CZ313598A3 - Nový rostlinný enzym a jeho použití - Google Patents
Nový rostlinný enzym a jeho použití Download PDFInfo
- Publication number
- CZ313598A3 CZ313598A3 CZ983135A CZ313598A CZ313598A3 CZ 313598 A3 CZ313598 A3 CZ 313598A3 CZ 983135 A CZ983135 A CZ 983135A CZ 313598 A CZ313598 A CZ 313598A CZ 313598 A3 CZ313598 A3 CZ 313598A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- seq
- delta
- acetylenase
- acid
- fatty acids
- Prior art date
Links
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title abstract description 18
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title abstract description 18
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 claims abstract description 41
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 claims abstract description 41
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 claims abstract description 41
- 108010056748 acetylenase Proteins 0.000 claims abstract description 31
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims abstract description 28
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 claims abstract description 28
- 241001250698 Crepis alpina Species 0.000 claims abstract description 19
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims abstract description 11
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 claims abstract description 7
- HSFWRNGVRCDJHI-UHFFFAOYSA-N alpha-acetylene Natural products C#C HSFWRNGVRCDJHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 23
- -1 acetylene fatty acids Chemical class 0.000 claims description 22
- SAOSKFBYQJLQOS-KTKRTIGZSA-N (9Z)-octadec-9-en-12-ynoic acid Chemical compound CCCCCC#CC\C=C/CCCCCCCC(O)=O SAOSKFBYQJLQOS-KTKRTIGZSA-N 0.000 claims description 12
- 108010074633 Mixed Function Oxygenases Proteins 0.000 claims description 11
- 125000002534 ethynyl group Chemical group [H]C#C* 0.000 claims description 11
- 102000008109 Mixed Function Oxygenases Human genes 0.000 claims description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 10
- SAOSKFBYQJLQOS-MDZDMXLPSA-N (e)-octadec-9-en-12-ynoic acid Chemical compound CCCCCC#CC\C=C\CCCCCCCC(O)=O SAOSKFBYQJLQOS-MDZDMXLPSA-N 0.000 claims description 9
- OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N Linoleic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N 0.000 claims description 8
- 235000020778 linoleic acid Nutrition 0.000 claims description 7
- OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N linoleic acid Natural products CCCCC\C=C/C\C=C\CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N 0.000 claims description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 6
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 claims description 5
- 235000021122 unsaturated fatty acids Nutrition 0.000 claims description 2
- 150000004670 unsaturated fatty acids Chemical class 0.000 claims description 2
- 239000003921 oil Substances 0.000 abstract description 25
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 abstract description 17
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 abstract description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 abstract description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 23
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 18
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 16
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 108010011713 delta-15 desaturase Proteins 0.000 description 13
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 241000723221 Crepis Species 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 235000004443 Ricinus communis Nutrition 0.000 description 8
- 240000000528 Ricinus communis Species 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 8
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 6
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 5
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 5
- HPNMFZURTQLUMO-UHFFFAOYSA-N diethylamine Chemical class CCNCC HPNMFZURTQLUMO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 235000019387 fatty acid methyl ester Nutrition 0.000 description 5
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 5
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 5
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 150000003278 haem Chemical class 0.000 description 4
- VKOBVWXKNCXXDE-UHFFFAOYSA-N icosanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O VKOBVWXKNCXXDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 150000004702 methyl esters Chemical class 0.000 description 4
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 102220056331 rs730880069 Human genes 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 3
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 description 3
- 235000011293 Brassica napus Nutrition 0.000 description 3
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 235000021588 free fatty acids Nutrition 0.000 description 3
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 3
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 3
- PBUBQZYMYOKABE-ZHACJKMWSA-N methyl (e)-octadec-9-en-12-ynoate Chemical compound CCCCCC#CC\C=C\CCCCCCCC(=O)OC PBUBQZYMYOKABE-ZHACJKMWSA-N 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 229940049964 oleate Drugs 0.000 description 3
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 3
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 3
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 101150115493 FAD3 gene Proteins 0.000 description 2
- IMNFDUFMRHMDMM-UHFFFAOYSA-N N-Heptane Chemical compound CCCCCCC IMNFDUFMRHMDMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N NADPH Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 2
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 150000002066 eicosanoids Chemical class 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FIKTURVKRGQNQD-UHFFFAOYSA-N icos-2-enoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC=CC(O)=O FIKTURVKRGQNQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 230000003228 microsomal effect Effects 0.000 description 2
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- SAOSKFBYQJLQOS-UHFFFAOYSA-N octadec-9-en-12-ynoic acid Chemical compound CCCCCC#CCC=CCCCCCCCC(O)=O SAOSKFBYQJLQOS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- OYHQOLUKZRVURQ-UHFFFAOYSA-N 9,12-Octadecadienoic Acid Chemical compound CCCCCC=CCC=CCCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 235000011299 Brassica oleracea var botrytis Nutrition 0.000 description 1
- 240000003259 Brassica oleracea var. botrytis Species 0.000 description 1
- 241000195940 Bryophyta Species 0.000 description 1
- XWDULLADLUEGPT-UHFFFAOYSA-N CCCCCC#CCC=CCCCCCCCC(=O)N(CC)CC Chemical compound CCCCCC#CCC=CCCCCCCCC(=O)N(CC)CC XWDULLADLUEGPT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100273639 Carassius auratus ccna1 gene Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UGFAIRIUMAVXCW-UHFFFAOYSA-N Carbon monoxide Chemical compound [O+]#[C-] UGFAIRIUMAVXCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-IGMARMGPSA-N Carbon-12 Chemical compound [12C] OKTJSMMVPCPJKN-IGMARMGPSA-N 0.000 description 1
- 102100035882 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N CoASH Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N 0.000 description 1
- 101000848267 Crepis alpina Delta(12) fatty acid dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 241000125469 Crepis rubra Species 0.000 description 1
- XFXPMWWXUTWYJX-UHFFFAOYSA-N Cyanide Chemical compound N#[C-] XFXPMWWXUTWYJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 102100027297 Fatty acid 2-hydroxylase Human genes 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 101000937693 Homo sapiens Fatty acid 2-hydroxylase Proteins 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 241001138417 Limnanthes douglasii Species 0.000 description 1
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 235000003846 Ricinus Nutrition 0.000 description 1
- 241000322381 Ricinus <louse> Species 0.000 description 1
- 244000000231 Sesamum indicum Species 0.000 description 1
- 235000003434 Sesamum indicum Nutrition 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- 102100028897 Stearoyl-CoA desaturase Human genes 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000012271 agricultural production Methods 0.000 description 1
- DTOSIQBPPRVQHS-PDBXOOCHSA-N alpha-linolenic acid Chemical compound CC\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O DTOSIQBPPRVQHS-PDBXOOCHSA-N 0.000 description 1
- 235000020661 alpha-linolenic acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical group 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 108010027375 bacterioferritin Proteins 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-YPZZEJLDSA-N carbon-10 atom Chemical compound [10C] OKTJSMMVPCPJKN-YPZZEJLDSA-N 0.000 description 1
- 150000001793 charged compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N coenzime A Natural products OC1C(OP(O)(O)=O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005516 coenzyme A Substances 0.000 description 1
- 229940093530 coenzyme a Drugs 0.000 description 1
- 230000008094 contradictory effect Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000006356 dehydrogenation reaction Methods 0.000 description 1
- KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N dephosphocoenzyme A Natural products OC1C(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N dihydroxy(oxo)silane Chemical compound O[Si](O)=O IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002009 diols Chemical class 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 239000011539 homogenization buffer Substances 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000033444 hydroxylation Effects 0.000 description 1
- 238000005805 hydroxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229940049918 linoleate Drugs 0.000 description 1
- 229960004488 linolenic acid Drugs 0.000 description 1
- KQQKGWQCNNTQJW-UHFFFAOYSA-N linolenic acid Natural products CC=CCCC=CCC=CCCCCCCCC(O)=O KQQKGWQCNNTQJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000037356 lipid metabolism Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- VJZWIFWPGRIJSN-NBTZWHCOSA-N octadeca-9,12-dienoic acid;(9z,12z)-octadeca-9,12-dienoic acid Chemical compound CCCCCC=CCC=CCCCCCCCC(O)=O.CCCCC\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O VJZWIFWPGRIJSN-NBTZWHCOSA-N 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000003348 petrochemical agent Substances 0.000 description 1
- 108010001545 phytoene dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 235000003441 saturated fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000004671 saturated fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
- C12N15/8247—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified lipid metabolism, e.g. seed oil composition
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
- C12P7/6409—Fatty acids
- C12P7/6427—Polyunsaturated fatty acids [PUFA], i.e. having two or more double bonds in their backbone
- C12P7/6431—Linoleic acids [18:2[n-6]]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
- C12P7/6436—Fatty acid esters
- C12P7/6445—Glycerides
- C12P7/6472—Glycerides containing polyunsaturated fatty acid [PUFA] residues, i.e. having two or more double bonds in their backbone
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
1 fv ·· f * · ···· ·· ·· ···· ·· · · · · · • « · · · · · · ® ♦ « <| ···· ·· ··· ··· ··· ··«· · ·
Nový rostlinný enzym a jeho použití Oblast techniky Předkládaný vynález se týká nového rostlinného enzymu. Přesněji, předkládaný vynález se týká způsobu pro produkci acetylenových sloučenin v určitých acetylenových mastných kyselinách, cDNA kódující rostlinnou acetylenasu mastných kyselin, použití uvedené cDNA pro transformaci organismů akumulujících oleje za účelem produkce acetylenových mastných kyselin jako takových, organismů produktujících olej, stejně jako olejů z nich vyrobených.
Dosavadní stav techniky
Ve světě je značný zájem o produkci chemických surovin jako jsou mastné kyseliny pro průmyslové použití z obnovitelných rostlinných zdrojů, spíše než z neobnovítelných petrochemikalií. Toto pojetí má značný význam jak pro výrobce, tak pro spotřebitele, vzhledem k zachování zdroje a kromě toho poskytuje významné možnosti pro vývoj nových industriálních plodin pro zemědělství.
Existuje značná rozmanitost neobyvklých mastných kyselin v olejích z přirozených druhů rostlin, které byly dobře charakterizovány (viz například Badami a Patil, 1981). Mnoho z těchto kyselin je potenciálně možno použít v průmyslu. Toto vedlo k zájmu o umožnění zemědělské produkce určitých mastných kyselin v domestikovaných odpovídajících druzích rostlin.
Nicméně, rozvoj genového inženýrství v kombinaci s důkladnějším pochopením biosyntesy neobvyklých mastných kyselin nyní umožňuje provést genový přenos genů kódujících klíčové enzymy, které se účastní syntesy určité aminokyseliny z přirozených druhů, do vybrané domestikované plodiny s olejnatými semeny. Tímto způsobem mohou být produkovány specifické mastné kyseliny vysoké čistoty a množství za přijatelných nákladů.
Jednou třídou mastných kyselin, která je zejména zajímavá, jsou acetylenové mastné kyseliny, skládající se z acylového řetězce majícího dva sousední uhlíkové atomy navázané acetylenovou neboli trojnou vazbou. Vzhledem ke své vysoké reaktivitě mohou být ideálně vhodné pro produkci potahů, plastů a mazacích činidel. Přenosem genů odpovědných za produkci specifických acetylenových kyselin z přirozených druhů do komerčních druhů s olejnatými semeny, nebo do jakéhokoliv jiného organismu, který akumuluje oleje, který může být snadno množen, by mělo být možné vyvinout obnovitelný primární zdroj tohoto oleje obsahujícího acetylenové mastné kyseliny pro průmyslové použití.
Tvorba acetylenových vazeb v mastných kyselinách v různých druzích mechu probíhá pomocí odstranění vodíků z dvojné vazby (Kohn a kol., 1994).
Druhy Crepis mají olejnatá semena s vysokým obsahem acetylenových kyselin (Badami a Patil, 1981; Hirsinger, 1991).
Podstata vynálezu Předkládaný vynález poskytuje nový způsob pro produkci acetylenových mastných kyselin z transgenních organismů akumulujících oleje. - 3 - 3
Původci charakterizovali enzym (acetylenasu), který je odpovědný za produkci 9-oktadecen-12-inové kyseliny (dále též "krepeninová kyselina") z 9,12-oktadekadienové kyseliny (kyselina linolová) v membránových frakcích z vyvíjejících se semen Crepis alpina. Charakterizace acetylenasy z Crepis alpina ukázala, že acetylenasa má velmi podobné biochemické vlastnosti jako non-hem obsahující monooxygenasy oleát delta 12 a linoleát delta 15 (omega 3) desaturasy. Na základě předpokladu, že biochemická podobnost pozorovaná mezi acetylenasou a enzymy produkujícími kyselinu linolovou a kyselinu linolenovou (delta 12 a delta 15 desaturasy) by mohla být také spojena s podobností v primární sekvenci kompletní cDNA těchto proteinů (pCrepl), kódující domnělou acetylenasu, byla izolována z Crepis alpina.
Nejprve byly z Crepis alpina charakterizovány dva typy cDNA fragmentů, získaných za použití PCR a primerů navržených za pomoci seřazení proteinových sekvencí delta 12 desaturas. Analýza DNA sekvence ukázala, že je vysoce homologní ke všem jiným rostlinným endoplasmatickým retikulárním (ER) delta 12 desaturasám a hydroxylase z ricinových bobů. Další charakterizovaný cDNA fragment měl sekvenci, která byla homologní k sekvenci rostlinné ER delta 12 desaturasy, ale byl odlišný nejen v počtu nekonzervovaných aminových zbytků, ale také v počtu aminokyselinových zbytků, které byly vysoce konzervované ve všech delta 12 ER desaturasách. Za použití Northern blot analýz genu kódujícího tuto cDNA (pCrepl) bylo zjištěno, že vysoce exprivována specificky pouze v semenech, ve srovnání s expresí v tkáni listu. Tato zjištění dohromady a uvážení jedinečného biochemického charakteru buněk v semenech poskytují silný důkaz toho, že izolovaná cDNA (pCrepl) z C. alpina kóduje enzym 4
···· ** ·· • · · » t · · · Ι·« ··· • · odpovědný za konversi kyseliny linolové na 9-oktadecen-12-inovou kyselinu, tedy "krepeninovou kyselinu".
Nakonec, konečný důkaz, že cDNA, pCrepl, z C. alpina kóduje rostlinný enzym acetylenasa, byl získán expresí tohoto genu ve kvasinkách. Exprese tohoto genu spolu s přidáním kyseliny linolové do kultury těchto kvasinek vedla k produkci delta 12 acetylenové kyseliny, 9-oktadecen-12-inové kyseliny ("krepeninové » kyseliny"), jak bylo potvrzeno analýzou extrahovaných kvasinkových mastných kyselin za použití analýzy hmotnostní spektrometrií.
Proto, v prvním aspektu, se předkládaný vynález týká způsobů pro produkci acetylenových sloučenin, ve kterých je dvojná vazba konvertována na acetylenovou vazbu acetylenasou.
Ve výhodném provedení způsobu jsou acetylenové mastné kyseliny produkovány konversi nenasycených mastných kyselin na acetylenové mastné kyseliny působením acetylenasy mastných kyselin.
Ve druhém aspektu se vynález týká cDNA kódující acetylenasu monooxygenasového typu se smíšenou funkcí obsahující tři konzervované histidinové motivy (HX(3 nebo 4)H, HX(2 nebo 3)HH a HX(2 ηθ];30 3)HH) podle obrázku 1 na připojených výkresech. V dalším provedení se vynález týká cDNA kódující acetylenasu mastných kyselin, jako je Crepis alpina delta 12 acetylenasa obsahující sekvenci podle obrázku 3 na připojených výkresech nebo jakoukoliv nukleotidovou sekvenci, která je k ní významně homologní. 5
♦ · · «·· ··· • ·
Ve třetím aspektu se vynález týká použití výše popsané cDNA pro transformaci organismů. Organismem může být organismus akumulující acetylenové sloučeniny nebo organismus akumuluj ící oleje, v příslušném pořadí.
Ve čtvrtém aspektu se vynález týká organismů transformovaných cDNA pro acetylenasu jak byla popsána výše. Organismy akumulují acetylenové sloučeniny nebo oleje, jejich příklady jsou olejnaté plodiny, oleogenní kvasinky a plísně. V pátém aspektu se vynález týká acetylenových sloučenin akumulovaných v organismech popsaných výše. V šestém aspektu se vynález týká olejů z organismů akumulujících oleje popsaných výše.
Ve výhodném provedení se předkládaný vynález týká transformace organismů akumulujících oleje uvedenou izolovanou cDNA z cDNA knihovny semen Crepis alpina za účelem produkce acetylenových mastných kyselin a konkrétně 9-oktadecen-l2-inové kyseliny ("krepeninové kyseliny").
Olej semen C. alpina je bohatý na 9-oktadecen-12-inovou kyselinu ("krepeninovou kyselinu") (Hirsinger, 1989)). Původci studovali syntésu kyseliny 9-oktadecen-12-inové ("krepeninové kyseliny") v semenech C. alpina. Přívod exogenních 1-14C-značených volných mastných kyselin do intaktních vyvíjejících se kotyledonů semen C. alpina prokázalo, že linoleat je prekursor kyseliny 9-oktadecen-12-inové ("krepeninová kyselina"). Toto je v protikladu k dříve publikovaným výsledkům pro biosyntesu kyseliny 9-oktadecen-12-inové ("krepeninové kyseliny") v Crepis rubra (Haigh a James, 1967). Ačkoliv bylo prokázáno, že reakce *· ···· *♦ Μ • ·· 6
• · · · · · · • · · · # · · ·· · · · ··· · ·· I · · · « * tvorby acetylenových kyselin v mechách je desaturační proces (Kohn a kol., 1994), může být takový desaturační proces proveden mnoha různými typy nepříbuzných rostinných enzymů, jako jsou fytoen desaturasy (Wieland a kol., 1994) nebo non-hem obsahující proteiny, kde z druhé uvedené třídy enzymů některé vykazují velmi malé homologie aminokyselinové sekvence, kromě tří konzervovaných histidinových motivů (Shanklin a kol., 1994). Bylo naznačeno, že biosyntesa acetylenových mastných kyselin probíhá přes sekvenci meziproduktů katalyzovaných různými enzymatickými reakcemi. Například, soudilo se, že acetylenové vazby jsou tvořeny jako vedlejší metabolická dráha syntesy nasycených mastných kyselin (Diedrich a Henschel, 1991); nebo přes epoxygenaci dvojné vazby s následnou konversí na diol, který je potom dehydratován ve dvou krocích za tvorby acetylenové vazby (Van de Loo a kol., 1993). Vzhledem k těmto protikladným alternativán nebyl v době podání předkládané patentové přihlášky SE 9601236-4 znám vůbec nebo nebyl zřejmý charakter enzymu acetylenasa ani mechanismus jeho účinku.
Enzym podle předkládaného vynálezu, který je odpovědný za syntesu kyseliny 9-oktadecen-12-inové ("krepeninové kyseliny") (nazvaný delta 12 acetylenasa), byl podle vynálezců prokázán aktivní pouze v membránových (mikrosomálních) frakcích připravených z vyvíjejících se semen Crepis alpina, za podmínek, že homogenizační pufr obsahoval NADH nebo NADPH, katalasu a volný koenzym A. Charakterizace mikrosomální acetylenasy a její srovnání s delta 12 desaturasou (odpovědnou za desaturaci oleátu na linoleat) ukázala, že tyto enzymy mají velmi podobné vlastnosti. Oba enzymy vyžadují 02 a NADH nabo NADPH; kde obě koredukční činidla působí stejně s oběma enzymy. Kyanid (CN-) a protilátky proti květákovému cytochromu b^ inhibovaly oba tyto • · ·« 7 enzymy, zatímco oxid uhelnatý neměl signifikantní účinek na aktivitu ani jednoho enzymu. Tato data naznačují, že oba enzymy jsou biochemicky podobné. Oleát delta 12 hydroxylasa z ricinových bobů má také podobné biochemické vlastnosti jako delta 12 desaturasa i přesto, že katalyzuje různé reakce (Bafor a kol, 1991; Smith a kol., 1992). Později bylo prokázáno, že gen pro delta 12 hydroxylasu z ricinových bobů má signifikantní homologii sekvence s geny pro ER delta 12 desaturasu (FAD 2 geny) (Van de Loo a kol., 1995). Protože delta 12 acetylenasa, stejně jako delta 12 desaturasy (FAD2), katalyzuje dehydrogenaci mezi uhlíky 12 a 13 acylového řetězce a podobně jako delta 15 desaturasa (FAD3) utilizuje kyselinu linolovou jako substrát, vynálezci usoudili, že gen pro acetylenasu by mohl mít určitou homologii sekvence s geny pro FAD2 a/nebo FAD3.
Vynález bude nyní podrobněji popsán v následujících příkladech a připojených výkresech.
Popis obrázků na výkresech
Obrázek 1: Restrikční mapa pCrepl.
Obrázek 2: Restrikční mapa pVT-Crepl.
Obrázek 3: Superponované chromatogramy jednotlivých iontů 333, 365, 367 z FADEA připravených z celkových mastných kyselin extrahovaných z kvasinek kmene YN94-1 transformovaných pVT-Crepl. Písmena označují píky představující následující diethylamidové deriváty mastných kyselin: A, kyselina eikosanová; B, kyselina eikosaenová; C, 9-oktadecen-12-inová kyselina. 8
• ♦
Obrázek 4: Superponované chromatogramy jednotlivých iontů 333, 365, 367 z FADEA připravených z celkových mastných kyselin extrahovaných z kvasinek kmene YN94-1 transformovaných prázdným vektorem (pVTlOOU; kontrola). Písmena označují píky představující následující diethylamidové deriváty mastných kyselin: A, kyselina eikosanová; B, kyselina eikosaenová.
Obrázek 5: Celkový iontový chromatogram FADEA připravených z mastných kyselin obohacených v domnělé 9-oktadecen-12-inové kyselině z lipidových extraktů z YN94-1 transformovaných pVT-Crepl. Písmena označují píky představující následující diethylamidové deriváty mastných kyselin: A, kyselina hexadekanová; B, kyselina oktadekanová; C, oktadeka-9, 12-dienoová kyselina; D, 9-oktadecen-12-inová kyselina.
Obrázek 6: Hmotnostní spektrum sloučenin odpovídajícím píku D na obrázku 5. Příklady provedeni vynálezu
Klonování předpokládaného genu pro acetylenasu
Srovnání aminokyselinových sekvencí z různých druhů ukázalo, že desaturasy mastných kyselin vázané na membrány mohou být přiřazeny do tří různých skupin podle homologie jejich předpokládaného zralého proteinu (plastid delta 12 desaturasy, ER delta 12 desaturasy a delta 15 desaturasy; viz seznam sekvencí 1). Hydroxylasa z ricinových bobů (Van de Loo a kol., 1995) má vysokou homologii s ER delta 12 desaturasami, která je takového stupně, že tyto sekvence nejsou snadno rozlišitelné. Kromě toho, sekvence ze všech tří tříd enzymů vykazují mezi sebou určitý
• · MM 9 • · · • · stupeň homologie sekvence.
Na základě tohoto srovnání byly navrženy oligonukleotidové primery a byly syntetizovány pro tyto tři skupiny sekvencí a pro konsensus všech těchto sekvencí. Sekvence těchto primerů jsou uvedeny dále. (i) konsensuální primery (primery navržené pro konsensus všech tří skupin desaturas vázaných na membrány a hydroxylasu mastných kyselin z ricinových bobů): sense primer: GSN CAY GAN TGY GSN CAY antisense primer: RAN ADR TGR TGN RBN AYR TG. (ii) primery pro plastid delta 12 desaturasy:
sense primer: TGG MGN TTY AAR CAY GAY MG antisense primer: GTN SWC ATC CAR AAR TGR TA. (iii) primery pro ER delta 12 desaturasy včetně hydroxylasy mastných kyselin z ricinových bobů:
sense primer: CAY GAR TGY GGN CAY CAY GC antisense primer: CCN CKN ARC CAR TCC CAY TC. (iv) primery pro delta 15 desaturasy:
sense primer: ACN CAY CAY CARAAY CAY GG antisense primer: CAY TGY TTN CCN CKR TAC CA. Póly A+ RNA byla izolována z vyvíjejících se semen (100 mg) 10 • · • · · C. alpina za použití QuickPrep Micro mRNA přečištovacího kitu od Pharmacia Biotech. Všechna póly A+ RNA z tohoto přečištění byla vysrážena a použita k syntese prvního řetězce cDNA, který byl započat jak oligo dT, tak náhodnými hexamery a který byl syntetizován za použití Superscript II reversní transkriptasy od Gibco BRL. Potom byla použita polymerasová řetězová reakce (PCR), s uvedenými primery a touto cDNA, pro amplifikaci produktů s následujícími podmínkami pro cykly: 1 cyklus při 94 °C po dobu 2 minut, 30 cyklů (94 °C, 30 sekund; 50 °C, 30 sekund; 72 °C, 30 sekund) a nakonec jeden cyklus 72 °C po dobu 5 minut.
Produkty byly získány pro všechny použité primery; zajímavé je, že primery proti ER delta 12 desaturasám dávaly výrazně více produktu, než ostatní použité primery. Velikost PCR produktů z delta 12 a delta 15 primerů odpovídala předpokládané velikosti. PCR produkty získané amplifikaci s ER delta 12 primery a delta 15 primery byly tupě zakončeny T4 a klenow polymerasami a byly klonovány do EcoRV místa plasmidového vektoru Bluescript. DNA sekvencování mnoha klonů ukázalo, že za použití těchto dvou sad primerů byly amplifikovány alespoň tři různé sekvence: (i) vysoce konzervovaná sekvence delta 15 desaturasy, (ii) vysoce konzervovaná sekvence ER delta 12 a (iii) sekvence (D12V) mající homologii k ER delta 12 sekvencím, ale vykazující různé odlišnosti i v některých aminokyselinových zbytcích, které byly vysoce konzervovány ve všech jiných sekvencích pro desaturasy.
Analýza mastných kyselin z C. alpina ukázala, že kyselina 9-oktadecen-12-inová ("krepeninová kyselina") je pravděpodobně přítomna pouze v semenech. Northern blot analýza při vysoké přísnosti ukázala, že mRNA z D12V sekvence popsané výše byla 11 11
• · exprivována ve vysokém množství v semenech, ale nikoliv v listech, což je v souladu s pozorováním, že kyselina 9-oktadecen-12-inová ("krepeninová kyselina") byla pozorována pouze v semenech. cDNA knihovna byla připravena z vyvíjejích se semen z C. alpina za použití Uni-ZAP XR klonovacího kitu pro cDNA od Stratagene a byla vyšetřována náhodně značenou D12V sekvencí. Z tohoto vyšetřování bylo hodnoceno, že cDNA kódující D12V sekvence vyla přítomna ve značném množství; což předpokládá vysoký stupeň exprese tohoto genu. Po izolaci jednotlivě hybridizujících lambda plaků byl pBluescript fagemid excidován za použití ExAssist/SOLR systému od Stratagene. Takto získané fagemidy byly potom použity pro produkci dvojřetězcového DNA plasmidu. Z těchto kolonií byl izolován kompletní klon (pCrepl, viz obrázek 1) za použití DNA sekvencování a restrikčního mapování izolovaného plasmidu.
Insert z pCrepl, 1,5 kb insert obsažený ve vektoru pBluescript SK, byl sekvencován a z tohoto insertu byl odvozen otevřený četecí rámeček kódující 375 aminokyselinový protein (seznam sekvencí 2). Analýza sekvence tohoto proteinu ukázala přibližně 60% identitu a 80% podobnost s jinými rostlinnými delta 12 desaturasovými proteiny a přítomnost zaznamenání hodných rozdílů v homologii, kdy určité zbytky, které byly konzervovány mezi všemi ostatními desaturasami, nebyly v této sekvenci (viz seznam sekvencí 1). Byly přítomné tři histidinové motivy, které byly prokázány jako konzervované v mnoha non-hem obsahujících monooxygenasách katalyzujících hydroxylaci a desaturační reakce (Shanklin a kol., 1994).
Exprese pCrep cDNA a detekce kyseliny 9-oktadecen-12-inové ("krepeninové kyseliny") v transgenních kvasinkách 12
• · • · · · « pCrepl otevřený čtecí rámeček byl uvolněn z pCrepl na Smal/Xhol restrikčním fragmentu a 1,5 kb Crepl otevřeného čtecího rámečeku získaného z gelového přečištění (Landridge a kol., 1980). pVT100-U DNA (Vernet a kol., 1987) byla trávena za použití PvuII a Xhol. 50 ng PvuII/XhoI-linearizovaného pVTlOO bylo ligováno s 100 ng 1,5 kb Smal/Xhol fragmentu odpovídajícího Crepl otevřenému čtecímu rámečku za použití T4 DNA ligasy (NBL Genen Science Ltd., UK). Část ligační směsi byla použita pro transformaci kompetentních E. coli DHa buněk. Byl vybrán jeden klon (pVT-Crepl), který obsahoval očekávaný 1,5 kb insert a konstrukt byl ověřen trávením EcoRI nebo HindlII + Xbal. Obě trávení dávala očekávané produkty (přibližně 5,3, 2,3 a 0,8 kb pro EcoRI trávení a 1,5 kb otevřený čtecí rámeček pro HindlII + Xbal trávení). pVT-Crepl DNA (viz obrázek 2), nebo prázdný vektor pVTlOOU, byly použity pro transformaci Saccharomyces cerevisiae kmenů YN94-1 a C13-ABYS86, za použití PLATE metody podle Elble (1992). Kvasinky transformované přes noc byly kultivovány na SCD minus uráčil agaru a jednotlivé kolonie byly přeneseny na čerstvé selektivní (minus uráčil) plotny. YN94-1 a C13-ABYS86 kmeny kvasinek transformované pVT-Crepl DNA a prázdným vektorem (pVTlOOU; kontrola) byly kultivovány v kuturách s třepáním při 28 °C po dobu pěti hodin v selektivním mediu (bez uracilu; 400 ml) a potom bylo 40 ml kultivačního media obsahujícího kyselinu linolovou rozpuštěnou v Tween 40R přidáno do kultury v konečné koncentraci 0,03% kyseliny linolové a 1% Tween 40R (hmotnost/hmotnost). Po kultivaci po dobu dalších 78 hodin při 28 °C byly buňky peletovány centrifugací a byly promyty disperzí ve 20 ml 0,1 M Tris-HCl pufru pH 7,8 obsahujícím 1% Tween 40R a byly znovu peletovány centrifugací. Buňky byly dále promyty resuspendováním ve 20 ml 0,1 M Tris-HCl pufru pH 7,8 a byly znovu 13 «· · ·· ···· ·· ·· ···· · · · ···· • « · ·« · ···· • · ·«·· ·· ··· ··· ··· ···· · · peletovány. Buňky byly potom extrahovány ve směsi chloroform/methanol/O,15 M kyselina octová (1:2:0,8, uvedeno objemově) v Braun MSK buněčném homogenizátoru se skleněnými korálky (B. Braun Biotech International, Melsungen, Germany) při frekvenci otáček 4000 za minutu po dobu 20 sekund. Kvasinkové lipidy byly extrahovány ze směsi do chloroformové fáze přidáním chloroformu a 0,15 M kyseliny octové v konečných poměrech 1:1:0,9 (uvedeno objemu) chloroformu, methanolu a 0,15 M kyseliny octové. Po centrifugaci směsi byla chloroformová fáze obsahující lipidy odstraněna a odpařena do sucha pod proudem dusíku.
Lipofilní zbytek byl methylován methanolickou HC1 (4% hmotnost/hmotnost) při 85 °C po dobu 45 minut a potom byly methylestery mastných kyselin extrahovány do n-hexanu. Plynově kapalinové (GC) chromatogramy methylesterů separovaných na skleněných kolonách (2,5 m x 3 mm, vnitřní průměr) obsahujících 3% SP-2300 Supelcoport 100/120 mesh (rozměr částice 0,122 až 0,147 mm) (Supelco, Bellefonte, P. USA) ukázaly pík se stejným retenčním časem jako autentický methylester 9-oktadecen-12-inové kyseliny vytvářející více než 0,3% celkové plochy píků ve vzorkách připravených z kvasinek transformovaných pVT-Crepl, ale nikoliv ve vzorkách připravených z kvasinek obsahujících prázdný vektor (pVTlOOU; kontrola).
Protože methylestery acetylenových mastných kyselin mohou být částečně separovány od jiných methylesterů mastných kyselin na silikagelové chromátografii na tenké vrstvě, byly methylestery připravené z YN94-1 transformovaných pVT-Crepl separovány na silikagelových 60 plotnách pro chromatrografii na tenké vrstvě (Merck, Darmstadt, SRN) vyvíjením ploten v hexan/ diethylether/kyselina octová (85:15:1, uvedeno objemově). Oblast 14 ·· · ·· ···· ·· ·· ···· · · · ···· ··· ··· · · · · ·· ···· ·· ··· ··· ··· ···· · · ihned pod hlavní methyesterovou oblastí byla odebrána z plotny a lipidy byly eluovány methanol/chloroform (2:1) a byly analyzovány kapalinovou chromatografií. Frakce se skládaly z methylesterů mastných kyselin, kde pík se stejným retenčním časem jako methylester 9-oktadecen-12-inové kyseliny tvořil více než 12,5% celkové plochy píku.
Methylesterové frakce obohacené o domnělý methylester 9-oktadecen-12-inové kyseliny a celkové methylestery mastných kyselin připravené z YN94-1 transformovaných pVT-Crepl a YN94-1 transformovaných prázdným vektorem (pVTlOOU; kontrola) byly hydrolyzovány v 2,5M KOH ve vodném methanolu (15 % objemových methanolu) při 90 °C po dobu 1 hodiny. Volné mastné kyseliny byly extrahovány do hexanu po okyselení HC1 a hexanová fáze byla odpařena do sucha pod proudem dusíku.
Diethylamidy mastných kyselin (FADEA) byly připraveny z volných mastných kyselin způsobem podle Nilssona a Liljenberga (1991). FADEA byly bud! přímo injikovány do plynové chromatografie s kapalnou stacionární fází spojené s hmotnostním spektrometrem (GS-MS) nebo byly podrobeny dalšímu přečištění silikagelovou chromátogafií na tenké vrstvě vyvíjením ploten v heptan/diethylether/kyselina octová (50:50:1, uvedeno obj emově). FADEA byly analyzovány na Hewlett-Packard 5890 II plynovém chromatografu vybaveném DB225 (0,25 mm (vnitřní průměr) x 30 m, J and W, Folsom, USA) v sérii s Rtx 2330 (Restek Corp., PA, USA) kapilární kolonou ze slinutého oxidu křemičitého, spojenou s Hewlett-Packard 5989A hmotnostním spektrometrem pracujícím v elektronovém impaktním modu při 70 eV. Injekční technika byla • · • ·· ··«· ·· «· • • • · • • • • • • · • · • • • • • • • · • · • • » • • • ··· ··· • • • • · • · • • nepřerušovaná při 100 °C a potom byla teplota co nejrychleji zvýšena na 240 °c. Teplota v pícce byla 100 °C po dobu 7 minut, potom 20 °C za minutu do 190 a potom 1 °C za minutu do konečné teploty 225 °C, která je udržována po dobu dalších 20 minut.. Pozice dvojné vazby byly určeny podle Nilssona a Liljenberga (1991) .
Jednoiontové chromatogramy hmotnostní odpovídajících molekulárnímu iontovému FADEA připravených z celkových mastných kyselin z YN94-1 transformovaných pVT-Crepl a z YN94-1 transformovaných prázdným vektorem (pVTlOOU; kontrola) jsou ukázány na obrázku 5 a 6, v příslušném pořadí. Chromatogram FADEA z YN94-1 transformovaných pVT-Crepl ukázal pík o hmotnosti 333 (odpovídající molekulové hmotnosti diethylamidu kyseliny 9-oktadecen-12-inové), který nebyl přítomen na chromatogramu FADEA z YN94-1 transformovaných prázdným vektorem (pVTlOOU, kontrola). Pík měl retenční čas 57,3 minuty a byl umístěn mezi píky odpovídající eikosanoidovým a eikosanoidovým FADEA derivátům.
Celkový iontový chromatogram FADEA připravených z mastných kyselin obohacených o domnělou kyselinu 9-oktadecen-12-inovou provedený za použití chromátografie na tenké vrstvě (jak je popsána výše), kde mastné kyseliny pocházejí z lipidových extraktů z YN94-1 transformovaných pVT-Crepl, je ukázán na obrázku 5. Hmotnostní spektrum (obrázek 6) domnělých diethylamidových derivátů kyseliny 9-oktadecen-12-inové (pík D na obrázku 5) ukazuje mezeru v hmotnosti 26 amu místo řádných 28 mezi uhlíkem 7 a 9, což ukazuje na dvojnou vazbu v pozici 9.
Kromě toho zde byla mezera 24 amu místo řádných 28 mezi uhlíkem 10 a 12, což ukazuje na přítomnost acetylenové vazby v pozici - 16 - 16 t • · » · • · é · · · 12. Pík D produkoval hmotnostní spektrum identické se spektrem autentického diethylamidu kyseliny 9-oktadecen-12-inové připravené z olejů ze semen Crepis alpina. Tak pík D v chromatogramu na obrázku 5 byl jednoznačně identifikován jako diethylamidový derivát kyseliny 9-oktadecen-12-inové. Jelikož sloučenina nebyla přítomná v kmenech kvasinek, které nebyly transformovány Crepl cDNA, je jasné, že že Crepl cDNA kóduje delta 12 acetylenasu mastných kyselin.
Odkazy:
Badami, R.C., and Patil, K.B. (1981). Strucure and occurrence of unusual fatty acids in minor seed oils. Progress in Lipid Research, 19, 119-53.
Banas, A., Bafor, M., Wiberg, E.ř Lenman, M., Stáhl, U. and Stymne, S. (1997) Biosynthesis of an acetylenic fatty acid in microsomal preparations frora developing seeds of Crepis alpina. In: Williams, J.P., Mobasher, K.U., Lem, N.W. (eds) Physiology, biochemistry and molecular biology of'plant lipids. Kluwer Academie Publisher, Dordrecht. In-press /
Birnboim, H.C., and Doly, J. (1979) A rapid alkaline extrac-tion proceduře for sereening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7, 1513-1523
Diedrich, M. & Henschel, K.P. (1991) The natural occurence of unusual fatty acids: Part 3. Acetylenic fatty acids. Nahrung 35, 193-202
Elble, R. (1992) A simple and efficient proceduře for trans-formation of yeasts. Biotechniques 13, 18-20
Haigh, W.G. & James, A.T. Biochim. Biophys. Acta 137, 391-392
Hirsinger, F. (1989). New annual oil crops. In Oil crops of the world, (eds. G. Rčbbelen, R.K. Downey and A. Ashri) , pp.518-532. Mc-Graw-Hill lne.
Kohn, G., Hartmann, E., Stymne, S. & Beutelmann, P. (1994) Biosynthesis of acetylenic acids in the moss Ceratodon pur-pureus. J. Plant Physiol. 144, 265-271 • ♦ 18
Langridge, J.; Langridge, P and Bergquist P.L. (1980) Extrac-tion of nucleic acids frora agarose gels. Anal. Biochem. 103, 264-271
Nilsson, R. and Liljenberg, C. (1991) The deterraination of double bond positions in polyunsaturated fatty acids -Gaschromátography/ mass spectrometry of the diethylamide derivative. Phytochemical analysis 2, 253-259
Shanklin, J., Whittle, E. & Fox, B.G. (1994) Eight histidine residues are catalytically essential in membrane '^-associated iron enzyme, stearoyl-CoA desaturase and are conserved in alkane hydroxylase and xylene monoxygenase. Biochemistry 33, 12787-12794.
Stymne, S. & Lenman, M. (1996) Novel plant enzyme and use thereof. Swedish patent application no. 9601236-4, 96-03-29.
Vernet, T., Dignard, D. and Thomas, D.Y. (1987) A family of yeast expression vectors containing the phafe fl intergenic region. Gene 52, 225-233
Wieland, B., Feil, C., Gloria-Maercker, E., Thumm, G., Lech-ner, M., Bravo, J.M., Poralla, K. & Goetz, F. (1994) Genetic and biochemical analysis of the biosynthesis of the yellow carotenoid 4,4'-diaponeurosporene of Staphylococcus aureus. J. Bacteriol. 176, 7719-7726. van de Loo, F.J., Broun, P., Turner, S. & Soraerville, C. (1995) An oleáte D12-hydroxylase from Ricinus cotnmunis L. is a fatty acid acyl desaturase homolog. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 95, 6743-6747. van de Loo, F.J., Fox, G. & Somerville, C. (1993) Unusual fatty acids. In: T.S. Moore
Jr (ed.) Lipid Metabolism in Plants. CRC Press, Boča Raton , str. 105. 19 » · t : ι ι 0 ·
4 » * «
« · ···· • · « · • t G • • · ··· 9 » · • • ··
Informace o seznamu sekvencí č. 1
Je uvedeno seřazení aminokyselinových sekvencí pro delta 12 ER a plastidových desaturas, delta 15 desaturas a hydroxylas z ricinových bobů. Také je v tomto seřazení uvedena proteinová sekvence odvozená od pCrepl (crepis). Podtržené jsou tři histidinové motivy, které jsou konzervovány v non-hem obsahujících monooxygenasách.
Sekvence uvedené v tomto seřazení spolu s jejich přírůstkovými čísly jsou: bnom6des.seq, delta 12 desaturasa z Brassica napus (L29214); gmom6des.seq, delta 12 desaturasa z Glycine max (L29215); atom3des.seq, delta 15 desaturasa z Arabidopsis thaliana (L22961); bnom3des.seq, delta 15 z Brassica napus (L22963); rcom3des.seq, delta 15 desaturasa z Ricinus communis (L25897); siom3des.seq, delta 15 desaturasa z orientálního sesamu (U25817); lddlSdes.seq, delta 15 desaturasa z Limnanthes douglasii (U17063); 20 i i 0 · % » ·· * · · · • · ě · · « t · · · · · • ? · « ··· «Μ % * · i Ψ » • M 1« gsom3des, delta 15 desaturasa z Glycine max (L22965); atom3bdes.seq, delta 15 desaturasa z Arabidopsis thaliana (D17597); bnom31des.seq, delta 15 z Brassica napus (L22962); gsom3bdes.seq, delta 15 desaturasa z Glycine max (L22964); atdl2des.seq, delta 12 desaturasa z Arabidopsis thaliana (L26296); gmom6bdes.seq, delta 12 desaturasa z Glycine max (L43921); scoml2des.seq, delta 12 desaturasa z S. commesonii (X92847); gmom6ades.seq, delta 12 desaturasa z Glycine max (L43920); rchyd.seq, oleát 12-hydroxylasa z Ricinus communis (U22378); crepis, acetylenasa Crepis alpina podle této přihlášky. 4 « ·) « · · · 21 • · t ‘ *·
Seznam sekvencí 1 1 50 bnomSdes.seq gnombdes. seq atom3des.seq bnom3des.seq rcom3des.seq siom3des.seq lddl5des.seq gsom3des.seq atom3bdes.seq bnom31des.seq gsom3bdes.seq atdl2des.seq gmom6bdes.seq scoml2des.seq gmom6ades.seq rchyd.seq crepis bnom6des.seq gmomádes. seq atom3des.seq bnom3des.seq rcom3des.seq siom3des.seq lddl5des.seq gsom3des.seq atom3bdes. seq bnom31des.seq gsom3bdes.seq atdl2des.seq gmom6bdes. seq scoml2des.seq gmom6ades.seq rchyd.seq crepis bnomSdes.seq gmoirt6des. seq atom3des.seq bnom3des.seq rcom3des.seq siom3des. seq lddl5des.seq gsom3des.seq atomSbdes.seq bnom31des.seq gsom3bdes.seq atdl2des.seq gmom6bdes. seq scoml2des.seq _gmom6ades .seq rchyd.seq crepis
........................MASRIA DSLFAFTGPQ QCLPRAPKLA
........................MACTLA DSLLLFKGSY Q.KPVLRRDI
.MANLVLSEC GIRPLPRIYT TPRSNFLSNH N...KFRPSL SSSSYKTSSS KAAGWVLSEC GLRPLPRIYS RPRIGFTSKT TNLLKLRELP DSKSYNLCSS .MASWVLSEC GLRPLPRVYP KPRTGHPLLN SNPTKLRFSR TDLGNGSS..
.MASWVLSQY ALNPLPHIFR TPRTSITSHK .........L TVSHTNNRAT
. MATWYHQKC GLKPLAPVIP RPRTGAALSS TSRVEF......LDTNKWA
51 100 SARLSPGVYA VRPIDLLLKG TRRTFLVPAK KRIGCIKAVF VPVAPPSADN AARYSPGIFS LNSNGLIQKR FRRQRNFVTR NKVTVIHAVA IPVQPAPVES PLSFGLNSRD GFTRNWALNV STPLTTPIFE ESP...........LEEDNK FKVSSWSNSK QSNWALNVAV PVNVSTVSGE DDREREEFNG IVN.VDEGKG ...FCLSSGI LREKNWALRV SAPLRVLQVE EEEENKEGER VIN.GGEE..
PDLTKLSLIK FRERKLGLRV SAPFQIASTT PE.............EEDEV
GPKFQPLRCN LRERNWGLKV SAPLRVASIE EEQKSVDLTN GTNGVEHEKL
...........................MW AMDQRTNVNG DPGAGDRKKE ...........................MW AMDQRSNANG D.........
............................MV KDTKPLAYAA NNGYQQKGSS
..........................MGAG GRMPVP____ TSSKKSETDT
..........................MGAG GRTDVP---- PANRKSEVDP
..........................MGAG GRMSAP----NGETEVKRNP
....................MGLAKETTMG GRGRVA____ KVEVQGK.KP
..........................MGGG GRMSTVITSN NSEKKGGSSH
..........................MGGG GR..........GRTSQKPL
101 ISO
AEDREQLAES YGFKQIGQDL PDNVTLKDIM DTLPKEVFEI DDVKAWKSVL AEYRKQLAED YGFRQVGEPL SDDVTLKDVI NPLPKEVFEI DDVKAWKSVL QRFDPGAPPP FNLADIRAAI PKHCWVKNPW KSLSYWRDV AIVFA..... ................................MSYWREL AIVFA..... EFFDAGAPPP FTLADIRAAI PKHCWVKNPW RSMSYVLRDV VWFG..... . . FDPGAPPP FKLSDIREAI PKHCWVKDPW RSMGYWRDV AWFG..... AEFDPGSPPP FKLADIRAAI PKHCWVKNQW RSMSYWRDV VIVLG..... PEFDPGAPPP FNLADIRAAI PKHCWVKDPW RSMSYWRDV IAVFG..... ERFDPSAQPP FKIGDIRAAI PKHCWVKSPL RSMSYWRDI_IAVAA..... ERFDPSAQPP FKIGDIRAAI PKHCWVKSPL RSMSYVARDI FAVVA..... FDFDPSAPPP FKIAEIRASI PKHCWVKNPW RSLSYVLRDV LVIAA..... TKRVPCEKPP FSVGDLKKAI PPHCFKRSIP RSFSYLISDI IIASC..... LKRVPFEKPQ FSLSQIKKAI PPHCFQRSVL RSFSYWYDL TIAFC..... LQKVPTSKPP FTVGDIKKAI PPHCFQRSLI RSFSYWYDL ILVSI..... LSRVPNTKPP FTVGQLKKAI PPHCFQRSLL TSFSYWYDL SFAF...... LKRAPHTKPP FTLGDLKRAI PPHCFERSFV RSFSYVAYDV CLSFL..... MERVSVD.PP FTVSDLKQAI PPHCFKRSVI RSSYYIVHDA IIAYI..... -22- • · • · ι · » · • · ·
Seznam sekvencí 1 (pokračování) bnom6des.seq gmomédes.seq atom3des.seq bnom3des.seq rcom3des.seq siom3des.seq lddl5des.seq gsom3des.seq atom3bdes.seq bnom31des.seq gsom3bdes.seq atdl2des.seq gmom6bdes.seq scoral2des.seq gmomoades. seq rchyd.seq crepis 151
ISVTSYALGL ISVTSYALGL LAAGAAYL.. LAAGAAYL.. LAAVAAYF.. LAAVAAYF.. LAAAAVAA.. LAAAAAYL.. LAIAAVYV.. LAVAAVYF.. LVAAAIHF.. FYYVATNYFS LYYVATHYFH MYYVANTYFH IFYIATTYFH FYSIATNFFP FYFLADKYIP
FMIAKAPWYL FMISKAPWYL .NNWIV .NNWLV .NNWVA . NNWW .NSWAV .NNWLV .DSWFL .DSWFF .DNWLL LLPQPLSYLA LLPGPLSFRG LLPSPYCYIA LLPQPFSLIA YISSPLSYVA ILPAPLAYLA
LPLAWAWTGT
LPLAWVWTGT
WPLYWLAQGT
WPLYWIAQGT
WPLYWFCQGT
WPLYWFAQST
WPLYWVAQGT
WPLYWAAQGT
WPLYWAAQGT
WPLYWAAQGT
WLIYCPIQGT
WPLYWACQGC
MAIYWAVQGC
WPIYWICQGC
WPIYWVLQGC
WLVYWLFQGC
WPLYWFCQAS
AVTGFFVIGH
AITGFFVIGH
MFWALFVLGK
MFWALFVLGH
HFWALFVLGH
MFWALFVLGH
MFWALFVLGH
MFWALFVLGH
LFWAIFVLGH
LFWAIFVLGH
MFWALFVLGH
VLTGIWVIAH
ILTGVWVIAH
VCTGIWVNAK
LLTGVWVIAH
ILTGLWVIGH
ILTGLWVIGH 200
DCAHKSFSKN
DCAHRSFSSN
DCGHGSFSND
DCGHGSFSND
DCGHGSFSNN
DCGHGSFSND
DCGHGSFSNN
DCGHGSFSNN
DCGHGSFSDI
DCGHGSFSDI
DCGHGSFSDS
ECGHHAFSDY
ECGHHAFSDY
ECGHHAFSDY
ECGHHAFSKY
ECGHHAFSEY
ECGHHAFSDY bnom6des.seq gmomódes.seq atom3des. seq bnom3des.seq rcom3des.seq siom3des.seq iddl5des.seq gsom3des.seq atom3bdes.seq bnom31des.seq gsom3bdes.seq atdl2des.seq ginom6bdes. seq scoml2des.seq gmomSades.seq rchyd.seq crepis bnom6des.seq gmom6des. seq atom3des.seq bnom3des.seq rcom3des.seq siom3des.seq lddl5des.seq gsom3des.seq atom3bdes.seq bnoro31des .seq gsom3bdes.seq atdl2des.seq gmom6bdes.seq scoml2des.seq gmomSades.seq rchyd.seq crepis
251 DS.........SPVLRKAII ES.........TPLLRKAII NTLDK..... PTRFFRFTLP KSLDK..... PTRFFRFTLP KSLDN.....VTKTLRFSLP KNLDT.....ATKKLRFTLP RSLDK..... IALTFRFKAP RSLDT.....VTRMLRFTAP KKLPH..... STRMLRYTVP KNLSH..... STRMLRYTVP KNLDS.....MTRLIRFTVP KWYGKYLNNP LGRIMMLTVQ KWYSKYLNNP PGRVLTLAVT GWYSKYLNNP PGRVLSLTIT AWFSKYLNNP LGRAVSLLVT SWYSKYSNNP PGRVLTLAAT ALYYKVLNHP PGRLLIMFIT
FGYGPIRPWL YGYGPFRCWM LVMLAYPFYL LVMLAYPFYL FPMLAYPFYL FPLLAYPIYL FPMLAYPFYL FPLLAFPVYL LPMLAYPLYL LPMLAYPLYL FPLFVYPIYL F.VLGWPLYL L.TLGWPLYL L.TLGWPLYL L.TIGWPMYL L.LLGWPLYL F.TLGFPLYL
SI......AH SI......AH WARSPGKK. . WARSPGKK. . WSRSPGKK. . WSRSPGKQ.. WERSPGKT.. FSRSPGKT.. CYRSPGKE. . WYRSPGKE.. FSRSPGKE. . AFNVSGRPYD ALNVSGRPYD AFNVSGRPYD AFNVSGRPYD AFNVSGRPYD FTNISGKKYE 201
KLVEDIVGTL
KLVEDIVGTL
PKLNSWGHL
PRLNSWGHL
PKLNSWGHL
PKLNSWGHI
HKLNSWGHL
SKLNSWGHL
PLLNSWGHI
PLLNTAVGHI
PLLNSLVGHI
QWLDDTVGLI
QLLDDIVGLI
QWVDDTVGLI
QWVDDWGLT
QLADDIVGLI
QWVDDTVGFI
AFLPLVYPYE
AFMPLIYPYE
LHSSILVPYH
LHSSILVPYH
LHSSILVPYH
LHSSILVPYH
LHSSILVPYH
LHSSILVPYH
LHSFILVPYH
LHSFILVPYH
LHSSILVPYH
FHSFLLVPYF
LHSALLVPYF
LHSALLVPYF
LHSTLLVPYF
VHSALLVPYF
LHSFLMTPYF
PWRFKHDRHH
PWRFKHDRHH
GWRISHRTHH
GWRISHRTHH
GWRISHRTHH
GWRISHRTHH
GWRIRHRTHH
GWRISHRTHH
GWRISHRTHH
GWRISHRTHH
GWRISHRTHH
SWKYSHRRHH
SWKYSHRRHH
SWKYSHRRHH
SWKISHRRHH
SWKYSHRRHH
SWKYSHRNHH
AKTNMLVHDT
AKTNMLREDT
QNHGHVENDE
QNHGHVENDE
QNHGHVENDE
QNHGHVENDE
QNHGHVENDE
QHHGHAENDE
QNHGHVENDE
QNHGHVENDE
QNHGHIEKDE
SNTGSLERDE
SNTGSLERDE
SNTGSLERDE
SNTGSLDRDE
SNIGSLERDE
ANTNSLDNDE 250
AWQPVPPEEF
AWHPVWKDEF
SWHPMSEKIY
SWHPMSEKIY
SWHPLSÉKIF
SWHPLSEKIY
SWHPMSEKLF
SWHPLPEKLF
SWVPLPERVY
SWVPLPEKLY
SWVPLTEKIY
VFVPKQKSAI
VFVPKQKSCI
VFVPKPKSQL
VFVPKPKSKV
VFVPKSKSKI
VYIPKSKAKV 300
WVNWHFNLRK WLMWHFDLKK ..GSHYHPDS ..GSHYHPDS ..GSHFHPDS ..GSHFHPDS ..GSHYHPDS ..GSHFDPSS ..GSHFNPYS . . GSHYNPYS ..GSHFNPYS GFACHFFPNA RFACHYDPYG RFACHYDPYG SFASHYHPYA RFACHYDPYG RFANHFDEMS -23 • · #«·· ·· • v · * « ι · * · * · « v ♦ · f * * · · · • · 4 <* £ · » # ««···· • « » · · * · » ·
Seznam sekvencí 1 (pokračování) bnomSdes.seq gmom6des.seq acom3des.seq bnon3des.seq rcon3des.seq siom3des.seq iddl5des.seq gsoir.3des. seq atom3bdes.seq bnom31des.seq gsom3bdes.seq atdl2des.seq gmom6bdes.seq scoml2des.seq gmom6ades.seq rchyd.seq crepis
301 ..FRPSEVNR ..FRPSEVPR DLFLPKERKD DLFLPKERND GLFVPKERKD DLFVPNEKKD DLFVPSEKKD DLFVPNERKD SLFAPSERKL SLFAPSERKL NLFPPSERKG PIYNDRERLQ PIYSDRERLQ PIYNNRERLQ PIYSNRERLL PIFSERERLQ PIFKERERFQ
VKISLACVFA VKISLACVFA VLTSTACWTA VLTSTACWTA IITSTACWTA VITSTVCWTA VITSTICWTT VITSTACWAA IATSTTCWSI IATSTTCWSI IAISTLCWAT IYLSDAGILA IYISDAGVLA IFISDAGVLG IYVSDVALFS IYIADLGIFA VLLSDLGLLA
FMAVGWPLII FIAIGWPLII .MAALLVCLM .MAVLLVCLN .MAALLVYLN .MLALLVGLS .MVGLLIGLS .MLGLLVGLG .MFVSLIALS .MLATLVYLS •MFSLLIYLS •VCFGLYRYA • WYGLFRLA .VCYLLYRIA .VTYSLYRVA . TTFVLYQAT .VLYGVKLAV
YKVGVLGWVK YKTGIMGWIK FTIGPIQMLK FVMGPMQMLK FSHGPVQMLK FVIGPVQLLK FVMGPIQILK FVMGPIQLLK FVFGPLAVLK FLVGPVTVLK FITSPLLVLK AAQGMASMIC MAKGLAWWC LVKGLAWLVC TLKGLVWLLC MAKGLAWVMR AAKGAAWVTC
350 FWLMPWLGYH FWLMPWLGYH LYGIPYWINV LYVIPYWINV LYGIPYWIFV LYGIPYLGNV LYWPYWIFV LYGVPYVTFV VYGVPYIIFV VYGVPYIIFV LYGIPYWIFV LYGVPLLIVN VYGVPLLWN VYGVPLLWN VYGVPLLIVN IYGVPLLIVN IYGIPVLGVF bnora6des.seq gmom6des.seq acom3des.seq bnom3des.seq rcom3des.seq siom3des.seq lddl5des.seq gsom3des.seq atom3bdes. seq bnom31des.seq gsom3bdes. seq atdl2des.seq gmom6bdes.seq scoml2des.seq gmom6ades.seq rchyd.seq crepis
351 FWMSTFTMVH FWMSTFTMVH MWLDFVTYLH MWLDFVTYLH MWLDFVTYLH MWLDLVTYLH MWLDFVTYLD MWLDLVTYLH MWLDAVTYLH MWLDAVTYLH MWLDFVTYLH AFLVLITYLQ GFLVLITFLQ GFLVLITYLQ GFLVTITYLQ CFLVMITYLQ IFFDIITYLH
HTAPH..IPF HTAPY..IPF HHGHEDKLPW HHGHEDKLPW HHGHEDKLPW HHGHEDKLPW HHGHEDKLPW HHGHEDKLPW HHGHDEKLPW HHGHDDKLPW HHGHHQKLPW H..THPSLPH H..THPALPH H..THPSLPH K..THFALPH H..THPAIPR H..THLSLPH
KPADEWNAAQ KYSEEWNRAQ YRGKEWSYLR YRGKEWSYLR YRGKAWSYLR YRGKEWSYLR YRGEEWSYLR YRGKEWSYLR YRGKEWSYLR YRGKEWSYLR YRGKEWSYLR YDSSEWDWLR YTSSEWDWLR YDSTEWDWLR YDSSEWDWLK YGSSEWDWLR YDSSEWNWLR
AQLNGTVHCD AQLNGTVHCD GGL.TTLDRD GGL.TTLDRD GGL.TTLDRD GGL.TTLDRD GGL.TTLDRD GGL.TTLDRD GGL.TTIDRD GGL.TTIDRD GGL.TTVDRD GAL.ATVDRD GAL.ATVDRD GAL.ATCDRD GAL. ATMDRD GAM. VTVDRD GAL.STIDRD
400 YPSWIEILCH YPKWIEILCH YGLINNIHHD YGLINNIHHD YGWINNIHHD YGWINNIHHD YGLINNIHHD YGWINNIHHD YGIFNNIHHD YGIFNNIHHD YGWIYNIHHD YGILNKVFHN YGILNKVFHN YGVLNKVFHN YGILNKVFHH YGVLNKVFHN FGFLNSVLHD bnom6des.seq gmom6des.seq atom3des.seq bnom3des.seq rcom3des. seq s±om3des.seq lddl5des.seq gsom3des.seq atom3bdes.seq bnom31des.seq gsom3bdes.seq atdl2des.seq gmom6bdes.seq scoml2des.seq gmom6ades.seq rchyd.seq crepis
401 DINVHIPHHI DINVHIPHHI I.GTHVIHHL I.GTHVIHHL I.GTHVIHHL I.GTHVIHHL I.GTHVIHHL I.GTHVIHHL I.GTHVIHHL I.GTHVIHHL I.GTHVIHHL ITDTHVAHHL ITDTHVAHHL ITDTHWHHL ITDTHVAHHL IADTHVAHHL VTHTHVMHHL
SPRIPSYNLR SPRIPSYNLR FPQIPHYHLV FPQIPHYHLV FPQIPHYHLV FPQIPHYHLI FPQIPHYHLV FPQIPHYHLV FPQIPHYHLV FPQIPHYHLV FPQIPHYHLV FSTMPHYNAM FSTMPHYHAM FSTMPHYNAM FSTMPHYHAM FATVPHYHAM FSYIPHYHAK
AAHQSIQENW AAHKSLQENW EATEAAKPVL EATEAAKPVL EATEAAKPVM EATEAAKPVL EATQAAKPIF EATEAAKPVF DATKAAKHVL DATKSAKHVL EATQAAKPVL EATKAIKPIL EATKAIKPIL EATKAVKPLL EATNAIKPIL EATKAIKPIM EARDAINTVL
GKYTNLATWN GQYLNEASWN GKYYREPDKS GKYYREPDKS GKYYREPKKS GKYYREPKKS GKYYKEPAKS GKYYREPKKS GRYYREPKTS GRYYREPKTS GDYYREPERS GDYYQFDGTP GEYYRFDETP GDYYQFDGTP GEYYQFDDTP GEYYRYDGTP GDFYKIDRTP
450 WRLMKTIMTV WRLMKTIMTV .GPLPLHLLE .GPLPLHLLG .GPLPLHLLG •APLPFHLLG .KPLPFHLID AAPLPFHLIG .GAIPIHLVE . GAIPIHLVE .APLPFHLIK .......WYV .......FVK .......IYK .......FYK .......FYK .......ILK
Seznam sekvencí 1 (pokračování) 451 493 bnom6des.seq gmomódes.seq atom3des. seq bnom3des. seq rcom3des. seq siom3des. seq lddlSdes. seq gsom3des.seq atoirúibdes. seq bnom31des.seq gsom3bdes. seq atdl2des.seq gmomSbdes, seq scoml2des. seq gmom6ades.seq rchyd.seq crepis CHVYDKEENY IPFDRLAPEE SQPITFLKKA MPDYAA....... CQVYDKEKSL CCLRRTCP......................... ILAKSIKEDH YV.....SDE GEWYYKADP NLYGEVKVRA D. . XLAKSIKEDH FV.....SDE GDWYYEADP MLYGEIKVTA E. . SLVRSMKEDH YV.....SDT GDWYYQKDP KLSGIGGEKT E. . DLTRSLKRDH YV.....SDV GDWYYQTDP QLTGAEKS..... VLLKSLKRDH FV.....PDT GDIVYYQSDP QISGSLKPE. ... EIIRSFKTDH FV.....SDT GDWYYQTDS KINGSSKLE. ...
SLVASIKKDH YV.....SDT GDIVFYETDP DLYVYASDKS KIN
SLVASIKKDH YV.....SDT GDIVFYETDP DLYVYASDKS KIN YLIQSMRQDH FV.....SDT GDWYYQTDS LLLHSQRD..... AMYREAKECI YVEPDREGDK KGVYWYNNKL ............. AMWREARECI YVEPDQSTES KGVFWYNNKL ............. EMWREAKECL YVEKDESSQG KGVFWYKNKL .......... > . . ALWREARECL YVEPDEGTSE KGVYWYRNKY ............. ALWREAKECL FVEPDEGAPT QGVFWYRNKY ............. AMWREAKECI FIEPEKGRES KGVYWY.NKF ............. 25 »«·· • ♦ « · t : • · * · é · • i «•f ♦ ··
Seznam sekvencí 2
Nukleotidová sekvence a odvozená aminokyselinová sekvence otevřeného čtecího rámečku z plasmidu pCrepl.
ATGGG7GGCGGTGGCCGTGGTCGGACTTCGCAAAAACCCCTCATGGAACGTGTCTCAGTT
MGGGGRGRTSQKPLMERVSV
GATCCACCCTTCACCGTGAGTGATCTCAAGCAAGCAATCCCTCCCCATTGCTTCAA.GCGA
DPPFTVSDLKQAIPPHCFKR
TCTGTAATCCGTTCCTCTTACTACATAGTCCACGATGCTATTATCGCCTACATCTTCTAC SVIRSSYYIVHDAI IAYIFY
TTCCTTGCCGACAAATACATTCCGATTCTCCCTGCCCCTCTAGCCTACCTCGCTTGGCCC
FLADKYIPILPAPLAYLAWP
CTTTACTGGTTCTGTCAAGCTAGCATCCTCACCGGCTTATGGGTCATCGGTCACGAATGC
LYWFCQASILTGLWVIGHEC
GGTCACCATGCCTTCAGCGACTACCAGTGGGTTGACGACACTGTGGGCTTCATCCTCCAC G H HAFS DY QWVDDTVGFI LK
TCGTTTCTCATGACCCCGTATTTCTCCTGGAAATACAGCCACCGGAACCACCATGCCAAC S FLMTPYFSWKYS H RNHHAN
ACAAATTCGCTTGACAACGATGAAGTTTACATCCCCAAAAGCAAGGCCAAAGTCGCGČTT TNSLDNDEVYIPKS KAKVAL
TACTATAAAGTTCTCAACCACCCACCTGGCCGACTGTTGATTATGTTCATCACCTTCACC
YYKVLNHPPGRLLIMFITFT
CTAGGCTTCCCTCTATACCTCTTTACCAATATTTCCGGCAAGAAGTATGAAAGGTTTGCC L G FPLYLFTNI SGKKYERFA
AACCATTTCGACCCCATGAGTCCGATTTTCAAAGAGCGTGAGCGGTTTCAGGTCTTGCTA
NHFDPMSPIFKERERFQVLL
TCGGATCTTGGCCTTCTTGCTGTGCTTTACGGAGTTAAACTTGCGGTAGCAGCGAAAGGC S D LGLLAVLY G VK LAVAAK G
GCCGCCTGGGTGACGTGCATTTACGGAATTCCAGTTTTAGGCGTGTTTATCTTTTTCGAT AAWVTC IYGI PVLGVFI FFD
ATCATCACCTACTTGCACCACACCCATCTGTCGTTGCCTCATTATGATTCATCTGAATGG I I TYLHHTHLS LP HYDS SEW
AACTGGCTCAGAGGGGCTTTGTCAACAATCGATAGGGACTTTGGGTTCCTGAATAGTGTG
NWLRGALSTIDRDFGFLNSV
CTCCATGATGTTACACACACTCACGTTATGCATCATCTGTTTTCATACATTCCACACTAT
LHDVTHTHVMHHLFSYIPHY
CATGCGAAGGAGGCAAGGGATGCAATCAACACAGTCTTGGGCGACTTTTATAAGATCGAT hakeardaintvlgdfykid
AGGACTCCAATTCTGAAAGCAATGTGGAGAGAGGCCAAGGAATGCATCTTCATCGAGCCT
RTPILKAMWREAKECIFIEP
GAAAAAGGTAGGGAGTCCAAGGGTGTATATTGGTACAATAAATTCTGA EKGRESKGVYWYNKF* 27
···· ·· ·« • · · * · * • · · · · « • · · «·* «·· • · · · · jakékoliv nukleotidové sekvence, které jsou v podstatě homologní k této sekvenci. 8. Použití cDNA podle jakéhokoliv z nároků 5, 6 nebo 7 pro transformaci organismů. 9. Použití podle nároku 8, kde organismus je schopen akumulace acetylenových sloučenin. 10. Použití podle nároku 8, kde organismy jsou organismy akumulující oleje. 11. Použití podle nároku 10, kde jsou organismy akumulující oleje vybrané ze skupiny skládající se z olejnatých plodin, oleogenních kvasinek a plísní. 12. Organismy transformované acetylenasovou cDNA podle jakéhokoliv z nároků 5, 6 nebo 7. 13. Organismy podle nároku 12, které jsou organismy akumulující acetylenové sloučeniny. 14. Organismy podle nároku 12, které jsou organismy akumulující oleje. 15. Organismy podle nároku 14, které jsou vybrány ze skupiny skládající se z olejnatých plodin, oleogenních kvasinek a plísní. 16. Acetylenové sloučeniny akumulované v organismech podle nároku 13. 28 • «· ·· • · · · · * · · * t ft ··· · · · • * ♦ 17. Oleje z organismů akumulujících oleje podle nároků 14 nebo 15.
Claims (7)
- 26 Patentové nároky 1. Způsob pro produkci acetylenových sloučenin vyznačující se tím, že dvojná vazba je přeměněna na acetylenovou vazbu působením acetylenasy.
- 2. Způsob podle nároku lvyznačující se tím, že acetylenové mastné kyseliny jsou produkovány přeměnou nenasycených mastných kyselin na acetylenové mastné kyseliny, která je způsobena acetylenasou mastných kyselin.
- 3. Způsob podle nároku 2vyznačující se tím, že C18 mastné kyseliny s dvojnými vazbami v pozici delta 12 jsou přeměněny na 12-inové kyseliny.
- 4. Způsob podle nároku 3vyznačující se tím, že kyselina linolová je přeměněna na 9-oktadecen-12-inovou kyselinu, tedy krepeninovou kyselinu, pomocí delta 12 acetylenasy z Crepis alpina.
- 5. cDNA kódující acetylenasu monooxygenasového typu se smíšenou funkcí obsahující tři konzervované histidinové motivy (hx(3 nebo 4)h' hx(2 nebo 3)™ a ^2 nebo 3)HH> Podle seznamu sekvencí 1.
- 6. cDNA podle nároku 5 kódující acetylenasu mastných kyselin.
- 7. cDNA podle nároku 6 kódující delta 12 acetylenasu Crepis alpina obsahující sekvenci podle seznamu sekvencí 2 nebo
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE9601236A SE9601236D0 (sv) | 1996-03-29 | 1996-03-29 | Novel plant enzyme and use thereof |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ313598A3 true CZ313598A3 (cs) | 1999-05-12 |
| CZ292780B6 CZ292780B6 (cs) | 2003-12-17 |
Family
ID=20402028
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ19983135A CZ292780B6 (cs) | 1996-03-29 | 1997-02-14 | Způsob produkce acetylenových sloučenin, cDNA sekvence kódující delta 12 acetylenázu a její použití a organismy transformované acetylenázovou cDNA |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6333448B1 (cs) |
| EP (1) | EP0889970B1 (cs) |
| JP (1) | JP2000507450A (cs) |
| AT (1) | ATE253124T1 (cs) |
| CA (1) | CA2250234C (cs) |
| CZ (1) | CZ292780B6 (cs) |
| DE (1) | DE69725841T2 (cs) |
| DK (1) | DK0889970T3 (cs) |
| ES (1) | ES2210493T3 (cs) |
| NO (1) | NO326619B1 (cs) |
| PL (1) | PL187096B1 (cs) |
| PT (1) | PT889970E (cs) |
| SE (1) | SE9601236D0 (cs) |
| WO (1) | WO1997037033A1 (cs) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6872872B1 (en) | 1992-11-17 | 2005-03-29 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Genes for microsomal delta-12 fatty acid desaturases and related enzymes from plants |
| US7589253B2 (en) | 1997-04-15 | 2009-09-15 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Fatty acid epoxygenase genes from plants and uses therefor in modifying fatty acid metabolism |
| BR9808676B1 (pt) | 1997-04-15 | 2010-10-05 | construção genética, processos para produzir um polipeptìdeo epoxigenase enzimaticamente ativo, recombinante, e, polipeptìdeo recombinante de ocorrência não natural. | |
| KR20020025069A (ko) | 1999-06-07 | 2002-04-03 | 바스프 플랜트 사이언스 게엠베하 | 쎄라토돈 푸르푸레우스로부터의 δ6-아세틸레나제 및δ6-데새처라제 |
| DE19941609A1 (de) * | 1999-09-01 | 2001-03-08 | Inst Pflanzenbiochemie Ipb | Fettsäure-Desaturase-Gen aus Pflanzen |
| US7365240B2 (en) * | 2003-02-05 | 2008-04-29 | Divergence, Inc. | Nucleic acids encoding anthelmintic agents and plants made therefrom |
| AU2003252953A1 (en) * | 2003-07-31 | 2005-02-25 | The University Of York | Fatty acid biosynthesis 2 |
| WO2005014832A1 (en) * | 2003-07-31 | 2005-02-17 | The University Of York | Fatty acid biosynthesis 4 |
| US7368629B2 (en) * | 2004-02-04 | 2008-05-06 | Divergence, Inc. | Nucleic acids encoding anthelmintic agents and plants made therefrom |
| AU2005323136A1 (en) * | 2004-12-20 | 2006-07-13 | Basf Plant Science Gmbh | Nucleic acid molecules encoding fatty acid desaturase genes from plants and methods of use |
| WO2012003545A1 (en) * | 2010-07-09 | 2012-01-12 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Acetylenation of fatty acids |
| SG11201604871VA (en) | 2013-12-18 | 2016-07-28 | Commw Scient Ind Res Org | Lipid comprising long chain polyunsaturated fatty acids |
| KR102527795B1 (ko) | 2014-06-27 | 2023-05-02 | 커먼웰쓰 사이언티픽 앤 인더스트리알 리서치 오거니제이션 | 도코사펜타에노산을 포함하는 지질 |
| EP3398442A1 (en) | 2017-05-05 | 2018-11-07 | Takasago International Corporation | Use of acetylenic fatty acid compounds as kokumi flavor |
-
1996
- 1996-03-29 SE SE9601236A patent/SE9601236D0/xx unknown
-
1997
- 1997-02-14 CA CA002250234A patent/CA2250234C/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-02-14 WO PCT/SE1997/000247 patent/WO1997037033A1/en active IP Right Grant
- 1997-02-14 AT AT97903713T patent/ATE253124T1/de not_active IP Right Cessation
- 1997-02-14 JP JP9535180A patent/JP2000507450A/ja active Pending
- 1997-02-14 ES ES97903713T patent/ES2210493T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-14 DE DE69725841T patent/DE69725841T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-14 CZ CZ19983135A patent/CZ292780B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1997-02-14 EP EP97903713A patent/EP0889970B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-14 PL PL97329175A patent/PL187096B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1997-02-14 DK DK97903713T patent/DK0889970T3/da active
- 1997-02-14 PT PT97903713T patent/PT889970E/pt unknown
-
1998
- 1998-09-24 NO NO19984448A patent/NO326619B1/no not_active IP Right Cessation
- 1998-09-29 US US09/161,994 patent/US6333448B1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK0889970T3 (da) | 2004-03-08 |
| DE69725841D1 (de) | 2003-12-04 |
| WO1997037033A1 (en) | 1997-10-09 |
| JP2000507450A (ja) | 2000-06-20 |
| CA2250234A1 (en) | 1997-10-09 |
| EP0889970B1 (en) | 2003-10-29 |
| CA2250234C (en) | 2007-05-15 |
| US6333448B1 (en) | 2001-12-25 |
| NO326619B1 (no) | 2009-01-19 |
| NO984448L (no) | 1998-11-30 |
| ATE253124T1 (de) | 2003-11-15 |
| PL329175A1 (en) | 1999-03-15 |
| AU1818797A (en) | 1997-10-22 |
| DE69725841T2 (de) | 2004-07-29 |
| SE9601236D0 (sv) | 1996-03-29 |
| PL187096B1 (pl) | 2004-05-31 |
| NO984448D0 (no) | 1998-09-24 |
| PT889970E (pt) | 2004-03-31 |
| ES2210493T3 (es) | 2004-07-01 |
| EP0889970A1 (en) | 1999-01-13 |
| CZ292780B6 (cs) | 2003-12-17 |
| AU720765B2 (en) | 2000-06-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Lu et al. | A high‐throughput screen for genes from castor that boost hydroxy fatty acid accumulation in seed oils of transgenic Arabidopsis | |
| Sakuradani et al. | Δ6-Fatty acid desaturase from an arachidonic acid-producing Mortierella fungus: gene cloning and its heterologous expression in a fungus, Aspergillus | |
| AU2005250074B2 (en) | Metabolically engineered cells for the production of polyunsaturated fatty acids | |
| Broun et al. | Accumulation of ricinoleic, lesquerolic, and densipolic acids in seeds of transgenic Arabidopsis plants that express a fatty acyl hydroxylase cDNA from castor bean | |
| Hong et al. | High-level production of γ-linolenic acid in Brassica juncea using a Δ6 desaturase from Pythium irregulare | |
| Dyer et al. | Molecular analysis of a bifunctional fatty acid conjugase/desaturase from tung. Implications for the evolution of plant fatty acid diversity | |
| US7645604B2 (en) | Delta-9 elongases and their use in making polyunsaturated fatty acids | |
| US20100168455A1 (en) | Production of Hydroxylated Fatty Acids in Genetically Modified Plants | |
| AU2007272252B2 (en) | Fatty acid desaturases and uses thereof | |
| EP1181373B1 (de) | Delta6-acetylenase und delta6-desaturase aus ceratodon purpureus | |
| CZ313598A3 (cs) | Nový rostlinný enzym a jeho použití | |
| US5801026A (en) | Use of plant fatty acyl hydroxylases to produce hydroxylated fatty acids and derivatives in plants | |
| US5668292A (en) | Use of plant fatty acyl hydroxylases to produce hydroxylated fatty acids and derivatives in plants | |
| Sayanova et al. | Accumulation of Δ6-unsaturated fatty acids in transgenic tobacco plants expressing a Δ6-desaturase from Borago officinalis | |
| US7923598B2 (en) | Fatty acid hydroxylases and uses thereof | |
| US6291742B1 (en) | Production of hydroxylated fatty acids in genetically modified plants | |
| CA2454372A1 (en) | Fatty acid desaturase gene obtained from pomegranate and method for the production of unsaturated fatty acids | |
| Hatanaka et al. | Expression of a Stokesia laevis epoxygenase gene | |
| AU720765C (en) | Novel plant enzyme and use thereof | |
| Huffman Sr | A New Polyacetylenic Alcohol in Fistulina Hepatica: Progress Towards the Identification of Acetylenases in Basidiomycetes | |
| US20160298148A1 (en) | Enrichment of oils with polyunsaturated fatty acids | |
| Dahmen | Deciphering the role of cytochrome b5-desaturase interactions for fatty acid desaturation |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20100214 |