ES2204328B1 - Procedimiento de produccion de acidos grasos polinsaturados con levaduras por incorporacion de sustratos olefinicos o acetilenicos. - Google Patents
Procedimiento de produccion de acidos grasos polinsaturados con levaduras por incorporacion de sustratos olefinicos o acetilenicos.Info
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Abstract
Procedimiento de producción de ácidos grasos poliinsaturados con levaduras por incorporación de sustratos olefínicos o acetilénicos. La presente invención describe un procedimiento de producción de ácidos grasos poliinsaturados mediante la incorporación de ácidos grasos olefínicos o acetilénicos de 13-18 átomos de carbono de longitud de cadena como sustratos a una cepa silvestre haploide o diploide de levadura Saccharomyces cerevisiae W 303 a ó DElo1 que permite la generación de un nuevo enlace de configuración Z en la posición 9 de dichos sustratos. La nueva desaturación sólo se produce si la instauración original en los productos suministrados tiene la configuración E o es un acetileno mientras que si el enlace original tiene la configuración Z el sustrato se recupera inalterado.
Description
Procedimiento de producción de ácidos grasos
poliinsaturados con levaduras por incorporación de sustratos
olefínicos o acetilénicos.
Producción de ácidos grasos poliinsaturados para
su utilización en las industrias farmacéuticas, agroalimentarias o
cosméticas y como intermedios de síntesis en química fina. Ácidos
linoleicos conjugados (CLA). Sector de la Biotecnología.
Para afrontar la demanda creciente de ácidos
grasos poliinsaturados en las industrias farmacéuticas,
agroalimentarias o cosméticas, ha de recurrirse a la extracción de
fuentes naturales donde se encuentran en forma de complejas mezclas
de las que es prácticamente imposible o muy laborioso aislar los
productos individuales por métodos cromatográficos o ha de aplicarse
de manera alternativa la síntesis orgánica. Debido a la
estereoespecificidad requerida, los productos sintéticos son
generalmente preparados en pequeñas cantidades, su coste es muy
elevado y sólo se utilizan en investigación.
Por ello, se ha recurrido a las fuentes naturales
para preparar concentrados de ácidos grasos poliinsaturados por
métodos diversos tales como destilación molecular de los ésteres
metílicos, separación con urea, empleo de lipasas para
discriminación en la hidrólisis de triglicéridos aprovechando la
especificidad respecto a las posiciones esterificadas del glicerol,
a la naturaleza del éster, a la longitud de la cadena y a la
posición de los dobles enlaces (Lipid Síntesis and Manufacture, Ed.
by Frank D. Gunstone, Sheffield Academic Press, 1999, England).
Asimismo, en la literatura se encuentran
descritos procedimientos para la preparación de ácidos grasos
diénicos conjugados a partir de ácidos no conjugados. Entre ellos,
los ácidos linoleicos conjugados (CLA) son los más importantes por
su capacidad de reducir o eliminar el cáncer (Seidel, MC 2001, US
Patent 6,319,950), de prevención de enfermedades cardiovasculares,
de mejora del sistema inmunológico y de ayuda en tratamientos de la
obesidad.
Estos ácidos linoleicos conjugados (CLA) se
obtienen como mezclas por isomerización del ácido linoleico, ácido
cis-9,cis-12-octadienoico,
en medio homogéneo mediante la utilización de bases tales como
hidróxido alcalino acuoso en un reactor de flujo tubular a una
presión de 2300 psi y temperaturas elevadas (Krajca, K.E. 1979,
U.S. Patent 4,164505) o metóxido sódico (Iweta T, et al. 1998,
EPO839897 A1) y deprotonación a temperaturas comprendidas entre -78
y - 20°C con una base orgánica superfuerte como
sec-butillitio, base de Schlosser y
trimetilsililmetiluro de potasio (Sih. Ch and Chen
Ch-A., 2001 US Patent 6,316,645). Se han utilizado
también catalizadores homogéneos como tris(trifenilfosfina)
clororodio (De Jarlas W., and Gast L.; J. Am. Oil Chem. Soc, 1971,
48, 21) y complejos de areno cromiocarbonilo (Frakel, E.; J. Am.
Oil Chem. Soc, 1970, 47, 33) que facilitan que la reacción de
isomerización pueda llevarse a cabo a temperaturas inferiores a los
180-200°C requeridos en el caso anterior. Sin
embargo, estos catalizadores son difíciles de eliminar y no son
compatibles con el medio ambiente. Por ello, recientemente se ha
desarrollado un procedimiento utilizando un catalizador de Ni
soportado sobre una zeolita preactivado con hidrógeno que permite
llevar a cabo la isomerización en disolución de
n-decano ó 1-octanol a temperaturas
de 80-120ºC (Bernas, A. et. al.; Chem. Común, 2002,
1142-3).
Sin embargo, se ha comprobado que el componente
responsable de los efectos anticarcinogénicos del CLA es el isómero
cis-9, trans-11, por lo que sería
preciso desarrollar métodos de isomerización específicos para la
obtención de dicho isómero. Esto se ha intentado por reacción del
ácido linoleico con una linoleoato isomerasa de la bacteria del
rumen Butyrivibrio fibrisolvens (Panza, M.W. and Ha Y.L.
1993. U.S.Patent 5,208356) y por combinación de una preparación
sustancialmente pura de una cepa de Lactobacillus que es
capaz de convertir ácidos grasos con dobles enlaces no conjugados
en la configuración cis-9,cis-12 en
ácidos grasos con dobles enlaces conjugados entre los que por lo
menos un 50% contienen dobles enlaces con la configuración
cis-9,trans 11l (Pariza, MW and Yang
X-Y, 2000 US Patent 6,060,304). Además, se ha
realizado un estudio sobre la selectividad de lipasas en la
esterificación de la mezcla de CLA con n-butanol en
n-hexano en el que se observó una preferencia de
las lipasas de Candida cylindracea y Mucor miehei en
la esterificación del isómero cis-9,
trans-11 deseado (Warwel, S.; Borgdorf, R.;
Biotechnology Letters, 2000, 22(14),
1151-55).
Como se describe más adelante en el procedimiento
de la presente invención puede obtenerse de manera unívoca este
isómero activo por desaturación específica del ácido trans
11-octadecenoico.
Para la producción de ácidos grasos
poliinsaturados se ha empleado levadura Saccharomyces
cerevisiae transformada genéticamente con incorporación de
genes de diversas desaturasas de ácidos grasos de distinta
procedencia (Suzuki, O. et al. W.O. 2001075069 Al, Michinaka, Y. et
al.; J. of Oleo Science 2001, 50(5):
359-365.)
En la presente invención se utiliza una
\Delta-9 desaturasa de Saccharomyces
cerevisiae, para la producción selectiva de ácidos grasos
poliinsaturados.
La presente invención describe un procedimiento
de producción de ácidos grasos poliinsaturados mediante la
incorporación de ácidos grasos olefínicos o acetilénicos de
13-18 átomos de carbono de longitud de cadena como
sustratos a una cepa silvestre haploide o diploide de levadura
Saccharomyces cerevisiae W 303a ó \DeltaElo1 que permite
la generación de un nuevo enlace de configuración Z en la posición
9 de dichos sustratos. La nueva desaturación sólo se produce si la
instauración original en los productos suministrados tiene la
configuración E o es un acetileno mientras que si el enlace original
tiene la configuración Z el sustrato se recupera inalterado.
La presente invención se basa en que los
inventores han observado que la adición como sustrato de ácidos
grasos monoinsaturados conteniendo una o varias instauraciones a
partir de la posición C-11 de la cadena a cepas de
la especie Saccharomyces cerevisiae permite la producción de
ácidos grasos poliinsaturados de longitud de cadena
C13-C18 con una instauración adicional de
configuración Z en la posición 9 de la cadena originada por la
\Delta-9 desaturasa de la levadura.
Más específicamente, la presente invención se
refiere a la producción de ácidos grasos poliinsaturados de
longitud de cadena C13-C18 empleando un
procedimiento que consiste en cultivos de cepas de Saccharomyces
cerevisiae W303a haploides o diploides (American Type Culture
Collection) y \DeltaElo1 (deficiente en elongasa) modificada
genéticamente (EUROSCARF) a los que se han incorporado como
sustratos ácidos grasos conteniendo una o varias instauraciones a
partir de la posición C-11 de la cadena para
producir compuestos con una instauración adicional de configuración
Z en la posición 9 de la cadena, entre otros, pertenecientes al
siguiente grupo: Z9,E 11:13; Z9,E11:14; Z9,E11:15; Z9,E11:16;
Z9,E11:18; Z11:13; Z11:14; Z11:15; Z11:16 y Z9,11,11:13 mediante la
incubación con las cepas W303a haploides o diploides, y Z9,E11:13;
Z9,E11:14; Z9,E11:15; Z9,E11:16; Z9,E11:18; Z11 :13; Z11 :14; Z11
:15; Z11 :16 y Z9,11,11:13 mediante la incubación con la cepa
\DeltaElo1, resoectivamente.
Se ha observado que los sustratos suministrados a
la levadura con dobles enlaces con configuración E o
trans son desaturados por la \Delta-9
desaturasa de la levadura mucho más rápidamente que los
correspondientes isómeros Z o cis con la formación de un nuevo
doble enlace de configuración Z o cis en posición 9
de la cadena alifática produciéndose los correspondientes derivados
Z9E11 (cis9,trans11). Asimismo, tal como se indica más abajo en la
Tabla I, se ha comprobado que en los casos de utilización de las
cepas haploides y diploides W303a se produce un alargamiento
parcial de dos de la cadena del sustrato original manteniéndose la
desaturación en la posición 9 del nuevo sustrato, elongación que no
se produce cuando se emplean las cepas \DeltaElo1.
Los productos obtenidos pueden tener aplicación
en la industria farmacéutica como anticancerígenos (por ejemplo el
compuesto Z9E11), en las industrias agroalimentarias como
nutricéuticos, en cosmética y en la industria de química fina como
intermedios para la síntesis de feromonas de insectos para su
aplicación dentro del control integrado de plagas de insectos por
métodos biorracionales.
Sin que ello presuponga una limitación en la
aplicación de la presente invención que se define en las
reivindicaciones especificadas más adelante vamos a describir un
ejemplo concreto de aplicación.
El crecimiento de colonias de levadura W303a
haploide y diploide y \DeltaElo1 (deficiente en elongasa) se
realizó en medio sólido con placas de YPD-agar a
37ºC durante 24 h. A partir de una solución etanólica 1M de ácido
graso sustrato se añade a una única colonia de levadura en 2 mL de
medio líquido YPD-tergitol (1%) de manera que los
ácidos grasos estén en una concentración final de
0,25-1 mM de sustrato, preferentemente 0,5 mM. La
mezcla se deja crecer durante 24-48 horas,
preferentemente 24 horas a 37ºC en agitación a
200-300 rpm, preferentemente 200 rpm.
Se trasvasa el medio de cultivo a un vial de tipo
eppendorf de 1,5 ml y se centrífuga a 3000 rpm durante 5 minutos. El
sobrenadante se descarta y se acaba de transvasar el medio de
cultivo restante y se centrífuga en las mismas condiciones
anteriores. Se descarta el sobrenadante y se lava con 1 mL de agua y
se repiten las operaciones de lavado, centrifugación y eliminación
del sobrenadante dos veces más. Finalmente, se centrifuga a 3000
rpm durante 2 min. para eliminar totalmente el agua. Se añade 1 mL
de CHCl_{3}:MeOH (2:1) y se deja en agitación con un brazo
mecánico durante 1 h. Finalmente, se centrifuga a 13200 rpm 15 s.
se pasa el extracto orgánico a un vial de 3 mL y se evapora el
disolvente.
El residuo de ácidos grasos fue metanolizado por
adición de 0,5 mL de una disolución 0,5N de KOH en MeOH, seguido de
neutralización después de 30 min con 0,5 mL de HCl 1N y extracción
con 0,5 mL de hexano. La capa orgánica se separa, se concentra
hasta un volumen de 20 \muL y se analiza por
CG-EM.
Los ésteres metílicos se analizan por
CG-EM en una columna apolar HP-1 con
el siguiente programa de temperaturas 80ºC
(0)/5/200(0)10/300 (10).
La posición de los dobles enlaces conjugados se
analizó por CG-EM por formación de los complejos
con MTAD
(4-metil-1,2,4-triazolin-3,5-diona).
Estos complejos se forman por adición de 2,5 \muL de una
disolución de 1,2 mg de MTAD en 1mL de CH_{2}Cl_{2} sobre 10
\muL de extracto hexánico, agitando y evaporando hasta un volumen
final de 2 \muL. Se inyecta en CG-EM con el
siguiente programa de temperaturas 80º(0)/5/200(0)/10/300
(25).
La posición de dobles enlaces no conjugados se
determinó por formación de complejos con DMDS (sulfuro de
dimetilo). Estos complejos se forman por adición sobre 20 \muL de
extracto hexánico, 50 \muL de disulfuro de dimetilo y una gota de
solución de yodo en dietil éter (60 mg/mL). La mezcla se calienta a
45-50º durante 72 h.
Pasado este tiempo se diluye con hexano, se
elimina el yodo con una solución saturada de
Na_{2}S_{2}O_{3}, se lava con H_{2}O y se separa la fase
orgánica. El volumen de hexano se concentra a 20 \muL y se analiza
por CG-EM inyectando 1 \muL bajo las condiciones
arriba indicadas.
Los sustratos empleados fueron una serie de
ácidos grasos monoinsaturados de 13-18 átomos de
carbono en la cadena que en la posición 11 poseían un doble enlace
de estereoquímica Z o E o un triple enlace.
Estos ácidos eran accesibles comercialmente o
fueron sintetizados en nuestro laboratorio por métodos
convencionales. Como se indica en la Tabla I los sustratos con
estereoquímica E o trans en el doble enlace o un
triple enlace son desaturados por la levadura en la posición 9
dando los correspondientes derivados Z9E11, mientras que bajo las
condiciones de la incubación, 24 horas a 37º agitando a 200 rpm,
los correspondientes sustratos con estereoquímica Z o
cis se recuperan inalterados.
Las cepas W303a haploide y diploide que contienen
elongasa son capaces de prolongar la cadena en 2, dependiendo del
sustrato. En estos casos los nuevos ácidos grasos formados con
insaturaciones en posiciones 13 ó 15 pueden desaturarse a los
correspondientes Z9E13 y Z9E15. En el caso de sustratos con dobles
enlaces de configuración Z11 no se observa una ulterior desaturación
a pesar de obtenerse por elongación de la cadena los
correspondientes sustratos con dobles enlaces de configuración Z13
y Z15. Además, los dienos Z9E11 formados pueden ser alargados a los
correspondientes Z11E13 y Z13E15.
Cuando se utilizan cepas de levadura deficientes
en elongasa (\DeltaElo1) sólo se obtienen los dienos Z9E11
resultantes de la desaturación.
En todos los casos se observan ácidos endógenos
propios de la levadura como son el palmitoleico (Z9:16) y el oleico
(Z9:18).
Claims (7)
1. Procedimiento de producción de ácidos grasos
poliinsaturados caracterizado porque está constituido por
las siguientes etapas:
- a)
- incubación de sustratos monoinsaturados con cepas de levadura Saccharomyces cerevisiae en medio líquido YPD-tergitol (1%) conteniendo 0,25-1 mM de sustrato, preferentemente 0,5 mM, a una temperatura de 37ºC, durante 24-48 horas, preferentemente 24 horas, agitando a 200-300 rpm, preferentemente 200 rpm; y
- b)
- extracción y purificación de los ácidos grasos poliinsaturados del medio de cultivo resultado de la incubación de a).
2. Procedimiento según la reivindicación 1
caracterizado porque la cepa de levadura de Saccharomyces
cerevisiae pertenece entre otras al siguiente grupo: cepa
haploide W303a conteniendo elongasa, cepa diploide W303a conteniendo
elongasa y cepa \DeltaElo1 deficiente en elongasa.
3. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a
la 2 caracterizado porque el sustrato empleado son ácidos
grasos monoinsaturados de 13 a 18 átomos de carbono en la cadena
que en la posición 11 poseían un doble enlace de configuración Z o
E o un triple enlace.
4. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a
la 3 caracterizado porque el producto resultante de la
incubación con un doble enlace en la posición 9 puede ser alargado
en su cadena por las elongasas de la levadura, W303a haploide o
diploide, dando nuevos productos que contienen dobles enlaces en las
posiciones 11 y 13.
5. Procedimiento según la reivindicación 4
caracterizado porque el producto resultante poliinsaturado
mayoritario de dicho procedimiento pertenece, entre otros posibles,
al siguiente grupo: Z9,E11:13; Z9,E11:14; Z9,E11:15; Z9,E11:16;
Z9,E11:18; Z11:13; Z11:14; Z11:15; Z11:16 y Z9,11,11:13.
6. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a
la 3 caracterizado porque el producto resultante de la
incubación con un doble enlace en la posición 9 no es alargado en
su cadena y porque la cepa utilizada es la cepa \DeltaElo1
deficiente en elongasa.
7. Procedimiento según la reivindicación 6
caracterizado porque el producto resultante poliinsaturado
de dicho procedimiento pertenece, entre otros posibles, al
siguiente grupo: Z9,E11:13; Z9,E11:14; Z9,E11:15; Z9,E11:16;
Z9,E11:18; Z11 :13; Z11 :14; Z11 :15; Z11 :16 y Z9,11,11:13.
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