CN117836406A

CN117836406A - 用于生产去饱和化合物的方法和酵母细胞

Info

Publication number: CN117836406A
Application number: CN202280054922.3A
Authority: CN
Inventors: C·霍尔肯布林克; I·波罗迪娜
Original assignee: Fumeishi Agricultural Solutions Co
Current assignee: Fumeishi Agricultural Solutions Co
Priority date: 2021-07-02
Filing date: 2022-07-01
Publication date: 2024-04-05

Abstract

本发明涉及能够生产Δ(12)去饱和脂肪酰基辅酶A和任选的脂肪醇的酵母细胞，所述酵母细胞表达异源Δ(12)去饱和酶，所述异源Δ(12)去饱和酶能够在碳链长度为至少13的饱和或去饱和脂肪酰基辅酶A的12位引入双键，即在(12)位的碳与在(13)位的碳之间引入双键。

Description

用于生产去饱和化合物的方法和酵母细胞

技术领域

本发明涉及能够生产Δ12去饱和脂肪酰基辅酶A和任选的去饱和脂肪醇的酵母细胞，所述酵母细胞表达异源Δ12去饱和酶。所述化合物是几种昆虫诸如印度谷螟(Plodiainterpunctella)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、干果斑螟(Cadra cautella)、亚热带粘虫(Spodoptera eridania)等的性信息素组分的前体。

背景技术

害虫综合治理(IPM)预期将在提高作物产量、最大限度地减少环境影响和实现有机食品生产方面发挥重要作用。IPM采用替代性害虫控制方法，诸如使用信息素干扰交配、使用信息素进行大规模诱捕、有益昆虫等。

信息素构成一组不同的化学物质，昆虫(像其它生物一样)在各种情况下用它们与同一物种的个体进行交流，包括配偶吸引、警报、踪迹标记和聚集。与远距离配偶寻找相关的昆虫信息素已经在农业和林业应用中用于监测和防治害虫，这是安全且环境友好的杀虫剂替代品。用于害虫防治的信息素的生物生产在价格、特异性和环境影响方面优于化学合成。

感兴趣的信息素是(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇、(Z9,E12)-十四碳二烯醛和(Z9,E12)-十四碳二烯乙酸酯。这些化合物是单独的，或是许多鳞翅目蛾(诸如印度谷螟、甜菜夜蛾、干果斑螟、亚热带粘虫等)的信息素混合物。这些蛾是对仓储和园艺作物具有显著重要经济价值的害虫。

Xia等人(2019)公开了表达来自甜菜夜蛾的去饱和酶(名称为SexiDes5)的酵母细胞。SexiDes5去饱和酶的主要产物是(Z11)-十六烷酸，同时还发现除了其它单去饱和脂肪酸和双去饱和脂肪酸外，它还生产少量(Z9,E12)-十四烷酸。

仍然需要能够以高滴度生产Δ12去饱和化合物的微生物细胞工厂。

发明内容

本发明如在权利要求书中所定义。

本申请提供了能够生产Δ12去饱和脂肪酰基辅酶A和任选的Δ12去饱和脂肪醇的酵母细胞，所述酵母细胞表达异源Δ12去饱和酶。具体地，本申请提供了能够生产(Z9,E12)-十四碳二烯酸或(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇，信息素(Z9,E12)-十四碳二烯醛和(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇乙酸酯的前体的酵母细胞。(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇、(Z9,E12)-十四碳二烯醛和(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇乙酸酯是印度谷螟的性信息素组分。此外，(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇和/或(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇乙酸酯是甜菜夜蛾、干果斑螟、亚热带粘虫等的信息素组分。干果斑螟也是已知的并且被称作干果粉斑螟(Ephestiacautella)。(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇乙酸酯也是已知的并且被称作(Z9,E12)-十四碳二烯-1-基乙酸酯。

因而，本文提供了能够生产具有n’个双键的去饱和脂肪酰基-辅酶A(脂肪酰基辅酶A)的酵母细胞，其中所述双键中的至少一个位于12位，

其中所述酵母细胞表达异源Δ12脂肪酰基辅酶A去饱和酶，所述去饱和酶能够在碳链长度为至少13且具有n个双键的饱和或去饱和脂肪酰基辅酶A，优选去饱和脂肪酰基辅酶A的12位引入双键，

其中n和n’是整数，

其中0≤n≤3且其中1≤n’≤4。

本文还提供了用于在酵母细胞中生产具有n’个双键的去饱和脂肪酰基辅酶A的方法，其中所述双键中的至少一个位于12位，所述方法包括以下步骤：

i)提供本文中公开的酵母细胞，

ii)在允许表达异源Δ12去饱和酶的条件下于培养基中孵育所述酵母细胞，所述去饱和酶能够在碳链长度为至少13且具有n个双键的饱和或去饱和脂肪酰基辅酶A，优选去饱和脂肪-酰基辅酶A的12位引入双键，

其中n和n’是整数，

其中0≤n≤3且其中1≤n’≤4，

从而生产具有n’个双键的去饱和脂肪酰基辅酶A，其中所述双键中的至少一个位于12位。

本文进一步提供了能够通过包括下述步骤的方法得到的信息素组合物：

i)通过本文中公开的方法生产(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇和/或E12-脂肪醇；

ii)回收所述(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇和/或E12-脂肪醇；

iii)将所述E12-脂肪醇和/或(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇分别转化为E12-脂肪醇乙酸酯和/或(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇乙酸酯；

iv)将所述E12-脂肪醇和/或(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇分别转化为E12-脂肪醛和/或(Z9,E12)-十四碳二烯醛；

v)将所述E12-脂肪醇、(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇、E12-脂肪醇乙酸酯、(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇乙酸酯、E12-脂肪醛和/或(Z9,E12)-十四碳二烯醛配制为信息素组合物。

本文进一步提供了信息素组合物，其包含E12-脂肪醇、(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇、E12-脂肪醇乙酸酯、(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇乙酸酯、E12-脂肪醛和/或(Z9,E12)-十四碳二烯醛，其中所述信息素组合物包含至少20％的生物基碳，诸如至少30％、诸如至少40％、诸如至少50％、诸如至少60％、诸如至少70％、诸如至少80％、诸如至少85％、诸如至少90％、诸如至少95％的生物基碳。

本文还提供了信息素化合物，其选自由E12-脂肪醇、(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇、E12-脂肪醇乙酸酯、(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇乙酸酯、E12-脂肪醛和(Z9,E12)-十四碳二烯醛组成的组，其中所述信息素化合物包含至少20％的生物基碳，诸如至少30％、诸如至少40％、诸如至少50％、诸如至少60％、诸如至少70％、诸如至少80％、诸如至少85％、诸如至少90％、诸如至少95％的生物基碳。

本文进一步提供了信息素组合物，其包含E12-脂肪醇、(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇、E12-脂肪醇乙酸酯、(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇乙酸酯、E12-脂肪醛和/或(Z9,E12)-十四碳二烯醛，其中所述信息素组合物具有至少20％、诸如至少30％、诸如至少40％、诸如至少50％、诸如至少60％、诸如至少70％、诸如至少80％、诸如至少85％、诸如至少90％、诸如至少95％的放射性¹⁴C水平。

本文还提供了信息素化合物，其选自由E12-脂肪醇、(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇、E12-脂肪醇乙酸酯、(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇乙酸酯、E12-脂肪醛和(Z9,E12)-十四碳二烯醛组成的组，其中所述信息素化合物具有至少20％、诸如至少30％、诸如至少40％、诸如至少50％、诸如至少60％、诸如至少70％、诸如至少80％、诸如至少85％、诸如至少90％、诸如至少95％的放射性¹⁴C水平。

本文还提供了印度谷螟去饱和酶在用于在饱和或去饱和脂肪酰基辅酶A中12位处引入双键的方法中的用途，任选地其中所述印度谷螟去饱和酶是Pid12(SEQ ID NO:2)或与其具有至少70％相似性或同一性，与其具有诸如至少80％、诸如至少90％、诸如至少91％、诸如至少92％、诸如至少93％、诸如至少94％、诸如至少95％、诸如至少96％、诸如至少97％、诸如至少98％、诸如至少99％、诸如100％相似性或同一性的其功能变体。

本文还提供了干果斑螟去饱和酶在用于在饱和或去饱和脂肪酰基辅酶A的12位处引入双键的方法中的用途，任选地其中所述干果斑螟去饱和酶是EcauDes12(SEQ ID NO:55)或与其具有至少70％相似性或同一性，与其具有诸如至少80％、诸如至少90％、诸如至少91％、诸如至少92％、诸如至少93％、诸如至少94％、诸如至少95％、诸如至少96％、诸如至少97％、诸如至少98％、诸如至少99％、诸如100％相似性或同一性的其功能变体。

本文进一步提供了地中海粉斑螟(Ephestia kuehniella)去饱和酶在用于在饱和或去饱和脂肪酰基辅酶A的12位处引入双键的方法中的用途，任选地其中所述地中海粉斑螟去饱和酶是Eku_d12(SEQ ID NO:85)或与其具有至少70％相似性或同一性，与其具有诸如至少80％、诸如至少90％、诸如至少91％、诸如至少92％、诸如至少93％、诸如至少94％、诸如至少95％、诸如至少96％、诸如至少97％、诸如至少98％、诸如至少99％、诸如100％相似性或同一性的其功能变体。

附图说明

图1.酵母中(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇(Z9,E12-14:OH)的生产途径以及向(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇乙酸酯(Z9,E12-14:OAc)或(Z9,E12)-十四碳二烯醛(Z9,E12-14:Ald)的酶或化学转化。

缩写:14:CoA，十四烷酰基辅酶A；Z9-14:CoA，(Z9)-十四烯酰基辅酶A；Z9,E12-14:CoA，(Z9,E12)-十四碳二烯酰基辅酶A。

图2.(A)Z9,E12-14:OH分析标准品、(B)对照菌株ST10628的提取物、(C)表达Pid12的菌株ST10870的提取物的GC色谱图，以及在保留时间10.2分钟时(D)分析标准品和(E)ST10870的提取物的质谱图。任意单位。

图3.(A)实施例12的起始材料A和产物B的GC色谱图，以及(B)实施例12的起始材料A和产物B的质谱图。

图4.(A)对照菌株ST10748的提取物、表达Eku_d12的菌株ST12596的提取物和Z9,E12-14:Me分析标准品的GC色谱图，以及在保留时间10.39分钟时(B)ST12596的提取物和(C)Z9,E12-14:Me的分析标准品的质谱图。任意单位。

具体实施方式

定义

异源Δ12去饱和酶：本文中使用的术语“异源Δ12去饱和酶”表示不同于“其它异源去饱和酶”的去饱和酶。所述异源去饱和酶能够在饱和或去饱和脂肪酰基-辅酶A(脂肪酰基-CoA)的12位引入双键。

其它异源去饱和酶：本文中使用的术语“其它异源去饱和酶”表示不同于“异源去饱和酶”的去饱和酶。所述其它异源去饱和酶能够在饱和或去饱和脂肪酰基辅酶A中除12位之外的任何其它位置引入双键。所述其它异源去饱和酶与异源Δ12去饱和酶可来源于相同的生物体，或者它与异源Δ12去饱和酶可来源于不同的生物体，并且催化与异源Δ12去饱和酶不同的反应。

生物杀虫剂：术语“生物杀虫剂”是“生物学杀虫剂”的缩写，表示几种类型的害虫管理干预：通过捕食、寄生或化学关系。在欧盟，生物杀虫剂已经被定义为“基于微生物或天然产物的杀虫剂形式”。在美国，EPA将其定义为“包括防治害虫的天然存在的物质(生化杀虫剂)、防治害虫的微生物(微生物杀虫剂)以及由含有添加遗传物质的植物所产生的杀虫物质(植物嵌入式保护剂，plant-incorporated protectant)或PIP”。本发明更具体地涉及包含天然产物或天然存在的物质的生物杀虫剂。在本发明的上下文中，这些通过培养和浓缩天然存在的生物体和/或其代谢物(包括细菌和其它微生物、真菌、线虫、蛋白等)来制备。这些化合物被认为是害虫综合治理(IPM)计划的重要组成部分，并作为合成化学植物保护产品(PPP)的替代品而受到广泛的实际关注。《生物防治剂手册》(Manual of BiocontrolAgents)(2009年：以前的《生物杀虫剂手册》(Biopesticide Manual))给出了可用的生物杀昆虫剂(和其它基于生物学的防治产品)的综述。

去饱和的(desaturated)：术语“去饱和的”在本文中将与术语“不饱和的(unsaturated)”互换使用，表示含有一个或多个碳-碳双键或碳-碳三键、优选碳-碳双键的化合物。本文通篇使用以下命名法：Δi去饱和化合物，其中i是整数，表示在碳链的i位的碳原子与碳链的i+1位的碳原子之间具有碳-碳双键或碳-碳三键的化合物。因此碳链长度至少等于i+1。例如，Δ12去饱和化合物表示在碳12和碳13之间具有碳-碳双键或碳-碳三键的化合物，并且在本文中被称作在12位具有碳-碳键的碳链。所述Δ12去饱和化合物可以具有13或更长的碳链长度。双键或三键可以是E构型或Z构型。因此，本文中，Ei或Zi去饱和化合物表示在碳链的碳i和碳i+1之间相应具有处于E构型或Z构型的碳-碳双键的化合物，其中所述去饱和化合物具有至少等于i+1的总长度。例如，E12去饱和脂肪醇在12位具有处于E构型的去饱和度(即碳原子12和碳原子13之间的双键)，并且具有13或更长的碳链长度。

衍生自：当表示衍生自生物体的多肽或多核苷酸时，术语“衍生自”意指所述多肽或多核苷酸对于所述生物体是天然的，即其天然存在于所述生物体中。

在12位具有至少一个双键的E12-脂肪酰基辅酶A：本文中使用的术语“在12位具有至少一个双键的E12-脂肪酰基辅酶A”是指E12-脂肪酰基辅酶A在12位具有一个双键。在本发明的某些实施方案中，E12-脂肪酰基辅酶A仅在12位具有双键。在本发明的其它实施方案中，除了12位的双键之外，E12-脂肪酰基辅酶A具有另外的双键。所述另外的双键可位于除12位之外的任何位置。其一个实例是具有在12位的双键和在任何其它位置处(诸如在9位)的另外的双键的E12-脂肪酰基辅酶A。

脂肪酸：术语“脂肪酸”在本文中表示具有长脂族链的羧酸，即具有13至28个碳原子，诸如13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28个碳原子的脂族链的羧酸。大多数天然存在的脂肪酸是直链的，即无支链的。它们可以是饱和的或去饱和的。

脂肪酰基辅酶A：该术语在本文中将与“脂肪酰基辅酶A酯”互换使用，表示通式R-CO-SCoA的化合物，其中R是具有13至28个碳原子，诸如13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28个碳原子的碳链长度的脂肪碳链。脂肪碳链通过硫酯键连接到辅酶A的-SH基团。脂肪酰基辅酶A可以是饱和的或去饱和的，取决于衍生出其的脂肪酸是饱和的还是去饱和的。

脂肪醇：术语“脂肪醇”在本文中表示衍生自脂肪酰基辅酶A的醇，其具有13至28个碳原子，诸如13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28个碳原子的碳链长度。脂肪醇可以是饱和的或去饱和的。

脂肪醇乙酸酯：该术语表示具有脂肪碳链的乙酸酯，其中脂肪碳链即具有13至28个碳原子，诸如13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28个碳原子的脂族链。脂肪酰基乙酸酯可以是饱和的或去饱和的。

脂肪醛：该术语在本文中表示衍生自脂肪酰基辅酶A的醛，其具有13至28个碳原子，诸如13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28个碳原子的碳链长度。脂肪醛可以是饱和的或去饱和的。

功能变体：该术语在本文中表示酶的功能变体，其保留亲本酶的至少一些活性。因此，酰基辅酶A氧化酶、去饱和酶、形成醇的脂肪酰基辅酶A还原酶、醇脱氢酶、形成醛的脂肪酰基辅酶A还原酶、乙酰基转移酶或NAD(P)H细胞色素b5氧化还原酶(Ncb5or)的功能变体可以分别催化与衍生出它们的酰基辅酶A氧化酶、去饱和酶、形成醇的脂肪酰基辅酶A还原酶、醇脱氢酶、形成醛的脂肪酰基辅酶A还原酶或乙酰基转移酶相同的转化，尽管反应效率可能不同，例如与亲本酶相比效率降低或提高，或者底物特异性被改变。

异源的：当表示多肽(诸如蛋白或酶)或多核苷酸时，术语“异源的”在本文中应解释为表示在野生型细胞中不天然存在的多肽或多核苷酸。例如，当应用于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)时，术语“异源Δ9去饱和酶”表示不是野生型酿酒酵母细胞中天然存在的Δ9去饱和酶，例如衍生自黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)的Δ9去饱和酶。

同一性/相似性：就多核苷酸(或多肽)而言，术语同一性和相似性在本文中被定义为在以下操作后在候选序列中分别与相应天然核酸(或氨基酸)的残基相同或相似的核酸(或氨基酸)的百分比：对序列进行比对并引入缺口(如果必要的话)以实现最大同一性/相似性百分比，并根据NCIUB规则(https://iubmb.qmul.ac.uk/misc/naseq.html；NC-IUB,Eur J Biochem(1985))考虑任何保守置换作为序列同一性的一部分。具体地，相似性百分比表示具有相似理化性质的保守残基的百分比。5'或3'延伸或插入(对于核酸)或者N'或C'延伸或插入(对于多肽)都不会引起同一性或相似性的降低。用于比对的方法和计算机程序是本领域众所周知的。通常，两个序列之间的给定相似性意味着这些序列之间的同一性至少等于相似性；例如，如果两个序列彼此具有70％相似性，则它们彼此的同一性不可低于70％，但可以具有80％同一性。

增加的活性：术语“增加的活性”在本文中表示给定肽(诸如蛋白或酶)的活性的增加。活性的增加可使用本领域已知的方法来测量，例如使用酶测定来测量酶的活性增加。在某些情况下，活性的增加使得酶以更高产量产生一种或多种化合物(即产物)。因此，通过测量所述产物的量(诸如浓度)，可以测量增加的酶活性。如果酶具有增加的活性，则与在相似或相同的条件下由没有增加活性的相同酶(例如亲本酶或未修饰的酶)产生的产物浓度相比，产物浓度将更高。如果活性增加的酶在细胞内表达，则可以以产物滴度来测量产物，即所述细胞产生的产物的量，并且可以与特定细胞在相似或相同的条件下获得的相同产物的滴度或量进行对比，所述特定细胞表达亲本酶或未修饰的酶但在其它方面具有与表达活性增加的酶的细胞相同或相似的基因型。

n个双键：本文中使用的术语“n个双键”表示脂肪酰基辅酶A中存在的双键的数目。具有n个双键的脂肪酰基辅酶A具有0至3个双键。因此，具有n个双键的脂肪酰基辅酶A可以是具有0个双键的饱和脂肪酰基辅酶A或具有一个或多个双键(诸如1、2或3个双键)的去饱和脂肪酰基辅酶A。所述n个双键可以位于除12位之外的任何位置。

n’个双键：本文中使用的术语“n’个双键”表示在脂肪酰基辅酶A中存在的双键的数目。具有n’个双键的脂肪酰基辅酶A具有1至4个双键。因此，具有n’个双键的脂肪酰基辅酶A可以是具有一个或多个双键(诸如1、2、3或4个双键)的去饱和脂肪酰基辅酶A，其中双键之一位于12位。

天然的：术语“天然的”当表示多肽(诸如蛋白或酶)或多核苷酸时，在本文中应解释为表示天然存在于野生型细胞中的多肽或多核苷酸。

害虫：本文中使用的术语“害虫”应表示对人类或人关注方面有害的生物体，特别是动物诸如昆虫，特别是在农业或畜牧业生产的语境中。害虫是对植物或动物、人或人关注方面、家畜、人建筑物(human structure)、野生生态系统等具有侵袭性或繁殖性、有害性、麻烦性、有毒性、破坏性、滋扰性的任何活生物体。该术语经常与相关术语害虫、杂草、植物和动物寄生虫和病原体重叠。生物体在一种设定中可能是害虫，但在另一设定中却是有益的、驯化的或可接受的。

信息素：信息素是天然存在的化合物。鳞翅目信息素特指由醇、醛或乙酸酯官能团封端且在脂族主链中最多含有3个双键(诸如1、2或3个双键)的非支链脂族链(9至18个碳，诸如9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个碳原子)。因此，去饱和脂肪醇、去饱和脂肪醛和去饱和脂肪醇乙酸酯通常被包含在信息素中。信息素组合物可以化学地或生物化学地产生，例如如本文所述。因此，信息素包含去饱和脂肪醇、去饱和脂肪醛和/或去饱和脂肪醇乙酸酯，诸如可以通过本文描述的方法和细胞获得。

“PidZ11”和“Pid12”：在发现SEQ ID NO:2所示的Δ12去饱和酶具有Δ12活性之前，该酶最初被内部命名为“PidZ11”。因此，更合适的名称可能是“Pid12”。术语“PidZ11”和“Pid12”在本文中可互换使用。

降低的活性：术语“降低的活性”在本文中可以表示给定肽(诸如蛋白或酶)的活性全部或部分丧失。在某些情况下，肽是由不可删除的必需基因编码的。在这些情况下，通过本领域已知的方法，诸如转录或翻译的下调、肽的抑制，可以降低所述肽的活性。在其它情况下，所述肽由非必需基因编码，并且活性可能降低或可能完全丧失，例如由于编码肽的基因缺失。为了部分地或完全地降低给定肽的活性，本领域已知的方法不仅包括编码所述肽的基因中的突变，而且还包括编码参与编码所述肽的基因的转录或翻译的调节因子的基因的突变，例如转录因子基因或转录阻遏物基因的突变，其引起所述转录因子或阻遏物的增加或减少的表达，这进而降低编码所述肽的基因的转录水平；基因的天然启动子的截短或突变，例如为了除去转录因子结合位点或使它们不可接触所述转录因子；用较弱的启动子替换天然启动子，从而减少编码所述肽的编码序列的转录；基因的天然终止子的截短或突变，或用另一终止子序列替换基因的天然终止子；Kozak序列的突变。其它方法涉及在RNA水平的调节，包括RNA干扰系统诸如Dicer或Argonaute、RNA沉默方法、引入导致靶向RNA降解的CRISPR/Cas系统。还考虑在蛋白水平的调节，例如通过使用抑制剂或蛋白降解序列。所列出的方法可以是诱导型的，即它们可以以本领域已知的瞬时方式被活化。

饱和的：术语“饱和的”表示不含碳-碳双键或碳-碳三键的化合物。

特异性：酶对给定底物的特异性是该酶在催化从所述底物开始的反应表现出的偏好。在本申请中，与用十六烷酰基辅酶A作为底物的反应相比，对十四烷酰基辅酶A(肉豆蔻酰基辅酶A)比对十六烷酰基辅酶A(棕榈酰基辅酶A)具有更高特异性的去饱和酶和/或脂肪酰基辅酶A还原酶优选地催化用十四烷酰基辅酶A作为底物的反应。确定去饱和酶或脂肪酰基辅酶A还原酶的特异性的方法是本领域已知的。例如，可如下确定给定去饱和酶在表达其的给定细胞中的特异性：在包含肉豆蔻酸甲酯的溶液中孵育所述细胞至多48小时，随后萃取并用甲醇酯化产物。然后可以通过GC-MS测定所得脂肪酸甲酯的特性。例如，对肉豆蔻酰基辅酶A具有较高特异性且对棕榈酰基辅酶A具有低特异性的去饱和酶将使得(Z)9-C14:Me的浓度高于(Z)9-C16:Me的浓度。例如，可如下确定给定细胞中给定还原酶的特异性：在包含(Z)9-肉豆蔻酸甲酯的溶液中孵育表达所述还原酶的细胞至多48小时，随后萃取并通过GC-MS分析所得的脂肪醇。对(Z)9-C14:辅酶A具有较高特异性且对(Z)9-C16:辅酶A具有低特异性的还原酶将使得(Z)9-C14:OH的浓度高于(Z)9-C16:OH的浓度。

滴度：化合物的滴度在本文中表示所产生化合物的浓度。当化合物由细胞产生时，该术语表示细胞所产生的总浓度，即化合物的总量除以培养基的体积。这意味着，特别是对于挥发性化合物，滴度包括可能已经从培养基中蒸发的化合物部分，并因此通过从发酵液中和从来自发酵罐的潜在废气中收集所产生的化合物来测定。

E12去饱和化合物的生产

本发明的发明人发现，异源Δ12去饱和酶在酵母细胞中的表达使得产生在12位具有双键的脂肪酰基辅酶A。本文公开的异源Δ12去饱和酶能够在具有至少13的碳链长度的去饱和或饱和脂肪酰基辅酶A的12位引入双键，并且任选地在12位以外的位置处引入双键。其中所述去饱和酶可以在12位引入双键的起始化合物可以是饱和化合物，或者是已经在不是12位的位置处包含双键的去饱和化合物。优选地，所述起始化合物是在9位包含双键的去饱和脂肪酰基辅酶A。除了12位的双键外，Δ12去饱和酶还可能引入另外的双键。

因而，本文提供了能够生产具有n’个双键的去饱和脂肪酰基辅酶A的酵母细胞，其中所述双键中的至少一个位于12位，

其中所述酵母细胞表达Δ12异源脂肪酰基辅酶A去饱和酶，所述去饱和酶能够在碳链长度至少13且具有n个双键的饱和或去饱和脂肪酰基辅酶A的12位引入双键，

其中n和n’是整数，

其中0≤n≤3且其中1≤n’≤4。

本文还提供了表达异源Δ12去饱和酶的酵母细胞，所述去饱和酶能够在碳链长度至少13且具有n个双键的饱和或去饱和脂肪酰基辅酶A的12位引入双键，从而生产具有n’个双键的去饱和脂肪酰基辅酶A，其中所述双键中的至少一个位于12位，

其中n和n’是整数，

其中0≤n≤3且其中1≤n’≤4。

在优选的实施方案中，所述碳链长度至少13且具有n个双键的饱和或去饱和脂肪酰基辅酶A是碳链长度14的去饱和脂肪酰基辅酶A，诸如(Z9)-十四烯酰基辅酶A。

本文进一步提供了能够生产(Z9,E12)-十四碳二烯酰基辅酶A的酵母细胞，所述酵母细胞表达

i)至少一种其它异源去饱和酶，其能够在十四烷酰基辅酶A的9位引入第一个双键，从而将所述十四烷酰基辅酶A转化为(Z9)-十四烯酰基辅酶A；和

ii)至少一种异源Δ12去饱和酶，其能够在(Z9)-十四烯酰基辅酶A的12位引入第二个双键，从而将(Z9)-十四烯酰基辅酶A转化为(Z9,E12)-十四碳二烯酰基辅酶A。

本文还提供了能够生产去饱和脂肪酰基辅酶A的酵母细胞，所述酵母细胞表达Pid12(SEQ ID NO:2)去饱和酶、EcauDes12(SEQ ID NO:55)去饱和酶、Ee_d12(SEQ ID NO:87)去饱和酶或Eku_d12(SEQ ID NO:85)去饱和酶，其能够在脂肪酰基辅酶A的12位引入反式双键，从而将所述脂肪酰基辅酶A转化为去饱和的E12-脂肪酰基辅酶A。所述EcauDes12去饱和酶也被称作Ecau_D4(Ding等人，2021)。

去饱和酶

在本发明中，术语“脂肪酰基辅酶A去饱和酶”、“去饱和酶”、“脂肪酰基去饱和酶”和“FAD”将互换使用。该术语通常表示能够在链长度为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个碳原子的酰基辅酶A中引入至少一个E/Z确认的双键的酶。所述双键可以在任何位置引入。例如，在12位引入双键的去饱和酶被称为Δ12去饱和酶。在某些实施方案中，本文中公开的去饱和酶能够在脂肪酰基辅酶A的几个位置处(例如12位和9位)引入双键。

去饱和酶催化以下反应：

脂肪酰基辅酶A+2亚铁细胞色素b5+O(2)+2H(+)<＝>去饱和脂肪酰基辅酶A+2高铁细胞色素b5+2H(2)O

本文提供了表达异源Δ12去饱和酶和任选的其它异源去饱和酶的酵母细胞。

Δ12去饱和酶

本文中公开了能够在碳链长度为13或更长的脂肪酰基辅酶A的12位引入双键的Δ12去饱和酶，当其在酵母细胞中表达时，使得所述酵母细胞生产在12位具有双键的去饱和脂肪酰基辅酶A。所述异源Δ12去饱和酶可以能够在去饱和或饱和脂肪酰基辅酶A的12位引入双键。换而言之，所述Δ12去饱和酶可以能够在没有双键的脂肪酰基辅酶A的12位引入双键，或者在12位之外的一个或多个位置引入一个或多个双键，例如在选自由8、9、10、11、13、14、15、16、17、18、19、20和21位组成的组中的一个或多个位置处引入一个或多个双键。在一个实施方案中，所述Δ12去饱和酶能够在没有具有双键或在9位具有至少一个双键的脂肪酰基辅酶A的12位引入双键。在优选的实施方案中，所述异源Δ12去饱和酶能够在去饱和脂肪酰基辅酶A(诸如在9位具有双键的脂肪酰基辅酶A)的12位引入双键。

在某些实施方案中，所述Δ12去饱和酶能够在12位引入至少一个双键，并且还能够在脂肪酰基辅酶A的另外位置处(诸如在12位之外的任何其它位置处)引入至少一个另外双键。换而言之，所述Δ12去饱和酶可以能够在12位和选自由8、9、10、11、13、14、15、16、17、18、19、20和21位组成的组中的至少一个以上的位置处引入双键。在一个实施方案中，所述Δ12去饱和酶能够在脂肪酰基辅酶A的12位和9位引入双键。

在一个实施方案中，所述异源Δ12去饱和酶对于选自由以下组成的组中的属的生物体而言是天然的：果斑螟属(Cadra)、谷斑螟属(Plodia)、粉斑螟属(Ephestia)、Maliarpha和Amorbia。在一个实施方案中，所述异源Δ12去饱和酶对于由以下组成的组中的种的生物体而言是天然的：干果斑螟(Cadra cautella)、烟草粉螟(Ephestiaelutella)、地中海粉斑螟(Ephestia kuehniella)、印度谷螟、Maliarpha separatella和Amorbia cuneana。在优选的实施方案中，所述异源Δ12去饱和酶是谷斑螟属去饱和酶，诸如印度谷螟去饱和酶。干果斑螟也是已知的并且被称作干果粉斑螟。

在一个实施方案中，所述Δ12去饱和酶是谷斑螟属Δ12去饱和酶。在一个实施方案中，所述去饱和酶是印度谷螟Δ12去饱和酶，诸如SEQ ID NO:2所示的Δ12去饱和酶(Pid12)。在某些实施方案中，所述Δ12去饱和酶是谷斑螟属Δ12去饱和酶的功能变体、印度谷螟Δ12去饱和酶的功能变体、或SEQ ID NO:2所示的Δ12去饱和酶(Pid12)的功能变体，与其具有至少60％同一性或相似性，与SEQ ID NO:2所示的Pid12Δ12去饱和酶具有诸如至少61％、诸如至少62％、诸如至少63％、诸如至少64％、诸如至少65％、诸如至少66％、诸如至少67％、诸如至少68％、诸如至少69％、诸如至少70％、诸如至少71％、诸如至少72％、诸如至少73％、诸如至少74％、诸如至少75％、诸如至少76％、诸如至少77％、诸如至少78％、诸如至少79％、诸如至少80％、诸如至少81％、诸如至少82％、诸如至少83％、诸如至少84％、诸如至少85％、诸如至少86％、诸如至少87％、诸如至少88％、诸如至少89％、诸如至少90％、诸如至少91％、诸如至少92％、诸如至少93％、诸如至少94％、诸如至少95％、诸如至少96％、诸如至少97％、诸如至少98％、诸如至少99％、诸如100％同一性或相似性。不受理论的约束，所述Pid12Δ12去饱和酶在碳链长度至少13的脂肪酰基辅酶A中引入单个双键，其中所述单个双键在12位。

如本领域已知的，编码异源Δ12去饱和酶的基因可以针对表达所述去饱和酶的酵母细胞进行密码子优化。确定所述去饱和酶是否在细胞中表达的方法是本领域技术人员已知的，并且包括例如检测来自给定底物的给定产物，如上文所详述和如下面实施例中所示。

本文进一步提供了印度谷螟去饱和酶在用于在饱和或去饱和脂肪酰基辅酶A的12位引入至少一个双键的方法中的用途。在某些实施方案中，所述印度谷螟去饱和酶在脂肪酰基辅酶A的12位引入单个双键。在某些实施方案中，所述印度谷螟去饱和酶是Pid12(SEQID NO:2)或与其具有至少70％相似性或同一性，与其具有诸如至少80％、诸如至少90％、诸如至少91％、诸如至少92％、诸如至少93％、诸如至少94％、诸如至少95％、诸如至少96％、诸如至少97％、诸如至少98％、诸如至少99％、诸如100％相似性或同一性的其功能变体。

在一个实施方案中，所述方法在体外进行，例如通过提供如上所述的去饱和酶，特别是SEQ ID NO:2所示的Pid12去饱和酶，或与其具有至少70％相似性或同一性的其功能变体，并使所述去饱和酶与饱和或去饱和脂肪酰基辅酶A接触。如本领域已知的，可以从表达所述去饱和酶的细胞纯化所述去饱和酶。在一个实施方案中，所述方法在体内进行，优选地在本文“酵母细胞”一节中定义的酵母细胞中进行。

在一个实施方案中，所述Δ12去饱和酶是果斑螟属Δ12去饱和酶。在一个实施方案中，所述去饱和酶是干果斑螟Δ12去饱和酶，诸如SEQ ID NO:55所示的Δ12去饱和酶(EcauDes12)。在某些实施方案中，所述Δ12去饱和酶是果斑螟属Δ12去饱和酶的功能变体、干果斑螟Δ12去饱和酶的功能变体或SEQ ID NO:55所示的Δ12去饱和酶(EcauDes12)的功能变体，与其具有至少60％同一性或相似性，与SEQ ID NO:55所示的EcauDes12Δ12去饱和酶具有诸如至少61％、诸如至少62％、诸如至少63％、诸如至少64％、诸如至少65％、诸如至少66％、诸如至少67％、诸如至少68％、诸如至少69％、诸如至少70％、诸如至少71％、诸如至少72％、诸如至少73％、诸如至少74％、诸如至少75％、诸如至少76％、诸如至少77％、诸如至少78％、诸如至少79％、诸如至少80％、诸如至少81％、诸如至少82％、诸如至少83％、诸如至少84％、诸如至少85％、诸如至少86％、诸如至少87％、诸如至少88％、诸如至少89％、诸如至少90％、诸如至少91％、诸如至少92％、诸如至少93％、诸如至少94％、诸如至少95％、诸如至少96％、诸如至少97％、诸如至少98％、诸如至少99％、诸如100％同一性或相似性。不受理论的约束，所述EcauDes12Δ12去饱和酶在碳链长度至少为13的脂肪酰基辅酶A中引入单个双键，其中所述单个双键位于12位。

本文进一步提供了干果斑螟去饱和酶在用于在饱和或去饱和脂肪酰基辅酶A的12位引入至少一个双键的方法中的用途。在某些实施方案中，所述干果斑螟去饱和酶在脂肪酰基辅酶A的12位引入单个双键。在某些实施方案中，所述干果斑螟去饱和酶是SEQ ID NO:55(EcauDes12)或与其具有至少70％相似性或同一性，与其具有诸如至少80％、诸如至少90％、诸如至少91％、诸如至少92％、诸如至少93％、诸如至少94％、诸如至少95％、诸如至少96％、诸如至少97％、诸如至少98％、诸如至少99％、诸如100％相似性或同一性的其功能变体。

在一个实施方案中，所述方法在体外进行，例如通过提供如上所述的去饱和酶，特别是SEQ ID NO:55所示的EcauDes12去饱和酶，或与其具有至少70％相似性或同一性的其功能变体，并使所述去饱和酶与饱和或去饱和脂肪酰基辅酶A接触。如本领域已知的，可以从表达所述去饱和酶的细胞纯化所述去饱和酶。在一个实施方案中，所述方法在体内进行，优选地在本文“酵母细胞”一节中定义的酵母细胞中进行。

在一个实施方案中，所述Δ12去饱和酶是粉斑螟属Δ12去饱和酶。在一个实施方案中，所述去饱和酶是地中海粉斑螟Δ12去饱和酶，诸如SEQ ID NO:85所示的Δ12去饱和酶(Eku_d12)。在一个实施方案中，所述去饱和酶是烟草粉螟Δ12去饱和酶，诸如SEQ IDNO:87所示的Δ12去饱和酶(Ee_d12)。在某些实施方案中，所述Δ12去饱和酶是粉斑螟属Δ12去饱和酶的功能变体、地中海粉斑螟Δ12去饱和酶的功能变体、烟草粉螟Δ12去饱和酶的功能变体或者SEQ ID NO:85(Eku_d12)或SEQ ID NO:87(Ee_d12)所示的Δ12去饱和酶的功能变体，与其具有至少60％同一性或相似性，与SEQ ID NO:85所示的Eku_d12Δ12去饱和酶或SEQ ID NO:87所示的Ee_d12Δ12去饱和酶具有诸如至少61％、诸如至少62％、诸如至少63％、诸如至少64％、诸如至少65％、诸如至少66％、诸如至少67％、诸如至少68％、诸如至少69％、诸如至少70％、诸如至少71％、诸如至少72％、诸如至少73％、诸如至少74％、诸如至少75％、诸如至少76％、诸如至少77％、诸如至少78％、诸如至少79％、诸如至少80％、诸如至少81％、诸如至少82％、诸如至少83％、诸如至少84％、诸如至少85％、诸如至少86％、诸如至少87％、诸如至少88％、诸如至少89％、诸如至少90％、诸如至少91％、诸如至少92％、诸如至少93％、诸如至少94％、诸如至少95％、诸如至少96％、诸如至少97％、诸如至少98％、诸如至少99％、诸如100％同一性或相似性。不受理论的约束，所述Eku_d12Δ12去饱和酶和所述Ee_d12Δ12去饱和酶在碳链长度至少为13的脂肪酰基辅酶A中引入单个双键，其中所述单个双键位于12位。

本文进一步提供了地中海粉斑螟去饱和酶在用于在饱和或去饱和脂肪酰基辅酶A的12位引入至少一个双键的方法中的用途。在某些实施方案中，所述地中海粉斑螟去饱和酶在脂肪酰基辅酶A的12位引入单个双键。在某些实施方案中，所述地中海粉斑螟去饱和酶是Eku_d12(SEQ ID NO:85)或与其具有至少70％相似性或同一性，与其具有诸如至少80％、诸如至少90％、诸如至少91％、诸如至少92％、诸如至少93％、诸如至少94％、诸如至少95％、诸如至少96％、诸如至少97％、诸如至少98％、诸如至少99％、诸如100％相似性或同一性的其功能变体。

本文进一步提供了烟草粉螟去饱和酶在用于在饱和或去饱和脂肪酰基辅酶A的12位引入至少一个双键的方法中的用途。在某些实施方案中，所述烟草粉螟去饱和酶在脂肪酰基辅酶A的12位引入单个双键。在某些实施方案中，所述烟草粉螟去饱和酶是Eku_d12(SEQ ID NO:87)或与其具有至少70％相似性或同一性，与其具有诸如至少80％、诸如至少90％、诸如至少91％、诸如至少92％、诸如至少93％、诸如至少94％、诸如至少95％、诸如至少96％、诸如至少97％、诸如至少98％、诸如至少99％、诸如100％相似性或同一性的其功能变体。

在一个实施方案中，所述方法在体外进行，例如通过提供如上所述的去饱和酶，特别是SEQ ID NO:85所示的Eku_d12去饱和酶或SEQ ID NO:87所示的Ee_d12去饱和酶，或与其具有至少70％相似性或同一性的其功能变体，并使所述去饱和酶与饱和或去饱和脂肪酰基辅酶A接触。如本领域已知的，可以从表达所述去饱和酶的细胞纯化所述去饱和酶。在一个实施方案中，所述方法在体内进行，优选地在本文“酵母细胞”一节中定义的酵母细胞中进行。

本发明的酵母细胞可以表达至少一种异源Δ12去饱和酶。在某些实施方案中，所述细胞表达一种异源Δ12去饱和酶。但是，可能需要表达几种异源Δ12去饱和酶，诸如至少两种异源Δ12去饱和酶，它们可以是相同的或不同的。可替换地，可能需要表达编码至少一种异源Δ12去饱和酶的核酸的几个拷贝，诸如至少两个拷贝，诸如至少三个拷贝或更多个。在其它实施方案中，所述细胞表达至少两种异源Δ12去饱和酶，例如三种异源Δ12去饱和酶。

在某些实施方案中，所述Δ12去饱和酶是Δ12去饱和酶的功能变体，其包含来自至少两种不同蛋白(诸如两种不同的去饱和酶，诸如三种不同的去饱和酶)的氨基酸序列。这样的功能变体可以例如是Δ12去饱和酶的融合蛋白，诸如嵌合体(mosaic)或嵌合蛋白(chimeric protein)。优选地，在Δ12去饱和酶的这样的功能变体中包含的氨基酸序列中的至少一种衍生自Δ12去饱和酶。因此，在某些实施方案中，本文公开的Δ12去饱和酶是Δ12去饱和酶的功能变体，其包含来自Δ12去饱和酶的氨基酸序列和来自至少一种其它去饱和酶(诸如Δ9去饱和酶)的至少一个氨基酸序列(诸如两个氨基酸序列或更多种)或由其组成。在其它实施方案中，所述Δ12去饱和酶的功能变体包含来自Δ12去饱和酶的氨基酸序列和来自至少一种其它去饱和酶(诸如Δ9去饱和酶、Δ11去饱和酶、两种Δ9去饱和酶、两种Δ11去饱和酶或更多种)的至少两个氨基酸序列或由其组成。在进一步其它实施方案中，本文中公开Δ12去饱和酶是Δ12去饱和酶的的功能变体，其包含衍生自Δ12去饱和酶的氨基酸序列和衍生自另一种Δ12去饱和酶的氨基酸序列，使得所述Δ12去饱和酶的功能变体包含来自两种不同的Δ12去饱和酶的氨基酸序列或由其组成。

在某些实施方案中，所述Δ12去饱和酶和所述至少一种其它去饱和酶(诸如Δ9、Δ11和/或Δ12去饱和酶)衍生自相同的物种。换而言之，所述Δ12去饱和酶的功能变体包含来自对于相同物种而言是天然的Δ12去饱和酶和至少一种其它去饱和酶的氨基酸序列(诸如来自Δ12去饱和酶的氨基酸序列和来自Δ11去饱和酶的氨基酸序列)或由其组成，其中所述Δ12去饱和酶和Δ11去饱和酶都衍生自印度谷螟。在其它实施方案中，所述Δ12去饱和酶和所述至少一种其它去饱和酶衍生自两种不同的物种、三种不同的物种或更多种不同的物种。换而言之，所述Δ12去饱和酶的功能变体包含来自对于至少两个不同物种而言是天然的Δ12去饱和酶和至少一种另外去饱和酶的氨基酸序列(诸如来自印度谷螟Δ12去饱和酶的氨基酸序列和来自干果斑螟Δ12去饱和酶的氨基酸序列)或由其组成。

在某些实施方案中，所述Δ12去饱和酶的功能变体包含来自一种去饱和酶的氨基酸序列或由其组成，其中所述一种去饱和酶的至少一个末端已经被替换，诸如与另一种去饱和酶的末端(诸如另一种去饱和酶的相应末端)交换。本文所述一种去饱和酶的N-端的相应末端表示所述另一种去饱和酶的N-末端，并且相同的术语适用于C-端。技术人员将理解，许多酶的末端，诸如去饱和酶的末端，可以相对于它们的天然序列而改变，同时保留所述酶的功能，即所述酶不会失去其活性。相反，在不干扰或改变所述酶的功能和/或催化活性的情况下，改变包含催化位点的残基和/或对所述酶的催化活性重要的残基可能是不可能的。关于末端，技术人员将理解保持末端的柔性、疏水性和/或亲水性以保留所述酶的特征和/或功能可能是重要的。例如，如果所述酶经由其至少一个末端锚定(也被称作嵌入和/或插入)至例如膜，则保持其末端相同或相似疏水性可能是重要的。

因而，在某些实施方案中，所述Δ12去饱和酶的功能变体包含来自Δ12去饱和酶的氨基酸序列或由其组成，其从其天然N-端和/或C-端剥离，并融合至另一种去饱和酶(诸如另一种Δ12去饱和酶、Δ9去饱和酶或Δ11去饱和酶)的N-端和/或C-端。在某些实施方案中，所述Δ12去饱和酶的功能变体包含Δ12去饱和酶的氨基酸序列的一部分或由其组成，其中所述Δ12去饱和酶的60个N-端氨基酸残基已经被删除或者被来自至少一种其它去饱和酶的氨基酸序列置换，诸如其中所述Δ12去饱和酶的50个N-端氨基酸残基已经被删除或者被来自至少一种其它去饱和酶的氨基酸序列置换，诸如其中所述Δ12去饱和酶的40个N-端氨基酸残基已经被删除或者被来自至少一种其它去饱和酶的氨基酸序列置换，诸如其中所述Δ12去饱和酶的35个N-端氨基酸残基已经被删除或者被来自至少一种其它去饱和酶的氨基酸序列置换，诸如其中所述Δ12去饱和酶的30个N-端氨基酸残基已经被删除或者被来自至少一种其它去饱和酶的氨基酸序列置换，诸如其中所述Δ12去饱和酶的25个N-端氨基酸残基已经被删除或者被来自至少一种其它去饱和酶的氨基酸序列置换，诸如其中所述Δ12去饱和酶的20个N-端氨基酸残基已经被删除或者被来自至少一种其它去饱和酶的氨基酸序列置换，诸如其中所述Δ12去饱和酶的15个N-端氨基酸残基已经被删除或者被来自至少一种其它去饱和酶的氨基酸序列置换，诸如其中所述Δ12去饱和酶的10个N-端氨基酸残基已经被删除或者被来自至少一种其它去饱和酶的氨基酸序列置换，诸如其中所述Δ12去饱和酶的5个N-端氨基酸残基已经被删除或者被来自至少一种其它去饱和酶的氨基酸序列置换，诸如其中所述Δ12去饱和酶的1至55个N-端氨基酸残基已经被删除或者被来自至少一种其它去饱和酶的氨基酸序列置换，诸如其中所述Δ12去饱和酶的5至45个N-端氨基酸残基已经被删除或者被来自至少一种其它去饱和酶的氨基酸序列置换，诸如其中所述Δ12去饱和酶的10至40个N-端氨基酸残基已经被删除或者被来自至少一种其它去饱和酶的氨基酸序列置换，诸如其中所述Δ12去饱和酶的15至35个N-端氨基酸残基已经被删除或者被来自至少一种其它去饱和酶的氨基酸序列置换，诸如其中所述Δ12去饱和酶的20至35个N-端氨基酸残基已经被删除或者被来自至少一种其它去饱和酶的氨基酸序列置换，诸如其中所述Δ12去饱和酶的25至35个N-端氨基酸残基已经被删除或者被来自至少一种其它去饱和酶的氨基酸序列置换，

和/或

其中所述Δ12去饱和酶的50个C-端氨基酸残基已经被删除或者被来自至少一种其它去饱和酶的氨基酸序列置换，诸如其中所述Δ12去饱和酶的40个C-端氨基酸残基已经被删除或者被来自至少一种其它去饱和酶的氨基酸序列置换，诸如其中所述Δ12去饱和酶的35个C-端氨基酸残基已经被删除或者被来自至少一种其它去饱和酶的氨基酸序列置换，诸如其中所述Δ12去饱和酶的30个C-端氨基酸残基已经被删除或者被来自至少一种其它去饱和酶的氨基酸序列置换，诸如其中所述Δ12去饱和酶的25个C-端氨基酸残基已经被删除或者被来自至少一种其它去饱和酶的氨基酸序列置换，诸如其中所述Δ12去饱和酶的20个C-端氨基酸残基已经被删除或者被来自至少一种其它去饱和酶的氨基酸序列置换，诸如其中所述Δ12去饱和酶的15个C-端氨基酸残基已经被删除或者被来自至少一种其它去饱和酶的氨基酸序列置换，诸如其中所述Δ12去饱和酶的10个C-端氨基酸残基已经被删除或者被来自至少一种其它去饱和酶的氨基酸序列置换，诸如其中所述Δ12去饱和酶的1至55个C-端氨基酸残基已经被删除或者被来自至少一种其它去饱和酶的氨基酸序列置换，诸如其中所述Δ12去饱和酶的5至45个C-端氨基酸残基已经被删除或者被来自至少一种其它去饱和酶的氨基酸序列置换，诸如其中所述Δ12去饱和酶的10至40个C-端氨基酸残基已经被删除或者被来自至少一种其它去饱和酶的氨基酸序列置换，诸如其中所述Δ12去饱和酶的15至35个C-端氨基酸残基已经被删除或者被来自至少一种其它去饱和酶的氨基酸序列置换，诸如其中所述Δ12去饱和酶的20至35个C-端氨基酸残基已经被删除或者被来自至少一种其它去饱和酶的氨基酸序列置换，诸如其中所述Δ12去饱和酶的25至35个C-端氨基酸残基已经被删除或者被来自至少一种其它去饱和酶的氨基酸序列置换。在优选的实施方案中，所述Δ12去饱和酶选自SEQ ID NO:2(Pid12)、SEQ ID NO:55(EcauDes12)、SEQ ID NO:85(Eku_d12)或SEQ ID NO:87(Ee_d12)所示的Δ12去饱和酶。

优选地，在所述Δ12去饱和酶的功能变体中，被删除的C-或N-端残基被等量或接近等量的来自其它去饱和酶的氨基酸残基置换，使得例如在其中30个N-端氨基酸已经被删除的Δ12去饱和酶的功能变体中，所述30个氨基酸已经被来自另一种去饱和酶的20至40个N-端氨基酸残基，诸如来自另一种去饱和酶的25至35个N-端氨基酸残基，诸如来自另一种去饱和酶(诸如来自另一种Δ11去饱和酶)的28至32个N-端氨基酸残基所替换。因而，例如在其中30个C-端氨基酸已经被删除的Δ12去饱和酶的功能变体中，所述30个氨基酸已经被来自另一种去饱和酶的20至40个C-端氨基酸残基，诸如来自另一种去饱和酶的25至35个C-端氨基酸残基，诸如来自另一种去饱和酶(诸如来自另一种Δ11去饱和酶)的28至32个C-端氨基酸残基所替换。

N-端残基在本文中被定义为蛋白的氨基酸序列的前列残基(first residues)，从而删除或替换蛋白的N-端的X个氨基酸残基是指删除或替换所述蛋白的前X个氨基酸。换而言之，删除或替换300个氨基酸的蛋白的N-端的30个氨基酸残基表示删除或替换所述蛋白的1至30位氨基酸。

C-端残基在本文中被定义为蛋白的氨基酸序列的最后残基，从而删除或替换蛋白的C-端的X个氨基酸残基是指删除或替换所述蛋白的最后X个氨基酸。换而言之，删除或替换300个氨基酸的蛋白的C-端的30个氨基酸残基表示删除或替换所述蛋白的271至300位氨基酸。

在某些实施方案中，所述Δ12去饱和酶的功能变体包含来自去饱和酶，诸如SEQID NO:2(Pid12)、SEQ ID NO:55(EcauDes12)、SEQ ID NO:85(Eku_d12)或SEQ ID NO:87(Ee_d12)的氨基酸序列或由其组成，其中至少一个氨基酸残基已经被删除、插入或被另一种氨基酸残基置换。所述删除、插入或置换可以出现在序列的C-端或N-端部分。

在某些实施方案中，序列，诸如选自SEQ ID NO:2(Pid12)、SEQ ID NO:55(EcauDes12)、SEQ ID NO:85(Eku_d12)和SEQ ID NO:87(Ee_d12)的序列的N-端氨基酸残基1至50，诸如1至40、诸如1至30、诸如1至20中的至少一个已经被删除、插入或被另一种氨基酸残基置换。

在某些实施方案中，序列，诸如选自SEQ ID NO:2(Pid12)、SEQ ID NO:55(EcauDes12)、SEQ ID NO:85(Eku_d12)和SEQ ID NO:87(Ee_d12)的序列的C-端氨基酸残基250至400，诸如260至390、诸如270至380、诸如280至370、诸如290至350、诸如300至350中的至少一个已经被删除、插入或被另一种氨基酸残基置换。在某些实施方案中，序列，诸如SEQID NO:2(Pid12)、SEQ ID NO:55(EcauDes12)、SEQ ID NO:85(Eku_d12)和SEQ ID NO:87(Ee_d12))的氨基酸残基290至400，诸如290至390、诸如290至380、诸如290至370、诸如290至350中的至少一个已经被删除、插入或被另一种氨基酸残基置换。在某些实施方案中，序列，诸如SEQ ID NO:2(Pid12)、SEQ ID NO:55(EcauDes12)、SEQ ID NO:85(Eku_d12)和SEQID NO:87(Ee_d12))的氨基酸残基302至348中的至少一个已经被删除、插入或被另一种氨基酸残基置换。

在某些实施方案中，所述Δ12去饱和酶的功能变体包含来自印度谷螟Δ12去饱和酶的氨基酸序列和来自另一种印度谷螟去饱和酶的氨基酸序列或由其组成。在一个实施方案中，所述Δ12去饱和酶的功能变体包含SEQ ID NO:2所示的印度谷螟去饱和酶Pid12的氨基酸序列的一部分和SEQ ID NO:47所示的印度谷螟去饱和酶Desat65的氨基酸序列的一部分或由其组成。在某些实施方案中，所述Δ12去饱和酶的功能变体由Pid12(SEQ ID NO:2)的变体组成，其中N-端的氨基酸残基1-30和/或C-端的氨基酸残基300-335分别已经被Desat65(SEQ ID NO:47)的C-端的氨基酸残基1-29和N-端的氨基酸残基299-344置换。因而，在某些实施方案中，所述Δ12去饱和酶的功能变体由SEQ ID NO:80所示的序列组成。

在某些实施方案中，所述Δ12去饱和酶的功能变体包含来自干果斑螟Δ12去饱和酶的氨基酸序列和来自印度谷螟去饱和酶的氨基酸序列或由其组成。在一个实施方案中，所述Δ12去饱和酶的功能变体包含SEQ ID NO:55所示的干果斑螟去饱和酶EcauDes12的氨基酸序列的一部分和SEQ ID NO:47所示的印度谷螟去饱和酶Desat65的氨基酸序列的一部分或由其组成。在某些实施方案中，所述Δ12去饱和酶的功能变体由EcauDes12(SEQ IDNO:55)的变体组成，其中N-端的氨基酸残基1-30和C-端的氨基酸残基300-338分别已经被Desat65(SEQ ID NO:47)的N-端的氨基酸残基1-29和C-端的氨基酸残基299-344置换。因而，在某些实施方案中，所述Δ12去饱和酶的功能变体由SEQ ID NO:81所示的序列组成。

在某些实施方案中，所述Δ12去饱和酶的功能变体包含来自干果斑螟Δ12去饱和酶的氨基酸序列和来自脐橙螟蛾(Amyelois transitella)Δ11去饱和酶的氨基酸序列或由其组成。在一个实施方案中，所述Δ12去饱和酶的功能变体包含SEQ ID NO:55所示的干果斑螟去饱和酶EcauDes12的氨基酸序列的一部分和SEQ ID NO:83所示的脐橙螟蛾Δ11去饱和酶Desat16的氨基酸序列的一部分或由其组成。在某些实施方案中，所述Δ12去饱和酶的功能变体由EcauDes12(SEQ ID NO:55)的变体组成，其中N-端的氨基酸残基1-30和C-端的氨基酸残基300-338分别已经被Desat16(SEQ ID NO:83)的N-端的氨基酸残基1-20和C-端的氨基酸残基302-326置换。因而，在某些实施方案中，所述Δ12去饱和酶的功能变体由SEQ ID NO:82所示的序列组成。

其它去饱和酶

除了所述异源Δ12去饱和酶外，本文提供的酵母细胞可表达至少一种不是Δ12去饱和酶的其它去饱和酶。在某些实施方案中，所述其它去饱和酶是同源去饱和酶，诸如同源的Δ9去饱和酶或同源Δ11去饱和酶。换而言之，所述酵母细胞表达至少一种不是Δ12去饱和酶的天然去饱和酶。例如，所述酵母细胞可以是表达同源Δ9去饱和酶Ole1的解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)酵母细胞。但是，在优选的实施方案中，所述其它去饱和酶是异源去饱和酶。换而言之，所述酵母细胞表达至少一种不是Δ12去饱和酶的其它异源去饱和酶。

在一个实施方案中，所述其它去饱和酶是异源去饱和酶，其能够在碳链长度为至少13的饱和或去饱和脂肪酰基辅酶A中在不是12位的任何位置处引入至少一个双键。换而言之，所述其它去饱和酶可能够在脂肪酰基辅酶A的选自由8、9、10、11、13、14、15、16、17、18、19、20和21位组成的组中的位置处引入至少一个双键。在优选的实施方案中，所述脂肪酰基辅酶A是饱和脂肪酰基辅酶A，例如十四烷酰基辅酶A。在另一实施方案中，所述脂肪酰基辅酶A是在12位处具有双键的去饱和脂肪酰基辅酶A。在又另一实施方案中，所述脂肪酰基辅酶A是在12位处和除了12位以外的位置处(例如在12位和9位)具有双键的去饱和脂肪酰基辅酶A。

因而，在一个实施方案中，所述酵母细胞能够表达至少一种其它异源去饱和酶(其为异源Δ5去饱和酶)。在另一个实施方案中，所述酵母细胞能够表达至少一种其它异源去饱和酶(其为异源Δ6去饱和酶)。在另一个实施方案中，所述酵母细胞能够表达至少一种其它异源去饱和酶(其为异源Δ7去饱和酶)。在另一个实施方案中，所述酵母细胞能够表达至少一种其它异源去饱和酶(其为异源Δ8去饱和酶)。在另一个实施方案中，所述酵母细胞能够表达至少一种其它异源去饱和酶(其为异源Δ9去饱和酶)。在另一个实施方案中，所述酵母细胞能够表达至少一种其它异源去饱和酶(其为异源Δ10去饱和酶)。在另一个实施方案中，所述酵母细胞能够表达至少一种其它异源去饱和酶(其为异源Δ11去饱和酶)。在另一个实施方案中，所述酵母细胞能够表达至少一种其它异源去饱和酶(其为异源Δ13去饱和酶)。在另一个实施方案中，所述酵母细胞能够表达至少一种其它异源去饱和酶(其为异源Δ14去饱和酶)。在另一个实施方案中，所述酵母细胞能够表达至少一种其它异源去饱和酶(其为异源Δ15去饱和酶)。在另一个实施方案中，所述酵母细胞能够表达至少一种其它异源去饱和酶(其为异源Δ16去饱和酶)。在另一个实施方案中，所述酵母细胞能够表达至少一种其它异源去饱和酶(其为异源Δ17去饱和酶)。在另一个实施方案中，所述酵母细胞能够表达至少一种其它异源去饱和酶(其为异源Δ18去饱和酶)。在另一个实施方案中，所述酵母细胞能够表达至少一种其它异源去饱和酶(其为异源Δ19去饱和酶)。在另一个实施方案中，所述酵母细胞能够表达至少一种其它异源去饱和酶(其为异源Δ20去饱和酶)。在另一个实施方案中，所述酵母细胞能够表达至少一种其它异源去饱和酶(其为异源Δ21去饱和酶)。在优选的实施方案中，所述其它去饱和酶是Δ9去饱和酶或Δ11去饱和酶。因而，所述其它去饱和酶可能够分别在9位或11位引入双键。

所述其它异源去饱和酶对于不同于根据本发明方法在其中表达它的酵母细胞的任何类型生物体而言可以是天然的。在某些实施方案中，所述异源去饱和酶对植物，诸如蓖麻(Ricinus communis)或天竺葵(Pelargonium hortorum)而言是天然的。在另一个实施方案中，所述异源去饱和酶对诸如以下的昆虫而言是天然的：诸如双翅目(Diptera)、鞘翅目(Coleoptera)或鳞翅目(Lepidoptera)的昆虫，诸如地老虎属(Agrotis)、带卷蛾属(Argyrotaenia)、脐橙螟属(Amyelois)、Chauliognathus、色卷蛾属(Choristoneura)、小卷蛾属(Cydia)、Dendrophilus、果蝇属(Drosophila)、Epiphyas、小食心虫属(Grapholita)、棉铃虫属(Helicoverpa)、Lampronia、花翅小卷蛾属(Lobesia)、Manducta、秆野螟属(Ostrinia)、红铃虫属(Pectinophora)、菜蛾属(Plutella)、Thalassiosira、异舟蛾属(Thaumetopoea)、拟谷盗属(Tribolium)、粉夜蛾属(Trichoplusia)或灰翅夜蛾属(Spodoptera)，诸如黄地老虎(Agrotis segetum)、红带卷蛾(Argyrotaenia velutiana)、脐橙螟蛾(Amyelois transitella)、Chauliognathus lugubris、Choristoneuraparallela、蔷薇斜条卷叶蛾(Choristoneura rosaceana)、苹果蠹蛾(Cydia pomonella)、Dendrophilus punctatus、嗜凤梨果蝇(Drosophila ananassae)、Drosophila grimshawi、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、Drosophila mojavensis、拟暗果蝇(Drosophilapseudoobscura)、大果蝇(Drosophila virilis)、Drosophila yakuba、苹淡褐卷蛾(Epiphyas postvittana)、梨小食心虫(Grapholita molesta)、烟夜蛾(Helicoverpaassulta)、谷实夜蛾(Helicoverpa zea)、红醋栗穿孔蛾(Lampronia capitella)、葡萄花翅小卷蛾(Lobesia botrana)、Manducta sexta、亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)、欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)、红铃麦蛾(Pectinophora gossypiella)、菜蛾(Plutellaxylostella)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、海灰翅夜蛾(Spodoptera littoralis)、斜纹夜蛾(Spodoptera litura)、假微型海链藻(Thalassiosira pseudonana)、松异舟蛾(Thaumetopoea pityocampa)、赤拟谷盗(Tribolium castaneum)或粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)。

在优选的实施方案中，所述其它异源去饱和酶是果蝇属去饱和酶、诸如黑腹果蝇去饱和酶、大果蝇去饱和酶、Drosophila grimshawi去饱和酶、Drosophila yakuba去饱和酶、Drosophila mojavensis去饱和酶、拟暗果蝇去饱和酶或嗜凤梨果蝇(Drosophilaananassae)去饱和酶。

在一个实施方案中，所述其它异源去饱和酶是果蝇属去饱和酶。在一个实施方案中，所述去饱和酶是大果蝇去饱和酶，诸如SEQ ID NO:4所示的去饱和酶(Desat61)。在一个实施方案中，所述去饱和酶是黑腹果蝇去饱和酶，诸如SEQ ID NO:6所示的去饱和酶(Desat24)。在一个实施方案中，所述去饱和酶是Drosophila grimshawi去饱和酶，诸如SEQID NO:8所示的去饱和酶(Desat59)。在一个实施方案中，所述去饱和酶是Drosophilayakuba去饱和酶，诸如SEQ ID NO:57所示的去饱和酶(Desat56)。在一个实施方案中，所述去饱和酶是嗜凤梨果蝇去饱和酶，诸如SEQ ID NO:59所示的去饱和酶(Desat60)。在某些实施方案中，所述去饱和酶是果蝇属去饱和酶的功能变体、大果蝇去饱和酶的功能变体、黑腹果蝇去饱和酶的功能变体、Drosophila grimshawi去饱和酶的功能变体、SEQ ID NO:6所示的去饱和酶(Desat24)的功能变体、SEQ ID NO:4所示的去饱和酶(Desat61)的功能变体、SEQ ID NO:59所示的去饱和酶(Desat60)的功能变体、SEQ ID NO:57所示的去饱和酶(Desat56)的功能变体、或SEQ ID NO:8所示的去饱和酶(Desat59)的功能变体，与其具有至少60％同一性或相似性。

在一个实施方案中，所述其它异源去饱和酶是脐橙螟属去饱和酶。在一个实施方案中，所述去饱和酶是脐橙螟蛾去饱和酶，诸如SEQ ID NO:10(Desat17)或SEQ ID NO:12(Desat18)所示的去饱和酶。在某些实施方案中，所述去饱和酶是脐橙螟属去饱和酶的功能变体、脐橙螟蛾去饱和酶的功能变体、SEQ ID NO:10所示的去饱和酶(Desat17)的功能变体、或SEQ ID NO:12所示的去饱和酶(Desat18)的功能变体，与其具有至少60％同一性或相似性。

在一个实施方案中，所述其它异源去饱和酶是色卷蛾属去饱和酶。在一个实施方案中，所述去饱和酶是Choristoneura parallela去饱和酶，诸如SEQ ID NO:61所示的去饱和酶(Desat74)。在某些实施方案中，所述去饱和酶是色卷蛾属去饱和酶的功能变体、Choristoneura parallela去饱和酶的功能变体、或SEQ ID NO:61所示的去饱和酶(Desat74)的功能变体，与其具有至少60％同一性或相似性。

在一个实施方案中，所述其它异源去饱和酶是灰翅夜蛾属去饱和酶。在一个实施方案中，所述去饱和酶是斜纹夜蛾去饱和酶，诸如SEQ ID NO:18所示的去饱和酶(Desat26)。在某些实施方案中，所述去饱和酶是灰翅夜蛾属去饱和酶的功能变体、斜纹夜蛾去饱和酶的功能变体、或SEQ ID NO:18所示的去饱和酶(Desat26)的功能变体，与其具有至少60％同一性或相似性。

在一个实施方案中，所述其它异源去饱和酶是酵母属去饱和酶。在一个实施方案中，所述去饱和酶是酿酒酵母去饱和酶，诸如SEQ ID NO:14所示的去饱和酶(Desat42)。在某些实施方案中，所述去饱和酶是酵母属去饱和酶的功能变体、酿酒酵母去饱和酶的功能变体、或SEQ ID NO:14所示的去饱和酶(Desat42)的功能变体，与其具有至少60％同一性或相似性。

在一个实施方案中，所述其它异源去饱和酶是耶氏酵母属去饱和酶。在一个实施方案中，所述去饱和酶是解脂耶氏酵母去饱和酶，诸如SEQ ID NO:16所示的去饱和酶(Desat69)。在某些实施方案中，所述去饱和酶是耶氏酵母属去饱和酶的功能变体、解脂耶氏酵母去饱和酶的功能变体、或SEQ ID NO:16所示的去饱和酶(Desat69)的功能变体，与其具有至少60％同一性或相似性。

关于给定的酶的术语“具有至少60％同一性或相似性的其变体”应当理解为表示与所述酶具有60％或更高同一性或相似性的变体，与所述酶具有诸如至少61％、诸如至少62％、诸如至少63％、诸如至少64％、诸如至少65％、诸如至少66％、诸如至少67％、诸如至少68％、诸如至少69％、诸如至少70％、诸如至少71％、诸如至少72％、诸如至少73％、诸如至少74％、诸如至少75％、诸如至少76％、诸如至少77％、诸如至少78％、诸如至少79％、诸如至少80％、诸如至少81％、诸如至少82％、诸如至少83％、诸如至少84％、诸如至少85％、诸如至少86％、诸如至少87％、诸如至少88％、诸如至少89％、诸如至少90％、诸如至少91％、诸如至少92％、诸如至少93％、诸如至少94％、诸如至少95％、诸如至少96％、诸如至少97％、诸如至少98％、诸如至少99％或更高的同一性或相似性。

待修饰的酵母细胞可以表达天然去饱和酶，其可能对去饱和脂肪酰基辅酶A和/或去饱和脂肪醇的生产具有负面影响。因此，如果待修饰的细胞表达这样的天然去饱和酶，则可以修饰生物体，使得天然去饱和酶的活性降低或缺失。

为了确保天然去饱和酶的活性的缺失或至少降低，可以采用本领域已知的方法。可以删除或部分地删除编码天然去饱和酶的基因，以确保天然去饱和酶不被表达。可替换地，所述基因可以被突变，使得天然去饱和酶被表达但缺乏活性，例如通过酶的催化位点的突变。可替换地，可以通过诸如沉默RNA或siRNA等方法阻止mRNA翻译成活性蛋白。可替换地，可以将所述细胞在包含抑制天然去饱和酶活性的抑制剂的培养基中孵育。还可以提供抑制编码天然去饱和酶的基因转录的化合物，使得当所述化合物存在时转录被失活。可以采用本领域已知的其它方法。

因此，天然去饱和酶的失活可以是永久的或长期的，即经修饰的细胞以稳定的方式表现出天然去饱和酶的活性降低或无活性，或者它可以是暂时的，即经修饰的细胞可以在一段时间内表现出天然去饱和酶的活性，但此活性可以在其它时间段内被抑制或降低。

在某些实施方案中，所述天然酵母去饱和酶被异源去饱和酶替换。所述异源去饱和酶可以是例如这样的去饱和酶：当在相同条件下测试时，与天然酵母去饱和酶相比，其不会产生不希望的副产物，或者产生更少的不希望的副产物。这样的不希望的副产物可以是例如(Z9)-十六碳烯酰基辅酶A(Z9-16:CoA)和/或(Z9)-十六碳烯醇(Z9-16:OH)。已经发现，用来自禾柄锈菌(Puccinia graminis)或Arxula adeninivorans的异源去饱和酶替换解脂耶氏酵母OLE1去饱和酶会导致减少的副产物Z9-16:OH产生(Tsakraklides等人,2018)。

替换天然酵母去饱和酶的异源去饱和酶可能对C18化合物，诸如十八碳酰基辅酶A具有特异性，并使十八烯酰基辅酶A(octadecenoyl-CoA)成为主要产物(Tsakraklides等人,2018)。

Δ12去饱和酶和其它去饱和酶

上述Δ12去饱和酶中的任一种可以与上述其它去饱和酶中的任一种一起表达。

因而，在某些实施方案中，所述细胞表达：

-印度谷螟Δ12去饱和酶，例如SEQ ID NO:2所示的Pid12，和

-选自以下的其它去饱和酶：果蝇属去饱和酶，诸如大果蝇去饱和酶，例如SEQ IDNO:4所示的Desat61，或诸如黑腹果蝇去饱和酶，例如SEQ ID NO:6中所示的Desat24，或诸如Drosophila grimshawi去饱和酶，例如SEQ ID NO:8所示的Desat59，或诸如Drosophilayakuba去饱和酶，例如SEQ ID NO:57所示的Desat56，或诸如嗜凤梨果蝇去饱和酶，例如SEQID NO:59所示的Desat60；脐橙螟属去饱和酶，诸如脐橙螟蛾去饱和酶，例如SEQ ID NO:10所示的Desat17或SEQ ID NO:12所示的Desat18；色卷蛾属去饱和酶，诸如Choristoneuraparallela去饱和酶，例如SEQ ID NO:61所示的Desat74；灰翅夜蛾属去饱和酶，诸如斜纹夜蛾去饱和酶，例如SEQ ID NO:18所示的Desat26；酵母属去饱和酶，诸如酿酒酵母去饱和酶，例如SEQ ID NO:14所示的Desat42；耶氏酵母属去饱和酶，诸如解脂耶氏酵母去饱和酶，例如SEQ ID NO:16所示的Desat69；

或与其具有至少60％同一性或相似性的其功能变体。

在某些实施方案中，所述细胞表达：

-干果斑螟Δ12去饱和酶，例如SEQ ID NO:55所示的EcauDes12，和

-选自以下的其它去饱和酶：果蝇属去饱和酶，诸如大果蝇去饱和酶，例如SEQ IDNO:4所示的Desat61，或诸如黑腹果蝇去饱和酶，例如SEQ ID NO:6所示的Desat24，或诸如Drosophila grimshawi去饱和酶，例如SEQ ID NO:8所示的Desat59，或诸如Drosophilayakuba去饱和酶，例如SEQ ID NO:57所示的Desat56，或诸如嗜凤梨果蝇去饱和酶，例如SEQID NO:59所示的Desat60；脐橙螟属去饱和酶，诸如脐橙螟蛾去饱和酶，例如SEQ ID NO:10所示的Desat17或SEQ ID NO:12所示的Desat18；色卷蛾属去饱和酶，诸如Choristoneuraparallela去饱和酶，例如SEQ ID NO:61所示的Desat74；灰翅夜蛾属去饱和酶，诸如斜纹夜蛾去饱和酶，例如SEQ ID NO:18所示的Desat26；酵母属去饱和酶，诸如酿酒酵母去饱和酶，例如SEQ ID NO:14中所示的Desat42；耶氏酵母属去饱和酶，诸如解脂耶氏酵母去饱和酶，例如SEQ ID NO:16所示的Desat69；

或与其具有至少60％同一性或相似性的其功能变体。

在某些实施方案中，所述细胞表达：

-地中海粉斑螟Δ12去饱和酶，例如SEQ ID NO:85所示的Eku_d12，和

-选自以下的其它去饱和酶：果蝇属去饱和酶，诸如大果蝇去饱和酶，例如SEQ IDNO:4所示的Desat61，或诸如黑腹果蝇去饱和酶，例如SEQ ID NO:6所示的Desat24，或诸如Drosophila grimshawi去饱和酶，例如SEQ ID NO:8所示的Desat59，或诸如Drosophilayakuba去饱和酶，例如SEQ ID NO:57所示的Desat56，或诸如嗜凤梨果蝇去饱和酶，例如SEQID NO:59所示的Desat60；脐橙螟属去饱和酶，诸如脐橙螟蛾去饱和酶，例如SEQ ID NO:10所示的Desat17或SEQ ID NO:12所示的Desat18；色卷蛾属去饱和酶，诸如Choristoneuraparallela去饱和酶，例如SEQ ID NO:61所示的Desat74；灰翅夜蛾属去饱和酶，诸如斜纹夜蛾去饱和酶，例如SEQ ID NO:18所示的Desat26；酵母属去饱和酶，诸如酿酒酵母去饱和酶，例如SEQ ID NO:14所示的Desat42；耶氏酵母属去饱和酶，诸如解脂耶氏酵母去饱和酶，例如SEQ ID NO:16所示的Desat69；

或与其具有至少60％同一性或相似性的其功能变体。

在某些实施方案中，所述细胞表达：

-烟草粉螟Δ12去饱和酶，例如SEQ ID NO:87所示的Ee_d12，和

或与其具有至少60％同一性或相似性的其功能变体。

应当理解，与上述给定的去饱和酶具有至少60％同一性或相似性的去饱和酶的功能变体可以与所述去饱和酶具有至少61％、诸如至少62％、诸如至少63％、诸如至少64％、诸如至少65％、诸如至少66％、诸如至少67％、诸如至少68％、诸如至少69％、诸如至少70％、诸如至少71％、诸如至少72％、诸如至少73％、诸如至少74％、诸如至少75％、诸如至少76％、诸如至少77％、诸如至少78％、诸如至少79％、诸如至少80％、诸如至少81％、诸如至少82％、诸如至少83％、诸如至少84％、诸如至少85％、诸如至少86％、诸如至少87％、诸如至少88％、诸如至少89％、诸如至少90％、诸如至少91％、诸如至少92％、诸如至少93％、诸如至少94％、诸如至少95％、诸如至少96％、诸如至少97％、诸如至少98％、诸如至少99％、诸如100％同一性或相似性。

增加的C14特异性

许多合乎需要的信息素化合物的碳链长度为14。因此，将反应导向C14化合物的生产可能是有意义的。在某些实施方案中，本文公开的酵母细胞表达对十四烷酰基辅酶A比对十六烷酰基辅酶A具有更高特异性的去饱和酶和/或对去饱和十四烷酰基辅酶A(即十四碳烯酰基辅酶A)比对去饱和十六烷酰基辅酶A(即十六烷酰基辅酶A)具有更高特异性的脂肪酰基辅酶A还原酶。换而言之，与碳链长度为16的底物相比，所述去饱和酶对碳链长度为14的底物更具特异性。表达这样的去饱和酶的酵母细胞的例子公开于WO 2018/109167中，特别是在题为“去饱和酶”一节中。

这样的去饱和酶(以及本文描述的任何还原酶)在酵母细胞中的表达增加了碳链长度为14的总去饱和脂肪醇的比例，特别是与碳链长度为16的总去饱和脂肪醇的比例相比。具有所需特异性的去饱和酶特别是对于果蝇属、灰翅夜蛾属、Choristneura而言天然的去饱和酶，诸如对于黑腹果蝇、Drosophila grimshawi、大果蝇、斜纹夜蛾、Choristoneuraparallela或蔷薇斜条卷叶蛾而言天然的去饱和酶，或与其具有至少60％同一性的其变体。

在某些实施方案中，所述去饱和酶选自由以下项组成的组：

i)与SEQ ID NO:6所示的来自黑腹果蝇的Δ9去饱和酶具有至少60％同一性的Δ9去饱和酶；

ii)与SEQ ID NO:8所示的来自Drosophila grimshawi的Δ9去饱和酶具有至少60％同一性的去饱和酶；

iii)与SEQ ID NO:4所示的来自大果蝇的Δ9去饱和酶具有至少60％同一性的去饱和酶；

iv)与SEQ ID NO:18所示的来自斜纹夜蛾的Δ9去饱和酶具有至少60％同一性的Δ9去饱和酶；

以及与其具有至少60％同一性或相似性的其功能变体，与其具有诸如至少61％、诸如至少62％、诸如至少63％、诸如至少64％、诸如至少65％、诸如至少66％、诸如至少67％、诸如至少68％、诸如至少69％、诸如至少70％、诸如至少71％、诸如至少72％、诸如至少73％、诸如至少74％、诸如至少75％、诸如至少76％、诸如至少77％、诸如至少78％、诸如至少79％、诸如至少80％、诸如至少81％、诸如至少82％、诸如至少83％、诸如至少84％、诸如至少85％、诸如至少86％、诸如至少87％、诸如至少88％、诸如至少89％、诸如至少90％、诸如至少91％、诸如至少92％、诸如至少93％、诸如至少94％、诸如至少95％、诸如至少96％、诸如至少97％、诸如至少98％、诸如至少99％、诸如100％同一性或相似性。

已经发现这些去饱和酶当在酵母细胞中表达时优先催化C14底物的去饱和。

在这样的细胞中，去饱和十四烷酰基辅酶A与去饱和十六烷酰基辅酶A的比例是至少0.1，诸如至少0.2，诸如至少0.3，诸如至少0.4，诸如至少0.5，诸如至少0.75，诸如至少1，诸如至少2，诸如至少3，诸如至少4，诸如至少5，诸如至少6，诸如至少7，诸如至少8，诸如至少9，诸如至少10，诸如至少12.5，诸如至少15，或更高。

当所述异源去饱和酶与脂肪酰基辅酶A还原酶一起表达时，如下面详细描述的，所述酵母细胞生产去饱和脂肪醇。

在这样的实施方案中，衍生自去饱和十四烷酰基辅酶A的去饱和脂肪醇的滴度是至少1mg/L，诸如至少1.5mg/L，诸如至少5mg/L，诸如至少10mg/L，诸如至少25mg/L，诸如至少50mg/L，诸如至少100mg/L，诸如至少250mg/L，诸如至少500mg/L，诸如至少750mg/L，诸如至少1g/L，诸如至少2g/L，诸如至少3g/L，诸如至少4g/L，诸如至少5g/L，或更高。

在某些实施方案中，衍生自链长度为14的去饱和十四烷酰基辅酶A的去饱和脂肪醇的滴度是至少1mg/L，诸如至少1.5mg/L，诸如至少5mg/L，诸如至少10mg/L，诸如至少25mg/L，诸如至少50mg/L，诸如至少100mg/L，诸如至少250mg/L，诸如至少500mg/L，诸如至少750mg/L，诸如至少1g/L，诸如至少2g/L，诸如至少3g/L，诸如至少4g/L，诸如至少5g/L，或更高。

在某些实施方案中，产生的去饱和脂肪醇包含至少1％，诸如至少1.5％、诸如至少2％、诸如至少2.5％、诸如至少3％、诸如至少3.5％、诸如至少4％、诸如至少4.5％、诸如至少5％、诸如至少7.5％、诸如至少10％或更高的链长度为14的去饱和脂肪醇。在某些实施方案中，所述酵母细胞生产具有一定范围的碳链长度的去饱和脂肪醇，包括碳链长度为14的去饱和脂肪醇和碳链长度为16的去饱和脂肪醇。在这样的实施方案中，碳链长度为14的去饱和脂肪醇相对于碳链长度为14的去饱和脂肪醇和碳链长度为16的去饱和脂肪醇的总和的比例是至少5％，诸如至少7.5％，诸如至少10％，诸如至少15％，诸如至少20％，或更高。

如何测定给定的去饱和酶是否具有所需的特异性可以如本文所述进行。

脂肪酰基辅酶A还原酶

本文进一步提供了表达脂肪酰基辅酶A还原酶(FAR)的酵母细胞，所述酵母细胞能够将至少一部分(E12)-脂肪酰基辅酶A或(Z9,E12)-脂肪酰基辅酶A转化为对应的脂肪醇。例如，所述酵母细胞可能够将至少一部分(Z9,E12)-十四碳二烯酰基辅酶A转化为(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇。

术语“脂肪酰基辅酶A还原酶”和“FAR”在本文中可互换地使用。术语“异源FAR”表示不是由生物体(诸如酵母细胞)天然地表达的FAR。

FAR催化两步反应：

酰基辅酶A+2NADPH<＝>辅酶A+醇+2NADP(+)

其中在第一步中，脂肪酰基辅酶A被还原为脂肪醛，然后脂肪醛在第二步中被进一步还原成脂肪醇。脂肪酰基辅酶A可以是去饱和的或饱和的脂肪酰基辅酶A。

能够催化这样的反应的FAR是具有EC编号1.2.1.84的形成醇的脂肪酰基辅酶A还原酶。

在一个实施方案中，所述FAR对于选自地老虎属(Agrotis)、脐橙螟属(Amyelois)、蔽眼蝶属、熊蜂属(Bombus)、禾草螟属(Chilo)、小卷蛾属(Cydia)、棉铃虫属(Helicoverpa)、实夜蛾属(Heliothis)、花翅小卷蛾属(Lobesia)、秆野螟属(Ostrinia)、谷斑螟属(Plodia)、菜蛾属(Plutella)、灰翅夜蛾属(Spodoptera)、粉夜蛾属(Trichoplusia)、倭夜蛾属(Tyta)和巢蛾属的属的生物体而言是天然的，诸如小地老虎(Agrotis ipsilon)、黄地老虎(Agrotis segetum)、脐橙螟蛾(Amyelois transitella)、偏瞳蔽眼蝶(Bicyclus anynana)、红尾熊蜂(Bombus lapidarius)、二化螟(Chilosuppressalis)、苹果蠹蛾(Cydia pomonella)、棉铃虫(Helicoverpa armigera)、烟夜蛾(Helicoverpa assulta)、Heliothis subflexa、烟芽夜蛾(Heliothis virescens)、葡萄花翅小卷蛾(Lobesia botrana)、亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)、欧洲玉米螟(Ostrinianubilalis)、Ostrinia zag、Ostrinia zea、印度谷螟(Plodia interpunctella)、菜蛾(Plutella xylostella)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)、海灰翅夜蛾(Spodoptera littoralis)、斜纹夜蛾(Spodoptera litura)、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)、Tyta alba和Yponomeuta rorellus，特别是甜菜夜蛾、棉铃虫、斜纹夜蛾和印度谷螟。

在一个实施方案中，所述FAR选自FAR1(SEQ ID NO:20)、FAR16(SEQ ID NO:22)、FAR17(SEQ ID NO:24)、FAR19(SEQ ID NO:26)、FAR28(SEQ ID NO:28)、FAR32(SEQ ID NO:30)、FAR38(SEQ ID NO:32)、FAR44(SEQ ID NO:63)、FAR48(SEQ ID NO:65)、FAR49(SEQ IDNO:67)、FAR38(SEQ ID NO:32)、FAR4(SEQ ID NO:69)、FAR6(SEQ ID NO:71)、FAR8(SEQ IDNO:73)、FAR12(SEQ ID NO:75)、FAR11(SEQ ID NO:77)或FAR5(SEQ ID NO:79)、或与其具有至少60％同一性或相似性的其功能变体，与其具有诸如至少61％、诸如至少62％、诸如至少63％、诸如至少64％、诸如至少65％、诸如至少66％、诸如至少67％、诸如至少68％、诸如至少69％、诸如至少70％、诸如至少71％、诸如至少72％、诸如至少73％、诸如至少74％、诸如至少75％、诸如至少76％、诸如至少77％、诸如至少78％、诸如至少79％、诸如至少80％、诸如至少81％、诸如至少82％、诸如至少83％、诸如至少84％、诸如至少85％、诸如至少86％、诸如至少87％、诸如至少88％、诸如至少89％、诸如至少90％、诸如至少91％、诸如至少92％、诸如至少93％、诸如至少94％、诸如至少95％、诸如至少96％、诸如至少97％、诸如至少98％、诸如至少99％、诸如100％同一性或相似性。

在一个实施方案中，所述异源FAR是地老虎属FAR。在一个实施方案中，所述FAR是黄地老虎FAR，诸如在EQ ID NO:75所示的FAR(FAR12)。在某些实施方案中，所述FAR是地老虎属FAR的功能变体，或黄地老虎FAR的功能变体，诸如SEQ ID NO:75所示的FAR(FAR12)的功能变体，与其具有至少60％同一性。

在一个实施方案中，所述异源FAR是蔽眼蝶属(Bicyclus)FAR。在一个实施方案中，所述FAR是偏瞳蔽眼蝶FAR，诸如SEQ ID NO:77所示的FAR(FAR11)。在某些实施方案中，所述FAR是蔽眼蝶属FAR的功能变体，或偏瞳蔽眼蝶FAR的功能变体，诸如SEQ ID NO:77所示的FAR(FAR11)的功能变体，与其具有至少60％同一性。

在一个实施方案中，所述异源FAR是棉铃虫属FAR。在一个实施方案中，所述FAR是棉铃虫FAR，诸如SEQ ID NO:20所示的FAR(FAR1)。在某些实施方案中，所述FAR是棉铃虫属FAR的功能变体，或棉铃虫FAR的功能变体，诸如SEQ ID NO:20所示的FAR(FAR1)的功能变体，与其具有至少60％同一性。

在一个实施方案中，所述异源FAR是棉铃虫属FAR。在一个实施方案中，所述FAR是烟夜蛾FAR，诸如SEQ ID NO:71所示的FAR(FAR6)。在某些实施方案中，所述FAR是棉铃虫属FAR的功能变体，或烟夜蛾FAR的功能变体，诸如SEQ ID NO:71所示的FAR(FAR6)的功能变体，与其具有至少60％同一性。

在一个实施方案中，所述异源FAR是实夜蛾属FAR。在一个实施方案中，所述FAR是Heliothis subflexa FAR，诸如SEQ ID NO:69所示的FAR(FAR4)。在某些实施方案中，所述FAR是实夜蛾属FAR的功能变体,或Heliothis subflexa FAR的功能变体，诸如SEQ ID NO:69所示的FAR(FAR4)的功能变体，与其具有至少60％同一性。

在一个实施方案中，所述异源FAR是实夜蛾属FAR。在一个实施方案中，所述FAR是烟芽夜蛾FAR，诸如SEQ ID NO:79所示的FAR(FAR5)。在某些实施方案中，所述FAR是实夜蛾属FAR的功能变体，或烟芽夜蛾FAR的功能变体，诸如SEQ ID NO:79所示的FAR(FAR5)的功能变体，与其具有至少60％同一性。

在一个实施方案中，所述异源FAR是秆野螟属FAR。在一个实施方案中，所述FAR是亚洲玉米螟FAR，诸如SEQ ID NO:63所示的FAR(FAR44)。在某些实施方案中，所述FAR是秆野螟属FAR的功能变体，或亚洲玉米螟FAR的功能变体，诸如SEQ ID NO:63所示的FAR(FAR44)的功能变体，与其具有至少60％同一性。

在一个实施方案中，所述异源FAR是秆野螟属FAR。在一个实施方案中，所述FAR是Ostrinia zag FAR，诸如SEQ ID NO:65所示的FAR(FAR48)。在某些实施方案中，所述FAR是秆野螟属FAR的功能变体，或Ostrinia zag FAR的功能变体，诸如SEQ ID NO:65所示的FAR(FAR48)的功能变体，与其具有至少60％同一性。

在一个实施方案中，所述异源FAR是秆野螟属FAR。在一个实施方案中，所述FAR是Ostrinia zea FAR，诸如SEQ ID NO:67所示的FAR(FAR49)。在某些实施方案中，所述FAR是秆野螟属FAR的功能变体，或Ostrinia zea FAR的功能变体，诸如SEQ ID NO:67所示的FAR(FAR49)的功能变体，与其具有至少60％同一性。

在一个实施方案中，所述异源FAR是谷斑螟属FAR。在一个实施方案中，所述FAR是印度谷螟FAR，诸如SEQ ID NO:28(FAR28)或SEQ ID NO:30(FAR32)所示的FAR。在某些实施方案中，所述FAR是谷斑螟属FAR的功能变体，或印度谷螟FAR的功能变体，诸如SEQ ID NO:28(FAR28)或SEQ ID NO:30(FAR32)所示的FAR的功能变体，与其具有至少60％同一性。

在一个实施方案中，所述异源FAR是灰翅夜蛾属FAR。在一个实施方案中，所述FAR是甜菜夜蛾FAR，诸如SEQ ID NO:22(FAR16)或SEQ IDNO:24(FAR17)所示的FAR。在一个实施方案中，所述FAR是斜纹夜蛾FAR，诸如SEQ ID NO:26所示的FAR(FAR19)。在某些实施方案中，所述FAR是灰翅夜蛾属FAR的功能变体，甜菜夜蛾FAR的功能变体，斜纹夜蛾FAR的功能变体，SEQ ID NO:22(FAR16)、SEQ ID NO:24(FAR17)所示的FAR的功能变体，或SEQ ID NO:26所示的FAR(FAR19)的功能变体，与其具有至少60％同一性。

在一个实施方案中，所述异源FAR是粉夜蛾属FAR。在一个实施方案中，所述FAR是粉纹夜蛾FAR，诸如SEQ ID NO:32所示的FAR(FAR38)。在某些实施方案中，所述FAR是粉夜蛾属FAR的功能变体，或粉纹夜蛾FAR的功能变体，诸如SEQ ID NO:32所示的FAR(FAR38)的功能变体，与其具有至少60％同一性。

在一个实施方案中，所述异源FAR是巢蛾属(Yponomeuta)FAR。在一个实施方案中，所述FAR是Yponomeuta rorellus FAR，诸如SEQ ID NO:73所示的FAR(FAR8)。在某些实施方案中，所述FAR是巢蛾属FAR的功能变体，或Yponomeuta rorellus FAR的功能变体，诸如SEQID NO:73所示的FAR(FAR8)的功能变体，与其具有至少60％同一性。

本发明的细胞可以表达至少一种异源FAR。在某些实施方案中，所述细胞表达一种异源FAR。但是，可能需要表达几种异源FAR，诸如至少两种异源FAR，它们可以是相同的或不同的。可替换地，可能需要表达编码至少一种异源FAR的核酸的几个拷贝，诸如至少两个拷贝、至少三个拷贝或更多。在其它实施方案中，所述细胞表达至少两种异源FAR，例如三种异源FAR。

例如，所述细胞可以表达FAR1或其变体的两个拷贝；或FAR1的一个拷贝和FAR16的一个拷贝；或FAR1的两个拷贝、FAR16的一个拷贝和FAR19的一个拷贝。

去饱和酶和FAR

任何上述FAR可以与任何去饱和酶、特别是本文描述的任何去饱和酶一起表达。

在某些实施方案中，所述细胞表达：

-印度谷螟Δ12去饱和酶，例如SEQ ID NO:2所示的Pid12，和

-选自以下的其它去饱和酶：果蝇属去饱和酶，诸如大果蝇去饱和酶，例如SEQ IDNO:4所示的Desat61，或诸如黑腹果蝇去饱和酶，例如SEQ ID NO:6所示的Desat24，或诸如Drosophila grimshawi去饱和酶，例如SEQ ID NO:8所示的Desat59，或诸如Drosophilayakuba去饱和酶，例如SEQ ID NO:57所示的Desat56，或诸如嗜凤梨果蝇去饱和酶，例如SEQID NO:59所示的Desat60；脐橙螟属去饱和酶，诸如脐橙螟蛾去饱和酶，例如SEQ ID NO:10所示的Desat17或SEQ ID NO:12所示的Desat18；色卷蛾属去饱和酶，诸如Choristoneuraparallela去饱和酶，例如SEQ ID NO:61所示的Desat74；灰翅夜蛾属去饱和酶，诸如斜纹夜蛾去饱和酶，例如SEQ ID NO:18所示的Desat26；酵母属去饱和酶，诸如酿酒酵母去饱和酶，例如在SEQ ID NO:14所示的Desat42；耶氏酵母属去饱和酶，诸如解脂耶氏酵母去饱和酶，例如SEQ ID NO:16所示的Desat69；和/或

-选自以下的FAR：地老虎属FAR，诸如黄地老虎FAR，例如SEQ ID NO:75所示的FAR12；蔽眼蝶属FAR，诸如偏瞳蔽眼蝶FAR，例如SEQ ID NO:77所示的FAR11；棉铃虫属FAR，诸如棉铃虫FAR或烟夜蛾FAR，例如SEQ ID NO:20所示的FAR1或SEQ ID NO:71所示的FAR6；实夜蛾属FAR，诸如Heliothis subflexa FAR或烟芽夜蛾FAR，例如SEQ ID NO:69所示的FAR4或SEQ ID NO:79所示的FAR5；秆野螟属FAR，诸如亚洲玉米螟FAR、Ostrinia zag FAR或Ostrinia zea FAR，例如SEQ ID NO:63所示的FAR44、SEQ ID NO:65所示的FAR48或SEQ IDNO:67所示的FAR49；谷斑螟属FAR，诸如印度谷螟FAR，例如SEQ ID NO:28所示的FAR28或SEQID NO:30所示的FAR32；灰翅夜蛾属FAR，诸如甜菜夜蛾FAR，例如SEQ ID NO:22所示的FAR16或SEQ ID NO:24所示的FAR17，或诸如斜纹夜蛾FAR，例如SEQ ID NO:26所示的FAR19；粉夜蛾属FAR，诸如粉纹夜蛾FAR，例如SEQ ID NO:32所示的FAR38；巢蛾属FAR，诸如Yponomeutarorellus FAR，例如SEQ ID NO:73所示的FAR8；

或与其具有至少60％同一性或相似性的其功能变体。

在某些实施方案中，所述细胞表达：

-干果斑螟Δ12去饱和酶，例如SEQ ID NO:55所示的EcauDes12，和

-选自以下的其它去饱和酶：果蝇属去饱和酶，诸如大果蝇去饱和酶，例如SEQ IDNO:4所示的Desat61，或诸如黑腹果蝇去饱和酶，例如SEQ ID NO:6所示的Desat24，或诸如Drosophila grimshawi去饱和酶，例如SEQ ID NO:8所示的Desat59，或诸如Drosophilayakuba去饱和酶，例如SEQ ID NO:57所示的Desat56，或诸如嗜凤梨果蝇去饱和酶，例如SEQID NO:59所示的Desat60；脐橙螟属去饱和酶，诸如脐橙螟蛾去饱和酶，例如SEQ ID NO:10所示的Desat17或SEQ ID NO:12所示的Desat18；色卷蛾属去饱和酶，诸如Choristoneuraparallela去饱和酶，例如SEQ ID NO:61所示的Desat74；灰翅夜蛾属去饱和酶，诸如斜纹夜蛾去饱和酶，例如SEQ ID NO:18所示的Desat26；酵母属去饱和酶，诸如酿酒酵母去饱和酶，例如SEQ ID NO:14所示的Desat42；耶氏酵母属去饱和酶，诸如解脂耶氏酵母去饱和酶，例如SEQ ID NO:16所示的Desat69；和/或

-选自以下的FAR：地老虎属FAR，诸如黄地老虎FAR，例如SEQ ID NO:75所示的FAR12；蔽眼蝶属FAR，诸如偏瞳蔽眼蝶FAR，例如SEQ ID NO:77所示的FAR11；棉铃虫属FAR，诸如棉铃虫FAR或烟夜蛾FAR，例如SEQ ID NO:20所示的FAR1或SEQ ID NO:71所示的FAR6；实夜蛾属FAR，诸如Heliothis subflexa FAR或烟芽夜蛾FAR，例如SEQ ID NO:69所示的FAR4或SEQ ID NO:79所示的FAR5；秆野螟属FAR，诸如亚洲玉米螟FAR、Ostrinia zag FAR或Ostrinia zea FAR，例如在SEQ ID NO:63中所示的FAR44、在SEQ ID NO:65中所示的FAR48或在SEQ ID NO:67中所示的FAR49；谷斑螟属FAR，诸如印度谷螟FAR，例如SEQ ID NO:28所示的FAR28或SEQ ID NO:30所示的FAR32；灰翅夜蛾属FAR，诸如甜菜夜蛾FAR，例如SEQ IDNO:22所示的FAR16或SEQ ID NO:24所示的FAR17，或诸如斜纹夜蛾FAR，例如SEQ ID NO:26所示的FAR19；粉夜蛾属FAR，诸如粉纹夜蛾FAR，例如SEQ ID NO:32所示的FAR38；巢蛾属FAR，诸如Yponomeuta rorellus FAR，例如SEQ ID NO:73所示的FAR8；

或与其具有至少60％同一性或相似性的其功能变体。

在某些实施方案中，所述细胞表达：

-地中海粉斑螟Δ12去饱和酶，例如SEQ ID NO:85所示的Eku_d12，和

或与其具有至少60％同一性或相似性的其功能变体。

在某些实施方案中，所述细胞表达：

-烟草粉螟Δ12去饱和酶，例如SEQ ID NO:87所示的Ee_d12，和

-选自以下的其它去饱和酶：果蝇属去饱和酶，诸如大果蝇去饱和酶，例如SEQ IDNO:4所示的Desat61，或诸如黑腹果蝇去饱和酶，例如SEQ ID NO:6所示的Desat24，或诸如Drosophila grimshawi去饱和酶，例如SEQ ID NO:8所示的Desat59，或诸如Drosophilayakuba去饱和酶，例如SEQ ID NO:57所示的Desat56，或诸如嗜凤梨果蝇去饱和酶，例如SEQID NO:59所示的Desat60；脐橙螟属去饱和酶，诸如脐橙螟蛾去饱和酶，例如SEQ ID NO:10所示的Desat17或SEQ ID NO:12所示的Desat18；色卷蛾属去饱和酶，诸如Choristoneuraparallela去饱和酶，例如SEQ ID NO:61所示的Desat74；灰翅夜蛾属去饱和酶，诸如斜纹夜蛾去饱和酶，例如SEQ ID NO:1所示的Desat26；酵母属去饱和酶，诸如酿酒酵母去饱和酶，例如在SEQ ID NO:14所示的Desat42；耶氏酵母属去饱和酶，诸如解脂耶氏酵母去饱和酶，例如SEQ ID NO:16所示的Desat69；和/或

或与其具有至少60％同一性或相似性的其功能变体。

应当理解，与上述给定的FAR或去饱和酶具有至少60％同一性或相似性的FAR或去饱和酶的功能变体可以与所述FAR或所述去饱和酶具有至少61％、诸如至少62％、诸如至少63％、诸如至少64％、诸如至少65％、诸如至少66％、诸如至少67％、诸如至少68％、诸如至少69％、诸如至少70％、诸如至少71％、诸如至少72％、诸如至少73％、诸如至少74％、诸如至少75％、诸如至少76％、诸如至少77％、诸如至少78％、诸如至少79％、诸如至少80％、诸如至少81％、诸如至少82％、诸如至少83％、诸如至少84％、诸如至少85％、诸如至少86％、诸如至少87％、诸如至少88％、诸如至少89％、诸如至少90％、诸如至少91％、诸如至少92％、诸如至少93％、诸如至少94％、诸如至少95％、诸如至少96％、诸如至少97％、诸如至少98％、诸如至少99％、诸如100％同一性或相似性。

表达所述Δ12去饱和酶、其它去饱和酶和FAR的酵母细胞能够生产(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇。

酵母细胞

本发明提供了一种酵母细胞，其已经被修饰或工程化以生产去饱和化合物，特别是在12位具有至少一个双键的去饱和脂肪酰基辅酶A和去饱和脂肪醇。这些中的一些是信息素的组分。因此，本文公开的酵母细胞为环境友好的信息素生产提供了改进的平台。

因此，本文提供了能够生产具有n’个双键的去饱和脂肪酰基辅酶A的酵母细胞，其中所述双键中的至少一个位于12位，

其中所述酵母细胞表达异源Δ12去饱和酶，所述去饱和酶能够在饱和或去饱和脂肪酰基辅酶A中，优选在碳链长度至少为13且具有n个双键的去饱和脂肪酰基辅酶A中的12位引入双键，

其中n和n’是整数，

其中0≤n≤3且其中1≤n’≤4。

在优选的实施方案中，所述饱和或去饱和脂肪酰基辅酶A用作底物，且具有n’个双键的去饱和脂肪酰基辅酶A具有相同的碳链长度。

所述异源Δ12去饱和酶可以如在本文“Δ12去饱和酶”一节中所公开。例如，所述Δ12去饱和酶可以是谷斑螟属Δ12去饱和酶，诸如印度谷螟Δ12去饱和酶，诸如SEQ IDNO:2所示的Δ12去饱和酶(Pid12)，或与其具有至少60％相似性或同一性的其功能变体。例如，所述Δ12去饱和酶可以是果斑螟属Δ12去饱和酶，诸如干果斑螟Δ12去饱和酶，诸如SEQ ID NO:55所示的Δ12去饱和酶(EcauDes12)，或与其具有至少60％相似性或同一性的其功能变体。例如，所述Δ12去饱和酶可以是粉斑螟属Δ12去饱和酶，诸如地中海粉斑螟Δ12去饱和酶或烟草粉螟Δ12去饱和酶，诸如SEQ ID NO:85(Eku_d12)或SEQ ID NO:87(Ee_d12)所示的Δ12去饱和酶，或与其具有至少60％相似性或同一性的其功能变体。

在一个实施方案中，本文中公开的酵母细胞表达可以如在本文“其它去饱和酶”一节中所公开的其它去饱和酶。例如，所述其它去饱和酶可以是能够在饱和或去饱和脂肪酸中在除了12位以外的位置处引入双键的去饱和酶。在某些实施方案中，所述去饱和酶是果蝇属去饱和酶，诸如大果蝇去饱和酶，例如SEQ ID NO:4所示的Desat61，或诸如黑腹果蝇去饱和酶，例如SEQ ID NO:6所示的Desat24，或诸如Drosophila grimshawi去饱和酶，例如SEQ ID NO:8所示的Desat59，或诸如Drosophila yakuba去饱和酶，例如SEQ ID NO:57所示的Desat56，或诸如嗜凤梨果蝇去饱和酶，例如SEQ ID NO:59所示的Desat60；脐橙螟属去饱和酶，诸如脐橙螟蛾去饱和酶，例如SEQ ID NO:10所示的Desat17或SEQ ID NO:12所示的Desat18；色卷蛾属去饱和酶，诸如Choristoneura parallela去饱和酶，例如SEQ ID NO:61所示的Desat74；灰翅夜蛾属去饱和酶，诸如斜纹夜蛾去饱和酶，例如SEQ ID NO:18所示的Desat26；酵母属去饱和酶，诸如酿酒酵母去饱和酶，例如SEQ ID NO:14所示的Desat42；耶氏酵母属去饱和酶，诸如解脂耶氏酵母去饱和酶，例如SEQ ID NO:16所示的Desat69，或与其具有至少60％相似性或同一性的其功能变体。

表达异源Δ12去饱和酶和其它去饱和酶的酵母细胞能够生产在12位具有双键且在一个其它位置处具有双键的双去饱和脂肪酰基辅酶A。在一个实施方案中，所述表达异源Δ12去饱和酶和其它异源去饱和酶的酵母细胞能够生产在12位具有双键且在9位具有双键的脂肪酰基辅酶A，例如(Z9,E12)-十四碳二烯酰基辅酶A。

在一个实施方案中，本文中公开的酵母细胞进一步表达可以如在本文“脂肪酰基辅酶A还原酶”一节中所公开的FAR。例如，所述FAR可以是地老虎属FAR，诸如黄地老虎FAR，例如SEQ ID NO:75所示的FAR12；蔽眼蝶属FAR，诸如偏瞳蔽眼蝶FAR，例如SEQ ID NO:77所示的FAR11；棉铃虫属FAR，诸如棉铃虫FAR或烟夜蛾FAR，例如SEQ ID NO:20所示的FAR1或SEQ ID NO:71所示的FAR6；实夜蛾属FAR，诸如Heliothis subflexa FAR或烟芽夜蛾FAR，例如SEQ ID NO:69所示的FAR4或SEQ ID NO:79所示的FAR5；秆野螟属FAR，诸如亚洲玉米螟FAR、Ostrinia zag FAR或Ostrinia zea FAR，例如SEQ ID NO:63所示的FAR44、SEQ ID NO:65所示的FAR48或SEQ ID NO:67所示的FAR49；谷斑螟属FAR，诸如印度谷螟FAR，例如SEQ IDNO:28所示的FAR28或SEQ ID NO:30所示的FAR32；灰翅夜蛾属FAR，诸如甜菜夜蛾FAR，例如SEQ ID NO:22所示的FAR16或SEQ ID NO:24所示的FAR17，或诸如斜纹夜蛾FAR，例如SEQ IDNO:26所示的FAR19；粉夜蛾属FAR，诸如粉纹夜蛾FAR，例如SEQ ID NO:32所示的FAR38；巢蛾属FAR，诸如Yponomeuta rorellus FAR，例如SEQ ID NO:73所示的FAR8；或与其具有至少60％相似性或同一性的其功能变体。

表达异源Δ12去饱和酶、其它去饱和酶和FAR的酵母细胞能够生产双去饱和脂肪醇，例如(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇。换而言之，所述表达异源Δ12去饱和酶、其它去饱和酶和FAR的酵母细胞能够通过FAR的作用将由异源Δ12去饱和酶和其它异源去饱和酶产生的至少一部分(Z9,E12)-十四碳二烯酰基辅酶A转化为(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇。

在某些实施方案中，编码异源Δ12去饱和酶、其它异源去饱和酶或FAR的基因已经针对所述酵母细胞进行了密码子优化。

在一个实施方案中，编码异源Δ12去饱和酶、其它异源去饱和酶或FAR的基因中的至少一个以高拷贝数存在于所述酵母细胞中。

在一个实施方案中，编码异源Δ12去饱和酶、其它异源去饱和酶或FAR的基因中的至少一个是在诱导型启动子的控制下。

在一个实施方案中，编码异源Δ12去饱和酶、其它异源去饱和酶或FAR的基因中的至少一个各自独立地被包含在细胞的基因组内或酵母细胞内包含的载体内。

在一个实施方案中，所述酵母细胞属于选自酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、耶氏酵母属(Yarrowia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、假丝酵母属(Candida)、红酵母属(Rhodotorula)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、隐球菌属(Cryptococcus)、丝孢酵母属(Trichosporon)和油脂酵母属(Lipomyces)的属，任选地其中所述酵母细胞属于选自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、布拉氏酵母(Saccharomyces boulardi)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、马克思克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、浅白隐球菌(Cryptococcus albidus)、产油油脂酵母(Lipomyces lipofera)、斯氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)、圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)、粘红酵母(Rhodotorula glutinis)、出芽丝孢酵母(Trichosporon pullulan)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)的种，优选地所述酵母细胞是解脂耶氏酵母细胞或酿酒酵母细胞。

在某些实施方案中，所述酵母细胞包含如在“核酸”一节中所述的核酸或核酸系统。

根据本发明的酵母细胞可以被包含在发酵液、发酵系统和/或催化系统中。换而言之，发酵液、发酵系统和/或催化系统可以包含根据本发明的酵母细胞。

在一个实施方案中，所述酵母细胞进一步表达异源NAD(P)H细胞色素b5氧化还原酶(Ncb5or)。术语“NAD(P)H细胞色素b5氧化还原酶”和“Ncb5or”在本文中可互换地使用。术语“异源Ncb5or”表示不是由生物体(诸如细胞)天然表达的Ncb5or。

Ncb5or是作用于NADH或NADPH的氧化还原酶，以血红素蛋白作为受体。它含有与细胞色素b5、细胞色素b5还原酶和CHORD-SGT1相似的功能结构域(Deng，等人,2010)。Ncb5or催化以下反应：

2Fe³⁺+NAD(P)H<＝>2Fe²⁺+H++NAD(P)+

能够催化这样的反应的Ncb5or具有EC编号1.6.2.2。

在表达去饱和酶和/或FAR的细胞中表达一种或多种Ncb5or对去饱和酶和/或FAR的活性具有积极影响，因为这引起去饱和脂肪酰基辅酶A和/或去饱和脂肪醇的滴度增加。因此，当在相同条件下培养时，与表达相同去饱和酶和/或FAR但不表达异源Ncb5or的酵母细胞相比，表达去饱和酶和/或FAR和一种或多种Ncb5or的酵母细胞能够以更高滴度生产所述化合物。

所述Ncb5or可以对于植物、昆虫或哺乳动物(诸如智人)而言是天然的。在一个实施方案中，所述Ncb5or对于昆虫而言是天然的，诸如地老虎属(Agrotis)、脐橙螟属、Aphantopus、灯蛾属(Arctia)、蔽眼蝶属(Bicyclus)、熊蜂属(Bombus)、家蚕属(Bombyx)、禾草螟属(Chilo)、小卷蛾属(Cydia)、Danaus、果蝇属(Drosophila)、Eumeta、Galleria、棉铃虫属(Helicoverpa)、实夜蛾属(Heliothis)、Hyposmocoma、小粉蝶属(Leptidea)、花翅小卷蛾属(Lobesia)、Manduca、Operophtera、秆野螟属(Ostrinia)、Papilio、Papilio、Papilio、菜粉蝶属(Pieris)、Plutella、灰翅夜蛾属(Spodoptera)、粉夜蛾属(Trichoplusia)和红蛱蝶属(Vanessa)的昆虫。在一个实施方案中，所述Ncb5or对于选自脐橙螟蛾(Amyeloistransitella)、黄地老虎(Agrotis segetum)、Aphantopus hyperantus、车前灯蛾(Arctiaplantaginis)、偏瞳蔽眼蝶(Bicyclus anynana)、欧洲熊蜂(Bombus terrestris)、野桑蚕(Bombyx mandarina)、家蚕(Bombyx mori)、二化螟(Chilo suppressalis)、苹果蠹蛾(Cydia pomonella)、黑脉金斑蝶(Danaus plexippus)、Drosophila grimshawi、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、大避债蛾(Eumeta japonica)、大蜡螟(Galleriamellonella)、棉铃虫(Helicoverpa armigera)、烟芽夜蛾(Heliothis virescens)、Hyposmocoma kahamanoa、条纹小粉蝶(Leptidea sinapis)、葡萄花翅小卷蛾(Lobesiabotrana)、烟草天蛾(Manduca sexta)、冬尺蠖蛾(Operophtera brumata)、亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)、金凤蝶(Papilio machaon)、玉带凤蝶(Papilio polytes)、柑橘凤蝶(Papilio xuthus)、菜粉蝶(Pieris rapae)、菜蛾(Plutella xylostella)、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)、斜纹夜蛾(Spodoptera litura)、粉纹夜蛾(Trichoplusiani)和特美红蛱蝶(Vanessa tameamea)的昆虫而言是天然的。

在一个实施方案中，所述Ncb5or选自同一申请人在2022年5月10日提交的标题为“Improved methods and cells for increasing enzyme activity and production ofinsect pheromones”的专利申请PCT/EP2022/062641中在“序列概述(Sequenceoverview)”一节中的表“Ncb5ors”中所示的Ncb5or。

因而，在一个实施方案中，所述Ncb5or选自SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ IDNO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89和SEQ ID NO:90所示的Ncb5or，或与其具有至少70％同一性或相似性、与其具有诸如至少75％同一性、诸如至少80％同一性、诸如至少85％同一性、诸如至少90％同一性、诸如至少95％同一性或相似性的功能变体。

在某些实施方案中，所述酵母细胞具有一种或多种蛋白的降低的活性，如在WO2018/109163和欧洲专利3555268中所公开，尤其是在标题为“Hfd1、Hfd4、Pex10、Fao1、GPAT或其同源物的降低的活性”一节中所公开的。例如，所述酵母细胞可能具有引起Pex10、Hfd1、Hfd4、Fao1和/或GPAT的活性降低(即下调)的突变。优选地，所述酵母细胞具有至少一种突变，其引起至少Fao1以及Hfd1、Hfd4、Pex10和/或GPAT中的一种或多种的活性降低。这样的突变可以增加表达异源去饱和酶和异源脂肪酰基辅酶A还原酶的酵母细胞中去饱和脂肪醇和/或去饱和脂肪醇乙酸酯的生产。

因而，在一个实施方案中，所述酵母细胞具有引起Hfd1、Hfd4、GPAT、Fao1、Pex10中的一种或多种的活性的部分或全部丧失的突变，诸如具有引起Fao1以及Hfd1、Hfd4、Pex10或GPAT中的一种或多种的活性的部分或全部丧失的至少一种突变。

在一个实施方案中，所述酵母细胞具有在PEX10(登录号：XP_501311.1)以及HFD1(登录号：XP_505802.1)、HFD4(登录号：XP_500380.1X)、FAO1(登录号：XP_500864.1)和/或GPAT(登录号：XP_501275.1)中的至少一种或与其具有至少60％同一性的其同源物中的突变。

在一个实施方案中，所述酵母细胞具有在FAO1(登录号：XP_500864.1)以及HFD1(登录号：XP_505802.1)、HFD4(登录号：XP_500380.1X)、PEX10(登录号：XP_501311.1)和/或GPAT(登录号：XP_501275.1)中的至少一种或与其具有至少60％同一性的其同源物中的突变。

在一个实施方案中，HFD1(登录号：XP_505802.1)、HFD4(登录号：XP_500380.1X)、PEX10(登录号：XP_501311.1)和/或FAO1(登录号：XP_500864.1)或与其具有至少60％同一性的其同源物被删除或突变，从而引起Hfd1、Hfd4、Pex10和/或Fao1的活性的部分丧失或全部丧失，和/或GPAT或与其具有至少60％同一性的其同源物被突变，从而引起GPAT的活性降低。

在一个实施方案中，所述酵母细胞包含在至少一种POX基因中的突变，诸如选自由POX1(登录号：O74934.1)、POX2(登录号：XP_505264.1)、POX3(登录号：XP_503244.1)、POX4(登录号：XP_504475.1)、POX5(登录号：XP_502199.1)和POX6(登录号：XP_503632.1)组成的组中的POX基因。

在一个实施方案中，所述酵母细胞包含在POX1(登录号：O74934.1)、POX2(登录号：XP_505264.1)、POX3(登录号：XP_503244.1)、POX4(登录号：XP_504475.1)、POX5(登录号：XP_502199.1)和/或POX6(登录号：XP_503632.1)或与其具有至少60％同一性的其同源物中的删除或突变，从而引起Pox1、Pox2、Pox3、Pox4、Pox5和/或Pox6的活性的部分丧失或全部丧失。

所述酵母细胞可进一步被工程化以表达任何类型的蛋白。这样的其它蛋白的表达可以提高本文公开的化合物的产量，诸如滴度。在一个实施方案中，所述酵母细胞表达：

i)异源细胞色素b5；

ii)异源细胞色素b5还原酶；

iii)血红蛋白；

iv)异源硫酯酶基因；和/或

v)脂肪酰基合酶和硫酯酶的融合蛋白。

所述酵母细胞的天然基因也可以被工程化。在一个实施方案中，所述酵母细胞具有以下的灭活或修饰：

i)引起活性全部或部分丧失的天然延长酶；

ii)引起活性全部或部分丧失的硫酯酶；和/或

iii)天然脂肪醛脱氢酶、脂肪醇氧化酶、过氧化物酶体生物发生因子和/或脂肪酰基合酶的活性。

在某些实施方案中，所述酵母细胞进一步被修饰，使得链长为14的脂肪酰基的可用性增加或进一步增加。例如，可以对所述脂肪酸合酶复合物进行工程化，从而增加十四烷酰基辅酶A的形成。脂肪酸合酶复合物(EC 2.3.1.86)由两个亚基Fas1(β亚基)和Fas2(α亚基)组成。α亚基包含酮脂酰基合酶结构域(“结合槽”)，推测其参与决定合成的脂肪酸的长度。

因此，为了引导代谢流产生碳链长度为14(C14)的去饱和脂肪醇、乙酸酯或醛，酵母细胞可以进一步表达具有经修饰的酮合酶结构域的脂肪酰基合酶变体。不受理论的约束，假设修饰的酮合酶结构域产生经修饰的结合槽(binding pocket)，其因此更容易容纳中等长度的底物诸如C14底物，从而产生更高比例的C14产物。

在一个实施方案中，所述酵母细胞是本文描述的酵母细胞，其中所述细胞进一步表达经修饰的脂肪酸合酶复合物。在一个实施方案中，通过突变编码所述复合物的α亚基的基因来修饰所述脂肪酸合酶复合物。在某些实施方案中，所述突变位于编码FAS2的基因中。在一个实施方案中，所述酵母细胞是解脂耶氏酵母酵母细胞，并且所述突变可以引起解脂耶氏酵母FAS2的残基1220(I1220)、残基1217(M1217)或残基1226(M1226)中的一个或多个的修饰，从而产生变体FAS2。技术人员将知道如何设计这样的突变。

优选地，所述突变产生I1220F变体、I1220W变体、I1220Y变体或I1220H变体。在具体实施方案中，所述突变产生I1220F变体。在某些实施方案中，所述突变产生M1217F变体、M1217W变体、M1217Y变体或M1217H变体。在其它实施方案中，所述突变产生M1226F变体、M1226W变体、M1226Y变体或M1226H变体。也考虑具有多于一种上述突变的酵母细胞，诸如在残基I1220、M1217或M1226处的两种突变或三种突变。

由所述细胞产生的脂肪酰基辅酶A可以进一步被细胞转化为相应的脂肪酸。所述脂肪酸可以是游离脂肪酸或三酰甘油酯(脂质)的一部分。

在一个实施方案中，所述酵母细胞能够以至少0.005mg/L，诸如至少0.01mg/L，诸如至少0.02mg/L，诸如至少0.03mg/L，诸如至少0.05mg/L，诸如至少0.06mg/L，诸如至少0.075mg/L，诸如至少0.1mg/L，诸如至少0.2mg/L，诸如至少0.3mg/L，诸如至少0.4mg/L，诸如至少0.5mg/L，诸如至少0.6mg/L，诸如至少0.7mg/L，诸如至少0.8mg/L，诸如至少0.9mg/L，诸如至少1mg/L，诸如至少2mg/L，诸如至少3mg/L，诸如至少4mg/L，诸如至少5mg/L，诸如至少10mg/L，诸如至少15mg/L，诸如至少20mg/L，诸如至少25mg/L，诸如至少30mg/L，诸如至少35mg/L，诸如至少50mg/L，诸如至少60mg/L，诸如至少70mg/L，诸如至少80mg/L，诸如至少90mg/L，诸如至少100mg/L，诸如至少200mg/L，诸如至少300mg/L，诸如至少400mg/L，诸如至少500mg/L，诸如至少750mg/L，诸如至少1g/L，诸如至少2g/L，诸如至少5g/L，诸如至少10g/L，诸如至少20g/L，诸如至少50g/L，诸如至少100g/L或更高的滴度生产E12-脂肪酸和/或(Z9,E12)-十四碳二烯酸。

在一个实施方案中，所述酵母细胞能够以至少0.005mg/L，诸如至少0.01mg/L，诸如至少0.02mg/L，诸如至少0.03mg/L，诸如至少0.05mg/L，诸如至少0.06mg/L，诸如至少0.075mg/L，诸如至少0.1mg/L，诸如至少0.2mg/L，诸如至少0.3mg/L，诸如至少0.4mg/L，诸如至少0.5mg/L，诸如至少0.6mg/L，诸如至少0.7mg/L，诸如至少0.8mg/L，诸如至少0.9mg/L，诸如至少1mg/L，诸如至少2mg/L，诸如至少3mg/L，诸如至少4mg/L，诸如至少5mg/L，诸如至少10mg/L，诸如至少15mg/L，诸如至少20mg/L，诸如至少25mg/L，诸如至少30mg/L，诸如至少35mg/L，诸如至少50mg/L，诸如至少60mg/L，诸如至少70mg/L，诸如至少80mg/L，诸如至少90mg/L，诸如至少100mg/L，诸如至少200mg/L，诸如至少300mg/L，诸如至少400mg/L，诸如至少500mg/L，诸如至少750mg/L，诸如至少1g/L，诸如至少2g/L，诸如至少5g/L，诸如至少10g/L，诸如至少20g/L，诸如至少50g/L，诸如至少100g/L或更高的滴度生产E12-脂肪醇和/或(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇。

本文公开的酵母细胞表达异源Δ12去饱和酶，任选地表达其它异源去饱和酶，并且进一步任选地表达异源FAR，其能够生产碳链长度为至少13且在12位具有双键以及任选在12位以外的位置处具有其它双键的去饱和脂肪酰基辅酶A和/或去饱和脂肪醇。

因而，本文提供了根据本文提出的方法可得到的去饱和脂肪酰基辅酶A和去饱和脂肪醇。

本文还提供了能够生产根据本发明的信息素化合物的酵母细胞，其中所述酵母细胞表达异源Δ12脂肪酰基辅酶A去饱和酶。

在某些实施方案中，所述酵母细胞表达其它异源去饱和酶。

在某些实施方案中，所述酵母细胞进一步表达至少一种形成醇的脂肪酰基辅酶A还原酶(FAR)。

本文进一步提供了根据本文提出的方法可得到的去饱和脂肪酰基辅酶A和/或去饱和脂肪醇的用途。这样的化合物可以用于例如监测害虫的存在或破坏害虫的存在；例如，它们可以配制为信息素组合物。

去饱和脂肪酰基辅酶A

在一个实施方案中，所述酵母细胞表达异源Δ12去饱和酶和任选的其它异源去饱和酶，所述酵母细胞能够生产在12位具有双键以及任选在12位以外的位置处具有其它双键的去饱和脂肪酰基辅酶A。

因而，本文中公开的酵母细胞能够生产具有n’个双键的去饱和脂肪酰基辅酶A，其中所述双键中的至少一个位于12位，

其中所述酵母细胞表达异源Δ12去饱和酶，所述去饱和酶能够在碳链长度为至少13且具有n个双键的饱和或去饱和脂肪酰基辅酶A，优选去饱和脂肪酰基辅酶A的12位引入双键，

其中n和n’是整数，

其中0≤n≤3且其中1≤n’≤4。

在优选的实施方案中，所述饱和或去饱和脂肪酰基辅酶A用作底物且所述具有n’个双键的去饱和脂肪酰基辅酶A具有相同的碳链长度。

在一个实施方案中，所述酵母细胞表达本文中在“其它去饱和酶”一节中公开的其它去饱和酶。

在一个实施方案中，n＝0。换而言之，所述酵母细胞能够在不具有双键的饱和脂肪酰基辅酶A中引入至多4个双键，诸如1、2、3或4个双键。因而，所述酵母细胞能够生产具有1、2、3或4个双键的去饱和脂肪酰基辅酶A。在优选的实施方案中，所述酵母细胞能够在十四烷酰基辅酶A中引入双键，从而将所述十四烷酰基辅酶A转化为(E12)-十四烯酰基辅酶A。

在一个实施方案中，n＝1。换而言之，所述酵母能够在除了12位外的位置处，诸如8、9、10、11、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22位具有一个双键的去饱和脂肪酰基辅酶A中引入至多3个双键，诸如1、2或3个双键。因而，所述酵母细胞能够生产具有2、3或4个双键的去饱和脂肪酰基辅酶A，优选具有2个双键的去饱和脂肪酰基辅酶A。在一个实施方案中，所述酵母细胞能在9位具有双键的去饱和脂肪酰基辅酶A中引入双键。在优选的实施方案中，所述酵母细胞能够在(Z9)-十四烯酰基辅酶A中引入双键，从而将所述(Z9)-十四烯酰基辅酶A转化为(Z9,E12)-十四碳二烯酰基辅酶A。

在一个实施方案中，n＝2。换而言之，所述酵母细胞能够在除了12位外的位置处具有两个双键(诸如在8、9、10、11、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22位的至少两个位置的双键)的去饱和脂肪酰基辅酶A中引入至多2个双键，诸如1或2个双键。因而，所述酵母细胞能够生产具有3或4个双键的去饱和脂肪酰基辅酶A。

在一个实施方案中，n＝3。换而言之，所述酵母能够在除了12位外的位置处具有三个双键(诸如在8、9、10、11、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22位的至少三个位置的双键)的去饱和脂肪酰基辅酶A中引入一个双键。因而，所述酵母细胞能够生产具有4个双键的去饱和脂肪酰基辅酶A。

在一个实施方案中，n’＝1且n＝0。换而言之，所述酵母细胞能够将不具有双键的饱和脂肪酰基辅酶A转化为在12位具有一个双键的去饱和脂肪酰基辅酶A。

在一个实施方案中，n’＝2且n＝0。换而言之，所述酵母细胞能够将饱和脂肪酰基辅酶A转化为具有两个双键的去饱和脂肪酰基辅酶A，其中一个双键位于12位。

在一个实施方案中，n’＝3且n＝0。换而言之，所述酵母细胞能够将饱和脂肪酰基辅酶A转化为具有三个双键的去饱和脂肪酰基辅酶A，其中一个双键位于12位。

在一个实施方案中，n’＝4且n＝0。换而言之，所述酵母细胞能够将饱和脂肪酰基辅酶A转化为具有四个双键的去饱和脂肪酰基辅酶A，其中一个双键位于12位。

在一个优选的实施方案中，n’＝2且n＝1。换而言之，所述酵母细胞能够将具有一个双键的去饱和脂肪酰基辅酶A转化为具有两个双键的去饱和脂肪酰基辅酶A，其中一个双键位于12位。

在一个实施方案中，n’＝3且n＝1。换而言之，所述酵母细胞能够将具有一个双键的去饱和脂肪酰基辅酶A转化为具有三个双键的去饱和脂肪酰基辅酶A，其中一个双键位于12位。

在一个实施方案中，n’＝4且n＝1。换而言之，所述酵母细胞能够将具有一个双键的去饱和脂肪酰基辅酶A转化为具有四个双键的去饱和脂肪酰基辅酶A，其中一个双键位于12位。

在一个实施方案中，n’＝3且n＝2。换而言之，所述酵母细胞能够将具有两个双键的去饱和脂肪酰基辅酶A转化为具有三个双键的去饱和脂肪酰基辅酶A，其中一个双键位于12位。

在一个实施方案中，n’＝4且n＝2。换而言之，所述酵母细胞能够将具有两个双键的去饱和脂肪酰基辅酶A转化为具有四个双键的去饱和脂肪酰基辅酶A，其中一个双键位于12位。

在一个实施方案中，n’＝4且n＝3。换而言之，所述酵母细胞能够将具有三个双键的去饱和脂肪酰基辅酶A转化为具有四个双键的去饱和脂肪酰基辅酶A，其中一个双键位于12位。

在一个实施方案中，所述碳链长度为至少13且具有n个双键的饱和或去饱和脂肪酰基辅酶A的碳链长度为至少13，诸如至少14，诸如至少15，诸如至少16，诸如至少17，诸如至少18，诸如至少19，诸如至少20，诸如至少21，诸如至少22。在优选的实施方案中，所述碳链长度为至少13且具有n个双键的饱和或去饱和脂肪酰基辅酶A具有13、14、15、16、17或18的碳链长度。

在一个实施方案中，所述碳链长度为至少13且具有n个双键的饱和或去饱和脂肪酰基辅酶A具有至少14的碳链长度，并且是十四烷酰基辅酶A或(Z9)-十四烯酰基辅酶A。在优选的实施方案中，所述碳链长度为至少13且具有n个双键的饱和或去饱和脂肪酰基辅酶A具有至少14的碳链长度并且是(Z9)-十四烯酰基辅酶A。

在一个实施方案中，所述具有n’个双键的去饱和脂肪酰基辅酶A的碳链长度为至少13，诸如至少14，诸如至少15，诸如至少16，诸如至少17，诸如至少18，诸如至少19，诸如至少20，诸如至少21，诸如至少22。在一个实施方案中，所述具有n’个双键的去饱和脂肪酰基辅酶A的碳链长度为至多18，诸如至多17，诸如至多16，诸如至多15，诸如至多14，诸如至多13，诸如至多12。在优选的实施方案中，所述具有n’个双键的去饱和脂肪酰基辅酶A具有13、14、15、16、17或18的碳链长度。

在一个实施方案中，所述具有n’个双键的去饱和脂肪酰基辅酶A具有一个双键，并且是(E12)-十四烯酰基辅酶A。

在一个实施方案中，所述具有n’个双键的去饱和脂肪酰基辅酶A具有两个双键，并且是(Z9,E12)-十四碳二烯酰基辅酶A。

因而，本文还提供了根据本文提出的方法可得到的(E12)-十四烯酰基辅酶A和/或(Z9,E12)-十四碳二烯酰基辅酶A。

去饱和脂肪醇

在一个实施方案中，所述表达Δ12去饱和酶和任选的其它去饱和酶的酵母细胞还表达本文在“脂肪酰基辅酶A还原酶”一节中提出的FAR。所述酵母细胞可能够生产在12位具有双键和任选的在12位以外的位置处，诸如在9位具有双键的去饱和脂肪醇。

生产去饱和脂肪醇所必需的所述FAR可以是本文在“脂肪酰基辅酶A还原酶”一节中描述的任何FAR，并且所述去饱和脂肪醇可以是对应于本文在“去饱和脂肪酰基辅酶A”一节中描述的脂肪酰基辅酶A的任何去饱和脂肪醇。

在一个实施方案中，所述去饱和脂肪醇是(E12)-脂肪醇，诸如(E12)-十四烯-1-醇。在一个实施方案中，所述去饱和脂肪醇是(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇。

因而，本文进一步提供了通过本文提出的方法可得到的(E12)-脂肪醇，诸如(E12)-十四烯-1-醇和/或(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇。

用于生产去饱和脂肪酰基辅酶A的方法

本文提供了用于在酵母细胞中生产具有n’个双键的去饱和脂肪酰基辅酶A的方法，其中所述双键中的至少一个位于12位，所述方法包含以下步骤：

i)提供如本文中定义的酵母细胞，

ii)在允许表达异源Δ12去饱和酶的条件下于培养基中孵育所述酵母细胞，所述去饱和酶能够在碳链长度为至少13且具有n个双键的饱和或去饱和脂肪酰基辅酶A，优选去饱和脂肪酰基辅酶A的12位引入双键，

其中n和n’是整数，

其中0≤n≤3且其中1≤n’≤4，

在一个实施方案中，所述异源Δ12去饱和酶如本文在“Δ12去饱和酶”一节中所定义。例如，所述Δ12去饱和酶可以是谷斑螟属Δ12去饱和酶，诸如印度谷螟Δ12去饱和酶，诸如SEQ ID NO:2所示的Δ12去饱和酶(Pid12)，或与其具有至少60％同一性或相似性的其功能变体。例如，所述Δ12去饱和酶可以是果斑螟属Δ12去饱和酶，诸如干果斑螟Δ12去饱和酶，诸如SEQ ID NO:55所示的Δ12去饱和酶(EcauDes12)，或与其具有至少60％相似性或同一性的其功能变体。例如，所述Δ12去饱和酶可以是粉斑螟属Δ12去饱和酶，诸如地中海粉斑螟Δ12去饱和酶或烟草粉螟Δ12去饱和酶，诸如SEQ ID NO:85(Eku_d12)或SEQ IDNO:87(Ee_d12)所示的Δ12去饱和酶，或与其具有至少60％相似性或同一性的其功能变体。

在一个实施方案中，所述其它异源去饱和酶如本文在“其它去饱和酶”一节中所定义。例如，所述其它去饱和酶可以是能够在饱和或去饱和脂肪酸中在除了12位以外的位置处引入双键的去饱和酶。在某些实施方案中，所述其它去饱和酶是对于酵母细胞而言天然的去饱和酶，诸如同源去饱和酶。在某些实施方案中，所述其它去饱和酶是对于酵母细胞而言非天然的去饱和酶，诸如异源去饱和酶。在某些实施方案中，所述去饱和酶是果蝇属去饱和酶，诸如大果蝇去饱和酶，例如SEQ ID NO:4所示的Desat61，或诸如黑腹果蝇去饱和酶，例如SEQ ID NO:6所示的Desat24，或诸如Drosophila grimshawi去饱和酶，例如SEQ IDNO:8所示的Desat59，或诸如Drosophila yakuba去饱和酶，例如SEQ ID NO:57所示的Desat56，或诸如嗜凤梨果蝇去饱和酶，例如SEQ ID NO:59所示的Desat60；脐橙螟属去饱和酶，诸如脐橙螟蛾去饱和酶，例如SEQ ID NO:10所示的Desat17或SEQ ID NO:12所示的Desat18；色卷蛾属去饱和酶，诸如Choristoneura parallela去饱和酶，例如SEQ ID NO:61所示的Desat74；灰翅夜蛾属去饱和酶，诸如斜纹夜蛾去饱和酶，例如SEQ ID NO:18所示的Desat26；酵母属去饱和酶，诸如酿酒酵母去饱和酶，例如SEQ ID NO:14所示的Desat42；耶氏酵母属去饱和酶，诸如解脂耶氏酵母去饱和酶，例如SEQ ID NO:16所示的Desat69，或与其具有至少60％相似性或同一性的其功能变体。

所述碳链长度为至少13且具有n个双键的饱和或去饱和脂肪酰基辅酶A可以如本文在“去饱和脂肪酰基辅酶A”一节中所定义。在一个实施方案中，所述碳链长度为至少13且具有n个双键的饱和或去饱和脂肪酰基辅酶A是十四烷酰基辅酶A或(Z9)-十四烯酰基辅酶A。

所述具有n’个双键的去饱和脂肪酰基辅酶A可以如本文在“去饱和脂肪酰基辅酶A”部分中所定义。在一个实施方案中，所述具有n’个双键的去饱和脂肪酰基辅酶A是(E12)-十四烯酰基辅酶A和/或(Z9,E12)-十四碳二烯酰基辅酶A。

在一个实施方案中，所述方法产生具有n’个双键的去饱和脂肪酰基辅酶A，诸如(E12)-十四烯酰基辅酶A和/或(Z9,E12)-十四碳二烯酰基辅酶A，其滴度为至少0.005mg/L，诸如至少0.01mg/L，诸如至少0.02mg/L，诸如至少0.03mg/L，诸如至少0.05mg/L，诸如至少0.06mg/L，诸如至少0.075mg/L，诸如至少0.1mg/L，诸如至少0.2mg/L，诸如至少0.3mg/L，诸如至少0.4mg/L，诸如至少0.5mg/L，诸如至少0.6mg/L，诸如至少0.7mg/L，诸如至少0.8mg/L，诸如至少0.9mg/L，诸如至少1mg/L，诸如至少2mg/L，诸如至少3mg/L，诸如至少4mg/L，诸如至少5mg/L，诸如至少10mg/L，诸如至少15mg/L，诸如至少20mg/L，诸如至少25mg/L，诸如至少30mg/L，诸如至少35mg/L，诸如至少50mg/L，诸如至少60mg/L，诸如至少70mg/L，诸如至少80mg/L，诸如至少90mg/L，诸如至少100mg/L，诸如至少200mg/L，诸如至少300mg/L，诸如至少400mg/L，诸如至少500mg/L，诸如至少750mg/L，诸如至少1g/L，诸如至少2g/L，诸如至少5g/L，诸如至少10g/L，诸如至少20g/L，诸如至少50g/L，诸如至少100g/L或更高。

在一个实施方案中，所述酵母细胞进一步表达至少一种形成醇的脂肪酰基辅酶A还原酶(FAR)，其能够将(E12)-十四烯酰基辅酶A和/或(Z9,E12)-十四碳二烯酰基辅酶A的至少一部分分别转化为(E12)-十四烯-1-醇和/或(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇。

所述FAR可以如本文在“脂肪酰基辅酶A还原酶”一节中所定义。例如，所述FAR可以是地老虎属FAR，诸如黄地老虎FAR，例如SEQ ID NO:75所示的FAR12；蔽眼蝶属FAR，诸如偏瞳蔽眼蝶FAR，例如SEQ ID NO:77所示的FAR11；棉铃虫属FAR，诸如棉铃虫FAR或烟夜蛾FAR，例如SEQ ID NO:20所示的FAR1或SEQ ID NO:71所示的FAR6；实夜蛾属FAR，诸如Heliothissubflexa FAR或烟芽夜蛾FAR，例如SEQ ID NO:69所示的FAR4或SEQ ID NO:79所示的FAR5；秆野螟属FAR，诸如亚洲玉米螟FAR、Ostrinia zag FAR或Ostrinia zea FAR，例如SEQ IDNO:63所示的FAR44、SEQ ID NO:65所示的FAR48或SEQ ID NO:67所示的FAR49；谷斑螟属FAR，诸如印度谷螟FAR，例如SEQ ID NO:28所示的FAR28或SEQ ID NO:30所示的FAR32；灰翅夜蛾属FAR，诸如甜菜夜蛾FAR，例如SEQ ID NO:22所示的FAR16或SEQ ID NO:24所示的FAR17，或诸如斜纹夜蛾FAR，例如SEQ ID NO:26所示的FAR19；粉夜蛾属FAR，诸如粉纹夜蛾FAR，例如SEQ ID NO:32所示的FAR38；巢蛾属FAR，诸如Yponomeuta rorellus FAR，例如SEQID NO:73所示的FAR8；或与其具有至少60％相似性或同一性的其功能变体。

在一个实施方案中，所述方法产生(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇，其滴度为至少0.005mg/L，诸如至少0.01mg/L，诸如至少0.02mg/L，诸如至少0.03mg/L，诸如至少0.05mg/L，诸如至少0.06mg/L，诸如至少0.075mg/L，诸如至少0.1mg/L，诸如至少0.2mg/L，诸如至少0.3mg/L，诸如至少0.4mg/L，诸如至少0.5mg/L，诸如至少0.6mg/L，诸如至少0.7mg/L，诸如至少0.8mg/L，诸如至少0.9mg/L，诸如至少1mg/L，诸如至少2mg/L，诸如至少3mg/L，诸如至少4mg/L，诸如至少5mg/L，诸如至少10mg/L，诸如至少15mg/L，诸如至少20mg/L，诸如至少25mg/L，诸如至少30mg/L，诸如至少35mg/L，诸如至少50mg/L，诸如至少60mg/L，诸如至少70mg/L，诸如至少80mg/L，诸如至少90mg/L，诸如至少100mg/L，诸如至少200mg/L，诸如至少300mg/L，诸如至少400mg/L，诸如至少500mg/L，诸如至少750mg/L，诸如至少1g/L，诸如至少2g/L，诸如至少5g/L，诸如至少10g/L，诸如至少20g/L，诸如至少50g/L，诸如至少100g/L或更高。

在一个实施方案中，所述方法进一步包括回收所述E12-脂肪醇和/或所述(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇的步骤。

在一个实施方案中，所述E12-脂肪醇和/或所述(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇分别进一步被修饰成E12-脂肪醇乙酸酯和/或(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇乙酸酯。

在一个实施方案中，在体外进行所述E12-脂肪醇和/或所述(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇向E12-脂肪醇乙酸酯和/或(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇乙酸酯的转化。

在一个实施方案中，如下在体内进行所述E12-脂肪醇和/或所述(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇向E12-脂肪醇乙酸酯和/或(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇乙酸酯的转化：在所述细胞中进一步表达能够分别将所述E12-脂肪醇和/或所述(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇转化为E12-脂肪醇乙酸酯和/或(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇乙酸酯的乙酰基转移酶。

在一个实施方案中，所述方法进一步包括将所述E12-脂肪醇和/或所述(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇转化为(E12)-脂肪醛和/或(Z9,E12)-十四碳二烯醛的步骤。在一个实施方案中，所述向醛的转化是化学或酶转化。

本公开内容的化合物可以如本文所述通过技术人员已知的方法或如同一申请人于2021年8月6日提交的欧洲专利申请EP21190097.2中所述进行氧化。在一个实施方案中，所述E12-脂肪醇和/或所述(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇被化学氧化成(E12)-脂肪醛和/或(Z9,E12)-十四碳二烯醛。

本公开内容的化合物可以如本文所述或通过技术人员已知的方法进行乙酰化。在一个实施方案中，所述E12-脂肪醇和/或所述(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇被化学乙酰化成E12-脂肪醇乙酸酯和/或(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇乙酸酯。

在一个实施方案中，所述方法进一步包括将E12-脂肪醇诸如(E12)-十四烯-1-醇、(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇、E12-脂肪醇乙酸酯、(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇乙酸酯、(E12)-脂肪醛和/或(Z9,E12)-十四碳二烯醛配制成本文在“信息素组合物”一节中定义的信息素组合物的步骤。

因而，本文提供了用于生产(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇的方法，所述方法包括以下步骤：

i)提供如在本文中公开的酵母细胞，

ii)在允许表达以下酶的条件下在培养基中孵育所述酵母细胞：

a.其它去饱和酶，所述去饱和酶能够在十四烷酰基辅酶A的9位引入双键，从而将十四烷酰基辅酶A的至少一部分转化为(Z9)-十四烯酰基辅酶A；

b.异源Δ12去饱和酶，所述去饱和酶能够在(Z9)-十四烯酰基辅酶A的12位引入双键，从而将(Z9)-十四烯酰基辅酶A的至少一部分转化为(Z9,E12)-十四碳二烯酰基辅酶A；

c.FAR，所述FAR能够将(Z9,E12)-十四碳二烯酰基辅酶A的至少一部分转化为(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇；

iii)任选地，回收所述(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇；

iv)任选地，将(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇转化为(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇乙酸酯；

v)任选地，将(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇转化为(Z9,E12)-十四碳二烯醛；

vi)任选地，将(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇、(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇乙酸酯和/或(Z9,E12)-十四碳二烯醛配制成信息素组合物。

核酸

本文提供了用于修饰酵母细胞的核酸或核酸系统，所述核酸或系统包含至少一种编码异源Δ12去饱和酶的多核苷酸，所述去饱和酶能够在碳链长度为至少13且具有n个双键的饱和或去饱和脂肪酰基辅酶A的12位引入双键，从而生产具有n’个双键的去饱和脂肪酰基辅酶A，其中所述双键中的至少一个位于12位，

其中n和n’是整数，

其中0≤n≤3且其中1≤n’≤4。

在一个实施方案中，所述异源Δ12去饱和酶由核酸编码，所述核酸与编码SEQ IDNO:1所示的印度谷螟Δ12去饱和酶的核酸具有至少60％同一性，与其具有诸如至少61％同一性，诸如至少62％同一性，诸如至少63％同一性，诸如至少64％同一性，诸如至少65％同一性，诸如至少66％同一性，诸如至少67％同一性，诸如至少68％同一性，诸如至少69％同一性，诸如至少70％同一性，诸如至少71％同一性，诸如至少72％，诸如至少73％，诸如至少74％，诸如至少75％，诸如至少76％，诸如至少77％，诸如至少78％，诸如至少79％，诸如至少80％，诸如至少81％，诸如至少82％，诸如至少83％，诸如至少84％，诸如至少85％，诸如至少86％，诸如至少87％，诸如至少88％，诸如至少89％，诸如至少90％，诸如至少91％，诸如至少92％，诸如至少93％，诸如至少94％，诸如至少95％，诸如至少96％，诸如至少97％，诸如至少98％，诸如至少99％同一性，诸如100％同一性。

在一个实施方案中，所述异源Δ12去饱和酶由核酸编码，所述核酸与编码SEQ IDNO:54所示的干果斑螟Δ12去饱和酶的核酸具有至少60％同一性，与其具有诸如至少61％同一性，诸如至少62％同一性，诸如至少63％同一性，诸如至少64％同一性，诸如至少65％同一性，诸如至少66％同一性，诸如至少67％同一性，诸如至少68％同一性，诸如至少69％同一性，诸如至少70％同一性，诸如至少71％同一性，诸如至少72％，诸如至少73％，诸如至少74％，诸如至少75％，诸如至少76％，诸如至少77％，诸如至少78％，诸如至少79％，诸如至少80％，诸如至少81％，诸如至少82％，诸如至少83％，诸如至少84％，诸如至少85％，诸如至少86％，诸如至少87％，诸如至少88％，诸如至少89％，诸如至少90％，诸如至少91％，诸如至少92％，诸如至少93％，诸如至少94％，诸如至少95％，诸如至少96％，诸如至少97％，诸如至少98％，诸如至少99％同一性，诸如100％同一性。

在一个实施方案中，所述异源Δ12去饱和酶由核酸编码，所述核酸与编码SEQ IDNO:84所示的地中海粉斑螟Δ12去饱和酶的核酸具有至少60％同一性，与其具有诸如至少61％同一性，诸如至少62％同一性，诸如至少63％同一性，诸如至少64％同一性，诸如至少65％同一性，诸如至少66％同一性，诸如至少67％同一性，诸如至少68％同一性，诸如至少69％同一性，诸如至少70％同一性，诸如至少71％同一性，诸如至少72％，诸如至少73％，诸如至少74％，诸如至少75％，诸如至少76％，诸如至少77％，诸如至少78％，诸如至少79％，诸如至少80％，诸如至少81％，诸如至少82％，诸如至少83％，诸如至少84％，诸如至少85％，诸如至少86％，诸如至少87％，诸如至少88％，诸如至少89％，诸如至少90％，诸如至少91％，诸如至少92％，诸如至少93％，诸如至少94％，诸如至少95％，诸如至少96％，诸如至少97％，诸如至少98％，诸如至少99％同一性，诸如100％同一性。

在一个实施方案中，所述异源Δ12去饱和酶由核酸编码，所述核酸与编码SEQ IDNO:86所示的烟草粉螟Δ12去饱和酶的核酸具有至少60％同一性，与其具有诸如至少61％同一性，诸如至少62％同一性，诸如至少63％同一性，诸如至少64％同一性，诸如至少65％同一性，诸如至少66％同一性，诸如至少67％同一性，诸如至少68％同一性，诸如至少69％同一性，诸如至少70％同一性，诸如至少71％同一性，诸如至少72％，诸如至少73％，诸如至少74％，诸如至少75％，诸如至少76％，诸如至少77％，诸如至少78％，诸如至少79％，诸如至少80％，诸如至少81％，诸如至少82％，诸如至少83％，诸如至少84％，诸如至少85％，诸如至少86％，诸如至少87％，诸如至少88％，诸如至少89％，诸如至少90％，诸如至少91％，诸如至少92％，诸如至少93％，诸如至少94％，诸如至少95％，诸如至少96％，诸如至少97％，诸如至少98％，诸如至少99％同一性，诸如100％同一性。

在一个实施方案中，所述核酸或所述核酸系统进一步包含编码其它异源去饱和酶的多核苷酸，所述其它异源去饱和酶能够在碳链长度为至少13且具有n个双键的饱和或去饱和脂肪酰基辅酶A中在不是12位的任何位置处引入双键。

在某些实施方案中，所述其它异源去饱和酶由核酸编码，所述核酸与选自SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:60所示的去饱和酶的组中的核酸具有至少60％同一性，与其具有诸如至少61％同一性，诸如至少62％同一性，诸如至少63％同一性，诸如至少64％同一性，诸如至少65％同一性，诸如至少66％同一性，诸如至少67％同一性，诸如至少68％同一性，诸如至少69％同一性，诸如至少70％同一性，诸如至少71％同一性，诸如至少72％，诸如至少73％，诸如至少74％，诸如至少75％，诸如至少76％，诸如至少77％，诸如至少78％，诸如至少79％，诸如至少80％，诸如至少81％，诸如至少82％，诸如至少83％，诸如至少84％，诸如至少85％，诸如至少86％，诸如至少87％，诸如至少88％，诸如至少89％，诸如至少90％，诸如至少91％，诸如至少92％，诸如至少93％，诸如至少94％，诸如至少95％，诸如至少96％，诸如至少97％，诸如至少98％，诸如至少99％同一性，诸如100％同一性。

在一个实施方案中，所述其它异源去饱和酶由核酸编码，所述核酸与编码SEQ IDNO:3所示的大果蝇去饱和酶的核酸具有至少60％同一性。

在一个实施方案中，所述其它异源去饱和酶由核酸编码，所述核酸与编码SEQ IDNO:5所示的黑腹果蝇去饱和酶的核酸具有至少60％同一性。

在一个实施方案中，所述其它异源去饱和酶由核酸编码，所述核酸与编码SEQ IDNO:7所示的Drosophila grimshawi去饱和酶的核酸具有至少60％同一性。

在一个实施方案中，所述其它异源去饱和酶由核酸编码，所述核酸与编码SEQ IDNO:9或SEQ ID NO:11所示的脐橙螟蛾去饱和酶的核酸具有至少60％同一性。

在一个实施方案中，所述其它异源去饱和酶由核酸编码，所述核酸与编码SEQ IDNO:13所示的酿酒酵母去饱和酶的核酸具有至少60％同一性。

在一个实施方案中，所述其它异源去饱和酶由核酸编码，所述核酸与编码SEQ IDNO:15所示的解脂耶氏酵母去饱和酶的核酸具有至少60％同一性。

在一个实施方案中，所述其它异源去饱和酶由核酸编码，所述核酸与编码SEQ IDNO:17所示的斜纹夜蛾去饱和酶的核酸具有至少60％同一性。

在一个实施方案中，所述其它异源去饱和酶由核酸编码，所述核酸与编码SEQ IDNO:56所示的Drosophila yakuba去饱和酶的核酸具有至少60％同一性。

在一个实施方案中，所述其它异源去饱和酶由核酸编码，所述核酸与编码SEQ IDNO:58所示的嗜凤梨果蝇去饱和酶的核酸具有至少60％同一性。

在一个实施方案中，所述其它异源去饱和酶由核酸编码，所述核酸与编码SEQ IDNO:60所示的Choristoneura parallela去饱和酶的核酸具有至少60％同一性。

在一个实施方案中，所述核酸或核酸系统进一步包含编码FAR的多核苷酸，所述FAR能够将至少一部分双去饱和的(Z9,E12)-十四碳二烯酰基辅酶A转化为(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇。

在某些实施方案中，所述FAR由核酸编码，所述核酸与选自SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ IDNO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:72、SEQ IDNO:74、SEQ ID NO:76和SEQ ID NO:78所示的FAR的组的核酸具有至少60％同一性，与其具有诸如至少61％同一性，诸如至少62％同一性，诸如至少63％同一性，诸如至少64％同一性，诸如至少65％同一性，诸如至少66％同一性，诸如至少67％同一性，诸如至少68％同一性，诸如至少69％同一性，诸如至少70％同一性，诸如至少71％同一性，诸如至少72％，诸如至少73％，诸如至少74％，诸如至少75％，诸如至少76％，诸如至少77％，诸如至少78％，诸如至少79％，诸如至少80％，诸如至少81％，诸如至少82％，诸如至少83％，诸如至少84％，诸如至少85％，诸如至少86％，诸如至少87％，诸如至少88％，诸如至少89％，诸如至少90％，诸如至少91％，诸如至少92％，诸如至少93％，诸如至少94％，诸如至少95％，诸如至少96％，诸如至少97％，诸如至少98％，诸如至少99％同一性，诸如100％同一性。

在一个实施方案中，所述FAR由核酸编码，所述核酸与编码SEQ ID NO:74所示的黄地老虎FAR的核酸具有至少60％同一性。

在一个实施方案中，所述FAR由核酸编码，所述核酸与编码SEQ ID NO:76所示的偏瞳蔽眼蝶FAR的核酸具有至少60％同一性。

在一个实施方案中，所述FAR由核酸编码，所述核酸与编码SEQ ID NO:19所示的棉铃虫FAR的核酸具有至少60％同一性。

在一个实施方案中，所述FAR由核酸编码，所述核酸与编码SEQ ID NO:70所示的烟夜蛾FAR的核酸具有至少60％同一性。

在一个实施方案中，所述FAR由核酸编码，所述核酸与编码SEQ ID NO:68所示的Heliothis subflex FAR的核酸具有至少60％同一性。

在一个实施方案中，所述FAR由核酸编码，所述核酸与编码SEQ ID NO:78所示的烟芽夜蛾FAR的核酸具有至少60％同一性。

在一个实施方案中，所述FAR由核酸编码，所述核酸与编码SEQ ID NO:62所示的亚洲玉米螟FAR的核酸具有至少60％同一性。

在一个实施方案中，所述FAR由核酸编码，所述核酸与编码SEQ ID NO:64所示的Ostrinia zag FAR的核酸具有至少60％同一性。

在一个实施方案中，所述FAR由核酸编码，所述核酸与编码SEQ ID NO:66所示的Ostrinia ze FAR的核酸具有至少60％同一性。

在一个实施方案中，所述FAR由核酸编码，所述核酸与编码SEQ ID NO:27或SEQ IDNO:29所示的印度谷螟FAR的核酸具有至少60％同一性。

在一个实施方案中，所述FAR由核酸编码，所述核酸与编码SEQ ID NO:21或SEQ IDNO:23所示的甜菜夜蛾FAR的核酸具有至少60％同一性。

在一个实施方案中，所述FAR由核酸编码，所述核酸与编码SEQ ID NO:25所示的斜纹夜蛾FAR的核酸具有至少60％同一性。

在一个实施方案中，所述FAR由核酸编码，所述核酸与编码SEQ ID NO:31所示的粉纹夜蛾FAR的核酸具有至少60％同一性。

在一个实施方案中，所述FAR由核酸编码，所述核酸与编在SEQ ID NO:72所示的Yponomeuta rorellus FAR的核酸具有至少60％同一性。

在本文中，与给定的核酸具有至少60％同一性的核酸可以与给定的核酸具有至少61％同一性，诸如至少62％同一性，诸如至少63％同一性，诸如至少64％同一性，诸如至少65％同一性，诸如至少66％同一性，诸如至少67％同一性，诸如至少68％同一性，诸如至少69％同一性，诸如至少70％同一性，诸如至少71％同一性，诸如至少72％，诸如至少73％，诸如至少74％，诸如至少75％，诸如至少76％，诸如至少77％，诸如至少78％，诸如至少79％，诸如至少80％，诸如至少81％，诸如至少82％，诸如至少83％，诸如至少84％，诸如至少85％，诸如至少86％，诸如至少87％，诸如至少88％，诸如至少89％，诸如至少90％，诸如至少91％，诸如至少92％，诸如至少93％，诸如至少94％，诸如至少95％，诸如至少96％，诸如至少97％，诸如至少98％，诸如至少99％或更高。

因此，所述核酸系统可以包含多个多核苷酸，其编码要在酵母细胞中表达的酶，特别是本文描述的异源Δ12去饱和酶，和任选的如本文描述的其它异源去饱和酶，以及其它任选的FAR和/或另外酶(诸如Ncb5or)。

回收

可能需要回收通过本文公开的方法获得的产物。因此，本发明的方法可以包括回收根据本文提出的方法生产的处于游离形式或作为脂质的去饱和脂肪酸、去饱和脂肪醇、去饱和脂肪醇乙酸酯和/或去饱和脂肪醛的进一步步骤。

在某些实施方案中，所述方法包括回收所述去饱和脂肪醇的步骤。在其它实施方案中，所述方法包括回收所述去饱和脂肪醇乙酸酯的步骤。

用于回收通过本发明获得的产物的方法是本领域已知的，并且可以包括用疏水溶剂(诸如癸烷、己烷或植物油)进行萃取。

所回收的产物可以被进一步修饰，例如可以如上文所述，将去饱和脂肪醇转化为对应的去饱和的脂肪醛或脂肪醇乙酸酯。在其中去饱和的脂肪醛和/或脂肪醇乙酸酯直接在培养基中产生(例如在体内或通过使细胞与相关酶接触)的实施方案中，也可以回收去饱和的脂肪醛和/或脂肪醇乙酸酯。

如同一申请人于2020年9月22日提交的标题为“Improved methods forproduction,recovery and secretion of hydrophobic compounds in a fermentation(用于在发酵中生产、回收和分泌疏水化合物的改进方法)”的申请WO 2021/078452中所描述的，当使用发酵系统培养能够生产去饱和脂肪醇、去饱和脂肪醇乙酸酯和/或去饱和脂肪醛的细胞(特别是酵母细胞)时，向培养基中添加萃取剂可以进一步增加滴度和细胞外分泌。在某些实施方案中，所述培养基中包含的萃取剂的量等于或大于其在水溶液中的混浊浓度，其中所述萃取剂是非离子表面活性剂诸如消泡剂，优选选自以下的聚乙氧基化表面活性剂：聚乙烯聚丙二醇，聚醚分散体的混合物，包含聚乙二醇单硬脂酸酯的消泡剂(诸如二甲硅油)以及乙氧基化和丙氧基化的C₁₆-C₁₈醇基消泡剂和它们的组合。在某些实施方案中：

-所述非离子表面活性剂是乙氧基化和丙氧基化的C₁₆-C₁₈醇基消泡剂，诸如C₁₆-C₁₈烷基醇乙氧基化物丙氧基化物(CAS号：68002-96-0)，且其中所述培养基包含至少1％体积/体积的C₁₆-C₁₈烷基醇乙氧基化物丙氧基化物，诸如至少1.5％，诸如至少2％，诸如至少2.5％，诸如至少3％，诸如至少3.5％，诸如至少4％，诸如至少5％，诸如至少6％，诸如至少7％，诸如至少8％，诸如至少9％，诸如至少10％，诸如至少12.5％，诸如至少15％，诸如至少17.5％，诸如至少20％，诸如至少22.5％，诸如至少25％，诸如至少27.5％，诸如至少30％体积/体积或更多的C₁₆-C₁₈烷基醇乙氧基化物丙氧基化物，

-所述非离子表面活性剂是聚乙烯聚丙二醇，例如P407(CAS号：9003-11-6)，且其中所述培养基包含至少10％体积/体积的聚乙烯聚丙二醇(诸如P407)，诸如至少11％体积/体积，诸如至少12％体积/体积，诸如至少13％体积/体积，诸如至少14％体积/体积，诸如至少15％体积/体积，诸如至少16％体积/体积，诸如至少17％体积/体积，诸如至少18％体积/体积，诸如至少19％体积/体积，诸如至少20％体积/体积，诸如至少25％体积/体积，诸如至少30％体积/体积，诸如至少35％体积/体积或更多的聚乙烯聚丙二醇(诸如/>P407)，

-所述非离子表面活性剂是聚醚分散体的混合物，诸如消泡剂204，且其中所述培养基包含至少1％体积/体积的聚醚分散体的混合物(诸如消泡剂204)，诸如至少1.5％，诸如至少2％，诸如至少2.5％，诸如至少3％，诸如至少3.5％，诸如至少4％，诸如至少5％，诸如至少6％，诸如至少7％，诸如至少8％，诸如至少9％，诸如至少10％，诸如至少12.5％，诸如至少15％，诸如至少17.5％，诸如至少20％，诸如至少22.5％，诸如至少25％，诸如至少27.5％，诸如至少30％体积/体积或更多的聚醚分散体的混合物(诸如消泡剂204)；和/或

-所述非离子表面活性剂是包含聚乙二醇单硬脂酸酯的非离子表面活性剂(诸如二甲硅油)，且其中所述培养基包含至少1％体积/体积的聚乙二醇单硬脂酸酯或二甲硅油，诸如至少1.5％，诸如至少2％，诸如至少2.5％，诸如至少3％，诸如至少3.5％，诸如至少4％，诸如至少5％，诸如至少6％，诸如至少7％，诸如至少8％，诸如至少9％，诸如至少10％，诸如至少12.5％，诸如至少15％，诸如至少17.5％，诸如至少20％，诸如至少22.5％，诸如至少25％，诸如至少27.5％，诸如至少30％体积/体积或更多的聚乙二醇单硬脂酸酯或二甲硅油。

在其它实施方案中，所述培养基包含的萃取剂的量比其混浊浓度(cloudconcentration)高至少50％，诸如至少100％，诸如至少150％，诸如至少200％，诸如至少250％，诸如至少300％，诸如至少350％，诸如至少400％，诸如至少500％，诸如至少750％，诸如至少1000％或更高，和/或其中所述培养基包含的萃取剂的量是其混浊浓度的至少2倍，诸如其混浊浓度的至少3倍，诸如其混浊浓度的至少4倍，诸如其混浊浓度的至少5倍，诸如其混浊浓度的至少6倍，诸如其混浊浓度的至少7倍，诸如其混浊浓度的至少8倍，诸如其混浊浓度的至少9倍，诸如其混浊浓度的至少10倍，诸如其混浊浓度的至少12.5倍，诸如其混浊浓度的至少15倍，诸如其混浊浓度的至少17.5倍，诸如其混浊浓度的至少20倍，诸如其混浊浓度的至少25倍，诸如其混浊浓度的至少30倍。

也可以将所回收的产物即去饱和脂肪醇、去饱和脂肪醇乙酸酯和/或去饱和脂肪醛配制成信息素组合物，诸如在“信息素组合物”一节中所描述的。在一个实施方案中，配制成信息素组合物的所回收的产物是(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇、(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇乙酸酯和/或(Z9,E12)-十四碳二烯醛。所述组合物可进一步包含一种或多种另外的化合物，诸如液体或固体载体或基质。从所述脂肪醇获得的脂肪醛也可以被包含在这样的组合物中。

可以通过本领域已知的方法回收脂肪酸，例如在通过本领域已知的方法均质化叶子之后回收脂质。将所回收的脂质水解成游离脂肪酸并酯化成脂肪酸烷基酯，随后还原成脂肪醇或脂肪醛。

套件

本文提供了用于进行本发明方法的部件套件。所述部件套件可包括如本文描述的“即用型”酵母细胞。在一个实施方案中，所述酵母细胞是耶氏酵母属细胞，诸如解脂耶氏酵母细胞。在一个实施方案中，所述酵母细胞是酵母属细胞，诸如酿酒酵母细胞。

在一个实施方案中，所述部件套件包括编码要引入生物体中的感兴趣活性的核酸或核酸系统，诸如本文在“核酸”一节中描述的核酸系统。所述核酸或核酸系统可以作为多个核酸构建体(诸如多个载体)提供，其中每个载体编码一种或几种期望的活性。

所述部件套件可以任选地包括待修饰的酵母细胞。

所述部件套件还可包括使用说明。

在某些实施方案中，所述部件套件包括上述的全部或组合。

信息素组合物

本发明提供了化合物，特别是去饱和脂肪醇和去饱和脂肪醇乙酸酯及它们的衍生物(诸如去饱和脂肪醛)，以及它们的用途。具体地，使用本发明的细胞和方法可获得的去饱和的化合物可有用地作为信息素组合物的组分。这样的信息素组合物可有用地害虫综合治理。它们可以如本领域已知的那样用于例如交配干扰。

因此，可通过本发明的方法或使用本发明的酵母细胞获得的去饱和脂肪醇、去饱和脂肪醇乙酸酯和去饱和脂肪醛可以配制在信息素组合物中。在一个实施方案中，将(E12)-脂肪醇、(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇和/或对应的脂肪醛和/或脂肪醇乙酸酯配制在信息素组合物中。

这样的信息素组合物可以用作害虫综合治理产品，其可以用在监测害虫存在的方法或干扰害虫交配的方法中。

因此，本文提供了一种监测害虫存在或干扰害虫交配的方法，所述方法包括以下步骤：

i)通过本文描述的方法生产(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇和/或E12-脂肪醇；

ii)将所述E12-脂肪醇和/或(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇分别转化为E12-脂肪醇乙酸酯和/或(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇乙酸酯；

iii)将所述E12-脂肪醇和/或(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇分别转化为E12-脂肪醛和/或(Z9,E12)-十四碳二烯醛；

iv)将所述E12-脂肪醇、(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇、E12-脂肪醇乙酸酯、(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇乙酸酯、E12-脂肪醛和/或(Z9,E12)-十四碳二烯醛配制为信息素组合物；和

v)采用所述信息素组合物作为害虫综合治理组合物。

本文还提供了能够通过包括下述步骤的方法得到的信息素组合物：

i)通过本文描述的方法生产(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇和/或(E12)-脂肪醇；

ii)将所述(E12)-脂肪醇和/或(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇分别转化为(E12)-脂肪醇乙酸酯和/或(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇乙酸酯；

iii)将所述(E12)-脂肪醇和/或(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇分别转化为(E12)-脂肪醛和/或(Z9,E12)-十四碳二烯醛；

iv)将所述(E12)-脂肪醇、(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇、E12-脂肪醇乙酸酯、(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇乙酸酯、(E12)-脂肪醛和/或(Z9,E12)-十四碳二烯醛配制成信息素组合物。

本文还提供了一种信息素组合物，其包含E12-脂肪醇、(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇、E12-脂肪醇乙酸酯、(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇乙酸酯、E12-脂肪醛和/或(Z9,E12)-十四碳二烯醛，其中所述信息素组合物包含至少20％生物基碳，诸如至少30％生物基碳，诸如至少40％生物基碳，诸如至少50％生物基碳，诸如至少60％生物基碳，诸如至少70％生物基碳，诸如至少80％生物基碳，诸如至少85％生物基碳，诸如至少90％生物基碳，诸如至少95％生物基碳，诸如100％生物基碳。

在本发明的信息素组合物中的E12-脂肪醇、(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇、E12-脂肪醇乙酸酯、(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇乙酸酯、E12-脂肪醛和/或(Z9,E12)-十四碳二烯醛的相对量可依据待防治的作物和/或害虫的性质而变化；还可能存在地理差异。因此，确定最佳相对量可能需要常规优化。

因此，所述信息素组合物可以包含1至100％的E12-脂肪醇、1至100％的(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇、1至100％的E12-脂肪醇乙酸酯、1至100％的(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇乙酸酯、1至100％的E12-脂肪醛和/或1至100％的(Z9,E12)-十四碳二烯醛。

在某些实施方案中，在所述信息素组合物中，(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇与E12-脂肪醇的比率、(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇乙酸酯与E12-脂肪醇乙酸酯的比率和/或(Z9,E12)-十四碳二烯醛与E12-脂肪醛的比率为至少0.1，诸如至少0.15，诸如至少0.2，诸如至少0.3，诸如至少0.4，诸如至少0.5，诸如至少0.75，诸如至少1，诸如至少2，诸如至少3，诸如至少4，诸如至少5，诸如至少6，诸如至少7，诸如至少8，诸如至少9，诸如至少10，诸如至少12.5，诸如至少15，或更高。

在某些实施方案中，在所述信息素组合物中，(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇与E12-脂肪醇的比率为至少0.1，诸如至少0.15，诸如至少0.2，诸如至少0.3，诸如至少0.4，诸如至少0.5，诸如至少0.75，诸如至少1，诸如至少2，诸如至少3，诸如至少4，诸如至少5，诸如至少6，诸如至少7，诸如至少8，诸如至少9，诸如至少10，诸如至少12.5，诸如至少15，或更高。

在某些实施方案中，在所述信息素组合物中，(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇乙酸酯与E12-脂肪醇乙酸酯的比率为至少0.1，诸如至少0.15，诸如至少0.2，诸如至少0.3，诸如至少0.4，诸如至少0.5，诸如至少0.75，诸如至少1，诸如至少2，诸如至少3，诸如至少4，诸如至少5，诸如至少6，诸如至少7，诸如至少8，诸如至少9，诸如至少10，诸如至少12.5，诸如至少15，或更高。

在某些实施方案中，在所述信息素组合物中，(Z9,E12)-十四碳二烯醛与E12-脂肪醛的比率为至少0.1，诸如至少0.15，诸如至少0.2，诸如至少0.3，诸如至少0.4，诸如至少0.5，诸如至少0.75，诸如至少1，诸如至少2，诸如至少3，诸如至少4，诸如至少5，诸如至少6，诸如至少7，诸如至少8，诸如至少9，诸如至少10，诸如至少12.5，诸如至少15，或更高。

在某些实施方案中，在所述信息素组合物中，(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇与Z9-脂肪醇的比率、(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇乙酸酯与Z9-脂肪醇乙酸酯的比率和/或(Z9,E12)-十四碳二烯醛与Z9-脂肪醛的比率为至少0.1，诸如至少0.15，诸如至少0.2，诸如至少0.3，诸如至少0.4，诸如至少0.5，诸如至少0.75，诸如至少1，诸如至少2，诸如至少3，诸如至少4，诸如至少5，诸如至少6，诸如至少7，诸如至少8，诸如至少9，诸如至少10，诸如至少12.5，诸如至少15，或更高。

在某些实施方案中，在所述信息素组合物中，(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇与Z9-脂肪醇的比率为至少0.1，诸如至少0.15，诸如至少0.2，诸如至少0.3，诸如至少0.4，诸如至少0.5，诸如至少0.75，诸如至少1，诸如至少2，诸如至少3，诸如至少4，诸如至少5，诸如至少6，诸如至少7，诸如至少8，诸如至少9，诸如至少10，诸如至少12.5，诸如至少15，或更高。

在某些实施方案中，在所述信息素组合物中，(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇乙酸酯与Z9-脂肪醇乙酸酯的比率为至少0.1，诸如至少0.15，诸如至少0.2，诸如至少0.3，诸如至少0.4，诸如至少0.5，诸如至少0.75，诸如至少1，诸如至少2，诸如至少3，诸如至少4，诸如至少5，诸如至少6，诸如至少7，诸如至少8，诸如至少9，诸如至少10，诸如至少12.5，诸如至少15，或更高。

在某些实施方案中，在所述信息素组合物中，(Z9,E12)-十四碳二烯醛与Z9-脂肪醛的比率为至少0.1，诸如至少0.15，诸如至少0.2，诸如至少0.3，诸如至少0.4，诸如至少0.5，诸如至少0.75，诸如至少1，诸如至少2，诸如至少3，诸如至少4，诸如至少5，诸如至少6，诸如至少7，诸如至少8，诸如至少9，诸如至少10，诸如至少12.5，诸如至少15，或更高。

在某些实施方案中，在所述信息素组合物中，(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇与(Z9,E12)-十四碳二烯醛的比率，和/或(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇与(Z9E12)-十四碳二烯-1-醇乙酸酯的比率为至少0.1，诸如至少0.15，诸如至少0.2，诸如至少0.3，诸如至少0.4，诸如至少0.5，诸如至少0.75，诸如至少1，诸如至少2，诸如至少3，诸如至少4，诸如至少5，诸如至少6，诸如至少7，诸如至少8，诸如至少9，诸如至少10，诸如至少12.5，诸如至少15，或更高。

在某些实施方案中，在所述信息素组合物中，(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇与(Z9,E12)-十四碳二烯醛的比率为至少0.1，诸如至少0.15，诸如至少0.2，诸如至少0.3，诸如至少0.4，诸如至少0.5，诸如至少0.75，诸如至少1，诸如至少2，诸如至少3，诸如至少4，诸如至少5，诸如至少6，诸如至少7，诸如至少8，诸如至少9，诸如至少10，诸如至少12.5，诸如至少15，或更高。

在某些实施方案中，在所述信息素组合物中(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇与(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇乙酸酯的比率为至少0.1，诸如至少0.15，诸如至少0.2，诸如至少0.3，诸如至少0.4，诸如至少0.5，诸如至少0.75，诸如至少1，诸如至少2，诸如至少3，诸如至少4，诸如至少5，诸如至少6，诸如至少7，诸如至少8，诸如至少9，诸如至少10，诸如至少12.5，诸如至少15，或更高。

在某些实施方案中，所述信息素组合物包含至少30％生物基碳，可替换地40％生物基碳，可替换地50％生物基碳，可替换地60％生物基碳，可替换地70％生物基碳，可替换地75％生物基碳，可替换地80％生物基碳，可替换地85％生物基碳，可替换地90％生物基碳，可替换地95％生物基碳。

在某些实施方案中，所述信息素组合物包含至少80％生物基碳，可替换地85％生物基碳，可替换地90％生物基碳，可替换地95％生物基碳，可替换地96％生物基碳，可替换地97％生物基碳，可替换地98％生物基碳，可替换地99％生物基碳。

在某些实施方案中，所述信息素组合物包含30％至100％生物基碳，可替换地40％至100％生物基碳，可替换地50％至100％生物基碳，可替换地60％至100％生物基碳，可替换地70％至100％生物基碳，可替换地75％至100％生物基碳，可替换地80％至100％生物基碳，可替换地85％至100％生物基碳，可替换地90％至100％生物基碳，可替换地95％至100％生物基碳。

在某些实施方案中，所述信息素组合物包含80％至100％生物基碳，可替换地85％至100％生物基碳，可替换地90％至100％生物基碳，可替换地95％至100％生物基碳，可替换地96％至100％生物基碳，可替换地97％至100％生物基碳，可替换地98％至100％生物基碳，可替换地99％至100％生物基碳。

本文还提供了一种信息素组合物，其包含E12-脂肪醇、(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇、E12-脂肪醇乙酸酯、(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇乙酸酯、E12-脂肪醛和/或(Z9,E12)-十四碳二烯醛，其中所述信息素组合物具有至少20％的放射性¹⁴C水平。

在某些实施方案中，所述信息素组合物具有至少30％，可替换地40％，可替换地50％，可替换地60％，可替换地70％，可替换地75％，可替换地80％，可替换地85％，可替换地90％，可替换地95％的放射性¹⁴C水平。

在某些实施方案中，所述信息素组合物具有至少80％，可替换地85％，可替换地90％，可替换地95％，可替换地96％，可替换地97％，可替换地98％，可替换地99％的放射性¹⁴C水平。

在某些实施方案中，所述信息素组合物具有30％至100％，可替换地40％至100％，可替换地50％至100％，可替换地60％至100％，可替换地70％至100％，可替换地75％至100％，可替换地80％至100％，可替换地85％至100％，可替换地90％至100％，可替换地95％至100％的放射性¹⁴C水平。

在某些实施方案中，所述信息素组合物具有80％至100％，可替换地85％至100％，可替换地90％至100％，可替换地95％至100％，可替换地96％至100％，可替换地97％至100％，可替换地98％至100％碳，可替换地99-100％的放射性¹⁴C水平。

本文还提供了用于生产根据本发明的信息素组合物的方法，所述方法包括下述步骤：

iv)将所述E12-脂肪醇、(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇、E12-脂肪醇乙酸酯、(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇乙酸酯、E12-脂肪醛和/或(Z9,E12)-十四碳二烯醛配制为信息素组合物，其任选地包含一种或多种另外的化合物(诸如液体或固体载体或基质)；

v)任选地确定所述信息素组合物的生物基碳含量或放射性¹⁴C水平。

本文公开的信息素组合物可以用作生物杀虫剂。这样的组合物可以喷洒或分配田地或果园中的栽培物上。如本领域已知的，它们还可以例如浸泡在橡胶隔片上，或与其它组分混合。在一个实施方案中，所述组合物被放置在扩散信息素组合物的装置(诸如信息素分配器)中。所述分配器可以例如以恒定的、可预先调节的速率释放信息素。这可以引起交配干扰，从而阻止害虫繁殖，或者可以与诱捕装置组合使用以诱捕害虫。本发明的信息素组合物可用于对抗的害虫的非限制性例子为：棉铃虫(棉铃虫(Helicoverpa armigera))，二化螟(二化螟(Chilo suppressalis))，菜蛾(菜蛾(Plutella xylostella))，甘蓝夜蛾(甘蓝夜蛾(Mamestra brassicae))，大甘蓝心幼虫(泛非绒毛螟(Crocidolomia binotalis))，欧洲玉米茎蛀虫(玉米蛀茎夜蛾(Sesamia nonagrioides))，醋栗透翅蛾(醋栗透翅蛾(Synanthedon tipuliformis))，洋蓟羽蛾(洋蓟羽蛾(Platyptilia carduidactylal))，印度谷螟(印度谷螟(Plodia interpunctella))，甜菜粘虫(甜菜夜蛾(Spodopteraexigua))，粉斑螟(干果斑螟(Cadra cautella))，南方粘虫(亚热带粘虫(Spodopteraeridania))等。因此，在栽培物上的使用本发明的组合物可增加作物产量，并且基本上没有环境影响。

在本发明的信息素组合物中的脂肪醇、脂肪醇乙酸酯和/或脂肪醛的相对量可以根据作物和/或待防治的害虫的性质而变化；还可存在地理差异。因此，确定最佳相对量可能需要常规优化。

用在害虫防治中的组合物的例子可以参见：关于棉铃虫(H.armigera)，参见Kehat和Dunkelblum(1993)；关于二化螟(C.suppressalis)，参见Alfaro等人(2009)；关于玉米蛀茎夜蛾(S.nonagrioides)，参见Eizaguirre等人(2002)；关于菜蛾(P.xylostella)，参见Wu等人(2012)；关于洋蓟羽蛾(P.carduidactyla)，参见Bari等人(2003)；关于印度谷螟(P.interpunctella)，参见Zhu等人(1999)；关于甜菜夜蛾(S.exigua)，参见Wakamura(1987)；和关于干果斑螟(C.cautella)，参见Brady等人(1971)。

在某些实施方案中，所述信息素组合物可以进一步包含一种或多种另外的化合物诸如液体或固体载体或基质。例如，合适的载体或基质包括植物油、精炼矿物油或其级分、橡胶、塑料、硅土(silica)、硅藻土、蜡基质和纤维素粉末。

可以按照本领域已知的方式配制所述信息素组合物。例如，它可以是溶液、凝胶、粉末的形式。如本领域已知的，可以配制所述信息素组合物，使得其可以容易地分配。

本发明的干扰交配的方法可以用在转基因作物的田地中。

本文还提供了用于减少或延迟对杀虫性状出现抗性的方法；所述方法可以是综合抗性治理方法。因此，本文公开了延迟害虫(诸如昆虫，例如本文列出的任何昆虫)对转基因杀虫作物和/或化学杀虫剂产生抗性的先发性和响应性方法，即先发性策略。还公开了一旦产生抗性就挽救一种或多种害虫对转基因杀虫作物和/或化学杀虫剂的易感性的方法，即响应性策略。在某些实施方案中，所述方法包括将诸如通过本文公开的方法获得的信息素组合物应用于包含田间群体的农业区，其中转基因作物包含一种或多种杀虫性状，诸如对本文列出的昆虫之一具有活性的转基因杀虫性状，以及任选地包含缺乏杀虫性状的作物的避难所，以破坏害虫的交配，从而延迟对杀虫性状的抗性的出现。因此，本发明的组合物可以与WO 2017/112887中描述的任何方法组合使用。

本文还提供了用于预防或减少害虫(诸如本文列出的昆虫)对作物造成损害的方法。这样的方法包括通过施用本文所公开的信息素组合物来对田地施加交配干扰，并干扰一种或多种害虫中一种或多种靶基因的表达，从而减少或防止田地中的作物损害。可以使用RNAi来破坏一种或多种靶基因的表达，例如如WO 2017/205751中所述。因此，本发明的组合物可以与在WO 2017/205751中描述的任何方法组合使用。

信息素化合物

本文还提供了选自由E12-脂肪醇、(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇、E12-脂肪醇乙酸酯、(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇乙酸酯、E12-脂肪醛和(Z9,E12)-十四碳二烯醛组成的组中的信息素化合物，其中所述信息素化合物包含至少20％生物基碳。

在某些实施方案中，所述信息素化合物包含至少30％生物基碳，可替换地40％生物基碳，可替换地50％生物基碳，可替换地60％生物基碳，可替换地70％生物基碳，可替换地75％生物基碳，可替换地80％生物基碳，可替换地85％生物基碳，可替换地90％生物基碳，可替换地95％生物基碳。

在某些实施方案中，所述信息素化合物包含至少80％生物基碳，可替换地85％生物基碳，可替换地90％生物基碳，可替换地95％生物基碳，可替换地96％生物基碳，可替换地97％生物基碳，可替换地98％生物基碳，可替换地99％生物基碳。

在某些实施方案中，所述信息素化合物包含30％至100％生物基碳，可替换地40％至100％生物基碳，可替换地50％至100％生物基碳，可替换地60％至100％生物基碳，可替换地70％至100％生物基碳，可替换地75％至100％生物基碳，可替换地80％至100％生物基碳，可替换地85％至100％生物基碳，可替换地90％至100％生物基碳，可替换地95％至100％生物基碳。

在某些实施方案中，所述信息素化合物包含80％至100％生物基碳，可替换地85％至100％生物基碳，可替换地90％至100％生物基碳，可替换地95％至100％生物基碳，可替换地96％至100％生物基碳，可替换地97％至100％生物基碳，可替换地98％至100％生物基碳，可替换地99％至100％生物基碳。

本文还提供了选自由E12-脂肪醇、(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇、E12-脂肪醇乙酸酯、(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇乙酸酯、E12-脂肪醛和(Z9,E12)-十四碳二烯醛组成的组中的信息素化合物，其中所述信息素化合物具有至少20％的放射性¹⁴C水平。

在某些实施方案中，所述信息素化合物具有至少30％，可替换地40％，可替换地50％，可替换地60％，可替换地70％，可替换地75％，可替换地80％，可替换地85％，可替换地90％，可替换地95％的放射性¹⁴C水平。

在某些实施方案中，所述信息素化合物具有至少80％，可替换地85％，可替换地90％，可替换地95％，可替换地96％，可替换地97％，可替换地98％，可替换地99％的放射性¹⁴C水平。

在某些实施方案中，所述信息素化合物具有30％至100％，可替换地40％至100％，可替换地50％至100％，可替换地60％至100％，可替换地70％至100％，可替换地75％至100％，可替换地80％至100％，可替换地85％至100％，可替换地90％至100％，可替换地95％至100％的放射性¹⁴C水平。

在某些实施方案中，所述信息素化合物具有80％至100％，可替换地85％至100％，可替换地90％至100％，可替换地95％至100％，可替换地96％至100％，可替换地97％至100％，可替换地98％至100％碳，可替换地99-100％的放射性¹⁴C水平。

本文进一步提供了在酵母细胞中生产根据本发明的信息素化合物的方法，所述方法包括以下步骤：

i)提供表达异源Δ12脂肪酰基辅酶A去饱和酶的酵母细胞，

ii)在允许表达异源Δ12脂肪酰基辅酶A去饱和酶的条件下于培养基中孵育所述酵母细胞，

从而生产所述信息素化合物。

在某些实施方案中，所述酵母细胞表达其它异源去饱和酶。

在某些实施方案中，所述方法进一步包括确定所述信息素化合物的生物基碳含量或放射性¹⁴C水平的步骤。

生物基产物

“生物基”产物可以定义为这样的产物，其中：

1.产物的总碳含量为至少30％；

2.可再生原料(生物基)的碳含量为至少20％。

化石和可再生原料均主要由碳(C)组成。碳有几种同位素。同位素¹⁴C具有放射性，并且以固定的相对浓度天然存在于所有生物体(植物、动物等)中，所述浓度与大气中的¹⁴C相对浓度几乎相同。在此浓度下，¹⁴C的放射性水平为100％。一旦生物体不再存活，该浓度以及因此放射性率就会衰减，半衰期为约5700年。因此，未知物质的放射性¹⁴C水平可以帮助确定该物质中所含碳的年龄。

衍生自可再生原料(诸如植物或动物)的“年轻”碳(0至10年)具有与大气中的相对¹⁴C浓度几乎相同的相对同位素¹⁴C浓度，并且因此这样的年轻碳的放射性¹⁴C水平为约100％。

衍生自合成或化石(石化)来源的“古老”碳(数百万年)被同位素¹⁴C大大耗竭，因为这样的合成和化石来源的年龄远远超过同位素¹⁴C的半衰期(约5700年)。因此，衍生自合成或化石来源的碳具有约0％的相对同位素¹⁴C浓度，并且这样的古老碳的放射性¹⁴C水平因此为约0％。

在一个实施方案中，术语“放射性¹⁴C水平”表示给定物质、产物或组合物的总放射性¹⁴C水平，如上文所定义。

同位素¹⁴C方法可以用于相对于古老(化石)资源的浓度确定年轻(可再生)材料的浓度。可再生原料的碳含量被称作“生物基碳含量”。可以如下所述确定可再生原料的碳含量或“生物基碳含量”。

当测量生物基碳含量时，结果可以报告为“％生物基碳”。这指示“天然”(植物或动物副产物)来源相对于“合成”或“化石”(石化)来源的碳的百分比。作为参考，100％生物基碳指示，材料完全源自植物或动物副产物，而0％生物基碳指示，材料不含有来自植物或动物副产物的任何碳。介于两者之间的值代表天然来源和化石来源的混合物。

实例：如果产物具有80％的放射性¹⁴C水平，它意味着该产物由80％可再生碳和20％化石碳(C)组成。换而言之，该产物是80％生物基的。

分析测量可以称为“现代碳百分比(pMC)”。这是在样品中测得的¹⁴C相对于现代参考标准(NIST 4990C)的百分比。该生物基碳含量％通过对当今空气中二氧化碳中的¹⁴C应用小的调整因子由pMC来计算得出。值得注意的是，所有使用¹⁴C的国际公认标准都假设植物或生物质原料得自于自然环境。

实施例

实施例1-BioBricks和质粒的构建

所有异源基因由GeneArt(Life Technologies)以解脂耶氏酵母的密码子优化形式合成。使用Phusion U Hot Start DNA聚合酶(ThermoFisher)通过PCR扩增所有基因，以获得用于克隆到酵母表达载体中的片段。所述引物列于表1中，并且所得的DNA片段(BioBricks)列于表2。按照生产商的说明书，通过指定的亲本质粒的BsaI限制酶切消化获得标记有“***BsaI”的BioBricks。在含有Midori Green Advance(Nippon GeneticsEurope GmbH)的1％-琼脂糖凝胶上分离PCR产物或限制酶切消化反应。从凝胶切下恰当大小的PCR/限制酶切消化产物，并使用Nucleospin凝胶和PCR净化试剂盒(Macherey-Nagel)进行纯化。

用FastDigest SfaAI(ThermoFisher)在37℃线性化带有USER盒的酵母载体2小时，并然后用Nb.Bsml(New England Biolabs)在65℃切刻1小时。通过凝胶电泳分离得到的含有粘性末端的载体，从凝胶切下，并使用Nucleospin凝胶和PCR净化试剂盒(Macherey-Nagel)进行凝胶纯化。通过(Holkenbrink，等人,2018；Jensen，等人,EasyClone:methodfor iterative chromosomal integration of multiple genes in Saccharomycescerevisiae,2014)所描述的施用USER克隆将DNA片段克隆到载体中。按照生产商的说明书通过DNA T4连接反应(包括指定的BioBricks)获得标有“连接”的质粒(表3)。将USER/T4连接酶反应转化进化学感受态的大肠杆菌(E.coli)DHα细胞中，并将细胞铺在含有100mg/L氨苄西林的溶菌肉汤(Lysogeny Broth，LB)琼脂平板上。将平板在37℃孵育过夜，并通过菌落PCR筛选所得菌落。从过夜大肠杆菌液体培养物中纯化质粒，并通过测序确认正确的克隆。所构建的载体列于表3中。

如下构建标有“**”的菌株。使用基因特异性引物扩增指示的基因，所述引物在正向引物中含有“ACTTTTTGCAGTACUAACCGCAG”的5’突出端，在反向引物中含有“CACGCGAU”的3’突出端。省略了靶基因序列的第一个“ATG”。如(Holkenbrink，等人,2018)中所述将这些PCR产物与BB9454一起克隆到整合型载体或附加型载体中。

如在Jensen,2014中所描述来克隆和转化用于酿酒酵母的附加型表达载体。去饱和酶Desat59和Pid12分别在基因TEF1和TDH3的酿酒酵母天然启动子的控制下表达。

表1.引物

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表2.使用指示的模板和引物通过PCR得到的DNA片段(BioBricks)

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*Holkenbrink等人,2018**Holkenbrink等人,2020***BsaI

表3.载体

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*Holkenbrink等人,2018

**Holkenbrink等人,2020

***连接

实施例2-酵母菌株的构建

如Holkenbrink等人,2018；Jensen等人,2014所述，通过DNA载体的转化构建酵母菌株。转化前，用FastDigest NotI线性化整合型载体。当需要时，将促进整合到特定基因组区域中的辅助载体与表3中列出的整合型质粒或DNA修复片段一起共转化。在含有适当的抗生素选择的酵母蛋白胨右旋糖(YPD)琼脂上或在缺乏特定氨基酸的合成脱落培养基(Sigma-Adrich)上选择菌株。通过菌落PCR确认正确的基因型，并在需要时通过测序确认。所得菌株列于表4中。

表4.酵母菌株

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*Holkenbrink等人,2020

**关于菌株描述，参见实施例1

***Euroscarf(德国)

实施例3-菌株的培养以及脂肪醇和脂肪酸甲酯(FAME)的分析

将解脂耶氏酵母菌株从YPD琼脂板(10g/L酵母浸出物，10g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，15g/L琼脂)接种到24孔板(EnzyScreen)中的2.5mL YPG培养基(10g/L酵母浸出物，10g/L蛋白胨，40g/L甘油)中，初始OD600为0.1至0.2。将板在28℃下孵育，以300rpm摇动。22小时以后，将板在4℃和3000xg下离心5分钟。弃去上清液，将细胞重新悬浮于1.25mL生产培养基/孔(50g/L甘油，5g/L酵母浸出物，4g/L KH₂PO₄，1.5g/L MgSO₄，0.2g/L NaCl，0.265g/LCaCl₂.2H₂O，2mL/L痕量元素溶液：4.5g/LCaCl₂.2H₂O、4.5g/L ZnSO₄.7H₂O、3g/L FeSO₄.7H₂O、1g/L H₃BO₃、1g/LMnCl₂.4H₂O、0.4g/L N Na₂MoO₄.2H₂O、0.3g/L CoCl₂.6H₂O、0.1g/LCuSO₄.5H₂O、0.1g/L KI、15g/L EDTA)中。如果必要的话，向培养基补充抗生素。将板在28℃、300rpm的摇动下孵育28小时。

将酿酒酵母菌株从合成缺陷型琼脂板(synthetic drop-out agar plate)(缺乏尿嘧啶、亮氨酸和组氨酸)接种到在24孔板(EnzyScreen)中的2.5mL补充有2％葡萄糖、1％tergitol、油酸(5.6ml/L)和肉豆蔻酸甲酯(2ml/L)的合成缺陷型培养基(缺乏尿嘧啶、亮氨酸和组氨酸)中，初始OD600为0.1-0.2。

为了分析脂肪醇，离心1ml培养液，吸出并弃去上清液。将1ml的乙酸乙酯:乙醇(84:15)和10μL的Z10-17:Me(2mg/mL)作为内部标准品加入细胞沉淀物中。将样品涡旋20秒并在室温下孵育1小时，随后涡旋5分钟。将300μL的H₂O加入每个样品中。将样品在21℃和3000x g下涡旋并离心5分钟。通过气相色谱法-质谱法(GC-MS)对上层有机相进行分析。在偶联有质量选择性检测器Agilent 5977B的Agilent 7820A GC上进行GC-MS分析。所述GC装配有DB Fatwax柱(30m×0.25mm×0.25μm)，并用氦作为载气。以电子撞击模式(70eV)运行MS，扫描范围在m/z 30和400之间，进样器在220℃下以分流模式20:1配置。烘箱温度设定为80℃保持1分钟，然后以20℃/分钟的速率升温至210℃，随后在210℃保持7分钟，然后以20℃/分钟的速率升温至230℃。通过对比参考化合物的保留时间和质谱图来鉴定化合物。通过Agilent Masshunter软件分析数据。基于用参考标准制备的标准校正曲线来计算脂肪醇的浓度。

为了分析脂肪酸，通过在4℃和3000xg下离心5分钟收获每管形瓶1mL。用1000μL1M HCl的甲醇(无水)萃取每份沉淀。将样品涡旋20秒，并置于80℃水浴中2小时。每30分钟涡旋样品10秒。将样品冷却至室温以后，加入1000μL的1M NaOH在甲醇(无水)中的溶液、500μL的NaCl饱和水溶液、990μL的己烷和10μL的Z10-17:Me(2mg/mL)作为内标物。将样品在21℃和3000xg下涡旋并离心5分钟。如上所述通过GC-MS分析上层有机相。

实施例4-在酵母解脂耶氏酵母中生产Z9,E12-14:CoA

将来自大果蝇的ΔZ9-去饱和酶Desat61在解脂耶氏酵母菌株ST7982(Petkevicius等人，2021)中单独表达(ST10628)或者与来自印度谷螟的Pid12去饱和酶组合表达(ST10870)，以相应产生菌株ST10628和ST10870。如在实施例3中所述培养菌株并提取脂肪酸。

表达ΔZ9-去饱和酶Desat61的菌株ST10628产生了Z9-14:Me(图2B和表4)。同时表达ΔZ9-去饱和酶Desat61和新鉴定的Pid12去饱和酶的菌株ST10870产生了Z9-14:Me和双不饱和的C14-脂肪酸甲酯。双不饱和的C14脂肪酸甲酯以与分析标准品Z9,E12:Me相同的保留时间(10.2分钟)洗脱(图2A、C)，并显示与标准品相似的质谱图(图2D、E)。Z9-14:Me和Z9,E12-14:Me的滴度列于表5中。

表5.在酵母解脂耶氏酵母中生产Z9,E12-14:Me

实施例5-在解脂耶氏酵母中生产Z9,E12-14:OH

将来自大果蝇的去饱和酶Desat61和来自印度谷螟的Pid12去饱和酶在解脂耶氏酵母菌株ST7982(Petkevicius等人，2021)中单独表达或与来自不同昆虫种的脂肪酰基还原酶组合表达。如在实施例3中所述培养菌株并提取脂肪醇。

表达来自棉铃虫的脂肪酰基还原酶FAR1、来自甜菜夜蛾的FAR16、来自甜菜夜蛾的FAR17、来自斜纹夜蛾的FAR19以及来自印度谷螟的FAR28、FAR29和PiFAR31的菌株ST10872至ST10879相应地产生了Z9-14:OH和目标化合物Z9,E12-14:OH(表6)。表达FAR19的菌株ST10875产生了Z9,E12-14:OH，具有0.88mg/L的最高滴度。表达FAR29和FAR31的菌株ST10877和ST10879仅产生了微量的Z9-14:OH，但是不产生Z9,E12-14:OH。

表6.在解脂耶氏酵母中生产Z9,E12-14:OH

菌株ID	表达的基因	Z9-14:OH(mg/L)	Z9,E12-14:OH(mg/L)
				ST10871	Desat61 Pid12	0±0	0±0
ST10872	Desat61 Pid12 FAR1	91±13	0.65±0.1
				ST10873	Desat61 Pid12 FAR16	119±9	0.76±0.04
ST10874	Desat61 Pid12 FAR17	6±2	0.04±0.01
				ST10875	Desat61 Pid12 FAR19	127±8	0.88±0.04
ST10876	Desat61 Pid12 FAR28	3.3±1.5	0.03±0.01
				ST10877	Desat61 Pid12 FAR29	1.7±0.4	0±0
ST10879	Desat61 Pid12 FAR31	0.4±0.5	0±0

实施例6-在解脂耶氏酵母中表达印度谷螟去饱和酶

菌株ST10629和ST11190至ST11193表达ΔZ9去饱和酶Desat61、脂肪酰基还原酶FAR1和来自印度谷螟的各种去饱和酶基因。菌株ST10661充当仅表达Desat61和FAR1的对照菌株。

所有测试的菌株均产生Z9-14:OH，但只有表达Pid12的菌株ST10629以0.6mg/l的滴度产生Z9,E12-14:OH。

表6.在解脂耶氏酵母中生产Z9,E12-14:OH

实施例7-在酵母酿酒酵母中生产Z9,E12-14:CoA和Z9,E12-14:OH

如在Jensen等人,2014中所述，可以将ΔZ9去饱和酶Desat59或Desat61或另一种ΔZ9去饱和酶Pid12去饱和酶和脂肪酰基还原酶克隆至酿酒酵母基因表达载体中并转化进酿酒酵母中。可以如实施例3中进行菌株培养和样品提取。表达来自印度谷螟的ΔZ9去饱和酶和Pid12去饱和酶的菌株产生Z9,E12-14:Me，另外表达脂肪酰基还原酶基因的菌株产生Z9,E12-14:OH。

实施例8-使用其它脂肪酰基辅酶A还原酶在解脂耶氏酵母中生产Z9,E12-14:OH

将来自大果蝇的去饱和酶Desat61和来自印度谷螟的Pid12去饱和酶在解脂耶氏酵母菌株ST7982(Petkevicius等人,2021)中单独表达或与来自印度谷螟的脂肪酰基还原酶FAR32组合表达。如实施例3所述培养菌株并提取脂肪醇。

实施例9-生物基碳含量的测量

通过使用可以被称为“现代碳百分比(pMC)”的分析测量来测量根据本发明的信息素化合物的生物基碳含量。这是在样品中测量的同位素¹⁴C相对于现代参考标准(NIST4990C)的百分比。通过对当今空气中二氧化碳中的同位素¹⁴C应用小调整因子，由pMC计算出生物基碳含量百分比。

根据本发明的信息素化合物具有80％以上的生物基碳含量。

实施例10-在解脂耶氏酵母中生产Z9,E12-14:CoA

将来自大果蝇的ΔZ9-去饱和酶Desat61在解脂耶氏酵母菌株ST7982(Petkevicius等人,2021)中单独表达(ST10628)或与来自干果斑螟的EcauDes12去饱和酶组合表达(ST12930)以产生相应菌株ST10628和ST12930。如实施例3中所述培养菌株并提取脂肪酸。

菌株ST10628的衍生提取物含有Z9-14:Me，菌株ST12930的衍生提取物含有Z9-14:Me和Z9,E12-14:Me。

实施例11-在酵母酿酒酵母中生产Z9,E12-14:CoA

如Jensen等人,2014所述，将ΔZ9去饱和酶Desat59在酿酒酵母中单独表达或与Pid12组合表达。如实施例3进行菌株培养和样品提取。共表达Desat59和Pid12的菌株ST12585的衍生提取物含有0.05±0.00mg/L的Z9,E12-14:Me，而单独表达Desat59的菌株ST12587的提取物不含任何Z9,E12-14:Me。

实施例12-通过Z9,E12-14:OH的乙酰化来制备Z9,E12-14:OAc

在装配有磁力搅拌器的玻璃圆底烧瓶中进行乙酰化反应。向反应烧瓶中装入2g的Z9,E12-14:OH(91％纯度；9.5mmol)和1.06g的乙酸酐(99％纯度，10.5mmol，1.1当量)。将反应混合物在恒定混合下加热至80℃。2小时后，GC分析显示醇完全消耗。

减压蒸发乙酸副产物以及未反应的乙酸酐，得到2.28g无色油状物。GC-MS分析证实产物的结构为Z9,E12-14:OAc，纯度为92％(95％收率)(图3A和B)。

实施例13-使用替代性FAR在解脂耶氏酵母中产生Z9,E12-14:OH

将ΔZ9去饱和酶Desat61和Δ12去饱和酶Pid12与分别源自不同生物体的各种脂肪酰基辅酶A还原酶共表达。如在实施例3中所述培养菌株并提取脂肪醇，不同之处在于将细胞在YPG培养基中孵育47小时而不是22小时。

菌株ST10872、ST12294-ST12296、ST12299、ST12271-ST12274、ST12777和ST12779的提取物含有>0.01mg/L的Z9,E12-14:OH(如在下表中“+”所示)。

实施例14-使用替代性Δ9去饱和酶在解脂耶氏酵母中生产Z9,E12-14:酸

将Δ12去饱和酶Pid12和EcauDes12分别与源自不同生物体的各种Δ9去饱和酶共表达。如在实施例3中所述培养菌株并提取FAME，不同之处在于将细胞在YPG培养基中孵育47小时而不是22小时。

在仅表达Pid12的菌株ST12630的提取物中检测到最低滴度的Z9,E12-14:Me(>0mg/L，下表中以“+”表示)。在该菌株中，Z9-14:CoA(Δ12去饱和反应的底物)是由酵母天然去饱和酶OLE1作为副产物产生。

菌株ST12631、ST12632、ST12634、ST12635、ST12640、ST12256、ST12257、ST12260、ST12261和ST12266除了表达Δ12去饱和酶以外还表达异源Δ9去饱和酶。这些菌株的衍生提取物含有比菌株ST12630的提取物更高水平的Z9,E12-14:Me(≥0.02mg/L，如下表中“++”所示)。

实施例15-使用替代性Δ12去饱和酶在解脂耶氏酵母中生产Z9,E12-14:酸

设计并测试了Pid12和EcauDes12的融合蛋白变体。在这些变体中，Δ12去饱和酶Pid12和EcauDes12的N-端和C-端被印度谷螟去饱和酶Desat65或脐橙螟蛾去饱和酶Desat16的N-端和C-端替换。融合蛋白的序列同一性可见下表。如在实施例3中所述培养菌株并提取FAME，不同之处在于将细胞在YPG培养基中孵育47小时而不是22小时。

与分别表达未修饰的Pid12和EcauDes12的菌株ST12366和ST12367相比，表达Pid12变体的菌株ST12368，其中N-端和C-端(N-端氨基酸1-30、C-端氨基酸300-335)被Desat65的N-端和C-端(N-端氨基酸1-29、C-端氨基酸299-344)替换，产生了相似量的Z9,E12-14:Me(>0.02mg/L，如下表中“+”所示)。对于表达EcauDes12变体的菌株ST12374和ST12379，其中N-端和C-端(N-端氨基酸1-30、C-端氨基酸300-338)分别被去饱和酶Desat65(N-端氨基酸1-29、C-端氨基酸299-344)和Desat16(N-端氨基酸1-20；C-端氨基酸:302-326)的N-端和C-端替换，也观察到了相同的结果。

在表中显示了蛋白之间的序列同一性百分比。

		1	2	3	4	5
							EcauDes12	1		90.46	89.97	79.65	80.92
EcauDes12_N-端+Desat65_C-端	2	90.46		90.99	78.61	90.14
							EcauDes12_N-端+Desat16_C-端	3	89.97	90.99		80.12	81.16
Pid12	4	79.65	78.61	80.12		87.86
							Pid12_N-端+Desat65_C-端	5	80.92	90.14	81.16	87.86

实施例16-使用来自地中海粉斑螟的Δ12去饱和酶在解脂耶氏酵母中生产Z9,E12-14:酸

将地中海粉斑螟的去饱和酶与Δ9去饱和酶Desat61一起在解脂耶氏酵母(ST12596)中共表达。仅表达Desat61的菌株ST10748用作阴性对照。如实施例3中所述培养菌株并提取FAME，不同之处在于将细胞在YPG培养基中孵育47小时而不是22小时。

菌株ST12596的FAME提取物含有双不饱和的十四碳二烯酸甲酯(图4A)。10.39分钟的保留时间以及该峰的质谱与Z9,E12-14:Me的分析纯标准品相同(图4A、B和C)。对照菌株ST10748的提取物不含有在10.39分钟洗脱的化合物(图4A)。由于地中海粉斑螟去饱和酶能够引入Δ12双键，因此将它缩写为Eku_d12。

序列概述

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参考文献

Alfaro et al.2009.Optimization of pheromone dispenser density formanaging the rice striped stem borer,Chilo suppressalis(Walker),by matingdisruption.Crop Protection.28:567-572.

Bari,2003.Development of pheromone mating disruption strategies forthesuppression of the artichoke plume moth in artichokes grown on the centralcoastof California.ISHS Acta Horticulturae 660:V International CongressonArtichoke.doi:10.17660/ActaHortic.2004.660.80

Brady et al.1971.Sex stimulant and attractant in the Indian meal mothandin the almond moth.Science.171:802-804.

Deng,B et al.(2010).Study of the individual cytochrome b5andcytochrome b5 reductase domains of Ncb5or reveals a unique heme pocket andapossible role the CS domain.The Journal of Biological Chemistry,30181-30191.

Ding,BJ et al.(2021).B Bioproduction of(Z,E)-9,12-tetradecadienylacetate(ZETA),the major pheromone component of Plodia,Ephestia,and Spodoptera species in yeast.Pest Management Science,78(3),1048-1059.

Eizaguirre et al.2002.Effects of mating disruption againsttheMediterranean corn borer,Sesamia nonagrioides,on the European cornborerOstrinia nubilalis.Use of pheromones and other semiochemicals inintegratedproduction IOBC wprs Bulletin.

Holkenbrink et al.,2018.EasyCloneYALI:CRISPR/Cas9-BasedSyntheticToolbox for Engineering of the Yeast Yarrowia lipolytica.BiotechnolJ.,Sep；13(9)

Holkenbrink et al.,2020.Production of moth sex pheromones forpestcontrol by yeast fermentation.Metab Eng.2020 Nov；62:312-321.

Jensen et al.,2014.EasyClone:method for iterativechromosomalintegration of multiple genes in Saccharomyces cerevisiae.FEMSYeast Research,238-248.

Kehat&Dunkelblum,1993.Sex Pheromones:achievements in monitoringandmating disruption of cotton pests in Israel,Achieves of InsectBiochemistryand Physiology.22:425-431.

Petkevicius et al.,2021.Biotechnological production of the Europeancornborer sex pheromone in the yeast Yarrowia lipolytica.Biotechnology J.,Jun；16(6)

Tsakraklides et al.(2018).High-oleate yeast oil withoutpolyunsaturatedfatty acids.Biotechnology for biofuels,11,131.https://doi.org/10.1186/s13068-018-1131-y

Wakamura et al.(1987).Sex pheromone of the beet armyworm Spodopteraexigua(Hubner)(Lepidoptera:Noctuidae):Field attraction of male moths in Japanto(Z,E)-9 12-tetradecadienylacetate and(Z)-9tetradecen-1-ol.AppliedEntomology and Zoology,22(3),348–351.

Wu et al.,2012.Management of diamondback moth,Plutella xylostella(Lepidoptera:Plutellidae)by mating disruption.Insect Science 19(6),643–648.

Xia et al.,2019.Multi-Functional Desaturases in Two Spodoptera MothswithΔ11andΔ12Desaturation Activities.J Chem Ecol 45,378–387.

Zhu et al.,1999.Reidentification of the female sex pheromone of theIndian meal moth,Plodia interpunctella:Evidence for a four-componentpheromone blend.Entomologia Experimentalis Et Applicata,92(2),p.137-146.

项目

1.能够生产具有n’个双键的去饱和脂肪酰基-辅酶A(脂肪酰基辅酶A)的酵母细胞，其中所述双键中的至少一个位于12位，

其中所述酵母细胞表达异源Δ12脂肪酰基辅酶A去饱和酶，所述去饱和酶能够在碳链长度为至少13且具有n个双键的饱和或去饱和脂肪酰基辅酶A底物，优选去饱和脂肪酰基辅酶A的12位引入双键，

其中n和n’是整数，

其中0≤n≤3且其中1≤n’≤4。

2.根据项目1的酵母细胞，其中所述饱和或去饱和脂肪酰基辅酶A用作底物，并且所述具有n’个双键的去饱和脂肪酰基辅酶A具有相同的碳链长度。

3.根据前述项目中的任一项的酵母细胞，其中所述异源Δ12去饱和酶对于选自果斑螟属、粉斑螟属、谷斑螟属、Maliarpha和Amorbia的属的生物体而言是天然的。

4.根据前述项目中的任一项的酵母细胞，其中所述异源Δ12去饱和酶对于选自干果斑螟、烟草粉螟、地中海粉斑螟、印度谷螟、Maliarpha separatella和Amorbia cuneana的种的生物体而言是天然的。

5.根据前述项目中的任一项的酵母细胞，其中所述异源Δ12去饱和酶是谷斑螟属去饱和酶，诸如印度谷螟去饱和酶。

6.根据前述项目中的任一项的酵母细胞，其中所述异源Δ12去饱和酶是果斑螟属去饱和酶，诸如干果斑螟去饱和酶。

7.根据前述项目中的任一项的酵母细胞，其中所述异源Δ12去饱和酶是粉斑螟属去饱和酶，诸如烟草粉螟去饱和酶或地中海粉斑螟去饱和酶。

8.根据前述项目中的任一项的酵母细胞，其中所述异源Δ12去饱和酶是SEQ IDNO:2所示的Pid12去饱和酶或与其具有至少70％相似性或同一性，与其具有诸如至少80％、诸如至少90％、诸如至少91％、诸如至少92％、诸如至少93％、诸如至少94％、诸如至少95％、诸如至少96％、诸如至少97％、诸如至少98％、诸如至少99％、诸如100％相似性或同一性的其功能变体。

9.根据前述项目中的任一项的酵母细胞，其中所述异源Δ12去饱和酶是SEQ IDNO:55所示的EcauDes12去饱和酶或与其具有至少70％相似性或同一性，与其具有诸如至少80％、诸如至少90％、诸如至少91％、诸如至少92％、诸如至少93％、诸如至少94％、诸如至少95％、诸如至少96％、诸如至少97％、诸如至少98％、诸如至少99％、诸如100％相似性或同一性的其功能变体。

10.根据前述项目中的任一项的酵母细胞，其中所述异源Δ12去饱和酶是SEQ IDNO:85所示的Eku_d12去饱和酶或与其具有至少70％相似性或同一性，与其具有诸如至少80％、诸如至少90％、诸如至少91％、诸如至少92％、诸如至少93％、诸如至少94％、诸如至少95％、诸如至少96％、诸如至少97％、诸如至少98％、诸如至少99％、诸如100％相似性或同一性的其功能变体。

11.根据前述项目中的任一项的酵母细胞，其中所述异源Δ12去饱和酶是SEQ IDNO:87所示的Ee_d12去饱和酶或与其具有至少70％相似性或同一性，与其具有诸如至少80％、诸如至少90％、诸如至少91％、诸如至少92％、诸如至少93％、诸如至少94％、诸如至少95％、诸如至少96％、诸如至少97％、诸如至少98％、诸如至少99％、诸如100％相似性或同一性的其功能变体。

12.根据前述项目中的任一项的酵母细胞，其中所述异源Δ12去饱和酶选自SEQID NO:80、SEQ ID NO:81和SEQ ID NO:82所示的去饱和酶。

13.根据前述项目中的任一项的酵母细胞，其中所述碳链长度为至少13且具有n个双键的饱和或去饱和脂肪酰基辅酶A具有至少14，诸如至少15的碳长度。

14.根据前述项目中的任一项的酵母细胞，其中所述碳链长度为至少13且具有n个双键的饱和或去饱和脂肪酰基辅酶A是十四烷酰基辅酶A或(Z9)-十四烯酰基辅酶A。

15.根据前述项目中的任一项的酵母细胞，其中n＝1。

16.根据前述项目中的任一项的酵母细胞，其中所述碳链长度为至少13且具有n个双键的饱和或去饱和脂肪酰基辅酶A是(Z9)-十四烯酰基辅酶A。

17.根据前述项目中的任一项的酵母细胞，其中所述具有n’个双键的去饱和脂肪酰基辅酶A具有至少13，诸如至少14，诸如至少15，诸如至少16，诸如至少17，诸如至少18，诸如至少19，诸如至少20的碳链长度。

18.根据前述项目中的任一项的酵母细胞，其中所述具有n’个双键的去饱和脂肪酰基辅酶A具有至多18，诸如至多17，诸如至多16，诸如至多15，诸如至多14，诸如至少15，诸如至少16，诸如至少17，诸如至少18，诸如至少19，诸如至少20的碳链长度。

19.根据前述项目中的任一项的酵母细胞，其中n’＝1。

20.根据前述项目中的任一项的酵母细胞，其中所述具有n’个双键的去饱和脂肪酰基辅酶A是(E12)-十四烯酰基辅酶A。

21.根据前述项目中的任一项的酵母细胞，其中n’＝2。

22.根据前述项目中的任一项的酵母细胞，其中所述具有n’个双键的去饱和脂肪酰基辅酶A是(Z9,E12)-十四碳二烯酰基辅酶A。

23.根据前述项目中的任一项的酵母细胞，其中所述酵母细胞表达其它异源去饱和酶。

24.根据前述项目中的任一项的酵母细胞，其中所述其它异源去饱和酶能够在碳链长度为至少13且具有n个双键的饱和或去饱和脂肪酰基辅酶A的不是12位的任何位置处引入双键。

25.根据前述项目中的任一项的酵母细胞，其中所述其它异源去饱和酶能够至少在9位引入双键。

26.根据前述项目中的任一项的酵母细胞，其中所述其它异源去饱和酶选自由Δ9去饱和酶和Δ11去饱和酶组成的组。

27.根据前述项目中的任一项的酵母细胞，其中所述其它异源去饱和酶对十四烷酰基辅酶A或十四烯酰基辅酶A的特异性分别高于所述其它异源去饱和酶对十六烷酰基辅酶A或十六烷酰基辅酶A的特异性。

28.根据前述项目中的任一项的酵母细胞，其中所述其它异源去饱和酶是果蝇属或色卷蛾属去饱和酶，诸如黑腹果蝇、大果蝇、Drosophila grimshawi、Drosophilayakuba、Drosophila mojavensis、拟暗果蝇、嗜凤梨果蝇或Choristoneura parallela去饱和酶。

29.根据前述项目中的任一项的酵母细胞，其中所述其它异源去饱和酶是选自Desat59(SEQ ID NO:8)、Desat61(SEQ ID NO:4)、Desat56(SEQ ID NO:57)、Desat60(SEQID NO:59)和Desat24(SEQ ID NO:6)的果蝇属去饱和酶或与其具有至少70％相似性或同一性，与其具有诸如至少80％、诸如至少90％、诸如至少91％、诸如至少92％、诸如至少93％、诸如至少94％、诸如至少95％、诸如至少96％、诸如至少97％、诸如至少98％、诸如至少99％、诸如100％相似性或同一性的其功能变体。

30.根据前述项目中的任一项的酵母细胞，其中所述其它异源去饱和酶是Choristoneura parallela去饱和酶Desat74(SEQ ID NO:61)。

31.根据前述项目中的任一项的酵母细胞，其中所述酵母细胞能够生产(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇，所述酵母细胞进一步表达至少一种形成醇的脂肪酰基辅酶A还原酶(FAR)，其能够将至少一部分(Z9,E12)-十四碳二烯酰基辅酶A转化为(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇。

32.根据前述项目中的任一项的酵母细胞，其中所述FAR对于选自以下组成的组中的属的生物体而言是天然的：地老虎属、脐橙螟属、蔽眼蝶属、熊蜂属、禾草螟属、小卷蛾属、棉铃虫属、实夜蛾属、花翅小卷蛾属、秆野螟属、谷斑螟属、Plutella、灰翅夜蛾属、粉夜蛾属、倭夜蛾属和巢蛾属，诸如小地老虎、黄地老虎、脐橙螟蛾、偏瞳蔽眼蝶、红尾熊蜂、二化螟、苹果蠹蛾、棉铃虫、烟夜蛾、Heliothis subflexa、烟芽夜蛾、葡萄花翅小卷蛾、亚洲玉米螟、欧洲玉米螟、Ostrinia zag、Ostrinia zea、印度谷螟、菜蛾、甜菜夜蛾、草地贪夜蛾、海灰翅夜蛾、斜纹夜蛾、粉纹夜蛾、Tyta alba和Yponomeuta rorellus，特别是甜菜夜蛾、棉铃虫、斜纹夜蛾和印度谷螟。

33.根据前述项目中的任一项的酵母细胞，其中所述FAR选自FAR1(SEQ ID NO:20)、FAR16(SEQ ID NO:22)、FAR17(SEQ ID NO:24)、FAR19(SEQ ID NO:26)、FAR28(SEQ IDNO:28)或FAR32(SEQ ID NO:30)、FAR44(SEQ ID NO:63)、FAR48(SEQ ID NO:65)、FAR49(SEQID NO:67)、FAR38(SEQ ID NO:32)、FAR4(SEQ ID NO:69)、FAR6(SEQ ID NO:71)、FAR8(SEQID NO:73)、FAR12(SEQ ID NO:75)、FAR11(SEQ ID NO:77)或FAR5(SEQ ID NO:79)或与其具有至少70％相似性或同一性，与其具有诸如至少80％、诸如至少90％、诸如至少91％、诸如至少92％、诸如至少93％、诸如至少94％、诸如至少95％、诸如至少96％、诸如至少97％、诸如至少98％、诸如至少99％、诸如100％相似性或同一性的其功能变体。

34.根据前述项目中的任一项的酵母细胞，其中所述酵母细胞属于选自酵母属、毕赤酵母属、耶氏酵母属、克鲁维酵母属、假丝酵母属、红酵母属、红冬孢酵母属、隐球菌属、丝孢酵母属和油脂酵母属的属，任选地其中所述酵母细胞属于选自酿酒酵母、布拉氏酵母、巴斯德毕赤酵母、马克思克鲁维酵母、热带假丝酵母、浅白隐球菌、产油油脂酵母、斯氏油脂酵母、圆红冬孢酵母、粘红酵母、出芽丝孢酵母和解脂耶氏酵母的种，优选地所述酵母细胞是解脂耶氏酵母细胞或酿酒酵母细胞。

35.根据前述项目中的任一项的酵母细胞，所述酵母细胞进一步表达异源NAD(P)H细胞色素b5氧化还原酶(Ncb5or)。

36.根据前述项目中的任一项的酵母细胞，其中所述Ncb5or对于植物、昆虫或哺乳动物，诸如智人而言是天然的。

37.根据前述项目中的任一项的酵母细胞，其中所述Ncb5or对于昆虫，诸如地老虎属、脐橙螟属、Aphantopus、灯蛾属、蔽眼蝶属、熊蜂属、家蚕属、禾草螟属、小卷蛾属、Danaus、果蝇属、Eumeta、Galleria、棉铃虫属、实夜蛾属、Hyposmocoma、小粉蝶属、花翅小卷蛾属、Manduca、Operophtera、秆野螟属、Papilio、Papilio、Papilio、菜粉蝶属、Plutella、灰翅夜蛾属、粉夜蛾属和红蛱蝶属的昆虫而言是天然的。

38.根据前述项目中的任一项的酵母细胞，其中所述Ncb5or对于选自黄地老虎、脐橙螟蛾、Aphantopus hyperantus、车前灯蛾、偏瞳蔽眼蝶、欧洲熊蜂、野桑蚕、家蚕、二化螟、苹果蠹蛾、黑脉金斑蝶、Drosophila grimshawi、黑腹果蝇、大避债蛾、大蜡螟、棉铃虫、烟芽夜蛾、Hyposmocoma kahamanoa、条纹小粉蝶、葡萄花翅小卷蛾、烟草天蛾、冬尺蠖蛾、亚洲玉米螟、金凤蝶、玉带凤蝶、柑橘凤蝶、菜粉蝶、菜蛾、草地贪夜蛾、斜纹夜蛾、粉纹夜蛾和特美红蛱蝶的昆虫而言是天然的。

39.根据前述项目中的任一项的酵母细胞，其中所述Ncb5or选自SEQID NO:37、SEQID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89或SEQ ID NO:90所示的Ncb5or或与其具有至少70％同一性或相似性，与其具有诸如至少75％同一性、诸如至少80％同一性、诸如至少85％同一性、诸如至少90％同一性、诸如至少95％同一性或相似性的功能变体。

40.根据前述项目中的任一项的酵母细胞，其具有引起Hfd1、Hfd4、Pex10、GPAT和/或Fao1中的一种或多种的活性部分或全部丧失的突变，诸如至少具有引起Fao1，以及Hfd1、Hfd4、Pex10和/或GPAT中的一种或多种的活性部分或全部丧失的突变。

41.根据前述项目中的任一项的酵母细胞，其具有PEX10以及HFD1、HFD4、FAO1和/或GPAT中的至少一种或其同源物中的突变。

42.根据前述项目中的任一项的酵母细胞，其具有FAO1以及HFD1、HFD4、PEX10和/或GPAT中的至少一种或其同源物中的突变。

43.根据前述项目中的任一项的酵母细胞，其中HFD1、HFD4、PEX10和/或FAO1或与其具有至少60％同一性的其功能变体被删除或突变，从而引起Hfd1、Hfd4、Pex10和/或Fao1的活性部分丧失或全部丧失，和/或其中GPAT或与其具有至少60％同一性的其功能变体被突变，从而引起GPAT的活性降低。

44.根据前述项目中的任一项的酵母细胞，包含在至少一种POX基因，诸如选自由POX1、POX2、POX3、POX4、POX5和POX6组成的组中的POX基因中的突变。

45.根据前述项目中的任一项的酵母细胞，其中POX1、POX2、POX3、POX4、POX5和/或POX6或与其具有至少60％同一性的其功能变体被删除或突变，从而引起Pox1、Pox2、Pox3、Pox4、Pox5和/或Pox6的活性部分丧失或全部丧失。

46.根据前述项目中的任一项的酵母细胞，其中所述酵母细胞进一步表达：

-异源细胞色素b5；

-异源细胞色素b5还原酶；

-血红蛋白；

-异源硫酯酶基因；和/或

-脂肪酰基合酶和硫酯酶的融合蛋白。

47.根据前述项目中的任一项的酵母细胞，其具有以下酶的灭活或修饰：

-引起活性全部或部分丧失的天然延长酶；

-引起活性全部或部分丧失的硫酯酶；和/或

-天然脂肪醛脱氢酶、脂肪醇氧化酶、过氧化物酶体生物发生因子和/或脂肪酰基合酶的活性。

48.根据前述项目中的任一项的酵母细胞，其中所述酵母细胞进一步被修饰以增加十四烷酰基辅酶A的可用性。

49.根据前述项目中的任一项的酵母细胞，其中编码异源Δ12去饱和酶、其它异源去饱和酶或FAR的基因中的至少一个以高拷贝数存在。

50.根据前述项目中的任一项的酵母细胞，其中编码异源Δ12去饱和酶、其它异源去饱和酶或FAR的基因中的至少一个是在诱导型启动子的控制下。

51.根据前述项目中的任一项的酵母细胞，其中编码异源Δ12去饱和酶、其它异源去饱和酶或FAR的基因中的至少一个各自独立地被包含在所述细胞的基因组内或所述酵母细胞内所包含的载体内。

52.根据前述项目中的任一项的酵母细胞，其中所述酵母细胞能够以至少1mg/L，诸如至少1.5mg/L，诸如至少1.7mg/L或更高的的滴度生产(Z9,E12)-十四碳二烯酸。

53.根据前述项目中的任一项的酵母细胞，其中所述酵母细胞能够以至少20mg/L，诸如至少50mg/L，诸如至少60mg/L，诸如至少70mg/L，诸如至少80mg/L，诸如至少90mg/L，诸如至少100mg/L，诸如至少150mg/L，诸如至少200mg/L，诸如至少250mg/L，诸如至少500mg/L，诸如至少750mg/L，诸如至少1g/L，诸如至少2g/L，诸如至少3g/L，诸如至少4g/L，诸如至少5g/L，诸如至少6g/L，诸如至少7g/L，诸如至少8g/L，诸如至少9g/L，诸如至少10g/L或更高的滴度生产E12-脂肪酸和/或(Z9,E12)-十四碳二烯酸。

54.根据前述项目中的任一项的酵母细胞，其中所述酵母细胞能够以至少0.005mg/L，诸如至少0.01mg/L，诸如至少0.02mg/L，诸如至少0.03mg/L，诸如至少0.05mg/L，诸如至少0.06mg/L，诸如至少0.075mg/L，诸如至少0.1mg/L，诸如至少0.2mg/L，诸如至少0.3mg/L，诸如至少0.4mg/L，诸如至少0.5mg/L，诸如至少0.6mg/L，诸如至少0.7mg/L，诸如至少0.8mg/L，诸如至少0.9mg/L，诸如至少1mg/L，诸如至少2mg/L，诸如至少3mg/L，诸如至少4mg/L，诸如至少5mg/L，诸如至少6mg/L，诸如至少7mg/L，诸如至少8mg/L，诸如至少9mg/L，诸如至少10mg/L或更高的滴度生产E12-脂肪醇和/或(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇。

55.用于在酵母细胞中生产具有n’个双键的去饱和脂肪酰基辅酶A的方法，其中所述双键中的至少一个位于12位，所述方法包括以下步骤：

i)提供根据项目1至54中的任一项的酵母细胞，

其中n和n’是整数，

其中0≤n≤3且其中1≤n’≤4，

56.根据项目55的方法，其中所述异源Δ12去饱和酶如前述项目中的任一项中所限定。

57.根据项目55至56中的任一项的方法，其中所述其它异源去饱和酶如前述项目中的任一项中所限定。

58.根据项目55至57中的任一项的方法，其中所述具有n’个双键的去饱和脂肪酰基辅酶A如前述项目中的任一项中所限定。

59.根据项目55至58中的任一项的方法，其中所述碳链长度为至少13且具有n个双键的饱和或去饱和脂肪酰基辅酶A如前述项目中的任一项中所限定。

60.根据项目55至59中的任一项的方法，其中所述酵母细胞进一步表达至少一种形成醇的脂肪酰基辅酶A还原酶(FAR)，其能够将至少一部分(Z9,E12)-十四碳二烯酰基辅酶A转化为(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇。

61.根据项目55至60中的任一项的方法，其中所述FAR如前述项目中的任一项中所限定。

62.根据项目55至61中的任一项的方法，进一步包括：将所述E12-脂肪醇和/或所述(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇配制在信息素组合物中的步骤。

63.根据项目55至62中的任一项的方法，进一步包括：回收所述E12-脂肪醇和/或(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇的步骤。

64.根据项目55至63中的任一项的方法，其中将所述E12-脂肪醇和/或所述(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇分别进一步转化为E12-脂肪醇乙酸酯和/或(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇乙酸酯。

65.根据项目55至64中的任一项的方法，其中将所述E12-脂肪醇和/或所述(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇分别进一步转化为E12-脂肪醛和/或(Z9,E12)-十四碳二烯醛。

66.根据项目55至65中的任一项的方法，其中所述E12-脂肪醇和/或所述(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇向E12-脂肪醇乙酸酯和/或(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇乙酸酯的转化：

a.通过在所述酵母细胞中进一步表达乙酰基转移酶在体内进行，所述乙酰基转移酶能够将所述E12-脂肪醇和/或所述(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇分别转化为E12-脂肪醇乙酸酯和/或(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇乙酸酯；或

b.例如通过化学转化在体外进行。

67.根据项目55至66中的任一项的方法，其中将所述E12-脂肪醇和/或所述(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇氧化成(E12)-脂肪醛和/或(Z9,E12)-十四碳二烯醛，任选地其中通过化学方式进行所述氧化。

68.根据项目55至66中的任一项的方法，其中将所述E12-脂肪醇和/或所述(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇通过化学方式乙酰化为E12-脂肪醇乙酸酯和/或(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇乙酸酯。

69.用于修饰酵母细胞的核酸或核酸系统，所述核酸或核酸系统包含至少一种编码异源Δ12去饱和酶的多核苷酸，所述去饱和酶能够在碳链长度为至少13且具有n个双键的饱和或去饱和脂肪酰基辅酶A的12位引入双键，从而生产具有n’个双键的去饱和脂肪酰基辅酶A，其中所述双键中的至少一个位于12位，

其中n和n’是整数，

其中0≤n≤3且其中1≤n’≤4。

70.根据项目69的核酸或核酸系统，其中所述异源Δ12去饱和酶由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:84和SEQ ID NO:86所示的序列中的任一个或与其具有至少80％同一性，与其具有诸如至少85％同一性，诸如至少90％同一性，诸如至少91％同一性，诸如至少92％同一性，诸如至少93％同一性，诸如至少94％同一性，诸如至少95％同一性，诸如至少96％同一性，诸如至少97％同一性，诸如至少98％同一性，诸如至少99％同一性的其功能变体编码。

71.根据项目69至70中的任一项的核酸或核酸系统，其中所述核酸或核酸系统进一步包含编码其它异源去饱和酶的多核苷酸，所述其它异源去饱和酶能够在碳链长度为至少13且具有n个双键的饱和或去饱和脂肪酰基辅酶A中不是12位的任何位置处引入双键。

72.根据项目67至71中的任一项的核酸或核酸系统，其中所述其它异源去饱和酶由SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:60所示的序列中的任一个或与其具有至少80％同一性，与其具有诸如至少85％同一性，诸如至少90％同一性，诸如至少91％同一性，诸如至少92％同一性，诸如至少93％同一性，诸如至少94％同一性，诸如至少95％同一性，诸如至少96％同一性，诸如至少97％同一性，诸如至少98％同一性，诸如至少99％同一性的其功能变体编码。

73.根据项目67至72中的任一项的核酸或核酸系统，其中所述核酸或核酸系统进一步包含编码脂肪酰基辅酶A还原酶(FAR)的多核苷酸，所述FAR能够将至少一部分双去饱和的(Z9,E12)-十四碳二烯酰基辅酶A转化为(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇。

74.根据项目73的核酸或核酸系统，其中所述FAR由SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ IDNO:76和SEQ ID NO:78所示的序列中的任一个或与其具有至少80％同一性，与其具有诸如至少85％同一性，诸如至少90％同一性，诸如至少91％同一性，诸如至少92％同一性，诸如至少93％同一性，诸如至少94％同一性，诸如至少95％同一性，诸如至少96％同一性，诸如至少97％同一性，诸如至少98％同一性，诸如至少99％同一性的其功能变体编码。

75.监测害虫的存在或干扰害虫的交配的方法，所述方法包括以下步骤：

i)通过根据项目55至63中的任一项的方法生产(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇和/或E12-脂肪醇；

v)采用所述信息素组合物作为害虫综合治理组合物。

76.一种信息素组合物，所述信息素能够通过包括下述步骤的方法来得到：

i)通过根据项目55至63中的任一项的方法生产(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇和/或(E12)-脂肪醇；

iv)将所述(E12)-脂肪醇、(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇、E12-脂肪醇乙酸酯、(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇乙酸酯、(E12)-脂肪醛和/或(Z9,E12)-十四碳二烯醛配制为信息素组合物。

77.一种信息素组合物，包含E12-脂肪醇、(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇、E12-脂肪醇乙酸酯、(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇乙酸酯、E12-脂肪醛和/或(Z9,E12)-十四碳二烯醛，其中所述信息素组合物包含至少20％生物基碳。

78.一种信息素化合物，选自E12-脂肪醇、(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇、E12-脂肪醇乙酸酯、(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇乙酸酯、E12-脂肪醛和(Z9,E12)-十四碳二烯醛，其中所述信息素化合物包含至少20％生物基碳。

79.根据项目77的信息素组合物，进一步包含选自液体载体、固体载体和基质的一种或多种另外化合物。

80.根据项目77或79中的任一项的信息素组合物，进一步包含选自由植物油、精炼矿物油或其级分、橡胶、塑料、硅土、硅藻土、蜡基体(wax matrix)和纤维素粉末组成的组中的一种或多种化合物。

81.根据项目77或79-80中的任一项的信息素组合物，其中所述信息素组合物是溶液、凝胶或粉末的形式。

82.根据项目77或79-81中的任一项的信息素组合物，其中所述信息素组合物被配制为使得其可以被分配。

83.根据项目77或79-82中的任一项的信息素组合物，其中在所述信息素组合物中，(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇与E12-脂肪醇的比例、(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇乙酸酯与E12-脂肪醇乙酸酯的比例和/或(Z9,E12)-十四碳二烯醛与E12-脂肪醛的比例为至少0.1，诸如至少0.15，诸如至少0.2，诸如至少0.3，诸如至少0.4，诸如至少0.5，诸如至少0.75，诸如至少1，诸如至少2，诸如至少3，诸如至少4，诸如至少5，诸如至少6，诸如至少7，诸如至少8，诸如至少9，诸如至少10，诸如至少12.5，诸如至少15或更高。

84.根据项目77或79-83中的任一项的信息素组合物，其中在所述信息素组合物中，(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇与(Z9,E12)-十四碳二烯醛的比例和/或(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇与(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇乙酸酯的比例为至少0.1，诸如至少0.15，诸如至少0.2，诸如至少0.3，诸如至少0.4，诸如至少0.5，诸如至少0.75，诸如至少1，诸如至少2，诸如至少3，诸如至少4，诸如至少5，诸如至少6，诸如至少7，诸如至少8，诸如至少9，诸如至少10，诸如至少12.5，诸如至少15或更高。

85.根据项目77或79-84中的任一项的信息素组合物，其中在所述信息素组合物中，(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇与Z9-脂肪醇的比例、(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇乙酸酯与Z9-脂肪醇乙酸酯的比率和/或(Z9,E12)-十四碳二烯醛与Z9-脂肪醛的比率为至少0.1，诸如至少0.15，诸如至少0.2，诸如至少0.3，诸如至少0.4，诸如至少0.5，诸如至少0.75，诸如至少1，诸如至少2，诸如至少3，诸如至少4，诸如至少5，诸如至少6，诸如至少7，诸如至少8，诸如至少9，诸如至少10，诸如至少12.5，诸如至少15或更高。

86.根据项目77-85中的任一项的信息素组合物或信息素化合物，其中所述信息素组合物或所述信息素化合物包含至少30％生物基碳，可替换地40％生物基碳，可替换地50％生物基碳，可替换地60％生物基碳，可替换地70％生物基碳，可替换地75％生物基碳，可替换地80％生物基碳，可替换地85％生物基碳，可替换地90％生物基碳，可替换地95％生物基碳。

87.根据项目77-86中的任一项的信息素组合物或信息素化合物，其中所述信息素组合物或所述信息素化合物包含至少80％生物基碳，可替换地85％生物基碳，可替换地90％生物基碳，可替换地95％生物基碳，可替换地96％生物基碳，可替换地97％生物基碳，可替换地98％生物基碳，可替换地99％生物基碳。

88.根据项目77-87中的任一项的信息素组合物或信息素化合物，其中所述信息素组合物或所述信息素化合物包含30％至100％生物基碳，可替换地40％至100％生物基碳，可替换地50％至100％生物基碳，可替换地60％至100％生物基碳，可替换地70％至100％生物基碳，可替换地75％至100％生物基碳，可替换地80％至100％生物基碳，可替换地85％至100％生物基碳，可替换地90％至100％生物基碳，可替换地95％至100％生物基碳。

89.根据项目77-88中的任一项的信息素组合物或信息素化合物，其中所述信息素组合物或所述信息素化合物包含80％至100％生物基碳，可替换地85％至100％生物基碳，可替换地90％至100％生物基碳，可替换地95％至100％生物基碳，可替换地96％至100％生物基碳，可替换地97％至100％生物基碳，可替换地98％至100％生物基碳，可替换地99％至100％生物基碳。

90.用于生产根据项目77或79-89中的任一项的信息素组合物的方法，所述方法包括下述步骤：

iv)将所述(E12)-脂肪醇、(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇、E12-脂肪醇乙酸酯、(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇乙酸酯、(E12)-脂肪醛和/或(Z9,E12)-十四碳二烯醛配制为信息素组合物，所述信息素组合物任选地包含一种或多种另外的化合物，诸如液体或固体载体或基质；

v)任选地确定所述信息素组合物的生物基碳含量。

91.用于在酵母细胞中生产根据项目78-89中的任一项的信息素化合物的方法，所述方法包括以下步骤：

i)提供表达异源Δ12脂肪酰基辅酶A去饱和酶的酵母细胞，

从而生产所述信息素化合物。

92.能够生产根据项目78-89中的任一项的信息素化合物的酵母细胞，其中所述酵母细胞表达异源Δ12脂肪酰基辅酶A去饱和酶。

93.根据项目91-92中的任一项的方法或酵母细胞，其中所述酵母细胞表达其它异源去饱和酶。

94.根据项目91-93中的任一项的方法或酵母细胞，其中所述酵母细胞进一步表达至少一种形成醇的脂肪酰基辅酶A还原酶(FAR)。

95.根据项目91-94中的任一项的方法，进一步包括确定所述信息素化合物的生物基碳含量的步骤。

96.印度谷螟去饱和酶在用于在饱和或去饱和脂肪酰基辅酶A的12位引入双键的方法中的用途。

97.根据项目96的用途，其中所述去饱和脂肪酰基辅酶A的碳长度为12或更长，诸如13，诸如14，诸如15或更长；和/或所述饱和脂肪酸甲酯的碳长度为12或更长，诸如13，诸如14，诸如15或更长。

98.根据项目96至97中的任一项的用途，其中所述印度谷螟去饱和酶是Pid12(SEQID NO:2)或与其具有至少70％相似性或同一性，与其具有诸如至少80％、诸如至少90％、诸如至少91％、诸如至少92％、诸如至少93％、诸如至少94％、诸如至少95％、诸如至少96％、诸如至少97％、诸如至少98％、诸如至少99％、诸如100％相似性或同一性的其功能变体。

99.干果斑螟去饱和酶在用于在饱和或去饱和脂肪酰基辅酶A的12位引入双键的方法中的用途。

100.根据项目99的用途，其中所述去饱和脂肪酰基辅酶A的碳长度为12或更长，诸如13，诸如14，诸如15或更长；和/或所述饱和脂肪酸甲酯的碳长度为12或更长，诸如13，诸如14，诸如15或更长。

101.根据项目99至100中的任一项的用途，其中所述干果斑螟去饱和酶是EcauDes12(SEQ ID NO:55)或与其具有至少70％相似性或同一性，与其具有诸如至少80％、诸如至少90％、诸如至少91％、诸如至少92％、诸如至少93％、诸如至少94％、诸如至少95％、诸如至少96％、诸如至少97％、诸如至少98％、诸如至少99％、诸如100％相似性或同一性的其功能变体。

102.地中海粉斑螟去饱和酶在用于在饱和或去饱和脂肪酰基辅酶A的12位引入双键的方法中的用途。

103.根据项目102的用途，其中所述去饱和脂肪酰基辅酶A的碳长度为12或更长，诸如13，诸如14，诸如15或更长；和/或所述饱和脂肪酸甲酯的碳长度为12或更长，诸如13，诸如14，诸如15或更长。

104.根据项目102至103中的任一项的用途，其中所述地中海粉斑螟去饱和酶是Eku_d12(SEQ ID NO:85)或与其具有至少70％相似性或同一性，与其具有诸如至少80％、诸如至少90％、诸如至少91％、诸如至少92％、诸如至少93％、诸如至少94％、诸如至少95％、诸如至少96％、诸如至少97％、诸如至少98％、诸如至少99％、诸如100％相似性或同一性的其功能变体。

105.烟草粉螟去饱和酶在用于在饱和或去饱和脂肪酰基辅酶A的12位引入双键的方法中的用途。

106.根据项目105的用途，其中所述去饱和脂肪酰基辅酶A的碳长度为12或更长，诸如13，诸如14，诸如15或更长；和/或所述饱和脂肪酸甲酯的碳长度为12或更长，诸如13，诸如14，诸如15或更长。

107.根据项目105至106中的任一项的用途，其中所述烟草粉螟去饱和酶是Ee_d12(SEQ ID NO:87)或与其具有至少70％相似性或同一性，与其具有诸如至少80％、诸如至少90％、诸如至少91％、诸如至少92％、诸如至少93％、诸如至少94％、诸如至少95％、诸如至少96％、诸如至少97％、诸如至少98％、诸如至少99％、诸如100％相似性或同一性的其功能变体。

108.根据项目96至101中的任一项的用途，其中所述方法在体外进行。

109.根据项目96至108中的任一项的用途，其中所述方法在体内进行，优选地其中在根据项目1至54中的任一项的酵母细胞中进行所述方法。

110.能够通过根据项目55至64中的任一项的方法得到的(Z9,E12)-十四碳二烯酰基辅酶A。

111.能够通过根据项目60至64中的任一项的方法得到的(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇。

112.包含根据项目1至54中的任一项的酵母细胞的发酵液。

113.能够生产(Z9,E12)-十四碳二烯酰基辅酶A的酵母细胞，所述酵母细胞表达：

i)至少一种第一异源去饱和酶，其能够在十四烷酰基辅酶A的9位引入第一个双键，从而将所述十四烷酰基辅酶A转化为(Z9)-十四烯酰基辅酶A；和

ii)至少一种第二异源去饱和酶，其能够在(Z9)-十四烯酰基辅酶A的12位引入第二个双键，从而将(Z9)-十四烯酰基辅酶A转化为(Z9,E12)-十四碳二烯酰基辅酶A。

114.能够生产去饱和脂肪酰基辅酶A的酵母细胞，所述酵母细胞表达Pid12(SEQID NO:2)去饱和酶、EcauDes12(SEQ ID NO:55)去饱和酶、Eku_d12(SEQ ID NO:85)或Ee_d12(SEQ ID NO:87)去饱和酶，其能够在脂肪酰基辅酶A的12位引入反式-双键，从而将所述脂肪酰基辅酶A转化为E12-脂肪酰基辅酶A。

115.用于生产(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇的方法，所述方法包括以下步骤：

i)提供根据项目1至54中的任一项的酵母细胞，

ii)在允许表达以下酶的条件下于培养基中孵育所述酵母细胞：

a.其它去饱和酶，所述去饱和酶能够在十四烷酰基辅酶A中的9位引入双键，从而将至少一部分十四烷酰基辅酶A转化为(Z9)-十四烯酰基辅酶A；

b.异源Δ12去饱和酶，所述去饱和酶能够在(Z9)-十四烯酰基辅酶A的12位引入双键，从而将至少一部分(Z9)-十四烯酰基辅酶A转化为(Z9,E12)-十四碳二烯酰基辅酶A；

c.FAR，所述FAR能够将至少一部分(Z9,E12)-十四碳二烯酰基辅酶A转化为(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇；

iii)任选地，回收所述(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇；

vi)任选地，将所述(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇、所述(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇乙酸酯和/或所述(Z9,E12)-十四碳二烯醛配制为信息素组合物。

Claims

1.能够生产具有n’个双键的去饱和脂肪酰基-辅酶A(脂肪酰基-CoA)的酵母细胞，其中所述双键中的至少一个位于12位，

其中n和n’是整数，

其中0≤n≤3且其中1≤n’≤4。

2.根据权利要求1所述的酵母细胞，其中所述异源Δ12去饱和酶对于选自由果斑螟属(Cadra)、粉斑螟属(Ephestia)、谷斑螟属(Plodia)、Maliarpha、Fumibotys和Amorbia组成的组的属的生物体而言是天然的，诸如对于选自由干果斑螟(Cadra cautella)、烟草粉螟(Ephestia elutella)、地中海粉斑螟(Ephestia kuehniella)、印度谷螟(Plodiainterpunctella)、Maliarpha separatella和Amorbia cuneana组成的组的种的生物体而言是天然的，任选地其中所述异源Δ12去饱和酶是谷斑螟属去饱和酶，诸如印度谷螟去饱和酶，或果斑螟属去饱和酶，诸如干果斑螟去饱和酶，或粉斑螟属去饱和酶，诸如烟草粉螟或地中海粉斑螟去饱和酶，进一步任选地其中所述异源Δ12去饱和酶是SEQ ID NO:2所示的Pid12去饱和酶或SEQ ID NO:85所示的Eku_d12去饱和酶或与其具有至少70％相似性或同一性的，与其具有诸如至少80％、诸如至少90％、诸如至少91％、诸如至少92％、诸如至少93％、诸如至少94％、诸如至少95％、诸如至少96％、诸如至少97％、诸如至少98％、诸如至少99％、诸如100％相似性或同一性的其功能同源物。

3.根据前述权利要求中的任一项所述的酵母细胞，其中所述异源Δ12去饱和酶选自SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81和SEQ ID NO:82所示的去饱和酶。

4.根据前述权利要求中的任一项所述的酵母细胞，其中所述碳链长度为至少13且具有n个双键的饱和或去饱和脂肪酰基辅酶A：

i)具有至少14，诸如至少15的碳长度；

ii)是十四烷酰基辅酶A或十四烯酰基辅酶A；

iii)具有一个双键(即n＝1)；和/或

iv)是(Z9)-十四烯酰基辅酶A。

5.根据前述权利要求中的任一项所述的酵母细胞，其中所述具有n’个双键的去饱和脂肪酰基辅酶A：

i)具有至多18，诸如至多17，诸如至多16，诸如至多15，诸如至多14，诸如至少15，诸如至少16，诸如至少17，诸如至少18，诸如至少19，诸如至少20的碳链长度；

ii)具有一个双键(即n’＝1)；

iii)具有两个双键(即n’＝2)；

iv)是(E12)-十四烯酰基辅酶A；和/或

v)是(Z9,E12)-十四碳二烯酰基辅酶A。

6.根据前述权利要求中的任一项所述的酵母细胞，其中所述酵母细胞表达其它异源去饱和酶；任选地其中所述其它异源去饱和酶能够在碳链长度为至少13且具有n个双键的饱和或去饱和脂肪酰基辅酶A的不是12位的任何位置处引入双键；任选地其中所述其它异源去饱和酶能够至少在9位引入双键；进一步任选地其中所述其它异源去饱和酶选自由Δ9去饱和酶和Δ11去饱和酶组成的组。

7.根据权利要求6所述的酵母细胞，其中所述其它异源去饱和酶是果蝇属(Drosophila)或色卷蛾属(Choristoneura)去饱和酶，诸如黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)、大果蝇(Drosophila virilis)、Drosophila grimshawi、Drosophilayakuba、Drosophila mojavensis、拟暗果蝇(Drosophila pseudoobscura)、嗜凤梨果蝇(Drosophila ananassae)或Choristoneura parallela去饱和酶，任选地其中所述其它异源去饱和酶选自由以下组成的组：Desat59(SEQ ID NO:8)、Desat61(SEQ ID NO:4)、Desat56(SEQ ID NO:57)、Desat60(SEQ ID NO:59)、Desat74(SEQ ID NO:61)和Desat24(SEQ ID NO:6)或与其具有至少70％相似性或同一性，与其具有诸如至少80％、诸如至少90％、诸如至少91％、诸如至少92％、诸如至少93％、诸如至少94％、诸如至少95％、诸如至少96％、诸如至少97％、诸如至少98％、诸如至少99％、诸如100％相似性或同一性的其功能变体。

8.根据前述权利要求中的任一项所述的酵母细胞，其中所述酵母细胞能够生产(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇，所述酵母细胞进一步表达至少一种形成醇的脂肪酰基辅酶A还原酶(FAR)，所述FAR能够将至少一部分(Z9,E12)-十四碳二烯酰基辅酶A转化为(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇；任选地其中所述FAR对于选自由以下组成的组的属的生物体而言是天然的：地老虎属(Agrotis)、脐橙螟属(Amyelois)、蔽眼蝶属(Bicyclus)、熊蜂属(Bombus)、禾草螟属(Chilo)、小卷蛾属(Cydia)、棉铃虫属(Helicoverpa)、实夜蛾属(Heliothis)、花翅小卷蛾属(Lobesia)、秆野螟属(Ostrinia)、谷斑螟属(Plodia)、菜蛾属(Plutella)、灰翅夜蛾属(Spodoptera)、粉夜蛾属(Trichoplusia)、倭夜蛾属(Tyta)和巢蛾属(Yponomeuta)，诸如小地老虎(Agrotis ipsilon)、黄地老虎(Agrotis segetum)、脐橙螟蛾(Amyeloistransitella)、偏瞳蔽眼蝶(Bicyclus anynana)、红尾熊蜂(Bombus lapidarius)、二化螟(Chilo Suppressalis)、苹果蠹蛾(Cydia pomonella)、棉铃虫(Helicoverpa armigera)、烟夜蛾(Helicoverpa assulta)、Heliothis subflexa、烟芽夜蛾(Heliothis virescens)、葡萄花翅小卷蛾(Lobesia botrana)、亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)、欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)、Ostrinia zag、Ostrinia zea、印度谷螟(Plodiainterpunctella)、菜蛾(Plutella xylostella)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)、海灰翅夜蛾(Spodoptera littoralis)、斜纹夜蛾(Spodoptera litura)、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)、Tyta alba和Yponomeuta rorellus，特别是甜菜夜蛾、棉铃虫、斜纹夜蛾和印度谷螟；进一步任选地其中所述FAR选自由以下组成的组：FAR1(SEQ ID NO:20)、FAR16(SEQ ID NO:22)、FAR17(SEQ ID NO:24)、FAR19(SEQID NO:26)、FAR28(SEQ ID NO:28)、FAR32(SEQ ID NO:30)、FAR44(SEQ ID NO:63)、FAR48(SEQ ID NO:65)、FAR49(SEQ ID NO:67)、FAR38(SEQ ID NO:32)、FAR4(SEQ ID NO:69)、FAR6(SEQ ID NO:71)、FAR8(SEQ ID NO:73)、FAR12(SEQ ID NO:75)、FAR11(SEQ ID NO:77)或FAR5(SEQ ID NO:79)或与其具有至少70％相似性或同一性，与其具有诸如至少80％、诸如至少90％、诸如至少91％、诸如至少92％、诸如至少93％、诸如至少94％、诸如至少95％、诸如至少96％、诸如至少97％、诸如至少98％、诸如至少99％、诸如100％相似性或同一性的其功能变体。

9.根据前述权利要求中的任一项所述的酵母细胞，其中所述酵母细胞属于选自酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、耶氏酵母属(Yarrowia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、假丝酵母属(Candida)、红酵母属(Rhodotorula)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、隐球菌属(Cryptococcus)、丝孢酵母属(Trichosporon)和油脂酵母属(Lipomyces)的属，任选地其中所述酵母细胞属于选自酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、布拉氏酵母(Saccharomyces boulardi)、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、马克思克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、热带假丝酵母(Candidatropicalis)、浅白隐球菌(Cryptococcus albidus)、产油油脂酵母(Lipomyceslipofera)、斯氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)、圆红冬孢酵母(Rhodosporidiumtoruloides)、粘红酵母(Rhodotorula glutinis)、出芽丝孢酵母(Trichosporonpullulan)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)的种，优选地所述酵母细胞是解脂耶氏酵母细胞或酿酒酵母细胞。

10.根据前述权利要求中的任一项所述的酵母细胞，其中所述酵母细胞能够生产：

i)(Z9,E12)-十四碳二烯酸，其滴度为至少1mg/L，诸如至少1.5mg/L，诸如至少1.7mg/L或更高；

ii)E12-脂肪酸和/或(Z9,E12)-十四碳二烯酸，其滴度为至少20mg/L，诸如至少50mg/L，诸如至少60mg/L，诸如至少70mg/L，诸如至少80mg/L，诸如至少90mg/L，诸如至少100mg/L，诸如至少150mg/L，诸如至少200mg/L，诸如至少250mg/L，诸如至少500mg/L，诸如至少750mg/L，诸如至少1g/L，诸如至少2g/L，诸如至少3g/L，诸如至少4g/L，诸如至少5g/L，诸如至少6g/L，诸如至少7g/L，诸如至少8g/L，诸如至少9g/L，诸如至少10g/L或更高；和/或

iii)E12-脂肪醇和/或(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇，其滴度为至少0.005mg/L，诸如至少0.01mg/L，诸如至少0.02mg/L，诸如至少0.03mg/L，诸如至少0.05mg/L，诸如至少0.06mg/L，诸如至少0.075mg/L，诸如至少0.1mg/L，诸如至少0.2mg/L，诸如至少0.3mg/L，诸如至少0.4mg/L，诸如至少0.5mg/L，诸如至少0.6mg/L，诸如至少0.7mg/L，诸如至少0.8mg/L，诸如至少0.9mg/L，诸如至少1mg/L，诸如至少2mg/L，诸如至少3mg/L，诸如至少4mg/L，诸如至少5mg/L，诸如至少6mg/L，诸如至少7mg/L，诸如至少8mg/L，诸如至少9mg/L，诸如至少10mg/L或更高。

11.用于在酵母细胞中生产具有n’个双键的去饱和脂肪酰基辅酶A的方法，其中所述双键中的至少一个位于12位，所述方法包括以下步骤：

i)提供根据权利要求1和10中的任一项所述的酵母细胞，

其中n和n’是整数，

其中0≤n≤3且其中1≤n’≤4，

从而生产具有n’个双键的去饱和脂肪酰基辅酶A，其中所述双键中的至少一个在12位。

12.根据权利要求11所述的方法，其中：

i)所述异源Δ12去饱和酶如在权利要求2中所限定；

ii)所述其它异源去饱和酶如在权利要求6和7中的任一项中所限定；

iii)所述酵母细胞如在权利要求1和10中的任一项中所限定；

iv)所述具有n’个双键的去饱和脂肪酰基辅酶A如在权利要求5中所限定；和/或

v)所述碳链长度为至少13且具有n个双键的饱和或去饱和脂肪酰基辅酶A如在权利要求4中所限定。

13.根据权利要求11至12中的任一项所述的方法，其中所述酵母细胞进一步表达至少一种形成醇的脂肪酰基辅酶A还原酶(FAR)，所述FAR能够将至少一部分(E12)-十四烯酰基辅酶A和/或(Z9,E12)-十四碳二烯酰基辅酶A分别转化为E12-脂肪醇和/或(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇，任选地其中所述FAR如在权利要求8中所限定。

14.根据权利要求11至13中的任一项所述的方法，进一步包括以下步骤：

i)回收所述E12-脂肪醇和/或(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇；

iii)将所述E12-脂肪醇和/或(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇分别转化为E12-脂肪醛和/或(Z9,E12)-十四碳二烯醛；和/或

iv)将E12-脂肪醇、(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇、E12-脂肪醇乙酸酯、(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇乙酸酯、E12-脂肪醛和/或(Z9,E12)-十四碳二烯醛配制在信息素组合物中。

15.一种信息素组合物，所述信息素组合物能够通过包括下述步骤的方法来得到：

i)通过根据权利要求11至14中的任一项所述的方法生产(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇和/或E12-脂肪醇；

ii)回收所述(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇和/或E12-脂肪醇；

16.一种信息素组合物，其包含E12-脂肪醇、(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇、E12-脂肪醇乙酸酯、(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇乙酸酯、E12-脂肪醛和/或(Z9,E12)-十四碳二烯醛，其中所述信息素组合物包含至少70％生物基碳，诸如至少75％生物基碳，诸如至少80％生物基碳，诸如至少85％生物基碳，诸如至少90％生物基碳，诸如至少95％生物基碳。

17.一种信息素化合物，选自由以下组成的组：E12-脂肪醇、(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇、E12-脂肪醇乙酸酯、(Z9,E12)-十四碳二烯-1-醇乙酸酯、E12-脂肪醛和(Z9,E12)-十四碳二烯醛，其中所述信息素化合物包含至少70％生物基碳，诸如至少75％生物基碳，诸如至少80％生物基碳，诸如至少85％生物基碳，诸如至少90％生物基碳，诸如至少95％生物基碳。

18.印度谷螟去饱和酶在用于在饱和或去饱和脂肪酰基辅酶A的12位引入双键的方法中的用途，任选地其中所述印度谷螟去饱和酶是Pid12(SEQ ID NO:2)或与其具有至少70％相似性或同一性，与其具有诸如至少80％、诸如至少90％、诸如至少91％、诸如至少92％、诸如至少93％、诸如至少94％、诸如至少95％、诸如至少96％、诸如至少97％、诸如至少98％、诸如至少99％、诸如100％相似性或同一性的其功能变体。

19.地中海粉斑螟去饱和酶在用于在饱和或去饱和脂肪酰基辅酶A的12位引入双键的方法中的用途，任选地其中所述地中海粉斑螟去饱和酶是Eku_d12(SEQ ID NO:85)或与其具有至少70％相似性或同一性，与其具有诸如至少80％、诸如至少90％、诸如至少91％、诸如至少92％、诸如至少93％、诸如至少94％、诸如至少95％、诸如至少96％、诸如至少97％、诸如至少98％、诸如至少99％、诸如100％相似性或同一性的其功能变体。