CN109929870B

CN109929870B - 糖代谢与脂质代谢协同提高解脂耶氏酵母合成脂肪酸衍生物的产量的应用

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Publication number: CN109929870B
Application number: CN201910126150.XA
Authority: CN
Inventors: 元英进; 张金来; 曹英秀; 晋聪聪; 白秋艳; 张若思; 彭洋子; 刘夺
Original assignee: Tianjin University
Current assignee: Tianjin University
Priority date: 2019-02-20
Filing date: 2019-02-20
Publication date: 2021-03-16
Anticipated expiration: 2039-02-20
Also published as: CN109929870A

Abstract

本发明涉及合成生物学技术领域，特别涉及糖代谢与脂质代谢在协同提高解脂耶氏酵母合成脂肪酸衍生物的产量的应用。协同脂肪醇与糖代谢路径的表达可以实现脂质产物生产与其他相关路径的平衡与协调从而促进细胞代谢的合理分配提高脂质合成效率。本发明通过实验发现当协同糖酵解与脂质产物生产路径时，可以实现有效的“拉‑推”效应，既脂质产物生产会拉动糖酵解表达上调，而糖酵解可以协同的进一步促进脂质产物合成基因的表达，从而大大的提高了整体代谢通量，实现了脂质类产物的高效生产。另一方面，协同表达也有利于实现动态调控，使得产物的生产可以依据细胞的不同代谢状态实时进行调整，从而进一步优化了细胞工厂的生产效率。

Description

糖代谢与脂质代谢协同提高解脂耶氏酵母合成脂肪酸衍生物的产量的应用

技术领域

本发明涉及合成生物学技术领域，特别涉及糖代谢与脂质代谢协同提高解脂耶氏酵母合成脂肪酸衍生物的产量的应用。

背景技术

中长链脂肪酸衍生物(C8-C18)——脂肪醇(Fatty alcohol，FOH)，脂肪酸乙酯(fatty acid ethyl ester，FAEE)，特殊脂肪酸(unusual fatty acid)等具有作为表面活性剂，生物柴油，化工原料，营养保健品等多种用途，市场需求日益增长，具有很高的经济价值。

由于脂肪酸类物质是微生物主要储能物质以及生物膜的重要组分，所以大多数细胞天然含有中长链(C16，C18)脂肪酸以及脂酰辅酶A的完整合成路径，其对应的脂肪酸类衍生物的生产主要是通过引入对应的还原酶或修饰酶来实现的。酵母中脂肪醇的生产，主要可以通过两种途径：一种是以细胞内自由脂肪酸(free fatty acid，FFA)为前体物，通过羧酸还原酶(carboxylic acid reductase)还原为脂肪醛，之后所得的醛再通过醇脱氢酶(alcoholdehydrogenases)还原得到脂肪醇。另一种是通过脂酰辅酶A还原酶(fatty acyl-CoA reductase，FAR)直接将胞内脂酰辅酶A一步还原为脂肪醇，并在绝大部分细胞中均展现了十分高效的催化能力。其它底盘细胞也可以通过脂酰ACP为前体合成脂肪醇。Liu等在引入FAR表达的基础上，通过构建“脂肪酸饥饿”策略并结合敲除脂酰ACP硫酯酶(acyl-ACPthioesterases)，成功使得大肠杆菌脂肪醇摇瓶产量达到2.024g/L，代表了目前原核细胞最高脂肪醇产量。在酿酒酵母酵母中，d'Espaux等通过综合不同FAR来源与细胞器定位筛选，碳代谢流“推-拉-堵”改造以及平衡辅因子供给等多种策略，使得其脂肪醇摇瓶产量达到1.2g/L，是目前酿酒酵母中的最高产量。而在2015年，Fillet等通过在产油酵母——圆红冬孢酵母中引入FAR酶，成功实现了摇瓶2g/L的脂肪醇产量，这说明了产油微生物(人们把油脂含量可以达到自身生物量20％以上的微生物称为产油微生物)对于脂肪酸衍生物巨大的合成潜力。

解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)是一种需氧的无致病性的二型性非常规酵母。作为产油微生物)的一种，解脂酵母具有很强的耐受、吸收、同化、贮藏油脂的能力；另一方面，它也是唯一完成完整测序以及具有完整遗传操作手段的产油酵母，被广泛用于生物脂质类产物的生产。目前解脂酵母中脂肪醇的生产主要是通过FAR途径进行的。Wang等通过引入FAR并利用两相发酵方法来减少脂肪醇对于细胞的生长毒性，使得解脂酵母中脂肪醇摇瓶产量达到167mg/L。Xu等在解脂酵母内表达FAR的同时过表达大肠杆菌来源的脂酰辅酶A合成酶(fatty acyl-CoA synthetase，EcfadD)，提高了脂肪醇合成的前体供给，使得摇瓶产量提高至205.4mg/L。在综合3模块优化(优化前体供给，FAR表达与降低内源分解)的策略后，Wang等通过继续优化发酵培养条件，使得解脂酵母发酵罐脂肪醇产量达到690mg/L。

虽然解脂酵母中已经能够合成出脂肪醇，并在结合传统代谢工程的改造后产量有了十分明显的提高，但是其产量还远远达不到工业应用的要求。现有的这些研究大多着眼于脂质合成路径本身的改造优化，然而很多研究发现其他代谢路径，像是磷酸戊糖途径，柠檬酸循环，氨基酸合成通路等，也对脂质类产物的合成具有很大影响。这些路径为脂质合成提供原料与辅因子，同时也参与影响胞内代谢信号传递与代谢的全局调控，从而影响对于脂质合成路径的基因表达与代谢通量。

另一方面，目前的代谢工程改造手段大多为稳态的对代谢流进行上下游表达强度的适配(表达强度不随发酵过程动态调控)。然而，人工细胞工厂合成化学品本身就是一个动态的过程。细胞生长速度、碳源利用速率、中间代谢物和产物浓度，都是一个随时间或发酵过程不断在动态改变的过程。即使是在连续培养或者两项发酵的条件下，外界发酵条件也不可能完美的控制一成不变。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了糖代谢与脂质代谢协同提高解脂耶氏酵母合成脂肪酸衍生物的产量的应用。本发明提供了协同相关代谢路径来提高脂肪醇生产的方法。协同脂肪醇与糖代谢路径的表达可以实现脂质产物生产与其他相关路径的平衡与协调从而促进细胞代谢的合理分配提高脂质合成效率。本发明通过实验发现当协同糖酵解与脂质产物生产路径时，可以实现有效的“拉-推”效应，既脂质产物生产会拉动糖酵解表达上调，而糖酵解可以协同的进一步促进脂质产物合成基因的表达，从而大大的提高了整体代谢通量，实现了脂质类产物的高效生产。另一方面，协同表达也有利于实现动态调控，使得产物的生产可以依据细胞的不同代谢状态实时进行调整，从而进一步优化了细胞工厂的生产效率。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了糖代谢与脂质代谢协同提高解脂耶氏酵母合成脂肪酸衍生物的产量的应用。

在本发明的一些具体实施方案中，所述脂肪酸衍生物包括脂肪醇、脂肪酸乙酯和/或特殊脂肪酸；所述特殊脂肪酸包括蓖麻油酸。

本发明还提供了重组质粒，包括整合载体以及如下所示的核苷酸序列中的任意一项：

Ⅰ、具有SEQ ID NO:1、62或63所示的核苷酸序列；或

Ⅱ、具有SEQ ID NO:1、62或63所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；或

III、与SEQ ID NO:1、62或63所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；或

IV、如Ⅰ、Ⅱ或III所示序列的互补序列。

在本发明的一些具体实施方案中，所述重组质粒还包括常表达启动子或糖酵解基因启动子。

所述常表达启动子为P_FBAin、P_HP8d、P_TEFin、P_HP4d、P_HK、P_PGI、P_PFK、P_GAPDH、P_PGK、P_GPD1、P_GUT2、P_PGM、P_ENO1或P_PYK；；

所述糖酵解基因包括果糖二磷酸醛缩酶基因FBA、己糖激酶基因HK、磷酸己糖异构酶基因PGI、磷酸果糖激酶基因PFK、3磷酸-甘油醛脱氢酶基因GAPDH、磷酸甘油酸激酶基因PGK、3磷酸-甘油脱氢酶(NAD)基因GPD1、3磷酸-甘油脱氢酶基因GUT2、磷酸甘油酸变位酶基因PGM、烯醇化酶基因ENO1或丙酮酸激酶基因PYK。

在上述研究的基础上，本发明还提供了解脂酵母菌株，转化有所述的重组质粒。

本发明还提供了过表达FAR、敲除脂肪酸衍生物相关转化降解基因、敲除脂肪酸衍生物合成前体脂酰辅酶A的消耗基因或扰动脂质合成通路的相关调控因子或其突变型在提高解脂耶氏酵母合成脂肪酸衍生物的产量的应用。

在本发明的一些具体实施方案中，所述脂肪酸衍生物相关转化降解基因包括PXA1、ANT1、POT1、MFE1、PEX10、ADH1或ADH3；

所述脂肪酸衍生物合成前体脂酰辅酶A的消耗基因包括DGA1、SCT1、DGK1、LRO1、ARE2或ARE1；

所述脂质合成通路的相关调控因子为RPD3或MGA2；所述突变型为MGA2(G643R)。

本发明还提供了重组质粒，包括整合载体以及过表达的FAR、敲除了脂肪酸衍生物相关转化降解基因、敲除了脂肪酸衍生物合成前体脂酰辅酶A的消耗基因或扰动脂质合成通路的相关调控因子或其突变型。

本发明还提供了解脂酵母菌株，转化有所述的重组质粒。

本发明还提供了所述的解脂酵母菌株在合成脂肪酸衍生物中的应用。

在本发明的一些具体实施方案中，所述合成脂肪酸衍生物的发酵培养基中碳源的浓度至少为45.5g/L。

在上述研究基础上，本发明还提供了发酵生产脂肪酸衍生物的方法，其特征在于，挑取如权利要求5或10所述的解脂酵母菌株培养，收集发酵液。

所述脂肪酸衍生物包括脂肪醇、脂肪酸乙酯和/或特殊脂肪酸；所述特殊脂肪酸包括蓖麻油酸。

在本发明的一些具体实施方案中，所述培养采用的培养基中碳源的浓度至少为45.5g/L。

实验证明，分别利用强常表达启动子P_TEFin与P_Hp8d在解脂耶氏酵母中表达海杆菌来源的FAR所得重组菌株JLFL-1(P_TEFin-FAR)与JLFL-2(P_Hp8d-FAR)均成功实现脂肪醇的生产。然后二者产量差别较大，如图1A。这说明FAR的表达情况对于解脂耶氏酵母中合成脂肪醇影响很大。

转录组结果表明，不同的产醇菌株内源基因的表达差异很大(图1B)，对这些较大表达差异的基因进行代谢路径归类，发现有相当多糖代谢路径的基因变化很大(图1C)，而且发现糖酵解的关键基因以及周围相关基因都明显上调了(图1D)。作为内源脂质合成的直接上游路径，糖酵解在脂肪醇高产菌株中被“拉”动上调并不奇怪。由此我们受到启发，若是能够将上调的糖酵解路径与产醇路径协同起来，利用上调的糖酵解去进一步“推”动产醇，形成自循环的“拉-推”效应，那么就可以更好的提高脂肪醇的生产。

在利用不同的糖酵解基因启动子去调控FAR的表达后(图2A)，可以看出大部分重组菌株均达到了与强常表达启动子产醇菌株JLFL-1与JLFL-2相近的脂肪醇产量。不仅如此，利用果糖二磷酸醛缩酶基因(fructose-1,6-biphosphate aldolase，FBA)启动子表达FAR的重组菌株JLFL-13(P_FBAin-FAR)摇瓶产量达到了557mg/L，分别是对照菌株JLFL-1和JLFL-2产量的116和4倍。这个结果初步证实了利用糖代谢协同产醇表达的策略有效性。

从图3A结果可以看出，无论何种C/N在碳源浓度加倍之后，协同菌株JLFL-13的脂肪醇产量均显著增长了2倍以上。在C/N为17的YPDx2培养基中，产量更是增长了2.75倍。而非协同菌株JLFL-1和JLFL-2在同等条件下产量仅增加为1.34和1.28倍(图3B)。我们推测正是由于碳源浓度的增加进一步激活了糖酵解路径基因的表达，这就同时推动了协同菌株产醇基因的表达增加，进而推动了其产醇合成。而在非协同菌株中，由于产醇基因受常启动子控制，因而无法与糖酵解路径偶联，故而就无法被进一步推动了。

如图4A中矩形所示，对于高产醇菌株，无论是协同高产的JLFL-13，还是非协同高产菌株JLFL-2，其糖酵解相关基因的表达均明显上调，这说明产醇确是对糖酵解有明显的“拉”动作用。

而协同菌株JLFL-13相比非协同的JLFL-2其脂肪醇合成通路相关基因额外明显提高了(图4B矩形)，这表明协同的产醇菌种中，脂肪醇路径的相关基因还会额外的收到一个“推”动作用，表达被上调。

另一方面，图4中圆圈显示，当外界碳源浓度增加后，非协同的JLFL-2菌株糖代谢与脂肪醇合成代谢基因表达并没有显著差异，而协同菌株JLFL-13中不论是糖代谢还是脂肪醇合成代谢其主干基因都明显提高了表达。这说明糖浓度增加上调的糖酵解路径确实可以协同的“推”动脂肪醇的合成，同时被“推”动的脂肪醇也进一步“拉”动了糖酵解。

为了进一步表征这种“拉-推”效应，我们还测定了不同菌株FAR与FBA基因的表达变化情况。从图4A插图中，我们可以看出非协同菌株由于FAR基因受常启动子的表达，所以表达量保持相对稳定。而协同菌株FAR的表达则随着FBA基因的表达持续动态增强(图4B插图)。这说明利用P_FBAin启动子调控FAR的表达可以实现产醇的动态调控，从而进一步增强产醇效率。

为了进一步提高解脂脂肪醇的产量，我们也通过经典的代谢工程改造来优化脂质合成的代谢通量(图5A)。首先我们利用CRISPR-Cas9系统将有关脂肪醇相关转化降解基因(PXA1,ANT1,POT1,MFE1,PEX10,ADH1与ADH3)以及其合成前体脂酰辅酶A的消耗基因(DGA1,SCT1,DGK1,LRO1,ARE2与ARE1)进行敲除，并将这些缺陷型底盘细胞与糖协同的产醇模块进行适配。同时我们也对脂质合成通路的一些相关调控因子(RPD3,MGA2与它的突变型MGA2(G643R))进行了扰动。结果如图5B所示，三种策略均成功的提高了脂肪醇的产量，并且效果相差不是很多(产量增加1.5～2倍左右)，与是便选择其中产量较高的菌株一同进行后续优化改造(图5B中*标记)。

接下来我们围绕着脂质合成通路的限速步骤——丙二酰辅酶A的生成步骤——进行优化。催化该步的限速酶是乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase，ACC1)。考虑到有研究报道说，过表达9位脱氢酶(△9-fatty acid desaturase，OLE1)可以减少中间物饱和脂酰辅酶A对ACC1的反馈抑制，所以我们同时应用了直接过表达ACC1与过表达OLE1的方式，来增强脂肪醇的生产。结果如图5C所示，菌株JLFL-46(在菌株JLFL-24基础上过表达OLE1基因)取得了最高产量，摇瓶产量达到了5.76g/L，是目前所报道的微生物脂肪醇摇瓶最高产量。

在相同条件下，协同菌株JLRA-3相比非协同菌株JLRA-2其蓖麻油酸产量增加到3倍。

在相同条件下，协同菌株JLEE-3相比非协同菌株JLEE-1与JLEE-2其脂肪酸乙酯产量增加到2倍。

本发明提供了协同相关代谢路径来提高脂肪醇生产的方法。协同脂肪醇与其他路径的表达可以实现脂质产物生产与其他相关路径的平衡与协调从而促进细胞代谢的合理分配提高脂质合成效率。本发明通过实验发现当协同糖酵解与脂质产物生产路径时，可以实现有效的“拉-推”效应，既脂质产物生产会拉动糖酵解表达上调，而糖酵解可以协同的进一步促进脂质产物合成基因的表达，从而大大的提高了整体代谢通量，实现了脂质类产物的高效生产。另一方面，协同表达也有利于实现动态调控，使得产物的生产可以依据细胞的不同代谢状态实时进行调整，从而进一步优化了细胞工厂的生产效率。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示实施例1中不同产醇菌株的转录组分析对比；(A)不同产醇菌株JLFL-1(PTEFin-FAR)与JLFL-2(PHp8d-FAR)的摇瓶产量；(B)二者转录组基因对比火山图；(C)KEGG代谢路径聚类分析，说明变化基因数目最多的是糖代谢；(D)糖酵解关键基因以及相关基因均明显上调；

图2示实施例2中利用糖酵解相关基因启动子表达FAR，去协同促进产醇，实现“拉-推”效应；(A)具体糖酵解相关基因与FAR协同代谢示意图；(B)不同糖酵解相关启动子产醇结果图；

图3示实施例3中，通过增加培养基碳源浓度，进一步增加糖酵解协同的“推”动力；(A)增加培养基中葡萄糖浓度配合不同氮源比例对于协同产醇菌株的影响；(B)增加培养基葡萄糖浓度对于协同产醇与非协同产醇菌株的产量影响对比；

图4示实施例4中非协同高产菌株JLFL-2(PHp8d-FAR与协同高产菌株JLFL-13(PFBAin-FAR)相较于低产菌株JLFL-1(PTEFin-FAR)在不同碳源浓度培养条件下的糖酵解相关基因(A)与脂肪醇合成通路基因(B)表达对比；矩形以及圆圈内的颜色表示基因表达的变化情况，由蓝到红依程度表示减弱到增强；插图为基因FBA与FAR的实时定量荧光PCR相对结果，显示了这两个基因在不同种类菌株中随发酵过程的变化情况；

图5示实施例5中通过结合改造脂质路径结构基因以及调控基因进一步增强脂肪醇产量；(A)脂肪醇合成相关改造基因路径示意图；(B)通过敲除脂酰辅酶A以及脂肪醇转化降解路径基因以及扰动脂质路径调控因子增强脂肪醇产量，*选作后续进一步改造出发菌株；(C)进一步改善脂质合成限速步骤来增强脂肪醇生产；

图6示实施例6与例7中通过应用协同糖代谢方法增加解脂酵母蓖麻油酸(Ricinoleic acid，RA)以及乙酸乙酯(fatty acid ethyl ester，FAEE)的合成；(A)应用糖酵解协同增加脂肪酸衍生物的路径示意图；(B)非协同菌株JLRA-2(PHp8d-FAH12)与协同菌株JLRA-3(PFBAin-FAH12)RA产量对比；(C)非协同菌株JLEE-1(PTEFin-AtfA)，JLEE-2(PHp8d-AtfA)与协同菌株JLEE-3(PFBAin-AtfA)FAEE产量对比图。

具体实施方式

本发明公开了糖代谢与脂质代谢协同提高解脂耶氏酵母合成脂肪酸衍生物的产量的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的糖代谢与脂质代谢在协同提高解脂耶氏酵母合成脂肪酸衍生物的产量的应用中所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1：构建不同产醇解脂酵母菌株，并利用转录组比较确定主要响应路径

实验材料：

1.基因

1)FAR：脂酰辅酶A还原酶，来源于海杆菌(Marinobacter aquaeolei VT8)，按照解脂耶氏酵母进行密码子优化，优化后的编码FAR的DNA具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，在金斯瑞Genscript公司合成基因。

2.基因表达载体信息

整合质粒PUC57-IntF-HUM合成自金斯瑞Genscript公司。

整合质粒PUC57-RS8d-HUM合成自金斯瑞Genscript公司。

3.基因操作所需试剂

1)酵母转化试剂盒Frozen EZ Yeast Transformation Kit II(Zymo ResearchCorporation)购自北京天漠科技开发有限公司；

2)KOD FX DNA聚合酶和dNTP(2.0mM each)购自Toyobo上海有限公司

3)限制性内切酶和T4DNA连接酶购自Fermentas(Thermo Fisher,USA)；

4)普通质粒小提试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、普通DNA产物纯化试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。

4.内标和有机溶剂

十九醇(1454-84-8-5G，99％)和乙酸乙酯(产品编号3485，色谱溶剂99.7％)购自SIGMA-ALDICH公司(St.Louis，MO，USA)；内标均用色谱纯无水乙醇(天津市天昊化工有限公司)溶解配制。

5.培养基配置所需试剂

1)葡萄糖·H₂O(纯度99％)购自上海生工；

2)酵母提取物和胰蛋白胨购自OXOID(Thermo Fisher,USA)；

3)LB培养基中无机盐购自天津市北方天医化学试剂厂；

4)5-FoA购自大连源叶生物有限公司

5)无氨基酵母氮源购自北京鼎国生物

6.培养基配制

LB液体培养基蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L(固体则加入琼脂粉15g/L)。根据需要，添加的抗生素浓度为：氨苄霉素100μg/mL、卡纳霉素50μg/mL。

YPD培养基蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，葡萄糖·45.5g/L。pH值用NaOH调节为6左右。SD营养缺陷型筛选固体培养基：20g/L葡萄糖、6.7g/L无氨基酵母氮源、2g/L缺失相应氨基酸的混合氨基酸粉末(具体配方参考[美]D.C.安伯格等的酵母遗传学方法试验指南)、20g/L琼脂粉，pH＝6.5。

实验方法：

1.本发明的生产脂肪醇的重组解脂酵母菌株的初步构建方法如下：

1)底盘菌株的准备

取Yarrowia lipolytica ATCC 201249新鲜单菌落划线于YPD平板，28℃培养2～3天

2)外源产醇基因模块重组片段的构建

将经过密码子优化后合成的FAR基因片段(两侧含有BsaI酶切位点)与合成的相应整合载体PUC57-IntF-HUM或者PUC57-RS8d-HUM分别用BsaI或者BsmbI内切酶(视载体内部酶切位点而定)进行酶切，然后连接重组，重组后质粒利用菌落PCR进行筛选，最终得到PUC57-IntF-FAR和PUC57-RS8d-FAR重组质粒。

3)产醇重组菌株JLFL-1(P_TEFin-FAR)与JLFL-2(P_Hp8d-FAR)的构建(解脂酵母整合片段的转化)

将重组质粒利用NotI酶切，去掉大肠扩增质粒部分，保留重组片段，然后取预先活化的酵母平板上单菌落于3mlYPD液体培养基中，250rpm下28℃培养过夜。之后以0.4OD的初始浓度转接3ml新鲜YPD培养基培养4～5h至OD值0.8～1左右。离心并利用无菌术清洗细胞，利用Frozen EZ Yeast Transformation Kit II试剂盒将2ug回收片段转化入细胞，并涂布对应营养缺陷型的SD培养基，28℃培养2～3天至形成明显菌落。之后利用KOD FX DNA聚合酶进行酵母菌落PCR筛选出成功的整合菌株，于新YPD平板上划线分纯，以便后续发酵验证。

2.摇瓶发酵比较JLFL-1(P_TEFin-FAR)与JLFL-2(P_Hp8d-FAR)的脂肪醇产量

1)脂肪醇摇瓶发酵过程

取新鲜划线的待发酵菌株接菌于5mlYPD培养基中，28℃250rpm过夜培养至对数中期，然后以0.2初始OD转接50mlYPD培养基于250ml摇瓶内，28℃250rpm培养72h后，取发酵液进行提取检测。

2)发酵液提取过程：

(1)取发酵72h的培养基0.5mL，加入终浓度50～500mg/L(依照具体产量确定)十九醇作为内标；

(2)加入0.5mL的乙酸乙酯，约0.1ml石英砂，漩涡震荡20min，15000rpm离心15min；

(3)吸取上层有机相，用0.22μm尼龙膜过滤。进样前将样品保存在-80℃冰箱中。

3)实验中涉及的气质联用系统为Waters GCT Premier MICROMASS系统，其中包括：

(1)Agilent 7683自动进样器

(2)Agilent 6890气相色谱(GC，Agilent Technologies，USA)

(3)飞行时间质谱仪(TOF-MS，Waters Corp.，USA)

(4)J&W DB-5毛细管石英柱(30m length，I.D.0.25mm，Film 0.25μm，AgilentTechnologies，USA)

GC条件如下：采用DB-5气相色谱柱，进样量为1μL，采用柱后分流技术，分流比为2:1。进样口温度为280℃，GC interface温度为280℃。高纯氦为载气，91Kpa恒压。色谱分离的升温程序如下：初始温度70℃，保持1min，分别以15℃·min^-1、8℃·min^-1、20℃·min^-1的速度升到140℃、220℃、280℃，并在140℃和280℃分别保持1min和3min。

质谱条件如下：质谱电离方式为正离子模式的电轰击电离(EI+)，其电离电压为70eV，源温保持在250℃。质谱的扫描范围为50-800m/z，扫描速度为2scan·s-1。

4)产物的定性和定量分析采用Masslynx软件(Version 4.1，Waters Corp.，USA)对GC-TOF/MS数据进行定性定量分析。采用NIST数据库(National Institute of Standardand Technology library，NIST，2005，Gaithersburg，MD)识别色谱峰，并用QuanLynx软件对各代谢物峰面积进行自动积分。通过各种物质的总离子流图的峰面积与同一张谱图上内标的峰面积的比值以获得产物的相对浓度值。

5)转录组测定

取新鲜划线的待发酵菌株接菌5mlYPD培养基中，28℃250rpm过夜培养至对数中期，然后以0.2初始OD转接50mlYPD培养基于250ml摇瓶内，28℃250rpm培养72h后，离心收集细胞约100ul，然后液氮保存，后干冰寄送至华大基因公司进行转录组分析检测。

6)转录组结果分析

利用华大BGI线上数据分析平台Dr.Tom上进行样本差异分析以及差异基因的KEGG路径聚类分析。

表1实施例1中的质粒信息

表2实施例1中的菌株信息

实验结果：

分别利用强常表达启动子P_TEFin与P_Hp8d在解脂耶氏酵母中表达海杆菌来源的FAR所得重组菌株JLFL-1(P_TEFin-FAR)与JLFL-2(P_Hp8d-FAR)均成功实现脂肪醇的生产。然后二者产量差别较大，如图1A。这说明FAR的表达情况对于解脂耶氏酵母中合成脂肪醇影响很大。

表3

实施例2：利用糖酵解启动子协同增强解脂酵母产醇

实验材料：

1.菌株信息：在本实施例中所用的质粒信息请见表4，菌株名称、基因型信息以及来源请见表5。

2.其它基因信息、试剂和培养基等与实施例1中相同。

实验方法：

1.各相关糖酵解启动子重组质粒的构建

利用表5所示引物以解脂酵母ATCC201249基因组为模板将各个糖酵解相关启动子序列扩增下来，并分别与FAR片段和载体PUC57-K8Zero-HUM利用BsaI，BsmbI或者BbsI以及T4连接酶进行GoldenGate基因组装，得到重组质粒PUC57-P1-K8Zero-FAR～PUC57-P11-K8Zero-FAR，之后利用NotI酶切并回收重组片段。

2.重组菌株构建过程与方法与实施例1中相同。

1)底盘菌株的准备

2)外源产醇基因模块重组片段的构建

将经过密码子优化后合成的FAR基因片段(两侧含有BsaI酶切位点)与合成的相应整合载体PUC57-K8zero以及对应的启动子PCR片段分别用BsaI或者BsmbI内切酶进行酶切，然后GoldenGate连接组装，重组后质粒利用菌落PCR进行筛选，最终得到带有不同糖酵解基因启动子的FAR重组质粒。

3)产醇重组菌株JLFL-3～13的构建(解脂酵母整合片段的转化)

3.将转化了各质粒的菌株进行发酵，方法过程同实施例1。

4.产物的提取，方法过程同实施例1。

5.产物的检测，方法过程同实施例1。

1)脂肪醇摇瓶发酵过程

2)发酵液提取过程：

(1)Agilent 7683自动进样器

(2)Agilent 6890气相色谱(GC，Agilent Technologies，USA)

(3)飞行时间质谱仪(TOF-MS，Waters Corp.，USA)

GC条件如下：采用DB-5气相色谱柱，进样量为1μL，采用柱后分流技术，分流比为2:1。进样口温度为280℃，GC interface温度为280℃。高纯氦为载气，91Kpa恒压。色谱分离的升温程序如下：初始温度70℃，保持1min，分别以15℃·min-1、8℃·min-1、20℃·min-1的速度升到140℃、220℃、280℃，并在140℃和280℃分别保持1min和3min。

表4实施例2中所用质粒信息

表5实施例2中的菌株信息

表6实施例2中各启动子扩增所需引物

实验结果：

表7

实施例3：增加培养基碳源浓度进一步“推”动协同菌株产醇

实验材料：

菌株信息、试剂等与实施例1、2中相同。

培养基除例1中涉及的YPD培养基(为了方便区分，这里将例1中培养基标记为YPDx1)外，还配置了葡糖糖加倍的YPDx2培养基。YPDx2培养基主要成分如图3A所示。

实验方法：

1.首先将JLFL-13菌株按照图3A各培养基进行发酵，并确定YPDx2培养基最佳N源配比。

2.将JLFL-1，JLFL-2和JLFL-13分别在优化后的YPDx2与YPDx1培养基中进行对比发酵，方法过程同实施例1。

3.产物的提取，方法过程同实施例1。

4.产物的检测，方法过程同实施例1。

具体来说

1)脂肪醇摇瓶发酵过程

取新鲜划线的待发酵菌株接菌于5mlYPD培养基中，28℃250rpm过夜培养至对数中期，然后以0.2初始OD转接50mlYPD or YPDx2培养基于250ml摇瓶内，28℃250rpm培养72h(YPD)or 120h(YPDx2)后，取发酵液进行提取检测。

2)发酵液提取过程：

(1)取发酵72h or 120h的培养基0.5mL，加入终浓度50～500mg/L(依照具体产量确定)十九醇作为内标；

(1)Agilent 7683自动进样器

(2)Agilent 6890气相色谱(GC，Agilent Technologies，USA)

(3)飞行时间质谱仪(TOF-MS，Waters Corp.，USA)

实验结果：

表8

实施例4：转录分析证明协同糖酵解实现动态“拉-推”效应提高产醇

实验材料：

菌株信息、试剂和培养基等与实施例3中相同。

实验方法：

1.转录组培养检测方法与例1中相同。

2.RT-qPCR方法为将发酵转接后0h24h48h60h72h96h各取样点发酵液离心收集约100ul细胞，然后液氮保存，样品送至北京爱普拜生物公司进行RT-qPCR分析，内参基因选择ACT1(YALI0D08272g)，各检测基因引物见表9。

表9实施例4中RT-qPCR所需引物

实验结果：

表10

实施例5：通过结合改造脂质路径结构基因以及调控基因进一步增强脂肪醇产量

实验材料：

质粒信息，菌株信息请见表11与表12。

试剂和培养基等与实施例1中相同。

实验方法：

1.利用CRISPR-Cas9系统敲除目标基因

1)gRNA片段的构建

利用NCBI解脂酵母基因组信息确定目标基因内部PAM序列NGG前20bp seed序列，然后利用引物oligo对应合成正反向互补的双链gRNA序列(两侧添加固定4bp保守序列切口)。对应的各个引物见表13。

a.Spacer-for:5’-ACGT NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’

b.Spacer-rev:5’-AAAC NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’

然后，将100uM的引物溶液各2ul与36ul 30mM的HEPES溶液混合，加热至95℃，以每秒0.1℃的速率煺火降温至4℃，后加入120ul超纯水。

2)敲除质粒的组装

将上述gRNA溶液0.5ul与PMCS-URA质粒100ng，T4连接酶1ul，10xT4连接酶buffer2ul，BbsI内切酶1ul混合并加入超纯水补齐体系至20ul。然后，37℃反应10min，16℃反应10min，重复10次后，将5ul体系转化大肠杆菌，并筛选成功重组gRNA的cas9质粒。

3)目标基因的敲除

将重组好的质粒利用酵母转化试剂盒转入解脂酵母，方法同例1。然后不涂布平板，而是直接加入3ml SD-Ura液体培养基，250rpm 28℃培养96h，然后适当稀释再涂布平板，使其长出单菌落，后通过对单菌落菌株进行菌落PCR测序确定基因敲除结果

2.ACC1和OLE1基因重组的构建方法与实施例1中相同。

1)底盘菌株的准备

2)外源产醇基因模块重组片段的构建

将经过密码子优化后合成的ACC1与OLE1基因片段(两侧含有BsaI酶切位点)与合成的相应整合载体PUC57-IntE-HUM分别用BsaI或者BsmbI内切酶(视载体内部酶切位点而定)进行酶切，然后连接重组，重组后质粒利用菌落PCR进行筛选，最终得到PUC57-IntE-ACC1和PUC57-IntE-OLE1重组质粒。

3)产醇重组菌株JLFL-31～52的构建(解脂酵母整合片段的转化)

将重组质粒利用NotI酶切，去掉大肠扩增质粒部分，保留重组片段，然后取预先活化的酵母平板上单菌落于3mlYPD液体培养基中，250rpm下28℃培养过夜。之后以0.4OD的初始浓度转接3ml新鲜YPD培养基培养4～5h至OD值0.8～1左右。离心并利用无菌术清洗细胞，利用Frozen EZ Yeast Transformation Kit II试剂盒将2ug回收片段转化入对应细胞，并涂布对应营养缺陷型的SD培养基，28℃培养2～3天至形成明显菌落。之后利用KOD FX DNA聚合酶进行酵母菌落PCR筛选出成功的整合菌株，于新YPD平板上划线分纯，以便后续发酵验证。

4)CRISPR敲除质粒的构建

将通过引物的变性和退火得到gRNA dimer，然后将得到的gRNA dimer通过Golden-gate一步组装连入PMCS-gRNA-Ura质粒中。得可表达gRNA的中间质粒。然后用限制性内切酶BsmBI对合成的CRI-part2质粒(含有Cas9基因)酶切，胶收后得到Cas9表达盒片段，同时利用BamHI和HindIII限制性内切酶对得到的中间质粒进行双酶切，纯化试剂盒回收后，将得到的Cas9片段与酶切过的中间质粒连接，最终得到可同时表达Cas9蛋白与相应gRNA的敲除质粒。

5)将敲除质粒转化入相应菌株，孵育2.5～3h之后，需要吸取200μL的混合液转入含有4mL SC-Ura液体培养基的试管中，而不是直接涂板。28℃，250rpm摇床培养4天，然后对将菌液稀释5至10万倍，再取200μL涂SC-Ura平板。将平板置于28℃培养箱培养，两到三天后，菌落长出，挑选单菌落，PCR送测确定相应基因是否敲除。

3.各重组菌株进行发酵，方法过程同实施例1。

4.产物的提取，方法过程同实施例1。

5.产物的检测，方法过程同实施例1。

具体来说

1)脂肪醇摇瓶发酵过程

取新鲜划线的待发酵菌株接菌于5mlYPD培养基中，28℃250rpm过夜培养至对数中期，然后以0.2初始OD转接50mlYPDx2培养基于250ml摇瓶内，28℃250rpm培养120h后，取发酵液进行提取检测。

2)发酵液提取过程：

(1)取发酵120h的培养基0.5mL，加入终浓度50～500mg/L(依照具体产量确定)十九醇作为内标；

(1)Agilent 7683自动进样器

(2)Agilent 6890气相色谱(GC，Agilent Technologies，USA)

(3)飞行时间质谱仪(TOF-MS，Waters Corp.，USA)

表11实施例5中的质粒信息

表12实施例5中的菌株信息

表13实施例5中各gRNA构建所需引物

实验结果：

表14

表15

实施例6：利用协同糖代谢方法改善蓖麻油酸生产

实验材料：

质粒信息，菌株信息详见表16，表17。

试剂和发酵培养基等与实施例3中YPDx2相同。

基因FAH12：12位羟化酶，来源于蓖麻(Ricinus communis)，按照解脂耶氏酵母进行密码子优化，优化后的编码FAH12的DNA具有如SEQ ID No.62所示核苷酸序列，在金斯瑞Genscript公司合成基因。

实验方法：

1.JLRA-2与JLRA-3的构建方法和质粒信息与实施例1JLFL-2与实施例3中JLFL-13相同。

1)底盘菌株的准备

2)外源产醇基因模块重组片段的构建

将经过密码子优化后合成的FAH12基因片段(两侧含有BsaI酶切位点)与合成的相应整合载体PUC57-RS8d-HUM分别用BsaI或者BsmbI内切酶(视载体内部酶切位点而定)进行酶切，然后连接重组，重组后质粒利用菌落PCR进行筛选，最终得到重组质粒PUC57-RS8d-FAH12。

将经过密码子优化后合成的FAH12基因片段(两侧含有BsaI酶切位点)与合成的相应整合载体PUC57-K8zero以及对应的FBAin启动子PCR片段分别用BsaI或者BsmbI内切酶进行酶切，然后Golden Gate连接组装，重组后质粒利用菌落PCR进行筛选，最终得到重组质粒PUC57-P4-K8Zero-FAH12。

3)产醇重组菌株JLRA-2与JLRA-3的构建(解脂酵母整合片段的转化)

2.发酵方法与实施例3中YPDx2发酵方法相同。

3.产物的提取，方法过程前面同实施例1，内标由十九醇改为十七酸，并在之后需要N气吹干后加入0.5ml MSTFA 37℃过夜衍生化。

4.产物的检测，方法过程同实施例1。

具体来说：

1)摇瓶发酵过程

2)发酵液提取过程：

(1)取发酵120h的培养基0.5mL，加入终浓度50～500mg/L(依照具体产量确定)十七酸作为内标；

(3)吸取上层有机相，N气吹干后加入0.5ml MSTFA 37℃过夜衍生化，用0.22μm尼龙膜过滤。进样前将样品保存在-80℃冰箱中。

(1)Agilent 7683自动进样器

(2)Agilent 6890气相色谱(GC，Agilent Technologies，USA)

(3)飞行时间质谱仪(TOF-MS，Waters Corp.，USA)

表16实施例6中的质粒信息

表17实施例6中的菌株信息

实验结果：

表18

实施例7：利用协同糖代谢方法改善脂肪酸乙酯的生产

实验材料：

质粒信息，菌株信息详见表19，表20。

试剂和发酵培养基等与实施例1中相同。

基因AtfA：ADP1蜡酯合成酶，来源于贝氏不动杆菌(Acinetobacter baylyi)，按照解脂耶氏酵母进行密码子优化，优化后的编码AtfA的DNA具有如SEQ ID No.63所示核苷酸序列，在金斯瑞Genscript公司合成基因。

实验方法：

5.JLEE-1，JLEE-2与JLEE-3的构建方法和质粒信息与实施例1中JLFL-1，JLFL-2与实施例3中JLFL-13相同。

1)底盘菌株的准备

取Yarrowia lipolytica ATCC 201249新鲜单菌落划线于YPD平板，28℃培养2～3天。

2)外源产醇基因模块重组片段的构建

将经过密码子优化后合成的AtfA基因片段(两侧含有BsaI酶切位点)与合成的相应整合载体PUC57-IntF-HUM或者PUC57-RS8d-HUM分别用BsaI或者BsmbI内切酶(视载体内部酶切位点而定)进行酶切，然后连接重组，重组后质粒利用菌落PCR进行筛选，最终得到PUC57-IntF-AtfA和PUC57-RS8d-AtfA重组质粒。

将经过密码子优化后合成的AtfA基因片段(两侧含有BsaI酶切位点)与合成的相应整合载体PUC57-K8zero以及对应的FBAin启动子PCR片段分别用BsaI或者BsmbI内切酶进行酶切，然后Golden Gate连接组装，重组后质粒利用菌落PCR进行筛选，最终得到重组质粒PUC57-P4-K8Zero-AtfA。

3)产醇重组菌株JLEE-1～3的构建(解脂酵母整合片段的转化)

6.发酵方法与实施例1中基本相同，只是需要再转接摇瓶后72h加入5％终浓度的无水乙醇。

7.产物的提取，方法过程前面同实施例1，内标由十九醇改为十五酸乙酯。

8.产物的检测，方法过程同实施例1。

具体来说：

1)摇瓶发酵过程

取新鲜划线的待发酵菌株接菌于5mlYPD培养基中，28℃250rpm过夜培养至对数中期，然后以0.2初始OD转接50mlYPD培养基于250ml摇瓶内，28℃250rpm培养,24h后加入5％乙醇，与72h结束发酵，取发酵液进行提取检测。

2)发酵液提取过程：

(1)取发酵72h的培养基0.5mL，加入终浓度50～500mg/L(依照具体产量确定)十五酸乙酯作为内标；

(1)Agilent 7683自动进样器

(2)Agilent 6890气相色谱(GC，Agilent Technologies，USA)

(3)飞行时间质谱仪(TOF-MS，Waters Corp.，USA)

表19实施例7中的质粒信息

表20实施例7中的菌株信息

实验结果：

表21

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 天津大学

<120> 糖代谢与脂质代谢协同提高解脂耶氏酵母合成脂肪酸衍生物的产量的应用

<130> MP1900152

<160> 63

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1542

<212> DNA

<213> FAR(FAR)

<400> 1

atggccatcc agcaggtgca ccacgctgac acctcttcct ctaaggtcct gggtcagctg 60

cgaggcaagc gagtgctgat taccggcacc accggattcc tgggcaaggt ggtcctggag 120

cgactgatcc gagccgtccc cgacatcggc gctatctacc tgctgattcg aggaaacaag 180

cgacaccccg acgcccgatc ccgattcctg gaggagatcg ctacctcctc tgtgttcgac 240

cgactgcgag aggccgactc tgagggtttc gacgctttcc tggaggagcg aatccactgt 300

gtcaccggag aggtgaccga ggctggtttc ggaattggtc aggaggacta ccgaaagctg 360

gccaccgagc tggacgctgt cattaactcc gccgcttctg tgaacttccg agaggagctg 420

gacaaggccc tggctatcaa caccctgtgt ctgcgaaaca ttgccggaat ggtcgacctg 480

aaccccaagc tggctgtgct gcaggtgtct acctgctacg tgaacggaat gaactccggt 540

caggtcaccg agtctgtgat caagcctgct ggagaggctg tccctcgatc tcccgacggt 600

ttctacgaga tcgaggagct ggtccgactg ctgcaggaca agattgagga cgtgcaggcc 660

cgatactccg gcaaggtcct ggagcgaaag ctggtggacc tgggtattcg agaggctaac 720

cgatacggct ggtctgacac ctacaccttc accaagtggc tgggcgagca gctgctgatg 780

aaggccctga acggacgaac cctgaccatc ctgcgaccct ccatcattga gtctgctctg 840

gaggagcctg ctcctggttg gattgaggga gtgaaggtcg ccgacgctat cattctggcc 900

tacgctcgag agaaggtgac cctgttcccc ggcaagcgat ccggcatcat tgacgtgatc 960

cccgtcgacc tggtggccaa ctccatcatt ctgtctctgg ctgaggctct gggagagcct 1020

ggacgacgac gaatctacca gtgttgctcc ggcggaggta accccatctc tctgggagag 1080

ttcattgacc acctgatggc cgagtccaag gctaactacg ccgcttacga ccacctgttc 1140

taccgacagc cctctaagcc cttcctggcc gtcaaccgag ctctgttcga cctggtcatc 1200

tccggagtgc gactgcccct gtctctgacc gaccgagtgc tgaagctgct gggtaactcc 1260

cgagatctga agatgctgcg aaacctggac accacccagt ctctggccac catcttcgga 1320

ttctacaccg ctcccgacta cattttccga aacgacgagc tgatggccct ggctaaccga 1380

atgggagagg tcgacaaggg tctgttcccc gtggacgccc gactgatcga ctgggagctg 1440

tacctgcgaa agattcacct ggccggcctg aaccgatacg ctctgaagga gcgaaaggtg 1500

tactctctga agaccgcccg acagcgaaag aaggccgctt aa 1542

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggtctccgct ttgcaacaaa gagaggtgtg gg 32

<210> 3

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggtctcccca ttgttgcggt agagaaatgc agtag 35

<210> 4

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgtctccgct tgaatgatta cagataatga tttatgattc aac 43

<210> 5

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgtctcccca ttgtgtttgt gtgttggtgt gtcttc 36

<210> 6

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggtctccgct tggtgtactg ttcgtacagg tcgg 34

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggtctcccca ttgtcggtgt tttgaagcgc 30

<210> 8

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggtctccgct taacagtgta cgcagtacta tagaggaac 39

<210> 9

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ggtctcccca tctgggttag tttgtgtaga gagtgtgtg 39

<210> 10

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggtctccgct tcgcagtagg atgtcctgca cg 32

<210> 11

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggtctcccca ttgttgatgt gtgtttaatt caagaatg 38

<210> 12

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gaagactcgc tttgtgtagt tgtgtagatg tgtatggttc g 41

<210> 13

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gaagactccc attttcgtcg gaagagatcg gagag 35

<210> 14

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ggtctccgct ttgatggaat taaaccgaaa tggc 34

<210> 15

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ggtctcccca tgttatgggg atgcgatctc ttatatc 37

<210> 16

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ggtctccgct tgcaggggtt ccagctcctg ag 32

<210> 17

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ggtctcccca tttgtttggg gtggtgggta gg 32

<210> 18

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ggtctccgct tggcacagca ggcacccttg 30

<210> 19

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ggtctcccca tttttgtatg tgttttggtg atgtcacg 38

<210> 20

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ggtctccgct tctagagtcc agcttcccgg aag 33

<210> 21

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ggtctcccca tggtgataaa tgtgtggtta gacggg 36

<210> 22

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

cgtctccgct tcaattcccc tcgtctacac gc 32

<210> 23

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

cgtctcccca ttgtaactgt ggtgtgaatt tctccg 36

<210> 24

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

ctccatcaag gtcaagat 18

<210> 25

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

taccaagaga agcaagaa 18

<210> 26

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

tggacgacga cgaatcta 18

<210> 27

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

aggtggtcaa tgaactctc 19

<210> 28

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

cgcaatccat cagcaatc 18

<210> 29

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

ataacgaggg caacagtt 18

<210> 30

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

acgtggccgc cggcaagttc gacc 24

<210> 31

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

aaacggtcga acttgccggc ggcc 24

<210> 32

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

acgtcatgaa cagcgtcgtc aagc 24

<210> 33

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

aaacgcttga cgacgctgtt catg 24

<210> 34

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

tgtgggtctc aagatgaacc gac 23

<210> 35

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

tcttccagcc gtcggttcat c 21

<210> 36

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

acgtcggtat caagtggatc aaca 24

<210> 37

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

aaactgttga tccacttgat accg 24

<210> 38

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

acgtactccc atcgagctgc tcct 24

<210> 39

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

aaacaggagc agctcgatgg gagt 24

<210> 40

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

acgtcttctc gtggccaagc tcga 24

<210> 41

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

aaactcgagc ttggccacga gaag 24

<210> 42

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

acgtccatca cgcaaagaaa tccg 24

<210> 43

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

aaaccggatt tctttgcgtg atgg 24

<210> 44

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

aaacgacaca acctgtgaat cgga 24

<210> 45

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

acgttccgat tcacaggttg tgtc 24

<210> 46

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

acgtcctctc attggcggcc acga 24

<210> 47

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 47

aaactcgtgg ccgccaatga gagg 24

<210> 48

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 48

acgtgtcatg tctgctgcat ctac 24

<210> 49

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 49

aaacgtagat gcagcagaca tgac 24

<210> 50

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 50

aaacctgctg gtctttacgg aaac 24

<210> 51

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 51

acgtgtttcc gtaaagacca gcag 24

<210> 52

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 52

acgttgttgc tatcatggct ctgg 24

<210> 53

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 53

aaacccagag ccatgatagc aaca 24

<210> 54

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 54

acgtctgctc aactacacaa acga 24

<210> 55

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 55

aaactcgttt gtgtagttga gcag 24

<210> 56

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 56

acgtcccgtt tctcccagct ctcc 24

<210> 57

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 57

aaacggagag ctgggagaaa cggg 24

<210> 58

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 58

acgtgcccag cccggaaaca tgga 24

<210> 59

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 59

aaactccatg tttccgggct gggc 24

<210> 60

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 60

acgtacgaaa aatcgacgtg ctca 24

<210> 61

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 61

aaactgagca cgtcgatttt tcgt 24

<210> 62

<211> 1437

<212> DNA

<213> FAH12(FAH12)

<400> 62

atgatggcct ctgccacccc cgccatgtct gagaacgccg tgctgcgaca caaggccgcc 60

tctaccaccg gaatcgacta cgagtcctct gccgccgtgt ctcccgccga gtctccccga 120

acctctgcct cttctacctc gctgtcctct ctgtcctccc tggacgccaa cgagaagaag 180

gacgagtacg ccggcctgct ggacacctac ggcaacgcct tcaccccccc tgacttctct 240

atcaaggaca tccgagccgc catccccaag cactgctacg agcgatctac catcaagtct 300

tacgcctacg tgctgcgaga tctgctgtgc ctgtctacca ccttctacct gttccacaac 360

ttcgtgaccc ccgagaacat cccctctaac cccctgcgat tcgtgctgtg gtctatctac 420

accgtgctgc agggcctgtt cgccaccggc ctgtgggtga tcggccacga gtgcggccac 480

tgcgccttct ctccctctcc cttcatctct gacctgaccg gctgggtgat ccactctgcc 540

ctgctggtgc cctacttctc ttggaagttc tctcactctg cccaccacaa gggcatcggc 600

aacatggagc gagacatggt gtttctgccc cgaacccgag agcagcaggc cacccgactg 660

ggccgagccg tcgaggagct gggcgacctg tgcgaggaga ctcccatcta caccgccctg 720

cacctggtgg gcaagcagct gatcggctgg ccctcttacc tgatgaccaa cgctaccggc 780

cacaacttcc acgagcgaca gcgagagggc cgaggcaagg gcaagaagaa cggcttcggc 840

ggaggcgtga accacttcga cccccgatct cccatcttcg aggcccgaca ggccaagtac 900

atcgtgctgt ctgacatcgg cctgggcctg gccattgccg ccctggtgta cctgggcaac 960

cgattcggct gggccaacat ggccgtgtgg tactttctgc cctacctgtg ggtgaaccac 1020

tggctggtgg ctatcacctt cctgcagcac accgacccca ccctgcccca ctacaaccga 1080

gaggagtgga acttcgtgcg aggcggagcc tgcaccatcg accgagatct gggcttcatc 1140

ggccgacacc tgttccacgg aatcgccgac acccacgtgg tgcatcacta cgtgtctcga 1200

atccccttct acaacgccga cgaggcctct gaggctatca agcccatcat gggcaagcac 1260

taccgatctg acaccgctca cggccccgtg ggctttctgc acgccctgtg gaagaccgcc 1320

cgatggtgcc agtgggtcga gccctctgcc gacgctcagg gcgctggcaa gggcatcctg 1380

ttctaccgaa accgaaacaa gctgggcacc aagcccatct ctatgaagac ccagtaa 1437

<210> 63

<211> 1389

<212> DNA

<213> AtfA(AtfA)

<400> 63

atgcgccccc tgcacccaat cgatttcatc ttcctctcgc tggaaaagcg acagcagccc 60

atgcatgtcg gcggtctgtt cctgttccag atccccgaca acgcccccga cacatttatc 120

caggacctgg tgaacgacat tagaatttcc aagtcgatcc ctgtgccgcc ctttaacaac 180

aagctgaacg gcctgttttg ggacgaggat gaggaattcg acctcgacca tcactttcga 240

cacatcgctt tgccccatcc tggtcgaatc cgagaattgc tcatctacat ttcacaggag 300

cattctaccc ttctcgatag agccaagccc ctttggacct gcaacattat cgagggtatt 360

gagggaaacc gattcgcaat gtactttaag atccatcacg ccatggtcga tggagtggca 420

ggcatgagac tgattgagaa gtccctgtca cacgacgtca ccgagaagag cattgtgccc 480

ccttggtgcg tcgagggcaa gcgggctaag cgtttgcgtg agccaaagac cggcaagatc 540

aagaagatta tgtcgggcat taagtcccag ctccaggcca ctcctaccgt gatccaggag 600

ctgtcccaga cagtgttcaa ggacatcgga cgaaaccccg accacgtgtc ctcgtttcag 660

gccccttgct ccattctcaa ccagcgggtt tccagctcca gacgattcgc tgcccagtct 720

tttgaccttg atcggtttcg aaacattgcc aagtcgctta acgtgaccat caacgacgtg 780

gttctggccg tgtgttccgg agcccttcga gcatacctga tgtctcataa ctctctgccc 840

tccaagccac tgattgccat ggtccctgcc agcattcgta acgacgattc tgatgtttct 900

aaccgcatca cgatgatcct ggctaacctc gctacgcaca aggacgatcc cctccagcga 960

ctcgaaatta tccgaagaag cgtgcagaac tccaagcagc ggttcaagcg catgacttct 1020

gaccagattc tgaactactc tgccgtcgtg tacggaccag ctggactgaa catcatttcg 1080

ggaatgatgc ctaagcgaca ggctttcaac ctggttatct ccaacgtccc tggtccccga 1140

gaacctctct actggaacgg agccaagctg gatgccctgt acccggcttc aatcgttctc 1200

gatggtcagg cactgaacat cacaatgacc tcttaccttg acaagttgga ggttggtctg 1260

attgcttgtc ggaacgctct gccgcgaatg cagaacttgc ttactcactt ggaggaagag 1320

attcagctct tcgagggcgt catcgccaag caggaggaca ttaagactgc caacaaggac 1380

gagctgtaa 1389

Claims

1.解脂耶氏酵母（Yarrowia. lipolytica）工程菌株，其特征在于，通过将连接有启动子和FAR基因的重组片段的质粒转化到解脂耶氏酵母中，酶切后将重组片段整合到解脂耶氏酵母基因组中获得；

所述启动子为PFBAin；

所述FAR的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.如权利要求1所述的解脂耶氏酵母工程菌株，其特征在于，进一步敲除了脂肪酸衍生物相关转化降解基因或敲除了脂肪酸衍生物合成前体脂酰辅酶A的消耗基因；

所述敲除的脂肪酸衍生物相关转化降解基因为：ADH1、MFE1、PEX10、同时敲除PEX10和 MFE1；

敲除的脂肪酸衍生物合成前体脂酰辅酶A的消耗基因为：SCT1。

3.如权利要求2所述的解脂耶氏酵母工程菌株，其特征在于，在敲除PEX10的基础上，进一步过表达脂质合成通路相关调控因子ACC1或OLE1；

或同时敲除PEX10和MFE1的基础上，进一步过表达脂质合成通路相关调控因子ACC1和/或OLE1；

或在敲除SCT1的基础上，进一步过表达脂质合成通路相关调控因子ACC1或OLE1。

4.如权利要求1至3任一项所述的解脂耶氏酵母工程菌株在合成脂肪醇中的应用。

5.一种发酵生产脂肪醇的方法，其特征在于，挑取如权利要求1至3任一项所述的解脂酵母工程菌株培养，收集发酵液。

6.解脂耶氏酵母（Yarrowia. lipolytica）工程菌株，其特征在于，通过将连接有启动子和FAH12的重组片段的质粒转化到解脂耶氏酵母中，酶切后将重组片段整合到解脂耶氏酵母基因组中获得；

所述启动子为PFBAin；

所述FAH12的核苷酸序列如SEQ ID NO:62所示。

7.如权利要求6所述的解脂耶氏酵母工程菌株在合成蓖麻油酸中的应用。

8.一种发酵生产蓖麻油酸的方法，其特征在于，挑取如权利要求6所述的解脂酵母工程菌株培养，收集发酵液。

9.解脂耶氏酵母（Yarrowia. lipolytica）工程菌株，其特征在于，通过将连接有启动子和AtfA基因的重组片段的质粒转化到解脂耶氏酵母中，酶切后将重组片段整合到解脂耶氏酵母基因组中获得；

所述启动子为PFBAin；

所述AtfA的核苷酸序列如SEQ ID NO:63所示。

10.如权利要求9所述的解脂耶氏酵母工程菌株在合成脂肪酸乙酯中的应用。

11.一种发酵生产脂肪酸乙酯的方法，其特征在于，挑取如权利要求9所述的解脂酵母工程菌株培养，收集发酵液。