ES2351973T3 - Células metabólicamente modificadas por ingeniería para la producción de ácidos grasos poliinsaturados. - Google Patents

Células metabólicamente modificadas por ingeniería para la producción de ácidos grasos poliinsaturados. Download PDF

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Abstract

Un procedimiento para producir ácidos grasos poliinsaturados con cuatro o más dobles enlaces que comprende la expresión heteróloga de una ruta que requiere oxígeno en un Saccharomyces cerevisiae desarrollado sobre un sustrato de ácido no graso, en el que la expresión heteróloga comprende la combinación de la expresión heteróloga de secuencias de nucleótidos que codifican delta-12 desaturasa, delta-6 desaturasa, delta-6 elongasa, delta-5 desaturasa y delta-9 desaturasa.

Description

CAMPO DE LA INVENCIÓN
Esta invención se refiere en general a la producción de ácidos grasos y en particular a la producción de ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) en diversas células, de manera más específica, a la expresión de rutas heterólogas en microorganismos para la producción de ácidos grasos y en particular ácidos grasos poliinsaturados. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Los PUFA son ácidos grasos poliinsaturados con una cadena larga de hidrocarburos compuesta de 18 o más átomos de carbono que tienen dos o más dobles enlaces y un grupo carboxilato terminal.
Las propiedades de los ácidos grasos poliinsaturados están altamente influenciadas por la posición del doble enlace, y se diferencia de los PUFA omega-3, en que el primer doble enlace en la tercera posición contando desde el extremo metilo de la cadena de carbono, y los PUFA omega-6, que tienen en primer doble enlace en la sexta posición contando desde el extremo metilo de la cadena de carbono. El ácido eicosapentaenoico pertenece al primer grupo, en particular ácido eicosapentaenoico con dobles enlaces en la posición 5, 8, 11, 14 y 17 (EPA) y ácido docosahexaenoico, en particular ácido docosahexaenoico con dobles enlaces en la posición 4,7,10, 13,16, 19 (DHA), mientras, por ejemplo, ácido araquidónico (ARA) pertenece al último grupo.
Los PUFA son esenciales para los seres humanos, y se ha probado que tienen efectos muy beneficiosos en la salud humana, incluyendo un desarrollo apropiado del cerebro y funciones visuales y prevención de enfermedad, tales como enfermedad cardiovascular y cáncer.
El ácido araquidónico omega-6 PUFA juega un papel importante en la estructura y función de membranas biológicas, y es un precursor de las prostaglandinas y leucotrienos biológicamente activas. Ácido araquidónico es necesario para el desarrollo neurológico y neurofisiológico de tanto niños nacidos a término como prematuros, y muchas organizaciones de expertos, incluyendo la Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y Alimentación (FAO) y la Organización Mundial de la salud (WHO) recomiendan que la fórmula de niños debe estar suplementada con ácido araquidónico.
El omega-3 PUFA EPA y DHA, también, posee un número de funciones biológicas en seres humanos. Son parte del tejido humano, y en el segmento exterior del bastón en la retina, DHA representa más de 60% de los ácidos grasos totales. DHA se considera que es esencial para la función visual apropiada y el desarrollo neurológico de los niños. Los niños prematuros y jóvenes son incapaces de sintetizar cantidades suficientes de DHA y reciben el resto mediante la leche de pecho. DHA también reduce o elimina el factor de riesgo implicado en diversas enfermedades como enfermedades cardiovasculares y ejerce efectos positivos sobre la hipertensión, artritis, arteriosclerosis y trombosis.
Diversas, patentes solicitudes de patente se centran en la producción de PUFA a partir de sustratos de ácidos grasos. Recientemente, la ruta del ácido linoleico a ácido araquidónico se reconstituyó en S. cerevisiae (Domergue et al., 2003, Beaudoin et al., 2000) y la síntesis de ácidos grasos poliinsaturados se estableció suministrando el metabolito precursor, ácido linoleico, al medio.
Otros grupos han establecido partes de la ruta PUFA en los experimentos de reconstitución. Por ejemplo, el documento US 6.432.684 describe la secuencia de una delta-5 desaturasa de ser humano, que, cuando se expresa, produce ácido araquidónico, cuando se suministra ácido dihomo-gamma-linolénico.
El documento US 2002/0170090 describe una omega-3 desaturasa a partir de Caenorhabditis elegans y su expresión en diversos organismos incluyendo bacterias, cianobacterias, fitoplancton, algas, hongos, plantas y animales, y la producción de un lípido a partir de un organismo que expresa la omega-3 desaturasa. La enzima cataliza la conversión de ácidos grasos omega-6 con 18, 20 y 22 átomos de carbono a los ácidos grasos omega-3 correspondiente. Células de levadura, que expresan la omega-3 desaturasa de C. elegans, convertía el ácido linoleico suministrado de manera exógena y ácido omega-6 docosatetraenoico en ácido alfa-linolénico y ácido omega-3 docosapentaenoico, respectivamente.
El documento PCT/US98/07422 describe el aislamiento de una delta-5 desaturasa de Mortierella alpina y expresión de dicha enzima en células microbianas, en particular en Saccharomyces cerevisiae, y reseña la producción de ácido araquidónico cuando de suministra ácido dihomo-gamma-linolénico en el medio de crecimiento.
El documento WO 99/27111 describe una delta-6 desaturasa de C. elegans y su expresión en levadura, que conduce a la producción de ácido gamma-linolénico a partir de ácido oleico suministrado de manera exógena.
En el documento WO 99/33958, se describe la expresión de una delta-5 desaturasa (obtenida originalmente de C. elegans) en microorganismos, tales como algas, bacterias y hongos, y en particular, su expresión en levadura.
El documento WO 02/44320 describe un número de diferentes elongasas humanas, muchas de las cuales se han ensayado para funcionalidad en levadura usando un número de diferentes ácidos grasos como sustratos suministrados externamente.
Un procedimiento para la producción de ácido araquidónico en organismos
transgénicos (documento WO 03/012092) se ha aplicado. En el presente documento, los inventores describen la expresión de una delta-5 desaturasa, que conduce a la producción de ácido araquidónico en levadura; sin embargo, requiere ácido dihomo-gamma linolénico como sustrato externo.
Los inventores del documento PCT/US98/07421 ensayan la expresión de diversas desaturasas incluyendo delta-12 desaturasa, delta-6 desaturasa y delta-5 desaturasa y reconstituyen la función de estas enzimas mediante la adición de sustratos de ácido graso al medio de crecimiento y analizando su conversión.
En todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente anteriormente mencionadas, se han descrito procedimientos, cuando es necesario suministrar ácidos grasos como sustratos externos en el medio con el fin de producir los PUFA.
En lo siguiente se describen unas pocas publicaciones, que reseñan la producción de PUFA con hasta 3 dobles enlaces a partir de sustratos de ácido no graso.
En el documento US 6.355.861 se muestra que la expresión de delta-12 y delta-6 desaturasa de Cynecosystis en Cynecococcus conduce tanto a la producción de ácido linoleico como ácido gamma-linolénico, ácidos grasos con dos dobles enlaces y tres dobles enlaces, respectivamente. Además, se describe la expresión de una delta-6 desaturasa de prímula en una bacteria, hongo o célula vegetal, incluyendo la expresión de dicha delta-6 desaturasa en diversas plantas para la producción de ácido gamma-linolénico.
El documento US 6.136.574 describe la producción de ácido gamma-linoleico en levadura a partir de ácido oleico disponible de manera endógena.
El documento PCT/US98/07126 describe la expresión de una delta-6 desaturasa y una delta-12 desaturasa y reseña, por ejemplo esa expresión de estos genes en una célula huésped conduce a la producción de ácido gamma-linoleico.
Ninguna referencia de la técnica anterior describe la producción exitosa de PUFA heterólogo con cuatro o más dobles enlaces en microorganismos a partir de fuentes de carbono diferentes de los ácidos grasos, a pesar del hecho que un alto número de genes diferentes implicados en la biosíntesis de PUFA se han identificado. Esto demuestra claramente que es una tarea difícil producir los PUFA con cuatro o más dobles enlaces a titulaciones suficientes o detectables en microorganismos que usualmente no producen PUFA. Aunque los inventores del documento US 2003/0177508 describen secuencias de cuatro genes que están implicados en la elongación de PUFA y muestran la función de todos estos genes, los inventores pueden solamente especular en un ejemplo (ejemplo III) esa expresión de delta-12 desaturasa, delta-6 desaturasa, delta-5 desaturasa, y un ADNc de elongasa de Mortierella alpina en levadura podría dar como resultado la producción de ácido araquidónico
sin la necesidad de suministro exógeno de ácidos grasos.
Como un resumen intermedio de los anteriores párrafos, se puede concluir que, excepto para las especulaciones especificadas en el documento US 2003/0177508, no ha habido hasta ahora ninguna reseña sobre la expresión de una ruta heteróloga para la producción y PUFA a partir de sustratos de ácido no graso en microorganismos. Hasta ahora, reseña lo concerniente a la producción de PUFA heterólogo de sustratos de ácido no graso en huéspedes microscópicos, tal como levadura, se han limitado a los PUFA con menos de cuatro dobles enlaces, a saber tres o menos dobles enlaces, tales como ácido linoleico y ácido gamma-linolénico.
Si se sigue la estrategia sugerida en el documento US 2003/0177508, se esperará un menor contenido de ácido araquidónico en levadura de panadería, como este organismo tiene un bajo contenido (aproximadamente 10% de peso seco de células) de ácidos grasos. Además, los ácidos grasos en levadura de panadería principalmente consta de ácidos grasos con 16 átomos de carbono, y el ácido graso monoinsaturado más dominante es ácido palmitoleico, que puede no servir como un precursor para la síntesis de ácido araquidónico. El resultado de simplemente la expresión de los cuatro genes mencionados en S. cerevisiae, cuando la expresión de estos cuatro genes, da como resultado un contenido de ácido araquidónico de 0,8% de los ácidos grasos, o correspondiente a menos de 0,08% del peso seco de levadura.
La producción de ácidos grasos omega-3 y omega-6 poliinsaturados con cuatro y cinco dobles enlaces, pero no seis dobles enlaces, se ha reseñado recientemente en plantas. Qi y colaboradores fueron capaces de producir el EPA de ácido graso omega-3 y el ácido araquidónico de ácido graso omega-6 en la planta Arabidopsis thaliana (Qi et al. 2004).
Qi y colaboradores muestran por primera vez que el ácido araquidónico y EPA se pueden producir mediante una ruta heteróloga en un organismo, tal como una planta, usando un sustrato de ácido no graso. Los autores tuvieron éxito mediante la expresión simultánea de los genes que codifican delta-9 elongasa, delta-8 desaturasa y delta-5 desaturasa, un planteamiento que hace uso de las actividades de delta-12 desaturasa endógena y omega-3 desaturasa endógena de A. thaliana para la producción de ácido araquidónico y EPA. En muchos organismos, incluyendo los microorganismos, tales como muchas levaduras y hongos filamentosos, sería necesario expresar al menos 4 o al menos 5 genes heterólogos con el fin de producir PUFA con al menos cuatro o al menos cinco dobles enlaces. Hasta ahora la expresión de más de 3 genes heterólogos al mismo tiempo para la producción de los PUFA no se ha aplicado nunca. Además, la producción de ácidos grasos poliinsaturados a partir de sustratos de ácido no graso no se ha mostrado todavía en células no vegetales. En el documento WO 2004/057001 los inventores describen que la tecnología trabaja tanto en plantas como en microorganismos. Sin embargo, los inventores todavía solamente han confirmado la tecnología descrita en plantas.
El documento PCT/US2004/014541 describe la producción de Los PUFA, tales como ácido araquidónico y EPA usando levadura oleaginosa. Los inventores definen levadura oleaginosa como levadura que puede acumular al menos 25% de su peso en seco celular en forma de aceite. La invención usa levadura oleaginosa tales como Yarrowia, Candida, Rhodotorula, Rhodosporidium, Cryptococcus, Trichosporon y Lipomyces como célula huésped. No se proporciona o reivindica información sobre otroa organismos o levadura no oleaginosa tal como Saccharomyces cerevisiae. Los inventores ejemplifican su tecnología mediante expresión heteróloga de tres enzimas adicionales en Yarrowia lipolytica usando delta-6 desaturasa, delta-5 desaturasa y delta-17 desaturasa. Lo último es equivalente a omega-3 desaturasas. Este planteamiento hace uso de la delta-12 desaturasa endógena.
En el documento WO 2005/01236 los inventores muestran que es posible producir los PUFA en levadura suministrando un ácido graso conjuntamente con un sustrato de ácido no graso. Los inventores expresan delta-4 desaturasa, elongasas y / o delta-5 desaturasa en Saccharomyces cerevisiae. Proporcionando EPA o ácido estearidónico conjuntamente con galactosa, Saccharomyces cerevisiae produce DHA.
Los PUFA se suministran de manera creciente en, por ejemplo en formula de niños, y también en formulaciones farmacéuticas. Una fuente general de los PUFA es el aceite de pescado. Sin embargo, el contenido de ácido graso de aceite de pescado puede variar durante la temporada de pesca y en algunos casos el aceite de pescado puede estar contaminado debido a la contaminación ambiental. Además de esto, el aceite de pescado tiene un olor detestable, que imposibilita su uso como un suplemento alimentario.
Por lo tanto, son necesarias etapas de purificación apropiadas y caras para alguna aplicación de los PUFA. La necesidad de los PUFA producidos por procedimientos bien definidos y en grandes cantidades se incrementará notablemente durante los siguientes 5 -10 años, y se estima que los PUFA se usarán en muchos productos diferentes como suplemento. Con el fin de encontrar la demanda creciente para alta calidad el enfoque de los PUFA se ha movido hacia procedimientos de producción reproducibles y esto incluye los procedimientos de producción que usan sustratos de ácidos no grasos. Esto último permite una producción de ácidos grasos insaturados más definida.
La presente invención se dirige a esta demanda, y presenta un procedimiento eficaz nuevo, rentable y alternativo para la producción a alto nivel de ácidos grasos monoinsaturados y en particular los PUFA.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
En un aspecto, la presente invención se refiere a la construcción y modificación por ingeniería genética de no vegetales más en particular microorganismos para producir los PUFA con cuatro o más dobles enlaces de sustratos de ácido no graso mediante la expresión heteróloga de una ruta que requiere oxígeno.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a la construcción y modificación por ingeniería genética de no vegetales más en particular microorganismos para producir los PUFA con cuatro o más dobles enlaces usando un sustrato de ácido no graso o sustratos como una o varias fuentes de carbono exclusivas mediante la expresión heteróloga de una ruta que requiere oxígeno.
En particular, la presente invención describe un procedimiento para producir ácidos grasos poliinsaturados con cuatro o más dobles enlaces que comprenden la expresión heteróloga de una ruta que requiere oxígeno en un Saccharomyces cerevisiae desarrollado sobre un sustrato de ácido no graso.
Además, la presente invención se refiere a la construcción y modificación por ingeniería genética de microorganismos para la producción heteróloga de ácido graso monoinsaturado y en particular los PUFA, que incluyen ácido oleico, ácido linoleico, alfalinolénico, ácido gamma-linoleico, ácido dihomo-gamma-linolénico, ácido araquidónico, ácido 5,8,11,14,17-eicosapentaenoico (EPA), ácido docosatetraenoico, ácido estearidónico, ácido eicosadienoico, ácido eicosatrienoico, ácido eicosatetraenoico, ácido 7,10,13,16,19docosapentaenoico y ácido 4,7,10,13,16,19-docosahexaenoico (DHA).
La invención especialmente implica un microorganismo modificado genéticamente que contiene una ruta heteróloga de ácido esteárico a ácidos grasos monoinsaturados y los PUFA, es decir, ácido oleico, ácido araquidónico, DHA o EPA mediante la expresión de las siguientes enzimas heterólogas delta-9 desaturasa, delta-12 desaturasa, delta-9 elongasa, delta-8 desaturasa, omega-3 desaturasa, delta-6 desaturasa, delta-6 elongasa, delta-5 desaturasa, delta-5 elongasa, delta-4 desaturasa o subconjuntos de las mismas (Figura 1 y Figura 2).
Además, la presente invención se refiere a mejora en el contenido de PUFA en el organismo huésped mediante la optimización de las condiciones de fermentación, por ejemplo, disminuyendo la temperatura y / o diseñando un medio óptimo, o mediante la mejora de flujo hacia los ácidos grasos por ingeniería genética metabólica, por ejemplo, mediante la sobreexpresión de la síntesis de ácidos grasos, sobreexpresión de otras enzimas implicadas en la biosíntesis de los precursores para los PUFA, o codón optimización de los genes heterólogos, o expresión de enzimas heterólogas implicadas en la biosíntesis del precursor para los PUFA, es decir, ácido oleico.
La invención también se refiere a una composición que comprende al menos 2 % de ácidos grasos poliinsaturados producidos a partir de un microorganismo que expresa una ruta heteróloga que conduce a los PUFA.
Éstas y otras realizaciones se describen o son obvias a partir de y están abarcadas por, la siguiente descripción detallada.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Se debe entender que cualquier característica y / o aspecto descrito anteriormente junto con el procedimientos de acuerdo con la invención se aplica por analogía a los usos.
Como será evidente, los rasgos y características preferidos de un aspecto de la invención pueden ser aplicables a otros aspectos de la invención.
A lo largo de esta memoria descriptiva la palabra "comprenden", o variaciones tales como "comprende" o "comprendiendo", se entenderá que implica la inclusión de un elemento, integrante o etapa establecida, o grupo de elementos, integrantes o etapas, pero no la exclusión de cualquier elemento, integrante o etapa, o grupo de elementos, integrantes o etapas.
Los presentes inventores han desarrollado un procedimiento novedosos, alternativo y altamente rentable para producir un ácido graso poliinsaturado mediante la construcción y modificación por ingeniería genética de células huésped no vegetales, especialmente microorganismos, para producir los PUFA con cuatro o más dobles enlaces a partir de sustratos de ácido no graso mediante la expresión heteróloga de una ruta que requiere oxígeno.
La invención se refiere a la construcción y modificación por ingeniería genética de tales células huésped no vegetales para la producción heteróloga de ácidos grasos monoinsaturados y los PUFA, que incluyen ácido oleico, ácido linoleico, alfa-linolénico, ácido gamma-linoleico, ácido dihomo-gamma-linolénico, ácido araquidónico, ácido 5,8,11,14,17eicosapentaenoico (EPA), ácido docosatetraenoico, ácido estearidónico, ácido eicosatetraenoico, ácido 7,10,13,16,19-docosapentaenoico y ácido 4,7,10,13,16,19docosahexaeonico (DHA).
La invención implica células huésped no vegetales modificadas genéticamente, especialmente microorganismos, que contienen una ruta heteróloga de ácido esteárico a ácidos grasos monoinsaturados y los PUFA, por ejemplo, ácido oleico, ácido araquidónico, DHA o EPA mediante la expresión de genes heterólogos que codifican las siguientes enzimas delta-9 desaturasa, delta-12 desaturasa, delta-9 elongasa, delta-8 desaturasa, omega-3 desaturasa, delta-6 desaturasa, delta-6 elongasa, delta-5 desaturasa, delta-5 elongasa, delta-4 desaturasa o sus subconjuntos (Figura 1 y Figura 2).
De este modo, en un aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para producir ácidos grasos poliinsaturados con cuatro o más dobles enlaces que comprende expresión heteróloga de una ruta que requiere oxígeno en una célula huésped no vegetal desarrollada sobre un sustrato de ácido no graso.
En una realización particular preferida dicho sustrato de ácido no graso es la fuente de carbono exclusiva.
Ácido graso poliinsaturado
En el presente contexto término "ácido graso poliinsaturado" se refiere a una larga cadena de hidrocarburo compuesta de 18 o más átomos de carbono que tienen al menos 4 dobles enlaces y un grupo carboxilato terminal.
En una realización preferida el ácido graso poliinsaturado producido por el procedimiento de la presente invención se refiere a ácidos grasos poliinsaturados con al menos 4 dobles enlaces, tales como 4 dobles enlaces, 5 dobles enlaces o 6 dobles enlaces.
Como los expertos en la técnica reconocerán, un ácido graso puede estar esterificado para formar triglicéridos y / o fosfolípidos así como esfingolípidos. De este modo, en una realización la presente invención también se refiere a tales productos esterificados.
Además, el producto de ácido graso de la presente invención puede ser ácidos grasos libres. Los ácidos grasos libres tienen un grupo carboxilo libre, no están químicamente conectados a cualquier otro compuesto incluyendo triacilglicéridos, fosfolípidos o esfingolípidos, y pueden estar presentes libremente en cualquier compartimiento de la célula
Expresión heteróloga
Por "expresión", se entiende la producción de un polipéptido funcional mediante la transcripción de un segmento de ácido nucleico en ARNm y traducción del ARNm en una proteína.
Por "expresión heteróloga", en general se entiende que un ácido nucleico, que no está presente de forma natural en el genoma huésped, está presente en la célula huésped y está unido de manera operativa a las secuencias de ácido nucleico de promotor y terminador de manera que se exprese en la célula huésped.
También, en el presente contexto expresión heteróloga además se refiere a la presencia de un ácido nucleico con una función similar al ácido nucleico presente de origen natural, en el que la expresión de dicho producto de ácido nucleico heterólogo cambia la composición del ácido graso. Por ejemplo, la expresión en levadura de una delta-9 desaturasa fúngica con especificidad de sustrato diferente de la delta-9 desaturasa nativa de levadura cambia la composición de ácido graso de levadura (Ejemplo 36).
Dicho ácido nucleico puede estar contenida en una construcción de ácido nucleico extracromosómica o puede estar integrada en el genoma huésped. Los procedimientos para aislamiento de ácidos nucleicos para la expresión heteróloga y realizaciones preferidas de expresión heteróloga se describen además en detalle más adelante.
Por expresión heteróloga de una ruta se entiende que varios genes se expresan de manera heteróloga, dichos productos génicos constituyen etapas en una ruta, no presente de manera natural en el huésped.
Ruta que requiere oxígeno
Una ruta que requiere oxígeno significa que al menos una de las enzimas en la ruta requiere oxígeno para que funcione. Por ejemplo la expresión de ácidos nucleicos que codifican la desaturasa usualmente conduce a una ruta que requiere oxígeno para actividad ya que las desaturasas usualmente son enzimas que requieren oxígeno.
Sustrato de ácido no graso
En el presente contexto, un "sustrato de ácido no graso" se refiere a cualquier sustrato, pero no un ácido graso, con dos o más átomos de carbono, tal como pero sin limitación azúcares, tales como glucosa, manosa, fructosa, sacarosa, galactosa, lactosa, eritrosa, treosa, ribosa, gliceraldehído, dihidroxiacetona, ribulosa, celobiosa, almidón, glucógeno, trehalosa, maltosa, maltotriosa, xilosa, arabinosa, estaquiosa, rafinosa, o fuente de carbón no fermentable, tal como pero sin limitación a etanol, lactato, acetato y glicerol.
Fuente de carbono exclusiva o fuentes de carbono exclusivas
Usualmente, un organismo vivo necesita un suministro de todos los macroelementos tales como carbono, azufre, fósforo, nitrógeno, oxígeno o hidrógeno. Un organismo puede crecer en mezclas de diferentes fuentes de carbono, tales como un sustrato de ácido graso y un sustrato de ácido no graso. Si un sustrato o sustratos se refieren a una fuente de carbono exclusiva o unas fuentes de carbono exclusivas, es solamente ese sustrato o esos sustratos se suministran al organismo como una fuente de carbono. Esto no excluiría otros macroelementos u otros requerimientos nutricionales, tales como requerimientos por ejemplo para microelementos y vitaminas. Por ejemplo, si un sustrato de ácido no graso se suministra exclusivamente como única fuente de carbono. Esto significa, que es solamente el ácido no graso el que se suministra como fuente de carbono sin suministrar otra fuente de carbono. Sin embargo, esto no excluye otros macroelementos u otros requerimientos nutricionales.
Célula huésped no vegetal
En el presente contexto el término "célula huésped no vegetal" se refiere a células huésped seleccionadas entre el grupo que consta de microorganismos, animales, hongos, bacterias, invertebrados (insectos) o protozoos. En particular, se refiere a organismos microscópicos, incluyendo bacterias, algas unicelulares, protozoos y hongos microscópicos, incluyendo levadura.
De manera más específica, el microorganismo puede ser un hongo, y de manera más específica un hongo filamentoso que pertenece al género Aspergillus, por ejemplo, A. niger, A. awamori, A. oryzae, A. nidulans, una levadura que pertenece al género Saccharomyces, por ejemplo, S. cerevisiae, S. kluyveri, S. bayanus, S. exiguus, S. sevazzi, S. uvarum, una levadura que pertenece al género Kluyveromyces, por ejemplo, K. lactis K. marxianus var, marxianus, K. thermotolerans, una levadura que pertenece al género Candida, por ejemplo, C. utilis, C. tropicalis, C.albicans, C. lipolytica, C. versatilis, una levadura que pertenece al género Pichia, por ejemplo, P. stipidis, P. pastoris, P. sorbitophila, u otro género de levadura, por ejemplo, Cryptococcus, Debaromyces, Hansenula, Pichia, Yarrowia, Zygosaccharomyces o Schizosaccharomyces, pero no se limitan a estos ejemplos. Con relación a otros microorganismos se suministra una lista no exhaustiva de hongos filamentosos: una especie que pertenece al género Penicillium, Rhizopus, Fusarium, Fusidium, Gibberella, Mucor, Mortierella, Trichoderma, entre otros.
Con relación a bacterias una lista no exhaustiva de bacterias adecuadas se proporciona como sigue: una especie que pertenece a Bacillus, una especie que pertenece al género Escherichia, una especie que pertenece al género Lactobacillus, una especie que pertenece al género Corynebacterium, una especie que pertenece al género Acetobacter, una especie que pertenece al género Acinetobacter, una especie que pertenece al género Pseudomonas, etc.
Los microorganismos preferidos de la invención pueden ser S. cerevisiae, A. niger, Escherichia coli o Bacillus subtilis.
En una realización actualmente preferida los microorganismos preferidos de la invención es S. cerevisiae por un número de razones. S. cerevisiae es también un organismo modelo conocido, y ha experimentado una tremenda investigación durante miles de años, su fisiología se entiende bien, y están disponibles herramientas analíticas para investigar el metabolismo a cualquier nivel, tal como el nivel de genoma, el nivel de transcripción, el nivel de proteína, el nivel de metabolito y el nivel de flujo. Por lo tanto esto permite rápidamente el desarrollo de estrategias de modificación por ingeniería genética metabólica y por lo tanto la identificación de dianas modificadas por ingeniería genética con el fin de mejorar el rendimiento de PUFA y tasas de producción. Además de esto, Saccharomyces cerevisiae tiene un estado GRAS, y la tecnología de fermentación está bien establecida.
El microorganismo construido y modificado por ingeniería se puede cultivar usando procedimientos bien conocidos, incluyendo cultivos en quimioestato, lote, alimentación por lotes, etc.
En un aspecto específico, la invención se refiere a un procedimiento para producir ácidos grasos poliinsaturados con cuatro o más dobles enlaces que comprende la expresión heteróloga de una ruta que requiere oxígeno en una célula huésped no vegetal desarrollada sobre un sustrato de ácido no graso, siempre que dicho procedimiento no comprenda la combinación de la expresión heteróloga de las secuencias de nucleótidos que codifican delta12 desaturasa, delta-6 desaturasa, delta-6 elongasa, y delta-5 desaturasa en una célula huésped.
En una realización preferida, se proporciona un procedimiento para producir ácidos grasos poliinsaturados con cuatro o más dobles enlaces que comprende la expresión heteróloga de una ruta que requiere oxígeno en una célula huésped no vegetal desarrollada en un sustrato de ácido no graso, en el que dicha expresión heteróloga incrementa el contenido de cada ácido graso poliinsaturado específico individual de en particular ARA, EPA y DHA hasta más de 2 % del contenido de ácido graso total. El contenido de los PUFA intermedios en la ruta biosintética hacia ARA, EPA o DHA puede ser más de 2 % pero no necesita más de 2 %.
El incremento del contenido de PUFA se describe en más detalle más adelante.
Expresión heteróloga de al menos 4 genes específicos
Un aspecto de la presente invención se refiere a la expresión heteróloga simultánea de
al menos 4 genes específicos para la producción de los PUFA.
De este modo, en una realización la presente invención se refiere a un procedimiento para producir ácidos grasos poliinsaturados con cuatro o más dobles enlaces que comprende la expresión heteróloga de una ruta que requiere oxígeno en un Saccharomyces cerevisiae desarrollado sobre un sustrato de ácido no graso, en el que la expresión heteróloga comprende la combinación de la expresión heteróloga de secuencias de nucleótidos que codifican delta-12 desaturasa, delta-6 desaturasa, delta-6 elongasa, y delta-5 desaturasa.
En otra realización la presente invención se refiere a un procedimiento para producir ácidos grasos poliinsaturados con cuatro o más dobles enlaces que comprende la expresión heteróloga de una ruta que requiere oxígeno en un Saccharomyces cerevisiae desarrollado sobre un sustrato de ácido no graso, en el que la expresión heteróloga comprende la combinación de la expresión heteróloga de las secuencias de nucleótidos que codifican delta12 desaturasa, delta-9 elongasa, delta-8 desaturasa, y delta-5 desaturasa.
Específicamente, una realización describe un procedimiento para producir un ácido graso poliinsaturado que comprende las etapas de
(a)
aislar al menos 4 secuencias de nucleótido, teniendo cada una identidad de al menos 75% a una de las secuencias de nucleótidos seleccionadas entre el grupo que consta de SEQ ID NO: 1 -38;
(b)
construir un vector que comprenden dichas secuencias de nucleótidos aisladas de la etapa (a);
(c)
transformar el vector de la etapa (en una célula huésped durante un tiempo y en condiciones suficientes para la expresión de las proteínas codificadas por dichas secuencias de nucleótidos aisladas de la etapa (a);
(d)
exponer dicha célula huésped a un sustrato de ácido no graso, mediante el cual dicho sustrato de ácido no graso se convierte por dicho huésped en un producto de ácido graso poliinsaturado deseado y obtener dicho ácido graso poliinsaturado.
De manera más específica, una realización describe un procedimiento para producir un ácido graso poliinsaturado que comprende las etapas de
(a)
aislar al menos 4 secuencias de nucleótidos que codifican delta-12 desaturasa, delta-6 desaturasa, delta-6 elongasa, y delta-5 desaturasa
(b)
construir uno o más vectores que comprenden dichas secuencias de nucleótidos de la etapa (a) y / o integrar dichas secuencias de nucleótidos aisladas en el genoma de Saccharomyces cerevisiae;
(c)
opcionalmente, transformar dicho (s) vector (es) de la etapa (b) en un Saccharomyces cerevisiae durante un tiempo y en condiciones suficientes para la expresión de proteínas
codificadas por dichas secuencias de nucleótidos aisladas de la etapa (a);
(d)
desarrollar dicho Saccharomyces cerevisiae en un sustrato de ácido no graso, mediante el cual dicho sustrato de ácido no graso se convierte por dicho huésped en un producto de ácido graso poliinsaturado deseado y obtener dicho ácido graso poliinsaturado.
Otra realización describe un procedimiento para producir un ácido graso poliinsaturado que comprende las etapas de
(a)
aislar al menos 4 secuencias de nucleótidos que codifican delta-12 desaturasa, delta-9 elongasa, delta-8 desaturasa, y delta-5 desaturasa
(b)
construir uno o más vectores que comprenden dichas secuencias de nucleótidos de la etapa (a) y / o integrar dichas secuencias de nucleótidos aisladas en el genoma de Saccharomyces cerevisiae;
(c)
opcionalmente, transformar dicho (s) vector (es) de la etapa (b) en un Saccharomyces cerevisiae durante un tiempo y en condiciones suficientes para la expresión de las proteínas codificadas por dichas secuencias de nucleótidos aisladas de la etapa (a);
(d)
desarrollar dicho Saccharomyces cerevisiae en un sustrato de ácido no graso, mediante el cual dicho sustrato de ácido no graso se convierte por dicho huésped en un producto de ácido graso poliinsaturado deseado y obtener dicho ácido graso poliinsaturado.
Como se menciona aquí en otra parte, la expresión heteróloga puede además comprender la expresión heteróloga de una secuencia de nucleótidos que codifica delta-9 desaturasa, delta-5 elongasa, omega-3 desaturasa, y / o delta-4 desaturasa.
Específicamente, en el que SEQ ID NO: 1 -4 codifican delta-9 desaturasas, en el que SEQ ID NO: 5 -10, 93, 95, 113 codifican delta-12 desaturasas, en el que SEQ ID NO: 11 -15, 97, 99 codifican delta-6 desaturasas, en el que SEQ ID NO: 16-21, 101, 103 codifican delta-6 elongasas, en el que SEQ ID NO: 22 -27, 105, 107 codifican delta-5 desaturasas, en el que SEQ ID NO: 30 -34, 87, 89, 111 codifican omega-3 desaturasas, en el que SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 19, 28-29, 101 codifican delta-5 elongasas en el que SEQ ID NO: 35 -36, 109 codifican delta-4 desaturasas, en el que SEQ ID NO: 37 codifican delta-9 elongasa y en el que SEQ ID NO: 38 codifican delta-8 desaturasa.
En una realización, la presente invención se refiere a un procedimiento para producir un ácido graso poliinsaturado que comprende la combinación de la expresión heteróloga de genes que codifican delta-12 desaturasa, delta-6 desaturasa, delta-6 elongasa, y delta-5 desaturasa en una célula huésped.
En otra realización la invención se refiere a un procedimiento para producir ácidos grasos poliinsaturados con cuatro o más dobles enlaces que comprende la expresión heteróloga de una ruta que requiere oxígeno en una célula huésped de Saccharomyces cerevisiae desarrollada exclusivamente sobre sustratos de ácido no graso as fuentes de carbono, que es la fuente de carbono exclusiva.
La expresión de dichos cuatro genes permite la producción de ácido araquidónico y / o
uno o más de sus precursores intermedios en células huésped que de manera endógena solamente producen ácidos grasos de hasta 18 átomos de carbono de longitud de hasta un doble enlace.
Además, la expresión de dicha ruta en general mejora la producción de ácido araquidónico en una célula huésped y también puede conducir a la producción mejorada de uno o más de sus precursores intermedios. Una ventaja general de este procedimiento es el uso de sustratos de ácido no graso, tales como azúcares. Sin embargo, los sustratos que contienen ácidos grasos, tales como aceites derivados de, por ejemplo, plantas, animales o microorganismos, también se pueden usar.
En otra realización de la presente invención, se proporciona un procedimiento para producir un ácido graso poliinsaturado, que comprende la combinación de la expresión heteróloga de los genes que codifican delta-12 desaturasa, delta-9 elongasa, delta-8 desaturasa, y delta-5 desaturasa en una célula huésped.
La expresión de dichos cuatro genes permite la producción de ácido araquidónico y o uno o más de sus precursores intermedios en células huésped que produce de manera endógena solamente ácidos grasos de hasta 18 átomos de carbono de longitud con hasta un doble enlace.
Además de esto, la expresión de dicha ruta en general mejora la producción de ácido araquidónico y / o uno o más de sus precursores intermedios en una célula huésped. Una ventaja general de este procedimiento es que permite el uso de sustratos de ácido no graso, tales como azúcares. Sin embargo, también se pueden usar sustratos que contienen ácidos grasos, tales como aceites derivados por ejemplo de plantas, animales o microorganismos.
En una tercera realización, la presente invención se refiere a un procedimiento para producir ácidos grasos poliinsaturados que comprende la combinación de la expresión heteróloga de genes que codifican delta-12 desaturasa, delta-6 desaturasa, delta-6 elongasa, delta-5 desaturasa y delta-5 elongasa en una célula huésped.
La expresión de dichos cinco genes permite la producción de ácido docosatetraenoico, de manera más específica ácido docosatetraenoico omega-6 y / o uno o más de sus precursores intermedios en células huésped que producen de manera endógena solamente ácidos grasos de hasta 18 átomos de carbono de longitud con hasta un doble enlace.
Además, la expresión de dicha ruta en general mejora la producción de ácido docosatetraenoico omega-6 en una célula huésped y también puede conducir a la producción mejorada de uno o más de sus precursores intermedios. Una ventaja general de este procedimiento es que permite el uso de sustratos de ácido no graso, tales como azúcares. Sin embargo, también se pueden usar sustratos que contienen ácidos grasos, tales como aceites derivados de, por ejemplo, plantas, animales o microorganismos.
En otra realización, la presente invención se refiere a un procedimiento para producir un ácido graso poliinsaturado que comprende la combinación de la expresión heteróloga de genes que codifican delta-12 desaturasa, delta-9 elongasa, delta-8 desaturasa, delta-5 desaturasa y delta-5 elongasa en una célula huésped.
La expresión de dichos cinco genes permite la producción de ácido docosatetraenoico, de manera más específica ácido docosatetraenoico omega-6 y o uno o más de sus precursores intermedios en células huésped que producen de manera endógena solamente ácidos grasos de hasta 18 átomos de carbono de longitud con hasta un doble enlace.
Además, expresión de dicha ruta en general mejora la producción de ácido docosatetraenoico omega-6 en una célula huésped y también puede conducir a la producción mejorada de uno o más de sus precursores intermedios. Una ventaja general de este procedimiento es que permite el uso de sustratos de ácido no graso, tales como azúcares. Sin embargo, también se pueden usar sustratos que contienen ácidos grasos, tales como aceites derivados de, por ejemplo, plantas, animales o microorganismos.
En una realización adicional, la presente invención se refiere a un procedimiento para producir un ácido graso poliinsaturado que comprende la combinación de la expresión heteróloga de genes que codifican delta-12 desaturasa, delta-6 desaturasa, delta-6 elongasa, delta-5 desaturasa y omega-3 desaturasa en una célula huésped.
La expresión de dichos cinco genes permite no solamente la producción de ácidos grasos omega-6, sino también la producción de ácidos grasos omega-3, de manera simultánea
o no, en células huésped que solamente producen de manera endógena ácidos grasos de hasta 18 átomos de carbono de longitud con hasta un doble enlace. En particular, la expresión de dichos cinco genes permite la producción de ácido eicosapentaenoico en dichas células huésped.
Además, la expresión de dichos cinco genes en general mejora la producción de ácido eicosapentaenoico y / o uno o más de sus precursores intermedios, incluyendo ácido araquidónico, en una célula huésped. Una ventaja general de este procedimiento es que permite el uso de sustratos de ácido no graso, tales como azúcares. Sin embargo, también se pueden usar sustratos que contienen ácidos grasos, tales como aceites derivados de, por ejemplo, plantas, animales o microorganismos.
En todavía otra realización, la presente invención se refiere a un procedimiento para
producir un ácido graso poliinsaturado que comprende la combinación de la expresión heteróloga de genes que codifican delta-12 desaturasa, delta-9 elongasa, delta-8 desaturasa, y delta-5 desaturasa y omega-3 desaturasa en una célula huésped.
La expresión de dichos cinco genes permite no solamente la producción de ácidos grasos omega-6, sino también la producción de ácidos grasos omega-3, de manera simultánea
o no, en células huésped que producen de manera endógena solamente ácidos grasos de hasta 18 átomos de carbono de longitud con hasta un doble enlace. En particular, la expresión de dichos cinco genes permite la producción de ácido eicosapentaenoico en dichas células huésped.
Además, la expresión de dichos cinco genes en general mejora la producción de ácido eicosapentaenoico y / o uno o más de sus precursores intermedios, incluyendo ácido araquidónico, en una célula huésped. Una ventaja general de este procedimiento es que permite el uso de sustratos de ácido no graso, tales como azúcares. Sin embargo, también se pueden usar sustratos que contienen ácidos grasos, tales como aceites derivados de, por ejemplo, plantas, animales o microorganismos.
En una realización adicional, la presente invención se refiere a un procedimiento para producir un ácido graso poliinsaturado que comprende la combinación de la expresión heteróloga de genes que codifican delta-12 desaturasa, delta-6 desaturasa, delta-6 elongasa, delta-5 desaturasa, omega-3 desaturasa y delta-5 elongasa en una célula huésped.
La expresión de dichos seis genes permite no solamente la producción de ácidos grasos omega-6, sino también la producción de ácidos grasos omega-3, de manera simultánea
o no, en células huésped que solamente producen de manera endógena ácidos grasos de hasta 18 átomos de carbono de longitud con hasta un doble enlace. En particular, permite la producción de ácido docosapentaenoico en dichas células huésped.
Además, la expresión de dichos seis genes en general mejora la producción de ácido docosapentaenoico y / o uno o más de sus precursores intermedios, incluyendo ácido docosatetraenoico, en una célula huésped. Una ventaja general de este procedimiento es que permite el uso de sustratos de ácido no graso, tales como azúcares. Sin embargo, también se pueden usar sustratos que contienen ácidos grasos, tales como aceites derivados de, por ejemplo, plantas, animales o microorganismos.
En otra realización, la presente invención se refiere a un procedimiento para producir un ácido graso poliinsaturado que comprende la combinación de la expresión heteróloga de genes que codifican delta-12 desaturasa, delta-9 elongasa, delta-8 desaturasa, delta-5 desaturasa omega-3 desaturasa y delta-5 elongasa en una célula huésped.
La expresión de dichos seis genes permite no solamente la producción de ácidos
grasos omega-6, sino también la producción de ácidos grasos omega-3, de manera simultánea
o no, en células huésped que producen de manera endógena solamente ácidos grasos de hasta 18 átomos de carbono de longitud con hasta un doble enlace. En particular, permite la producción de ácido docosapentaenoico en dichas células huésped.
Además, la expresión de dichos seis genes en general mejora la producción de ácido docosapentaenoico y / o uno o más de sus precursores intermedios, incluyendo ácido docosatetraenoico, en una célula huésped. Una ventaja general de este procedimiento es que permite el uso de sustratos de ácido no graso, tales como azúcares. Sin embargo, también se pueden usar sustratos que contienen ácidos grasos, tales como aceites derivados de, por ejemplo, plantas, animales o microorganismos.
En otra realización, la presente invención se refiere a un procedimiento para producir un ácido graso poliinsaturado que comprende la combinación de la expresión heteróloga de genes que codifican delta-12 desaturasa, delta-6 desaturasa, delta-6 elongasa, delta-5 desaturasa, omega-3 desaturasa, delta-5 elongasa y delta-4 desaturasa en una célula huésped.
La expresión de dichos siete genes permite no solamente la producción de ácidos grasos omega-6, sino también la producción de ácidos grasos omega-3, de manera simultánea
o no, en células huésped que producen de manera endógena solamente ácidos grasos de hasta 18 átomos de carbono de longitud con hasta un doble enlace. En particular, permite la producción de ácido docosahexaenoico en dichas células huésped.
Además, la expresión de dichos siete genes en general mejora la producción de ácido docosahexanenoico y / o uno o más de sus precursores intermedios, incluyendo ácido docosatetraenoico, en una célula huésped. Una ventaja general de este procedimiento es que permite el uso de sustratos de ácido no graso, tales como azúcares. Sin embargo, también se pueden usar sustratos que contienen ácidos grasos, tales como aceites derivados de, por ejemplo, plantas, animales o microorganismos.
En otra realización, la presente invención se refiere a un procedimiento para producir un ácido graso poliinsaturado que comprende la combinación de la expresión heteróloga de genes que codifican delta-12 desaturasa, delta-9 elongasa, delta-8 desaturasa, delta-5 desaturasa omega-3 desaturasa, delta-5 elongasa y delta-4 desaturasa en una célula huésped.
La expresión de dichos siete genes permite no solamente la producción de ácidos grasos omega-6, sino también la producción de ácidos grasos omega-3, de manera simultánea
o no, en un huésped que produce de manera endógena solamente ácidos grasos de hasta 18 átomos de carbono de longitud con hasta un doble enlace. En particular, permite la producción de ácido docosahexaenoico en dichas células huésped.
Además, la expresión de dichos siete genes en general mejora la producción de ácido docosahexanenoico y / o uno o más de sus precursores intermedios, incluyendo ácido docosatetraenoico, en una célula huésped. Una ventaja general de este procedimiento es que permite el uso de sustratos de ácido no graso, tales como azúcares. Sin embargo, también se pueden usar sustratos que contienen ácidos grasos, tales como aceites derivados por ejemplo de plantas, animales o microorganismos.
En otra realización preferida, se proporciona un procedimiento de acuerdo con la presente invención, en el que una cualquiera de las diferentes combinaciones de expresión heteróloga descrita anteriormente además comprende la expresión heteróloga de un gen que codifica una delta-9 desaturasa que preferiblemente usa ácido esteárico como sustrato. La expresión de dicho gene que codifica una delta-9 desaturasa específica de ácido esteárico permite un desplazamiento en la composición de ácido graso de ácido palmitoleico hacia ácido oleico comparado con una célula huésped no modificada. La expresión de dicho gen en combinación con una de las rutas descritas anteriormente para la producción de ácidos grasos poliinsaturados por lo tanto además mejora la producción de ácidos grasos poliinsaturados.
En una realización particular preferida, la presente invención se refiere a un procedimiento para producir ácidos grasos poliinsaturados con cuatro o más dobles enlaces que comprende la expresión heteróloga de una ruta que requiere oxígeno en una célula huésped de Saccharomyces cerevisiae desarrollada en un sustrato de ácido no graso o sustratos de ácido no graso que es / son las fuentes de carbono exclusivas, en el que la expresión heteróloga combinada consta de la expresión heteróloga de secuencias de nucleótidos que codifican delta-12 desaturasa, delta-6 desaturasa, delta-6 elongasa, y delta-5 desaturasa.
En otra realización particular preferida, la presente invención se refiere a un procedimiento para producir ácidos grasos poliinsaturados con cuatro o más dobles enlaces que comprende la expresión heteróloga de una ruta que requiere oxígeno en una célula huésped de Saccharomyces cerevisiae desarrollada sobre un sustrato de ácido no graso que es la fuente de carbono exclusiva, en el que la expresión heteróloga combinada consta de la expresión heteróloga de las secuencias de nucleótidos que codifican delta-12 desaturasa, delta-9 elongasa, delta-8 desaturasa, y delta-5 desaturasa.
Una realización particular preferida se refiere a un procedimiento de acuerdo con la presente invención, en el que la expresión heteróloga combinada comprende además la expresión heteróloga de una secuencia de nucleótidos que codifica delta-5 elongasa, omega-3 desaturasa, y / o delta-4 desaturasa.
Otra realización adicional particular preferida se refiere a un procedimiento de acuerdo
con la presente invención, en el que dicha expresión heteróloga combinada comprende además la expresión heteróloga de una secuencia de nucleótidos que codifica una delta-9 desaturasa.
Substrato
El sustrato de fermentación para la producción de los PUFA de acuerdo con el presente aspecto puede ser cualquier medio complejo o medio definido por ejemplo, que contiene azúcares, tales como glucosa, manosa, fructosa, sacarosa, galactosa, lactosa, eritrosa, treosa, ribosa, gliceraldehído, dihidroxiacetona, ribulosa, celobiosa, almidón, glucógeno, trehalosa, maltosa, maltotriosa, xilosa, arabinosa, estaquiosa, rafinosa, o fuentes de carbono no fermentables, tales como etanol, acetato, lactato, o glicerol, o aceites, tales como aceites derivados de plantas, animales o microorganismos o ácidos grasos, tales como ácido butírico, ácido caproico, ácido caprílico, ácido cáprico, ácido láurico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido araquidónico, ácido palmitoleico, ácido oleico, ácido elaídico, ácido cis-vacénico, ácido linoleico, alfa-linolénico, ácidos gamma-linoleicos, ácido dihomogammalinolénico, ácido araquidónico, EPA, ácido 7,10,13,16,19-docosapentaenoico y ácido 4,7,10,13,16,19-docosahexaeonico DHA. Célula huésped
En el presente contexto el término "célula huésped" se refiere a células huésped seleccionadas entre el grupo que consta de microorganismos, animales, hongos, bacterias, invertebrados (insectos), plantas o protozoos. En particular, se refiere a organismos microscópicos, incluyendo bacterias, virus, algas unicelulares, protozoos y hongos microscópicos incluyendo levadura.
En una realización actualmente preferida la célula huésped es una célula huésped no vegetal como se ha descrito anteriormente.
De manera más específica, el microorganismo puede ser un hongo, y de manera más específica a hongo filamentoso que pertenece al género de Aspergillus, por ejemplo, A. niger,
A. awamori, A. oryzae, A. nidulans, una levadura que pertenece al género de Saccharomyces, por ejemplo, S. cerevisiae, S. kluyveri, S. bayanus, S. exiguus, S. sevazzi, S. uvarum, una levadura que pertenece al género Kluyveromyces, por ejemplo, K. lactis K. marxianus var. marxianus, K. thermotolerans, una levadura que pertenece al género Candida, por ejemplo, C. utilis, C. tropicalis, C.albicans, C. lipolytica, C. versatilis, una levadura que pertenece al género Pichia, por ejemplo, P. stipidis, P. pastoris, P. sorbitophila, u otro género de levadura, por ejemplo, Cryptococcus, Debaromyces, Hansenula, Pichia, Yarrowia, Zygosaccharomyces or Schizosaccharomyces. Con relación a otros microorganismos se suministra una lista no exhaustiva de hongos filamentosos adecuados: una especie que pertenece al género Penicillium, Rhizopus, Fusarium, Fusidium, Gibberella, Mucor, Mortierella, Trichoderma, entre otros
Con relación a bacterias se proporciona una lista no exhaustiva de bacterias adecuadas como sigue: una especie que pertenece a Bacillus, una especie que pertenece al género Escherichia, una especie que pertenece al género Lactobacillus, una especie que pertenece al género Corynebacterium, una especie que pertenece al género Acetobacter, una especie que pertenece al género Acinetobacter, una especie que pertenece al género Pseudomonas, etc., que se conocen bien en la técnica.
Los microorganismos preferidos de la invención pueden ser S. cerevisiae, A. niger, Escherichia coli o Bacillus subtilis.
El microorganismo construido y modificado por ingeniería genética se puede cultivar usualmente usando procedimientos comúnmente conocidos, incluyendo cultivos en quimioestato, lote, alimentación por lotes, etc.
De este modo, en una realización preferida, la presente invención se refiere a un procedimiento para producir un ácido graso poliinsaturado que comprende la combinación de la expresión heteróloga de genes que codifican diversas desaturasas y elongasas en una célula huésped como se describe en el presente documento, en el que dicha célula huésped se selecciona entre el grupo que consta de plantas, microorganismos, animales, hongos, bacterias, invertebrados (insectos) o protozoos.
En una realización particular preferida, la presente invención se refiere a un procedimiento para producir un ácido graso poliinsaturado que comprende la combinación de la expresión heteróloga de genes que codifican diversas desaturasas y elongasas en una célula huésped como se describe en el presente documento, en el que dicho célula huésped es un hongo, y preferiblemente, en el que dicho hongo es un hongo filamentoso o una levadura.
En una realización dicha levadura se selecciona entre el grupo del género
Saccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Pichia, Cryptococcus, Debaromyces, Hansenula,
Yarrowia, Zygosaccharomyces, Schizosaccharomyces, Lipomyces.
En una realización preferida dicha levadura es Saccharomyces cerevisiae.
En otra realización dicho hongo filamentoso se selecciona entre el grupo del género Aspergillus, Penicillium, Rhizopus, Fusarium, Fusidium, Gibberella, Mucor, Mortierella o Trichoderma.
En una realización adicional dicho Aspergillus se selecciona entre las especies
Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus oryzae o Aspergillus nidulans. Y en una realización actualmente más preferida, dicho huésped es Aspergillus niger.
En otra realización preferida, la presente invención se refiere a un procedimiento para producir a ácido graso poliinsaturado que comprende la combinación de la expresión heteróloga de genes que codifican diversas desaturasas y elongasas en una célula huésped como se describe en el presente documento, en el que dicho huésped es una bacteria.
En una realización, dicha bacteria se selecciona entre el grupo de Bacillus, Escherichia, Lactobacillus, Corynebacterium, Acetobacter, Acinetobacter, o Pseudomonas
En una realización actualmente más preferida dicha bacteria es Bacillus subtilis.
En otra realización actualmente más preferida dicha célula huésped es Escherichia coli.
En una realización actualmente preferida, la presente invención se refiere a un Saccharomyces cerevisiae modificado genéticamente capaz de producir ácidos grasos poliinsaturados con cuatro o más dobles enlaces cuando se desarrolla sobre un sustrato de ácido no graso.
En una realización actualmente más preferida, la presente invención se refiere a un Saccharomyces cerevisiae modificado genéticamente de acuerdo con la invención, en el que dicho Saccharomyces cerevisiae es capaz de producir ácidos grasos poliinsaturados con cuatro o más dobles enlaces cuando se desarrolla sobre un sustrato de ácido no graso como la fuente de carbono exclusiva.
Ácido graso poliinsaturado
En el contexto de la presente invención, un ácido graso poliinsaturado se refiere a un compuesto químico con una larga cadena de hidrocarburo compuesta de 18 o más átomos de carbono que tiene al menos 4 dobles enlaces y un grupo carboxilato terminal, que tiene al menos 5 dobles enlaces y un grupo carboxilato terminal o que tiene 6 dobles enlaces y un grupo carboxilato terminal.
Cuando se aplican los genes heterólogos específicos descritos anteriormente se pueden formar varios productos intermedios, y de este modo tales productos intermedios se incluyen en la presente invención. Sin embargo, en algunos o muchos casos o todos los productos intermedios pueden estar presentes a bajos niveles que no se pueden detectar fácilmente.
En el presente contexto estos productos intermedios pueden ser ácido oleico, ácido linoleico, ácido gamma-linolénico, ácido dihomo-gamma-linoleico, ácido eicosadienoico, en particular, ácido eicosadienoico con dobles enlaces en la posición 11 y 14, ácido eicosatrienoico, en particular, ácido eicosatrienoico con dobles enlaces en la posición 11, 14, y 17, ácido araquidónico, ácido docosatetraenoico, en particular ácido docosatetraenoico con dobles enlaces en la posición 7, 10, 13, 16, ácido alfa-linoleico, ácido estearidónico, ácido eicosatetraenoico, en particular ácido eicosatetraenoico con dobles enlaces en la posición 8, 11, 14 y 17, ácido eicosapentaenoico, en particular ácido eicosaoentaenoico con dobles enlaces en la posición 5, 8, 11, 14 y 17 o ácido docosapentaenoico.
En una realización preferida, se proporciona un procedimiento de acuerdo con la presente invención, en el que el ácido graso poliinsaturado comprende al menos 4 dobles enlaces, tal como 4 dobles enlaces, tal como 5 dobles enlaces y tal como 6 dobles enlaces.
En otra realización preferida, dicho ácido graso poliinsaturado se produce a partir de un sustrato de ácido no graso.
En una realización preferida, dicho ácido graso poliinsaturado se produce a partir de un sustrato de ácido graso con menos de 4 dobles enlaces en células huésped originalmente desprovisto de la expresión endógena de al menos una de las enzimas seleccionadas entre el grupo que consta de delta-12 desaturasa, delta-6 desaturasa, delta-6 elongasa, delta-5 desaturasa, omega-3 desaturasa, delta-5 elongasa y delta-4 desaturasa.
En otra realización preferida el ácido graso poliinsaturado se selecciona entre el grupo que consta de ácido araquidónico, ácido eicosapentaenoico y ácido docosahexaenoico.
En una realización preferida, dicho ácido graso poliinsaturado es ácido araquidónico.
Específicamente, se proporciona un procedimiento para producir ácido araquidónico que comprende
(a)
aislar una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 75% de identidad con al menos una de las secuencias de nucleótidos establecidas en SEQ ID NO: 5-10, 93, 95, 113 aislar otra secuencia de nucleótidos que tiene al menos 75% de identidad con al menos una de las secuencias de nucleótidos establecidas en SEQ ID NO: 11-15, 97, 99 aislar una tercera secuencia de nucleótidos que tiene al menos 75% de identidad con al menos una de las secuencias de nucleótidos establecidas en SEQ ID NO: 16-21, 101, 103 y aislar una cuarta secuencia de nucleótidos que tiene al menos 75% de identidad con al menos una de las secuencias de nucleótidos establecidas en SEQ ID NO: 22 -27, 99, 105, 107.
(b)
construir al menos un vector que comprende dichas secuencias de nucleótidos aisladas de la etapa (a);
(c)
transformar el (los) vector (es) de la etapa (b) en una célula huésped durante un tiempo y en condiciones suficientes para la expresión de las proteínas codificadas por dichas secuencias de nucleótidos aisladas de la etapa (a)
(d)
exponer dicha célula huésped, a un sustrato de ácido no graso, por lo que dicho sustrato de ácido no graso se convierte por dicho huésped en un producto de ácido graso poliinsaturado deseado. y obtener dicho ácido araquidónico.
O, como alternativa, la presente invención se refiere a un procedimiento para producir ácido araquidónico que comprende
(a)
aislar una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 75% de identidad con al menos una de las secuencias de nucleótidos establecidas en SEQ ID NO: 5 -10, 93, 95, 113 aislar otra secuencia de nucleótidos que tiene al menos 75% de identidad con la secuencia de nucleótidos establecida en SEQ ID NO: 37, aislar una tercera secuencia de nucleótidos que tiene al menos 75% de identidad con la secuencia de nucleótidos establecida en SEQ ID NO: 38 y aislar una cuarta secuencia de nucleótidos que tiene al menos 75% de identidad con al menos una de las secuencias de nucleótidos establecidas en SEQ ID NO: 22 -27, 99, 105, 107
(b)
construir al menos un vector que comprende dichas secuencias de nucleótidos aisladas de la etapa (a);
(c)
transformar el (los) vector (es) de la etapa (b) en una célula huésped durante un tiempo y en condiciones suficientes para la expresión de las proteínas codificadas por dichas secuencias de nucleótidos aisladas de la etapa (a)
(d)
exponer dicha célula huésped, a un sustrato de ácido no graso, por lo que dicho sustrato de ácido no graso se convierte por dicho huésped en un producto de ácido graso poliinsaturado
(a)
aislar una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 75% de identidad con al menos una de las secuencias de nucleótidos establecidas en SEQ ID NO: 5 -10, 93, 95, 113 aislar otra secuencia de nucleótidos que tiene al menos 75% de identidad con al menos una de las secuencias de nucleótidos establecidas en SEQ ID NO: 11 -15, 97, 99 aislar una tercera secuencia de nucleótidos que tiene al menos 75% de identidad con al menos una de las secuencias de nucleótidos establecidas en SEQ ID NO: 16 -21, 101, 103 aislar una cuarta secuencia de nucleótidos que tiene al menos 75% de identidad con al menos una de las secuencias de nucleótidos establecidas en SEQ ID NO: 22 -27, 99, 105, 107 y aislar una quinta secuencia de nucleótidos que tiene al menos 75% de identidad con al menos una de las secuencias de nucleótidos establecidas en SEQ ID NO: 30 -34, 87, 89, 111;
(b)
construir al menos un vector que comprende dichas secuencias de nucleótidos aisladas de la etapa (a);
(c)
transformar el (los) vector (es) de la etapa (b) en una célula huésped durante un tiempo y en condiciones suficientes para la expresión de las proteínas codificadas por dichas secuencias de nucleótidos aisladas de la etapa (a)
(d)
exponer dicha célula huésped, a un sustrato de ácido no graso, por lo que dicho sustrato de ácido no graso se convierte por dicho huésped en un producto de ácido graso poliinsaturado deseado. y obtener dicho ácido eicosapentaenoico.
O, como alternativa, se proporciona un procedimiento para producir ácido eicosapentaenoico que comprende
(a)
aislar una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 75% de identidad con al menos una de las secuencias de nucleótidos establecidas en SEQ ID NO: 5 -10, 93, 95, 113 aislar otra secuencia de nucleótidos que tiene al menos 75% de identidad con la secuencia de nucleótidos establecida en SEQ ID NO: 37, aislar una tercera secuencia de nucleótidos que tiene al menos 75% de identidad con las secuencias de nucleótidos establecidas en SEQ ID NO: 38, aislar una cuarta secuencia de nucleótidos que tiene al menos 75% de identidad con al menos una de las secuencias de nucleótidos establecidas en SEQ ID NO: 22 -27, 99, 105, 107 y aislar una quinta secuencia de nucleótidos que tiene al menos 75% de identidad con al menos una de las secuencias de nucleótidos establecidas en SEQ ID NO: 30 -34, 87, 89, 111;
(b)
construir al menos un vector que comprende dichas secuencias de nucleótidos aisladas de la etapa (a);
(c)
transformar el (los) vector (es) de la etapa (b) en una célula huésped durante un tiempo y en condiciones suficientes para la expresión de las proteínas codificadas por dichas secuencias de nucleótidos aisladas de la etapa (a)
(d)
exponer dicha célula huésped, a un sustrato de ácido no graso, por lo que dicho sustrato de ácido no graso se convierte por dicho huésped en un producto de ácido graso poliinsaturado
(a)
aislar una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 75% de identidad con al menos una de las secuencias de nucleótidos establecidas en SEQ ID NO: 5-10, 93, 95, 113 aislar otra
secuencia de nucleótidos que tiene al menos 75% de identidad con al menos una de las secuencias de nucleótidos establecidas en SEQ ID NO: 11-15, 97, 99 aislar una tercera secuencia de nucleótidos que tiene al menos 75% de identidad con al menos una de las secuencias de nucleótidos establecidas en SEQ ID NO: 16-21, 101, 103 aislar una cuarta secuencia de nucleótidos que tiene al menos 75% de identidad con al menos una de las secuencias de nucleótidos establecidas en SEQ ID NO: 22 -27, 99, 105, 107 aislar una quinta secuencia de nucleótidos que tiene al menos 75% de identidad con al menos una de las secuencias de nucleótidos establecidas en SEQ ID NO: 30 -34, 87, 89, 111 aislar una sexta secuencia de nucleótidos que tiene al menos 75% de identidad con al menos una de las secuencias de nucleótidos establecidas en SEQ ID NO: 19, 28, 29, 101 y aislar una séptima secuencia de nucleótidos que tiene al menos 75% de identidad con al menos una de las secuencias de nucleótidos establecidas en SEQ ID NO: 35 -36, 109;
(b)
construir al menos un vector que comprende dichas secuencias de nucleótidos aisladas de la etapa (a);
(c)
transformar el (los) vector (es) de la etapa (b) en una célula huésped durante un tiempo y en condiciones suficientes para la expresión de las proteínas codificadas por dichas secuencias de nucleótidos aisladas de la etapa (a)
(d)
exponer dicha célula huésped, a un sustrato de ácido no graso, por lo que dicho sustrato de ácido no graso se convierte por dicho huésped en un producto de ácido graso poliinsaturado deseado, y obtener dicho ácido docosahexaenoico.
O, la presente invención también se refiere a un procedimiento para producir ácido docosahexaenoico que comprende (a) aislar una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 75% de identidad con al menos una de las secuencias de nucleótidos establecidas en SEQ ID NO: 5 -10, 93, 95, 113 aislar otra secuencia de nucleótidos que tiene al menos 75% de identidad con la secuencia de nucleótidos establecida en SEQ ID NO: 37, aislar una tercera secuencia de nucleótidos que tiene al menos 75% de identidad con la secuencia de nucleótidos establecida en SEQ ID NO: 38, aislar una cuarta secuencia de nucleótidos que tiene al menos 75% de identidad con al menos una de las secuencias de nucleótidos establecidas en SEQ ID NO: 22 -27, 99 105, 107 aislar una quinta secuencia de nucleótidos que tiene al menos 75% de identidad con al menos una de las secuencias de nucleótidos establecidas en SEQ ID NO: 30 -34, 87, 89, 111 aislar una sexta secuencia de nucleótidos que tiene al menos 75% de identidad con al menos una de las secuencias de nucleótidos establecidas en SEQ ID NO: 19, 28, 29, 101 and aislar una séptima secuencia de nucleótidos que tiene al menos 75% de identidad con al menos una de las secuencias de nucleótidos establecidas en SEQ ID NO: 35 -36, 109;
(b)
construir al menos un vector que comprende dichas secuencias de nucleótidos aisladas de la etapa (a);
(c)
transformar el (los) vector (es) de la etapa (b) en una célula huésped durante un tiempo y en condiciones suficientes para la expresión de las proteínas codificadas por dichas secuencias de nucleótidos aisladas de la etapa (a)
(d)
exponer dicha célula huésped, a un sustrato de ácido no graso, por lo que dicho sustrato de ácido no graso se convierte por dicho huésped en un producto de ácido graso poliinsaturado deseado, y obtener dicho ácido docosahexaenoico.
En todavía otra realización preferida, dicho ácido graso poliinsaturado es ácido docosapentaenoico. Específicamente, se proporciona un procedimiento para producir ácido docosapentaenoico que comprende
(a)
aislar una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 75% de identidad con al menos una de las secuencias de nucleótidos establecidas en SEQ ID NO: 5 -10, 93, 95, 113 aislar otra secuencia de nucleótidos que tiene al menos 75% de identidad con al menos una de las secuencias de nucleótidos establecidas en SEQ ID NO: 11-15, 97, 99 aislar una tercera secuencia de nucleótidos que tiene al menos 75% de identidad con al menos una de las secuencias de nucleótidos establecidas en SEQ ID NO: 16-21, 101, 103 aislar una cuarta secuencia de nucleótidos que tiene al menos 75% de identidad con al menos una de las secuencias de nucleótidos establecidas en SEQ ID NO: 22 -27, 99, 105, 107 aislar una quinta secuencia de nucleótidos que tiene al menos 75% de identidad con al menos una de las secuencias de nucleótidos establecidas en SEQ ID NO: 19, 28, 29, 101 and aislar una sexta secuencia de nucleótidos que tiene al menos 75% de identidad con al menos una de las secuencias de nucleótidos establecidas en SEQ ID NO: 30 -34, 87, 89, 111;
(b)
construir al menos un vector que comprende dichas secuencias de nucleótidos aisladas de la etapa (a);
(c)
transformar el (los) vector (es) de la etapa (b) en una célula huésped durante un tiempo y en condiciones suficientes para la expresión de las proteínas codificadas por dichas secuencias de nucleótidos aisladas de la etapa (a)
(d)
exponer dicha célula huésped, a un sustrato de ácido no graso, por lo que dicho sustrato de ácido no graso se convierte por dicho huésped en un producto de ácido graso poliinsaturado deseado, y obtener dicho ácido docosapentenoico
deseado. y obtener dicho ácido araquidónico.
En
otra realización preferida, dicho ácido graso poliinsat urado es ácido
eicosapentaenoico.
Específicamente,
se proporciona un procedimiento para producir ácido
eicosapentaenoico que comprende
deseado.
y obtener dicho ácido eicosapentaenoico.
En
una realización preferida, dicho ácido graso poliinsaturado es ácido
docosahexanoico.
Específicamente,
se proporciona un procedimiento para producir ácido
docosahexaenoico que comprende
En una realización preferida, el ácido graso poliinsaturado es ácido docosatetraenoico.
Específicamente, la presente invención se refiere a un procedimiento para producir ácido docosatetraenoico que comprende (a) aislar una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 75% de identidad con al menos una de las secuencias de nucleótidos establecidas en SEQ ID NO: 5-10, 93, 95, 113 aislar otra secuencia de nucleótidos que tiene al menos 75% de identidad con al menos una de las secuencias de nucleótidos establecidas en SEQ ID NO: 11 15, 97, 99 aislar una tercera secuencia de nucleótidos que tiene al menos 75% de identidad con al menos una de las secuencias de nucleótidos establecidas en SEQ ID NO: 16 -21, 101, 103 aislar una cuarta secuencia de nucleótidos que tiene al menos 75% de identidad con al menos una de las secuencias de nucleótidos establecidas en SEQ ID NO: 22 -27, 99, 105, 107 and aislar una quinta secuencia de nucleótidos que tiene al menos 75% de identidad con al menos una de las secuencias de nucleótidos establecidas en SEQ ID NO: 19, 28, 29, 101;
(b)
construir al menos un vector que comprende dichas secuencias de nucleótidos aisladas de la etapa (a);
(c)
transformar el (los) vector (es) de la etapa (b) en una célula huésped durante un tiempo y en condiciones suficientes para la expresión de las proteínas codificadas por dichas secuencias de nucleótidos aisladas de la etapa (a)
(d)
exponer dicha célula huésped, a un sustrato de ácido no graso, por lo que dicho sustrato de ácido no graso se convierte por dicho huésped en un producto de ácido graso poliinsaturado deseado, y obtener dicho ácido docosatetraenoico.
En una realización, la presente invención se refiere al uso de secuencias de nucleótidos específicas que codifican delta-12 desaturasas, de manera más específica SEQ ID Números 5 -10, 93, 95, 113 que codifican las secuencias de aminoácidos SEQ ID Números 43 -48. Usualmente estas secuencias de nucleótidos que codifican delta-12 desaturasa se usan conjuntamente con al menos 3 o más secuencias de nucleótidos adicionales. Las tres secuencias mínimas son o bien secuencias de nucleótidos que codifican delta-6 desaturasa, delta-5 elongasa, y delta-5 desaturasa, o secuencias de nucleótidos que codifican delta-9 elongasa, delta-8 desaturasa y delta-5 desaturasa. Las secuencias adicionales se pueden seleccionar entre las secuencias que se suministran en la tabla 1. La misma realización también se refiere a cualquier secuencia de nucleótidos que codifica delta-12 desaturasa que comprende o que tiene al menos 75% de identidad con una cualquiera de las secuencias de nucleótidos SEQ ID Números 5 -10.
Específicamente, una secuencia de nucleótidos que codifica una delta-12 desaturasa se selecciona entre el grupo que consta de a) las secuencias de nucleótidos establecidas en SEQ ID Números 5 -10, 93, 95 y 113; y b) secuencias de nucleótidos que tiene al menos 75% de identidad con las secuencias de
nucleótidos establecidas en SEQ ID NO: 5 -10, 93, 95 y 113.
En el presente contexto "delta-12 desaturasa" se refiere a una enzima que es capaz de convertir ácido oleico en ácido linoleico y el significado no excluirá otra funcionalidad de dicha enzima.
En una realización, la presente invención se refiere al uso de una secuencia de nucleótidos específica que codifica delta-9 elongasa, de manera más específica SEQ ID NO 37, que codifica la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO 79. Usualmente esta secuencia de nucleótidos que codifica delta-9 elongasa se usa conjuntamente con al menos 3 o más secuencias de nucleótidos adicionales. Las tres secuencias mínimas adicionales son secuencias de nucleótidos que codifican delta-12 desaturasa, delta-8 desaturasa y delta-5 desaturasa. Las secuencias adicionales se pueden seleccionar entre las secuencias que se suministran en la Tabla 1. La misma realización también se refiere a cualquier secuencia de nucleótidos que codifica delta-9 elongasa que comprende o tiene al menos 75% de identidad con la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO 37.
En el presente contexto "delta-9 elongasa" se refiere a una enzima que es capaz de convertir ácido linoleico en ácido eicosadienoico y / o alfa ácido linoleico en ácido eicosatrienoico y el significado no excluirá otra funcionalidad de dicha enzima.
En una realización, la presente invención se refiere al uso de secuencias de nucleótidos específicas que codifican delta-9 desaturasas, de manera más específica SEQ ID Números 1 -4, que codifican las secuencias de aminoácidos SEQ ID Números 39 -42. Usualmente estas secuencias de nucleótidos que codifican delta-9 desaturasa se usan conjuntamente con al menos 4 o más secuencias de nucleótidos adicionales. Las cuatro secuencias mínimas adicionales son o bien secuencias de nucleótidos que codifican delta-12 desaturasa, delta-9 desaturasa, delta-8 desaturasa y delta-5 desaturasa, o secuencias de nucleótidos que codifican delta-12 desaturasa, delta-6 desaturasa, delta-6 elongasa y delta-5 desaturasa. Las secuencias adicionales se pueden seleccionar entre las secuencias que se proporcionan en la Tabla 1. La misma realización también se refiere a cualquier secuencia de nucleótidos que codifica delta-9 desaturasa que comprende o que tiene al menos 75% de identidad con una cualquiera de las secuencias de nucleótidos SEQ ID Números 1 -4.
Específicamente, una secuencia de nucleótidos que codifica una delta-9 desaturasa se selecciona entre el grupo que consta de a) las secuencias de nucleótidos establecidas en SEQ ID Números 1-4; and b) secuencias de nucleótidos que tiene al menos 75% de identidad con las secuencias de nucleótidos establecidas en SEQ ID Números 1 -4.
En el presente contexto "delta-9 desaturasa" se refiere a una enzima que es capaz de convertir ácido esteárico en ácido oleico y / o ácido palmítico en ácido palmitoleico, y el
significado no excluirá otra funcionalidad de dicha enzima.
En una realización, la presente invención se refiere al uso de una secuencia de nucleótidos específica que codifica una delta-8 desaturasa, de manera más específica SEQ ID NO 38, que codifica la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO 79. Usualmente las secuencias de nucleótidos que codifican delta-8 desaturasa se usan conjuntamente con al menos 3 o más secuencias de nucleótidos adicionales. Las tres secuencias mínimas adicionales son secuencias de nucleótidos que codifican delta-12 desaturasa, delta-9 elongasa, y delta-5 desaturasa. Las secuencias adicionales se pueden seleccionar entre las secuencias que se proporcionan en la Tabla 1. La misma realización también se refiere a cualquier secuencia de nucleótidos de delta-8 desaturasa que comprende o que tiene al menos 75% de identidad con la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO 38.
En el presente contexto "delta-8 desaturasa" se refiere a una enzima capaz de convertir ácido eicosadienoico en ácido dihomo-gamma linolénico o ácido eicosatrienoico en ácido eicosatrienoico y el significado no excluirá otra funcionalidad de dicha enzima.
En una realización, la presente invención se refiere a use of secuencias de nucleótidos específicas que codifican delta-6 desaturasas, de manera más específica SEQ ID Números 11 -15, 97 y 99, que codifican las secuencias de aminoácidos SEQ ID Números 49-53, 98 and
100. Usualmente estas secuencias de nucleótidos que codifican delta-6 desaturasa se usan conjuntamente con al menos 3 o más secuencias de nucleótidos adicionales. Las tres secuencias mínimas adicionales son secuencias de nucleótidos que codifican delta-12 desaturasa, delta-6 elongasa, y delta-5 desaturasa. Las secuencias adicionales se pueden seleccionar entre secuencias proporcionadas en la Tabla 1. La misma realización también se refiere a secuencias de nucleótidos que codifican delta-6 desaturasa que comprende o que tiene al menos 75% de identidad con las secuencias de nucleótidos SEQ ID Números 11 -15, 97 y99.
Específicamente, una secuencia de nucleótidos que codifica una delta-6 desaturasa se selecciona entre el grupo que consta de
a) las secuencias de nucleótidos establecidas en SEQ ID Números 11 -15, 97 y 99; y
b) secuencias de nucleótidos que tienen al menos 75% de identidad con una cualquiera de las secuencias de nucleótidos establecidas en SEQ ID Números 11 -15, 97 y 99.
En el presente contexto "delta-6 desaturasa" es una enzima capaz de convertir ácido linoleico en ácido gamma-linolénico y / o alfa-linolénico en ácido estearidónico y el significado no excluirá otra funcionalidad de dicha enzima.
En una realización, la presente invención se refiere a use of secuencias de nucleótidos específicas que codifican delta-6 elongasas, de manera más específica SEQ ID Números 1621, 101 and 103, que codifican las secuencias de aminoácidos SEQ ID Números 54-59, 102 and 104. Usualmente estas secuencias de nucleótidos que codifican delta-6 elongasa se usan conjuntamente con al menos 3 o más secuencias de nucleótidos adicionales. Las tres secuencias mínimas adicionales son secuencias de nucleótidos que codifican delta-12 desaturasa, delta-6 desaturasa, y delta-5 desaturasa. Las secuencias adicionales se pueden seleccionar entre las secuencias que se proporcionan en la Tabla 1. La misma realización también se refiere a secuencias de nucleótidos que codifican delta-6 elongasa que comprenden o tienen al menos 75% de identidad con las secuencias de nucleótidos SEQ ID Números 16 -21, 101 y 103.
Específicamente, una secuencia de nucleótidos que codifica una delta-6 elongasa se selecciona entre el grupo que consta de a) las secuencias de nucleótidos establecidas en SEQ ID Números 16-21, 101 and 103; and b) secuencias de nucleótidos que tiene al menos 75% de identidad con las secuencias de nucleótidos establecidas en SEQ ID Números 16 -21, 101 y 103.
En el presente contexto "delta-6 elongasa" se refiere a una enzima capaz de convertir ácido gamma-linoleico en ácido dihomo-gamma-linolénico y / o ácido estearidónico en ácido eicosatetraenoico, y el significado no excluirá otra funcionalidad de dicha enzima.
En una realización, la presente invención se refiere a use of secuencias de nucleótidos específicas que codifican delta-5 desaturasas, de manera más específica SEQ ID Números 22 -27, 99, 105 y 107, que codifican las secuencias de aminoácidos SEQ ID Números 60 -65, 100, 106 y 108. Usualmente estas secuencias de nucleótidos que codifican delta-5 desaturasa se usan conjuntamente con al menos 3 o más secuencias de nucleótidos adicionales. Las tres secuencias mínimas adicionales son secuencias de nucleótidos que codifican delta-12 desaturasa, delta-6 desaturasa, y delta-6 elongasa. Las secuencias adicionales se pueden seleccionar entre las secuencias que se proporcionan en la Tabla 1. La misma realización también se refiere a secuencias de nucleótidos que codifican delta-5 desaturasa que comprenden o tienen al menos 75% de identidad con las secuencias de nucleótidos SEQ ID Números 22 -27, 99, 105 y 107.
Específicamente, una secuencia de nucleótidos que codifica una delta-5 desaturasa se selecciona entre el grupo que consta de a) las secuencias de nucleótidos establecidas en SEQ ID NO: 22 -27, 99, 105 y 107; y b) secuencias de nucleótidos que tiene al menos 75% de identidad con las secuencias de nucleótidos establecidas en SEQ ID NO: 22 -27, 99, 105 y 107.
En el presente contexto "delta-5 desaturasa" se refiere a una enzima capaz de convertir ácido dihomo-gamma-linolénico en ácido araquidónico y / o eicosatetraenoico en ácido eicosapentaenoico y el significado no excluirá otra funcionalidad de dicha enzima.
En una realización, la presente invención se refiere a use of secuencias de nucleótidos específicas que codifican delta-5 elongasas, de manera más específica SEQ ID Números 19, 28 -29 y 101, que codifican las secuencias de aminoácidos SEQ ID Números 66 -67 y 102. Además, se refiere a secuencias de nucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO 68. Usualmente estas secuencias de nucleótidos que codifican delta-5 elongasa se usan conjuntamente con al menos 4 o más secuencias de nucleótidos adicionales. Las cuatro secuencias mínimas adicionales son o bien secuencias de nucleótidos que codifican delta-12 desaturasa, delta-6 desaturasa, delta-6 elongasa y delta-5 desaturasa, o secuencias de nucleótidos que codifican delta-12 desaturasa, delta-9 elongasa, delta-8 desaturasa y delta-5 desaturasa. Las secuencias adicionales se pueden seleccionar entre secuencias proporcionadas en la Tabla 1. La misma realización también se refiere a secuencias de nucleótidos que codifican delta-5 elongasa que comprenden o tienen al menos 75% de identidad con las secuencias de nucleótidos SEQ ID Números 19, 28 -29 y 101 y a secuencias de nucleótidos que codifican secuencias de aminoácidos que tiene al menos 75% identidad con SEQ ID NO 68.
Específicamente, una secuencia de nucleótidos que codifica una delta-5 elongasa se selecciona entre el grupo que consta de a) las secuencias de nucleótidos establecidas en SEQ ID Números 19, 28 -29 y 101; y b) secuencias de nucleótidos que tiene al menos 75% de identidad con las secuencias de nucleótidos establecidas en SEQ ID Números 19, 28 -29 y 101; y c) secuencias de nucleótidos que codifican secuencias de aminoácidos que tienen al menos 75% identidad con SEQ ID NO 68.
En el presente contexto "delta-5 elongasa" se refiere a una enzima capaz de convertir ácido araquidónico en ácido docosatetraenoico y / o ácido eicosapentaenoico en ácido docosapentaeonico y el significado no excluirá otra funcionalidad de dicha enzima.
En una realización, la presente invención se refiere al uso de secuencias de nucleótidos específicas que codifican delta-4 desaturasas, de manera más específica SEQ ID Números 35 -36 y 109, que codifican las secuencias de aminoácidos SEQ ID Números 74 -75 y 110. Además, se refiere a secuencias de nucleótidos que codifican las secuencias de aminoácidos SEQ ID Números 76 -77. Usualmente estas secuencias de nucleótidos que codifican delta-4 desaturasa se usan conjuntamente con al menos 4 o más secuencias de nucleótidos adicionales. Las cuatro secuencias mínimas adicionales son o bien secuencias de nucleótidos que codifican delta-12 desaturasa, delta-6 desaturasa, delta-6 elongasa y delta-5 desaturasa, o secuencias de nucleótidos que codifican delta-12 desaturasa, delta-9 elongasa, delta-8 desaturasa y delta-5 desaturasa. Las secuencias adicionales se pueden seleccionar entre secuencias proporcionadas en la Tabla 1. La misma realización también se refiere a secuencias de nucleótidos de delta-4 desaturasa que comprenden o tienen al menos 75% de identidad con las secuencias de nucleótidos SEQ ID Números 35 -36 y 109 y a secuencias de nucleótidos que codifican secuencias de aminoácidos que tiene al menos 75% identidad con SEQ ID Números 76 -77.
Específicamente, una secuencia de nucleótidos que codifica una delta-4 desaturasa se selecciona entre el grupo que consta de a) las secuencias de nucleótidos establecidas en SEQ ID NO: 35 -36 y 109; y b) secuencias de nucleótidos que tiene al menos 75% de identidad con las secuencias de nucleótidos establecidas en SEQ ID Números 35 -36 y 109; y c) secuencias de nucleótidos que codifican secuencias de aminoácidos que tienen al menos 75% identidad con SEQ ID Números 76 -77.
En el presente contexto "delta-4 desaturasa" se refiere a una enzima capaz de convertir ácido docosapentaenoico en ácido docosahexaenoico y el significado no excluirá otra funcionalidad de dicha enzima.
En una realización, la presente invención se refiere al uso de secuencias de nucleótidos específicas que codifican omega-3 desaturasas, de manera más específica SEQ ID Números 30 -34, 87, 89 y 111, que codifican las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO 69 -73, 88, 90 y 112. Usualmente estas secuencias de nucleótidos que codifican omega-3 desaturasa se usan conjuntamente con al menos 4 o más secuencias de nucleótidos adicionales. Las cuatro secuencias mínimas adicionales son o bien secuencias de nucleótidos que codifican delta-12 desaturasas, delta-6 desaturasas, delta-6 elongasa y delta-5 desaturasa, o secuencias de nucleótidos que codifican delta-12 desaturasa, delta-9 elongasa, delta-8 desaturasa y delta-5 desaturasa. Las secuencias adicionales se pueden seleccionar entre secuencias proporcionadas en la Tabla 1. La misma realización también se refiere a secuencias de nucleótidos que codifican omega-3 desaturasa que comprenden o tienen al menos 75% de identidad con las secuencias de nucleótidos SEQ ID Números 30 -34, 87, 89 y 111.
Específicamente, una secuencia de nucleótidos que codifica una omega-3 desaturasa se selecciona entre el grupo que consta de a) las secuencias de nucleótidos establecidas en SEQ ID Números 30 -34, 87, 89 y 111; y b) secuencias de nucleótidos que tienen al menos 75% de identidad con las secuencias de nucleótidos establecidas en SEQ ID Números 30 -34, 87, 89 y 111.
En el presente contexto "omega-3 desaturasa" se refiere a una enzima capaz de convertir ácido linoleico en ácido alfalinolénico, ácido gamma-linolénico en ácido estearidónico, ácido eicosadieonico en ácido eicosatrienoico, ácido dihomo-gamma-linolénico en ácido eicosatetraenoico, ácido araquidónico en ácido eicosapentaenoico, y ácido docosatetraenoico en ácido docosapentaenoico o subconjuntos de estas capacidades, y el significado no excluirá otra funcionalidad de dicha enzima.
Como se define comúnmente (véase por ejemplo, Encyclopaedia of Life Sciences, Nature Publishing Group, 2000) "identidad" se define en el presente documento como la identidad de secuencia entre genes o proteínas a nivel de nucleótido aminoácido, respectivamente. De este modo, en el presente contexto "identidad de secuencia" es una medida de identidad entre proteínas a nivel de aminoácido y una medición de la identidad entre ácidos nucleicos a nivel de nucleótido. La identidad de secuencia de proteína se puede determinar comparando la secuencia de aminoácidos en una posición dada en cada secuencia cuando las secuencias están alineadas. De manera similar, la identidad de secuencias de ácido nucleico se puede determinar comparando la secuencia de nucleótidos en una posición dada en cada secuencia cuando las secuencias están alineadas.
Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos o de dos ácidos nucleicos, las secuencias están alineadas para propósitos de comparación óptimos
(por ejemplo, se pueden introducir huecos en la secuencia de una primera secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos para alineación óptima una segunda secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos). Los restos de aminoácido o nucleótidos en las posiciones de aminoácido correspondientes o nucleótido se comparan después. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo resto de aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % de identidad = nº de posiciones idénticas /nº de posiciones total (por ejemplo, posiciones de superposición) x 100). En una realización las dos secuencias tienen la misma longitud.
Se pueden alinear manualmente las secuencias y contra el número de aminoácidos idénticos. Como alternativa, la alineación de dos secuencias para la determinación del porcentaje de identidad se puede llevar a cabo usando un algoritmo matemático. Un ejemplo preferido, no limitante de un algoritmo matemático que se puede utilizar para la comparación de dos secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc. Natl. Acad Sci. Estados Unidos 87: 2264 -2268, modificado por Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 90:5873 -5877. Tal algoritmo se incorpora en los programas NBLAST y XBLAST de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403 -410. Las búsquedas de nucleótido BLAST se pueden realizar con el programa NBLAST, puntuación = 100, longitud de palabra = 12, para obtener las secuencias de nucleótidos homólogas de una molécula de ácido nucleico de la invención. Las búsquedas de proteína BLAST se pueden realizar con el programa XBLAST, puntuación = 50, longitud de palabra = 3 para obtener las secuencias de aminoácidos homólogas a una molécula de proteína de la invención. Para obtener las alineaciones de huecos para propósitos de comparación, Se puede usar Gapped BLAST como se describe en Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389 -402. Como alternativa, PSI-Blast se puede usar para realizar un una búsqueda repetida que detecta las relaciones distantes entre moléculas. Cuando se utilizan los programas NBLAST, XBLAST, y Gapped BLAST, se pueden usar los parámetros por defecto de los programas. Véase http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Como alternativa, la identidad de secuencia se puede calcular después que las secuencias se hayan alineado por ejemplo, por el programa de Pearson W.R y D.J. Lipman (Proc Natl Acad Sci Estados Unidos 85: 2444 -2448, 1998) en la base de datos EMBL (www.ncbi.nim.gov/cgi-bin/BLAST). En general, las posiciones por defecto con respecto a por ejemplo, "matriz de puntuación" y "penalización de hueco" se pueden usar para alineación. En el contexto de la presente invención, las posiciones por defecto de BLASTN y PSI BLAST pueden ser ventajosas. El porcentaje de identidad entre dos secuencias se puede determinar usando técnicas similares a las descritas anteriormente, con o sin huecos permitidos. En el cálculo del porcentaje de identidad, solamente se cuentan las coincidencias exactas.
Genes heterólogos
La tecnología descrita en la presente invención se refiere a células huésped no vegetales modificadas genéticamente y a células huésped que producen los PUFA a partir de por ejemplo, sustratos de ácido no graso, tales como fuentes de azúcar o sustratos de v combinados como se ha descrito anteriormente.
Las células transformadas genéticamente en particular que albergan una ruta que requiere oxígeno heteróloga de ácido esteárico a los PUFA mediante la expresión de las siguientes enzimas heterólogas delta-9 desaturasa, delta-12 desaturasa, delta-9 elongasa, delta-8 desaturasa omega-3 desaturasa, delta-6 desaturasa, delta-6 elongasa, delta-5 desaturasa, delta-5 elongasa, delta-4 desaturasa o sus subconjuntos.
Delta-9 desaturasa cataliza la reacción de ácido palmítico a ácido palmitoleico así como la reacción de ácido esteárico a ácido oleico. Delta-12 desaturasa cataliza la reacción de ácido oleico a ácido linoleico, que inicia la ruta omega-6, ácido linoleico se convierte en ácido gamma-linolénico mediante la acción de delta-6 desaturasa. Ácido gammalinolénico se alarga mediante dos grupos metilo por delta-6 elongasa para formar dihomo-gamma-linolénico, que
se desatura por delta-5 desaturasa en ácido araquidónico.
Como alternativa, ácido araquidónico se puede producir a partir de ácido linoleico mediante la acción de delta -9 elongasa, delta-8 desaturasa y delta-5 desaturasa. Ácido linoleico se alarga mediante delta-9 elongasa para formar ácido eicosadienoico, que se convierte en ácido dihomo-gamma-linolénico mediante la acción de delta-8 desaturasa, y finalmente ácido araquidónico se forma a partir de ácido dihomo-gamma-linolénico mediante la acción de delta-5 desaturasa. Para ambas alternativas, ácido araquidónico se puede alargar mediante delta-5 elongasa para formar ácido �7, �10, �13, �16-docosatetraenoico.
Omega-3 desaturasa convierte los ácidos linoleicos en ácido alfa-linoleico, el punto de partida de la ruta omega-3. Omega-3 desaturasas son a menudo inespecíficas y pueden convertir ácido gamma-linoleico en ácido estearidónico, ácido eicosadienoico en ácido eicosatrienoico, ácido dihomo-gamma-linolénico en ácido eicosatetraenoico, ácido araquidónico en EPA y ácido ácido docosatetraenoico en ácido docosapentaenoico. La ruta omega-3 usa las mismas enzimas que la ruta omega-6 más una delta-4 desaturasa. Delta-6 desaturasa cataliza la reacción de ácido alfa-linoleico en ácido estearidónico, que además se convierte por delta-6 elongasa en ácido eicosatetraenoico. Como alternativa, ácido eicosatetraenoico se puede producir a partir de ácido alfa-linolénico mediante la acción de delta-9 elongasa y delta-8 desaturasa. Delta-9 elongasa catatliza la reacción de ácido alfalinolénico a ácido eicosatrienoico, y delta-8 desaturasa cataliza la reacción de ácidos eicosatrienoicos a ácido eicososatetraenoico. La desaturación de ácido eicosatetraenoico por delta-5 desaturasa conduce a EPA. EPA se convierte mediante delta-5 elongasa en ácido docosapentaenoico, que el mismo se desatura mediante delta-4 desaturasa para formar DHA.
Los genes heterólogos se pueden aislar a partir de cualquier organismo vivo, incluyendo hongos, plantas, animales, algas y protistas marinos, amebas y bacterias, que albergan rutas para ácido oleico, ácido linoleico, alfa-linolénico, ácidos gamma-linoleicos, ácido dihomo-gamma-linolénico, ácido araquidónico, ácido estearidónico, ácido eicosatetraenoico, EPA, ácido 7,10,13,16,19-docosapentaenoico, ácido docosatetraeonico o DHA.
Una lista no exhaustiva de organismos que tienen tales rutas que conducen a ácidos grasos con uno o más dobles enlaces son bacterias tales como pero sin limitación a, Spirulina spp., Synechocystis, etc. hongos tales como Mortiella alpina, Mucor rouxii, Mucor circinelloides, Aspergillus fumigatus, etc., plantas como Petroselinum crispum, Arabidopsis thaliana, Brassica napus, Glycine max, Zea mays, Ricinus communis, Corylus avellana, Phaeodactylum tricornutum, etc., y los animales tales como Caenorhabditis elegans, Homo sapiens, Mus musculus, Rattus norvegicus, Lepidoptera, etc., y del mismo modo las algas tales como Schizochytrium, Thraustochytrium sp., Phaeodactylum tricornutum, etc., y amebas, tales como
Dictyostelium discoideum, etc.
La expresión de delta-12 desaturasa se ha reseñado en una amplia gama de organismos diferentes incluyendo pero sin limitación a, Mortierella alpina, Mucor rouxii, Mucor circinelloides, Aspergillus fumigatus, Helianthus annuus, Petroselinum crispum, Arabidopsis thaliana, Brassica napus, Glycine max, Zea mays, Ricinus communis, Corylus avellana, Phaeodactylum tricornutum, C.elegans, Calendula officinalis y algodón, pero no se limitan a estos ejemplos (documentos WO9411516, US6025172, US2003/0180802, US2003/0172398, US2003/0074694, US2003/066104, US6,372,965, US6,441,278, WO200185968-A2, WO200179499-A1, US6372965-B1, WO200114538-A).
Delta-6 desaturasas se pueden encontrar al menos en los siguientes organismos Mortierella alpina, Mucor rouxii, Mucor circinelloides, Pythium irregulare, Borago officinalis, Ceratodon purpureus, Physcomitrella patens, Anemone leveillei, Phaeodactylum tricornutum, Tetrahymena, Caenorhabditis elegans, Primulaceae, Homo sapiens, Castor, evening primrose, Synechocystis, Spirulina spp., Physcomitrella patens (documentos WO 9927111, US 2002/0170090, WO 03/072784, US 6,492,108, US 6,686,186, US 2002/0151019, US 2002/0108147, WO 02/081702, WO200272028-A2, US6355861-B1, WO200144485-A, JP2001095588-A, WO200120001-A, WO200102591-A, WO200104636-A, JP2001095588-A, WO200175069-A1). Delta-6 elongasas se han identificado entre otros en los siguientes organismos Mortierella alpina, Physcomitrella patens, Caenorhabditis elegans, Mortiella Alpina, Homo sapiens, C.elegans, Mus musculus, T.aureum, Pavlova, Thraustochytrium aureum, Phytophthora infestans (documentos US6403349, WO 03/102138, US 2003/0177508, WO200244320-A, W0200208401-A, WO200159128-A, DE10005973-A1, WO200055330-A, WO2003064638-A2).
Delta-9 elongasas se han aislado de Isochrysis galbana (documento WO02077213, Qi et al. 2004) y delta-8 desaturasas de Euglena gracilis (Wallis and Browse 1999). Delta-5 desaturasas se han aislado de Mortierella alpina, Phytophthora megasperma, Physcomitrella patens, Phaeodactylum tricornutum, Thraustochytrium sp. ATCC 2165, Caenorhabditis elegans, Dictyostelium discoideum, Schizochytrium, Thraustocytrium aureum, Saprolegnia diclina, Isochrysis galbana, Phytophthora megasperma, Homo sapiens, rata, Euglena , entre otros (documentos US5972664, WO9933958, WO9846765, WO 02/081668, WO2003012092A, US6428990-B1, US6432684-B1, WO200234940-A, WO200040705-A, WO200034439-A, WO200104636-A, WO2003012092-A).
Omega-3 desaturasas se pueden aislar de de plantas, hongos, y nematodos, tales como Petroselinum crispum, Brassica napus, Arabidopsis thaliana, Glycine soya, Saprolegnia diclina, Caenorhabditis elegans (es decir, documentos US6194167, US20030196217, Yadav et
al. 1993, Kirsch et al. 1997) o de Saccharomyces kluyveri
Delta-5 elongasa se ha encontrado entre otros en ratón, Homo sapiens, Caenorhabditis elegans, Thraustochytrium aureum, (es decir, documentos US 2003/0177508 y WO200208401-A) y Delta-4 desaturasa se puede aislar de hongos, algas y protistas marinos incluyendo Thraustochytrium sp., Euglena gracilis, Thraustochytrium aureum, Saprolegnia diclina, Isochrysis galbana, etc. Pero no se limitan a estos organismos (es decir, WO 02/090493, WO200226946-A, Qiu et al. 2001, Meyer et al. 2003)
En una realización, la presente invención describe la expresión heteróloga simultánea de genes que codifican delta-12 desaturasa, delta-6 desaturasa, delta-6 elongasa y delta-5 desaturasa en un microorganismo, que conduce a la producción de los PUFA, y en particular la producción de ácido araquidónico a partir de sustratos de ácido no graso. Los genes se pueden expresar sobre un único plásmido o varios plásmidos, tal como un plásmido, dos plásmidos, tres plásmidos, cuatro plásmidos, cinco plásmidos, seis plásmidos, siete plásmidos, ocho plásmidos, nueve plásmidos, o diez plásmidos o más. El uso de un único plásmido que porta varios genes heterólogos, por ejemplo cuatro genes, es ventajoso debido a que asegura que las células que portan el plásmido contienen todos los genes heterólogos. Por el contrario si se usan varios plásmidos, una fracción de la población de células contendrá solamente uno de los plásmidos y de este modo no expresará la ruta heteróloga completa. Sin embargo, el número de genes heterólogos que se pueden expresar a partir de un único plásmido está limitado por el tamaño incrementado del plásmido; los plásmidos grandes tienden a ser menos estables en la célula que los plásmidos pequeños, que conduce a una expresión más deficiente de los plásmidos grandes. Una realización actualmente preferida por lo tanto implica la expresión de uno o dos genes heterólogos por plásmido.
Además, se describe la expresión heteróloga simultánea de genes que codifican delta12 desaturasa, omega-3 desaturasa, delta-6 desaturasa, delta-6 elongasa y delta-5 desaturasa en un microorganismo, que da como resultado la producción de EPA y otros PUFA a partir de sustratos de ácido no graso.
La invención también describe la expresión heteróloga simultánea de genes que codifican delta-12 desaturasa, omega-3 desaturasa, delta-6 desaturasa, delta-6 elongasa, delta-5 desaturasa, delta-5 elongasa y delta-4 desaturasa en un microorganismo, que da como resultado la producción de DHA a partir de sustratos de ácido no graso.
La invención describe una expresión adicional de una delta-9 desaturasa. La producción de los PUFA en microorganismos se puede mejorar mediante la expresión de delta9 desaturasas que son más específicas para la producción de ácido oleico mejor que ácido palmitoleico (Figura 2). Recientemente, se han clonado dos delta-9 desaturasas de M. alpina, ole1 y ole2. Ambos genes complementan los mutantes de levadura �ole1, que no pueden crecer sin suplemento de ácidos grasos 16:1 y 18:1 en el medio. Tanto delta-9 desaturasas de
M. alpina desplazan el contenido de ácido graso de ácido graso desaturado 16:1 hacia ácido graso desaturado 18:1 (ácido oleico) en levadura. El contenido de ácido oleico de la levadura
�ole1 que expresa M. alpina ole1 era 53,6% de lípido total, comparado con 21.6% en S. cerevisiae de tipo salvaje (Wongwathanarat et al., 1999). La presente invención muestra esa expresión de una delta-9 desaturasa heteróloga conjuntamente con la ruta biosintética de PUFA heteróloga puede incrementar la producción de PUFA en levadura. Por ejemplo, la expresión de Mortierella alpina ole1 conjuntamente con una delta-12 desaturasa de Mortierella alpina en levadura incrementa la producción de ácido linoleico, por ejemplo por el factor de 5 o cualquiera de sus múltiplos.
Secuencias y construcciones de nucleótidos
Por "gen" se entiende una secuencia de nucleótidos, también llamada secuencia de ADN o ARN, que codifica una proteína específica. Las secuencias de nucleótidos que codifican las desaturasas y elongasas de PUFA descritas se pueden aislar a partir de fuentes naturales usando procedimientos convencionales conocidos en la técnica. Uno de tales procedimientos comprenden el aislamiento de ARN total, transcripción inversa usando Oligo(dT) o cebadores aleatorios seguido de amplificación por PCR usando cebadores específicos de secuencia. Las secuencias de nucleótidos que codifican desaturasa-y elongasa de PUFA se pueden aislar del mismo modo mediante procedimientos conocidos. Preferiblemente, se basan en la homología de secuencia y comprenden, por ejemplo, PCR usando cebadores degenerados y selección de las genotecas de ADN o ADNc mediante hibridación de colonias usando sondas de polinucleótidos marcadas radiactivamente. Como alternativa, los procedimientos de aislamiento se basan en la función del polipéptido codificado por el polinucleótido. Por ejemplo, una genoteca de expresión de ADNc se genera a partir de un organismo que produce PUFA y se selecciona para desaturación o alargamiento de sustratos de PUFA.
PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) es una técnica para la síntesis de grandes cantidades de secuencias de ADN específicas que se basa en ciclos repetidos de replicación in vitro de molde de ADN por una ADN polimerasa tolerante a la temperatura (Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51: 263 -273 (1986); Solicitud de Patente europea 50424; Solicitud de Patente europea 84796; Solicitud de Patente europea 258017: Solicitud de Patente europea 237362; Solicitud de Patente europea 201184; documentos US4683202; US4582788; US4683194). La técnica utiliza de conjuntos de oligonucleótidos sintetizados in vitro específicos, denominados cebadores, que se hibridan a secuencias complementarias en la síntesis de ADN de molde ADN y de ADN de cebo por la ADN polimerasa. La amplificación se logra aplicando varios ciclos (normalmente 20 -50) de fusión del molde de doble cadena a alta temperatura, hibridación de los cebadores, y replicación de ADN. Para la amplificación de las secuencias conocidas, cebadores se diseñan usualmente para emparejar la secuencia de molde exactamente. Sin embargo, se pueden introducir características deseadas, tales como sitios de restricción específicos en el fragmento resultante de ADN mediante el diseño de los cebadores. Además, una secuencia de cola específica de 5’ se puede incluir en la secuencia del cebador, que más tarde permite la fusión del producto de la PCR a un fragmento de ADN que contiene una secuencia del extremo de emparejamiento.
PCR que usa cebadores degenerados se pueden usar para amplificar una secuencia de ADN novedosa con homología de secuencia consecuencias de ADN conocidas. Los cebadores se diseñan después para emparejar las regiones de ADN de alta homología, como se deduce a partir de alineaciones múltiples de secuencias conocidas. Los cebadores se permite que contengan bases diferentes en ciertas posiciones, de manera que el cebador usado en la reacción de la PCR es realmente una mezcla de oligonucleótidos con secuencias diferentes. Una parte de los oligonucleótidos en la mezcla se hibrida con la secuencia diana, permitiendo la amplificación del molde.
Técnicas para manipulación de ácidos nucleicos que codifican enzimas de PUFA tales como subclonación de las secuencias de ácido nucleico que codifican polipéptidos en los vectores de expresión, sondas de marcado, hibridación de ADN, y similares se describen en general en Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual (2ª ed.), Vols. 1 -3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).
Después del aislamiento de un gen deseado, se puede secuenciar usando procedimientos conocidos.
Una vez que una secuencia de nucleótidos se ha aislado, se puede expresar en una célula huésped. Con el propósito de expresar un ácido nucleico heterólogo en una célula huésped, está unido de manera operativa a una secuencia promotora y una terminadora usando técnicas de clonación convencionales o procedimientos in vitro convencionales, tal como fusión por PCR.
El término "promotora" se refiere a una secuencia de ADN capaz de controlar la expresión de un gen. la secuencia v consta de elementos próximos y más distales localizados cadena arriba del gen. Los elementos más distales a menudo se refieren a potenciadotes. Las secuencias promotoras también se pueden localizar dentro de la parte transcrita de la secuencia de ADN, y / o cadena debajo de las secuencias transcritas. La "secuencia terminadora", también llamada la secuencia no codificadora de 3’ se refiere a secuencias de ADN localizadas cadena debajo de un gen e incluyen secuencias de reconocimiento de poliadenilación y otras secuencias que codifican señales reguladoras capaces de de afectar al procesamiento de ARNm o expresión del gen. Las secuencias promotoras y terminadoras usadas para la expresión heteróloga se pueden derivar de la secuencia nativa del gen heterólogo. Más a menudo, las secuencias promotoras y terminadoras se toman a partir de una secuencia de ADN altamente expresada de la célula huésped. Por ejemplo, las secuencias promotoras adecuadas para la expresión en Saccharomyces cerevisiae incluyen los promotores constitutivos de TDH3, ADH1, TPI1, ACT1 GPD y PGI del promotor de cualquier gen de levadura constitutivamente y altamente transcrito y los promotores inducibles de galactosa de GAL1, GAL10 y GAL7. También contemplado por la presente invención son otros promotores inducible de levadura, tales como pero sin limitación, el promotor de metalotioneína CUP1, que permite la expresión del gen en la presencia de metales pesados, tal como cobre (Karin M, et al, (1984) Proc Natl Acad Sci Estados Unidos 81 (2): 337 -41. El promotor MET15 también se puede usar cuando la represión de genes se desea. Las secuencias promotoras bacterianas adecuadas son por ejemplo la región promotora y operadora de la ruta biosintética de triptófano de E. coli como se describe por Yanofsky (1984)
J. Bacteriol., 158: 1018 -1024 y el promotor del fago lambda (Pλ) como se describe por Herskowitz y Hagen, (1980) Ann. Rev. Genet., 14: 399 -445. Se conocen un gran número de secuencias terminadoras y se han encontrado en que son satisfactorias en una diversidad de huéspedes del mismo y diferente género y especie. Un polinucleótido heterólogo, unido de manera operativa a una secuencia promotora y una terminadora, se denomina de aquí en adelante un módulo de expresión. El término unido de manera operativa se refiere a la asociación de un gen con una secuencia que controla su expresión sobre un único fragmento de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor está ligado de manera operativa con una secuencia codificadora cuando es capaz de regular la expresión de esa secuencia codificadora.
Las construcciones que contienen genes heterólogos de de interés se pueden introducir en el huésped mediante técnicas convencionales. estas técnicas incluyen transformación, tal como por ejemplo, en S. cerevisiae, transformación por acetato de litio, esferoplastificación, y uso de un mutante kar1�15 (Georgieva, B. et al, (2002) Meth. Enzymol.
350: 278 -89), fusión de protoplasto, lipofección, transfección, transducción, conjugación, infección, impacto balístico, electroporación, o cualquier otro procedimiento que introduce el ADN extraño en la célula huésped. Para simplicidad, una célula huésped manipulada de esta
manera se denominará "transformada", "recombinante" o "modificada genéticamente". La construcción que se introduce en la célula huésped contiene además del módulo de expresión un gen marcador, que permite identificación de células transformadas, y en el caso de expresión extracromosómica, también evita que la célula pierda la construcción. 5 Preferiblemente, el gen marcador que codifica un gen condicionalmente esencial, que se ha suprimido en el genoma huésped. Los ejemplos de los últimos son, en levadura, el gen URA3, el gen TRP1, el gen HIS3 y el gen LEU2, que restablece la capacidad de la célula de levadura mutante ura3, trp1, his3 o leu2 para producir los compuestos esenciales de uracilo, triptófano, histidina y leucina, respectivamente. Las células de levadura recombinante por lo tanto se
10 seleccionan y se mantienen en medio que carece de estos factores. Como alternativa, el gen marcador puede conferir resistencia a un antibiótico, permitiendo la selección y mantenimiento de células recombinantes en medio que contiene el antibiótico.
Tabla 1. Los ejemplos de desaturasas y elongasas, útiles para la producción de PUFA 15 heterólogo.
Enzima
Fuente Referencia SEQ ID NO: (nucleótido) Enzima: aminoácido)
delta-9 desaturasa
Mortierella alpina Solicitud de patente presente 1 39
Cryptococcus curvatus
Meesters et al. 1996 Yeast 12:723 -730 2 40
Histoplasma capsulatus
Gargano et al. 1995 Lípidos41 30:899 -906 3
Trichoplusia ni
Liu et al. 1999 Insect 4 42
Enzima
Fuente Referencia SEQ ID NO: (nucleótido) Enzima: aminoácido)
Biochem Mol Biol 29: 435 – 443
delta-12
Mortierella Solicitud de 5 43
desaturasa
alpina patente presente
Mucor rouxii
Passorn et al. 1999 Biochem Biophys Res Commun 263: 47 -51 6 44
Mucor circinelloides
BAB69056, GenBank Dec 2000 7 45
Aspergillus
CAE47978, 8 46
fumigatus
GenBank diciembre 2003
Cryptococcus
AAS78627, 9 47
curvatus
Pubmed marzo 2004
Caenorhabditis
Documento US 10 48
Elegans
2003/0172398
Enzima
Fuente Referencia SEQ ID NO: (nucleótido) Enzima: aminoácido)
Aspergillus parasiticus
Wilson et al. 2004 Microbiology 150: 2881 -2888 93 94
Pichia pastoris Saccharomyces kluyveri
AAX20125, Pubmed marzo 2005 Watanabe et al. 2004 Biosci Biotechnol Biochem 68: 721 -727 95 113 96 114
delta-6 desaturasa
Mortierella alpina Mucor rouxii Solicitud de patente presente Laoteng et al. 2000 Biochem Biophys 11 12 49 50
Enzima
Fuente Referencia SEQ ID NO: (nucleótido) Enzima: aminoácido)
Borago officinalis
Res Commun 279: 17 -22 Sayanova et al. 1997 Proc Natl Acad Sci USA 94: 4211 -4216. 13 51
Anemone
Whitney et al. 14 52
leveillei
2003 Planta 14 52
Caenorhabditis
WO 9927111 15 53
elegans
Marchantia
Kajikawa et al. 97 98
polymorpha
2004 Plant Mol Biol 54: 335 -352
Cyprinus carpio
Hastings et al. 2001 Proc Natl Acad Sci 98: 14304-14309 99 100
Enzima
Fuente Referencia SEQ ID NO: (nucleótido) Enzima: aminoácido)
delta-6 elongasa
Mortierella alpina Solicitud de patente presente 16 54
Physcomitrella patens
WO0159128 17 55
Caenorhabditis elegans
W0200055330-A 18 56
Mus musculus
WO200208401-A 19 57
Thraustochytrium aureum
WO200208401-A 20 58
Phytophthora infestans
WO2003064638A2 21 59
Salmo salar
Hastings et al. 2004 Mar Biotechnol 6: 463 -474 101 102
Marchantia polymorpha
Kajikawa et al. 2004 Plant Mol Biol 54: 335 -352 103 104
Enzima
Fuente Referencia SEQ ID NO: (nucleótido) Enzima: aminoácido)
delta-5
Mortierella alpina Solicitud de patente presente 22 60
desaturasa
Phytohphtora megasperma Documento WO030120 23 61
Thraustochytrium
Documento WO200226946-A 24 62
Caenorhabditis elegans
Documento WO9933958 25 63
Pythium irregulare
Documento WO200226946-A 26 64
Phaedodactylum. Tricornutum
Documento US20040053379A1 27 65
Salmo salar
Hastings et al. 2004 Mar Biotechnol 6: 463 -464 105 106
Enzima
Fuente Referencia SEQ ID NO: (nucleótido) Enzima: aminoácido)
Marchantia
Kajikawa et al. 107 108
polymorpha
2004 Plant Mol Biol 54: 335-352
Cyprinus carpio
Hastings et al. 2001 Proc Natl Acad Sci 98: 14304 -14309 99 100
delta-5 elongasa
Mus musculus Tvrdik et al. 2000 J Cell Biol 149: 707-717 28 66
Mus musculus
Documento W0200208401-A 19 57
Homo sapiens
Documento WO0244320 29 67
Pavlova
Documento WO 03102138 68 68
Salmo salar
Hastings et al. 2004 Mar Biotechnol 6: 463 -474 101 102
omega-3 desaturasa
Caenorhabditis elegans Petroselinum Documento US6194167 Kirsch et al. 1997 30 31 69 70
Enzima
Fuente Referencia SEQ ID NO: (nucleótido) Enzima: aminoácido)
crispum
Proc Natl Acad Sci USA 94: 2079 2084
Arabidopsis thaliana
Yadav et al. 1993 Plant Physiol 103: 467 -476 32 71
Brassica napus
Yadav et al. 1993 Plant Physiol 103: 467 -476 33 72
Glycine soya
Yadav et al. 1993 Plant Physiol 103: 467 -476 34 73
Mortierella alpina
Sakuradani et al. 2005 Appl Microbiol Biotechnol 66: 648 -654 89 90
Saccharomyces
Oura et al. 2004 87 88
Enzima
Fuente Referencia SEQ ID NO: (nucleótido) Enzima: aminoácido)
kluyveri Saprolegnia diclina
Microbiology 150: 1983-1990 Pereira et al. 2004 Biochem J 378: 665-671 111 112
delta-4 desaturasa
Thraustochytrium aureum Euglena gracilis Isochrysis galbana Schizochytrium aggregatum Pavlova lutheri Documento WO200226946-A Meyer et al. 2003 Biochemistry 42: 9779 -9788 Documento WO 02/090493 Documento WO 02/090493 Pereira et al. 2004 Biochem. J. 384: 357 -366 35 36 109 74 75 76 77 110
delta-9 elongasa
Isochrysis galbana Documento WO2002077213_A2 37 78
Enzima
Fuente Referencia SEQ ID (nucleótido) NO: Enzima: aminoácido)
delta-8 desaturasa
Euglena gracilis Documento WO200034439-A 38 79
En una realización de la invención, los genes requeridos para la producción de PUFA se integran en el genoma del organismo huésped. La integración de polisecuencias 5 heterólogas de nucleótidos en el genoma de Saccharomyces cerevisiae por recombinación homóloga también se conoce, la técnica estándar para la manipulación genética de S. cerevisiae. Una construcción de AND lineal se puede dirigir para la integración en cualquier localización en el genoma de levadura fusionándose a las secuencias dianas en el extremo 5’ y en el extremo 3’. Tras la transformación con la construcción de ADN lineal, la ruta de la
10 reparación de la rotura de la hebra de doble ADN de levadura se activa, que media en la recombinación homóloga entre las secuencias diana del sustrato de ADN lineal y las secuencias correspondientes en el genoma de levadura. Esto da como resultado integración de la construcción de ADN lineal en el genoma, y formación de bucle simultáneo de cualquier secuencia entre las dos secuencias diana en el
15 genoma de levadura. Dependiendo del propósito de la manipulación genética, la secuencias Diana se pueden seleccionar en cada lado de un gen de levadura, dando como resultado la inactivación de ese gen gene, o adyacente entre sí, dando como resultado la ruptura de la secuencia diana pero que dejan de otra manera el genoma intacto. La presente invención implica la integración de varios genes heterólogos, que codifican
20 PUFA desaturasas y elongasas. Preferiblemente, todos los módulos de expresión necesarios para la producción de un PUFA específico se ensamblan en un único plásmido, que también contienen un gen marcador y una secuencia diana para integración. La secuencia diana se modifica por ingeniería genética para que contenga o contenga de forma natural un único sitio de restricción, que permite la alineación del plásmido.
25 Después de la transformación de la levadura con el plásmido alineado, las células de levadura se siembran en medio de selección como se describe en el presente documento y se identifican células recombinantes que contienen la construcción heteróloga de ADN. Preferiblemente, todos los módulos de expresión necesarios para la producción de un
PUFA específico se ensamblan en una única construcción y se integran de manera simultánea el genoma de la célula de levadura. Sin embargo, si se desea la expresión de muchos genes heterólogos, puede ser beneficioso colocar los genes individuales en varias, por ejemplo dos, construcciones diferentes, dirigidas para la integración en diferentes sitios en el genoma huésped como se ha descrito anteriormente. Después de la identificación de las células recombinantes, las dos integraciones cromosómicas separadas se pueden combinar mediante cruzamiento de las hebras recombinantes. Si es necesario, cada hebra recombinante se toma primero mediante un cruce intermedio con el fin de introducir los marcadores genéticos adecuados.
El cruce de cepas es un procedimiento tradicional, ampliamente usado y muy eficaz para combinar genotipos diferentes. En resumen, dos cepas de levaduras haploide de tipo de emparejamiento opuesto (es decir, para S. cerevisiae, se describen tipos de emparejamiento como MATa y MATalfa) se permiten para emparejarse en medio rico, tal como YPD. Usualmente, las cepas haplolides cada una de ellas muestra un fenotipo seleccionable diferente, tal como auxotrofia de aminoácido, permitiendo que los diploides se seleccionen en medio que se han eliminado dos aminoácidos. Como alternativa, las células se pueden sembrar en medio rico después de emparejamiento, y se identifican los diploides mediante la inducción de células que experimentan meiosis y esporulación simplemente transfiriendo un número de colonias individuales en medio de esporulación, tal como, por ejemplo, medio que contiene acetato de potasio como la única fuente de carbono, y controlar la esporulación por microscopía. Después de esporulación de los diploides, las esporas se diseccionan y los genotipos de las cepas haploides resultantes se puntúan usando diversos procedimientos, tal como siembra en réplica a placas de adecuadas desechables mediante PCR de las colonias. El cruzamiento de las cepas para combinar diferentes genotipos también se puede llevar a cabo usando un mutante que no tiene cariogamia, tal como el mutante kar1�15 (Georgieva, B. et al (2002) Meth. Enzymol. 350: 278 -89).
Preferiblemente, se usan diferentes promotores en la construcción de varios módulos de expresión en la construcción heteróloga, de manera que para evitar episodios de recombinación homóloga adicionales tenga lugar y las partes de formación de bucle de la construcción heteróloga. Como alternativa, una secuencia promotora se coloca en dos copias en la misma construcción heteróloga pero en direcciones divergentes de manera que se evite una repetición directa.
Los procedimientos bien conocidos para mejorar la expresión heteróloga incluyen optimización de codón de la secuencia de nucleótido heteróloga. Esto se hace empleando los codones preferidos de huésped, como se determina a partir de los codones de la frecuencia mayor en proteínas altamente expresadas del huésped de interés. La secuencia codificadora para un polipéptido que tiene actividad de PUFA desaturasa o elongasa se puede sintetizar químicamente en total o en parte usando procedimientos bien establecidos en la bibliografía. además, la secuencia de nucleótidos que rodea el codón de partida de traducción ATG se ha encontrado que influye en la expresión génica en levadura. Si el polipéptido deseado se expresa débilmente en levadura, la secuencia de nucleótidos del gen heterólogo se puede modificar para que incluya una secuencia de inicio de traducción de levadura eficaz para obtener la expresión génica óptima. Esto se puede llevar a cabo mediante técnicas convencionales tal como mutagénesis dirigida al sitio basada en PCR o mediante fusión a la secuencia de inicio de un gen de levadura altamente expresado.
Producción de levadura de panadero que contiene PUFA
Cepas de levadura recombinantes que contienen rutas heterólogas para los PUFA, tales como ácido araquidónico o DHA, se pueden desarrollar en cultivo de lote, de alimentación por lotes o quimioestato como se describe en el ejemplo 10 con el fin de producir grandes cantidades de biomasa que contiene PUFA. Después de la recogida de la biomasa, por ejemplo, por centrifugación o filtración, y posible secado de la biomasa hasta un grado adecuado, se puede usar como un ingrediente de alimentación adicional funcional, por ejemplo como levadura de panadería, extracto de levadura o como un potenciador de aroma. La biomasa que contiene PUFA también se puede usar directamente como un alimento funcional, por ejemplo en comprimidos como una alternativa cápsulas de aceite de pescado.
De este modo, la presente invención también se refiere a productos de alimentación, tales como productos de alimentación funcionales, en los que dicho producto de alimentación tiene un contenido aumentado de ácidos grasos poliinsaturados cuando se compara con un producto producido por una, que no está modificado para la expresión heteróloga de acuerdo con la presente invención.
Estrategias producciones de PUFA mejoradas en levadura recombinante
La producción de PUFA en una levadura recombinante se puede mejorar mediante varias estrategias, alguna de las cuales implica el incremento del porcentaje de PUFA del ácido graso total, y otros que implican modificación por ingeniería genética metabólica del huésped para el incremento de la producción de ácido graso.
Incremento de la producción de PUFA en el ácido graso total
Una estrategia que se puede usar para incrementar el porcentaje de PUFA en ácido graso total implica la expresión heteróloga de una delta-9 desaturasa con especificidad de sustrato para ácido esteárico en lugar de ácido palmítico. La expresión de tal delta-9 desaturasa desplaza la composición de ácido graso hacia una concentración mayor de ácido oleico, el precursor de la ruta PUFA, y da como resultado el aumento de producción de PUFA (véanse los ejemplos 9 y 12). Otra estrategia que puede incrementar el contenido de ácido oleico en levadura implica la sobreexpresión de los genes ELO1, ELO2 y / o ELO3, que codifican las elongasas de ácidos grasos. Sobreexpresión de estos genes pueden incrementar la concentración de ácidos grasos con 18 átomos de carbono en relación con la concentración de ácidos grasos con 16 átomos de carbono. Como alternativa, una elongasa heteróloga con especificidad de sustrato para ácido palmítico o ácido palmitoleico se puede expresar para incrementar la disponibilidad de ácidos grasos con 18 átomos de carbono. Además, la eficacia de la expresión de genes heterólogos que codifican enzimas en la ruta PUFA se puede incrementar mediante la optimización de los codones de los genes heterólogos. Los genes heterólogos es probable que contengan codones que son raros en el organismo huésped, y la disponibilidad de los ARNt correspondientes puede por lo tanto estar limitada para la expresión del gen en cuestión. Con el fin de optimizar los codones de un gen específico, la secuencia de aminoácidos correspondiente se vuelve a traducir usando la frecuencia de codón óptima del huésped. Esto se puede hacer, por ejemplo, usando el programa de herramientas Backtranslation V2.0. La hebra codificadora y no codificadora del gen optimizado de codón se puede sintetizar químicamente en la forma de oligonucleótidos superpuestos. Para ensamblar el gen sintético, los oligonucleótidos de superposición se permite que se hibriden entre sí y reconstituyan la secuencia de nucleótidos total de doble cadena, que después se puede amplificar mediante la PCR.
Modificación por ingeniería genética metabólica para el aumento de la producción de ácido graso
En S. cerevisiae, la síntesis de ácido graso se lleva a cabo mediante el complejo de la ácido graso sintasa (FAS) (Figura 3), que consta de un complejo heteromultimérico de dos subunidades multifuncionales (α y β). La sobreexpresión de las subunidades α y β, codificadas por los genes de levadura FAS2 y FA51, respectivamente, pueden incrementar sustancialmente el contenido de ácido graso de S.cerevisiae y por lo tanto la producción de
PUFA en peso seco de célula
Acetil-CoA carboxilasa cataliza la reacción de acetil-CoA a malonil-CoA y está codificada por el producto génico ACC1. Sobreexpresión de ACC1 permite un incremento en la combinación de malonil-CoA, y por lo tanto efectúan de una manera más eficaz la síntesis de ácido graso. Por consiguiente, se incrementa la producción de lípido y PUFA en los mutantes de sobreexpresión de ACC1 (ejemplo 39).
Otras dianas para la modificación por ingeniería genética metabólica incluyen los genes implicados en la síntesis del lípido triacilglicerol (TAG) almacenado. En levadura, la síntesis de TAG se logra mediante la acción de las enzimas codificadas por los cuatro genes DGA1, LRD1, ARE1 y ARE2 (Sandager et al. 2002 J Biol Chem 277: 6478 -6482). La sobreexpresión de estos genes pueden por lo tanto incrementar el TAG, y por lo tanto contenido de ácido graso total, de levadura. En particular, sobreexpresión de DGA1, que codifica acil-CoA:diacilglicerol aciltransferasa, puede incrementar el contenido de TAG, como supresión de este gen solo da como resultado aproximadamente 60% de disminución en el contenido de TAG y aproximadamente 40% de disminución en el contenido de lípidos total (Sandager et al. 2002 J Biol Chem 277: 6478 -6482) y el ejemplo 29.
Además, el contenido celular de TAG y de lípido total se puede aumentar incrementando la disponibilidad de precursores necesaria para la síntesis de TAG. Por ejemplo, la concentración intracelular del precursor principal de TAG L-glicerol 3-fosfato se puede incrementar en más de 20 veces en levadura por la sobreexpresión de GPD1, que codifica glicerol 3-fosfato deshidrogenasa, y supresión de GPP1 y GPP2, que codifican las isoenzimas de glicerol 3-fosfatasa (Nguyen et al. 2004 Met Eng 6: 155-163). Potencialmente se puede usar la misma estrategia sobreexpresando GPD2 o GPD1 y GPD2 conjuntamente con una supresión de GPP1 y GPP2.
Con el fin de producir TAG, se pueden sobreespresar otros genes diana tales como los genes implicados en la producción de ácido fosfatídico. En este documento, la síntesis de ácido lisofosfatídico y ácido fosfatídico se puede incrementar mediante la sobreexpresión de GAT1 y SLC1 que codifican L-glicerol 3-fosfato aciltransferasa y 1-acilglicerol-3-fosfato aciltransferasa, respectivamente. La combinación de ácido fosfatídico está incrementada y más precursor está más disponible para incrementar los niveles de TAG (ejemplo 30). Otros genes Diana incluyen SPO14, una fosfolipasa D que cataliza la reacción de la fosfatidilcolina en ácido fosfatídico y colina (Xie, et al, (1988) Proc. Natl. Acad. Sci Estados Unidos 95 (21): 12346 -51.
La disponibilidad del principal precursor de la síntesis de ácido graso, acetil-CoA, se puede aumentar mediante la expresión de una ATP:citrato liasa heteróloga. ATP:citrato liasa está presente en la mayoría de los organismos oleaginosos usualmente no en levadura no oleaginosa tal como Saccharomyces cerevisiae y cataliza la conversión de citrato en acetil-CoA y oxaloacetato (Figura 5). Además, la expresión heteróloga de una isocitrato deshidrogenasa regulada por AMP es probable que conduzca a la acumulación de citrato durante las condiciones de limitación de nitrógeno (Ratledge 2002 Biochem Soc Trans 30:1047 -1050). La expresión combinada de genes heterólogos que codifican ATP:citrato liasa y una isocitrato deshidrogenasa cuya actividad está favorecida por la presencia de AMP por lo tanto puede conducir a una disponibilidad aumentada de acetil-CoA y producción aumentada de ácido graso en la célula huésped.
Se ha mostrado que la sobreexpresión de pantotenato quinasa en Escherichia coli da lugar a mayores niveles de CoA. Por lo tanto, la sobreexpresión de la pantotenato quinasa supuesta en Saccharomyces cerevisiae codificada por YDR531 W puede permitir un incremento en la combinación de CoA en Saccharomyces cerevisiae y por lo tanto incremento en la producción de acetil-CoA.
La síntesis de ácido graso por el complejo FAS requiere NADPH como un cofactor, e incrementa la producción de ácido graso puede dar por lo tanto como resultado un desequilibrio redox en la célula, de manera que la disponibilidad de NADPH controle la velocidad de producción de ácido graso. Se pueden usar varias estrategias para superar este problema, incluyendo la expresión de una gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa dependiente de NADP+ no fosforilante heteróloga (Bro et al. 2005 2006 Met Eng 8: 102-11) y modificación de la ruta de asimilación de amonio (Nissen et al. 2000 Met Eng 2: 69-77). Sobreexpresión de FAS1 y FAS2 se puede combinar con la supresión de GDH1 y la sobreexpresión de o bien GDH2, que codifica una glutamato deshidrogenasa dependiente de NADH, o GLT1 y GLN1, que codifican las enzimas que constituyen la ruta de GS-GOGAT de asimilación de amonio (Figura 6)
La producción de ácido graso se puede además aumentar mediante la supresión del gen estructural para la degradación de ácido graso, en levadura POX1 (Figura 7). Tal supresión se puede combinar, por ejemplo, con la sobreexpresión o integración de una esteaoril-CoA desaturasa heteróloga que es más específica en la síntesis de ácido oleico en lugar de ácido palmitoleico, favoreciendo de esta manera la síntesis de los PUFA (figura 3) esto además se puede combinar con la sobreexpresión de ACC1 para además potenciar la producción de PUFA y / o lípidos.
Otra posibilidad para mejorar la producción de PUFA o rendimiento es potenciar el alargamiento de PUFA. Por ejemplo, la delta-6 elongasa en la ruta a ARA realiza una reacción de condensación, donde 18:3 está condensado a una unidad de malonil-CoA. Sin embargo, el alargamiento completo de 18:3 a 20:3 de manera adicional implica una reducción del grupo ceto, unaa deshidratación y una reducción de enoilo (Figura 8). Ya que la expresión heteróloga de delta-6 elongasa en levadura da como resultado alargamiento de 18:3, las tres últimas reacciones deben estar catalizadas por las enzimas de levadura endógenas. La función de estas enzimas en la levadura de tipo salvaje es la formación de ácidos grasos de cadena muy larga y el alargamiento de los ácidos grasos de cadena larga exógenos. A β-cetoacil-CoA reductasa se codifica por el gen YBR159W. El gen que codifica la β-hidroxiacil-CoA deshidrasa no se ha identificado en levadura. La etapa final de alargamiento de ácido graso, reducción de enoilo, está catalizada por la enzima codificada por el gen TSC13. Para incrementar la eficacia de alargamiento, YBR159W y TSC13 se pueden después sobreexpresar.
La producción de lípidos y / o contenido en PUFA también se puede mejorar además mediante la combinación de las diferentes estrategias de modificación por ingeniería genética descritas anteriormente. Esto se puede hacer mediante cruzamiento de de las cepas que portan diferentes modificaciones genéticas, por ejemplo como se describe en los Ejemplos 28, 35 y36.
La sobreexpresión de los genes de levadura nativos descritos anteriormente se puede lograr mediante el reemplazo del promotor nativo con un fuerte promotor constructivo, por ejemplo el promotor TDH3, el promotor ADH1, el promotor ACT1, el promotor TPI o el promotor GPD promotor, usando un planteamiento similar a la estrategia usada en la presente invención para la integración de M. alpine ole1 (ejemplo 7). Del mismo modo, genes heterólogos se pueden expresar mediante la integración en el genoma como se describe en el ejemplo 7. Como alternativa, genes nativos y heterólogos se pueden expresar a partir de plásmidos tales como los plásmidos de levadura 2µ y plásmidos CEN episomales, o plásmidos integrantes de levadura (es decir, serie YiP), como se describe en los ejemplos 2-5. La supresión de los genes de levadura se puede lograr mediante un planteamiento similar al descrito en el ejemplo 7. Las diferentes alteraciones genéticas descritas en el presente ejemplo se pueden combinar mediante cruzamiento de las cepas recombinantes o mediante combinación de las modificaciones cromosómicas con la expresión a parir de vectores, que puede dar como resultado un huésped modificado por ingeniería genética para la producción de los PUFA.
Los expertos reconocerán que la simple expresión de una ruta PUFA heteróloga en levadura de panadería se espera que dé como resultado un bajo contenido de ácido araquidónico, como la levadura de panadería tiene un bajo contenido de (aproximadamente 10% de peso seco de célula) de ácidos grasos. Además, los ácidos grasos en levadura de panadería principalmente consta de ácidos grasos con 16 átomos de carbono, y el ácido graso monoinsaturado más dominante es ácido palmitoleico, que puede no servir como precursor para la síntesis de ácido araquidónico. El resultado de simplemente expresar cuatro genes que codifican las enzimas de la ruta a ácido araquidónico en S. cerevisiae se ilustra en el presente documento (Ejemplo 12) donde la expresión de estos cuatro genes da como resultado un contenido en ácido araquidónico de 0,8% de los ácidos grasos, o correspondiente a menos de 0,08% del peso seco de levadura.
De este modo, la presente invención se refiere a una mejora del contenido de PUFA en el organismo huésped mediante optimización de la fermentación (es decir, fermentación usando limitación de nitrógeno, limitación de fósforo, limitación de oligoelementos, limitación de NaCl, limitación de mio-inositol, etc.), por ejemplo, disminución de la temperatura y / o diseño de un medio óptimo, o mediante la mejora del flujo hacia ácidos grasos mediante ingeniería genética metabólica, por ejemplo, mediante la sobreexpresión de las ácido graso sintasas, sobreexpresión de otras enzimas implicadas en la biosíntesis de los precursores de los PUFA, u optimización de codón de los genes heterólogos, o expresión de enzimas heterólogas implicadas en la biosíntesis del precursor de los PUFA, es decir, ácido oleico.
De este modo, una realización preferida de la presente invención se refiere a un procedimiento de acuerdo con la presente invención, en el que dicha célula huésped, tal como Saccharomyces cerevisiae se cultiva en un medio deficiente en mioinositol.
Crecimiento en medio deficiente en mioinositol
Se sabe que en alguna especie de levadura desarrollada en medios deficientes en mioinositol, se incrementa la producción de lípidos. Por lo tanto, es una ventaja desarrollar las células modificadas genéticamente de esta en un medio que no está suplementado con mioinositol ya que la producción de lípidos y PUFA se incrementa.
Uso y optimización de codón
El uso de codón puede a menudo diferir entre diferentes especies. Para la expresión de una proteína heteróloga de un organismo que tiene un uso de codón diferente es ventajoso alterar el uso de codón de la proteína heteróloga para emparejase con la de la célula huésped. Por lo tanto la expresión de proteína se puede mejorar. Por ejemplo, cuando se compara con Saccharomyces cerevisiae, el uso de codón es diferente en muchos hongos, tales como Mortierella alpina, Cryptococcus, curvatus, y Histoplasma capsulatus, Mucor rouxii, Mucor circinelloides, Aspergillus fumigatus Saccharomyces klyveri, Phytophthera megasperma, Pythium irregulareand Aspergillus parasiticus, insectos, tales como Trichoplusia ni, mamíferos,
tales como Mus musculus y Homo sapiens, algas, tales como Thraustocytrium aureum, Euglena gracilis, Isochrysis galbana, Saprilegnia diclian, Phaeodactylum tricornutum, Saprolegnia y Schizochytrium aggregatum y Pavlova lutheri, gusanos, tales como Caenorhabditis elegans, plantas, tales como Arabidopsis thaliana, Brassica napus, Glycine soya, Borago officinalis, Anemone leveillei, Marchantia polymorpha, Physcomitrella patens, Petroselinum crispum y Phytophthora infestans, peces, tales como Cyprinus carpio,y Salmo salar. Ya que, la optimización de codón de las secuencias de nucleótidos de las enzimas correspondientes mencionadas en la Tabla 1 incrementará la producción de PUFA.
De este modo, una realización preferida de la presente invención se refiere a un procedimiento de acuerdo con la presente invención, en el que dichas secuencias heterólogas de nucleótidos son de codón optimizado para la expresión en Saccharomyces cerevisiae.
Además, en una realización la presente invención se refiere a un procedimiento de acuerdo con la presente invención, en el que dicha expresión heteróloga combinada además comprende una sobreexpresión de al menos uno de los genes seleccionados entre el grupo que consta de ACC1, YBR159W, ELO1, ELO2, ELO3, FAS1, FAS2, DGA1, LRO1, ARE1, ARE2, y GPD1.
Otra realización se refiere a un procedimiento de acuerdo con la presente invención, en el que dicha expresión heteróloga combinada además comprende a supresión de al menos uno de los genes seleccionados entre el grupo que consta de GPP1, GPP2 and POX1.
Otra realización se refiere a un procedimiento de acuerdo con la presente invención, en el que dicha expresión heteróloga combinada además comprende una expresión heteróloga de las secuencias de nucleótidos que codifican ATP:citrato liasa y / o una isocitrato deshidrogenasa que está estimulada por AMP.
Otra realización se refiere a un procedimiento de acuerdo con la presente invención, en el que dicha expresión heteróloga combinada además comprende una expresión heteróloga de una secuencia de nucleótidos que una D-gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa dependiente de NADP no fosforilante.
Otra realización se refiere a un procedimiento de acuerdo con la presente invención, en el que dicha expresión heteróloga combinada además comprende una supresión del gen GDH1 y opcionalmente una sobreexpresión de al menos uno de los genes seleccionados entre el grupo que consta de GDH2, GLN1 y GLT1.
Otra realización se refiere a un procedimiento de acuerdo con la presente invención, en el que dicha expresión heteróloga combinada además comprende una sobreexpresión de al menos uno de los genes seleccionados entre el grupo que consta de TSC13, GAT1, SLC1 e YDR531W.
De este modo, en una realización, la presente invención se refiere a procedimientos, células, y condiciones con relación a un contenido de ácido graso poliinsaturado mejorado, en el que dicha expresión heteróloga incrementa el contenido de ácido graso poliinsaturado específico individual, en particular ARA, EPA and DHA, hasta más de 2 % del contenido de ácido graso total, tal comos 3% del contenido de ácido graso total, 4% del contenido de ácido graso total, 5% del contenido de ácido graso total, 6% del contenido de ácido graso total, 7% del contenido de ácido graso total, 8% del contenido de ácido graso total, 9% del contenido de ácido graso total, 10% del contenido de ácido graso total o más.
De este modo, en una realización particular preferida actualmente, el procedimiento de la invención describe la expresión heteróloga que incrementa el contenido de ácido araquidónico, ácido eicosapentaenoico y / o ácido docosahexaenoico hasta más de 2 % del contenido de ácido graso total en el Saccharomyces cerevisiae modificado genéticamente descrito en el presente documento.
En otra realización la presente invención se refiere a procedimientos, células, y composiciones que se refieren a un contenido en ácido graso poliinsaturado mejorado, en el que dicha expresión heteróloga incrementa el contenido de cada ácido graso poliinsaturado específico individual hasta más de 0,1% del peso seco de levadura, tal como 0,2% del peso seco de levadura, 0,3% del peso seco de levadura, 0.4% del peso seco de levadura, 0.5% del peso seco de levadura, 0,6% del peso seco de levadura, 0.7% del peso seco de levadura, 0,8% del peso seco de levadura, 0,9% del peso seco de levadura, 1% del peso seco de levadura, 2% del peso seco de levadura, 3 del peso seco de levadura, 4% del peso seco de levadura, 5% del peso seco de levadura o más.
Vector
Los polinucleótidos que codifican PUFA desaturasas y elongasas se pueden expresar en el organismo huésped a partir de elementos extracromosómicos. Para la expresión extracromosómica por ejemplo, levadura, se prefieren plásmidos de alto número de copias. Otros vectores de levadura incluyen plásmidos de replicación de levadura (YRps), tal como el plásmido 2µ, que tienen una secuencia de replicación derivada cromosómicamente y se propagan con un número de copias medio (20 a 40 copias por célula), y plásmidos de centrómero de levadura (Ycps; también conocido como plásmidos CEN), que tienen tanto un origen de replicación como una secuencia de centrómero, asegurando una segregación estable. Varios vectores de expresión de levadura con marcadores de selección diferentes se pueden usar en combinación cuando el propósito es expresar varios genes heterólogos.
Además, varios genes heterólogos se pueden expresar a partir del mismo plásmido, por ejemplo usando los vectores pESC (Stratagene), que permiten la expresión simultánea, inducible a partir de la secuencia promotora GAL1/GAL10 divergente. Se pueden usar una diversidad de sistemas de expresión procarióticos para expresar las desaturasas y elongasas de síntesis de PUFA, incluyendo el plásmido pBR322, los plásmidos pUC y sus derivados. Para la expresión en procariotas los genes heterólogos se ensamblan en un operón artificial, lo que significa que una única secuencia promotora controla la expresión de un grupo de genes. Varios genes que codifican las desaturasas y elongasas de síntesis de PUFA se pueden fusionar mediante PCR y posteriormente subclonarse en vector de expresión bacteriano usando técnicas convencionales.
De este modo, un aspecto de la presente invención se refiere a un vector que comprende al menos 4 secuencias de nucleótidos aisladas que tiene al menos 75% identidad de secuencia con las secuencias de nucleótidos seleccionadas entre el grupo que consta de SEQ ID NO: 1 -38.
Como se ha descrito en detalle anteriormente, la expresión combinada de las secuencias de nucleótidos heterólogas 4-7 debe permitir la producción de PUFA. De este modo, el vector puede comprender secuencias de nucleótidos que codifican, por ejemplo, delta-12 desaturasa, delta-6 desaturasa, delta 6 elongasa y delta-5 desaturasa o, por ejemplo, delta-12 desaturasa,delta-9 elongasa, delta-8 desaturasa y delta-5 desaturasa. Como alternativa la vector de expresión puede, por ejemplo, comprender 7 genes que codifican delta-12 desaturasa, delta-6 desaturasa, delta 6 elongasa, delta-5 desaturasa, omega-3 desaturasa, delta-5 elongasa y delta-4 desaturasa.
Debido a la alimentación cruzada entre células, en general no se espera que las células en una población contengan una construcción de plásmido específica, incluso aunque se esté aplicando la presión de selección. Este efecto se potencia si se usan varios diferentes vectores con diferentes marcadores de selección. Por lo tanto, todos los genes requeridos para la producción de PUFA preferiblemente se expresan a partir de un único vector de expresión. Sin embargo, como grandes construcciones de vector(es decir, vectores que exceden de aproximadamente 20 kb de tamaño) se pueden replicar de manera instable y segregarse en la célula huésped, también puede ser beneficioso expresar la ruta heteróloga a partir de varios, por ejemplo dos, vectores separados.
Como los expertos en la técnica reconocerán, las secuencias de nucleótidos individuales se pueden expresar o bien a partir de un único vector o a partir de vectores separados. El experto en la técnica también será consciente de los elementos genéticos que deben estar presentes sobre el vector con el fin de transformar, seleccionar y propagar de manera exitosa las células huésped que comprenden cualquiera de los fragmentos de ácido nucleico aislados de la invención. El experto en la técnica también reconocerá que diferentes episodios de transformación independiente darán como resultado diferentes niveles y patrones de expresión, y de este modo que se pueden seleccionar episodios múltiples con el fin de obtener cepas que muestren el nivel y patrón de expresión deseado. Tal selección se puede llevar a cabo mediante análisis de Southern de ADN, análisis de Northern de la expresión de ARNm, análisis de Western de la proteína expresión, o análisis fenotípico, tal como análisis de la composición de ácido graso que se puede detectar mediante procedimientos tales como pero sin limitación a, cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), cromatografía de gas acoplada a espectrometría de masas (GC-MS), cromatografía de capa fina, entre otros.
Preferiblemente, los genes heterólogos se expresan a partir de vectores. También puede ser ventajoso expresar uno o varios genes heterólogos en la ruta PUFA de una localización genómica. Por ejemplo, ácido eicosapentaenoico se puede producir en S. cerevisiae mediante la expresión de cinco genes heterólogos que codifican delta-12 desaturasa, delta-6 desaturasa, delta-6 elongasa, delta-5 desaturasa y omega-3 desaturasa a partir de tres vectores diferentes, y adicionalmente expresando una delta-9 desaturasa heteróloga de una localización genómica (Ejemplo 58).
Como se ha indicado anteriormente, una vez que el vector se ha construido, se puede introducir entonces en la célula huésped de elección mediante procedimientos conocidos por los expertos en la técnica incluyendo, por ejemplo, transfección, transformación y electroporación.
La célula huésped después se cultiva en condiciones adecuadas que permiten la expresión de los genes que conducen a la producción del PUFA deseado, que después se recupera y se purifica.
La célula genéticamente modificada
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una célula modificada genéticamente que comprende un vector de acuerdo con la presente invención.
Como se ha indicado, una realización adicional de la presente invención se refiere a una célula modificada genéticamente, en la que la expresión de dichas secuencias de nucleótidos aisladas a partir de dicho vector da como resultado dicha célula que produce ácido graso poliinsaturado que no se produce en un tipo salvaje de dicha célula huésped.
Composición
En un aspecto la presente invención se refiere a una composición que comprende a ácido graso poliinsaturado producido por una célula modificada genéticamente de acuerdo con la presente invención.
En una realización preferida la composición que comprende un ácido graso poliinsaturado producido por un Saccharomyces cerevisiae modificado genéticamente de acuerdo con la presente invención.
Como se ejemplifica más adelante, las composiciones que contiene 25% de PUFA en composición de ácido graso total mediante la expresión heteróloga de al menos 4 genes se puede lograr mediante procedimientos de la presente invención.
De este modo, en una realización actualmente preferida, la invención se refiere a una composición que comprende al menos 25% de ácido graso poliinsaturado producido en una composición de ácido graso total por una célula modificada genéticamente de acuerdo con la invención.
Sin embargo, incluso cantidades más pequeñas son de importancia tanto económica como técnica, de este modo la invención además se refiere a una composición que comprende al menos 2 % de ácido graso poliinsaturado de la composición de ácido graso total, tal como 5% de ácido graso poliinsaturado de la composición de ácido graso total, tal como 10% o más ácido graso poliinsaturado de la composición de ácido graso total.
De hecho incluso se prefiere más niveles más altos tal como 25% de ácido graso poliinsaturado de la composición de ácido graso total, tal como 30% de ácido graso poliinsaturado de la composición de ácido graso total, tal como 35% de ácido graso poliinsaturado de la composición de ácido graso total, tal como 40% de ácido graso poliinsaturado de la composición de ácido graso total, tal como 45% de ácido graso poliinsaturado de la composición de ácido graso total, tal como 50% de ácido graso poliinsaturado de la composición de ácido graso total, tal como 55% de ácido graso poliinsaturado de la composición de ácido graso total, tal como 60% de ácido graso poliinsaturado de la composición de ácido graso total, tal como 65% de ácido graso poliinsaturado de la composición de ácido graso total, tal como 70% de ácido graso poliinsaturado de la composición de ácido graso total, tal como 75% de ácido graso poliinsaturado de la composición de ácido graso total, tal como 80% de ácido graso poliinsaturado de la composición de ácido graso total, tal como 85% de ácido graso poliinsaturado de la composición de ácido graso total, tal como 90% de ácido graso poliinsaturado de la composición de ácido graso total, tal como 95% de ácido graso poliinsaturado de la composición de ácido graso total, tal como 97% de ácido graso poliinsaturado v composición de ácido graso total, tal como 98% de ácido graso poliinsaturado de la composición de ácido graso total, tal como 99% de ácido graso poliinsaturado de la composición de ácido graso total, tal como 100% de ácido graso poliinsaturado v composición de ácido graso total, producido a partir de una célula, tal como un microorganismo que expresa una ruta heteróloga que conduce a ácidos grasos monoinsaturados y en particular los PUFA.
Una composición en el contexto de la presente invención significará una combinación o mezcla of compuestos.
En una realización dicha composición es un aceite.
Como se ha descrito anteriormente el PUFA puede ser de varias formaciones/formulaciones, de este modo en una realización dicho ácido graso poliinsaturado es una formación de triacilglicéridos.
En otra realización, dichos ácidos grasos poliinsaturados están en una formulación of fosfolípidos.
En una realización adicional dichos ácidos grasos poliinsaturados is in a formulación de ácidos grasos libres.
Uso de composición de la presente invención
Existen numerosos datos sobre las ventajas de PUFA. Se ha recogido evidencia clínica que muestra que DHA y ARA son ventajosos en el desarrollo de las funciones neurales y retinales y por lo tanto puede ser beneficioso para niños para alcanzar una memoria y vista mejorada. Además, niños prematuros y jóvenes son realmente capaces de sintetizar cantidades suficientes de DHA y reciben de manera natural los PUFA por la lecha de pecho. Sin embargo, los PUFA no están anteriormente en la fórmula de niños así como en la leche de vaca. DHA también reduce o elimina el factor de riesgo implicado en diversas enfermedades como enfermedades cardiovasculares y tiene algunos efectos positivos sobre hipertensión, artritis, arteriosclerosis y trombosis. Ahora se ha establecido que ambos PUFA se suministran de manera de manera creciente en la alimentación, por ejemplo en la fórmula de niños, y también en formulaciones farmacéuticas y cosméticas. La demanda creciente se puede cubrir con la tecnología descrita en la presente invención mediante el suministro de PUFA tal como un aceite que comprende triacilglicéridos, fosfolípidos o ácidos grasos libres (enriquecidos en PUFA) que se producen con alta reproducibilidad y calidad constante por un Saccharomyces cerevisiae modificado genéticamente que es capaz de producir los PUFA con cuatro o más dobles enlaces cuando se desarrolla en un sustrato de ácido no graso.
Una fuente general de los PUFA es aceite de pescado. Sin embargo, el contenido de
ácido graso de aceite de pescado varía durante la temporada de pesca y en algunos casos el aceite de pescado puede estar contaminado debido a la contaminación ambiental. Además de esto, el aceite de pescado tiene un olor detestable. El propio pescado no produce PUFA pero lo ingiere usualmente mediante el consumo de algas. Actualmente, el aceite de pescado rico en los PUFA se produce a partir de peces de acuacultura. Sin embargo, el contenido en PUFA puede variar dependiendo de la dieta de la dieta que se ingiera. Además de esto, se espera una escasez en la pienso de peces de alta calidad y por lo tanto es ventajoso suplementar la el pienso de los peces con PUFA o simplemente con levadura o pienso que sea alto en contenido en PUFA.
De este modo, una realización de la presente invención se refiere al uso de una composición de acuerdo con la presente invención como ingrediente en un producto alimentario.
Otra realización se refiere al uso de a composición de acuerdo con la presente invención como ingrediente en un producto cosmético.
En una realización particular preferida, la presente invención se refiere al uso de una composición de acuerdo con la invención como ingrediente en piensos.
En una realización actualmente más preferida, la presente invención se refiere al uso de un Saccharomyces cerevisiae modificado genéticamente de acuerdo con la invención a como ingrediente en piensos.
Observaciones generales
La composición puede ser un aceite que contenga ácidos grasos poliinsaturados, y los PUFA pueden estar en formación de triglicéridos, fosfolípidos o ácidos grasos libres.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La siguiente descripción detallada, proporcionada por medio de ejemplo, pero no pretende limitar la invención a realizaciones específicas descritas, se puede entender junto con las Figuras acompañantes, incorporadas en el presente documento por referencia, en la que: Figura 1 Síntesis of ácidos grasos poliinsaturados en un microorganismo modificado por ingeniería genética (ruta omega-6 delta/delta-6 y omega-3 delta/delta-6 usando delta-6 desaturasa y delta-6 elongasa) Figura 2 Síntesis de ácidos grasos poliinsaturados en un microorganismo modificado por ingeniería genética (ruta omega-6 delta/delta-8 y omega-3 delta/delta-8 usando delta-9 elongasa y delta-8 desaturasa) Figura 3 Vista simplificada de biosíntesis de ácido graso en S. cerevisiae Figura 4 Ruta para TAG y fosfolípidos en Saccharomyces cerevisiae. PA, ácido fosfatídico; DAG, diacilglicerol; TAG, triacilglicerol. Figura 5 Ruta para acetil-CoA citosólica en levadura oleaginosa y hongos. Figura 6 asimilación de amoníaco en Saccharomyces cerevisiae Figura 7 Degradación de ácido graso por beta-oxidación Figura 8 Alargamiento de ácido graso Figura 9
A: Vector de levadura para la expresión de genes que codifican delta-12 desaturasa y delta-6 desaturasa.
B: Vector de levadura para la expresión de genes que codifican delta-6 elongasa y delta-5 desaturasa. Figura 10 Estrategia de integración de M. alpina ole1 en el genoma de S. cerevisiae Figura 11 Perfil de cromatograma de gas de ácidos grasos, extraídos de S. cerevisiae que albergan una ruta heteróloga incluyendo delta-12 desaturasa, delta-6 desaturasa, delta-6 elongasa y delta-5 desaturasa y espectrograma de masas correspondiente de ácido araquidónico Figura 12 Perfil de cromatograma de gas de ácidos grasos, extraídos de S. cerevisiae que alberga una ruta heteróloga incluyendo delta-9 desaturasa, delta-12 desaturasa, delta-6 desaturasa, delta-6 elongasa y delta-5 desaturasa y espectrograma de masas correspondiente de ácido araquidónico Figura 13
A: Mapa de plásmido sobre pWAD1
B: Mapa de plásmido sobre pWAD2 Figura 14
A: Mapa de plásmido sobre pWJ716-TD1
B: Mapa de plásmido sobre pWJ716-TD2 Figura 15 Procedimiento usado para la sobreexpresión de genes por reemplazo de promotor. YFG, gen arbitrario que se va a sobreexpresar.
Figura 16 Estrategia para la integración de M. alpina olel en el genoma de S. cerevisiae en la localización POX1 Figura 17 Estrategia para la integración de Sordaria macrospora acl1 y acl2 en el genoma de Saccharomyces cerevisiae. Figura 18 Visión general del comportamiento de las cepas modificadas genéticamente de
Saccharomyces cerevisiae: producción de ácido araquidónico sobre fuente de carbono representada gráficamente contra el porcentaje de ácido araquidónico de ácido graso total. Figura 19 Construcción de plásmido p300 Figura 20
A: Mapa de plásmido sobre pESC-LEU-SK33
B: Mapa de plásmido sobre pESC-LEU Ssc2
C: Mapa de plásmido sobre pESC-LEU-Ssc2-SK33 Figura 21 Perfil de cromatograma de gas de ácidos grasos, extraídos de la cepa de S. cerevisiae FS01446, que alberga una ruta heteróloga incluyendo delta-9 desaturasa, delta-12 desaturasa, delta-6 desaturasa, delta-6 elongasa, delta-5 desaturasa and omega-3 desaturasa y espectrograma de masas correspondiente de ácido eicosapentaenoico. Figura 22 Procedimiento usado para el ensamblaje de gen sintético que codifica delta-4 desaturasa, codón optimizado para la expresión en Saccharomyces cerevisiae. Figura 23 Mapa de plásmido sobre pESC-LEU-Ssc2-delta-4d Figura 24 Estrategia para la integración de Saccharomyces kluyveri FAD3, que codifica una omega-3 desaturasa, en el genoma de Saccharomyces cerevisiae.
ORIGEN DE LAS SECUENCIAS
SEQ ID NO: 1 es una secuencia de nucleótidos de Mortierella alpina que codifica una delta-9 desaturasa SEQ ID NO: 2 es una secuencia de nucleótidos de Cryptococcus curvatus que codifica una delta-9 desaturasa SEQ ID NO: 3 es una secuencia de nucleótidos de Histoplasma capsulatus que codifica una delta-9 desaturasa SEQ ID NO: 4 es una secuencia de nucleótidos de Trichoplusia ni que codifica una delta-9 desaturasa SEQ ID NO: 5 es una secuencia de nucleótidos de Mortierella alpina que codifica una delta-12 desaturasa SEQ ID NO: 6 es una secuencia de nucleótidos de Mucor rouxii que codifica una delta-12 desaturasa SEQ ID NO: 7 es una secuencia de nucleótidos de Mucor circinelloides que codifica una delta12 desaturasa SEQ ID NO: 8 es una secuencia de nucleótidos de Aspergillus fumigatus que codifica una delta-12 desaturasa SEQ ID NO: 9 es una secuencia de nucleótidos de Cryptococcus curvatus que codifica una delta-12 desaturasa SEQ ID NO: 10 es una secuencia de nucleótidos de Caenorhabditis elegans que codifica una delta-12 desaturasa SEQ ID NO: 11 es una secuencia de nucleótidos de Mortierella alpina que codifica una delta-6 desaturasa SEQ ID NO: 12 es una secuencia de nucleótidos de Mucor rouxii que codifica una delta-6 desaturasa SEQ ID NO: 13 es una secuencia de nucleótidos de Borago officinalis que codifica una delta-6 desaturasa SEQ ID NO: 14 es una secuencia de nucleótidos de Anemone levellei que codifica una delta-6 desaturasa SEQ ID NO: 15 es una secuencia de nucleótidos de Caenorhabditis elegans que codifica una delta-6 desaturasa SEQ ID NO: 16 es una secuencia de nucleótidos de Mortierella alpina que codifica una delta-6 elongasa SEQ ID NO: 17 es una secuencia de nucleótidos de Physcomitrella patens que codifica una delta-6 elongasa SEQ ID NO: 18 es una secuencia de nucleótidos de Caenorhabditis elegans que codifica una delta-6 elongasa SEQ ID NO: 19 es una secuencia de nucleótidos de ratón que codifica una delta-6 elongasa SEQ ID NO: 20 es una secuencia de nucleótidos de Thraustochytrium aureum que codifica una delta-6 elongasa SEQ ID NO: 21 es una secuencia de nucleótidos de Phytophthora infestans que codifica una delta-6 elongasa SEQ ID NO: 22 es una secuencia de nucleótidos de Mortierella alpina que codifica una delta-5 desaturasa SEQ ID NO: 23 es una secuencia de nucleótidos de Phytophthora megasperma que codifica una delta-5 desaturasa SEQ ID NO: 24 es una secuencia de nucleótidos de Thraustochytrium sp. ATCC 21685 que codifica una delta-5 desaturasa SEQ ID NO: 25 es una secuencia de nucleótidos de Caenorhabditis elegans que codifica una delta-5 desaturasa SEQ ID NO: 26 es una secuencia de nucleótidos de Pythium irregulare que codifica una delta5 desaturasa
SEQ ID NO: 27 es una secuencia de nucleótidos de Phaeodactylum tricornutum que codifica una delta-5 desaturasa SEQ ID NO: 28 es una secuencia de nucleótidos de ratón que codifica una delta-5 elongasa SEQ ID NO: 29 es una secuencia de nucleótidos de seres humanos que codifica una delta-5 elongasa SEQ ID NO: 30 es una secuencia de nucleótidos de Caenorhabditis elegant que codifica una omega-3 desaturasa SEQ ID NO: 31 es una secuencia de nucleótidos de Petroselinum crispum que codifica una omega-3 desaturasa SEQ ID NO: 32 es una secuencia de nucleótidos de Arabidopsis thaliana que codifica una omega-3 desaturasa SEQ ID NO: 33 es una secuencia de nucleótidos de Brassica napus que codifica una omega-3 desaturasa SEQ ID NO: 34 es una secuencia de nucleótidos de Glycine soya que codifica una omega-3 desaturasa SEQ ID NO: 35 es una secuencia de nucleótidos de Thraustochytrium aureum que codifica una delta-4 desaturasa SEQ ID NO: 36 es una secuencia de nucleótidos de Euglena gracilis que codifica una delta-4 desaturasa SEQ ID NO: 37 es una secuencia de nucleótidos de Isochrysis galbana que codifica una delta9 elongasa SEQ ID NO: 38 es una secuencia de nucleótidos de Euglena gracilis que codifica una delta-8 desaturasa SEQ ID NO: 39 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 40 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 41 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 42 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 43 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 44 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 45 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 46 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 47 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 48 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 49 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 11
SEQ ID NO: 50 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 12
SEQ ID NO: 51 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 13
SEQ ID NO: 52 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 14
SEQ ID NO: 53 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 15
SEQ ID NO: 54 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 16
SEQ ID NO: 55 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 17
SEQ ID NO: 56 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 18
SEQ ID NO: 57 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 19
SEQ ID NO: 58 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 20
SEQ ID NO: 59 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 21
SEQ ID NO: 60 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 22
SEQ ID NO: 61 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 23
SEQ ID NO: 62 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 24
SEQ ID NO: 63 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 25
SEQ ID NO: 64 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 26
SEQ ID NO: 65 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 27
SEQ ID NO: 66 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 28
SEQ ID NO: 67 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 29
SEQ ID NO: 68 es lasecuencia de aminoácidos of una delta-5 elongasa de Pavlova
SEQ ID NO: 69 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 30
SEQ ID NO: 70 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 31
SEQ ID NO: 71 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 32
SEQ ID NO: 72 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 33
SEQ ID NO: 73 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 34
SEQ ID NO: 74 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 35
SEQ ID NO: 75 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 36
SEQ ID NO: 76 es la secuencia de aminoácidos de una delta-4 desaturasa de Isochrysis
galbana
SEQ ID NO: 77 es la secuencia de aminoácidos de una delta-4 desaturasa de Schizochytrium
aggregatum
SEQ ID NO: 78 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 37 SEQ ID NO: 79 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 38 SEQ ID NO: 80 es una secuencia de nucleótidos de Sordaria macrospora que codifica la subunidad 1 de ATP:citrato liasa SEQ ID NO: 81 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 80 SEQ ID NO: 82 es una secuencia de nucleótidos de Sordaria macrospora que codifica la subunidad 2 de ATP:citrato liasa SEQ ID NO: 83 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 82 SEQ ID NO: 84 es una secuencia de nucleótidos sintética que codifica una delta-4 desaturasa, de codón optimizado para la expresión en S. cerevisiae SEQ ID NO: 85 es una secuencia de nucleótidos sintética que codifica una delta-9 elongasa, de codón optimizado para la expresión en S. cerevisiae SEQ ID NO: 86 es una secuencia de nucleótidos sintética que codifica una delta-8 desaturasa, de codón optimizado para la expresión en S. cerevisiae SEQ ID NO: 87 es una secuencia de nucleótidos de Saccharomyces kluyveri que codifica una omega-3 desaturasa SEQ ID NO: 88 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 87 SEQ ID NO: 89 es una secuencia de nucleótidos de Mortierella alpina que codifica una omega3 desaturasa SEQ ID NO: 90 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 89 SEQ ID NO: 92 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 91 SEQ ID NO: 93 es una secuencia de nucleótidos de Aspergillus parasiticus que codifica una delta-12 desaturasa SEQ ID NO: 94 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 93 SEQ ID NO: 95 es una secuencia de nucleótidos de Pichia pastoris que codifica una delta-12 desaturasa SEQ ID NO: 96 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 95 SEQ ID NO: 97 es una secuencia de nucleótidos de Marchantia polymorpha que codifica una delta-6 desaturasa SEQ ID NO: 98 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 97 SEQ ID NO: 99 es una secuencia de nucleótidos de Cyprinus carpio que codifica una delta6/delta-5 desaturasa SEQ ID NO: 100 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 99 SEQ ID NO: 101 es una secuencia de nucleótidos de Salmo salar que codifica una delta6/delta-5 elongasa SEQ ID NO: 102 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 101 SEQ ID NO: 103 es una secuencia de nucleótidos de Marchantia polymorpha que codifica una delta-6 elongasa SEQ ID NO: 104 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 103 SEQ ID NO: 105 es una secuencia de nucleótidos de Salmo salar que codifica una delta-5 desaturasa SEQ ID NO: 106 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 105 SEQ ID NO: 107 es una secuencia de nucleótidos de Marchantia polymorpha que codifica una delta-5 desaturasa SEQ ID NO: 108 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 107 SEQ ID NO: 109 es una secuencia de nucleótidos de Pavlova lutheri que codifica una delta-4 desaturasa SEQ ID NO: 110 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 109 SEQ ID NO: 111 es una secuencia de nucleótidos de Saproleigna diclina que codifica una omega-3 desaturasa SEQ ID NO: 112 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 111 SEQ ID NO: 113 es una secuencia de nucleótidos de Saccharomyces kluyveri que codifica una delta-12 desaturasa SEQ ID NO: 114 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 113
EJEMPLOS
Ejemplo 1
Aislamiento de genes que codifican delta-9 desaturasa, delta-12 desaturasa, delta-6 desaturasa, delta-6 elongasa y delta-5 desaturasa
El hongo Mortierella alpina produces ácido araquidónico mediante una ruta, en la que ácido oleico se desatura y alarga a la vez por una delta-12 desaturasa, una delta-6 desaturasa, una delta-6 elongasa y una delta-5 desaturasa. Las secuencias de nucleótidos que codifican estas enzimas se amplificaron por PCR usando la primera hebra de ADNc de Mortierella alpina CBS 608.70. Además, se aisló la secuencia de nucleótidos que codifica la delta-9 desaturasa de M. alpina. Los cebadores definidos usados para la amplificación se diseñaron para emparejar las secuencias publicadas de los genes de M. alpina que codifican estas enzimas.
El procedimiento era como sigue:
M. alpina CBS 608.70 se cultivó en 100 ml de medio GY (20 g/l de glucosa, 10 g/l de extracto de levadura pH 6,0) a temperatura ambiente durante 3 días. Se recogió la biomasa mediante filtración y se aisló el ARN total usando reactivo Trizol (Gibco BRL). Aproximadamente 5 µg of ARN se usaron para la transcripción inversa (Superscript II RT, Invitrogen) usando Oligo(dT) 12-18 como cebador. Después de la síntesis de la primera hebra de ADNc, se retiró el ARN complementario mediante digestión con ARNasa. Después se usó el ADNc como molde para PCR (Phusion enzyme, Finnzymes) usando los siguientes cebadores: 5’ATGGCAACTCCTCTTCCCCCCTCC 3’ y 5’CTATTCGGCCTTGACGTGGTCAGTGC 3’ para delta-9 desaturasa; 5’AACCCTTTTTCAGGATGGCACC 3’ y 5’AAAGTTGTGTCCGGTAAATGCTTC 3’ para delta-12 desaturasa; 3’
GGACTAGTCCACCATGGCTGCTGCTCCCAGTGTGAGG
5’ y 3’
CCATCGATGGCTTACTGTGCCTTGCCCATCTTGGAGG
5’ para delta-6 desaturasa;
5’ATGGAGTCGATTGCGCCATTCC 3’ y
5’TTACTGCAACTTCCTTGCCTTCTCC3’ para delta-6 elongasa; y 5’ ATGGGTACGGACCAAGGAAAAACC3’ y 5’ CTACTCTTCCTTGGGACGGAGTCC3’ para delta-5 desaturasa. Los fragmentos resultantes de los tamaños esperados se escindieron de un gel de agarosa y se purificaron usando columnas de GFX (Amersham).
Ejemplo 2
Construcción de un vector de levadura para la expresión de delta-12 desaturasa
El gen que codifica delta-12 desaturasa, aislado como se describe en el Ejemplo 1, se volvió a ampliar mediante PCR usando los cebadores 5’ GACCTCGAGTAAGCTTATGGCACCTCCCAACACTATTG 3’ y 5’ GCTAGCCGCGGTACCAATTACTTCTTGAAAAAGACC 3’. Estos cebadores introdujeron los sitios de restricción XhoI y NheI en los extremos 5’ y 3’ del gen, respectivamente, y ligamiento permitido del fragmento de PCR restringido XhoI/NheI en un vector pESC-TRP digerido con XhoI/NheI (Stratagene) produciendo pESC-TRP-delta-12. La secuencia del gen que codifica delta-12 desaturasa (SEQ ID NO 5) se obtuvo mediante secuenciación de dos clones diferentes de pESC-TRP-delta-12.
Ejemplo 3
Construcción de un vector de levadura para la expresión de delta-12 desaturasa y delta-6 desaturasa
El gen que codifica delta-6 desaturasa se aisló como se describe en el Ejemplo 1. El fragmento de PCR resultante contenía los sitios de restricción SpeI y ClaI en los extremos 5’ y 3’ del gen, respectivamente. El fragmento se restringió con SpeI y ClaI y se ligó en pESC-TRPdelta-12 digerido con SpeI/ClaI digested (Ejemplo 2). El plásmido resultante, pESCTRP-delta12 delta-6, contenía los genes que codifican delta-12 desaturasa y delta-6 desaturasa bajo el control del promotor divergente GAL1/GAL10 (figura 9A). La secuencia del gen que codifica delta-6 desaturasa (SEQ ID NO 11) se obtuvo mediante secuenciación de dos clones diferentes.
Ejemplo 4
Construcción de un vector de levadura para la expresión de delta-6 elongasa
El gen que codifica delta-6 elongasa, aislado como se describe en el Ejemplo 1, se volvió a ampliar mediante PCR usando los cebadores 5’ GACCTCGAGTAAGCTTATGGAGTCGATTGCGCC 3’ y 5’ GCTAGCCGCGGTACCAATTACTGCAACTTCCTTGC 3’. Estos cebadores introdujeron los sitios de restricción HindIII y NheI en los extremos 5’ y 3’ del gen, respectivamente, y permite el ligamiento del fragmento de PCR restringido por HindIII/NheI en un vector pESC-URA digerido con HindIII/NheI (Stratagene) produciendo pESC-URA-elo. Dos diferentes clones de pESCURA-elo se secuenciaron obteniendo la secuencia del gen clonado (SEQ ID NO 16).
Ejemplo 5
Construcción de un vector de levadura para la expresión of delta-6 elongasa y delta-5 desaturasa
El gen que codifica delta-5 desaturasa, aislado como se describe en el Ejemplo 1, se volvió a ampliar mediante PCR usando los cebadores 5’CGCACTAGTATCGATATGGGTACGGACCAAGG 3’ y 5’ TTAATTAAGAGCTCAGATCTTCTACTCTTCCTTGGGACG 3’. Estos cebadores introdujeron los sitios de restricción ClaI y SacI en los extremos 5’ y 3’ del gen, respectivamente, y permitió el ligamiento del producto de PCR restringido por ClaI/SacI en pESC-URA-elo digerido con ClaI/SacI (Ejemplo 4). El plásmido resultante, pESC-URA-elo-delta-5, contenía los genes que codifican delta-6 elongasa y delta-5 desaturasa bajo el control del promotor divergente GAL1/GAL10 (figura 9B). La secuencia del gen que codifica delta-5 desaturasa (SEQ ID NO 22) se obtuvo mediante secuenciación de dos clones diferentes de pESC-URA-elo-delta-5.
Ejemplo 6
Expresión de la ruta a ácido araquidónico en levadura
Las cepas de levadura que contenían los marcadores genéticos apropiados se transformaron con los vectores descritos en los Ejemplos 2, 3, 4, y 5, separadamente o en combinación. Los transformantes se seleccionaron en medio que carece de uracilo y triptófano y posteriormente se purificó por siembra en de estría en el mismo medio.
La cepa de S. cerevisiae CEN.PK113-3C (MATa trp1) se transformó de manera separada con el vector pESC-TRP-delta-12 (Ejemplo 2), produciendo la cepa FS01321, y con pESC-TRP-delta-12 delta-6 (Ejemplo 3), dando como resultado la cepa FS01322. La cepa de S. cerevisiae FS01267 (MATa trp1 ura3) se cotransformó con pESC-TRP-delta-12 delta-6 y pESC-URA-elo (Ejemplo 4), y la cepa transformada se denominó FS01323. la misma cepa también se cotransformó con pESC-TRP-delta-12 delta-6 y pESC-URA-elo-delta-5 (Ejemplo 5), dando como resultado la cepa FS01324.
Ejemplo 7
Reemplazo de levadura OLE1 con M. alpina ole1
El reemplazo del gen de S. cerevisiae OLE1 con el gen correspondiente de M. alpina se llevó a cabo mediante recombinación homóloga con un sustrato bipartito (Figura 10). Una parte del sustrato bipartito constaba de dos tercios (hacia el extremo 3’) de K. lactis URA3, condensado con la secuencia promotora TDH3, el gen de M. alpina ole1 y una secuencia diana cadena debajo del S. cerevisiae OLE1. La segunda parte del sustrato bipartito constaba de una secuencia diana cadena abajo del OLE1 nativo, condensado a la secuencia promotora de TDH3 y dos tercios (hacia el extremo 5’) de K. lactis URA3. Después de la transformación con el sustrato bipartito y selección sobre medio que carece de uracilo, se obtuvieron los transformantes en los que OLE1 nativo se había inactivado y reemplazado con dos copias de la secuencia promotora TDH3 como una repetición directa cobre cualquier lado del gen marcador de K. lactis URA3 y el gen de M. alpina ole1 inmediatamente cadena debajo de la segunda repetición promotora TDH3. Un segundo episodio de recombinación, que da como resultado la formación de bucle del marcador de selección, se seleccionó mediante resiembra de los transformantes en medio que contiene ácido 5’-fluoroorótico (5-FOA), que es tóxica para las células que expresan el gen URA3. Esto da como resultado una cepa, en el que el gen de
S. cerevisiae OLE1 se había reemplazado con el M. alpina ole1 en el control del promotor TDH3. Se introdujeron marcadores genéticos adecuados en esta cepa cruzándola con una cepa de tipo de emparejamiento opuesto y que contiene el marcador deseado, induciendo la esporulación, disección de las esporas, y puntuación de los genotipos de las cepas haploides novedosas.
El procedimiento fue como sigue:
Para la construcción de la primera parte del gen bipartito gene que dirige el sustrato, el gen de M. alpina ole1 (SEQ ID NO 1), aislado como se describe en el Ejemplo 1, se volvió a ampliar mediante PCR usando los cebadores 5’ATGGCAACTCCTCTTCCCCCCTCC3’ y 5’TTGTTATTGTAATGTGATACCTATTCGGCCTTGACGTGG 3’. Una secuencia diana cadena abajo de S. cerevisiae OLE1 se amplificó mediante PCR usando ADN genómico de S.
cerevisiae como molde y los cebadores 5’ GTATCACATTACAATAACAAAACTGCAAC3’ y 5’ ACCAGCATCTATTAAAGTAAAATACCG 3’. Un tercer fragmento de ADN se generó mediante PCR usando un plásmido, que contenía la secuencia promotora de TDH3 (-1 a -1067) cadena abajo del K. lactis URA3, como molde y los cebadores 5’ CTTGACGTTCGTTCGACTGATGAGC 3’ y 5’ GGGGGGAAGAGGAGTTGCCATTTTGTTTGTTTATGTGTG 3’. Estos fragmentos de PCR después se condensaron durante dos rondas de PCR. Primero, M. alpina ole1 se fusionó a la secuencia diana cadena abajo usando los cebadores 5’ATGGCAACTCCTCTTCCCCCCTCC3’ y 5’ ACCAGCATCTATTAAAGTAAAATACCG 3’. Segundo, el producto de la primera reacción de fusión se fusionó con el fragmento promotor de K. lactis URA3/TDH3 usando los cebadores 5’ CTTGACGTTCGTTCGACTGATGAGC 3’ y 5’ ACCAGCATCTATTAAAGTAAAATACCG 3’. Esto dio como resultado el producto de fusión 2/3URA3-TDH3p-ole1-DOWN, que constituía la primera parte del gen bipartito que dirige el sustrato.
Para la construcción de la segunda parte del sustrato bipartito, una secuencia diana cadena arriba del S. cerevisiae OLE1 nativo se amplificó mediante PCR usando ADN genómico de S. cerevisiae como molde y los cebadores 5’ GCTGAAAAGATGATGTTCTGAGG 3’ y 5’ AGTACATACAGGGAACGTCCGCGGTCTGCAGAGAAGGC 3’. Un segundo fragmento de PCR se construyó usando un plásmido, que contenía la secuencia promotora TDH3 (-1 a 1067) cadena arriba del gen K. lactis URA3, como molde y los cebadores 5’ GGACGTTCCCTGTATGTACTAAAAATGAAAGAAGCTTACCAG 3’ y 5’ GAGCAATGAACCCAATAACGAAATC 3’. Finalmente, este fragmento se fusionó a la secuencia diana cadena arriba por PCR usando los cebadores 5’ GCTGAAAAGATGATGTTCTGAGG 3’ y 5’ GAGCAATGAACCCAATAACGAAATC 3’, dando como resultado el producto de fusión UP-TDH3p-2/3URA3, que era la segunda parte del gen bipartito que dirige el sustrato.
La cepa de levadura CEN.PK 113-5D (MATa ura3) se transformó con los sustratos lineales 2/3URA3-TDH3p-ole1-DOWN y UP-TDH3p-2/3URA3 y se sembró sobre un medio que carece de uracilo. Transformantes se sembraron por siembra en estría y se purificaron en el mismo medio y después se transfirieron en un medio que contenía 5-FOA. Los recombinantes de escisión se purificaron mediante siembra por siembra en estría sobre medio que contenía 5-FOA y se verificaron por PCR de colonia. La correcta integración y ausencia de mutaciones en el promotor TDH3 y M. alpina ole1 (SEQ ID NO 1) se verificó mediante secuenciación de la región modificada en dos transformantes diferentes. La cepa resultante, FS01309, tenía el genotipo MATa OLE1::TDH3p-M.alpina ole1.
Para introducir el marcador TRP1 en FS01309, FS01309 se cruzó con una cepa trp1
del mismo fondo genético (CEN.PK) y tipo de emparejamiento opuesto. Se seleccionaron diploides en medio que carece de uracilo y triptófano y se transfirieron a medio de esporulación. Después de la esporulación, las esporas se diseccionaron usando un microscopio Singer MSM y microscopio de disección de micromanipulación. Se puntuaron tétradas para auxotrofia mediante siembra de réplica a placas de adecuadas desechables y para el genotipo OLE1: :TDH3p-M.alpina ole1 mediante PCR de colonias, usando los cebadores 5’ ATGGCAACTCCTCTTCCCCCCTCC 3’ y 5’ AGACATTGAAATCCAAAGAAGACTGAAGG 3’. El tipo de emparejamiento se puntuó mediante siembra de replica a una capa de células con cualquier tipo de emparejamiento alfa, incubar a 30°C para permitir en emparejamiento, siembra de réplica a medio de esporulación, y visualizar la esporulación mediante iluminación de las placas en una fuente de luz UV de 302 nm UV. Las cepas haploides con los tipos de emparejamiento MATa trp1 OLE1::TDH3pM.alpina ole1 y MATa ura3 trp1 OLE1:TDH3p-M.alpina ole1 se denominaron FS01315 y FS01316, respectivamente.
Ejemplo 8
Expresión de la ruta a ácido araquidónico en combinación con una delta-9 desaturasa heteróloga en levadura
Cepas de levadura, en las que OLE1 nativo se reemplazó por ole1 de M. alpina (Ejemplo 7) y que contenían los marcadores genéticos adecuados, se transformaron con los vectores descritos en los Ejemplos 2, 3, 4, y 5, de manera separada o en combinación. Los transformantes se seleccionaron en medio que carece de uracilo y triptófano y se purificaron por siembra en estría en el mismo medio.
La cepa de S. cerevisiae FS01315 (MATa trp1 OLE1::TDH3p-M.alpina ole1) se transformó de manera separada con el vector pESC-TRP-delta-12 (Ejemplo 2), produciendo la cepa FS01326, y con pESC-TRP-delta-12 delta-6 (Ejemplo 3), dando como resultado la cepa FS01327. La cepa de S. cerevisiae FS01316 (MATa trp1 ura3 OLE1::TDH3p-M.alpina ole1) se cotransformó con pESC-TRP-delta-12 delta-6 and pESC-URA-elo (Ejemplo 4), y la cepa transformada se denominó FS01328. La misma cepa también se cotransformó con pESCTRP-delta-12 delta-6 y pESC-URAelo-delta-5 (Ejemplo 5), dando como resultado la cepa FS01329.
Ejemplo 9
Fermentación con cepas de levadura recombinantes en matraces de agitación
Las colonias de levadura individuales se inocularon en 100 ml de medio mínimo (5 g/l de glucosa, 20 g/l de galactosa, 15 g/l de (NH4)2SO4, 1 g/l de MgSO4·7H2O, 14.4 g/l de KH2PO4, solución de vitamina 1 ml/l, solución de oligoelementos metálicos 1 ml/l, pH 6,5) en matraces de agitación con deflector de 500 ml. La solución de vitaminas contenía: 50 mg/l de biotina, 1 g/l de pantotenato de calcio, 1 g/l de ácido nicotínico, 25 g/l de mioinositol, 1 g/l de tiamina HCl, 1 g/l de piridoxal HCl y 0,2 g/l de ácido para-aminobenzoico, mientras que la solución de oligoelementos metálicos contenía: 15 g/l de EDTA, 4,5 g/l de ZnSO4·7H2O, 1 g/l de MnCl2·2H2O, 0,3 g/l de CoCl2·6H2O, 0,4 g/l de Na2MoO4·2H2O, 4,5 g/l de CaCl2·2H2O, 3 g/l de FeSO4·7H2O, 1 g/l de H3BO3 y 0,1 g/l KI. Para la cepa FS01309 de ura3, 100 ml/l de un cóctel de aminoácidos (0.5 g/l de histidina, 0,5 g/l de triptófano, 0,5 g/l de uracilo, 0,5 g/l de leucina) se añadió al medio mediante filtración a través de un filtro estéril de 0,22 µm. Los cultivos se incubaron agitando (150 rpm) a 18 ó 30°C durante 96 ó 72 horas, respectivamente. Después de la incubación, se recogió la biomasa mediante filtración y se analizó la composición de lípidos como se describe en el Ejemplo 11.
Ejemplo 10
Fermentación con cepas de levadura recombinantes en fermentadores
Las cepas de levadura recombinantes se pueden desarrollar en fermentadores que funcionan como cultivos en lote, alimentación por lotes, o quimioestato.
Cultivos en lote y alimentación por lotes
Para los precultivos, se inocularon colonias de levadura individuales en 100 ml de medio mínimo en 500 ml en matraces de agitación con deflector como se describe en el Ejemplo 9 y se incubaron agitando (150 rpm) a 30°C. Precultivos desarrollados exponencialmente se usan para inoculación de cultivos en lote a una concentración de partida de 1 mg DW/L. Los cultivos en lote se pueden llevar a cabo en fermentadores de laboratorio (por ejemplo, B. Braun Biotech, Melsungen, Alemania) con un volumen de trabajo de 2 l. para los cultivos se puede usar un medio definido que contiene: 40 g/l de glucosa o galactosa; 5,0 g/l de (NH4)2SO4; 3,0 g/l de KH2PO4; 0,5 g/l de MgSO4·7H2O; y oligoelementos metálicos y vitaminas como se describe en el Ejemplo 9. Antiespumante (300 µl/L, Sigma A-8436) se añadió para evitar la formación de espuma. La elección de la fuente de carbono depende de los promotores elegidos para la expresión heteróloga; por ejemplo, si se usan los promotores GAL1/GAL10, galactosa se usa como fuente de carbono y si se usan los promotores de levadura constitutivos, glucosa se elige en general como fuente de carbono. La fuente de carbono se debe autoclavar de manera separada del medio mínimo y después se añade al fermentador. También, las soluciones de vitamina y oligoelementos metálicos se añaden al fermentador mediante filtración estéril después de autoclavado y enfriamiento del medio. Los cultivos se realizan a una temperatura fija, por ejemplo, 18°C o 30°C, con una velocidad de agitador de 600 rpm y con 1 vvm (volumen de aire por volumen líquido por minuto) de aireación. El pH se controla a 5,0 mediante adición automática de 4 M KOH. Los biorreactores se equipan con condensadores de enfriamiento, y el gas desprendido se puede llevar a un analizador de gas (INNOVA, Ballerup, Dinamarca) para medir el contenido de gas desprendido de CO2.
Cultivos de quimiostato
En cultivos de quimioestato las células se pueden desarrollar en, por ejemplo, fermentadores de laboratorio Applikon de 1 l operativo. En resumen, los cultivos se alimentan con medio definido que contiene glucosa o galactosa como el nutriente que limita el desarrollo (mismo medio que para las fermentaciones de lote). La velocidad de dilución (que es igual a la velocidad de desarrollo específico) en un cultivo en estado estacionario se puede establecer a diferentes valores, por ejemplo, a 0,050 h-1, 0,10 h-1, 0,15 h-1 o 0,20 h-1. La temperatura se establece en un valor fijo, por ejemplo, 18°C o 30°C, y el pH del cultivo se establece en 5,0. Las condiciones aeróbicas se establecen mediante pulverización de los cultivos con (por ejemplo, 0,5 l/min). La concentración de oxígeno disuelto, que se controla de manera continua, por ejemplo, con un a sonda Ingold modelo 34 100 3002, se mantiene por encima de 50% de saturación de aire.
Ejemplo 11
Análisis de los PUFA como ésteres metílicos
Se desarrollan células en matraces de agitación de 100 ml que usan el medio mínimo como se describe en el Ejemplo 9 hasta que se agota la fuente de carbono. La biomasa se separa mediante centrifugación a 3000 rpm, y los lípidos se extraen usando 30 ml de una mezcla de cloroformo/metanol (2:1, v:v) durante toda una noche. En la siguiente etapa, la muestra se filtra, la solución de disolvente se lava con 6 ml NaCl y la muestra se seca sobre nitrógeno. A los lípidos, se añaden 2 ml de tolueno y 2 ml 1% de ácido sulfúrico en metanol, y la muestra se deja a 50°C durante toda una noche para la transesterificación de los lípidos. La muestra se lava con 5 ml de solución de NaCl y se agitaron en un aparato Vortex. La extracción de los ésteres de metilo comienza con la adición de 5 ml de hexano, después la muestra se agitó en un aparato Vortex y la fase de hexano superior se retiró. Se añadieron otros 5 ml de hexano y continuó la extracción. Se añadieron 4 ml de carbonato de sodio al hexano, la muestra se agitó en un aparato Vortex y se separaron las fases mediante centrifugación a 2000 rpm durante 2 min. La muestra se seca usando sulfato sódico anhidro y la solución se filtra y se seca sobre nitrógeno. A la muestra seca se añadieron 0,5 ml de hexano y la muestra se prepara para la determinación de ésteres metílicos, que se lleva a cabo usando un cromatógrafo de gas acoplado a un detector selectivo de masa (GC/MS). El GC/MS es un Hewlett Packard HP G1723A, cromatógrafo de gas – v cuádruple (EI) que funciona a 70 eV. La columna es una JW-1701, 30 m, 250 µm i.d., 0,15 µm de espesor de película. El MS funciona en modo SCAN. La temperatura del horno es inicialmente 170°C y a continuación alcanza hasta 220°C a 4°C/min. La temperatura final se mantiene durante 3 min. El flujo a través de la columna es 1 ml de He/min. Los volúmenes de inyección son 5 µl. El inyector se conduce a un fraccionado de 100:1 no fraccionado para todos los análisis. La temperatura de la entrada es 300°C, la temperatura de interfase es 230 °C, y la temperatura cuádruple 105°C. Los ésteres metílicos de ácidos grasos detectados se confirman con la Base de Datos de Espectros de masas 1998 NIST, y los tiempos de retención se confirman con ésteres metílicos de ácidos grasos convencionales. Un cromatograma de gas típico se muestra en la figura 11:
Ejemplo 12
Composiciones de ácido graso de cepas de levadura recombinante
La cepa de levadura recombinante FS01324, que expresa los genes de M. alpina que codifican delta-12 desaturasa, delta-6 desaturasa, delta-6 elongasa y delta-5 desaturasa, y la cepa de levadura recombinante FS01329, que además de los genes de M. alpina mencionados también expresa el gen de M. alpina olel, se cultivaron como se describe en el Ejemplo 9 y la composición de ácido graso se analizó como se describe en el Ejemplo 11. Una cepa de tipo salvaje (FS01201) del mismo fondo genético se incluyó también en el análisis como referencia. Las cepas FS01329 y FS01201 se cultivaron a 30°C, mientras que FS01324 se cultivó a 17°C.
Los resultados del análisis (Tabla 2) muestran que el araquidónico se produjo en ambas cepas recombinantes. Como se esperaba, el porcentaje de ácido araquidónico era mayor en FS01329 que en FS01324, es decir aproximadamente dos veces mayor. Además, la relación de ácido esteárico (18:1) a ácido palmitoleico (16:1) se incrementó notablemente en la cepa FS01329 que expresa ole1.
Tabla 2. Composición de ácido graso (% de ácido graso total) de las cepas de levadura
imagen1
5
Ejemplo 14
Integración de genes que codifican delta-12 desaturasa, delta-6 desaturasa, delta-6 elongasa y delta-5 desaturasa en el genoma de levadura
Los genes que codifican delta-12 desaturasa, delta-6 desaturasa, delta-6 elongasa y
10 delta-5 desaturasa, aislados de acuerdo con el Ejemplo 1, se colocan cada uno cadena debajo de un promotor constitutivo de levadura fuerte separado, (por ejemplo, promotor TDH3, promotor ADH1, promotor GPD o promotor TPI) sobre un único plásmido. El plásmido también contiene una secuencia diana para integración en el genoma de levadura mediante recombinación homóloga y el gen K. lactis URA3 flanqueado por repeticiones directas. La
15 secuencia diana se modifica por ingeniería genética para que contenga un único sitio de restricción que permita la linealización del plásmido. Las cepas de levadura adecuadas (por ejemplo, una cepa con el genotipo MATa ura3 y una cepa con el genotipo MATa ura3 OLE1::TDH3p-M. alpina ole1) se transforman con el plásmido linealizado, y se seleccionan los transformantes en medio que carece de uracilo.
20 Después de la purificación por siembra en estría sobre el mismo medio, la escisión del marcador de K. lactis URA3 se selecciona para el medio que contiene 5-FOA. La correcta integración del plásmido se verifica mediante PCR y secuenciación de la región modificada. Para introducir las características genéticas deseadas en la cepa resultante, se cruza con una cepa de levadura de tipo de emparejamiento opuesto. Después de la selección de diploides,
25 esporulación y disección, las cepas haploides novedosas se puntúan mediante los procedimientos descritos en el Ejemplo 7.
Ejemplo 15
Clonación de una delta-5 elongasa en un vector de expresión de levadura
El gen de ratón Ssc2 codifica una proteína con homología de secuencia con una elongasa de ácido graso de levadura, ELO1p (Tvrdik et al. 2000). La expresión del gen en células 293 de Riñón de embriones Humanos, seguido de ensayos in vitro de proteínas extraídas de estas células, ha mostrado que el producto génico Ssc2 puede alargarse 20:4 (n6) y 20:5 (n-3), es decir, ácido araquidónico y ácido eicosapentaenoico (Moon et al. 2001).
Ssc2 de ratón (Tvrdik et al. 2000, Moon et al. 2001) se aisló mediante PCR usando ADNc de hígado de ratón (Quick-Clone ADNc, Clontech) como molde y los cebadores 5’GAAGATCTCCACCATGGAGCAGCTGAAGGCCTTTGATAATG 3’ y 5’ CCTTAATTAAGGCTTATTGAGCCTTCTTGTCCGTCATGCCATTAGC 3’. Estos cebadores contenían sitios de restricción BglII y PacI, que permiten el ligamiento del fragmento de PCR digerido con BglII/PacI en el vector pESC-TRP digerido con BglII/PacI, dando como resultado el vector pESC-TRP-delta-5elo.
Ejemplo 16
Clonación de una omega3 desaturasa en un vector de expresión de levadura
C. elegans fat1 (Spychalla et al. 1997) is se amplifica a partir de una genoteca de ADNc de C. elegans (Stratagene) usando un cebador directo específico del gen que contiene un KpNI sitio de restricción y un cebador inverso específico del gen que contiene un sitio de restricción NheI. El producto de PCR se digiere con KpNI/NheI y se liga en el vector pESCTRP-delta-5elo digerido con KpNI/NheI (Ejemplo 15), produciendo el vector pESC-TRP-delta5elo-omega3.
Ejemplo 17
Clonación de una delta-4 desaturasa en un vector de expresión de levadura
Thraustochytrium sp. ATCC 26185 se cultiva en un matraz de agitación de 500 ml que contiene 100 ml de medio a temperatura ambiente con agitación. Después de recoger la biomasa, se aísla el ARN total y se usa para la preparación de ADNc usando Oligo(dT)12-18 como cebador. Thraustochytrium Fad4 se amplifica usando el ADNc de Thraustochytrium como molde y cebadores específicos de genes que contienen sitios de restricción adecuados. El gen Fad4 después se liga en un vector de expresión de levadura adecuado (por ejemplo, un vector de alta copia con selección de HIS o LEU y un promotor inducible por galactosa o constitutivo).
Ejemplo 18
Expresión de la ruta a ácido docosahexaenoico en levadura
Una cepa de levadura, que contiene genes que codifican delta-12 desaturasa, delta-6 desaturasa, delta-6 elongasa y delta-5 desaturasa integrados en su genoma (Ejemplo 14), se cotransforma con pESC-TRP-delta-5elo-omega-3 (Ejemplo 16) y un vector de expresión que contiene un que codifica una delta-4 desaturasa (Ejemplo 17).
Ejemplo 19
Integración de genes que codifican delta-5 elongasa, omega-3 desaturasa y delta-4 desaturasa en el genoma de levadura
Genes que codifican delta-5 elongasa, omega-3 desaturasa y delta-4 desaturasa se colocan cada uno de ellos cadena debajo de un promotor de levadura separado fuerte, cosntitutivo (por ejemplo, promotor TDH3, promotor ADH1, promotor GPD o promotor TPI) en un único plásmido. El plásmido también contiene una secuencia diana para la integración en el genoma de levadura mediante recombinación homóloga y el gen de K. lactis URA3 flanqueado por repeticiones directas. la secuencia diana se modifica por ingeniería genética para que contenga un único sitio de restricción que permita la linearización del plásmido. Las cepas de levadura adecuadas se transforman con plásmido linealizado, y se seleccionan los transformantes en medio que carece de uracilo. Después de la purificación por siembra en estría sobre el mismo medio, escisión del marcador de K. lactis URA3 se selecciona para un medio que contenga 5-FOA. La integración correcta del plásmido se verifica mediante PCR y secuenciación de la región modificada. Con el fin de introducir las características genéticas deseadas en la cepa resultante, se cruza con una cepa de levadura adecuada de tipo de emparejamiento opuesto. Después de la selección de diploides, esporulación y disección, las cepas haploides novedosas se puntúan mediante los procedimientos descritos en el Ejemplo 7.
Ejemplo 20
Construcción de vectores para la producción de PUFA en E. coli
Los genes necesarios para la producción de PUFA (por ejemplo, genes que codifican delta-12 desaturasa, delta-6 desaturasa, delta-6 elongasa y delta-5 desaturasa para la producción de ácido araquidónico) se fusionan mediante PCR de manera que los codones de parada e inicio se superpongan entre sí. Se usan cebadores adecuados, de manera que los únicos sitios de restricción se introduzcan en el extremo 5’ y el extremo 3’ del producto de fusión. El producto de fusión se liga en un vector de expresión de E.coli (por ejemplo, pTXB1, pBR322 o un vector pUC) cadena abajo del promotor, dando como resultado un operón artificial. Más genes (por ejemplo, delta-5 elongasa, delta-3 desaturasa, delta-4 desaturasa) se pueden añadir al operón, del mismo modo usando un planteamiento de fusión de PCR – seguido de la inserción en el sitio de restricción del extremo que se usó originalmente para la clonación del grupo. Preferiblemente, el sistema de expresión se basa en un promotor constitutivo, tal como el promotor en tándem del bacteriófago gamma PR, µl o un promotor fuerte constitutivo de E.coli. Como alternativa, el sistema es inducible por temperatura, por ejemplo, el promotor en tándem del bacteriófago gamma PR, µl se usa en combinación con el represor cI857, o inducible por IPTG-, es decir, se usa el promotor T7.
Ejemplo 21
Producción de los PUFA en E. coli
Una cepa de E. coli de genotipo apropiado se transforma con un vector de expresión que contiene un grupo de genes artificiales con los genes requeridos para la producción de un PUFA (Ejemplo 21) y células recombinantes se identifican sobre medio de selección, por ejemplo, medio LB que contiene 5 mg/l de ampicilina. Se inoculan colonias individuales en 100 ml de medio, que puede ser 20 g/l de glucosa, 3 g/l de KH2PO4, 7 g/l de K2HPO4, 2 g/l de (NH4)2SO4 y 0,25 g/l de MgSO4·7H2O complementado con 5 mg7l de ampicilina, en un matraz de agitación con deflector de 500 ml. Los cultivos se incuban con agitación a 200 rpm a37°C durante 16 -20 horas, hasta que se agota la fuente de carbono, y se recoge la biomasa para análisis de la composición de ácido graso como se describe en el Ejemplo 11. Si se usa un promotor inducible por IPTG, tal como el promotor T7, IPTG se añade al medio a una concentración final de 0,01 -1 mM.
Ejemplo 22
Procedimientos de biología molecular generales usados en la construcción de cepas
Las técnicas convencionales de ADN recombinante y clonación molecular usadas en los Ejemplos son bien conocidas en la técnica y se describen por: Sambrook, J., Fritsch, E.F., y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1989). Materiales y procedimientos adecuados para el mantenimiento y desarrollo de cultivos microbianos son bien conocidos en la técnica como se describe en, por ejemplo, Manual of Methods for General Bacteriology (Gerhardt, P., Murray, R.G.E., Costilow, R.N., Nester, E. W., Wood, W.A., Krieg, N.R., and Briggs, G., Eds.) American Society for Microbiology: Washington, D.C. (1994). Todos los productos químicos y reactivos usados para el mantenimiento y desarrollo de las células se obtuvieron de Sigma, Laboratorios DIFCO o GIBCO/BRL salvo que se especifique de otra manera. Las enzimas de restricción y ADN ligasa se compró en New England Biolabs. Tolas las reacciones de PCR se llevaron a cabo usando Phusion polimerasa (Finnzymes). Oligonucleótidos y servicios de secuenciación se compraron en MWG Biotech, Ebersberg, Alemania. Purificación de fragmentos de ADN se llevaron a cabo usando columnas GFX (Amersham) o el kit de purificación QiaexII (Qiagen).
Células DH5α de E. coli se hicieron competentes mediante el procedimiento de Inoue como se describe en Sambrook et al., supra. Las células de E. coli se desarrollaron típicamente a 37°C INEN medio Luria Bertani (LB), provisto de 50 mg/l ampicilina si es necesario.
Las células de levadura se desarrollaron típicamente a 30°C en medio YPD o medio que se han eliminado los aminoácidos completo, y se hicieron competentes mediante un procedimiento basado en LiAc (Sambrook et al., supra). Las modificaciones genómicas (sobreexpresión y supresión de genes, integración de genes heterólogos) se realizaron mediante recombinación homóloga usando sustratos de dirección generados por la PCR y el gen K. lactis URA3 como un marcador seleccionable, esencialmente como se describe en Erdeniz, N., Mortensen, U.H., Rothstein, R. (1997) Genome Res. 7:1174 -83. La información sobre el diseño de cebador para PCR de fusión se puede encontrar en la misma publicación. En general, la fusión de los fragmentos de ADN se hizo posible usando cebadores con salientes en 5’ diseñados apropiadamente para la amplificación de los fragmentos de ADN originales. En todos los casos, los fragmentos generados por la PCR se escindieron de un gel de agarosa al 1% y se purificaron antes de proceder con la PCR de fusión. Los transformantes se seleccionaron en general sobre placas URA, y la escisión del gen marcador K. lactis URA3 se seleccionó mediante siembra sobre medio 5-FOA (ácido 5-fluoroorótico, 750 mg/l). La integración de promotores y genes heterólogos correcta se verificó mediante la PCR, siempre usando un cebador que se hibrida a una secuencia fuera de la secuencia diana para integración y un cebador que se hibrida dentro de la secuencia que se va a integrar inciden en la secuencia que se va a integrar. Las supresiones de los genes también se verificaron mediante la PCR, usando cebadores sobre ambos lados del gen suprimido. En general, la verificación de la PCR de las modificaciones genéticas se realizó mediante la PCR de colonias.
Para la PCR de colonias, una pequeña cantidad de células se dispersó en 10 µl de H2O y se colocó a -80°C durante aproximadamente 30 min, seguido de 15 min. de incubación a 37°C. La suspensión de células se usó después como molde para la PCR.
Procedimientos para combinar las características genéticas mediante cruzamiento de las cepas usadas en los Ejemplos son bien conocidas y están, por ejemplo, descritas en: Adams, A., Gottschling, D. E., Kaiser, C. A., y Stearns, T. Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1997). Típicamente, cepas de tipo de emparejamiento opuestos se dejaron emparejarse, diploides se seleccionaron y se transfirieron a medio de esporulación (20 g/l acetato de potasio, 1 g/l de glucosa, 2,5 g/l de extracto de levadura, pH 7,0) y se permitió la esporulación a 30°C durante aproximadamente 3 días. Se diseccionaron las asci sobre una placa de YPD usando un microscopio Singer MSM y un microscopio de disección de micromanipulador. Los tipos de emparejamiento de las tétradas resultantes se puntuaron mediante siembra de réplica a una capa de células con o bien un tipo de emparejamiento o alfa, incubando a 30°C para permitir el emparejamiento, la siembra de réplica a medio de esporulación, y visualización de la esporulación mediante iluminación de las placas a una fuente de luz UV de 302 nm. Los marcadores auxotróficos se puntuaron mediante siembra de réplica a placas desechables. Las modificaciones genéticas que no se pueden puntuar mediante fenotipo se puntuaron mediante la PCR de colonias. En general, el mismo conjunto de cebadores que se usó para la verificación de integraciones o inactivaciones genómicas se usó también para la puntuación por PCR de colonias de las tétradas (véase antes).
La nomenclatura genética usada para describir los genotipos de las cepas es como sigue: los genes de levadura nativos se escriben en letra mayúscula, mientras que los genes de levadura nativos suprimidos o mutados se escriben en letras minúsculas. Los genes de hongos se escriben en letras minúsculas, por ejemplo M. alpina olel, S. macrospora acl1. Los promotores de levadura se indican por una p pequeña, por ejemplo pADH1, pTDH3 para los promotores ADH1 y TDH3. Las sobreexpresiones de los genes de levadura nativos por el procedimiento de reemplazo de promotor se indican por el nombre del promotor seguido del nombre del gen, por ejemplo pADH1-FAS1, pTDH3-DGA1 para la sobreexpresión de FAS1 con el promotor ADH1 y sobreexpresión de DGA1 con el promotor TDH3. La ruptura de los genes de levadura nativos se indican por dos puntos dobles, por ejemplo poxl::pTDH3-M. alpina olel, que significa que el gen POX1 se ha roto y que el promotor TDH3 y el gen M. alpina olel se ha integrado en su lugar. Los plásmidos se escriben entre paréntesis.
Ejemplo 23
Construcción de pWAD1 y pWAD2
Los dos vectores pWAD1 y pWAD2 se usaron como moldes para PCR en la construcción sustratos de dirección del gen para la sobreexpresión de genes con el promotor ADH1. Para la construcción de pWAD1 y pWAD2, el promotor ADH1 (que consta de 1467 pares de bases inmediatamente cadena arriba del codón de inicio del gen ADH1) se amplificó a partir de ADN de levadura genómico usando los cebadores 5’ AAATCGATAACCGCGGAGGGGGATCGAAGAAATGATGG 3’ y 5’ TTGGGCCCTTTCCCGGGTGTATATGAGATAGTTGATTGTATGC 3’. Estos cebadores introdujeron un sitio de restricción ClaI y uno SacII en el extremo 5’ de la secuencia promotora, y sitios de restricción XmaI y ApaI en el extremo 3’. Para la construcción de pWAD1, el fragmento del promotor ADH1 fragmento se digirió con ClaI y ApaI y se introdujo en pWJ716 digerido con ClaI/ApaI. Esto dio como resultado una construcción de plásmido, donde el promotor ADH1 se colocó inmediatamente cadena abajo de K. lactis URA3. La ausencia de mutaciones en la secuencia del promotor ADH1 se verificó mediante secuenciación de pWAD1. Para construcción de pWAD2, el fragmento del promotor ADH1 se liberó de pWAD1 mediante digestión con SacII y XmaI. El fragmento se purificó y se introdujo en v digerido con SacII/XmaI. Esto dio como resultado una construcción de plásmido, en la que el promotor ADH1 se colocó inmediatamente cadena arriba de K. lactis URA3. Los mapas de plásmidos de pWAD1 y pWAD2 se muestran en la Figura 13. El plásmido pWJ716, que llevan el K. lactis URA3 estructural bajo el control de su promotor nativo y conectado a su secuencia terminadora nativa, fue un amable regalo de Uffe H. Mortensen, Centro de Biotecnología Microbiana, Bio-Centrum DTU, Universidad Técnica de Dinamarca.
Ejemplo 24
Construcción de pWJ716-TD1 y pWJ716-TD2
Los dos vectores pWJ716-TD1 y pWJ716-TD2 se usaron como moldes para la PCR en la construcción de sustratos de dirección del gen para la sobreexpresión de genes con el promotor TDH3. Para la construcción de pWJ716-TD1 y pWJ716-TD2, el promotor TDH3 (que consta de las 1067 pares de bases inmediatamente cadena arriba del codón de inicio del gen TDH3) se amplificó a partir de ADN de levadura genómico usando los cebadores 5’TTGGGCCCTTTCCCGGGTTTTGTTTGTTTATGTGTG 3’ y 5’ AAATCGATAACCGCGGATGAAAGAAGCTTACCAG 3’. Estos cebadores introdujeron un sitio de restricción ClaI ya SacII en el extremo 5’ de la secuencia promotora, y sitios de restricción XmaI y ApaI en el extremo 3’. Para la construcción de pWJ716-TD1, el fragmento del promotor TDH3 se digirió con ClaI y ApaI y se introdujo en pWJ716 digerido con ClaI/ApaI. Esto dio como resultado una construcción de plásmido, en la que el promotor TDH3 se colocó inmediatamente cadena abajo de K. lactis URA3. La ausencia de mutaciones en la secuencia
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del promotor TDH3 se verificó mediante secuenciación de pWJ716-TD1. Para la construcción de pWJ716-TD2, el fragmento del promotor TDH3 se liberó de pWJ716-TD1 mediante digestión con SacII y XmaI. El fragmento se purificó y se introdujo en pWJ716 digerido con SacII/XmaI. Esto dio como resultado una construcción de plásmido, en la que el promotor TDH3 se colocó inmediatamente cadena arriba de K. lactis URA3. Los mapas de plásmidos de pWJ716-TD1 y pWJ716-TD2 se muestran en la Figura 14.
Ejemplo 25
Visión general de cepas de levadura modificadas genéticamente
Un número de cepas de levadura modificadas genéticamente se construyeron como se describe en los Ejemplos. Una visión general de las cepas mencionadas en los Ejemplos se proporciona en la Tabla 3. Todas las mutaciones se realizaron ene. Fondo genético de CEN.PK. Las cepas FS01267, FS01269 y FS01277 se obtuvieron mediante cruzamiento de las cepas CEN.PK 110-10C y CEN.PK 113-6B, diseccionando los asci de los diploides resultantes y puntuación del genotipo de las cepas haploides resultantes.
Tabla 3. Visión general de cepas usadas o construidas en los Ejemplos. La tabla muestra solamente modificaciones genómicas; par alas cepas que expresan las rutas PUFA de plásmidos, véase la Tabla 4 y 11. SDG, Scientific research and Development GmbH, Oberusel, Alemania; FS, Fluxome Sciences A/S
Cepa
Genotipo Fuente
CEN.PK 113-7D
MATa SDG
CEN.PK 113-5D
MATa ura3 SDG
CEN.PK 110-10C
MATalfa his3 SDG
CEN.PK 113-6B
MATa ura3 trp1 leu2 SDG
FS01267
MATa trp1ura3 FS
FS01269
MATalfa trp1 FS
FS01277
MATa ura3 leu2 trp1 FS
FS01309
MATa ura3 olel::pTDH3-M.alpina Ejemplo 7
olel
FS01316
MATa ura3 trplolel::pTDH3 Ejemplo 7
FS01351
MATa ura3 pADH1-FAS1 Ejemplo 26
FS01352
MATa ura3 pADH1-FAS2 Ejemplo 26
FS01342
MATalfa trp1 pADH1-FAS1 Ejemplo 26
FS01372
MATa ura3 trp1 pADH1-FAS1 Ejemplo 26
pADH1-FAS2
FS01392
MATa ura3 trp1 pADHi-FAS1 Ejemplo 27
Cepa
FS01367 FS01368
FS01344 FS01370 FS01425
FS01395 FS01394 FS01393 FS01427 FS01440 FS01254 FS01398
FS01419
FS01420
FS01437
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Genotipo
pADH1-FAS2 pTPI1-ACC1 MATa ura3 pox1::pTDH3-M.alpina
MAT alfa ura3 trp1 pox1::pTDH3M.alpina olel MATa ura3 pTDH3-DGA1 MATa ura3 trp1 pTDH3-DGA1
MATa ura3 trp1 pADH1-FAS1 pADH1-FAS2 pox1::pTDH3M.alpina ole1-pADH1-S. macrospora acl1-pTDH3-S.
macrospora acl2 MATa ura3 trp1 pADH1-FAS1 pADH1-FAS2 pTPI1-GAT1 MATa ura3 trp1 pADH1-FAS1 pADH1-FAS2 pTPI1-SLC1 MATa ura3 trp1 pADH1-FAS1 pADH1-FAS2 pTPI1-YDR531W MATa ura3 trp1 pADH1-FAS1 pADH1-FAS2 pADH1-YBR159W MATa ura3 trp1 pAOH1-FAS1 pADH1-FAS2 pADH1-TSC13 MATalfa ura3 gdh1::loxP gdh2: PGKp-GDH2-KanMX3: MATa ura3 trp1 pADH1-FAS1 pADH1-FAS2 gdh1::loxP gdh2:: PGKp-GDH2-KanMX3 MATa ura3 trp1 pADH1-FAS1 pADH1-FAS2 gdh1::loxP glt1:: PGKp-GLT1-KanMX3 MATalfa ura3 trp1 pADH1-FAS1 gdh1::loxP gln1::PGKp-GLN1KanMX3 MATa ura3 trp1 pADH1-FAS1 pADH1-FAS2 gdh1::loxP glt1:: PGKp-GLT1-KanMX3 glnl::PGKpGLN1-KanMX3
Fuente
Ejemplo 28 Ejemplo 28
Ejemplo 29 Ejemplo 29 Ejemplo 33
Ejemplo 30 Ejemplo 30 Ejemplo 30 Ejemplo 31 Ejemplo 31 Ejemplo 35 Ejemplo 35
Ejemplo 35
Ejemplo 35
Ejemplo 35
Cepa Genotipo Fuente
FS01396 MATa ura3 trp1 pADH1-FAS1 Ejemplo 36 pADH1-FAS2 pox1::pTDH3-M. alpina olel
FS01408 Ejemplo 36
MATalfa ura3 trp1 pADH1-FAS1 pox1::pTDH3-M. alpina olel
FS01423 Ejemplo 36
MATa ura3 trp1 pADH1-FAS1 pADH1-FAS2 pTPI1-ACC1 pox1:: pTDH3-M. alpina olel
FS01444
MATalfa ura3 trp1 leu2 pox1:: Ejemplo 57 pTDH3-M. alpina olel
FS01460
MATalfa ura3 trp1 leu2 poxl:: Ejemplo 61 pTDH3-M. alpina olel gpp1::pGAL1-S.kluyveri FAD3
Ejemplo 26
Sobreexpresión de ácido graso sintasa (FAS)
Los dos genes FAS1 y FAS2, que codifican las subunidades beta y alfa de la ácido
5 graso de levadura, respectivamente, se sobreexpresaron sobre un fuerte promotor de levadura. Esto se realizó reemplazando los promotores nativos FAS1-y FAS2 con el promotor ADH1, usando un procedimiento de reemplazo de promotor basándose en un sustrato de dirección del gen bipartito (Figura 15). Los dos genes se sobreexpresaron separadamente y las modificaciones se combinaron posteriormente mediante cruzamiento de las cepas. Para cada
10 una de las sobreexpresiones, una parte del sustrato bipartito constaba de dos tercios (hacia el extremo 3’) de K. lactis URA3, fusionado a la secuencia del promotor ADH1 y una secuencia diana correspondiente al comienzo del gen a sobreexpresar. La segunda parte del sustrato bipartito constaba de una secuencia diana cadena arriba del gen a sobreexpresar, fusionada a la secuencia del promotor ADH1 y dos tercios de (hacia el extremo 5’) de K. lactis URA3.
15 Después de la transformación con el sustrato bipartito y selección en medio que carece de uracilo, se obtuvieron los transformantes en los que el promotor nativo se había inactivado y reemplazado con dos copias de la secuencia del promotor ADH1 como una repetición directa sobre cualquier lado del gen marcador de K. lactis URA3. un Segundo episodio de recombinación, dando como resultado la formación de bucle del marcador de selección, se
20 seleccionó mediante la resiembra de los transformantes sobre medio que contenía ácido 5’fluoroorótico (5-FOA), que es tóxico para las células que expresan el gen URA3. Esto dio como resultado una cepa, en la que el promotor nativo se había reemplazado con el promotor ADH1.
El procedimiento era como sigue:
Para la construcción de la parte 1 de los sustratos de dirección del gen bipartito (Figura 15), un fragmento que consta de dos tercios de K. lactis URA3 (hacia el extremo 3’) y el promotor ADH1 se amplificó a partir del plásmido pWAD1. Para la sobreexpresión de FAS1, el par de cebadores 5’ CTTGACGTTCGTTCGACTGATGAGC 3’ y 5’ TGGTCTTGTGGAGTAAGCGTCCATTGTATATGAGATAGTTGATTGTATGC 3’ se usó para esta amplificación y para la sobreexpresión de FAS2, se usó el par de cebadores 5’ CTTGACGTTCGTTCGACTGATGAGC 3’ y 5’ TTCTTGCTCAACTTCCGGCTTCATTGTATATGAGATAGTTGATTGTATGC 3’. Además, secuencias diana cadena abajo, constituidas por el comienzo de FAS1 y FAS2, respectivamente, se amplificaron a partir de ADN de levadura genómico por la PCR usando el par de cebadores 5’ ATGGACGCTTACTCCACAAGACCATTAAC 3’ y 5’ TTGATATAGATCACGCAATTCTTCAAAGTAGTC 3’ para la secuencia de dirección de FAS1 y el par de cebadores 5’ ATGAAGCCGGAAGTTGAGCAAGAATTAGC 3’ y 5’ ACTTCTTCAACTTGTGAGCAACCAAAACG 3’ para la secuencia de dirección de FAS2. Finalmente, las secuencias de dirección cadena debajo de FAS1 y FAS2 se fusionaron al fragmento constituido fragmento que consta de dos tercios de K. lactis URA3 (hacia el extremo 3’) y el promotor ADH1. Para FAS1, el par de cebadores 5’ CTTGACGTTCGTTCGACTGATGAGC 3’ y 5’ TTGATATAGATCACGCAATTCTTCAAAGTAGTC 3’ se usó para la reacción de fusión y para FAS2, se usó el par de cebadores 5’ CTTGACGTTCGTTCGACTGATGAGC 3’ y 5’ ACTTCTTCAACTTGTGAGCAACCAAAACG 3’. Los fragmentos de fusión resultantes 3’ 2/3 K. lactis URA3-pADH1-DOWN (FAS1) y 3’ 2/3 K. lactis URA3-pADH1-DOWN (FAS2) eran la parte 1 del sustrato de dirección bipartito usado para el reemplazo del promotor FAS1 y FAS2, respectivamente.
Para la construcción de la parte 2 del sustrato de dirección bipartito, un fragmento que consta de el promotor ADH1 y dos tercios de K.lactis URA3 hacia el extremo 5’ se amplificó primero por la PCR usando plásmido pWAD2 como molde. Los cebadores usados para esta amplificación fueron 5’ GGACGTTCCCTGTATGTACTAGGGGGATCGAAGAAATGATGG 3’ y 5’ GAGCAATGAACCCAATAACGAAATC 3’. A continuación, secuencias de dirección cadena arriba se amplificaron a partir de ADN de levadura genómico usando los cebadores 5’ CCGCTGTACTATGCGGTCTCGTCC 3’ y 5’ AGTACATACAGGGAACGTCCGTATGCCAAAAATGCCAAAATGCC 3’ para la secuencia de dirección cadena arriba de FAS1 y 5’ CAACTACAAGGAGGAGAATAAAGAGCAAGCC 3’ y 5’ AGTACATACAGGGAACGTCCAACGACAACAACAACGACTACAATGATGG 3’ para la secuencia de dirección cadena arriba de FAS2. Las secuencias de dirección cadena arriba después se fusionaron al fragmento de pADH1-5’ 2/3 K.lactis URA3 previamente construido. Los cebadores para la reacción de fusión fueron 5’ CCGCTGTACTATGCGGTCTCGTCC 3’ y 5’ GAGCAATGAACCCAATAACGAAATC 3’ para FAS1 y 5’ CAACTACAAGGAGGAGAATAAAGAGCAAGCC 3’ y 5’ GAGCAATGAACCCAATAACGAAATC 3’ para FAS2. Los fragmentos de fusión resultantes UP (FAS1)-pADH1-5’ 2/3 K. lactis URA3 y UP(FAS2)-pADH1-5’ 2/3 K. lactis URA3 eran la parte 2 del sustrato de dirección bipartito usado para el reemplazo del promotor FAS1 y FAS2, respectivamente.
Para la sobreexpresión de FAS1, la cepa de levadura CEN.PK 113-5D (MATa ura3) se transformó con los sustratos lineales UP(FAS1)-pADH1-5’ 2/3 K. lactis URA3 y 3’ 2/3 K. lactis URA3-pADH1-DOWN (FAS1). Para la sobreexpresión de FAS2, la misma cepa precursora se transformó con los sustratos lineales UP(FAS2)-pADH1-5’ 2/3 K. lactis URA3 y 3’ 2/3 K. lactis URA3-pADH1-DOWN (FAS2). Los transformantes de seleccionaron y se purificaron por siembra en estría en medio que carece de uracilo y después se transfirieron a placas que contenían 5-FOA. Los recombinantes de escisión se purificaron por siembra en estría sobre medio que contenía 5-FOA. Las cepas resultantes tenían los genotipos MATa ura3 pADH1FAS1 y MATa ura3 pADH1-FAS2 y se denominaron FS01351 y FS01352, respectivamente. La integración correcta del promotor ADH1 y ausencia de las mutaciones generadas por la PCR se verificaron mediante secuenciación de las regiones modificadas en ambas cepas.
Para combinar sobreexpresión de FAS1 y FAS2 en una cepa, el FAS1 que sobreexpresa el mutante FS01351 (MATa ura3 pADH1-FAS1) se cruzó primero con cepa FS01269 (MATalfa trp1). se seleccionaron diploides en medio que carece de uracilo y triptófano y después se transfirieron a medio de esporulación. Después de la esporulación, se diseccionaron los asci en tétradas de ascosporas. La presencia de la modificación pADH1FAS1 en las cepas haploides resultantes se determinó mediante la PCR de colonias, y las características remanentes se puntuaron usando procedimientos convencionales. A partir del conjunto de cepas haploides derivadas del cruzamiento, una cepa con el genotipo MATalfa trp1 pADH1-FAS1 se seleccionó y se denominó FS01342.
FS01342 (MATalfa trp1 pADH1-FAS1) se cruzó después con FS01352 (MATa ura3 pADH1-FAS2) y se seleccionaron diploides en medio que carece de uracilo y triptófano. Después de transferir los diploides a medio de esporulación, se diseccionaron los asci en tétradas de ascosporas. La presencia de las modificaciones pADH1-FAS1 y pADH1-FAS2 en las cepas haploides resultantes se determinó mediante la PCR de colonias, y las características remanentes se puntuaron usando procedimientos convencionales. A partir del conjunto de cepas haploides derivadas del cruzamiento, una cepa con el genotipo MATa ura3 trp1 pADH1-FAS1 pADH1-FAS2 se seleccionó y se denominó FS01372.
Ejemplo 27
Sobreexpresión de ACC1
El gen de levadura ACC1, que codifica la acetil-CoA carboxilasa, se sobreexpresó con un fuerte promotor constitutivo de levadura. Esto se realizó reemplazando el promotor ACC1 nativo con el promotor TPI1, usando un procedimiento de reemplazo de promotor basándose en un sustrato de dirección del gen bipartito (Figura 15). Una parte del sustrato bipartito constaba de dos tercios (hacia el extremo 3’) de K. lactis URA3, fusionado a la secuencia del promotor TPI1 y una secuencia diana correspondiente al comienzo de ACC1. La segunda parte del sustrato bipartito constaba de una secuencia diana cadena arriba de ACC1, fusionada a la secuencia del promotor TPI1 y dos tercios (hacia el extremo 5’) de K. lactis URA3. Después de la transformación con el sustrato bipartito and selección en medio que carece de uracilo, se obtuvieron transformantes en los que el promotor nativo se habían inactivado y reemplazado con dos copias de la secuencia del promotor TPI1 como una repetición directa sobre cualquier lado del gen marcador K. lactis URA3. Un segundo episodio de recombinación, que da como resultado la formación de bucle del marcador de selección, se realizó mediante resiembra de los transformantes en medio que contenía ácido 5’-fluoroorótico (5-FOA), que es tóxico para las células que expresan el gen URA3. Esto dio como resultado una cepa, en la que el promotor ACC1 nativo se había reemplazado con el promotor TPI1.
Con el fin de construir la parte 1 del sustrato bipartito, dos tercios (hacia el extremo 3’) de K. lactis ura3 se amplificó a partir del plásmido pWJ716 usando los cebadores 5’ CTTGACGTTCGTTCGACTGATGAGC 3’ y 5’ CTGGAATTCGATGATGTAGTTTCTGG 3’. Además, la secuencia del promotor TPI1 se amplificó a partir de ADN de levadura genómico usando los cebadores 5’ CTACATCATCGAATTCCAGCTACGTATGGTCATTTCTTCTTC 3’ y 5’ TTTTTGATTAAAATTAAAAAAACTTTTTAGTTTATGTATGTGTTTTTTG 3’ y una secuencia de dirección cadena abajo, que consta de el comienzo del gen ACC1 (es decir, las primeras 553 pares de bases del gen) se amplificó a partir de ADN de levadura genómico usando los cebadores 5’ AGTTTTTTTAATTTTAATCAAAAAATGAGCGAAGAAAGCTTATTCGAGTC 3’ y 5’ CACCTAAAGACCTCATGGCGTTACC 3’. Estos tres fragmentos se fusionaron entre sí en dos rondas de PCR. Primero, la secuencia del promotor TPI1 se fusionó a la secuencia de dirección cadena abajo, usando los cebadores 5’ CTACATCATCGAATTCCAGCTACGTATGGTCATTTCTTCTTC 3’ y 5’ CACCTAAAGACCTCATGGCGTTACC 3’. El producto resultante se fusionó después al fragmento que contenía dos tercios (hacia el extremo 3’) de K. lactis URA3. El fragmento resultante, 3’ 2/3 K. lactis URA3-pTPI1-DOWN (ACC1) era la parte 1 del sustrato de dirección del gen bipartito.
Con el fin de construir la parte 2 del sustrato bipartito, dos tercios (hacia el extremo 5’) de K. lactis URA3 se amplificó a partir del plásmido pWJ716 usando los cebadores 5’ CGGTCTGCATTGGATGGTGGTAAC 3’ y 5’ GAGCAATGAACCCAATAACGAAATC 3’. La secuencia del promotor TPI1 se amplificó a partir de ADN de levadura genómico usando los cebadores 5’ CTACATCATCGAATTCCAGCTACGTATGGTCATTTCTTCTTC 3’ y 5’ CACCATCCAATGCAGACCGTTTTAGTTTATGTATGTGTTTTTTG 3’, y una secuencia diana cadena arriba de ACC1 se amplificó a partir de ADN genómico usando cebadores 5’ TGTTCTGCTCTCTTCAATTTTCCTTTC 3’ y 5’ CTGGAATTCGATGATGTAGTTTCTAATTTTCTGCGCTGTTTCG 3’. Estos tres fragmentos se fusionaron en dos rondas de PCR. Primero, la secuencia de dirección cadena arriba se fusionó a la secuencia del promotor TPI1, usando los cebadores 5’ TGTTCTGCTCTCTTCAATTTTCCTTTC 3’ y 5’ CACCATCCAATGCAGACCGTTTTAGTTTATGTATGTGTTTTTTG 3’. El fragmento resultante después se fusionó al fragmento que contenía dos tercios (hacia el extremo 5’) de K. lactis URA3, dando como resultado el fragmento UP(ACC1)-pTPI1-5’ 2/3 K. lactis URA3, que constituía la parte 2 del sustrato de dirección del gen bipartito.
Cepa de levadura FS01372 (MATa ura3 trp1 pADH1-FAS1 pADH1-FAS2) se transformó con los sustratos lineales UP(ACC1)-pTPI1-5’ 2/3 K. lactis URA3 y 3’ 2/3 K. lactis URA3-pTPI1-DOWN(ACC1). Los transformantes de seleccionaron y se purificaron por siembra en estría en medio que carece de uracilo y después se transfirieron a placas que contenían 5FOA. Los recombinantes de escisión se purificaron por siembra en estría sobre medio que contenía 5-FOA. La cepa resultante tenía el genotipo MATa ura3 trp1 pADH1-FAS1 pADH1FAS2 pTPI1-ACC1 y se denominó FS01392. La integración correcta del promotor TP11 se comprobó mediante PCR de colonias.
Ejemplo 28
Integración de M. alpina olel en la localización POX1 en S. cerevisiae El gen M. alpina olel, que codifica una delta-9 desaturasa, se integró en el genoma de
S. cerevisiae y se colocó bajo el control del promotor de levadura TDH3. El promotor TDH3 y el gen M. alpina olel se integraron en la localización de POX1, que codifica la primera enzima en la ruta de beta-oxidación, dando como resultado la inactivación de este gen. La integración se llevó a cabo mediante recombinación homóloga usando un sustrato de dirección del gen bipartito (Figura 16). Una parte del sustrato bipartito constaba de dos tercios (hacia el extremo 3’) de K. lactis URA3, condensado a la secuencia del promotor TDH3, el gen M. alpina ole1 y una secuencia diana cadena abajo de POX1. La segunda parte del sustrato bipartito constaba de una secuencia diana cadena arriba de POX1, fusionada a la secuencia del promotor TDH3 y dos tercios (hacia el extremo 5’) de K. lactis URA3. Después de la transformación con el sustrato bipartito y selección en medio que carece de uracilo, se obtuvieron los transformantes en los que POX1 se habían inactivado y reemplazado con dos copias de la secuencia del promotor TDH3 como una repetición directa sobre cualquier lado del gen marcador K. lactis URA3 y el gen M. alpina ole1 inmediatamente cadena abajo de la segunda repetición del promotor TDH3. Un segundo episodio de recombinación, que da como resultado la formación de bucle del marcador de selección, se realizó mediante resiembra de los transformantes en medio que contenía ácido 5’-fluoroorótico (5-FOA), que es tóxico para las células que expresan el gen URA3. Esto dio como resultado una cepa, en la del gen POX1 se había reemplazado con el M. alpina ole1 en el control del promotor TDH3.
El procedimiento era como sigue:
Para la construcción de la parte 1 de los sustratos de dirección del gen bipartito (Figura 16), un fragmento que consta de dos tercios de K. lactis URA3 (hacia el extremo 3’) seguido del promotor TDH3 se amplificó mediante PCR a partir del plásmido pWJ716-TD1, usando cebadores 5’ CTTGACGTTCGTTCGACTGATGAGC 3’ y 5’GGGGGGAAGAGGAGTTGCCATTTTGTTTGTTTATGTGTG 3’. Además, el gen M. alpina ole1 (SEQ ID NO 1), aislado como se describe en el Ejemplo 1, se volvió a ampliar mediante PCR usando los cebadores 5’ ATGGCAACTCCTCTTCCCCCCTCC 3’ y 5’TTGTTATTGTAATGTGATACCTATTCGGCCTTGACGTGG 3’, and una secuencia de dirección cadena abajo de POX1 se amplificó a partir de ADN de levadura genómico por la PCR usando los cebadores 5’ GTATCACATTACAATAACAATTCCTTCGAACCCTCTGTTTTGC 3’ y 5’ TTAGAGCTTCATTCCAACAAGTGCC 3’. Estos tres fragmentos se fusionaron después mediante dos rondas de PCR. Primero, el gen M. alpina ole1 se fusionó a la secuencia de dirección cadena abajo, usando los cebadores 5’ATGGCAACTCGTCTTCCCCCCTCC 3’ y 5’ TTAGAGCTTCATTCCAACAAGTGCC 3’. El fragmento resultante después se fusionó al fragmento que contenía dos tercios de K. lactis URA3 (hacia el extremo 3’) seguido del promotor TDH3. El fragmento resultante, 3’ 2/3 K. lactis URA3-pTDH3-M. alpina ole1DOWN(POX1), constituía parte 1 del sustrato de dirección bipartito.
Para la construcción de la segunda parte del sustrato bipartito, una secuencia diana cadena arriba de POX1 se amplificó mediante PCR usando ADN genómico de S. cerevisiae como molde y los cebadores 5’ AATTCGGTAAATTCAATGGGTAGG 3’ y 5’ TTAGTACATACAGGGAACGTCCGTAAATATAGGGCTTAAAATGTGTCAGG 3’. Además, un fragmento que consta de el promotor TDH3 seguido de dos tercios de K.lactis URA3 (hacia el extremo 5’) se amplificó mediante PCR usando el plásmido pWJ716-TD2 como molde. Los cebadores usados para esta amplificación fueron 5’ GGACGTTCCCTGTATGTACTAAAAATGAAAGAAGCTTACCAG 3’ y 5’ GAGCAATGAACCCAATAACGAAATC 3’. Estos dos fragmentos se fusionaron después por la PCR usando los cebadores 5’ AATTCGGTAAATTCAATGGGTAGG 3’ y 5’ GAGCAATGAACCCAATAACGAAATC 3’, dando como resultado el fragmento UP(POX1)pTDH3-5’ 2/3 K. lactis URA3, que constituía la parte 2 del sustrato de dirección bipartito.
La cepa de levadura CEN.PK 113-5D (MATa ura3) se transformó con los sustratos lineales UP(POX1)-pTDH3-5’ 2/3 K. lactis URA3 y 3’ 2/3 K. lactis URA3-pTDH3-M. alpina ole1DOWN(POX1) y se sembraron en medio que carece de uracilo. Los transformantes de seleccionaron y se purificaron por siembra en estría en medio que carece de uracilo y después se transfirieron a placas que contenían 5-FOA. Los recombinantes de escisión se purificaron por siembra en estría sobre medio que contenía 5-FOA. La cepa resultante tenía el genotipo MATa ura3 pox1::pTDH3-M.alpina ole1 y se denominó FS01367. La integración correcta del promotor TDH3 and M.alpina ole1 y ausencia de Mutaciones generadas por la PCR se verificó mediante secuenciación de la región modificada.
Para combinar la modificación pox1::pTDH3-M.alpina ole1 con los marcadores genéticos apropiados, FS01367 (MATa ura3 pox1::pTDH3-M.alpina ole1) se cruzó con FS01269 (MATalfa trp1). Se seleccionaron diploides en medio que carece de uracilo y triptófano y después se transfirieron a medio de esporulación. Después de la esporulación, se diseccionaron los asci en tétradas de ascosporas. Presencia de la modificación pox1::pTDH3M.alpina ole1 en las cepas haploides resultantes se determinó mediante la PCR de colonias, y las características remanentes se puntuaron usando procedimientos convencionales. A partir del conjunto de cepas haploides derivadas del cruzamiento, una cepa con el genotipo MAT alfa ura3 trp1 pox1::pTDH3-M.alpina ole1 se seleccionó y se denominó FS01368.
Ejemplo 29
Sobreexpresión de DGA1
El gen de levadura DGA1, que codifica diacilglicerol aciltransferasa, se sobreexpresó con un fuerte promotor constitutivo de levadura. Esto se realizó reemplazando el promotor DGA1 nativo con el promotor TDH3, usando un procedimiento de reemplazo del promotor basándose en un sustrato de dirección del gen bipartito (Figura 15). Una parte del sustrato bipartito constaba de dos tercios (hacia el extremo 3’) de K. lactis URA3, fusionado a la secuencia del promotor TDH3 y una secuencia de dirección cadena abajo correspondiente al comienzo de DGA1. La segunda parte del sustrato bipartito constaba de una secuencia diana cadena arriba de DGA1, fusionada a la secuencia del promotor TDH3 y dos tercios (hacia el extremo 5’) de K. lactis URA3. Después de la transformación con el sustrato bipartito y selección en medio que carece de uracilo, se obtuvieron transformantes en los que el promotor nativo se habían inactivado y reemplazado con dos copias de la secuencia del promotor TDH3 como una repetición directa sobre cualquier lado del gen marcador K. lactis URA3. Un segundo episodio de recombinación, dando como resultado la formación de bucle del marcador de selección, se realizó mediante resiembra de los transformantes en medio que contenía ácido 5’-fluoroorótico (5-FOA), que es tóxico para las células que expresan el gen URA3. Esto dio como resultado una cepa, en la que el promotor DGA1 nativo se había reemplazado con el promotor TDH3.
El procedimiento era como sigue:
Para la construcción de la parte 1 de los sustratos de dirección del gen bipartito (Figura 15), un fragmento que consta de dos tercios de K. lactis ura3 (hacia el extremo 3’) seguido del promotor TDH3 se amplificó mediante PCR a partir del plásmido pWJ716-TD1, usando cebadores 5’ CTTGACGTTCGTTCGACTGATGAGC 3’ y 5’ TTTGTTTGTTTATGTGTGTTTATTCGAAACTAAG 3’. Además, una secuencia de dirección cadena abajo, correspondiente al comienzo de DGA1, se amplificó mediante PCR a partir de ADN de levadura genómico por la PCR usando los cebadores 5’ CGAATAAACACACATAAACAAACAAAATGTCAGGAACATTCAATGATATA 3’ y 5’ GTTTTAAATTGACAGTTTTAATCAAACTTATAGGG 3’. Estos fragmentos se fusionaron después por la PCR usando los cebadores 5’ CTTGACGTTCGTTCGACTGATGAGC 3’ y 5’ GTTTTAAATTGACAGTTTTAATCAAACTTATAGGG 3’. El fragmento resultante, 3’ 2/3 K. lactis URA3-pTDH3-DOWN(DGA1), constituía la parte 1 del sustrato de dirección bipartito.
Para la construcción de la segunda parte del sustrato bipartito, una secuencia diana cadena arriba de DGA1 se amplificó mediante PCR usando ADN genómico de S. cerevisiae como molde y los cebadores 5’ TTTTGGCTGTTGTTCCAGGTCGTAGG 3’ y 5’ AGTACATACAGGGAACGTCCGATAAACAGGAAAAAAAAAAAACTTTGGCG 3’. Además, un fragmento que consistía del promotor TDH3 seguido de dos tercios de K.lactis URA3 (hacia el extremo 5’) se amplificó mediante la PCR usando plásmido pWJ716-TD2 como molde. Los cebadores usados para esta amplificación fueron 5’ GGACGTTCCCTGTATGTACTAAAAATGAAAGAAGCTTACCAG 3’ y 5’ GAGCAATGAACCCAATAACGAAATC 3’. Estos dos fragmentos se fusionaron después por la PCR usando los cebadores 5’ TTTTGGCTGTTGTTCCAGGTCGTAGG 3’ y 5’ GAGCAATGAACCCAATAACGAAATC 3’, dando como resultado el fragmento UP(DGA1)pTDH3-5’ 2/3 K. lactis URA3, que constituía la parte 2 del sustrato de dirección bipartito.
La cepa de levadura FS01202 (MATa ura3) se transformó con los sustratos lineales UP(DGA1)-pTDH3-5’ 2/3 K. lactis URA3 y 3’ 2/3 K. lactis URA3-pTDH3-DOWN(DGA1) y se sembraron en medio que carece de uracilo. Los transformantes de seleccionaron y se purificaron por siembra en estría en medio que carece de uracilo y después se transfirieron a placas que contenían 5-FOA. Los recombinantes de escisión se purificaron por siembra en estría en medio que contenía 5-FOA. La cepa resultante tenía el genotipo MATa ura3 pTDH3DGA1 y se denominó FS01344. La integración correcta del promotor TDH3 y ausencia de las mutaciones generadas por la PCR se verificó mediante secuenciación de la región modificada.
Para combinar la sobreexpresión de DGA1 con los marcadores genéticos apropiados, FS01344 (MATa ura3 pTDH3-DGA1) se cruzó con FS01269 (MATalfa trp1). Se seleccionaron diploides en medio que carece de uracilo y triptófano y después se transfirieron a medio de esporulación. Después de la esporulación, se diseccionaron los asci en tétradas de ascosporas. La presencia de la modificación de pTDH3-DGA1 en las cepas haploides resultantes se determinó mediante la PCR de colonias, y las características remanentes se puntuaron usando procedimientos convencionales. A partir del conjunto de cepas haploides derivadas del cruzamiento, una cepa con el genotipo MATa ura3 trp1 pTDH3-DGA1 se seleccionó y se denominó FS01370.
Ejemplo 30
Sobreexpresión de GAT1, SLC1 e YDR531W
Los genes de levadura GAT1, que codifican la glicerol-3-fosfato aciltransferasa, SLC1, que codifica la 1-acil-sn-glicerol-3-fosfato aciltransferasa, e YDR531W, que supuestamente codifica pantotenato quinasa, se expresaron todos con el fuerte promotor TPI1 constitutivo usando un procedimiento de reemplazo de promotor basándose en un sustrato de dirección del gen bipartito (Figura 15). Para cada una de las sobreexpresiones, la primera parte del sustrato que consta de dos tercios (hacia el extremo 3’) de K. lactis URA3, fusionado a la secuencia del promotor TPI1 y una secuencia diana correspondiente al comienzo del gen a sobreexpresar. La segunda parte del sustrato bipartito constaba de una secuencia diana cadena arriba del gen a sobreexpresar, fusionada a la secuencia del promotor TPI1 y dos tercios (hacia el extremo 5’) de K. lactis URA3. Después de la transformación con el sustrato bipartito and selección en medio que carece de uracilo, se obtuvieron transformantes en los que el promotor nativo se habían inactivado y reemplazado con dos copias de la secuencia del promotor TPI1 como una repetición directa sobre cualquier lado del gen marcador K. lactis URA3. Un segundo episodio de recombinación, dando como resultado la formación de bucle del marcador de selección, se realizó mediante resiembra de los transformantes en medio que contenía 5-FOA. En los recombinantes de escisión, los promotores nativos de este modo se habían reemplazado con el promotor TPI1, dando como resultado la sobreexpresión de GAT1, SLC1 e YDR531W, respectivamente.
Con el fin de construir la parte 1 del sustrato bipartito, dos tercios (hacia el extremo 3’) de K. lactis URA3 se amplificó a partir del plásmido pWJ716 usando los cebadores 5’ CTTGACGTTCGTTCGACTGATGAGC 3’ y 5’ CTGGAATTCGATGATGTAGTTTCTGG 3’. Además, la secuencia del promotor TPI1 se amplificó a partir de ADN de levadura genómico usando los cebadores 5’ CTACATCATCGAATTCCAGCTACGTATGGTCATTTCTTCTTC 3’ y 5’ TTTTTGATTAAAATTAAAAAAACTTTTTAGTTTATGTATGTGTTTTTTG 3’. Secuencias diana cadena abajo, constituidas por el comienzo de GAT1, SLC1 e YDR531W, respectivamente, se amplificaron después a partir de ADN de levadura genómico. El par de cebadores 5’ AGTTTTTTAATTTTAATCAAAAAATGTCTGCTCCCGCTGCC 3’ y 5’ AACCTTTTCGTAAAGTTCACTGG 3’ se usó para amplificación de la secuencia de dirección de GAT1 cadena abajo, el par de cebadores 5’ AGTTTTTTTAATTTTAATCAAAAAATGAGTGTGATAGGTAGGTTCTTG 3’ y 5’ AGGAAAAACCCATAGAGCACG 3’ se usó para amplificación de la secuencia de dirección de SLC1, y el par de cebadores 5’ AGTTTTTTTAATTTTAATCAAAAAATGCCGCGAATTACTCAAG 3’ y 5’ GACTAGAAGGTATGGGTAGATAGCC 3’ se usó para amplificación de la secuencia de dirección de YDR531W. Cada una de las secuencias diana cadena abajo GAT1, SLC1 e YDR531 W se fusionaron después al promotor TPI por la PCR, usando el cebador directo 5’ CTACATCATCGAATTCCAGCTACGTATGGTCATTTCTTCTTC 3’ y los cebadores inversos 5’ AACCTTTTCGTAAAGTTCACTGG 3’ (para la fusión a la secuencia de dirección GAT1), 5’ AGGAAAAACCCATAGAGCACG 3’ (para la fusión a la secuencia de dirección SLC1) o 5’ GACTAGAAGGTATGGGTAGATAGCC 3’ (para la secuencia de dirección YDR531W). Finalmente, los fragmentos de fusión resultantes se fusionaron al fragmento que consta de dos tercios (hacia el extremo 3’) de K. lactis URA3 por la PCR usando el cebador directo 5’ CTTGACGTTCGTTCGACTGATGAGC 3’ y los cebadores inversos 5’ AACCTTTTCGTAAAGTTCACTGG 3’ (para la fusión a la secuencia de dirección GAT1), 5’ AGGAAAAACCCATAGAGCACG 3’ (para la fusión a la secuencia de dirección SLC1) o 5’ GACTAGAAGGTATGGGTAGATAGCC 3’ (para la secuencia de dirección YDR531W ). Los fragmentos resultantes, 3’ 2/3 K. lactis URA3-pTPI1-DOWN(GAT1), 3’ 2/3 K. lactis URA3pTPI1-DOWN(SLC1) y 3’2/3 K. lactis URA3-pTPl1-DOWN (YDR531W) constituían la parte 1 del sustrato de dirección del gen bipartito usado para la sobreexpresión de GAT1 y SLC1, respectivamente.
Con el fin de construir la parte 2 del sustrato bipartito, dos tercios (hacia el extremo 5’) de K. lactis URA3 se amplificó a partir del plásmido pWJ716 usando los cebadores 5’ CGGTCTGCATTGGATGGTGGTAAC 3’ y 5’ GAGCAATGAACCCAATAACGAAATC 3’, y la secuencia del promotor TPI1 se amplificó a partir de ADN de levadura genómico usando los cebadores 5’ CTACATCATCGAATTCCAGCTACGTATGGTCATTTCTTCTTC 3’ y 5’ CACCATCCAATGCAGACCGTTTTAGTTTATGTATGTGTTTTTTG 3’. Además, secuencias diana cadena arriba de GAT1, SLC1 e YDR531W se amplificaron a partir de ADN de levadura genómico por la PCR usando el par de cebadores 5’ GGTAAAGAAAACTACAAATCTGGG 3’ y 5’ CTGGAATTCGATGATGTAGAAGCTGCCACTTCTTCAGGG 3’ para la secuencia diana GAT1, el par de cebadores 5’ TTGCTTTAAACATCTGTCCAAGAC 3’ y 5’ CTGGAATTCGATGATGTAGCCTTCACCTTAAACCCTTCC 3’ para la secuencia diana SLC1, y el par de cebadores 5’ TGTCTTCCTATTTTCTCTGACCC 3’ y 5’ CTGGAATTCGATGATGTAGTCGCATGCACTCAATTGG 3’ para la secuencia diana YDR531W. Cada una de las secuencias diana GAT1, SLC1 e YDR531W cadena arriba se fusionaron después al promotor TPI por la PCR, usando el cebador inverso 5’ CACCATCCAATGCAGACCGTTTTAGTTTATGTATGTGTTTTTTG 3’ y los cebadores directos 5’ GGTAAAGAAAACTACAAATCTGGG 3’ (para la fusión a la secuencia de dirección GAT1) 5’ TTGCTTTAAACATCTGTCCAAGAC 3’ (para la fusión a la secuencia de dirección SLC1), o 5’ TGTCTTCCTATTTTCTCTGACCC 3’ (para la fusión a la secuencia diana YDR531W). Finalmente, los fragmentos de fusión resultantes se fusionaron al fragmento que consta de dos tercios (hacia el extremo 5’) de K. lactis URA3 por la PCR usando el cebador inverso 5’ GAGCAATGAACCCAATAACGAAATC 3’ y los cebadores directos 5’ GGTAAAGAAAACTACAAATCTGGG 3’ (para la fusión a la secuencia de dirección GAT1), 5’ TTGCTTTAAACATCTGTCCAAGAC 3’ (para la fusión a la secuencia de dirección SLC1), o 5’ TGTCTTCCTATTTTCTCTGACCC 3’ (para la fusión a la secuencia diana YDR531W).
Los fragmentos resultantes, UP(GAT1)-pTPI1-S’ 2/3 K. lactis URA3, UP(SLC1)-pTPI15’ 2/3 K. lactis URA3 y UP(YDR531W)-pTPI1-5’ 2/3 K. lactis URA3 constituían la parte 2 del
sustrato de dirección del gen bipartito usado para la sobreexpresión de GAT1, SLC1 e YDR531W, respectivamente.
Para la sobreexpresión de GAT1, la cepa de levadura FS01372 (MATa ura3 trp1 pADH1-FAS1 pADH1-FAS2) se transformó con los sustratos lineales UP(GAT1)-pTPI1-5’ 2/3
K. lactis URA3 and 3’ 2/3 K. lactis URA3-pTPI1-DOWN(GAT1). De manera similar, para la sobreexpresión de SLC1, FS01372 se transformó con los sustratos lineales UP(SLC1)-pTPIl-5’ 2/3 K. lactis URA3 y 3’ 2/3 K. lactis URA3-pTPI1-DOWN(SLC1) y para la sobreexpresión de YDR531W, FS01372 se transformó con los sustratos lineales UP(YDR531W)-pTPI1-5’ 2/3 K. lactis URA3 y 3’ 2/3 K. lactis URA3-pTPI1-DOWN (YDR531W). Los transformantes de seleccionaron y se purificaron por siembra en estría en medio que carece de uracilo and después se transfirieron a placas que contenían 5-FOA. Los recombinantes de escisión se purificaron por siembra en estría sobre medio que contenía 5-FOA. Las cepas resultantes tenían los genotipos MATa ura3 trp1 pADH1-FAS1 pADH1-FAS2 pTPI1-GAT1, MATa ura3 trp1 pADH1-FAS1 pADH1-FAS2 pTPI1-SLC1, y MATa ura3 trp1 pADH1-FAS1 pADH1-FAS2 pTPI1YDR531W y se denominaron FS01395, FS01394 y FS01393, respectivamente. La integración correcta del promotor TPI1 se verificó por la PCR de colonias en todas las cepas.
Ejemplo 31
Sobreexpresión de YBR159W y TSC13
Los genes de levadura YBR159W, que codifican beta-cetoacil-CoA sintasa, y TSC13, que codifica la trans-2-enoil-CoA reductasa, ambos se sobreexpresaron con el fuerte promotor ADH1 constitutivo usando un procedimiento de reemplazo de promotor basándose en un sustrato de dirección del gen bipartito (Figura 15). Para cada una de las sobreexpresiones, la primera parte del sustrato que consta de dos tercios (hacia el extremo 3’) de K. lactis URA3, fusionado a la secuencia del promotor ADH1 y una secuencia diana correspondiente al comienzo del gen a sobreexpresar. La segunda parte del sustrato bipartito constaba de una secuencia diana cadena arriba del gen a sobreexpresar, fusionada a la secuencia del promotor ADH1 y dos tercios (hacia el extremo 5’) de K. lactis URA3. Después de la transformación con el sustrato bipartito y selección en medio que carece de uracilo, se obtuvieron transformantes en los que el promotor nativo se habían inactivado y reemplazado con dos copias de la secuencia del promotor ADH1 como una repetición directa sobre cualquier lado del gen marcador K. lactis URA3. Un segundo episodio de recombinación, que como resultado la formación de bucle del marcador de selección, se realizó mediante resiembra de los transformantes en medio que contenía 5-FOA. En los recombinantes de escisión, los promotores nativos de este modo se habían reemplazado con el promotor ADH1, dando como resultado la sobreexpresión de YBR159W y TSC13, respectivamente.
El procedimiento era como sigue:
Para la construcción de la parte 1 de los sustratos de dirección del gen bipartito (Figura 15), un fragmento que consta de dos tercios de K. lactis URA3 (hacia el extremo 3’) y el promotor ADH1 se amplificó a partir de plásmido pWAD1 usando los cebadores 5’ CTTGACGTTCGTTCGACTGATGAGC 3’ y 5’ TGTATATGAGATAGTTGATTGTATGC 3’. Además, las secuencias diana cadena abajo, constituidas por el comienzo de YBR159W y TSC13, respectivamente, se amplificaron por la PCR a partir de ADN de levadura genómico usando el par de cebadores 5’ TACAATCAACTATCTCATATACAATGACTTTTATGCAACAGCTTCAAGAG 3’ y 5’ GACCAACATTATTGACCAAAACGG 3’ para la secuencia de dirección YBR159W y el par de cebadores 5’ GCATACAATCAACTATCTCATATACAATGCCTATCACCATAAAAAGCC 3’ y 5’ GGAAGCCGTAGCCAAAGTAACC 3’ para la secuencia de dirección TSC13. Finalmente, las secuencias de dirección YBR159W y TSC13 cadena abajo se fusionaron al fragmento que consta de dos tercios de K. lactis URA3 (hacia el extremo 3’) y el promotor ADH1 por la PCR. Para YBR159W, el par de cebadores 5’ CTTGACGTTCGTTCGACTGATGAGC 3’ y 5’ GACCAACATTATTGACCAAAACGG 3’ se usó para la reacción de fusión y para TSC13, se usó el par de cebadores 5’ CTTGACGTTCGTTCGACTGATGAGC 3’ y 5’ GGAAGCCGTAGCCAAAGTAACC 3’. Los fragmentos de fusión resultantes 3’ 2/3 K. lactis URA3-pADH1-DOWN (YBR159W) y 3’ 2/3 K. lactis URA3-pADH1-DOWN (TSC13) eran la parte 1 del sustrato de dirección bipartito usado para reemplazo del promotor YBR159W y TSC13, respectivamente.
Para la construcción de la parte 2 del sustrato de dirección bipartito, un fragmento que consta de el promotor ADH1 y dos tercios de K.lactis URA3 hacia el extremo 5’ se amplificó primero por la PCR usando plásmido pWAD2 como molde. Los cebadores usados para esta amplificación fueron 5’ GGACGTTCCCTGTATGTACTAGGGGGATCGAAGAAATGATGG 3’ y 5’ GAGCAATGAACCCAATAACGAAATC 3’. Next, secuencias de dirección cadena arriba se amplificaron a partir de ADN de levadura genómico usando el par de cebadores 5’ GAAAAAATCATTGGATGCCC 3’ y 5’ AGTACATACAGGGAACGTCCAACGCTTTTATTCGTGAAATCTC 3’ para la secuencia de dirección YBR159W cadena arriba y el par de cebadores 5’ GTTATTGAAAGCAATGGGCAAC 3’ y 5’ AGTACATACAGGGAACGTCCAATTCAAAATATGTATCTCTCTC 3’ para la secuencia de dirección TSC13 cadena arriba. Las secuencias de dirección cadena arriba se fusionaron después para el fragmento pADH1-5’ 2/3 K.lactis URA3 previamente construido. El cebador inverso usado para las reacciones de fusión era 5’ GAGCAATGAACCCAATAACGAAATC 3’ y los cebadores directos eran 5’ GAAAAAATCATTGGATGCCC 3’ (para la secuencia diana YBR159W) o y 5’ GTTATTGAAAGCAATGGGCAAC 3’ (para la secuencia diana TSC13). Los fragmentos de fusión resultantes UP (YBR159W)-pADH1-5’ 2/3 K. lactis URA3 and UP(TSC13)-pADHl-5’ 2/3 K. lactis URA3 eran la parte 2 del sustrato de dirección bipartito usado para el reemplazo de los promotores YBR159W y TSC13, respectivamente.
Para la sobreexpresión de YBR159W, la cepa de levadura FS01372 (MATa ura3 trp1 pADH1-FAS1 pADH1-FAS2) se transformó con los sustratos lineales UP(YBR159W)-pADH1-5’ 2/3 K. lactis URA3 y 3’ 2/3 K. lactis URA3-pADH1-DOWN (YBR159W). De manera similar, para la sobreexpresión de TSC13, FS01372 se transformó con los sustratos lineales UP (TSC13)pADH1-5’ 2/3 K. lactis URA3 y 3’ 2/3 K. lactis URA3-pADH1-DOWN (TSC13). Los transformantes de seleccionaron y se purificaron por siembra en estría en medio que carece de uracilo y después se transfirieron a placas que contenían 5-FOA. Los recombinantes de escisión se purificaron por siembra en estría sobre medio que contenía 5-FOA. Las cepas resultantes tenían los genotipos MATa ura3 trp1 pADH1-FAS1 pADH1-FAS2 pADH1YBR159W y MATa ura3 trp1 pADH1-FAS1 pADH1-FAS2 pADH1-TSC13 y se denominaron FS01427 y FS01440, respectivamente. La integración correcta del promotor ADH1 se verificó por la PCR de colonias en ambas cepas.
Ejemplo 32
Aislamiento de genes que codifican subunidades de una ATP: citrato liasa fúngica
Las ATP:citrato liasas fúngicas constan de dos subunidades, codificadas por genes separados. En la levadura Sordaria macrospora estas dos subunidades están codificadas por los genes acl1 y acl2 (Minou et al. 2000 Curr Genet 37:189 -193). Las secuencias codificadoras de S. macrospora acl1 y acl2 se aislaron por la PCR a partir de la primera hebra de ADNc de S. macrospore CBS 957.73 como molde. Los cebadores definidos usados para la amplificación se diseñaron para emparejar las secuencias publicadas codificadoras de acl1 (SEQ ID NO 80) y acl2 (SEQ ID NO 82). El procedimiento era como sigue:
S. macrospora CBS 957.73 se cultivó en 100 ml de medio YEPA (1% extracto de levadura, 2%
de peptona y 2% de acetato, pH 6,0) agitando a 100 rpm a temperatura ambiente durante 4 días. Se recogió la biomasa mediante filtración y se aisló el ARN total usando reactivo Trizol (Gibco BRL). 5 µg de ARN se usó para transcripción inversa (Superscript II RT, Invitrogen) usando Oligo(dT)12-18 como cebador. Después de la síntesis de la primera hebra de ADNc, se retiró el ARN complementario mediante digestión con ARNasa. El ADNc se usó después como molde para la PCR (Phusion enzyme, Finnzymes) usando los siguientes cebadores:
5’GCATACAATCAACTATCTCATATACAATGCCTTCCGCAACTAGCACC
3’ y 5’
TTGTTATTGTAATGTGATACTTAAATTTGGACCTCAACACGACC
3’ para acl1;
5’TTAGGCCTGGAACTCCACCGCAC
3’ y 5’
CGAATAAACACACATAAACAAACAAAATGTCTGCGAAGAGCATC
3’ para acl2. Los
fragmentos resultantes de los tamaños esperados se escindieron de un gel de agarosa y se purificaron usando columnas GFX (Amersham).
Ejemplo 33
Integración de genes que codifican subunidades de una ATP: citrato liasa fúngica en el genoma de S. cerevisiae
La estrategia usada para la integración de las dos subunidades de ATP:citrato liasa (acl1 y acl2) se muestra en la Figura 17. Como cepa precursora para la integración en el genoma, FS01396, se eligió una cepa que lleva el gen M. alpina ole1 integrado en la localización POX1. Los genes acl1 y acl2 se integraron cadena abajo del gen M. alpina ole1 en esta cepa, usando a sustrato de dirección del gen que consta de cuatro fragmentos lineales: ACL-F1, ACL-F2, ACL-F3 y ACL-F4. ACL-F1 contenían la secuencia de dirección cadena arriba para la dirección del sustrato a la posición correcta en el genoma, además de la secuencia terminadora CYC en orientación hacia delante y la secuencia terminadora ADH1 en orientación inversa. ACLF1 contenía adicionalmente una secuencia de 20 pares de bases en 3’ que era idéntica al extremo 5’ de ACL-F2. ACL-F2 contenía el gen acl2 en orientación inversa bajo el control del promotor TDH3, fusionado al promotor ADH1 en orientación hacia delante. ACL-F2 contenía adicionalmente una secuencia de 20 pares de bases en 3’ que era idéntica al extremo 5’ de ACL-F3. ACL-F3 constaba del gen marcador completo K. lactis URA3 en orientación hacia delante seguido de la secuencia del promotor ADH1 en orientación hacia delante. ACL-F4 constaba del gen acl1 en orientación hacia delante, fusionado a la secuencia de dirección cadena abajo usada para dirigir el sustrato a la posición correcta en el genoma. Además, ACL-F4 contenía una secuencia de 20 pares de bases en 5’ que era idéntica al extremo 3’ de ACL-F3.
La superposición de las secuencias en el extremo 3’ de ACL-F1 y el extremo 5’ de ACL-F2, el extremo 3’ de ACL-F2 y el extremo 5’ de ACL-F3, y entre el extremo 3’ de ACL-F3 y el extremo 5’ de ACL-F4 permitía el ensamblaje del sustrato completo de dirección del gen in vivo mediante mecanismos de recombinación homóloga de S. cerevisiae. De este modo, FS01396 se transformó con los cuatro sustratos lineales ACL-F1, ACL-F2, ACL-F3 y ACL-F4, e integración del sustrato completo de dirección del gen en la localización genómica propuesta se seleccionó mediante siembra del transformado en medio que carece de uracilo. Esto dio como resultado una cepa en la que el sustrato de dirección completo se integró inmediatamente cadena abajo de M. alpina olel, de manera que el M. alpina ole 1 se conectó ahora al terminador CYC1. Además, el gen acl2 se colocó bajo el control del promotor TDH3 y se conectó a la secuencia terminadora ADH1, todos en la dirección inversa. El gen marcador
K. lactis URA3 se integró en dirección hacia adelante y se flanqueó por promotor ADH1 como una repetición directa sobre cualquier lado del marcador. Finalmente, el gen acl1e se colocó bajo el control del promotor ADH1 e inmediatamente cadena arriba de la secuencia terminadora POX1, correspondiente a la secuencia de dirección cadena abajo (Figura 17). El gen marcador K. lactis URA3 después formó un bucle mediante resiembra en los transformantes sobre medio 5-FOA .
El procedimiento era como sigue:
Para la construcción del fragmento ACL-F1, una secuencia de dirección cadena arriba, correspondiente al extremo 5’ de M. alpine olel, se amplificó primero por la PCR usando ADN genómico como molde y los cebadores 5’ CAACGCTATCCGCTTTTACCAGT 3’ y 5’ CTATTCGGCCTTGACGTGGTCAGTGC 3’. Además, un fragmento que contenía terminadores CYC1 y terminadores ADH1 en orientación inversa se amplificó mediante PCR usando
plásmido
p300 como molde y usando los cebadores 5’
GCACTGACCACGTCAAGGCCGAATAGCCGCTCTAACCGAAAAGGAAGG
3’ y 5’
GTGCGGTGGAGTTCCAGGCCTAACGAATTTCTTATGATTTATGATTTTTA
3’. Los dos
fragmentos
se fusionaron después por la PCR usando los cebadores 5’
CAACGCTATCCGCTTTTACCAGT
3’ y
GTGCGGTGGAGTTCCAGGCCTAACGAATTTCTTATGATTTATGATTTTTA 3’, dando como resultado el fragmento ACL-F1.
Para la construcción del fragmento ACL-F2, un fragmento que contiene el promotor TDH3 en dirección inversa y el promotor ADH1 en dirección hacia adelante se amplificó mediante PCR usando como molde el plásmido pESC-URA-elo-delta-5-AT (Ejemplo 34) y usando los cebadores 5’ TTTGTTTGTTTATGTGTGTTTATTCGAAACTAAG 3’ y 5’ GTTACCACCATCCAATGCAGACCGTGTATATGAGATAGTTGATTGTATGC 3’. El fragmento resultante se fusionó por la PCR al gen acl2, isolated como se describe en el Ejemplo X, usando los cebadores 5’ TTAGGCCTGGAACTCCACCGCAC 3’ y 5’ GTTACCACCATCCAATGCAGACCGTGTATATGAGATAGTTGATTGTATGC 3’. El fragmento de fusión resultante era ACL-F2
Para la construcción del fragmento ACL-F3, un fragmento que contiene el gen marcador completo K. lactis URA3 cadena arriba del promotor ADH1 se amplificó mediante PCR a partir del plásmido pWAD2 usando los cebadores 5’ CGGTCTGCATTGGATGGTGGTAAC 3’ y 5’ TGTATATGAGATAGTTGATTGTATGC 3’. El fragmento resultante constituía ACL-F3.
Para la construcción del fragmento ACL-F4, una secuencia de dirección cadena abajo, correspondiente a la secuencia terminadora POX1, se amplificó mediante PCR a partir de ADN genómico usando los cebadores 5’ GTATCACATTACAATAACAATTCCTTCGAACCCTCTGTTTTGC 3’ y 5’ TTAGAGCTTCATTCCAACAAGTGCC 3’. El fragmento resultante se fusionó al gen acl1e,
aislado
como se describe en el Ejemplo 32, usando los cebadores 5’
GCATACAATCAACTATCTCATATACAATGC
CTTCCGC AACT AGCACC 3’ y 5’
TTAGAGCTTCATTCCAACAAGTGCC 3’.
La cepa de levadura FS01396 (MATa ura3-52 trp1 pox1::pTDH3-M.alpina olel pADH1FAS1 pADH1-FAS2, Ejemplo 36) se transformó con los fragmentos lineales ACL-F1, ACL-F2, ACL-F3 y ACL-F4. Los transformantes de seleccionaron y se purificaron por siembra en estría en medio que carece de uracilo and después se transfirieron a placas que contenían 5-FOA. Los recombinantes de escisión se purificaron por siembra en estría sobre medio que contenía 5-FOA. La cepa resultante tenía el genotipo MATa ura3 trp1 pADH1-FAS1 pADH1-FAS2 pox1::pTDH3-mole1-pADH1-S. macrospora acl1-pTDH3-S. macrospora acl2 y se denominó FS01425. El ensamblaje correcto del sustrato completo de dirección del gen e integración en la localización correcta genómica se verificó por la PCR de colonias.
Ejemplo 34
Construcción of plásmido pESC-URA-elo-delta-5-AT
El plásmido pESC-URA-elo-delta-5-AT contiene versiones cortas de los promotores TDH3 y ADH1 en el reemplazo del promotor divergente GAL10/GAL1 de pESC-URA-elo-delta
5. Las versiones cortas (fragmentos correspondientes a 674 y 439 pares de bases cadena arriba de los codones de inicio TDH3 y ADH1, respectivamente) de los promotores TDH3 y ADH1 se amplificaron por la PCR usando ADN de levadura genómico como molde y el par de cebadores 5’ AAGCGGCCGCTTTTGTTTGTTTATGTGTGTTTATTCG 3’ y 5’ AAATGGAAAAAGGGTAGTGAAAAGTTTATCATTATCAATACTGCCATTTC 3’ para la amplificación de pTDH3 y el par de cebadores 5’ TTTCACTACCCTTTTTCCATTTGCCATC 3’ y 5’ TTCCCGGGTGTATATGAGATAGTTGATTGTATGC 3’ para la amplificación de pADH1. Los dos fragmentos de promotores se fusionaron después por la PCR usando los cebadores 5’ AAGCGGCCGCTTTTGTTTGTTTATGTGTGTTTATTCG 3’ y 5’ TTCCCGGGTGTATATGAGATAGTTGATTGTATGC 3’. Esto dio como resultado un fragmento que consta de para la versión corta de los promotores TDH3 y ADH1 en orientación divergente, que contienen un sitio de restricción NotI en el extremo 5’ y un sitio de restricción XmaI en el extremo 3’. Después de la restricción con NotI y XmaI, el fragmento se introdujo en pESC-URA-elo-delta-5 digerido con NotI/XmaI. Esto dio como resultado plásmido pESC-URAelo-delta-5-AT, en el que el promotor divergente GAL10/GAL1 se había reemplazado por un promotor TDH3/ADH1 divergente. La ausencia de mutaciones generadas por la PCR en pESCURA-elo-delta-5-AT se verificó mediante secuenciación de las secuencias promotoras de pTDH3/pADH1.
Ejemplo 35
Combinación de las modificaciones de asimilación de amonio con la sobreexpresión FAS
La supresión del gen GDH1 y sobreexpresión de o bien el gen GDH2 o los genes GLN1 y GLT1 condujo a una dependencia alterada del cofactor de la ruta de la asimilación de amonio de levadura, y las cepas que llevan estas modificaciones es probable que contenga una disponibilidad incrementada de NADPH que se puede usar para la síntesis de ácido graso. La supresión de GDH1 y sobreexpresión de GDH2 se combinó por lo tanto con la sobreexpresión de FAS1 y FAS2. De manera similar, la supresión GDH1 y sobreexpresión de GLN1 y GLT1 también se combinó con la sobreexpresión de FAS1 y FAS2. Esto se realizó mediante cruzamiento de cepas que contienen las modificaciones de asimilación de amonio para una cepa que contiene las sobreexpresiones FAS1 y FAS2. Después de la esporulación los diploides resultantes, esporulación y disección de asci, se identificaron cepas haploides novedosas queque portaban las modificaciones genéticas deseadas. Las cepas CEN.PK usadas en el presente Ejemplo que llevan las modificaciones de asimilación de amonio mencionadas se derivaron de las cepas CEN.MS1-10C T1 y CEN.MS5-3A, que ran regalos amables de Margarida Moreira dos Santos, Centro de biología Microbiana, Bio-Centrum DTU, Universidad técnica de Dinamarca. El procedimiento era como sigue:
Combinar la supresión de GDH1 y sobreexpresión de GDH2 con la sobreexpresión de FAS1 y FAS2, la cepa de levadura FS01254 (MATalfa ura3 gdh1::loxP gdh2::PGKp-GDH2KanMX3) se cruzó con la cepa FS01372 (MATa ura3 trp1 pADH1-FAS1 pADH1-FAS2, Ejemplo 26). se seleccionaron diploides en medio que carece de uracilo y triptófano y después se transfirieron a medio de esporulación. Después de la esporulación, se diseccionaron los asci en tétradas de ascosporas. La presencia de la modificación gdh2::PGKp-GDH2-KanMX3 en las cepas haploides resultantes se determinó mediante siembra de réplica a placas que contienen genticina. La presencia de la inactivación de gdh1::IoxP, la sobreexpresión de pADH1-FAS1 la sobreexpresión de pADH1-FAS2 se determinaron mediante PCR de colonias usando cebadores apropiados, y las características remanentes se puntuaron usando procedimientos convencionales. A partir del conjunto de cepas haploides derivadas del cruzamiento, una cepa con el genotipo MATa ura3 trp1 pADH1-FAS1 pADH1-FAS2 gdh1::IoxP gdh2::PGKp-GDH2KanMX3 se seleccionó y se denominó FS01398.
Para combinar la sobreexpresión de FAS1 y FAS2 con la supresión de GDH1, se realizó la sobreexpresión de GLN1 y sobreexpresión de GLT1, a cruces consecutivos. Primero, la cepa FS01335 (MATalfa ura3 trp1 gdh1::IoxP gln1::PGKp-GLN1-KanMX3 glt1::PGKp-GLT1KanMX3) se cruzó con FS01372 (MATa ura3 trp1 pADH1-FAS1 pADH1-FAS2). Se identificaron los diploides mediante siembra por estría de las células del cruce a colonias individuales, transferencia de un número de colonias a una placa maestra, y ensayo de la capacidad de las colonias seleccionadas para esporular en medio de esporulación. Después de la esporulación, se diseccionaron los asci en tétradas de ascosporas. La presencia de las modificaciones gln1::PGKp-GLN1-KanMX3 y glt1::PGKp-GLT1-KanMX3 en las cepas haploides resultantes se determinó mediante siembra de réplica a placas que contienen genticina y mediante la realización de la PCR de colonias usando cebadores apropiados. La presencia de la inactivación de gdh1::IoxP, la sobreexpresión de pADH1-FAS1 y la sobreexpresión de pADH1-FAS2 se determinaron mediante la PCR de colonias, y los tipos de emparejamiento se puntuaron usando procedimientos convencionales. A partir del conjunto de cepas haploides derivadas del cruzamiento, se seleccionaron las dos cepas FS01419 (MATa ura3 trp1 pADH1-FAS1 pADH1-FAS2 gdh1::IoxP glt1::PGKp-GLT1-KanMX3) y FS01420 (MATalfa ura3 trp1 pADH1-FAS1 gdh1::IoxP gln1::PGKp-GLN1-KanMX3).
Segundo, FS01419 y FS01420 se cruzaron y se seleccionaron diploides como se ha descrito anteriormente para el cruce FS01335 x FS01372. Después de la esporulación, se diseccionaron los asci en tétradas de ascosporas. La presencia de las modificaciones gln1::PGKp-GLN1-KanMX3 y glt1::PGKp-GLT1-KanMX3 en las cepas haploides resultantes se determinó mediante siembra de réplica a placas que contienen genticina. La presencia de la sobreexpresión de pADH1-FAS2 se determinó mediante la PCR de colonias, y los tipos de emparejamiento se puntuaron usando procedimientos convencionales. A partir del conjunto de cepas haploides derivadas del cruzamiento, se seleccionó la cepa FS01437 (MATa ura3 trp1 pADH1-FAS1 pADH1-FAS2 gdh1::IoxP glt1::PGKp-GLT1-KanMX3 gln1::PGKp-GLN1KanMX3). La presencia de la supresión gdh1::IoxP y la sobreexpresión de pADH1-FAS2 en la cepa FS01437 se verificó mediante PCR de colonias.
Ejemplo 36
Combinación de la modificación de pox1::pTDH3-M. alpina olel con la sobreexpresión de FAS y la sobreexpresión de ACC1
Para combinar la integración genómica de M. alpina olel con la sobreexpresión de FAS1 y FAS2, FS01368 (MATalfa ura3 trp1 pox1:: pTDH3-M. alpina olel, Ejemplo 28) se cruzó con FS01372 (MATa ura3 trp1 pADH1-FAS1 pADH1-FAS2, Ejemplo 26). Se identificaron los diploides mediante siembra por estría células del cruce a colonias individuales, transferencia de un número de colonias a una placa maestra, y ensayo de la capacidad de las colonias seleccionadas para esporular en medio de esporulación. Después de la esporulación, se diseccionaron los asci en tétradas de ascosporas. Presencia en las cepas haploides resultantes de las sobreexpresiones de pADH1-FAS1 y pADH1-FAS2 y la presencia de la modificación de pox1:: pTDH3-M. alpina olel se determinaron mediante PCR de colonias usando cebadores apropiados, y los tipos de emparejamiento se puntuaron usando procedimientos convencionales. A partir del conjunto de cepas haploides derivadas del cruzamiento, una cepa con el genotipo MATa ura3 trp1 pADH1-FAS1 pADH1-FAS2 poxl::pTDH3-M. alpina olel se seleccionó y se denominó FS01396. Además, una cepa con el genotipo MATalfa ura3 trp1 pADH1-FAS1 pox1::pTDH3-M. alpina olel se seleccionó y se denominó FS01408.
Para combinar además la integración genómica de M. alpina olel, la sobreexpresión de FAS1, y sobreexpresión de FAS2 con sobreexpresión de ACC1, FS01408 (MATalfa ura3 trp1 pADH1-FAS1 poxl::pTDH3-M. alpina olel, derivada como se ha descrito anteriormente) se cruzó con FS01392 (MATa ura3 trp1 pADH1-FAS1 pADH1-FAS2 pTPI1-ACC1, Ejemplo 27). Se seleccionaron diploides como se ha descrito anteriormente para el cruce FS01368 x FS01372 y se transfirieron a medio de esporulación. Después de la esporulación, se diseccionaron los asci en tétradas de ascosporas. Presencia en las cepas haploides resultantes de las sobreexpresiones de pADH1-FAS2 y pTPI1-ACC1 y la presencia de la modificación de pox1:: pTDH3-M. alpina ole1 se determinaron mediante PCR de colonias usando cebadores apropiados, y los tipos de emparejamiento se puntuaron usando procedimientos convencionales. A partir del conjunto de cepas haploides derivadas del cruzamiento, una cepa con el genotipo MATa ura3 trp1 pADH1-FAS1 pADH1-FAS2 pTPI1ACC1 poxl::pTDH3-M. alpina olel se seleccionó y se denominó FS01423. Ejemplo 37
5
Expresión de ruta en ácido araquidónico en levadura modificada genéticamente
Para expresar la ruta a ácido araquidónico en los fondos de cepa modificada descrita en los Ejemplos previos, la cepas modificadas por ingeniería genética se contransformaron con los plásmidos pESC-TRP-delta-12 delta-6 y pESC-URAelo-delta-5. Una visión general de
10 las cepas que se producen por las transformaciones se muestra en la Tabla 4.
Tabla 4. Resumen de las cepas que producen ácido araquidónico, sus genotipos y cepas precursoras
Cepa Genotipo Precursor
FS01373 FS01372
MATa ura3 trp1 pADH1-FAS1 pADH1-FAS2 [pESC-TRP-delta-12
delta-6] [pESC-URA-elo-delta-5] FS01413 FS01392
MATa ura3 trp1 pADH1-FAS1 pADH1-FAS2 pTPI1-ACC1 [pESC
TRP-delta-12 delta-6] [pESC-URA-elo-delta-5] FS01369 FS01368
MAT alfa ura3 trp1 pox1::pTDH3-M.alpina ole1 [pESC-TRP-delta
12 delta-6] [pESC-URA-elo-delta-5] FS01371 FS01370
MATa ura3 trp1 pTDH3-DGA1 [pESC -TRP-delta-12 delta-6]
[pESC-URA-elo-delta-5] FS01417 FS01396
MATa ura3 trp1 pADH1-FAS1 pADH1-FAS2 pox1::M. alpina ole1
[pESC -TRP-delta-12 delta-6] [pESC-URAelo-delta-5] FS01414 FS01393
MATa ura3 trp1 pADH1-FAS1 pADH1-FAS2 pTPI1-YDR531W
[pESC -TRP-delta-12 delta-6] [pESC-URAelo-delta-5] FS01415 MATa ura3 trp1 pADH1-FAS1 pADH1-FAS2 pTPI1-SLC1 [pESC -FS01394 TRP-delta-12 delta-6] [pESC-URA-elo-delta-5] FS01416 MATa ura3 trp1 pADH1-FAS1 pADH1-FAS2 pTPI1-GAT1 [pESC -FS01395 TRP-delta-12 delta-6] [pESC-URA-elo-delta-5]
FS01418 MATa ura3 trp1 pADH1-FAS1 pADH1-FAS2 gdh1::loxP FS01398 gdh2::PGKp-GDH2-KanMX3 [pESC-TRP-delta-12delta-6] [pESCURA-elo-delta-5]
FS01429 FS01423
MATa ura3 trp1 pADH1-FAS1 pADH1-FAS2 pTPI1-ACC1 pox1::M. alpina olel [pESC -TRP-delta-12 delta-6] [pESC-URA-elodelta-5]
FS01430 FS01425
MATa ura3 trp1 pADH1-FAS1 pADH1-FAS2 pox1:: pTDH3-mole1
5
10
15
20
25
110
Cepa
Genotipo Precursor
pADH1-S. macrospora acl1-pTDH3-S.macrospora acl2 [pESC -
TRP-delta-12 delta-6] [pESCURA-elo-delta-5]
FS01431
MATa ura3 trp1 pADH1-FAS1 pADH1-FAS2 pADH1-YBR159W FS01427
[pESC -TRP-delta-12 delta-6] [pESC-URAelo-delta-5]
FS01439
MATa ura3 trp1 pADH1-FAS1 pADH1-FAS2 gdh1::loxP FS01437
glt1::PGKp-GLT1-KanMX3
gln1::PGKp-GLN1-KanMX3 [pESC -
TRP-delta-12 delta-6] [pESC-URA-elo-delta-5]
FS01442
MATa ura3 trp1 pADH1-FAS1 pADH1-FAS2 pADH1 TSC13 FS01440
[pESC -TRP-delta-12 delta-6] [pESC-URA-elo-delta-5]
Ejemplo 38
Composiciones de ácido graso de ácido araquidónico que producen cepas de levadura en matraces agitados
La cepa de referencia FS01324 (MATa ura3 trp1 [pESC -TRP-delta-12 delta-6] [pESCURA-elo-delta-5]) y las cepas metabólicamente modificadas por ingeniería genética FS01373, FS01413, FS01369, FS01371, FS01417, FS01414, FS01415, FS01416, FS01418, FS01429, FS01430, FS01431, FS01439 y FS01442 (Ejemplo 37) se cultivaron en matraces agitados a 17°C como se describe en el Ejemplo 9. Después del agotamiento de fuente de carbono, se extrajeron los lípidos y las composiciones de ácido graso de las cepas se analizaron como se describe en el Ejemplo 45. Los resultados del análisis se muestran en la Tabla 5. Todas las muestras se analizaron en una columna SP-X, que proporciona la total separación de los máximos. Para comparación, los resultados mostrados en el Ejemplo 12 (Tabla 2) se obtuvieron usando una columna JW-1701, que no proporcionan la separación completa de los máximos, y por lo tanto da como resultado la sobreestimación del porcentaje de área de los máximos más pequeños.
La introducción de M. alpina ole1, que codifica una delta-9 desaturasa fúngica con mayor especificidad hacia 18:0 que 16:0, dio como resultado una disminución del nivel de 16:1 y un incremento correspondiente en 18:1 y los PUFA (FS01369, Tabla 5a). El contenido de ácido araquidónico era aproximadamente el doble en FS01369 comparado con la cepa de referencia FS01324 (0,63% comparado con 0,28% de ácido graso total).
La sobreexpresión de FAS1 y FAS2 (cepa FS01373) o FAS1, FAS2 y ACC1 (cepa FS01413) dio como resultado un ligero incremento en el contenido en ARA comparado con la cepa de referencia FS01324 (Tabla 5a). En la cepa FS01417, la sobreexpresión de FAS1 y FAS2 se combinó con expresión de M. alpina ole1. La composición de ácido graso de esta cepa era similar a la composición de la cepa FS01369 (que lleva el M. alpina ole1 como la única modificación genómica).
La sobreexpresión de YDR531W, que codifica supuestamente la pantotenato quinasa, en la cepa FS01414 no condujo a alteraciones significativas de la composición de ácido graso comparada con la cepa de referencia. GAT1, SLC1 y DGA1, todas las aciltransferasas codificadoras en la síntesis de TAG, se sobreexpresaron de manera separada (cepa FS01416, FS01415 y FS01371, respectivamente). Para todos estos tres genes, la sobreexpresión dio como resultado una disminución de niveles de ácido araquidónico (Tabla 5a, 5b). Además, para la sobreexpresión de SLC1 y GAT1, el contenido 16:1 se incrementó en un 10% de FA total.
La cepa FS01418, que lleva una supresión de GDH1 y que sobreexpresa GDH2 además de FAS1 y FAS2, contenía cantidades disminuidas de ácido araquidónico comparada con FS01373 (que sobreexpresa FAS1 y FAS2) (Tabla 5b). La cepa FS01439, que lleva una supresión de GDH1 y que sobreexpresa GLN1 y GLT1 además de la sobreexpresión de FAS1 y FAS2, contenía 0,44% de ácido araquidónico comparada con 0,39% en FS01373.
La cepa FS01430 lleva los dos genes que codifican subunidades de ATP:citrato liasa a partir de hongo Sordaria macrospora oleaginoso bajo el control de fuertes promotores de levadura constitutivos. Además, sobreexpresa FAS1, FAS2 y M. alpina ole1. Típico para las cepas que expresan M. alpina ole1, el contenido de 16:1 se disminuyó en esta cepa comparado con la cepa de referencia FS01324. FS01430 y tienen un mayor contenido 18:1 y 18:2, y un contenido ligeramente incrementado de ARA comparada con su cepa precursora FS01417 (que sobreexpresa FAS1, FAS2 y M. alpina ole1).
En la cepa FS01431, el gen YBR159W, que codifica la β-cetoacil-CoA reductasa, se sobreexpresó en una FAS1/FAS2 que sobreexpresa el fondo. FS01431 no mostró un incremento en el contenido de ARA comparada con la cepa FS01373 (que sobreexpresa FAS1 y FAS2), pero en su lugar contenía niveles aumentados de 16:1 (Tabla 5b). Sin embargo, el alargamiento de 18:3 a 20:3 se mejoró de 19% de conversión en FS01373 a 25% de conversión en FS01431, calculado como 100x (20:3 + 20:4)/(18:3 + 20:3 + 20:4).
Tabla 5a. Composición de ácido graso (% de ácido graso total) de cepas metabólicamente modificadas por ingeniería genética que expresan la ruta en ácido araquidónico, analizada en matraces agitados.
imagen1
Tabla 5b. Composición de ácido graso (% de ácido graso total) de cepas metabólicamente modificadas por ingeniería genética que expresan la ruta en ácido araquidónico, analizada en matraces agitados.
imagen1
En la cepa FS01442, el gen TSC13, que codifica la trans-2-enoil-CoA reductasa, se sobreexpresó en una FAS1/FAS2 que sobreexpresa el fondo. Esto dio como resultado un
10 incremento notable en el contenido de ácido araquidónico, de 0,39% de ácido graso total en FS01373 (que sobreexpresa FAS1 y FAS2) a 0,75% de ácido graso total en FS01442 (que sobreexpresa FAS1, FAS2 y TSC13). El incremento en contenido de ácido araquidónico se debió a un incremento de la eficacia de alargamiento, de 19% de conversión en FS01373 a 51% de conversión en FS01431, calculado como 100x (20:3 + 20:4)/(18:3 + 20:3 + 20:4).
15
5
10
15
20
25
114
Ejemplo 39
Producciones de lípidos de ácido araquidónico que produce cepas de levadura en matraces agitados
La cepa de referencia FS01324 (MATa ura3 trp1 [pESC -TRP-delta-12 delta-6] [pESCURA-elo-delta-5]) y cepas metabólicamente modificadas por ingeniería genética FS01373, FS01413, FS01369, FS01371, FS01417, FS01414, FS01415, FS01416, FS01418, FS01429, FS01430, FS01431 y FS01439 (Ejemplo 37) se cultivaron a 17°C como se describe en el Ejemplo 9. Se extrajeron los lípidos y se cuantificaron como se describe en el Ejemplo 44. Las producciones de lípidos, producciones de biomasa y producciones de ácido araquidónico De las cepas modificadas se resumen en la Tabla 6.
Tabla 6. Producción de lípidos, producción de biomasa y producción de ácido araquidónico en cepas que producen ácido araquidónico, analizado en matraces agitados. La producción de ácido araquidónico sobre fuente de carbono se calculó bajo la suposición que los ácidos grasos constituyen 70% (p/p) de lípidos. Los lípidos se extrajeron poco tiempo después del agotamiento de la fuente de carbono pata todas las cepas excepto las cepas marcadas por un asterisco (*); para estas cepas los lípidos se extrajeron a fase medio exponencial.
Cepa
Producción de Ácido Producción de Producción de
lípidos
araquidónico biomasa ácido
(% de ps)
(% de FA) (g de ps/g de araquidónico
hexosa)
mg/g de hexosa
FS01324
12,8 ± 1,9 0,31 0,36 0,10
FS01369*
9,9 ± 1,1 0,63 n. d. n. d.
FS01373
11,4 ± 0,3 0,47 0,34 0,13
FS01413
16,8 ± 0,8 0,41 0,33 0,16
FS01417
20,1 ± 0,14 0,35 0,28 0,14
FS01414
17,0 ± 0,8 0,35 0,33 0,14
FS01415
17,5 ± 0,3 0,25 0,33 0,10
FS01416
17,8 ± 0,3 0,15 0,35 0,07
FS01418
17,0 ± 1,5 0,17 0,26 0,05
FS01430
16,8 ± 0,6 0,50 0,30 0,18
FS01431
12,8 ± 0,2 0,43 0,29 0,11
FS01371*
8,9 ± 1,2 0,14 s. d. s. d.
De acuerdo con este análisis, la sobreexpresión de FAS1 y FAS2 solas (cepa FS01373) no dio como resultado un aumento en la producción de lípidos comparado con la cepa de referencia FS01324. Sin embargo, la sobreexpresión de FAS1/FAS2 combinada con otras modificaciones (sobreexpresión de o bien ACC1, YDR531W, SLC1, GAT1 o S. macrospora acll y acl2, la supresión de POX1 y la sobreexpresión de M.alpina olel, la supresión de GDH1 combinada con la sobreexpresión de GDH2, la supresión de GDH1 combinada con la sobreexpresión de GLN1 y GLT1) dio como resultado un incremento en la producción de lípidos comparado con la cepa de referencia. la cepa más exitosa en términos de producción de ácido araquidónico sobre fuente de carbono era FS01430 (que sobreexpresa FAS1, FAS2,
S. macrospora acl1 and acl2,y M. alpina olel). Esta cepa produjo 0,18 mg de ácido araquidónico/g de hexosa, comparado con 0,10 mg/g de hexosa en la cepa de referencia FS01324.
Ejemplo 40
Fermentaciones en quimioestato
Se realizaron cultivos continuos en fermentadores Braun Biostat B (Braun Biotech International). Células de un cultivo en matraz agitado 48 h en medio mínimo definido (Verduyn et al,. 1990) se usaron para la inoculación de 1,0 I de medio hasta una DO600 de 0,2 medida usando un espectrofotómetro Hitachi U-1100 (Tokio, Japón). Las fermentaciones se llevaron a cabo a 17 °C y un pH 5,0, controlado por 2 M KOH. Se evitó la formación de espuma mediante la adición de 100 µl de Antiespumante 204 (Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri) por litro de medio. Las condiciones aerobias se obtuvieron mediante rociado del fermentador con aire estéril con un caudal de 1,5 -2,5 I/min para asegurar que la concentración de oxígeno disuelto era superior al 60%. La velocidad de agitación era 800 rpm y el contenido de dióxido de carbono de la salida del gas de salida se midió con un analizador de gas acústico Brüel y Kjær (Brüel & Kjær, Dinamarca). Después del agotamiento de la fuente de carbono, se aplicó el modo de fermentación continua de nivel controlado a una velocidad de dilución de 0,05 h-1 .
Ejemplo 41
Medio de crecimiento usado en las fermentaciones en quimioestato
Medio limitado en carbono con glucosa o etanol como fuente de carbono contenía: 12,5 g/l de glucosa o 10 g/l de etanol, 5 g/l de (NH4)2SO4, 3 g/l KH2PO4, 0,5 g/l MgSO4 *7H2O, 1ml/l de solución de vitamina y 1 ml/l de solución de oligoelementos metálicos. Medio limitado en nitrógeno con glucosa o etanol como fuente de carbono contenía: 40 g/l de glucosa o 30 g/l de etanol, 2 g/l (NH4)2SO4, 4 g/l K2SO4, 3 g/l KH2PO4, 0,5 g/l MgSO4 * 7H2O, 1ml/I solución de vitaminas y 1 ml/l solución de oligoelementos metálicos. El medio mínimo limitado en carbono de glucosa/galactosa contenía: 2,5 g/l de glucosa, 10 g/l de galactosa, 5 g/l de (NH4)2SO4, 3 g/l de KH2PO4, 0,5 g/l de MgSO4 *7H2O, 1 ml/I de solución de vitaminas y 1 ml/I solución de oligoelementos metálicos. Para todos los medios descritos anteriormente, la solución de vitaminas contenía: 50 mg/l de biotina, 1 g/l de pantotenato de calcio, 1 g/l de ácido nicotínico, 25 g/l de mioinositol, 1 g/l de tiamina HCl, 1 g/l de piridoxal HCl y 0.2 g/l de ácido paraaminobenzoico, mientras la solución de oligoelementos metálicos contenía: 15 g/l de EDTA,
4.5 g/l de ZnSO4-7H2O, 1 g/l de MnCl2·2H2O, 0,3 g/l de CoCl2·6H2O, 0,4 g/l de Na2MoO4-2H2O, 4,5 g/l CaCl2·2H2O, 3 g/l de FeSO4.7H2O, 1 g/l de H3BO3 y 0,1 g/l de KI. El medio deficiente en mioinositol mejorado no contenía mioinositol pero de otra manera era idéntica al medio mínimo limitado en carbono de glucosa/galactosa.
Ejemplo 42
Análisis HPLC
Las concentraciones de glucosa, galactosa, etanol, glicerol, acetato, succinato, y piruvato en el caldo de medio de cultivo se determinaron mediante cromatografía líquida en columna (CLC) usando un sistema Dionex Summit CLC (Dionex, Sunnyvale, CA) después de retirar las células del caldo de cultivo mediante centrifugación. Se usó una columna Aminex HPX-87H (BioRad, Hercules, CA) a 60°C con un detector de índice de refracción Diferencial Waters 410 (Millipore, Milford, MA) y un Detector de Absorbancia Sintonizable Waters 486 (detector de UV) fijado a 210 nm. Los dos detectores se conectaron en serie. Como fase móvil 5 mM H2SO4 se usó a un caudal de 0,6 ml/min.
Ejemplo 43
Determinación del Peso Seco de Biomasa
El peso seco de las células se determinó mediante filtración de un volumen conocido del caldo de cultivo a través de un filtro de membrana Supor pesado previamente de 0,45 µm (Pall Corporation, Ann Arbor, MI). Después del lavado con 1 volumen de agua destilada y secado en un horno microondas durante 15 minutos a 150 W, el filtro se pesó de nuevo.
Ejemplo 44
Análisis de lípidos totales
Para análisis de la producción de lípidos totales, la biomasa se separó mediante centrifugación durante 5 minutos a 5000 rpm. La biomasa se volvió a disolver en 10 ml de agua destilada y la suspensión de células resultante se rompió usando el procedimiento de perlas de vidrio para generar el extracto de células. El extracto de células se preparó mediante la adición de 1 ml de perlas de vidrio con un tamaño de partícula de 250 -500 µm (Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri) a una suspensión de células de 1 ml suspensión de células en un micro tubo con tapa roscada (Sarstedt, Alemania). Para cada suspensión de células se procesaron 6 tubos. Los tubos se agitaron a un nivel 4 durante 20 segundos en un instrumento FastPrep FP120 (Qbiogene, Francia). Esto se realizó en un total de 6 rondas para cada tubo con un enfriamiento de intervención de 5 minutos de los tubos en aceite después de 3 rondas. Los extractos de células se combinaron en tubos eppendorf de 2 ml transfiriendo 600 µl de extracto de células para generar 3 tubos eppendorf conteniendo cada uno de ellos 1,2 ml de extracto de células sin perlas de vidrio. 1 ml del extracto de células se transfirió a un tubo de vidrio con tapa de rosca que contiene 20 ml cloroformo/metanol 2:1. El tubo se roció con nitrógeno después se cerró inmediatamente y se colocó sobre un mezclador rotatorio y la extracción de lípidos totales se realizó durante toda una noche. Esto se realizó por triplicado. El extracto después se filtró a través de un filtro Whatman (Whatman International, Inglaterra) y el disolvente recogido se lavó con 4 ml NaCl y finalmente se secó sobre nitrógeno en tubos de vidrio de 10 pesados previamente. Los tubos con la fracción de lípidos seca se pesaron y se determinó la producción de lípidos calculando el peso seco de lípidos dividido por el peso seco de la biomasa en 1 ml de la suspensión de células inicial.
Ejemplo 45
Transesterificación de lípidos y análisis de GC-MS
El lípido seco se generó como para la determinación de lípido total (Ejemplo 44) y se disolvió en 1 ml de tolueno y se añadieron 2 ml de 1 % de ácido sulfúrico en metanol. El tubo se cerró después de mezclar y se roció con nitrógeno y se dejó a 50°C durante toda una noche para la transesterification de los lípidos. La muestra se lavó después con 5 ml de solución al 5% de NaCl. Los ésteres de metilo se extrajeron posteriormente dos veces mediante la adición de 5 ml de hexano, agitando en un aparato Vortex la muestra y recogiendo la fase orgánica superior. La fase orgánica se lavó con 4 ml de 2% de carbonato de sodio y la fase orgánica se recogió de nuevo. Se recogió una pequeña cantidad de la fase acuosa mediante la adición de sulfato sódico anhidro y se filtró la muestra a través de un papel de filtro Whatman (Whatman International, Inglaterra) para retirar el sulfato de sodio. La fase de hexano se secó después en una corriente de nitrógeno. Cuando está seca, la muestra se volvió a disolver en 0,5 ml de hexano que contiene 0,01% de hidroxitolueno butilado (BHT) (Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri) para la protección de dobles enlaces se añadió y la muestra se analizó para determinar los ésteres de metilo. El análisis se realizó usando un cromatógrafo de gas acoplado a un detector selectivo de masas (GC/MS). El sistema GC/MS era un Hewlett Packard HP G1723A con un cromatógafo de gas -detector selectivo de masas cuádruple (EI) que funciona a 70 eV. La columna usada era Supelco SP™-2380. El MS funcionó en modo SCAN. La temperatura del horno era inicialmente 170°C y a continuación hasta 220°C a 4°C/min. La temperatura final se mantuvo durante 15 min. El flujo a través de la columna era 0,6 ml He/min. Los volúmenes de inyección fueron 1 -5 µl. El inyector se dirigió a una abertura de 100:1 de fraccionamiento para todos los análisis. La temperatura de la entrada era 300°C, la temperatura de interfase 230 °C, y la temperatura cuádruple 105°C. Los ésteres metílicos de ácido graso se confirmaron con la base de datos espectrales de masas 1998 NIST, y los tiempos de retención se confirmaron con ésteres metílicos de ácido graso convencionales.
Ejemplo 46
Análisis de cepas de levadura que producen ácido araquidónico en fermentación continua
La cepa de referencia FS01324 (MATa ura3 trp1 [pESC -TRP-delta-12 delta-6] [pESCURA-elo-delta-5]) y las cepas metabólicamente modificadas por ingeniería genética FS01373 y FS01413 (Ejemplo 37) se desarrollaron en cultivos de quimioestato como se describe en el Ejemplo 40. El medio era medio mínimo limitado en carbono de glucosa/galactosa como se describe en el Ejemplo 41. En estado estacionario, se recogieron las muestras para análisis de HPLC, análisis de peso seco de biomasa, producción de lípidos y composición se ácidos grasos como se describe en los Ejemplos anteriores. Un resumen del análisis se muestra en la Tabla 7.
Tabla 7. Contenido de ácido araquidónico (% de ácido graso total), producción de lípidos (% de peso seco de biomasa), producción de biomasa (g de peso seco/g de hexosa), producción de ácido araquidónico sobre la biomasa (mg ácido araquidónico/ g de peso seco de biomasa) y producción de ácido araquidónico sobre la fuente de carbono (mg ácido araquidónico/ g hexosa) de cepas de levadura que producen ácido araquidónico analizada en fermentación continua con medio mínimo limitada de carbono. La producción de ácido araquidónico sobre fuente de carbono se calculó bajo la suposición de que los ácidos grasos constituyen 70% (p/p) de lípidos.
Cepa 20:4 Producción de Producción de Producción Producción lípidos Biomasa 20:4 sobre 20:4 sobre (% de FA) Biomasa fuente de (% de ps) (g/g) carbono
(mg/g) (mg/g)
FS01324 1,1 15,0 ± 0,6 0,43 1,17 0,50
FS01373 1,0 15,3 ± 0,5 0,42 1,03 0,44
FS01413 0,8 12,1 ± 2,9 0,56 0,64 0,36
Todas las cepas tenían un mayor contenido de ácido araquidónico en cultivos de quimioestato que los mostrados en los cultivos en matraces agitados. Sin embargo, las cepas modificadas genéticamente FS01373 y FS01413 no tenían producciones de lípidos mejoradas
5 con relación a la cepa de referencia FS01324 en cultivos de quimioestato limitados en carbono.
Ejemplo 47
10 Optimización de medio para la producción de ácido araquidónico incrementada
La cepa de tipo salvaje CEN.PK 113-7D, la cepa de referencia FS01324 (MATa ura3 trp1 [pESC -TRP-delta-12 delta-6] [pESC-URA-elo-delta-5]), y cepas metabólicamente modificadas por ingeniería genética FS01373, FS01413, FS01417 y FS01430 (Ejemplo 37) se
15 desarrollaron en cultivos de quimioestato como se describe en el Ejemplo 40. El medio usado en estos experimentos era un medio mínimo limitado en carbono mejorado, que no contenía mioinositol (Ejemplo 41). En el estado estacionario, las muestras se recogieron para análisis de HPLC, análisis de peso seco de biomasa, producción de lípidos y v de ácido graso como se describe Ejemplos. Un resumen del análisis se muestra s se muestra en la Tabla 8.
20 Tabla 8. Contenido de ácido araquidónico (% de ácido graso total), producción de lípidos (% de peso seco de biomasa), producción de biomasa (g peso seco/g de hexosa), producción de ácido araquidónico sobre biomasa (mg de ácido araquidónico/ g peso seco de biomasa) y producción de ácido araquidónico sobre fuente de carbono (mg de ácido araquidónico/ g de
25 hexosa) de cepas de levadura que producen ácido araquidónico analizada en fermentación continua con medio mínimo deficiente en mioinositol, limitado en carbono. La producción de ácido araquidónico sobre fuente de carbono se calculó bajo la suposición de que ácidos grasos
Cepa 20:4 Producción de Producción de Producción Producción lípidos Biomasa 20:4 sobre 20:4 sobre (% de FA) Biomasa fuente de (% de ps) (g/g) carbono
(mg/g) (mg/g)
CEN.PK 0 8,4±2,5 0,67 0 0
FS01324 0,8 10,4 ± 1,0 0,75 0,58 0,43
FS01373 1,2 11,7 ± 1,0 0,67 1,01 0,68
FS01413 1,5 10,4 ± 0,2 0,68 1,09 0,74
FS01430 2,7 8,6 ± 0,7 0,58 1,62 0,72
FS01417 3,5 8,0 ± 0,8 0,45 1,93 1,12
En medio mínimo deficiente en mioinositol, limitado en carbono, cepas metabólicamente
5 modificadas por ingeniería genética FS01324, FS01373, FS01413, FS01430 y FS01417 todas contenían mayores niveles de ácido araquidónico que la cepa de referencia FS01324. En particular, la cepa FS01417 contenía 3,5 % de ácido araquidónico del ácido graso total, comparada con 0,8 % in la cepa de referencia FS01324. Una visión general del comportamiento de las cepas modificadas por ingeniería genética as se muestra en la Figura
10 18.
Ejemplo 48
Optimización de medio para la producción incrementada de lípidos totales
15 Por el contrario que los experimentos de matraces agitados (Ejemplo 39), las cepas modificadas no tenían producciones de lípidos incrementadas con relación a la cepa de referencia en los cultivos de quimioestato de los Ejemplos 46 y 47. Esto es probable que se deba a que los experimentos se llevaron a cabo en limitación de carbono, que no es óptima
20 para la acumulación de lípidos. Por lo tanto es probable que las cepas metabólicamente modificadas por ingeniería genética muestren producciones de lípidos incrementadas con relación a la cepa de referencia cuando se analizan en condiciones que promueven la acumulación de lípidos. Para optimizar las condiciones de quimioestato para la acumulación de lípidos, la cepa de tipo salvaje CEN.PK 113-7D se desarrolló en quimioestato como se describe en el Ejemplo 40 en diferentes composiciones de medio. El medio usado en estos experimentos era o bien i) limitado en carbono con glucosa como fuente de carbono, ii) limitado en nitrógeno con glucosa como fuente de carbono, iii) limitado en carbono con etanol como fuente de carbono o iiii) limitado en nitrógeno con etanol as fuente de carbono (Ejemplo 41). En
5 estado estacionario, se recogieron muestras para análisis de HPLC, análisis de peso seco de biomasa y producción de lípidos como se describe anteriormente en los Ejemplos. Un resumen del análisis se muestra en la Tabla 9.
Tabla 9. Producción de biomasa y producción de lípidos de la cepa de tipo salvaje CEN.PK
10 113-7D desarrollada en quimioestato con i) medio limitado en carbono con glucosa como fuente de carbono, ii) medio limitado en nitrógeno con glucosa como fuente de carbono, iii) medio limitado en carbono con etanol como fuente de carbono o iiii) medio limitado en nitrógeno con etanol como fuente de carbono.
15
Medio i) C-lim, glc ii) N-lim, glc iii) C-lim, EtOH iiii) N-lim, EtOH
Producción de lípidos (% de ps) 7 14 10 10
El análisis mostró que la producción de lípidos en cultivo en quimioestato con S. cerevisiae puede ser aproximadamente el doble usando un medio limitado en nitrógeno, mejor 20 que limitado en glucosa.
Ejemplo 49
Análisis de cepas de levadura que producen ácido araquidónico en fermentación continua con 25 medio de crecimiento optimizado
La cepa de referencia FS01324 (MATa ura3 trp1 [pESC -TRP-delta-12 delta-6] [pESCURA-elo-delta-5]) y las cepas modificadas por ingeniería genética FS01373, FS01413, FS01369, FS01371, FS01417, FS01414, FS01415, FS01416, FS01418, FS01429, FS01430, FS01431, FS01439 y FS01442 (Ejemplo 37) se desarrollan en cultivos continuos usando medio limitado en nitrógeno, deficiente en mioinositol. En estado estacionario, se recogen muestras para análisis de HPLC, análisis de peso seco de biomasa, producción de lípidos y composición de ácido graso como se describe en los anteriores Ejemplos. El uso de medio limitado en nitrógeno se anticipa que conduce a unas mayores producciones de lípido y por lo tanto producciones incrementadas de ácido araquidónico. Además, las cepas que llevan las modificaciones genéticas deseadas en la mejora de la producción de lípidos es probable que tengan incluso producciones de lípidos que la cepa de referencia en medio limitado en nitrógeno.
Ejemplo 50
Construcción de p300, un único vector de expresión de levadura que contiene genes que codifican delta-12 desaturasa, delta-6 desaturasa, delta-6 elongasa y delta-5 desaturasa
Para reducir el número de plásmidos necesarios para la expresión de rutas PUFA, los cuatro genes requeridos para la producción de ácido araquidónico (genes de M. alpina que codifican -12 desaturasa, delta-6 desaturasa, delta-6 elongasa y delta-5 desaturasa) se colocaron sobre un único plásmido, p300. La estrategia usada para la construcción de p300 se muestra en la Figura 19. Primero, un segundo sitio de restricción PacI se introdujo en pESCTRP-delta-12 delta-6 en el sitio de restricción NheI. Para este propósito, se usó el oligonucleótido sintético palindrómico 5’ CTAGCAATTCCTTAATTAAGGAATTG 3’. Este oligonucleótido se hibrida a él mismo, dando como resultado un fragmento de ADN de doble cadena que contiene un sitio de restricción PacI y salientes en ambos extremos que se emparejan con el sitio de restricción NheI. El fragmento se clonó en el sitio de restricción NheI de pESC-TRP-delta-12 delta-6, dando como resultado el plásmido pESC-TRPdelta-12 delta-6PacI. A continuación, un fragmento que contiene las secuencias terminadoras de ADH1 y CYC1 en orientación uno tras otro se introdujo en pESC-TRP-delta-12 delta-6-PacI. Para construir el fragmento terminador ADH1-CYC1, el terminador ADH1 se amplificó por la PCR usando los cebadores 5’ TGTTCTCGAGAAGGTGTTGAGCGACCTCATGCTATACCTGAGAAAG 3’ y 5’ CCATCGATGGCGAATTTCTTATGATTTATGATTTTTA 3’ y el terminador CYC1 se amplificó mediante PCR usando los cebadores 5’ GAAGATCTTCCCGCTCTAACCGAAAAGGAAGG 3’ y 5’ AACACCTTCTCGAGAACACTTCGAGCGTCCCAAAACC 3’, usando pESC-URA como molde para ambas reacciones. Después de la purificación de los fragmentos del terminador ADH1 y CYC1, se fusionaron por la PCR usando los cebadores 5’ GAAGATCTTCCCGCTCTAACCGAAAAGGAAGG 3’ y 5’ CCATCGATGGCGAATTTCTTATGATTTATGATTTTTA 3’. Los sitios de restricción ClaI y BgIII incluidos en estos cebadores permitieron la introducción del fragmento terminador ADH1CYC1 -en pESC-TRP-delta-12 delta-6-PacI digerido con ClaI/BglII, dando como resultado el plásmido pESC-TRP-delta-12 delta-6-PacI-T. La ausencia de mutaciones en las secuencias terminadoras se verificó mediante secuenciación de pESC-TRP-delta-12 delta-6-PacI-T. Para construir el plásmido p300, pESC-TRP-delta-12 delta-6-PacI-T se digirió con PacI, dando como resultado la liberación de una inserción que contiene el gen de M. alpina que codifica delta-12 desaturasa, el promotor divergente GAL1/GAL10, el gen de M. alpina que codifica delta-6 desaturasa, el terminador ADH1 y el terminador CYC (Figura 19). La inserción se purificó y se introdujo en pESC-URA-elo-delta-5 digerido con PacI, dando como resultado el plásmido p300. La correcta orientación de la inserción derivada de pESC-TRP-delta-12 delta-6-PacI-T-en p300 se verificó mediante análisis de restricción.
Ejemplo 51
Clonación de una omega-3 desaturasa a partir de A. thaliana en un vector de expresión de levadura
El gen FAD3 de A. thaliana (SEQ ID NO 32), que codifica una omega-3 desaturasa, se amplificó a partir de una preparación de ADNc de A. thaliana (Plant normal Tissue First strand ADNc/Arabidopsis, Gentaur Molecular Products) usando los cebadores 5’ GGTCTCGAGCCACCATGGTTGTTGCTATGGACCAAC 3’ y 5’ GGGGTACCATTAATTGATTTTAGATTTGTCAGAAGCGTAA 3’. Estos cebadores introducen sitios de restricción XhoI y KpNI en el extremo 5’ y 3’ del gen, respectivamente. El gen FAD3 de A. thaliana se introdujo en pESC-TRP digerido con XhoI/KpNI, dando como resultado el plásmido pESC-TRP-Aro3. Ausencia de mutaciones en A. thaliana FAD3 se verificó mediante secuenciación de pESC-TRP-Aro3. Ejemplo 52 Clonación de omega-3 desaturasa de Saccharomyces kluyveri en un vector de expresión de levadura
El gen FAD3 de S. kluyveri (SEQ ID NO 87), que codifica una omega-3 desaturasa, se
amplificó a partir de una preparación de ADN genómico de S. kluyveri Y159 usando los cebadores 5’ GGTCTCGAGCCACCATGTCTATTGAAACAGTCGG 3’ y 5’ GGCCGCGGATCATTGACTGGAACCATCTT 3’. Estos cebadores introducen sitios de restricción XhoI y SacII en el extremo 5’ y 3’ del gen, respectivamente. El gen FAD3 de S.
5 kluyveri se introdujo en pESC-TRP digerido con XhoI/SacII, dando como resultado el plásmido pESC-TRP-SK33. Ausencia de mutaciones en S. kluveri FAD3 se verificó mediante secuenciación de pESC-TRP-SK33.
Ejemplo 53
10
Expresión of omega-3 desaturasa de S. kluyveri y evaluación de p300
Cepa de levadura FS01267 (MATa trp1 ura3) se cotransformó con los plásmidos p300 y pESC-TRP-SK33. Los transformantes se seleccionaron en medio que carece de uracilo y
15 triptófano y se purificaron por siembra de estría sobre el mismo medio. La cepa transformada se denominó FS01432. FS01432 se desarrolló en un matraz agitado como se describe en el Ejemplo 9 y se analizó la composición de ácido graso como se describe en el Ejemplo 45. Las composiciones de ácido graso de FS01432, la cepa de referencia FS01324 y S. kluyveri Y159 se muestran en la Tabla 10.
20 Los resultados del análisis mostraron que la cepa FS01432, que expresa la ruta en ácido araquidónico y la omega-3 desaturasa de S. kluyveri, contenía ácido alfa-linoleico y pequeñas cantidades de ácido estearidónico. El contenido en ácido alfalinolénico en esta cepa era mayor que el contenido en ácido gamma-linolénico, indicando que la omega-3 desaturasa de S. kluyveri desatura el ácido linoleico de manera más eficaz que la delta-6 desaturasa de M.
25 alpina.
Tabla 10. Composición de ácido graso composición (% of ácido graso total) de la cepa FS01324 (MATa ura3 trp1 [pESC-TRP-delta-12 delta-6] [pESC-URA-elo-delta-5]), FS01432 (MATa ura3 trp1 [p300] [pESC-TRP-SK33]) y S. kluyveri Y159.
imagen1
5 Comparando la composición de ácido graso de FS01324 (que expresa la ruta a ARA de los dos plásmidos) y FS01432 (que expresa la ruta a ARA de un único plásmido), se puede observar que la conversión del ácido oleico del sustrato inicial en ácido linoleico y los intermedios cadena abajo de ácido linoleico es menos eficaz en FS01432 que FS01324. De este modo, FS01432 contiene solamente 6,1% de ácidos grasos con dos o más dobles enlaces
10 comparado con un 11,6% en FS01324. Esta disminución también se reflejaba en un mayor contenido de ácido oleico en FS01432 comparada con FS01324. En conclusión, parece que esa expresión a partir del plásmido p300 es menos eficaz que la expresión a partir de los plásmidos originales pESC-TRP-delta-12 delta-6 y pESC-URA-elo-delta-5.
15 Ejemplo 54
Construcción del vector pESC-LEU-SK33 Para construir el vector pESC-LEU-SK33, S. kluyveri FAD3 se liberó de pESC-TRPSK33 (Ejemplo 52) mediante digestión con ApaI y NheI y se introdujo en pESC-LEU digerido con ApaI/NheI, dando como resultado el plásmido pESCLEU-SK33 (Figura 20A). La correcta inserción de S. kluyveri FAD3 se verificó mediante análisis de restricción.
Ejemplo 55
Construcción del vector pESC-LEU-Ssc2
Para construir el vector pESC-LEU-Ssc2, Ssc2 de ratón se liberó de pESC-TRP-delta5elo (Ejemplo 15) mediante digestión con BgIII y PacI y se introdujo en pESC-LEU digerido con BglII/PacI, dando como resultado el plásmido pESCLEU-Ssc2 (Figura 20B). La correcta inserción de Ssc2 de ratón se verificó mediante análisis de restricción.
Ejemplo 56
Construcción del vector pESC-LEU-Ssc2-SK33
[0390] Para construir el vector pESC-LEU-Ssc2-SK33, S. kluyveri FAD3 se liberó de pESCTRP-SK33 (Ejemplo 52) mediante digestión con ApaI y NheI y se introdujo en pESC-LEUSsc2 digerido con ApaI/NheI (Ejemplo 55), dando como resultado el plásmido pESC-LEUSsc2-SK33 (Figura 20C). La correcta inserción de S. kluyveri FAD3 se verificó mediante análisis de restricción.
Ejemplo 57
Introducción de la mutación leu2 en fondo de pox1::pTDH3-M. alpina olel
Para permitir la expresión de una ruta PUFA a partir de tres plásmidos, que llevan los marcadores URA3, TRP1 y LEU2, respectivamente, en una cepa que lleva el M. alpina ole1 integrado en su genoma, una mutación leu2 se introdujo en este fondo de cepa. Para este propósito, FS01368 (MATalfa ura3 trp1 pox1::pTDH3-M.alpina ole1) se cruzó con FS01277 (MATa ura3 leu2 trpl). Se identificaron los diploides mediante siembra por estría células del cruce a colonias individuales, transferencia de un número de colonias a una placa maestra, y ensayo de la capacidad de las colonias seleccionadas para esporular en medio de esporulación. Después de la esporulación, se diseccionaron los asci en tétradas de ascosporas y los genotipos se puntuaron. La presencia de la modificación de pox1:: pTDH3-M. alpina olel se determinó mediante la PCR de colonias usando cebadores apropiados. A partir del conjunto de cepas haploides derivadas del cruzamiento, una cepa con el genotipo MATalfa ura3 trp1 leu2 pox1::pTDH3-M. alpina olel se seleccionó y se denominó FS01444.
5
Ejemplo 58
Expresión de las rutas a ácido eicosapentaenoico, ácido docosatetraenoico y ácido docosapentaenoico en S. cerevisiae
10 Para expresar la rutas en ácido eicosapentaenoico, ácido docosatetraenoico y ácido docosapentaenoico en S. cerevisiae, los plásmidos construidos en los Ejemplos 54 -56 se introdujeron en levadura conjuntamente con los dos plásmidos pESCTRP-delta-12 delta-6 y pESC-URA-elo-delta-5, dando como resultado las cepas FS01446, FS01447 y FS01448 (Tabla
15 11).
Tabla 11. Genotipos de las cepas FS01369, FS01446, FS01447 y FS01448
Cepa Genotipo Precursor
FS01369 MAT alfa ura3 trp1 pox1:: pTDH3-M.alpina olel [pESC -TRPdelta-12 delta-6] FS01368 [pESC-URA-elo-delta-5]
FS01446 MATalfa ura3 trp1 leu2 pox1::pTDH3-M. alpina olel [pESCTRP-delta-12 delta-FS01444 6] [pESC-URA-elo-delta-5] [pESC-LEUSK33]
FS01447 MATalfa ura3 trp1 leu2 pox1::pTDH3-M. alpina olel [pESCTRP-delta-12 delta-FS01444 6] [pESC-URA-elo-delta-5] [pESC-LEUSsc2]
FS01448 MATalfa ura3 trp1 leu2 pox1::pTDH3-M. alpina olel [pESCTRP-delta-12 delta-FS01444 6] [pESC-URA-elo-delta-5] [pESC-LEUSsc2-SK33]
20 Las cepas FS01446, FS01447 y FS01448 y FS01369 se cultivaron primero en matraces agitados con agitación a 150 rpm a 17°C en medio mínimo definido que contiene 5 g/l de glucosa y 20 g/l de galactosa. Después del agotamiento de glucosa y mientras que las células estaban en crecimiento exponencial en galactosa, 1 ml de cada cultivo se transfirió a nuevos matraces agitados que contenían 100 ml de medio mínimo con 20 g/l de galactosa
25 como única fuente de carbono. Las células después se cultivaron a 17°C con agitación a 150 rpm hasta el agotamiento de la fuente de carbono, la biomasa se recogió, lípidos se extrajeron como se describe en el Ejemplo X y la composición de ácido graso se analizó como se describe en el Ejemplo X. Las composiciones de ácido graso de las cepas se resumen en la Tabla 12.
Tabla 12. Composición de ácido graso composición (% de ácido graso total) de las cepas FS01369, FS01446, FS01447 y FS01448.
imagen1
10 El análisis mostró que FS01446 y FS01448, ambas cepas que expresan S. kluyveri FAD3, produjeron ácido eicosapentaenoico (Tabla 12, Figura 21). Sin embargo, la expresión de Ssc2 de ratón en FS01447 y FS01448 no dio como resultado el alargamiento esperado de 20:4 en 22:4 (o 20:5 en 22:5).
15
Ejemplo 59
Optimización de codón y ensamblaje de la delta-4 desaturasa sisntética a partir de Thraustochytrium
20 La secuencia de nucleótidos de delta-4 desaturasa de Thraustochytrium (SEQ ID NO 35) era de codón optimizado para la expresión en S. cerevisiae y se ensambló a partir de los oligonucleótidossintéticos. El procedimiento era como sigue:
La secuencia de nucleótidos de Thraustochytrium que codifica una delta-4 desaturasa era de codón optimizado para la expresión en S. cerevisiae usando herramienta Backtranslation (Entelechon) con la opción "codones desechados por debajo de 50% de la relación teórica"-. El gen de codón optimizado (SEQ ID NO 84) se ensambló después a partir de a partir de los oligonucleótidos químicamente sintetizados. El procedimiento usado para el ensamblaje del gen se muestra en la Figura 22. Los oligonucleótidos codificantes y no codificantes se diseñaron para cubrir la secuencia completa del gen, y se diseñaron de manera que una superposición de 20 pares de bases se logró para cada oligonucleótido codificante y no codificante (Figura 22). Los oligonucleótidos codificantes eran cada uno de 40 pares de bases de longitud y se numeraron D4D-A01 a D4D-A39 consecutivamente desde el extremo 5’ al extremo 3’ de la hebra codificante. De manera similar, los oligonucleótidos no codificantes se numeraron D4D-B01 a D4D-40 consecutivamente desde el extremo 5’ al extremo 3’ de la hebra no codificante. Primero, piezas de 200 pares de bases de ADN de doble cadena se ensamblaron mezclando cinco oligonucleótidos codificantes con sus 5 oligonucleótidos no codificantes complementarios. Por ejemplo, 100 pmol de cada uno de los oligonucleótidos D4D-01, D4D-02, D4D-03, D4D-04 y D4D-05, D4D-B40, D4D-39, D4D-38, D4D-37 y D4D-36 se mezclaron en un volumen de 50 µl. La mezcla de oligonucleótidos después se mezcló sobre un gel de agarosa al 2% conjuntamente con un marcador de tamaño, y la mancha alrededor de 200 pares de bases se escindió del gel y se purificó. Después la mezcla purificada se usó como molde en una reacción de PCR usando los oligonucleótidos D4D-A01 y D4D-B36 como cebadores, que dio como resultado la amplificación del fragmento de 200 pares de bases deseado, denominado D4D-1. Por analogía, la parte remanente del gen se ensambló en piezas de 200 pares de bases, denominadas D4D-2 a D4D-8 (Figura 22). A continuación, los ocho fragmentos de 200 pares de bases se fusionaron por la PCR hasta cuatro fragmentos de 400 pares de bases, denominados D4D-12, D4D-34, D4D-56 y D4D-78. Estos fragmentos se fusionaron después por la PCR formando dos fragmentos de 800 pares de bases, y finalmente los dos fragmentos de 800 pares de bases se fusionaron formando el gen completo. La reacción de la PCR de fusión final se llevó a cabo usando los cebadores 5’ ATCCCGGGACCATGACAGTTGGTTACGATGAGG 3’ y 5’ ATCCGCGGTTATGCTGCTCTTTGCCAACTTTCG 3’, que introdujeron los sitios de restricción XmaI y SacII en el extremo 5’ y extremo 3’ del gen, respectivamente.
Ejemplo 60
Clonación de delta-4 desaturasa sintética en un vector de expresión de levadura
El gen ensamblado sintéticamente que codifica la delta-4 desaturasa (Ejemplo 59) se
digirió con XmaI y SacII y se introdujo en pESC-LEU-Ssc2 digerido con XmaI/SacII, dando como resultado el plásmido pESC-LEU-Ssc2-delta-4d (Figura 23).
Ejemplo 61
Integración de S. kluyveri FAD3 en el genoma de S. cerevisiae
El gen FAD3 de S. kluyveri, que codifica una omega-3 desaturasa se integró en el genoma de S. cerevisiae y se colocó bajo el control del promotor de levadura GAL1. El promotor GAL1 y el gen FAD3 de S. kluyveri se integraron en la localización de GPP1, dando como resultado la inactivación de este gen (véase también el Ejemplo 66). La integración se llevó a cabo mediante recombinación homóloga usando a sustrato de dirección del gen bipartito (Figura 24). Una parte del sustrato bipartito constaba de dos tercios (hacia el extremo 3’) de K. lactis URA3, fusionado a la secuencia del promotor GAL1, el gen FAD3 de S. kluyveri y una secuencia diana cadena abajo de GPP1. La segunda parte del sustrato bipartito constaba de una secuencia diana cadena arriba de GPP1, fusionado a la secuencia del promotor GAL1 y dos tercios (hacia el extremo 5’) de K. lactis URA3. Después de la transformación con el sustrato bipartito y selección en medio que carece de uracilo, se obtuvieron los transformantes en los que GPP1 se habían inactivado y reemplazado con dos copias de la secuencia del promotor GAL1 como una repetición directa sobre cualquier lado del gen marcador K. lactis URA3 y el gen S.kluyveri FAD3 inmediatamente cadena abajo de la segunda repetición del promotor GAL1. Un segundo episodio de recombinación, que como resultado la formación de bucle del marcador de selección, se realizó mediante resiembra de los transformantes en medio que contenía ácido 5’-fluoroorótico (5-FOA), que es tóxico para las células que expresan el gen URA3. Esto dio como resultado una cepa, en la que el gen GPP1 se había reemplazado con el S.kluyveri FAD3 bajo el control del promotor GAL1.
El procedimiento era como sigue:
Para la construcción de la primera parte del sustrato de dirección del gen bipartito, un fragmento que contiene el promotor GAL1 inmediatamente cadena arriba de S. kluyveri FAD3 se amplificó a partir de plásmido pESC-TRP-SK33 (véase el ejemplo X para la construcción de pESC-TRP-SK33), usando los cebadores 5’ ACTACATCATCGAATTCCAGAACGAATCAAATTAACAACCATAG 3’ y 5’ TCATTGACTGGAACCATCTT 3’. una secuencia diana cadena abajo de S. cerevisiae GPP1 se amplificó mediante PCR usando ADN genómico de S. cerevisiae como molde and los cebadores 5’ AAGATGGTTCCAGTCAATGATAAGGATGACTTGTTGAAATGGTAA 3’ and 5’CCACAAGACTGTTTCCAGAGC 3’. Un tercer fragmento de ADN, que consta de dos tercios de K. lactis URA3 hacia el extremo 3’, se generó por la PCR usando como molde un plásmido que contiene el K. lactis URA3 y los cebadores 5’ CTTGACGTTCGTTCGACTGATGAGC 3’ y 5’CTGGAATTCGATGATGTAGTTTCTGG 3’. Estos fragmentos de PCR se fusionaron después durante dos rondas de PCR. Primero, el fragmento que contiene el promotor GAL1 y el S. kluyveri FAD3 se fusionó a la cadena abajo secuencia diana usando los cebadores 5’ ACTACATCATCGAATTCCAGAACGAATCAAATTAACAACCATAG 3’ y 5’ CCACAAGACTGTTTCCAGAGC 3’. Segundo, el producto de la primera reacción de fusión se fusionó al fragmento 3’ 2/3 K. lactis URA3 usando los cebadores 5’ CTTGACGTTCGTTCGACTGATGAGC 3’ y 5’ CCACAAGACTGTTTCCAGAGC 3’. Esto dio como resultado el producto de fusión 2/3URA3-pGAL1-S.kluyveri FAD3-DOWN, que constituía la primera parte del sustrato de dirección del gen bipartito.
Para la construcción de la segunda parte del sustrato bipartito, una secuencia diana cadena arriba de GPP1 se amplificó mediante PCR usando ADN genómico de S. cerevisiae como molde y los cebadores 5’ ATGGCATGGCCCCGAAGG 3’ y 5’ CTGGAATTCGATGATGTAGTTTGAACGAAAATGAACAAGACG 3’. El promotor GAL1 se amplificó mediante PCR usando pESC-TRP-SK33 como molde y los cebadores 5’ ACTACATCATCGAATTCCAGAACGAATCAAATTAACAACCATAG 3’ y 5’ CCACCATCCAATGCAGACCGCGGGGTTTTTTCTCCTTGAC 3’. Un tercer fragmento, que consta de dos tercios de K. lactis URA3 hacia el extremo 5’, se generó por la PCR usando los cebadores 5’ CGGTCTGCATTGGATGGTGGTAAC 3’ y 5’ GAGCAATGAACCCAATAACGAAATC 3’, y un plásmido que contiene el K. lactis URA3 como molde. Estos fragmentos de PCR se fusionaron después durante dos rondas de PCR. Primero, el promotor GAL1 se fusionó a la secuencia de dirección cadena arriba usando los cebadores 5’ ATGGCATGGCCCCGAAGG 3’ y 5’ CCACCATCCAATGCAGACCGCGGGGTTTTTTCTCCTTGAC 3’. Segundo, el producto de la primera reacción de fusión se fusionó al fragmento 5’ 2/3 K. lactis URA3 usando los cebadores 5’ ATGGCATGGCCCCGAAGG 3’ y 5’ GAGCAATGAACCCAATAACGAAATC 3’. Esto dio como resultado el producto de fusión UP-pGAL1-2/3URA3, que constituía la segunda parte del sustrato de dirección del gen bipartito.
La cepa de levadura FS01444 (MATalfa ura3 trp1 leu2 pox1::pTDH3-mole1, Ejemplo 57) se transforma con los sustratos lineales 2/3URA3-pGAL1-S.kluyveri FAD3-DOWN y UPpGAL1-2/3URA3 y se sembraron en medio que carece de uracilo. Los transformantes se purificaron mediante siembra en el mismo medio y después se transfiere al medio que contiene 5-FOA. Los recombinantes de escisión se purifican por siembra en estría sobre medio que contenía 5-FOA y se verificaron mediante PCR de colonias. La cepa resultante tiene el genotipo MATalfa ura3 trp1 leu2 pox1::pTDH3-mole1 gpp1::pGAL1-S.k/uyveri FAD3 y se denominó FS01460.
Ejemplo 62
Expresión de la ruta a ácido docosahexaenoico
Para expresar la ruta completa a ácido docosahexaenoico, FS01460 (MATalfa ura3 trp1 leu2 pox1::pTDH3-mole1 gpp1::pGAL1-S.kluyveri FAD3, Ejemplo 61) se cotransforma con los plásmidos pESC-TRP-delta-12 delta-6, pESCURA-elo-delta-5 y pESC-LEU-Ssc2-delta-4d. Se seleccionan los transformantes y se purifican por siembra en estría en medio que carece de uracilo, triptófano y leucina. La cepa transformada después se cultiva en condiciones adecuadas para la inducción de los promotores GAL (por ejemplo, Ejemplo 9, Ejemplo 49), y la composición de ácido graso se analiza como se describe en el Ejemplo 45.
Ejemplo 63
Sobreexpresión de LRO1
La aciltransferasa codificada por LRO1 en S. cerevisiae cataliza la transferencia de una cadena acilo desde la posición 2 en fosfatidilcolina a diacilglicerol, dando como resultado la formación de triacilglicerolo. Ya que la desnaturalización de ácido graso poliinsaturado tiene lugar principalmente en la posición 2 de fosfatidilcolina (Domergue, F. et al. (2003) J Biol Chem
278: 35115 -35126), la sobreexpresión de LRO1 es probable que dé como resultado un aumento en la incorporación de ácido graso poliinsaturado en triacilglicerol y un incremento global en el contenido de ácido graso poliinsaturado. LRO1 se sobreexpresa con un fuerte promotor de levadura, por ejemplo el promotor TDH3, ADH1, TPI1 o HXT7 usando un procedimiento de reemplazo de promotor basándose en un sustrato de dirección del gen bipartito (Figura 15) ), como se describe en por ejemplo, Ejemplo 26 y Ejemplo 30.
Ejemplo 64
Sobreexpresión de ARE1 y ARE2
Las aciltransferasas codificadas por ARE1 y ARE2 in S. cerevisiae catalizan la adición de una cadena acilo a diacilglicerol formando triacilglicerol. La sobreexpresión de ARE1 y ARE2 pueden dar como resultado un aumento de producción de lípidos y un aumento del contenido global de ácido graso poliinsaturado. ARE1 y ARE2 se sobreexpresan con fuertes promotores de levadura, por ejemplo los promotores TDH3, ADH1, TPI1 o HXT7 usando un procedimiento de reemplazo de promotor basándose en un sustrato de dirección del gen bipartito (Figura 15) , como se describe en por ejemplo, Ejemplo 26 y Ejemplo 30.
Ejemplo 65
Sobreexpresión de ELO1, ELO2 y ELO3
Los genes de levadura ELO1, ELO2 y ELO3 codifican las ácido graso elongasas. La elongasa codificada por ELO1 es responsable del alargamiento de las esepcies ácidos grasos C14 a C16 (Toke et al. (1996) J Biol Chem 271: 18413 -18422), ELO2 codifica una elongasa implicada en la síntesis de ácido graso saturado y monoinsaturado de hasta 24 átomos de carbono de longitud, y ELO3 codifica una elongasa con un amplio intervalo de sustrato (Oh, C.
S. et al. (1997) J Biol Chem 272: 17376 -17384). La sobreexpresión de estas elongasas puede contribuir a un incremento en los contenidos de ácidos grasos C18, los sustratos para la ruta de ácido graso poliinsaturado, y por lo tanto da como resultado un incremento en la producción de ácidos grasos poliinsaturados. ELO1, ELO2 y ELO3 se sobreexpresan con fuertes promotores de levadura , por ejemplo los promotores TDH3, ADH1, TPI1 o HXT7 usando un procedimiento de reemplazo de promotor basándose en un sustrato de dirección del gen bipartito (Figura 15), como se describe en por ejemplo, Ejemplo 26 y Ejemplo 30.
Ejemplo 66
Sobreexpresión de GPD1 y supresión de GPP1 y GPP2
El precursor universal para la síntesis de lípidos es glicerol-3-fosfato, que se forma a partir de dihidroxiacetonefosfato mediante la acción de glicerol-3-fosfato deshidrogenasa dependiente de NAD, en la levadura codificada por GPD1. Glicerol-3-fosfato o bien entra en la ruta de la síntesis de lípidos o se puede desfosforilar formando glicerol por la acción de glicerol-3-fosfatasas codificadas por GPP1 y GPP2. Mediante la sobreexpresión de GPD1 y supresión de GPP1 y GPP2, la disponibilidad de glicerol-3-fosfato se puede incrementar (Nguyen, H.T.T. et al. (2004) Metab Eng. 6,155 -163). Combinando estas modificaciones con la sobreexpresión del complejo FAS y aciltransferasas en la ruta de síntesis de lípidos, es probable que la producción de lípidos y producción de ácido graso poliinsaturado se pueda mejorar.
GPD1 se sobreexpresa con un fuerte promotor de levadura, por ejemplo el promotor TDH3, ADH1, TPI1 o HXT7, usando un procedimiento de reemplazo de promotor basándose en un sustrato de dirección del gen bipartito (Figura 15) , como se describe en por ejemplo, Ejemplo 26 y Ejemplo 30.
GPP1 y GPP2 se suprimen usando un sustrato de dirección del gen bipartito con K.lactis URA3 como un marcador reciclable. Una parte del sustrato bipartito consta de dos tercios (hacia el extremo 3’) de K. lactis URA3, seguido de una corta secuencia R, y una secuencia diana cadena abajo de GPP1 o GPP2, respectivamente. La segunda parte del sustrato bipartito consta de una secuencia diana cadena arriba de GPP1 o GPP2, respectivamente, fusionada a la secuencia corta R y dos tercios (hacia el extremo 5’) de K. lactis URA3. Después de la transformación con el sustrato bipartito and selección en medio que carece de uracilo, se obtuvieron los transformantes en los que GPP1 o GPP2, respectivamente, se habían inactivado y reemplazado con dos copias de la secuencia corta R como una repetición directa sobre cualquier lado del gen marcador K. lactis URA3. Un segundo episodio de recombinación, que da como resultado la formación de bucle del marcador de selección, se selecciona volviendo a sembrar los transformantes sobre medio que contiene ácido 5’-fluoroorótico (5-FOA), que es tóxico para las células que expresan el gen URA3. En las cepas resultantes, GPP1 y GPP2 se han suprimido y reemplazado con la secuencia corta
R. Como alternativa, GPP1 y GPP2 se usan como las localizaciones para la integración de genes heterólogos, dando como resultado la supresión de estos genes, por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 66.
La sobreexpresión de GPD1 y las supresiones de GPP1 y GPP2 se realizan en un fondo de la cepa pADH1-FAS1 pADH1-FAS2 pTPI1-ACC1 pox1::pTDH3-M.alpina olel. Después de la construcción de la sobreexpresión de GPD1, cepa de supresión de GPP1 y GPP2, estas modificaciones se combinan con la sobreexpresión de aciltransferasas en la ruta biosintética de lípidos (por ejemplo, la sobreexpresión de GAT1, SLC1 y DGA1 o LRO1) mediante cruzamiento de cepas.
Ejemplo 67
Expresión de una gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa heteróloga dependiente de NADP+ Expresión del gen GapN de Streptococcus mutans (SEQ ID NO: 91), que codifica una
gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa dependiente de NADP+, incrementa la disponibilidad de NADPH citosólico para la síntesis de ácido graso. La integración del S. mutans GapN en el genoma de S. cerevisiae se combina con la sobreexpresión de FAS1, FAS2 y ACC1.
El gen GapN de S. mutans se integra en el genoma de S. cerevisiae y se coloca bajo el control del promotor de levadura ADH1. El promotor ADH1 y el gen GapN de S. mutans se integran en la localización de GPP2, dando como resultado la inactivación de este gen (véase también el Ejemplo 66). La integración se lleva a cabo mediante recombinación homóloga usando un sustrato de dirección de gen bipartito, usando los mismos procedimientos en principio que se describen para la integración de M. alpine ole1 (Ejemplo 28)..
Ejemplo 68
Modificaciones de modificaciones genéticas en una única cepa
Las modificaciones genéticas que conducen a producciones de lípidos y / o producciones de ácido graso poliinsaturado mejoradas se combinan mediante cruzamiento de las cepas o mediante repetición del procedimiento de reemplazo del promotor en fondos de cepas diferentes. Por ejemplo, la sobreexpresión de FAS1, FAS2,y ACC1 se combina con sobreexpresión de GAT1, SLC1,y DGA1 y/o LRO1.
Ejemplo 69
Optimización de codón y ensamblaje de la delta-9 elongasa sintética de Isochrysis galbana y delta-8 desarurasa sintética de Euglena gracilis
Las secuencias que codifican la delta-9 elongasa de Isochrysis galbana (SEQ ID NO 37) y delta-8 desaturasa de Euglena gracilis (SEQ ID NO 38) son de codón optimizado para la expresión en S. cerevisiae usando la herramienta Backtraducción (Entelechon) con la opción
"codones de desecho por debajo de 50% de relación teórica". Los genes de codón optimizado (SEQ ID NO 85 y SEQ ID NO 86, respectivamente) después se ensamblan a partir de oligonucleótidos sintetizados químicamente, en principio como se describe para el ensamblaje de un gen sintético que codifica delta-4 desaturasa (Ejemplo 59). Ejemplo 70
Clonación de delta-9 elongasa y delta-8 desaturasa en vectores de expresión de levadura
El gen de codón optimizado que codifica una delta-9 elongasa (SEQ ID NO 85, Ejemplo 70) se clona en el vector de expresión de levadura pESC-TRP-delta-12 (Ejemplo 2), dando como resultado el vector pESC-TRP-delta-12 delta-9e. Además, el vector pESC-URAelo-delta-5 se digiere con enzimas de restricción adecuadas dando como resultado la liberación de la M.alpina delta-6 elongasa que codifica el gen de este plásmido. El plásmido linealizado se purifica y la delta-8 desaturasa de codón optimizado (SEQ ID NO 86, Ejemplo 71) se introduce en lugar de la M.alpina delta-6 elongasa. El plásmido resultante se denomina pESC-URA-delta-8 delta-5.
Ejemplo 71
Expresión de la ruta en ácido araquidónico mediante la delta-9 elongasa y delta-8 desaturasa de codón optimizado
Una cepa de levadura adecuada (por ejemplo, FS01267, FS01368, FS01408 o FS01423) se cotransforma con plásmidos pESCTRP-delta-12 delta-9e y pESC-URA-delta-8 delta-5. La cepa resultante se cultiva en condiciones adecuadas para la inducción de los promotores GAL (por ejemplo, Ejemplo 9, Ejemplo 49), y la composición de ácido graso se analiza como se describe en el Ejemplo 45.
Ejemplo 72
Expresión de la ruta a ácido eicosapentaenoico mediante delta-9 elongasa y delta-8 desaturasa de codón optimizado
Una cepa de levadura adecuada (por ejemplo, FS01277 o FS01444) se cotransforma con los plásmidos pESC-TRP-delta-12 delta-9e (Ejemplo 70), pESC-URA-delta-8 delta-5 (Ejemplo 70) y pESC-LEU-SK33 (Ejemplo 54). La cepa resultante se cultiva en condiciones adecuadas para la inducción de los promotores GAL (por ejemplo, Ejemplo 9, Ejemplo 49), y la composición de ácido graso se analiza como se describe en el Ejemplo 45.
Ejemplo 73
Expresión de la ruta a ácido docosatetraenoico mediante delta-9 elongasa y delta-8 desaturasa de codón optimizado
Una cepa de levadura adecuada (por ejemplo, FS01277 o FS01444) se cotransforma con los plásmidos pESC-TRP-delta-12 delta-9e (Ejemplo 70), pESC-URA-delta-8 delta-5 (Ejemplo 70) y pESC-LEU-Ssc2 (Ejemplo 55). La cepa resultante se cultiva en condiciones adecuadas para la inducción de los promotores GAL (por ejemplo, Ejemplo 9, Ejemplo 49), y la composición de ácido graso se analiza como se describe en el Ejemplo 45.
Ejemplo 74
Expresión de la ruta a ácido docosapentaenoico mediante delta-9 elongasa y delta-8 desaturasa de codón optimizado
Una cepa de levadura adecuada (por ejemplo, FS01277 or FS01444) se cotransforma con los plásmidos pESC-TRP-delta-12 delta-9e (Ejemplo 70), pESC-URA-delta-8 delta-5 (Ejemplo 70) y pESC-LEU-Ssc2-SK33 (Ejemplo 56). La cepa resultante se cultiva en condiciones adecuadas para la inducción de los promotores GAL (por ejemplo, Ejemplo 9, Ejemplo 49), y la composición de ácido graso se analiza como se describe en el Ejemplo 45.
Ejemplo 75
Expresión de la ruta a ácido docosahexaenoico mediante delta-9 elongasa y delta-8 desaturasa de codón optimizado
La cepa de levadura FS01460 (Ejemplo 61) se cotransforma con los plásmidos pESCTRP-delta-12 delta-9e (Ejemplo 70), pESC-URA-delta-8 delta-5 (Ejemplo 70) y pESC-pESCLEU-Ssc2-delta-4d (Ejemplo 60). La cepa resultante se cultiva en condiciones adecuadas para la inducción de los promotores GAL (por ejemplo, Ejemplo 9, Ejemplo 49), y la composición de ácido graso se analiza como se describe en el Ejemplo 45.
Ejemplo 76
Optimización de genes que codifican delta-9 desaturasa, delta-12 desaturasa, delta-6 desaturasa, delta-6 elongasa, delta-5 desaturasa, delta-5 elongasa y omega-3 desaturasa
Las secuencias de delta-9 desaturasa (SEQ ID NO 1), delta-12 desaturasa (SEQ ID NO 5), delta-6 desaturasa (SEQ ID NO 11), delta-6 elongasa (SEQ ID NO 16) y delta-5 desaturasa (SEQ ID NO 22) de M. alpina, delta-5 elongasa (SEQ ID NO 28) de ratón y omega-3 desaturasa (SEQ ID NO 87) de S. kluyveri son de codón optimizado para la expresión en S.
cerevisiae y se ensamblan a partir de oligonucleótidos sintéticos usando el mismo principio que se describe para el ensamblaje de un gen sintético que codifica delta-4 desaturasa (Ejemplo
59).
REFERENCIAS
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LISTADO DE SECUENCIAS
10 <110> Fluxome Sciences Jochen Förster Nina Katarina Gunnarsson Jens Bredal Nielsen
<120> CÉLULAS METABÓLICAMENTE MODIFICADAS POR INGENIERÍA GENÉTICA PARA 15 LA PRODUCCIÓN DE ÁCIDOS GRASOS POLIINSATURADOS
<130> P36601PC01
<150> 60/577,245
<151> 2004-06-04
<160> 114 20 <170> FastSEQ for Windows Versión 4.0
<210> 1
<211> 1338
<212> ADN
<213> Mortierella alpina 25 <400> 1
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<210> 2
<211> 1482
<212> ADN
<213> Cryptococcus curvatus
<400> 2
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<210> 3
<211> 1431
<212> ADN
<213> Histoplasma capsulatus
<400> 3
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<210> 4
<211> 1439
<212> ADN
<213> Trichoplusia ni
<400> 4
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<210> 5
<211> 1206
<212> ADN
<213> Mortierella alpina
<400> 5
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<210> 6
<211> 1191
<212> ADN
<213> Mucor rouxii
<400> 6
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<210> 7
<211> 1366
<212>
ADN 10 <213> Mucor circinelloides
<400> 7
<210> 8
<211> 1275
<212> ADN
<213> Aspergillus fumigatus
<400> 8
<210> 9
<211> 1341
<212> ADN
<213> Cryptococcus curvatus
<400> 9
<210> SEQ ID NO:10
<211> LENGTH: 1253
<212>
TIPO: ADN 10 <213> ORGANISMO:Caenorhabditis elegans
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<400> SEQ ID NO:10
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<210> 11
<211> 1374
<212> ADN
<213> Mortierella alpina
<400> 11
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<210> 12
<211> 1572
<212> ADN
<213> Mucor rouxii
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<210> 13
<211> 1687
<212> ADN
<213> Borago officinalis 10 <400> 13
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<210> 14
<211> 1341
<212> ADN
<213> Anemone levellei
<400> 14
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<210> 15
<211> 1332
<212> ADN
<213> Caenorhabditis elegans
<400> 15
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<210> 16
<211> 957
<212> ADN
<213> Mortierella alpina
<400> 16
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<210> 17
<211>
1192 10 <212> ADN
<213> Physcomitrella patens
<400> 17
<210> 18
<211> 867
<212> ADN
<213> Caenorhabditis elegans
<400> 18
<210> 19
<211>
900 10 <212> ADN
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<213> Mus musculus
<400> 19
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<210> 20
<211> 819
<212> ADN
<213> Thraustochytrium aureum
<400> 20
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10 <210> 21
<211> 1066
<212> ADN
<213> Phytophthora infestans
<400> 21
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<210> 22
<211> 1341
<212> ADN
<213> Mortierella alpina
<400> 22
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10 <210> 23
<211> 1740
<212> ADN
<213> Phytophthora megasperma
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<210> 24
<211> 1320
<212> ADN
<213> Thraustochytrium sp. ATCC 21685 10 <400> 24
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<210> 25
<211> 1344
<212> ADN
<213> Caenorhabditis elegans
<400> 25
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<210> 26
<211> 1371
<212> ADN
<213> Pythium irregulare
<400> 26
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<210> 27
<211> 1652
<212> ADN
<213> Phaeodactylum tricornutum
<400> 27
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<210> 28
<211> 879 10 <212> ADN
<213> Mus musculus
<400> 28
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<210> 29
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<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 29
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10 <210> 30
<211> 1209
<212> ADN
<213> Caenorhabditis elegans
<400> 30
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<210> 31
<211> 1556
<212> ADN
<213> Petroselinum crispum
<400> 31
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<210> 32
<211> 1525
<212> ADN
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 32
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<210> 33
<211> 1336
<212> ADN
<213> Brassica napus
<400> 33
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<210> 34
<211> 2181 10 <212> ADN
<213> Glycine soya
<400> 34
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<210> 35
<211> 1560
<212> ADN
<213> Thraustochytrium aureum
<400> 35
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<210> 36
<211> 2569
<212> ADN
<213> Euglena gracilis
<400> 36
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<210> 37
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<212> ADN
<213> Isochrysis galbana
<400> 37
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<210> 38
<211> 1275
<212> ADN
<213> Euglena gracilis
<400> 38
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<210> 39 10 <211> 445
<212> PRT <213> Mortierella alpina
<400> 39
imagen1
imagen1
<210> 40
<211> 493
<212> PRT
<213> Cryptococcus curvatus
<400> 40
imagen4
imagen1
<210> 41
<211> 476
<212> PRT
<213> Histoplasma capsulatus
<400> 41
imagen1
imagen1
<210> 42
<211> 353
<212> PRT
<213> Trichoplusia ni
<400> 42
imagen1
<210> 43
<211> 401
<212> PRT
<213> Mortierella alpina
<400> 43
imagen1
imagen1
<210> 44
<211> 396
<212> PRT
<213> Mucor rouxii
<400> 44
imagen1
imagen1
<210> 45
<211> 396
<212> PRT
<213> Mucor circinelloides
<400> 45
imagen1
imagen1
<210> 46
<211> 424
<212> PRT
<213> Aspergillus fumigatus
<400> 46
imagen1
imagen1
<210> 47
<211> 446
<212> PRT
<213> Cryptococcus curvatus
<400> 47
imagen1
imagen1
<210> 48
<211> 376
<212> PRT
<213> Caenorhabditis elegans
<400> 48
imagen1
<210> 49
<211> 457
<212> PRT
<213> Mortierella alpina
<400> 49
imagen1
imagen1
<210> 50
<211> 523
<212> PRT
<213> Mucor rouxii
<400> 50
imagen1
imagen1
<210> 51
<211> 448
<212> PRT
<213> Borago officinalis
<400> 51
imagen1
imagen1
<210> 52
<211> 446
<212> PRT
<213> Anemone levellei
<400> 52
imagen1
imagen1
<210> 53
<211> 443
<212> PRT
<213> Caenorhabditis elegans
<400> 53
imagen1
imagen1
<210> 54
<211> 318
<212> PRT
<213> Mortierella alpina
<400> 54
imagen1
<210> 55
<211> 290
<212> PRT
<213> Physcomitrella patens
<400> 55
imagen1
<210> 56
<211> 288
<212> PRT
<213> Caenorhabditis elegans
<400> 56
imagen1
<210> 57
<211> 299
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 57
imagen1
<210> 58
<211> 272
<212> PRT
<213> Thraustochytrium aureum
<400> 58
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<210> 59
<211> 278
<212> PRT
<213> Phytophthora infestans
<400> 59
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<210> 60
<211> 446
<212> PRT
<213> Mortierella alpina
<400> 60
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<210> 61
<211> 477
<212> PRT
<213> Phytophthora megasperma
<400> 61
imagen1
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<210> 62
<211> 439
<212> PRT
<213> Thraustochytrium sp. ATCC 21685
<400> 62
imagen1
imagen1
<210> 63
<211> 447
<212> PRT
<213> Caenorhabditis elegans
<400> 63
imagen1
imagen1
<210> 64
<211> 456
<212> PRT
<213> Pythium irregulare
<400> 64
imagen1
imagen1
<210> 65
<211> 469
<212> PRT
<213> Phaeodactylum tricornutum
<400> 65
imagen1
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<210> 66
<211> 292
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 66
imagen1
<210> 67
<211> 299
<212> PRT
<213> Homo sapiens
imagen5
<210> 68
<211> 277
<212> PRT
<213> Pavlova
<400> 68
imagen1
<210> 69
<211> 402
<212> PRT
<213> Caenorhabditis elegans
<400> 69
imagen1
imagen1
<210> 70
<211> 438
<212> PRT
<213> Petroselinum crispum
<400> 70
imagen1
imagen1
<210> 71
<211> 446
<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 71
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imagen1
<210> 72
<211> 377
<212> PRT
<213> Brassica napus
<400> 72
imagen1
<210> 73
<211> 380
<212> PRT
<213> Glycine soya
<400> 73
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<210> 74
<211> 519
<212> PRT
<213> Thraustochytrium aureum
<400> 74
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<210> 75
<211> 541
<212> PRT
<213> Euglena gracilis
<400> 75
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imagen1
<210> 76
<211> 433
<212> PRT
<213> Isochrysis galbana
<400> 76
imagen1
<210> 77
<211> 509
<212> PRT
<213> Schizochytrium aggregatum
<400> 77
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<210> 78
<211> 263
<212> PRT
<213> Isochrysis galbana
<400> 78
imagen1
<210> 79
<211> 419
<212> PRT
<213> Euglena gracilis
<400> 79
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<210> 80
<211> 2025
<212> ADN
<213> Sordaria macrospora
<400> 80
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<210> 81
<211> 674
<212> PRT 10 <213> Sordaria macrospora
<400> 81
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<210> 82
<211> 1446
<212> ADN
<213> Sordaria macrospora
<400> 82
imagen1
<210> 83
<211> 481
10 <212> PRT
<213> Sordaria macrospora
<400> 83
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<210> 84
<211> 1560
<212> ADN
<213> Saccharomyces cerevisiae 5 <220>
<221> CDS
<222> (0)...(0)
<223> Secuencia sintética de nucleótidos que codifica
optimizado para la expresión en S. cerevisiae 10 <400> 84
imagen1
<210> 85
<211> 792 15 <212> ADN
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<221> CDS
<222> (0)...(0)
una delta-4 desaturasa, de codón
<223> Secuencia sintética de nucleótidos que codifica una delta-9 elongasa, de codón optimizado para la expresión en S. cerevisiae
<400> 85
imagen1
5
<210> 86
<211> 1260
<212> ADN
<213> Saccharomyces cerevisiae 10 <220>
<221> CDS
<222> (0)...(0)
<223> Secuencia sintética de nucleótidos que codifica una delta-8 desaturasa, de codón
optimizado para la expresión en S. cerevisiae 15 <400> 86
imagen1
<210> 87
<211> 1260
<212> ADN
<213> Saccharomyces kluyveri
<400> 87
imagen1
<210> 88
<211> 419
<212> PRT
<213> Saccharomyces kluyveri
imagen6
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<210> 89
<211> 1353
<212> ADN
<213> Mortierella alpina
<400> 89
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<210> 90
<211> 403
<212> PRT
<213> Mortierella alpina
<400> 90
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<210> 91
<211> 1428
<212> ADN
<213> Streptococcus mutans
<400> 91
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<210> 92 10 <211> 475
<212> PRT
<213> Streptococcus mutans
<400> 92
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<210> 93
<211> 1401
<212> ADN
<213> Aspergillus parasiticus
<400> 93
imagen1
<210> 94
<211> 466
<212> PRT
<213> Aspergillus parasiticus
<400> 94
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<210> 95
<211> 1263
<212> ADN
<213> Pichia pastoris
<400> 95
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<210> 96
<211> 420 10 <212> PRT
<213> Pichia pastoris
<400> 96
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<210> 97
<211> 3175
<212> ADN
<213> Marchantia polymorpha
<400> 97 <210> 98
imagen1
<211> 481
<212> PRT
<213> Marchantia polymorpha
<400> 98
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<210> 99
<211> 1335
<212> ADN
<213> Cyprinus carpio
<400> 99
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<210> 100 10 <211> 444
<212> PRT
<213> Cyprinus carpio
<400> 100
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imagen1
<210> 101
<211> 894
<212> ADN
<213> Salmo salar
<400> 101 <210> 102
imagen1
<211> 297
<212> PRT
<213> Salmo salar
<400> 102
imagen1
<210> 103
<211> 873
<212> ADN
<213> Marchantia polymorpha
<400> 103
imagen1
<210> 104
<211> 290
<212> PRT
<213> Marchantia polymorpha
<400> 104
imagen1
<210> 105
<211> 1365
<212> ADN
<213> Salmo salar
<400> 105 <210> 106
imagen1
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<211> 454
<212> PRT
<213> Salmo salar
<400> 106
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<210> 107
<211> 1455
<212> ADN
<213> Marchantia polymorpha
<400> 107
imagen1
<210> 108
<211> 484
<212> PRT
<213> Marchantia polymorpha
<400> 108
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<210> 109
<211> 1338
<212> ADN
<213> Pavlova lutheri
<400> 109
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10 <210> 110
<211> 445
<212> PRT
<213> Pavlova lutheri
<400> 110
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<210> 111
<211> 1077
<212> ADN
<213> Saproleigna diclina
<400> 111
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<210> 112
<211> 358 10 <212> PRT
<213> Saproleigna diclina
<400> 112
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<210> 113
<211> 1251
<212> ADN
<213> Saccharomyces kluyveri
<400> 113
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5
<210> 114
<211> 416
<212> PRT
<213> Saccharomyces kluyveri 10 <400> 114
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Claims (26)

1.
Un procedimiento para producir ácidos grasos poliinsaturados con cuatro o más dobles enlaces que comprende la expresión heteróloga de una ruta que requiere oxígeno en un Saccharomyces cerevisiae desarrollado sobre un sustrato de ácido no graso, en el que la expresión heteróloga comprende la combinación de la expresión heteróloga de secuencias de nucleótidos que codifican delta-12 desaturasa, delta-6 desaturasa, delta-6 elongasa, delta-5 desaturasa y delta-9 desaturasa.
2.
Un procedimiento para producir ácidos grasos poliinsaturados con cuatro o más dobles enlaces que comprende la expresión heteróloga de una ruta que requiere oxígeno en un Saccharomyces cerevisiae desarrollado sobre un sustrato de ácido no graso, en el que la expresión heteróloga comprende la combinación de la expresión heteróloga de secuencias de nucleótidos que codifican delta-12 desaturasa, delta-9 elongasa, delta-8 desaturasa, delta-5 desaturasa y delta-9 desaturasa.
3.
Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho sustrato de ácido no graso es la fuente de carbono exclusiva.
4.
Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la expresión heteróloga combinada además comprende la expresión heteróloga de una secuencia de nucleótidos que codifica delta-5 elongasa, omega-3 desaturasa, y / o delta-4 desaturasa.
5.
Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha expresión heteróloga combinada además comprende una sobreexpresión de al menos uno de los genes seleccionados entre el grupo que consta de ACC1, YBR159W, FAS1, y FAS2.
6.
Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha expresión heteróloga combinada además comprende una supresión de POX1.
7.
Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha expresión heteróloga combinada además comprende una expresión heteróloga de las secuencias de nucleótidos que codifican ATP:citrato liasa.
8.
Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha expresión heteróloga combinada además comprende una supresión del gen GDH1 y opcionalmente una sobreexpresión de al menos uno de los genes seleccionados entre el grupo que consta de GDH2, GLN1 y GLT1.
9.
Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que
dicha expresión heteróloga combinada además comprende una sobreexpresión de al menos uno de los genes seleccionados entre el grupo que consta de TSC13, GAT1, SLC1 y YDR531W.
10.
Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dichas secuencias de nucleótidos heterólogas son de codón optimizado para la expresión en Saccharomyces cerevisiae.
11.
Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho Saccharomyces cerevisiae está cultivado en un medio deficiente en mioinositol.
12.
Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el ácido graso poliinsaturado está seleccionado entre el grupo que consta de ácido araquidónico, ácido eicosapentaenoico y ácido docosahexaenoico.
13.
Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha expresión heteróloga incrementa el contenido de ácido araquidónico, ácido eicosapentaenoico y / o ácido docosahexaenoico hasta más de 2 % del contenido de ácido graso total en dicho Saccharomyces cerevisiae
14.
Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la secuencia de nucleótidos que codifica delta-12 desaturasa está seleccionada entre el grupo que consta de a) las secuencias de nucleótidos establecidas en SEQ ID Números 5 -10, 93, 95, y 113; y b) secuencias de nucleótidos que tiene al menos 75% de identidad con las secuencias de nucleótidos establecidas en SEQ ID Números 5 -10, 93, 95, y 113.
15.
Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la secuencia de nucleótidos que codifica delta-9 desaturasa está seleccionada entre el grupo que consta de a) las secuencias de nucleótidos definidas en SEQ ID NO: 1-4; y b) secuencias de nucleótidos que tienen al menos 75% de identidad con las secuencias de nucleótidos definidas en SEQ ID NO: 1 -4.
16.
Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la secuencia de nucleótidos que codifica delta-5 desaturasa está seleccionada entre el grupo que consta de a) las secuencias de nucleótidos establecidas en SEQ ID NO: 22 -27, 99, 105 y 107; y b) secuencias de nucleótidos que tienen al menos 75% de identidad con las secuencias de nucleótidos definidas en SEQ ID NO: 22 -27, 99, 105 y 107.
17.
Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 -16, en el que la secuencia de nucleótidos que codifica delta-9 elongasa es una secuencia de nucleótidos que
comprende o que tiene al menos 75% de identidad con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 37.
18.
Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 -16, en el que la secuencia de nucleótidos que codifica delta-8 desaturasa es una secuencia de nucleótidos que comprende o que tiene al menos 75% de identidad con la secuencia de nucleótidos of SEQ ID NO: 38.
19.
Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 y / o 3 -16, en el que la secuencia de nucleótidos que codifica delta-6 desaturasa está seleccionada entre el grupo que consta de a) las secuencias de nucleótidos definidas en SEQ ID. NO: 11 -15, 97, y 99; y b) secuencias de nucleótidos que tiene al menos 75% de identidad con las secuencias de nucleótidos definidas en SEQ ID NO: 11-15, 97, y 99.
20.
Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 y / o 3-16, en el que la secuencia de nucleótidos que codifica delta-6 elongasa eatá seleccionada entre el grupo que consta de a) las secuencias de nucleótidos definidas en SEQ ID NO: 16-21, 101 and 103; and b) secuencias de nucleótidos que tiene al menos 75% de identidad con las secuencias de nucleótidos establecidas en SEQ ID NO: 16-21, 101 y 103.
21.
Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 -16, en el que la secuencia de nucleótidos que codifica delta-5 elongasa eatá seleccionada entre el grupo que consta de a) las secuencias de nucleótidos definidas en SEQ ID NO: 19, 28, 29 y 101; b) secuencias de nucleótidos que tienen al menos 75% de identidad con las secuencias de nucleótidos establecidas en SEQ ID NO: 19, 28, 29 y 101; y c) secuencias de nucleótidos que codifican secuencias de aminoácidos que tienen al menos 75% identidad con SEQ ID NO 68.
22.
Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 -16, en el que la secuencia de nucleótidos que codifica delta-4 desaturasa está seleccionada entre el grupo que consta de a) las secuencias de nucleótidos definidas en SEQ ID NO: 35 -36 y 109; b) secuencias de nucleótidos que tienen al menos 75% de identidad con las secuencias de nucleótidos definidas en SEQ ID NO: 35 -36 y 109; y c) secuencias de nucleótidos que codifican secuencias de aminoácidos que tienen al menos 75% identidad con SEQ ID Números 76 -77.
23.
Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4-16, en el que la
secuencia de nucleótidos que codifica omega-3 desaturasa está seleccionada entre el grupo que consta de a) las secuencias de nucleótidos definidas en SEQ ID NO: 30 -34, 87, 89 y 111; y b) secuencias de nucleótidos que tienen al menos 75% de identidad con las secuencias de
5 nucleótidos definidas en SEQ ID NO: 30 -34, 87, 89 y 111.
24.
Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende la etapa de recuperación de dicho ácido graso poliinsaturado.
25.
Un Saccharomyces cerevisiae modificado genéticamente capaz de producir ácidos grasos poliinsaturados con cuatro o más dobles enlaces cuando se desarrolla sobre un sustrato de
10 ácido no graso, en el que dicho Saccharomyces cerevisiae comprende la expresión heteróloga de secuencias de nucleótidos que codifican delta-12 desaturasa, delta-6 desaturasa, delta-6 elongasa, delta-5 desaturasa y delta-9 desaturasa.
26. Un Saccharomyces cerevisiae modificado genéticamente capaz de producir ácidos grasos poliinsaturados con cuatro o más dobles enlaces cuando se desarrolla sobre un sustrato de
15 ácido no graso, en el que dicho Saccharomyces cerevisiae comprende la expresión heteróloga de secuencias de nucleótidos que codifican delta-12 desaturasa, delta-9 elongasa, delta-8 desaturasa, delta-5 desaturasa y delta-9 desaturasa.
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