KR20020025069A - 쎄라토돈 푸르푸레우스로부터의 δ6-아세틸레나제 및δ6-데새처라제 - Google Patents

쎄라토돈 푸르푸레우스로부터의 δ6-아세틸레나제 및δ6-데새처라제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 불포화 지방산의 생산 방법 및 불포화 지방산 함량이 증가된 트리글리세리드의 생산 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 Δ6 삼중 결합 및(또는) Δ6 이중 결합이 있는 지방산, 오일 또는 지질의 함량이 증가된 트랜스제닉 생물체, 바람직하게는 트랜스제닉 식물 또는 트랜스제닉 미생물의 생산을 위한 Δ6-아세틸레나제/Δ6-데새처라제 또는 Δ6-데새처라제를 코딩하는 DNA 서열의 용도에 관한 것이다.

Description

쎄라토돈 푸르푸레우스로부터의 Δ6-아세틸레나제 및 Δ6-데새처라제{Δ6-Acetylenase and Δ6-Desaturase from Ceratodon Purpureus}
본 발명은 불포화 지방산의 제조 방법 및 불포화 지방산 함량이 증가된 트리글리세리드의 제조 방법에 관한 것이다. 나아가, 본 발명은 Δ6 삼중 결합 및(또는) Δ6 이중 결합이 있는 지방산, 오일 또는 지질의 함량이 증가된 트랜스제닉 생물체, 바람직하게는 트랜스제닉 식물 또는 트랜스제닉 미생물의 생산을 위한 Δ6-아세틸레나제/Δ6-데새처라제 또는 Δ6-데새처라제를 코딩하는 DNA 서열의 용도에 관한 것이다.
추가로, 본 발명은 단리된 핵산 서열, 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트 (cassette), 하나 이상의 핵산 서열 또는 발현 카세트를 포함하는 벡터 및 생물체에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 불포화 지방산 및 불포화 지방산 함량이 증가된 트리글리세리드와 그 용도에 관한 것이다.
지방산 및 트리글리세리드는 식품 산업, 가축 영양 사료, 화장품 및 의약품 분야에 많이 이용된다. 그들이 유리 포화 지방산인지 불포화 지방산인지의 여부 또는 포화 지방산 함량이 증가된 트리글리세리드인지 불포화 지방산 함량이 증가된 트리글리세리드인지의 여부에 따라 그들은 광범위하게 다양한 용도에 적합하다. 예를 들어, 다가불포화 지방산은 영양가 개선을 위해 유아 식품에 첨가한다. 다양한 지방산 및 트리글리세리드는 모르티에렐라 (mortierella)와 같은 미생물 또는대두, 유지종자 평지, 해바라기 등과 같은 오일 생산 식물로부터 주로 얻으며, 보통 트리글리세리드의 형태로 생성된다. 그러나, 어류와 같은 동물 종으로부터도 얻을 수 있다. 유리 지방산은 비누화 반응에 의해 제조하는 것이 유리하다.
사용 목적에 따라 포화 또는 불포화 지방산 함유 오일이 바람직하다. 예를 들어 불포화 지방산, 특히 다가불포화 지방산이 있는 지질은 혈중 콜레스테롤 농도 및 그에 따른 심장 질환의 발병률에 있어 유익하게 작용하기 때문에 인간 영양에 있어 바람직하다. 다양한 인간의 식료품 또는 의약품에 사용된다.
그들의 유익한 성질 때문에, 변형된 불포화 지방산 함유량을 갖는 다양한 생물체 내에서 오일을 생산하기 위해 지방산 및 트리글리세리드의 합성에 관여하는 유전자를 이용하려는 여태까지 많은 연구가 있었다. 예를 들어, 특허 WO 91/13972호 및 그에 대응하는 미국 특허는 Δ9-데새처라제를 기재하고 있다. 특허 WO 93/11245호는 Δ15-데새처라제에 대해 청구하고, 특허 WO 94/11516호는 Δ12-데새처라제에 대해 청구하고 있다. Δ6-데새처라제는 특허 WO 93/06712호, 미국 특허 제5,614,393호, 특허 WO 96/21022호 및 WO 99/27111호에서 기재되어 있다. 나아가, 데새처라제는 예를 들어, 특허 EP-A-0 550 162호, 특허 WO 94/18337호, WO 87/30582호, WO 97/21340호, WO 95-18222호, 특허 EP-A-0 794 250호, 문헌 [Stukey et al. J. Biol.Chem., 265,1990:20144-20149], [Wada et al., Nature 347, 1990:200-203] 또는 [Huang et al., Lipids 34,1999:649-659]에 기재되어 있다. 특허 WO 96/13591호는 Δ6-팔미토일-ACP-데새처라제에 대해 기재 및 청구하고 있다. 그러나, 다양한 데새처라제의 생화학적 특성화는 아직 충분하지 못한데, 이는상기 효소들이 막 결합 단백질이어서 단리 및 특성화에 큰 어려움이 있기 때문이다 (문헌 [McKeon et al., Methods in Enzymol. 71,1981;12141-12147], [Wang et al., Plant Physiol. Biochem. 26, 1988;777-792]을 참조).
특허 WO 97/37033호는 Δ12-아세틸레나제를 기재하고 있다. 이 효소는 삼중 결합이 있는 불포화 C18-지방산을 제조하는데 사용할 수 있다. 인간 식품에서의 용도 뿐만 아니라, 이러한 유형의 지방산은 반응성이 있기 때문에 중합체 제조에 사용될 수도 있다. 스페를링 (Sperling) 등은 한 회합 (사우스 레이크 타호 (South Lake Tahoe), 캐나다, 1999년 6월 9일 - 13일)에서, 마찬가지로 지방산에 삼중 결합을 도입하는 효소의 클로닝에 대해 보고하였는데, 이 효소의 기질은 Δ12-아세틸레나제의 것과 다르고, 상기 삼중 결합은 효소에 의해 지방산 내의 다른 위치에 도입된다.
효모 내에서 지방산 스펙트럼이 불포화 지방산으로 이동하는 것과 생산량이 증가하는 것 둘 모두를 증명할 수 있었다 (문헌 [Huang et al., Lipids 34,1999:649-659], [Napier et al., Biochem. J., Vol.330,1998:611-614) 참조). 그러나, 트랜스제닉 식물 내에서의 다양한 데새처라제 발현은 원하는 결과를 보이지 않았다. 지방산 스펙트럼에서 불포화 지방산으로의 이동을 보여주기는 하였지만, 그와 동시에 트랜스제닉 식물의 합성 효율이 대폭 감소하는 것으로 나타났으며, 즉 원래 식물에 비해 단지 소량의 오일만이 단리될 수 있었다.
따라서, 불포화 지방산의 생합성에 관여하며 불포화 지방산을 산업 규모로제조 가능하도록 하는 효소를 코딩하는 신규 유전자가 지금까지도 크게 요구되고 있다.
본 발명의 목적은 공액 불포화 지방산의 합성을 위한 새로운 효소를 제공하는 것이다. 본 발명자들은 하기 군으로부터 선택한 Δ6-아세틸레나제 및(또는) Δ6-데새처라제 활성이 있는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산 서열에 의해 상기 목적을 달성하였다:
a) 서열 1, 서열 3 또는 서열 11에 기재된 서열을 갖는 핵산 서열,
b) 유전자 코드의 축중 (degeneracy)으로 인하여 서열 1, 서열 3 또는 서열 11에 기재된 핵산 서열로부터 유래되는 핵산 서열,
c) 서열 2에 기재된 아미노산 서열을 가지며 아미노산 수준에서 75％ 이상의 상동성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는, 폴리펩티드의 효소 작용의 감소가 미미한, 서열 1, 서열 3 또는 서열 11에 기재된 핵산 서열의 유도체.
유도체(들)란, 예를 들어 서열 1, 서열 3 또는 서열 11에 의해 코딩되는 효소의 기능적 상동체 또는 그 효소 활성의 기능적 상동체, 즉 서열 1, 서열 3 또는 서열 11에 의해 코딩된 효소와 같은 효소 반응을 촉매하는 효소를 의미한다. 이러한 유전자는 마찬가지로 6번 위치에서 삼중 결합 및(또는) 이중 결합이 있는 불포화 지방산을 제조하는데 유리하게 사용 가능하다. 이후 불포화 지방산이란 하나 이상의 불포화 부분을 가지며 삼중 결합 및(또는) 이중 결합이 있는 지방산을 의미한다. 삼중 및(또는) 이중 결합은 공액 또는 비공액성일 수 있다. 서열 1, 서열 3, 또는 서열 11에서 특정된 서열은 아세틸레나제 및(또는) Δ6-데새처라제 활성을갖는 신규 효소를 코딩한다.
신규 효소인 Δ6-아세틸레나제/Δ6-데새처라제는 글리세롤리피드의 지방산 잔기 내로 C6-C7위치에 cis 이중 결합을 유리하게 도입하고(하거나) C6-C7위치에 이미 존재하는 이중 결합을 삼중 결합으로 전환시킨다 (서열 1 또는 서열 3). 또한, 상기 효소는 글리세롤리피드의 지방산 잔기 내로 C6-C7위치에 cis 이중 결합을 유리하게 배타적으로 도입하는 Δ6-데새처라제 활성을 가진다. 또한 서열 11에서 특정된 서열을 갖는 효소는 상기 활성을 가지며, 이는 단기능의 Δ6-데새처라제이다.
신규 핵산 서열(들) (본 명세서에서, 단수는 복수를 포함하며 역도 성립함) 또는 그의 단편은 상동성 스크리닝에 의해 또다른 게놈 서열을 단리하는데도 유리하게 이용될 수 있다.
언급된 유도체는 다른 생물체들, 예를 들어 식물, 구체적으로 이끼, 와편목충류로부터 또는 진균류와 같은 진핵 생물체로부터 단리될 수 있다.
또한, 서열 1, 서열 3 또는 서열 11에서 특정한 서열의 유도체 또는 기능적 유도체란, 예를 들어 유래된 아미노산 수준에서 70％ 이상의 상동성을 갖는, 유리하게는 75％ 이상의 상동성을 갖는, 바람직하게는 80％ 이상의 상동성을 갖는, 특히 바람직하게는 85％ 이상의 상동성을 갖는, 그리고 매우 특별히 바람직하게는 90％ 이상의 상동성을 갖는 대립 형질 변이체를 의미한다. 상동성은 전체 아미노산 영역에 걸쳐 계산한다. 프로그램 PileUp, BESTFIT, GAP, TRANSLATE 또는BACKTRANSLATE (= UWGCG 프로그램 팩키지의 구성요소, 위스콘신 팩키지 (Wisconsin Package), 버전 10.0-UNIX, 1999년 1월, 제네틱스 컴퓨터 그룹, 인크. (Genetics Computer Group, Inc.), 문헌 [Devereux et al., Nucleic Acids Res., 12,1984:387 -395] 참조)을 사용하였다 (문헌 [J.Mol.Evolution., 25,351-360,1987, Higgins et al., CABIOS, 5 1989:151-153] 참조). 특정된 핵산으로부터의 아미노산 서열은 서열 2, 서열 4 및 서열 12에 나타내었다. 상동성이란 동일성, 즉 아미노산 서열이 70％ 이상 동일한 것을 의미한다. 신규 서열은 핵산 수준에서 상동성이 65％ 이상, 바람직하게는 70％ 이상, 특히 바람직하게는 75％ 이상, 매우 특별히 바람직하게는 80％ 이상을 나타낸다.
대립형질 변이체는 특히 서열 1, 서열 3 또는 서열 11에 기재된 서열로부터 뉴클레오티드의 결실, 삽입 또는 치환에 의해 얻어질 수 있으며, 유래된 합성 단백질의 효소 활성을 보유한 기능적 변이체를 포함한다.
그러한 DNA 서열은 서열 1, 서열 3 또는 서열 11에 기재된 서열이나 이들 서열의 일부로부터 출발하여, 예를 들어 통상적인 혼성화 방법이나 PCR 기술을 사용하여 다른 진핵 생물, 예를 들어 상기 언급한 것들로부터 단리할 수 있다. 이들 DNA 서열을 표준 조건 하에서 상기 언급한 서열과 혼성화시킨다. 혼성화에는 짧은 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 보존된 영역의 것을 사용하는 것이 유리하며, 이는 당업자에게 공지된 방식으로 다른 아세틸레나제 및(또는) 데새처라제 유전자를 비교함으로써 결정될 수 있다. 히스티딘 박스 (histidine box) 서열을 사용하는 것이 유리하다. 그러나, 혼성화에 신규 핵산의 보다 긴 단편 또는 완전한 서열을 사용하는 것도 가능하다. 이들 표준 조건은 올리고뉴클레오티드, 보다 긴 단편 또는 완전한 서열처럼 사용되는 핵산에 따라, 또는 혼성화에 사용하는 핵산의 유형, 즉 DNA인지 RNA인지에 따라 다양하다. 따라서, 예를 들어 DNA:DNA 하이브리드의 융점은 동일한 길이의 DNA:RNA 하이브리드의 융점보다 약 10℃가 낮다.
표준 조건이란, 예를 들어 핵산에 따라 결정되며, 온도는 42 내지 58℃ 사이에, 0.1 내지 5 x SSC (1 x SSC = 0.15 M NaCl, 15 mM 시트르산나트륨, pH 7.2) 농도의, 또는 추가로 50％ 포름아미드가 존재하는 완충 수용액 중을 의미하며, 예를 들어 42℃에 5 x SSC 중에서 50％ 포름아미드의 존재 하에 있는 조건이다. DNA:DNA 하이브리드에 대한 혼성화 조건은 0.1 x SSC 및 온도는 약 20℃ 내지 45℃ 사이에서, 바람직하게는 약 30℃ 내지 약 45℃ 사이인 것이 유리하다. DNA:RNA 하이브리드에 대한 혼성화 조건은 0.1 x SSC 및 온도는 약 30℃ 내지 55℃ 사이에서, 바람직하게는 약 45℃ 내지 약 55℃ 사이인 것이 유리하다. 이러한 혼성화 온도는 포름아미드의 부재 상태에서 길이 약 100 뉴클레오티드이고 G+C 함유량이 50％인 핵산에 대해 예시적으로 계산한 융점이다. DNA 혼성화를 위한 실험 조건은 유전학 관련 교과서, 예를 들어 문헌 [Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989]에 기술되어 있으며, 당업자에 공지된 공식, 예를 들어 핵산의 길이, 하이브리드의 특성 또는 G+C 함유량에 의존성인 공식에 의해 계산할 수 있다. 혼성화에 대한 추가의 정보는 당업자가 하기 교과서에서 찾을 수 있다: 문헌 [Ausubel et al., (eds), 1985, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons, New York], 문헌 [Hames and Higgins (eds), 1985,Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford], 문헌 [Brown (eds), 1991, Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford].
또한 변이체들이란 서열 1, 서열 3 또는 서열 11의 상동체, 예를 들어 진핵세포 상동체, 끝이 절단된 서열, 코딩 및 비코딩 DNA 서열의 단일쇄 DNA 또는 코딩 및 비코딩 DNA 서열의 RNA를 의미한다.
또한, 서열 1, 서열 3 또는 서열 11의 상동체란 유도체, 예를 들어 프로모터 변이체를 의미한다. 이들 변이체는 하나 이상의 뉴클레오티드 교환에 의해, 삽입 및(또는) 결실에 의해 수식될 수 있지만, 프로모터의 기능이나 효율은 손상시키지 않는다. 또한, 프로모터는 서열의 수식에 의해 그 효율을 증가시킬 수 있으며, 심지어 이종 생물체로부터의 보다 효과적인 프로모터로 완전히 치환시킬 수도 있다.
또한 편리하게, 유도체란 출발 코돈 앞의 -1 내지 -2000의 영역에 있는 뉴클레오티드 서열이 수식되어 유전자 발현 및(또는) 단백질 발현이 변형된, 바람직하게는 증가한 변이체를 의미한다. 또한 유도체란 3' 말단에서 수식된 변이체를 의미한다.
또한 유도체란 신규 단백질의 생합성을 저해하는데 사용 가능한 안티센스 DNA를 의미한다. 이들 안티센스 DNA는 효소 활성이 없는 유도체와 같은 신규 비기능적 유도체 중에 있다. 당업자에게 공지된 비기능적 유도체의 추가 제조 방법으로는 소위 코서프레션 (cosuppression)이라 불리는, 리보자임 및 인트론의 사용이 있다. 리보자임이란 상보성을 나타내는 단일쇄 핵산, 예를 들어 mRNA를 절단시킬수 있는 리보누클레아제 활성을 가진 촉매성 RNA 분자이다. 이들 리보자임을 사용함으로써 mRNA 전사체의 절단이 촉매될 수 있고, 따라서 이 mRNA의 번역을 억제 (suppression)하는 것이 가능하다 (문헌 [Haselhoff and Gerlach, Nature, 334,1988:585-591] 참조). 이러한 유형의 리보자임은 그 용도에 따라 특이적으로 맞추어 제작할 수 있다 (미국 특허 제4,987,071호, 미국 특허 제5,116,742호 및 문헌 [Bartel et al., Science 261,1993:1411-1418] 참조). 결국 안티센스 DNA를 사용함으로써 포화 지방산의 함량이 증가된 지방산, 지질 또는 오일을 제조하는 것이 가능하다.
Δ6-아세틸레나제/Δ6-데새처라제 및(또는) Δ6-데새처라제를 코딩하는 신규 핵산 서열을 합성하거나 자연으로부터 단리함으로써 제조할 수 있으며, 합성 및 천연 DNA 구성분의 혼합물을 포함할 수 있고 다양한 생물체로부터 유래된 다양한 이종 Δ6-아세틸레나제/Δ6-데새처라제 및(또는) Δ6-데새처라제 유전자 단편으로 구성될 수 있다. 일반적으로, 합성 뉴클레오티드 서열은 적합한 숙주 생물체, 예를 들어 식물이 선호하는 코돈을 사용하여 제조한다. 일반적으로 이런 방식은 이종 유전자의 최적화된 발현을 일으킨다. 식물-선호 코돈은 해당 식물종 대부분에서 발현되는 가장 빈도가 높은 단백질의 코돈으로부터 결정할 수 있다. 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)에 대한 일례가 문헌 [Wada et al., (1992) Nucleic Acids Res. 20:2111-2118]에 제시되어 있다. 이러한 유형의 실험은 당업자에게 공지된 표준 방법에 의해 수행될 수 있다.
Δ6-아세틸레나제/Δ6-데새처라제 및(또는) Δ6-데새처라제 유전자를 코딩하는 기능적으로 동등한 서열은 뉴클레오티드 서열이 다름에도 불구하고 목적하는 기능, 즉 상기 단백질의 효소 활성을 여전히 가지고 있는 신규 서열의 유도체이다. 결국 기능적 동등물은 본원에서 기술한 서열의 천연 변이체 및 인공 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 화학적 합성에 의해 얻어지고 식물의 코돈 사용량 (codon usage)에 적합화시킨 것을 포함한다.
또한 상기 기술한 것처럼, 목적하는 성질, 예를 들어 작물 내에 Δ6-아세틸레나제/Δ6-데새처라제 및(또는) Δ6-데새처라제 유전자의 과발현에 의해 식물 내의 지방산, 오일 또는 지질 내에 Δ6 삼중 결합 또는 Δ6 이중 결합의 함량 증가를 제공하는 한 인공 DNA 서열도 적합하다. 그러한 인공 DNA 서열은 예를 들어, Δ6-아세틸레나제/Δ6-데새처라제 및(또는) Δ6-데새처라제 유전자 활성을 갖는 제조된 단백질의 분자 모델링에 의한 역번역 (backtranslation) 또는 시험관내 선별에 의해 제작 가능하다. DNA 서열의 수식 또는 개선을 위한 DNA의 시험관내 진화에 이용 가능한 기술은 문헌 [Patten, P.A., Current Opinion in Biotechnology 8,724-733(1997)] 또는 문헌 [Moore, J.C., Journal of Molecular Biology 272,336-347(1997)]에 기술되어 있다. 폴리펩티드 서열의 역번역에 의해 얻어지고, 숙주 식물의 특이적인 코돈 사용량에 맞는 코딩 DNA 서열이 특히 적합하다. 특이적인 코돈 사용량은 식물 유전학의 방법에 친숙한 당업자에 의해 형질전환될 식물 내에서의 다른 공지된 유전자에 대한 컴퓨터 분석을 통해서 용이하게 확증할 수 있다.
또 다른 적합한 동등물 핵산 서열은 융합 단백질을 코딩하는 서열이며, 이는 Δ6-아세틸레나제/Δ6-데새처라제 및(또는) Δ6-데새처라제 폴리펩티드 또는 그의기능적 동등물 일부를 그 융합 단백질의 구성분으로 한다. 상기 융합 단백질의 두번째 부분은 예를 들어, 효소 활성을 갖는 다른 폴리펩티드 또는 Δ6-아세틸레나제/Δ6-데새처라제 및(또는) Δ6-데새처라제 발현을 검출 가능하도록 돕는 항원 폴리펩티드 서열 (예, myc 태그 또는 his 태그)일 수 있다. 그러나, 조절 단백질 서열, 예를 들어 Δ6-아세틸레나제/Δ6-데새처라제 및(또는) Δ6-데새처라제 단백질을 목적하는 작용 부위로 유도하는 ER에 대한 신호 서열이 바람직하다.
신규 방법에서의 Δ6-아세틸레나제/Δ6-데새처라제 또는 Δ6-데새처라제 유전자를 지방산 생합성의 다른 유전자와 조합하는 것이 유리할 수 있다. 그러한 유전자의 예로는 아세틸트랜스퍼라제, 다른 데새처라제 또는 엘롱가제 (elongase)가 있다. 예를 들어, 환원 동등물의 흡수 또는 방출이 가능한 NADH 시토크롬 B5 리덕타제 (NADH cytochrome B5 reductase)와의 조합이 생체내 및 특이적으로 시험관내 합성에 적합하다.
신규 아미노산 서열이란 서열 2, 서열 4 또는 서열 12에 기재된 아미노산 서열 또는 이로부터 하나 이상의 아미노산 잔기를 치환, 역위, 삽입 또는 결실시킴으로써 얻을 수 있으며 서열 2, 서열 4 또는 서열 12에 나타난 단백질의 효소 활성을 보유하거나 또는 활성의 감소가 미미한 서열을 포함하는 단백질을 의미한다. 감소가 미미한 것이란 원래 효소의 효소 활성의 약 10％, 바람직하게는 약 20％, 특히 바람직하게는 약 30％를 여전히 갖고 있는 모든 효소를 의미한다. 또한, 예를 들어 유사한 물리화학적 성질 (부피, 염기성, 소수성 등)을 갖는 아미노산으로 특정아미노산을 치환하는 것이 가능하다. 예를 들어, 아르기닌 잔기는 리신 잔기로, 발린 잔기는 이소루이신 잔기로, 또는 아스파르트산 잔기는 글루탐산 잔기로 치환된다. 그러나, 또한 하나 이상의 아미노산을 그 서열 내에서 전치시키거나, 첨가 또는 결실, 또는 이러한 방법 일부를 함께 조합하는 것도 가능하다.
또한 유도체란 특히 Δ6-아세틸레나제/Δ6-데새처라제 및(또는) Δ6-데새처라제를 코딩하는 원래의 단리된 서열의 천연 또는 인공 돌연변이를 역시 포함하며 추가로 목적하는 기능, 즉 효소 활성의 감소가 미미한 기능적 동등물을 의미한다. 돌연변이는 치환, 첨가, 결실, 전위 또는 하나 이상의 뉴클레오티드 잔기의 첨가를 포함한다. 따라서, 예를 들어, 본 발명은 또한 Δ6-아세틸레나제/Δ6-데새처라제 및(또는) Δ6-데새처라제 뉴클레오티드 서열의 수식에 의해 얻은 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 그러한 수식의 목적은 예를 들어, 그 안에 포함된 코딩 서열을 추가로 위치시키거나, 예를 들어 또한 추가의 제한 효소 절단 부위를 삽입하는 것이다.
또한 기능적 동등물이란 그 기능이 원래 유전자 또는 유전자 단편과 비교시 약화되거나 (=감소가 미미한) 증가된 (=효소 활성이 원래 효소의 활성보다 큼. 즉, 활성이 100％를 넘고, 바람직하게는 110％를 넘고, 특히 바람직하게는 130％를 넘는) 변이체이다.
또한 유리하게, 핵산 서열은 예를 들어, DNA 또는 cDNA 서열일 수 있다. 신규 발현 카세트 내로 삽입하기 적합한 코딩 서열은 예를 들어, 상기 기술한 서열을 갖는 Δ6-아세틸레나제/Δ6-데새처라제 및(또는) Δ6-데새처라제를 코딩하며 위치6에서 삼중 결합 및(또는) 이중 결합을 갖는 지방산, 오일 또는 지질을 초과생산하는 능력을 숙주에게 부여하는 것이다. 이러한 서열은 동종 또는 이종 기원인 것일 수 있다.
신규 발현 카세트 (=핵산 구조물 또는 단편)란 서열 1, 서열 3 또는 서열 11에 특정되어 있으며 이롭게는 숙주 세포 내에서 코딩 서열의 발현을 조절하는 하나 이상의 조절 신호에 기능적으로 연결되어 유전자 발현이 증가된 유전자 코드로부터 및(또는) 기능적 또는 비기능적 변이체로부터 얻은 서열을 의미한다. 이러한 조절 서열은 유전자의 특이적인 발현 및 단백질 발현을 가능하도록 하는데 목적이 있다. 숙주 생물체에 따라, 예를 들어, 상기 유전자가 그의 발현 및(또는) 과발현이 유도 후에야 일어나도록, 또는 그 발현 및(또는) 과발현이 즉각 일어나도록 한다. 예를 들어, 이들 조절 서열은 유도인자 또는 억제인자가 결합하여 결국 그 핵산의 발현을 조절하게 되는 서열이다. 이러한 신규 조절 서열에 추가하여 또는 이들 서열 대신에, 이들 서열의 천연 조절 서열이 여전히 실제 구조 유전자의 앞에 존재하고, 적절한 경우, 유전적으로 수식되어 천연 조절의 작동이 중지되어 그 유전자의 발현이 증가하도록 하는 것도 가능하다. 그러나, 상기 유전자 구조물은 또한 보다 단순한 구조, 즉 상기 핵산 서열 또는 그 유도체 앞에 추가의 조절 신호가 삽입되지 않고 천연 조절 프로모터가 결실되어 있지 않은 구조도 가능하다. 다만, 상기 천연 조절 서열은 조절이 더이상 일어나지 않고(않거나) 유전자 발현이 증가되도록 돌연변이된 것이다. 또한 이러한 수식된 프로모터는 천연 유전자의 앞에서 부분 서열의 형태 (=신규 핵산 서열의 일부가 있는 프로모터)로 단독으로 존재하여 활성을 증가시킬 수 있다. 또한, 상기 유전자 구조물은 하나 이상의, 소위 인핸서 (enhancer) 서열에 기능적으로 연결된 프로모터를 유리하게 포함할 수 있으며, 이는 상기 핵산 서열의 발현이 증가할 수 있도록 한다. 또한 상기 DNA 서열의 3' 말단에 추가의 유리한 서열, 예를 들어 추가의 조절 엘리먼트 (element) 또는 터미네이터 (terminator)를 첨가하는 것이 가능하다. Δ6-아세틸레나제/Δ6-데새처라제 및(또는) Δ6-데새처라제 유전자는 발현 카세트 (=유전자 구조물) 내에 하나 이상의 카피로 존재할 수 있다.
또한 조절 서열 또는 인자는 상기 기술한 것처럼 바람직하게는 삽입된 유전자의 발현에 이로운 영향을 주어, 결국 발현을 증가시킨다. 따라서, 조절 엘리먼트의 증가는 프로모터 및(또는) 인핸서와 같은 강력한 전사 신호를 사용함으로써 전사의 수준에서 유리하게 일어날 수 있다. 그러나, 예를 들어 mRNA의 안정성을 증가시킴으로써 번역을 증가시키는 것도 가능하다.
발현 카세트에 적합한 프로모터는 본질적으로는 생물체 내, 유리하게는 식물 또는 진균 내에서 외부 유전자의 발현을 조절할 수 있는 모든 프로모터이다. 특히 식물 프로모터 또는 식물 바이러스로부터 유래된 프로모터를 사용하는 것이 바람직하다. 신규 방법을 위해 유리한 조절 서열은 예를 들어, 그람 음성 세균 내에서 유리하게 사용되는 cos, tac, trp, tet, trp-tet, lpp, lac, lpp-lac, lacIq, T7, T5, T3, gal, trc, ara, SP6, λ-PR또는 λ-PL프로모터 내에 존재한다. 추가로 유리한 조절 서열은 예를 들어, 그람 양성 프로모터인 amy 및 SPO2, 효모 또는 진균 프로모터인 ADC1, MFα, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH 또는 CaMV/35S (문헌 [Frank et al., Cell 21(1980)285-294] 참조), SSU, OCS, lib4, STLS1, B33, nos (=노팔린 (nopaline) 신타제 프로모터) 또는 우비퀴틴 프로모터와 같은 식물 프로모터 내에 존재하고 있다. 또한 상기 발현 카세트는 생물체, 유리하게는 식물 내에서 외생 Δ6-아세틸레나제/Δ6-데새처라제 및(또는) Δ6-데새처라제 유전자의 발현을 특정 시간에 조절할 수 있는, 화학적으로 유도 가능한 프로모터를 포함할 수 있다. 그러한 유리한 식물 프로모터의 예로는 PRP1 프로모터 (문헌 [Ward et al., Plant.Mol.Biol.22(1993)] 참조), 벤젠설폰아미드로 유도 가능한 프로모터 (EP 388186), 테트라시클린으로 유도 가능한 프로모터 (문헌 [Gatz et al., (1992) Plant J. 2,397-404)] 참조), 살리실산으로 유도 가능한 프로모터 (특허 WO 95/19443호), 낙엽산으로 유도 가능한 프로모터 (특허 EP335528호) 또는 에탄올이나 시클로헥사논으로 유도 가능한 프로모터 (특허 WO93/21334호)가 있다. 유리하게 사용될 수 있는 식물 프로모터의 추가적인 예로는 감자로부터의 세포질 FBPase의 프로모터, 감자로부터의 ST-LSI 프로모터 (문헌 [Stockhaus et al., EMBO J. 8(1989)2445-245 [본문생략]]), 글리신 맥스 (Glycine max)로부터의 포스포리보실-피로포스페이트 아미도트랜스퍼라제의 프로모터 (또한 진뱅크 (Genbank) 고유 번호 U87999 참조) 또는 특허 EP 249676호에 기재된 노드-특이적 프로모터가 있다. 특히 유리한 식물 프로모터는 지방산 또는 그 전구체의 생합성이 일어나는 조직 또는 식물 일부/기관, 예를 들어 배유(胚乳) 또는 발아중인 배(胚) 내에서의 발현을 보증하는 것이다. 특히, 종자-특이적인 발현을 보증하는데 유리한 프로모터, 예를들어 USP 프로모터 또는 그의 유도체, LEB4 프로모터, 파세올린 프로모터 또는 나핀 프로모터를 들 수 있다. 특히 유리한 USP 프로모터 또는 그의 유도체는 종자 발생에서 매우 초기에 유전자 발현을 매개한다 (문헌 [Baeumlein et al., Mol Gen Genet, 1991,225(3):459-67] 참조). 외떡잎 또는 쌍떡잎 식물에 사용할 수 있는, 추가의 유리한 종자-특이적 프로모터로는 쌍떡잎 식물에 적합한 프로모터의 경우, 예를 들어 유지종자 평지로부터의 나핀 유전자 프로모터 (미국 특허 제5,608,152호), 아라비돕시스 (arabidopsis)로부터의 올레오신 프로모터 (특허 WO98/45461호), 파세올루스 불가리스 (Phaseolus vulgaris)로부터의 파세올린 프로모터 (미국 특허 제5,504,200호), 브라시카 (brassica)로부터의 Bce4 프로모터 (특허 WO91/13980호) 또는 콩과 B4 프로모터 (LeB4, 문헌 [Baeumlein et al., Plant J., 2,2,1992:233-239] 참조) 또는 외떡잎 식물에 적합한 프로모터의 경우, 예를 들어 보리로부터의 lpt2 또는 lpt1의 프로모터 (특허 WO95/15389호 및 특허 WO95/23230호) 또는 보리 호다인 (hordein) 유전자의 프로모터, 쌀 글루텔린 (glutelin) 유전자의 프로모터, 쌀 오리진 (oryzin) 유전자의 프로모터, 쌀 프롤라민 (prolamin) 유전자의 프로모터, 밀 글리아딘 (gliadin) 유전자의 프로모터, 밀 글루텔린 유전자의 프로모터, 옥수수 제인 (zein) 유전자의 프로모터, 귀리 글루텔린 유전자의 프로모터, 사탕수수 카시린 (kasirin) 유전자의 프로모터 또는 특허 WO99/16890에 기술된 호밀 세칼린 (secalin) 유전자의 프로모터가 있다.
보다 특별히 바람직한 프로모터는 지방산, 오일 및 지질 또는 그의 전구체의 생합성이 일어나는 조직 또는 식물 일부 내에서의 발현을 보증하는 것이다. 특히종자-특이적인 발현을 보증하는 프로모터를 들 수 있다. 예를 들어, 유지종자 평지로부터의 나핀 유전자의 프로모터 (미국 특허 제5,608,152호), 비시아 파바 (Vicia faba)로부터의 USP 프로모터 (USP=미지의 종자 단백질, 문헌 [Baeumlein et al., Mol Gen Genet, 1991,225(3):459-67]), 아라비돕시스로부터의 올레오신 유전자의 프로모터 (특허 WO98/45461호), 파세올린 프로모터 (미국 특허 제5,504,200호) 또는 콩과 B4 유전자의 프로모터 (LeB4; 문헌 [Baeumlein et al., 1992, Plant Journal, 2(2):233-9])이 있다. 또한 보리로부터의 lpt2 또는 lpt1 유전자의 프로모터 (특허 WO95/15389호 및 특허 WO95/23230호)와 같은 프로모터를 언급할 수 있는데, 이들은 외떡잎 식물에 종자-특이적 발현을 부여한다.
발현 카세트 (=유전자 구조물, 핵산 구조물)은 상기 기술한 것처럼 생물체 내로 도입하고자 하는 다른 유전자를 포함할 수 있다. 이러한 유전자는 별도의 조절 하에 있거나 Δ6-아세틸레나제/Δ6-데새처라제 및(또는) Δ6-데새처라제의 유전자와 같은 조절 영역 하에 있을 수 있다. 이들 유전자의 예로는 생합성 유전자, 유리하게는 지방산 생합성의 유전자이며, 합성 증가를 가능하게 한다. 언급할 수 있는 예로는 Δ15-, Δ12-, Δ9-, Δ6- 및 Δ5-데새처라제, 다양한 히드록실라제, Δ12-아세틸레나제, 아실 ACP 티오에스테라제, β-케토아실 ACP 신타제 또는 β-케토아실 ACP 리덕타제가 있다. 데새처라제 유전자를 핵산 구조물에 사용하는 것이 유리하다.
상기 언급한 것들처럼 그들의 조절 서열을 갖는 모든 천연 프로모터를 하기에서 기술하는 신규 발현 카세트 및 신규 방법에 사용하는 것이 본질적으로 가능하다. 또한, 합성 프로모터를 사용하는 것도 가능하고 유리하다.
발현 카세트의 제조에 있어서, 다양한 DNA 단편을 조작하여 간단하게 올바른 방향으로 읽히고 올바른 리딩 프레임을 갖춘 뉴클레오티드 서열을 얻는 것이 가능하다. DNA 단편들 (=신규 핵산들)을 함께 연결하기 위해, 아답터 (adapter) 또는 링커 (linker)를 상기 단편에 부착시키는 것이 가능하다.
서열의 삽입을 위한 하나 이상의 제한 부위를 포함하는 링커 또는 폴리링커와 함께 전사의 방향으로 프로모터 및 터미네이터 영역을 제공하는 것이 가능하고 편리하다. 상기 링커는 보통 1 내지 10, 통상적으로는 1 내지 8, 바람직하게는 2 내지 6개의 제한 부위를 갖는다. 조절 영역 내에서의 링커의 크기는 일반적으로 100 bp 미만, 빈번하게는 60 bp 미만, 그러나 5 bp 이상이다. 상기 프로모터는 숙주 생물체, 예를 들어 숙주 식물과의 관계에서 천연 또는 동종 및 외부 또는 이종 둘 다일 수 있다. 상기 발현 카세트는 5'-3' 방향의 전사 프로모터, Δ6-아세틸레나제/Δ6-데새처라제 및(또는) Δ6-데새처라제 유전자를 코딩하는 DNA서열 및 전사 종결을 위한 영역을 포함한다. 다양한 종결 영역은 목적에 따라 서로 대체될 수 있다.
적합한 제한 절단 부위를 제공하거나 과다 DNA 또는 제한 절단 부위를 결실시키는 조작을 사용할 수도 있다. 삽입, 결실 또는 치환, 예를 들어 전위 (transition) 및 트랜스버전 (transversion)의 경우, 시험관내 돌연변이, 프라이머 수복, 제한 또는 리게이션을 이용하는 것이 가능하다. 예를 들어 평활말단에서 오버행 (overhang) 절단 또는 충전과 같은 적합한 조작으로 리게이션을 위해 상기 단편에 상보적인 말단을 제공하는 것이 가능하다.
특이적인 ER 보유 신호인 SEKDEL의 부착은 특히 유리한 높은 수준의 발현에 중요한데 (쇼텐 에이 (Schouten A.) 등의 문헌 [Plant Mol.Biol. 30(1996),781-792]), 이는 발현 평균 수준의 세배 또는 네배에 달한다. 또한 카세트를 제작함에 있어서 ER에 위치하는 식물 및 동물 단백질에서 천연 상태로 나타나는 다른 보유 신호를 사용하는 것도 가능하다.
바람직한 폴리아데닐화 신호는 식물 폴리아데닐화 신호, 바람직하게는 특히 아그로박테리움 투메파시엔 (Agrobacterium Tumefaciens)으로부터의 T-DNA 폴리아데틸화 신호에 본질적으로 상응하는 것, 특히 Ti 플라스미드인 pTiACH5 (문헌 [Gielen et al., EMBO J. 3(1984),835 ff] 참조)의 T-DNA의 유전자 3 (옥토핀 신타제)에 대한 폴리아데닐화 신호 또는 기능적 동등물에 해당하는 것이다.
발현 카세트는 예를 들어, 문헌 [T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)] 및 문헌 [T.J. Silhavy, M.L. Berman and L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984)]와 문헌 [Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecualr Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987)]에 기술된 통상적인 재조합과 클로닝 방법을 통해 적합한 프로모터를 적합한 Δ6-아세틸레나제/Δ6-데새처라제 및(또는) Δ6-데새처라제 DNA 서열에, 그리고 폴리아데닐화 신호에 융합시킴으로써 제조한다.
발현 카세트의 제조에 있어서, 다양한 DNA 단편을 조작하여 간단하게 올바른 방향으로 읽히고 올바른 리딩 프레임을 갖춘 뉴클레오티드 서열을 얻는 것이 가능하다. DNA 단편들을 서로 연결하기 위해, 아답터 또는 링커를 상기 단편에 부착시키는 것이 가능하다.
서열의 삽입을 위한 하나 이상의 제한 부위를 포함하는 링커 또는 폴리링커와 함께 전사의 방향으로 프로모터 및 터미네이터 영역을 제공하는 것이 가능하고 편리하다. 상기 링커는 보통 1 내지 10, 통상적으로는 1 내지 8, 바람직하게는 2 내지 6개의 제한 부위를 갖는다. 조절 영역 내에서의 링커의 크기는 일반적으로 100 bp 미만, 빈번하게는 60 bp 미만, 그러나 5 bp 이상이다. 상기 프로모터는 숙주 식물과의 관계에서 천연 또는 동종 및 외부 또는 이종 둘 다일 수 있다. 상기 발현 카세트는 5'-3' 방향의 전사 프로모터, Δ6-아세틸레나제/데새처라제 유전자를 코딩하는 DNA서열 및 전사 종결을 위한 영역을 포함한다. 다양한 종결 영역은 목적에 따라 서로 대체될 수 있다.
발현 카세트의 제조에 있어서, 다양한 DNA 단편을 조작하여 간단하게 올바른 방향으로 읽히고 올바른 프레임을 갖춘 뉴클레오티드 서열을 얻는 것이 가능하다. DNA 단편들을 함께 연결하기 위해, 아답터 또는 링커를 상기 단편에 부착시키는 것이 가능하다.
이 서열의 삽입을 위한 하나 이상의 제한 부위를 포함하는 링커 또는 폴리링커와 함께 전사의 방향으로 프로모터 및 터미네이터 영역을 제공하는 것이 가능하고 편리하다. 상기 링커는 보통 1 내지 10, 통상적으로는 1 내지 8, 바람직하게는2 내지 6개의 제한 부위를 갖는다. 조절 영역 내에서의 링커의 크기는 100 bp 미만, 빈번하게는 60 bp 미만, 그러나 5 bp 이상이다. 상기 프로모터는 숙주 식물과의 관계에서 천연 또는 동종 및 외부 또는 이종 둘 다일 수 있다. 상기 발현 카세트는 5'-3' 방향의 전사 프로모터, Δ6-아세틸레나제/Δ6-데새처라제 또는 Δ6-데새처라제 유전자를 코딩하는 DNA서열 및 전사 종결을 위한 영역을 포함한다. 다양한 종결 영역이 서로 바람직하게 치환될 수 있다.
쎄라토돈 푸르푸레우스의 Δ6-아세틸레나제/Δ6-데새처라제 및(또는) Δ6-데새처라제를 코딩하는 DNA 서열은 지방산, 지질 또는 오일 생합성의 부위에 알맞은 위치 결정을 하는데 필요한 모든 서열 특성을 포함한다. 따라서, 다른 표적화 서열은 그 자체로 필요하지 않다. 그러나, 그러한 위치 지정 (localization)은 바람직하고 유리할 수 있고, 따라서, 인공적으로 수식하거나 개선한 융합 구조물도 바람직하고 유리한 본 발명의 실시양태이다.
특히 바람직한 서열은 플라스티드를 표적으로 하게 하는 서열이다. 특정 환경에서는 다른 구성분, 예를 들어 액포, 미토콘드리아, 소포체 (ER), 퍼옥시솜, 지방체를 표적으로 삼거나 (케르모데 (Kermode)의 문헌 [Crit.Rev.Plant Sci. 15,4(1996),285-423) 참조), 또는 적절한 작용성 서열이 없어서 생산 구획인 세포질에 남아있는 것도 또한 바람직할 수 있다.
신규 핵산 서열을 하나 이상의 리포터 (reporter) 유전자와 함께 발현 카세트 내로 클로닝하는 것이 유리하며, 이 발현 카세트는 벡터를 경유하여 생물체 내로 또는 직접적으로 게놈 내로 도입된다. 이 리포터 유전자는 생장, 형광, 화학-또는 생물발광이나 내성 분석시험 또는 광도계 측정에 의해 용이하게 검출 가능해야 한다. 언급할 수 있는 리포터 유전자의 예로는 Ura3 유전자, Ilv2 유전자, 루시퍼라제 유전자, β-갈락토시다제 유전자, gfp 유전자, 2-데옥시글루코스-6-포스페이트 포스파타제 유전자, β-글루쿠로니다제 유전제, β-락타마제 유전자, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자, 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자 또는 BASTA (=글루포시네이트-내성) 유전자와 같은 항생제- 또는 제초제-내성 유전자, 히드롤라제 유전자, 형광 단백질 유전자, 생물발광 유전자, 당 또는 뉴클레오티드 대사 유전자 또는 생합성 유전자이다. 이들 유전자는 전사 활성 및 그에 따른 유전자 발현을 용이하게 측정하고 정량하는 것을 가능하게 한다. 따라서, 생산성의 차이를 보이는 게놈 상의 부위를 확인하는 것이 가능하다.
바람직한 실시양태에서, 발현 카세트는 프로모터 상류, 즉 코딩 서열의 5' 말단 및 폴리아데닐화 신호 하류, 즉 3' 말단과 적절한 경우, Δ6-아세틸레나제/Δ6-데새처라제 및(또는) Δ6-데새처라제 DNA 서열 사이에 있는 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 추가의 조절 엘리먼트를 포함한다. 작동 가능한 연결이란 각 조절 엘리먼트가 코딩 서열의 발현을 위해 기능을 수행할 수 있는 방식으로 프로모터, 코딩 서열, 터미네이터 및 적절한 경우, 추가의 조절 엘리먼트가 순차적으로 정렬된 것이다. 작동 가능한 연결에 바람직한 서열은 플라스티드에의 세포 내 위치 지정을 보장하는 표적화 서열이다. 그러나, 미토콘드리아, 소포체 (ER), 세포핵, 지방형성체 또는 다른 구획에의 세포내 위치 지정을 보장하는 표적화 서열 뿐만 아니라 필요한 경우, 담배 모자이크 바이러스로부터의 5' 리더 서열과 같은 번역 인핸서도 또한 사용될 수 있다 (갈리에 (Gallie) 등의 문헌 [Nucl.Acids Res. 15(1987),8693-8711)]).
발현 카세트는 예를 들어 구성적 프로모터 (바람직하게는 USP 또는 나핀 프로모터), 발현될 유전자 및 ER 보유 신호를 포함할 수 있다. 바람직하게 사용되는 ER 보유 신호는 아미노산 서열인 KDEL (리신, 아스파르트산, 글루탐산, 루이신)이다.
발현을 위해, 발현 카세트는 원핵 또는 진핵 숙주 생물체, 예를 들어 진균류와 같은 미생물이나 식물 내로, 유리하게는 벡터 내로, 예를 들어 플라스미드, 파지 또는 상기 유전자를 숙주 생물체 내에서 최적으로 발현 가능한 다른 DNA 내로 삽입한다. 적합한 플라스미드의 예로는 이 콜라이 (E. coli) 내에서의 pLG338, pACYC184, pBR322와 같은 pBR계, pUC18 또는 pUC19와 같은 pUC계, M133mp계, pKC30, pRep4, pHS1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III113-B1, λgt11 또는 pBdCI, 스트렙토마이시즈 (streptomyces) 내에서의 pIJ101, pIJ364, pIJ702 또는 pIJ361, 바실루스 (bacillus) 내에서의 pUB110, pC194 또는 pBD214, 코리네박테리움 (corynebacterium) 내에서의 pSA77 또는 pAJ667, 진균류 내에서의 pALS1, pIL2 또는 pBB116이며, 보다 유리한 진균성 벡터는 문헌 [Romanos, M.A. et al., (1992) "Foreign gene expression in yeast; a review", Yeast 8:423-488] 및 문헌 [van den Holden, C.A.M.J.J. et al., (1991) "Heterologous gene expression in filamentous fungi"]과 문헌 ["More Gene Manipulations in Fungi" [J.W.Bennet ＆ L.L. Lasure, eds., p.396-428: Academic Press; San Diego]] 및 문헌 ["Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi" [van den Hondel, C.A.M.J.J. ＆ Punt, P.J. (1991) in: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J.F. et al., eds., p.1-28, Cambridge University Press; Cambridge]]에 기술된 것이다. 유리한 효모 프로모터의 예로는 2μM, pAG-1, YEp6, YEp13 및 pEMBLYe23이 있다. 조류 또는 식물 프로모터의 예로는 pLGV23, pGHlac+, pBIN19, pAK2004, pVKH 및 pDH51이 있다 (문헌 [Schmidt, R. and Willmitzer, L.(1988)] 참조). 상기 벡터 또는 상기 벡터의 유도체는 가능한 플라스미드 중에서의 작은 선택예들을 보여주고 있다. 추가의 플라스미드가 당업자에게 공지되어 있고 예를 들어, 문헌 ["Cloning Vector" (Eds. Pouwels P.H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018)] 내에서 찾을 수 있다. 적합한 식물 벡터는 특히 문헌 ["Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology" (CRC Press), Chapters 6/7, pp.71-119]에 기술되어 있다. 유리한 벡터는 이 콜라이와 아그로박테리움 내에서 복제하는 셔틀 벡터 (shuttle vector) 또는 이원성 벡터 (binary vector)이다.
플라스미드 이외에도, 벡터는 또한 당업자에게 공지된 모든 다른 벡터, 예를 들어 파지, SV40, CMV, 바큘로바이러스, 아데노바이러스와 같은 바이러스, 트랜스포손, IS 엘리먼트, 플라스미드, 파지미드, 코스미드, 선형 또는 환형 DNA를 의미한다. 이들 벡터는 숙주 생물체 내에서 자가 복제 또는 염색체 복제가 가능하며, 염색체 복제가 바람직하다.
추가적인 벡터 실시양태에서, 신규 발현 카세트는 또한 선형 DNA의 형태로 생물체 내에 유리하게 도입되고 숙주 생물체의 게놈 내로 이종 또는 동종 재조합에 의해 삽입된다. 이 선형 DNA는 선형화된 플라스미드로 또는 벡터로서의 발현 카세트만으로 또는 신규 핵산 서열로 구성될 수 있다.
추가의 유리한 실시양태에서, 신규 핵산 서열은 단독으로 생물체 내에 도입된다. 신규 핵산 서열 뿐만 아니라 추가의 유전자가 생물체 내로 도입되는 경우, 이 모두를 리포터 유전자와 함께 단일 벡터 내에 도입하거나 각 개별적인 유전자가 리포터 유전자와 함께 별도로 하나씩의 벡터 내에서 생물체 내로 각각 달리 도입할 수 있으며, 이경우 다양한 벡터가 동시에 또는 순차적으로 도입될 수 있다.
벡터는 유리하게 한 카피 이상의 신규 핵산 서열 및(또는) 한 카피 이상의 신규 발현 카세트를 포함한다.
예를 들어 식물 발현 카세트를 담배 형질전환 벡터인 pBinAR 내로 혼입시키는 것이 가능하다. 도 1은 35S 프로모터가 있는 담배 형질 전환 벡터인 pBinAR (C) 및 USP 프로모터가 있는 pBin-USP (C)를 도시하고 있다. 원래의 벡터는 도 1 A) 및 B)에 도시하고 있다.
별법으로, 예를 들어 T7 프로모터 및 T7 RNA 폴리머라제를 사용함으로써 재조합 벡터 (=발현 벡터)의 시험관내 전사 및 번역이 가능하다.
원핵세포에서 빈번히 사용되는 발현 벡터는 융합 단백질 및 융합 올리고펩티드의 존재 및 부재 하의 유도성 발현계를 사용하며, 이러한 융합은 N-말단 및 C-말단 둘 다에서 일어나거나, 단백질 내에서 사용 가능한 다른 도메인 상에서 일어날수 있다. 이러한 유형의 융합 벡터는 통상적으로 i) RNA 발현 속도 증가, ii) 달성될 수 있는 단백질 합성 속도의 증가, iii) 단백질의 용해도 증가 또는 iv) 친화도 크로마토크래피에 사용될 수 있는 결합 서열에 의한 정제의 간편화를 위해 사용된다. 또한 빈번하게 융합 단백질을 통해 단백질 분해성 절단 부위를 도입하여, 정제 후 융합 단백질의 일부를 절단 가능하도록 한다. 그러한 프로테아제 인식 서열은 예를 들어, 팩터 Xa (Factor Xa), 트롬빈 및 엔테로키나제를 인식한다.
통상의 유리한 융합 및 발현 벡터는 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (GST), 말토스 결합 단백질 또는 단백질 A를 포함하는 pGEX [Pharmacia Biotech Inc; Smith, D.B. and Johnson, K.S. (1988) Gene 67:31-40] 및 pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) 및 pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ)]이다.
이. 콜라이 발현 벡터의 추가적인 예로는 pTrc (문헌 [Amann et al., (1988) Gene 69:301-315] 참조) 및 pET 벡터 (문헌 [Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89; Stratagene, Amsterdam, The Netherlands] 참조)가 있다.
효모에 사용되는 추가의 유리한 벡터로는 pYepSec1 ( 문헌 [Baldari et al., (1987) Embo J. 6:229-234)], pMFa (문헌 [Kurjan and Herskowitz (1982) Cell 30:933-943] 참조), pJRY88 (문헌 [Schultz et al., (1987) Gene 54:113-123)] 참조) 및 pYES 유도체 (인비트로젠 코퍼레이션 (Invitrogen Coperation), 캘리포니아 샌 디에고 소재)가 있다. 사상 진균류에서 사용되는 벡터는 하기에 기재되어 있다: 문헌 [van den hondel C.A.M.J.J. and Punt, P.J. (1991) "Gene transfersystems and vector development for filamentous fungi"], 문헌 [Applied Molecular Genetics of Fungi, J.F. Peberdy, et al.,eds.,p.1-28, Cambridge University Press: Cambridge].
또한 유리한 별법으로 곤충 세포 발현 벡터, 예를 들어 Sf 9 세포에서의 발현을 위한 벡터를 사용하는 것도 가능하다. 그 예로는 pAc계 벡터 (문헌 [Smith et al., (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165] 참조) 및 pVL계 벡터 (문헌 [Lucklow and Summers (1989) Virology 170:31-39] 참조)가 있다.
유전자 발현을 위해 식물 세포 또는 조류 세포를 사용하는 것도 추가로 가능하고 유리하다. 식물 발현 벡터의 예는 문헌 [Becker, D. et al., (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border", Plant Mol. Biol. 20:1195-1197] 또는 문헌 [Bevan, M.W. et al., (1984) "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation", Nucl.Acid.Res. 12:8711-8721]에서 찾을 수 있다.
또한 신규 핵산 서열은 포유류 세포 내에서도 발현될 수 있다. 적합한 발현 벡터의 예로는 pCDM8 및 pMT2PC가 있다: 문헌 [Seed, B., (1987) Nature 329:840] 또는 문헌 [Kaufman et al., (1987) EMBO J. 6:187-195] 참조. 이러한 경우에 바람직하게 사용되는 프로모터로는 예를 들어, 폴리오마바이러스 (polyomavirus), 아데노바이러스 2 (adenovirus 2), 사이토메갈로바이러스 (cytomegalovirus) 또는 시미안 바이러스 40 (simian virus 40)과 같은 바이러스 기원의 프로모터가 있다. 추가의 원핵세포 및 진핵세포 발현 시스템은 문헌 [Sambrook, et al., MolecularCloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989]의 16장 및 17장에 언급되고 있다.
생물체, 예를 들어 식물로의 신규 핵산의 도입, 발현 카세트의 도입 또는 벡터의 도입은 본질적으로 당업자에게 공지된 모든 방법에 의해 수행할 수 있다.
당업자는 미생물에 대한 적합한 방법을 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual: Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press], 문헌 [F.M. Ausubel et al., (1994) Current protocols in molecular biology, John Wiley and Sons], 문헌 [D.M. Glover et al., DNA Cloning Vol.1, (1995), IRL Press (ISBN 019-963476-9)], 문헌 [Kaiser et al., (1994) Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press] 또는 문헌 [Guthrie et al., Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Method in Enzymology, 1994, Academic Press]에 의한 교과서 내에서 찾을 수 있다.
외부 유전자를 식물 게놈 내로 전달하는 것을 형질전환으로 지칭한다. 이 경우, 형질 전환과 일시적 또는 안정적인 형질전환을 위한 식물 조직이나 식물 세포로부터의 식물의 재생에 대해 기술하는 방법을 사용한다. 적합한 방법으로는 폴리에틸렌 글리콜-유도 DNA 흡입에 의한 프로토플라스트 형질전환, 소위 파티클 봄바드먼트 (particle bombardment)로 불리는 유전자 총에 의한 바이오리스틱 (biolistic) 방법, 전기천공법 (electroporation), DNA를 함유한 용액에서 건조된 배 배양, 마이크로인젝션 (microinjection) 및 아그로박테리움-매개 유전자 전달이있다. 언급한 방법은 예를 들어, 문헌 [B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol.1, Engineering and Utilization, edited by S.D. Kung and R. Wu, Academic Press (1993) 128-143] 및 문헌 [Potrykus et al., Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42(1991)205-225]에 기술되어 있다. 발현될 구조물은 바람직하게는 아그로박테리움 투메파시엔을 형질전환시키기에 적합한 벡터, 예를 들어 pBin19 (문헌 [Bevan et al., Nucl.Acid.Res. 12 (1984) 8711] 참조) 내로 클로닝된다. 그러한 벡터로 형질전환된 아그로박테리아는 그후 식물, 특히 예를 들어 담배 식물과 같은 작물 식물을 형질전환시키기 위한 공지된 방식, 예를 들어 아그로박테리아 용액에 손상된 잎 또는 잎 조각을 담그고, 그후 적합한 배지에서 재배하는데 사용할 수 있다. 아그로박테리움 투메파시엔에 의한 식물의 형질전환은 예를 들어 문헌 [ Hoefgen and Willmitzer, Nucl.Acids Res. (1988)16,9877] 또는 특히 문헌 [F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, edited by S.D. Kung and R. Wu, Academic Press, 1993, pp. 15-38]에 기재되어 있다.
신규 발현 벡터로 형질전환된 아그로박테리아는 유사하게 공지된 방식으로 아라비돕시스와 같은 시험 식물이나 곡물, 옥수수, 귀리, 호밀, 보리, 밀, 대두, 쌀, 면화, 사탕무, 카놀라, 해바라기, 아마, 삼, 감자, 담배, 토마토, 당근, 파프리카 (paprika) 고추, 유지종자 평지, 타피오카 (tapioca), 마니옥 (manioc), 칡, 천수국, 자주개자리, 상추 및 다양한 나무, 견과 및 포도나무 종, 특히 대두, 땅콩, 피마자, 해바라기, 옥수수, 면화, 아마, 유지종자 평지, 코코넛, 오일 팜, 홍화 (카르타무스 틴크토리우스, Carthamus tinctorius) 또는 코코아 콩과 같은 오일 함유 작물 식물과 같은 작물 식물을, 예를 들어 손상된 잎 또는 잎 조각을 아그로박테리움 용액에 담그고 그후, 적합한 배지에 재배함으로써 형질전환시키는데 사용할 수 있다.
유전적으로 수식된 식물 세포는 당업자에게 공지된 모든 방법에 의해 재생될 수 있다. 적합한 방법은 상기 문헌 (S.D. Kung and R. Wu, Potrykus, Hoefgen and Willmitzer)에서 찾을 수 있다.
본질적으로 신규 핵산, 발현 카세트 또는 벡터에 적합하고 유리한 생물체 또는 숙주 생물체는 지방산, 특히 불포화 지방산을 합성할 수 있거나 재조합 유전자를 발현하는데 적합한 모든 생물체이다. 언급될 수 있는 예로는 아라비돕시스와 같은 식물, 칼렌둘라 (calendula)와 같은 아스테라세아 (asteraceae) 또는 대두, 땅콩, 피마자, 해바라기, 옥수수, 면화, 아마, 유지종자 평지, 코코넛, 오일 팜, 홍화 (카르타무스 틴크토리우스) 또는 코코아콩과 같은 작물 식물, 예를 들어 모르티에렐라 (Mortierella) 속, 사프롤레그니아 (Sprolegnia) 속 또는 파이티움 (Pythium) 속과 같은 진균류, 에스케리키아 속과 같은 박테리아, 사카로마이세스 속과 같은 효모, 시아노박테리아, 섬모충류, 크립테코디니움 (crypthecodinium)과 같은 쌍편모조류와 같은 조류나 원생동물이 있다. 천연 상태에서 오일을 상대적으로 다량 합성할 수 있는 모르티에렐라 알피나 (Mortierella alpina), 파이티움 인시디오숨 (Pathium insidiosum)과 같은 진균류, 대두, 유지종자 평지, 코코넛, 오일 팜, 홍화, 피마자, 금송화, 땅콩, 코코아 콩 또는 해바라기나 사카로마이세스 세레비지아 (Saccharomyces Cerevisiae)와 같은 효모 등의 생물체가 바람직하며, 특히 대두, 유지종자 평지, 해바라기, 금송화 또는 사카로마이세스 세레비지아가 바람직하다. 또한 트랜스제닉 동물은 본질적으로 숙주 생물체, 예를 들어 시. 엘레강스 (C. elegans)가 적합하다.
또한 사용 가능한 숙주 세포는 괴델 (Goeddel)의 문헌 [Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)]에 언급되어 있다.
사용 가능한 발현 균주, 예를 들어 비교적 낮은 프로테아제 활성을 갖는 균주는 고테스만 에스 (Gottesman, S.)의 문헌 [Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119-128]에 기술되어 있다.
나아가 본 발명은 식물 세포 또는 식물의 조직 또는 일부의 형질 전환을 위해 Δ6-아세틸레나제/Δ6-데새처라제 및(또는) Δ6-데새처라제 유전자를 코딩하는 DNA 서열 또는 상기 유전자를 융합시킨 DNA 서열을 포함하는 발현 카세트의 용도에 관한 것이다. 상기 용도의 목적은 6번 위치에서 삼중 결합 및 이중 결합의 함량이 증가된 지방산, 오일 또는 지질의 함량을 증가시키는데 있다.
또한, 프로모터의 선택에 따라 Δ6-아세틸레나제/Δ6-데새처라제 및(또는) Δ6-데새처라제 유전자의 발현이 잎, 종자, 괴경 또는 식물의 다른 부위에서 특이적으로 일어나도록 하는 것이 가능하다. 본 발명의 추가의 측면은 Δ6 삼중 결합또는 Δ6 이중 결합이 있는 그러한 지방산, 오일 또는 지질을 과생산하는 트랜스제닉 식물, 그의 유전 물질 및 그의 식물 세포, 조직 또는 그 일부이다. 본 발명은 바람직하게는 신규 기능적 또는 비기능적 (=안티센스 DNA 또는 효소적으로 불활성인 효소) 핵산 서열이나 기능적 또는 비기능적 발현 카세트를 포함하는 트랜스제닉 식물에 관한 것이다.
또한, Δ6-아세틸레나제/Δ6-데새처라제 및(또는) Δ6-데새처라제 유전자 서열을 포함하는 발현 카세트 또는 신규 핵산 서열은 Δ6 삼중 결합 또는 Δ6 이중 결합이 있는 그러한 지방산, 오일 또는 지질의 함량을 증가시킬 목적으로 박테리아, 시아노박테리아, 효모, 사상 진균류, 섬모충류 및 조류와 같은 예를 통해 상기에서 언급한 생물체를 형질변환시키는데 사용할 수 있다.
Δ6 삼중 결합 또는 Δ6 이중 결합이 있는 그러한 지방산, 오일 또는 지질의 함량 증가란 본 발명의 목적상 예를 들어, 신규 생물체 내, 유리하게는 신규 트랜스제닉 식물체 내에서 유전적 수식이 없는 원래 식물과 비교시 1세대 이상이 지속하는 동안 Δ6-아세틸레나제/Δ6-데새처라제 및(또는) Δ6-데새처라제 유전자의 기능적 과발현을 통해 인공적으로 획득한 증가된 생합성 활성의 능력을 의미한다.
예를 들어 지방산, 오일 또는 지질의 생합성 부위는 일반적으로 종자 또는 종자의 세포층이어서, Δ6-아세틸레나제/Δ6-데새처라제 및(또는) Δ6-데새처라제 유전자의 종자-특이적 발현은 상당하다. 그러나, 지방산, 오일 또는 지질의 생합성은 종자 조직으로 제한할 필요가 없을 뿐만 아니라 식물의 다른 모든 부분, 예를 들어 표피 세포 또는 괴경에서의 조직-특이적인 방식으로 일어날 수 있다는 것이명백하다.
또한, 외생 Δ6-아세틸레나제/Δ6-데새처라제 및(또는) Δ6-데새처라제 유전자의 구성적 발현이 유리하다. 그러나, 한편으로 유도적 발현도 바람직하게 나타날 수 있다.
예를 들어, 트랜스제닉 Δ6-아세틸레나제/Δ6-데새처라제 및(또는) Δ6-데새처라제 유전자의 발현 효과는 시험관 내에서 가지 분열조직 증식에 의해 측정할 수 있다. 또한, Δ6-아세틸레나제/Δ6-데새처라제 및(또는) Δ6-데새처라제 유전자의 성질과 발현 수준의 변화 및 지방산, 오일 또는 지질 생합성 활성에 대한 효과는 시험 식물에 대한 온실 실험으로 시험할 수 있다.
본 발명은 추가로 Δ6-아세틸레나제/Δ6-데새처라제 및(또는) Δ6-데새처라제의 유전자 서열 또는 상기 유전자를 융합시킨 DNA 서열을 포함하는 발현 카세트로 형질전환된 트랜스제닉 식물 및 트랜스제닉된 세포, 조직, 일부와 그러한 식물의 유전 물질에 관한 것이다. 이 관계에 특히 바람직한 것은 예를 들어, 보리, 밀, 호밀, 귀리, 옥수수, 대두, 쌀, 면화, 사탕무, 유지종자 평지 및 카놀라, 해바라기, 아마, 삼, 감자, 담배, 토마토, 타피오카, 마니옥, 칡, 자주개자리, 상추 및 다양한 나무, 견과 및 포도나무 종과 같은 트랜스제닉된 작물 식물이다.
본 발명의 목적을 위한 식물은 외떡잎 및 쌍떡잎 식물 또는 조류이다.
다른 신규 실시양태는 상기 기술한 트랜스제닉 식물체와 기능적 또는 비기능적 신규 핵산 서열이나 기능적 또는 비기능적 신규 발현 카세트를 포함한다. 비기능적이란 더이상 효소적으로 활성인 단백질의 합성이 없다는 것을 의미한다. 또한, 비기능적 핵산 또는 핵산 구조물은 또한 효소 활성의 감소를 나타내거나 효소 활성을 나타내지 않는 트랜스제닉 식물을 생성하는, 소위 안티센스 DNA를 의미한다. 안티센스 기술은 특히 신규 핵산 서열이 안티센스 DNA 내에서의 다른 지방산 합성 유전자와 합하여진 경우, 포화 지방산의 함량이 증가된 트리글리세리드를 합성하거나 포화 지방산을 합성하는데 사용할 수 있다. 트랜스제닉 식물이란 개별적인 식물 세포 및 고체 배지 또는 액체 배지 상의 그 배양물, 식물의 부분 및 식물 전체를 의미한다.
나아가 본 발명은
- Δ6-아세틸레나제/Δ6-데새처라제 및(또는) Δ6-데새처라제 유전자 서열 또는 상기 유전자 서열을 혼성화시킨 DNA 서열을 포함하는 발현 카세트를 식물 세포, 유합조직, 식물 전체 또는 식물의 원형질체로 도입하는 것을 포함하는, 식물을 형질전환시키는 방법,
- 식물 내에서 Δ6-아세틸레나제/데새처라제 DNA를 발현시킴으로써 델타 6번에 삼중 결합 또는 이중 결합이 있는 지방산, 오일 또는 지질의 함량을 증가시킨 식물을 생산하기 위한 Δ6-아세틸레나제/Δ6-데새처라제 및(또는) Δ6-데새처라제 DNA 유전자 서열 또는 상기 유전자 서열과 혼성화된 DNA 서열의 용도,
- 서열 8에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질,
- 서열 10에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질,
- 불포화 지방산을 생성하기 위한 서열 8 및 서열 10의 서열을 갖는 단백질의 용도에 관한 것이다.
나아가 본 발명은 상기 기술한 하나 이상의 신규 핵산 서열 또는 하나 이상의 신규 핵산 구조물을 바람직하게는 오일-생산 생물체로 도입하는 단계, 이 생물체를 배양하는 단계, 생물체 내에 함유된 오일을 단리하는 단계, 상기 오일에 함유된 지방산을 유리시키는 단계를 포함하는, 불포화 지방산의 생산 방법에 관한 것이다. 이들 불포화 지방산은 Δ6 삼중 결합 및(또는) Δ6 이중결합을 유리하게 포함한다. 또한 상기 지방산은 예를 들어 염기 가수분해에 의해, 예를 들어 NaOH 또는 KOH를 사용하여 오일 또는 지질로부터 유리될 수 있다.
추가로 본 발명은 상기 기술한 하나 이상의 신규 핵산 서열 또는 하나 이상의 신규 핵산 구조물을 오일-생산 생물체로 도입하는 단계, 이 생물체를 배양하는 단계, 생물체 내에 함유된 오일을 단리하는 단계를 포함하는, 불포화 지방산의 함량이 증가된 트리글리세리드의 제조 방법에 관한 것이다.
나아가 본 발명은 서열 1, 서열 3, 서열 8, 서열 10 또는 서열 11의 서열 중 하나에 의해 코딩된 하나 이상의 단백질로 포화 또는 불포화 지방산 또는 포화 및 불포화 지방산과 함께 트리글리세리드를 인큐베이션시킴으로써 불포화 지방산의 함량이 증가된 트리글리세리드의 제조 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 환원 동등물의 흡수 또는 방출이 가능한 화합물의 존재 하에서 수행하는 것이 유리하다. 그후 상기 지방산은 트리글리세리드로부터 유리될 수 있다.
청구항 16 또는 17의 어느 한 항에 있어서, 지방산은 트리글리세리드로부터 유리된 방법.
상기 언급한 방법은 Δ6 삼중 결합 및(또는) Δ6 이중 결합이 있는 지방산의함량이 증가된 지방산 또는 트리글리세리드를 유리하게 합성 가능하도록 한다.
또한 소위 안티센스 기술을 포화 지방산의 함량이 증가된 지방산 또는 트리글리세리드 제조 방법에 사용할 수 있다.
상기 방법을 위해 언급할 수 있는 생물체의 예로는 아라비돕시스, 보리, 밀, 호밀, 귀리, 옥수수, 대두, 쌀, 면화, 사탕무, 유지종자 평지 및 카놀라, 해바라기, 아마, 삼, 감자, 담배, 토마토, 타피오카, 마니옥, 칡, 자주개자리, 땅콩, 피마자, 코코넛, 오일 팜, 홍화 (카르타무스 틴크토리우스) 또는 코코아 콩과 같은 식물, 진균류인 모르티에렐라, 사프롤레그니아 또는 파이티움과 같은 진균류와 같은 미생물, 에스케리키아 속과 같은 박테리아, 시아노박테리아, 사카로마이세스 속과 같은 효모, 크립테코디니움과 같은 와편모충류와 같은 조류 또는 원생동물이 있다. 포르티에렐라 알피나, 파이티움 인시디오숨과 같은 진균류와 같은 미생물 또는 대두, 유지종자 평지, 코코넛, 오일 팜, 홍화, 피마자, 금송화, 땅콩, 코코아 콩 또는 해바라기와 같은 식물, 또는 사카로마이세스 세레비지아와 같은 효모처럼 천연 상태에서 오일을 비교적 다량으로 생산하는 생물체가 바람직하며, 대두, 유지종자 평지, 해바라기, 카르타무스 또는 사카로마이세스 세레비지아가 특히 바람직하다.
본 방법에 사용된 생물체를 당업자에게 공지된 방식으로 숙주 생물체에 따라 생장시키거나 배양한다. 미생물은 일반적으로 당의 형태를 갖는 탄소원, 일반적으로 효모 추출물이나 황산 암모늄과 같은 염처럼 질소의 유기원 형태를 갖는 질소원, 철, 망간, 마그네슘 염과 같은 미량 원소 및 적절한 경우 비타민을 함유하는액체 배지에서 0℃ 내지 100℃ 사이, 바람직하게는 10℃ 내지 60℃ 사이의 온도로 산소를 통과시키면서 배양한다. 이 과정동안 배양액의 pH는 고정값으로 유지하거나 그렇지 않을 수 있다. 즉, 배양하는 동안 조절하거나 그렇지 않을 수 있다. 배양은 회분식, 반회분식 또는 연속식으로 수행될 수 있다. 영양분은 배양 개시에 넣거나 그 후에 반연속식 또는 연속식으로 넣을 수 있다.
형질 전환 후, 식물은 상기 기술한 대로 초기에 재생할 수 있고, 그후 일반적인 방법으로 배양하거나 생장시킬 수 있다.
배양 후, 일반적인 방법으로 배양액을 생물체로부터 단리한다. 이를 위해, 상기 생물체를 수확 후 초기에 파쇄하거나 직접 사용한다. 지질은 적절한 용매, 예를 들어 헥산 또는 에탄올, 이소프로판올 또는 헥산/ 이소프로판올, 페놀/클로로포름/이소아밀알코올과 같은 혼합물과 같은 비극성 용매로 0℃ 내지 80℃ 사이, 바람직하게는 20℃ 내지 50℃ 사이의 온도에서 유리하게 추출한다. 바이오매스 (biomass)는 일반적으로 과량의 용매, 예를 들어 바이오매스에 대해 1:4 과량의 용매로 추출한다. 그 후에 예를 들어 증류를 통해 상기 용매를 제거한다. 또한 상기 추출은 초임계 CO2로 수행할 수 있다. 추출 후 남은 바이오매스는 예를 들어 여과를 통해 제거할 수 있다.
이 방법에서 얻은 조질 오일은 그 후 예를 들어, 아세톤 또는 클로로포름과 같은 극성 용매를 첨가하여 혼탁도를 제거하고 이어서 여과 또는 원심분리를 통해 추가로 정제할 수 있다. 또한 컬럼 상에서의 추가 정제도 가능하다.
트리글리세리드로부터의 유리 지방산을 단리하기 위해, 트리글리세리드를 일반적인 방법으로 가수분해한다.
나아가 본 발명은 상기 언급한 방법에 의해 제조된 불포화 지방산 및 불포화 지방산의 함량이 증가된 트리글리세리드와 인간 식품, 동물 사료, 화장품 또는 약품 생산을 위한 그 용도에 관한 것이다. 이를 위해, 상기 생성물은 인간 식품, 동물 사료, 화장품 또는 약품에 통상적인 양으로 첨가된다.
본 발명은 하기 실시예를 통해 자세히 설명된다.
도 1은 35S 프로모터가 있는 담배 형질 전환 벡터인 pBinAR (C) 및 USP 프로모터가 있는 pBin-USP (C)를 도시하고 있다. 원래의 벡터는 도 1 A) 및 B)에 도시하고 있다.
<실시예 1> 일반적인 클로닝 방법
클로닝 방법, 예를 들어 제한효소에 의한 절단, 아가로스 겔 전기영동, DNA 단편의 정제, 니트로셀룰로스 및 나일론 막으로의 핵산 전이, DNA 단편의 연결, 대장균 세포의 형질전환, 세균의 배양 및 재조합 DNA 서열의 분석 등은 문헌 [Sambrook et al. (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6)에 기재된 바와 같이 수행하였다.
<실시예 2> 재조합 DNA 서열의 분석
재조합 DNA 분자를 생어(Sanger) 방법[Sanger et al. (1977) Proc. Natl.Acad. Sci. USA 74, 5463-5467]에 의해 ABI 레이저 형광 DNA 서열분석기를 이용하여 서열분석하였다. 중합효소 연쇄반응으로부터 생성된 단편을 서열분석하여 구조물 상의 중합효소 오류가 나타나지 않도록 검사하였다.
<실시예 3> 유지종자 평지(rape)의 트랜스제닉 식물 생성 (문헌[Moloney et al., 1992, Plant Cell Reports, 8:238-242]의 방법 변형)
유지종자 평지의 트랜스제닉 식물은 아그로박테리움 투메파시엔 C58C1:pGV2260 또는 대장균 중의 2원 벡터를 이용하여 생성하였다(Deblaere et al., 1984, Nucl. Acids. Res. 13, 4777-4788). 유지종자 평지 식물(변종 드라카 (Var. Drakkar), NPZ Nordeutsche Pflanzenzucht, Hohenlieth, Germany)을, 3％ 수크로스가 포함된 무라쉬게-스코크 배지(Murashige and Skoog, 1962, Physiol. Plant. 15, 473)(3MS 배지)에서 밤새 배양된 양성 형질전환 아그로벡테리아 콜로니 1:50 희석액을 사용하여 형질전환시켰다. 새로이 발아된 멸균 유지종자 평지 식물로부터의 잎꼭지 또는 어린 떡잎(각각 약 1 cm2)을 샤알레에서 아그로박테리움 1:50 희석액과 함께 5 내지 10분 동안 배양하였다. 이어서, 0.8％ 박토(Bacto) 아가를 함유한 3MS 배지에서 25℃의 어두운 곳에서 3일 동안 배양하였다. 3일 후, 밝은 곳에서 16시간 및 어두운 곳에서 8시간 배양한 후, 일주일 단위로 500 mg/l의 클라포란(Claforan; 세포탁심 나트륨), 50 mg/l의 카나마이신, 20 μM의 벤질아미노푸린(BAP) 및 1.6 g/l의 글루코스를 함유한 MS 배지에서 계속 배양하였다. 생장하는 어린싹을 2％ 수크로스, 250 mg/l의 클라포란 및 0.8％ 박토 아가를 함유한 MS 배지로 옮겼다. 3주 후에도 뿌리가 생성되지 않으면, 생장 호르몬인 2-인돌부티르산을 배지에 가하여 뿌리를 생성시켰다.
<실시예 4> 트랜스제닉 아라비돕시스 탈리아나 식물의 생성
아라비돕시스 탈리아나 변종 콜럼비아 콜 0(Arabidopsis thaliana var. Columbia Col 0; Lehle Seeds, Round Rock, Texas, USA)을, 문헌 [Bechtold, N., Ellis, J. and Pelletier, G. in Planta, Agrobacterium mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants, C. R. Acad. Sci. Paris, Life Sciences 316 (1993), 1194-119](원문 생략)에 기재된 꽃 침윤법(flower infiltration method) 또는 뿌리 형질전환법에 의해 형질전환시켰다.
<실시예 5>
문헌 [Pareddy, D., Petolino, J., Skokut, T., Hopkins, N., Miller, M., Welter, M., Smith, K., Clayton, D., Pescitelli, S., Gould, A., Maize Transformation via Helium Blasting. Maydica. 42(2):143-154, 1997]에 기재된 바와 같이 옥수수 식물을 형질전환시켰다.
<실시예 6> 쎄라토돈 푸르푸레우스(Ceratodon purpureus)로부터의 Δ6-아세틸레나제/Δ6-데새처라제 및 Δ6-데새처라제의 단리 및 클로닝
Δ6-아세틸레나제/Δ6-데새처라제 및 Δ6-데새처라제를 코딩하는 쎄라토돈 푸르푸레우스로부터 DNA 서열을 단리하기 위해, 다양한 축중 올리고뉴클레오티드 프라이머를 Δ5-지방산 데새처라제(EMBL 고유번호 Z81122) 및 Δ6-지방산 데새처라제(U79010, AJ222980, AF031477)를 코딩하는 DNA 서열로부터 유도하였다.
프라이머 A: 5'-TGG TGG AA(A/G) TGG A(A/C)I CA(C/T) AA-3'
(아미노산 서열 WWKW(N/T/K)H(N/K)로부터 추정한 정방향 프라이머)
프라이머 B: 5'-(T/G)GI TGG AA(A/G) (T/G)(G/A)I (A/C)AI CA(C/T) AA-3'
(아미노산 서열 (G/W)WK(E/D/W)(N/Q/K)H(N/K)로부터 추정한 정방향 프라이머)
프라이머 C: 5'-AT (A/T/G/C)T(T/G) (A/T/G/C)GG (A/G)AA (A/T/G/C)A(A/G) (A/G)TG (A/G)TG-3' (아미노산 서열 (I/M)(H/Q/N)PF(L/F)HH로부터 추정한 역방향 프라이머)
단일 사슬 씨. 푸르푸레우스 cDNA를 이용한 중합효소 연쇄반응(PCR)에 의해, 프라이머 A와 프라이머 C로 557 bp(Cer 3) 및 575 bp(Cer16) 길이의 DNA 단편 2개를 증폭하였고, 프라이머 B와 프라이머 C로 560 bp(Cer1) 길이의 DNA 단편 1개를 증폭하였다. 증폭을 위해 다음과 같은 프로그램을 사용하였다: 94℃에서 10분; 72℃에서 고온 개시를 위한 정지 단계 이후에 94℃에서 20초, 45℃에서 1분(어닐링 온도, Tm) 및 72℃에서 1분 32 주기; 72℃에서 10분 1 주기, 및 4℃에서 반응 정지. 증폭을 위해 택(Taq)-DNA 중합효소(Gibco BRL)를 사용하였다.
2회의 PCR 증폭으로부터 생성된 상기 이중 가닥 DNA 단편을 pGEM-T 벡터(Promega)에 라이게이션시키고, 대장균 XL1-블루 MRF' Kan(Stratagene)에 형질전환시킨 후, ABI PRISM 빅 다이 터미네이터 싸이클 씨퀀싱 레디 리액션 키트(Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit; Perkin-Elmer, Weiterstadt)를 이용하여 서열분석하였다. Cer1과 Cer3의 DNA 서브 서열은 70％의동일성을 나타냈다. 상기 DNA 서브 서열은 각각 프라이머를 제외하고, Cer1의 경우 173개 아미노산의 오픈 리딩 프레임(서열 5는 프라이머가 없는 Cer1의 부분 뉴클레오티드 서열이고, 서열 6은 Cer1의 추정된 부분 아미노산 서열임)을 코딩하였고, Cer3의 경우 172개 아미노산의 오픈 리딩 프레임(서열 7은 프라이머가 없는 Cer3의 부분 뉴클레오티드 서열이고, 서열 8은 Cer3의 추정된 부분 아미노산 서열임)을 코딩하였으며, Cer16의 경우 178개 아미노산의 오픈 리딩 프레임(서열 9는 프라이머가 없는 Cer16의 부분 뉴클레오티드 서열이고, 서열 10은 Cer16의 추정된 부분 아미노산 서열임)을 코딩하였다. Cer1의 유도된 단백질은 Cer3에 대해 64％의 아미노산 동일성, Cer16에 대해 28％의 아미노산 동일성을 나타냈으며, Cer3 및 Cer16은 27％의 아미노산 동일성을 나타냈다.
Cer1 및 Cer3 단백질은 피스코미트렐라 파텐스(Physcomitrella patens)의 Δ6-아실-리피드 데새처라제와 가장 높은 유사성을 나타냈으며(Girke et al., Plant J., 15, 1998: 39-48), Cer16은 고등식물로부터의 Δ6-아실-리피드 데새처라제 및 Δ8-스핑고리피드 데새처라제와 가장 높은 유사성을 나타냈다.
쎄라토돈 푸르푸레우스로부터 유도된 λZAP cDNA 라이브러리는 프리츠 툼러(Fritz Thummler, Department of Botany, University of Munich)(Pasentsis et al., Plant J., 13, 1, 1998: 51-61)가 제공하였다. 이 쎄라토돈 라이브러리로 PCR 시험을 수행하였으며, 여기에 사용된 특이적인 프라이머는 상기 언급한 DNA 서브 서열 Cer1, Cer3 및 Cer16으로부터 유도되었다.
특이적인 정방향 및 역방향 프라이머는 하기와 같다:
Cer1: 5'-CGAATGAGTGCGACGAAC-3' + 5'-AATAACCTGGGCTCTCAC-3'
Cer3: 5'-ATGAGGATATTGATACTCTC-3' + 5'-GCAATCTGGGCATTCACG-3'
Cer16: 5'-GACATCAAAGCTCTTCTC-3' + 5'-GGCGATGAGAAGTGGTTC-3'
PCR에 의해 cDNA 라이브러리로부터 증폭된 생성물의 제한효소 분석(HindⅢ 및 EcoRⅤ) 결과, 3가지 모든 경우에 ss-cDNA로부터 증폭된 PCR 생성물과 동일한 제한효소 분석 패턴을 나타냈으며, 이는 세로토돈 cDNA 라이브러리가 Cer1, Cer3 및 Cer16의 3가지 클론을 함유함을 의미한다.
<실시예 7> cDNA 라이브러리 스크리닝 및 전장 클론의 서열분석
ss-cDNA로부터 약 570 bp 크기로 증폭된 Cer1, Cer3 및 Cer16의 3가지 PCR 단편(실시예 6 참조)이 포함된 pGEM-T의 DNA를 미니프렙하여 리(M. Lee)와 스팀네(S. Stymne)에게 주어 쎄라토돈 푸르푸레우스 λZAP cDNA 라이브러리로부터의 전장 클론을 추가로 스크리닝하였다. 그 때는, 상기 cDNA 라이브러리 스크리닝으로 약 2.2 kb의 삽입체를 포함하는 Cer1 및 Cer3의 2가지 전장 클론을 얻었으며, 이 클론들은 λZAP 벡터로부터의 EcoRⅠ/KpnⅠ 단편으로서 pUC19 벡터(New England Biolabs)의 EcoRⅠ/KpnⅠ 절단 부위에 서브클로닝한 후, 대장균 JM105 균주에 형질전환시켰다. 낮은 엄격도의 혼성화 프로브로서 Cer1 및 Cer3을 이용하여 cDNA 라이브러리를 추가로 스크리닝한 결과, Cer1에 상동성이 있는 1개 이상의 추가 클론이 존재했으며, 이는 Δ5-데새처라제를 코딩할 것으로 생각되었다.
Cer1-50 및 Cer30-50의 대장균 클론 2개를 완전히 서열분석하였다. Cer1-50은 길이가 2003 bp(서열 1은 5'과 3'의 비번역 영역과 폴리A를 포함하는 쎄라토돈 푸르푸레우스의 Δ6-아세틸레나제/Δ6-데새처라제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열임)이며, 483개 아미노산의 오픈 리딩 프레임(서열 2는 쎄라토돈 푸르푸레우스의 Δ6-아세틸레나제/Δ6-데새처라제에 해당하는 추정 아미노산 서열임)을 코딩하였다. Cer3-50은 길이가 2142 bp(서열 11은 5'과 3'의 비번역 영역을 포함하는 쎄라토돈 푸르푸레우스의 Δ6-데새처라제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열[2142 bp]임)로서, 520개 아미노산의 오픈 리딩 프레임(서열 12는 쎄라토돈 푸르푸레우스의 Δ6-데새처라제에 해당하는 추정 아미노산 서열임)을 코딩하였다. 상기 2가지 단백질 서열은 N-말단에 시트크롬 b5의 매우 보존적인 HPGG 모티프(Lederer F., Biochimie 76, 1994: 674-692)를 나타냈으며, C-말단에 데새처라제의 특징인 3개의 히스티딘 박스(Shanklin et al., Biochemistry, 33, 1994: 12787-12794)가 있었다. 따라서, 이들은 증대되고 있는 시트크롬 b5융합 단백질 족의 추가 구성원이 된다(Napier et al., Trends in Plant Science, 4, 1, 1999: 2-4). 세번째 히스티딘 박스의 첫번째 히스티딘은 글루타민으로 대체되어 있었으며, 이는 Δ5-아실-리피드 데새처라제, Δ6-아실-리피드 데새처라제 및 Δ8-스핑고리피드 데새처라제의 또다른 특징이다.
<실시예 8> PCR과 벡터로의 클로닝을 위한 상기 서열의 제공에 의한, 기능적으로 완전한 활성을 지닌 Δ6-아세틸레나제/Δ6-데새처라제 및 Δ6-데새처라제 서열의 클로닝, 및 효모에서의 기능적 발현
Δ6-아세틸레나제/Δ6-데새처라제의 활성을 지닌 효소를 코딩하는 cDNA를 쎄라토돈 푸르프레우스로부터 제조하였다. Δ6-데새처라제는 본원에 기재된 실시예와 유사하게 클로닝하였다(서열 2, 서열 4 및 서열 12 참조).
우선, 쎄라토돈 푸르푸레우스로부터의 Δ6-아세틸레나제/데새처라제에 대한 Cer1 cDNA를 기초로 중합효소 연쇄반응(PCR)을 위한 올리고뉴클레오티드를 유도하여 클로닝을 수행하였다.
Cer1: 5'-CCGGTACC ATGGCC CTC GTT ACC GAC-3' +
5'-CCGAATTC TTAGTG AGC GTG AAG CCG-3'
Cer3: 5'-CCGGTACC ATGGTG TCC CAG GGC GGC-3' +
5'-CCGAATTC TCAACT CGC AGC AAG CTG-3'
Cer1으로부터 유도된 하기 프라이머를 효소에서의 발현을 위해 채택하였다:
5' 프라이머: 5'-AAAAGGATCCAAAATGGCCCTCGTTACCGAC-3'
3' 프라이머: 5'-AAAAGTCGACTTAGTGAGCGTGAAGCC-3'
쎄라토돈 푸르푸레우스로부터의 Δ6-아세틸레나제/데새처라제 cDNA를 PCR에서의 주형으로 사용하였다. Δ6-아세틸레나제/데새처라제 cDNA의 개시코돈 앞쪽에서 프라이머를 보조하기 위해 BamHⅠ 절단 부위를 도입하였다. 직접 클로닝하기 위해, SalⅠ 제한효소 절단 부위를 정지 코돈 뒤쪽에 도입하였다. 반응 혼합물은 주형 DNA 1 ng/㎕, 0.5 μM의 올리고뉴클레오티드 및 200 μM의 데옥시뉴클레오티드(Pharmacia), 50 mM KCl, 10 mM 트리스-HCl(25℃에서 pH 8.3), 1.5 mM MgCl2및0.02 U/㎕의 Pwo 중합효소(Boehringer Mannheim)로 이루어져 있었으며, 이를 퍼킨 엘머(Perkin Elmer) PCR 기계를 사용하여 하기 온도 프로그램으로 인큐베이션시켰다:
어닐링 온도:50℃, 52초
변성 온도:95℃, 52초
신장 온도:72℃, 90초
주기 수:30
결과로 생성된 1467 염기쌍의 단편을, EcoRⅤ로 절단된 pBluescript LK-(Stratagene) 벡터에 라이게이션시켰다. 삽입체가 BamHⅠ/SalⅠ에 의해 전장의 길이로 절단(1452 bp에 부가하여 제한효소 절단 부위 15 뉴클레오티드 포함)되며 하기 서열(개시 코돈과 정지 코돈에 밑줄이 있고, 절단 부위가 이탤릭체로 표시됨)을 갖는 대조군 플라스미드 pBS-Cer1의 절단에 의해 하나의 클론을 찾아냈다. 또한, 클론 Cer50의 cDNA 서열을 유사하게 사용할 수도 있다. 이것이 단일 기능적 델타-6-데새처라제이다(서열 3 참조). 유도된 아미노산 서열은 서열 4에 기재되어 있다.
미생물에서 코딩된 효소의 기능을 검사하기 위해, pBS-Cer1으로부터의 1467 bp BamHⅠ/SalⅠ 단편을, BamHⅠ/XhoⅠ으로 절단된 발현 벡터 pYES2(Invitrogen, Groningen, The Netherlands)에 라이게이션시키고, 새로이 생성된 플라스미드 pYES2-Cer1으로 표준 프로토콜에 의해 효모를 형질전환시켰다(인비트로젠 (Invitrogen, Groningen, The Netherlands) 형질전환 프로토콜 참조). 결과의 콜로니를 라피노스 함유 배지에서 배양하고, 갈락토스로 Δ6-아세틸레나제/데새처라제 유전자 발현을 유도하였다(하기 참조).
<실시예 9> 형질전환된 효모의 지질 분석
효모는 내생성 지방산(16:0, 16:1, 18:0 및 18:1) 뿐만 아니라 외생성 지방산도 자신의 막 지질에 혼입시킬 수 있다. 발현된 특정 데새처라제의 기질 특이성을 검사하기 위해, 접종하기 전에 CM-2％ 라피노스 배지에 외생성 지방산을 용해시키기 위한 1％ 터지톨(Tergitol) NP-40(w/v, Sigma)과 0.003％의 당해 지방산(원액: 5％ 터지톨 NP-40 중의 0.3％ 또는 3％ 지방산, w/v)을 가하였다. CM-2％ 라피노스 배지/1％ 터지톨 NP-40 3 ml에 트랜스제닉 효모 콜로니를 접종한 후, 이를 30℃의 회전장치에서 600 nm에서의 광학밀도(OD600)가 4.0 내지 4.3이 되도록 2일 동안 예비배양을 수행하였다. 주배양을 위해, CM-2％ 라피노스/1％ 터지톨 NP-40 배지 ±0.003％ 지방산 10 ml에 예비배양액의 분액을 접종(200배 희석)하여 OD600이 0.02가 되도록 한 후, 30℃ 및 250 rpm의 진탕기에서 배양하였다. 로그 생장기 (OD600이 0.5 내지 0.6)에 갈락토스를 1.8％로 가하여 시험배양을 유도하였다. 유도된 세포를 30℃에서 24시간 동안 공기와 접촉하도록 배양한 후, OD600이 4.0 내지 4.3이 되면 이들은 수획하였다.
유도된 효모 세포를 2000 g에서 10분 동안 원심분리하여 수획하고, 증류수 3 ml에 재현탁시킨 후, 100℃에서 10분 동안 끓인 다음, 얼음 상에서 냉각시키고, 재침강시켰다. 1 N의 메탄올성 황산 및 2％ 디메톡시프로판을 이용하여 세포 침전물을 90℃에서 1시간 동안 가수분해하고, 지질을 트랜스메틸화시켰다. 결과의 지방산 메틸 에스테르(FAME)를 석유 에테르로 추출하였다. 추출된 FAME를, 모세관 컬럼(Chrompack, WCOT Fused Silica, CP-Wax-52 CB, 25 m,0.32 mm)을 이용하고 170℃ 내지 240℃의 구배 20분 및 240℃에서 5분 수행하는 가스 액체 크로마토그래피로 분석하였다. 모노에노산, 디에노산, 트리에노산 및 테트라에노산의 메틸 에스테르의 본질은 적합한 FAME 표준(Sigma)과 비교함으로써 확인하였다. 트리이노산 및 테트라이노산에 대해서는 기준이 되는 물질을 입수할 수 없었다. 이들의 본질 및 삼중결합의 위치는 FAME 혼합물의 적합한 화학적 유도체화(예를 들면, 4,4-디메톡시옥사졸린 유도체의 수득; Christie, 1998)에 의해 GC-MS로 분석하였다. 삽입체가 없는 pYES2 벡터, 및 pYES2-Cer1(Δ6-아세틸레나제)로 형질전환된 트랜스제닉 효모로부터의 지방산 메틸 에스테르의 GC 분석 결과가 표 1에 기재되어 있다. 트랜스제닉 효모 세포는 외생성 지방산 없이, 또는 리놀레산(18:2), γ-리놀렌산(γ-18:3), α-리놀렌산(α-18:3) 또는 ω3-옥타데카테트라에노산(18:4)을 가한 후에 분석하였다.
표 1은 삽입체가 없는 pYES2 벡터, Δ6-아세틸레나제(Cer1/pYES2) 및 Δ6-데새처라제(Cer3/pYES2)로 형질전환된 트랜스제닉 효모로부터의 지방산 메틸 에스테르에 대한 GC 분석 결과를 보여준다. 트랜스제닉 효모 세포는 외생성 지방산 없이(-), 또는 리놀레산(18:2), γ-리놀렌산(γ-18:3), α-리놀렌산(α-18:3) 또는 ω3-옥타데카테트라에노산(18:4)을 가한 후에 분석하였다. 총 지방산에 대한 몰％의 지방산 조성, 공급된 지방산의 혼입(진한 글씨, 흑색), 불포화 생성물(적색) 및불포화 생성물의 합계(마지막 행)가 개개의 공급 실험에 대해 기재되어 있다.
<실시예 10> Δ6-아세틸레나제/데새처라제 활성을 지닌 효소를 과다발현하는 트랜스제닉 식물의 생성
식물을 형질전환시키기 위해, pBS-Cer1으로부터의 BamHⅠ/SalⅠ 단편을 BamHⅠ/SalⅠ으로 절단된 pBIN-USP 또는 pBinAR에 라이게이션시켜 형질전환 벡터를 생성하였다. pBin-USP 및 pBinAR은 pBin19 플라스미드의 유도체이다. pBinAR은 EcoRⅠ-KpnⅠ 단편으로서 35S CaMV 프로모터(꽃양배추 모자이크 바이러스의 뉴클레오티드 6909-7437에 상응함) (Frank et al. (1980) Cell 21, 285)를 pBin19(Bevan et al. (1980) Nucl. Acids Res. 12, 8711)에 삽입시킴으로써 제조하였다. Ti 플라스미드 pTiACH5(Gielen et al., (1984) EMBO J. 3, 835)의 T-DNA 중 3번 유전자의 폴리아데닐화 신호(뉴클레오티드 11749-11939)는 PvuⅡ-HindⅢ 단편으로서 단리하였고, PvuⅡ 절단 부위에 SphⅠ 링커를 가한 후에 벡터의 SphⅠ-HindⅢ 절단 부위 사이에 클로닝하였다. 그 결과, 플라스미드 pBinAR(Hoefgen and Willmitzer (1990) Plant Science 66, 221-230)이 생겨났으며, 이 플라스미드는 pBluescript로부터 다시 클로닝했기 때문에 프로모터와 종결자 사이에 이용가능한 몇개의 제한효소 절단 부위가 있다. USP 프로모터는 뉴클레오티드 1-684(진뱅크 고유번호 X56240)에 상응하며, USP 유전자의 비코딩 영역 중 일부가 프로모터에 존재한다. 크기가 684 bp인 프로모터 단편을, 상업적으로 시판되는 T7 표준 프라이머(Stratagene)를 사용하는 표준 방법에 의해 합성 프라이머 (프라이머 서열: 5'-GTCGACCCGCGGACTAGTGGGCCCTCTAGACCCGGGGGATCCGGATCTGCTGGCTATGAA-3')의 도움을 받아 PCR로 증폭하였다. 이어서, PCR 단편을 EcoRⅠ/SalⅠ으로 절단하여 pBinAR 벡터에 삽입하였다. 결과로 생성된 플라스미드를 pBinUSP라 부른다.
상기 구조물을 이용하여 아라비돕시스 탈리아나 및 유지종자 평지 식물을 형질전환시켰다.
재생된 어린싹을 카나마이신과 클라포란이 함유된 2MS 배지에서 얻었으며, 이 어린싹이 뿌리를 형성한 후에 토양에 옮긴 다음, 공기-조절 챔버 또는 온실에서 2주 동안 배양하였다. 개화 후, 숙성 종자를 수확하여, 지질 분석에 의해 Δ6-아세틸레나제/데새처라제 발현을 조사하였다. 아세틸렌성 지방산 또는 이중결합의 함량이 증가된 식물 계통이 확인되었다. 형질전환되지 않은 대조군 식물에 비해 델타-6 위치에서 아세틸렌성 지방산 및 이중결합의 함량이 증가되는 현상은, 트랜스유전자(transgene)를 기능적으로 발현하는, 안정하게 형질전환된 트랜스제닉 식물 계통에서 나타났다.
<실시예 11> 종자로부터 지질의 추출
식물 종자로부터의 지질 분석은 효모의 지질 분석과 유사하게 수행하였다. 그러나, 식물 재료는 우선 추출이 가능하도록 모르타르를 이용하여 기계적으로 균질화시켰다.

Claims (23)

  1. a) 서열 1, 서열 3 또는 서열 11에 기재된 서열을 갖는 핵산 서열,
    b) 유전자 코드의 축중(degeneracy)으로 인하여 서열 1, 서열 3 또는 서열 11에 기재된 핵산 서열로부터 유래되는 핵산 서열, 및
    c) 서열 2에 기재된 아미노산 서열을 가지며 아미노산 수준에서 75％ 이상의 상동성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하고 그 폴리펩티드의 효소 작용 감소가 미미한, 서열 1, 서열 3 또는 서열 11에 기재된 핵산 서열의 유도체
    로 이루어진 군으로부터 선택되는, Δ6-아세틸레나제 및(또는) Δ6-데새처라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산 서열.
  2. 제1항에 청구된 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열.
  3. 제2항에 있어서, 서열 1, 서열 3 또는 서열 11에 기재된 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열.
  4. 제1항에 청구된 핵산 서열을 하나 이상의 조절 신호에 연결된 상태로 포함하는 발현 카세트.
  5. 제1항에 청구된 핵산 서열 또는 제4항에 청구된 발현 카세트를 포함하는 벡터.
  6. 제1항에 청구된 핵산 서열 1개 이상 또는 제4항에 청구된 발현 카세트 1개 이상 또는 제5항에 청구된 벡터 1개 이상을 포함하는 생물체.
  7. 제6항에 있어서, 생물체가 식물, 미생물 또는 동물인 생물체.
  8. 제1항에 청구된 기능적 또는 비기능적 핵산 서열 또는 제4항에 청구된 기능적 또는 비기능적 발현 카세트를 포함하는 트랜스제닉 식물.
  9. 제1항에 청구된 핵산 서열 1개 이상 또는 제4항에 청구된 발현 카세트 1개 이상을 오일-생성 생물체에 도입하고, 상기 생물체를 배양하여 그 생물체에 함유된 오일을 단리한 후, 오일에 함유된 지방산을 유리시키는 것을 포함하는 불포화 지방산의 제조 방법.
  10. 제1항에 청구된 핵산 서열 1개 이상 또는 제4항에 청구된 발현 카세트 1개 이상을 오일-생성 생물체에 도입하고, 상기 생물체를 배양하여 그 생물체에 함유된 오일을 단리하는 것을 포함하는, 불포화 지방산의 함량이 증가된 트리글리세리드의 제조 방법.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 불포화 지방산이 삼중결합을 갖는 불포화 지방산, 또는 6번 위치에 이중결합을 갖거나 6번 위치에 삼중결합과 이중결합을 갖는 불포화 지방산의 함량이 증가된 것인 방법.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 생물체가 식물 또는 미생물인 방법.
  13. 서열 8에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질.
  14. 서열 10에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질.
  15. 불포화 지방산을 제조함에 있어서, 제13항 또는 제14항에 청구된 단백질의 용도.
  16. 포화 지방산, 불포화 지방산, 또는 포화 지방산과 불포화 지방산 둘 다를 갖는 트리글리세리드를 제2항, 제13항 또는 제14항에 청구된 단백질 중 하나 이상과 인큐베이션시킴으로써, 불포화 지방산의 함량이 증가된 트리글리세리드를 제조하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 트리글리세리드가 환원 동등물의 흡수 또는 방출이 가능한화합물의 존재하에 제조되는 것인 방법.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 지방산이 트리글리세리드로부터 유리되는 것인 방법.
  19. 제9항 또는 제18항에 청구된 방법에 의해 제조한 불포화 지방산.
  20. 제10항, 제16항 또는 제17항에 청구된 방법에 의해 제조된 불포화 지방산의 함량이 증가된 트리글리세리드.
  21. 트랜스제닉 식물을 생성함에 있어서, 제1항에 청구된 핵산 서열 또는 제4항에 청구된 발현 카세트의 용도.
  22. 상동성 스크리닝에 의해 게놈 서열을 단리함에 있어서, 제1항에 청구된 핵산 서열 또는 그의 단편의 용도.
  23. 인간의 식품, 동물의 사료, 화장품 또는 약제를 제조함에 있어서, 제19항에 청구된 불포화 지방산, 또는 제20항에 청구된 불포화 지방산의 함량이 증가된 트리글리세리드의 용도.
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Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19806235A1 (de) * 1998-02-16 1999-09-09 Rasmussen Gmbh Schellenanordnung
EP1322752B2 (en) 2000-09-28 2015-02-11 Bioriginal Food & Science Corp. Fad4, fad5, fad5-2, and fad6, fatty acid desaturase family members and uses thereof
AU2002309482B2 (en) * 2001-01-25 2007-08-30 Abbott Laboratories Desaturase genes and uses thereof
US6635451B2 (en) 2001-01-25 2003-10-21 Abbott Laboratories Desaturase genes and uses thereof
AU2003252954A1 (en) * 2003-07-31 2005-02-25 The University Of York Fatty acid biosynthesis 4
MY140210A (en) 2003-12-22 2009-11-30 Suntory Holdings Ltd Marchantiales-derived unsaturated fatty acid synthetase genes and use of the same
ES2421440T3 (es) * 2004-02-27 2013-09-02 Basf Plant Science Gmbh Método para preparar ácidos grasos poliinsaturados en plantas transgénicas
CA2563875C (en) 2004-04-22 2015-06-30 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Synthesis of long-chain polyunsaturated fatty acids by recombinant cells
ES2529572T3 (es) 2004-04-22 2015-02-23 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Síntesis de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga por células recombinantes
CN101321872B (zh) * 2005-05-23 2012-09-05 阿凯迪亚生物科学公司 高γ-亚麻酸红花
CN101578363A (zh) 2006-08-29 2009-11-11 联邦科学技术研究组织 脂肪酸的合成
EP2318533A2 (en) 2008-07-01 2011-05-11 BASF Plant Science GmbH Promoters from brassica napus for seed specific gene expression
US8809559B2 (en) 2008-11-18 2014-08-19 Commonwelath Scientific And Industrial Research Organisation Enzymes and methods for producing omega-3 fatty acids
CA2760326A1 (en) 2009-05-13 2010-11-18 Basf Plant Science Company Gmbh Acyltransferases and uses thereof in fatty acid production
DE112010002353T5 (de) 2009-06-08 2012-08-09 Basf Plant Science Company Gmbh Neue fettsäure-elongations-komponenten und anwenduingen davon
DE112010002967T5 (de) 2009-07-17 2012-10-11 Basf Plant Science Company Gmbh Neue Fettsäuredesaturasen und -elongasen und Anwendungen davon
CN102597245A (zh) 2009-08-31 2012-07-18 巴斯夫植物科学有限公司 用于在植物中增强种子特异性基因表达而促进增强的多不饱和脂肪酸合成的调节性核酸分子
US9347049B2 (en) 2009-11-24 2016-05-24 Basf Plant Science Company Gmbh Fatty acid elongase and uses thereof
EP2504427B1 (en) 2009-11-24 2018-06-27 BASF Plant Science Company GmbH Novel fatty acid desaturase and uses thereof
CA2787832C (en) 2010-02-01 2016-01-05 Suntory Holdings Limited Polynucleotide encoding acyl-coa synthetase homolog and use thereof
NO2585603T3 (ko) 2010-06-25 2018-05-19
WO2012052468A2 (en) 2010-10-21 2012-04-26 Basf Plant Science Company Gmbh Novel fatty acid desaturases, elongases, elongation components and uses therof
PL2861059T3 (pl) 2012-06-15 2017-10-31 Commw Scient Ind Res Org Wytwarzanie długołańcuchowych wielonienasyconych kwasów tłuszczowych w komórkach roślinnych
WO2014020533A2 (en) 2012-08-03 2014-02-06 Basf Plant Science Company Gmbh Novel enzymes, enzyme components and uses thereof
KR102535223B1 (ko) 2013-12-18 2023-05-30 커먼웰쓰 사이언티픽 앤 인더스트리알 리서치 오거니제이션 장쇄 다중불포화 지방산을 포함하는 지질
CN105219789B (zh) 2014-06-27 2023-04-07 联邦科学技术研究组织 包含二十二碳五烯酸的提取的植物脂质

Family Cites Families (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5504200A (en) 1983-04-15 1996-04-02 Mycogen Plant Science, Inc. Plant gene expression
US5420034A (en) 1986-07-31 1995-05-30 Calgene, Inc. Seed-specific transcriptional regulation
DK162399C (da) 1986-01-28 1992-03-23 Danisco Fremgangsmaade til ekspression af gener i baelgplanteceller, dna-fragment, rekombineret dna-fragment samt plasmid til brug ved udoevelsen af fremgangsmaaden
US4987071A (en) 1986-12-03 1991-01-22 University Patents, Inc. RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods
US5116742A (en) 1986-12-03 1992-05-26 University Patents, Inc. RNA ribozyme restriction endoribonucleases and methods
NZ228320A (en) 1988-03-29 1991-06-25 Du Pont Nucleic acid promoter fragments of the promoter region homologous to the em gene of wheat, dna constructs therefrom and plants thereof
HU218717B (hu) 1989-03-17 2000-11-28 E. I. Du Pont De Nemours And Co. Nukleinsav-termelést fokozó növényi eredetű génfragmentek és eljárás előállításukra
ATE241007T1 (de) 1990-03-16 2003-06-15 Calgene Llc Dnas, die für pflanzliche desaturasen kodieren und deren anwendungen
ATE205530T1 (de) 1990-03-16 2001-09-15 Calgene Llc Neue sequenzen vorzugsweise exprimiert während der frühen keimentwicklung und darauf bezogene methoden
US5614393A (en) 1991-10-10 1997-03-25 Rhone-Poulenc Agrochimie Production of γ-linolenic acid by a Δ6-desaturase
PH31293A (en) 1991-10-10 1998-07-06 Rhone Poulenc Agrochimie Production of y-linolenic acid by a delta6-desaturage.
AU675923B2 (en) 1991-12-04 1997-02-27 E.I. Du Pont De Nemours And Company Fatty acid desaturase genes from plants
CA2084348A1 (en) 1991-12-31 1993-07-01 David F. Hildebrand Fatty acid alteration by a d9 desaturase in transgenic plant tissue
EP0637339B1 (en) 1992-04-13 2001-10-31 Syngenta Limited Dna constructs and plants incorporating them
WO1994011516A1 (en) 1992-11-17 1994-05-26 E.I. Du Pont De Nemours And Company Genes for microsomal delta-12 fatty acid desaturases and related enzymes from plants
US7205457B1 (en) 1993-02-05 2007-04-17 Monsanto Technology Llc Altered linolenic and linoleic acid content in plants
GB9324707D0 (en) 1993-12-02 1994-01-19 Olsen Odd Arne Promoter
ES2222462T3 (es) 1993-12-28 2005-02-01 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Gen que codifica acido graso-desaturasa, vector que contiene dicho gen, planta que contiene dicho gen transferido a ella y procedimiento para crear dicha planta.
WO1995019943A1 (en) 1994-01-21 1995-07-27 Minnesota Mining And Manufacturing Company Starved matrix composite
GB9403512D0 (en) 1994-02-24 1994-04-13 Olsen Odd Arne Promoter
US6310194B1 (en) 1994-09-26 2001-10-30 Carnegie Institution Of Washington Plant fatty acid hydroxylases
US5654402A (en) 1994-10-26 1997-08-05 Michigan State University Methods and compositions relating to plant Δ6 palmitoyl-acyl carrier protein desaturase
ATE520302T1 (de) 1995-12-14 2011-09-15 Cargill Inc Pflanzen mit mutierten sequenzen, welche einen veränderten fettsäuregehalt vermitteln
EP0794250A1 (en) 1996-03-04 1997-09-10 Soremartec S.A. Isolation and sequencing of the hazel FAd2-N gene
SE9601236D0 (sv) 1996-03-29 1996-03-29 Sten Stymne Novel plant enzyme and use thereof
US5977436A (en) 1997-04-09 1999-11-02 Rhone Poulenc Agrochimie Oleosin 5' regulatory region for the modification of plant seed lipid composition
NZ337459A (en) 1997-04-11 2000-07-28 Abbott Lab Nucleic acid construct in plants and dietary supplement
US5968809A (en) 1997-04-11 1999-10-19 Abbot Laboratories Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids
WO1999016890A2 (en) 1997-09-30 1999-04-08 The Regents Of The University Of California Production of proteins in plant seeds
GB9724783D0 (en) 1997-11-24 1998-01-21 Inst Arable Crops Research Novel polypeptides

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CA2376383C (en) 2009-11-17

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