세서에 개시된 바와 같은 방법에 의해 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 및/또는 E12-지방 알코올을 생산하는 단계;
ii) E12-지방 알코올 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올을 각각 E12-지방 알코올 아세테이트 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 아세테이트로 전환시키는 단계;
iii) E12-지방 알코올 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올을 각각 E12-지방 알데하이드 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔알로 전환시키는 단계;
iv) E12-지방 알코올, (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올, E12-지방 알코올 아세테이트, (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 아세테이트, E12-지방 알데하이드 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔알을, 선택적으로 액체 또는 고체 담체 또는 기질과 같은 1종 이상의 추가 화합물을 포함하는 페로몬 조성물로서 제형화하는 단계;
v) 선택적으로 페로몬 조성물의 바이오기반 탄소 함량 또는 방사성 14C 수준을 결정하는 단계.
본 명세서에 개시된 바와 같은 페로몬 조성물은 생물농약으로서 사용될 수 있다. 이러한 조성물은 배양물 상에서, 농지(field)에서 또는 과수원에서 분무되거나 제공될 수 있다. 이들은 또한 당업계에 알려진 바와 같이, 예를 들어, 고무 격막 상에서 침지되거나, 또는 다른 구성성분과 혼합될 수 있다. 일 실시형태에서, 상기 조성물은 페로몬 조성물을 확산시키는 장치, 예컨대, 페로몬 디스펜서에 위치된다. 디스펜서는, 예를 들어, 일정한, 사전 조절 가능한 속도로 페로몬을 방출시킬 수 있다. 이는 교미 교란을 초래하여, 해충 생식을 방지할 수 있거나, 또는 이는 해충을 잡기 위한 포획 장치와 조합하여 사용될 수 있다. 본 페로몬 조성물이 사용될 수 있는 해충의 비제한적 예는 목화 벌레(헬리코베르파 아르미게라(Helicoverpa armigera)), 줄무늬 줄기뚫이 나방(칠로 수프레살리스), 등에 다이아몬드 나방(플루텔라 자일로스텔라), 배추좀나방(마메스트라 브라시카에), 거대 양배추-심장 애벌레(large cabbage-heart caterpillar)(크로시도로미아 비노탈리스(Crocidolomia binotalis)), 유럽 옥수수 줄기 천공충(세사미아 노나그리오이데스), 건포도 클리어윙(시난테돈 티풀리포르미스(Synanthedon tipuliformis)) 및 아티초크 털날개 나방(플라팁틸리아 카르두이닥티랄(Platyptilia carduidactylal)), 화랑곡나방(플로디아 인터푼텔라), 파밤나방 애벌레(스포돕테라 엑시구아), 줄알락명나방(카드라 카우텔라), 열대거세미나방(스포돕테라 에리다니아) 및 기타이다. 따라서, 배양물에 대한 본 조성물의 용도는 실질적으로 환경적 영향 없이 증가된 곡물 수확량을 야기할 수 있다.
본 페로몬 조성물에서 지방 알코올, 지방 알코올 아세테이트 및/또는 지방 알데하이드의 상대적 양은 방제될 작물 및/또는 해충의 특성에 따라 다를 수 있으며; 지리학적 변이가 또한 존재할 수 있다. 따라서 최적의 상대적 양을 결정하는 것은 일상적인 최적화를 필요로 할 수 있다.
해충 방제에 사용되는 조성물의 예는 헬리코베르파 아르미게라의 경우 문헌[Kehat & Dunkelblum (1993)]; 칠로 수프레살리스의 경우 문헌[Alfaro et al. (2009)]; 세사미아 노나그리오이데스의 경우 문헌[Eizaguirre et al. (2002)]; 플루텔라 자일로스텔라의 경우 문헌[Wu et al. (2012)]; 플라팁틸리아 카르두이닥티랄의 경우 문헌[Bari et al. (2003)]; 플로디아 인테르펀텔라의 경우 문헌[Zhu et al. (1999)]; 스포돕테라 엑시구아의 경우 문헌[Wakamura (1987)]; 및 카드라 카우텔라의 경우 문헌[Brady et al. (1971)]에서 찾을 수 있다.
일부 실시형태에서, 페로몬 조성물은 1종 이상의 추가적인 화합물, 예컨대, 액체 또는 고체 담체 또는 기질을 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 적합한 담체 또는 기질은 식물성 오일, 정제된 광유 또는 이들의 단편, 고무, 플라스틱, 실리카, 규조토, 왁스 매트릭스 및 셀룰로스 분말을 포함한다.
페로몬 조성물은 당업계에 알려진 바와 같이 제형화될 수 있다. 예를 들어, 이는 용액, 겔, 분말의 형태일 수 있다. 페로몬 조성물은 당업계에서 알 수 있는 바와 같이 용이하게 제공될 수 있도록 제형화될 수 있다.
본 교미 교란 방법은 유전자이식 작물 분야에서 사용될 수 있다.
또한 살충 형질에 대한 내성의 출현을 감소 또는 지연시키는 방법이 본 명세서에 제공되며; 상기 방법은 통합된 내성 관리 방법일 수 있다. 따라서, 유전자이식 살충 작물 및/또는 화학적 살충제, 즉, 선제적 전략에 대해 해충, 예컨대, 곤충, 예를 들어, 본 명세서에 열거된 임의의 곤충에서 내성의 발생을 지연시키는 선제적 및 반응성 방법이 개시된다. 또한 일단 내성이 발생되면 유전자이식 살충 작물 및/또는 화학적 살충제에 대해 하나 이상의 해충 감수성을 구제하는 방법, 즉, 반응성 전략이 개시된다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 본 명세서에 개시된 방법에 의해 얻어지는 것과 같은 페로몬 조성물을 농지 집단을 포함하는 농업 분야에 적용하는 것을 포함하되, 유전자이식 작물은 하나 이상의 살충 형질, 예컨대, 본 명세서에 열거된 곤충 중 하나에 대해 활성인 유전자이식 살충 형질을 포함하고, 선택적으로 피난처는 해충의 교미를 교란시켜 살충 형질에 대한 내성의 출현을 지연시키기 위한 살충 형질이 없는 작물을 포함한다. 따라서, 본 조성물은 WO 2017/112887에 기재된 임의의 방법과 조합하여 사용될 수 있다.
또한 해충 예컨대, 본 명세서에 열거된 바와 같은 곤충으로부터 작물 손상을 방지하거나 감소시키는 방법이 본 명세서에 제공된다. 이러한 방법은 본 명세서에 개시된 바와 같은 페로몬 조성물을 적용함으로써 밭에 교미 교란을 적용하는 단계 및 1종 이상의 해충에서 하나 이상의 표적 유전자의 발현을 교란시켜, 농지에서의 작물 손상을 감소 또는 방지하는 단계를 포함한다. 하나 이상의 표적 유전자의 발현 교란은, 예를 들어, WO 2017/205751에 기재된 바와 같이, RNAi를 이용하여 달성될 수 있다. 따라서, 본 조성물은 WO 2017/205751에 기재된 임의의 방법과 조합하여 사용될 수 있다.
페로몬 화합물
또한 E12-지방 알코올, (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올, E12-지방 알코올 아세테이트, (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 아세테이트, E12-지방 알데하이드 및 (Z9, E12)-테트라데카다이엔알로 이루어진 군으로부터 선택된 페로몬 화합물이 본 명세서에 제공되되, 페로몬 화합물은 적어도 20% 바이오기반 탄소를 포함한다.
일부 실시형태에서, 페로몬 화합물은 적어도 30% 바이오기반 탄소, 대안적으로 40% 바이오기반 탄소, 대안적으로 50% 바이오기반 탄소, 대안적으로 60% 바이오기반 탄소, 대안적으로 70% 바이오기반 탄소, 대안적으로 75% 바이오기반 탄소, 대안적으로 80% 바이오기반 탄소, 대안적으로 85% 바이오기반 탄소, 대안적으로 90% 바이오기반 탄소, 대안적으로 95% 바이오기반 탄소를 포함한다.
일부 실시형태에서, 페로몬 화합물은 적어도 80% 바이오기반 탄소, 대안적으로 85% 바이오기반 탄소, 대안적으로 90% 바이오기반 탄소, 대안적으로 95% 바이오기반 탄소, 대안적으로 96% 바이오기반 탄소, 대안적으로 97% 바이오기반 탄소, 대안적으로 98% 바이오기반 탄소, 대안적으로 99% 바이오기반 탄소를 포함한다.
일부 실시형태에서, 페로몬 화합물은 30 내지 100% 바이오기반 탄소, 대안적으로 40 내지 100% 바이오기반 탄소, 대안적으로 50 내지 100% 바이오기반 탄소, 대안적으로 60 내지 100% 바이오기반 탄소, 대안적으로 70 내지 100% 바이오기반 탄소, 대안적으로 75 내지 100% 바이오기반 탄소, 대안적으로 80 내지 100% 바이오기반 탄소, 대안적으로 85 내지 100% 바이오기반 탄소, 대안적으로 90 내지 100% 바이오기반 탄소, 대안적으로 95 내지 100% 바이오기반 탄소를 포함한다.
일부 실시형태에서, 페로몬 화합물은 80 내지 100% 바이오기반 탄소, 대안적으로 85 내지 100% 바이오기반 탄소, 대안적으로 90 내지 100% 바이오기반 탄소, 대안적으로 95 내지 100% 바이오기반 탄소, 대안적으로 96 내지 100% 바이오기반 탄소, 대안적으로 97 내지 100% 바이오기반 탄소, 대안적으로 98 내지 100% 바이오기반 탄소, 대안적으로 99 내지 100% 바이오기반 탄소를 포함한다.
또한 E12-지방 알코올, (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올, E12-지방 알코올 아세테이트, (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 아세테이트, E12-지방 알데하이드 및 (Z9, E12)-테트라데카다이엔알로 이루어진 군으로부터 선택된 페로몬 화합물이 본 명세서에 제공되되, 페로몬 화합물은 적어도 20%의 방사성 14C 수준을 갖는다.
일부 실시형태에서, 페로몬 화합물은 적어도 30%, 대안적으로 40%, 대안적으로 50%, 대안적으로 60%, 대안적으로 70%, 대안적으로 75%, 대안적으로 80%, 대안적으로 85%, 대안적으로 90%, 대안적으로 95%의 방사성 14C 수준을 갖는다.
일부 실시형태에서, 페로몬 화합물은 적어도 80%, 대안적으로 85%, 대안적으로 90%, 대안적으로 95%, 대안적으로 96%, 대안적으로 97%, 대안적으로 98%, 대안적으로 99%의 방사성 14C 수준을 갖는다.
일부 실시형태에서, 페로몬 화합물은 30 내지 100%, 대안적으로 40 내지 100%, 대안적으로 50 내지 100%, 대안적으로 60 내지 100%, 대안적으로 70 내지 100%, 대안적으로 75 내지 100%, 대안적으로 80 내지 100%, 대안적으로 85 내지 100%, 대안적으로 90 내지 100%, 대안적으로 95 내지 100%의 방사성 14C 수준을 갖는다.
일부 실시형태에서, 페로몬 화합물은 80 내지 100%, 대안적으로 85 내지 100%, 대안적으로 90 내지 100%, 대안적으로 95 내지 100%, 대안적으로 96 내지 100%, 대안적으로 97 내지 100%, 대안적으로 98 내지 100% 탄소, 대안적으로 99 내지 100%의 방사성 14C 수준을 갖는다.
추가로 효모 세포에서 본 발명에 따른 페로몬 화합물을 생산하는 방법이 제공되되, 상기 방법은,
i) 이종성 Δ12 지방 아실-CoA 탈포화효소를 발현시키는 효모 세포를 제공하는 단계,
ii) 이종성 Δ12 지방 아실-CoA 탈포화효소의 발현을 가능하게 하는 조건 하의 배지에서 상기 효모 세포를 인큐베이션시키는 단계
를 포함함으로써, 페로몬 화합물을 생산한다.
일부 실시형태에서, 효모 세포는 추가 이종성 탈포화효소를 발현시킨다.
일부 실시형태에서, 효모 세포는 적어도 1종의 알코올-형성 지방 아실-CoA 환원효소(FAR)를 추가로 발현시킨다.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 페로몬 화합물의 바이오기반 탄소 함량 또는 방사성 14C 수준을 결정하는 단계를 더 포함한다.
생물기반 생성물
"생물기반" 생성물은 하기의 생성물로서 정의될 수 있다:
1. 생성물의 총 탄소 함량이 적어도 30%이고,
2. 재생 가능한 원료(생물 기반)의 탄소 함량은 적어도 20%이다.
화석과 재생 가능한 원료는 둘 다 주로 탄소(C)로 이루어진다. 탄소는 여러 동위원소에서 발견된다. 동위원소 14C는 방사성이고, 대기에서 상대 14C 농도와 거의 동일한 고정된 상대 농도로 모든 살아있는 유기체(식물, 동물 등)에서 자연적으로 발생된다. 이 농도에서, 14C의 방사성 수준은 100%이다. 일단 유기체가 더 이상 생존하지 않는다면, 이 농도 및 그에 따른 방사성 비율은 대략 5700년의 반감기로 붕괴된다. 따라서, 알려지지 않은 물질의 방사성 14C 수준은 물질에 함유된 탄소가 얼마나 오래되었는지를 결정하는 것을 도울 수 있다.
재생 가능한 원료, 예컨대, 식물 또는 동물로부터 유래된 "젊은" 탄소(0 내지 10년)는 대기에서 상대 14C 농도와 거의 동일한 상대 동위원소 14C 농도를 갖고, 따라서 이러한 젊은 탄소의 방사성 14C 수준은 약 100%이다.
합성 또는 화석(석유화학) 공급원으로부터 유래된 "오래된"(수백만년) 탄소는, 이러한 합성 및 화석 공급원의 연령이 대략 5700년인 동위원소 14C의 반감기를 훨씬 초과하기 때문에 동위원소 14C로부터 크게 감소된다. 따라서, 합성 또는 화석 공급원으로부터 유래된 탄소는 대략 0%의 상대 동위원소 14C 농도를 갖고, 따라서 이러한 오래된 탄소의 방사성 14C 수준은 약 0%이다.
일 실시형태에서, 용어 "방사성 14C 수준"은 위에 정의된 바와 같이 주어진 물질, 생성물 또는 조성물의 총 방사성 14C 수준을 지칭한다.
동위원소 14C 방법은 오래된(화석) 자원의 농도에 비해서 젊은(재생 가능한) 물질의 농도를 결정하는 데 사용될 수 있다. 재생 가능한 원료의 탄소 함량은 "바이오기반 탄소 함량"으로 지칭된다. 재생 가능한 원료의 탄소 함량 또는 "바이오기반 탄소 함량"은 아래에 기재되는 바와 같이 결정될 수 있다.
바이오기반 탄소 함량을 측정할 때, 결과는 "바이오기반 탄소%"로 보고될 수 있다. 이는 "천연" (식물 또는 동물 부산물) 공급원 대 "합성" 또는 "화석" (석유화학) 공급원으로부터의 탄소 백분율을 나타낸다. 참고를 위해, 100% 바이오기반 탄소는 물질이 완전히 식물 또는 동물 부산물로부터 공급된다는 것을 나타내고 0% 바이오기반 탄소는 물질이 식물 또는 동물 부산물로부터의 임의의 탄소를 함유하지 않았다는 것을 나타낸다. 사이의 값은 천연 공급원과 화학 공급원의 혼합물을 나타낸다.
실시예: 생성물이 80%의 방사성 14C 수준을 갖는다면, 생성물은 80%의 재생 가능 및 20% 화석 탄소(C)로 이루어진다는 것을 의미한다. 다시 말해서, 생성물은 80% 생물 기반이다.
분석 측정은 "모던 탄소 백분율(percent modern carbon: pMC)"로서 인용될 수 있다. 이는 모든 참조 표준(NIST 4990C)에 대해 샘플에서 측정되는 14C의 백분율이다. 생물기반 탄소 함량%는 오늘 날 공기 중 이산화탄소의 14C에 대한 작은 조정 계수를 적용함으로써 pMC로부터 계산된다. 14C를 사용하는 모든 국제적으로 인식되는 표준은 식물 또는 바이오매스 공급원료가 자연 환경으로부터 얻은 것으로 가정한다는 점에 유의하는 것이 중요하다.
실시예
실시예 1 - 바이오브릭스(BioBricks) 및 플라스미드의 작제
모든 이종성 유전자를 야로위아 리폴리티카에 대한 코돈-최적화 형태로 GeneArt(Life Technologies)가 합성하였다. 모든 유전자를 Phusion U Hot Start DNA 중합효소(ThermoFisher)를 이용하는 PCR에 의해 증폭시켜 효모 추출 벡터에 클로닝시키기 위한 단편을 얻었다. 프라이머를 표 1에 열거하고, 얻어진 DNA 단편(BioBricks)을 표 2에 열거한다. "***BsaI"로 표지된 BioBricks를 제조업자의 지침에 따라 표시된 모 플라스미드의 BsaI 제한 분해에 의해 얻었다. PCR 산물 또는 제한 분해 반응을 1%-아가로스 겔 함유 Midori Green Advance(Nippon Genetics Europe GmbH) 상에서 분리시켰다. 정확한 크기의 PCR/제한 분해 산물을 겔로부터 절단하고, Nucleospin Gel 및 PCR Clean-up 키트(Macherey-Nagel)를 이용해서 정제하였다.
USER 카세트를 갖는 효모 벡터를 2시간 동안 37℃에서 FastDigest SfaAI(ThermoFisher)를 이용해서 선형화하였고, 이어서, 1시간 동안 65℃에서 Nb.Bsml(New England Biolabs)로 틈내기하였다. 접착 말단을 포함하는 얻어진 벡터를 겔 전기영동에 의해 분리시키고, 겔로부터 절단하였고, Nucleospin Gel 및 PCR Clean-up 키트(Macherey-Nagel)를 이용해서 겔-정제하였다. DNA 단편을 (Holkenbrink, et al., 2018; Jensen, et al., EasyClone: method for iterative chromosomal integration of multiple genes in Saccharomyces cerevisiae, 2014)에 기재된 바와 같이 USER-클로닝에 의해 벡터에 클로닝하였다. "결찰"로 표시된 플라스미드(표 3)를 제조업자의 지침에 따라 표시된 BioBricks를 포함하는 DNA T4 결찰 반응에 의해 얻었다. USER/T4 반응을 화학적 적격 이콜라이(E. coli) DHα 세포에 형질전환시켰고, 세포를 100㎎/ℓ 암피실린을 이용해서 Lysogeny 브로스(LB) 한천 플레이트 상에서 플레이팅하였다. 플레이트를 밤새 37℃에서 인큐베이션시켰고, 얻어진 콜로니를 콜로니 PCR에 의해 선별하였다. 플라스미드를 밤새 이콜라이 액체 배양물로부터 정제하였고, 서열분석에 의해 정확한 클로닝을 확립하였다. 작제된 벡터를 표 3에 열거한다.
"**"로 표시한 균주를 다음과 같이 작제하였다. 표시된 유전자를 정방향 프라이머에서 "ACTTTTTGCAGTACUAACCGCAG"의 5'-돌출부 및 역방향 프라이머에서 "CACGCGAU"의 3'-돌출부를 포함하는 유전자-특이적 프라이머로 증폭시켰다. 표적 유전자 서열의 첫 번째 "ATG"를 생략하였다. 이러한 PCR 산물을 (Holkenbrink, et al., 2018)에 기재된 바와 같이 통합 벡터 또는 에피솜 벡터에 BB9454와 함께 클로닝시켰다.
사카로마이세스 세레비시애에서 사용하기 위한 에피솜 발현 벡터를 클로닝하였고, 문헌[Jensen, 2014]에 기재된 바와 같이 형질전환시켰다. 탈포화효소 Desat59 및 Pid12를 각각 유전자 TEF1 및 TDH3의 사카로마이세스 세레비시애 천연 프로모터의 제어 하에서 발현시켰다.
실시예 2 - 효모 균주의 작제
문헌[Holkenbrink et al., 2018; Jensen et al., 2014]에 기재된 바와 같이 DNA 벡터의 형질전환에 의해 효모 균주를 작제하였다. 형질전환 전에 FastDigest NotI를 이용해서 통합 벡터를 선형화하였다. 필요한 경우, 특정 게놈 영역에 통합을 촉진시키기 위한 헬퍼 벡터를 표 3에 열거되는 통합 플라스미드 또는 DNA 수선 단편과 함께 공동 형질전환시켰다. 적절한 항생제 선택을 갖는 효모 펩톤 덱스트로스(yeast peptone dextrose: YPD) 한천 상에서 또는 특정 아미노산이 없은 합성 드롭-아웃 배지(Sigma-Adrich) 상에서 균주를 선택하였다. 콜로니 PCR에 의해 그리고 서열분석에 의해 필요한 경우 정확한 유전자형을 확립하였다. 얻어진 균주를 표 4에 열거한다.
실시예 3 - 지방 알코올 및 지방산 메틸 에스터(FAME)의 균주 배양 및 분석
야로위아 리폴리티카 균주를 YPD 한천 플레이트(10g/ℓ 효모 추출물, 10g/ℓ 펩톤, 20g/ℓ 글루코스, 15g/ℓ 한천)로부터 24 웰-플레이트(EnzyScreen)에서 2.5㎖ YPG 배지(10g/ℓ 효모 추출물, 10g/ℓ 펩톤, 40g/ℓ 글리세롤)에 0.1 내지 0.2의 초기 OD600로 접종하였다. 플레이트를 28℃에서 인큐베이션시키고, 300rpm에서 진탕시켰다. 22시간 후에, 플레이트를 5분 동안 4℃ 및 3,000 xg에서 원심분리시켰다. 상청액을 버리고, 세포를 웰당 1.25㎖ 생산 배지(50g/ℓ 글리세롤, 5g/ℓ 효모 추출물, 4g/ℓ KH2PO4, 1.5g/ℓ MgSO4, 0.2g/ℓ NaCl, 0.265g/ℓ CaCl2.2H2O, 2㎖/ℓ 미량의 구성요소 용액: 4.5g/ℓ CaCl2.2H2O, 4.5g/ℓ ZnSO4.7H2O, 3g/ℓ FeSO4.7H2O, 1g/ℓ H3BO3, 1g/ℓ MnCl2.4H2O, 0.4g/ℓ N Na2MoO4.2H2O, 0.3g/ℓ CoCl2.6H2O, 0.1g/ℓ CuSO4.5H2O, 0.1g/ℓ KI, 15g/ℓ EDTA)에서 재현탁시켰다. 필요한 경우 배지를 항생제로 보충하였다. 플레이트를 28시간 동안 28℃에서 인큐베이션시키고, 300rpm에서 진탕시켰다.
합성 드롭 아웃 한천 플레이트(유라실, 류신 및 히스티딘 없음)로부터 0.1 내지 0.2의 초기 OD600까지 24 웰-플레이트(EnzyScreen)에서 2% 글루코스, 1% 터지톨, 올레산(5.6㎖/ℓ) 및 메틸 미리스테이트(2㎖/ℓ)를 보충한 2.5㎖의 합성 드롭-아웃 배지(유라실, 류신 및 히스티딘 없음)에 사카로마이세스 세레비시애 균주를 접종하였다.
지방 알코올의 분석을 위해, 1㎖의 배양 브로스를 원심분리시키고, 상청액을 흡입하고 버렸다. 1㎖의 에틸 아세테이트:에탄올(84:15) 및 10㎕의 Z10-17:Me(2㎎/㎖)를 내부 표준으로서 세포 펠릿에 첨가하였다. 샘플을 20초 동안 교반하였고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이션시킨 후에, 5분 동안 교반하였다. 300㎕의 H2O를 각 샘플에 첨가하였다. 샘플을 교반하였고, 5분 동안 21℃ 및 3,000×g에서 원심분리시켰다. 상부 유기상을 기체 크로마토그래피-질량분석법(GC-MS)을 통해 분석하였다. GC-MS 분석을 질량 선택적 검출기 Agilent 5977B에 결합된 Agilent 7820A GC 상에서 수행하였다. GC는 DB Fatwax 칼럼(30m×0.25㎜×0.25㎛)을 구비하였고, 헬륨을 운반 기체로 사용하였다. MS를 m/z 30 내지 400에서 스캐닝하여 전자 충격 모드(70eV)에서 작동시켰고, 주사기를 220℃에서 분할 모드 20:1로 구성하였다. 오븐 온도를 1분 동안 80℃로 설정하였고, 이어서, 20℃/분의 속도로 210℃까지 증가시킨 후에, 210℃에서 7분 동안 유지하였고, 이어서, 20℃/분의 속도로 230℃까지 증가시켰다. 화합물을 체류 시간 및 참조 화합물의 질량 스펙트럼의 비교에 의해 확인하였다. Agilent Masshunter 소프트웨어에 의해 데이터를 분석하였다. 지방 알코올의 농도를 참조 표준과 비교되는 표준 교정 곡선에 기반하여 계산하였다.
지방산의 분석을 위해, 1㎖의 각 바이알을 5분 동안 4℃ 및 3,000×g에서 원심분리에 의해 채취하였다. 각 펠릿을 메탄올(무수) 중 1000㎕ 1M HCl로 추출하였다. 샘플을 20초 동안 교반하였고, 80℃ 수욕에서 2시간 동안 두었다. 샘플을 30분마다 10초 동안 교반하였다. 샘플을 실온으로 냉각시킨 후에, 메탄올(무수) 중 1000㎕의 1M NaOH, 500㎕의 NaCl 포화 H2O, 990㎕의 헥산 및 내부 표준으로서 10㎕의 Z10-17:Me(2㎎/㎖)를 첨가하였다. 샘플을 교반하였고, 5분 동안 21℃ 및 3,000×g에서 원심분리시켰다. 상부 유기상을 위에 기재한 바와 같이 GC-MS를 통해 분석하였다.
실시예 4 - 효모 야로위아 리폴리티카에서 Z9, E12-14:CoA의 생성
드로소필라 비릴리스로부터의 ΔZ9-탈포화효소 Desat61를 단독으로(ST10628) 또는 야로위아 리폴리티카 균주 ST7982에서 플로디아 인터푼텔라(ST10870)로부터의 Pid12 탈포화효소와 조합하여 발현시켜(Petkevicius et al., 2021) 상응하는 균주 ST10628 및 ST10870을 제공하였다. 균주를 배양시켰고, 지방산을 실시예 3에 기재한 바와 같이 추출하였다.
ΔZ9-탈포화효소 Desat61을 발현시키는 균주 ST10628은 Z9-14:Me을 제공하였다(도 2B 및 표 4). ΔZ9-탈포화효소 Desat61과 새로 확인된 Pid12 탈포화효소를 둘 다 발현시키는 균주 ST10870은 Z9-14:Me과 이중 불포화 C14-지방산 메틸 에스터를 모두 제공하였다. Z9,E12:Me의 분석 표준으로서 동일한 체류 시간(10.2분)에 이중-불포화 C14 지방산 메틸 에스터를 용리시켰고(도 2A, 도 2C), 표준으로서 유사한 질량 스펙트럼을 나타냈다(도 2D, 도 2E). Z9-14:Me 및 Z9, E12-14:Me의 역가를 표 5에 열거한다.
실시예 5 - 야로위아 리폴리티카에서 Z9, E12-14:OH의 생산
드로소필라 비릴리스로부터의 탈포화효소 Desat61 및 플로디아 인터푼텔라로부터의 Pid12 탈포화효소를 단독으로 또는 상이한 곤충 종으로부터의 지방 아실 환원효소와 조합하여 야로위아 리폴리티카 균주 ST7982에서 발현시켰다(Petkevicius et al., 2021). 균주를 배양시켰고, 지방 알코올을 실시예 3에 기재한 바와 같이 추출하였다.
헬리코베르파 아르미게라로부터의 지방 아실 환원효소 FAR1, 스포돕테라 엑시구아로부터의 FAR16, 스포돕테라 엑시구아로부터의 FAR17, 스포돕테라 리투라로부터의 FAR19 및 플로디아 인터푼텔라로부터의 FAR28, FAR29 및 PiFAR31을 각각 발현시키는 균주 ST10872 내지 ST10879는 Z9-14:OH와 표적 화합물 Z9, E12-14:OH를 둘 다 생산하였다(표 6). FAR19를 발현시키는 균주 ST10875는 0.88㎎/ℓ의 Z9, E12-14:OH로 가장 높은 역가를 생성하였다. FAR29 및 FAR31을 발현시키는 균주 ST10877 및 ST10879는 소량의 Z9-14:OH만을 생성하였지만, Z9, E12-14:OH는 생성하지 않았다.
실시예 6 - 야로위아 리폴리티카에서 플로디아 인터푼텔라 탈포화효소의 발현
균주 ST10629 및 ST11190 내지 ST11193은 ΔZ9 탈포화효소 Desat61, 지방 아실 환원효소 FAR1 및 플로디아 인터푼텔라로부터의 다양한 탈포화효소 유전자를 발현시킨다. 균주 ST10661은 Desat61 및 FAR1만을 발현시키는 대조군 균주로서 작용한다.
시험한 모든 균주는 Z9-14:OH를 시험하였지만, Pid12를 발현시키는 균주인 ST10629만이 0.6㎎/ℓ의 역가에서 Z9, E12-14:OH를 생성하였다.
[표 6]
실시예 7 - 효모 사카로마이세스 세레비시애에서 Z9, E12-14:CoA 및 Z9, E12-14:OH의 생산
ΔZ9 탈포화효소 Desat59 또는 Desat61 또는 다른 ΔZ9 탈포화효소, Pid12 탈포화효소 및 지방 아실 환원효소를 사카로마이세스 세레비시애 유전자 발현 벡터에 클로닝시키고, 문헌[Jensen et al., 2014]에 기재된 바와 같이 사카로마이세스 세레비시애에 형질전환시켰다. 균주 배양 및 샘플 추출을 실시예 3에서와 같이 수행할 수 있다. 플로디아 인터푼텔라로부터의 ΔZ9 탈포화효소 및 Pid12 탈포화효소를 발현시키는 균주는 Z9, E12-14:Me를 생산하는 반면, 지방 아실 환원효소 유전자를 추가로 발현시키는 균주는 Z9, E12-14:OH를 생산한다.
실시예 8 - 다른 지방 아실-CoA 환원효소를 이용하는 야로위아 리폴리티카에서의 Z9, E12-14:OH의 생산
드로소필라 비릴리스로부터의 탈포화효소 Desat61 및 플로디아 인터푼텔라로부터의 Pid12 탈포화효소를 단독으로 또는 플로디아 인터푼텔라로부터의 지방 아실 환원효소 FAR32와 조합하여 야로위아 리폴리티카 균주 ST7982에서 발현시켰다(Petkevicius et al., 2021). 균주를 배양시켰고, 지방 알코올을 실시예 3에 기재한 바와 같이 추출하였다.
실시예 9 - 바이오기반 탄소 함량의 측정
본 발명에 따른 페로몬 화합물의 바이오기반 탄소 함량은 모던 탄소 백분율(pMC)"로서 인용될 수 있는 분석 측정을 이용함으로써 측정된다. 이는 모든 참조 표준(NIST 4990C)에 대해 샘플에서 측정되는 동위원소 14C의 백분율이다. 생물기반 탄소 함량%는 오늘 날 공기 중 이산화탄소의 동위원소 14C에 대한 작은 조정 계수를 적용함으로써 pMC로부터 계산된다.
본 발명에 따른 페로몬 화합물은 80% 초과의 바이오기반 탄소 함량을 갖는다.
실시예 10 - 야로위아 리폴리티카에서 Z9, E12-14:CoA의 생산
드로소필라 비릴리스로부터의 ΔZ9-탈포화효소 Desat61를 단독으로(ST10628) 또는 야로위아 리폴리티카 균주 ST7982에서 카드라 카우텔라(ST12930)로부터의 EcauDes12 탈포화효소와 조합하여 발현시켜(Petkevicius et al., 2021) 상응하는 균주 ST10628 및 ST12930을 제공한다. 균주를 배양시키고, 지방산을 실시예 3에 기재된 바와 같이 추출한다.
균주 ST10628의 유도체화된 추출물은 Z9-14:Me을 함유한 반면, 균주 ST12930의 유도체화된 추출물은 Z9-14:Me과 Z9,E12-14:Me을 모두 함유하였다.
실시예 11 - 효모 사카로마이세스 세레비시애에서 Z9, E12-14:CoA의 생산
ΔZ9 탈포화효소 Desat59를 사카로마이세스 세레비시애에서 문헌[Jensen et al., 2014]에 기재된 바와 같이 단독으로 또는 Pid12와 조합하여 발현시켰다. 균주 배양 및 샘플 추출을 실시예 3에서와 같이 수행하였다. Desat59 및 Pid12를 공동 발현시키는 균주 ST12585의 유도체화된 추출물은 0.05±0.00㎎/ℓ의 Z9,E12-14:Me을 함유한 반면, Desat59만을 발현시키는 균주 ST12587의 추출물은 임의의 Z9,E12-14:Me를 함유하지 않았다.
실시예 12 - Z9, E12-14:OH의 아세틸화에 의한 Z9, E12-14:OAc의 제조
자기 교반기를 구비한 유리 둥근 바닥 플라스크에서 아세틸화 반응을 수행하였다. 반응 플라스크에 2g의 Z9,E12-14:OH(91% 순도; 9.5 ㎜ol) 및 1.06g 아세트산 무수물(99% 순도, 10.5 ㎜ol, 1.1 당량)을 장입하였다. 반응 혼합물을 일정한 혼합 하에서 80℃까지 가열하였다. 2시간 후에, GC 분석은 완전한 알코올 소모를 나타냈다.
아세트산 부산물뿐만 아니라 비반응 아세트산 무수물을 감압 하에 증발시켜 2.28g의 무색 오일을 수득하였다. GC-MS 분석은 생성물의 구조를 92% 순도(95% 수율)의 Z9, E12-14:OAc로서 확인하였다(도 3A 및 도 3B).
실시예 13 - 대안의 FAR을 이용하는 야로위아 리폴리티카에서의 Z9,E12-14:OH의 생산
ΔZ9 탈포화효소 Desat61 및 Δ12 탈포화효소 Pid12를 개별적으로 다양한 유기체로부터 유래된 다양한 지방 아실-CoA 환원효소와 함께 공동발현시켰다. 균주를 배양시켰고, 세포를 22시간 대신에 YPG 배지에서 47시간 동안 인큐베이션시킨 것을 제외하고 실시예 3에 기재된 바와 같이 지방 알코올을 추출하였다.
균주 ST10872, ST12294-ST12296, ST12299, ST12271-ST12274, ST12777 및 ST12779의 추출물은 0.01㎎/ℓ 초과의 Z9,E12-14:OH를 함유하였다(아래의 표에서 "+"로 표시함).
실시예 14 - 대안의 Δ9 탈포화효소를 이용하는 야로위아 리폴리티카에서의 Z9,E12-14:산의 생산
Δ12 탈포화효소 Pid12 및 EcauDes12를 개별적으로 다양한 유기체로부터 유래된 다양한 Δ9 탈포화효소와 함께 공동 발현시켰다. 균주를 배양시켰고, 세포를 22시간 대신에 YPG 배지에서 47시간 동안 인큐베이션시킨 것을 제외하고 실시예 3에 기재된 바와 같이 FAME를 추출하였다.
Z9,E12-14:Me(0㎎/ℓ 초과는 아래의 표에서 "+"로 나타냄)의 가장 낮은 역가를 Pid12만을 발현시킨 균주 ST12630의 추출물에서 검출하였다. 이 균주에서, Δ12 탈포화 반응을 위한 기질인 Z9-14:CoA를 효모 천연 탈포화효소 OLE1에 의한 부산물로서 생성한다.
균주 ST12631, ST12632, ST12634, ST12635, ST12640, ST12256, ST12257, ST12260, ST12261 및 ST12266를 Δ12 탈포화효소 이종성 Δ9 탈포화효소에 추가로 발현시켰다. 이러한 균주의 유도체화된 추출물은 균주 ST12630의 추출물보다 고수준의 Z9,E12-14:Me(아래의 표에서 "++"로 나타낸 바와 같은 0.02㎎/ℓ 이상)를 함유하였다.
실시예 15 - 대안의 Δ12 탈포화효소를 이용하는 야로위아 리폴리티카에서의 Z9,E12-14:산의 생산
Pid12 및 EcauDes12의 융합-단백질 변이체를 설계하고, 시험하였다. 이러한 변이체에서, Δ12 탈포화효소 Pid12 및 EcauDes12의 N- 및 C-말단을 플로디아 인터푼텔라 탈포화효소 Desat65 또는 아미엘로이스 트란시텔라 탈포화효소 Desat16 중 하나의 N- 및 C-말단으로 대체하였다. 융합 단백질의 서열 동일성을 아래의 표에서 알 수 있다. 균주를 배양시켰고, 세포를 22시간 대신에 YPG 배지에서 47시간 동안 인큐베이션시킨 것을 제외하고 실시예 3에 기재된 바와 같이 FAME를 추출하였다.
N- 및 C-말단(N-말단 아미노산 1 내지 30, C-말단 아미노산 300 내지 335)이 Desat65의 말단(N-말단 아미노산 1 내지 29, C-말단 아미노산 299-344)으로 대체된 Pid12의 변이체를 발현시키는 균주 ST12368은 비변형 Pid12 및 EcauDes12를 각각 발현시키는 균주 ST12366 및 ST12367와 유사한 양의 Z9,E12-14:Me(아래의 표에서 "+"로 나타내는 바와 같은 0.02㎎/ℓ 초과)를 생산하였다. N- 및 C-말단(N-말단 아미노산 1 내지 30, C-말단 아미노산 300 내지 338)이 각각 탈포화효소 Desat65의 말단(N-말단 아미노산 1 내지 29, C-말단 아미노산 299 내지 344) 및 Desat16(N-말단 아미노산 1 내지 20; C-말단 아미노산: 302 내지 326)으로 대체된 EcauDes12의 변이체를 발현시키는 균주 ST12374 및 ST12379에 대해 동일한 것이 관찰되었다.
단백질 사이의 서열 동일성 백분율을 표에 나타낸다.
실시예 16 - 에페스티아 쿠에니엘라로부터의 Δ12 탈포화효소를 이용하는 야로위아 리폴리티카에서의 Z9,E12-14:산의 생산
에페스티아 쿠에니엘라의 탈포화효소를 야로위아 리폴리티카(ST12596)에서 Δ9 탈포화효소 Desat61과 함께 공동발현시켰다. Desat61만을 발현시키는 균주 ST10748은 음성 대조군으로서 작용하였다. 균주를 배양시켰고, 세포를 22시간 대신에 YPG 배지에서 47시간 동안 인큐베이션시킨 것을 제외하고 실시예 3에 기재된 바와 같이 FAME를 추출하였다.
균주 ST12596의 FAME 추출물은 이중 불포화 메틸 테트라데카다이에노에이트를 함유하였다(도 4A). 10.39분의 체류시간과 이 피크의 질량 스펙트럼은 둘 다 Z9,E12-14:Me의 순수한 분석 표준과 동일하였다(도 4A, 도 4B 및 도 4C) . 대조군 균주 ST10748의 추출물은 10.39분에 용리되는 화합물을 함유하지 않았다(도 4A). 에페스티아 쿠에니엘라 탈포화효소가 Δ12 이중결합을 도입할 수 있기 때문에, 이를 약어 Eku_d12로 제공하였다.
서열 개요
참고 문헌
항목
1. n'개의 이중결합(들)을 갖는 탈포화 지방 아실-조효소 A(지방 아실-CoA)를 생산할 수 있는 효모 세포로서, 상기 이중결합(들) 중 적어도 하나는 12번 위치에 있되,
상기 효모 세포는 이종성 Δ12 지방 아실-CoA 탈포화효소를 발현시키고, 상기 탈포화효소는, 적어도 13개의 탄소 사슬 길이를 갖고 n개의 이중결합(들)을 갖는, 포화 또는 탈포화 지방 아실-CoA 기질, 바람직하게는 탈포화 지방 아실-CoA의 12번 위치에 이중결합을 도입할 수 있고,
n 및 n'는 정수이며,
0 ≤ n ≤ 3이고, 1 ≤ n' ≤ 4인, 효모 세포.
2. 항목 1에 있어서, 기질로서 사용되는 포화 또는 탈포화 지방 아실-CoA 및 n'개의 이중결합을 갖는 탈포화 지방 아실-CoA는 동일한 탄소 사슬 길이를 갖는, 효모 세포.
3. 선행하는 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 이종성 Δ12 탈포화효소는 카드라, 에페스티아, 플로디아, 마리아르파 및 아모르비아로 이루어진 군으로부터 선택된 속의 유기체에 대해 천연인, 효모 세포.
4. 선행하는 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 이종성 Δ12 탈포화효소는 카드라 카우텔라, 에페스티아 엘루텔라, 에페스티아 쿠에니엘라, 플로디아 인터푼텔라, 마리아르파 세파라텔라 및 아모르비아 쿠네아나로 이루어진 군으로부터 선택된 종의 유기체에 대해 천연인, 효모 세포.
5. 선행하는 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 이종성 Δ12 탈포화효소는 플로디아 탈포화효소, 예컨대, 플로디아 인터푼텔라 탈포화효소인, 효모 세포.
6. 선행하는 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 이종성 Δ12 탈포화효소는 카드라 탈포화효소, 예컨대, 카드라 카우텔라 탈포화효소인, 효모 세포.
7. 선행하는 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 이종성 Δ12 탈포화효소는 에페스티아 탈포화효소, 예컨대, 에페스티아 엘루텔라 탈포화효소 또는 에페스티아 쿠에니엘라 탈포화효소인, 효모 세포.
8. 선행하는 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 이종성 Δ12 탈포화효소는 서열번호 2에 제시된 바와 같은 Pid12 탈포화효소 또는 이와 적어도 70% 유사성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%, 예컨대, 100% 유사성 또는 동일성을 갖는 기능적 변이체인, 효모 세포.
9. 선행하는 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 이종성 Δ12 탈포화효소는 서열번호 55에 제시된 바와 같은 EcauDes12 탈포화효소 또는 이와 적어도 70% 유사성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%, 예컨대, 100% 유사성 또는 동일성을 갖는 기능적 변이체인, 효모 세포.
10. 선행하는 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 이종성 Δ12 탈포화효소는 서열번호 85에 제시된 바와 같은 Eku_d12 탈포화효소 또는 이와 적어도 70% 유사성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%, 예컨대, 100% 유사성 또는 동일성을 갖는 기능적 변이체인, 효모 세포.
11. 선행하는 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 이종성 Δ12 탈포화효소는 서열번호 87에 제시된 바와 같은 Ee_d12 탈포화효소 또는 이와 적어도 70% 유사성 또는 동일성, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%, 예컨대, 100% 유사성 또는 동일성을 갖는 기능적 변이체인, 효모 세포.
12. 선행하는 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 이종성 Δ12 탈포화효소는 서열번호 80, 서열번호 81 및 서열번호 82에 제시된 탈포화효소로부터 선택되는, 효모 세포.
13. 선행하는 항목 중 어느 하나에 있어서, 적어도 13개의 탄소 사슬 길이를 갖고 n개의 이중결합을 갖는 상기 포화 또는 탈포화 지방 아실-CoA는 적어도 14개, 예컨대, 적어도 15개의 탄소 길이를 갖는, 효모 세포.
14. 선행하는 항목 중 어느 하나에 있어서, 적어도 13개의 탄소 사슬 길이를 갖고 n개의 이중결합을 갖는 상기 포화 또는 탈포화 지방 아실-CoA는 테트라데칸오일-CoA 또는 (Z9)-테트라데센오일-CoA인, 효모 세포.
15. 선행하는 항목 중 어느 하나에 있어서, n = 1인, 효모 세포.
16. 선행하는 항목 중 어느 하나에 있어서, 적어도 13개의 탄소 사슬 길이를 갖고 n개의 이중결합을 갖는 상기 포화 또는 탈포화 지방 아실-CoA는 (Z9)-테트라데센오일-CoA인, 효모 세포.
17. 선행하는 항목 중 어느 하나에 있어서, n'개의 이중결합(들)을 갖는 상기 탈포화 지방 아실-CoA는 적어도 13, 예컨대, 적어도 14, 예컨대, 적어도 15, 예컨대, 적어도 16, 예컨대, 적어도 17, 예컨대, 적어도 18, 예컨대, 적어도 19, 예컨대, 적어도 20개의 탄소 사슬 길이를 갖는, 효모 세포.
18. 선행하는 항목 중 어느 하나에 있어서, n'개의 이중결합(들)을 갖는 상기 탈포화 지방 아실-CoA는 최대 18, 예컨대, 최대 17, 예컨대, 최대 16, 예컨대, 최대 15, 예컨대, 최대 14, 예컨대, 적어도 15, 예컨대, 적어도 16, 예컨대, 적어도 17, 예컨대, 적어도 18, 예컨대, 적어도 19, 예컨대, 적어도 20개의 탄소 사슬 길이를 갖는, 효모 세포.
19. 선행하는 항목 중 어느 하나에 있어서, n' = 1인, 효모 세포.
20. 선행하는 항목 중 어느 하나에 있어서, n'개의 이중결합(들)을 갖는 상기 탈포화 지방 아실-CoA는 (E12)-테트라데센오일-CoA인, 효모 세포.
21. 선행하는 항목 중 어느 하나에 있어서, n' = 2인, 효모 세포.
22. 선행하는 항목 중 어느 하나에 있어서, n'개의 이중결합(들)을 갖는 상기 탈포화 지방 아실-CoA는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔오일-CoA인, 효모 세포.
23. 선행하는 항목 중 어느 하나에 있어서 상기 효모 세포는 추가 이종성 탈포화효소를 발현시키는, 효모 세포.
24. 선행하는 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 추가 이종성 탈포화효소는 적어도 13개의 탄소 사슬 길이를 갖고 n개의 이중결합을 갖는 포화 또는 탈포화 지방 아실-CoA에서 12번 위치에 있지 않은 임의의 위치에 이중결합을 도입할 수 있는, 효모 세포.
25. 선행하는 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 추가 이종성 탈포화효소는 9번 위치에 이중결합을 도입할 수 있는, 효모 세포.
26. 선행하는 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 추가 이종성 탈포화효소는 Δ9 탈포화효소 및 Δ11 탈포화효소로 이루어진 군으로부터 선택되는, 효모 세포.
27. 선행하는 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 추가 이종성 탈포화효소는 헥사데칸오일-CoA 또는 헥사데칸오일-CoA에 대해서보다 각각 테트라데칸오일-CoA 또는 테트라데센오일-CoA에 대해서 더 높은 특이성을 갖는, 효모 세포.
28. 선행하는 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 추가 이종성 탈포화효소는 드로소필라 또는 코리스토네우라 탈포화효소, 예컨대, 드로소필라 멜라노가스터, 드로소필라 비릴리스, 드로소필라 그림샤위, 드로소필라 야쿠바, 드로소필라 모자벤시스, 드로소필라 슈도옵쿠라, 드로소필라 아나나사에 또는 코리스토네우라 파랄렐라 탈포화효소인, 효모 세포.
29. 선행하는 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 추가 이종성 탈포화효소는 Desat59(서열번호 8), Desat61(서열번호 4), Desat56(서열번호 57), Desat60(서열번호 59) 및 Desat24(서열번호 6)로 이루어진 군으로부터 선택된 드로소필라 탈포화효소 또는 이들과 적어도 70% 유사성 또는 동일성, 예컨대, 이들과 적어도 80%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%, 예컨대, 100% 유사성 또는 동일성을 갖는 이들의 기능적 변이체인, 효모 세포.
30. 선행하는 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 추가 이종성 탈포화효소는 코리스토네우라 파랄렐라 탈포화효소 Desat74(서열번호 61)인, 효모 세포.
31. 선행하는 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 효모 세포는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올을 생산할 수 있되, 상기 효모 세포는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔오일-CoA의 적어도 일부를 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올로 전환시킬 수 있는 적어도 1종의 알코올-형성 지방 아실-CoA 환원효소(FAR)를 더 발현시키는, 효모 세포.
32. 선행하는 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 FAR은 아그로티스, 아미엘로이스, 바이사이클러스, 봄버스, 칠로, 시디아, 헬리코베르파, 헬리오티스, 로베시아, 오스트리니아, 플로디아, 플루텔라, 스포돕테라, 트리코플루시아, 티타 및 이포노메우타, 예컨대, 아그로티스 입실론, 아그로티스 세게툼, 아미엘로이스 트란시텔라, 바이사이클러스 아니나나, 봄버스 라피다리우스, 칠로 서프레살리스, 시디아 포모넬라, 헬리코베르파 아르미게라, 헬리코베르파 아설타, 헬리오티스 서브플렉사, 헬리오티스 비레센스, 로베시아 보트라나, 오스트리니아 푸르나칼리스, 오스트리니아 누빌라리스, 오스트리니아 자그, 오스트리니아 제아, 플로디아 인터푼텔라, 플루텔라 자일로스텔라, 스포돕테라 엑시구아, 스포돕테라 프루기페르다, 스포돕테라 리토랄리스, 스포돕테라 리투라, 트리코플루시아 니, 티타 알바 및 이포노메우타 로렐루스, 특히 스포돕테라 엑시구아, 헬리코베르파 아르미게라, 스포돕테라 리투라 및 플로디아 인터푼텔라로 이루어진 군으로부터 선택된 속의 유기체에 대해 천연인, 효모 세포.
33. 선행하는 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 FAR은 FAR1(서열번호 20), FAR16(서열번호 22), FAR17(서열번호 24), FAR19(서열번호 26), FAR28(서열번호 28) 또는 FAR32(서열번호 30), FAR44(서열번호 63), FAR48(서열번호 65), FAR49(서열번호 67); FAR38(서열번호 32), FAR4(서열번호 69), FAR6(서열번호 71), FAR8(서열번호 73), FAR12(서열번호 75), FAR11(서열번호 77) 또는 FAR5(서열번호 79) 또는 이들과 적어도 70% 유사성 또는 동일성, 예컨대, 이와 적어도 80%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%, 예컨대, 100% 유사성 또는 동일성을 갖는 이들의 기능적 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 효모 세포.
34. 선행하는 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 효모 세포는 사카로마이세스, 피키아, 야로위아, 클루이베로미세스, 칸디다, 로도토룰라, 로도스포리디움, 크립토코커스, 트리코스포론 및 리포마이세스로부터 선택되는 속에 속하되, 선택적으로 효모 세포는 사카로마이세스 세레비시애, 사카로마이세스 보울라디, 피키아 파스토리스, 클루이베로미세스 막시아누스, 칸디다 트로피칼리스, 크립토코커스 알비두스, 리포마이세스 리포페라, 리포마이세스 스타키, 로도스포리디움 토룰로이데스, 로도토룰라 글루티니스, 트리코스포론 풀루란 및 야로위아 리폴리티카로부터 선택된 종에 속하며, 바람직하게는 효모 세포는 야로위아 리폴리티카 세포 또는 사카로마이세스 세레비시애 세포인, 효모 세포.
35. 선행하는 항목 중 어느 하나에 있어서, 이종성 NAD(P)H 사이토크롬 b5 옥시도환원효소(Ncb5or)를 더 발현시키는, 효모 세포.
36. 선행하는 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 Ncb5or은 식물, 곤충 또는 포유류, 예컨대, 호모 사피엔스에 대해 천연인, 효모 세포.
37. 선행하는 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 Ncb5or은 아그로티스, 아미엘로이스, 아판토푸스, 아크티아, 바이사이클러스, 봄빅스, 봄버스, 칠로, 시디아, 다나우스, 드로소필라, 유메타, 갤러리아, 헬리코베르파, 헬리오티스, 하이포스모코마, 렙티데아, 로베시아, 맨듀카, 오페로프테라, 오스트리니아, 파필리오, 파필리오, 파필리오, 피에리스, 플루텔라, 스포돕테라, 트리코플루시아 및 바네사 속의 곤충과 같은 곤충에 대해 천연인, 효모 세포.
38. 선행하는 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 Ncb5or은 아그로티스 세게툼, 아미엘로이스 트란시텔라, 아판토푸스 하이퍼란투스, 아크티아 플란타기니스, 바이사이클러스 아니나나, 봄버스 테레스트리스, 봄빅스 만다리나, 봄빅스 모리, 칠로 수프레살리스, 시디아 포모넬라, 다나우스 플렉시푸스, 드로소필라 그림샤위, 드로소필라 멜라노가스터, 유메타 자포니카, 갤러리아 멜로넬라, 헬리코베르파 아르미게라, 헬리오티스 비레센스, 하이포스모코마 카하마노아, 렙티데아 시나피스, 로베시아 보트라나, 맨듀카 섹스타, 오페로프테라 브루마타, 오스트리니아 푸르나칼리스, 파필리오 마카온, 파필리오 폴리테스, 파필리오 크수토스, 피에리스 라파에, 플루텔라 자일로스텔라, 스포돕테라 프루기페르다, 스포돕테라 리투라, 트리코플루시아 니 및 바네사 타메아메아로부터 선택된 곤충에 대해 천연인, 효모 세포.
39. 선행하는 항목 중 어느 하나에 있어서, Ncb5or은 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41, 서열번호 88, 서열번호 89 또는 서열번호 90에 제시된 Ncb5or 또는 이들과 적어도 70% 동일성 또는 유사성, 예컨대, 적어도 75% 동일성, 예컨대, 적어도 80% 동일성, 예컨대, 적어도 85% 동일성, 예컨대, 적어도 90% 동일성, 예컨대, 이와 적어도 95% 동일성 또는 유사성을 갖는 기능적 변이체의 군으로부터 선택되는, 효모.
40. 선행하는 항목 중 어느 하나에 있어서, Hfd1, Hfd4, Pex10, GPAT 및/또는 Fao1 중 하나 이상의 활성의 부분적 또는 전체적 상실을 야기하는 돌연변이를 갖고, 예컨대, 적어도, Fao1 및 Hfd1, Hfd4, Pex10 및/또는 GPAT 중 하나 이상의 활성의 부분적 또는 전체적 상실을 야기하는 돌연변이를 갖는, 효모 세포.
41. 선행하는 항목 중 어느 하나에 있어서, PEX10 및 HFD1, HFD4, FAO1 및/또는 GPAT 중 적어도 하나 또는 이들의 상동체의 돌연변이를 갖는, 효모 세포.
42. 선행하는 항목 중 어느 하나에 있어서, FAO1 및 HFD1, HFD4, PEX10 및/또는 GPAT 중 적어도 하나 또는 이들의 상동체의 돌연변이를 갖는, 효모 세포.
43. 선행하는 항목 중 어느 하나에 있어서, HFD1, HFD4, PEX10 및/또는 FAO1 또는 이들과 적어도 60% 동일성을 갖는 이들의 기능적 변이체는 결실 또는 돌연변이되어, Hfd1, Hfd4, Pex10 및/또는 Fao1의 활성의 부분적 상실 또는 전체적 상실을 초래하고, 그리고/또는 GPAT 또는 이와 적어도 60% 동일성을 갖는 이들의 기능적 변이체가 돌연변이되어, GPAT의 감소된 활성을 초래하는, 효모 세포.
44. 선행하는 항목 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 POX 유전자, 예컨대, POX1, POX2, POX3, POX4, POX5 및 POX6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 POX 유전자의 돌연변이를 포함하는, 효모 세포.
45. 선행하는 항목 중 어느 하나에 있어서, POX1, POX2, POX3, POX4, POX5 및/또는 POX6 또는 이들과 적어도 60% 동일성을 갖는 이들의 기능적 변이체는 결실 또는 돌연변이되어, Pox1, Pox2, Pox3, Pox4, Pox5 및/또는 Pox6의 활성의 부분적 상실 또는 전체적 상실을 초래하는, 효모 세포.
46. 선행하는 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 효모 세포는,
- 이종성 사이토크롬 b5;
- 이종성 사이토크롬 b5 환원효소;
- 헤모글로빈;
- 이종성 티오에스터라제 유전자; 및/또는
- 지방 아실 합성효소 및 티오에스터라제의 융합 단백질
을 더 발현시키는, 효모 세포.
47. 선행하는 항목 중 어느 하나에 있어서,
- 활성의 전체적 또는 부분적 상실을 초래하는 천연 신장효소(들);
- 활성의 전체적 또는 부분적 상실을 초래하는 티오에스터라제(들); 및/또는
- 천연 지방 알데하이드 탈수소효소(들), 지방 알코올 옥시다제(들), 퍼옥시좀 생물발생 인자 및/또는 지방 아실 합성효소(들)의 활성
의 비활성화 또는 변형을 갖는, 효모 세포.
48. 선행하는 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 효모 세포는 테트라데칸오일-CoA의 이용 가능성을 증가시키도록 더 변형된, 효모 세포.
49. 선행하는 항목 중 어느 하나에 있어서, 이종성 Δ12 탈포화효소, 추가 이종성 탈포화효소 또는 FAR을 암호화하는 유전자 중 적어도 하나는 높은 복제수로 존재하는, 효모 세포.
50. 선행하는 항목 중 어느 하나에 있어서, 이종성 Δ12 탈포화효소, 추가 이종성 탈포화효소 또는 FAR을 암호화하는 유전자 중 적어도 하나는 유도성 프로모터의 제어 하에 있는, 효모 세포.
51. 선행하는 항목 중 어느 하나에 있어서, 이종성 Δ12 탈포화효소, 추가 이종성 탈포화효소 또는 FAR을 암호화하는 유전자 중 적어도 하나는 각각 독립적으로 세포의 게놈 내에 또는 효모 세포 내에 포함된 벡터 내에 각각 독립적으로 포함되는, 효모 세포.
52. 선행하는 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 효모 세포는 적어도 1㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 1.5㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 1.7㎎/ℓ 이상의 역가를 갖는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔산을 생산할 수 있는, 효모 세포.
53. 선행하는 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 효모 세포는 적어도 20㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 50㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 60㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 70㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 80㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 90㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 100㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 150㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 200㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 250㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 500㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 750㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 1g/ℓ, 예컨대, 적어도 2g/ℓ, 예컨대, 적어도 3g/ℓ, 예컨대, 적어도 4g/ℓ, 예컨대, 적어도 5g/ℓ, 예컨대, 적어도 6g/ℓ, 예컨대, 적어도 7g/ℓ, 예컨대, 적어도 8g/ℓ, 예컨대, 적어도 9g/ℓ, 예컨대, 적어도 10g/ℓ 이상의 역가를 갖는 E12-지방산 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔산을 생산할 수 있는, 효모 세포.
54. 선행하는 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 효모 세포는 적어도 0.005㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.01㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.02㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.03㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.05㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.06㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.075㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.1㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.2㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.3㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.4㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.5㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.6㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.7㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.8㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.9㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 1㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 2㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 3㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 4㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 5㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 6㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 7㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 8㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 9㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 10㎎/ℓ 이상의 역가를 갖는 E12-지방 알코올 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올을 생산할 수 있는, 효모 세포.
55. n'개의 이중결합(들)을 갖는 탈포화 지방 아실-CoA를 생산하는 방법으로서, 상기 이중결합(들) 중 적어도 하나는 효모 세포의 12번 위치에 있고, 상기 방법은,
i) 항목 1 내지 54 중 어느 하나에 따른 효모 세포를 제공하는 단계,
ii) 이종성 Δ12 탈포화효소를 발현시키는 조건 하에서 배지에서 상기 효모 세포를 인큐베이션시키는 단계로서, 상기 탈포화효소는 적어도 13개의 탄소 사슬 길이를 갖고 n개의 이중결합을 갖는 포화 또는 탈포화 지방 아실-CoA, 바람직하게는 탈포화 지방-아실-CoA의 12번 위치에 이중결합을 도입할 수 있는, 상기 인큐베이션시키는 단계
를 포함함으로써, n'개의 이중결합(들)을 갖는 탈포화 지방 아실-CoA를 생산하되, 상기 이중결합(들) 중 적어도 하나는 12번 위치에 있고,
n 및 n'는 정수이며,
0 ≤ n ≤ 3이고, 1 ≤ n' ≤ 4인, 방법.
56. 항목 55에 있어서, 상기 이종성 Δ12 탈포화효소는 선행하는 항목 중 어느 하나에 규정된 바와 같은, 방법.
57. 항목 55 또는 56에 있어서, 상기 추가 이종성 탈포화효소는 선행하는 항목 중 어느 하나에 규정된 바와 같은, 방법.
58. 항목 55 내지 57 중 어느 하나에 있어서, n'개의 이중결합(들)을 갖는 상기 탈포화 지방 아실-CoA는 선행하는 항목 중 어느 하나에 규정된 바와 같은, 방법.
59. 항목 55 내지 58 중 어느 하나에 있어서, 적어도 13개의 탄소 사슬 길이를 갖고 n개의 이중결합을 갖는 상기 포화 또는 탈포화 지방 아실-CoA는 선행하는 항목 중 어느 하나에 규정된 바와 같은, 방법.
60. 항목 55 내지 59 중 어느 하나에 있어서, 상기 효모 세포는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔오일-CoA의 적어도 일부를 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올로 전환시킬 수 있는 적어도 1종의 알코올-형성 지방 아실-CoA 환원효소(FAR)를 더 발현시키는, 방법.
61. 항목 55 내지 60 중 어느 하나에 있어서, 상기 FAR은 선행하는 항목 중 어느 하나에 규정된 바와 같은, 방법.
62. 항목 55 내지 61 중 어느 하나에 있어서, 페로몬 조성물에서 E12-지방 알코올 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올을 제형화하는 단계를 더 포함하는, 방법.
63. 항목 55 내지 62 중 어느 하나에 있어서, E12-지방 알코올 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올을 회수하는 단계를 더 포함하는, 방법.
64. 항목 55 내지 63 중 어느 하나에 있어서, E12-지방 알코올 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올은 각각 E12-지방 알코올 아세테이트 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 아세테이트로 추가로 전환되는, 방법.
65. 항목 55 내지 64 중 어느 하나에 있어서, E12-지방 알코올 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올은 각각 E12-지방 알데하이드 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔알로 추가로 전환되는, 방법.
66. 항목 55 내지 65 중 어느 하나에 있어서, E12-지방 알코올 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올의 E12-지방 알코올 아세테이트 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 아세테이트로의 전환은
a. 효모 세포에서 E12-지방 알코올 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올을 각각 E12-지방 알코올 아세테이트 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 아세테이트로 전환시킬 수 있는 아세틸트랜스퍼라제를 더 발현시킴으로써 생체내에서 수행되거나; 또는
b. 시험관내에서, 예를 들어, 화학적 전환에 의해 수행되는, 방법.
67. 항목 55 내지 66 중 어느 한 항에 있어서, 상기 E12-지방 알코올 및/또는 상기 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올은 (E12)-지방 알데하이드 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔알로 산화되되, 선택적으로 산화는 화학적으로 수행되는, 방법.
68. 항목 55 내지 66 중 어느 하나에 있어서, 상기 E12-지방 알코올 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올은 E12-지방 알코올 아세테이트 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 아세테이트로 화학적으로 아세틸화된, 방법.
69. 효모 세포를 변형시키기 위한 핵산 또는 핵산의 시스템으로서, 상기 핵산 또는 핵산의 시스템은 이종성 Δ12 탈포화효소를 암호화하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 탈포화효소는 적어도 13개의 탄소 사슬 길이를 갖고 n개의 이중결합을 갖는 포화 또는 탈포화 지방 아실-CoA에서 12번 위치에 이중결합을 도입하여 n'개의 이중결합(들)을 갖는 탈포화 지방 아실-CoA를 생산할 수 있되, 상기 이중결합(들) 중 적어도 하나는 12번 위치에 있고,
n 및 n'는 정수이며,
0 ≤ n ≤ 3이고, 1 ≤ n' ≤ 4인, 핵산 또는 핵산의 시스템.
70. 항목 69에 있어서, 상기 이종성 Δ12 탈포화효소는 서열번호 1, 서열번호 54, 서열번호 84 및 서열번호 86에 제시된 서열 중 어느 하나, 또는 이들과 적어도 80% 동일성, 예컨대, 이와 적어도 85% 동일성, 예컨대, 적어도 90% 동일성, 예컨대, 적어도 91% 동일성, 예컨대, 적어도 92% 동일성, 예컨대, 적어도 93% 동일성, 예컨대, 적어도 94% 동일성, 예컨대, 적어도 95% 동일성, 예컨대, 적어도 96% 동일성, 예컨대, 적어도 97% 동일성, 예컨대, 적어도 98% 동일성, 예컨대, 적어도 99% 동일성을 갖는 이들의 기능적 변이체에 의해 암호화된, 핵산 또는 핵산의 시스템.
71. 항목 69 내지 70 중 어느 하나에 있어서, 상기 핵산 또는 핵산의 시스템은 적어도 13개의 탄소 사슬 길이를 갖고 n개의 이중결합을 갖는 포화 또는 탈포화 지방 아실-CoA에서 12번 위치가 아닌 임의의 위치에 이중결합을 도입할 수 있는 추가 이종성 탈포화효소를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 더 포함하는, 핵산 또는 핵산의 시스템.
72. 항목 67 내지 71 중 어느 하나에 있어서, 상기 추가 이종성 탈포화효소는 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 56, 서열번호 58 및 서열번호 60에 제시된 서열 중 어느 하나, 또는 이들과 적어도 80% 동일성, 예컨대, 이와 적어도 85% 동일성, 예컨대, 적어도 90% 동일성, 예컨대, 적어도 91% 동일성, 예컨대, 적어도 92% 동일성, 예컨대, 적어도 93% 동일성, 예컨대, 적어도 94% 동일성, 예컨대, 적어도 95% 동일성, 예컨대, 적어도 96% 동일성, 예컨대, 적어도 97% 동일성, 예컨대, 적어도 98% 동일성, 예컨대, 적어도 99% 동일성을 갖는 이들의 기능적 변이체에 의해 암호화된, 핵산 또는 핵산의 시스템.
73. 항목 67 내지 72 중 어느 하나에 있어서, 핵산 또는 핵산의 시스템은 이중 탈포화 (Z9, E12)-테트라데카다이엔오일-CoA의 적어도 일부를 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올로 전환시킬 수 있는 지방 아실-CoA 환원효소(FAR)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 더 포함하는, 핵산 또는 핵산의 시스템.
74. 항목 73에 있어서, 상기 FAR은 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 27,서열번호 29, 서열번호 62, 서열번호 64, 서열번호 66, 서열번호 68, 서열번호 70, 서열번호 72, 서열번호 74, 서열번호 76 및 서열번호 78에 제시된 서열 중 어느 하나, 또는 이들과 적어도 80% 동일성, 예컨대, 이들과 적어도 85% 동일성, 예컨대, 적어도 90% 동일성, 예컨대, 적어도 91% 동일성, 예컨대, 적어도 92% 동일성, 예컨대, 적어도 93% 동일성, 예컨대, 적어도 94% 동일성, 예컨대, 적어도 95% 동일성, 예컨대, 적어도 96% 동일성, 예컨대, 적어도 97% 동일성, 예컨대, 적어도 98% 동일성, 예컨대, 적어도 99% 동일성을 갖는 이들의 기능적 변이체에 의해 암호화된, 핵산 또는 핵산의 시스템.
75. 해충의 존재를 모니터링하거나 또는 해충의 교미를 교란시키는 방법으로서,
i) 항목 55 내지 63 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 및/또는 E12-지방 알코올을 생산하는 단계;
ii) E12-지방 알코올 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올을 각각 E12-지방 알코올 아세테이트 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 아세테이트로 전환시키는 단계;
iii) E12-지방 알코올 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올을 각각 E12-지방 알데하이드 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔알로 전환시키는 단계;
iv) 상기 E12-지방 알코올, (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올, E12-지방 알코올 아세테이트, (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 아세테이트, E12-지방 알데하이드 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔알을 페로몬 조성물로서 제형화하는 단계; 및
v) 상기 페로몬 조성물을 병충해 집중 관리 조성물로서 사용하는 단계
를 포함하는, 방법.
76. 페로몬 조성물로서,
i) 항목 55 내지 63 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 및/또는 (E12)-지방 알코올을 생산하는 단계;
ii) (E12)-지방 알코올 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올을 각각 (E12)-지방 알코올 아세테이트 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 아세테이트로 전환시키는 단계;
iii) (E12)-지방 알코올 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올을 각각 (E12)-지방 알데하이드 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔알로 전환시키는 단계;
iv) 상기 (E12)-지방 알코올, (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올, E12-지방 알코올 아세테이트, (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 아세테이트, (E12)-지방 알데하이드 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔알을 페로몬 조성물로서 제형화하는 단계
를 포함하는 방법에 의해 얻을 수 있는, 페로몬 조성물.
77. 페로몬 조성물로서, E12-지방 알코올, (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올, E12-지방 알코올 아세테이트, (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 아세테이트, E12-지방 알데하이드 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔알을 포함하되, 상기 페로몬 조성물은 적어도 20% 바이오기반 탄소를 포함하는, 페로몬 조성물.
78. 페로몬 화합물로서, E12-지방 알코올, (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올, E12-지방 알코올 아세테이트, (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 아세테이트, E12-지방 알데하이드 및 (Z9, E12)-테트라데카다이엔알로 이루어진 군으로부터 선택되되, 상기 페로몬 화합물은 적어도 20% 바이오기반 탄소를 포함하는, 페로몬 화합물.
79. 제77항에 있어서, 액체 담체, 고체 담체 및 기질로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 추가 화합물을 더 포함하는, 페로몬 조성물.
80. 항목 77 또는 79에 있어서, 식물성 오일, 정제된 광유 또는 이들의 단편, 고무, 플라스틱, 실리카, 규조토, 왁스 매트릭스 및 셀룰로스 분말로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 화합물을 더 포함하는, 페로몬 조성물.
81. 항목 77 또는 79 및 80 중 어느 하나에 있어서, 상기 페로몬 조성물은 용액, 겔 또는 분말의 형태인, 페로몬 조성물.
82. 항목 77 또는 79 내지 81 중 어느 하나에 있어서, 상기 페로몬 조성물은 이것이 제공될 수 있도록 제형화되는, 페로몬 조성물.
83. 항목 77 또는 79 내지 82 중 어느 하나에 있어서, 페로몬 조성물에서 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 대 E12-지방 알코올, (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 아세테이트 대 E12-지방 알코올 아세테이트 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔알 대 E12-지방 알데하이드의 비는 적어도 0.1, 예컨대, 적어도 0.15, 예컨대, 적어도 0.2, 예컨대, 적어도 0.3, 예컨대, 적어도 0.4, 예컨대, 적어도 0.5, 예컨대, 적어도 0.75, 예컨대, 적어도 1, 예컨대, 적어도 2, 예컨대, 적어도 3, 예컨대, 적어도 4, 예컨대, 적어도 5, 예컨대, 적어도 6, 예컨대, 적어도 7, 예컨대, 적어도 8, 예컨대, 적어도 9, 예컨대, 적어도 10, 예컨대, 적어도 12.5, 예컨대, 적어도 15 이상인, 페로몬 조성물.
84. 항목 77 또는 79 내지 83 중 어느 하나에 있어서, 페로몬 조성물에서 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 대 (Z9, E12)-테트라데카다이엔알 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 대 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 아세테이트의 비는 적어도 0.1, 예컨대, 적어도 0.15, 예컨대, 적어도 0.2, 예컨대, 적어도 0.3, 예컨대, 적어도 0.4, 예컨대, 적어도 0.5, 예컨대, 적어도 0.75, 예컨대, 적어도 1, 예컨대, 적어도 2, 예컨대, 적어도 3, 예컨대, 적어도 4, 예컨대, 적어도 5, 예컨대, 적어도 6, 예컨대, 적어도 7, 예컨대, 적어도 8, 예컨대, 적어도 9, 예컨대, 적어도 10, 예컨대, 적어도 12.5, 예컨대, 적어도 15 이상인, 페로몬 조성물.
85. 항목 77 또는 79 내지 84 중 어느 하나에 있어서, 페로몬 조성물에서 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 대 Z9-지방 알코올, (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 아세테이트 대 Z9-지방 알코올 아세테이트 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔알 대 Z9-지방 알데하이드의 비는 적어도 0.1, 예컨대, 적어도 0.15, 예컨대, 적어도 0.2, 예컨대, 적어도 0.3, 예컨대, 적어도 0.4, 예컨대, 적어도 0.5, 예컨대, 적어도 0.75, 예컨대, 적어도 1, 예컨대, 적어도 2, 예컨대, 적어도 3, 예컨대, 적어도 4, 예컨대, 적어도 5, 예컨대, 적어도 6, 예컨대, 적어도 7, 예컨대, 적어도 8, 예컨대, 적어도 9, 예컨대, 적어도 10, 예컨대, 적어도 12.5, 예컨대, 적어도 15 이상인, 페로몬 조성물.
86. 항목 77 내지 85 중 어느 하나에 있어서, 상기 페로몬 조성물 또는 상기 페로몬 화합물은 적어도 30% 바이오기반 탄소, 대안적으로 40% 바이오기반 탄소, 대안적으로 50% 바이오기반 탄소, 대안적으로 60% 바이오기반 탄소, 대안적으로 70% 바이오기반 탄소, 대안적으로 75% 바이오기반 탄소, 대안적으로 80% 바이오기반 탄소, 대안적으로 85% 바이오기반 탄소, 대안적으로 90% 바이오기반 탄소, 대안적으로 95% 바이오기반 탄소를 포함하는, 페로몬 조성물 또는 페로몬 화합물.
87. 항목 77 내지 86 중 어느 하나에 있어서, 상기 페로몬 조성물 또는 상기 페로몬 화합물은 적어도 80% 바이오기반 탄소, 대안적으로 85% 바이오기반 탄소, 대안적으로 90% 바이오기반 탄소, 대안적으로 95% 바이오기반 탄소, 대안적으로 96% 바이오기반 탄소, 대안적으로 97% 바이오기반 탄소, 대안적으로 98% 바이오기반 탄소, 대안적으로 99% 바이오기반 탄소를 포함하는, 페로몬 조성물 또는 페로몬 화합물.
88. 항목 77 내지 87 중 어느 하나에 있어서, 상기 페로몬 조성물 또는 상기 페로몬 화합물은 30 내지 100% 바이오기반 탄소, 대안적으로 40 내지 100% 바이오기반 탄소, 대안적으로 50 내지 100% 바이오기반 탄소, 대안적으로 60 내지 100% 바이오기반 탄소, 대안적으로 70 내지 100% 바이오기반 탄소, 대안적으로 75 내지 100% 바이오기반 탄소, 대안적으로 80 내지 100% 바이오기반 탄소, 대안적으로 85 내지 100% 바이오기반 탄소, 대안적으로 90 내지 100% 바이오기반 탄소, 대안적으로 95 내지 100% 바이오기반 탄소를 포함하는, 페로몬 조성물 또는 페로몬 화합물.
89. 항목 77 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 상기 페로몬 조성물 또는 상기 페로몬 화합물은 80 내지 100% 바이오기반 탄소, 대안적으로 85 내지 100% 바이오기반 탄소, 대안적으로 90 내지 100% 바이오기반 탄소, 대안적으로 95 내지 100% 바이오기반 탄소, 대안적으로 96 내지 100% 바이오기반 탄소, 대안적으로 97 내지 100% 바이오기반 탄소, 대안적으로 98 내지 100% 바이오기반 탄소, 대안적으로 99 내지 100% 바이오기반 탄소를 포함하는, 페로몬 조성물 또는 페로몬 화합물.
90. 항목 77 또는 79 내지 89 중 어느 하나에 따른 페로몬 조성물의 생산 방법으로서,
i) 항목 55 내지 63 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 및/또는 (E12)-지방 알코올을 생산하는 단계;
ii) (E12)-지방 알코올 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올을 각각 (E12)-지방 알코올 아세테이트 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 아세테이트로 전환시키는 단계;
iii) (E12)-지방 알코올 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올을 각각 (E12)-지방 알데하이드 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔알로 전환시키는 단계;
iv) 상기 (E12)-지방 알코올, (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올, E12-지방 알코올 아세테이트, (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 아세테이트, (E12)-지방 알데하이드 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔알을, 선택적으로 액체 또는 고체 담체 또는 기질과 같은 1종 이상의 추가 화합물을 포함하는 페로몬 조성물로서 제형화하는 단계;
v) 선택적으로 페로몬 조성물의 바이오기반 탄소 함량을 결정하는 단계
를 포함하는, 방법.
91. 항목 78 내지 89 중 어느 하나에 따른 페로몬 화합물의 생산 방법으로서, 효모 세포에서, 상기 방법은,
i) 이종성 Δ12 지방 아실-CoA 탈포화효소를 발현시키는 효모 세포를 제공하는 단계,
ii) 이종성 Δ12 지방 아실-CoA 탈포화효소의 발현을 가능하게 하는 조건 하의 배지에서 상기 효모 세포를 인큐베이션시키는 단계
를 포함함으로써, 상기 페로몬 화합물을 생산하는, 방법.
92. 항목 78 내지 89 중 어느 하나에 있어서, 상기 효모 세포는 이종성 Δ12 지방 아실-CoA 탈포화효소를 발현시키는, 효모 세포.
93. 항목 91 또는 92에 있어서, 상기 효모 세포는 추가 이종성 탈포화효소를 발현시키는, 방법 또는 효모 세포.
94. 항목 91 내지 93 중 어느 하나에 있어서, 상기 효모 세포는 적어도 1종의 알코올-형성 지방 아실-CoA 환원효소(FAR)를 더 발현시키는, 방법 또는 효모 세포.
95. 항목 91 내지 94 중 어느 하나에 있어서, 페로몬 화합물의 바이오기반 탄소 함량을 결정하는 단계를 더 포함하는, 방법.
96. 포화 또는 탈포화 지방 아실-CoA에서 12번 위치에 이중결합을 도입하는 방법에서의, 플로디아 인터푼텔라 탈포화효소의 용도.
97. 항목 96에 있어서, 탈포화 지방 아실-CoA는 12개 이상, 예컨대, 13, 예컨대, 14, 예컨대, 15개 이상의 탄소 길이를 갖고/갖거나 포화된 지방산 메틸 에스터는 12개 이상, 예컨대, 13, 예컨대, 14, 예컨대, 15개 이상의 탄소 길이를 갖는, 용도.
98. 항목 96 또는 97에 있어서, 플로디아 인터푼텔라 탈포화효소는 Pid12(서열번호 2)이거나, 또는 이와 적어도 70% 유사성 또는 동일성, 예컨대, 이와 적어도 80%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%, 예컨대, 100% 유사성 또는 동일성을 갖는 기능적 변이체인, 용도.
99. 포화 또는 탈포화 지방 아실-CoA에서 12번 위치에 이중결합을 도입하는 방법에서의, 카드라 카우텔라 탈포화효소의 용도.
100. 항목 99에 있어서, 탈포화 지방 아실-CoA는 12개 이상, 예컨대, 13, 예컨대, 14, 예컨대, 15개 이상의 탄소 길이를 갖고/갖거나 포화된 지방산 메틸 에스터는 12개 이상, 예컨대, 13, 예컨대, 14, 예컨대, 15개 이상의 탄소 길이를 갖는, 용도.
101. 항목 99 내지 100 중 어느 하나에 있어서, 카드라 카우텔라 탈포화효소는 EcauDes12(서열번호 55)이거나, 또는 이와 적어도 70% 유사성 또는 동일성, 예컨대, 이와 적어도 80%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%, 예컨대, 100% 유사성 또는 동일성을 갖는 기능적 변이체인, 용도.
102. 포화 또는 탈포화 지방 아실-CoA에서 12번 위치에 이중결합을 도입하는 방법에서의, 에페스티아 쿠에니엘라 탈포화효소의 용도.
103. 항목 102에 있어서, 탈포화 지방 아실-CoA는 12개 이상, 예컨대, 13, 예컨대, 14, 예컨대, 15개 이상의 탄소 길이를 갖고/갖거나 포화된 지방산 메틸 에스터는 12개 이상, 예컨대, 13, 예컨대, 14, 예컨대, 15개 이상의 탄소 길이를 갖는, 용도.
104. 항목 102 또는 103에 있어서, 에페스티아 쿠에니엘라 탈포화효소는 Eku_d12(서열번호 85)이거나, 또는 이와 적어도 70% 유사성 또는 동일성, 예컨대, 이와 적어도 80%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%, 예컨대, 100% 유사성 또는 동일성을 갖는 기능적 변이체인, 용도.
105. 포화 또는 탈포화 지방 아실-CoA에서 12번 위치에 이중결합을 도입하는 방법에서의, 에페스티아 엘루텔라 탈포화효소의 용도.
106. 항목 105에 있어서, 탈포화 지방 아실-CoA는 12개 이상, 예컨대, 13, 예컨대, 14, 예컨대, 15개 이상의 탄소 길이를 갖고/갖거나 포화된 지방산 메틸 에스터는 12개 이상, 예컨대, 13, 예컨대, 14, 예컨대, 15개 이상의 탄소 길이를 갖는, 용도.
107. 항목 105 또는 106에 있어서, 에페스티아 엘루텔라 탈포화효소는 Ee_d12(서열번호 87)이거나, 또는 이와 적어도 70% 유사성 또는 동일성, 예컨대, 이와 적어도 80%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%, 예컨대, 100% 유사성 또는 동일성을 갖는 기능적 변이체인, 용도.
108. 항목 96 내지 101 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 시험관내에서 수행되는, 용도.
109. 항목 96 내지 108 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 생체내에서 수행되되, 바람직하게는상기 방법은 항목 1 내지 54 중 어느 하나에 따른 효모 세포에서 수행되는, 용도.
110. 항목 55 내지 64 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 얻을 수 있는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔오일-CoA.
111. 항목 60 내지 64 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 얻을 수 있는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올.
112. 항목 1 내지 54 중 어느 하나에 따른 효모 세포를 포함하는 발효 브로스.
113. (Z9, E12)-테트라데카다이엔오일-CoA를 생산할 수 있는 효모 세포로서, 상기 효모 세포는
i) 테트라데칸오일-CoA에서 9번 위치에 제1 이중결합을 도입하여, 상기 테트라데칸오일-CoA를 (Z9)-테트라데센오일-CoA로 전환시킬 수 있는, 적어도 1종의 제1 이종성 탈포화효소; 및
ii) (Z9)-테트라데센오일-CoA에서 12번 위치에 제2 이중결합을 도입하여, (Z9)-테트라데센오일-CoA를 (Z9, E12)-테트라데카다이엔오일-CoA로 전환시킬 수 있는, 적어도 1종의 제2 이종성 탈포화효소
를 발현시키는, 효모 세포.
114. 탈포화 지방 아실-CoA를 생산할 수 있는 효모 세포로서, 상기 효모 세포는 지방 아실-CoA에서 12번 위치에 트랜스이중결합을 도입하여, 지방 아실-CoA를 E12-지방 아실-CoA로 전환시킬 수 있는 Pid12(서열번호 2) 탈포화효소, EcauDes12(서열번호 55) 탈포화효소, Eku_d12(서열번호 85) 또는 Ee_d12(서열번호 87) 탈포화효소를 발현시키는, 효모 세포.
115. (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올을 생산하는 방법으로서, 상기 방법은
i) 항목 1 내지 54 중 어느 하나에 따른 효모 세포를 제공하는 단계,
ii) a. 추가 탈포화효소로서, 테트라데칸오일-CoA에서 9번 위치에 이중결합을 도입하여, 테트라데칸오일-CoA의 적어도 일부를 (Z9)-테트라데센오일-CoA로 전환시킬 수 있는, 상기 탈포화효소;
b. 이종성 Δ12 탈포화효소로서, (Z9)-테트라데센오일-CoA에서 12번 위치에 이중결합을 도입하여, (Z9)-테트라데센오일-CoA의 적어도 일부를 (Z9, E12)-테트라데카다이엔오일-CoA로 전환시킬 수 있는, 상기 탈포화효소;
c. FAR로서, (Z9, E12)-테트라데카다이엔오일-CoA의 적어도 일부를 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올로 전환시킬 수 있는, 상기 FAR
의 발현을 가능하게 하는 조건 하에 배지에서 상기 효모 세포를 인큐베이션시키는 단계;
iii) 선택적으로, (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올을 회수하는 단계;
iv) 선택적으로, (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올을 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 아세테이트로 전환시키는 단계;
v) 선택적으로, (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올을 (Z9, E12)-테트라데카다이엔알로 전환시키는 단계;
vi) 선택적으로, (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올, (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 아세테이트 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔알을 페로몬 조성물로 제형화하는 단계
를 포함하는, 방법.
Claims (19)
- n'개의 이중결합(들)을 갖는 탈포화 지방 아실-조효소 A(지방 아실-CoA)를 생산할 수 있는 효모 세포로서, 상기 이중결합(들) 중 적어도 하나는 12번 위치에 있되,
상기 효모 세포는 이종성 Δ12 지방 아실-CoA 탈포화효소(desaturase)를 발현시키고, 상기 탈포화효소는, 적어도 13개의 탄소 사슬 길이를 갖고 n개의 이중결합(들)을 갖는, 포화 또는 탈포화 지방 아실-CoA, 바람직하게는 탈포화 지방 아실-CoA의 12번 위치에 이중결합을 도입할 수 있고,
n 및 n'는 정수이며,
0 ≤ n ≤ 3이고, 1 ≤ n' ≤ 4인, 효모 세포. - 제1항에 있어서, 상기 이종성 Δ12 탈포화효소는 카드라(Cadra), 에페스티아(Ephestia), 플로디아(Plodia), 마리아르파(Maliarpha), 푸미보티스(Fumibotys) 및 아모르비아(Amorbia)로 이루어진 군으로부터 선택된 속의 유기체, 예컨대, 카드라 카우텔라(Cadra cautella), 에페스티아 엘루텔라(Ephestia elutella), 에페스티아 쿠에니엘라(Ephestia kuehniella), 플로디아 인터푼텔라(Plodia interpunctella), 마리아르파 세파라텔라(Maliarpha separatella) 및 아모르비아 쿠네아나(Amorbia cuneana)로 이루어진 군으로부터 선택된 종에 대해 천연이되, 선택적으로 상기 이종성 Δ12 탈포화효소는 플로디아 탈포화효소, 예컨대, 플로디아 인터푼텔라 탈포화효소 또는 카드라 탈포화효소, 예컨대, 카드라 카우텔라 탈포화효소, 또는 에페스티아 탈포화효소, 예컨대, 에페스티아 엘루텔라 또는 에페스티아 쿠에니엘라 탈포화효소이고, 추가로 선택적으로 상기 이종성 Δ12 탈포화효소는 서열번호 2에 제시된 바와 같은 Pid12 탈포화효소 또는 서열번호 85에 제시된 바와 같은 Eku_d12 탈포화효소, 또는 이들과 적어도 70% 유사성 또는 동일성, 예컨대, 이들과 적어도 80%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%, 예컨대, 100% 유사성 또는 동일성을 갖는 기능적 상동체인, 효모 세포.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 이종성 Δ12 탈포화효소는 서열번호 80, 서열번호 81 및 서열번호 82에 제시된 탈포화효소로부터 선택되는, 효모 세포.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 13개의 탄소 사슬 길이를 갖고 n개의 이중결합을 갖는 상기 포화 또는 탈포화 지방 아실-CoA는,
i) 적어도 14, 예컨대, 적어도 15개의 탄소 길이를 갖고/갖거나;
ii) 테트라데칸오일-CoA 또는 테트라데센오일-CoA이고/이거나;
iii) 1개의 이중결합(즉, n = 1)을 갖고/갖거나;
iv) (Z9)-테트라데센오일-CoA인, 효모 세포. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, n'개의 이중결합(들)을 갖는 상기 탈포화 지방 아실-CoA는,
i) 최대 18, 예컨대, 최대 17, 예컨대, 최대 16, 예컨대, 최대 15, 예컨대, 최대 14, 예컨대, 적어도 15, 예컨대, 적어도 16, 예컨대, 적어도 17, 예컨대, 적어도 18, 예컨대, 적어도 19, 예컨대, 적어도 20개의 탄소 사슬 길이를 갖고/갖거나;
ii) 1개의 이중결합(즉, n' = 1)을 갖고/갖거나;
iii) 2개의 이중결합(즉, n' = 2)을 갖고/갖거나;
iv) (E12)-테트라데센오일-CoA이고/이거나;
v) (Z9, E12)-테트라데카다이엔오일-CoA인, 효모 세포. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모 세포는 추가 이종성 탈포화효소를 발현시키되; 선택적으로 상기 추가 이종성 탈포화효소는 적어도 13개의 탄소 사슬 길이를 갖고 n개의 이중결합을 갖는 포화 또는 탈포화 지방 아실-CoA에서 12번 위치가 아닌 임의의 위치에 이중결합을 도입할 수 있고; 선택적으로 상기 추가 이종성 탈포화효소는 적어도 9번 위치에 이중결합을 도입할 수 있고; 추가로 선택적으로 상기 추가 이종성 탈포화효소는 Δ9 탈포화효소 및 Δ11 탈포화효소로 이루어진 군으로부터 선택되는, 효모 세포.
- 제6항에 있어서, 상기 추가 이종성 탈포화효소는 드로소필라(Drosophila) 또는 코리스토네우라(Choristoneura) 탈포화효소, 예컨대, 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster), 드로소필라 비릴리스(Drosophila virilis), 드로소필라 그림샤위(Drosophila grimshawi), 드로소필라 야쿠바(Drosophila yakuba), 드로소필라 모자벤시스(Drosophila mojavensis), 드로소필라 슈도옵쿠라(Drosophila pseudoobscura), 드로소필라 아나나사에(Drosophila ananassae) 또는 코리스토네우라 파랄렐라(Choristoneura parallela) 탈포화효소이되, 선택적으로 상기 추가 이종성 탈포화효소는 Desat59(서열번호 8), Desat61(서열번호 4), Desat56(서열번호 57), Desat60(서열번호 59), Desat74(서열번호 61) 및 Desat24(서열번호 6) 또는 이들과 적어도 70% 유사성 또는 동일성, 예컨대, 이들과 적어도 80%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%, 예컨대, 100% 유사성 또는 동일성을 갖는 이들의 기능적 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 효모 세포.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모 세포는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올을 생산할 수 있되, 상기 효모 세포는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔오일-CoA의 적어도 일부를 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올로 전환시킬 수 있는 적어도 1종의 알코올-형성 지방 아실-CoA 환원효소(FAR)를 추가로 발현시키되; 선택적으로 상기 FAR은 아그로티스(Agrotis), 아미엘로이스(Amyelois), 바이사이클러스(Bicyclus), 봄버스(Bombus), 칠로(Chilo), 시디아(Cydia), 헬리코베르파(Helicoverpa), 헬리오티스(Heliothis), 로베시아(Lobesia), 오스트리니아(Ostrinia), 플로디아, 플루텔라, 스포돕테라, 트리코플루시아, 티타(Tyta) 및 이포노메우타(Yponomeuta), 예컨대, 아그로티스 입실론(Agrotis ipsilon), 아그로티스 세게툼(Agrotis segetum), 아미엘로이스 트란시텔라(Amyelois transitella), 바이사이클러스 아니나나(Bicyclus anynana), 봄버스 라피다리우스(Bombus lapidarius), 칠로 서프레살리스(Chilo suppressalis), 시디아 포모넬라(Cydia pomonella), 헬리코베르파 아르미게라(Helicoverpa armigera), 헬리코베르파 아설타(Helicoverpa assulta), 헬리오티스 서브플렉사(Heliothis subflexa), 헬리오티스 비레센스(Heliothis virescens), 로베시아 보트라나(Lobesia botrana), 오스트리니아 푸르나칼리스(Ostrinia furnacalis), 오스트리니아 누빌라리스(Ostrinia nubilalis), 오스트리니아 자그(Ostrinia zag), 오스트리니아 제아(Ostrinia zea), 플로디아 인터푼텔라, 플루텔라 자일로스텔라(Plutella xylostella), 스포돕테라 엑시구아(Spodoptera exigua), 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda), 스포돕테라 리토랄리스(Spodoptera littoralis), 스포돕테라 리투라(Spodoptera litura), 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni), 티타 알바(Tyta alba) 및 이포노메우타 로렐루스(Yponomeuta rorellus), 특히 스포돕테라 엑시구아(Spodoptera exigua), 헬리코베르파 아르미게라(Helicoverpa armigera), 스포돕테라 리투라(Spodoptera litura) 및 플로디아 인터푼텔라(Plodia interpunctella)로 이루어진 군으로부터 선택된 속의 유기체에 대해 천연이고; 추가로 선택적으로 상기 FAR은 FAR1(서열번호 20), FAR16(서열번호 22), FAR17(서열번호 24), FAR19(서열번호 26), FAR28(서열번호 28), FAR32(서열번호 30), FAR44(서열번호 63), FAR48(서열번호 65), FAR49(서열번호 67); FAR38(서열번호 32), FAR4(서열번호 69), FAR6(서열번호 71), FAR8(서열번호 73), FAR12(서열번호 75), FAR11(서열번호 77) 또는 FAR5(서열번호 79) 또는 이들과 적어도 70% 유사성 또는 동일성, 예컨대, 이들과 적어도 80%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%, 예컨대, 100% 유사성 또는 동일성을 갖는 이들의 기능적 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 효모 세포.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모 세포는 사카로마이세스(Saccharomyces), 피키아(Pichia), 야로위아(Yarrowia), 클루이베로미세스(Kluyveromyces), 칸디다(Candida), 로도토룰라(Rhodotorula), 로도스포리디움(Rhodosporidium), 크립토코커스(Cryptococcus), 트리코스포론(Trichosporon) 및 리포마이세스(Lipomyces)로부터 선택되는 속에 속하되, 선택적으로 효모 세포는 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 보울라디(Saccharomyces boulardi), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 클루이베로미세스 막시아누스(Kluyveromyces marxianus), 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 크립토코커스 알비두스(Cryptococcus albidus), 리포마이세스 리포페라(Lipomyces lipofera), 리포마이세스 스타키(Lipomyces starkeyi), 로도스포리디움 토룰로이데스(Rhodosporidium toruloides), 로도토룰라 글루티니스(Rhodotorula glutinis), 트리코스포론 풀루란(Trichosporon pullulan) 및 야로위아 리폴리티카(Lipomyces lipofera)로부터 선택된 종에 속하며, 바람직하게는 상기 효모 세포는 야로위아 리폴리티카 세포 또는 사카로마이세스 세레비시애 세포인, 효모 세포.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모 세포는,
i) 적어도 1㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 1.5㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 1.7㎎/ℓ 이상의 역가를 갖는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔산;
ii) 적어도 20㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 50㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 60㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 70㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 80㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 90㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 100㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 150㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 200㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 250㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 500㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 750㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 1g/ℓ, 예컨대, 적어도 2g/ℓ, 예컨대, 적어도 3g/ℓ, 예컨대, 적어도 4g/ℓ, 예컨대, 적어도 5g/ℓ, 예컨대, 적어도 6g/ℓ, 예컨대, 적어도 7g/ℓ, 예컨대, 적어도 8g/ℓ, 예컨대, 적어도 9g/ℓ, 예컨대, 적어도 10g/ℓ 이상의 역가를 갖는 E12-지방산 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔산; 및/또는
iii) 적어도 0.005㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.01㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.02㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.03㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.05㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.06㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.075㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.1㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.2㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.3㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.4㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.5㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.6㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.7㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.8㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 0.9㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 1㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 2㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 3㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 4㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 5㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 6㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 7㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 8㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 9㎎/ℓ, 예컨대, 적어도 10㎎/ℓ 이상의 역가를 갖는 E12-지방 알코올 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올
을 생산할 수 있는, 효모 세포. - n'개의 이중결합(들)을 갖는 탈포화 지방 아실-CoA를 생산하는 방법으로서, 상기 이중결합(들) 중 적어도 하나는 효모 세포의 12번 위치에 있고, 상기 방법은
i) 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 효모 세포를 제공하는 단계,
ii) 이종성 Δ12 탈포화효소를 발현시키는 조건 하에서 배지에서 상기 효모 세포를 인큐베이션시키는 단계로서, 상기 탈포화효소는, 적어도 13개의 탄소 사슬 길이를 갖고 n개의 이중결합을 갖는, 포화 또는 탈포화 지방 아실-CoA, 바람직하게는 탈포화 지방-아실-CoA의 12번 위치에 이중결합을 도입할 수 있는, 상기 인큐베이션시키는 단계
를 포함함으로써, n'개의 이중결합(들)을 갖는 탈포화 지방 아실-CoA를 생산하되, 상기 이중결합(들) 중 적어도 하나는 12번 위치에 있고,
n 및 n'는 정수이며,
0 ≤ n ≤ 3이고, 1 ≤ n' ≤ 4인, 탈포화 지방 아실-CoA를 생산하는 방법. - 제11항에 있어서,
i) 상기 이종성 Δ12 탈포화효소는 제2항에 규정된 바와 같고/같거나;
ii) 상기 추가 이종성 탈포화효소는 제6항 또는 제7항에 규정된 바와 같고/같거나;
iii) 상기 효모 세포는 제1항 또는 제10항에 규정된 바와 같고/같거나;
iv) n'개의 이중결합(들)을 갖는 상기 탈포화 지방 아실-CoA는 제5항에 규정된 바와 같고/같거나;
v) 적어도 13개의 탄소 사슬 길이를 갖고 n개의 이중결합을 갖는 상기 포화 또는 탈포화 지방 아실-CoA는 제4항에 규정된 바와 같은, 탈포화 지방 아실-CoA를 생산하는 방법. - 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 효모 세포는 (E12)-테트라데센오일-CoA 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔오일-CoA의 적어도 일부를 각각 E12-지방 알코올 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올로 전환시킬 수 있는 적어도 1종의 알코올-형성 지방 아실-CoA 환원효소(FAR)를 추가로 발현시키되, 선택적으로 상기 FAR은 제8항에 규정된 바와 같은, 방법.
- 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
i) 상기 E12-지방 알코올 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올을 회수하는 단계;
ii) 상기 E12-지방 알코올 및/또는 (Z9,E12)-테트라데카다이엔-1-올을 각각 E12-지방 알코올 아세테이트 및/또는 (Z9,E12)-테트라데카다이엔-1-올 아세테이트로 전환시키는 단계;
iii) 상기 E12-지방 알코올 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올을 각각 E12-지방 알데하이드 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔알로 전환시키는 단계, 및/또는
iv) 페로몬 조성물에서 E12-지방 알코올, (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올, E12-지방 알코올 아세테이트, (Z9,E12)-테트라데카다이엔-1-올 아세테이트, E12-지방 알데하이드 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔알을 제형화하는 단계
를 더 포함하는, 탈포화 지방 아실-CoA를 생산하는 방법. - 페로몬 조성물로서,
i) 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 및/또는 E12-지방 알코올을 생산하는 단계;
ii) (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 및/또는 E12-지방 알코올을 회수하는 단계;
iii) 상기 E12-지방 알코올 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올을 각각 E12-지방 알코올 아세테이트 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 아세테이트로 전환시키는 단계;
iv) 상기 E12-지방 알코올 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올을 각각 E12-지방 알데하이드 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔알로 전환시키는 단계;
v) 상기 E12-지방 알코올, (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올, E12-지방 알코올 아세테이트, (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 아세테이트, E12-지방 알데하이드 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔알을 페로몬 조성물로서 제형화하는 단계
를 포함하는 방법에 의해 얻을 수 있는, 페로몬 조성물. - 페로몬 조성물로서,
E12-지방 알코올, (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올, E12-지방 알코올 아세테이트, (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 아세테이트, E12-지방 알데하이드 및/또는 (Z9, E12)-테트라데카다이엔알을 포함하되, 상기 페로몬 조성물은 적어도 70% 바이오기반 탄소, 예컨대, 적어도 75% 바이오기반 탄소, 예컨대, 적어도 80% 바이오기반 탄소, 예컨대, 적어도 85% 바이오기반 탄소, 예컨대, 적어도 90% 바이오기반 탄소, 예컨대, 적어도 95% 바이오기반 탄소를 포함하는, 페로몬 조성물. - 페로몬 화합물로서, E12-지방 알코올, (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올, E12-지방 알코올 아세테이트, (Z9, E12)-테트라데카다이엔-1-올 아세테이트, E12-지방 알데하이드 및 (Z9, E12)-테트라데카다이엔알로 이루어진 군으로부터 선택되되, 상기 페로몬 화합물은 적어도 70% 바이오기반 탄소, 예컨대, 적어도 75% 바이오기반 탄소, 예컨대, 적어도 80% 바이오기반 탄소, 예컨대, 적어도 85% 바이오기반 탄소, 예컨대, 적어도 90% 바이오기반 탄소, 예컨대, 적어도 95% 바이오기반 탄소를 포함하는, 페로몬 화합물.
- 포화 또는 탈포화 지방 아실-CoA에서 12번 위치에 이중결합을 도입하기 위한 방법에서의, 플로디아 인터푼텔라 탈포화효소의 용도로서,
선택적으로 상기 플로디아 인터푼텔라 탈포화효소는 Pid12(서열번호 2), 또는 이와 적어도 70% 유사성 또는 동일성, 예컨대, 이와 적어도 80%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%, 예컨대, 100% 유사성 또는 동일성을 갖는 이의 기능적 변이체인, 용도. - 포화 또는 탈포화 지방 아실-CoA에서 12번 위치에 이중결합을 도입하기 위한 방법에서의, 에페스티아 쿠에니엘라(Ephestia kuehniella) 탈포화효소의 용도로서,
선택적으로 상기 에페스티아 쿠에니엘라 탈포화효소는 이와 적어도 70% 유사성 또는 동일성, 예컨대, 이와 적어도 80%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 91%, 예컨대, 적어도 92%, 예컨대, 적어도 93%, 예컨대, 적어도 94%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 96%, 예컨대, 적어도 97%, 예컨대, 적어도 98%, 예컨대, 적어도 99%, 예컨대, 100% 유사성 또는 동일성을 갖는 Eku_d12(서열번호 85) 또는 이의 기능성 변이체인, 용도.
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