NO326619B1 - Fremgangsmate ved fremstilling av acetyleniske forbindelser ved anvendelse av delta-12-acetylenase, DNA-sekvenser som koder for delta-12-acetylenasen samt organismer transformert med slike DNA-sekvenser. - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for å fremstille acetyleniske forbindelser, spesielt acetyleniske fettsyrer som angitt i krav 1, et cDNA som koder for Crepis alpina delta-12-acetylenase som angitt i krav 3, anvendelsen av nevnte cDNA for å transformere oljeakkumulerende organismer for det formål å fremstille acetyleniske fettsyrer som angitt i krav 4 samt slike oljeakkumulerende organismer i seg selv som angitt i krav 8.

Bakgrunn for oppfinnelsen

Det er stor interesse i verden for fremstilling av kjemisk råmateriale så som fettsyrer til industrielt bruk fra fornybare planteressurser i stedet for fra ikke-fornybare petrokje-miske materialer. Dette konsept har bred appell både for produsenter og forbrukere på basis av ressurskonservering og dette gir dessuten vesentlige muligheter for å utvikle nye industrielle avlinger for agrikultur.

Det finnes en enorm mengde av uvanlige fettsyrer i oljer fra ville plantearter som har blitt godt karakterisert (se for eksempel Badami & Patil, 1981). Mange av disse syrer er av potensiell industriell bruk. Dette har ført til en interesse i dyrkning av relevante plantearter for å tillate agrikulturell produksjon av spesielle fettsyrer. Imidlertid gjør utviklingen av genetisk manipulering, kombinert med større forståelse for biosyntesen av uvanlige fettsyrer det nå mulig å overføre gener som koder for nøkkelenzymer invol-vert i syntesen av en spesiell fettsyre fra en villart til en utvalgt domestikert oljefrøav-ling. På denne måte kan spesielle fettsyrer bli fremstilt med høy renhet og i mengder ved moderate omkostninger.

En klasse av fettsyrer av spesiell interesse er de acetyleniske fettsyrer bestående av en acylkjede som har to hosliggende karbonatomer bundet med en acetylenisk- eller trip-pelbinding. På grunn av sin høye reaktivitet vil de være ideelt egnet for fremstilling av belegg, plast og smøremidler. Ved å overføre genene som er ansvarlige for fremstillingen av en spesiell acetylenisk syre fra en villart til kommersielle oljefrø eller enhver annen oljeakkumulerende organisme som lett kan bli forøket bør det være mulig å utvikle en fornybar primærkilde for denne olje inneholdende acetyleniske fettsyrer for industrielt bruk.

Tidligere teknikk

Dannelsen av acetyleniske bindinger i fettsyrer hos moser inntreffer via fratrekningen av hydrogener fra en dobbelt binding (Kohn et al., 1994).

Krepisarter har frøoljer med høyt innhold av acetyleniske syrer (Badami & Patil, 1981, Hirsinger, 1991).

Det er fra en artikkel til G. Kohn et al., J. Plant Physiol, vol. 144,1994, s. 265-271 kjent organismen Ceratodon purpureus som akkumulerer triacylglyceroler med to acetylensy-rer som de viktigste bestanddelene. Likeledes er acetyleniske fettsyrer kjent fra artik-lene W.G. Haigh et al., Lipids, vol. 3, no. 4, 1968, s. 307-312 og Biochim. Biophys. Acta, vol. 137, 1967, s. 391-392 dannet av Crepis rubra.

Oppsummering av oppfinnelsen

Den foreliggende oppfinnelse fremskaffer en ny fremgangsmåte ved fremstilling av acetyleniske fettsyrer hvor linoleinsyre omdannes til krepenyninsyre (9-oktadecen-12-yn-syre) med Crepis alpina delta-12-acetylenase.

Oppfinnerne har karakterisert dette enzym (acetylenase) som er ansvarlig for fremstillingen av 9-oktadecen-12-ynoinsyre (krepenyninsyre) fra 9,12-oktadekadienoinsyre (linoleinsyre) i membranfraksjoner fra spirende Crepis alpina frø. Karakteirseringen av acetylenasen fra Crepis alpina viste at acetylenasen hadde meget like biokjemiske egenskaper som de ikke-hemeinneholdende monooksygenaser oleat delta-12 og linoleat delta 15 (omega 3) desaturaser. Basert på det premiss at de biokjemiske likheter som ble observert mellom acetylenasen og enzymene som produserte linoleinsyre og linole-ninsyre (delta-12 og delta 15 desaturaser) også ville være assosiert med likheter i pri-mærsekvensen av disse proteiner ble et cDNA av full lengde (pCrepl), som koder for en forsøksvis acetylenase, isolert fra Crepis alpina.

Opprinnelig ble to typer av cDNA-fragmenter fremskaffet ved å bruke PCR og primere utformet ved å sammenstille proteinsekvenser av delta-12 desaturaser karakterisert fra C. alpina. DNA-sekvensanalyse viste at én var sterkt homolog med alle de andre plan-teendoplasmiske retikulære (ER) delta-12 desaturaser og lakserbønne hydroksylase. Det andre cDNA-fragment som ble karakterisert hadde en sekvens som var homolog med ER delta-12 desaturasesekvensene hos planter, men var divergent ikke bare i antallet ikke-konserverte aminoresiduer, men også i antallet aminosyreresiduer som var sterkt konservert i alle delta-12 ER-desaturaser. Ved å bruke "northern blot"-analyse ble genet som koder for dette cDNA (pCrepl) observert å være sterkt uttrykt kun på en frøspesifik måte sammenlignet med ekspresjon i bladvev. Tatt sammen gir disse funn og en betraktning av den enestående biokjemiske natur av en celle i et oljefrø sterke bevis for at det isolerte cDNA(pCrepl) fra C alpina koder for et enzym som er ansvarlig for omdannelsen av linoeinsyre til krepenyninsyre.

Endelig ble konkluderende bevis for at cDNA, pCrepl, fra C alpina kodet for et plan-teacetylenaseenzym fremskaffet ved ekspresjon av dette gen i gjær. Ekspresjonen av dette gen sammen med tilsetningen av linoleinsyre ved dyrkning av disse gjærorganis-mer resulterte i fremstillingen av en delta-12 acetylenisk syre, 9-oktadecen-12-ynoin-syre (krepenyninsyre) som bekreftet med massespektrometrisk analyse av ekstraherte gjærfettsyrer.

Følgelig angår, i første aspekt, foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for fremstilling av acetyleniske forbindelser som er særpreget ved at linoleinsyre omdannes til krepenyninsyre med Crepis alpina delta-12-acetylenase.

I en ytterligere utførelsesform angår oppfinnelsen et cDNA som koder for Crepis alpina delta-12 acetylenase omfattende sekvensen i henhold til sekvensopplisting 2 eller enhver nukleotidsekvens som koder for et protein som har samme biologiske aktivitet.

Et tredje aspekt av oppfinnelsen angår anvendelsen av de ovenfor beskrevne cDNA'er for transformering av organismer, valgt fra gruppen bestående av oljeholdige avlinger, oleogene gjær og muggsopp. Organismene kan være henholdsvis acetyleniske forbin-delsesakkumulerende organismer eller oljeakkumulerende organismer.

I et fjerde aspekt angår oppfinnelsen organismer som er transformert med et acetylenase cDNA som beskrevet ovenfor. Organismene er acetyleniske forbindelse eller oljeakkumulerende og eksempler på sistnevnte er oljeavlinger, oleogene gjærtyper og mugg.

I en foretrukket utførelsesform angår foreliggende oppfinnelse transformerende oljeakkumulerende organismer med nevnte isolerte cDNA fra Crepis alpina frø cDNA bibliotek for formålet å fremstille acetyleniske fettsyrer og spesielt 9-oktadecen-12-ynoin-syre (krepenyninsyre).

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

C. alpina frøolje er rik på krepenyninsyre [9-oktadecen-12-ynoinsyre (Hirsinger, 1989)]. Oppfinnerne har studert biosyntesen av krepenyninsyre i C. alpina frø. Tilfø-ringen av eksogene l-<14>C-merkede frie fettsyrer til inntakte utviklende kotyledoner av C. alpina- frø viste at linoleat er en prekursor for krepyninsyre. Dette står i motsetning til tidligere publiserte resultater for biosyntesen av krepenyninsyre i Crepis rubra (Haigh & James, 1967). Selv om reaksjonen av acetyleninsyredannelse hos moser har blitt vist å være en avmetningsprosess (Kohn et al, 1994), kan slike avmetningsproses-ser bli utført med et antall forskjellige urelaterte typer av planteenzymer så som fytoen-desaturaser (Wieland et al, 1994) eller ikke-heme proteiner hvor sistnevnte er en klasse enzymer hvorav enkelte viser meget liten aminosyresekvenshomologi bortsett fra for tre konserverte histidinplasseringer (Shanklin et al, 1994). Det har blitt antydet at biosyntesen av acetylenin fettsyrer inntreffer med en sekvens av intermediater katalysert av separate enzymatiske reaksjoner. For eksempel, ble acetyleniske bindinger antatt å bli dannet som en sidevei for mettet fettsyresyntese (Diedrich & Henschel, 1991); eller via en epoksygenering av en dobbeltbinding med påfølgende omdannelse til en diol som i sin tur blir dehydrert i to trinn for å danne acetylenisk binding (Van de Loo et al, 1993). Gitt disse motstridende alternativer var naturen til et acetylenaseenzym og dets virk-ningsmekanisme ikke kjent i det hele tatt og heller ikke innlysende ved tiden for foreliggende prioritets patentsøknad SE 9601236-4.

Enzymet som er ansvarlig for syntesen av krepenyninsyre (kalt delta-12 acetylenase), ble vist av oppfinnerne kun å være aktiv i membran-(mikrosomale)fraksjoner fremstilt av frø under utvikling av Crepis alpina, forutsatt at homogeniseringsbufferen innehol-der NADH eller NADPH, katalase og fritt coenzym A. Karakteriseringen av den mikrosomale acetylenase og dets sammenligning med delta-12 desaturasen (som er ansvarlig for desatureringen av oleat til linoleat) viste at disse enzymer hadde meget like egenskaper. Begge enzymer krevde O2 og NADH eller NADPH; hvor begge coreduk-tanter virket like godt med begge enzymer. Cyanid (CN-) og antistoff mot blomkål cy-tokrom bs inhiberte begge disse enzymer mens karbonmonoksid ikke hadde noen ve-sentlig effekt på noen av enzymaktivitetene. Disse data antydet at begge enzymer var biokjemisk like. Oleat delta-12 hydroksylasen fra lakserbønne ble også vist å ha lig-nende biokjemiske egenskaper som delta-12 desaturasen til tross for at den katalyserer en forskjellig reaksjon (Bafor et al., 1991), Smith et al., 1992). Lakserbønne delta-12 hydroksylasegenet ble senere vist å ha signifikant sekvenshomologi med ER delta-12 desaturasegenene (FAD 2 gener) (Van de Loo et al, 1995). Fordi delta-12 acetylenasen lik delta-12 desaturasen (FAD 2) katalyserer en dehydrogenering mellom karbon 12 og 13 av en acylkjede og lik delta-15 desaturasen (FAD 3) anvendte linoleinsyre som substrat, vurderte oppfinnerne muligheten for at acetylenasegenet ville ha en viss sekvenshomologi med FAD 2- og/eller FAD 3-genene.

Oppfinnelsen vil nå bli beskrevet nærmere nedenfor i relasjon til de medfølgende teg-ninger og den eksperimentelle del.

Tegningene viser:

Fig. 1: Restriksjonskart av pCrepl.

Fig. 2: Restriksjonskart av pVT-Crepl.

Fig. 3 Overlagte enkle ionekromatogrammer av ioner 333, 365, 367 fra FADEA fremstilt fra totale fettsyrer ekstrahert fra gjærstamme YN94-1 transformert med pVT-Crepl. Bokstavene betegner topper som representerer de følgende dietylamidderivater av fettsyrer: A, eikosansyre; B, eikosaensyre; C, 9-oktadecen-12-ynonsyre. Fig. 4 Overlagte enkle ionekromatogrammer av ioner 333, 365, 367 fra FADEA fremstilt fra totale fettsyrer ekstrahert fra gjærstamme YN94-1 transformert med tom vektor (pVTlOOU; kontroll). Bokstavene betegner topper som representerer de følgende dietylamidderivater av fettsyrer: A, eikosansyre; B, eikosaensyre. Fig. 5 Et totalt ionekromatogram av FADEA fremstilt fra fettsyrer anriket i den for-søksvise 9-oktadecen-12 ynonsyre som stammer fra lipidekstrakter av YN94-1 transformert med pVT-Crepl. Bokstavene betegner toppene som representerer de følgende dietylamidderivativer av fettsyrer: A, hekadekanoinsyre; B, oktadekaoninsyre; C, okta-deka-9,12-dienoinsyre; D, 9-oktadecen-12-ynonsyre.

Fig. 6 Massesprektrum av forbindelse tilsvarende topp D i fig. 5.

Eksperimentell del

Kloning av forsøksvis acetylenasegen.

En sammenligning mellom aminosyresekvenser av forskjellige arter viste at de membranbundne fettsyredesaturaser kunne bli gruppert i henhold til homologien av deres for-søksvise ferdigutviklede protein til tre distinkte grupper (plastid delta-12 desaturaser, ER delta-12 desaturaser og delta-15 desaturaser; se sekvensopplisting 1). Laksérbønne hydroksylasen (Van de Loo et al 1995) delte en høy homologi med ER delta-12 desaturasene i den grad at den ikke var lett distingverbar fra disse sekvenser. Videre viste sekvensene fra alle tre klasser enzymer en viss grad av sekvenshomologi med hver-andre.

Basert på denne sammenligning ble oligonukleotidprimere utarbeidet og syntetisert for disse tre grupper av sekvenser og for en konsensus av alle disse sekvenser. Sekvensen av disse primere er gitt nedenfor. (i) konsensusprimere (primere utformet til en konsensus av alle tre grupper av membranbundne desaturaser og laksérbønnefettsyre hydroksylasen):

sens er GSN CAY GAN TGY GSN CAY

antisens er RAN ADR TGR TGN RBN A YR TG

(ii) plastid delta-12 desaturaseprimere:

sens er TGG MGN TTY AAR CAY GAY MG

antisens er GTN SWC ATC CAR AAR TGR TA

(iii) ER delta-12 desaturaseprimere innbefattende laksérbønnefettsyre hydroksylase: sens er CAY GAR TGY GGN CAY CAY GC

antisens er CCN CKN ARC TCC CAY TC

(iv) delta-15 desaturaseprimere:

sens er ACN CAY CAY CARAAY CAY GG

antisens er CAY TGY CCN CKR TAC CA

Poly A+ er isolert fra utviklende frø (100 mg) av C. alpina ved å bruke et "QuickPrep Micro" mRNA opprenskningssett fra Pharmacia Biotech. Alle av poly A+ RNA fra denne opprenskning ble utfelt og brukt for å syntetisere første kjede cDNA som ble primet med både oligo dT og tilfeldige heksamere og syntetisert med "Superscript II" revers transcriptase fra Gibco BRL. Polymerase kjedereaksjon (PCR) ble så benyttet med de beskrevne primere og dette cDNA for å amplifikere produkter med de følgende cykliserende betingelser: 1. syklus på 94°C i 2 minutter, 30 cykler på (94°C, 30 sek., 50°C, 30 sek., 72°C, 30 sek.) og til slutt en cykel på 72°C i 5 minutter.

Produkter ble fremskaffet for alle de benyttede primere, spesielt bemerkelsesverdig var at primerne mot ER delta-12 desaturasene ga signifikant mer produkt enn fra de andre anvendte primere. Størrelsene av PCR-produktene fra delta-12 og delta-15 primerne tilsvarte de forventede størrelser.

PCR-produktene som ble dannet ved amplifikering med ER delta-12 primerne og delta-15 primerne ble gjort buttendede med T4 og klenow polymeraser og klonet i EcoRV sete av plasmidvektoren "Bluescript". DNA-sekvensering av et antall av klonene viste at minst 3 distingte sekvenser hadde blitt amplifikert når disse to sett av primere ble brukt: (i) en sterkt konservert delta-15 desaturasesekvens, (ii), en sterkt konservert ER delta-12 sekvens og (iii), en sekvens (Dl2V) som har homologi med ER delta-12 sekvensen, men som viser distingte forskjeller selv i enkelte aminosyreresiduer som var sterkt konservert blant alle de andre desaturasesekvenser.

Analysen av fettsyrer fra C. alpina hadde indikert at krepenyninsyren sannsynligvis var til stede kun i frø. Northern blot analyse ved høy stringens viste at mRNA fra D12V-sekvensen beskrevet ovenfor ble uttrykt i sterk grad i frø, men ikke i blad, noe som er konsistent med observasjonen at krepenyninsyren kun ble observert i frø.

Et cDNA-bibliotek ble dannet fra utviklende frø fra C. alpina ved å bruke et Uni-ZAP XR kloningssett for cDNA fra "Stratagene" og utvalgt med den tilfeldig merkede D12V-sekvens. Fra dette utvelgelsessett ble det beregnet at cDNA som koder for D12V-sekvensene fantes i rikelig monn, noe som ytterligere understreker det høye eks-presjonsnivå av dette gen. Etter isoleringen av enkle hybridiserende "Lambda" plakker, ble pBluescript fagemid skåret ut ved å bruke ExAssist/SOLR-systemet fra "Stratagene". Fagemider fremskaffet ved dette ble derpå benyttet for å danne dobbeltkjedet DNA-plasmid. Fra disse kolonier ble en full-lengde-klon (pCrepl, se fig. 1) isolert ved å bruke DNA sekvensering og restriksjonskartlegging av det isolerte plasmid. Innskud-det fra pCrepl, et 1,5 kb innskudd inneholdt i vektoren pBluescript SK, ble sekvensert og fra dette ble en åpen leseramme dedusert som koder for et 375 aa langt protein (sekvensopplisting 2). Analysen av denne proteinsekvens viste omtrentlig 60% identitet og 80% likhet med andre plante delta-12 desaturaseproteiner og hadde merkbare forskjeller i homologi hvor visse residuer som var konservert blant alle andre desaturaser ikke var i denne sekvens (se sekvensopplisting 1) Tre histidinseter var til stede som er blitt vist å være konservert i et antall ikke-heme-inneholdende monooksygenaser som katalyserer hydroksylering og desatureringsreaksjoner (Shanklin et al., 1994).

Ekspresjon av pCrep cDNA og deteksjon av krepenyninsyre i transgent gjær.

Den pCrepl åpne leseramme ble frigjort fra pCrepl på et SmaVXhol restriksjonsfrag-ment og den 1,5 kb Crepl åpne leseramme gjenvunnet ved gelopprenskning (Langridge et al, 1980). pVT100-U DNA (Vernet et al, 1987) ble spaltet ved å bruke PvuII og Xhol. 50 ng PvuII/XhoI-linearisert pVTlOO ble ligert med 100 ng 1,5 kb Smal/Xhol fragment tilsvarende den åpne Crepl leseramme ved å bruke T4 DNA ligase (NBL Ge-nen Science Ltd., UK). Deler av legeringsblandingen ble benyttet for å transformere kompetente E. coli Dha-celler. En klon (pVT-Crepl), som inneholdt det forventede 1,5 kb innskudd ble valgt og konstruksjonen undersøkt ved spalting med EcoRI eller Hindlll + Xbal. Begge spaltinger ga de ventede produkter (omkring 5,3,2,3 og 0,8 kb for EcoRI-spaltingen og frigjøring av den 1,5 kb store åpne leseramme med Hindlll + Xbal spaltingen). pVT-Crepl DNA (se fig. 2) eller tom vektor pVTlOOU ble benyttet for å transformere Saccharomyces cerevisiae stammer YN94-1 og C13-ABYS86, ved å bruke PLATE-metoden til Elble (1992). Overnattede gjærtransformanter ble spredd ut på SCD minus uracil agar og enkle kolonier ble streket på ferske selektive (minus uracil) plater. YN94-1 og C13-ABYS86 stammene av gjær transformert med pVT-Crepl DNA og med tom vektor (pVTlOOU; kontroll) ble dyrket i ristekulturer ved 28°C i 5 timer i selektivt medium (uten uracil; 400 ml) hvorpå 40 ml dyrkningsmedium inneholdende linoleinsyre dispergert i Tween 40® ble tilsatt til kulturen for å gi en endelig kon-sentrasjon på 0,03% linoleinsyre og 1% Tween 40® (w/w). Etter dyrkning i ytterligere 78 timer ved 28°C ble cellene pelletert ved sentrifugering og vasket ved dispersjon i 20 ml 0,1M Tris-HCl buffer pH 7,8 inneholdende 1% Tween 40® og repelletert ved sentrifugering. Cellene ble videre vasket ved resuspensjon i 20 ml

Claims (11)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av en acetylenisk forbindelse, karakterisert ved at linoleinsyre omdannes til krepenyninsyre (9-oktadecen-12-yn-syre) med Crepis alpina delta-12-acetylenase.

2. Fremgangsmåte for fremstilling av en acetylenisk forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at delta-12-acetylenasen har aminosyresekvens ifølge sekvensopplisting 2.

3. DNA-sekvens som koder for Crepis alpina delta-12-acetylenase omfattende sekvensen ifølge sekvensopplisting 2 eller enhver nukleotidsekvens som koder for et protein som har samme biologiske aktivitet.

4. Anvendelse av en DNA-sekvens ifølge krav 3 for å transformere organismer valgt fra en gruppe bestående av oljeholdige avlinger, oleogene gjær og muggsopp.

5. Anvendelse ifølge krav 4, hvor organismen vil være i stand til å akkumulere acetyleniske forbindelser.

6. Anvendelse ifølge krav 4, hvor organismen er en oljeakkumulerende organisme.

7. Anvendelse ifølge krav 6, hvor den oljeakkumulerende forbindelse er valgt fra gruppen bestående av oljeholdige avlinger, oljeholdig gjær og muggsopp.

8. Organisme transformert med et acetylenase-DNA ifølge krav 3.

9. Organisme ifølge krav 8, som er organismer som akkumulerer acetyleniske forbindelser.

10. Organisme ifølge krav 8, som er en organisme som akkumulerer olje.

11. Organisme ifølge krav 10, som er valgt fra gruppen bestående av oljeholdige avlinger, oljeholdig gjær og muggsopp.