DE112010002967T5

DE112010002967T5 - Neue Fettsäuredesaturasen und -elongasen und Anwendungen davon

Info

Publication number: DE112010002967T5
Application number: DE112010002967T
Authority: DE
Inventors: Jörg Bauer; Jonathan A. Napier; Olga Sayanova
Original assignee: BASF Plant Science Co GmbH
Current assignee: BASF Plant Science Co GmbH
Priority date: 2009-07-17
Filing date: 2010-07-15
Publication date: 2012-10-11
Also published as: CA3037072A1; CA3161358A1; EP2454278A1; US11913007B2; EP2454278B1; AU2010272536A1; US20170067070A1; AU2010272536B2; WO2011006948A1; US20190323022A1; CA2768082A1; AU2018282290A1; AU2016273845A1; ZA201201063B; US20220170036A1; US9493520B2; AU2021204777A1; CA2768082C; CA3037072C; US10351870B2

Abstract

Die Erfindung stellt isolierte Nukleinsäuremoleküle bereit, die für neue Fettsäuredesaturasen und -elongasen aus dem Organismus Emiliana huxleyi codieren. Die Erfindung stellt außerdem rekombinante Expressionsvektoren bereit, die neue Desaturase- oder Elongasenukleinsäuremoleküle enthalten, Wirtszellen, in die die Expressionsvektoren eingeführt wurden, und Verfahren zur großtechnischen Produktion von langkettigen, mehrfach ungesättigten Fettsäuren (Lang Chain Polyunsaturated Fatty Acids, LCPUFAs), z. B. Arachidonsäure (ARA), Eicosapentaensäure (EPA) oder Docosahexaensäure (DHA).

Description

Die Erfindung betrifft im Prinzip das Gebiet der rekombinanten Herstellung von Fettsäuren. Sie stellt Nukleinsäuremoleküle bereit, die für neue Fettsäuredesaturasen und -elongasen codieren. Die Erfindung stellt außerdem rekombinante Expressionsvektoren bereit, die Desaturase- und Elongasenukleinsäuremoleküle enthalten, Wirtszellen, in die die Expressionsvektoren eingeführt wurden, und Verfahren zur großtechnischen Produktion von langkettigen, mehrfach ungesättigten Fettsäuren (Long Chain Polyunsaturated Fatty Acids, LCPUFAs), z. B. Arachidonsäure (ARA), Eicosapentaensäure (EPA) oder Docosahexaensäure (DHA).
Fettsäuren sind Carbonsäuren mit langkettigen Kohlenwasserstoff-Seitengruppen, die bei vielen biologischen Prozessen eine grundlegende Rolle spielen. Fettsäuren finden sich in der Natur nur selten in freier Form, sondern kommen vielmehr in veresterter Form als Hauptkomponente von Lipiden vor. Als solche sind Lipide/Fettsäuren Energiequellen (z. B. b-Oxidation). Darüber hinaus sind Lipide/Fettsäuren ein wesentlicher Teil von Zellmembranen und daher unerlässlich für die Verarbeitung biologischer oder biochemischer Informationen.
Fettsäuren lassen sich in zwei Gruppen einteilen: aus Kohlenstoff-Einfachbindungen gebildete gesättigte Fettsäuren und die ungesättigten Fettsäuren, die eine oder mehrere Kohlenstoff-Doppelbindungen in cis-Konfiguration enthalten. Ungesättigte Fettsäuren werden von terminalen Desaturasen gebildet, die zur Klasse der Nichthäm-Eisenenzyme gehören. Diese Enzyme sind jeweils Teil eines Elektronentransportsystems, das zwei weitere Proteine enthält, nämlich Cytochrom b₅ und NADH-Cytochrom-b₅-Reduktase. Solche Enzyme katalysieren speziell die Bildung von Doppelbindungen zwischen den Kohlenstoffatomen eines Fettsäuremoleküls, zum Beispiel, indem sie die sauerstoffabhängige Dehydrierung von Fettsäuren katalysieren (Sperling et al., 2003). Menschen und andere Säugetiere verfügen über ein begrenztes Spektrum an Desaturasen, die für die Bildung bestimmter Doppelbindungen in ungesättigten Fettsäuren erforderlich sind und haben somit eine begrenzte Kapazität, essentielle Fettsäuren, z. B. langkettige, mehrfach ungesättigte Fettsäuren (LCPUFAs) zu synthetisieren. Menschen müssen daher einige Fettsäuren mit ihrer Nahrung aufnehmen. Zu diesen essentiellen Fettsäuren zählen zum Beispiel Linolsäure (C18:2) und Linolensäure (C18:3). Im Gegensatz dazu sind Insekten, Mikroorganismen und Pflanzen dazu in der Lage, eine viel größere Anzahl an ungesättigten Fettsäuren und Derivaten davon zu synthetisieren. Die Biosynthese von Fettsäuren ist sogar eine der Hauptaktivitäten von Pflanzern und Mikroorganismen.
Langkettige, mehrfach ungesättigte Fettsäuren (LCPUFAs) wie Docosahexaensäure (DHA, 22:6 (4, 7, 10, 13, 16, 19)) sind essentielle Komponenten von Zellmembranen verschiedener Gewebe und Organellen in Säugetieren (Nerven-, Netzhaut-, Gehirn- und Immunzellen). So sind zum Beispiel über 30% der Fettsäuren im Gehirnphospholipid 22:6 (n-3) und 20:4 (n-6) (Crawford, M.A., et al., (1997) Am. J. Clin. Nutr. 66: 1032S–1041S). In der Netzhaut macht DHA mehr als 60% der Gesamtfettsäuren im äußeren Stäbchensegment, dem lichtempfindlichen Teil der Photorezeptorzelle, aus (Giusto, N.M., et al. (2000) Prog. Lipid Res. 39: 315–391). Klinische Studien haben gezeigt, dass DHA essentiell für das Wachstum und die Entwicklung des Gehirns von Kleinkindern und für die Erhaltung einer normalen Gehirnfunktion bei Erwachsenen ist (Martinetz, M. (1992) J. Pediatr. 120: S129–S138). DHA hat außerdem einen beträchtlichen Einfluss auf die Photorezeptorfunktion, die am Signalübertragungsprozess, der Rhodopsinaktivierung und der Entwicklung von Stäbchen und Zapfen beteiligt ist (Giusto, N.M., et al. (2000) Prog. Lipid Res. 39: 315–391). Darüber hinaus wurden auch bei Krankheiten wie Hypertonie, Arthritis, Atherosklerose, Depression, Thrombose und Krebs einige positive Wirkungen von DHA gefunden (Horrocks, L.A. und Yeo, Y.K. (1999) Pharmacol. Res. 40: 211–215). Eine angemessene Zufuhr der Fettsäure mit der Nahrung ist somit für die menschliche Gesundheit wichtig. Da solche Fettsäuren von Kleinkindern, jungen Kindern und älteren Menschen nicht effizient synthetisiert werden können, ist eine angemessene Zufuhr dieser Fettsäuren mit der Nahrung somit besonders wichtig (Spector, A.A. (1999) Lipids 34: S1–S3).
Gegenwärtig sind die Hauptquellen von DHA Öle aus Fisch und Algen. Fischöl ist eine wichtige und traditionelle Quelle für diese Fettsäure, bis zum Verkauf ist es jedoch meistens oxidiert. Darüber hinaus unterliegt die Versorgung mit Fischöl großen Schwankungen, insbesondere angesichts schrumpfender Fischpopulationen. Außerdem sind die Algenquellen des Öls aufgrund der niedrigen Ausbeute und der hohen Extraktionskosten teuer.
EPA und ARA sind beide essentielle Δ5-Fettsäuren. Sie bilden eine einzigartige Klasse von Nahrungs- und Futtermittelbestandteilen für Menschen und Tiere. EPA gehöhrt zur n-3-Reihe mit fünf Doppelbindungen in der Acylkette. EPA findet sich in aus dem Meer stammenden Nahrungsmitteln und kommt in großen Mengen in öligem Fisch aus dem Nordatlantik vor. ARA gehört zur n-6-Reihe mit vier Doppelbindungen. Die fehlende Doppelbindung in der ω-3-Position verleiht ARA andere Eigenschaften als die, die man bei EPA findet. Die aus ARA produzierten Eicosanoide haben starke entzündungsfördernde und thrombozytenaggregierende Eigenschaften, während die, die sich von EPA ableiten, entzündungshemmende und die Thrombozytenaggregation hemmende Eigenschaften aufweisen. ARA lässt sich aus einigen Nahrungsmitteln wie Fleisch, Fisch und Eiern erhalten, die Konzentration ist jedoch gering.
Gamma-Linolensäure (GLA) ist eine andere essentielle Fettsäure, die in Säugetieren zu finden ist. GLA ist das metabolische Zwischenprodukt für sehr langkettige n-6-Fettsäuren und für verschiedene aktive Moleküle. Bei Säugetieren ist die Rate der Bildung langkettiger, mehrfach ungesättigter Fettsäuren durch Δ6-Desaturation begrenzt. Es wurde gezeigt, dass viele physiologische und pathologische Leiden wie das Altern, Stress, Diabetes, Ekzeme und einige Infektionen den Δ6-Desaturierungsschritt unterdrücken. Darüber hinaus wird GLA durch die mit bestimmten Erkrankungen wie Krebs oder Entzündungen assoziierte Oxidation und schnelle Zellteilung leicht katabolisiert. Durch eine Ergänzung der Nahrung mit GLA lässt sich das Risiko dieser Erkrankungen also vermindern. Klinische Studien haben gezeigt, dass sich durch eine Ergänzung der Nahrung mit GLA pathologische Leiden wie atopisches Ekzem, prämenstruelles Syndrom, Diabetes, Hypercholesterinämie und entzündliche Erkrankungen sowie Herz-Kreislauf-Erkrankungen wirksam behandeln lassen.
Für DHA oder EPA/DHA-Mischungen wurde eine große Anzahl an vorteilhaften gesundheitlichen Wirkungen nachgewiesen. DHA ist eine sehr langkettige n-3-Fettsäure mit sechs Doppelbindungen.
Wenngleich die Biotechnologie eine attraktive Route für die Herstellung von besonderen Fettsäuren bietet, können die gegenwärtig zur Verfügung stehenden Technologien keine effizienten Mittel für die Produktion ungesättigter Fettsäuren im großtechnischen Maßstab bereitstellen. Dementsprechend besteht ein Bedarf an einem verbesserten und effizienten Verfahren zur Herstellung ungesättigter Fettsäuren wie DHA, EPA und ARA.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit ein Polynukleotid, welches eine Nukleinsäuresequenz ausgewählt aus der folgenden Gruppe umfasst:

a) eine Nukleinsäuresequenz mit einer in SEQ ID NR: 1, 3, 5, 7 oder 9 gezeigten Nukleotidsequenz;
b) eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid mit einer wie in SEQ ID NR: 2, 4, 6, 8 oder 10 gezeigten Aminosäuresequenz codiert;
c) eine Nukleinsäuresequenz mit wenigstens 70% Identität zur Nukleinsäuresequenz von a) oder b), wobei die Nukleinsäuresequenz für ein Polypeptid mit Desaturase- oder Elongaseaktivität codiert;
d) eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid mit Desaturase- oder Elongaseaktivität codiert und eine Aminosäuresequenz aufweist, die zu mindestens 82% mit einer der Aminosäuresequenzen von a) bis c) identisch ist; und
e) eine Nukleinsäuresequenz, die dazu in der Lage ist, unter stringenten Bedingungen mit einer der Sequenzen von a) bis d) zu hybridisieren, wobei diese Nukleinsäuresequenz für ein Polypeptid mit Desaturase- oder Elongaseaktivität codiert.

Der Ausdruck „Polynukleotid” bezieht sich, so wie er gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wird, auf ein Polynukleotid, welches eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die für ein Polypeptid mit Desaturase- oder Elongaseaktivität codiert. Vorzugsweise sollte das durch das Polynukleotid der vorliegenden Erfindung codierte Polypeptid mit Desaturase- oder Elongaseaktivität bei der Expression in einer Pflanze dazu in der Lage sein, die Menge an PUFA und insbesondere LCPUFA z. B. in Samenölen oder der gesamten Pflanze oder Teilen davon zu erhöhen. Eine solche Erhöhung ist vorzugsweise im Vergleich zu einer LCPUFA produzierenden transgenen Kontrollpflanze, die den dem gegenwärtigen Stand der Technik entsprechenden, für die LCPUFA-Synthese erforderlichen Satz an Desaturasen und Elongasen, jedoch nicht das Polynukleotid der vorliegenden Erfindung, exprimiert, statistisch signifikant. Ob eine Zunahme signifikant ist, lässt sich durch im Stand der Technik gut bekannte statistische Tests einschließlich z. B. Students t-Test bestimmen. Besonders bevorzugt ist die Zunahme eine Zunahme der Menge an LCPUFA enthaltenden Triglyceriden von mindestens 5%, mindestens 10%, mindestens 15%, mindestens 20% oder mindestens 30% im Vergleich zu der Kontrolle. Vorzugsweise handelt es sich bei der oben angesprochenen LCPUFA um eine mehrfach ungesättigte Fettsäure mit einem C-20- oder C-22-Fettsäurekörper, besonders bevorzugt um ARA, EPA oder DHA. Geeignete Assays zum Messen der oben erwähnten Aktivitäten sind in den anhängenden Beispielen beschrieben.
Der Ausdruck „Desaturase” oder ”Elongase” bezieht sich, so wie er hier verwendet wird, auf die Aktivität einer Desaturase, die eine Doppelbindung in die Kohlenstoffkette einer Fettsäure, vorzugsweise in Fettsäuren mit 18, 20 oder 22 Kohlenstoffmolekülen, einführt, bzw. auf die Aktivität einer Elongase, die zwei Kohlenstoffmoleküle in die Kohlenstoffkette einer Fettsäure, vorzugsweise in Fettsäuren mit 18, 20 oder 22 Kohlenstoffmolekülen, einführt.
Besonders bevorzugt zeigen Polynukleotide mit einer wie in SEQ ID NR: 1, 3, 5, 7 oder 9 gezeigten Nukleinsäuresequenz, die für Polypeptide mit wie in SEQ ID NR: 2, 4, 6, 8 oder 10 gezeigten Aminosäuresequenzen oder Varianten davon codieren, vorzugsweise, Desaturase- oder Elongaseaktivität.
Für ein wie oben angegebenes Polypeptid mit Desaturase- oder Elongaseaktivität codierende Polynukleotide werden gemäß der vorliegenden Erfindung vorzugsweise aus Emiliana huxleyi erhalten. Es können jedoch auch Orthologe, Paraloge oder andere Homologe aus anderen Spezies identifiziert werden. Sie werden bevorzugt aus Pflanzen wie Algen, zum Beispiel Isochrysis, Mantoniella, Ostreococcus oder Crypthecodinium, Algen/Diatomeen wie Phaeodactylum, Thalassiosira oder Thraustochytrium, Moosen wie Physcomitrella oder Ceratodon, oder höheren Pflanzen wie den Primulaceae wie Aleuritia, Calendula stellata, Osteospermum spinescens oder Osteospermum hyoseroides, Mikroorganismen wie Pilzen wie Aspergillus, Phytophthora, Entomophthora, Mucor oder Mortierella, Bakterien wie Shewanella, Hefen oder Tieren erhalten. Bevorzugte Tiere sind Nematoden wie Caenorhabditis, Insekten oder Wirbeltiere. Bei den Wirbeltieren können die Nukleinsäuremoleküle vorzugsweise aus Euteleostomi, Actinopterygii; Neopterygii; Teleostei; Euteleostei, Protacanthopterygii, Salmoniformes; Salmonidae oder Oncorhynchus, besonders bevorzugt aus der Ordnung der Salmoniformes, ganz besonders bevorzugt der Familie der Salmonidae wie der Gattung Salmo, zum Beispiel aus den Gattungen und Arten Oncorbynchus mykiss, Trutta trutta oder Salmo trutta fario stammen. Außerdem lassen sich die Nukleinsäuremoleküle aus den Diatomeen wie der Gattung Thallasiosira oder Phaeodactylum erhalten.
Der Ausdruck „Polynukleotid” umfasst gemäß der vorliegenden Erfindung somit weiterhin Varianten der oben erwähnten speziellen Polynukleotide, die Orthologe, Paraloge oder andere Homologe des Polynukleotids der vorliegenden Erfindung darstellen. Außerdem schließen Varianten des Polynukleotids der vorliegenden Erfindung auch künstlich erzeugte Muteine ein. Diese Muteine schließen z. B. Enzyme ein, die durch Mutagenesetechniken erzeugt wurden und die eine verbesserte oder veränderte Substratspezifität zeigen, oder codonoptimierte Polynukleotide. Die Polynukleotidvarianten umfassen vorzugsweise eine Nukleinsäuresequenz, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sich die Sequenz von den oben erwähnten spezifischen, in einer der SEQ ID NR: 1, 3, 5, 7 oder 9 gezeigten Nukleinsäuresequenzen oder von einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid mit einer wie in einer der SEQ ID NR: 2, 4, 6, 8 oder 10 gezeigten Aminosäuresequenz codiert, durch mindestens eine Nukleotidsubstitution, -addition und/oder -deletion ableiten lässt, wobei die Nukleinsäuresequenzvariante immer noch für ein Polypeptid mit einer wie oben ausgeführten Desaturase- oder Elongaseaktivität codiert. Zu den Varianten zählen auch Polynukleotide, die eine Nukleinsäuresequenz umfassen, die dazu in der Lage ist, mit den oben erwähnten spezifischen Nukleinsäuresequenzen zu hybridisieren, vorzugsweise unter stringenten Hybridisierungsbedingungen. Diese stringenten Bedingungen sind dem Fachmann bekannt und finden sich in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1–6.3.6. Ein bevorzugtes Beispiel für stringente Hybridisierungsbedingungen sind Hybridisierungsbedingungen in 6 × Natriumchlorid/Natriumcitrat (= SSC) bei ungefähr 45°C, gefolgt von einem oder mehreren Waschschritten in 0,2 × SSC, 0,1% SDS bei 50 bis 65°C. Dem Fachmann ist bekannt, dass diese Hybridisierungsbedingungen sich je nach Typ der Nukleinsäure und, zum Beispiel wenn organische Lösungsmittel vorhanden sind, hinsichtlich der Temperatur und der Konzentration des Puffers unterscheiden. Bei „Standardhybridisierungsbedingungen” zum Beispiel variiert die Temperatur je nach Nukleinsäuretyp zwischen 42°C und 58°C in wässrigem Puffer mit einer Konzentration von 0,1 bis 5 × SSC (pH 7,2). Ist im oben erwähnten Puffer ein organisches Lösungsmittel vorhanden, zum Beispiel 50% Formamid, so beträgt die Temperatur unter Standardbedingungen ungefähr 42°C. Die Hybridisierungsbedingungen für DNA:DNA-Hybride sind vorzugsweise 0,1 × SSC und 20°C bis 45°C, vorzugsweise zwischen 30°C und 45°C. Die Hybridisierungsbedingungen für DNA:RNA-Hybride sind vorzugsweise 0,1 × SSC und 30°C bis 55°C, vorzugsweise zwischen 45°C und 55°C. Die oben erwähnten Hybridisierungstemperaturen werden zum Beispiel für eine Nukleinsäure mit einer Länge von ungefähr 100 Bp (= Basenpaaren) und einem G + C-Gehalt von 50% in Abwesenheit von Formamid bestimmt. Dem Fachmann ist bekannt, wie man die erforderlichen Hybridisierungsbedingungen unter Bezug auf Lehrbücher wie das oben erwähnte Lehrbuch oder die folgenden Lehrbücher bestimmt: Sambrook et al., „Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989; Harnes und Higgins (Hrsg.) 1985, „Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach", IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (Hrsg.) 1991, „Essential Molecular Biology: A Practical Approach", IRL Press at Oxford University Press, Oxford. Alternativ dazu lassen sich Polynukleotidvarianten durch auf PCR basierende Techniken wie die auf gemischten Oligonukleotidprimern basierende Amplifikation von DNA erhalten, d. h. unter Einsatz von degenerierten Primern gegen konservierte Domänen der Polypeptide der vorliegenden Erfindung. Konservierte Domänen des Polypeptids der vorliegenden Erfindung lassen sich durch einen Sequenzvergleich der Nukleinsäuresequenzen der Polynukleotide oder der Aminosäuresequenzen der Polypeptide der vorliegenden Erfindung erhalten. Als PCR-Primer geeignete Oligonukleotide sowie geeignete PCR-Bedingungen sind in den angefügten Beispielen beschrieben. Als Matrize kann man DNA oder cDNA aus Bakterien, Pilzen, Pflanzen oder Tieren verwenden. Weiterhin schließen Varianten Polynukleotide ein, die Nukleinsäuresequenzen umfassen, die mindestens 50%, mindestens 55%, mindestens 60%, mindestens 65%, mindestens 70%, mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Identität mit den in einer der SEQ ID NR: 1, 3, 5, 7 oder 9 gezeigten Nukleinsäuresequenzen aufweisen; vorzugsweise ist bei den codierten Polypeptiden eine wie oben ausgeführte Desaturase- oder Elongaseaktivität erhalten geblieben. Außerdem eingeschlossen sind Polynukleotide, die Nukleinsäuresequenzen umfassen, die für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz mit mindestens 50%, mindestens 55%, mindestens 60%, mindestens 65%, mindestens 70%, mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Identität mit den in einer der SEQ ID NR: 2, 4, 6, 8 oder 10 gezeigten Aminosäuresequenzen codieren, wobei bei dem Polypeptid vorzugsweise die wie oben ausgeführte Desaturase- oder Elongaseaktivität erhalten geblieben ist. Die Werte für die prozentuale Identität werden vorzugsweise über die gesamte Aminosäure- oder Nukleinsäuresequenzregion berechnet. Dem Fachman stehen eine Reihe von auf verschiedenen Algorithmen basierenden Programmen zum Vergleich verschiedener Sequenzen zur Verfügung. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird die prozentuale Identität zwischen zwei Aminosäuresequenzen unter Anwendung des Needleman-und-Wunsch-Algorithmus (Needleman 1970, J. Mol. Biol. (48): 444–453), die in das Needle-Programm im EMBOSS-Softwarepaket (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice, P., Longden, I. und Bleasby, A, Trends in Genetics 16(6), 276–277, 2000) integriert wurde, bestimmt, wobei man entweder eine BLOSUM45- oder PAM250-Bewertungsmatrix für entfernt miteinander verwandte Proteine oder entweder eine BLOSUM62- oder PAM160-Bewertungsmatrix für enger miteinander verwandte Proteine und eine Gap Opening Penalty von 16, 14, 12, 10, 8, 6 oder 4 und eine Gap Extension Penalty von 0,5, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 verwendet. Anleitungen für die lokale Installation des EMBOSS-Pakets sowie Links zu WEB-Services finden sich bei http://emboss.sourceforge.net. Ein bevorzugtes, nicht einschränkendes Beispiel für Parameter, die für das Aligning zweier Aminosäuresequenzen mit dem Needle-Programm verwendet werden können, sind die Standardparameter, die die EBLOSUM62-Bewertungsmatrix, eine Gap Opening Penalty von 10 und eine Gap Extension Penalty von 0,5 einschließen. Bei noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird die prozentuale Identität zwischen zwei Nukleotidsequenzen mit dem Needle-Programm im EMBOSS-Softwarepaket (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice, P., Longden, I., und Bleasby, A., Trends in Genetics 16(6), 276–277, 2000), unter Anwendung der EDNAFULL-Bewertungsmatrix und einer Gap Opening Penalty von 16, 14, 12, 10, 8, 6 oder 4 und einer Gap Extension Penalty von 0,5, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 bestimmt. Ein bevorzugtes, nicht einschränkendes Beispiel für Parameter, die im Zusammenhang mit dem Aligning zweier Aminosäuresequenzen mit dem Needle-Programm verwendet werden sollen, sind die Standardparameter, die die EDNAFULL-Bewertungsmatrix, eine Gap Opening Penalty von 10 und eine Gap Extension Penalty von 0,5 einschließen. Die Nukleinsäure- und Proteinsequenzen der vorliegenden Erfindung können weiterhin als „Abfragesequenzen” beim Durchführen einer Suche gegen öffentlich zugängliche Datenbanken zum Einsatz kommen, zum Beispiel um andere Familienmitglieder oder verwandte Sequenzen zu identifizieren. Solche Suchen lassen sich mit der BLAST-Reihe von Programmen (Version 2.2) von Altschul et al. (Altschul 1990, J. Mol. Biol. 215: 403–10) durchführen. BLAST unter Verwendung von erfindungsgemäßen Acyltransferase-Nukleinsäuresequenzen als Abfragesequenz lässt sich mit dem BLASTn-, BLASTx- oder dem tBLASTx-Programm mit den Standardparametern durchführen, wodurch man entweder Nukleotidsequenzen (BLASTn, tBLASTx) oder Aminosäuresequenzen (BLASTx) homolog zu den erfindungsgemäßen Acyltransferasesequenzen erhalten kann. BLAST mit erfindungsgemäßen Acyltransferase-Proteinsequenzen als Abfragesequenz lässt sich mit dem BLASTp- oder dem tBLASTn-Programm mit den Standardparametern durchführen, wodurch man entweder Aminosäuresequenzen (BLASTp) oder Nukleinsäuresequenzen (tBLASTn) homolog zu den erfindungsgemäßen Acyltransferasesequenzen erhalten kann.

Zum Erhalt von gapped Alignments für Vergleichszwecke kann ein Gapped BLAST mit den Standardparametern wie in Altschul et al. beschrieben (Altschul 1997, Nucleic Acids Res. 25(17): 3389–3402) angewendet werden. Tabelle 1: Zusammenhang von Abfragesequenztypen und Treffersequenzen für verschiedene BLAST-Programme

Abfrage-Eingabesequenz	Umgewandelte Abfrage	Algorithmus	Ungewandelter Treffer	Eigentliche Datenbank
DNA		BLASTp		DNA
PRT		BLASTp		PRT
DNA	PRT	BLASTx		PRT
PRT		tBLASTn	PRT	DNA
DNA	PRT	tBLASTx	PRT	DNA

Zu den Polynukleotiden der vorliegenden Erfindung zählen auch Polynukleotide, die ein Fragment einer der oben erwähnten Nukleinsäuresequenzen enthalten. Das Fragment soll für ein Polypeptid codieren, welches immer noch eine wie oben angegebene Desaturase- und Elongaseaktivität aufweist. Dementsprechend kann das Polypeptid die Domänen des Polypeptids der vorliegenden Erfindung, die diese biologische Aktivität verleihen, umfassen oder daraus bestehen. Ein Fragment umfasst, so wie der Ausdruck hier gemeint ist, vorzugsweise mindestens 50, mindestens 100, mindestens 250 oder mindestens 500 aufeinanderfolgende Nukleotide einer der oben erwähnten Nukleinsäuresequenzen oder codiert für eine Aminosäuresequenz, die mindestens 20, mindestens 30, mindestens 50, mindestens 80, mindestens 100 oder mindestens 150 aufeinanderfolgende Aminosäuren einer der oben erwähnten Aminosäuresequenzen umfasst.
Die oben angesprochenen Polynukleotidvarianten oder Fragmente davon codieren vorzugsweise für Polypeptide, bei denen die Desaturase- oder Elongaseaktivität in signifikantem Maße, vorzugsweise mindestens 10%, mindestens 20%, mindestens 30%, mindestens 40%, mindestens 50%, mindestens 60%, mindestens 70%, mindestens 80% oder mindestens 90% der von einem der in SEQ ID NR: 2, 4, 6, 8 oder 10 aufgeführten Polypeptide gezeigten Desaturase- und Elongaseaktivität, erhalten geblieben ist. Die Aktivität lässt sich wie in einem der angefügten Beispiele beschrieben testen.
Die Polynukleotide der vorliegenden Erfindung bestehen entweder im Wesentlichen aus den oben erwähnten Nukleinsäuresequenzen oder umfassen die oben erwähnten Nukleinsäuresequenzen. Sie können also auch weitere Nukleinsäuresequenzen enthalten. Das Polynukleotid der vorliegenden Erfindung kann somit zusätzlich zu einem offenen Leserahmen weitere nicht translatierte Sequenzen am 3'- und am 5'-Terminus der codierenden Genregion enthalten: mindestens 500, vorzugsweise 200, besonders bevorzugt 100 Nukleotide der Sequenz stromaufwärts des 5'-Terminus der codierenden Region und mindestens 100, vorzugsweise 50, besonders bevorzugt 20 Nukleotide der Sequenz stromabwärts des 3'-Terminus der codierenden Genregion. Weiterhin können die Polynukleotide der vorliegenden Erfindung für Fusionsproteine codieren, wobei es sich bei einem der Partner des Fusionsproteins um ein Polypeptid handelt, das durch eine der oben angeführten Nukleinsäuresequenzen codiert wird. Solche Fusionsproteine können als weiteren Teil andere Enzyme des Fettsäure- oder PUFA-Biosynthesepfades, Polypeptide zum Verfolgen der Expression (z. B. grün, gelb, blau oder rot fluoreszierende Proteins, alkalische Phosphatase und dergleichen) oder sogenannte „Tags”, die als nachweisbare Marker oder als Hilfe für Aufreinigungszwecke dienen können, enthalten. Tags für die verschiedenen Zwecke sind im Stand der Technik gut bekannt und umfassen FLAG-Tags, 6-Histidin-Tags, MYC-Tags und dergleichen.
Das Polynukleotid der vorliegenden Erfindung wird vorzugsweise entweder als isoliertes Polynukleotid (d. h. aufgereinigt oder zumindest aus seinem natürlichen Umfeld wie seinem natürlichen Genlokus isoliert) oder in genetisch modifizierter oder exogen (d. h. künstlich) manipulierter Form bereitgestellt. Ein isoliertes Polynukleotid kann zum Beispiel weniger als ungefähr 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb oder 0,1 kb Nukleotidsequenzen enthalten, die normalerweise das Nukleinsäuremolekül in der genomischen DNA der Zelle, aus der die Nukleinsäure gewonnen wurde, flankieren. Das Polynukleotid wird vorzugsweise in Form des doppel- oder einzelsträngigen Moleküls bereitgestellt. Es versteht sich, dass, wenn in der vorliegenden Erfindung auf eines der oben erwähnten erfindungsgemäßen Polynukleotide Bezug genommen wird, dies auch die komplementären oder revers-komplementären Stränge der spezifischen Sequenzen oder Varianten davon, auf die oben verwiesen wurde, einschließt. Das Polynukleotid schließt Polynukleotide aus DNA, einschließlich cDNA und genomischer DNA, oder RNA ein.
Die vorliegende Erfindung betrifft jedoch auch Polynukleotidvarianten, die sich von den Polynukleotiden der vorliegenden Erfindung ableiten und dazu in der Lage sind, die Transkription oder Translation der Polynukleotide der vorliegenden Erfindung zu stören. Solche Polynukleotidvarianten schließen Anti-Sense-Nukleinsäuren, Ribozyme, siRNA-Moleküle, Morpholinonukleinsäuren (Phosphorodiamidatmorpholino-Oligos), triplehelixbildende Oligonukleotide, hemmende Oligonukleotide oder Mikro-RNA-Moleküle ein, die alle aufgrund des Vorhandenseins komplementärer oder im Wesentlichen komplementärer Sequenzen dazu in der Lage sein sollen, das erfindungsgemäße Polynukleotid spezifisch zu erkennen. Diese Techniken sind dem Fachmann gut bekannt. Geeignete Polynukleotidvarianten der oben erwähnten Art lassen sich auf der Grundlage der Struktur der Polynukleotide der vorliegenden Erfindung leicht entwickeln.
Außerdem umfasst sind chemisch modifizierte Polynukleotide einschließlich natürlich vorkommender modifizierter Polynukleotide wie glykosylierter oder methylierter Polynukleotide oder künstlich modifizierter wie z. B. biotinylierter Polynukleotide.
In den der vorliegenden Erfindung zugrundeliegenden Untersuchungen wurden in vorteilhafter Weise Polynukleotide identifiziert, die für Desaturase und Elongasen aus Emiliana huxleyi codieren. Es wurden insbesondere die Desaturasen Δ4Des(Eh), Δ8Des(Eh) und Δ5Des(Eh) und die Elongasen Δ9Elo(Eh) und Δ5Elo(Eh) aus Emiliana huxleyi identifiziert. Alle diese Desaturasen sind dazu in der Lage, eine Doppelbindung in Fettsäuren einzuführen. So führt zum Beispiel die Expression der Δ8Des(Eh) zur Einführung einer Doppelbindung in der Position acht in eine C20:2n-6-Fettsäure. Die Polynukleotide der vorliegenden Erfindung eignen sich insbesondere für die rekombinante Herstellung von LCPUFAs und insbesondere ARA, EPA und/oder DHA.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des Polynukleotids der vorliegenden Erfindung umfasst das Polynukleotid weiterhin eine Expressionskontrollsequenz, die funktionell mit der Nukleinsäuresequenz verbunden ist.
Der Ausdruck „Expressionskontrollsequenz” bezieht sich, so wie er hier verwendet wird, auf eine Nukleinsäuresequenz, die dazu in der Lage ist, die Transkription einer interessierenden Nukleinsäuresequenz, im vorliegenden Fall die oben angeführten Nukleinsäuresequenzen, zu regulieren, d. h. einzuleiten und zu steuern. Eine solche Sequenz umfasst gewöhnlich einen Promoter oder eine Kombination eines Promotors mit Verstärkersequenzen, oder sie besteht daraus. Die Expression eines Polynukleotids umfasst die Transkription des Nukleinsäuremoleküls, vorzugsweise in eine translatierbare mRNA. Zusätzliche Steuerungselemente können Verstärker für die Transkription sowie die Translation umfassen. Die folgenden Promotoren und Expressionssteuerungssequenzen lassen sich bevorzugt in einem Expressionsvektor gemäß der vorliegenden Erfindung einsetzen. Die cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, lpp-lac-, laclq-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, λ-PR- oder λ-PL-Promotoren kommen vorzugsweise in Gram-negativen Bakterien zum Einsatz. Für Gram-positive Bakterien kann man die Promotoren amy und SPO2 verwenden. Von den Hefe- bzw. Pilzpromotoren verwendet man vorzugsweise ADC1, AOX1r, GAL1, MFα, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH. Für die Expression in tierischen Zellen oder Organismen verwendet man vorzugsweise die Promotoren CMV, SV40, den RSV-Promotor (Rous-Sarcoma-Virus), den CMV-Enhancer, den SV40-Enhancer. Aus Pflanzen die Promotoren CaMV/35S (Franck 1980, Cell 21: 285–294], PRP1 (Ward 1993, Plant. Mol. Biol. 22), SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, nos oder den Ubiquitin- oder Phaseolin-Promotor. In diesem Zusammenhang ebenfalls bevorzugt sind induzierbare Promotoren wie die in EP 0 388 186 A1 (d. h. ein durch Benzylsulfonamid induzierbarer Promotor), Gatz 1992, Plant J. 2: 397–404 (d. h. ein durch Tetracyclin induzierbarer Promotor), EP 0 335 528 A1 (d. h. ein durch Abscisinsäure induzierbarer Promoter) oder WO 93/21334 (d. h. ein durch Ethanol oder Cyclohexenol induzierbarer Promotor) beschriebenen Promotoren. Weitere geeignete Pflanzenpromotoren sind der Promotor der zytosolischen FBPase oder der ST-LSI-Promotor aus Kartoffeln (Stockhaus 1989, EMBO J. 8, 2445), der Phosphoribosylpyrophosphat-Amidotransferasepromoter aus Glycine max (Genbank-Zugangsnr. U87999) oder der in EP 0 249 676 A1 beschriebene knotenspezifische Promotor. Besonders bevorzugt sind Promotoren, die die Expression in Geweben ermöglichen, die an der Biosynthese von Fettsäuren beteiligt sind. Ebenfalls besonders bevorzugt sind samenspezifische Promotoren wie praxisgemäß der USP-Promotor, jedoch auch andere Promotoren wie die LeB4-, DC3-, Phaseolin- oder Napin-Promotoren. Weitere besonders bevorzugte Promotoren sind samenspezifische Promotoren, die sich für monokotyle oder dikotyle Pflanzen verwenden lassen und die in US 5,608,152 (Napin-Promotor aus Raps), WO 98/45461 (Oleosin-Promotor aus Arabidopsis, US 5,504,200 (Phaseolin-Promotor aus Phaseolus vulgaris), WO 91/13980 (Bce4-Promotor aus Brassica), von Baeumlein et al., Plant J., 2, 2, 1992: 233–239 (LeB4-Promotor aus einer Leguminose) beschrieben sind, wobei sich diese Promotoren für die Anwendung in dikotylen Pflanzen eignen. Die folgenden Promotoren eignen sich für monokotyle Pflanzen: der lpt-2- oder lpt-1-Promotor aus Gerste ( WO 95/15389 und WO 95/23230 ), der Hordein-Promotor aus Gerste und andere geeignete Promotoren, die in WO 99/16890 beschrieben sind. Im Prinzip ist es möglich, für das neue Verfahren alte natürlichen Promotoren zusammen mit ihren Steuerungssequenzen wie den oben erwähnten zu verwenden. Ebenso ist die Verwendung synthetischer Promotoren, entweder zusätzlich oder alleine, möglich und vorteilhaft, insbesondere, wenn sie eine samenspezifische Expression vermitteln, wie zum Beispiel in WO 99/16890 beschrieben. Bei einer besonderen Ausführungsform verwendet man samenspezifische Promotoren zur Steigerung der Produktion der gewünschten PUFA oder LCPUFA.
Der Ausdruck „funktionell verbunden” bedeutet, so wie er hier verwendet wird, dass die Expressionssteuerungssequenz und die interessierende Nukleinsäure so miteinander verbunden sind, dass die Expression der interessierenden Nukleinsäure durch die Expressionssteuerungssequenz reguliert werden kann, d. h. die Expressionssteuerungssequenz soll funktionell mit der zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz verbunden sein. Dementsprechend können die Expressionssteuerungssequenz und die zu exprimierende Nukleinsäuresequenz physisch miteinander verbunden werden, z. B. indem man die Expressionssteuerungssequenz am 5'-Ende der zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz einfügt. Alternativ dazu können sich die Expressionssteuerungssequenz und die zu exprimierende Nukleinsäure lediglich in physischer Nähe zueinander befinden, so dass die Expressionssteuerungssequenz dazu in der Lage ist, die Expression mindestens einer interessierenden Nukleinsäuresequenz zu regulieren. Die Expressionssteuerungssequenz und die zu exprimierende Nukleinsäure sind vorzugsweise durch nicht mehr als 500 Bp, 300 Bp, 100 Bp, 80 Bp, 60 Bp, 40 Bp, 20 Bp, 10 Bp oder 6 Bp voneinander getrennt.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Polynukleotids der vorliegenden Erfindung umfasst das Polynukleotid weiterhin eine funktionell mit der Nukleinsäuresequenz verbundene Terminatorsequenz.
Der Ausdruck ”Terminator” bezieht sich, so wie er hier verwendet wird, auf eine Nukleinsäuresequenz, die dazu in der Lage ist, die Transkription zu beenden. Diese Sequenzen bewirken ein Loslösen der Transkriptionsmaschine von der zu transkribierenden Nukleinsäuresequenz. Vorzugsweise sollte der Terminator in Pflanzen und insbesondere in Pflanzensamen wirksam sein. Geeignete Terminatoren sind im Stand der Technik bekannt und schließen vorzugsweise Polyadenylierungssignale wie die SV40-Poly-A-Stelle oder die tk-Poly-A-Stelle oder eines der in Loke et al. (Loke 2005, Plant Physiol 138, S. 1457–1468) angeführten pflanzenspezifischen Signale stromabwärts von der zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz ein.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem einen das Polynukleotid der vorliegenden Erfindung umfassenden Vektor.
Der Ausdruck „Vektor” umfasst vorzugsweise Phagenvektoren, Plasmidvektoren, virale Vektoren sowie künstliche Chromosomen wie künstliche Bakterien- oder Hefe-Chromosomen. Außerdem bezieht sich der Ausdruck auch auf Targetingkonstrukte, welche die zufällige oder ortsgerichtete Integration des Targetingkonstrukts in genomische DNA erlauben. Solche Target-Konstrukte umfassen vorzugsweise DNA von ausreichender Länge für eine entweder homologe oder heterologe Rekombination, wie es nachstehend ausführlich beschrieben ist. Der Vektor, der das Polynukleotid der vorliegenden Erfindung beinhaltet, umfasst vorzugsweise ferner selektierbare Marker zur Vermehrung und/oder zur Selektion in einem Wirt. Der Vektor kann durch verschiedene im Fachgebiet allgemein bekannte Techniken in eine Wirtszelle eingeführt werden. Nachdem er in eine Wirtszelle eingebracht worden Ist, kann der Vektor im Zytoplasma vorliegen oder kann in das Genom eingebaut werden. Im letztgenannten Fall versteht es sich, dass der Vektor ferner Nukleinsäuresequenzen umfassen kann, die eine homologe Rekombination oder heterologe Insertion erlauben. Vektoren können in prokaryontische oder eukaryontische Zellen über herkömmliche Transformations- oder Transfektionstechniken eingebracht werden. Die Ausdrücke „Transformation” und „Transfektion”, Konjugation und Transduktion, wie im vorliegenden Zusammenhang verwendet, sollen eine Vielzahl von im Stand der Technik bekannten Verfahren zum Einbringen fremder Nukleinsäure (zum Beispiel DNA) in eine Wirtszelle, einschließlich Calciumphosphat-, Rubidiumchlorid- oder Calciumchlorid-Copräzipitation, DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion, Lipofektion, natürliche Kompetenz, kohlenstoffbasierten Clustern, chemisch vermitteltem Transfer, Elektroporation oder Teilchenbeschuss, umfassen. Geeignete Verfahren zur Transformation oder Transfektion von Wirtszellen, einschließlich Pflanzenzellen, finden sich in Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA, 1989) und anderen Laborhandbüchern wie Methods in Molecular Biology, 1995, Band 44, Agrobacterium protocols, Hrsg.: Gartland und Davey, Humana Press, Totowa, New Jersey, USA. Alternativ dazu kann man einen Plasmidvektor durch Hitzeschock- oder Elektroporationsverfahren einführen. Handelt es sich bei dem Vektor um einen Virus, kann er mit Hilfe einer passenden Verpackungs-Zelllinie vor Anwendung auf Wirtszellen in vitro verpackt werden.
Vorzugsweise ist der hier umschriebene Vektor als Klonierungsvektor geeignet, d. h. in mikrobiellen Systemen replizierbar. Derartige Vektoren sichern eine effiziente Klonierung in Bakterien, und, vorzugsweise, Hefen oder Pilzen, und ermöglichen die stabile Transformation von Pflanzen. Insbesondere müssen hierbei diverse binäre und co-integrierte Vektorsysteme genannt werden, die für die T-DNA-vermittelte Transformation geeignet sind. Derartige Vektorsysteme sind in der Regel dadurch gekennzeichnet, dass sie zumindest die für die Agrobakterium-vermittelte Transformation benötigten vir-Gene sowie die T-DNA-begrenzenden Sequenzen (T-DNA-Border) beinhalten. Vorzugsweise umfassen diese Vektorsysteme auch weitere cis-regulatorische Regionen, wie Promotoren und Terminatoren und/oder Selektionsmarker, mit denen entsprechend transformierte Wirtszellen oder Organismen identifiziert werden können. Während bei co-integrierten Vektorsystemen vir-Gene und T-DNA-Sequenzen auf demselben Vektor angeordnet sind, basieren binäre Systeme auf wenigstens zwei Vektoren, von denen einer vir-Gene, aber keine T-DNA und ein zweiter T-DNA, jedoch kein vir-Gen trägt. Als Folge davon sind letztere Vektoren relativ klein, leicht zu manipulieren, und können sowohl in E. coli als auch in Agrobacterium repliziert werden. Zu diesen binären Vektoren gehören Vektoren der pBIB-HYG-, pPZP-, pBecks-, pGreen-Reihe. Erfindungsgemäß bevorzugt verwendet werden Bin19, pBI101, pBinAR, pGPTV und pCAMBIA. Eine Übersicht über binäre Vektoren und ihre Verwendung gibt Hellens et al., Trends in Plant Science (2000) 5, 446–451. Ferner können die Polynukleotide durch Verwenden entsprechender Klonierungsvektoren in Wirtszellen oder Organismen, wie Pflanzen oder Tiere, eingebracht werden und somit bei der Transformation von Pflanzen verwendet werden, wie jenen, die in Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press, Boca Raton, Florida, USA), Kapitel 6/7, S. 71–119 (1993); F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg.: Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, 15–38; B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg.: Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128–143; Potrykus 1991, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42, 205–225, veröffentlicht und zitiert sind.
Weiter bevorzugt ist der Vektor der vorliegenden Erfindung ein Expressionsvektor. In einem solchen Expressionsvektor, d. h. einem Vektor, der das erfindungsgemäße Polynulkeotid umfasst, ist die Nukleinsäuresequenz funktionell mit einer Expressionssteuerungssequenz verbunden (auch als ”Expressionskassette” bezeichnet), welche die Expression in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen oder isolierten Fraktionen davon erlaubt. Geeignete Expressionsvektoren wie der Okayama-Berg-cDNA-Expressionsvektor pcDV1 (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3 (Invitrogene) oder pSPORT1 (GIBCO BRL) sind im Stand der Technik bekannt. Weitere Beispiele für typische Fusionsexpressionsvektoren sind pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith 1988, Gene 67: 31–40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA, USA) und pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ, USA), wobei Glutathion-S-Transferase (GST), das Maltose-E-bindende Protein beziehungsweise Protein A mit dem rekombinanten Targetprotein fusioniert sind. Beispiele für geeignete induzierbare Nichtfusions-E.-coli-Expressionsvektoren sind unter anderem pTrc (Amann 1988, Gene 69: 301–315) und pET 11d (Studier 1990, Methods in Enzymology 185, 60–89). Die Zielgenexpression des pTrc-Vektors basiert auf der Transkription durch Wirts-RNA-Polymerase von einem hybriden trp-lac-Fusionspromotor aus. Die Zielgenexpression aus dem pET 11d-Vektor basiert auf der Transkription von einem T7-gn10-lac-Fusionspromotor aus, welche von einer coexprimierten viralen RNA-Polymerase (T7 gn1) vermittelt wird. Diese virale Polymerase wird von den Wirtsstämmen BL21 (DE3) oder HMS174 (DE3) aus einem residenten λ-Prophagen bereitgestellt, der ein T7 gn1-Gen unter der transkriptionellen Steuerung des lacUV 5-Promotors beherbergt. Dem Fachmann sind andere für prokaryontische Organismen geeignete Vektoren bekannt; bei diesen Vektoren handelt es sich zum Beispiel in E. coli um pLG338, pACYC184, die pBR-Reihe wie pBR322, die pUC-Reihe wie pUC18 oder pUC19, die M113mp-Reihe, pKC30, pRep4, pHS1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III113-B1, λgt11 oder pBdCl, in Streptomyces pIJ101, pIJ364, pIJ702 oder pIJ361, in Bacillus um pUB110, pC194 oder pBD214, in Corynebacterium um pSA77 oder pAJ667. Beispiele für Vektoren für eine Expression in der Hefe S. cerevisiae schließen pYep Sec1 (Baldari 1987, Embo J. 6: 229–234), pMFa (Kurjan 1982, Cell 30: 933–943), pJRY88 (Schultz 1987, Gene 54: 113–123) und pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA, USA) ein. Vektoren und Verfahren für die Konstruktion von Vektoren, welche zur Verwendung in anderen Pilzen geeignet sind, wie etwa den filamentösen Pilzen, umfassen diejenigen, welche ausführlich beschrieben sind in: van den Handel, C.A.M.J.J., & Punt, P.J. (1991) "Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi", in: Applied Molecular Genetics of Fungi, J.F. Peberdy et al., Hrsg., S. 1–28, Cambridge University Press: Cambridge, oder in: More Gene Manipulations in Fungi (J.W. Bennett & L.L. Lasure, Hrsg., S. 396–428: Academic Press: San Diego). Weitere geeignete Hefevektoren sind zum Beispiel pAG-1, YEp6, YEp13 oder pEMBLYe23. Als Alternative können die Polynukleotide der vorliegenden Erfindung auch in Insektenzellen unter Anwendung von Baculovirus-Expressionsvektoren exprimiert werden. Baculovirus-Vektoren, welche für die Expression von Proteinen in kultivierten Insektenzellen (zum Beispiel Sf9-Zellen) verfügbar sind, umfassen die pAc-Reihe (Smith 1983, Mol. Cell Biol. 3: 2156–2165) und die pVL-Reihe (Lucklow 1989, Virology 170: 31–39).
Das Polynukleotid der vorliegenden Erfindung kann in einzelligen Pflanzenzellen (wie Algen), siehe Falciatore 1999, Marine Biotechnology 1 (3): 239–251 und die darin zitierten Literaturstellen, und Pflanzenzellen aus höheren Pflanzen (zum Beispiel Spermatophyten, wie anbaufähigen Nutzpflanzen) durch Verwendung von Pflanzenexpressionsvektoren exprimiert werden. Beispiele von Pflanzenexpressionsvektoren umfassen diejenigen, welche ausführlich in: Becker 1992, Plant Mol. Biol. 20: 1195–1197; Bevan 1984, Nucl. Acids Res. 12: 8711–8721; Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg.: Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15–38, beschrieben sind. Eine Pflanzenexpressionskassette umfasst vorzugsweise regulatorische Sequenzen, welche zur Steuerung der Genexpression in Pflanzenzellen in der Lage sind, und welche funktionell so verknüpft sind, dass jede Sequenz ihre Funktion, wie etwa transkriptionelle Termination, erfüllen kann, zum Beispiel Polyadenylierungs-Signale. Bevorzugte Polyadenylierungs-Signale sind jene, die aus Agrobacterium tumefaciens-T-DNA abgeleitet sind, wie dem Gen 3 des Ti-Plasmids pTiACH5, das als Octopin-Synthase bekannt ist (Gielen 1984, EMBO J. 3, 835) oder funktionale Äquivalente derselben, aber alle anderen Terminatoren, die in Pflanzen funktionell aktiv sind, sind auch geeignet. Da Pflanzen-Genexpression sehr häufig nicht auf transkriptionelle Spiegel beschränkt ist, umfasst eine Pflanzenexpressionskassette vorzugsweise andere funktionell gebundene Sequenzen, wie Translationsverstärker, zum Beispiel die Overdrive-Sequenz, welche die 5'-untranslatierte Tabakmosaikvirus-Leadersequenz umfasst, die das Protein/RNA-Verhältnis erhöht (Gallie 1987, Nucl. Acids Research 15: 8693–8711). Wie oben beschrieben, muss die Pflanzengenexpression funktionell mit einem geeigneten Promotor verknüpft sein, der die Expression des Gens in einer zeitlichen, zellspezifischen oder gewebespezifischen Weise ausführt. Promotoren, die verwendet werden können, sind konstitutive Promotoren (Benfey 1989, EMBO J. 8: 2195–2202) wie jene, die aus Pflanzenviren abgeleitet sind, wie etwa 35S-CAMV (Franck 1980, Cell 21: 285–294), 19S CaMV (siehe US 5,352,605 und WO 84/02913 ) oder pflanzliche Promotoren, wie der Promotor der kleinen Rubisco-Untereinheit, der in US 4,962,028 beschrieben ist. Andere bevorzugte Sequenzen für die Verwendung zur funktionsfähigen Verbindung in Pflanzengenexpressions-Kassetten sind Targeting-Sequenzen, die zum Targeting des Genproduktes in sein entsprechendes Zellkompartiment notwendig sind (eine Übersicht findet sich in Kermode 1996, Crit. Rev. Plant Sci. 15, 4: 285–423 und den darin zitierten Literaturstellen), beispielsweise in die Vakuole, den Zellkern, alle Arten von Plastiden, wie Amyloplasten, Chloroplasten, Chromoplasten, den extrazellulären Raum, die Mitochondrien, das endoplasmatische Retikulum, Ölkörper, Peroxisomen und andere Kompartimente von Pflanzenzellen. Die Pflanzengenexpression lässt sich auch wie oben beschrieben mit einem chemisch induzierbaren Promotor erleichtern (eine Übersicht findet sich in Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48:89–108). Chemisch induzierbare Promotoren eignen sich besonders, wenn gewünscht wird, dass die Genexpression auf zeitspezifische Weise erfolgt. Beispiele für solche Promotoren sind ein salicylsäureinduzierbarer Promotor ( WO 95119443 ), ein tetracyclininduzierbarer Promotor (Gatz 1992, Plant J. 2, 397–404) und ein durch Ethanol induzierbarer Promoter. Auch Promotoren, die auf biotische oder abiotische Stressbedingungen reagieren, sind geeignete Promotoren, beispielsweise der pathogeninduzierte PRP1-Gen-Promotor (Ward 1993, Plant Mol. Biol. 22: 361–366), der hitzeinduzierbare hsp80-Promotor aus Tomate ( US 5,187,267 ), der kälteinduzierbare Alpha-Amylase-Promotor aus Kartoffel ( WO 96/12814 ) oder der durch Wunden induzierbare pinII-Promotor ( EP 0 375 091 A ). Es sind insbesondere solche Promotoren bevorzugt, welche die Genexpression in Geweben und Organen herbeiführen, in denen die Fettsäure-, Lipid- und Ölbiosynthese stattfindet, in Samenzellen, wie den Zellen des Endosperms und des sich entwickelnden Embryos. Geeignete Promotoren sind der Napingen-Promotor aus Raps ( US 5,608,152 ), der USP-Promotor aus Vicia faba (Baeumlein 1991, Mol. Gen. Genet. 225 (3): 459–67), der Oleosin-Promotor aus Arabidopsis ( WO 98/45461 ), der Phaseolin-Promotor aus Phaseolus vulgaris ( US 5,504,200 ), der Bce4-Promotor aus Brassica ( WO 91/13980 ) oder der Legumin-B4-Promotor (LeB4; Baeumlein 1992, Plant Journal, 2 (2):233–9) sowie Promotoren, welche die samenspezefische Expression in monokotylen Pflanzen wie Mais, Gerste, Weizen, Roggen, Reis und dergleichen herbeiführen. Geeignete beachtenswerte Promotoren sind der Ipt2- oder Ipt1-Gen-Promotor aus Gerste ( WO 95/15389 und WO 95/23230 ) oder die in WO 99/16890 beschriebenen (Promotoren aus dem Gerste-Hordein-Gen, dem Reis-Glutelin-Gen, dem Reis-Oryzin-Gen, dem Reis-Prolamin-Gen, dem Weizen-Gliadin-Gen, Weizen-Glutelin-Gen, dem Mais-Zein-Gen, dem Hafer-Glutelin-Gen, dem Sorghum-Kasirin-Gen, dem Roggen-Secalin-Gen). Ebenso sind Promotoren besonders geeignet, welche die plastidspezifische Expression herbeiführen, da Plastiden das Kompartiment sind, in dem die Synthese von Vorläufern und manchen Endprodukten der Lipidbiosynthese erfolgt. Geeignete Promotoren wie der virale RNA-Polymerase-Promotor sind in WO 95/16783 und WO 97/06250 beschrieben, und der clpP-Promotor aus Arabidopsis ist in WO 99/46394 beschrieben.
Die oben genannten Vektoren geben nur einen kleinen Überblick über Vektoren, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden sollen. Weitere Vektoren sind dem Fachmann bekannt und sind zum Beispiel beschrieben in: Cloning Vectors (Hrsg.: Pouwels, P.H., et al., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018). Weitere geeignete Expressionssysteme für prokaryontische und eukaryontische Zellen finden sich in den Kapiteln 16 und 17 von Sambrook, loc cit.
Aus dem Obengesagten folgt, dass der Vektor vorzugsweise ein Expressionsvektor ist. Weiter bevorzugt steht das Polynukleotid der vorliegenden Erfindung im Vektor der vorliegenden Erfindung unter der Kontrolle eines samenspezifischen Promotors. Ein bevorzugter samenspezifischer Promotor, wie hierin gemeint, ist ausgewählt aus der aus Conlinin 1, Conlinin 2, Napin, LuFad3, USP, LeB4, Arc, Fae, ACP, LuPXR und SBP bestehenden Gruppe, siehe z. B. US 2003-0159174 .
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner eine Wirtszelle, welche das Polynukleotid oder den Vektor der vorliegenden Erfindung umfasst.
Vorzugsweise ist die Wirtszelle eine pflanzliche Zelle und weiter bevorzugt eine aus einer Ölsaat-Nutzpflanze erhaltene pflanzliche Zelle. Besonders bevorzugt wird die Ölsaat-Nutzpflanze aus der Gruppe gewählt, die aus Flachs (Linum sp.), Raps (Brassica sp.), Sojabohne (Glycine sp.), Sonnenblume (Helianthus sp.), Baumwolle (Gossypium sp.), Mais (Zea mays), Olive (Olea sp.), Saflor (Carthamus sp.), Kakao (Theobroma cacoa), Erdnuss (Arachis sp.), Hanf, Camelina, Crambe, Ölpalme, Kokosnüssen, Erdnüssen, Sesamsaat, Kastorbohne, Lesquerella, Talgbaum, Sheanuss, Tungnuss, Kapok-Frucht, Mohnsamen, Jojobasamen und Perilla besteht.
Ebenfalls bevorzugt ist die Wirtszelle ein Mikroorganismus. Weiter bevorzugt handelt es sich bei dem Mikroorganismus um ein Bakterium, einen Pilz oder eine Alge. Besonders bevorzugt ist er aus der aus Candida, Cryptococcus, Lipomyces, Rhodosporidium, Yarrowia und Schizochytrium bestehenden Gruppe ausgewählt.
Bei einer Wirtszelle gemäß der vorliegenden Erfindung kann es sich auch um eine tierische Zelle handeln. Vorzugsweise ist eine Tierwirtszelle eine Wirtszelle eines Fisches oder eine daraus erhaltene Zelllinie. Besonders bevorzugt stammt die Fisch-Wirtszelle aus Hering, Lachs, Sardine, Goldbarsch, Aal, Karpfen, Forelle, Heilbutt, Makrele, Zander oder Thunfisch.
Im Allgemeinen werden die regulierenden Schritte bei der Produktion von LCPUFAs, d. h. dem Biosyntheseweg für langkettige ungesättigte Fettsäuren, von membranassoziierten Fettsäuredesaturasen und – elongasen katalysiert. Pflanzen und die meisten anderen eukaryontischen Organismen verfügen über spezialisierte Desaturase- und Elongasesysteme zum Einführen von Doppelbindungen und der Verlängerung von Fettsäuren über C18-Atome hinaus. Die Elongase-Reaktionen haben einige bedeutende Merkmale mit dem Fettsäure-Synthase-Komplex (FAS) gemein. Allerdings ist der Elongase-Komplex von dem FAS-Komplex verschieden, da der Komplex im Zytosol lokalisiert ist und membrangebunden vorkommt, ACP nicht beteiligt ist, und die Elongase-3-Keto-Acyl-CoA-Synthase die Kondensation von Malonyl-CoA mit einem Acyl-Primer katalysiert. Der Elongase-Komplex besteht aus vier Komponenten mit unterschiedlichen katalytischen Funktionen, der Keto-Acyl-Synthase (Kondensationsreaktion von Malonyl-CoA zu Acyl-CoA, Erzeugung einer um 2 C-Atome längeren Keto-Acyl-CoA-Fettsäure), der Keto-Acyl-Reductase (Reduktion der 3-Ketogruppe zu einer 3-Hydroxygruppe), der Dehydratase (Dehydratisierung führt zu einer 3-Enoyl-Acyl-CoA-Fettsäure) und der Enoyl-CoA-Reductase (Reduktion der Doppelbindung an Position 3, Ablösung aus dem Komplex). Für die Produktion von LCPUFAs einschließlich ARA, EPA und/oder DHA ist die Elongationsreaktion neben den Desaturierungsreaktionen wesentlich. Höhere Pflanzen weisen nicht den für die Produktion von LCPUFAs (4 oder mehr Doppelbindungen, 20 oder mehr C-Atome) notwendigen Enzymsatz auf. Deshalb müssen den Pflanzen bzw. Pflanzenzellen die katalytischen Aktivitäten verliehen werden. Die Polynukleotide der vorliegenden Erfindung katalysieren die für die Bildung von ARA, EPA und/oder DHA benötigten Desaturierungs- und Elongationsaktivitäten. Durch die Bereitstellung der neuen Desaturasen und Elongasen werden erhöhte Konzentrationen an PUFAs und LCPUFAs erzeugt.
Dem Fachmann ist jedoch bekannt, dass man in Abhängigkeit von der Wirtszelle den Wirtszellen weitere enzymatische Aktivitäten verleihen kann, z. B. durch rekombinante Technologien. Dementsprechend sieht die vorliegende Erfindung vorzugsweise eine Wirtszelle vor, die zusätzlich zum Polynukleotid der vorliegenden Erfindung Polynukleotide umfasst, die für diejenigen Desaturasen und/oder Elongasen codieren, die je nach gewählter Wirtszelle benötigt werden. Bevorzugte Desaturasen und/oder Elongasen, die in der Wirtszelle vorhanden sein sollten, sind mindestens ein Enzym ausgewählt aus der folgenden Gruppe: Δ-4-Desaturase, Δ-5-Desaturase, Δ-5-Elongase, Δ-6-Desaturase, Δ12-Desaturase, Δ-15-Desaturase, ω3-Desaturase und Δ-6-Elongase. Besonders bevorzugt sind die bifunktionellen d12d15-Desaturasen d12d15Des(Ac) aus Acanthamoeba castellanii ( WO2007042510 ), d12d15Des(Cp) aus Claviceps purpurea ( WO2008006202 ) und d12d15Des(Lg)1 aus Lottia gigantea ( WO2009016202 ), die d12-Desaturasen d12Des(Co) aus Calendula officinalis ( WO200185968 ), d12Des(Lb) aus Laccaria bicolor (WO2009016202), d12Des(Mb) aus Monosiga brevicollis (WO2009016202), d12Des(Mg) aus Mycosphaerella graminicola (WO2009016202), d12Des(Nh) aus Nectria haematococca (WO2009016202), d12Des(Ol) aus Ostreococcus lucimarinus ( WO2008040787 ), d12Des(Pb) aus Phycomyces blakesleeanus (WO2009016202), d12Des(Ps) aus Phytophthora sojae ( WO2006100241 ) und d12Des(Tp) aus Thalassiosira pseudonana ( WO2006069710 ), die d15-Desaturasen d15Des(Hr) aus Helobdella robusta (WO2009016202), d15Des(Mc) aus Microcoleus chthonoplastes (WO2009016202), d15Des(Mf) aus Mycosphaerella fijiensis (WO2009016202), d15Des(Mg) aus Mycosphaerella graminicola (WO2009016202) und d15Des(Nh)2 aus Nectria haematococca (WO2009016202), die d4-Desaturasen d4Des(Eg) aus Euglena gracilis ( WO2004090123 ), d4Des(Tc) aus Thraustochytrium sp. ( WO2002026946 ) und d4Des(Tp) aus Thalassiosira pseudonana (WO2006069710), die d5-Desaturasen d5Des(Ol)2 aus Ostreococcus lucimarinus (WO2008040787), d5Des(Pp) aus Physcomitrella patens ( WO2004057001 ), d5Des(Pt) aus Phaeodactylum tricornutum ( WO2002057465 ), d5Des(Tc) aus Thraustochytrium sp. (WO2002026946), d5Des(Tp) aus Thalassiosira pseudonana (WO2006069710) und die d6-Desaturasen d6Des(Cp) aus Ceratodon purpureus ( WO2000075341 ), d6Des(Ol) aus Ostreococcus lucimarinus (WO2008040787), d6Des(Ot) aus Ostreococcus tauri (WO2006069710), d6Des(Pf) aus Primula farinosa ( WO2003072784 ), d6Des(Pir)_BO aus Pythium irregulare (WO2002026946), d6Des(Pir) aus Pythium irregulare (WO2002026946), d6Des(Plu) aus Primula luteola (WO2003072784), d6Des(Pp) aus Physcomitrella patens ( WO200102591 ), d6Des(Pt) aus Phaeodactylum tricornutum (WO2002057465), d6Des(Pv) aus Primula vialii (WO2003072784) und d6Des(Tp) aus Thalassiosira pseudonana (WO2006069710), die d8-Desaturasen d8Des(Ac) aus Acanthamoeba castellanii ( EP1790731 ), d8Des(Eg) aus Euglena gracilis ( WO200034439 ) und d8Des(Pm) aus Perkinsus marinus ( WO2007093776 ), die o3-Desaturasen o3Des(Pi) aus Phytophthora infestans ( WO2005083053 ), o3Des(Pir) aus Pythium irregulare ( WO2008022963 ), o3Des(Pir)2 aus Pythium irregulare (WO2008022963) und o3Des(Ps) aus Phytophthora sojae (WO2006100241), die bifunktionellen d5d6-Elongasen d5d6Elo(Om)2 aus Oncorhynchus mykiss ( WO2005012316 ), d5d6Elo(Ta) aus Thraustochytrium aureum (WO2005012316) und d5d6Elo(Tc) aus Thraustochytrium sp. (WO2005012316), die d5-Elongasen d5Elo(At) aus Arabidopsis thaliana (WO2005012316), d5Elo(At)2 aus Arabidopsis thaliana (WO2005012316), d5Elo(Ci) aus Ciona intestinalis (WO2005012316), d5Elo(Ol) aus Ostreococcus lucimarinus ( WO2008040787 ), d5Elo(Ot) aus Ostreococcus tauri (WO2005012316), d5Elo(Tp) aus Thalassiosira pseudonana (WO2005012316) und d5Elo(Xl) aus Xenopus laevis (WO2005012316), die d6-Elongasen d6Elo(Ol) aus Ostreococcus lucimarinus (WO2008040787), d6Elo(Ot) aus Ostreococcus tauri (WO2005012316), d6Elo(Pi) aus Phytophthora infestans ( WO2003064638 ), d6Elo(Pir) aus Pythium irregulare ( WO2009016208 ), d6Elo(Pp) aus Physcomitrella patens (WO2001059128), d6Elo(Ps) aus Phytophthora sojae ( WO2006100241 ), d6Elo(Ps)2 aus Phytophthora sojae (WO2006100241), d6Elo(Ps)3 aus Phytophthora sojae (WO2006100241), d6Elo(Pt) aus Phaeodactylum tricornutum (WO2005012316), d6Elo(Tc) aus Thraustochytrium sp. (WO2005012316) und d6Elo(Tp) aus Thalassiosira pseudonana (WO2005012316), die d9-Elongasen d9Elo(Ig) aus Isochrysis galbana ( WO2002077213 ), d9Elo(Pm) aus Perkinsus marinus ( WO2007093776 ) und d9Elo(Ro) aus Rhizopus oryzae (WO2009016208). Insbesondere wenn die Herstellung von ARA in höheren Pflanzen vorgesehen ist, so kann man die in Tabelle 3 unten aufgeführten Enzyme (d. h. zusätzlich eine d6-Desaturase, d6-Elongase, d5-Elongase, d5-Desaturase, d12-Desaturase und d6-Elongase) oder Enzyme mit im Wesentlichen der gleichen Aktivität in einer Wirtszelle miteinander kombinieren. Ist die Herstellung von EPA in höheren Pflanzen vorgesehen, so kann man die in Tabelle 4 unten aufgeführten Enzyme (d. h. zusätzlich eine d6-Desaturase, d6-Elongase, d5-Desaturase, d12-Desaturase, d6-Elongase, Omega 3-Desaturase und d15-Desaturase) oder Enzyme mit im Wesentlichen der gleichen Aktivität in einer Wirtszelle miteinander kombinieren. Ist die Herstellung von DHA in höheren Pflanzen vorgesehen, so kann man die in Tabelle 5 unten aufgeführten Enzyme (d. h. zusätzlich eine d6-Desaturase, d6-Elongase, d5-Desaturase, d12-Desaturase, d6-Elongase, Omega 3-Desaturase, d15-Desaturase, d5-Elongase und d4-Desaturase) oder Enzyme mit im Wesentlichen der gleichen Aktivität in einer Wirtszelle miteinander kombinieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem eine Zelle, vorzugsweise eine wie oben angeführte Wirtszelle oder eine hier an anderer Stelle angeführte Zelle eines nicht-menschlichen Organismus, wobei diese Zelle ein Polynukleotid umfasst, welches durch eine Punktmutation, eine Verkürzung, eine Inversion, eine Deletion, eine Addition, eine Substitution und homologe Rekombination aus dem Polynukleotid der vorliegenden Erfindung erhältlich ist. Wie man solche Modifikationen an einem Polynukleotid durchführt, ist dem Fachmann gut bekannt und wurde an anderer Stelle in der vorliegenden Beschreibung ausführlich beschrieben.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines durch ein Polynukleotid der vorliegenden Erfindung codierten Polypeptids, bei dem man

a) die erfindungsgemäße Wirtszelle unter Bedingungen kultiviert, die die Herstellung des Polypeptids erlauben; und
b) das Polypeptid aus der Wirtszelle von Schritt a) gewinnt.

Geeignete Bedingungen, die eine Expression des erfindungsgemäßen Polynukleotids erlauben, welches von der Wirtszelle umfasst ist, hängen von der Wirtszelle sowie der zur Regulierung der Expression des Polunukleotids eingesetzten Expressionssteuerungssequenz ab. Diese Bedingungen und wie sie auszuwählen sind, sind dem Fachmann sehr gut bekannt. Das exprimierte Polypeptid kann zum Beispiel durch alle herkömmlichen Aufreinigungstechniken einschließlich Affinitätschromatographie, Größenausschluss-Chromatographie, Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) und Ausfällungstechniken einschließlich Antikörperpräzipitation erhalten werden. Es versteht sich, dass das Verfahren – obwohl bevorzugt – nicht notwendigerweise eine im Wesentlichen reine Präparation des Polypeptids liefert. Es versteht sich, dass je nach der für das oben erwähnte Verfahren verwendeten Wirtszelle die so produzierten Polypeptide posttranslational modifiziert oder anderweitig prozessiert werden können.
Die vorliegende Erfindung umfasst außerdem ein Polypeptid, welches durch das Polynukleotid der vorliegenden Erfindung codiert wird oder nach dem oben erwähnten Verfahren erhältlich ist.
Der Ausdruck „Polypeptid” umfasst, so wie er hier verwendet wird, im Wesentlichen aufgereinigte Polypeptide oder Polypeptidzubereitungen, die zusätzlich andere Proteine enthalten. Der Ausdruck bezieht sich außerdem auf die Fusionsproteine oder Polypeptidfragmente, die mindestens teilweise durch das oben angesprochene Polynukleotid der vorliegenden Erfindung codiert werden. Es schließt auch chemisch modifizierte Polypeptide ein. Bei diesen Modifikationen kann es sich um künstliche Modifikationen oder natürlich vorkommende Modifikationen wie Phosphorylierung, Glykosylierung, Myristylierung und dergleichen handeln (Übersichtsartikel in Mann 2003, Nat. Biotechnol. 21, 255–261, Übersichtsartikel mit dem Hauptaugenmerk auf Pflanzen in Huber 2004, Curr. Opin. Plant Biol. 7, 318–322). Gegenwärtig sind mehr als 300 posttranslationale Modifikationen bekannt (siehe die vollständige ABFRC Delta-Massenliste bei http://www.abrf.org/index.cfm/dm.home). Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung sollen die oben angesprochene Desaturase- oder Elongaseaktivität zeigen.
Die vorliegende Erfindung umfasst weiterhin einen Antikörper oder Fragmente davon, die das erfindungsgemäße Polypeptid spezifisch erkennen.
Antikörper gegen die erfindungsgemäßen Polypeptide können durch allgemein bekannte Verfahren unter Verwendung eines gereinigten Polypeptids gemäß der Erfindung oder eines geeigneten, daraus abgeleiteten Fragments als Antigen hergestellt werden. Ein Fragment, welches als ein Antigen geeignet ist, kann durch antigenizitätsbestimmende Algorithmen, die im Fachgebiet allgemein bekannt sind, identifiziert werden. Derartige Fragmente können entweder aus dem Polypeptid der Erfindung durch proteolytischen Verdau erhalten werden oder können ein synthetisches Peptid sein. Vorzugsweise ist der Antikörper der vorliegenden Erfindung ein monoklonaler Antikörper, ein polyklonaler Antikörper, ein Einzelkettenantikörper, ein chimärisierter Antikörper oder Fragment eines dieser Antikörper wie Fab-, Fr- oder scFv-Fragmente usw. Unter die Antikörper der vorliegenden Erfindung fallen außerdem bispezifische Antikörper, synthetische Antikörper oder chemisch modifizierte Derivate einer der oben erwähnten Antikörper. Der Antikörper der vorliegenden Erfindung soll spezifisch an das Polypeptid der Erfindung binden (d. h. er zeigt keine signifikante Kreuzreaktion mit anderen Polypeptiden oder Peptiden). Die spezifische Bindung kann durch verschiedene allgemein bekannte Techniken getestet werden. Antikörper oder Fragmente davon können durch Anwendung von Verfahren erhalten werden, welche z. B. in Harlow und Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988 beschrieben sind. Monoklonale Antikörper können durch die Techniken hergestellt werden, welche ursprünglich in Köhler 1975, Nature 256, 495, und Galfré 1981, Meth. Enzymol. 73, 3, beschrieben wurden, welche die Fusion von Maus-Myelomzellen mit Milzzellen, die aus immunisierten Säugern abgeleitet sind, umfassen. Die Antikörper können zum Beispiel für die Immunpräzipitation, Immunlokalisierung oder Aufreinigung (z. B. durch Affinitätschromatographie) der erfindungsgemäßen Polypeptide sowie für die Überwachung des Vorhandenseins der Polypeptidvarianten zum Beispiel in rekombinanten Organismen und für die Identifizierung von Proteinen bzw. Verbindungen, welche mit den Proteinen gemäß der Erfindung wechselwirken, verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung zieht weiterhin einen nicht-menschlichen, transgenen Organismus in Betracht, der das Polynukleotid oder den Vektor der vorliegenden Erfindung umfasst.
Bei dem nicht-menschlichen, transgenen Organismus handelt es sich vorzugsweise um eine Pflanze, einen Teil einer Pflanze oder Pflanzensamen. Bevorzugte zum Einführen des erfindungsgemäßen Polynukleotids oder Vektors zu verwendende Pflanzen sind Pflanzen, die in der Lage sind, Fettsäuren zu synthetisieren, wie z. B. alle dikotylen oder monokotylen Pflanzen, Algen oder Moose. Es versteht sich, dass von einer Pflanze gewonnene Wirtszellen auch zur Produktion einer Pflanze gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Bevorzugte Pflanzen sind ausgewählt aus der Gruppe der Pflanzenfamilien Adelotheciaceae, Anacardiaceae, Asteraceae, Apiaceae, Betulaceae, Boraginaceae, Brassicaceae, Bromeliaceae, Caricaceae, Cannabaceae, Convolvulaceae, Chenopodiaceae, Crypthecodiniaceae, Cucurbitaceae, Ditrichaceae, Elaeagnaceae, Ericaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae, Geraniaceae, Gramineae, Juglandaceae, Lauraceae, Leguminosae, Linaceae, Prasinophyceae oder Gemüsepflanzen oder Zierpflanzen wie Tagetes. Beispielhaft seien die folgenden Pflanzen genannt ausgewählt aus der Gruppe: Adelotheciaceae wie die Gattungen Physcomitrella z. B. die Gattung und Arten Physcomitrella patens, Anacardiaceae wie die Gattungen Pistacia, Mangifera, Anacardium z. B. die Gattung und Arten Pistacia vera [Pistazie], Mangifer indica [Mango] oder Anacardium occidentale [Cashew], Asteraceae wie die Gattungen Calendula, Carthamus, Centaurea, Cichorium, Cynara, Helianthus, Lactuca, Locusta, Tagetes, Valeriana z. B. die Gattung und Arten Calendula officinalis [Garten-Ringelblume], Carthamus tinctorius [Färberdistel, Saflor], Centaurea cyanus [Kornblume], Cichorium intybus [Wegwarte], Cynara scolymus [Artischocke], Helianthus annus [Sonnenblume], Lactuca sativa, Lactuca crispa, Lactuca esculenta, Lactuca scariola L. ssp. sativa, Lactuca scariola L. var. integrata, Lactuca scariola L. var. integrifolia, Lactuca sativa subsp. romana, Locusta communis, Valeriana locusta [Salat], Tagetes lucida, Tagetes erecta oder Tagetes tenuifolia [Studentenblume], Apiaceae wie die Gattung Daucus z. B. die Gattung und Art Daucus carota [Karotte], Betulaceae wie die Gattung Corylus z. B. die Gattungen und Arten Corylus avellana oder Corylus colurna [Haselnuss], Boraginaceae wie die Gattung Borago z. B. die Gattung und Art Borago officinalis [Borretsch], Brassicaceae wie die Gattungen Brassica, Melanosinapis, Sinapis, Arabadopsis z. B. die Gattungen und Arten Brassica napus, Brassica rapa ssp. [Raps], Sinapis arvensis Brassica juncea, Brassica juncea var. juncea, Brassica juncea var. crispifolia, Brassica juncea var. foliosa, Brassica nigra, Brassica sinapioides, Melanosinapis communis [Senf], Brassica oleracea [Futterrübe] oder Arabidopsis thaliana, Bromeliaceae wie die Gattungen Anana, Bromelia (Ananas) z. B. die Gattungen und Arten Anana comosus, Ananas ananas oder Bromelia comosa [Ananas], Caricaceae wie die Gattung Carica wie die Gattung und Art Carica papaya [Papaya], Cannabaceae wie die Gattung Cannabis wie die Gattung und Art Cannabis sative [Hanf], Convolvulaceae wie die Gattungen Ipomea, Convolvulus z. B. die Gattungen und Arten Ipomoea batatus, Ipomoea pandurata, Convolvulus batatas, Convolvulus tiliaceus, Ipomoea fastigiata, Ipomoea tiliacea, Ipomoea triloba oder Convolvulus panduratus [Süßkartoffel, Batate], Chenopodiaceae wie die Gattung Beta wie die Gattungen und Arten Beta vulgaris, Beta vulgaris var. altissima, Beta vulgaris var. Vulgaris, Beta maritima, Beta vulgaris var. perennis, Beta vulgaris var. conditiva oder Beta vulgaris var. esculenta [Zuckerrübe], Crypthecodiniaceae wie die Gattung Crypthecodinium z. B. die Gattung und Art Cryptecodinium cohnii, Cucurbitaceae wie die Gattung Cucubita z. B. die Gattungen und Arten Cucurbita maxima, Cucurbita mixta, Cucurbita pepo oder Cucurbita moschata [Kürbis], Cymbellaceae wie die Gattungen Amphora, Cymbella, Okedenia, Phaeodactylum, Reimeria z. B. die Gattung und Art Phaeodactylum tricornutum, Ditrichaceae wie die Gattungen Ditrichaceae, Astomiopsis, Ceratodon, Chrysoblastella, Ditrichum, Distichium, Eccremidium, Lophidion, Philibertiella, Pleuridium, Saelania, Trichodon, Skottsbergia z. B. die Gattungen und Arten Ceratodon antarcticus, Ceratodon columbiae, Ceratodon heterophyllus, Ceratodon purpurascens, Ceratodon purpureus, Ceratodon purpureus ssp. convolutus, Ceratodon purpureus ssp. stenocarpus, Ceratodon purpureus var. rotundifolius, Ceratodon ratodon, Ceratodon stenocarpus, Chrysoblastella chilensis, Ditrichum ambiguum, Ditrichum brevisetum, Ditrichum crispatissimum, Ditrichum difficile, Ditrichum falcifolium, Ditrichum flexicaule, Ditrichum giganteum, Ditrichum heteromallum, Ditrichum lineare, Ditrichum lineare, Ditrichum montanum, Ditrichum montanum, Ditrichum pallidum, Ditrichum punctulatum, Ditrichum pusillum, Ditrichum pusillum var. tortile, Ditrichum rhynchostegium, Ditrichum schimperi, Ditrichum tortile, Distichium capillaceum, Distichium hagenii, Distichium inclinatum, Distichium macounii, Eccremidium floridanum, Eccremidium whiteleggei, Lophidion strictus, Pleuridium acuminatum, Pleuridium alternifolium, Pleuridium holdridgei, Pleuridium mexicanum, Pleuridium ravenelii, Pleuridium subulatum, Saelania glaucescens, Trichodon borealis, Trichodon cylindricus oder Trichodon cylindricus var. oblongus, Elaeagnaceae wie die Gattung Elaeagnus z. B. die Gattung und Art Olea europaea [Olive], Ericaceae wie die Gattung Kalmia z. B. die Gattungen und Arten Kalmia latifolia, Kalmia angustifolia, Kalmia microphylla, Kalmia polifolia, Kalmia occidentalis, Cistus chamaerhodendros oder Kalmia lucida [Berglorbeer], Euphorbiaceae wie die Gattungen Manihot, Janipha, Jatropha, Ricinus z. B. die Gattungen und Arten Manihot utilissima, Janipha manihot, Jatropha manihot., Manihot aipil, Manihot dulcis, Manihot manihot, Manihot melanobasis, Manihot esculenta [Manihot] oder Ricinus communis [Rizinus], Fabaceae wie die Gattungen Pisum, Albizia, Cathormion, Feuillea, Inga, Pithecolobium, Acacia, Mimosa, Medicajo, Glycine, Dolichos, Phaseolus, Soja z. B. die Gattungen und Arten Pisum sativum, Pisum arvense, Pisum humile [Erbse], Albizia berteriana, Albizia julibrissin, Albizia lebbeck, Acacia berteriana, Acacia littoralis, Albizia berteriana, Albizzia berteriana, Cathormion berteriana, Feuillea berteriana, Inga fragrans, Pithecellobium berterianum, Pithecellobium fragrans, Pithecolobium berterianum, Pseudalbizzia berteriana, Acacia julibrissin, Acacia nemu, Albizia nemu, Feuilleea julibrissin, Mimosa julibrissin, Mimosa speciosa, Sericanrda julibrissin, Acacia lebbeck, Acacia macrophylla, Albizia lebbek, Feuilleea lebbeck, Mimosa lebbeck, Mimosa speciosa [Seidenbaum], Medicago sativa, Medicago falcata, Medicago varia [Alfalfa], Glycine max Dolichos soja, Glycine gracilis, Glycine hispida, Phaseolus max, Soja hispida oder Soja max [Sojabohne], Funariaceae wie die Gattungen Aphanorrhegma, Entosthodon, Funaria, Physcomitrella, Physcomitrium z. B. die Gattungen und Arten Aphanorrhegma serratum, Entosthodon attenuatus, Entosthodon bolanderi, Entosthodon bonplandii, Entosthodon californicus, Entosthodon drummondii, Entosthodon jamesonii, Entosthodon leibergii, Entosthodon neoscoticus, Entosthodon rubrisetus, Entosthodon spathulifolius, Entosthodon tucsoni, Funaria americana, Funaria bolanderi, Funaria calcarea, Funaria californica, Funaria calvescens, Funaria convoluta, Funaria flavicans, Funaria groutiana, Funaria hygrometrica, Funaria hygrometrica var. arctica, Funaria hygrometrica var. calvescens, Funaria hygrometrica var. convoluta, Funaria hygrometrica var. muralis, Funaria hygrometrica var. utahensis, Funaria microstoma, Funaria microstoma var. obtusifolia, Funaria muhlenbergii, Funaria orcuttii, Funaria plano-convexa, Funaria polaris, Funaria ravenelii, Funaria rubriseta, Funaria serrata, Funaria sonorae, Funaria sublimbatus, Funaria tucsoni, Physcomitrella californica, Physcomitrella patens, Physcomitrella readeri, Physcomitrium australe, Physcomitrium californicum, Physcomitrium collenchymatum, Physcomitrium coloradense, Physcomitrium cupuliferum, Physcomitrium drummondii, Physcomitrium eurystomum, Physcomitrium flexifolium, Physcomitrium hookeri, Physcomitrium hookeri var. serratum, Physcomitrium immersum, Physcomitrium kellermanii, Physcomitrium megalocarpum, Physcomitrium pyriforme, Physcomitrium pyriforme var. serratum, Physcomitrium rufipes, Physcomitrium sandbergii, Physcomitrium subsphaericum, Physcomitrium washingtoniense, Geraniaceae wie die Gattungen Pelargonium, Cocos, Oleum z. B. die Gattungen und Arten Cocos nucifera, Pelargonium grossularioides oder Oleum cocois [Kokusnuss], Gramineae wie die Gattung Saccharum z. B. die Gattung und Art Saccharum officinarum, Juglandaceae wie die Gattungen Juglans, Wallia z. B. die Gattungen und Arten Juglans regia, Juglans ailanthifolia, Juglans sieboldiana, Juglans cinerea, Wallia cinerea, Juglans bixbyi, Juglans californica, Juglans hindsii, Juglans intermedia, Juglans jamaicensis, Juglans major, Juglans microcarpa, Juglans nigra oder Wallia nigra [Walnuss], Lauraceae Wie die Gattungen Persea, Laurus z. B. die Gattungen und Arten Laurus nobilis [Lorbeer], Persea americana, Persea gratissima oder Persea Persea [Avocado], Leguminosae wie die Gattung Arachis z. B. die Gattung und Art Arachis hypogaea [Erdnuss], Linaceae wie die Gattungen Linum, Adenolinum z. B. die Gattungen und Arten Linum usitatissimum, Linum humile, Linum austriacum, Linum bienne, Linum angustifolium, Linum catharticum, Linum flavum, Linum grandiflorum, Adenolinum grandiflorum, Linum lewisii, Linum narbonense, Linum perenne, Linum perenne var. lewisii, Linum pratense oder Linum trigynum [Lein], Lythrarieae wie die Gattung Punica z. B. die Gattung und Art Punica granatum [Granatapfel], Malvaceae wie die Gattung Gossypium z. B. die Gattungen und Arten Gossypium hirsutum, Gossypium arboreum, Gossypium barbadense, Gossypium herbaceum oder Gossypium thurberi [Baumwolle], Marchantiaceae wie die Gattung Marchantia z. B. die Gattungen und Arten Marchantia berteroana, Marchantia foliacea, Marchantia macropora, Musaceae wie die Gattung Musa z. B. die Gattungen und Arten Musa nana, Musa acuminata, Musa paradisiaca, Musa spp. [Banane], Onagraceae wie die Gattungen Camissonia, Oenothera z. B. die Gattungen und Arten Oenothera biennis oder Camissonia brevipes [Nachtkerze], Palmae wie die Gattung Elacis z. B. die Gattung und Art Elaeis guineensis [Ölpalme], Papaveraceae wie die Gattung Papaver z. B. die Gattungen und Arten Papaver Orientale, Papaver rhoeas, Papaver dubium [Mohn], Pedaliaceae wie die Gattung Sesamum z. B. die Gattung und Art Sesamum indicum [Sesam], Piperaceae wie die Gattungen Piper, Artanthe, Peperomia, Steffensia z. B. die Gattungen und Arten Piper aduncum, Piper amalago, Piper angustifolium, Piper auritum, Piper betel, Piper cubeba, Piper longum, Piper nigrum, Piper retrofractum, Artanthe adunca, Artanthe elongata, Peperomia elongata, Piper elongatum, Steffensia elongata. [Cayennepfeffer], Poaceae wie die Gattungen Hordeum, Secale, Avena, Sorghum, Andropogon, Holcus, Panicum, Oryza, Zea (Mais), Triticum z. B. die Gattungen und Arten Hordeum vulgare, Hordeum jubatum, Hordeum murinum, Hordeum secalinum, Hordeum distichon, Hordeum aegiceras, Hordeum hexastichon, Hordeum hexastichum, Hordeum irregulare, Hordeum sativum, Hordeum secalinum [Gerste], Secale cereale [Roggen], Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida [Hafer], Sorghum bicolor, Sorghum halepense, Sorghum saccharatum, Sorghum vulgare, Andropogon drummondii, Holcus bicolor, Holcus sorghum, Sorghum aethiopicum, Sorghum arundinaceum, Sorghum caffrorum, Sorghum cernuum, Sorghum dochna, Sorghum drummondii, Sorghum durra, Sorghum guineense, Sorghum lanceolatum, Sorghum nervosum, Sorghum saccharatum, Sorghum subglabrescens, Sorghum verticilliflorum, Sorghum vulgare, Holcus halepensis, Sorghum miliaceum, Panicum militaceum [Hirse], Oryza sativa, Oryza latifolia [Reis], Zea mays [Mais], Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum oder Triticum vulgare [Weizen], Porphyridiaceae wie die Gattungen Chroothece, Flintiella, Petrovanella, Porphyridium, Rhodella, Rhodosorus, Vanhoeffenia z. B. die Gattung und Art Porphyridium cruentum, Proteaceae wie die Gattung Macadamia z. B. die Gattung und Art Macadamia intergrifolia [Macadamia], Prasinophyceae wie die Gattungen Nephroselmis, Prasinococcus, Scherffelia, Tetraselmis, Mantoniella, Ostreococcus z. B. die Gattungen und Arten Nephroselmis olivacea, Prasinococcus capsulatus, Scherffelia dubia, Tetraselmis chui, Tetraselmis suecica, Mantoniella squamata, Ostreococcus tauri, Rubiaceae wie die Gattung Cofea z. B. die Gattungen und Arten Cofea spp., Coffea arabica, Coffea canephora oder Coffea liberica [Kaffee], Scrophulariaceae wie die Gattung Verbascum z. B. die Gattungen und Arten Verbascum blattaria, Verbascum chaixii, Verbascum densiflorum, Verbascum lagurus, Verbascum longifolium, Verbascum lychnitis, Verbascum nigrum, Verbascum olympicum, Verbascum phlomoides, Verbascum phoenicum, Verbascum pulverulentum oder Verbascum thapsus [Königskerze], Salanaceae wie die Gattungen Capsicum, Nicotiana, Solanum, Lycopersicon z. B. die Gattungen und Arten Capsicum annuum, Capsicum annuum vor. glabriusculum, Capsicum frutescens [Pfeffer], Capsicum annuum [Paprika], Nicotiana tabacum, Nicotiana alata, Nicotiana attenuata, Nicotiana glauca, Nicotiana langsdorffii, Nicotiana obtusifolia, Nicotiana quadrivalvis, Nicotiana repanda, Nicotiana rustica, Nicotiana sylvestris [Tabak], Solanum tuberosum [Kartoffel], Solanum melongena [Aubergine] Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum., Lycopersicon pyriforme, Solanum integrifolium oder Solanum lycopersicum [Tomate], Sterculiaceae wie die Gattung Theobroma z. B. die Gattung und Art Theobroma cacao [Kakao] oder Theaceae wie die Gattung Camellia z. B. die Gattung und Art Camellia sinensis [Tee]. Besonders bevorzugt als transgene Pflanzen gemäß der vorliegenden Erfindung zu verwendende Pflanzen sind Ölfruchtpflanzen, die große Mengen an Lipidverbindungen enthaften, wie Erdnuss, Raps, Canola, Sonnenblume, Saflor, Mohn, Senf, Hanf, Rizinus, Olive, Sesam, Calendula, Punica, Nachtkerze, Königskerze, Distel, Wildrosen, Haselnuss, Mandel, Macadamia, Avocado, Lorbeer, Kürbis, Lein, Soja, Pistazien, Borretsch, Bäume (Ölpalme, Kokosnuss oder Walnuss) oder Feldfrüchte, wie Mais, Weizen, Roggen, Hafer, Triticale, Reis, Gerste, Baumwolle, Maniok, Pfeffer, Tagetes, Solanaceen-Pflanzen, wie Kartoffel, Tabak, Aubergine und Tomate, Vicia-Arten, Erbse, Alfalfa oder Buschpflanzen (Kaffee, Kakao, Tee), Salix-Arten sowie ausdauernde Gräser und Futterfeldfrüchte. Bevorzugte erfindungsgemäße Pflanzen sind Ölfruchtpflanzen, wie Erdnuss, Raps, Canola, Sonnenblume, Saflor, Mohn, Senf, Hanf, Rhizinus, Olive, Calendula, Punica, Nachtkerze, Kürbis, Lein, Soja, Borretsch, Bäume (Ölpalme, Kokosnuss). Besonders bevorzugt sind Sonnenblume, Tabak, Königskerze, Sesam, Baumwolle, Kürbis, Mohn, Nachtkerze, Walnuss, Lein, Hanf, Distel oder Färberdistel. Ganz besonders bevorzugt sind Pflanzen wie Färberdistel, Sonnenblume, Mohn, Nachtkerze, Walnuss, Lein oder Hanf.
Bevorzugte Moose sind Physcomitrella oder Ceratodon. Bevorzugte Algen sind Isochrysis, Mantoniella, Ostreococcus oder Crypthecodinium, und Algen/Diatomeen wie Phaeodactylum oder Thraustochytrium. Besonders bevorzugt sind diese Algen bzw. Moose aus der folgenden Gruppe ausgewählt: Emiliana, Shewanella, Physcomitrella, Thraustochytrium, Fusarium, Phytophthora, Ceratodon, Isochrysis, Aleurita, Muscarioides, Mortierella, Phaeodactylum, Cryphthecodinium, insbesondere aus den Gattungen und Arten Thallasiosira pseudonona, Euglena gracilis, Physcomitrella patens, Phytophtora infestans, Fusarium graminaeum, Cryptocodinium cohnii, Ceratodon purpureus, Isochrysis galbana, Aleurita farinosa, Thraustochytrium sp., Muscarioides viallii, Mortierella alpina, Phaeodactylum tricornutum oder Caenorhabditis elegans oder besonders vorteilhaft aus Phytophtora infestans, Thallasiosira pseudonona und Cryptocodinium cohnii.
Transgene Pflanzen lassen sich wie an anderer Stelle in dieser Beschreibung durch Transformationstechniken erhalten. Vorzugsweise können transgene Pflanzen durch T-DNA-vermittelte Transformation erhalten werden. Solche Vektorsysteme sind in der Regel dadurch charakterisiert, dass sie mindestens die vir-Gene enthalten, die für die durch Agrobacterium vermittelte Transformation benötigt werden, und die Sequenzen, die die T-DNA umfassen (T-DNA-Border). Geeignete Vektoren sind an anderer Stelle in dieser Beschreibung ausführlich beschrieben.
Ebenfalls eingeschlossen sind transgene, nicht menschliche Tiere, die den Vektor oder das Polynukleotid der vorliegenden Erfindung enthalten. Bevorzugte nicht menschliche, transgene Tiere, die in der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen werden, sind Fische wie Hering, Lachs, Sardine, Goldbarsch, Aal, Karpfen, Forelle, Heilbutt, Makrele, Zander oder Thunfisch.
Es versteht sich jedoch, dass je nach dem oben beschriebenen nicht menschlichen, transgenen Organismus diesem Organismus weitere enzymatische Aktivitäten verliehen werden können, z. B. durch rekombinante Techniken. Dementsprechend sieht die vorliegende Erfindung vorzugsweise einen wie oben beschriebenen nicht menschlichen, transgenen Organismus vor, der zusätzlich zum Polynukleotid der vorliegenden Erfindung Polynukleotide umfasst, die für die je nach ausgewählter Wirtszelle benötigten Desaturasen und/oder Elongasen codieren. Bevorzugte Desaturasen und/oder Elongasen, die in dem Organismus vorhanden sein sollten, sind mindestens ein Enzym ausgewählt aus der Gruppe der Desaturasen und/oder Elongasen oder der explizit an anderer Stelle in der vorliegenden Beschreibung angeführten Kombinationen (siehe oben und Tabellen 3, 4 und 5).
Die vorliegende Erfindung umfasst weiterhin ein Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren, bei dem man:

a) die erfindungsgemäße Wirtszelle unter Bedingungen kultiviert, die die Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren in dieser Wirtszelle erlauben;
b) die mehrfach ungesättigten Fettsäuren aus dieser Wirtszelle gewinnt.

Der Ausdruck ”mehrfach ungesättigte Fettsäuren (PUFA)” bezieht sich, so wie er hier verwendet wird, auf Fettsäuren, die mindestens zwei, vorzugsweise drei, vier, fünf oder sechs, Doppelbindungen enthalten. Es versteht sich außerdem, dass solche Fettsäuren vorzugsweise 18 bis 24 Kohlenstoffatome in der Fettsäurekette enthalten. Besonders bevorzugt bezieht sich der Ausdruck auf langkettige PUFA (LCPUFA) mit 20 bis 24 Kohlenstoffatomen in der Fettsäurekette. Bevorzugte ungesättigte Fettsäuren in Sinne der vorliegenden Erfindung sind aus der folgenden Gruppe ausgewählt: DGLA 20:3 (8, 11, 14), ARA 20:4 (5, 8, 11, 14), iARA 20:4 (8, 11, 14, 17), EPA 20:5 (5, 8, 11, 14, 17), DPA 22:5 (4, 7, 10, 13, 16), DHA 22:6 (4, 7, 10, 13, 16, 19), 20:4 (8, 11, 14, 17), besonders bevorzugt Arachidonsäure (ARA) 20:4 (5, 8 ,11, 14), Eicosapentaensäure (EPA) 20:5 (5, 8, 11, 14, 17), und Docosahexaensäure (DHA) 22:6 (4, 7, 10, 13, 16, 19). Es versteht sich somit, dass die von der vorliegenden Erfindung bereitgestellten Methoden ganz besonders bevorzugt die Herstellung von ARA, EPA oder DHA betreffen. Außerdem sind auch die während der Synthese auftretenden Zwischenprodukte von LCPUFA eingeschlossen. Solche Zwischenprodukte werden vorzugsweise durch die Desaturase- oder Elongaseaktivität der Polypeptide der vorliegenden Erfindung aus Substraten gebildet. Die Substrate schließen vorzugsweise LA 18:2 (9, 12), ALA 18:3 (9, 12, 15), Eicosadiensäure 20:2 (11, 14), Eicosatriensäure 20:3 (11, 14, 17), DGLA 20:3 (8, 11, 14), ARA 20:4 (5, 8, 11, 14), Eicosatetraensäure 20:4 (8, 11, 14, 17), Eicosapentaensäure 20:5 (5, 8, 11, 14, 17) und Docosahexapentansäure 22:5 (7, 10, 13, 16, 19) ein.
Der Ausdruck ”Kultivieren” bezieht sich, so wie er hier verwendet wird, auf das Halten und Wachsenlassen der Wirtszellen unter Kultivierungsbedingungen, die es den Zellen erlauben, die mehrfach ungesättigte Fettsäure, d. h. die oben angesprochene PUFA und/oder LCPUFA, zu produzieren. Dies bedeutet, dass das Polynukleotid der vorliegenden Erfindung in der Wirtszelle exprimiert wird, so dass die Desaturase- und/oder Elongaseaktivität vorhanden ist. Geeignete Kultivierungsbedingungen zum Kultivieren der Wirtszelle sind unten ausführlicher beschrieben.
Der Ausdruck ”Gewinnen” umfasst, so wie er hier verwendet wird, die Bereitstellung der Zellkultur einschließlich der Wirtszellen und des Kulturmediums sowie die Bereitstellung aufgereinigter oder teilweise aufgereinigter Zubereitungen davon, die die mehrfach ungesättigte Fettsäuren, vorzugsweise ARA, EPA, DHA, in freier oder in -CoA-gebundener Form als Membranphospholipide oder als Triacylglyceridester enthalten. Besonders bevorzugt werden die PUFA und LCPUFA als Triglyceridester erhalten, z. B. in Form eines Öls. Weitere Einzelheiten zu Aufreinigungstechniken finden sich hier an anderer Stelle unten.
Die in dem erfindungsgemäßen Verfahren einzusetzenden Wirtszellen werden auf eine Weise wachsen gelassen bzw. kultiviert, mit der der Fachmann vertraut ist, in Abhängigkeit vom Wirtsorganismus. Gewöhnlich werden Wirtszellen in einem flüssigen Medium, das eine Kohlenstoffquelle, gewöhnlich in Form von Zuckern, eine Stickstoffquelle, gewöhnlich in Form organischer Stickstoffquellen wie Hefeextrakt oder Salzen wie Ammoniumsulfat, Spurenelemente wie Eisen-, Mangan- und Magnesiumsalze und gegebenenfalls Vitamine enthält, bei Temperaturen zwischen 0°C und 100°C, vorzugsweise zwischen 10°C und 60°C, unter Sauerstoff oder einer anaeroben Atmosphäre, je nach Art des Organismus, kultiviert. Der pH-Wert des flüssigen Mediums kann entweder konstant gehalten werden, d. h. während der Kultivierungsperiode reguliert werden, oder nicht. Die Kulturen können chargenweise, teilweise in Chargen oder kontinuierlich herangezogen werden. Nährstoffe können zu Beginn der Fermentation bereitgestellt oder halbkontinuierlich oder kontinuierlich verabreicht werden: die produzierte PUFA oder LCPUFA kann wie oben beschrieben durch dem Fachmann bekannte Verfahren, z. B. durch Extraktion, Destillation, Kristallisation, gegebenenfalls durch Ausfällen mit Salz, und/oder Chromatographie, aus den Wirtszellen isoliert werden. Es kann erforderlich sein, die Wirtszellen vor der Aufreinigung aufzubrechen. Hierzu kann man die Wirtszellen vorher aufbrechen. Das zu verwendende Kulturmedium muss in geeigneter Weise den Bedürfnissen der jeweiligen Wirtszelle gerecht werden. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen, die als Wirtszellen gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, finden sich in dem Lehrbuch „Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981). Kulturmedien können auch von verschiedenen kommerziellen Lieferanten erhalten werden. Alle Medienkomponenten werden sterilisiert, entweder durch Erhitzen oder durch Sterilfiltration. Alle Medienkomponenten können jeweils zu Beginn der Kultivierung vorhanden sein oder kontinuierlich oder chargenweise zugegeben werden, wie gewünscht. Wenn das erfindungsgemäße Polynukleotid bzw. der erfindungsgemäße Vektor, das bzw. der in die Wirtszelle eingeführt wurde, weiterhin einen exprimierbaren Selektionsmarker wie z. B. ein Antibiotikaresistenzgen umfasst, kann es erforderlich sein, der Kultur ein Selektionsmittel wie z. B. ein Antibiotikum zuzusetzen, um die Stabilität des eingeführten Polynukleotids aufrechtzuerhalten. Es wird kultiviert, bis die Bildung des gewünschten Produkts ein Maximum erreicht hat. Dies wird normalerweise innerhalb von 10 bis 160 Stunden erreicht. Die Fermentationsbrühen können direkt verwendet oder weiterverarbeitet werden. Die Biomasse kann je nach Erfordernis durch Abtrennmethoden wie zum Beispiel Zentrifugieren, Filtrieren, Dekantieren oder eine Kombination dieser Methoden vollständig oder zum Teil aus der Fermentationsbrühe entfernt werden oder ganz in dieser Brühe belassen werden. Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Fettsäurezubereitungen, z. B. Öle, die die gewünsche PUFA oder LCPUFA als Triglyceridester enthalten, eignen sich auch als Ausgangsmaterial für die chemische Synthese weiterer Produkte von Interesse. Sie können zum Beispiel in Kombination miteinander oder alleine zur Herstellung von pharmazeutischen oder kosmetischen Zusammensetzungen, Nahrungsmitteln oder Tierfutter verwendet werden. Chemisch reine Triglyceride, die die gewünschte PUFA oder LCPUFA enthalten, lassen sich ebenfalls nach den oben beschriebenen Methoden herstellen. Zu diesem Zweck werden die Fettsäurezubereitungen weiter durch Extraktion, Destillation, Kristallisation, Chromatographie oder Kombinationen dieser Methoden aufgereinigt. Zur Freisetzung der Fettsäuregruppierungen aus den Triglyceriden kann eine Hydrolyse erforderlich sein. Diese chemisch reinen Triglyceride oder freien Fettsäuren eignen sich insbesondere für Anwendungen in der Nahrungsmittelindustrie oder für kosmetische und pharmakologische Zusammensetzungen.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren, bei dem man:

a) den erfindungsgemäßen nicht menschlichen, transgenen Organismus unter Bedingungen kultiviert, die die Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren in diesem nicht menschlichen, transgenen Organismus erlauben; und
b) die mehrfach ungesättigten Fettsäuren aus diesem nicht menschlichen, transgenen Organismus gewinnt.

Aus dem Obigen folgt weiterhin, dass die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung einer Öl-, Lipid- oder Fettsäurezusammensetzung vorsieht, welches die Schritte eines der oben erwähnten Verfahren und den weiteren Schritt der Formulierung der PUFA oder LCPUFA als Öl-, Lipid- oder Fettsäurezusammensetzung umfasst. Diese Öl-, Lipid- oder Fettsäurezusammensetzung wird vorzugsweise für Futter, Nahrungsmittel, Kosmetika oder Medikamente verwendet. Dementsprechend sollte die Formulierung der PUFA oder LCPUFA für die einzelnen vorgesehenen Produkte nach GMP-Standards erfolgen. So kann man zum Beispiel ein Öl mittels einer Ölmühle aus Pflanzensamen erhalten. Aus Gründen der Produktsicherheit kann unter dem betreffenden GMP-Standard jedoch eine Sterilisation erforderlich sein. Ähnliche Standards werden für Lipid- oder Fettsäurezusammensetzungen gelten, die in kosmetischen oder pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Anwendung kommen. Alle diese Maßnahmen zur Formulierung von Öl-, Lipid- oder Fettsäurezusammensetzungen als Produkte fallen mit unter die oben erwähnte Herstellung.
Der Ausdruck ”Öl” bezieht sich auf eine Fettsäuremischung, welche ungesättigte und/oder gesättigte Fettsäuren umfasst, die mit Triglyceriden verestert sind. Vorzugsweise umfassen die Triglyceride im erfindungsgemäßen Öl PUFA oder LCPUFA, wie oben angeführt. Die Menge an veresterter PUFA und/oder LCPUFA beträgt vorzugsweise etwa 30%, ein Gehalt von 50% ist besonders bevorzugt, ein Gehalt von 60%, 70%, 80% oder mehr ist noch mehr bevorzugt. Das Öl kann weiterhin freie Fettsäuren, vorzugsweise die oben angesprochenen PUFA und LCPUFA, enthalten. Zur Analyse lässt sich der Fettsäuregehalt z. B. nach der Umwandlung der Fettsäuren durch Umesterung in die Methylester mittels GC-Analyse bestimmen. Der Gehalt der verschiedenen Fettsäuren im Öl bzw. Fett kann schwanken, insbesondere in Abhängigkeit von der Quelle. Das Öl sollte jedoch eine nicht natürlich vorkommende Zusammensetzung hinsichtlich der Zusammensetzung und des Gehalts an PUFA und/oder LCPUFA aufweisen. Es versteht sich, dass eines solche einzigartige Ölzusammensetzung und das einzigartige Veresterungsmuster von PUFA und LCPUFA in den Triglyceriden des Öls nur durch Anwendung der oben beschriebenen Methoden der vorliegenden Erfindung erhältlich sein soll. Außerdem kann das erfindungsgemäße Öl andere molekulare Spezies enthalten. Es kann speziell geringfügige Verunreinigungen des erfindungsgemäßen Polynukleotids oder Vektors enthalten. Solche Verunreinigungen sind jedoch nur durch hochempfindliche Techniken wie PCR nachweisbar.
Der Inhalt aller in dieser Anmeldung zitierten Literaturstellen wird hiermit durch Verweis im Allgemeinen und bezüglich ihres oben angesprochenen speziellen Offenbarungsinhalts Bestandteil der vorliegenden Anmeldung.
FIGUREN
1 zeigt eine schematische Darstellung der verschiedenen enzymatischen Aktivitäten, die zur Produktion von ARA, EPA und DHA führen.
2 zeigt ein Hefe-Expressionsexperiment, bei dem 22:5n-3 in Gegenwart (A) und Abwesenheit (B) von d4Des(Eh) zugegeben wird.
3 zeigt ein Hefe-Expressionsexperiment, bei dem 20:3n-3 in Gegenwart (A) und Abwesenheit (B) von d8Des(Eh) zugegeben wird.
4 zeigt ein Hefe-Expressionsexperiment, bei dem 18:3n-3 in Gegenwart (A) und Abwesenheit (B) von d9Elo(Eh) zugegeben wird.
5 zeigt ein Hefe-Expressionsexperiment, bei dem 18:3n-6 (GLA) und 18:4n-3 (SDA) in Gegenwart (A) und Abwesenheit (B) von d5Elo(Eh) zugegeben werden.
6 zeigt ein Hefe-Expressionsexperiment, bei dem 20:4n-6 (ARA) und 20:5n-3 (EPA) in Gegenwart (A) und Abwesenheit (B) von d5Elo(Eh) zugegeben werden.
7 zeigt die Expression von d9Elo(Eh) in Samen von zwei Arabidopsis-Ereignissen. Als Kontrolle sind Samen, die kein d9Elo(Eh) exprimieren, gezeigt (WT).
8 zeigt die Acyl-CoA-Analyse reifer Arabidopsis-Samen aus den beiden d9Elo(Eh) exprimierenden Ereignissen im Vergleich zu Samen, die kein d9Elo(Eh) exprimieren (Col0).
9 zeigt die Expression von d9Elo(Eh), d8Des(Eh) und d5Des(Eh) in Samen verschiedener Arabidopsis-Ereignisse.
10 zeigt die gaschromatographische Analyse reifer Arabidopsis-Samen, die mit dem Konstrukt OstELO5EmD4 transformiert wurden. Die Peaks wurden quantifiziert und in der Tabelle unten aufgeführt. Die Produkte der d5Elo(Ot)- und d4Des(Eh)-Aktivität sind 22:6n-3 (DHA).
11 ist ein Vergleich zwischen zwei d4-Desaturasen (Tc und Eh), aus dem hervorgeht, dass sich d4Des(Eh) von bekannten d4-Desaturasen dahingehend unterscheidet, dass es ein hohes DHA:DPA-Verhältnis produziert.
12 zeigt die Expression von d5Elo(Eh) in Samen verschiedener Arabidopsis-Ereignisse.
13 ist ein Vergleich zwischen drei verschiedenen d6-Desaturasen und der Substratspezifität von d5Des(Eh).
Diese Erfindung wird durch die folgenden Beispiele, welche nicht als einschränkend ausgelegt werden sollten, weiter veranschaulicht. Der Inhalt aller in dieser Anmeldung zitierten Literaturstellen, Patente und veröffentlichten Patentanmeldungen, sowie die Figuren, werden durch Verweis Bestandteil der vorliegenden Anmeldung.
BEISPIELE
Beispiel 1: Organismus und Kulturbedingungen
Emiliana huxleyi wurde wie in Sciandra et al. (2003) Marine Ecology Progress Series 261: 111–122 beschrieben unter den folgenden Bedingungen kultiviert: Kultivierung in 50 ml in konischen Kolben mit K/2-Medium (Keller et al. (1987) Journal of Phycology 23: 633–638). Die Kolben wurden bei einer Temperatur von 17 ± 0,1°C unter 14L:10D-Bestrahlung in eine Kulturkammer gegeben. Das Licht stammte von Fluoreszenzlampen mit einer Photonenflussdichte (400 bis 700 nm) von 170 μmol Photon m-2 s-1.
Beispiel 2: Klonieren neuer Desaturase- und Elongasesequenzen
RNA aus Zellen, die wie in Beispiel 1 beschriebenen kultiviert worden waren, wurden unter Verwendung des RNA-Extraktionskits von Qiagen extrahiert, und mit dem RACE-Kit von Clontech wurde eine RACE-Bibliothek erstellt. Aus der RACE-Bibliothek wurden Sequenzen für Desaturasen und Elongasen mittels PCR amplifiziert, wobei die folgenden Primerpaare und PCR-Bedingungen zur Anwendung kamen.
PCR-Reaktion (50 μl):

5,00 μl Matrize cDNA
5,00 μl 10 × Puffer (Advantage-Polymerase) + 25 mM MgCl₂
5,00 μl 2 mM dNTP
1,25 μl je Primer (10 pmol/μl)
0,50 μl Advantage-Polymerase

Es wurde die Advantage-Polymerasemischung von Clontech verwendet.
Reaktionsbedingungen für die PCR:

Annealing: 1 min 55°C
Denaturieren: 1 min 94°C
Elongation: 2 min 72°C
Zyklen: 35

Bei der PCR verwendete Primerpaare:
Die PCR-Reaktionen lieferten die folgenden Polynukleotidsequenzen:

Gen Aktivität Länge in bp SEQ ID NR.

D4Des(Eh) D4-Desaturase 1280 5

D8Des(Eh) D8-Desaturase 1256 1

D9Elo(Eh) D9-Elongase 804 3

D5ElO(Eh) Multi-Elongase 921 7
Eine Liste identifizierter vollständiger Codierungssequenzen ist in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1: Liste vollständiger Codierungssequenzen und abgeleitete Aminosäuresequenzen

SEQ ID NR: Gen Codierungssequenz in bp Aminosäuresequenz

1 D8Des(Eh) 1254 417

3 D9Elo(Eh) 801 266

5 D4Des(Eh) 1278 425

7 D5Elo(Eh) 918 305
Wie in Tabelle 1 gezeigte offene Leserahmen wurden gemäß den Reaktionsbedingungen des Herstellers in den pESC(Leu)-Vektor von Stratagene kloniert. Die Reaktionen wurden in E. coli DH5α transformiert, und die Plasmid-DNA wurde isoliert. Die Plasmide pESC-d4Des(Eh), pESC-d8Des(Eh), pESC-d9Elo(Eh), pESC-d5Elo(Eh) wurden dann für die Hefetransformation verwendet.
Beispiel 3: Hefetransformation und Wachstumsbedingungen
Der S. cerevisiae-Stamm INVSC von Invitrogen wurde mit den Konstrukten pESC-d4Des(Eh), pESC-d8Des(Eh), pESC-d9Elo(Eh), pESC-d5Elo(Eh) und pESC transformiert, wobei das S. C. EasyComp Transformation Kit (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornien, USA) mit Selektion auf Leucinmangelmedium zur Anwendung kam.
Die Hefen wurden nach der Transformation in vollständigem Medium mit allen Aminosäuren und Nukleotiden kultiviert. Die Hefen wurden dann auf verschiedenen Medien plattiert, die entweder das vollständige Medium (SD) oder das vollständige Medium ohne Leucin (SD-Leu) enthielten. Nur Hefen mit pESC-d4Des(Eh)-, pESC-d8Des(Eh)-, pESC-d9Elo(Eh)-, pESC-d5Elo(Eh)- oder pESC-Vektor können auf diesem Medium wachsen.
Beispiel 4: Funktionelle Expression von Desaturasen und Elongasen in Hefe und gaschromatographische Analyse.
Hefezellen, die die jeweiligen, wie oben hergestellten pESC-Plasmide enthalten, wurden 12 h in flüssigem DOB-U-Medium bei 28°C, 200 U/min und dann weitere 12 h in Induktionsmedium (DOB-U + 2% (w/v) Galactose + 2% (w/v) Raffinose) inkubiert. Dem Induktionsmedium wurden 250 μM der jeweiligen Fettsäuren zugesetzt, um die Enzymaktivität und -spezifität zu prüfen.
Die Hefezellen wurden wie folgt analysiert:
Hefezellen aus dem Induktionsmedium wurden durch Zentrifugieren (100 × g, 5 min, 20°C) geerntet und zum Entfernen verbliebener Fettsäuren mit 100 mM NaHCO₃, pH 8,0 gewaschen. Aus dem Hefepellet erhielt man durch Zugabe von 2 ml 1 N methanolischer Schwefelsäure und 2% (v/v) Dimethoxypropan für 1 h bei 80°C einen Gesamtextrakt der Fettsäuremethylester (FAME). Die FAME wurden zweimal mit Petrolether (PE) extrahiert. Nicht derivatisierte Fettsäuren wurden durch Waschen mit 2 ml 100 mM NaHCO₃, pH 8,0 und 2 ml destilliertem Wasser entfernt. Die PE-Phasen wurden mit Na₂SO₄ getrocknet und mit 100 μl PE eluiert. Die Proben wurden dann auf einer DB-23-Säule (30 m, 0,25 mm, 0,25 μm, Agilent) in einem Hewlett-Packard 6850-Gerät mit FID getrennt, wobei die folgenden Bedingungen angewendet wurden: Ofentemperatur 50°C bis 250°C mit einer Rate von 5°C/min und schließlich 10 min bei 250°C.
Die Identifikation der Fettsäuren erfolgte über die Retentionszeiten bekannter Fettsäure-standards (Sigma). Die Methode ist z. B. in Napier und Michaelson, 2001, Lipids. 36(8): 761–766; Sayanova et al., 2001, Journal of Experimental Botany. 52(360): 1581–1585, Sperling et al., 2001, Arch. Biochem. Biophys. 388(2): 293–298 und Michaelson et al., 1998, FEBS Letters. 439(3): 215–218 beschrieben.
Beispiel 5: Funktionelle Charakterisierung von d4Des(Eh).
Wie oben beschrieben wurde d4Des(Eh) funktionell in Hefe charakterisiert. Das Ergebnis der Analyse ist in 2 gezeigt. Mit pESC-d4Des(Eh) transformierte Hefe wurde mit mit pESC transformierter Hefe (Kontrolle) verglichen, während die Hefezellen mit der Fettsäure DPA 22:5n-3 gefüttert wurden. Auf der Grundlage dieses Vergleichs zeigt pESC-d4Des(Eh) d4-Desaturase-Aktivität, da sich in der Kontrolle keine 22:6 findet. d4Des(Eh) ist also eine funktionelle d4-Desaturase.
Beispiel 6: Funktionelle Charakterisierung von d8Des(Eh).
Wie oben beschrieben wurde d8Des(Eh) funktionell in Hefe charakterisiert. Das Ergebnis der Analyse ist in 3 gezeigt. Mit pESC-d8Des(Eh) transformierte Hefe wurde mit mit pESC transformierter Hefe (Kontrolle) verglichen, während mit der Fettsäure 20:3n-3 gefüttert wurde. Auf der Grundlage dieses Vergleichs wurde im Vergleich zur Kontrolle eine neue Fettsäure gebildet, bei der es sich um 20:4n-3 handelt. Die Bildung dieser Fettsäure beweist, dass d8Des(Eh) funktionell exprimiert wurde und d8-Desaturase-Aktivität hat. Die Umwandlungrate von 20:3n-3 zu 20:4n-3 betrug 5%.
Beispiel 7: Funktionelle Charakterisierung von d9Elo(Eh).
Wie oben beschrieben wurde d9Elo(Eh) funktionell in Hefe charakterisiert. Das Ergebnis der Analyse ist in 4 gezeigt. Mit pESC-d9Elo(Eh) transformierte Hefe wurde mit mit pESC transformierter Hefe (Kontrolle) verglichen, während mit der Fettsäure 18:3n-3 (ALA) oder 18:2 (LA) gefüttert wurde. Auf der Grundlage dieses Vergleichs wurde im Vergleich zur Kontrolle eine neue Fettsäure gebildet, bei der es sich um 20:3n-3 beziehungsweise 20:2n-6 handelt. Die Bildung dieser Fettsäuren beweist, dass d9Elo(Eh) funktionell exprimiert wurde und d9-Elongase-Aktivität hat. Die Umwandlungrate von 18:3n-3 zu 20:3n-3 betrug 17%, die Umwandlungrate von 18:2n-6 zu 20:2n-6 betrug 49%.
Beispiel 8: Funktionelle Charakterisierung von d5Elo(Eh).
Wie oben beschrieben wurde d5Elo(Eh) funktionell in Hefe charakterisiert. Das Ergebnis der Analyse ist in 5 und 6 gezeigt. Mit pESC-d5Elo(Eh) transformierte Hefe wurde mit mit pESC transformierter Hefe (Kontrolle) verglichen, während mit den Fettsäuren 18:3n-6 (GLA), 18:4 (SDA) beziehungsweise 20:4n-6 (ARA), 20:5n-3 (EPA) gefüttert wurde. Auf der Grundlage dieses Vergleichs wurde im Vergleich zur Kontrolle die Bildung neuer Fettsäuren beobachtet, bei denen es sich um 20:3n-6 oder 20:4n-3 handelte, wenn mit GLA bzw. SDA gefüttert wurde, und 22:4n-6 oder 22:5n-3 handelte, wenn mit ARA bzw. EPA gefüttert wurde. Die Bildung dieser Fettsäuren beweist, dass d5Elo(Eh) funktionell exprimiert wurde und d5-Elongase-Aktivität hat. Die Umwandlungrate von GLA betrug 13%, die Umwandlungrate von 18:4n-3 betrug 30%, die Umwandlungrate von ARA betrug 38% und die Umwandlungrate von EPA betrug 30%. Überraschenderweise verwendete die Elongase eine Vielzahl verschiedener Substrate für die Elongation. Die Beschreibung deutet auf eine multifunktionelle Elongaseaktivität mit höheren Spezifitäten für Omega-3-Fettsäuren hin.
Beispiel 9: Expression neuer Elongasen aus Emiliana huxleyi in Pflanzen.

Die neuen Desaturasen und Elongasen wurden wie in WO2003/093482 , WO2005/083093 oder WO2007/093776 beschrieben in einen Pflanzentransformationsvektor kloniert. Beispielhafte geeignete Genkombinationen sind in Tabelle 2, 3 und 4 beschrieben. Tabelle 2: Genkombinationen für die Herstellung von ARA.

Gen	Aktivität	SEQ ID NR:
D6Des(Ot)	Δ6-Desaturase	19
D6Elo(Pp)	Δ6-Elongase	21
D5Des(Eh)	Δ5-Desaturase	9
D12Des(Ps)	Δ12-Desaturase	23
D6Elo(Tp)	Δ6-Elongase	25
D8Des(Eh)	Δ8-Desaturase	1
D9Elo(Eh)	Δ9-Elongase	3

Tabelle 3: Genkombinationen für die Herstellung von EPA.

Gen	Aktivität	SEQ ID NR:
D6Des(Ot)	Δ6-Desaturase	19
D5Elo(Eh)	Δ5-Elongase	7
D5Des(Eh)	Δ5-Desaturase	9
D12Des(Ps)	Δ12-Desaturase	23
D6Elo(Tp)	Δ6-Elongase	25
o3-Des(Pi)	Omega-3-Desaturase	27
D15Des(Cp)	Δ15-Desaturase	29
D8Des(Eh)	Δ8-Desaturase	1
D9Elo(Eh)	Δ9-Elongase	3

Tabelle 4: Genkombinationen für die Herstellung von DHA.

Gen	Aktivität	SEQ ID NR:
D6Des(Ot)	Δ6-Desaturase	19
D5Elo(Eh)	Δ5-Elongase	7
D5Des(Eh)	Δ5-Desaturase	9
D12Des(Ps)	Δ12-Desaturase	23
D6Elo(Tp)	Δ6-Elongase	25
ω3-Des (Pi)	Omega-3-Desaturase	27
D15Des(Cp)	Δ15-Desaturase	29
D5Elo(Ot)	Δ5-Elongase	31
D4Des(Eh)	Δ4-Desaturase	5
D8Des(Eh)	Δ8-Desaturase	1
D9Elo(Eh)	Δ9-Elongase	3

Ausgehend von den in Tabelle 2, Tabelle 3 oder Tabelle 4 beschriebenen Genkombinationen wurden die folgenden Kombinationen entwickelt

• AP2: LuCnl-dSDes(Eh)_LuCnl-d8Des8Eh)_Napin-o3Des(Pi)_Napin-d12Des(Ps)_LuCnl-d9Elo(Eh)
• OstELO5EmD4: VfUSP-d6Elo(Pp)_LuCnl-d5Des8Tc)_VfSBP-d6Des(Ot)_Napin-o3Des(Pi)_Napin-d12Des(Ps)_LuCnl-d5Elo(Ot)_LuCnl-d4Des(Eh)
• OstELO5TcD4: VfUSP-d6Elo(Pp)_LuCnl-d5Des8Tc)_VfSBP-d6Des(Ot)_Napin-o3Des(Pe)_Napin-d12Des(Ps)_LuCnl-d5Elo(Ot)_LuCnl-d4Des(Tc)

Transgene Rapslinien wurden wie in Deblaere et al, 1984, Nucl. Acids. Res. 13, 4777–4788 beschrieben erzeugt, und Samen transgener Rapspflanzen werden wie in Qiu et al. 2001, J. Biol. Chem. 276, 31561–31566 beschrieben analysiert.
Transgene Arabidopsis-Pflanzen wurden wie in Bechtholdt et al. 1993 C.R. Acad. Sci. Ser. III Sci. Vie., 316, 1194–1199 beschrieben erzeugt. Samen transgener Arabidopsis-Pflanzen, die d9Elo(Eh) unter der Kontrolle des samenspezifischen Promotors Glycinin aus Sojabohnen exprimieren (Lelievre et al. (1992) Plant Physiol 98: 387–391), wurden durch Gaschromatographie analysiert (7). Im Vergleich zu nicht transgenen Kontrollpflanzen (WT) gibt es Änderungen im Fettsäureprofil, was beweist, das d9Elo(Eh) in Samen funktionell exprimiert wurde. Die Hauptveränderungen beim Fettsäureprofil sind auf eine 10fache Erhöhung bei der Fettsäure 20:2n-6 und 20:3n-3 gerichtet (7). d9Elo(Eh) zeigt also eine Δ9-Elongase-Aktivität, was mit der Hefecharakterisierung übereinstimmt. Weiterhin sind die Konzentrationen an 18:2 und ALA in den d9Elo(Eh) exprimierenden transgenen Ereignissen im Vergleich zu WT abgesenkt, da diese Fettsäuren direkte Substrate für d9Elo(Eh) sind. Weiterhin ist das endogene Elongationssystem in der Pflanze unverändert, de die Konzentrationen von 20:1 und 22:1 bei den d9Elo(Eh) exprimierenden Pflanzen und der WT-Kontrolle ähnlich sind. Dies weist darauf hin, dass die Expression von d9Elo(Eh) den endogenen Elongationsprozess nicht stört, sondern für zusätzliche Aktivität sorgt.
Um die Aktivität von in Samen von Arabidopsis thaliana exprimiertem d9Elo(Eh) weiter zu belegen, wurden AcylCoA-Messungen vorgenommen. Substrate und Produkte der d9Elo(Eh)-Elongationsreaktion sind AcylCoA-Ester, die dann weiter in Triacylglyceride (Öl) eingebaut werden. Die Analyse des AcylCoA-Pools zeigt die Bildung und den Verlauf der Elongationsreaktion.
In 8 sind die AcylCoA-Messungen für ein d9Elo(Eh)-exprimierendes Arabidopsis-Ereignis im Vergleich zu Kontrollen, die kein d9Elo(Eh) exprimieren (Col0), zusammengefasst. Die Veränderung im Chromatogramm ist durch ein Sternchen markiert. An dieser Stelle wird eine enorme Menge an 20:2n-6 nachgewiesen, die in der Kontrolle sehr viel geringer ist. Die Bedingungen für die Abtrennung der Fettsäure-CoA-Ester erlaubt nicht den Nachweis von 20:3n-3, da dieser CoA-Ester nicht von 18:3CoA getrennt wird. Das enorme Vorkommen von 20:2n-6-CoA belegt die Expression von d9Elo(Eh), da dies das direkte Produkt seiner enzymatischen Aktivität ist.
Weiterhin wurden transgene Arabidopsis-Linien erzeugt, um die Aktivität von d8Des(Eh) und d5Des(Eh) zu validieren. Der Vektor AP2 wurde nach molekularbiologischen Standardprozeduren wie in WO2003/093482 , WO2005/083093 , WO2007/093776 oder WO2009/016202 beschrieben konstruiert und wie oben beschrieben in Arabidopsis thaliana transformiert. Die Analyse von transgenen Samen ist in 9 gezeigt. Die Produkte von d9Elo(Eh) sind 20:2 und 20:3n-3.
Weiterhin wurden transgene Arabidopsis-Linien erzeugt, um die Aktivität von d4Des(Eh) zu validieren. Das Konstrukt OstELO5EmD4 wurde wie oben beschrieben in Arabidopsis transformiert, und Samen einer Reihe einzelner Linien wurden durch Gaschromatographie analysiert (10). Die Aktivität von d4Des(Eh) zeigt sich in der Bildung von DHA 22:6 (letzte Spalte). Alle Linien produzieren DHA in Konzentrationen von bis zu 4,7%. Von besonderem Interesse ist das Verhältnis von DHA zu DPA. Überraschenderweise ist das Verhältnis von d4Des(Eh) viel höher als bei den im Stand der Technik bekannten d4-Desaturasen. Ein Vergleich mit der d4-Desaturase aus Thraustochytrium ssp. von WO2002/026946 ist in 11 gezeigt. Das Enzym aus Thraustochytrium ssp. zeigte die höchsten Konzentrationen an DHA (WO2005/083093 ), jedoch mit einem ungünstigen Verhältnis von DPA zu DHA. Ein hohes DHA:DPA-Verhältnis ist für die kommerzielle Verwendung solcher Öle wichtig.
Weiterhin wurden transgene Arabidopsis-Linien erzeugt, um die Aktivität von d5Elo(Eh) zu validieren. Das Konstrukt EmELO5TcD4 wurde wie oben beschrieben in Arabidopsis transformiert, und Samen einer Reihe einzelner Linien wurden durch Gaschromatographie analysiert (12). Die Aktivität von d5Elo(Eh) zeigt sich in der Bildung von DPA 22:5 und DHA 22:6. Die meisten Linien zeigen die Produktion dieser beiden Fettsäuren, was belegt, dass d5Elo(Em) in den Samen funktionell exprimiert wird.
Weiterhin wurden transgene Arabidopsis-Linien erzeugt, um die Aktivität und Substratspezifität von d5Des(Eh) zu validieren. Zu diesem Zweck wurden zwei Δ6-Desaturasen auf der Basis ihrer unterschiedlichen Substratpezifität ausgewählt. Es steht zu erwarten, dass die Borretsch-Δ6 Phosphatidylcholin-18:2 als Substrat verwendet (WO96/21022 ), während die Ostreococcus-Δ6 (OstrΔ6) Acyl-CoA-Ester verwendet ( WO2005/012316 ). In Kombination mit der d6-Elongase aus Physcomitrella patens ( WO2001/059128 ) produzieren beide d6-Desaturasen DGLA beziehungsweise 20:4n-3. Das Verhältnis von ARA zu EPA beträgt für Borretsch-Δ6 2,9, für OstrΔ6 2,3. Es sei angemerkt, dass die Verwendung von OstrΔ6 im Vergleich zur Borretsch-Δ6 zu 3- bis 4-fach höheren Konzentrationen an Produkten führt. Die weitere Kombination mit d5Des(Eh) führte zur Produktion von ARA und EPA, was die Funktionalität von d5Des(Eh) beweist. Die durch d5Des(Eh) bewirkte Umwandlung von DGLA in ARA beträgt 29% (Borretsch-Δ6) bzw. 47% (OstrΔ6). Bei der Umwandlung von 20:4n-3 in EPA ist dies 33% (Borretsch-Δ6) bzw. 26% (OstrΔ6).
Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wird die Schlussfolgerung gezogen, dass d5Des(Eh) bei Acyl-CoA-Substraten spezifisch für die Omega-6-Fettsäure DGLA ist. Hierbei handelt es sich um eine neue Substratspezifität, die man bei den d5-Desaturasen aus dem Stand der Technik nicht beobachtet.
Literaturstellen

Arondel, V., Lemieux, B., Hwang,I., Gibson, S., Goodman, H.M. und Somerville, C.R. (1992). Map-based cloning of a gene controlling omega-3 fatty acid desaturation in Arabidopsis. Science 258, 1353–1355.
Broadwater, J.A., Whittle, E. und Shanklin, J. (2002). Desaturation und hydroxylation. Residues 148 and 324 of Arabidopsis FAD2, in addition to substrate chain length, exert a major influence in partitioning of catalytic specificity. J. Biol. Chem. 277, 15613–15620.
Broun, P., Shanklin, J., Whittle, E. und Somerville, C. (1998b). Catalytic plasticity of fatty acid modification enzymes underlying chemical diversity of plant lipids. Science 282, 1315–1317.
Calvo, A.M., Gardner, H.W. und Keller, N.P. (2001). Genetic connection between fatty acid metabolism and sporulation in Aspergillus nidulans. J. Biol. Chem. 276, 25766–25774.
Knutzon, D.S., Thurmond, J.M., Huang, Y.S., Chaudhary, S., Bobik, E.G., Jr., Chan, G.M., Kirchner, S.J. und Mukerji, P. (1998). Identification of Delta5-dehydratase from Mortierella alpina by heterologous expression in Bakers' yeast and canola. J. Biol. Chem. 273, 29360–29366.
Mantle, P.G. und Nisbet, L.J. (1976). Differentiation of Claviceps purpurea in axenic culture. J. Gen. Microbiol. 93, 321–334.
Mey, G., Oeser, B., Lebrun, M.H. und Tudzynski, P. (2002). The biotrophic, non-appressorium-forming grass pathogen Claviceps purpurea needs a Fus3/Pmk1 homologous mitogen-activated protein kinase for colonization of rye ovarian tissue. Mol. Plant Microbe Interact. 15, 303–312.
Okuley, J., Lightner, J., Feldmann, K., Yadav, N., Lark, E. und Browse, J. (1994). Arabidopsis FAD2 gene encodes the enzyme that is essential for polyunsaturated lipid synthesis. Plant Cell 6, 147–158.
Qi, B., Fraser, T., Mugford, S., Dobson, G., Sayanova, O., Butler, J., Napier, J.A., Stobart, A.K. und Lazarus, C.M. (2004). Production of very long chain polyunsaturated omega-3 and omega-6 fatty acids in plants. Nat. Biotechnol. 22, 739–745.
Qiu, X., Hong, H. und McKenzie, SL. (2001) Identification of a Delta 4 fatty acid desaturase from Thraustochytrium sp. involved in the biosynthesis of docosahexanoic acid by heterologous expression in Saccharomyces cerevisiae and Brassica juncea. J Biol Chem 276, 31561–6.
Shanklin, J. und Cahoon, E.B. (1998). DESATURATION AND RELATED MODIFICATIONS OF FATTY ACIDS1. Annu. Rev. Plant Physiol Plant Mol. Biol. 49, 611–641.
Tudzynski, P., Correia, T. und Keller, U. (2001). Biotechnology and genetics of ergot alkaloids. Appl. Microbiol. Biotechnol. 57, 593–605.

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Zitierte Patentliteratur

EP 0388186 A1 [0025]
EP 0335528 A1 [0025]
WO 93/21334 [0025]
EP 0249676 A1 [0025]
US 5608152 [0025, 0033]
WO 98/45461 [0025, 0033]
US 5504200 [0025, 0033]
WO 91/13980 [0025, 0033]
WO 95/15389 [0025, 0033]
WO 95/23230 [0025, 0033]
WO 99/16890 [0025, 0033]
US 5352605 [0033]
WO 84/02913 [0033]
US 4962028 [0033]
WO 95119443 [0033]
US 5187267 [0033]
WO 96/12814 [0033]
EP 0375091 A [0033]
WO 95/16783 [0033]
WO 97/06250 [0033]
WO 99/46394 [0033]
US 2003-0159174 [0035]
WO 2007042510 [0041]
WO 2008006202 [0041]
WO 2009016202 [0041]
WO 200185968 [0041]
WO 2008040787 [0041, 0041]
WO 2006100241 [0041, 0041]
WO 2006069710 [0041]
WO 2004090123 [0041]
WO 2002026946 [0041]
WO 2004057001 [0041]
WO 2002057465 [0041]
WO 2000075341 [0041]
WO 2003072784 [0041]
WO 200102591 [0041]
EP 1790731 [0041]
WO 200034439 [0041]
WO 2007093776 [0041, 0041]
WO 2005083053 [0041]
WO 2008022963 [0041]
WO 2005012316 [0041]
WO 2003064638 [0041]
WO 2009016208 [0041]
WO 2002077213 [0041]
WO 2003/093482 [0093, 0099]
WO 2005/083093 [0093, 0099, 0100]
WO 2007/093776 [0093, 0099]
WO 2009/016202 [0099]
WO 2002/026946 [0100]
WO 96/21022 [0102]
WO 2005/012316 [0102]
WO 2001/059128 [0102]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Sperling et al., 2003 [0003]
Crawford, M.A., et al., (1997) Am. J. Clin. Nutr. 66: 1032S–1041S [0004]
Giusto, N.M., et al. (2000) Prog. Lipid Res. 39: 315–391 [0004]
Martinetz, M. (1992) J. Pediatr. 120: S129–S138 [0004]
Giusto, N.M., et al. (2000) Prog. Lipid Res. 39: 315–391 [0004]
Horrocks, L.A. und Yeo, Y.K. (1999) Pharmacol. Res. 40: 211–215 [0004]
Spector, A.A. (1999) Lipids 34: S1–S3 [0004]
Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1–6.3.6 [0015]
Sambrook et al., „Molecular Cloning”, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989 [0015]
Harnes und Higgins (Hrsg.) 1985, „Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach”, IRL Press at Oxford University Press, Oxford [0015]
Brown (Hrsg.) 1991, „Essential Molecular Biology: A Practical Approach”, IRL Press at Oxford University Press, Oxford [0015]
Needleman 1970, J. Mol. Biol. (48): 444–453 [0015]
EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice, P., Longden, I. und Bleasby, A, Trends in Genetics 16(6), 276–277, 2000 [0015]
EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice, P., Longden, I., und Bleasby, A., Trends in Genetics 16(6), 276–277, 2000 [0015]
Altschul 1990, J. Mol. Biol. 215: 403–10 [0015]
Altschul 1997, Nucleic Acids Res. 25(17): 3389–3402 [0016]
Franck 1980, Cell 21: 285–294 [0025]
Ward 1993, Plant. Mol. Biol. 22 [0025]
Gatz 1992, Plant J. 2: 397–404 [0025]
Stockhaus 1989, EMBO J. 8, 2445 [0025]
Baeumlein et al., Plant J., 2, 2, 1992: 233–239 [0025]
Loke 2005, Plant Physiol 138, S. 1457–1468 [0028]
Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA, 1989 [0030]
Methods in Molecular Biology, 1995, Band 44, Agrobacterium protocols, Hrsg.: Gartland und Davey, Humana Press, Totowa, New Jersey, USA [0030]
Hellens et al., Trends in Plant Science (2000) 5, 446–451 [0031]
Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press, Boca Raton, Florida, USA), Kapitel 6/7, S. 71–119 (1993) [0031]
F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg.: Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, 15–38 [0031]
B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg.: Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128–143 [0031]
Potrykus 1991, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42, 205–225 [0031]
Smith 1988, Gene 67: 31–40 [0032]
Amann 1988, Gene 69: 301–315 [0032]
Studier 1990, Methods in Enzymology 185, 60–89 [0032]
Baldari 1987, Embo J. 6: 229–234 [0032]
Kurjan 1982, Cell 30: 933–943 [0032]
Schultz 1987, Gene 54: 113–123 [0032]
van den Handel, C.A.M.J.J., & Punt, P.J. (1991) ”Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi” [0032]
Applied Molecular Genetics of Fungi, J.F. Peberdy et al., Hrsg., S. 1–28, Cambridge University Press: Cambridge [0032]
More Gene Manipulations in Fungi (J.W. Bennett & L.L. Lasure, Hrsg., S. 396–428: Academic Press: San Diego [0032]
Smith 1983, Mol. Cell Biol. 3: 2156–2165 [0032]
Lucklow 1989, Virology 170: 31–39 [0032]
Falciatore 1999, Marine Biotechnology 1 (3): 239–251 [0033]
Becker 1992, Plant Mol. Biol. 20: 1195–1197 [0033]
Bevan 1984, Nucl. Acids Res. 12: 8711–8721 [0033]
Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg.: Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15–38 [0033]
Gielen 1984, EMBO J. 3, 835 [0033]
Gallie 1987, Nucl. Acids Research 15: 8693–8711 [0033]
Benfey 1989, EMBO J. 8: 2195–2202 [0033]
Franck 1980, Cell 21: 285–294 [0033]
Kermode 1996, Crit. Rev. Plant Sci. 15, 4: 285–423 [0033]
Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48:89–108 [0033]
Gatz 1992, Plant J. 2, 397–404 [0033]
Ward 1993, Plant Mol. Biol. 22: 361–366 [0033]
Baeumlein 1991, Mol. Gen. Genet. 225 (3): 459–67 [0033]
Baeumlein 1992, Plant Journal, 2 (2):233–9 [0033]
Cloning Vectors (Hrsg.: Pouwels, P.H., et al., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018) [0034]
Mann 2003, Nat. Biotechnol. 21, 255–261 [0046]
Huber 2004, Curr. Opin. Plant Biol. 7, 318–322 [0046]
Harlow und Lane ”Antibodies, A Laboratory Manual”, CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988 [0048]
Köhler 1975, Nature 256, 495 [0048]
Galfré 1981, Meth. Enzymol. 73, 3 [0048]
„Manual of Methods for General Bacteriology” der American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981) [0059]
Sciandra et al. (2003) Marine Ecology Progress Series 261: 111–122 [0078]
Keller et al. (1987) Journal of Phycology 23: 633–638 [0078]
Napier und Michaelson, 2001, Lipids. 36(8): 761–766 [0088]
Sayanova et al., 2001, Journal of Experimental Botany. 52(360): 1581–1585 [0088]
Sperling et al., 2001, Arch. Biochem. Biophys. 388(2): 293–298 [0088]
Michaelson et al., 1998, FEBS Letters. 439(3): 215–218 [0088]
Deblaere et al, 1984, Nucl. Acids. Res. 13, 4777–4788 [0095]
Qiu et al. 2001, J. Biol. Chem. 276, 31561–31566 [0095]
Bechtholdt et al. 1993 C.R. Acad. Sci. Ser. III Sci. Vie., 316, 1194–1199 [0096]
Lelievre et al. (1992) Plant Physiol 98: 387–391 [0096]

Claims

Polynukleotid, welches eine Nukleinsäuresequenz ausgewählt aus der folgenden Gruppe umfasst: a) eine Nukleinsäuresequenz mit einer in SEQ ID NR: 1, 3, 5, 7 oder 9 gezeigten Nukleotidsequenz; b) eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid mit einer wie in SEQ ID NR: 2, 4, 6, 8 oder 10 gezeigten Aminosäuresequenz codiert; c) eine Nukleinsäuresequenz mit wenigstens 70% Identität zur Nukleinsäuresequenz von a) oder b), wobei die Nukleinsäuresequenz für ein Polypeptid mit Desaturase- oder Elongaseaktivität codiert; d) eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid mit Desaturase- oder Elongaseaktivität codiert und eine Aminosäuresequenz aufweist, die zu mindestens 82% mit einer der Aminosäuresequenzen von a) bis c) identisch ist; und e) eine Nukleinsäuresequenz, die dazu in der Lage ist, unter stringenten Bedingungen mit einer der Sequenzen von a) bis d) zu hybridisieren, wobei diese Nukleinsäuresequenz für ein Polypeptid mit Desaturase- oder Elongaseaktivität codiert.
Polynukleotid nach Anspruch 1, wobei dieses Polynukleotid weiterhin eine funktionell mit der Nukleinsäuresequenz verbundene Expressionssteuerungsequenz umfasst.
Polynukleotid nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Polynukleotid weiterhin eine funktionell mit der Nukleinsäuresequenz verbundene Terminatorsequenz umfasst.
Vektor, umfassend das Polynukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 3.
Wirtszelle, umfassend das Polynukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder den Vektor nach Anspruch 4.
Verfahren zur Herstellung eines durch ein Polynukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 codierten Polypeptids, bei dem man a) die Wirtszelle nach Anspruch 5 unter Bedingungen kultiviert, die die Herstellung des Polypeptids erlauben; und b) das Polypeptid aus der Wirtszelle von Schritt a) gewinnt.
Polypeptid, codiert durch das Polynukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder erhältlich durch das Verfahren nach Anspruch 6.
Nicht menschlicher, transgener Organismus, umfassend das Polynukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder den Vektor nach Anspruch 4.
Nicht menschlicher, transgener Organismus nach Anspruch 8, bei dem es sich um eine Pflanze, einen Teil einer Pflanze oder Pflanzensamen handelt.
Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren, bei dem man: a) die Wirtszelle nach Anspruch 5 unter Bedingungen kultiviert, die die Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren in dieser Wirtszelle erlauben; und b) die mehrfach ungesättigten Fettsäuren aus dieser Wirtszelle gewinnt.
Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren, bei dem man: a) den nicht menschlichen, transgenen Organismus nach Anspruch 8 oder 9 unter Bedingungen kultiviert, die die Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren in diesem nicht menschlichen, transgenen Organismus erlauben; und b) die mehrfach ungesättigten Fettsäuren aus diesem nicht menschlichen, transgenen Organismus gewinnt.
Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, wobei es sich bei der mehrfach ungesättigten Fettsäure um Arachidonsäure (ARA), Eicosapentaensäure (EPA) oder Docosahexaensäure (DHA) handelt.
Verfahren zur Herstellung einer Öl-, Lipid- oder Fettsäurezusammensetzung, welches die Schritte des Verfahrens nach einem der Ansprüche 10 bis 12 und den weiteren Schritt der Formulierung der mehrfach ungesättigten Fettsäure als Öl-, Lipid- oder Fettsäurezusammensetzung umfasst.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Öl-, Lipid- oder Fettsäurezusammensetzung für Futter, Nahrungsmittel, Kosmetika oder Medikamente verwendet wird.
Antikörper oder Fragment davon, welcher bzw. welches spezifisch das Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 erkennt.