PL187096B1

PL187096B1 - Sposób wytwarzania kwasu krepeninowego, sekwencjacDNA kodująca acetylenazę, zastosowanie tej sekwencji cDNA i organizmy stransformowane tą sekwencjącDNA

Info

Publication number: PL187096B1
Application number: PL97329175A
Authority: PL
Inventors: Maureen Bafor; Antoni Banas; Anders Dahlqvist; Per-Olov Gummeson; Michael Lee; Marit Lenman; Staffan Sjödahl; Sten Stymne
Original assignee: Maureen Bafor; Antoni Banas; Anders Dahlqvist; Gummeson Per Olov; Michael Lee; Marit Lenman; Sjoedahl Staffan; Sten Stymne
Priority date: 1996-03-29
Filing date: 1997-02-14
Publication date: 2004-05-31
Also published as: NO984448D0; EP0889970B1; SE9601236D0; CZ313598A3; JP2000507450A; US6333448B1; ES2210493T3; PL329175A1; CA2250234A1; NO984448L; EP0889970A1; DE69725841D1; DK0889970T3; DE69725841T2; ATE253124T1; AU720765B2; CA2250234C; PT889970E; NO326619B1; WO1997037033A1

Abstract

1. Sposób wytwarzania kwasu krepeninowego, znam ienny tym, ze kwas linolowy przeprowadza sie w kwas krepeninowy [kwas 9-oktadecen-12-ynowy] stosujac acetylena- ze delta 12 [Numer EC 1.14.99.33] z Crepis alpina o sekwencji aminokwasowej zgodnej z Lista Sekwencji 2 PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania kwasu krepeninowego, sekwencja cDNA kodująca acetylenazę, zastosowanie tej sekwencji cDNA i organizmy stransformowane tą sekwencją cDNA.

Na całym świecie istnieje coraz większe zainteresowanie wytwarzaniem materiałów chemicznych takich jak kwasy tłuszczowe, wykorzystywanych w przemyśle, z odnawialnych zasobów roślinnych, a nie z nieodnawialnych produktów przemysłu petrochemicznego. Znajduje to szerokie zainteresowanie zarówno wśród wytwórców jak konsumentów ze względu na ochronę zasobów oraz dostarcza dodatkowo istotnych sposobności dla rozwoju nowych roślin przemysłowych w rolnictwie.

W olejach pochodzących z dzikich gatunków roślin istnieje olbrzymia różnorodność rzadko spotykanych kwasów tłuszczowych, które zostały dobrze scharakteryzowane (patrz np. Badami i Patii, 1981). Wiele z tych kwasów ma potencjalnie przemysłowe zastosowanie. Dlatego też wzrosło zainteresowanie zaadaptowaniem stosownych gatunków roślin dla produkcji rolnej określonych kwasów tłuszczowych. Rozwój inżynierii genetycznej w połączeniu z coraz lepszym zrozumieniem biosyntezy rzadko spotykanych kwasów tłuszczowych pozwala obecnie na przenoszenie genów kodujących kluczowe enzymy, wymaganych podczas syntezy określonego kwasu tłuszczowego, z dzikiego gatunku do wybranej zaadaptowanej rośliny wytwarzającej nasiona oleiste. Dzięki temu można wytwarzać konkretne kwasy tłuszczowe o wysokiej czystości i w dużych ilościach, przy umiarkowanych kosztach.

Jedną ze szczególnie interesujących klas kwasów tłuszczowych są acetylenowe kwasy tłuszczowe, składające się z łańcucha acylowego, w którym dwa sąsiadujące atomy węgla połączone są wiązaniem acetylenowym (potrójnym). Ze względu na swoją wysoką reaktywność mogą one doskonale służyć do wytwarzania środków powlekających, tworzyw sztucznych i środków smarujących. Dzięki przeniesieniu genów odpowiedzialnych za wytwarzanie określonych kwasów acetylenowych, z dzikiego gatunku do handlowych roślin wytwarzających nasiona oleiste lub do innego akumulującego olej organizmu, który w prosty sposób

187 096 można powielić, możliwe stanie się rozwinięcie odnawialnych pierwotnych źródeł olejów, zawierających acetylenowe kwasy tłuszczowe dla celów przemysłowych.

Tworzenie wiązań acetylenowych w kwasach tłuszczowych w torfowiskach odbywa się poprzez usuwanie wodoru z wiązań podwójnych (Kohn i wsp., 1994).

Oleje z nasion różnych gatunków pępawy mają wysoką zawartość kwasów acetylenowych (Badami i Patii, 1981; Hirsinger, 1991).

Niniejszy wynalazek dostarcza nowego sposobu wytwarzania kwasu krepeninowego.

Twórcy wynalazku scharakteryzowali enzym (acetylenazę), który odpowiada za wytwarzanie kwasu 9-oktadecen-12-ynowego (kwas krepeninowy) z kwasu 9,12-oktadekadienowego (kwas linolowy) we frakcji błonowej rozwijających się nasion Crepis alpina (Pępawa alpejska). Charakterystyka acetylenazy z Crepis alpina wykazała, że enzym ten ma bardzo podobne właściwości biochemiczne do nie zawierających hemu monooksygenaz olejanowych delta 12 i desaturaz linoleinianowych delta 15 (omega 3). Zakładając, że biochemiczne podobieństwa obserwowane pomiędzy acetylenazą a enzymami wytwarzającymi kwas linolowy i linolenowy (desaturazy delta 12 i delta 15) są związane z podobieństwem na poziomie pierwszorzędowym sekwencji tych białek, wyizolowano cDNA (pCrep 1) pełnej długości, kodujący przypuszczalną acetylenazę z Crepis alpina.

Początkowo scharakteryzowano dwa typy fragmentów cDNA z C. alpina otrzymanych przy użyciu PCR i starterów’ zaprojektowanych dzięki porównaniu sekwencji białek desaturaz delta 12. Analiza sekwencji DNA wykazała, że jeden z fragmentów posiadał wysoką homologię do wszystkich innych desaturaz delta 12 z roślinnego reticulum endoplazmatycznego (RE) oraz hydrolazy z rącznika pospolitego. Drugi scharakteryzowany fragment cDNA posiadał wprawdzie sekwencję homologiczną do sekwencji desaturaz delta 12 z roślinnych ER, ale posiadał również różnice nie tylko w liczbie niekonserwowanych reszt aminokwaso-wych, lecz także w liczbie reszt aminokwasowych, które były silnie konserwowane we wszystkich desaturazach delta 12 z ER. Na podstawie analizy typu Northern wysoką, specyficzną ekspresję genu, którego kopię cDNA niesie pCrepl stwierdzono jedynie w nasionach, natomiast nie stwierdzono w tkance liściowej. Podsumowując, obserwacje te oraz unikatowa biochemiczna natura komórek nasion oleistych dostarczyły silnych dowodów na to, że wyizolowany cDNA (pCrepl) z C.alpina koduje enzym odpowiedzialny za przekształcenie kwasu linolowego w kwas krepeninowy.

Ostateczny dowód rozstrzygający to, że cDNA, pCrepl, z C.alpina koduje roślinną acetylenazę otrzymano dzięki ekspresji genu w drożdżach. Ekspresja tego genu, w obecności kwasu linolowego w hodowli drożdży, prowadziła do wytworzenia kwasu acetylenowego delta 12, kwasu 9-oktadecen-12-ynowego (kwasu krepeninowego), co potwierdzono za pomocą analizy spektrometrii mas kwasów tłuszczowych wyekstrahowanych z drożdży.

Sposób wytwarzania kwasu krepeninowego według wynalazku, w którym podwójne wiązania są przekształcane przez acetylenazę w wiązania acetylenowe, polega na tym, że kwas linolowy przeprowadza się w kwas krepeninowy [kwas 9-oktadecen-12-ynowy] stosując acetylenazę delta 12 [Numer EC 1.14.99.33] z Crepis alpina o sekwencji aminokwasowej zgodnej z Listą Sekwencji 2.

Wynalazek odnosi się też do sekwencji cDNA kodującej acetylenazę delta 12 z Crepis alpina, o sekwencji nukleotydowej zgodnej z Listą Sekwencji 2.

Wynalazek dotyczy też zastosowania opisanej powyżej sekwencji cDNA do transformacji organizmów wybranych z grupy obejmującej uprawne rośliny oleiste oraz drożdże i pleśnie wytwarzające oleje.

W zakres wynalazku wchodzą też organizmy stransformowane przy użyciu cDNA acetylenazy jak opisany powyżej, wybrane z grupy obejmującej uprawne rośliny oleiste oraz drożdże i pleśnie wytwarzające oleje.

W korzystnym wykonaniu wynalazek odnosi się do akumulujących olej organizmów wybranych z grupy obejmującej uprawne rośliny oleiste oraz drożdże i pleśnie wytwarzające oleje, stransformowanych omawianym wyizolowanym cDNA z banku cDNA nasion Crepis alpina, w celu wytworzenia kwasu 9-oktadecen-12-ynowego (kwasu krepenino-wego).

187 096

Olej z nasion C.alpina jest bogaty w kwas krepeninowy [9-oktadecen-12-ynowy (Hirsinger, 1989)]. Twórcy wynalazku przestudiowali biosyntezę kwasu krepeninowego w nasionach C.alpina. Podawanie egzogennych wolnych kwasów tłuszczowych wyznakowanych 1- Cdo nie uszkodzonych rozwijających się liścieni z nasion C.alpina wykazało, że linolinian jest prekursorem kwasu krepeninowego. Jest to sprzeczne z wcześniej publikowanymi danymi o biosyntezie kwasu krepeninowego w Crepis rubra (Haigh i James, 1967). Chociaż pokazano, że reakcja tworzenia kwasu acetylenowego w torfowiskach polega na procesie desaturacji (Kohn i wsp., 1994), takie procesy desaturacji mogą przeprowadzać różne, niespokrewnionych typów, enzymy roślinne takie jak desaturazy fitoenu (Wieland i wsp., 1994) lub białka nie zawierające hemu; niektóre enzymy, z tej drugiej klasy, wykazują bardzo niewielką homologię sekwencji aminokwasowej z wyjątkiem trzech konserwowanych motywów histydynowych (Shanklin i wsp., 1994). Sugerowano, że biosynteza acetylenowych kwasów tłuszczowych przebiega przez kolejne produkty pośrednie wytwarzane w oddzielnych reakcjach enzymatycznych. Przykładowo, uważano, że wiązania acetylenowe są tworzone jako boczny szlak syntezy nasyconych kwasów tłuszczowych (Diedrich i Henschel,1991); lub poprzez epoksygenację wiązań podwójnych i następnie przekształcenie w diol, który sam ulega dehydratacji w dwóch etapach tworząc wiązanie acetylenowe (Van de Loo i wsp., 1993). Przy tak sprzecznych ze sobą alternatywach natura acetylenazy oraz mechanizm działania nie były zupełnie znane ani oczywiste w czasie składania zgłoszenia patentowego SE 9601236-4, stanowiącego pierwszeństwo dla niniejszego zgłoszenia.

Twórcy wynalazku wykazali, że enzym stosowany w sposobie według wynalazku, odpowiedzialny za syntezę kwasu krepeninowego (nazywany acetylenazą delta 12) jest aktywny jedynie we frakcjach błonowych (mikrosomalnych) przygotowanych z rozwijających się nasion Crepis alpina w buforze do homogenizacji zawierającym NADH lub NADpH, katalazę i wolny koenzym A. Charakterystyka acetylenazy mikrosomalnej i jej porównanie z desaturazą delta 12 (odpowiedzialną za desaturację oleinianu do linolinianu) wykazały, że enzymy te posiadają bardzo podobne właściwości. Oba enzymy wymagają O2 i nADh lub NADPH, a oba koreduktory działają równie dobrze z obydwoma enzymami. Cyjanek (CN-) oraz przeciwciała przeciwko cytochromowi bs kalafiora hamują oba enzymy, podczas gdy tlenek węgla nie wykazuje istotnego wpływu na aktywność każdego z enzymów. Wyniki te sugerują, że oba enzymy są biochemicznie podobne. Wykazano, że hydroksylaza olejanowa delta 12 z rącznika pospolitego ma podobne właściwości biochemiczne do desaturazy delta 12, pomimo katalizowania innej reakcji (Bafor i wsp., 1991; Smith i wsp., 1992). Wykazano również, że gen hydrogenazy delta 12 z rącznika pospolitego posiada znaczącą homologię sekwencji do genów desaturazy delta 12 z Er (geny FAD 2) (Van de Loo i wsp., 1995). Ponieważ acetylenaza delta 12, podobnie jak desaturaza delta-12 (FAD2), katalizuje odwodornienie pomiędzy 12 i 13 węglem łańcucha acylowego, oraz jak desaturaza delta 15 (FAD3) wykorzystuje jako substrat kwas linolowy, twórcy wynalazku nie wykluczają możliwości, że gen acetylenazy wykazuje pewną homologię do genów FAD2 i/lub FAD3.

Poniżej wynalazek zostanie dokładniej opisany w powiązaniu z załączonymi rysunkami i częścią eksperymentalną. Rysunki przedstawiają:

Fig .1 Mapa restrykcyjna pCrepl

Fig. 2 Mapa restrykcyjna pVT-Crepl

Fig. 3 Nałożone na siebie pojedyncze chromatogramy jonowe dla jonów 333, 365, 367 z FADEA, przygotowane z całkowitych ekstraktów kwasów tłuszczowych ze szczepu drożdży YN94-1 stransformowćinych pVT-Crepl. Litery oznaczają piki odpowiadające następującym dietyloamidowym pochodnym kwasów tłuszczowych: A, kwas eikozanowy, B, kwas eikozenowy, C, kwas 9-oktadecen-12-ynowy.

Fig. 4 Nałożone na siebie pojedyncze chromatogramy jonowe dla jonów 333, 365, 367 z FADEA, przygotowane z całkowitych ekstraktów kwasów tłuszczowych ze szczepu drożdży YN94-1 stransformowanych pustym wektorem (pVT100U; kontrola). Litery oznaczają piki odpowiadające następującym dietyloamidowym pochodnym kwasów tłuszczowych: A, kwas eikozanowy, B, kwas eikozenowy.

187 096

Figura 5. Pełny chromatogram jonowy z FADEA przygotowany z kwasów tłuszczowych wzbogaconych w domniemany kwas 9-oktadecen-12-ynowy pochodzący z ekstraktów lipidowych z transformantów YN94-1 niosących pVT-Crepl. Litery oznaczają piki odpowiadające następującym dietyloamidowym pochodnym kwasów tłuszczowych: A, kwas heksadekanowy; B, kwas oktadekanowy; C, kwas oktadeka-9,12-dienowy; D, kwas 9-oktadecen-12-ynowy.

Figura 6. Widmo mas związku odpowiadającego pikowi D na Fig.5.

Część doświadczalna

Klonowanie genu domniemanej acetyłenazy

Porównanie sekwencji aminokwasowych z różnych gatunków wykazało, że związane z błonami desaturazy kwasów tłuszczowych można zgrupować stosownie do homologii ich domniemanej sekwencji dojrzałego białka w trzy różne grupy (desaturazy delta 12 z plastydów, desaturazy delta 12 oraz delta 15 z ER; patrz Lista sekwencji 1). Hydrolaza z rącznika pospolitego (Van de Loo i wsp., 1995) posiada do tego stopnia wysoką homologię z desaturazami delta 12 z ER, że rozróżnienie tych sekwencji nie było łatwe. Ponadto, sekwencje ze wszystkich trzech klas enzymów wykazują pewien stopień homologii sekwencji między sobą.

W oparciu o to zestawienie zaprojektowano i zsyntetyzowano startery oligonukłeotydowe dla każdej z trzech grup sekwencji i dla sekwencji najwyższej zgodności dla wszystkich tych sekwencji. Sekwencje starterów pokazano poniżej, (i) startery najwyższej zgodności (startery zaprojektowane dla sekwencji najwyższej zgodności dla wszystkich, pochodzących z trzech grup desaturaz związanych z błonami oraz dla hydroksylazy kwasu tłuszczowego z rącznika pospolitego):

nić kodująca GSN CAY GAN TGY GSN CAY nić niekodująca RAN ADR TGR TGN RBN AYR TG.

(ii) startery desaturazy delta 12 z plastydów nić kodująca TGG MGN TTY AAR CAY GAY MG nić niekodująca GTN SWC ATC CAR AAR TGR TA.

(iii) startery desaturazy delta 12 z ER obejmujące hydrolazę kwasu tłuszczowego z rącznika pospolitego:

nić kodująca CAY GAR TGY GGN CAY CAY GC nić niekodująca CCN CKN ARC CAR TCC CAY TC.

(iv) startery desaturazy delta 15:

nić kodująca ACN CAY CAY CAR AAY CAY GG nić niekodująca CAY TGY TTN CCN CKR TAC CA.

Poli A+ RNA izolowano z rozwijających się nasion (100 mg) C.alpina przy użyciu zestawu QuickPrep Micro mRNA purification kit pochodzącego z Pharmacia Biotech. Wszystkie poliA+ RNA otrzymane w wyniku oczyszczenia wytrącano i wykorzystywano do syntezy pierwszej nici cDNA, którą rozpoczynano stosując zarówno oligo dT jak i losowe heksamery, syntezę prowadzono przy zastosowaniu odwrotnej transkryptazy Superscript II z Gibco BRL. Następnie prowadzono reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) z opisanymi starterami i tym cDNA dla powielenia produktów w następujących cyklach o warunkach: 1 cykl 94°C przez 2 min., 30 cykli (94°C, 30 sek.; 50°C, 30 sek.; 72°C, 30 sek.) i ostatni jeden cykl 72°C przez 5 min. Produkty otrzymano dla wszystkich stosowanych starterów; szczególnie ciekawy był fakt, że startery do desaturaz delta 12 z ER dawały znacznie więcej produktu niż inne zastosowane startery. Wielkość produktów PCR ze starterów dla delta 12 i delta 15 odpowiadała oczekiwanym wielkościom.

Produktom PCR otrzymanym poprzez amplifikację przy użyciu starterów delta 12 i starterów delta 15 wypełniano lepkie końce przy pomocy polimerazy T4 i fragmentu Klenowa i sklonowano je w miejscu EcoRV plazmidowego wektora Bluscript. Sekwencjonowanie DNA szeregu klonów wykazało, że powielono co najmniej trzy różne sekwencje wówczas gdy zstosowano dwa zestawy starterów:

(i) silnie konserwowaną sekwencję desaturazy delta 15, (ii) silnie konserwowaną sekwencję delta 12 z ER oraz (iii) sekwencję (D12V) posiadającą homologię do sekwencji delta 12, lecz wykazującą widoczne różnice nawet w tych resztach aminokwasowych, które były silnie konserwowane pośród wszystkich innych sekwencji desaturaz.

187 096

Analiza kwasów tłuszczowych z C.alpina wykazała, że kwas krepeninowy jest prawdopodobnie obecny jedynie w nasionach. Analiza typu Northern w warunkach ostrej hybrydyzacji wykazała, że mRNA z sekwencji D12V opisanej powyżej ulegał wysokiej ekspresji w nasionach, ale nie w liściach, co jest zgodne z obserwacją, że kwas krepeninowy występuje jedynie w nasionach.

Sporządzono bibliotekę cDNA z rozwijających się nasion C.alpina przy użyciu zestawu Uni-ZAP XR cloning kit dla cDNA z firmy Stratagene i przeszukano ją za pomocą losowo wyznakowanej sekwencji D12V. Na podstawie wyników tej analizy oceniono, że cDNA kodujące sekwencje D12V były liczne reprezentowane, co dodatkowo potwierdziło wysoki poziom ekspresji tego genu. Po wyizolowaniu pojedynczych, hybrydyzujących łysinek faga lambda; fagemid pBluescript wycinano stosując system ExAssist/SOLR firmy Stratagene. Otrzymane w ten sposób fagemidy były później wykorzystane do wytworzenia plazmidu o dwuniciowym DNA. Dzięki sekwencjonowamu DNA i mapowaniu restrykcyjnemu wyizolowanych plazmidów z kolonii otrzymano klony pełnej długości (pCrepl, patrz Fig. 1). Wstawka z pCrepl, o długości 1,5 kb, znajdująca się w wektorze pBluescript SK, została zsekwencjonowana i na podstawie sekwencji nukleotydowej ustalono otwartą ramkę odczytu, kodującą przewidywane białko o długości 375 aminokwasów (Lista sekwencji nr 2). Analiza sekwencji białka wykazała blisko 60% identyczności oraz 80% podobieństwa z innymi białkami desaturaz delta 12 z roślin, jak również wykazała, że białko posiada istotne różnice w homologii, gdzie pewne reszty konserwowane wśród wszystkich innych desaturaz nie występują w tej sekwencji (patrz Lista sekwencji nr 1). Pokazano obecność trzech motywów histydynowych, które są konserwowane w wielu nie zawierających hemu monooksygenazach katalizujących reakcje hydroksylacji i desaturacji (Shanklin i wsp., 1994).

Ekspresja cDNA z pCrepl i wykrywanie kwasu krepeninowego w transgenicznych drożdżach.

Otwartą ramkę odczytu z pCrepl wycinano z pCrepl we fragmencie restrykcyjnym SmaI/XhoI i 1,5 kb fragment zawierający otwartą ramkę odczytu odzyskiwano przez oczyszczanie w żelu (Langridge i wsp., 1980). DNA plazmidu pVT100-U (Vemet i wsp., 1987) trawiono przy użyciu enzymów PvuII i Xho-I. 50 ng tak zlinearyzowanego pVT100U poddawano ligacji ze 100 ng 1,5 kb fragmentu SmaI/XhoI odpowiadającego otwartej ramce odczytu przy użyciu ligazy DNA faga T4 (NBL Genen Science Ltd., UK). Część mieszaniny ligacyjnej użyto do transformacji kompetentnych komórek E.coli DHa. Wybrano jeden klon (pVTCrep1) zawierający spodziewana wstawkę o wielkości 1,5 kb i konstrukt sprawdzono za pomocą trawienia enzymami EcoRI lub HindIII+XbaI. Oba trawienia dały spodziewane produkty (fragmenty około 5,2, 2,3 oraz 0,8 kb dla trawienia EcoRI oraz fragment 1,5 kb z otwartą ramką odczytu dla trawienia HindIII+XbaI). DNA z pVT-Crep1 (patrz fig. 2) lub DNA pustego wektora pVT100U użyto do transformacji szczepów YN94-1 i C13-ABYS86 Saccharomyces cerevisiae, stosując metodę PLATE z Elbie (1992). Nocne hodowle transformantów drożdży wysiewano na agar SCD bez uracylu i pojedyncze kolonie przeszczepiano na świeże selekcyjne podłoża (bez uracylu). Szczepy YN94-1 i C13-ABYS86 drożdży, stransformowane DNA plazmidu pVT-Crepl i pustym wektorem (pVT100U; kontrola), hodowano z wytrząsaniem w 28°C przez pięć godzin w selektywnym podłożu (bez uracylu; 400 ml) po czym do hodowli dodawano 40 ml pożywki zawierającej kwas linolowy zawieszony w Tween40® do końcowego stężenia 0,03% kwasu linolowego i 1% Tween40® (w/w). Po hodowli przez dodatkowe 78 godzin w 28°C komórki osadzano przez wirowanie, płukano przez zawieszenie w 20 ml buforu 0,1 M Tris-HCl pH 7,8 zawierającego 1% Tween40® i ponownie osadzano przez wirowanie. Następnie komórki płukano poprzez zawieszenie w 20 ml buforu 0,1 M Tris-HCl pH 7,8 i po raz kolejny osadzano. Następnie komórki poddawano ekstrakcji mieszaniną chloroform/metanol/ 0,15 M kwas octowy (objętości w stosunku 1:2:0,8) w homogenizatorze Braun'a MSK ze szklanymi kulkami (B. Braun Biotech Intemattonal, Melsungen, Niemcy) przy 4000 obr./min. przez 20 sek. Lipidy drożdżowe ekstrahowano z mieszaniny do fazy chloroformowej poprzez dodanie chloroformu i 0,15 M kwasu octowego do końcowego stosunku objętości 1:1 ;0,9 dla chloroformu, metanolu i 0,15 M kwasu octowego. Po wirowaniu mie187 096 szaniny fazę chloroformową zawierającą lipidy zbierano i odparowywano do sucha pod strumieniem azotu.

Reszty lipofilowe metylowano przy użyciu metanolowego roztworu HC1 (4% w/w) w 85°C przez 45 min., a następnie estry metylowe kwasów tłuszczowych poddawano ekstrakcji do n-heksanu. Chromatogramy gaz-ciecz (GC) estrów metylowych rozdzielanych w szklanej kolumnie (2,5m x 3mm, średnica wewnętrzna) zawierającej 3% SP-2300 na Supelcoport, sito 100/120 Supelco, Bellefonte, P. USA) ujawniły piki o tym samym czasie retencji co autentyczny ester metylowy kwasu 9-oktadecen-12-ynowego, stanowiące do 0,3% całkowitego obszaru pików w próbkach przygotowanych z drożdży stransformowanych pVT-Crepl, lecz nie w próbkach przygotowanych z drożdży stransformowanych pustym wektorem (pVT100U; kontrola).

Ponieważ estry metylowe acetylenowych kwasów tłuszczowych można częściowo oddzielić od innych estrów metylowych kwasów tłuszczowych na żelach krzemionkowych w chromatografii cienkowarstwowej, estry metylowe wytworzone w transformantach YN94-1 niosących pVT-Crepl rozdzielano w żelu krzemionkowym 60 na płytkach do chromatografii cienkowarstwowej (Merck, Darmstadt, Niemcy) przez rozwinięcie płytki w mieszaninie heksan/eter etylowy/kwas octowy (stosunek objętości 85:15:1). Obszar występujący bezpośrednio poniżej głównego obszaru estru metylowego zbierano z płytki, lipidy wypłukiwano mieszaniną metanol/chloroform (2:1) i analizowano stosując chromatografię gaz-ciecz. Okazało się, że frakcja zawiera estry metylowe kwasów tłuszczowych, gdzie pik o tym samym czasie retencji co autentyczny ester metylowy kwasu 9-oktadecen-12-ynowego stanowi do 12,5% całkowitego obszaru pików.

Frakcja estru metylowego wzbogacona w domniemany ester metylowy kwasu 9-oktadecen-12-ynowego, tak samo jak całkowite estry metylowe kwasów tłuszczowych wytworzone przez szczep YN96-1 stransformowany pVT-Crepl i YN96-1 stransformowany pustym wektorem (pYT100U; kontrola) hydrolizowano w 2,5 M KOH w wodnym roztworze metanolu (15% metanol, objętościowo) w 90°C przez 1 godzinę. Wolne kwasy tłuszczowe ekstrahowano heksanem po zakwaszeniu za pomocą HC1 i fazę heksanową odparowywano do sucha pod strumieniem azotu.

Dietyloamidy kwasów tłuszczowych (FADEA) wytwarzano z wolnych kwasów tłuszczowych według Nilsson i Liljenberg (1991). FADEa wstrzykiwano bądź bezpośrednio do chromatografu gaz-ciecz sprzęgniętego ze spektrometrem mas (GC-MS) lub poddawano dalszemu oczyszczaniu w żelach krzemionkowych metodą chromatografii cienkowarstwowej przez rozwijanie płytki w mieszaninie heptan/eter etylowy/kwas octowy (stosunek objętości 50:50:1).

FADEA analizowano w chromatografie gazowym Hewlett-Packard 5890 II wyposażonym w DB225 (0,25 mm, średnica wewnętrzna, x 30 m, J&W, Folsom, USA) serii z Rtx 2330 (Restek Corp., PA, USA) połączonym z krzemionkową kolumną kapilarną sprzęgniętą ze spektrometrem mas Hewlett-Packard 5989A z jonizacją strumieniem elektronów przy 70 eV. Stosowano technikę wstrzykiwania typu „cold splitless” w 100°C, a następnie temperaturę podnoszono tak szybko jak tylko możliwe do 240°C.

Temperatura pieca wynosiła 100°C przez 7 min., następnie podnoszono ją o 20°C na minutę do 190°C i następnie o 1°C na minutę do końcowej temperatury 225°C, która utrzymano przez 20 min. Pozycje wiązań podwójnych ustalano według Nilsson i Liljenberg (1991).

Pojedyncze chromatogramy jonowe mas odpowiadające jonom molekularnym FADEA wytworzonym z całkowitych kwasów tłuszczowych ze szczepu YN94-1 stransformowanego pVT-Crepl oraz z YN96-1 stransformowanego pustym wektorem (pVT100U; kontrola) pokazano odpowiednio na fig. 5 i fig. 6. Chromatogram FADEA ze szczepu YN94-1 stransformowanego pVT-Crepl pokazuje pik o masie 333 (odpowiadający masie cząsteczkowej dietyloamidu kwasu 9-oktadecen-12-ynowego), który nie był obecny na chromatogramie FADEA ze szczepu YN96-1 stransformowanego pustym wektorem (pVT100U; kontrola). Pik ma czas retencji 57,3 min i jest położony pomiędzy pikami dla pochodnej eikozanowej i eikozenowej FADEA.

187 096

Całkowity chromatogram jonowy FADEA przygotowanych z kwasów tłuszczowych wzbogaconych przez domniemany kwas 9-oktadecen-12-ynowy z chromatografii cienkowarstwowej (jak opisano powyżej) pochodzący z ekstraktów lipidów ze szczepu w YN94-1 stransformowanego pVT-Crepl pokazano na fig. 5. Widmo masowe (fig. 6) domniemanej dietyloamidowej pochodnej kwasu 9-oktadecen-12-ynowego (pik D na fig. 5) pokazuje lukę w masie 26 amu (ang. atomie mass unit) zamiast prawidłowego 28 pomiędzy 7 a 9 atomem węgla wskazującą na podwójne wiązanie w pozycji 9. Dodatkowo luka 24 amu zamiast prawidłowego 28 występowała pomiędzy 10 a 12 atomem węgla wskazując na wiązanie acetylenowe w pozycji 12. Pik D daje widmo mas identyczne z autentycznym dietyloamidem kwasu 9-oktadecen-12-ynowego wytworzonym z olejów nasion Crepis alpina. Tak więc pik D chromatogramu na Fig. 5 został niedwuznacznie zidentyfikowany jako dietyloamidowa pochodna kwasu 9-oktadecen-12-ynowego. Ponieważ związek ten był nieobecny w nietransformowanych cDNA Crepl szczepach drożdżowych jest oczywiste, że cDNA Crepl koduje acetylenazę delta 12 kwasu tłuszczowego.

Literatura

Badami, R.C., and Patii, K.B. (1981). Strucure and occurrence of unusual fatty acids in minor seed oils. Progress in Lipid Research, 19, 119-53.

Banas, A., Bafor, M., Wiberg, E., Lenman, M., Stahl, U. and Stymne, S. (1997) Biosynthesis of an acetylenie fatty acid in microsomal preparations from developing seeds of Crepis alpina. In: Williams, J.P., Mobasher, K.U., Lem, N.W. (eds) Physiology, biochemistry and molecular biology of plant lipids. Kluwer Academic Publisher, Dordrecht. In-press

Bimoim, H.C., and Doly, J. (1979) A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7, 1513-1523

Diedrich, M. & Henschel, K.P. (1991) The natural occurence of unusual fatty acids: Part 3. Acetylenic fatty acids. Nahrung 35, 193-202

Elbie, R. (1992) A simple and efficient procedure for transformation of yeasts. Biotechniques 13, 18-20

Haigh, W.G. & James, A.T. Biochim. Biophys. Acta 137, 391-392

Hirsinger, F. (1989). New annual oil crops. In Oil crops of the world, (eds. G. Robbelen, R.K. Downey and A. Ashri), pp.518-532. Mc-Graw-Hill Inc.

Kohn, G., Hartmann, E., Stymne, S. & Beutelmann, P. (1994) Biosynthesis of acetylenic acids in the moss Ceratodon purpureus. J. Plant Physiol. 144, 265-271

Langridge, J., Langridge, P and Bergquist P.L. (1980) Extraction of nucleic acids from agarose gels. Anal. Biochem. 103, 264-271

Nilsson, R. and Liljenberg, C. (1991) The determination of double bond positions in polyunsaturated fatty acids - Gaschromatography/ mass spectrometry of the diethylamide derivative. Phytochemical analysis 2, 253-259

Shanklin, J., Whittle, E. & Fox, B.G. (1994) Eight histidine residues are catalytically essential in membrane - associated iron enzyme, stearoyl-CoA desaturase and are conserved in alkane hydroxylase and xylene monoxygenase. Biochemistry 33, 12787-12794.

Stymne, S. & Lenman, M. (1996) Novel plant enzyme and use thereof. Swedish patent application no. 9601236-4, 96-03-29.

Vemet, T., Dignard, D. and Thomas, D.Y. (1987) A family of yeast expression vectors containing the phafe fl intergenic region. Gene 52,225-233

Wieland, B., Feil, C., Gloria-Maercker, E., Thumm, G., Lechner, M., Bravo, J.M., Poralla, K. & Goetz, F. (1994) Genetic and biochemical analysis of the biosynthesis of the yellow carotenoid 4,4'-diaponeurosporene of Staphylococcus aureus. J. Bacteriol. 176, 77197726.

van de Loo, F.J., Broun, P., Turner, S. & Somerville, C. (1995) An oleate D12hydroxylase from Ricinus communis L. is a fatty acid acyl desaturase homolog. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 6743-6747.

187 096 van de Loo, F.J., Fox, G. & Somerville, C. (1993) Unusual fatty acids. In: T.S. Moore Jr (ed.) Lipid Metabolism in Plants. CRC Press, Boca Raton , page 105.

Objaśnienia do Listy sekwencji nr l

Zestawienie sekwencji aminokwasowych desaturaz delta 12 z ER i piastydów, desaturaz delta 15 i hydroksylazy z rącznika pospolitego. Zestawienie zawiera także sekwencję białka pochodzącego z pCrepl (pępawa). Podkreślono trzy motywy histydynowe, konserwowane w monooksydazach nie zawierających hemu.

Sekwencje w niniejszym zestawieniu, podane wraz z numerami dostępu są następujące:

bnom6des.seq, desaturaza delta 12 z Brassica napus (L29214);

gmom6des.seq, desaturaza delta 15 z Glycine max (L29215);

atom3des.seq, desaturaza delta 15 z Arabidopsis thaliana (L22961);

bnom3des.seq, desaturaza delta 15 z Brassica napus (L22963);

rcom3des.seq, desaturaza delta 15 z Ricinus communis (L25897);

siom3des.seq, desaturaza delta 15 z sezamu orientalnego (U25817);

1dd15des.seq, desaturaza delta 15 z Limnanthes douglasii (U17063); gsom3des.seq, desaturaza delta 15 z Glycine max (L22965); atom3bdes.seq, desaturaza delta 15 z Arabidopsis thaliana (DD17579); bnom31des.seq, desaturaza delta 15 z Brassica napus (L22962); gsom3bdes.seq, desaturaza delta 15 z Glycine max (L22964); atd12des.seq, desaturaza delta 12 z Arabidopsis thaliana (L262966); gmom6bdes.seq, desaturaza delta 12 z Glycine max (L43921); scom12des.seq, desaturaza delta 12 z S.commersonii (X92847); gmom6ades.seq, desaturaza delta 12 z Glycine max (L43920); rchyd.seq, hydrolaza olejanowa 12 z Ricinus communis (U22378) ; pępawa, acetylenaza z Crepis alpina (ten dokument).

187 096

LISTA SEKWENCJI nr 1 bnom6des.seq gmom6des.seq atom3des.seq bnom3des.seq rcom3des.seq siom3des.seq lddl5des.seq gsom3des.seq atom3bdes.seq bnom31des.seq gsom3bdes.seq atdlżdes.seq graom6bdes.seq scoml2des.seq gmoraóades.seq rchyd.seq crepis bnom6des.seq gmom6des. seq atom3des.seq bnom3des.seq rcom3des. seq siom3des.seq lddlSdes.seq gsom3des.seq atom3bdes.seq bnom31des. seq gsom3bdes. seq atdl2des.seq grnorn6bdes. seq scoml2des.seq gmom6ades.seq rchyd.seq crepis bnom6des.seq gmoiti6des. seq atom3des. seq bnom3des.seq rcom3des.seq siom3des.seq lddlSdes.seq gsom3des.seq atom3bdes.seq bnom31des.seq gsom3bdes.seq atdl2des.seq gmom6bdes.seq scoml2des.seq graom6ades.seq rchyd.seq crepis

50

........................MASRIA DSLFAFTGPQ QCLPRAPKLA

.........._..............MACTLA DSLLLFKGSY Q.KPVLRRDI .MANLVLSEC GIRPLPRIYT TPRSNFLSNN N...KFRPSL SSSSYKTSSS

MAAGWVLSEC GLRPLPRIYS RPRIGFTSKT TMLLKLRELP DSKSYNLCSS .MASWVLSEC GLRPLPRVYP KPRTGHPLLN SNPTKLRFSR TDLGNGSS..

.MASWVLSQY ALNPLPHIFR TPRTSITSHK .........L TVSHTNNRAT •MATWYHQKC GLKPLAPVIP RPRTGAALSS TSRVEF......LDTNKWA

SARLSPGVYA

AARYSPGIFS

PLSFGLNSRD

VRPIDLLLKG

LNSNGLIQKR

GFTRNWALNV

TRRTFLVPAK

FRRQRNFVTR

STPLTTPIFE

KRIGCIKAVF NKVTVIHAVA ESP.......

100

VPVAPPSADN IPVQPAPVES ....LEEDNK

FKVSSWSNSK QSNWALNVAV PVNVSTVSGE DDREREEFNG IVN.VDEGKG ...FCLSSGI LREKNWALRV SAPLRVLQVE EEEENKEGER VIN.GGEE..

PDLTKLSLIK FRERKLGLRV SAPFQIASTT PE.............EEDEV

GPKFQPLRCN LRERNWGLKV SAPLRVASIE EEQKSVDLTN GTNGVEHEKL

...........................MW AMDQRTNVNG DPGAGDRKKE

...........................MW AMDQRSNANG D.........

............................MV KDTKPLAYAA NNGYQQKGSS

..........................MGAG GRMPVP.... TSSKKSETDT

..........................MGAG GRTDVP.... PANRKSEVDP

........................ .MGAG GRMSAP. . . . NGETEVKRNP

.................... MGLAKETTMG GRGRVA.... KVEVQGK.KP

..........................MGGG GRMSTVITSN NSEKKGGSSH

..........................MGGG GR..........GRTSQKPL

101 150

AEDREQLAES YGFKQIGQDL PDNVTLKDIM DTLPKEVFEI DDVKAWKSVL AEYRKQLAED YGFRQVGEPL SDDVTLKDVI NPLPKEVFEI DDVKAWKSVL

QRFDPGAPPP FNLADIRAAI PKHCWVKNPW KSLSYWRDV AIVFA.....

................................MSYWREL AIYFA.....

EFFDAGAPPP ..FDPGAPPP AEFDPGSPPP PEFDPGAPPP ERFDPSAQPP ERFDPSAQPP FDFDPSAPPP TKRVPCEKPP LKRVPFEKPQ LQKVPTSKPP LSRYPNTKPP LKRAPHTKPP MERYSYD.PP

FTLADIRAAI

FKLSDIREAI

FKLADIRAAI

FNLADIRAAI

FKIGDIRAAI

FKIAEIRASI

FSVGDLKKAI

FSLSQIKKAI

FTVGDIKKAI

FTVGQLKKAI

FTLGDLKRAI

FTVSDLKQAI

PKHCWVKNPW

PKHCWVKDPW

PKHCWVKNQW

PKHCWVKDPW

PKHCWVKSPL

PKHCWYKNPW

PPHCFKRSIP

PPHCFQRSVL

PPHCFQRSLI

PPHCFQRSLL

PPHCFERSFV

PPHCFKRSYI

RSMSYVLRDV

RSMGYWRDV

RSMSYWRDV

RSMSYWRDI

RSMSYYARDI

RSLSYVLRDV

RSFSYLISDI

RSFSYWYDL

TSFSYWYDL

RSFSYVAYDV

RSSYYIYHDA

VWFG.....

AWFG.....

VIVLG.....

IAVFG.....

_IAVAA.....

FAWA.....

LVIAA.....

IIASC.....

TIAFC.....

ILVSI.....

SFAF......

CLSFL.....

IIAYI.....

187 096

LISTA SEKWENCJI nr 1 (kont) fcnomćaes.seq gr.omćaes . seq 2 com3aes.seq br.om3ces . seq rcorr.3des . seq siom3aes.seq iadlSdes.seq ęsom3des.seq atom3bdes.seq bnom31des.seq gsom3bdes.seq acdl2des.seq gmomSbdes.seq scoml2des.seq gmomóades.seq rchyd.seq crepis br.om6des . seq gmomódes.seq abom3des.seq bnom3des.seq rcom3des.seq siom3des.seq lddl5des.seq gsom3des. seq atom3bdes.seq bnom31des.seq gsom3bdes.seq atdl2des.seq gmomóbdes.seq scoml2des. seq gmomóades. seq rchyd.seq crepis bnomódes.seq gmomódes. seq atora3des.seq bnom3des.seq rcom3des.seq siom3des.seq lddl5des.seq gsom3des.seq atom3bdes.seq bnom31des.seq gsom3bdes.seq atdl2des-seq gmomóbdes.seq scoml2des.seq gmom6ades.seq rchyd.seq crepis :=i 2oo

ISYTSYALGL FMIAKAPWYL LPLAWAWTG7 AA~7GFFVIGH DCAHKSFSKN I5VTSYALGL FMISKAPWYL L?LAWVW7G7 AI7GFFVIGH DCAKRSFSSN

LAAGAAYL.......NNWIV WPLYWLA2GT MFWALFVLGH DCGHGSFSND

LAAGAAYL.......NNWLV WPLYWIA2GT KFNALFVLGK DCGHGSFSND

LAAVAAYF.......NNWVA WPLYWFCQGT MFWALFVLGH DCGHGSFSNN

LAAVAAYF.......NNWW WPLYWFAQST MFWALFVLGH DCGHGSFSND

LAAAAVAA.......NSWAV WPLYWVAQGT MFWALFVLGH DCGHGSFSNN

LAAAAAYL.......NNWLV WPLYWAAQGT MFWALFVLGH DCGHGSFSNN

LAIAAVYV.......DSWFL WPLYWAAQGT LFWAIEVLGH DCGHGSFSDI

LAVAAVYF.......DSWFF WPLYWAAQGT LFWAIFVLGH DCGHGSFSDI

LYAAAIHF.......DNWLL WLIYCPIQGT MFWALFVLGH DCGHGSFSDS

FYYVATNYFS LLPQPLSYLA WPLYWACQGC VLTGIWVIAH ECGHHAFSDY LYYVATHYFH LLPGPLSFRG MAIYWAVQGC ILTGVWVIAH ECGHHAFSDY MYYVANTYFH LLPSPYCYIA WPIYWICQGC VCTGIWVNAH ECGHHAFSDY IFYIATTYFH LLPQPFSLIA WPIYWVLQGC LLTGVWVIAH ECGHHAFSKY FYSIATNFFP YISSPLSYVA WLVYWLFQGC ILTGLWYIGH ECGHHAFSEY FYFLADKYIP ILPAPLAYLA WPLYWFCQAS ILTGLWVIGH ECGHHAFSDY

201 250

KLVEDIVGTL AFLPLVYPYE PWRFKHDRHH AKTNMLVHDT AWQPVPPEEF KLVEDIVGTL AFMPLIYPYE PWRFKHDRHH AKTNMLREDT AWHPVWKDEF PKLNSWGHL LHSSILVPYH GWRISHRTHH QNHGHVENDE SWHPMSEKIY PRLNSWGHL LHSSILVPYH GWRISHRTHH QNHGHVENDE SWHPMSEKIY PKLNSWGHL LHSSILVPYH GWRISHRTHH QNHGHVENDE SWHPLSEKIF PKLNSWGHI LHSSILVPYH GWRISHRTHH QNHGHVENDE SWHPLSEKIY HKLNSWGHL LHSSILVPYH GWRIRHRTHH QNHGHVENDE SWHPMSEKLF SKLNSWGHL LHSSILVPYH GWRISHRTHH QHHGHAENDE SWHPLPEKLF PLLNSWGHI LHSFILVPYH GWRISHRTHH ONHGHVENDE SWVPLPERVY PLLNTAVGHI LHSFILVPYH GWRISHRTHH QNHGHVENDE SWVPLPEKLY PLLNSLVGHI LHSSILVPYH GWRISHRTHH QNHGHIEKDE SWVPLTEKIY QWLDDTVGLI FHSFLLVPYF SWKYSHRRHH SNTGSLERDE VFVPKQKSAI QLLDDIVGLI LHSALLVPYF SWKYSHRRHH SNTGSLERDE VFVPKQKSCI QWVDDTVGLI LHSALLVPYF’ SWKYSHRRHH SNTGSLERDE VFVPKPKSQL QWVDDWGLT LHSTLLVPYF SWKISHRRHH SNTGSLDRDE VFVPKPKSKV QLADDIVGLI VHSALLVPYF SWKYSHRRHH SNIGSLERDE VFVPKSKSKI QWVDDTVGFI LHSFLMTPYF SWKYSHRNHH ANTNSLDNDE VYIPKSKAKV

251 300

DS.........SPVLRKAII FGYGPIRPWL SI......AH WVNWHFNLRK

ES.........TPLLRKAII YGYGPFRCWM SI......AH WLMWHFDLKK

NTLDK..... PTRFFRFTLP LVMLAYPFYL WARSPGKK. . . .GSHYHPDS

KSLDK.....PTRFFRFTLP LVMLAYPFYL WARSPGKK. . ..GSHYHPDS

KSLDN.....VTKTLRFSLP FPMLAYPFYL WSRSPGKK.. . .GSHFHPDS

KNLDT.....ATKKLRFTLP FPLLAYPIYL WSRSPGKQ.. ..GSHFHPDS

RSLFK..... IALTFRFKAP FPMLAYPFYL WERSPGKT.. ..GSHYHPDS

RSLDT.....VTRMLRFTAP FPLLAFPVYL FSRSPGKT.. . .GSHFDPSS

KKLPH..... STRMLRYTVP LPMLAYPLYL CYRSPGKE. . . .GSHFNPYS

KNLSH.....STRMLRYTVP LPMLAYPLYL WYRSPGKE.. ..GSHYNPYS

KNLDS.....MTRLIRFTVP FPLFVYPIYL FSRSPGKE. . ..GSHFNPYS

KWYGKYLNNP LGRIMMLTVQ F.VLGWPLYL AFNVSGRPYD GFACHFFPNA KWYSKYLNNP ?GRVLTLAVT L.TLGWPLYL ALNVSGRPYD RFACHYDPYG GWYSKYLNNP PGRVLSLTIT L.TLGWPLYL AFNVSGRPYD RFACHYDPYG AWFSKYLNNP LGRAVSLLVT L.TIGWPMYL AFNVSGRPYD SFASHYHPYA SWYSKYSNNP PGRVLTLAAT L.LLGWPLYL AFNVSGRPYD RFACHYDPYG ALYYKVLNHP PGRLLIMFIT F.TLGFPLYL FTNISGKKYE RFANHFDPMS

187 096

LISTA SEKWENCJI nr 1 (kont) bnomćdes.s eq gnomódes . seq a;om3des.seq bno.-n3des . seo rcor.3des . seq sion3des.seq lddl5des.seq gson3des.seq atom3bdes.seq bnom3ldes.seq gsom3bdes.seq atdl2des.seq gmomćbdes.seq scorr.l2des . seq gmom6ades.seq rchyd.seq crepis bnom6aes.seq gmomódes.seq arom3des.s eq bnom3des.seq rcorn3des . seq siotr.3des . seo lddl5des.seq gsom3des. seq atom3bdes. seq bnom31des.seq gsom3bdes.seq atdl2des. seq gmom6bdes. seq scoml2des. seq graom6ades.seq rchyd.seq crepis bnom6des. seq gmom6des.seq atomSdes.seq bno'.?3des. seq rcom3des.seq siom3des.seq lddlSdes.seq gsom3des.seq atom3bdes.seq bnom31des.seq gsom3bdes.seq atdl2des.seq gmom6bdes.seq scoml2des.seq gmom6ades.seq rchyd.seq crepis

301 . . F?.?SEVNR . . FR?SEVPR

DLFLPKERKD

DLFLPKERND

GLFVPKERKD

DLFVPNEKKD

DLFVPSEKKD

DLFVPNERKD

SLFAPSERKL

MLFPPSERKG

PIYNDRERLQ

PIYSDRERLQ

PIYNNRERLQ

PIYSNRERLL

PIFSERERLQ

PIFKERERFQ

351

FWMSTFTMVH

MWLDFVTYLH

MWLDLVTYLH

MWLDFVTYLD

MWLDLVTYLH

MWLDAVTYLH

MWLDFVTYLH

AFLVLITYLQ

GFLVLITFLQ

GFLVLITYLQ

GFLVTITYLQ

CFLVMITYLQ

IFFDIITYLH

VKISLACVFA

VLTSTACWTA

IITSTACWTA

VITSTVCWTA

VITSTICWTT

VITSTACWAA

IATSTTCWSI

IAISTLCWAT

IYLSDAGILA

IYISDAGVLA

IFISDAGVLG

IYVSDVALFS

IYIADLGIFA

VLLSDLGLLA

HTAPH..IPF ETAPY. . IPF HHGHEDKLPW HHGHEDKLPW HHGHEDKLPW HHGHEDKLPW HHGHEDKLPW HHGHEDKLPW HHGHDEKLPW HHGHDDKLPW HHGHHQKLPW H..THPSLPH H..THPALPH H..THPSLPH K..THFALPH H..THPAIPR H..THLSLPH

FMAVGWPLII

FIAIGWPLII .KAALLVCLN .KAVLLVCLH .MAALLVYLN .MLALLVGLS .MVGLLIGLS .MLGLLVGLG .MFVSLIALS .MLATLVYLS .MFSLLIYLS .VCFGLYRYA .WYGLFRLA .VCYLLYRIA .VTYSLYRVA •TTFVLYQAT .VLYGVKLAV

KPADEWNAAQ

KYSSEWNRAQ

YRGKEWSYLR

YRGKAWSYLR

YRGKEWSYLR

YRGEEWSYLR

YRGKEWSYLR

YDSSEWDWLR

YTSSEWDWLR

YDSTEWDWLR

YDSSEWDWLK

YGSSEWDWLR

YDSSEWNWLR

YKVGVLGWVK

YKTGIMGWIK

FTIGPIQMLK

FVMGPMQMLK

FSMGPVQMLK

FVIGPVQLLK

FVMGPIQILK

FVMGPIQLLK

FVFGPLAVLK

FLVGPVTVLK

FITSPLLVLK

AAQGMA5MIC

MAKGLAWWC

LVKGLAWLVC

TLKGLVWLLC

MAKGLAWVMR

AAKGAAWVTC

AQLMGTVHCD AQLNGTVKCD GGL.TTLDRD GGL.TTLDRD GGL.TTLDRD GGL.TTLDRD GGL.TTLDRD GGL.TTLDRD GGL.TTIDRD GGL.TTIDRD GGL.TTVDRD GAL.ATVDRD GAL.ATVDRD GAL.ATCDRD

GAL. ATMDRD

GAM. VTVDRD GAL.STIDRD

350

FWLMPWLGYH

LY3I?YWINV

LYYI?YWINV

LYGIPYWIFV

LYGIPYLGNV

LYWPYWIFV

LYGVPYVIFV

VYGVPYIIFV

LYGIPYWIFV

LYGVPLLIVN

VYGVPLLWN

VYGVPLLIVN

IYGVPLLIVN

IYGIPVLGVF

400

YPSWIEILCH

YPKWIEILCH

YGLINNIHHD

YGWINNIHHD

YGLINNIHHD

YGWINNIHHD

YGIFNNIHHD

YGWIYNIHHD

YGILNKVFHN

YGVLNKVFHN

YGILNKVFHH

YGVLNKVFHN

FGFLNSVLHD

401

DINVHIPHHI DINVHIPHHI I.GTHVIHHL I.GTHVIHHL I.GTHVIHHL I.GTHVIHHL I.GTHyiHHL I.GTHVIHHL I.GTHYIKHL I.GTHYIHHL I.GTHYIHHL ITDTHYAHHL ITDTHYAHHL ITDTHYYHHL ITDTHYAHHL IADTHYAHHL YTHTHYMHHL

SPRIPSYNLR

FPQIPHYHLV

FPQIPHYHLI

FPQIPHYHLV

FSTMPHYNAM

FSTMPHYHAM

FSTMPHYNAM

FSTMPHYHAM

FATVPHYHAM

FSYIPHYHAK

AAHQSIQENW

AAHKSLQENW

EATEAAKPYL

EATEAAKPYM

EATEAAKPYL

EATQAAKPIF

EATEAAKPVF

DATKAAKHVL

DATKSAKHVL

EATQAAKPVL

EATKAIKPIL

EATKAVKPLL

EATNAIKPIL

EATKAIKPIM

EARDAINTYL

GKYTNLATWN

GQYLNEASWN

GKYYREPDKS

GKYYREPKKS

GKYYKEPAKS

GKYYREPKKS

GRYYREPKTS

GDYYREPERS

GDYYQFDGTP

GEYYRFDETP

GDYYQFDGTP

GEYYQFDDTP

GEYYRYDGTP

GDFYKIDRTP

450

WRLMKTIMTV

WRLMKTIMTV .GPLPLHLLE .TPLPLHLLG .GPLPLKLLG •APLPFHLLG •KPLPFHLID

AAPLPFHLIG •GAIPIHLYE .GAIPIHLVE •APLPFHLIK

.......WYV

.......FVK

.......IYK

.......FYK

.......ILK

187 096

LISTA SEKWENCJI nr 1 (kont) bnomódes. seq gmomódes.seq atom3des.seq bnom3des,seq rcom3des.seq siom3des.seq lddlSdes.seq gsom3des.seq atom3bdes.seq bnom31des.seq gsom3bdes. seq atdl2des.seq gmom6bdes.seq scoml2des.seq gmom6ades. seq rchyd.seq crepis

451

CHVYDKEENY

CQVYDKEKSL

ILAKSIKEDH

SLVRSMKEDH

DLTRSLKRDH

VLLKSLKRDH

EIIRSFKTDH

SLVASIKKDH

YLIQSMRQDH

AMYREAKECI

AMWREARECI

EMWREAKECL

ALWREARECL

ALWREAKECL

AMWREAKECI

493

IPFDRLAPEE SQPITFLKKA MPDYAA.......

CCLRRTCP.........................

YV.....SDE GEWYYKADP NLYGEVKVRA D..

FV.....SDE GDWYYEADP NLYGEIKVTA E. .

YV.....SDT GDWYYQKDP KLSGIGGEKT E. .

YV.....SDV GDWYYQTDP QLTGAEKS.....

FV.....PDT GDIVYYQSDP QISGSLKPE. ...

FV.....SDT GDWYYQTDS KINGSSKLE. ...

YV.....SDT GDIVFYETDP DLYVYASDKS KIN

FV.....SDT GDWYYQTDŚ LLLHSQRD.....

YVEPDREGDK KGVYWYNNKL .............

YVEPDQSTES KGVFWYNNKL .............

YVEKDESSQG KGVFWYKNKL .......... , . .

YVEPDEGTSE KGVYWYRNKY .............

FVEPDEGAPT QGVFWYRNKY .............

FIEPEKGRES KGVYWY.NKF .............

187 096

LISTA SEKWENCJI nr 2

Sekwencja nukleotydowa i sekwencja aminokwasowa otwartej ramki odczytu z plazmidu pCrepl.

ATGGGTGGCGGTGGCCGTGGTCGGACTTCGCAAAA^(^C^C^C^'^C.ATGGA^(^(^'rGTCTCAGTT

MGGGGRGRTSQKPLMERVSV aATCCACCCTTCACCGTGAGTGATCTCAAGCjA^(^<^CV^TrC^<^<^T^CC^ATTGCT^l^^AA^GC_GA DPPETVSDLKQAI PPHCFKR

TCTGTAATCCGTTCCTCTTACTACATAGTCCACGATGCTATTATCGCCTACA_TCTTCTACSVIRSSYYIVHDAI IAYIFY

TTCCTTGCCGACAAATACATTCCGATTCTCCCTGCCCCTCTAGCCTACCTCGCTTGGCCC

FLADKYIPILPAPLAYLAWP

CTTTACTGGTTCTGTCAAGCTAGCATCCTCACCGGCTTATGGGTCATCGGTCACGAATGC LYWFCQAS ILTGLWVIGHEC

GGTCACCATGCCTTCAGCGACTACCAGTGGGTTGACGACACTGTGGGCTTCATCCTCCAC GHHAFS DYQWVDDTVGFILH

TCGTTTCTCATGACCCCGTATTTCTCCGGG/AATTACAGCCACCGGAACCACCATGCCAAC

SFLMTPYFSWKYSHRNHHAN

ACAAATTCGCTTGACAACGATGAAGTCTACATCCCCAAAAGCAAGGCCAAAGTCGCGĆTT TNSLDNDEVYIPKS K A K V A L

CACTATAAAGTTCCCAACCACCCACCTGGCCGACTGTTGATTATGTTCATCACCTTCACC

YYKVLNHPPGRLLIMFITFT

CTAGGCTCCCCTCT^,ATACCTCTTTACCAACΓATTTCCGGCAAGAAGTATGAAAGGTTTGCC

LGFPLYLFTNISGKKYERFA

AACCATTTCGACCCCATGAGTCCGATTTTCAAAGAGCGTGAGCGGTTTCAGGTCCTGCTA

NHFDPMSPIFKERERFQVLL

CCGGACCCTGGCCCCCTTGCTGTGCTTTACGGAGTΊ7AACTTGCGGTAGCAGCGAAA.GGc S DLGLLAVLYGVKLAVAAKG

GCCGCCTGGGTGACGTGCCA[CCTACGG?AA?TCCAGGCTCAGGCGTGGTTATCTTCCCCGAC AAWVTCIYGIPVLGVFI FFD

ATCATCACCTACCTGCACCACACCCA.TCTGCCGTTGCCTCATCACGATTCACCTGAATGG I IYLLHTHHLSLPHYDS SEW

AACTGGCCCAGAGGGGCTCCGTCAACAATCGATAGGGACTTTGGGTTCCCGAATAGTGTG

NWLRGALSTIDRDFGFLNSV

CTCCATGATGTTACACACACTCACGTTATGCATGAΓCTGTTTTCATACATCCCACACTAC LHDVTHTHVMHHLFSYI PHY

CATGCGAAG<GAGGCCA^GGGATGCCAA?CCAACACGGTCTGGGCGACTTTTACAAGATCGAC HAKEARDAINTVLGDY YKID

AGGACCCCAATTCT^,GAAAGCAATGTGGAGAGAGGC<CAGGGAA^,GCATCTTCACCGAGCCC

RTPILKAMWREAKECIFIEP

GAAAAAGGTAGGGAGTC CAAGGGTGTATATTGGTACWAT AŻAATTCTGA EKGRESKGYYWYNK F *

187 096

FIG. 2

Eco RI

Eco RI Hind III *

Xba I

ca 8.5 kb

187 096

FIG. 3

187 096

FIG. 4

φ u r* 5

o CJ <N

O O CM

O CO «Η

O UD r—ł

O τΤ rH

O <N rH

O O rH

O CO

o VD

O TT

O ΓΊ

O Λ 1 1

Φ

[c

E

187 096

FIG. 5

187 096

FIG. 6 co co co co co o

-CM

Γ0

CM

CD

CM

CO

CM coco

O

-o co

CD cm

CM co · CM o

en·

CM

CD -ςΤ CM o

•co

CM

O •CO

CM

O •^r

CM

II

CMCM

CD

CM

O •OJ

CM

CD

-o cm o

•co

nr o

c <0

C c

D jQ <

i“T

Τ*' 1

o	o	o	o	σ	O
O	o	o	o	o
in	Ό-	co	CU	1-

187 096

FIG. 1

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz.

Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania kwasu krepeninowego, znamienny tym, że kwas linolowy przeprowadza się w kwas krepeninowy [kwas 9-oktadecen-12-ynowy] stosując acetylenazę delta 12 [Numer EC 1.14.99.33] z Crepis alpina o sekwencji aminokwasowej zgodnej z Listą Sekwencji 2.
2. Sekwencja cDNA kodująca acetylenazę delta 12 Crepis alpina o sekwencji nukleotydowej zgodnej z Listą Sekwencji 2.
3. Zastosowanie sekwencji cDNA określonej w zastrz. 2 do transformacji organizmów wybranych z grupy obejmującej uprawne rośliny oleiste oraz drożdże i pleśnie wytwarzające oleje.
4. Zastosowanie według zastrz. 3, w którym organizmami są organizmy akumulujące olej, wybrane z grupy obejmującej uprawne rośliny oleiste oraz drożdże i pleśnie wytwarzające oleje.
5. Organizmy stransformowane cDNA acetylenazy określonym w zastrz. 2, wybrane z grupy obejmującej uprawne rośliny oleiste oraz drożdże i pleśnie wytwarzające oleje.