WO2005083053A2 - Verfahren zur herstellung von ungesättigten omega-3-fettsäuren in transgenen organismen - Google Patents

Verfahren zur herstellung von ungesättigten omega-3-fettsäuren in transgenen organismen Download PDF

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WO2005083053A2
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fatty acid
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Petra Cirpus
Jörg BAUER
Thorsten Zank
Ernst Heinz
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Basf Plant Science Gmbh
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Definitions

  • the present invention relates to a process for the preparation of unsaturated ⁇ -3 fatty acids and to a process for the preparation of triglycerides having an increased content of unsaturated fatty acids, especially of ⁇ -3 fatty acids having more than three double bonds.
  • the invention relates to the production of a transgenic organism preferably a transgenic plant or a transgenic microorganism with an increased content of unsaturated ⁇ -3 fatty acids, oils or lipids with ⁇ -3 double bonds due to the expression of a fungi of the family Pythiaceae ⁇ -3-desaturase such as the genus Phytophtora, for example of the genus and species Phytophtora infestans.
  • the invention furthermore relates to the nucleic acid sequences, nucleic acid constructs, vectors and organisms containing at least one nucleic acid sequence according to the invention, at least one vector comprising the nucleic acid sequence and / or the nucleic acid constructs and transgenic organisms contain the aforementioned nucleic acid sequences, nucleic acid constructs and / or vectors.
  • Another part of the invention relates to oils, lipids and / or fatty acids prepared by the process according to the invention and their use. Moreover, the invention relates to unsaturated fatty acids and triglycerides having an increased content of unsaturated fatty acids and their use.
  • Fatty acids and triacylglycerides have a variety of uses in the food, animal nutrition, cosmetics and pharmaceutical industries. Depending on whether they are free saturated and unsaturated fatty acids or triacylglycerides with an increased content of saturated or unsaturated fatty acids, they are suitable for a wide variety of applications.
  • polyunsaturated long chain fatty acids Due to the customary composition of human food today, addition of polyunsaturated ⁇ -3 fatty acids, which are preferred in fish oils, is particularly important for food.
  • polyunsaturated fatty acids such as DHA or EPA baby food are added to increase nutritional value.
  • the unsaturated fatty acid DHA is thereby attributed a positive effect on the development and maintenance of brain functions.
  • polyunsaturated fatty acids are referred to as PUFA, PUFAs, LCPUFA or LCPUFAs (poly unsaturated fatty acids, PUFA, polyunsaturated fatty acids, long chain polyunsaturated fatty acids, LCPUFA, long chain polyunsaturated fatty acids).
  • PUFA poly unsaturated fatty acids
  • PUFA polyunsaturated fatty acids
  • LCPUFA long chain polyunsaturated fatty acids
  • the free fatty acids are advantageously prepared by saponification.
  • Common natural sources of these fatty acids are fish such as herring, salmon, sardine, perch, eel, carp, trout, halibut, mackerel, zander or tuna or algae.
  • oils with saturated or unsaturated fatty acids are preferred.
  • lipids with unsaturated fatty acids especially polyunsaturated fatty acids are preferred.
  • the polyunsaturated ⁇ -3 fatty acids are thereby attributed a positive effect on the cholesterol level in the blood and thus on the possibility of preventing heart disease.
  • inflammatory especially chronic inflammatory processes in the context of immunological diseases such as rheumatoid arthritis can be characterized by ⁇ -3
  • ⁇ -6 fatty acids such as arachidonic acid tend to have a negative effect on these diseases in these rheumatic diseases due to our usual food composition.
  • ⁇ -3- and ⁇ -6 fatty acids are precursors of tissue hormones, the so-called eicosanoids such as the prostaglandins derived from dihomo- ⁇ -linolenic acid, arachidonic acid and eicosapentaenoic acid, the thromoxanes and leukotrienes derived from arachidonic acid and Derive the eicosapentaenoic acid.
  • Eicosanoids which are formed from ⁇ -6 fatty acids usually promote inflammatory reactions
  • eicosanoids (so-called PG 3 series) of ⁇ -3 fatty acids have little or no pro-inflammatory effect. Therefore, food with a high ⁇ -3 fatty acid content is said to have a positive effect on human health. Due to their positive properties, there has been no lack of approaches in the past, genes involved in the synthesis of fatty acids or triglycerides, for to make available the production of oils in various organisms with modified unsaturated fatty acid content. Thus, WO 91/13972 and its US equivalent describe a ⁇ -9-desaturase.
  • ⁇ 6-desaturases are described in WO 93/06712, US 5,614,393, US 5614393, WO 96/21022, WO 00/21557 and WO 99/27111 and also the application for production in transgenic organisms as described in WO 98/46763 WO 98/46764, WO 9846765.
  • the expression of various desaturases as in WO 99/64616 or WO 98/46776 and formation of polyunsaturated fatty acids is described and claimed. Concerning.
  • microorganisms for the production of PUFAs are microorganisms such as microalgae such as Phaeodactylum tricornutum, Porphiridium species, Thraustochytrien species, Schizochytria species or Crypthecodinium species, ciliates such as Stylonychia or Colpidium, fungi such as Mortierella, Entomophthora or Mucor and / or mosses such as Physcomitrella, Ceratodon and Marchantia (R. Vazhappilly & F. Chen (1998) Botanica Marina 41: 553-558; K. Totani & K. Oba (1987) Lipids 22: 1060-1062; M.
  • microalgae such as Phaeodactylum tricornutum, Porphiridium species, Thraustochytrien species, Schizochytria species or Crypthecodinium species
  • ciliates such as Stylonychia or Colpidium
  • the polyunsaturated fatty acids can be classified according to their desaturation pattern into two large classes, ⁇ -6 or ⁇ -3 fatty acids, which have metabolically and functionally different activities (Figure 1).
  • the starting material for the ⁇ -6 metabolic pathway is the fatty acid linoleic acid (18: 2 ⁇ 9 '12 ), while the ⁇ -3 pathway is via linolenic acid (18: 3 ⁇ 9,12 ' 15 ).
  • Linolenic acid is formed by the activity of an ⁇ -3-desaturase (Tocher et al., 1998, Prog. Lipid Res., 37, 73-117, Domergue et al., 2002, Eur. J. Biochem., 269, 4105-4113).
  • ⁇ -3 fatty acids shows the therapeutic effect as described above in the treatment of cardiovascular diseases (Shimikawa 2001, World Rev. Nutr., Diet, 88, 100-108), inflammations (Calder 2002, Proc. Soc., 61, 345-358) and Arthridis (Cleland and James 2000, J. Rheumatol., 27, 2305-2307).
  • Another object was to develop a method for producing polyunsaturated ⁇ -3 fatty acids in an organism, preferably in a eukaryotic organism, preferably in a plant or a microorganism. This object has been achieved by the process according to the invention for the preparation of compounds of the general formula I
  • R 2 hydrogen, lyso-phosphatidylcholine, lyso-phosphatidylethanolamine, lyso-phosphatidylglycerol, lyso-diphosphatidylglycerol, lyso-phosphatidylserine, lyso-phosphatidylinositol or saturated or unsaturated C 2 -C 24 -alkylcarbonyl-,
  • R 3 hydrogen, saturated or unsaturated C 2 -C 24 -alkylcarbonyl-, or R 2 or R 3 independently of one another a radical of the general formula Ia:
  • R 1 in general formula I denotes hydroxyl, coenzyme A (thioester), lysophosphatidylcholine, lyso-phosphatidylethanolamine, lyso-phosphatidylglycerol, lyso-diphosphatidylglycerol, lyso-phosphatidylserine, lyso-phosphatidylinositol, sphingobase, or a radical of the general formula II
  • R 2 in the general formula II denotes hydrogen, lyso-phosphatidylcholine, lyso-phosphatidylethanolamine, lyso-phosphatidylglycerol, lyso-diphosphatidylglycerol, lyso-phosphatidylserine, lyso-phosphatidylinositol or saturated or unsaturated C 2 -C 24 - alkylcarbonyl, Alkyl radicals which may be substituted or unsubstituted, saturated or unsaturated C 2 -C 2 -alkylcarbonyl chains, such as ethylcarbonyl, n-propylcarbonyl, n-butylcarbonyl, n-pentylcarbonyl, n-hexylcarbonyI, n-heptylcarbonyl, n-octylcarbonyl, n-nonylcarbonyl, n-decylcarbon
  • C 0 -C 22 -alkylcarbonyl radicals such as n-decylcarbonyl, n-undecylcarbonyl, n-dodecylcarbonyl, n-tridecylcarbonyl, n-tetradecylcarbonyl, n-pentadecylcarbonyl, n-hexadecylcarbonyl, n-hepta decylcarbonyl, n-octadecylcarbonyl, n-nonadecylcarbonyl, n-eicosylcarbonyl, n-docosanylcarbonyl or n-tetracosanylcarbonyl containing one or more double bonds are preferred.
  • C ⁇ 0 -C 22 -alkylcarbonyl such as C ⁇ 0 alkylcarbonyl, Cn-alkylcarbonyl, C 12 -alkylcarbonyl, C 13 -alkylcarbonyl, C 1 alkylcarbonyl, C 16 -AlkylcarbonyI- , C 18 - alkylcarbonyl, C 20 alkylcarbonyl or C 22 alkylcarbonyl radicals which contain one or more double bonds.
  • C 16 -C 22 -alkylcarbonyl radicals such as C 16 -alkylcarbonyl, C 18 -alkylcarbonyl, C 20 -alkylcarbonyl or C 22 -alkylcarbonyl radicals, which contain one or more double bonds.
  • These advantageous radicals may contain two, three, four, five or six double bonds.
  • the particularly advantageous radicals having 18, 20 or 22 carbon atoms in the fatty acid chain contain up to six double bonds, advantageously two, three, four or five double bonds, more preferably two, three or four double bonds. All the radicals mentioned are derived from the corresponding fatty acids.
  • R 3 in the general formula II is hydrogen, saturated or unsaturated C 2 -C 24 -alkylcarbonyk
  • Alkyl radicals which may be substituted or unsubstituted, saturated or unsaturated C 2 -C 24 -alkylcarbonyl chains, such as ethylcarbonyl, n-propylcarbonyl, n-butylcarbonyl, n-pentylcarbonyl, n-hexylcarbonyl, n-heptylcarbonyl, n-octylcarbonyl, n-nonylcarbonyl, n-decylcarbonyl, n-undecylcarbonyl, n-dodecylcarbonyl, n-tridecylcarbonyl, n-tetradecylcarbonyl, n-pentadecylcarbonyl, n-hexadecylcarbonyl, n-hepta-decylcarbonyl , n-octadecylcarbonyl, n-nonadec
  • C 10 -C 22 -alkylcarbonyl radicals such as n-decylcarbonyl, n-undecylcarbonyl, n-dodecylcarbonyl, n-tridecylcarbonyl, n-tetradecylcarbonyl, n-pentadecylcarbonyl, n-hexadecylcarbonyl, n-hepta decylcarbonyl, n-octadecylcarbonyl, n-nonadecylcarbonyl, n-eicosylcarbonyl, n-docosanylcarbonyl or n-tetracosanylcarbonyl containing one or more double bonds are preferred.
  • saturated and / or unsaturated C 1 -C 22 -alkylcarbonyl radicals such as C 10 -alkylcarbonyl, C 5 -alkylcarbonyl, C 12 -alkylcarbonyl, C 13 -alkylcarbonyl, C 14 -alkylcarbonyl, C 16 -alkylcarbonyl, , C 18 - alkylcarbonyl, C 20 alkylcarbonyl or C 22 alkylcarbonyl radicals which contain one or more Double bonds included.
  • C 16 -C 22 -alkylcarbonyl radicals such as C 6 -alkylcarbonyl, C 18 -alkylcarbonyl, C 20 -alkylcarbonyl or C 22 -alkylcarbonyl radicals which contain one or more double bonds.
  • These advantageous radicals may contain two, three, four, five or six double bonds.
  • the particularly advantageous radicals having 18, 20 or 22 carbon atoms in the fatty acid chain contain up to six double bonds, advantageously two, three, four or five double bonds, more preferably two, three or four double bonds. All these radicals are derived from the corresponding fatty acids.
  • the abovementioned radicals of R 1 , R 2 and R 3 may be substituted by hydroxyl and / or epoxy groups and / or may contain triple bonds.
  • the polyunsaturated fatty acids prepared in the process according to the invention contain at least two, advantageously three, four, five or six double bonds. Particularly advantageously, the fatty acids contain two, three, four or five double bonds.
  • fatty acids produced in the process have 18, 20 or 22 C atoms in the fatty acid chain, preferably the fatty acids contain 20 or 22 carbon atoms in the fatty acid chain.
  • saturated fatty acids are little or not reacted with the nucleic acids used in the process. Little is meant that, compared to polyunsaturated fatty acids, the saturated fatty acids are converted to less than 5% of the activity, advantageously less than 3%, most advantageously less than 2%. These produced fatty acids can be produced as the only product in the process or present in a fatty acid mixture.
  • nucleic acid sequences used in the method of the invention are isolated nucleic acid sequences encoding polypeptides having ⁇ -3 desaturase activity.
  • Nucleic acid sequences which code for polypeptides with ⁇ -3-desaturase activity are advantageously used in the process according to the invention, selected from the group consisting of: a) a nucleic acid sequence with the sequence shown in SEQ ID NO: 1, or b) nucleic acid sequences which are known as Result of the degenerate genetic code from the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 2, or c) derivatives of the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, for polypeptides having at least 60% identity at the amino acid level with SEQ ID NO: 2 encode and have a ⁇ -3 desaturase activity.
  • the substituents R 2 or R 3 in the general formulas I and II are independently saturated or unsaturated C 8 -C 22 ⁇ -AlkylcarbonyI- sawn they are particularly advantageously independent of one another of unsaturated C 18 , C 20 or C 22 alkylcarbonyl having at least two double bonds.
  • the polyunsaturated fatty acids produced in the process are advantageously bound in membrane lipids and / or triacylglycerides, but may also occur as free fatty acids or bound in the form of other fatty acid esters in the organisms. They may be present as "pure products" or advantageously in the form of mixtures of different fatty acids or mixtures of different glycerides.
  • the different fatty acids bound in the triacylglycerides can be derived from short-chain fatty acids having 4 to 6 C atoms, medium-chain fatty acids having 8 to 12 C atoms or long-chain fatty acids having 14 to 24 C atoms, the long-chain fatty acids being particularly preferred are the long-chain fatty acids LCPUFAs of C 8 -, C 20 - and / or C 22 fatty acids.
  • the fatty acid esters with polyunsaturated C 8 , C 20 and / or C 22 fatty acid can be prepared from the organisms used for the preparation of the fatty acid esters in the form of an oil or lipid, for example in the form of compounds such as sphingolipids, phosphoglycerides, lipids, glycolipids such as glycosphingolipids, phospholipids such as phosphatidylethanolamine, phosphatidylcholine, phosphatidylserine, phosphatidylglycerol , Phosphatidylinositol or diphosphatidylglycerol, monacylglycerides, diacylglycerides, triacylglycerides or other fatty acid esters such as the acetyl-coenzymeA esters containing the polyunsaturated fatty acids containing at least two, three, four, five or six preferably five or six double bonds, they are advantageous isolated in the
  • the polyunsaturated fatty acids are also included as free fatty acids or bound in other compounds in the organisms beneficial to the plants.
  • the various abovementioned compounds (fatty acid esters and free fatty acids) in the organisms have an approximate distribution of 80 to 90% by weight of triglycerides, 2 to 5% by weight of diglycerides, 5 to 10% by weight of monoglycerides , 1 to 5 wt.% Of free fatty acids, 2 to 8 wt. lipids, wherein the sum of the various compounds to 100 wt .-% complements.
  • the LCPUFAs produced are present in a content of at least 3% by weight, advantageously of at least 5% by weight, preferably of at least 8% by weight, more preferably of at least 10% by weight, very particularly preferably at least 15 wt .-% based on the total fatty acids in the transgenic organisms advantageously produced in a transgenic plant.
  • the fatty acids are prepared in bound form. With the aid of the nucleic acids used in the method according to the invention, these unsaturated fatty acids can be brought to the sn1, sn2 and / or sn3 position of the advantageously prepared triglycerides.
  • the ⁇ -3-desaturase sequences according to the invention are advantageously used in combination with further PUFA synthesis genes such as ⁇ -4-desaturase, ⁇ -5-desaturase, ⁇ -6-desaturase, ⁇ -8-desaturase , ⁇ 5-elongase, ⁇ 6-elongase and / or ⁇ -9 elongase gene.
  • the end products of the process for example arachidonic acid (ERA), eicosapentaenoic acid (EPA), ⁇ -6-docosapentaenoic acid or DHA
  • ERA arachidonic acid
  • EPA eicosapentaenoic acid
  • DHA ⁇ -6-docosapentaenoic acid
  • linoleic acid C18: 2
  • linolenic acid C18: 3
  • these are usually not as absolute pure products, they are i.d.R. also contain small traces of the precursors in the final product.
  • the end products such as ERA, EPA or DHA are present as mixtures.
  • the precursors should advantageously not more than 20 wt .-%, preferably not more than 15 wt .-%, more preferably not more than 10 wt .-%, most preferably not more than 5 wt .-% based on the amount of the respective Final product.
  • ERA e.g., ERA, EPA or only DHA are advantageously bound in the process according to the invention or prepared as free acids. If the compounds ERA, EPA and DHA are produced simultaneously, they are advantageously used in a ratio of at least 1: 1: 2 (EPA: ARA: DHA), more preferably at least 1: 1: 3, preferably 1: 1: 4 preferably prepared from 1: 1: 5.
  • Fatty acid esters or fatty acid mixtures which have been prepared by the process according to the invention advantageously contain 6 to 15% palmitic acid, 1 to 6% stearic acid; 7 - 85% oleic acid; 0.5 to 8% of vaccenic acid, 0.1 to 1% of arachidic acid, 7 to 25% of saturated fatty acids, 8 to 85% of monounsaturated fatty acids and 60 to 85% of polyunsaturated fatty acids in each case based on 100% and on
  • Total fatty acid content of the organisms are preferably at least 0.1; 0.2; 0.3; 0.4; 0.5; 0.6; 0.7; 0.8; 0.9 or 1% based on the total fatty acid content of arachidonic acid.
  • the fatty acid esters or fatty acid mixtures which have been prepared by the process according to the invention advantageously contain fatty acids selected from the group of the fatty acids erucic acid (13-docosaic acid), sterculic acid (9,10-methylene octadec-9-enoic acid), malvalic acid (8,9-methylene heptadec-8-enoic acid), chaulmoogric acid (cyclopentenodecanoic acid), Furan fatty acid (9,12-epoxy-octadeca-9,11-dienoic acid), vernonic acid (9,10-epoxy-octadec-12-enoic acid), tartric acid (6-octadecynoic acid), 6-nonadecynoic acid, sanaltabinic acid (t11 Octadecen-9-ynoic acid), 6,9-octadecenynoic acid, pyrulic acid (t10-heptadecen
  • nucleic acid sequences according to the invention By virtue of the nucleic acid sequences according to the invention or nucleic acid sequences used in the method according to the invention, an increase in the yield of polyunsaturated ⁇ -3 fatty acids of at least 50%, advantageously at least 80%, particularly advantageously at least 100%, very particularly advantageously at least 150% see the non-transgenic parent organism of, for example, a yeast, an alga, a fungus or a plant such as Arabidopsis or flax when compared in GC analysis, see Examples.
  • fatty acids or fatty acid compositions can be prepared by the methods described above.
  • the fatty acids or fatty acid compositions from the organism such as the microorganisms or plants or the culture medium in which or on which the organisms were grown, or from the organism and the culture medium in a known manner, for example, extraction, distillation, crystallization, chromatography or combinations isolated from these methods.
  • These chemically pure fatty acids or fatty acid compositions are advantageous for applications in the food industry, the cosmetics industry and especially the pharmaceutical industry.
  • organisms such as microorganisms, non-human animals or plants come into question as organism for the preparation in the process according to the invention.
  • plants are in question, which are able to synthesize fatty acids as all dicotyledonous or monocotyledonous plants, algae or mosses.
  • Advantageous plants are selected from the group of the plant families Adelotheci- aceae, Anacardiaceae, Asteraceae, Apiaceae, Betulaceae, Boraginaceae, Brassicaceae, Bromeliaceae, Caricaceae, Cannabaceae, Convolvulaceae, Chenopodiaceae, Crypthecodiniaceae, Cucurbitaceae, Ditrichaceae, Elaeagnaceae, Ericaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae, Geraniaceae, Gramineae, Juglandaceae, Lauraceae, Leguminose, Linaceae, Prasinophyceae or vegetables or ornamental plants such as Tagetes.
  • Examples include the following plants selected from the group: Adelotheciaceae as the genera Physcomitrella eg the genus and species Physcomitrella patens, Anacardiaceae such as the genera Pistacia, Mangifera, Anacardium eg the genus and species Pistacia vera [pistachio], Mangifer indica [Mango] or Anacardium occidentale [Cashew], Asteraceae such as the genera Calendula, Carthamus, Centaurea, Cichorium, Cynara, Helianthus, Lactuca, Locusta, Tagetes, Valeriana eg the genus and species Calendula officinalis [Gardening Marigold], Carthamus tinctorius [Dyer's Thistle , safflowerj, Centaurea cyanus [cornflower], Cichorium intybus [chicory], Cynara scolymus [Artichoke], Helianthus annus [sunflower],
  • Ditrichaceae such as the genera Ditrichaceae, Astomiopsis, Ceratodon, Chrysoblastella, Ditrichum, Distichium, Eccremidium, Lophidion, Philibertiella, Pleuridium, Saelania, Trichodon, Skottsbergia eg the genera and species Ceratodon antarcticus, Ceratodon columbiae, Ceratodon heterophyllus, Ceratodon purpurascens, Ceratodon pur pureus, Ceratodon purpureus ssp. convolutus, Ceratodon purpureus ssp. stenocarpus, Ceratodon purpureus var.
  • Ditrichum ambiguum Ditrichum brevisetum, Ditrichum crispatissimum, Ditrichum difficile, Ditrichum falcifolium, Ditrichum flexicaule, Ditrichum giganteum, Ditrichum heteromallum, Ditrichum linear, Ditrichum linear, Ditrichum montanum, Ditrichum montanum, Ditrichum pallidum, Ditrichum franatum, Ditrichum pusillum, Ditrichum pusillum var.
  • Elaeagnaceae such as the genus Elaeagnus eg the Gatt and Olea europaea [Olive]
  • Ericaceae such as the genus Kalmia eg the genera and species Kalmia latifolia, Kalmia angustifolia, Kalmia microphylla, Kalmia polifolia, Kalmia occidentalis, Cistus chamaerhodendros or Kalmia lucida [Berglorbeer]
  • Euphorbiaceae such as the genera Manihot , Janipha, Jatropha, Ricinus eg the genera and species Manihot utilissima, Janipha manihot ,, Jatropha manihot, Manihot aipil, Manihot dulcis, Manihot manihot, Manihot melanobasis, Manihot esculenta [Manihot] or Ricinus communis [Castor], Fab
  • [Cayenne pepper] such as the genera Hordeum, Seeale, Avena, Sorghum, Andropogon, Holcus, Panicum, Oryza, Zea (maize), Triticum eg the genera and species Hordeum vulgare, Hordeum jubatum, Hordeum murinum, Hordeum secalinum, Hordeum Hordeum aegiceras, Hordeum hexastichon, Hordeum hexastichum, Hordeum irregular, Hordeum sativum, Hordeum secalinum [barley], Seeale cereale [rye], Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var.
  • Capsicum frutescens [pepper], Capsicum annuum [paprika], Nicotiana tabacum, Nicotiana alata, Nicotiana attenuata, Nicotiana glauca, Nicotiana slowdorffii, Nicotiana obtusifolia, Nicotiana quadrivalvis, Nicotiana repanda, Nicotiana rustica, Nicotiana sylvestris [tobacco], Solanum tuberosum [potato], Sol anum melongena [eggplant] Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum., Lycopersicon pyriforme, Solanum integrifolium or Solanum lycopersicum [tomato], Sterculiaceae such as the genus Theobroma eg the genus and species Theobroma cacao [cocoa] or Theaceae such as the genus Camellia eg the
  • Advantageous microorganisms are, for example, fungi selected from the group of the families Chaetomiaceae, Choanephoraceae, Cryptococcaceae, Cunninghamellaceae, Demetiaceae, Moniliaceae, Mortierellaceae, Mucoraceae, Pythiaceae, Sacharomycesaceae, Saprolegniaceae, Schizosacharomycetaceae, Sodariaceae or Tubercularaceae.
  • Examples include the following microorganisms selected from the group: Choanephoraceae such as the genera Blakeslea, Choanephora eg the genera and species Blakeslea trispora, Choanephora cucurbitarum, Choanephora infundibulifera var cucurbitarum, Mortierellaceae such as the genus Mortierella eg the genera and species Mortierella isabellina, Mortierella polycephala , Mortierella ramanniana, Mortierella vinacea, Mortierella zonata, Pythiaceae such as the genera Phytium, Phytophthora eg the genera and species Pythium debaryanum, Pythium • intermedium, Pythium irregular, Pythium megalacanthum, Pythium paroecandrum, Pythium sylvaticum, Pythium ultimum, Phytophthora cactorum, Phytophthora cinna- momi, Phytophthora citricola
  • Pichia minuta Pichia minuta var. non-fermentans, Pichia norvegensis Pichia qhmeri, Pichia pastoris, Pichia philodendri, Pichia pini, Pichia polymorpha, Pichia quercuum, Pichia rhodanensis, Pichia sarbenensis, Pichia stipitis, Pichia strasburgensis, Pichia subpelliculosa, Pichia toletana, Pichia trehalophila, Pichia vini, Pichia xylosa, Saccharomyces aceti , Saccharomyces bailii, Saccharomyces bayanus, Saccharomyces bisporus, Saccharomyces capensis, Saccharomyces carisbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces cerevisiae var.
  • Thraustochytriaceae as well as the genera Althornia, Aplanochytrium, Japonochytrium, Schizochytrium, Thraustochytrium eg the species Schizochytrium aggregatum, Schizochytr ium limacinum, Schizochytrium mangrovei, Schizochytrium minutum, Schizochytrium octosporum, Thraustochytrium aggregatum, Thraustochytrium amoe- boideum, Thraustochytrium antacticum, arudimentale Thraustochytrium, aureum, Thraustochytrium, benthicola Thraustochytrium, Thraustochytrium globosum, Thraustochytrium indicum, kerguelense Thraustochytrium, Thraustochytrium kinnei, motivum Thraustochytrium, Thraustochytrium multi Rudi mental, Thraustochyt
  • Bacillaceae such as the genus Bacillus eg the genera and species Bacillus acidocaldarius, Bacillus acidoterrestris, Bacillus alcalophilus, Bacillus amyloliquefiens, Bacillus amylolyticus, Bacillus brevis, Bacillus cereus, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus sphaericus subsp. fusiformis, Bacillus galactophilus, Bacillus globisporus, Bacillus globisporus subsp.
  • Bacillaceae such as the genus Bacillus eg the genera and species Bacillus acidocaldarius, Bacillus acidoterrestris, Bacillus alcalophilus, Bacillus amyloliquefiens, Bacillus amylolyticus, Bacillus brevis, Bacillus cereus, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus sphaericus sub
  • Bacillus subtilis subsp. marinus Bacillus halophilus, Bacillus lentimorbus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus polymyxa, Bacillus psychrosaccharolyticus, Bacillus pumilus, Bacillus sphaericus, Bacillus subtilis subsp. spizizenii, Bacillus subtilis subsp.
  • Enterobacteriacae such as the genera Citrobacter, Edwardsieila, Enterobacter, Erwinia, Escherichia, Klebsiella, Salmonella or Serratia eg the genera and species Citrobacter amalonaticus, Citrobacter diversus, Citrobacter freundii, Citrobacter genomicpecies, Citrobacter gillenii, Citrobacter intermedium, Citrobacter koseri, Citrobacter murliniae, Citrobacter sp., Edwardsiella hoshinae, Edwardsieila ictaluri, Edwardsieila tarda, Erwinia alni, Erwinia amylovora, Erwiniaananatis, Erwinia aphidicola, Erwinia billingiae, Erwinia cacticida, Erwinia carcinogena, Enwinia carnegieana, Erwinia caroto
  • Rhizobiaceae such as the genera Agrobacterium, Carbophilus, Chelatobacter, Ensifer, Rhizobium, Sinorhizobium eg the genera and species Agrobacterium atlanticum, Agrobacterium ferrugineum, Agrobacterium gelatinovorum, Agrobacterium larrymoorei, Agrobacterium meteori, Agrobacterium radiobacter, Agrobacterium rhizogenes, Agrobacterium rubi, Agrobacterium stellulatum, Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium vitis, Carbophilus carboxidus, Chelatobacter heintzii, Ens
  • microorganisms for the method according to the invention are, for example, protists or diatoms selected from the group of the families Dinophyceae, Turaniellidae or Oxytrichidae such as the genera and species: Crypthecodinium cohnii, Phaeodactylum tricornutum, Stylonychia mytilus, Stylonychia pustulata, Stylonychia putrina, Stylonychia notophora , Stylonychia sp., Colpidium campylum or Colpidium sp. i
  • Transgenic organisms such as fungi such as Mortierella or Traustochytrium, yeasts such as Saccharomyces or Schizosaccharomyces, mosses such as Physcomitrella or Ceratodon, non-human animals such as Caenorhabditis, algae such as Crypthecodinium or Phaeodactylum or plants such as dicotyledonous or monocotyledonous plants are advantageously used in the process according to the invention.
  • fungi such as Mortierella or Traustochytrium
  • yeasts such as Saccharomyces or Schizosaccharomyces
  • mosses such as Physcomitrella or Ceratodon
  • non-human animals such as Caenorhabditis
  • algae such as Crypthecodinium or Phaeodactylum
  • plants such as dicotyledonous or monocotyledonous plants are advantageously used in the process according to the invention.
  • oils such as fungi such as Mortierella or Thraustochytrium, algae such as Crypthecodinium, Phaeodactylum or plants, in particular plants preferred oil crop plants containing large amounts of lipid compounds, such as peanut, oilseed rape, canola, sunflower, safflower, poppy, mustard, hemp, castor, olive, sesame, calendula, punica, evening primrose, mullein, thistle, wild rose, hazelnut, almond, Macadamia, avocado, bay leaf, pumpkin, flax, soy, pistachios, borage, trees (palm oil, coconut or walnut) or crops such as corn, wheat, rye, oats, triticale, rice, barley, cotton, manioc, pepper, Tagetes, Solanaceae plants such as potato, tobacco, eggplant and tomato,
  • oils such as Mortierella or Thraustochytrium, algae such as Crypthecodinium, Phaeodacty
  • Preferred plants according to the invention are oil crop plants, such as peanut, oilseed rape, canola, sunflower, safflower, poppy, mustard, hemp, castor, olive, calendula, punica, evening primrose, pumpkin, flax, soy, borage, trees (oil palm, coconut) , Particularly preferred are C18: 2 and / or C18: 3 fatty acid rich plants such as sunflower, safflower, tobacco, mullein, sesame, cotton, pumpkin, poppy, evening primrose, walnut, flax, hemp, thistle or safflower. Very particularly preferred are plants such as safflower, sunflower, poppy, evening primrose, walnut, flax or hemp.
  • nucleic acid sequences coding for an ⁇ -3-desaturase it is advantageous to introduce into the organism, in addition to the nucleic acid sequences coding for an ⁇ -3-desaturase, further nucleic acids which encode enzymes of the fatty acid or lipid metabolism.
  • genes of fatty acid or lipid metabolism can advantageously be used in combination with the inventive ⁇ -3-desaturase in the process for producing polyunsaturated fatty acids.
  • the ⁇ -3-desaturase according to the invention has the advantageous property that it can deuterate a wide range of ⁇ -6-fatty acids compared with the known ⁇ -3-desaturase, preference being given to C 20 and C 22 -fatty acids, such as C 20: 2 , C 20: 3 , C 20: 4 , C 22: 4 or C 22: 5 fatty acids. But also the shorter C 18 fatty acids such as C 18: 2 or C 18: 3 fatty acids are advantageously desaturated. By virtue of these properties of the omega-3-desaturase, it is advantageously possible to shift the fatty acid spectrum within an organism, advantageously within a plant or a fungus, from the omega-6 fatty acids to the omega-3 fatty acids.
  • C 20 -fatty acids are preferably desaturated by the ⁇ -3-desaturase according to the invention.
  • these fatty acids are converted from the existing fatty acid pool to at least 10%, 15%, 20%, 25% or 30% to the corresponding ⁇ -3 fatty acids.
  • the ⁇ -3-desaturase has a factor of 10 lower activity, that is, only about 1, 5 to 3% of the fatty acids present in the fatty acid pool to the corresponding ⁇ -3 fatty acids.
  • Preferred substrate of the ⁇ -3-desaturase according to the invention are the ⁇ -6-fatty acids bound in phospholipids.
  • PC phosphatidylcholine
  • PIS phosphatidylinositol
  • PE phosphatidylethanolamine
  • fatty acids derived from C18: 2 fatty acids such as GLA, DGLA or ERA, or those derived from C18 : Derive 3-fatty acids, such as SDA, ETA or EPA.
  • linoleic acid LA, C18: 2 ⁇ 9,12
  • the products of the process can initially only be GLA, DGLA and ERA, which may be present as free fatty acids or bound.
  • GLA GLA
  • DGLA DGLA
  • ERA free fatty acids or bound.
  • ⁇ -3-desaturase involved in the synthesis advantageously in combination with the ⁇ -4-, ⁇ -5-, ⁇ -6-desaturase and / or ⁇ -6 elongase and / or ⁇ -5- Elongase, or the ⁇ -, ⁇ -5, ⁇ -8-desaturase, and / or ⁇ -9 elongase and / or ⁇ -5 elongase can be targeted in the aforementioned organisms advantageously in the aforementioned plants only individual products
  • the activity of ⁇ -6-desaturase and ⁇ -6-elon- gase produces, for example, GLA and DGLA or SDA and ETA, depending on the starting plant and unsaturated fatty acid.
  • ⁇ -5-desaturase, the ⁇ -5 elongase and the ⁇ -4-desaturase are additionally introduced into the organism advantageously into the plant, then ERA, EPA and / or DHA are additionally produced. This also applies to organisms in which previously the ⁇ -8-desaturase and ⁇ -9 elongase was introduced.
  • ERA, EPA or DHA or mixtures thereof are particularly advantageously synthesized only EPA or DHA or mixtures thereof, depending on the fatty acid present in the organism or in the plant, which serves as the starting substance for the synthesis. Since these are biosynthetic chains, the respective end products are not present as pure substances in the organisms.
  • fatty acids there are always small amounts of precursor compounds in the final product. These small amounts are less than 20 wt .-%, advantageously less than 15 wt .-%, particularly advantageous less than 10 wt .-%, most preferably less than 5, 4, 3, 2 or 1 wt .-% based on the final product DGLA, ETA or mixtures thereof or ERA, EPA, DHA or mixtures thereof advantageously EPA or DHA or mixtures thereof.
  • the fatty acids can also be fed from the outside. For cost reasons, production in the organism is preferred.
  • Preferred substrates of ⁇ -3-desaturase are linoleic acid (C18: 2 ⁇ 9,12 ), ⁇ -linolenic acid (C18: 3 ⁇ 6,9,12 ), eicosadienoic acid (C20: 2 ⁇ 11 '14 ), dihomo- ⁇ linolenic acid (C20: 3 ⁇ 8 ' 11 ' 14 ), the arachidonic acid (C20: 4 ⁇ 5 ' 8 ' 11 '14 ), docosatetraenoic acid (C22: 4 ⁇ 7 ' 10 ' 13 ' 16 ) and docosapentaenoic acid (C20: 4 ; C22: 5 ⁇ 4,7 ' 10 ' 13 - 15 ).
  • Nucleic acids used in the method according to the invention are advantageously derived from plants such as algae such as Isochrysis, Mantoniella, Ostreococcus or Crypthecodinium, algae / diatoms such as Phaeodactylum or Thraustochytrium, mosses such as Physcomitella or Ceratodon or higher plants such as the primulaceae such as Aleuritia, Calendula stellata, Osteospermum spinescens or Osteospermum hyoseroides, microorganisms such as fungi such as Aspergillus, Thraustochytrium, Phytophthora, Entomophthora, Mucor or Mortierella, bacteria such as Shewanella, yeasts or animals such as nematodes such as Caenorhabditis, insects or fish.
  • plants such as algae such as Isochrysis, Mantoniella, Ostreococcus or Cryp
  • the isolated nucleic acid sequences according to the invention are derived from an animal of the vertebrate order.
  • the nucleic acid sequences are of the vertebrate class; Euteleostomi, Actinopterygii; Neopterygii; Teleostei; Euteleostei, Procanthopterygii, Salmoniformes; Salmonidae or Oncorhynchus.
  • the nucleic acids are particularly advantageously derived from fungi, animals or from plants such as algae or mosses, preferably from the order of the Salmoniformes such as the family Salmonidae such as the genus Salmo example of the genera and species Oncorhynchus mykiss, Trutta trutta or Salmo trutta fario or from the Diatoms such as the genera Thallasiosira or Crypthecodinium.
  • nucleic acid sequences or their derivative or homologs which code for polypeptides which still retain the enzymatic activity of the proteins encoded by nucleic acid sequences are advantageous. to sit.
  • These sequences are cloned individually or in combination with the ⁇ -3-desaturase coding nucleic acid sequences in expression constructs and used for introduction and expression in organisms. By their construction, these expression constructs enable a favorable optimal synthesis of the polyunsaturated fatty acids produced in the process according to the invention.
  • the method further comprises the step of obtaining a cell or a whole organism containing the nucleic acid sequences used in the method, the cell and / or the organism being equipped with a nucleic acid sequence according to the invention coding for the ⁇ -3-desaturase, a gene construct or a vector as described below, alone or in combination with other nucleic acid sequences encoding proteins of the fatty acid or lipid metabolism.
  • this method further comprises the step of recovering the oils, lipids or free fatty acids from the organism or from the culture.
  • the culture may be, for example, a fermentation culture, for example, in the case of culturing microorganisms such as e.g.
  • the cell or organism thus produced is advantageously a cell of an oil-producing organism such as an oil crop such as peanut, canola, canola, flax, hemp, peanut, soybean, safflower, hemp, sunflower or borage.
  • an oil-producing organism such as an oil crop such as peanut, canola, canola, flax, hemp, peanut, soybean, safflower, hemp, sunflower or borage.
  • Cultivation is, for example, culturing in the case of plant cells, tissue or organs on or in a nutrient medium or the whole plant on or in a substrate, for example in hydroponics, potting soil or on arable land.
  • Natural genetic environment means the natural one genomic or chromosomal locus in the source organism or presence in a genomic library.
  • the natural genetic environment of the nucleic acid sequence is preferably at least partially conserved.
  • the environment flanks the nucleic acid sequence at least on one side and has a sequence length of at least 50 bp, preferably at least 500 bp, more preferably at least 1000 bp, most preferably at least 5000 bp.
  • a naturally occurring expression cassette - for example the naturally occurring combination of the natural promoter of the inventive nucleic acid sequences with the corresponding ⁇ -3-desaturase genes - becomes a transgenic expression cassette when modified by non-natural, synthetic ("artificial") methods such as mutagenization becomes. Corresponding methods are described, for example, in US Pat. No. 5,565,350 or WO 00/15815.
  • transgenic organism or transgenic plant As mentioned above is to be understood that the nucleic acids used in the method are not in their natural place in the genome of an organism, while the nucleic acids can be expressed homologously or heterologously.
  • transgene also means, as mentioned, that the nucleic acids according to the invention are in their natural place in the genome of an organism, but that the sequence has been changed compared to the natural sequence and / or the regulatory sequences of the natural sequences have been changed.
  • Transgenic is preferably understood to mean the expression of the nucleic acids according to the invention at a non-natural site in the genome, that is to say a homologous or preferably heterologous expression of the nucleic acids is present.
  • Preferred transgenic organisms are fungi such as Mortierella, mosses such as Physcomitella, algae such as Crypthecodinium or plants such as the oil crop plants.
  • Suitable organisms or host organisms for the nucleic acids, the expression cassette or the vector used in the method according to the invention are in principle advantageously all organisms which are able to synthesize fatty acids, especially unsaturated fatty acids or are suitable for the expression of recombinant genes.
  • Examples include plants such as Brassicaceae such as Arabidopsis, Asteraceae such as calendula or crops such as soybean, peanut, castor, sunflower, corn, cotton, flax, oilseed rape, coconut, oil palm, safflower (Carthamus tinctorius) or cocoa bean, microorganisms such as fungi, for example, the genus Mortierella, Thraustochytrium, Saprolegnia or Pythium, bacteria such as the genus Escherichia or Shewanella, yeasts such as the genus Saccharomyces, cyanobacteria, ciliates, algae or protozoans such as dinoflagellates such as Crypthecodinium.
  • plants such as Brassicaceae such as Arabidopsis, Asteraceae such as calendula or crops such as soybean, peanut, castor, sunflower, corn, cotton, flax, oilseed rape, coconut, oil palm, safflower (Carthamus
  • fungi such as Mortierella alpina, Pythium insidiosum or plants such as soya, oilseed rape, coconut, oil palm, safflower, flax, hemp, castor, calendula, peanut, cocoa bean or sunflower or yeasts such as Saccharomyces cerevisiae, particularly preferred are soy, flax, rapeseed, safflower, sunflower, calendula, Mortierella or Saccharomyces cerevisiae.
  • host organisms in addition to the Transgenic animals are also advantageously suitable for non-human animals, for example C. elegans.
  • Useful host cells are also mentioned in: Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).
  • Useful expression strains e.g. those which have lower protease activity are described in: Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119-128.
  • transgenic plants include plant cells and certain tissues, organs and parts of plants in all their forms, such as anthers, fibers, root hairs, stems, embryos, calli, kotelydons, petioles, crops, plant tissue, reproductive tissue and cell cultures, that of the actual transgenic plant is derived and / or can be used to produce the transgenic plant.
  • Transgenic plants containing the polyunsaturated fatty acids synthesized in the process according to the invention can advantageously be marketed directly without having to isolate the synthesized oils, lipids or fatty acids.
  • Plants in the method according to the invention include whole plants and all plant parts, plant organs or plant parts such as leaves, stems, seeds, roots, tubers, anthers, fibers, root hairs, stems, embryos, calli, kotelydons, petioles, crop material, plant tissue, reproductive tissue, Cell cultures that can be derived from the transgenic plant and / or used to produce the transgenic plant.
  • the seed includes all seed parts such as the seed shells, epidermis and sperm cells, endosperm or embryonic tissue.
  • the compounds prepared in the process according to the invention can also be isolated from the organisms advantageously plants in the form of their oils, fat, lipids and / or free fatty acids.
  • Polyunsaturated fatty acids produced by this process can be harvested by harvesting the organisms either from the culture in which they grow or from the field. This can be done by pressing or extraction of the plant parts, preferably the plant seeds.
  • the oils, fats, lipids and / or free fatty acids by so-called cold beat or cold pressing can be obtained without supplying heat by pressing.
  • the plant parts, especially the seeds, to be easier to digest they are first crushed, steamed or roasted. The thus pretreated seeds can then be pressed or extracted with solvents such as warm hexane.
  • the solvent is removed again.
  • these are harvested after harvesting, for example, directly without further working steps, or else extracted after digestion by various methods known to the person skilled in the art. In this way, more than 96% of the compounds prepared in the process can be isolated.
  • the products thus obtained are further processed, that is refined.
  • the so-called degumming can enzymatically or, for example, chemically / physically by adding acid such as mechanically or, for example, chemically / physically by addition of acid such as phosphoric acid.
  • the free fatty acids are removed by treatment with a base, for example sodium hydroxide solution.
  • the product obtained is thoroughly washed with water to remove the lye remaining in the product and dried.
  • the products are subjected to bleaching with, for example, bleaching earth or activated carbon.
  • the product is still deodorized, for example, with steam.
  • the PUFAs or LCPUFAs produced by this process are C 8 , C 20 or C 22 fatty acid molecules having at least two double bonds in the fatty acid molecule, preferably two, three, four, five or six double bonds.
  • These Ci 8 - > C 2 o- or C 22 -Fettklamoleküle can be isolated from the organism in the form of an oil, lipid or a free fatty acid. Suitable organisms are, for example, those mentioned above. Preferred organisms are transgenic plants.
  • One embodiment of the invention is therefore oils, lipids or fatty acids or fractions thereof which have been prepared by the method described above, more preferably oil, lipid or fatty acid composition comprising PUFAs derived from transgenic plants.
  • oils, lipids or fatty acids advantageously contain 6 to 15% palmitic acid, 1 to 6% stearic acid as described above; 7 - 85% oleic acid; 0.5 to 8% of vaccenic acid, 0.1 to 1% of arachidic acid, 7 to 25% of saturated fatty acids, 8 to 85% of monounsaturated fatty acids and 60 to 85% of polyunsaturated fatty acids in each case based on 100% and on the total fatty acid content of the organisms.
  • polyunsaturated fatty acid in the fatty acid esters or fatty acid mixtures are preferably at least 0.1; 0.2; 0.3; 0.4; 0.5; 0.6; 0.7; 0.8; 0.9 or 1% based on the total fatty acid content of arachidonic acid.
  • the fatty acid esters or fatty acid mixtures which have been prepared by the process according to the invention advantageously contain fatty acids selected from the group of the fatty acids erucic acid (13-docosaic acid), sterculic acid (9,10-methylene octadec-9-enoic acid), malvalic acid (8 , 9-methylene heptadec-8-enoic acid), chaulmoogric acid (cyclopentene-dodecanoic acid), furan fatty acid (9,12-epoxy-octadeca-9,11-dienoic acid), vernoic acid (9,10-epoxyoctadec-12-enoic acid ), Taric acid (6-octadecynonic acid), 6-nonadecynoic acid, santalbinic acid (t11-octadecen-9-ynoic acid), 6,9-octadecenynoic acid, pyrulic acid (t10
  • the oils, lipids or fatty acids according to the invention advantageously contain at least 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4% or 5%, advantageously at least 6%, 7%, 8%, 9% or 10%, particularly advantageously at least 11%, 12%, 13%, 14% or 15% ERA or at least 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4% or 5%, advantageously at least 6%, or 7%, more preferably at least 8 %, 9% or 10% EPA and / or DHA based on thePolfettklagehalt of Artsiohsorganismus advantageous a plant, particularly advantageous an oil crop such as soybean oilseed rape, coconut, oil palm, Desirbersafflor, flax, hemp, castor, calendula, peanut, cocoa bean, sunflower or the above other monocotyledonous or dicotyledonous oil crops.
  • an oil crop such as soybean oilseed rape, coconut, oil palm, Desirbersafflor, flax, hemp, castor, calendula
  • oils, lipid, fatty acids and / or fatty acid composition in feed, food, cosmetics or pharmaceuticals.
  • the oils, lipids, fatty acids or fatty acid mixtures according to the invention may be mixed with other oils, lipids, fatty acids or fatty acid mixtures of animal origin, such as those known to those skilled in the art, for example. Fish oils are used.
  • oil is understood as meaning a fatty acid mixture which contains unsaturated, saturated, preferably esterified fatty acid (s).
  • the oil, lipid or fat contain a high proportion of polyunsaturated free or advantageously esterified fatty acid (s), especially linoleic acid, ⁇ -linolenic acid, dihomo-Y-linolenic acid, arachidonic acid, ⁇ -linolenic acid, stearidonic acid, eicosatetraenoic acid, eicosapentaenoic acid, Docosapentaenoic acid or docosahexaenoic acid has.
  • the proportion of unsaturated esterified fatty acids is about 30%, more preferred is a proportion of 50%, even more preferred is a proportion of 60%, 70%, 80% or more.
  • the proportion of fatty acid after transfer of the fatty acids into the methyl esters can be determined by gas chromatography by transesterification.
  • the oil, lipid or fat may contain various other saturated or unsaturated fatty acids, e.g. Calendulic acid, palmitic, palmitoleic, stearic, oleic acid, etc. included.
  • the proportion of the various fatty acids in the oil or fat may vary depending on the starting organism.
  • the polyunsaturated fatty acids having advantageously at least two double bonds which are produced in the process are, as described above, for example sphingolipids, phosphoglycerides, lipids, glycolipids, phospholipids, monoacylglycerol, diacylglycerol, triacylglycerol or other fatty acid esters.
  • the polyunsaturated fatty acids containing, for example, an alkali treatment such as aqueous KOH or NaOH or acid hydrolysis can be advantageous in the presence of an alcohol such as methanol or ethanol or via an enzymatic elimination and isolate via, for example, phase separation and subsequent acidification over eg H 2 SO.
  • an alcohol such as methanol or ethanol or via an enzymatic elimination and isolate via, for example, phase separation and subsequent acidification over eg H 2 SO.
  • the release of the fatty acids can also be carried out directly without the workup described above.
  • the nucleic acids used in the process can after introduction into a
  • Organism advantageously a plant cell or plant are either on a separate plasmid or advantageously integrated into the genome of the host cell.
  • integration may be at random or by such recombination as to replace the native gene with the incorporated copy, thereby modulating the production of the desired compound by the cell, or by using a gene in trans such that Gene with a functional expression unit which contains at least one gene which ensures the expression of a gene and at least one polyadenylation of a functionally transcribed gene ensuring sequence is operably linked.
  • the nucleic acids are brought into the plants via multi-expression cassettes or constructs for multiparallel expression in the organisms, advantageously for multiparallel seed-specific expression of genes.
  • Moose and algae are the only known plant systems that produce significant amounts of polyunsaturated fatty acids, such as arachidonic acid (ERA) and / or eicosapentaenoic acid (EPA) and / or docosahexaenoic acid (DHA).
  • ERA arachidonic acid
  • EPA eicosapentaenoic acid
  • DHA docosahexaenoic acid
  • Moose contain PUFAs in membrane lipids, while algae, algae-related organisms and some fungi also accumulate significant levels of PUFAs in the triacylglycerol fraction.
  • nucleic acid molecules isolated from strains which also accumulate PUFAs in the triacylglycerol fraction are particularly advantageous for the process of the invention and thus for modification of the lipid and PUFA production system in a host, in particular plants such as oilseed crops, for example oilseed rape. Canola, flax, hemp, soy, sunflower, borage. They are therefore advantageous for use in the process according to the invention.
  • nucleic acids used in the method according to the invention which code for polypeptides with ⁇ -3-desaturase activity, and / or the other used nucleic acids such as the nucleic acids selected for polypeptides of fatty acid or lipid metabolism selected from the group acyl-CoA-dehydrogenase (n ) Acyl-ACP [acyl carrier protein] desaturase (s), acyl-ACP thioesterase (s), fatty acid acyltransferase (s), acyl-CoA: lysophospholipid acyltransferase (s), fatty acid Synthase (s), fatty acid hydroxylase (s), acetyl coenzyme A carboxylase (s), acyl coenzyme A oxidase (s), fatty acid desaturase (s), fatty acid acetylenase (s), lipoxygenase (n) n), triacylglyce
  • the fatty acids reacted as substrates in the process are reacted in the form of their phospholipid esters.
  • the polyunsaturated C 18 -fatty acids must first be desaturated by the enzymatic activity of a desaturase and then be extended by at least two carbon atoms via an elongase. After one round of elongation, this enzyme activity leads to C 20 fatty acids, and after two rounds of elongation to C 22 fatty acids.
  • the desaturases and elongases used in the activity of the processes according to the invention preferably lead to C 18 , C 20 and / or C 22 fatty acids advantageously having at least two double bonds in the fatty acid molecule, preferably having three, four, five or six double bonds, more preferably C 20 - and / or C 22 fatty acids having at least two double bonds in the fatty acid molecule, preferably having three, four, five or six double bonds, very particularly preferably having four, five or six double bonds in the molecule.
  • Particularly preferred products of the process according to the invention are eicosatrienoic acid, eicosapentaenoic acid, docosapentaenoic acid and / or docosaheic acid.
  • the C 20 fatty acids having at least two double bonds in the fatty acid can be extended by the enzymatic activity of the enzymes used in the process in the form of the free fatty acid or in the form of the esters, such as phospholipids, glycolipids, sphingolipids, phosphoglycerides, monoacylglycerol, diacylglycerol or triacylglycerol.
  • the preferred biosynthesis site of fatty acids, oils, lipids or fats in the advantageously used plants is, for example, generally the seeds or cell layers of the seed, so that a seed-specific expression of the nucleic acids used in the method is useful.
  • biosynthesis of fatty acids, oils or lipids need not be restricted to the seed tissue but can also be tissue-specific in all other parts of the plant - for example in epidermis cells or in the tubers.
  • microorganisms such as yeasts such as Saccharomyces or Schizosaccharomyces
  • fungi such as Mortierella, Aspergillus, Phytophtora, Entomophthora, Mucor or Thraustochytrium algae such as Isochrysis, Phaeodactylum or Crypthecodinium are used in the process according to the invention as organisms, these organisms are advantageously attracted to fermentation.
  • the polyunsaturated fatty acids produced in the process can be at least 5%, preferably at least 10%, more preferably at least 20%, very particularly preferably at least 50%. be increased compared to the wild type of organisms that do not contain the nucleic acids recombinantly.
  • the polyunsaturated fatty acids produced in the organisms used in the process can in principle be reduced to two Species are increased.
  • the pool of free polyunsaturated fatty acids and / or the proportion of esterified polyunsaturated fatty acids produced by the process can be increased.
  • the process according to the invention increases the pool of esterified polyunsaturated fatty acids in the transgenic organisms.
  • microorganisms are used as organisms in the process according to the invention, they are grown or grown, depending on the host organism, in a manner known to the person skilled in the art.
  • Microorganisms are usually in a liquid medium containing a carbon source usually in the form of sugars, a nitrogen source usually in the form of organic nitrogen sources such as yeast extract or salts such as ammonium sulfate, trace elements such as iron, manganese, magnesium salts and optionally vitamins, at temperatures between 0 ° C and 100 ° C, preferably between 10 ° C to 60 ° C attracted under oxygen fumigation.
  • the pH of the nutrient fluid can be kept at a fixed value, that is regulated during cultivation or not.
  • the cultivation can be batchwise, semi-batch wise or continuous. Nutrients can be presented at the beginning of the fermentation or fed in semi-continuously or continuously.
  • the polyunsaturated fatty acids prepared can be isolated from the organisms by methods known to those skilled in the art as described above. For example, extraction, distillation, crystallization, optionally salt precipitation and / or chromatography. The organisms can be opened up for this purpose yet advantageous.
  • the process according to the invention is advantageously carried out at a temperature between 0.degree. C. and 95.degree. C., preferably between 10.degree. C. and 85.degree. C., more preferably between 15.degree. C. and 75.degree , most preferably carried out between 15 ° C to 45 ° C.
  • the pH is advantageously maintained between pH 4 and pH 12, preferably between pH 6 and pH 9, particularly preferably between pH 7 and pH 8.
  • the process according to the invention can be operated batchwise, semi-batchwise or continuously.
  • a summary of known cultivation methods is in the textbook by Chmiel (Bioreatechnik 1. Introduction to bioprocess engineering (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) or in the textbook by Storhas (bioreactors and peripheral facilities (Vieweg Verlag, Braunschweig / Wiesbaden, 1994)) Find.
  • the culture medium to be used must suitably satisfy the requirements of the respective strains. Descriptions of culture media of various microorganisms are contained in the Manual of Methods for General Bacteriology of the American Society of Bacteriology (Washington D.O, USA, 1981). As described above, these media which can be used according to the invention usually comprise one or more carbon sources, nitrogen sources, inorganic salts, vitamins and / or trace elements.
  • Preferred carbon sources are sugars, such as mono-, di- or polysaccharides.
  • sugars such as mono-, di- or polysaccharides.
  • very good carbon sources are glucose, fructose, mannose, galactose, ribose, sorbose, ribulose, lactose, maltose, sucrose, raffinose, starch or cellulose.
  • Sugar can also be added to the media via complex compounds, such as molasses, or other by-products of sugar refining. It may also be advantageous to add mixtures of different carbon sources.
  • Other possible sources of carbon are oils and fats, e.g. Soybean oil, sunflower oil, peanut oil and / or coconut fat, fatty acids such as e.g.
  • alcohols and / or polyalcohols such as e.g. Glycerol, methanol and / or ethanol and / or organic acids such as e.g. Acetic acid and / or lactic acid.
  • Nitrogen sources are usually organic or inorganic nitrogen compounds or materials containing these compounds.
  • Exemplary nitrogen sources include ammonia in liquid or gaseous form or ammonium salts such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate or ammonium nitrate, nitrates, urea, amino acids or complex nitrogen sources such as corn steep liquor, soybean meal, soy protein, yeast extract, meat extract and others.
  • the nitrogen sources can be used singly or as a mixture.
  • Inorganic salt compounds which may be included in the media include the chloride, phosphorus or sulfate salts of calcium, magnesium, sodium, cobalt, molybdenum, potassium, manganese, zinc, copper and iron.
  • sulfur source for the production of sulfur-containing fine chemicals in particular methionine, inorganic sulfur-containing compounds such as sulfates, sulfites, dithionites, tetrathionates, thiosulfates, sulfides but also organic sulfur compounds, such as mercaptans and thiols can be used.
  • inorganic sulfur-containing compounds such as sulfates, sulfites, dithionites, tetrathionates, thiosulfates, sulfides
  • organic sulfur compounds such as mercaptans and thiols
  • Phosphoric acid potassium dihydrogen phosphate or dipotassium hydrogen phosphate or the corresponding sodium-containing salts can be used as the phosphorus source.
  • Chelating agents can be added to the medium to keep the metal ions in solution.
  • Particularly suitable chelating agents include dihydroxyphenols, such as catechol or protocatechuate, or organic acids, such as citric acid.
  • the fermentation media used according to the invention for the cultivation of microorganisms usually also contain other growth factors, such as vitamins or growth promoters, which include, for example, biotin, riboflavin, thiamine, folic acid, nicotinic acid, panthothenate and pyridoxine.
  • Growth factors and salts are often derived from complex media components, such as yeast extract, molasses, corn steep liquor, and the like.
  • the culture medium can also suitable precursors are added.
  • the exact composition of the media compounds will depend heavily on the particular experiment and will be decided on a case by case basis. Information about the media optimization is available from the textbook "Applied Microbiol Physiology, A Practical Approach” (Ed PM Rhodes, PF Stanbury, IRL Press (1997) pp. 53-73, ISBN 0 19 963577 3).
  • Growth media may also be obtained from commercial suppliers such as Standard 1 (Merck) or BHI (Brain heart infusion, DIFCO) and the like.
  • All media components are sterilized either by heat (20 min at 1.5 bar and 121 ° C) or by sterile filtration.
  • the components can either be sterilized together or, if necessary, sterilized separately. All media components may be present at the beginning of the culture or added randomly or batchwise, as desired.
  • the temperature of the culture is usually between 15 ° C and 45 ° C, preferably 25 ° C to 40 ° C and can be kept constant or changed during the experiment.
  • the pH of the medium should be in the range of 5 to 8.5, preferably around 7.0.
  • the pH for cultivation can be controlled during the cultivation by adding basic compounds such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia or ammonia water or acidic compounds such as phosphoric acid or sulfuric acid.
  • anti-foaming agents such as e.g. Fatty acid polyglycol esters.
  • suitable selective substances e.g. Antibiotics, to be added.
  • oxygen or oxygen containing gas mixtures e.g.
  • the temperature of the culture is normally from 20 ° C to 45 ° C, and preferably from 25 ° C to 40 ° C.
  • the culture is continued until a maximum of the desired product has formed. This goal is usually reached within 10 hours to 160 hours.
  • the fermentation broths thus obtained in particular containing polyunsaturated fatty acids, usually have a dry matter content of 7.5 to 25% by weight.
  • the fermentation broth can then be further processed. Depending on
  • the biomass wholly or partly by separation methods such as centrifugation, filtration, decantation or a combination of these methods are removed from the fermentation broth or completely left in it.
  • the biomass is worked up after separation.
  • the fermentation broth can also without cell separation with known methods such. B. with the aid of a rotary evaporator, thin film evaporator, falling film evaporator, by reverse osmosis, or by nanofiltration, thickened or concentrated. This concentrated fermentation broth may eventually be worked up to recover the fatty acids contained therein.
  • the fatty acids obtained in the process are also suitable as starting material for the chemical synthesis of further products of value.
  • the nucleic acids used in the method are advantageously subjected to amplification and ligation in a known manner.
  • the procedure is based on the protocol of the Pfu DNA polymerase or of a Pfu / Taq DNA polymerase mixture.
  • the primers are selected on the basis of the sequence to be amplified. Conveniently, the primers should be chosen so that the amplificate comprises the entire codogenic sequence from the start to the stop codon.
  • the amplificate is conveniently analyzed. For example, the analysis can be carried out after gel electrophoretic separation in terms of quality and quantity.
  • the amplificate can be purified according to a standard protocol (eg Qiagen). An aliquot of the purified amplificate is then available for subsequent cloning. Suitable cloning vectors are generally known to the person skilled in the art.
  • vectors which can be replicated in microbial systems ie in particular vectors which ensure efficient cloning in yeasts or fungi, and which enable stable transformation of plants.
  • various suitable for the T-DNA-mediated transformation binary and co-integrated vector systems.
  • Such vector systems are usually characterized in that they contain at least the vir genes required for the Agrobacterium-mediated transformation as well as the T-DNA limiting sequences (T-DNA border).
  • these vector systems also include other cis-regulatory regions, such as promoters and terminators and / or selection markers, with which appropriately transformed organisms can be identified.
  • binary systems are based on at least two vectors, one of them vir genes, but no T-DNA and a second T-DNA, but no carries vir gene.
  • these binary vectors include vectors of the series pBIB-HYG, pPZP, pBecks, pGreen.
  • Preferably used according to the invention are Bin 19, pBI101, pBinAR, pGP and pCAMBIA.
  • the vectors can first be linearized with restriction endonuclease (s) and then enzymatically modified in a suitable manner. The vector is then purified and an aliquot used for cloning. Upon cloning, this is enzymatically cut and, if necessary, purified Amplicon cloned with similarly prepared vector fragments using ligase.
  • a particular nucleic acid construct or vector or plasmid construct can have one or more codogenic gene segments.
  • the codogenic gene segments in these constructs are functionally linked to regulatory sequences.
  • the regulatory sequences include, in particular, plant sequences such as the promoters and terminators described above.
  • the constructs can advantageously be stably propagated in microorganisms, in particular Escherichia coli and Agrobacterium tumefaciens, under selective conditions and enable a transfer of heterologous DNA into plants or microorganisms.
  • nucleic acids used in the method can be introduced into organisms such as microorganisms or advantageously plants and thus used in plant transformation, such as those published in and cited herein: Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press, Boca Raton, Florida), Chapter 6/7, pp. 71-119 (1993); F. F. White, Vectors for Gene Transfer to Higher Plants; in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds .: Kung and R. Wu, Academic Press, 1993, 15-38; Techniques for Gene Transfer, Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. Kung and R.
  • nucleic acids used in the method, the inventive nucleic acids and nucleic acid constructs and / or vectors can thus advantageously be used on plants for the genetic modification of a broad spectrum of organisms so that they become better and / or more efficient producers of PUFAs.
  • the number or activity of ⁇ -9 elongase, ⁇ -6-desaturase, ⁇ -8-desaturase, ⁇ -6 elongase, ⁇ -5-desaturase, ⁇ -5 elongase, ⁇ -4 -Desaturase or ⁇ -3-desaturase proteins or genes can be increased so that larger amounts of the gene products and thus ultimately larger amounts of the compounds of general formula I are produced. Also, a de novo synthesis in an organism lacking the activity and ability to biosynthesize the compounds before introducing the gene (s) of interest is possible. The same applies to the combination with other desaturases or elongases or other enzymes from the fatty acid and lipid metabolism.
  • the use of different divergent, ie different sequences on DNA sequence level may be advantageous or the use of promoters for gene expression, the other temporal gene expression eg depending on the degree of ripeness of a seed or oil-storing tissue.
  • the number or activity of other genes necessary for the import of nutrients necessary for the biosynthesis of one or more fatty acids, oils, polar and / or neutral lipids may be increased, such that the concentration of these precursors, cofactors or intermediates within the cells or within the storage compartment, thereby further increasing the ability of the cells to produce PUFAs, as described below.
  • the isolated nucleic acid molecules used in the method of the invention encode proteins or parts thereof, wherein the proteins or the single protein or parts thereof contain an amino acid sequence sufficiently homologous to an amino acid sequence shown in the sequences SEQ ID NO: 2 that the proteins or parts thereof still have an ⁇ -3-desaturase-desaturase activity.
  • the proteins or portions thereof encoded by the nucleic acid molecule (s) still have their essential enzymatic activity and the ability to metabolically metabolize or transport necessary to establish cell membranes or lipid bodies in organisms in plants to participate in molecules through these membranes.
  • the proteins encoded by the nucleic acid molecules are at least about 60%, preferably at least about 70%, and more preferably at least about 80% or 90%, and most preferably at least about 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • homology or homologous, identical or identical is meant homology or homologous, identical or identical.
  • the homology was calculated over the entire amino acid or nucleic acid sequence range.
  • a number of programs that are based on different algorithms are available to the person skilled in the art.
  • the algorithms of Needleman and Wunsch or Smith and Waterman provide particularly reliable results.
  • the program PileUp was used (J. Mol. Evolution., 25, 351-360, 1987, Higgins et al., CABIOS, 5 1989: 151-153) or the Gap and BestFit programs [Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970) and Smith and Waterman (Adv. Appl. Math.
  • 3-desaturase is to be understood as having at least one enzymatic activity of at least 10%, preferably 20%, compared to the proteins / enzymes encoded by the sequence with SEQ ID NO: 1 and its derivatives It may preferably have 30% and especially 40%, and may participate in the metabolism of compounds necessary for building up fatty acids, fatty acid esters such as diacylglycerides and / or triacylglycerides in an organism advantageously a plant or plant cell or on the transport of molecules via membranes, wherein C 18 -, C o- or C 22 carbon chains in the fatty acid molecule with double bonds at least two, preferably three, four, five or six positions are meant.
  • Nucleic acids useful in the method are derived from bacteria, fungi, diatoms, animals such as algae or mosses such as the genera Shewanella, Physcomitrella, Thraustochytrium, Fusarium, Phytophthora, Ceratodon, Isochrysis, Aleurita, Muscarioides, Mortierella, Phaeodactylum, Crypthecodinium , Species of the genera and species Thallasiosira pseudonona, Euglena gracilis, Physcomitrella patens, Phytophthora infestans, Fusarium graminaeum, Cryptodecinium cohnii, Ceratodon purpureus, Isochrysis galbana, Aleurita farinosa, Thraustochytrium sp., Muscarioides viallii, Mortierella alpina, Phaeodactylum tricornutum or Caen
  • nucleotide sequences can be used which code for ⁇ -3-desaturase and hybridize to a nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 1, advantageously under stringent conditions.
  • the nucleic acid sequences used in the method are advantageously introduced into an expression cassette which enables expression of the nucleic acids in organisms such as microorganisms or plants.
  • the nucleic acid sequences coding for the ⁇ -3-desaturase are advantageously linked functionally to one or more regulatory signals in order to increase gene expression.
  • These regulatory sequences are intended to allow the targeted expression of genes and protein expression. Depending on the host organism, this may mean, for example, that the gene is only expressed after induction and / or overexpressed, or that it is immediately expressed and / or overexpressed.
  • these regulatory sequences are sequences that bind to the inducers or repressors and thus regulate the expression of the nucleic acid.
  • the natural regulation of these sequences may still be present before the actual structural genes and may have been genetically altered so that natural regulation is eliminated and gene expression increased.
  • the gene construct may advantageously also contain one or more so-called enhancer sequences operably linked to the promoter which allow for increased expression of the nucleic acid sequence.
  • Additional advantageous sequences can also be inserted at the 3 'end of the DNA sequences, such as further regulatory elements or terminators.
  • only one copy of the genes is present in the expression cassette.
  • This gene construct or gene cohorts can be expressed together in the host organism.
  • the gene construct or the gene constructs can be inserted in one or more vectors and be present freely in the cell or else be inserted in the genome. It is advantageous for the insertion of additional genes in the host genome when the genes to be expressed are present together in a gene construct.
  • the regulatory sequences or factors can, as described above, preferably positively influence the gene expression of the introduced genes and thereby increase them.
  • enhancement of the regulatory elements can advantageously be done at the transcriptional level by using strong transcription signals such as promoters and / or enhancers.
  • an enhancement of the translation is also possible, for example by improving the stability of the mRNA.
  • a further embodiment of the invention are one or more gene constructs which contain one or more sequences which are defined by SEQ ID NO: 1 or its derivatives and which code for polypeptides according to SEQ ID NO: 2.
  • the mentioned ⁇ -3-desaturase proteins advantageously lead to a desaturation of ⁇ -6-fatty acids, wherein the substrate advantageously has two, three, four or five double bonds and advantageously has 18, 20 or 22 carbon atoms in the fatty acid molecule.
  • Advantageous regulatory sequences for the novel process are, for example, in promoters, such as the cos, tac, trp, tet, trp-tet, lpp, lac, lpp-lac, laclq, T7, T5 , T3, gal, trc, ara, SP6, ⁇ -PR or ⁇ -PL promoter and are advantageously used in Gram-negative bacteria.
  • promoters such as the cos, tac, trp, tet, trp-tet, lpp, lac, lpp-lac, laclq, T7, T5 , T3, gal, trc, ara, SP6, ⁇ -PR or ⁇ -PL promoter and are advantageously used in Gram-negative bacteria.
  • Further advantageous regulatory sequences are, for example, in the Gram-positive promoters amy and SPO2, in the yeast or fungal promoters ADC1, MF ⁇ , AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH or in the plant promoters CaMV / 35S [Franck et al., Cell 21 (1980) 285-294], PRP1 [Ward et al. Plant. Mol. Bioi. 22 (1993)], SSU, OCS, Iib4, usp, STLS1, B33, nos or in the ubiquitin or phaseolin promoter.
  • inducible promoters such as those described in EP-A-0 388 186 (benzylsulfonamide-inducible), Plant J. 2, 1992: 397-404 (Gatz et al, tetracycline-inducible), EP-A -0 335 528 (abzisinicin-inducible) or WO 93/21334 (ethanol- or cyclohexenol-inducible) promoters.
  • suitable plant promoters are the promoter of cytosolic FBPase or the potato ST LSI promoter (Stockhaus et al., EMBO J.
  • promoters which allow expression in tissues involved in fatty acid biosynthesis.
  • Very specific advantages are seed-specific promoters, such as the USP promoter according to the invention, but also other promoters such as the LeB4, DC3, phaseolin or napin promoter.
  • Further particularly advantageous promoters are seed-specific promoters which can be used for monocotyledonous or dicotyledonous plants and are described in US Pat. No.
  • promoters are suitable, for example, for monocotylone lpt-2 or lpt-1 promoter from barley (WO 95/15389 and WO 95/23230), hordein promoter from barley and other suitable promoters described in WO 99/16890 ,
  • seed-specific promoters can be used, or such promoters that are active in the embryo and / or in the endosperm.
  • seed-specific promoters can consist of both dicotolydonen as well as from monocotolydonen plants are isolated.
  • USP unknown seed protein
  • Vicilin Vicia faba
  • Plant gene expression can also be facilitated by a chemically inducible promoter (see an overview in Gatz 1997, Annu Rev. Plant Physiol Plant Mol. Biol, 48: 89-108).
  • Chemically inducible promoters are particularly useful when it is desired that gene expression be in a time-specific manner. Examples of such promoters are a salicylic acid-inducible promoter (WO 95/19443), a tetracycline-inducible promoter (Gatz et al. (1992) Plant J. 2, 397-404) and an ethano-inducible promoter.
  • each of the nucleic acids used in the process for the ⁇ -3-desaturase or other genes of fatty acid biosynthesis, such as ⁇ -9 elongase, ⁇ -6-desaturase, ⁇ -8-desaturase, ⁇ -6 elongase, ⁇ -5-desaturase, ⁇ -5 elongase and / or ⁇ -4-desaturase are expressed under the control of their own preferably a different promoter, since repeating Sequence motifs can lead to instability of the T-DNA or to recombination events.
  • the expression cassette is advantageously constructed in such a way that a promoter has a suitable cleavage site for the insertion of the nucleic acid to be expressed, advantageously followed by a polylinker, optionally followed by a terminator behind the polylinker.
  • This sequence is repeated several times, preferably three, four or five times, so that up to five genes can be brought together in one construct and thus introduced into the transgenic plant for expression.
  • the sequence is repeated up to three times.
  • the nucleic acid sequences are inserted for expression via the appropriate interface, for example in the polylinker downstream of the promoter.
  • each nucleic acid sequence has its own promoter and optionally its own terminator.
  • Such advantageous constructs are disclosed, for example, in DE 10102337 or DE 101 ⁇ 2338 (see, for example, in the appended Sequence Listings).
  • the insertion site or the sequence of the inserted nucleic acids in the expression cassette is not of decisive importance, that is to say a nucleic acid sequence can be inserted at the first or last position in the cassette, without this significantly influencing the expression.
  • It can be in the Expression cassette advantageously different promoters such as the USP, LegB4 or DC3 promoter and different terminators can be used. But it is also possible to use only one type of promoter in the cassette.
  • transcription of the introduced genes should be advantageously aborted by suitable terminators at the 3 'end of the introduced biosynthetic genes (beyond the stop codon).
  • the OCS1 terminator can be used here.
  • different terminator sequences should be used for each gene.
  • the gene construct may, as described above, also include other genes to be introduced into the organisms. It is possible and advantageous to introduce into the host organisms regulatory genes, such as genes for inducers, repressors or enzymes, which intervene by their enzyme activity in the regulation of one or more genes of a biosynthetic pathway, and to express therein. These genes may be of heterologous or homologous origin.
  • biosynthesis genes of the fatty acid or lipid metabolism can advantageously be contained in the nucleic acid construct or gene construct, or else these genes can be located on a further or several further nucleic acid constructs.
  • nucleic acid sequences are biosynthesis genes of the fatty acid or lipid metabolism selected from the group of acyl-CoA: lysophospholipid acyltransferase, ⁇ -4-desaturase, ⁇ -5-desaturase, ⁇ -6-desaturase, ⁇ -8 Desatuase, ⁇ -9-desaturase, ⁇ -12-desaturase, ⁇ -5 elongase, ⁇ -6 elongase and / or ⁇ -9 elongase.
  • acyl-CoA lysophospholipid acyltransferase, ⁇ -4-desaturase, ⁇ -5-desaturase, ⁇ -6-desaturase, ⁇ -8 Desatuase, ⁇ -9-desaturase, ⁇ -12-desaturase, ⁇ -5 elongase, ⁇ -6 elongase and / or ⁇ -9 elongase.
  • nucleic acids or genes can be cloned in combination with other elongases and desaturases in expression cassettes, such as those mentioned above, and used to transform plants using Agrobacterium.
  • the regulatory sequences or factors can, as described above, preferably positively influence the gene expression of the introduced genes and thereby increase them.
  • enhancement of the regulatory elements can advantageously be done at the transcriptional level by using strong transcription signals such as promoters and / or enhancers.
  • the expression cassettes can in principle be used directly for introduction into the plant or else introduced into a vector.
  • These advantageous vectors contain the nucleic acids according to the invention which code for .omega.-3-desaturases and optionally further nucleic acids used in the method which are responsible for ⁇ -9-enone gases, .DELTA.-6-desaturases, .DELTA -8-desaturases, ⁇ -6-elongases, ⁇ -5-desaturases, ⁇ -5- elongases or ⁇ -4-desafurases, or a nucleic acid construct containing the nucleic acid used alone or in combination with further biosynthesis genes of the fatty acid or lipid metabolism such as the acyl-CoA: lysophospholipid acyltransferases, ⁇ -4-desaturases, ⁇ -5-desaturases, ⁇ -6-desaturases, ⁇ -8-desatuases, ⁇ -9-desaturases, ⁇ -12-desaturases, ⁇ 3- Desaturases, ⁇ -5-elongases, ⁇ -6-elongases and
  • vector refers to a nucleic acid molecule that can transport another nucleic acid to which it is attached.
  • plasmid which is a circular double-stranded DNA loop into which additional DNA segments can be ligated.
  • viral vector Another type of vector is a viral vector, where additional DNA segments can be ligated into the viral genome.
  • Certain vectors can autonomously replicate in a host cell in which they have been introduced (e.g., bacterial origin of bacterial vectors). Other vectors are advantageously integrated into the genome of a host cell upon introduction into the host cell and thereby replicated together with the host genome.
  • certain vectors may direct the expression of genes to which they are operably linked.
  • expression vectors suitable for recombinant DNA techniques are in the form of plasmids.
  • plasmid and “vector” can be used interchangeably since the plasmid is the most commonly used vector form.
  • the invention is intended to encompass these other forms of expression vectors, such as viral vectors that perform similar functions.
  • vector is also intended to encompass other vectors known to those skilled in the art, such as phages, viruses such as SV40, CMV, TMV, transposons, IS elements, phasmids, phagemids, cosmids, linear or circular DNA.
  • the recombinant expression vectors advantageously used in the method comprise the above-described nucleic acid sequences and / or the above-described gene construct in a form suitable for expression of the nucleic acids used in a host cell, which means that the recombinant expression vectors select one or more regulatory sequences based on the host cells to be used for expression, which is operably linked to the nucleic acid sequence to be expressed.
  • operably linked means that the nucleotide sequence of interest is bound to the regulatory sequence (s) such that expression of the nucleotide sequence is possible and they are linked to each other such that both sequences fulfill the predicted function ascribed to the sequence (eg in an in vitro transcription / translation system or in a host cell when the vector is introduced into the host cell).
  • regulatory sequence is intended Promoters, enhancers and other expression control elements (eg, polyadenylation signals).
  • Regulatory sequences include those that direct the constitutive expression of a nucleotide sequence in many types of host cells and those that direct the direct expression of the nucleotide sequence only in certain host cells, under certain conditions.
  • the design of the expression vector may depend on factors such as the selection of the host cell to be transformed, the level of expression of the desired protein, etc.
  • the recombinant expression vectors used can be used for expression of ⁇ -3-desaturases, ⁇ -9-elongases, ⁇ -6-desaturases, ⁇ -8-desaturases, ⁇ -6-elongases, ⁇ -5-desaturases, ⁇ -5-elongases and or ⁇ 4-desaturases in prokaryotic or eukaryotic cells. This is advantageous because intermediate steps of the vector construction are often carried out in microorganisms for the sake of simplicity.
  • the recombinant expression vector may alternatively be transcribed and translated in vitro, for example using T7 promoter regulatory sequences and T7 polymerase.
  • the expression of proteins in prokaryotes is usually carried out with vectors which contain constitutive or inducible promoters which control the expression of fusion or non-fusion proteins.
  • Typical fusion expression vectors include pGEX (Pharmacia Biotech Ine, Smith, DB, and Johnson, KS (1988) Gene 67: 31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA), and pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ). in which glutathione S-transferase (GST), maltose E-binding protein or protein A is fused to the recombinant target protein.
  • GST glutathione S-transferase
  • pTrc amann et al., (1988) Gene 69: 301-315
  • pET 11d a coexpressed viral RNA polymerase
  • T7 gn1 a coexpressed viral RNA polymerase
  • This viral polymerase is provided by the host strains BL21 (DE3) or HMS174 (DE3) from a resident ⁇ prophage harboring a T7 gn1 gene under the transcriptional control of the lacUV 5 promoter.
  • vectors in prokaryotic organisms are known to those skilled in the art, these vectors are, for example, in E. coli pLG338, pACYC184, the pBR series, such as pBR322, the pUC series, such as pUC18 or pUC19, the M113mp series, pKC30, pRep4, pHS1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pN-IIH 13-B1, ⁇ gt11 or pBdCI, Streptomyces pI101, pI364, pIJ702 or pIJ361, Bacillus pUB110, pC194 or pBD214, Corynebacterium pSA77 or pAJ667.
  • the expression vector is a yeast expression vector.
  • yeast expression vectors for expression in the yeast S. cerevisiae include pYe-desaturase (Baldari et al. (1987) Embo J. 6: 229-234), pMFa (Kurjan and Herskowitz (1982) Cell 30: 933-943), pJRY88 (Schultz et al. (1987) Gene 54: 113-123) and pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA).
  • Vectors and methods for the construction of vectors suitable for use in other fungi, such as the filamentous fungi include those described in detail in: van den Hondel, C.A.M.J.J, & Punt, P.J.
  • yeast vectors are, for example, pAG-1, YEp6, YEp13 or pEMBLYe23.
  • ⁇ -3-desaturases, ⁇ -9-elongases, ⁇ -6-desaturases, ⁇ -8-desaturases, ⁇ -6-elongases, ⁇ -5-desaturases, ⁇ -5-elongases and / or ⁇ 4-desaturases are expressed in insect cells using baculovirus expression vectors.
  • Baculovirus vectors used for expression of proteins in bred Insect cells include the pAc series (Smith et al (1983) Mol. Cell Biol. 3: 2156-2165) and the pVL series (Lucklow and Summers (1989) Virology 170: 31-39).
  • Citations, and plant cells from higher plants e.g., spermatophytes such as crops.
  • plant expression vectors include those described in detail in: Becker, D, Kemper, E, Schell, J, and Masterson, R. (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border "Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197; and Bevan, M.W. (1984) "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation", Nucl. Acids Res. 12: 8711-8721; Vectors for Gene Transfer to Higher Plants; in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds .: Kung and R. Wu, Academic Press, 1993, pp. 15-38.
  • a plant expression cassette preferably contains regulatory sequences that can direct gene expression in plant cells and are operably linked so that each sequence can perform its function, such as termination of transcription, for example, polyadenylation signals.
  • Preferred polyadenylation signals are those derived from Agrobacterium tumefaciens T-DNA, such as the gene 3 of the Ti plasmid pTiACH5 known as octopine synthase (Gielen et al, EMBO J. 3 (1984) 835ff.) Or functional equivalents thereof, but all other terminators functionally active in plants are also suitable.
  • a plant expression cassette preferably contains other operably linked sequences, such as translation enhancers, e.g., the overdrive sequence containing the 5'-untranslated tobacco mosaic virus leader sequence, which is the protein / RNA ratio increases (Gallie et al., 1987, Nucl. Acids Research 15: 8693-8711).
  • translation enhancers e.g., the overdrive sequence containing the 5'-untranslated tobacco mosaic virus leader sequence, which is the protein / RNA ratio increases (Gallie et al., 1987, Nucl. Acids Research 15: 8693-8711).
  • Plant gene expression must be operably linked to a suitable promoter that performs gene expression in a timely, cell or tissue-specific manner.
  • useful promoters are constitutive promoters (Benfey et al., EMBO J. 8 (1989) 2195-2202), such as those derived from Plant viruses such as 35S CAMV (Franck et al, Cell 21 (1980) 285-294), 19S CaMV (see also US 5352605 and WO 84/02913) or plant promoters such as the Rubisco small subunit described in US 4,962,028.
  • telomeres are preferred sequences necessary to direct the gene product into its corresponding cell compartment (see review in Kermode, Crit., Plant, 15, 4 (1996) 285) -423 and references cited therein), for example, in the vacuole, the nucleus, all kinds of plastids, such as amyloplasts, chloroplasts, chromoplasts, the extracellular space, the mitochondria, the endoplasmic reticulum, oily bodies, peroxisomes and other compartments of plant cells.
  • plastids such as amyloplasts, chloroplasts, chromoplasts, the extracellular space, the mitochondria, the endoplasmic reticulum, oily bodies, peroxisomes and other compartments of plant cells.
  • Plant gene expression can also be facilitated by a chemically inducible promoter as described above (see review in Gatz 1997, Annu Rev. Plant Physiol Plant Mol. Biol, 48: 89-108).
  • Chemically inducible promoters are particularly useful when it is desired that gene expression be in a time-specific manner. Examples of such promoters are a salicylic acid-inducible promoter (WO 95/19443), a tetracycline-inducible promoter (Gatz et al. (1992) Plant J. 2, 397-404) and an ethanol-inducible promoter.
  • Promoters which react to biotic or abiotic stress conditions are also suitable promoters, for example the pathogen-induced PRP1 gene promoter (Ward et al., Plant Mol. Biol. 22 (1993) 361-366), the tomato heat-inducible hsp ⁇ O promoter (US 5,187,267), the potato inducible alpha-amylase promoter (WO 96/12814) or the wound-inducible pinII promoter (EP-A-0375091).
  • those promoters which induce gene expression in tissues and organs in which the fatty acid, lipid and oil biosynthesis take place are preferred in sperm cells such as the cells of the endosperm and the developing embryo.
  • Suitable promoters are the rapeseed napkin promoter (US 5,608,152), the Vicia faba USP promoter (Baeumlein et al, Mol Gen Genet, 1991, 225 (3): 459-67), the Arabidopsis oleosin promoter (WO 98/45461), the phaseolin promoter from Phaseolus vulgaris (US 5,504,200), the Brassica Bce4 promoter (WO 91/13980) or the legumin B4 promoter (LeB4; Baeumlein et al, 1992, Plant Journal, 2 ( 2): 233-9) as well as promoters which induce seed-specific expression in monocotyledonous plants such as maize, barley, wheat, rye, rice, etc.
  • Suitable noteworthy promoters are the lpt2 or Ipt1
  • Barley gene promoter (WO 95/15389 and WO 95/23230) or the promoters described in WO 99/16890 from the barley hordein gene, the rice glutelin gene, the rice oryzine gene, the rice Proline protein, wheat gliadin gene, wheat glutelin gene, maize zein gene, oat glutelin gene, sorghum kasirin gene, rye secalin gene).
  • the multiparallel expression of the ⁇ -3-desaturases, ⁇ -9-elongases, ⁇ -6-desaturases, ⁇ -8-desaturases, ⁇ -6-elongases, ⁇ -5-desaturases, ⁇ -5-elongases used in the method can be and / or ⁇ -4 desaturases.
  • the introduction of such expression cassettes can be carried out via a simultaneous transformation of a plurality of individual expression constructs or preferably by combining a plurality of expression cassettes on a construct. It is also possible to transform a plurality of vectors each having a plurality of expression cassettes and to transfer them to the host cell.
  • promoters which induce plastid-specific expression since plastids are the compartment in which the precursors as well as some end products of lipid biosynthesis are synthesized.
  • Suitable promoters such as the viral RNA polymerase promoter, are described in WO 95/16783 and WO 97/06250, and the Arabidopsis clpP promoter described in WO 99/46394.
  • Vector DNA can be introduced into prokaryotic or eukaryotic cells via conventional transformation or transfection techniques.
  • transformation and “transfection”, conjugation and transduction are intended to encompass a variety of methods known in the art for introducing foreign nucleic acid (eg DNA) into a host cell, including calcium phosphate or calcium chloride coprecipitation, DEAE- Dextran-mediated transfection, lipofection, natural competence, chemically mediated transfer, electroporation or particle bombardment.
  • Suitable methods for transforming or transfecting host cells, including plant cells can be found in Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N °, 1989) and other laboratory manuals, such as Methods in Molecular Biology, 1995, Vol. 44, Agrobacterium protocols, Eds: Gartland and Davey, Humana Press, Totowa, New Jersey.
  • Host cells which are suitable in principle for receiving the nucleic acid according to the invention, the gene product according to the invention or the vector according to the invention are all prokaryotic or eukaryotic organisms.
  • the host organisms which are advantageously used are microorganisms, such as fungi or yeasts or plant cells, preferably plants or parts thereof.
  • Fungi, yeasts or plants are preferably used, more preferably plants, most preferably plants such as oil crops containing high levels of lipid compounds such as oilseed rape, evening primrose, hemp, Diestel, peanut, canola, flax, soy, safflower, sunflower, borage , or plants such as corn, wheat, rye, oats, triticale, rice, barley, cotton, cassava, pepper, tagetes, solanaceae plants such as potato, tobacco, eggplant and tomato, vicia species, pea, alfalfa, bush plants ( Coffee, cocoa, tea), Salix species, trees (oil plan, coconut) and perennial grasses and forage crops.
  • oilseed rape evening primrose, hemp, Diestel, peanut, canola, flax, soy, safflower, sunflower, borage , or plants such as corn, wheat, rye, oats, triticale, rice, barley, cotton, cassava, pepper, tagetes, solan
  • Particularly preferred plants according to the invention are oil crop plants, such as soybean, peanut, rapeseed, canola, flax, hemp, evening primrose, sunflower, safflower, trees (oil palm, coconut).
  • a further subject of the invention are isolated nucleic acid sequences as described above which code for polypeptides having ⁇ -3-desaturase activity, wherein the ⁇ -3-desaturases encoded by the nucleic acid sequences comprise C 18 , C 20 and C 12 fatty acids with two, three, four or five double bonds and advantageously polyunsaturated C 8 fatty acids having two or three double bonds and polyunsaturated C 20 fatty acids having two, three or four double bonds.
  • C 22 fatty acids with four or five double bonds are also desaturated.
  • nucleic acid (molecule) also comprises, in an advantageous embodiment, the untranslated sequence located at the 3 'and 5' end of the coding gene region: at least 500, preferably 200, more preferably 100 nucleotides of the sequence upstream of the 5 'end of the coding region and at least 100, preferably 50, more preferably 20 nucleotides of the sequence downstream of the 3' end of the coding gene region.
  • An "isolated" nucleic acid molecule is separated from other nucleic acid molecules present in the natural source of the nucleic acid.
  • an "isolated" nucleic acid preferably does not have sequences that naturally flank the nucleic acid in the genomic DNA of the organism from which the nucleic acid is derived (e.g., sequences located at the 5 'and 3' ends of the nucleic acid).
  • the isolated ⁇ -3 desaturase molecule may contain less than about 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb, or 0.1 kb of nucleotide sequences naturally occurring Flank the nucleic acid molecule in the genomic DNA of the cell from which the nucleic acid is derived.
  • nucleic acid molecules used in the method can be isolated using standard molecular biology techniques and the sequence information provided herein. Also, by comparison algorithms, for example, a homologous sequence or homologous, conserved sequence regions at the DNA or amino acid level can be identified. These can be used as a hybridization probe as well as standard hybridization techniques (such as described in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). to isolate further nucleic acid sequences useful in the method.
  • a nucleic acid molecule comprising a complete sequence of SEQ ID NO: 1 or a portion thereof can be isolated by polymerase chain reaction, using oligonucleotide primers based on this sequence or portions thereof (eg, a nucleic acid molecule comprising the complete Sequence or part thereof, isolated by polymerase chain reaction using oligonucleotide primers prepared on the basis of this same sequence).
  • mRNA can be isolated from cells (eg, by the guanidinium thiocyanate extraction method of Chirgwin et al.
  • Synthetic oligonucleotide primers for polymerase chain reaction amplification can be prepared on the basis of the sequence shown in SEQ ID NO: 1 or by using the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • a nucleic acid of the invention may be amplified using cDNA or alternatively genomic DNA as a template and appropriate oligonucleotide primers according to standard PCR amplification techniques.
  • the thus amplified nucleic acid can be cloned into a suitable vector and characterized by DNA sequence analysis.
  • Oligonucleotides corresponding to a desaturase nucleotide sequence can be prepared by standard synthetic methods, for example, with an automatic DNA synthesizer.
  • Homologs of the ⁇ -3-desaturase nucleic acid sequence having the sequence SEQ ID NO: 1 mean, for example, allelic variants having at least about 60%, preferably at least 70%, more preferably at least 80%, 90% or 95% and even more preferably at least about 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or more of identity or homology to a nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or its homologs, derivatives or analogs or parts thereof.
  • homologs are isolated nucleic acid molecules having a nucleotide sequence which hybridize to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a part thereof, eg hybridized under stringent conditions.
  • Allelic variants include, in particular, functional variants which can be obtained by deletion, insertion or substitution of nucleotides from / in the sequence shown in SEQ ID NO: 1, but the intention is that the enzyme activity of the resulting synthesized proteins for the Insertion of one or more genes is advantageously maintained.
  • Homologs of SEQ ID NO: 1 also mean, for example, bacterial, fungal and plant homologs, truncated sequences, single-stranded DNA or RNA of the coding and non-coding DNA sequence. Homologs of SEQ ID NO: 1 also mean derivatives, such as promoter variants.
  • the promoters upstream of the indicated nucleotide sequences may be modified by one or more nucleotide exchanges, insertions, and / or deletions, without, however, interfering with the functionality or activity of the promoters. It is also possible that the activity of the promoters is increased by modification of their sequence or that they are completely replaced by more active promoters, even from heterologous organisms.
  • nucleic acids and protein molecules with ⁇ -3-desaturase activity which are involved in the metabolism of lipids and fatty acids, PUFA cofactors and enzymes or in the transport of lipophilic compounds via membranes, are used in the process according to the invention for modulating the production of PUFAs transgenic organisms advantageously in plants such as maize, wheat, rye, oats, triticale, rice, barley, soybean, peanut, cotton, linum species such as oil or fiber kidney, Brassica species such as oilseed rape, canola and turnip rape, pepper, Sunflower, borage, evening primrose and Tagetes, Solanacaen plants such as potato, tobacco, eggplant and tomato, Vicia species, pea, cassava, alfalfa, bush plants (coffee, cocoa, tea), Salix species, trees (oil palm, coconut) and perennial grasses and forage fields, either directly (eg when overexpression or optimization of a fatty acid biosynthesis protein has
  • PUFAs polyunsaturated fatty acids
  • stearidonic acid, eicosapentaenoic acid and docosahexaenoic acid are boraginaceae, primulaceae or linaceae.
  • Lein Lipid usitatissimum
  • Lipid synthesis can be divided into two parts: the synthesis of fatty acids and their binding to sn-glycerol-3-phosphate, as well as the addition or modification of fication of a polar head group.
  • Common lipids used in membranes include phospholipids, glycolipids, sphingolipids and phosphoglycerides.
  • Fatty acid synthesis begins with the conversion of acetyl-CoA into malonyl-CoA by the acetyl-CoA carboxylase or into acetyl-ACP by the acetyl transacylase. After a condensation reaction, these two product molecules together form acetoacetyl-ACP, which is converted via a series of condensation, reduction and dehydration reactions to give a saturated fatty acid molecule of the desired chain length.
  • the production of unsaturated fatty acids from these molecules is catalyzed by specific desaturases, either aerobically by molecular oxygen or anaerobically (for fatty acid synthesis in microorganisms, see FC Neidhardt et al., (1996) E.
  • Precursors for PUF ⁇ biosynthesis are, for example, oleic acid, linoleic acid and linolenic acid. These C “ 8" carbon fatty acids must be extended to C “ 20" and C “ 22" to obtain Eicosa- and Docosa-type fatty acids.
  • arachidonic acid can be converted to eicosapentaenoic acid and docosapentaenoic acid to docosahexaenoic acid and subsequently used for various purposes in food, feed, cosmetic or pharmaceutical applications.
  • the desaturation can be carried out before or after elongation of the corresponding fatty acid.
  • the products of desaturase activities and possible further desaturation and elongation result in preferred PUFAs having a higher degree of desaturation, including a further elongation of C 20 to C 22 fatty acids.
  • Substrates of the desaturase used in the process according to the invention are C 18 , C 20 or C 22 fatty acids, for example linoleic acid, ⁇ -linolenic acid, dihomo- ⁇ -linolenic acid, arachidonic acid, docosatetraenoic acid or docosapentaenoic acid.
  • Preferred substrates are arachidonic acid, docosatetraenoic acid or docosapentaenoic acid.
  • the synthesized C 20 - or C 22 -fatty acids having at least two double bonds in the fatty acid are obtained in the process according to the invention in the form of the free fatty acid or in the form of their esters, for example in the form of their glycerides.
  • glycolide is understood to mean a glycerol esterified with one, two or three carboxylic acid residues (mono-, di- or triglyceride).
  • glycolide is also meant a mixture of different glycerides.
  • the glyceride or the glyceride mixture may contain further additives, eg free fatty acids, antioxidants, proteins, carbohydrates, vitamins and / or other substances.
  • a "glyceride” in the sense of the method according to the invention is also understood to mean derivatives derived from glycerol.
  • these also include glycerophospholipids and glyceroglycolipids.
  • the glycerophospholipids such as lecithin (phosphatidylcholine), cardiolipin, phosphatidylglycerol, phosphatidylserine and alkylacylglycerophospholipids, may be mentioned by way of example here.
  • fatty acids must then be transported to various modification sites and incorporated into the triacylglycerol storage lipid.
  • Another important step in lipid synthesis is the transfer of fatty acids to the polar head groups, for example, by glycerol-fatty acid acyltransferase (see Frentzen, 1998, Lipid, 100 (4-5): 161-166).
  • the PUFAs produced in the process comprise a group of molecules that are no longer able to synthesize, and therefore need to take up, higher animals, or that can no longer sufficiently produce higher animals themselves, and thus have to additionally take up, even though they are readily synthesized by other organisms, such as bacteria For example, cats can no longer synthetize arachidonic acid.
  • phospholipids which are advantageously reacted by the ⁇ -3-desaturase according to the invention are phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, phosphatidylglycerol and / or phosphatidylinositol, advantageously phosphatidylcholine.
  • production or productivity are known in the art and include the concentration of the fermentation product (compounds of the formula I) in a given period of time and a certain fermentation volume is formed (eg kg of product per hour per liter).
  • the term efficiency of production includes the time required to reach a certain amount of production (eg, how long the cell needs to set up a specific throughput rate of a fine chemical).
  • yield or product / carbon yield is known in the art and includes the efficiency of converting the carbon source into the product (ie, the fine chemical). This is usually expressed, for example, as kg of product per kg of carbon source.
  • biosynthesis or biosynthetic pathway are known in the art and involve the synthesis of a compound, preferably an organic compound, by a cell from intermediates, for example in a multi-step and highly regulated process.
  • degradation or degradation pathway are well known in the art and involve the cleavage of a compound, preferably an organic compound, by a cell into degradation products (more generally, smaller or less complex molecules) in, for example, a multi-step and highly regulated process.
  • metabolism is known in the art and includes the entirety of the biochemical reactions that take place in an organism.
  • the metabolism of a particular compound eg, the metabolism of a fatty acid
  • DNA sequence polymorphisms that result in changes in the ⁇ -3 desaturase amino acid sequences can exist within a population.
  • These genetic polymorphisms in the ⁇ -3 desaturase gene may exist between individuals within a population due to natural variation. These natural variants usually cause a variance of 1 to 5% in the nucleotide sequence of the ⁇ -3-desaturase gene. All and all of these nucleotide variations and resulting amino acid polymorphisms in the ⁇ -3 desaturase, which are the result of natural variation and do not alter the functional activity of, are intended to be included within the scope of the invention.
  • Nucleic acid molecules advantageous for the method according to the invention can be isolated on the basis of their homology to the ⁇ -3-desaturase nucleic acids disclosed herein using the sequences or a part thereof as hybridization probe according to standard hybridization techniques under stringent hybridization conditions.
  • isolated nucleic acid molecules can be used which are at least 15 nucleotides long and under stringent conditions with the nucleic acid molecules comprising a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, hybridize.
  • Nucleic acids of at least 25, 50, 100, 250 or more nucleotides may also be used.
  • hybridized under stringent conditions is intended to describe hybridization and washing conditions, among which nucleotide sequences accounting for at least 60% homologous to each other, usually remain hybridized to each other.
  • the conditions are preferably such that sequences that are at least about 65%, more preferably at least about 70%, and even more preferably at least about 75% or more homologous, are usually hybridized to each other.
  • These stringent conditions are known to those skilled in the art and can be found in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1989), 6.3.1-6.3.6.
  • a preferred, non-limiting example of stringent hybridization conditions are hybridizations in 6x sodium chloride / sodium citrate (SSC) at about 45 ° C, followed by one or more washes in 0.2x SSC, 0.1%. SDS at 50 to 65 ° C. It is known to those skilled in the art that these hybridization conditions differ with respect to the type of nucleic acid and, for example, when organic solvents are present, with respect to the temperature and the concentration of the buffer. The temperature differs, for example under "standard hybridization conditions" depending on the type of nucleic acid between 42 ° C and 58 ° C in aqueous buffer with a concentration of 0.1 to 5 x SSC (pH 7.2).
  • the temperature is about 42 ° C under standard conditions.
  • the hybridization conditions for DNA: DNA hybrids are, for example, 0.1 x SSC and 20 ° C to 45 ° C, preferably between 30 ° C and 45 ° C.
  • the hybridization conditions for DNA: RNA hybrids are, for example, 0.1 x SSC and 30 ° C to 55 ° C, preferably between 45 ° C and 55 ° C.
  • the sequences are written among each other for the purpose of optimal comparison (eg gaps in the Sequence of one protein or nucleic acid can be inserted to create an optimal alignment with the other protein or nucleic acid).
  • the amino acid residues or nucleotides at the corresponding amino acid positions or nucleotide positions are then compared. If a position in one sequence is occupied by the same amino acid residue or nucleotide as the corresponding site in the other sequence, then the molecules are homologous at that position (ie, amino acid or nucleic acid 'homology' as used herein).
  • the terms homology and identity are thus to be regarded as synonymous.
  • the programs or algorithms used are described above.
  • An isolated nucleic acid molecule encoding a ⁇ -3 desaturase homologous to the protein sequence of SEQ ID NO: 2 can be generated by introducing one or more nucleotide substitutions, additions or deletions into a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, such that one or more amino acid substitutions, additions or deletions are introduced into the encoded protein. Mutations can be introduced into any of the sequence of SEQ ID NO: 1 by standard techniques such as site-directed mutagenesis and PCR-mediated mutagenesis. Preferably, conservative amino acid substitutions are made on one or more of the predicted nonessential amino acid residues. In a "conservative amino acid substitution", the amino acid residue is replaced with an amino acid residue having a similar side chain.
  • families of amino acid residues have been defined with similar side chains. These families include amino acids with basic side chains (eg, lysine, arginine, histidine), acidic side chains (eg, aspartic acid, glutamic acid), uncharged polar side chains (eg, glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine), nonpolar side chains (eg Alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan), beta-branched side chains (eg threonine, valine, isoleucine) and aromatic side chains (eg tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine).
  • basic side chains eg, lysine, arginine, histidine
  • acidic side chains eg, aspartic acid, glutamic acid
  • uncharged polar side chains eg, g
  • a predicted non-essential amino acid residue in a lysophosphatidic acid acyltransferase, glycerol-3-phosphate acyltransferase, diacylglycerol acyltransferase or lecithin cholesterol acyltransferase is thus preferably exchanged for another amino acid residue from the same side chain family.
  • the mutations may be introduced randomly over all or part of the lysophosphatidic acid acyltransferase, glycerol-3-phosphate acyltransferase, diacylglycerol acyltransferase or lecithin cholesterol acyltransferase coding sequence, e.g.
  • the encoded protein can be recombinantly expressed, and the activity of the protein can be e.g. be determined using the tests described herein.
  • transgenic non-human organisms which contain the nucleic acids SEQ ID NO: 1 according to the invention or a gene construct or a vector which contain these nucleic acid sequences according to the invention.
  • the non-human organism is a microorganism, a non-human animal or a plant, more preferably a plant.
  • Example 1 General Cloning Methods: The cloning methods such as restriction cleavage, agarose gel electrophoresis, purification of DNA fragments, transfer of nucleic acids to nitrocellulose and nylon membranes, linkage of DNA fragments, transformation of Escherichia coli cells, culture of bacteria and sequence analysis recombinant DNA were used as in Sambrook et al. (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6).
  • Example 2 Sequence Analysis of Recombinant DNA Sequencing of recombinant DNA molecules was carried out with a laser fluorescence DNA sequencer from ABI according to the method of Sanger (Sanger et al. (1977) Proc. Natl.
  • Example 3 Cloning of the ⁇ -3-specific desaturase from Phytophthora infestans By searching for conserved regions in the protein sequences corresponding to the desaturase genes listed in the description, a sequence with corresponding motifs characteristic for a desaturase was identified in an EST sequence database.
  • RNA from Phytophthora infestans was isolated using the RNAeasy kit from Qiagen (Valencia, CA, US) and used to make an EST sequence database. From the total RNA, poly-A + RNA (mRNA) was isolated using oligo-dT-cellulose (Sambrook et al, 1989). The RNA was reverse transcribed with Promega's Reverse Transcription System Kit and the synthesized cDNA cloned into the lambda ZAP vector (lambda ZAP Gold, Stratagene). According to the manufacturer's instructions, the cDNA was unpacked to the plasmid DNA. The cDNA plasmid library was then used for PCR for cloning expression plasmids. The sequence data was stored in a corresponding database.
  • the pi-omega3Done clone was cloned into the yeast expression vector pYES3 for heterologous expression in yeast via PCR with appropriate pi-omega3D specific primers. Only the open reading frame of the gene coding for the pi-omega3Des protein was amplified and provided with two cloning sites for the pYES3 expression vector:
  • Annealing temperature 1 min 55 ° C denaturation temperature: 1 min 94 ° C elongation temperature: 2 min 72 ° C number of cycles: 35
  • the PCR product was incubated for 2 h at 37 ° C with the restriction enzymes HindIII and BamHI.
  • the yeast expression vector pYES3 (Invitrogen) was incubated in the same way. Subsequently, the 1104 bp PCR product and the vector was separated by agarose gel electrophoresis and the corresponding DNA fragments were excised. Purify the DNA using the Qiagen Gel Purification Kit according to the manufacturer's instructions. Subsequently, vector and desaturase cDNA were ligated. The rapid ligation kit from Roche was used for this purpose.
  • the resulting plasmid pYES3-Pi-omega3Des was checked by sequencing and transformed into the Saccharomyces strain INVSd (Invitrogen) by electroporation (1500 V). As a control, pYES3 was transformed in parallel. Subsequently, the yeasts were plated on complete minimal medium without tryptophan with 2% glucose. Cells which were able to grow without tryptophan in the medium thus contain the corresponding plasmids pYES3, pYES3-Pi-omega3Des. After selection, two transformants were selected for further functional expression.
  • composition of the PCR batch (50 ⁇ L): 5.00 ⁇ L template cDNA 5.00 ⁇ L 10x buffer (Advantage polymerase) + 25 mM MgCl 2 5.00 ⁇ L 2 mM dNTP 1.25 ⁇ L per primer (10 pmol / ⁇ L) 0 , 50 ⁇ L Advantage Polymerase The Advantage polymerase from Clontech was used.
  • Annealing temperature 1 min 55 ° C denaturation temperature: 1 min 94 ° C elongation temperature: 2 min 72 ° C number of cycles: 35
  • the PCR products were incubated for 4 h at 37 ° C with the restriction enzyme Notl.
  • the plant expression vector pSUN300-USP was incubated in the same way. Subsequently, the PCR products and the 7624 bp vector were separated by agarose gel electrophoresis and the corresponding DNA fragments were excised. Purify the DNA using Qiagen Gel purification Kit according to the manufacturer's instructions. Subsequently, vector and PCR products were ligated. The rapid ligation kit from Roche was used for this purpose. The resulting plasmid pSUN-piomega3Des was verified by sequencing.
  • Example 6 Expression of Pi omega3Des in Yeasts Yeasts transformed with the plasmid pYES3 or pYES3 pi omega3Des as in Example 4 were analyzed as follows: The yeast cells from the main cultures were purified by centrifugation (100 xg, 5 min, 20 min ° C) and washed with 100 mM NaHCO 3 , pH 8.0 to remove residual medium and fatty acids. From the yeast cell sediments, fatty acid methyl ester (FAMEs) produced by acid methanolysis. For this purpose, the cell sediments were incubated with 2 ml of 1 N methanolic sulfuric acid and 2% (v / v) dimethoxypropane for 1 h at 80 ° C.
  • FAMEs fatty acid methyl ester
  • the extraction of the FAMES was carried out by extraction twice with petroleum ether (PE).
  • PE petroleum ether
  • the organic phases were washed once each with 2 ml of 100 mM NaHCO 3 , pH 8.0 and 2 ml of distilled water. washed.
  • the PE phases were dried with Na 2 SO 4 , evaporated under argon and taken up in 100 ⁇ l of PE.
  • the samples were separated on a DB-23 capillary column (30 m, 0.25 mm, 0.25 ⁇ m, Agilent) in a Hewlett-Packard 6850 gas chromatograph with flame ionization detector.
  • the conditions for the GLC analysis were as follows: The oven temperature was programmed from 50 ° C to 250 ° C at a rate of 5 ° C / min and finally 10 min at 250 ° C (hold). The signals were identified by comparing the retention times with corresponding fatty acid standards (Sigma). The methodology is described, for example, in Napier and Michaelson, 2001, Lipids. 36 (8): 761-766; Sayanova et al, 2001, Journal of Experimental Botany. 52 (360): 1581-1585, Sperling et al, 2001, Arch. Biochem. Biophys. 388 (2): 293-298 and Michaelson et al, 1998, FEBS Letters. 439 (3): 215-218.
  • the substrate specificity of could be determined after expression and feeding of various fatty acids (FIGS. 2 to 8).
  • the fed substrates are present in large quantities in all transgenic yeasts, demonstrating the uptake of these fatty acids into the yeasts.
  • the transgenic yeasts show the synthesis of new fatty acids, the products of the pi omega3Des reaction. This means that the gene Pi omega3Des could be expressed functionally.
  • Figure 2 shows the desaturation of linoleic acid (18: 2 ⁇ -6 fatty acid) to ⁇ -linolenic acid (18: 3 ⁇ -3 fatty acid) by the Pi omega3Des again.
  • the synthesis of the fatty acid methyl esters was carried out by acidic methanolysis of intact cells which had been transformed with the empty vector pYES2 (FIG. 2A) or the vector pYes3-Pi-omega3Des (FIG. 2B). Yeasts were incubated in minimal medium in the presence of C18: 2 ⁇ 9,12 -
  • FIG. 3 shows the desaturation of ⁇ -linolenic acid (18: 3 ⁇ -6 fatty acid) into stearidonic acid (18: 4 ⁇ -3 fatty acid) by pi-omega3Des.
  • the synthesis of the fatty acid methyl esters was carried out by acidic methanolysis of intact cells which had been transformed with the empty vector pYES2 (FIG. 3A) or the vector pYes3-Piohnega3Des (FIG. 3B).
  • the yeasts were cultured in minimal medium in the presence of ⁇ -C18: 3 "fatty acid (300 ⁇ M). Subsequently, the FAMEs were analyzed by GLC.
  • Figure 4 depicts the desaturation of C20: 2- ⁇ -6 fatty acid into C20: 3- ⁇ -3 fatty acid by Pi-omega3Des.
  • the synthesis of the fatty acid methyl esters was carried out by acidic methanolysis of intact cells which had been transformed with the empty vector pYES2 (FIG. 4A) or the vector pYes3-Pi-omega3Des (FIG. 4B).
  • the yeasts were cultured in minimal medium in the presence of C20: 2 ⁇ 11,14 fatty acid (300 ⁇ M). Subsequently, the FAMEs were analyzed by GLC.
  • Figure 5 depicts the desaturation of C20: 3- ⁇ -6 fatty acid into C20: 4- ⁇ -3 fatty acid by Pi-omega3Des.
  • the synthesis of the fatty acid methyl esters was carried out by acidic methanolysis of intact cells which had been transformed with the empty vector pYES2 (FIG. 5A) or the VeMor pYes3-Pi-omega3Des (FIG. 5B).
  • the yeasts were cultured in minimal medium in the presence of C20: 3 ⁇ 8,1, 14- fatty acid (300 ⁇ M). Subsequently, the FAMEs were analyzed by GLC.
  • FIG. 6 shows the desaturation of arachidonic acid (C20: 4- ⁇ -6 fatty acid) into eicosapentaenoic acid (C20: 5- ⁇ -3 fatty acid) by the pi omega3Des.
  • the synthesis of the fatty acid methyl esters was carried out by acidic methanolysis of intact cells which had been transformed with the empty vector pYES2 (FIG. 6A) or the vector pYes3-P ⁇ ega3Des (FIG. 6B).
  • the yeasts were cultured in minimal medium in the presence of C20: 4 ⁇ 5,8 ' 1,14- fatty acid (300 ⁇ M). Subsequently, the FAMEs were analyzed by GLC.
  • FIG. 7 shows the desaturation of docosatetraenoic acid (C22: 4-omega-6 fatty acid) into docosapentaenoic acid (C22: 5-omega-3 fatty acid) by Pi-omega3Des.
  • the synthesis of the fatty acid methyl esters was carried out by acidic methanolysis of intact cells which had been transformed with the empty vector pYES2 (FIG. 7A) or the vector pYes3-Pi-omega3Des (FIG. 7B).
  • the yeasts were grown in minimal medium in the presence of C22: cultured for 4 ⁇ 7,10 '3' 16 -fatty acid (300 uM). Subsequently, the FAMEs were analyzed by GLC.
  • the substrate specificity of Pi omega3Des against various fatty acids is shown in Figure 8.
  • the yeasts transformed with the vector pYes3-Pi-omega3Des were cultured in minimal medium in the presence of the indicated fatty acids.
  • the synthesis of fatty acid methyl esters was carried out by acidic methanolysis of intact cells.
  • the FAMEs were analyzed by GLC. Each value represents an average of three measurements.
  • the conversion rates (% desaturation) were calculated with the formula: [product] / [product] + [substrate] * 100.
  • the effect of genetic modification in plants, fungi, algae, ciliates or on the production of a desired compound may be determined by cultivating the modified microorganism or modified plant under suitable conditions (such as those described above), and Medium and / or the cellular components on the increased production of the desired product (ie of lipids or a fatty acid) is examined.
  • suitable conditions such as those described above
  • These analytical techniques are well known to those skilled in the art and include spectroscopy, thin layer chromatography, staining methods of various types, enzymatic and microbiological methods, and analytical chromatography such as high performance liquid chromatography (see, for example, Ullman, Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A2, pp. 89-90 and p.
  • the analytical methods include measurements of nutrient levels in the medium (e.g.
  • One example is the analysis of fatty acids (abbreviations: FAME, fatty acid methyl ester, GC-MS, gas-liquid chromatography-mass spectrometry, TAG, triacylglycerol, TLC, thin-layer chromatography).
  • the unambiguous evidence for the presence of fatty acid products can be obtained by analysis of recombinant organisms by standard analytical methods: GC, GC-MS or TLC as variously described by Christie and the references therein (1997, in: Advances on Lipid Methodology, Fourth Edition. : Christie, Oily Press, Dundee, 119-169; 1998, Gas Chromatography Mass Spectrometry Methods, Lipids 33: 343-353).
  • the material to be analyzed may be broken up by sonication, milling in the glass mill, liquid nitrogen and milling or other applicable methods. The material must be centrifuged after rupture. The sediment is distilled in aqua.
  • fatty acid methyl esters are extracted into petroleum ether and finally subjected to GC analysis using a capillary column (Chrompack, WCOT Fused silica, CP-Wax-52 CB, 25 microm, 0.32 mm) at a temperature gradient between 170 ° C and 240 ° C 20 min and 5 min at 240 ° C subjected.
  • Chropack, WCOT Fused silica, CP-Wax-52 CB, 25 microm, 0.32 mm Chrompack, WCOT Fused silica, CP-Wax-52 CB, 25 microm, 0.32 mm
  • Plant material is first mechanically homogenized by mortars to make it more accessible to extraction. The mixture is then heated for 10 min at 100 ° C and again sedimented after cooling on ice. The cell pellet is hydrolyzed with 1 M methanolic sulfuric acid and 2% dimethoxypropane for 1 h at 90 ° C and transmethylated the lipids. The resulting fatty acid methyl esters (FAME) are extracted into petroleum ether. The extracted FAME are purified by gas chromatography using a capillary column (Chrompack, WCOT Fused silica, CP-Wax-52 CB, 25 m, 0.32 mm) and a
  • Petioles or hypocotyledons of freshly germinated sterile rape plants were incubated in a Petri dish with a 1:50 agrobacterial dilution for 5-10 minutes. This is followed by a 3-day colncubation in darkness at 25 ° C on 3MS medium with 0.8% Bacto agar. Cultivation was continued after 3 days at 16 hours light / 8 hours darkness and at weekly intervals on MS medium containing 500 mg / L claforan (cefotaxime sodium), 50 mg / L kanamycin, 20 microM benzylaminopurine (BAP) and 1, 6 g / l glucose continued.
  • MS medium containing 500 mg / L claforan (cefotaxime sodium), 50 mg / L kanamycin, 20 microM benzylaminopurine (BAP) and 1, 6 g / l glucose continued.
  • Regenerated shoots were obtained on 2MS medium with kanamycin and claforan, transferred into soil after rooting and grown in a climatic chamber or greenhouse after cultivation for two weeks, flowered, harvested mature seeds, and ⁇ -3-desaturase expression by lipid analysis examined. Lines with elevated levels of C20 and C22 polyunsaturated fatty acids were identified. b) Production of transgenic flax plants
  • transgenic flax plants can be carried out, for example, according to the method of Bell et al, 1999, In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant. 35 (6): 456-465 by means of particle bombartment.
  • Agrobacteria-mediated transformations can be carried out, for example, according to Mlynarova et al. (1994), Plant Cell Report 13: 282-285.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von ungesättigten ω-3 Fettsäuren sowie ein Verfahren zur Herstellung von Triglyceriden mit einem erhöhten Gehalt an ungesättigten Fettsäuren, besonders von ω-3 Fettsäuren mit mehr als drei Doppelbindungen. Die Erfindung betrifft die Herstellung eines transgenen Organismus bevorzugt einer transgenen Pflanze oder eines transgenen Mikroorganismus mit erhöhtem Gehalt an ungesättigten ω-3-Fettsäuren, Ölen oder Lipiden mit ω-3-Doppelbindungen aufgrund der Expression einer ω-3-Desaturase aus Pilzen der Familie Pythiaceae wie der Gattung Phytophtora beispielsweise der Gattung und Art Phytophtora infestans. Die Erfindung betrifft weiterhin die Nukleinsäuresequenzen, Nukleinsäurekonstrukte, Vektoren und Organismen enthaltend mindestens eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz, mindestens einen Vektor enthaltend die Nukleinsäuresequenz und/oder die Nukleinsäurekonstrukte sowie transgene Organismen enthalten die vorgenannten Nukleinsäuresequenzen, Nukleinsäurekonstrukte und/oder Vektoren. Ein weiterer Teil der Erfindung betrifft Öle, Lipide und/oder Fettsäuren hergestellt nach dem erfindungsgemäßen Verfahren und deren Verwendung. Außerdem betrifft die Erfindung ungesättigte Fettsäuren sowie Triglyceride mit einem erhöhten Gehalt an ungesättigten Fettsäuren und deren Verwendung.

Description

Verfahren zur Herstellung ungesättigten ω-3-Fettsäuren in transgenen Organismen
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von ungesättigten ω-3 Fettsäuren sowie ein Verfahren zur Herstellung von Triglyceriden mit einem er- höhten Gehalt an ungesättigten Fettsäuren, besonders von ω-3 Fettsäuren mit mehr als drei Doppelbindungen. Die Erfindung betrifft die Herstellung eines transgenen Organismus bevorzugt einer transgenen Pflanze oder eines transgenen Mikroorganismus mit erhöhtem Gehalt an ungesättigten ω-3-Fettsäuren, Ölen oder Lipiden mit ω-3-Doppelbindungen aufgrund der Expression einer ω-3-Desaturase aus Pilzen der Familie Pythiaceae wie der Gattung Phytophtora beispielsweise der Gattung und Art Phytophtora infestans.
Die Erfindung betrifft weiterhin die Nukleinsauresequenzen, Nukleinsaurekonstrukte, Vektoren und Organismen enthaltend mindestens eine erfindungsgemäße Nukleinsauresequenz, mindestens einen Vektor enthaltend die Nukleinsauresequenz und/oder die Nukleinsaurekonstrukte sowie transgene Organismen enthalten die vorgenannten Nukleinsauresequenzen, Nukleinsaurekonstrukte und/oder Vektoren.
Ein weiterer Teil der Erfindung betrifft Öle, Lipide und/oder Fettsäuren hergestellt nach dem erfindungsgemäßen Verfahren und deren Verwendung. Außerdem betrifft die Erfindung ungesättigte Fettsäuren sowie Triglyceride mit einem erhöhten Gehalt an ungesättigten Fettsäuren und deren Verwendung.
Fettsäuren und Triacylglyceride haben eine Vielzahl von Anwendungen in der Lebensmittelindustrie, der Tierernährung, der Kosmetik und im Pharmabereich. Je nachdem, ob es sich um freie gesättigte und ungesättigte Fettsäuren oder um Triacylglyceride mit einem erhöhten Gehalt an gesättigten oder ungesättigten Fettsäuren handelt, sind sie für die unterschiedlichsten Anwendungen geeignet.
Mehrfach ungesättigte langkettige ω-3-Fettsäuren wie Eicosapentaensäure (= EPA, C20:5Δ5'8'11'14'17) oder Docosahexaensäure (= DHA, C22:6M'7'10'13'16'19) sind wichtige Komponenten der menschlichen Ernährung aufgrund ihrer verschiedenen Rollen in der Gesundheit, die Aspekte wie die Entwicklung des kindlichen Gehirns, der Funktionalität des Auges, der Synthese von Hormonen und anderer Signalstoffe, sowie die Vorbeugung von Herz-Kreislauf-Beschwerden, Krebs und Diabetes umfassen (Poulos, A Lipids 30:1-14, 1995; Horrocks, LA und Yeo YK Pharmacol Res 40:211-225, 1999). Es besteht aus diesem Grund ein Bedarf an der Produktion mehrfach ungesättiger Iangkettiger Fettsäuren. Aufgrund der heute üblichen Zusammensetzung der menschlichen Nahrung ist ein Zusatz von mehrfach ungesättigten ω-3-Fettsäuren, die bevorzugt in Fischölen vorkommen, zur Nahrung besonders wichtig. So werden beispielsweise mehrfach ungesättigte Fettsäuren wie DHA oder EPA Babynahrung zur Erhöhung des Nährwertes zugesetzt. Der ungesättigten Fettsäure DHA wird dabei ein positiver Effekt auf die Entwicklung und Aufrechterhaltung von Gehirnfunktionen zugeschrieben. Im folgenden werden mehrfach ungesättigte Fettsäuren als PUFA, PUFAs, LCPUFA oder LCPUFAs bezeichnet (|>oly unsaturated fatty acids, PUFA, mehrfach ungesättigte Fettsäuren;Jong chain ßoly unsaturated fatty acids, LCPUFA, langkettige mehrfach ungesättigte Fettsäuren). Hauptsächlich werden die verschiedenen Fettsäuren und Triglyceride aus Mikroorganismen wie Mortierella oder Schizochytrium oder aus Öl-produzierenden Pflanzen wie Soja, Raps, Algen wie Crypthecodinium oder Phaeodactylum und weiteren gewonnen, wobei sie in der Regel in Form ihrer Triacylglyceride (= Triglyceride = Triglycerole) anfallen. Sie können aber auch aus Tieren wie z.B. Fischen gewonnen werden. Die freien Fettsäuren werden vorteilhaft durch Verseifung hergestellt. Sehr langkettige mehrfach ungesättigte Fettsäuren wie DHA, EPA, Arachidonsäure (= ÄRA, C20:4Δ5,8'11'14), Di- homo-γ-linolensäure (C20:3Δ8'11'14) oder Docosapentaensäure (DPA, C22:5Δ7>10'13'16'19) werden in Pflanzen z.B. Ölfruchtpflanzen wie Raps, Soja, Sonnenblume, Färberdistel nicht synthetisiert. Übliche natürliche Quellen für diese Fettsäuren sind Fische wie Hering, Lachs, Sardine, Goldbarsch, Aal, Karpfen, Forelle, Heilbutt, Makrele, Zander oder Thunfisch oder Algen.
Je nach Anwendungszweck werden Öle mit gesättigten oder ungesättigten Fettsäuren bevorzugt. So werden z.B. in der humanen Ernährung Lipide mit ungesättigten Fettsäuren speziell mehrfach ungesättigten Fettsäuren bevorzugt. Den mehrfach unge- sättigten ω-3-Fettsäuren wird dabei ein positiver Effekt auf den Cholesterinspiegel im Blut und damit auf die Möglichkeit der Prävention einer Herzerkrankung zugeschrieben. Durch Zugabe dieser ω-3-Fettsäuren zu Nahrung kann das Risiko einer Herzerkrankung, eines Schlaganfalls oder von Bluthochdruck deutlich verringert werden. Auch entzündliche speziell chronisch entzündliche Prozesse im Rahmen immunologischer Erkrankungen wie rheumatroide Arthritis lassen sich durch ω-3-
Fettsäuren positiv beeinflussen. Sie werden deshalb Lebensmitteln speziell diätischen Lebensmitteln zugegeben oder finden in Medikamenten Anwendung. ω-6-Fettsäuren wie Arachidonsäure haben bei diesen rheumatischen Erkrankungen aufgrund unserer üblichen Nahrungsmittelzusammensetzung eher einen negativen Effekt auf diese Krankheiten. ω-3- und ω-6-Fettsäuren sind Vorläufer von Gewebshormonen, den sogenannten Eicosanoiden wie den Prostaglandinen, die sich von der Dihomo-γ-linolensäure, der Arachidonsäure und der Eicosapentaensäure ableiten, den Thromoxanen und Leukotrienen, die sich von der Arachidonsäure und der Eicosapentaensäure ableiten. Eicosanoide (sog. PG2-Serie), die aus ω-6-Fettsäuren gebildet werden fördern in der Regel Entzündungsreaktionen, während Eicosanoide (sog. PG3-Serie) aus ω-3- Fettsäuren geringe oder keine entzündungsfördernde Wirkung haben. Deshalb spricht man Lebensmittel mit einem hohen ω-3-Fettsäureanteil einen positiven Effekt auf die menschliche Gesundheit zu. Aufgrund ihrer positiven Eigenschaften hat es in der Vergangenheit nicht an Ansätzen gefehlt, Gene, die an der Synthese von Fettsäuren bzw. Triglyceriden beteiligt sind, für die Herstellung von Ölen in verschiedenen Organismen mit geändertem Gehalt an ungesättigten Fettsäuren verfügbar zu machen. So wird in WO 91/13972 und seinem US-Äquivalent eine Δ-9-Desaturase beschrieben. In WO 93/11245 wird eine Δ-15-Desaturase, in WO 94/11516 wird eine Δ-12-Desaturase beansprucht. Weitere Desaturasen werden beispielsweise in EP-A-0 550 162, WO 94/18337, WO 97/30582, WO 97/21340, WO 95/18222, EP-A-0 794250, Stukey et al., J. Biol. Chem., 265, 1990: 20144-20149, Wada et al., Nature 347, 1990: 200-203 oder Huang et al., Lipids 34, 1999: 649-659 beschrieben. Die biochemische Charakterisierung der verschiedenen Desaturasen ist jedoch bisher nur unzureichend erfolgt, da die Enzyme als membrangebundene Proteine nur sehr schwer zu isolieren und zu charakterisieren sind (McKeon et al., Methods in Enzymol. 71, 1981: 12141-12147, Wang et al., Plant Physiol. Biochem., 26, 1988: 777-792). In der Regel erfolgt die Charakterisierung membrangebundener Desaturasen durch Einbringung in einen geeigneten Organismus, der anschließend auf Enzymaktivität mittels Edukt- und Produktanalyse unter- sucht wird. Δ-6-Desaturasen werden in WO 93/06712, US 5,614,393, US 5614393, WO 96/21022, WO 00/21557 und WO 99/27111 beschrieben und auch die Anwendung zur Produktion in transgenen Organismen beschrieben wie in WO 98/46763 WO 98/46764, WO 9846765. Dabei wird auch die Expression verschiedener Desaturasen wie in WO 99/64616 oder WO 98/46776 und Bildung polyungesättigter Fett- säuren beschrieben und beansprucht. Bzgl. der Effektivität der Expression von Desaturasen und ihren Einfluss auf die Bildung polyungesättigter Fettsäuren ist anzumerken, dass durch Expression einer einzelnen Desaturase wie bisher beschrieben lediglich geringe Gehalte an ungesättigten Fettsäuren/Lipiden wie z.B. γ-Linolensäure und Stearidonsäure erreicht wurden. Weiterhin werden in der Regel Gemische aus ω-3- und ω-6-Fettsäuren erhalten.
Besonders geeignete Mikroorganismen zur Herstellung von PUFAs sind Mikroorganismen wie Mikroalgen wie Phaeodactylum tricornutum, Porphiridium-Arten, Thraustochytrien-Arten, Schizochytrien-Arten oder Crypthecodinium-Arten, Ciliaten, wie Stylonychia oder Colpidium, Pilze, wie Mortierella, Entomophthora oder Mucor und/oder Moosen wie Physcomitrella, Ceratodon und Marchantia (R. Vazhappilly & F. Chen (1998) Botanica Marina 41: 553-558; K. Totani & K. Oba (1987) Lipids 22: 1060-1062; M. Akimoto et al. (1998) Appl. Biochemistry and Biotechnology 73: 269-278). Durch Stammselektion ist eine Anzahl von Mutantenstämmen der entsprechenden Mikroorganismen entwickelt worden, die eine Reihe wünschenswerter Verbindungen, einschließlich PUFAs, produzieren. Die Mutation und Selektion von Stämmen mit verbesserter Produktion eines bestimmten Moleküls wie den mehrfach ungesättigten Fettsäuren ist jedoch ein zeitraubendes und schwieriges Verfahren. Deshalb werden, wenn immer möglich wie oben beschrieben gentechnologische Verfahren bevorzugt. Mit Hilfe der vorgenannten Mikroorganismen lassen sich jedoch nur begrenzte Mengen der gewünschten mehrfach ungesättigten Fettsäuren wie DPA, EPA oder ÄRA herstellen. Wobei diese in der Regel je nach verwendetem Mikroorganismus als Fettsäuregemische aus beispielsweise EPA, DPA und ÄRA anfallen. Für die Synthese der polyungesättigten Fettsäuren Arachidonsäure, Eicosapentaensäure und Docosahexaensäure werden verschiedene Synthesewege diskutiert (Fig. 1). So erfolgt die Produktion von EPA oder DHA in zahlreichen marinen Bakterien wie Vibrio sp. oder Shewanella sp. nach dem Polyketid-Weg (Yu, R. et al. Lipids 35:1061- 1064, 2000; Takeyama, H. et al. Microbiology 143:2725-2731, 1197)).
Ein alternative Strategie verläuft über die wechselnde Aktivität von Desaturasen und Eiongasen (Zank, T.K. et al. Plant Journal 31:255-268, 2002; Sakuradani, E. et al. Gene 238:445-453, 1999). Eine Modifikation des beschriebenen Weges über Δ6-Desa- turase, Δ6-Elongase, Δ5-Desaturase, Δ5-Elongase, Δ4-Desaturase ist der Sprecher- Syntheseweg (Sprecher 2000, Biochim. Biophys. Acta 1486:219-231) in Säugetieren. Anstelle der Δ4-Desaturierung erfolgt hier ein weiterer Elongationsschritt auf C24, eine weitere Δ6-Desaturierung und abschließend eine ß-Oxidation auf die C22-Kettenlänge. Für die Herstellung in Pflanzen und Mikroorganismen ist der sogenannte Sprecher- Syntheseweg (siehe Figur 1) allerdings nicht geeignet, da die Regulationsmecha- nismen nicht bekannt sind.
Die polyungesättigten Fettsäuren können entsprechend ihrem Desaturierungsmuster in zwei große Klassen, in ω-6- oder ω-3-Fettsäuren eingeteilt werden, die metabolisch und funktionell unterschiedlich Aktivitäten haben (Fig. 1).
Als Ausgangsprodukt für den ω-6-Stoffwechselweg fungiert die Fettsäure Linolsäure (18:2Δ9'12), während der ω-3-Weg über Linolensäure (18:3Δ9,12'15) abläuft. Linolensäure wird dabei durch Aktivität einer ω-3-Desaturase gebildet (Tocher et al. 1998, Prog. Lipid Res. 37, 73-117 ; Domergue et al. 2002, Eur. J. Biochem. 269, 4105-4113).
Säugetiere und damit auch der Mensch verfügen über keine entsprechende Desa- turaseaktivität (Δ-12- und ω-3-Desaturase) und müssen diese Fettsäuren (essentielle Fettsäuren) über die Nahrung aufnehmen. Über die Abfolge von Desaturase- und Elon- gase-Reaktionen werden dann aus diesen Vorstufen die physiologisch wichtigen polyungesättigten Fettsäuren Arachidonsäure (= ÄRA, 20:4Δ5,8,11,14), eine ω-6-Fettsäure und die beiden ω-3-Fettsäuren Eicosapentaen- (= EPA, 20:5Δ5'8,11,14'17) und Docosahexaensäure (DHA, 22:6Δ4'7,10'13'17'19) synthetisiert. Die Applikation von ω-3-Fettsäuren zeigt dabei die wie oben beschrieben therapeutische Wirkung bei der Behandlung von Herz-Kreislaufkrankheiten (Shimikawa 2001, World Rev. Nutr. Diet. 88, 100-108), Entzündungen (Calder 2002, Proc. Nutr. Soc. 61, 345-358) und Arthridis (Cleland und James 2000, J. Rheumatol. 27, 2305-2307).
Aus ernährungsphysiologischer Sicht ist es deshalb wichtig bei der Synthese mehr- fach ungesättigter Fettsäuren eine Verschiebung zwischen dem ω-6-Syntheseweg und dem ω-3-Syntheseweg (siehe Figur 1) zu erreichen, so dass mehr ω-3-Fettsäuren hergestellt werden. In der Literatur wurden die enzymatischen Aktivitäten verschiedener ω-3-Desaturasen beschrieben, die C18:2-, C22:4- oder C22:5-Fettsäuren desaturieren (siehe Figur 1). Keine der biochemisch beschriebenen Desaturasen setzt jedoch ein breites Substratspektrum des ω-6-Synthesewegs zu den entsprechenden Fettsäuren des ω-3-Syntheseweg um. Es besteht daher weiterhin ein großer Bedarf an einer ω-3-Desaturase, die zur Herstellung von ω-3-polyungesättigte Fettsäuren geeignet ist. Alle bekannten pflanzlichen und cyanobakteriellen ω-3-Desatu rasen desaturieren C18-Fettsäuren mit Linolsäure als Substrat, können aber keine C20- oder C22-Fettsäuren desaturieren.
Von dem Pilz Saprolegnia dicilina ist eine ω-3-Desaturase bekannt (Pereira et al. 2003, Biochem. J. 2003 Dez, Manuskript BJ20031319), die C20-mehrfach ungesättigte Fettsäuren desaturieren kann. Von Nachteil ist jedoch, dass diese ω-3-Desaturase keine Ci8- oder C^-PUFAs, wie den wichtigen Fettsäuren C18:2-, C22.4- oder C22.5-Fettsäuren des ω-6-Syntheseweg desaturieren kann. Ein weiterer Nachteil dieses Enzyms ist, dass es keine Fettsäuren desaturieren kann, die an Phospholipide gebunden sind. Es werden nur die CoA-Fettsäureester umgesetzt.
Um eine Anreicherung der Nahrung und des Futters mit diesen mehrfach ungesättigten ω-3-Fettsäuren zu ermöglichen, besteht daher ein großer Bedarf an einem einfachen, kostengünstigen Verfahren zur Herstellung dieser mehrfach ungesättigten Fettsäuren speziell in eukaryontischen Systemen.
Es bestand daher die Aufgabe weitere Gene bzw. Enzyme, die für die Synthese von LCPUFAs geeignet sind und eine Verschiebung vom ω-6-Syntheseweg zum ω-3-Syn- theseweg hin ermöglichen, speziell Gene, die eine ω-3-Deaturaseaktivität aufweisen, für die Herstellung von mehrfach ungesättigten Fettsäuren zur Verfügung zu stellen. Weiterhin bestand die Aufgabe ein Verfahren zur Herstellung von mehrfach ungesättigten ω-3-Fettsäuren in einem Organismus vorteilhaft in einem eukaryontischen Organismus bevorzugt in einer Pflanze oder einem Mikroorganismus zu entwickeln. Diese Aufgabe wurde durch das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der allgemeinen Formel I
Figure imgf000007_0001
in transgenen Organismen mit einem Gehalt von mindestens 1 Gew.-% dieser Verbindungen bezogen auf den Gesamtlipidgehalt des transgenen Organismus gelöst, dadurch gekennzeichnet, dass es folgende Verfahrensschritte umfasst: a) Einbringen mindestens einer Nukleinsauresequenz in den Organismus, welche für eine ω-3-Desaturase-Aktivität codiert, und b) Anzucht des Organismus unter Bedingungen, die die Herstellung der Verbindungen der allgemeinen Formel I ermöglicht, und wobei die Variablen und Substituenten in der Formel I die folgende Bedeutung haben: R1 = Hydroxyl-, CoenzymA-(Thioester), Lyso-Phosphatidylcholin-, Lyso-Phosphatidylethanolamin-, Lyso-Phosphatidylglycerol-, Lyso-Diphosphatidylglycerol-, Lyso-Phosphatidylserin-, Lyso-Phosphatidylinositol-, Sphingobase-, oder einen Rest der allgemeinen Formel II
Figure imgf000008_0001
R2 = Wasserstoff-, Lyso-Phosphatidylcholin-, Lyso-Phosphatidylethanolamin-, Lyso- Phosphatidylglycerol-, Lyso-Diphosphatidylglycerol-, Lyso-Phosphatidylserin-, Lyso-Phosphatidylinositol- oder gesättigtes oder ungesättigtes C2-C24-Alkyl- carbonyl-,
R3 = Wasserstoff-, gesättigtes oder ungesättigtes C2-C24-Alkylcarbonyl-, oder R2 oder R3 unabhängig voneinander einen Rest der allgemeinen Formel la:
Figure imgf000008_0002
n = 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 9, m = 2, 3, 4, 5 oder 6, p = 0 oder 3.
R1 bedeutet in der allgemeinen Formel I Hydroxyl-, CoenzymA-(Thioester), Lyso- Phosphatidylcholin-, Lyso-Phosphatidylethanolamin-, Lyso-Phosphatidylglycerol-, Lyso-Diphosphatidylglycerol-, Lyso-Phosphatidylserin-, Lyso-Phosphatidylinositol-, Sphingobase-, oder einen Rest der allgemeinen Formel II
Figure imgf000008_0003
Die oben genannten Reste von R1 sind immer in Form ihrer Thioester an die Ver- bindungen der allgemeinen Formel I gebunden.
R2 bedeutet in der allgemeinen Formel II Wasserstoff-, Lyso-Phosphatidylcholin-, Lyso-Phosphatidylethanolamin-, Lyso-Phosphatidylglycerol-, Lyso-Diphosphatidylglycerol-, Lyso-Phosphatidylserin-, Lyso-Phosphatidylinositol- oder gesättigtes oder ungesättigtes C2-C24-Alkylcarbonyl-, Als Alkylreste seien substituiert oder unsubstituiert, gesättigt oder ungesättigte C2-C2 - Alkylcarbonyl-Ketten wie Ethylcarbonyl-, n-Propylcarbonyl-, n-Butylcarbonyl-, n-Pentyl- carbonyl-, n-HexylcarbonyI-,n-Heptylcarbonyl-, n-Octylcarbonyl-, n-Nonylcarbonyl-, n-Decylcarbonyl-, n-Undecylcarbonyl-, n-Dodecylcarbonyl-, n-Tridecylcarbonyl-, n-Tetradecylcarbonyl-, n-Pentadecylcarbonyl-, n-Hexadecylcarbonyl-, n-Hepta- decylcarbonyl-, n-Octadecylcarbonyl-, n-Nonadecylcarbonyl-, n-Eicosylcarbonyl-, n-Docosanylcarbonyl- or n-Tetracosanylcarbonyl- genannt, die ein oder mehrere Doppelbindungen enthalten. Gesättigte oder ungesättigte C 0-C22-Alkylcarbonylreste wie n-Decylcarbonyl-, n-Undecylcarbonyl-, n-Dodecylcarbonyl-, n-Tridecylcarbonyl-, n-Tetradecylcarbonyl-, n-Pentadecylcarbonyl-, n-Hexadecylcarbonyl-, n-Hepta- decylcarbonyl-, n-Octadecylcarbonyl-, n-Nonadecylcarbonyl-, n-Eicosylcarbonyl-, n-Docosanylcarbonyl- oder n-Tetracosanylcarbonyl-, die ein oder mehrere Doppelbindungen enthalten, sind bevorzugt. Besonders bevorzugt sind gesättigte und/oder ungesättigte Cι0-C22-Alkylcarbonylreste wie Cι0-Alkylcarbonyl-, Cn-Alkylcarbonyl-, C12-Alkylcarbonyl-, C13-Alkylcarbonyl-, C1 -Alkylcarbonyl-, C16-AlkylcarbonyI-, C18- Alkylcarbonyl-, C20-Alkylcarbonyl- oder C22-Alkylcarbonylreste, die ein oder mehrere Doppelbindungen enthalten. Ganz besonders bevorzugt sind gesättigte oder ungesättigte C16-C22-Alkylcarbonylreste wie C16-Alkylcarbonyl-, C18-Alkylcarbonyl-, C20- Alkylcarbonyl- oder C22-Alkylcarbonylreste, die ein oder mehrere Doppelbindungen enthalten. Diese vorteilhaften Reste können zwei, drei, vier, fünf oder sechs Doppelbindungen enthalten. Die besonders vorteilhaften Reste mit 18, 20 oder 22 Kohlenstoffatomen in der Fettsäurekette enthalten bis zu sechs Doppelbindungen, vorteilhaft zwei, drei, vier oder fünf Doppelbindungen, besonders bevorzugt zwei, drei oder vier Doppelbindungen. Alle genannten Reste leiten sich von den entsprechenden Fett- säuren ab.
R3 bedeutet in der allgemeinen Formel II Wasserstoff-, gesättigtes oder ungesättigtes C2-C24-Alkylcarbonyk
Als Alkylreste seien substituiert oder unsubstituiert, gesättigt oder ungesättigte C2-C24- Alkylcarbonyl-Ketten wie Ethylcarbonyl-, n-Propylcarbonyl-, n-Butylcarbonyl-, n-Pentyl- carbonyl-, n-Hexylcarbonyl-,n-Heptylcarbonyl-, n-Octylcarbonyl-, n-Nonylcarbonyl-, n-Decylcarbonyl-, n-Undecylcarbonyl-, n-Dodecylcarbonyl-, n-Tridecylcarbonyl-, n-Tetradecylcarbonyl-, n-Pentadecylcarbonyl-, n-Hexadecylcarbonyl-, n-Hepta- decylcarbonyl-, n-Octadecylcarbonyl-, n-Nonadecylcarbonyl-, n-Eicosylcarbonyl-, n-Docosanylcarbonyl- or n-Tetracosanylcarbonyl- genannt, die ein oder mehrere Doppelbindungen enthalten. Gesättigte oder ungesättigte C10-C22-Alkylcarbonylreste wie n-Decylcarbonyl-, n-Undecylcarbonyl-, n-Dodecylcarbonyl-, n-Tridecylcarbonyl-, n-Tetradecylcarbonyl-, n-Pentadecylcarbonyl-, n-Hexadecylcarbonyl-, n-Hepta- decylcarbonyl-, n-Octadecylcarbonyl-, n-Nonadecylcarbonyl-, n-Eicosylcarbonyl-, n-Docosanylcarbonyl- oder n-Tetracosanylcarbonyl-, die ein oder mehrere Doppel- bindungen enthalten, sind bevorzugt. Besonders bevorzugt sind gesättigte und/oder ungesättigte Cι0-C22-Alkylcarbonylreste wie C10-Alkylcarbonyl-, Cn-Alkylcarbonyl-, C12-Alkylcarbonyl-, C13-Alkylcarbonyl-, C14-Alkylcarbonyl-, C16-AIkylcarbonyl-, C18- Alkylcarbonyl-, C20-Alkylcarbonyl- oder C22-Alkylcarbonylreste, die ein oder mehrere Doppelbindungen enthalten. Ganz besonders bevorzugt sind gesättigte oder ungesättigte C16-C22-Alkylcarbonylreste wie Cι6-Alkylcarbonyl-, C18-Alkylcarbonyl-, C20- Alkylcarbonyl- oder C22-Alkylcarbonylreste, die ein oder mehrere Doppelbindungen enthalten. Diese vorteilhaften Reste können zwei, drei, vier, fünf oder sechs Doppel- bindungen enthalten. Die besonders vorteilhaften Reste mit 18, 20 oder 22 Kohlenstoffatomen in der Fettsäurekette enthalten bis zu sechs Doppelbindungen, vorteilhaft zwei, drei, vier oder fünf Doppelbindungen, besonders bevorzugt zwei, drei oder vier Doppelbindungen. Alle genannten Reste leiten sich von den entsprechenden Fettsäuren ab. Die oben genannten Reste von R1, R2and R3 können mit Hydroxyl- und/oder Epoxy- gruppen substituierte sein und/oder können Dreifachbindungen enthalten.
Vorteilhaft enthalten die im erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten mehrfach ungesättigten Fettsäuren mindestens zwei vorteilhaft drei, vier, fünf oder sechs Doppelbindungen. Besonders vorteilhaft enthalten die Fettsäuren zwei, drei, vier oder fünf Doppelbindungen. Im Verfahren hergestellte Fettsäuren haben vorteilhaft 18-, 20- o- der 22-C-Atome in der Fettsäurekette, bevorzugt enthalten die Fettsäuren 20 oder 22 Kohlenstoffatome in der Fettsäurekette. Vorteilhaft werden gesättigte Fettsäuren mit den im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren wenig oder gar nicht umgesetzt. Unter wenig ist zu verstehen, das im Vergleich zu mehrfach ungesättigten Fettsäuren die gesättigten Fettsäuren mit weniger als 5 % der Aktivität, vorteilhaft weniger als 3 %, besonders vorteilhaft mit weniger als 2 % umgesetzt werden. Diese hergestellten Fettsäuren können als einziges Produkt im Verfahren hergestellt werden oder in einem Fettsäuregemisch vorliegen.
Bei den im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsauresequenzen handelt es sich um isolierte Nukleinsauresequenzen, die für Polypeptide mit ω-3- Desaturaseaktivität codieren.
Vorteilhaft werden im erfindungsgemäßen Verfahren Nukleinsauresequenzen, die für Polypeptide mit ω-3-Desaturaseaktivität codieren, verwendet, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: a) einer Nukleinsauresequenz mit der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz, oder b) Nukleinsauresequenzen, die sich als Ergebnis des degenerierten genetischen Codes von den in SEQ ID NO: 2 dargestellten Aminosäuresequenzen ableiten lassen, oder c) Derivate der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Nukleinsauresequenz, die für Poly- peptide mit mindestens 60 % Identität auf Aminosäureebene mit SEQ ID NO: 2 codieren und eine ω-3-Desaturaseaktivität aufweisen.
Vorteilhaft bedeuten die Substituenten R2 oder R3 in den allgemeinen Formeln I und II unabhängig voneinander gesättigtes oder ungesättigtes C-ι8-C22-AlkylcarbonyI-, be- sonders vorteilhaft bedeuten sie unabhängig voneinander ungesättigtes C18-, C20- o- der C22-Alkylcarbonyl- mit mindestens zwei Doppelbindungen.
Die im Verfahren hergestellten mehrfach ungesättigten Fettsäuren sind vorteilhaft in Membranlipiden und/oder Triacylglyceriden gebunden, können aber auch als frei Fettsäuren oder aber gebunden in Form anderer Fettsäureester in den Organismen vorkommen. Dabei können sie als "Reinprodukte" oder aber vorteilhaft in Form von Mischungen verschiedener Fettsäuren oder Mischungen unterschiedlicher Glyceride vorliegen. Die in den Triacylglyceriden gebundenen verschieden Fettsäuren lassen sich dabei von kurzkettigen Fettsäuren mit 4 bis 6 C-Atomen, mittelkettigen Fettsäuren mit 8 bis 12 C-Atomen oder langkettigen Fettsäuren mit 14 bis 24 C-Atomen ableiten, bevorzugt sind die langkettigen Fettsäuren, besonders bevorzugt sind die langkettigen Fettsäuren LCPUFAs von Cι8-, C20- und/oder C22-Fettsäuren.
Im erfindungsgemäßen Verfahren werden vorteilhaft Fettsäureester mit mehrfach ungesättigten C18-, C20- und/oder C22-Fettsäuremolekülen mit mindestens zwei Doppel- bindungen im Fettsäureester, vorteilhaft mit mindestens zwei, drei, vier, fünf oder sechs Doppelbindungen im Fettsäureester, besonders vorteilhaft von mindestens drei, vier, fünf oder sechs Doppelbindungen im Fettsäureester hergestellt und führen vorteilhaft zur Synthese von Linolensäure (=LA, C18:2Δ9,12'15), γ-Linolensäure (= GLA, C18:3Δ6'9'12), Stearidonsäure (= SDA, C18:4Δ6'9'12'15)' Dihomo-γ-Linolensäure (= DGLA, 20:3 Δ8'11'14), ω-3-Eicosatetraensäure (= ETA, C20:4Δ8'11,H17), Arachidonsäure (ÄRA, C20:4 Δ5,8,n,ι4)) Eicosapentaensäure (EPA, C20:5Δ5'8'11'14-17), ω-6-Docosapentaensäure (C22:5Δ4'7'10'13'16), ω-3-Docosapentaensäure (C22:5Δ7'10'13'16'19), Docosahexaensäure (= DHA, C22:6Δ4-7'10'13'16'19) oder deren Mischungen, bevorzugt ÄRA, EPA und/oder DHA. Die Fettsäureester mit mehrfach ungesättigten C 8-, C20- und/oder C22-Fettsäure- . molekülen können aus den Organismen, die für die Herstellung der Fettsäureester verwendet wurden, in Form eines Öls oder Lipids beispielsweise in Form von Verbindungen wie Sphingolipide, Phosphoglyceride, Lipide, Glycolipide wie Glycosphingo- lipide, Phospholipide wie Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylcholin, Phosphatidyl- serin, Phosphatidylglycerol, Phosphatidylinositol oder Diphosphatidylglycerol, Monό- acylglyceride, Diacylglyceride, Triacylglyceride oder sonstige Fettsäureester wie die AcetylCoenzymA-Ester, die die mehrfach ungesättigten Fettsäuren mit mindestens zwei, drei, vier, fünf oder sechs bevorzugt fünf oder sechs Doppelbindungen enthalten, isoliert werden, vorteilhaft werden sie in der Form ihrer Diacylglyceride, Triacylglyceride und/oder in Form des Phosphatidylcholin isoliert, besonders bevorzugt in der Form der Triacylglyceride. Neben diesen Estern sind die mehrfach ungesättigten Fettsäuren auch als freie Fettsäuren oder gebunden in anderen Verbindungen in den Organismen vorteilhaft den Pflanzen enthalten. In der Regel liegen die verschiedenen vorgenannten Verbindungen (Fettsäureester und frei Fettsäuren) in den Organismen in einer unge- fähren Verteilung von 80 bis 90 Gew.-% Triglyceride, 2 bis 5 Gew.-% Diglyceride, 5 bis 10 Gew.-% Monoglyceride, 1 bis 5 Gew.-% freie Fettsäuren, 2 bis 8 Gew.-% Phospho- lipide vor, wobei sich die Summe der verschiedenen Verbindungen zu 100 Gew.-% ergänzt.
Im erfindungsgemäßen Verfahren werden die hergestellten LCPUFAs mit einem Gehalt von mindestens 3 Gew.-%, vorteilhaft von mindestens 5 Gew.-%, bevorzugt von mindestens 8 Gew.-%, besonders bevorzugt von mindestens 10 Gew.-%, ganz besonders bevorzugt von mindestens 15 Gew.-% bezogen auf die gesamten Fettsäuren in der transgenen Organismen vorteilhaft in einer transgenen Pflanze hergestellt. Vorteilhaft werden die Fettsäuren in gebundener Form hergestellt. Mit Hilfe der im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren lassen sich diese ungesättigten Fettsäuren an sn1-, sn2- und/oder sn3-Position der vorteilhaft hergestellten Triglyceride bringen. Im PUFA-Herstellverfahren werden die erfindungsgemäßen ω-3-Desaturasesequenzen vorteilhaft in Kombination mit weitern Genen der PUFA-Synthese wie dem Δ-4-Desaturase-, Δ-5-Desaturase-, Δ-6-Desaturase-, Δ-8-Desaturase-, Δ-5-Elongase-, Δ-6-Elongase- und/oder Δ-9-Elongasegen verwendet. Dadurch können im erfindungsgemäßen Verfahren ausgehend von den Verbindungen Linolsäure (C18:2) bzw. Linolensäure (C18:3) über mehrere Reaktionsschritte die Endprodukte des Verfahrens beispielsweise Arachidonsäure (ÄRA), Eicosapentaensäure (EPA), ω-6-Docosapentaensäure oder DHA hergestellt werden. Diese fallen in der Regel nicht als absolute Reinprodukte an, es sind i.d.R. auch geringe Spuren der Vor- stufen im Endprodukt enthalten. Sind in dem Ausgangsorganismus bzw. in der Ausgangspflanze beispielsweise sowohl Linolsäure als auch Linolensäure vorhanden, so liegen die Endprodukte wie ÄRA, EPA oder DHA als Mischungen vor. Die Vorstufen sollten vorteilhaft nicht mehr als 20 Gew.-%, bevorzugt nicht mehr als 15 Gew.-%, besonders bevorzugt nicht als 10 Gew.-%, ganz besonders bevorzugt nicht mehr als 5 Gew.-% bezogen auf die Menge des jeweilige Endprodukts betragen. Vorteilhaft werden in einer transgenen Pflanze als Endprodukte nur ÄRA, EPA oder nur DHA im erfindungsgemäßen Verfahren gebunden oder als freie Säuren hergestellt. Werden die Verbindungen ÄRA, EPA und DHA gleichzeitig hergestellt, werden sie vorteilhaft in einem Verhältnis von mindesten 1:1:2 (EPA:ARA:DHA), vorteilhaft von mindestens 1:1:3, bevorzugt von 1:1:4, besonders bevorzugt von 1:1:5 hergestellt.
Fettsäureester bzw. Fettsäuregemische, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurden, enthalten vorteilhaft 6 bis 15 % Palmitinsäure, 1 bis 6 % Stearinsäure; 7 - 85 % Ölsäure; 0,5 bis 8 % Vaccensäure, 0,1 bis 1 % Arachinsäure, 7 bis 25 % gesättigte Fettsäuren, 8 bis 85 % einfach ungesättigte Fettsäuren und 60 bis 85 % mehrfach ungesättigte Fettsäuren jeweils bezogen auf 100 % und auf den
Gesamtfettsäuregehalt der Organismen. Als vorteilhafte mehrfach ungesättigte Fettsäure sind in den Fettsäureester bzw. Fettsäuregemische bevorzugt mindestens 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9 oder 1 % bezogen auf den Gesamtfettsäuregehalt an Arachidonsäure enthalten. Weiterhin enthalten die Fettsäureester bzw. Fettsäure- gemische, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurden, vorteilhaft Fettsäuren ausgewählt aus der Gruppe der Fettsäuren Erucasäure (13-Docosaen- säure), Sterculinsäure (9,10-Methylene octadec-9-enonsäure), Malvalinsäure (8,9- Methylen Heptadec-8-enonsäure), Chaulmoogrinsäure (Cyclopenten-dodecansäure), Furan-Fettsäure (9,12-Epoxy-octadeca-9,11-dienonsäure), Vernonsäure (9,10-Epoxy- octadec-12-enonsäure), Tarinsäure (6-Octadecynonsäure),6-Nonadecynonsäure, San- talbinsäure (t11-Octadecen-9-ynoic acid), 6,9-Octadecenynonsäure, Pyrulinsäure (t10- Heptadecen-8-ynonsäure), Crepenyninsäure (9-Octadecen-12-ynonsäure), 13,14- Dihydrooropheinsäure, Octadecen-13-ene-9,11-diynonsäure, Petroselensäure (cis-6- Octadecenonsäure), 9c,12t-Octadecadiensäure, Calendulasäure (8t10t12c-Octadeca- triensäure), Catalpinsäure (9t11t13c-Octadecatriensäure), Eleosterinsäure (9c11t13t- Octadecatriensäure), Jacarinsäure (8c10t12c-Octadecatriensäure), Punicinsäure (9c11t13c-Octadecatriensäure),Parinarinsäure (9c11t13t15c-Octadecatetraensäure), Pinolensäure (all-cis-5,9,12-Octadecatriensäure), Laballensäure (5,6-Octadecadien- allensäure), Ricinolsäure (12-Hydroxyölsäure) und/oder Coriolinsäure (13-Hydroxy- 9c, 11t-Octadecadienonsäure). Vorteilhaft enthalten die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Fettsäureester bzw. Fettsäuregemische weniger als 0,1 % bezogen auf die Gesamtfettsäuren oder keine Buttersäure, kein Cholesterin, keine Clupanodonsäure (= Docosapentaensäure, C22:5Δ4,8,12'15,21) sowie keine Nisinsäure (Tetracosahexaensäure, C23:6Δ3'8'12'15'18'21).
Durch die erfindungsgemäßen Nukleinsauresequenzen bzw. im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsauresequenzen kann eine Steigerung der Ausbeute an mehrfach ungesättigten ω-3-Fettsäuren von mindestens 50 %, vorteilhaft von mindestens 80 %, besonders vorteilhaft von mindestens 100 %, ganz besonders vorteilhaft von mindestens 150 % gegenüber den nicht transgenen Ausgangsorganismus beispielsweise einer Hefe, einer Alge, einem Pilz oder einer Pflanze wie Arabidopsis • oder Lein beim Vergleich in der GC-Analyse siehe Beispiele erreicht werden.
Auch chemisch reine mehrfach ungesättigte Fettsäuren oder Fettsäurezusammen- Setzungen sind nach den vorbeschriebenen Verfahren darstellbar. Dazu werden die Fettsäuren oder die Fettsäurezusammensetzungen aus dem Organismus wie den Mikroorganismen oder den Pflanzen oder dem Kulturmedium, in dem oder auf dem die Organismen angezogen wurden, oder aus dem Organismus und dem Kulturmedium in bekannterWeise beispielsweise über Extraktion, Destillation, Kristallisation, Chromatographie oder Kombinationen dieser Methoden isoliert. Diese chemisch reinen Fettsäuren oder Fettsäurezusammensetzungen sind für Anwendungen im Bereich der Lebensmittelindustrie, der Kosmetikindustrie und besonders der Pharmaindustrie vorteilhaft.
Als Organismus für die Herstellung im erfindungsgemäßen Verfahren kommen prinzipiell alle Organismen wie Mikroorganismen, nicht-humane Tiere oder Pflanzen in Frage.
Als Pflanzen kommen prinzipiell alle Pflanzen in Frage, die in der Lage sind Fettsäuren zu synthetisieren wie alle dicotylen oder monokotylen Pflanzen, Algen oder Moose. Vorteilhaft Pflanzen sind ausgewählt aus der Gruppe der Pflanzenfamilien Adelotheci- aceae, Anacardiaceae, Asteraceae, Apiaceae, Betulaceae, Boraginaceae, Brassica- ceae, Bromeliaceae, Caricaceae, Cannabaceae, Convolvulaceae, Chenopodiaceae, Crypthecodiniaceae, Cucurbitaceae, Ditrichaceae, Elaeagnaceae, Ericaceae, Euphor- biaceae, Fabaceae, Geraniaceae, Gramineae, Juglandaceae, Lauraceae, Legumino- sae, Linaceae, Prasinophyceae oder Gemüsepflanzen oder Zierpflanzen wie Tagetes in Betracht. Beispielhaft seien die folgenden Pflanzen genannt ausgewählt aus der Gruppe: Adelo- theciaceae wie die Gattungen Physcomitrella z.B. die Gattung und Arten Physco- mitrella patens, Anacardiaceae wie die Gattungen Pistacia, Mangifera, Anacardium z.B. die Gattung und Arten Pistacia vera [Pistazie], Mangifer indica [Mango] oder Anacardium occidentale [Cashew], Asteraceae wie die Gattungen Calendula, Carthamus, Centaurea, Cichorium, Cynara, Helianthus, Lactuca, Locusta, Tagetes, Valeriana z.B. die Gattung und Arten Calendula officinalis [Garten-Ringelblume], Carthamus tinctorius [Färberdistel, safflowerj, Centaurea cyanus [Kornblume], Cichorium intybus [Wegwarte], Cynara scolymus [Artichoke], Helianthus annus [Sonnenblume], Lactuca sativa, Lactuca crispa, Lactuca esculenta, Lactuca scariola L. ssp. sativa, Lactuca scariola L. var. integrata, Lactuca scariola L. var. integrifolia, Lactuca sativa subsp. romana, Locusta communis, Valeriana locusta [Salat], Tagetes lucida, Tagetes erecta oder Tagetes tenuifolia [Studentenblume], Apiaceae wie die Gattung Daucus z.B. die Gattung und Art Daucus carota [Karotte], Betulaceae wie die Gattung Corylus z.B. die Gattungen und Arten Corylus avellana oder Corylus colurna [Haselnuss], Boragin- aceae wie die Gattung Borago z.B. die Gattung und Art Borago officinalis [Borretsch], Brassicaceae wie die Gattungen Brassica, Melanosinapis, Sinapis, Arabadopsis z.B. die Gattungen und Arten Brassica napus, Brassica rapa ssp. [Raps], Sinapis arvensis Brassica juncea, Brassica juncea var.juncea, Brassica juncea var. crispifolia, Brassica juncea var. foliosa, Brassica nigra, Brassica sinapioides, Melanosinapis communis [Senf], Brassica oleracea [Futterrübe] oder Arabidopsis thaliana, Bromeliaceae wie die Gattungen Anana, Bromelia (Ananas) z.B. die Gattungen und Arten Anana comosus, Ananas ananas oder Bromelia comosa [Ananas], Caricaceae wie die Gattung Carica wie die Gattung und Art Carica papaya [Papaya], Cannabaceae wie die Gattung Cannabis wie die Gattung und Art Cannabis sative [Hanf], Convolvulaceae wie die Gattungen Ipomea, Convolvulus z.B. die Gattungen und Arten Ipomoea batatus, Ipomoea pandurata, Convolvulus batatas, Convolvulus tiliaceus, Ipomoea fastigiata, Ipomoea tiliacea, Ipomoea triloba oder Convolvulus panduratus [Süßkartoffel, Batate], Chenopodiaceae wie die Gattung Beta wie die Gattungen und Arten Beta vulgaris, Beta vulgaris var. altissima, Beta vulgaris var. Vulgaris, Beta maritim a, Beta vulgaris var. perennis, Beta vulgaris var. conditiva oder Beta vulgaris var. esculenta [Zuckerrübe], Crypthecodiniaceae wie die Gattung Crypthecodinium z.B. die Gattung und Art Cryptecodinium cohnii, Cucurbitaceae wie die Gattung Cucubita z.B. die Gattungen und Arten Cucurbita maxima, Cucurbita mixta, Cucurbita pepo oder Cucurbita moschata [Kürbis], Cymbellaceae wie die Gattungen Amphora, Cymbella, Okedenia, Phaeodactylum, Reimeria z.B. die Gattung und Art Phaeodactylum tricornutum,
Ditrichaceae wie die Gattungen Ditrichaceae, Astomiopsis, Ceratodon, Chrysoblastella, Ditrichum, Distichium, Eccremidium, Lophidion, Philibertiella, Pleuridium, Saelania, Trichodon, Skottsbergia z.B. die Gattungen und Arten Ceratodon antarcticus, Ceratodon columbiae, Ceratodon heterophyllus, Ceratodon purpurascens, Ceratodon pur- pureus, Ceratodon purpureus ssp. convolutus, Ceratodon purpureus ssp. stenocarpus, Ceratodon purpureus var. rotundifolius, Ceratodon ratodon, Ceratodon stenocarpus, Chrysoblastella chilensis, Ditrichum ambiguum, Ditrichum brevisetum, Ditrichum crispatissimum, Ditrichum difficile, Ditrichum falcifolium, Ditrichum flexicaule, Ditrichum giganteum, Ditrichum heteromallum, Ditrichum lineare, Ditrichum lineare, Ditrichum montanum, Ditrichum montanum, Ditrichum pallidum, Ditrichum punctulatum, Ditrichum pusillum, Ditrichum pusillum var. tortile, Ditrichum rhynchostegium, Ditrichum schim- peri, Ditrichum tortile, Distichium capillaceum, Distichium hagenii, Distichium inclina- tum, Distichium macounii, Eccremidium floridanum, Eccremidium whiteleggei, Lophi- dion strictus, Pleuridium acuminatum, Pleuridium alternifolium, Pleuridium holdridgei, Pleuridium mexicanum, Pleuridium ravenelii, Pleuridium subulatum, Saelania glau- cescens, Trichodon borealis, Trichodon cylindricus oder Trichodon cylindricus var. oblongus, Elaeagnaceae wie die Gattung Elaeagnus z.B. die Gattung und Art Olea europaea [Olive], Ericaceae wie die Gattung Kalmia z.B. die Gattungen und Arten Kalmia latifolia, Kalmia angustifolia, Kalmia microphylla, Kalmia polifolia, Kalmia occi- dentalis, Cistus chamaerhodendros oder Kalmia lucida [Berglorbeer], Euphorbiaceae wie die Gattungen Manihot, Janipha, Jatropha, Ricinus z.B. die Gattungen und Arten Manihot utilissima, Janipha manihot,, Jatropha manihot, Manihot aipil, Manihot dulcis, Manihot manihot, Manihot melanobasis, Manihot esculenta [Manihot] oder Ricinus communis [Rizinus], Fabaceae wie die Gattungen Pisum, Albizia, Cathormion, Feuillea, Inga, Pithecolobium, Acacia, Mimosa, Medicajo, Glycine, Dolichos, Phaseolus, Soja z.B. die Gattungen und Arten Pisum sativum, Pisum arvense, Pisum humile [Erbse], Albizia berteriana, Albizia julibrissin, Albizia lebbeck, Acacia berteriana, Acacia littora- lis, Albizia berteriana, Albizzia berteriana, Cathormion berteriana, Feuillea berteriana, Inga fragrans, Pithecellobium berterianum, Pithecellobium fragrans, Pithecolobium berterianum, Pseudalbizzia berteriana, Acacia julibrissin, Acacia nemu, Albizia nemu, Feuilleea julibrissin, Mimosa julibrissin, Mimosa speciosa, Sericanrda julibrissin, Acacia lebbeck, Acacia macrophylla, Albizia lebbek, Feuilleea lebbeck, Mimosa lebbeck, Mimosa speciosa [Seidenbaum], Medicago sativa, Medicago falcata, Medicago varia [Alfalfa] Glycine max Dolichos soja, Glycine gracilis, Glycine hispida, Phaseolus max, Soja hispida oder Soja max [Sojabohne], Funariaceae wie die Gattungen Apha- norrhegma, Entosthodon, Funaria, Physcomitrella, Physcomitrium z.B. die Gattungen und Arten Aphanorrhegma serratum, Entosthodon attenuatus, Entosthodon bolanderi, Entosthodon bonplandii, Entosthodon californicus, Entosthodon drummondii, Entostho- don jamesonii, Entosthodon leibergii, Entosthodon neoscoticus, Entosthodon rubrise- tus, Entosthodon spathulifolius, Entosthodon tucsoni, Funaria americana, Funaria bolanderi, Funaria calcarea, Funaria californica, Funaria calvescens, Funaria con- voluta, Funaria flavicans, Funaria groutiana, Funaria hygrometrica, Funaria hygro- metrica var. arctica, Funaria hygrometrica var. calvescens, Funaria hygrometrica var. convoluta, Funaria hygrometrica var. muralis, Funaria hygrometrica var. utahensis, Funaria microstoma, Funaria microstoma var. obtusifolia, Funaria muhlenbergii, Funaria orcuttii, Funaria plano-convexa, Funaria polaris, Funaria ravenelii, Funaria rubriseta, Funaria serrata, Funaria sonorae, Funaria sublimbatus, Funaria tucsoni, Physcomitrella californica, Physcomitrella patens, Physcomitrella readeri, Physco- mitrium austräte, Physcomitrium californicum, Physcomitrium collenchymatum, Physcomitrium coloradense, Physcomitrium cupuliferum, Physcomitrium drummondii, Physcomitrium eurystomum, Physcomitrium flexifolium, Physcomitrium hookeri, Physcomitrium hookeri var. serratum, Physcomitrium immersum, Physcomitrium keller- manii, Physcomitrium megalocarpum, Physcomitrium pyriforme, Physcomitrium pyri- forme var. serratum, Physcomitrium rufipes, Physcomitrium sandbergii, Physcomitrium subsphaericum, Physcomitrium washingtoniense, Geraniaceae wie die Gattungen Pelargonium, Cocos, Oleum z.B. die Gattungen und Arten Cocos nucifera, Pelar- gonium grossularioides oder Oleum cocois [Kokusnuss], Gramineae wie die Gattung Saccharum z.B. die Gattung und Art Saccharum officinarum, Juglandaceae wie die Gattungen Juglans, Wallia z.B. die Gattungen und Arten Juglans regia, Juglans ailanthifolia, Juglans sieboldiana, Juglans cinerea, Wallia cinerea, Juglans bixbyi, Juglans californica, Juglans hindsii, Juglans intermedia, Juglans jamaicensis, Juglans major, Juglans microcarpa, Juglans nigra oder Wallia nigra [Walnuss], Lauraceae Wie die Gattungen Persea, Laurus z.B. die Gattungen und Arten Laurus nobilis [Lorbeer], Persea americana, Persea gratissima oder Persea persea [Avocado], Leguminosae wie die Gattung Arachis z.B. die Gattung und Art Arachis hypogaea [Erdnuss], Lina- ceae wie die Gattungen Linum, Adenolinum z.B. die Gattungen und Arten Linum usi- tatissimum, Linum humile, Linum austriacum, Linum bienne, Linum angustifolium, Linum catharticum, Linum flavum, Linum grandiflorum, Adenolinum grandiflorum, Linum lewisii, Linum narbonense, Linum perenne, Linum perenne var. lewisii, Linum pratense oder Linum trigynum [Lein], Lythrarieae wie die Gattung Punica z.B. die Gattung und Art Punica granatum [Granatapfel], Malvaceae wie die Gattung Gossy- piüm z.B. die Gattungen und Arten Gossypium hirsutum, Gossypium arboreum, Gossy- pium barbadense, Gossypium herbaceum oder Gossypium thurberi [Baumwolle], Marchantiaceae wie die Gattung Marchantia z.B. die Gattungen und Arten Marchantia berteroana, Marchantia foliacea, Marchantia macropora, Musaceae wie die Gattung Musa z.B. die Gattungen und Arten Musa nana, Musa acuminata, Musa paradisiaca, Musa spp. [Banane], Onagraceae wie die Gattungen Camissonia, Oenothera z.B. die Gattungen und Arten Oenothera biennis oder Camissonia brevipes [Nachtkerze], Palmae wie die Gattung Elacis z.B. die Gattung und Art Elaeis guineensis [Ölpalme], Papaveraceae wie die Gattung Papaver z.B. die Gattungen und Arten Papaver Orientale, Papaver rhoeas, Papaver dubium. [Mohn], Pedaliaceae wie die Gattung Sesamum z.B. die Gattung und Art Sesamum indicum [Sesam], Piperaceae wie die Gattungen Piper, Artanthe, Peperomia, Steffensia z.B. die Gattungen und Arten Piper aduncum, Piper amalago, Piper angustifolium, Piper auritum, Piper betel, Piper cubeba, Piper longum, Piper nigrum, Piper retrofractum, Artanthe adunca, Artanthe elongata, Peperomia elongata, Piper elongatum, Steffensia elongata. [Cayennepfeffer], Poaceae wie die Gattungen Hordeum, Seeale, Avena, Sorghum, Andropogon, Holcus, Panicum, Oryza, Zea (Mais), Triticum z.B. die Gattungen und Arten Hordeum vulgäre, Hordeum juba- tum, Hordeum murinum, Hordeum secalinum, Hordeum distichon Hordeum aegiceras, Hordeum hexastichon., Hordeum hexastichum, Hordeum irreguläre, Hordeum sativum, Hordeum secalinum [Gerste], Seeale cereale [Roggen], Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybride [Hafer], Sorghum bicolor, Sorghum halepense, Sorghum saccharatum, Sorghum vulgäre, Andropogon drum- mondii, Holcus bicolor, Holcus sorghum, Sorghum aethiopicum, Sorghum arundina- ceum, Sorghum caffrorum, Sorghum cernuum, Sorghum dochna, Sorghum drum- mondii, Sorghum durra, Sorghum guineense, Sorghum lanceolatum, Sorghum nervo- sum, Sorghum saccharatum, Sorghum subglabrescens, Sorghum verticilliflorum, Sorghum vulgäre, Holcus halepensis, Sorghum miliaceum, Panicum militaceum [Hirse], Oryza sativa, Oryza latifolia [Reis], Zea mays [Mais] Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum mache, Triticum sativum oder Triticum vulgäre [Weizen], Porphyridiaceae wie die Gattungen Chroothece, Flintiella, Petro- vanella, Porphyridium, Rhodella, Rhodosorus, Vanhoeffenia z.B. die Gattung und Art Porphyridium cruentum, Proteaceae wie die Gattung Macadamia z.B. die Gattung und Art Macadamia intergrifolia [Macadamia], Prasinophyceae wie die Gattungen Nephro- selmis, Prasinococcus, Scherffelia, Tetraselmis, Mantoniella, Ostreococcus z.B. die Gattungen und Arten Nephroselmis olivacea, Prasinococcus capsulatus, Scherffelia dubia, Tetraselmis chui, Tetraselmis suecica, Mantoniella squamata, Ostreococcus tauri, Rubiaceae wie die Gattung Coffea z.B. die Gattungen und Arten Cofea spp., Coffea arabica, Coffea canephora oder Coffea liberica [Kaffee], Scrophulariaceae wie die Gattung Verbascum z.B. die Gattungen und Arten Verbascum blattaria, Verbascum chaixii, Verbascum densiflorum, Verbascum lagurus, Verbascum longifolium, Verbascum lychnitis, Verbascum nigrum, Verbascum olympicum, Verbascum phlomoides, Verbascum phoenicum, Verbascum pulverulentum oder Verbascum thapsus [Königs- kerze], Solanaceae wie die Gattungen Capsicum, Nicotiana, Solanum, Lycopersicon z.B. die Gattungen und Arten Capsicum annuum, Capsicum annuum var. glabrius- culum, Capsicum frutescens [Pfeffer], Capsicum annuum [Paprika], Nicotiana tabacum, Nicotiana alata, Nicotiana attenuata, Nicotiana glauca, Nicotiana langsdorffii, Nicotiana obtusifolia, Nicotiana quadrivalvis, Nicotiana repanda, Nicotiana rustica, Nicotiana sylvestris [Tabak], Solanum tuberosum [Kartoffel], Solanum melongena [Aubergine] Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum., Lycopersicon pyriforme, Solanum integrifolium oder Solanum lycopersicum [Tomate], Sterculiaceae wie die Gattung Theobroma z.B. die Gattung und Art Theobroma cacao [Kakao] oder Theaceae wie die Gattung Camellia z.B. die Gattung und Art Camellia sinensis [Tee]. Vorteilhafte Mikroorganismen sind beispielweise Pilze ausgewählt aus der Gruppe der Familien Chaetomiaceae, Choanephoraceae, Cryptococcaceae, Cunninghamellaceae, Demetiaceae, Moniliaceae, Mortierellaceae, Mucoraceae, Pythiaceae, Sacharomyce- taceae, Saprolegniaceae, Schizosacharomycetaceae, Sodariaceae oder Tubercularia- ceae. Beispielhaft seien die folgenden Mikroorganismen genannt ausgewählt aus der Gruppe: Choanephoraceae wie den Gattungen Blakeslea, Choanephora z.B. die Gattungen und Arten Blakeslea trispora, Choanephora cucurbitarum, Choanephora infundibulifera var. cucurbitarum, Mortierellaceae wie der Gattung Mortierella z.B. die Gattungen und Arten Mortierella isabellina, Mortierella polycephala , Mortierella ramanniana , Mortierella vinacea, Mortierella zonata, Pythiaceae wie den Gattungen Phytium, Phytophthora z.B. die Gattungen und Arten Pythium debaryanum, Pythium • intermedium, Pythium irreguläre, Pythium megalacanthum, Pythium paroecandrum, Pythium sylvaticum, Pythium ultimum, Phytophthora cactorum, Phytophthora cinna- momi, Phytophthora citricola, Phytophthora citrophthora, Phytophthora cryptogea, Phytophthora drechsleri, Phytophthora erythroseptica, Phytophthora lateralis, Phytophthora megasperma, Phytophthora nicotianae, Phytophthora nicotianae var. parasitica, Phytophthora palmivora, Phytophthora parasitica, Phytophthora syringae, Saccharo- mycetaceae wie den Gattungen Hansenula, Pichia, Saccharomyces, Saccharomy- codes, Yarrowia z.B. die Gattungen und Arten Hansenula anomala, Hansenula californica, Hansenula canadensis, Hansenula capsulata, Hansenula ciferrii, Hansenula glucozyma, Hansenula henricii, Hansenula holstii, Hansenula minuta, Hansenula non- fermentans, Hansenula philodendri, Hansenula polymorpha, Hansenula saturnus, Hansenula subpelliculosa, Hansenula wickerhamii, Hansenula wingei, Pichia alcoholo- phila, Pichia angusta, Pichia anomala, Pichia bispora, Pichia burtonii, Pichia canadensis, Pichia capsulata, Pichia carsonii, Pichia cellobiosa, Pichia ciferrii, Pichia farinosa, Pichia fermentans, Pichia finlandica, Pichia glucozyma, Pichia guilliermondii, Pichia haplophila, Pichia henricii, Pichia holstii, Pichia jadinii, Pichia lindnerii, Pichia mem- branaefaciens, Pichia methanolica, Pichia minuta var. minuta, Pichia minuta var. non- fermentans, Pichia norvegensis, Pichia qhmeri, Pichia pastoris, Pichia philodendri, Pichia pini, Pichia polymorpha, Pichia quercuum, Pichia rhodanensis, Pichia sargen- tensis, Pichia stipitis, Pichia strasburgensis, Pichia subpelliculosa, Pichia toletana, Pichia trehalophila, Pichia vini, Pichia xylosa, Saccharomyces aceti, Saccharomyces bailii, Saccharomyces bayanus, Saccharomyces bisporus, Saccharomyces capensis, Saccharomyces carisbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces cere- visiae var. ellipsoideus, Saccharomyces chevalieri, Saccharomyces delbrueckii, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces drosophilarum, Saccharomyces elegans, Saccharomyces ellipsoideus, Saccharomyces fermentati, Saccharomyces florentinus, Saccharomyces fragilis, Saccharomyces heterogenicus, Saccharomyces hienipien- sis, Saccharomyces inusitatus, Saccharomyces italicus, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces krusei, Saccharomyces lactis, Saccharomyces marxianus, Saccharomyces microellipsoides, Saccharomyces montanus, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oleaceus, Saccharomyces paradoxus, Saccharomyces pastorianus, Saccharomyces pretoriensis, Saccharomyces rosei, Saccharomyces rouxii, Saccharomyces uvarum, Saccharomycodes ludwigii, Yarrowia lipolytica, Schizosacharomyceta- ceae such as the genera Schizosaccharomyces e.g. the species Schizosaccharomyces japonicus var. japonicus, Schizosaccharomyces japonicus var. versatilis, Schizosaccharomyces malidevorans, Schizosaccharomyces octosporus, Schizo- saccharomyces pombe var. malidevorans, Schizosaccharomyces pombe var. pombe, Thraustochytriaceae such as the genera Althornia, Aplanochytrium, Japonochytrium, Schizochytrium, Thraustochytrium e.g. the species Schizochytrium aggregatum, Schizochytrium limacinum, Schizochytrium mangrovei, Schizochytrium minutum, Schizochytrium octosporum, Thraustochytrium aggregatum, Thraustochytrium amoe- boideum, Thraustochytrium antacticum, Thraustochytrium arudimentale, Thraustochytrium aureum, Thraustochytrium benthicola, Thraustochytrium globosum, Thraustochytrium indicum, Thraustochytrium kerguelense, Thraustochytrium kinnei, Thraustochytrium motivum, Thraustochytrium multirudimentale, Thraustochytrium pachyder- mum, Thraustochytrium proliferum, Thraustochytrium roseum, Thraustochytrium rossii, Thraustochytrium striatum oder Thraustochytrium visurgense. Weitere vorteilhafte Mikroorganismen sind beispielweise Bakterien ausgewählt aus der Gruppe der Familien Bacillaceae, Enterobacteriacae oder Rhizobiaceae.
Beispielhaft seien die folgenden Mikroorganismen genannt ausgewählt aus der Gruppe: Bacillaceae wie die Gattung Bacillus z.B die Gattungen und Arten Bacillus acidocaldarius, Bacillus acidoterrestris, Bacillus alcalophilus, Bacillus amylolique- faciens, Bacillus amylolyticus, Bacillus brevis, Bacillus cereus, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus sphaericus subsp. fusiformis, Bacillus galactophilus, Bacillus globisporus, Bacillus globisporus subsp. marinus, Bacillus halophilus, Bacillus lentimorbus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus poly- myxa, Bacillus psychrosaccharolyticus, Bacillus pumilus, Bacillus sphaericus, Bacillus subtilis subsp. spizizenii, Bacillus subtilis subsp. subtilis oder Bacillus thuringiensis; Enterobacteriacae wie die Gattungen Citrobacter, Edwardsieila, Enterobacter, Erwinia, Escherichia, Klebsiella, Salmonella oder Serratia z.B die Gattungen und Arten Citrobacter amalonaticus, Citrobacter diversus, Citrobacter freundii, Citrobacter geno- mospecies, Citrobacter gillenii, Citrobacter intermedium, Citrobacter koseri, Citrobacter murliniae, Citrobacter sp., Edwardsiella hoshinae, Edwardsieila ictaluri, Edwardsieila tarda, Erwinia alni, Erwinia amylovora, Erwinia ananatis, Erwinia aphidicola, Erwinia billingiae, Erwinia cacticida, Erwinia cancerogena, Enwinia carnegieana, Erwinia caroto- vora subsp. atroseptica, Erwinia carotovora subsp. betavasculorum, Erwinia carotovora subsp. odorifera, Erwinia carotovora subsp. wasabiae, Erwinia chrysanthemi, Erwinia cypripedii, Erwinia dissolvens, Erwinia herbicola, Erwinia mallotivora, Erwinia milletiae, Erwinia nigrifluens, Erwinia nimipressuralis, Erwinia persicina, Erwinia psidii, Erwinia pyrifoliae, Erwinia quercina, Erwinia rhapontici, Erwinia rubrifaciens, Erwinia salicis, Erwinia stewartii, Erwinia tracheiphila, Erwinia uredovora, Escherichia adecarboxylata, Escherichia anindolica, Escherichia aurescens, Escherichia blattae, Escherichia coli, Escherichia coli var. communior, Escherichia coli-mutabile, Escherichia fergusonii, Escherichia hermannii, Escherichia sp., Escherichia vulneris, Klebsiella aerogenes, Klebsiella edwardsii subsp. atlantae, Klebsiella ornithinolytica, Klebsiella oxytoca, Klebsiella planticola, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae, Klebsiella sp., Klebsiella terrigena, Klebsiella trevisanii, Salmonella abony, Salmonella arizonae, Salmonella bongori, Salmonella choleraesuis subsp. arizonae, Salmonella choleraesuis subsp. bongori, Salmonella choleraesuis subsp. cholereasuis, Salmonella choleraesuis subsp. diarizonae, Salmonella choleraesuis subsp. houtenae, Salmonella choleraesuis subsp. indica, Salmonella choleraesuis subsp. salamae, Salmonella daressalaam, Salmonella enterica subsp. houtenae, Salmonella enterica subsp. salamae, Salmonella enteritidis, Salmonella gällinarum, Salmonella heidelberg, Salmonella panama, Salmonella senftenberg, Salmonella typhimurium, Serratia entomophila, Serratia ficaria, Serratia fonticola, Serratia grimesii, Serratia liquefaciens, Serratia marcescens, Serratia marcescens subsp. marcescens, Serratia marinorubra, Serratia odorifera, Serratia plymouthensis, Serratia plymuthica, Serratia proteamaculans, Serratia proteamaculans subsp. quinovora, Serratia quinivorans oder Serratia rubi- daea; Rhizobiaceae wie die Gattungen Agrobacterium, Carbophilus, Chelatobacter, Ensifer, Rhizobium, Sinorhizobium z.B. die Gattungen und Arten Agrobacterium atlanticum, Agrobacterium ferrugineum, Agrobacterium gelatinovorum, Agrobacterium larrymoorei, Agrobacterium meteori, Agrobacterium radiobacter, Agrobacterium rhizo- genes, Agrobacterium rubi, Agrobacterium stellulatum, Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium vitis, Carbophilus carboxidus, Chelatobacter heintzii, Ensifer adhaerens, Ensifer arboris, Ensifer fredii, Ensifer kostiensis, Ensifer kummerowiae, Ensifer medi- cae, Ensifer meliloti, Ensifer saheli, Ensifer terangae, Ensifer xinjiangensis, Rhizobium ciceri Rhizobium etli, Rhizobium fredii, Rhizobium galegae, Rhizobium gallicum, Rhizobium giardinii, Rhizobium hainanense, Rhizobium huakuii, Rhizobium huautlense, Rhizobium indigoferae, Rhizobium japonicum, Rhizobium leguminosarum, Rhizobium loessense, Rhizobium loti, Rhizobium lupini, Rhizobium mediterraneum, Rhizobium meliloti, Rhizobium mongolense, Rhizobium phaseoli, Rhizobium radiobacter, Rhizobium rhizogenes, Rhizobium rubi, Rhizobium sullae, Rhizobium tianshanense, Rhizobium trifolii, Rhizobium tropici, Rhizobium undicola, Rhizobium vitis, Sinorhizobium adhaerens, Sinorhizobium arboris, Sinorhizobium fredii, Sinorhizobium kostiense, Sinorhizobium kummerowiae, Sinorhizobium medicae, Sinorhizobium meliloti, Sinorhizobium morelense, Sinorhizobium saheli oder Sinorhizobium xinjiangense.
Weitere vorteilhafte Mikroorganismen für das erfindungsgemäße Verfahren sind beispielweise Protisten oder Diatomeen ausgewählt aus der Gruppe der Familien Di- nophyceae, Turaniellidae oder Oxytrichidae wie die Gattungen und Arten: Cryptheco- dinium cohnii, Phaeodactylum tricornutum, Stylonychia mytilus, Stylonychia pustulata, Stylonychia putrina, Stylonychia notophora, Stylonychia sp., Colpidium campylum oder Colpidium sp. i
Vorteilhaft werden im erfindungsgemäßen Verfahren transgene Organismen wie Pilze wie Mortierella oderTraustochytrium, Hefen wie Saccharomyces oder Schizosaccharomyces, Moose wie Physcomitrella oder Ceratodon, nicht-humane Tiere wie Caenorhabditis, Algen wie Crypthecodinium oder Phaeodactylum oder Pflanzen wie zweikeimblättrige oder einkeimblättrige Pflanzen verwendet. Besonders vorteilhaft werden Organismen im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet, die zu den Öl- produzierenden Organismen gehören, das heißt die für die Herstellung von Ölen verwendet werden, wie Pilze wie Mortierella oder Thraustochytrium, Algen wie Crypthe- codinium, Phaeodactylum oder Pflanzen, insbesondere Pflanzen bevorzugt Ölfruchtpflanzen, die große Mengen an Lipidverbindungen enthalten, wie Erdnuss, Raps, Canola, Sonnenblume, Safflor (Färberdistel), Mohn, Senf, Hanf, Rizinus, Olive, Sesam, Calendula, Punica, Nachtkerze, Königskerze, Distel, Wildrosen, Haselnuss, Mandel, Macadamia, Avocado, Lorbeer, Kürbis, Lein, Soja, Pistazien, Borretsch, Bäume (Öl- palme, Kokosnuss oder Walnuss) oder Feldfrüchte, wie Mais, Weizen, Roggen, Hafer, Triticale, Reis, Gerste, Baumwolle, Maniok, Pfeffer, Tagetes, Solanaceen-Pflanzen, wie Kartoffel, Tabak, Aubergine und Tomate, Vicia-Arten, Erbse, Alfalfa oder Buschpflanzen (Kaffee, Kakao, Tee), Salix-Arten sowie ausdauernde Gräser und Futterfeldfrüchte. Bevorzugte erfindungsgemäße Pflanzen sind Ölfruchtpflanzen, wie Erdnuss, Raps, Canola, Sonnenblume, Safflor (Färberdistel), Mohn, Senf, Hanf, Rhizinus, Olive, Calendula, Punica, Nachtkerze, Kürbis, Lein, Soja, Borretsch, Bäume (Ölpalme, Kokosnuss). Besonders bevorzugt sind C18:2- und/oder C18:3-Fettsäure reiche Pflanzen wie Sonnenblume, Färberdistel, Tabak, Königskerze, Sesam, Baumwolle, Kürbis, Mohn, Nachtkerze, Walnuss, Lein, Hanf, Distel oder Färberdistel. Ganz besonders bevorzugt sind Pflanzen wie Färberdistel, Sonnenblume, Mohn, Nachtkerze, Walnuss, Lein oder Hanf.
Für das erfindungsgemäß beschriebene Verfahren ist es vorteilhaft, in den Organismus zusätzlich zu den im Verfahren eingebrachten Nukleinsauresequenzen, die für eine ω-3-Desaturase codieren, weitere Nukleinsäuren einzubringen, die für Enzyme des Fettsäure- oder Lipidstoffwechsels codieren.
Im Prinzip können alle Gene des Fettsäure- oder Lipidstoffwechsels vorteilhaft in Kombination mit der erfinderischen ω-3-Desaturase im Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren verwendet werden vorteilhaft werden Gene des Fettsäure- oder Lipidstoffwechsels ausgewählt aus der Gruppe Acyl-CoA-Dehydro- genase(n), Acyl-ACP[= acyl carrier protein]-Desaturase(n), Acyl-ACP-Thioester- ase(n), Fettsäure-Acyl-Transferase(n), Acyl-CoA:Lysophospholipid-Acyltransferasen, Fettäure-Synthase(n), Fettsäure-Hydroxylase(n), Acetyl-Coenzym A-Carboxylase(n), Acyl-Coenzym A-Oxidase(n), Fettsäure-Desaturase(n), Fettsäure-Acetylenasen, Lipoxygenasen, Triacylglycerol-Lipasen, Allenoxid-Synthasen, Hydroperoxid-Lyasen oder Fettsäure-Elongase(n) in Kombination mit der ω-3-Desaturase verwendet. Besonders bevorzugt werden Gene ausgewählt aus der Gruppe der Δ-4-Desatu rasen, Δ-5-Desaturasen, Δ-6-Desaturasen, Δ-8-Desatuasen, Δ-9-Desaturasen, Δ-12-Desa- urasen, Δ-5-Elongasen, Δ-6-Elongasen oder Δ-9-Elongasen in Kombination mit den vorgenannten Genen für die ω-3-Desaturase verwendet, wobei einzelne Gene oder mehrere Gene in Kombination verwendet werden können.
Die erfindungsgemäße ω-3-Desaturase hat gegenüber den bekannten ω-3-Desaturase die vorteilhafte Eigenschaft, dass sie ein breites Spektrum an ω-6-Fettsäuren desa- turieren kann, bevorzugt werden C20- und C22-Fettsäuren wie C20:2-, C20:3-, C20:4-, C22:4- oder C22:5-Fettsäuren desaturiert. Aber auch die kürzeren C18-Fettsäuren wie C18:2- oder C18:3-Fettsäuren werden vorteilhaft desaturiert. Durch diese Eigenschaften der ω-3-Desaturase ist es vorteilhaft möglich das Fettsäurespektrum innerhalb eines Organismus vorteilhaft innerhalb einer Pflanze oder einem Pilz von den ω-6-Fettsäuren zu den ω-3-Fettsäuren hin zu verschieben. Bevorzugt werden von der erfindungsgemäßen ω-3-Desaturase C20-Fettsäuren desaturiert. Innerhalb des Organismus werden diese Fettsäuren aus dem vorhandenen Fettsäurepool zu mindestens 10 %, 15 %, 20 %, 25 % oder 30 % zu den entsprechenden ω-3-Fettsäuren umgesetzt. Gegenüber den C 8-Fettsäuren weist die ω-3-Desaturase eine um den Faktor 10 geringere Aktivität auf, das heißt es werden nur ca. 1 ,5 bis 3 % der im Fettsäurepool vorhandenen Fettsäuren zu den entsprechenden ω-3-Fettsäuren umgesetzt. Bevorzugtes Substrat der erfindungsgemäßen ω-3-Desaturase sind die in Phospholipiden gebundenen ω-6-Fettsäuren. Figur 9 zeigt deutlich am Beispiel der Desaturierung von Dihomo-γ-linolensäure [C2o:4 A8,11'14], dass die ω-3-Desaturase bei der Desaturierung vorteilhaft nicht zwischen an sn1- oder sn2-Position gebundenen Fettsäuren unterscheidet. Sowohl an sn1- oder sn2-Position in den Phospholipide gebundene Fettsäuren werden desaturiert. Weiterhin ist vorteilhaft, dass die ω-3-Desaturase eine breite Palette von Phospholipiden wie Phosphatidylcholin (= PC), Phosphatidylinositol (= PIS) oder Phosphatidylethanolamin (= PE) umsetzt. Schließlich lassen sich auch Desaturierungsprodukte in den Neutrallipiden (= NL), das heißt in den Triglyceriden finden. Durch die enzymatische Aktivität der im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren, die für Polypeptide mit ω-3-Desaturaseaktivität codieren, vorteilhaft in Kombination mit Nukleinsauresequenzen, die für Polypeptide des Fettsäure- oder Lipidstoffwechsels wie weiteren Polypeptiden mit Δ-4-, Δ-5-, Δ-6-, Δ-8-Desaturase- oder Δ-5-, Δ-6-oder Δ-9-Elongaseaktivität codieren, können unterschiedlichste mehr- fach ungesättigte Fettsäuren im erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt werden. Je nach Auswahl der für das erfindungsgemäße Verfahren verwendeten Organismen wie den vorteilhaften Pflanze lassen sich Mischungen der verschiedenen mehrfach ungesättigten Fettsäuren oder einzelne mehrfach ungesättigte Fettsäuren wie EPA oder DHA in freier oder gebundener Form herstellen. Je nachdem welche Fettsäure- Zusammensetzung in der Ausgangspflanze vorherrscht (C18:2- oder C18:3-Fett- säuren) entstehen so Fettsäuren, die sich von C18:2-Fettsäuren ableiten, wie GLA, DGLA oder ÄRA oder, die sich von C18:3-Fettsäuren ableiten, wie SDA, ETA oder EPA. Liegt in der für das Verfahren verwendeten Pflanze als ungesättigte Fettsäure nur Linolsäure (= LA, C18:2Δ9,12) vor, so können als Produkte des Verfahrens zunächst nur GLA, DGLA und ÄRA entstehen, die als freie Fettsäuren oder gebunden vorliegen können. Durch die Aktivität der erfindungsgemäßen ω-3-Desatürase können aus diesen schließlich ω-3-Fettsäuren synthetisiert werden. Ist in der im Verfahren verwendeten Pflanze als ungesättigte Fettsäure nur α-Linolensäure (= ALA, C18:3Δ9,12,15) beispielsweise wie in Lein, so können als Produkte des Verfahrens nur SDA, ETA, EPA und/oder DHA entstehen, die wie oben beschrieben als freie Fettsäuren oder gebunden vorliegen können. Durch Modifikation der Aktivität des an der Synthese beteiligten Enzyms ω-3-Desaturase vorteilhaft in Kombination mit der Δ-4-, Δ-5-, Δ-6-Desaturase und/oder Δ-6-Elongase und/oder Δ-5-Elongase, oder der Δ- -, Δ-5-, Δ-8-Desaturase, und/oder Δ-9-Elongase und/oder Δ-5-Elongase lassen sich gezielt in den vorgenannten Organismen vorteilhaft in den vorgenannten Pflanzen nur einzelne Produkte herstellten.. Durch die Aktivität der Δ-6-Desaturase und Δ-6-Elon- gase entstehen beispielsweise GLA und DGLA bzw. SDA und ETA, je nach Ausgangspflanze und ungesättigter Fettsäure. Bevorzugt entstehen DGLA bzw. ETA oder deren Mischungen. Werden die Δ-5-Desaturase, die Δ-5-Elongase und die Δ-4-Desa- turase zusätzlich in die Organismen vorteilhaft in die Pflanze eingebracht, so entstehen zusätzlich ÄRA, EPA und/oder DHA. Dies gilt auch für Organismen in die vorher die Δ-8-Desaturase und Δ-9-Elongase eingebracht wurde. Vorteilhaft werden nur ÄRA, EPA oder DHA oder deren Mischungen besonders vorteilhaft nur EPA oder DHA o- der deren Mischungen synthetisiert, abhängig von der in im Organismus bzw. in der Pflanze vorliegenden Fettsäure, die als Ausgangssubstanz für die Synthese dient. Da es sich um Biosyntheseketten handelt, liegen die jeweiligen Endprodukte nicht als Reinsubstanzen in den Organismen vor. Es sind immer auch geringe Mengen der Vorläuferverbindungen im Endprodukt enthalten. Diese geringen Mengen betragen weniger als 20 Gew.-%, vorteilhaft weniger als 15 Gew.-%, besonders vorteilhaft weniger als 10 Gew.-%, ganz besonders vorteilhaft weniger als 5, 4, 3, 2 oder 1 Gew.-% bezogen auf das Endprodukt DGLA, ETA oder deren Mischungen bzw. ÄRA, EPA, DHA oder deren Mischungen vorteilhaft EPA oder DHA oder deren Mischungen. Neben der Produktion der Ausgangsfettsäuren für die erfindungsgemäße ω-3-Desa- turase direkt im Organismus können die Fettsäuren auch von außen gefüttert werden. Aus kostengründen ist die Produktion im Organismus bevorzugt. Bevorzugt Substrate der ω-3-Desaturase sind die Linolsäure (C18:2Δ9,12), die γ-Linolensäure (C18:3Δ6,9,12), die Eicosadiensäure (C20:2Δ11'14), die Dihomo-γ-linolensäure (C20:3Δ8'11'14), die Ara- chidonsäure (C20:4Δ5'8'11'14), die Docosatetraensäure (C22:4Δ7'10'13'16) und die Docosa- pentaensäure (C22:5Δ4,7'10'13-15).
Zur Steigerung der Ausbeute im beschriebenen Verfahren zur Herstellung von Ölen und/oder Triglyceriden mit einem vorteilhaft erhöhten Gehalt an mehrfach ungesättigten Fettsäuren ist es vorteilhaft die Menge an Ausgangsprodukt für die Fettsäure- synthese zu steigern, dies kann beispielsweise durch das Einbringen einer Nuklein- säure in den Organismus, die für ein Polypeptid mit Δ-12-Desaturaseaktivität codiert, erreicht werden. Dies ist besonders vorteilhaft in Öl-produzierenden Organismen wie Raps, die einen hohen Ölsäuregehalt aufweisen. Da diese Organismen nur einen geringen Gehalt an Linolsäure aufweisen (Mikoklajczak et al., Journal of the American Oil Chemical Society, 38, 1961 , 678 - 681) ist die Verwendung der genannten Δ-12- Desaturasen zur Herstellung des Ausgangsprodukts Linolsäure vorteilhaft.
Im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren stammen vorteilhaft aus Pflanzen wie Algen wie Isochrysis, Mantoniella, Ostreococcus oder Crypthecodinium, Algen/Diatomeen wie Phaeodactylum oder Thraustochytrium, Moose wie Physco- mitrella oder Ceratodon oder höheren Pflanzen wie den Primulaceae wie Aleuritia, Calendula stellata, Osteospermum spinescens oder Osteospermum hyoseroides, Mikroorganismen wie Pilzen wie Aspergillus, Thraustochytrium, Phytophthora, Entomo- phthora, Mucor oder Mortierella, Bakterien wie Shewanella, Hefen oder Tieren wie Nematoden wie Caenorhabditis, Insekten oder Fischen. Vorteilhaft stammen die erfindungsgemäßen isolierten Nukleinsauresequenzen aus einem Tier aus der Ordnung der Vertebraten. Bevorzugt stammen die Nukleinsauresequenzen aus der Klasse der Vertebrata; Euteleostomi, Actinopterygii; Neopterygii; Teleostei; Euteleostei, Pro- täcanthopterygii, Salmoniformes; Salmonidae bzw. Oncorhynchus. Besonders vorteilhaft stammen die Nukleinsäuren aus Pilzen, Tieren oder aus Pflanzen wie Algen oder Moosen, bevorzugt aus der Ordnung der Salmoniformes wie der Familie der Salmonidae wie der Gattung Salmo beispielsweise aus den Gattungen und Arten Oncorhynchus mykiss, Trutta trutta oder Salmo trutta fario oder aus den Diatomeen wie den Gattungen Thallasiosira oder Crypthecodinium.
Vorteilhaft werden im erfindungsgemäßen Verfahren die vorgenannten Nukleinsäure- Sequenzen oder deren Derivat oder Homologe, die für Polypeptide codieren, die noch die enzymatische Aktivität der durch Nukleinsauresequenzen codierten Proteine be- sitzen. Diese Sequenzen werden einzeln oder in Kombination mit den für die ω-3- Desaturase codierenden Nukleinsäuresquenzen in Expressionskonstrukte cloniert und zum Einbringen und zur Expression in Organismen verwendet. Diese Expressionskonstrukte ermöglichen durch ihre Konstruktion eine vorteilhafte optimale Synthese der im erfindungsgemäßen Verfahren produzierten mehrfach ungesättigten Fettsäuren.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren ferner den Schritt des Gewinnens einer Zelle oder eines ganzen Organismus, der die im Verfahren verwendeten Nukleinsauresequenzen enthält, wobei die Zelle und/oder der Organismus mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsauresequenz, die für die ω-3-Desaturase codiert, einem Genkonstrukt oder einem Vektor wie nachfolgend beschrieben, allein oder in Kombination mit weiteren Nukleinsauresequenzen, die für Proteine des Fettsäure- oder Lipidsstoffwechsels codieren, transformiert wird. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst dieses Verfahren ferner den Schritt des Gewinnens der Öle, Lipide oder freien Fettsäuren aus dem Organismus oder aus der Kultur. Bei der Kultur kann es sich beispielsweise um eine Fermentationskultur beispielsweise im Falle der Kultivierung von Mikroorganismen wie z.B. Mortierella, Saccharomyces oder Thraustochytrium oder um eine Treibhaus- oder Feldkultur einer Pflanze handeln. Die so hergestellte Zelle oder der so hergestellte Organismus ist vorteilhaft eine Zelle eines Öl-produzierenden Organismus wie einer Ölfruchtpflanze wie beispielsweise Erdnuss, Raps, Canola, Lein, Hanf, Erdnuss, Soja, Safflower, Hanf, Sonnenblumen oder Borretsch.
Unter Anzucht ist beispielsweise die Kultivierung im Falle von Pflanzenzellen, -gewebe oder -organe auf oder in einem Nährmedium oder der ganzen Pflanze auf bzw. in einem Substrat beispielsweise in Hydrokultur, Blumentopferde oder auf einem Acker- boden zu verstehen.
"Transgen" bzw. "Rekombinant" im Sinne der Erfindung bedeutet bezüglich zum Beispiel einer Nukleinsauresequenz, einer Expressionskassette (= Genkonstrukt) oder einem Vektor enthaltend die erfindungsgemäße Nukleinsauresequenz oder einem Organismus transformiert mit den erfindungsgemaßen Nukleinsauresequenzen, Expressionskassette oder Vektor alle solche durch gentechnische Methoden zustandegekommenen Konstruktionen, in denen sich entweder a) die erlϊndungsgemäße Nukleinsauresequenz, oder b) eine mit der erfindungsgemäßen Nukleinsauresequenz funktionell verknüpfte genetische Kontrollsequenz, zum Beispiel ein Promotor, oder c) (a) und (b) - sich nicht in ihrer natürlichen, genetischen Umgebung befinden oder durch gentechnische Methoden modifiziert wurden, wobei die Modifikation beispielhaft eine Substitution, Addition, Deletion, Inversion oder Insertion eines oder mehrerer Nukleotidreste sein kann. Natürliche genetische Umgebung meint den natürlichen genomischen bzw. chromosomalen Locus in dem Herkunftsorganismus oder das Vorliegen in einer genomischen Bibliothek. Im Fall einer genomischen Bibliothek ist die natürliche, genetische Umgebung der Nukleinsauresequenz bevorzugt zumindest noch teilweise erhalten. Die Umgebung flankiert die Nukleinsauresequenz zumindest an einer Seite und hat eine Sequenzlänge von mindestens 50 bp, bevorzugt mindestens 500 bp, besonders bevorzugt mindestens 1000 bp, ganz besonders bevorzugt mindestens 5000 bp. Eine natürlich vorkommende Expressionskassette - beispielsweise die natürlich vorkommende Kombination des natürlichen Promotors der erfindungsgemäßen Nukleinsauresequenzen mit den entsprechenden ω-3-Desaturasegenen - wird zu einer transgenen Expressionskassette, wenn diese durch nicht-natürliche, synthetische ("künstliche") Verfahren wie beispielsweise einer Mutagenisierung geändert wird. Entsprechende Verfahren sind beispielsweise beschrieben in US 5,565,350 oder WO 00/15815.
Unter transgenen Organismus bzw. transgener Pflanze im Sinne der Erfindung ist wie vorgenannt zu verstehen, dass die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren nicht an ihrer natürlichen Stelle im Genom eines Organismus sind, dabei können die Nukleinsäuren homolog oder heterolog exprimiert werden. Transgen bedeutet aber auch wie genannt, dass die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren an ihrem natürlichen Platz im Genom eines Organismus sind, dass jedoch die Sequenz gegenüber der natürlichen Sequenz verändert wurde und/oder das die Regulationssequenzen, der natürlichen Sequenzen verändert wurden. Bevorzugt ist unter transgen die Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren an nicht natürlicher Stelle im Genom zu verstehen, das heißt eine homologe oder bevorzugt heterologe Expression der Nukleinsäuren liegt vor. Bevorzugte transgene Organismen sind Pilze wie Mortierella, Moose wie Physco- mitrella, Algen wie Crypthecodinium oder Pflanzen wie die Ölfruchtpflanzen.
Als Organismen bzw. Wirtsorganismen für die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren, die Expressionskassette oder den Vektor eignen sich prinzipiell vorteilhaft alle Organismen, die in der Lage sind Fettsäuren speziell ungesättigte Fettsäuren zu synthetisieren bzw. für die Expression rekombinanter Gene ge- eignet sind. Beispielhaft seien Pflanzen wie Brassicaceae wie Arabidopsis, Asteraceae wie Calendula oder Kulturpflanzen wie Soja, Erdnuss, Rizinus, Sonnenblume, Mais, Baumwolle, Flachs, Raps, Kokosnuss, Ölpalme, Färbersafflor (Carthamus tinctorius) oder Kakaobohne, Mikroorganismen wie Pilze beispielsweise die Gattung Mortierella, Thraustochytrium, Saprolegnia oder Pythium, Bakterien wie die Gattung Escherichia oder Shewanella, Hefen wie die Gattung Saccharomyces, Cyanobakterien, Ciliaten, Algen oder Protozoen wie Dinoflagellaten wie Crypthecodinium genannt. Bevorzugt werden Organismen, die natürlicherweise Öle in größeren Mengen synthetisieren können wie Pilze wie Mortierella alpina, Pythium insidiosum oder Pflanzen wie Soja, Raps, Kokosnuss, Ölpalme, Färbersafflor, Flachs, Hanf, Rizinus, Calendula, Erdnuss, Kakao- bohne oder Sonnenblume oder Hefen wie Saccharomyces cerevisiae, besonders bevorzugt werden Soja, Flachs, Raps, Färbersafflor, Sonnenblume, Calendula, Mortierella oder Saccharomyces cerevisiae. Prinzipiell sind als Wirtsorganismen neben den vorgenannten transgenen Organismen auch transgene Tiere vorteilhaft nicht-humane Tiere geeignet beispielsweise C. elegans.
Nutzbare Wirtszellen sind weiterhin genannt in: Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Verwendbare Expressionsstämme z.B. solche, die eine geringere Proteaseaktivität aufweisen sind beschrieben in: Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119-128.
Hierzu gehören Pflanzenzellen und bestimmte Gewebe, Organe und Teile von Pflanzen in all ihren Erscheinungsformen, wie Antheren, Fasern, Wurzelhaare, Stängel, Embryos, Kalli, Kotelydonen, Petiolen, Erntematerial, pflanzliches Gewebe, reproduktives Gewebe und Zellkulturen, das von der eigentlichen transgenen Pflanze abgeleitet ist und/oder dazu verwendet werden kann, die transgene Pflanze hervorzubringen.
Transgene Pflanzen, die die im erfindungsgemäßen Verfahren synthetisierten mehr- fach ungesättigten Fettsäuren enthalten, können vorteilhaft direkt vermarktet werden ohne dass, die synthetisierten Öle, Lipide oder Fettsäuren isoliert werden müssen. Unter Pflanzen im erfindungsgemäßen Verfahren sind ganze Pflanzen sowie alle Pflanzenteile, Pflanzenorgane oder Pflanzenteile wie Blatt, Stiel, Samen, Wurzel, Knollen, Antheren, Fasern, Wurzelhaare, Stängel, Embryos, Kalli, Kotelydonen, Petiolen, Erntematerial, pflanzliches Gewebe, reproduktives Gewebe, Zellkulturen, die sich von der transgenen Pflanze abgeleiten und/oder dazu verwendet werden können, die transgene Pflanze hervorzubringen. Der Samen umfasst dabei alle Samenteile wie die Samenhüllen, Epidermis- und Samenzellen, Endosperm oder Embyrogewebe. Die im erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Verbindungen können aber auch aus den Organismen vorteilhaft Pflanzen in Form ihrer Öle, Fett, Lipide und/oder freien Fettsäuren isoliert werden. Durch dieses Verfahren hergestellte mehrfach ungesättigten Fettsäuren lassen sich durch Ernten der Organismen entweder aus der Kultur, in der sie wachsen, oder vom Feld ernten. Dies kann über Pressen oder Extraktion der Pflanzenteile bevorzugt der Pflanzensamen erfolgen. Dabei können die Öle, Fette, Lipide und/oder freien Fettsäuren durch sogenanntes kalt schlagen oder kalt pressen ohne Zuführung von Wärme durch Pressen gewonnen werden. Damit sich die Pflanzenteile speziell die Samen leichter aufschließen lassen, werden sie vorher zerkleinert, gedämpft oder geröstet. Die so vorbehandelten Samen können anschließend gepresst werden oder mit Lösungsmittel wie warmen Hexan extrahiert werden. Anschließend wird das Lösungsmittel wieder entfernt. Im Falle von Mikroorganismen werden diese nach Ernte beispielsweise direkt ohne weitere Arbeitsschritte extrahiert oder aber nach Aufschluss über verschiedene dem Fachmann bekannte Methoden extrahiert. Auf diese Weise können mehr als 96 % der im Verfahren hergestellten Verbindungen isoliert werden. Anschließend werden die so erhaltenen Produkte weiter bearbeitet, das heißt raffiniert. Dabei werden zunächst beispielsweise die Pfianzenschleime und Trübstoffe entfernt. Die sogenannte Entschleimung kann enzymatisch oder beispielsweise chemisch/physikalisch durch Zugabe von Säure wie matisch oder beispielsweise chemisch/physikalisch durch Zugabe von Säure wie Phosphorsäure erfolgen. Anschließend werden die freien Fettsäuren durch Behandlung mit einer Base beispielsweise Natronlauge entfernt. Das erhaltene Produkt wird zur Entfernung der im Produkt verbliebenen Lauge mit Wasser gründlich gewaschen und getrocknet. Um die noch im Produkt enthaltenen Farbstoffe zu entfernen werden die Produkte einer Bleichung mit beispielsweise Bleicherde oder Aktivkohle unterzogen. Zum Schluss wird das Produkt noch beispielsweise mit Wasserdampf noch desodoriert.
Vorzugsweise sind die durch dieses Verfahren produzierten PUFAs bzw. LCPUFAs Cι8-, C20- oder C22-Fettsäuremoleküle mit mindestens zwei Doppelbindungen im Fettsäuremolekül, vorzugsweise zwei, drei, vier, fünf oder sechs Doppelbindungen. Diese Ci8-> C2o- oder C22-Fettsäuremoleküle lassen sich aus dem Organismus in Form eines Öls, Lipids oder einer freien Fettsäure isolieren. Geeignete Organismen sind beispielsweise die vorstehend erwähnten. Bevorzugte Organismen sind transgene Pflanzen. Eine Ausführungsform der Erfindung sind deshalb Öle, Lipide oder Fettsäuren oder Fraktionen davon, die durch das oben beschriebene Verfahren hergestellt worden sind, besonders bevorzugt Öl, Lipid oder eine Fettsäurezusammensetzung, die PUFAs umfassen und von transgenen Pflanzen herrühren.
Diese Öle, Lipide oder Fettsäuren enthalten wie oben beschrieben vorteilhaft 6 bis 15 % Palmitinsäure, 1 bis 6 % Stearinsäure; 7 - 85 % Ölsäure; 0,5 bis 8 % Vaccensäure, 0,1 bis 1 % Arachinsäure, 7 bis 25 % gesättigte Fettsäuren, 8 bis 85 % einfach ungesättigte Fettsäuren und 60 bis 85 % mehrfach ungesättigte Fettsäuren jeweils bezogen auf 100 % und auf den Gesamtfettsäuregehalt der Organismen. Als vorteilhafte mehrfach ungesättigte Fettsäure sind in den Fettsäureester bzw. Fettsäuregemische bevor- zugt mindestens 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9 oder 1 % bezogen auf den Gesamtfettsäuregehalt an Arachidonsäure enthalten. Weiterhin enthalten die Fettsäureester bzw. Fettsäuregemische, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurden, vorteilhaft Fettsäuren ausgewählt aus der Gruppe der Fettsäuren Erucasäure (13-Docosaensäure), Sterculinsäure (9,10-Methylene octadec-9-enon- säure), Malvalinsäure (8,9-Methylen Heptadec-8-enonsäure), Chaulmoogrinsäure (Cyclopenten-dodecansäure), Furan-Fettsäure (9,12-Epoxy-octadeca-9,11-dienon- säure), Vernonsäure (9,10-Epoxyoctadec-12-enonsäure), Tarinsäure (6-Octadecynon- säure),6-Nonadecynonsäure, Santalbinsäure (t11-Octadecen-9-ynoic,acid), 6,9-Octa- decenynonsäure, Pyrulinsäure (t10-Heptadecen-8-ynonsäure), Crepenyninsäure (9-Octadecen-12-ynonsäure), 13,14-Dihydrooropheinsäure, Octadecen-13-ene-9,11- diynonsäure, Petroselensäure (cis-6-Octadecenonsäure), 9c,12t-Octadecadiensäure, Calendulasäure (8t10t12c-Octadecatriensäure), Catalpinsäure (9t11t13c-Octadeca- triensäure), Eleosterinsäure (9c11t13t-Octadecatriensäure), Jacarinsäure (8c10t12c- Octadecatriensäure), Punicinsäure (9c11t13c-Octadecatriensäure),Parinarinsäure (9c11t13t15c-Octadecatetraensäure), Pinolensäure (all-cis-5,9,12-Octadecatrien- säure), Laballensäure (5,6-OctadecadienalIensäure), Ricinolsäure (12-HydroxyöIsäure) und/oder Coriolinsäure (13-Hydroxy-9c,11t-Octadecadienonsäure). Vorteilhaft ent- halten die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Fettsäureester bzw. Fettsäuregemische weniger als 0,1 % bezogen auf die Gesamtfettsäuren oder keine Butterbuttersäure, kein Cholesterin, keine Clupanodonsäure (= Docosapentaensäure, C22,5 Δ4,8, 2,i5,2i ) sowie kejne Njsjnsäure (Tetracosahexaensäure, C23:6Δ3 ' 8 ' 12 ' 15 ' 18 ' 21).
Vorteilhaft enthalten die erfindungsgemäßen Öle, Lipide oder Fettsäuren mindestens 0,5 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 % oder 5 %, vorteilhaft mindestens 6 %, 7 %, 8 %, 9 % oder 10 %, besonders vorteilhaft mindestens 11 %, 12 %, 13 %, 14 % oder 15 % ÄRA oder mindestens 0,5 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 % oder 5 %, vorteilhaft mindestens 6 %, oder 7 %, besonders vorteilhaft mindestens 8 %, 9 % oder 10 % EPA und/oder DHA bezogen auf den Gesamtfettsäuregehalt des Produktiohsorganismus vorteilhaft einer Pflanze, besonders vorteilhaft einer Ölfruchtpflanze wie Soja, Raps, Kokosnuss, Ölpalme, Färbersafflor, Flachs, Hanf, Rizinus, Calendula, Erdnuss, Kakaobohne, Sonnenblume oder den oben genannten weiteren ein- oder zweikeimblättrigen Ölfruchtpflanzen.
Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform ist die Verwendung des Öls, Lipids, der Fettsäuren und/oder der Fettsäurezusammensetzung in Futtermitteln, Nahrungsmitteln, Kosmetika oder Pharmazeutika. Die erfindungsgemäßen Öle, Lipide, Fett säuren oder Fettsäuregemische können in der dem Fachmann bekannten Weise zur Abmischung mit anderen Ölen, Lipiden, Fettsäuren oder Fettsäuregemischen tierischen Ursprungs wie z.B. Fischölen verwendet werden. Unter dem Begriff "Öl", "Lipid" oder "Fett" wird ein Fettsäuregemisch verstanden, das ungesättigte, gesättigte, vorzugsweise veresterte Fettsäure(n) enthält. Bevorzugt ist, dass das Öl, Lipid oder Fett einen hohen Anteil an mehrfach ungesättigten freien oder vorteilhaft veresterten Fettsäure(n), insbesondere Linolsäure, γ-Linolensäure, Dihomo- Y-Iinolensäure, Arachidonsäure, α-Linolensäure, Stearidonsäure, Eicosatetraensäure, Eicosapentaensäure, Docosapentaensäure oder Docosahexaensäure hat. Vorzugsweise ist der Anteil an ungesättigten veresterten Fettsäuren ungefähr 30 %, mehr bevorzugt ist ein Anteil von 50 %, noch mehr bevorzugt ist ein Anteil von 60 %, 70 %, 80 % oder mehr. Zur Bestimmung kann z.B. der Anteil an Fettsäure nach Überführung der Fettsäuren in die Methylestern durch Umesterung gaschromatographisch bestimmt werden. Das Öl, Lipid oder Fett kann verschiedene andere gesättigte oder ungesättigte Fettsäuren, z.B. Calendulasäure, Palmitin-, Palmitolein-, Stearin-, Ölsäure etc., enthalten. Insbesondere kann je nach Ausgangsorganismus der Anteil der verschiedenen Fettsäuren in dem Öl oder Fett schwanken.
Bei den im Verfahren hergestellten mehrfach ungesättigte Fettsäuren mit vorteilhaft mindestens zwei Doppelbindungen enthalten, handelt es sich wie oben beschrieben beispielsweise um Sphingolipide, Phosphoglyceride, Lipide, Glycolipide, Phospholipide, Monoacylglycerin, Diacylglycerin, Triacylglycerin oder sonstige Fettsäureester.
Aus den so im erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten mehrfach ungesättigte Fettsäuren mit vorteilhaft mindestens fünf oder sechs Doppelbindungen lassen sich die enthaltenden mehrfach ungesättigten Fettsäuren beispielsweise über eine Alkalibehandlung beispielsweise wäßrige KOH oder NaOH oder saure Hydrolyse vorteilhaft in Gegenwart eines Alkohols wie Methanol oder Ethanol oder über eine enzymatische Abspaltung freisetzen und isolieren über beispielsweise Phasentrennung und anschließender Ansäuerung über z.B. H2SO . Die Freisetzung der Fettsäuren kann auch direkt ohne die vorhergehend beschriebene Aufarbeitung erfolgen. Die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren können nach Einbringung in einem
Organismus vorteilhaft einer Pflanzenzelle bzw. Pflanze entweder auf einem separaten Plasmid liegen oder vorteilhaft in das Genom der Wirtszelle integriert sein. Bei Integration in das Genom kann die Integration zufallsgemäß sein oder durch derartige Rekombination erfolgen, dass das native Gen durch die eingebrachte Kopie ersetzt wird, wodurch die Produktion der gewünschten Verbindung durch die Zelle moduliert wird, oder durch Verwendung eines Gens in trans, so dass das Gen mit einer funktioneilen Expressionseinheit, welche mindestens eine die Expression eines Gens gewährleistende Sequenz und mindestens eine die Polyadenylierung eines funktionell transkribierten Gens gewährleistende Sequenz enthält, funktioneil verbunden ist. Vorteilhaft werden die Nukleinsäuren über Multiexpressionskassetten oder Konstrukte zur multiparallelen Expression in die Organismen vorteilhaft zur multiparallelen samenspezifischen Expression von Genen in die Pflanzen gebracht.
Moose und Algen sind die einzigen bekannten Pflanzensysteme, die erhebliche Mengen an mehrfach ungesättigten Fettsäuren, wie Arachidonsäure (ÄRA) und/oder Eicosapentaensäure (EPA) und/oder Docosahexaensäure (DHA) herstellen. Moose enthalten PUFAs in Membranlipiden während Algen, algenverwandte Organismen und einige Pilze auch nennenswerte Mengen an PUFAs in der Triacylglycerolfraktion akkumulieren. Daher eignen sich Nukleinsäuremoleküle, die aus solchen Stämmen isoliert werden, die PUFAs auch in der Triacylglycerolfraktion akkumulieren, besonders vorteilhaft für das erfindungsgemäße Verfahren und damit zur Modifikation des Lipid- und PUFA-Produktionssystems in einem Wirt, insbesondere Pflanzen, wie Ölfruchtpflanzen, beispielsweise Raps, Canola, Lein, Hanf, Soja, Sonnenblumen, Borretsch. Sie sind deshalb vorteilhaft im erfindungsgemäßen Verfahren verwendbar.
Als Substrate der im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren, die für Polypeptide mit ω-3-Desaturase-Aktivität codieren, und/oder den weiteren verwendeten Nukleinsäuren wie den Nukleinsäuren, die für Polypeptide des Fettsäureoder Lipidstoffwechsels ausgewählt aus der Gruppe Acyl-CoA-Dehydrogenase(n), Acyl-ACP[= acyl carrier protein]-Desaturase(n), Acyl-ACP-Thioesterase(n), Fett- säure-Acyl-Transferase(n), Acyl-CoA:Lysophospholipid-Acyltransferase(n), Fettsäure- Synthase(n), Fettsäure-Hydroxylase(n), Acetyl-Coenzym A-Carboxylase(n), Acyl- Coenzym A-Oxidase(n), Fettsäure-Desaturase(n), Fettsäure-Acetylenase(n), Lipoxy- genase(n), Triacylglycerol-Lipase(n), Allenoxid-Synthase(n), Hydroperoxid-Lyase(n) oder Fettsäure-EIongase(n) codieren eignen sich vorteilhaft C18-, C20- oder C22-Fett- säuren. Bevorzugt werden die im Verfahren als Substrate umgesetzten Fettsäuren in Form ihrer Phospholipid-Ester umgesetzt. Zur Herstellung der erfindungsgemäßen langkettigen PUFAs müssen die mehrfach ungesättigten C18-Fettsäuren zunächst durch die enzymatische Aktivität einer Desaturase zunächst desaturiert und anschließend über eine Elongase um mindestens zwei Kohlenstoffatome verlängert werden. Nach einer Elongationsrunde führt diese Enzym- aktivität zu C20-Fettsäuren, und nach zwei Elongationsrunden zu C22-Fettsäuren. Die Aktivität der erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Desaturasen und Elongasen führt vorzugsweise zu C18-, C20- und/oder C22-Fettsäuren vorteilhaft mit mindestens zwei Doppelbindungen im Fettsäuremolekül, vorzugsweise mit drei, vier, fünf oder sechs Doppelbindungen, besonders bevorzugt zu C20- und/oder C22-Fettsäuren mit mindestens zwei Doppelbindungen im Fettsäuremolekül, vorzugsweise mit drei, vier, fünf oder sechs Doppelbindungen, ganz besonders bevorzugt mit vier, fünf oder sechs Doppelbindungen im Molekül. Nachdem eine erste Desaturierung und die Verlängerung stattgefunden hat, können weitere Desaturierungs- und Elongierungsschritte wie z.B. eine solche Desaturierung in Δ-5- und Δ-4-Position in erfolgen. Besonders bevor- zugt als Produkte des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die Eicosatriensäure, die Eicosapentaensäure, Docosapetaensäure und/oder Docosahesaensäure. Die C20- Fettsäuren mit mindestens zwei Doppelbindungen in der Fettsäure können durch die enzymatische Aktivität der im Verfahren verwendeten Enzyme in Form der freien Fettsäure oder in Form der Ester, wie Phospholipide, Glycolipide, Sphingolipide, Phosphoglyceride, Monoacylglycerin, Diacylglycerin oderTriacylglycerin, verlängert werden.
Der bevorzugte Biosyntheseort von Fettsäuren, Ölen, Lipiden oder Fette in den vorteilhaft verwendeten Pflanzen ist beispielsweise im allgemeinen der Samen oder Zellschichten des Samens, so dass eine samenspezifische Expression der im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren sinnvoll ist. Es ist jedoch naheliegend, dass die Biosynthese von Fettsäuren, Ölen oder Lipiden nicht auf das Samengewebe beschränkt sein muss, sondern auch in allen übrigen Teilen der Pflanze - beispielsweise in Epidermis- zellen oder in den Knollen - gewebespezifisch erfolgen kann.
Werden im erfindungsgemäßen Verfahren als Organismen Mikroorganismen wie Hefen wie Saccharomyces oder Schizosaccharomyces, Pilze wie Mortierella, Aspergillus, Phytophtora, Entomophthora, Mucor oder Thraustochytrium Algen wie Isochrysis, Phaeodactylum oder Crypthecodinium verwendet, so werden diese Organismen vorteilhaft fermentativ angezogen.
Durch die Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, die für eine ω-3- Desaturase codieren, können im Verfahren die hergestellten mehrfach ungesättigten Fettsäuren mindestens um 5 % , bevorzugt mindestens um 10 %, besonders bevorzugt mindestens um 20 %, ganz besonders bevorzugt um mindestens 50 % gegenüber dem Wildtyp der Organismen, die die Nukleinsäuren nicht rekombinant enthalten, erhöht werden. Durch das erfindungsgemäße Verfahren können die hergestellten mehrfach ungesättigten Fettsäuren in den im Verfahren verwendeten Organismen prinzipiell auf zwei Arten erhöht werden. Es kann vorteilhaft der Pool an freien mehrfach ungesättigten Fettsäuren und/oder der Anteil der über das Verfahren hergestellten veresterten mehrfach ungesättigten Fettsäuren erhöht werden. Vorteilhaft wird durch das erfindungsgemäße Verfahren der Pool an veresterten mehrfach ungesättigten Fettsäuren in den transgenen Organismen erhöht.
Werden im erfindungsgemäßen Verfahren als Organismen Mikroorganismen verwendet, so werden sie je nach Wirtsorganismus in dem Fachmann bekannter Weise angezogen bzw. gezüchtet. Mikroorganismen werden in der Regel in einem flüssigen Medium, das eine Kohlenstoffquelle meist in Form von Zuckern, eine Stickstoffquelle meist in Form von organischen Stickstoffquellen wie Hefeextrakt oder Salzen wie Ammoniumsulfat, Spurenelemente wie Eisen-, Mangan-, Magnesiumsalze und gegebenenfalls Vitamine enthält, bei Temperaturen zwischen 0°C und 100°C, bevorzugt zwischen 10°C bis 60°C unter Sauerstoffbegasung angezogen. Dabei kann der pH der Nährflüssigkeit auf einen festen Wert gehalten werden, das heißt während der Anzucht reguliert werden oder aber auch nicht. Die Anzucht kann batch weise, semi batch weise oder kontinuierlich erfolgen. Nährstoffe können zu Beginn der Fermentation vorgelegt oder semikontinuierlich oder kontinuierlich nachgefüttert werden. Die hergestellten mehrfach ungesättigten Fettsäuren können nach dem Fachmann bekannten Verfahren wie oben beschrieben aus den Organismen isoliert werden. Beispielsweise über Extraktion, Destillation, Kristallisation, ggf. Salzfällung und/oder Chromatographie. Die Organismen können dazu vorher noch vorteilhaft aufgeschlossen werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird, wenn es sich bei den Wirtsorganismen um Mikroorganismen handelt, vorteilhaft bei einer Temperatur zwischen 0°C bis 95°C, be- vorzugt zwischen 10°C bis 85°C, besonders bevorzugt zwischen 15°C bis 75°C, ganz besonders bevorzugt zwischen 15°C bis 45°C durchgeführt.
Der pH-Wert wird dabei vorteilhaft zwischen pH 4 und pH 12, bevorzugt zwischen pH 6 und pH 9, besonders bevorzugt zwischen pH 7 und pH 8 gehalten.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann batchweise, semi-batchweise oder kontinuier- lieh betrieben werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozeßtechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) zu finden. Das zu verwendende Kulturmedium hat in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme zu genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods für General Bacteriology" der American Society für Bacteriology (Washington D. O, USA, 1981) enthalten. Diese erfindungsgemäß einsetzbaren Medien umfassen wie oben beschrieben gewöhnlich eine oder mehrere Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Salze, Vitamine und/oder Spurenelemente.
Bevorzugte Kohlenstoffquellen sind Zucker, wie Mono-, Di- oder Polysaccharide. Sehr gute Kohlenstoffquellen sind beispielsweise Glucose, Fructose, Mannose, Galactose, Ribose, Sorbose, Ribulose, Lactose, Maltose, Saccharose, Raffinose, Stärke oder Cellulose. Man kann Zucker auch über komplexe Verbindungen, wie Melassen, oder andere Nebenprodukte der Zucker-Raffinierung zu den Medien geben. Es kann auch vorteilhaft sein, Gemische verschiedener Kohlenstoffquellen zuzugeben. Andere mög- liehe Kohlenstoffquellen sind Öle und Fette wie z.B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erd- nussöl und/oder Kokosfett, Fettsäuren wie z.B. Palmitinsäure, Stearinsäure und/oder Linolsäure, Alkohole und/oder Polyalkohole wie z.B. Glycerin, Methanol und/oder Ethanol und/oder organische Säuren wie z.B. Essigsäure und/oder Milchsäure.
Stickstoffquellen sind gewöhnlich organische oder anorganische Stickstoffver- bindungen oder Materialien, die diese Verbindungen enthalten. Beispielhafte Stickstoffquellen umfassen Ammoniak in flüssiger- oder gasform oder Ammoniumsalze, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat oder Ammoniumnitrat, Nitrate, Harnstoff, Aminosäuren oder komplexe Stickstoffquellen, wie Maisquellwasser, Sojamehl, Sojaprotein, Hefeextrakt, Fleischextrakt und andere. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
Anorganische Salzverbindungen, die in den Medien enthalten sein können, umfassen die Chlorid-, Phosphor- oder Sulfatsalze von Calcium, Magnesium, Natrium, Kobalt, Molybdän, Kalium, Mangan, Zink, Kupfer und Eisen.
Als Schwefelquelle für die Herstellung von schwefelhaltigen Feinchemikalien, ins- besondere von Methionin, können anorganische schwefelhaltige Verbindungen wie beispielsweise Sulfate, Sulfite, Dithionite, Tetrathionate, Thiosulfate, Sulfide aber auch organische Schwefelverbindungen, wie Mercaptane und Thiole, verwendet werden.
Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium haltigen Salze ver- wendet werden.
Chelatbildner können zum Medium gegeben werden, um die Metallionen in Lösung zu halten. Besonders geeignete Chelatbildner umfassen Dihydroxyphenole, wie Catechol oder Protocatechuat, oder organische Säuren, wie Citronensäure.
Die erfindungsgemäß zur Kultivierung von Mikroorganismen eingesetzten Fermen- tationsmedien enthalten üblicherweise auch andere Wachstumsfaktoren, wie Vitamine oder Wachstumsförderer, zu denen beispielsweise Biotin, Riboflavin, Thiamin, Fol- säure, Nikotinsäure, Panthothenat und Pyridoxin gehören. Wachstumsfaktoren und Salze stammen häufig von komplexen Medienkomponenten, wie Hefeextrakt, Melassen, Maisquellwasser und dergleichen. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genaue Zusammensetzung der Medienverbindungen hängt stark vom jeweiligen Experiment ab und wird für jeden spezifischen Fall individuell entschieden. Information über die Medienoptimierung ist erhältlich aus dem Lehrbuch "Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach" (Hrsg. P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) S. 53-73, ISBN 0 19 963577 3). Wachstumsmedien lassen sich auch von kommerziellen Anbietern beziehen, wie Standard 1 (Merck) oder BHI (Brain heart infusion, DIFCO) und dergleichen.
Sämtliche Medienkomponenten werden, entweder durch Hitze (20 min bei 1,5 bar und 121°C) oder durch Sterilfiltration, sterilisiert. Die Komponenten können entweder zu- sammen oder nötigenfalls getrennt sterilisiert werden. Sämtliche Medienkomponenten können zu Beginn der Anzucht zugegen sein oder wahlfrei kontinuierlich oder chargenweise hinzugegeben werden.
Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise zwischen 15°C und 45°C, vorzugsweise bei 25°C bis 40°C und kann während des Experimentes konstant gehalten oder ver- ändert werden. Der pH-Wert des Mediums sollte im Bereich von 5 bis 8,5, vorzugsweise um 7,0 liegen. Der pH-Wert für die Anzucht lässt sich während der Anzucht durch Zugabe von basischen Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder sauren Verbindungen wie Phosphorsäure o- der Schwefelsäure kontrollieren. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Anti- schaummittel wie z.B. Fettsäurepolyglykolester, eingesetzt werden. Zur Aufrecht- erhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe, wie z.B. Antibiotika, hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoff haltige Gasmischungen, wie z.B. Umgebungsluft, in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normaler- weise bei 20°C bis 45°C und vorzugsweise bei 25°C bis 40°C. Die Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum des gewünschten Produktes gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.
Die so erhaltenen, insbesondere mehrfach ungesättigte Fettsäuren enthaltenden, Fermentationsbrühen haben üblicherweise eine Trockenmasse von 7,5 bis 25 Gew.-%. Die Fermentationsbrühe kann anschließend weiterverarbeitet werden. Je nach
Anforderung kann die Biomasse ganz oder teilweise durch Separationsmethoden, wie z. B. Zentrifugation, Filtration, Dekantieren oder einer Kombination dieser Methoden aus der Fermentationsbrühe entfernt oder vollständig in ihr belassen werden. Vorteilhaft wird die Biomasse nach Abtrennung aufgearbeitet. Die Fermentationsbrühe kann aber auch ohne Zellabtrennung mit bekannten Methoden, wie z. B. mit Hilfe eines Rotationsverdampfers, Dünnschichtverdampfers, Fallfilmverdampfers, durch Umkehrosmose, oder durch Nanofiltration, eingedickt beziehungsweise aufkonzentriert werden. Diese aufkonzentrierte Fermentationsbrühe kann schließlich zur Gewinnung der darin enthaltenen Fettsäuren aufgearbeitet werden. Die im Verfahren gewonnenen Fettsäuren eignen sich auch als Ausgangsmaterial für die chemische Synthese von weiteren Wertprodukten. Sie können beispielsweise in Kombination miteinander oder allein zur Herstellung von Pharmaka, Nahrungsmittel, Tierfutter oder Kosmetika verwendet werden. Die im Verfahren verwendeten Nukleinsauresequenzen, die für Proteine mit ω-3- Desaturase-Aktivität codieren, werden vorteilhaft allein oder bevorzugt in Kombination mit weiteren Genen der Fettsäurebiosynthese in einer Expressionskassette (= Nuklein- säurekonstrukt), die die Expression der Nukleinsäuren in einem Organismus vorteilhaft einer Pflanze oder einem Mikroorganismus ermöglicht, eingebracht. Zum Einbringen werden die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren vorteilhaft einer Amplifikation und Ligation in bekannter Weise unterworfen. Vorzugsweise geht man in Anlehnung an das Protokoll der Pfu-DNA-Polymerase oder eines Pfu/Taq-DNA- Polymerasegemisches vor. Die Primer werden in Anlehnung an die zu amplifizierende Sequenz gewählt. Zweckmäßigerweise sollten die Primer so gewählt werden, dass das Amplifikat die gesamte kodogene Sequenz vom Start- bis zum Stop-Kodon umfasst. Im Anschluss an die Amplifikation wird das Amplifikat zweckmäßigerweise analysiert. Beispielsweise kann die Analyse nach gelelektrophoretischer Auftrennung hinsichtlich Qualität und Quantität erfolgen. Im Anschluss kann das Amplifikat nach einem Standardprotokoll gereinigt werden (z.B. Qiagen). Ein Aliquot des gereinigten Amplifikats steht dann für die nachfolgende Klonierung zur Verfügung. Geeignete Klonierungsvek- toren sind dem Fachmann allgemein bekannt. Hierzu gehören insbesondere Vektoren, die in mikrobiellen Systemen replizierbar sind, also vor allem Vektoren, die eine effiziente Klonierung in Hefen oder Pilze gewährleisten, und die stabile Transformation von Pflanzen ermöglichen. Zu nennen sind insbesondere verschiedene für die T-DNA- vermittelte Transformation geeignete, binäre und co-integrierte Vektorsysteme. Derartige Vektorsysteme sind in der Regel dadurch gekennzeichnet, dass sie zumindest die für die Agrobakterium-vermittelte Transformation benötigten vir-Gene sowie die T-DNA begrenzenden Sequenzen (T-DNA-Border) beinhalten. Vorzugsweise umfassen diese Vektorsysteme auch weitere cis-regulatorische Regionen wie Promotoren und Terminatoren und/oder Selektionsmarker, mit denen entsprechend transformierte Organismen identifiziert werden können. Während bei co-integrierten Vektorsystemen vir-Gene und T-DNA-Sequenzen auf demselben Vektor angeordnet sind, basieren binäre Systeme auf wenigstens zwei Vektoren, von denen einer vir-Gene, aber keine T-DNA und ein zweiter T-DNA, jedoch kein vir-Gen trägt. Dadurch sind letztere Vek- toren relativ klein, leicht zu manipulieren und sowohl in E.-coli als auch in Agrobacterium zu replizieren. Zu diesen binären Vektoren gehören Vektoren der Serien pBIB-HYG, pPZP, pBecks, pGreen. Erfindungsgemäß bevorzugt verwendet werden Bin 19, pBI101, pBinAR, pGP und pCAMBIA. Eine Übersicht über binäre Vektoren und ihre Verwendung gibt Hellens et al, Trends in Plant Science (2000) 5, 446-451. Für die Vektorpräparation können die Vektoren zunächst mit Restriktionsendonukle- ase(n) linearisiert und dann in geeigneter Weise enzymatisch modifiziert werden. Im Anschluss wird der Vektor gereinigt und ein Aliquot für die Klonierung eingesetzt. Bei der Klonierung wird das enzymatisch geschnittenen und erforderlichenfalls gereinigten Amplifikat mit ähnlich präparierten Vektorfragmenten mit Einsatz von Ligase kloniert. Dabei kann ein bestimmtes Nukleinsäurekonstrukt bzw. Vektor- oder Plasmidkonstrukt einen oder auch mehrere kodogene Genabschnitte aufweisen. Vorzugsweise sind die kodogenen Genabschnitte in diesen Konstrukten mit regulatorischen Sequenzen funktional verknüpft. Zu den regulatorischen Sequenzen gehören insbesondere pflanzliche Sequenzen wie die oben beschriebenen Promotoren und Terminatoren. Die Konstrukte lassen sich vorteilhafterweise in Mikroorganismen, insbesondere Escherichia coli und Agrobacterium tumefaciens, unter selektiven Bedingungen stabil propagieren und ermöglichen einen Transfer von heterologer DNA in Pflanzen oder Mikroorganis- men.
Unter der vorteilhaften Verwendung von Klonierungsvektoren können die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren, die erfinderischen Nukleinsäuren und Nukleinsaurekonstrukte in Organismen wie Mikroorganismen oder vorteilhaft Pflanzen eingebracht werden und damit bei der Pflanzentransformation verwendet werden, wie denjenigen, die veröffentlicht sind in und dort zitiert sind: Plant Molecular Biology and Biotechno- logy (CRC Press, Boca Raton, Florida), Kapitel 6/7, S. 71-119 (1993); F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsgb.: Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, 15-38; B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Bd. 1 , Engineering and Utili- zation, Hrsgb.: Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128-143; Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205-225)). Die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren, die erfinderischen Nukleinsäuren und Nukleinsaurekonstrukte und/oder Vektoren lassen sich damit zur gentechnologischen Veränderung eines breiten Spektrums an Organismen vorteilhaft an Pflanzen verwenden, so dass diese bessere und/oder effizientere Produzenten von PUFAs werden.
Es gibt eine Reihe von Mechanismen, durch die eine Veränderung des erfindungsgemäßen ω-3-Desaturase-Proteins sowie der weiteren im Verfahren verwendeten Proteine wie die Δ-9-Elongase-, Δ-6-Desaturase-, Δ-8-Desaturase-, Δ-6-Elongase-, Δ-5-Desaturase-, Δ-5-Elongase- oder Δ-4-Desaturase-Proteine möglich ist, so dass die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion der vorteilhaft mehrfach ungesättigten Fettsäuren in einer Pflanze bevorzugt in einer Ölfruchtpflanze oder einem Mikroorganismus aufgrund dieses veränderten Proteins direkt beeinflusst werden kann. Die Anzahl oder Aktivität der Δ-9-Elongase-, Δ-6-Desaturase-, Δ-8-Desaturase-, Δ-6- Elongase-, Δ-5-Desaturase-, Δ-5-Elongase-, Δ-4-Desaturase- oder ω-3-Desaturase- Proteine oder -Gene kann erhöht werden, so dass größere Mengen der Genprodukte und damit letztlich größere Mengen der Verbindungen der allgemeinen Formel I hergestellt werden. Auch eine de novo Synthese in einem Organismus, dem die Aktivität und Fähigkeit zur Biosynthese der Verbindungen vor dem Einbringen des/der entsprechenden Gens/Gene fehlte, ist möglich. Entsprechendes gilt für die Kombination mit weiteren Desaturasen oder Elongasen oder weiteren Enzymen aus dem Fettsäure- und Lipidstoffwechsel. Auch die Verwendung verschiedener divergenter, d.h. auf DNA- Sequenzebene unterschiedlicher Sequenzen kann dabei vorteilhaft sein bzw. die Verwendung von Promotoren zur Genexpression, die eine andere zeitliche Genexpression z.B. abhängig vom Reifegrad eines Samens oder Öl-speichemden Gewebes ermöglicht.
Durch das Einbringen eines Δ-9-Elongase-, Δ-6-Desaturase-, Δ-8-Desaturase-, Δ-6-Elongase-, Δ-5-Desaturase-, Δ-5-Elongase-, Δ-4-Desaturase- und/oder ω-3- Desaturase-Genes in einen Organismus allein oder in Kombination mit anderen Genen in eine Zelle kann nicht nur den Biosynthesefiuss zum Endprodukt erhöht, sondern auch die entsprechende Triacylglycerin-Zusammensetzung erhöht oder de novo geschaffen werden. Ebenso kann die Anzahl oder Aktivität anderer Gene, die am Import von Nährstoffen, die zur Biosynthese einer oder mehrerer Fettsäuren, Ölen, polaren und/oder neutralen Lipiden nötig sind, erhöht sein, so dass die Konzentration dieser Vorläufer, Cofaktoren oder Zwischenverbindungen innerhalb der Zellen oder innerhalb des Speicherkompartiments erhöht ist, wodurch die Fähigkeit der Zellen zur Produktion von PUFAs, wie im folgenden beschrieben, weiter gesteigert wird. Durch Optimierung der Aktivität oder Erhöhung der Anzahl einer oder mehrerer Δ-9-Elongase-, Δ-6-Desa- turase-, Δ-8-Desaturase-, Δ-6-Elongase-, Δ-5-Desaturase-, Δ-5-Elongase-, Δ-4-Desa- turase- oder ω-3-Desaturase-Gene, die an der Biosynthese dieser Verbindungen beteiligt sind, oder durch Zerstören der Aktivität einer oder mehrerer Gene, die am Abbau dieser Verbindungen beteiligt sind, kann es möglich sein, die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion von Fettsäure- und Lipidmolekülen aus Organismen und vorteilhaft aus Pflanzen zu steigern.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten isolierten Nukleinsäuremoleküle codieren für Proteine oder Teile von diesen, wobei die Proteine oder das einzelne Protein oder Teile davon eine Aminosäuresequenz enthält, die ausreichend homolog zu einer Aminosäuresequenz ist, die in den Sequenzen SEQ ID NO: 2 dargestellt ist, so dass die Proteine oder Teile davon noch eine ω-3-Desaturase-Desaturase-Aktivität aufweisen. Vorzugsweise haben die Proteine oder Teile davon, die von dem Nuklein- säuremolekül/den Nukleinsäuremolekülen kodiert wird/werden, noch seine wesentliche enzymatische Aktivität und die Fähigkeit, am Stoffwechsel von zum Aufbau von Zellmembranen oder Lipidkörperchen in Organismen vorteilhaft in Pflanzen notwendigen Verbindungen oder am Transport von Molekülen über diese Membranen teilzunehmen. Vorteilhaft sind die von den Nukleinsäuremolekülen kodierten Proteine zu mindestens etwa 60 %, vorzugsweise mindestens etwa 70 % und stärker bevorzugt mindestens etwa 80 % oder 90 % und am stärksten bevorzugt mindestens etwa 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % oder mehr identisch zu der in SEQ ID NO: 2 dargestellten Aminosäurese- quenz. Im Sinne der Erfindung ist unter Homologie oder homolog, Identität oder identisch zu verstehen.
Die Homologie wurde über den gesamten Aminosäure- bzw. Nukleinsäuresequenz- bereich berechnet. Für das Vergleichen verschiedener Sequenzen stehen dem Fachmann eine Reihe von Programmen, die auf verschiedenen Algorithmen beruhen zur Verfügung. Dabei liefern die Algorithmen von Needleman und Wunsch oder Smith und Waterman besonders zuverlässige Ergebnisse. Für die Sequenzvergleiche wurde das Programm PileUp verwendet (J. Mol. Evolution., 25, 351-360, 1987, Higgins et al., CABIOS, 5 1989: 151-153) oder die Programme Gap und BestFit [Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48; 443-453 (1970) und Smith and Waterman (Adv. Appl. Math. 2; 482-489 (1981)], die im GCG Software-Packet [Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711 (1991)] enthalten sind. Die oben in Prozent angegebenen Sequenzhomologiewerte wurden mit dem Programm GAP über den gesamten Sequenzbereich mit folgenden Einstellungen ermittelt: Gap Weight: 50, Length Weight: 3, Average Match: 10.000 und Average Mismatch: 0.000. Diese Einstellungen wurden, falls nicht anders angegeben, immer als Standardeinstellungen für Sequenzvergleiche verwendet. Unter wesentlicher enzymatischer Aktivität der im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten ω-3-Desaturase ist zu verstehen, dass sie gegenüber den durch die Sequenz mit SEQ ID NO: 1und deren Derivate codierten Proteinen/Enzymen im Vergleich noch mindestens eine enzymatische Aktivität von mindestens 10 %, bevorzugt 20 %, besonders bevorzugt 30 % und ganz besonders 40 % aufweisen und damit am Stoffwechsel von zum Aufbau von Fettsäuren, Fettsäureester wie Diacylglyceride und/oder Triacylglyceride in einem Organismus vorteilhaft einer Pflanze oder Pflanzenzelle notwendigen Verbindungen oder am Transport von Molekülen über Membranen teilnehmen können, wobei C18-, C o- oder C22-Kohlenstoffketten im Fettsäuremolekül mit Doppelbindungen an mindestens zwei, vorteilhaft drei, vier, fünf oder sechs Stellen gemeint sind.
Vorteilhaft im Verfahren verwendbare Nukleinsäuren stammen aus Bakterien, Pilzen, Diatomeen, Tieren wie Caenorhabditis oder Pflanzen wie Algen oder Moosen wie den Gattungen Shewanella, Physcomitrella, Thraustochytrium, Fusarium, Phytophthora, Ceratodon, Isochrysis, Aleurita, Muscarioides, Mortierella, Phaeodactylum, Crypthe- codinium, speziell aus den Gattungen und Arten Thallasiosira pseudonona, Euglena gracilis, Physcomitrella patens, Phytophtora infestans, Fusarium graminaeum, Crypto- codinium cohnii, Ceratodon purpureus, Isochrysis galbana, Aleurita farinosa, Thraustochytrium sp., Muscarioides viallii, Mortierella alpina, Phaeodactylum tricornutum oder Caenorhabditis elegans oder besonders vorteilhaft Phytophtora infestans, Thallasiosira pseudonona oder Cryptocodinium cohnii.
Alternativ können im erfindungsgemäßen Verfahren Nukleotidsequenzen verwendet werden, die für ω-3-Desaturase codieren und die an eine Nukleotidsequenz, wie in SEQ ID NO: 1 dargestellt, vorteilhaft unter stringenten Bedingungen hybridisieren.
Die im Verfahren verwendeten Nukleinsauresequenzen werden vorteilhaft in einer Expressionskassette, die die Expression der Nukleinsäuren in Organismen wie Mikroorganismen oder Pflanzen ermöglicht, eingebracht.
Dabei werden die Nukleinsauresequenzen, die für die ω-3-Desaturase codieren, mit einem oder mehreren Regulationssignalen vorteilhafterweise zur Erhöhung der Genexpression funktionell verknüpft. Diese regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der Gene und der Proteinexpression ermöglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, dass das Gen erst nach Induktion exprimiert und/oder überexprimiert wird, oder dass es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird. Beispielsweise handelt es sich bei diesen regulatorischen Sequenzen um Sequenzen an die Induktoren oder Repressoren binden und so die Expression der Nukleinsäure regulieren. Zusätzlich zu diesen neuen Regulationssequenzen oder anstelle dieser Sequenzen kann die natürliche Regulation dieser Sequenzen vor den eigentlichen Strukturgenen noch vorhanden sein und gegebenenfalls genetisch verändert worden sein, so dass die natürliche Regulation ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht wurde. Die Expressionskassette (= Expressionskonstrukt = Genkonstrukt) kann aber auch einfacher aufgebaut sein, das heißt es wurden keine zusätzlichen Regulationssignale vor die Nukleinsauresequenz oder dessen Derivate inseriert und der natürliche Promotor mit seiner Regulation wurde nicht entfernt. Stattdessen wurde die natüriiche Regulationssequenz so mutiert, dass keine Regulation mehr erfolgt und/oder die Genexpression gesteigert wird. Diese veränderten Promotoren können in Form von Teilsequenzen (= Promotor mit Teilen der erfindungsgemäßen Nukleinsauresequenzen) auch allein vor das natürliche Gen zur Steigerung der Aktivität gebracht werden. Das Genkonstrukt kann außerdem vorteilhafterweise auch eine oder mehrere sogenannte "enhancer Sequenzen" funktioneil verknüpft mit dem Promotor enthalten, die eine erhöhte Expression der Nukleinsauresequenz ermöglichen. Auch am 3'-Ende der DNA-Sequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen inseriert werden wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren. Die ω-3- Desaturase-Gene können in einer oder mehreren Kopien in der Expressionskassette (= Genkonstrukt) enthalten sein. Gleiches gilt für die weiteren Gene der Fettsäurebiosynthese, die in Kombination mit der erfindungsgemäßen ω-3-Desaturase verwendet werden. Vorteilhaft liegt nur jeweils eine Kopie der Gene in der Expressionskassette vor. Dieses Genkonstrukt oder die Genkohstrukte können zusammen im Wirtsorganismus exprimiert werden. Dabei kann das Genkonstrukt oder die Genkonstrukte in einem oder mehreren Vektoren inseriert sein und frei in der Zelle vorliegen oder aber im Genom inseriert sein. Es ist vorteilhaft für die Insertion weiterer Gene im Wirtsgenom, wenn die zu exprimierenden Gene zusammen in einem Genkonstrukt vorliegen. Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei wie oben beschrieben vorzugsweise die Genexpression der eingeführten Gene positiv beeinflussen und dadurch erhöhen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Ver- Stärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung sind ein oder mehrere Genkonstrukte, die eine oder mehrere Sequenzen enthalten, die durch SEQ ID NO: 1 oder dessen Derivate definiert sind und für Polypeptide gemäß SEQ ID NO: 2 kodieren. Die genannten ω-3-Desaturase-Proteine führen dabei vorteilhaft zu einer Desaturierung von ω-6-Fett- säuren, wobei das Substrat vorteilhaft zwei, drei, vier oder fünf Doppelbindungen aufweist und vorteilhaft 18, 20 oder 22 Kohlenstoffatome im Fettsäuremolekül aufweist. Gleiches gilt für ihre Homologen, Derivate oder Analoga, die funktionsfähig mit einem oder mehreren Regulationssignalen, vorteilhafterweise zur Steigerung der Genexpression, verbunden sind.
Vorteilhafte Regulationssequenzen für das neue Verfahren liegen beispielsweise in Promotoren vor, wie dem cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, Ipp-, lac-, Ipp-lac-, laclq-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, λ-PR- oder λ-PL-Promotor und werden vorteilhafterweise in Gram-negativen Bakterien angewendet. Weitere vorteilhafte Regulationssequenzen liegen beispielsweise in den Gram-positiven Promotoren amy und SPO2, in den Hefe- oder Pilzpromotoren ADC1, MFα, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH oder in den Pflanzenpromotoren CaMV/35S [Franck et al., Cell 21 (1980) 285-294], PRP1 [Ward et al. Plant. Mol. Bioi. 22 (1993)], SSU, OCS, Iib4, usp, STLS1, B33, nos oder im Ubiquitin- oder Phaseolin-Promotor vor. In diesem Zusammenhang vorteilhaft sind ebenfalls induzierbare Promotoren, wie die in EP-A-0 388 186 (Benzyl- sulfonamid-induzierbar), Plant J. 2, 1992:397-404 (Gatz et al, Tetracyclin-induzierbar), EP-A-0 335 528 (Abzisinsäure-induzierbar) oder WO 93/21334 (Ethanol- oder Cyclo- hexenol-induzierbar) beschriebenen Promotoren. Weitere geeignete Pflanzenpromotoren sind der Promotor von cytosolischer FBPase oder der ST-LSI-Promotor der Kartoffel (Stockhaus et al., EMBO J. 8, 1989, 2445), der Phosphoribosylpyrophos- phatamidotransferase-Promotor aus Glycine max (Genbank-Zugangsnr. U87999) oder der in EP-A-0249 676 beschriebene nodienspezifische Promotor. Besonders vorteil- hafte Promotoren sind Promotoren, welche die Expression in Geweben ermöglichen, die an der Fettsäurebiosynthese beteiligt sind. Ganz besonders vorteilhaft sind samenspezifische Promotoren, wie der ausführungsgemäße USP Promotor aber auch andere Promotoren wie der LeB4-, DC3, Phaseolin- oder Napin-Promotor. Weitere besonders vorteilhafte Promotoren sind samenspezifische Promotoren, die für monokotyle oder dikotyle Pflanzen verwendet werden können und in US 5,608, 152 (Napin-Promotor aus Raps), WO 98/45461 (Oleosin-Promotor aus Arabidopsis), US 5,504,200 (Phaseolin- Promotor aus Phaseolus vulgaris), WO 91/13980 (Bce4-Promotor aus Brassica), von Baeumlein et al. Plant J, 2, 2, 1992:233-239 (LeB4-Promotor aus einer Leguminose) beschrieben sind, wobei sich diese Promotoren für Dikotyledonen eignen. Die folgen- den Promotoren eignen sich beispielsweise für Monokotyledonen lpt-2- oder lpt-1- Promotor aus Gerste (WO 95/15389 und WO 95/23230), Hordein-Promotor aus Gerste und andere, in WO 99/16890 beschriebene geeignete Promotoren.
Es ist im Prinzip möglich, alle natürlichen Promotoren mit ihren Regulationssequenzen, wie die oben genannten, für das neue Verfahren zu verwenden. Es ist ebenfalls mög- lieh und vorteilhaft, zusätzlich oder alleine synthetische Promotoren zu verwenden, besonders wenn sie eine Samen-spezifische Expression vermitteln, wie z.B. beschrieben in WO 99/16890.
Um einen besonders hohen Gehalt an PUFAs vor allem in transgenen Pflanzen zu erzielen, sollten die ω-3-Desaturase- und/oder PUFA-Biosynthesegene vorteilhaft samenspezifisch in Ölsaaten exprimiert werden. Hierzu können Samen-spezifische Promotoren verwendet werden, bzw. solche Promotoren die im Embryo und/oder im Endosperm aktiv sind. Samen-spezifische Promotoren können prinzipiell sowohl aus dikotolydonen als auch aus monokotolydonen Pflanzen isoliert werden. Im folgenden sind vorteilhafte bevorzugte Promotoren aufgeführt: USP (= unknown seed protein) und Vicilin (Vicia faba) [Bäumlein et al, Mol. Gen Genet, 1991 , 225(3)], Napin (Raps) [US 5,608,152], Acyl-Carrier Protein (Raps) [US 5,315,001 und WO 92/18634], Oleosin (Arabidopsis thaliana) [WO 98/45461 und WO 93/20216], Phaseolin (Phaseolus vulgaris) [US 5,504,200], Bce4 [WO 91/13980], Leguminosen B4 (LegB4-Promotor) [Bäumlein et al. Plant J, 2,2, 1992], Lpt2 und lpt1 (Gerste) [WO 95/15389 und WO95/23230], Samen-spezifische Promotoren aus Reis, Mais u. Weizen [WO 99/16890], Amy32b, Amy 6-6 und Aleurain [US 5,677,474], Bce4 (Raps) [US 5,530,149], Glycinin (Soja) [EP 571 741], Phosphoenol-Pyruvatcarboxylase (Soja) [JP 06/62870], ADR12-2 (Soja) [WO 98/08962], Isocitratlyase (Raps) [US 5,689,040] oder α-Amylase (Gerste) [EP 781 849].
Die Pflanzengenexpression lässt sich auch über einen chemisch induzierbaren Promotor erleichtern (siehe eine Übersicht in Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol, 48:89-108). Chemisch induzierbare Promotoren eignen sich besonders, wenn gewünscht wird, dass die Genexpression auf zeitspezifische Weise erfolgt. Beispiele für solche Promotoren sind ein Salicylsäure-induzierbarer Promotor (WO 95/19443), ein Tetracyclin-induzierbarer Promotor (Gatz et al. (1992) Plant J. 2, 397-404) und ein EthanoMnduzierbarer Promotor. Um eine stabile Integration der Biosynthesegene in die transgene Pflanze über mehrere Generation sicherzustellen, sollte jede der im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren, die für die ω-3-Desaturase- oder weitere Gene der Fettsäurebiosynthese wie Δ-9-Elongase, Δ-6-Desaturase, Δ-8-Desaturase, Δ-6-Elongase, Δ-5-Desaturase, Δ-5- Elongase und/oder Δ-4-Desaturase codieren, unter der Kontrolle eines eigenen bevor- zugt eines unterschiedlichen Promotors exprimiert werden, da sich wiederholende Sequenzmotive zu Instabilität der T-DNA bzw. zu Rekombinationsereignissen führen können. Die Expressionskassette ist dabei vorteilhaft so aufgebaut, dass einem Promotor eine geeignete Schnittstelle zur Insertion der zu expremierenden Nuklein- säure folgt vorteilhaft in einem Polylinker anschließend gegebenenfalls ein Terminator hinter dem Polylinker liegt. Diese Abfolge wiederholt sich mehrfach bevorzugt drei-, vier- oder fünfmal, so dass bis zu fünf Gene in einem Konstrukt zusammengeführt werden und so zur Expression in die transgene Pflanze eingebracht werden können. Vorteilhaft wiederholt sich die Abfolge bis zu dreimal. Die Nukleinsauresequenzen werden zur Expression über die geeignete Schnittstelle beispielsweise im Polylinker hinter den Promotor inseriert. Vorteilhaft hat jede Nukleinsauresequenz ihren eigenen Promotor und gegebenenfalls ihren eigenen Terminator. Derartige vorteilhafte Konstrukte werden beispielsweise in DE 10102337 oder DE 101Ö2338 offenbart (siehe beispielsweise in den angehängten Sequenzprotokollen). Es ist aber auch möglich mehrere Nukleinsauresequenzen hinter einem Promotor und ggf. vor einem Terminator zu inserieren. Dabei ist die Insertionsstelle bzw. die Abfolge der inserierten Nukleinsäuren in der Expressionskassette nicht von entscheidender Bedeutung, das heißt eine Nukleinsauresequenz kann an erster oder letzter Stelle in der Kassette inseriert sein, ohne dass dadurch die Expression wesentlich beeinflusst wird. Es können in der Expressionskassette vorteilhaft unterschiedliche Promotoren wie beispielsweise der USP-, LegB4 oder DC3-Promotor und unterschiedliche Terminatoren verwendet werden. Es ist aber auch möglich nur einen Promotortyp in der Kassette zu verwenden. Dies kann jedoch zu unerwünschten Rekombinationsereignissen führen. Wie oben beschrieben sollte die Transkription der eingebrachten Gene vorteilhaft durch geeignete Terminatoren am 3'-Ende der eingebrachten Biosynthesegene (hinter dem Stoppcodon) abgebrochen werden. Verwendet werden kann hier z.B. der OCS1 Terminator. Wie auch für die Promotoren, so sollten hier für jedes Gen unterschiedliche Terminatorsequenzen verwendet werden. Das Genkonstrukt kann, wie oben beschrieben, auch weitere Gene umfassen, die in die Organismen eingebracht werden sollen. Es ist möglich und vorteilhaft, in die Wirtsorganismen Regulationsgene, wie Gene für Induktoren, Repressoren oder Enzyme, welche durch ihre Enzymaktivität in die Regulation eines oder mehrerer Gene eines Biosynthesewegs eingreifen, einzubringen und darin zu exprimieren. Diese Gene können heterologen oder homologen Ursprungs sein. Weiterhin können vorteilhaft im Nukleinsäurekonstrukt bzw. Genkonstrukt weitere Biosynthesegene des Fettsäureoder Lipidstoffwechsels enthalten sein oder aber diese Gene können auf einem weiteren oder mehreren weiteren Nukleinsäurekonstrukten liegen. Vorteilhaft werden als Biosynthesegene des Fettsäure- oder Lipidstoffwechsels ein Gen ausgewählt aus der Gruppe Acyl-CoA-Dehydrogenase(n), Acyl-ACP[= acyl carrier protein]- Desaturase(n), Acyl-ACP-Thioesterase(n), Fettsäure-Acyl-Transferase(n), Acyl- CoA:Lysophospholipid-Acyltransferase(n), Fettsäure-Synthase(n), Fettsäure- Hydroxylase(n), Acetyl-Coenzym A-Carboxylase(n), Acyl-Coenzym A-Oxidase(n), Fettsäure-Desaturase(n), Fettsäure-Acetylenase(n), Lipoxygenase(n), Triacylglycerol- Lipase(n), Allenoxid-Synthase(n), Hydroperoxid-Lyase(n) oder Fettsäure-Elongase(n) oder deren Kombinationen verwendet. Besonders vorteilhafte Nukleinsauresequenzen sind Biosynthesegene des Fettsäure- oder Lipidstoffwechsels ausgewählt aus der Gruppe der Acyl-CoA:Lysophospholipid-Acyltransferase, Δ-4-Desaturase-, Δ-5-Desa- turase-, Δ-6-Desaturase-, Δ-8-Desatuase-, Δ-9-Desaturase-, Δ-12-Desaturase-, Δ-5- Elongase-, Δ-6-Elongase- und/oder Δ-9-Elongase.
Dabei können die vorgenannten Nukleinsäuren bzw. Gene in Kombination mit anderen Elongasen und Desaturasen in Expressionskassetten, wie den vorgenannten, kloniert werden und zur Transformation von Pflanzen Mithilfe von Agrobakterium eingesetzt werden. Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei wie oben beschrieben vorzugsweise die Genexpression der eingeführten Gene positiv beeinflussen und dadurch erhöhen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Ver- Stärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA ver- bessert wird. Die Expressionskassetten können prinzipiell direkt zum Einbringen in die Pflanze verwendet werden oder aber in einen Vektoren eingebracht werden.
Diese vorteilhaften Vektoren, vorzugsweise Expressionsvektoren, enthalten die im Verfahren verwendeten erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, die für ω-3-Desaturasen codieren, sowie ggf. weitere im Verfahren verwendete Nukleinsäuren, die für Δ-9-Elon- gasen, Δ-6-Desaturasen, Δ-8-Desaturasen, Δ-6-Elongasen, Δ-5-Desaturasen, Δ-5- Elongasen oder Δ-4-Desafurasen codieren, oder ein Nukleinsäurekonstrukt, die die verwendeten Nukleinsäure allein oder in Kombination mit weiteren Biosynthesegenen des Fettsäure- oder Lipidstoffwechsels wie den Acyl-CoA:Lysophospholipid-Acyltrans- ferasen, Δ-4-Desaturasen, Δ-5-Desaturasen, Δ-6-Desaturasen, Δ-8-Desatuasen, Δ-9- Desaturasen, Δ-12-Desaturasen, ω3-Desaturasen, Δ-5-Elongasen, Δ-6-Elongasen und/oder Δ-9-Elongasen. Wie hier verwendet, betrifft der Begriff "Vektor" ein Nuklein- säuremolekül, das eine andere Nukleinsäure transportieren kann, an welche es gebunden ist. Ein Vektortyp ist ein "Plasmid", was für eine zirkuläre doppelsträngige DNA- Schleife steht, in die zusätzlichen DNA-Segmente ligiert werden können. Ein weiterer Vektortyp ist ein viraler Vektor, wobei zusätzliche DNA-Segmente in das virale Genom ligiert werden können. Bestimmte Vektoren können in einer Wirtszelle, in die sie eingebracht worden sind, autonom replizieren (z.B. Bakterienvektoren mit bakteriellem Replikationsursprung). Andere Vektoren werden vorteilhaft beim Einbringen in die Wirtszelle in das Genom einer Wirtszelle integriert und dadurch zusammen mit dem Wirtsgenom repliziert. Zudem können bestimmte Vektoren die Expression von Genen, mit denen sie funktionsfähig verbunden sind, steuern. Diese Vektoren werden hier als "Expressionsvektoren" bezeichnet. Gewöhnlich haben Expressionsvektoren, die für DNA-Rekombinationstechniken geeignet sind, die Form von Plasmiden. In der vorlie- genden Beschreibung können "Plasmid" und "Vektor" austauschbar verwendet werden, da das Plasmid die am häufigsten verwendete Vektorform ist. Die Erfindung soll jedoch diese anderen Expressionsvektorformen, wie virale Vektoren, die ähnliche Funktionen ausüben, umfassen. Ferner soll der Begriff Vektor auch andere Vektoren, die dem Fachmann bekannt sind, wie Phagen, Viren, wie SV40, CMV, TMV, Transposons, IS-Elemente, Phasmide, Phagemide, Cosmide, lineare oder zirkuläre DNA, umfassen.
Die im Verfahren vorteilhaft verwendeten rekombinanten Expressionsvektoren umfassen die oben beschriebenen Nukleinsäurensequenzen und/oder das oben beschriebene Genkonstrukt in einer Form, die sich zur Expression der verwendeten Nukleinsäuren in einer Wirtszelle eignet, was bedeutet, dass die rekombinanten Expressi- onsvektoren eine oder mehrere Regulationssequenzen, ausgewählt auf der Basis der zur Expression zu verwendenden Wirtszellen, die mit der zu exprimierenden Nukleinsauresequenz funktionsfähig verbunden ist, umfasst. In einem rekombinanten Expressionsvektor bedeutet "funktionsfähig verbunden", dass die Nukleotidsequenz von Interesse derart an die Regulationssequenz(en) gebunden ist, dass die Expression der Nukleotidsequenz möglich ist und sie aneinander gebunden sind, so dass beide Sequenzen die vorhergesagte, der Sequenz zugeschriebene Funktion erfüllen (z.B. in einem ln-vitro-Transkriptions-/TransIationssystem oder in einer Wirtszelle, wenn der Vektor in die Wirtszelle eingebracht wird). Der Begriff "Regulationssequenz" soll Promotoren, Enhancer und andere Expressionskontrollelemente (z.B. Polyadeny- iierungssignale) umfassen. Diese Regulationssequenzen sind z.B. beschrieben in Goeddel: Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990), oder siehe: Gruber und Crosby, in: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnolgy, CRC Press, Boca Raton, Florida, Hrsgb.: Glick und Thompson, Kapitel 7, 89-108, einschließlich der Literaturstellen darin. Regulationssequenzen umfassen solche, welche die konstitutive Expression einer Nukleotidsequenz in vielen Wirtszelltypen steuern, und solche, welche die direkte Expression der Nukleotidsequenz nur in bestimmten Wirtszellen, unter bestimmten Bedingungen steuern. Der Fachmann weiß, dass die Gestaltung des Expressionsvektors von Faktoren, wie der Auswahl der zu transformierenden Wirtszelle, dem Ausmaß der Expression des gewünschten Proteins usw., abhängen kann.
Die verwendeten rekombinanten Expressionsvektoren können zur Expression von ω-3-Desaturasen, Δ-9-Elongasen, Δ-6-Desaturasen, Δ-8-Desaturasen, Δ-6-Elongasen, Δ-5-Desaturasen, Δ-5-Elongasen und/oder Δ-4-Desaturasen in prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen gestaltet sein. Dies ist vorteilhaft, da häufig Zwischenschritte der Vektorkonstruktion der Einfachheithalber in Mikroorganismen durchgeführt werden. Beispielsweise können die ω-3-Desaturase-, Δ-9-Elongase-, Δ-6-Desaturase-, Δ-8- Desaturase-, Δ-6-Elongase-, Δ-5-Desaturase-, Δ-5-Elongase- und/oder Δ-4-Desa- turase-Gene in bakteriellen Zellen, Insektenzellen (unter Verwendung von Baculovirus- Expressiqnsvektoren), Hefe- und anderen Pilzzellen (siehe Romanos, M.A, et al. (1992) "Foreign gene expression in yeast: a review", Yeast 8:423-488; van den Hondel, C.A.M.J.J, et al. (1991) "Heterologous gene expression in filamentous fungi", in: More Gene Manipulations in Fungi, J.W. Bennet & L.L. Lasure, Hrsgb, S. 396-428: Aca- demic Press: San Diego; und van den Hondel, CAM.J.J, & Punt, P.J. (1991) "Gene transfer Systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J.F, et al, Hrsgb, S. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge), Algen (Falciatore et al, 1999, Marine Biotechnology.1, 3:239-251), Ciliaten der Typen: Holotrichia, Peritrichia, Spirotrichia, Suctoria, Tetrahymena, Para- meeium, Colpidium, Glaucoma, Platyophrya, Potomacus, Desaturaseudocohnilembus, Euplotes, Engelmanieila und Stylonychia, insbesondere der Gattung Stylonychia lemnae, mit Vektoren nach einem Transformationsverfahren, wie beschrieben in WO 98/01572, sowie bevorzugt in Zellen vielzelliger Pflanzen (siehe Schmidt, R. und Willmitzer, L. (1988) "High efficiency Agrobacterium tumefaciens-mediated trans- formation of Arabidopsis thaliana leaf and cotyledon explants" Plant Cell Rep.:583-586; Plant Molecular Biology and Biotechnology, C Press, Boca Raton, Florida, Kapitel 6/7, S.71-119 (1993); F.F. White, B. Jenes et al, Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsgb.: Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128-43; Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205-225 (und darin zitierte Literaturstellen)) exprimiert werden. Geeignete Wirtszellen werden ferner erörtert in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Der rekombinante Expressionsvektor kann alternativ, zum Beispiel unter Verwendung von T7-Promotor-Regu- lationssequenzen und T7-Polymerase, in vitro transkribiert und translatiert werden. Die Expression von Proteinen in Prokaryoten erfolgt meist mit Vektoren, die konstitu- tive oder induzierbare Promotoren enthalten, welche die Expression von Fusions- oder nicht-Fusionsproteinen steuern. Typische Fusions-Expressionsvektoren sind u.a. pGEX (Pharmacia Biotech Ine; Smith, D.B, und Johnson, K.S. (1988) Gene 67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) und pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ), bei denen Glutathion-S-Transferase (GST), Maltose E-bindendes Protein bzw. Protein A an das rekombinante Zielprotein fusioniert wird.
Beispiele für geeignete induzierbare nicht-Fusions-E. coli-Expressionsvektoren sind u.a. pTrc (Amann et al. (1988) Gene 69:301-315) und pET 11d (Studier et al, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Kalifornien (1990) 60-89). Die Zielgenexpression vom pTrc-Vektor beruht auf der Transkription durch Wirts-RNA-Polymerase von einem Hybrid-trp-lac-Fusionspromotor. Die Zielgenexpression aus dem pET 11d-Vektor beruht auf der Transkription von einem T7-gn10-lac-Fusions-Promotor, die von einer coexprimierten viralen RNA- Polymerase (T7 gn1) vermittelt wird. Diese virale Polymerase wird von den Wirtsstämmen BL21 (DE3) oder HMS174 (DE3) von einem residenten λ-Prophagen bereitgestellt, der ein T7 gn1-Gen unter der Transkriptionskontrolle des lacUV 5-Promotors birgt.
Andere in prokaryotischen Organismen geeignete Vektoren sind dem Fachmann be- kannt, diese Vektoren sind beispielsweise in E. coli pLG338, pACYC184, die pBR- Reihe, wie pBR322, die pUC-Reihe, wie pUC18 oder pUC19, die M113mp-Reihe, pKC30, pRep4, pHS1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, plN-IIH 13-B1, λgt11 or pBdCI, in Streptomyces plJ101, plJ364, plJ702 oder plJ361, in Bacillus pUB110, pC194 oder pBD214, in Corynebacterium pSA77 oder pAJ667. Bei einer weiteren Ausführungsform ist der Expressionsvektor ein Hefe-Expressionsvektor. Beispiele für Vektoren zur Expression in der Hefe S. cerevisiae umfassen pYe- Desaturased (Baldari et al. (1987) Embo J. 6:229-234), pMFa (Kurjan und Herskowitz (1982) Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al. (1987) Gene 54:113-123) sowie pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Vektoren und Verfahren zur Kon- struktion von Vektoren, die sich zur Verwendung in anderen Pilzen, wie den filamen- tösen Pilzen, eignen, umfassen diejenigen, die eingehend beschrieben sind in: van den Hondel, C.A.M.J.J, & Punt, P.J. (1991) "Gene transfer Systems and vector develop- ment for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of fungi, J.F. Peberdy et al, Hrsgb, S. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge, oder in: More Gene Mani- pulations in Fungi [J.W. Bennet & L.L. Lasure, Hrsgb, S. 396-428: Academic Press: San Diego]. Weitere geeignete Hefevektoren sind beispielsweise pAG-1, YEp6, YEp13 oder pEMBLYe23.
Alternativ können die ω-3-Desaturasen, Δ-9-Elongasen, Δ-6-Desaturasen, Δ-8-Desa- turasen, Δ-6-Elongasen, Δ-5-Desaturasen, Δ-5-Elongasen und/oder Δ-4-Desaturasen in Insektenzellen unter Verwendung von Baculovirus-Expressionsvektoren exprimiert werden. Baculovirus-Vektoren, die zur Expression von Proteinen in gezüchteten Insektenzellen (z.B. Sf9-Zellen) verfügbar sind, umfassen die pAc-Reihe (Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol.. 3:2156-2165) und die pVL-Reihe (Lucklow und Summers (1989) Virology 170:31-39).
Die oben genannten Vektoren bieten nur einen kleinen Überblick über mögliche geeig- nete Vektoren. Weitere Plasmide sind dem Fachmann bekannt und sind zum Beispiel beschrieben in: Cloning Vectors (Hrsgb. Pouwels, P.H, et al, Elsevier, Amsterdam- New York-Oxford, 1985, ISBN 0444 904018). Weitere geeignete Expressionssysteme für prokaryotische und eukaryotische Zellen siehe in den Kapiteln 16 und 17 von Sambrook, J, Fritsch, E.F., und Maniatis, T, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
Bei einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens können die ω-3-Desaturasen, Δ-9-Elongasen, Δ-6-Desaturasen, Δ-8-Desaturasen, Δ-6-Elongasen, Δ-5-Desatu rasen, Δ-5-Elongasen und/oder Δ-4-Desaturasen in einzelligen Pflanzenzellen (wie Algen), siehe Falciatore et al, 1999, Marine Biotechnology 1 (3):239-251 und darin zitierte
Literaturangaben, und Pflanzenzellen aus höheren Pflanzen (z.B. Spermatophyten, wie Feldfrüchten) exprimiert werden. Beispiele für Pflanzen-Expressionsvektoren umfassen solche, die eingehend beschrieben sind in: Becker, D, Kemper, E, Schell, J, und Masterson, R. (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proxi- mal to the left border", Plant Mol. Biol. 20:1195-1197; und Bevan, M.W. (1984) "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation", Nucl. Acids Res. 12:8711-8721 ; Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsgb.: Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15-38.
Eine Pflanzen-Expressionskassette enthält vorzugsweise Regulationssequenzen, welche die Genexpression in Pflanzenzellen steuern können und funktionsfähig verbunden sind, so dass jede Sequenz ihre Funktion, wie Termination der Transkription, erfüllen kann, beispielsweise Polyadenylierungssignale. Bevorzugte Polyadeny- lierungssignale sind diejenigen, die aus Agrobacterium tumefaciens-T-DNA stammen, wie das als Octopinsynthase bekannte Gen 3 des Ti-Plasmids pTiACH5 (Gielen et al, EMBO J. 3 (1984) 835ff.) oder funktionelle Äquivalente davon, aber auch alle anderen in Pflanzen funktionell aktiven Terminatoren sind geeignet.
Da die Pflanzengenexpression sehr oft nicht auf Transkriptionsebenen beschränkt ist, enthält eine Pflanzen-Expressionskassette vorzugsweise andere funktionsfähig verbunden Sequenzen, wie Translationsenhancer, beispielsweise die Overdrive- Sequenz, welche die 5'-untranslatierte Leader-Sequenz aus Tabakmosaikvirus, die das Protein/RNA-Verhältnis erhöht, enthält (Gallie et al, 1987, Nucl. Acids Research 15:8693-8711).
Die Pflanzengenexpression muss wie oben beschrieben funktionsfähig mit einem geeigneten Promotor verbunden sein, der die Genexpression auf rechtzeitige, zell- oder gewebespezifische Weise durchführt. Nutzbare Promotoren sind konstitutive Promotoren (Benfey et al, EMBO J. 8 (1989) 2195-2202), wie diejenigen, die von Pflanzenviren stammen, wie 35S CAMV (Franck et al, Cell 21 (1980) 285-294), 19S CaMV (siehe auch US 5352605 und WO 84/02913) oder Pflanzenpromotoren, wie der in US 4,962,028 beschriebene der kleinen Untereinheit der Rubisco.
Andere bevorzugte Sequenzen für die Verwendung zur funktionsfähigen Verbindung in Pflanzengenexpressions-Kassetten sind Targeting-Sequenzen, die zur Steuerung des Genproduktes in sein entsprechendes Zellkompartiment notwendig sind (siehe eine Übersicht in Kermode, Crit. Rev. Plant Sei. 15, 4 (1996) 285-423 und darin zitierte Literaturstellen), beispielsweise in die Vakuole, den Zellkern, alle Arten von Piastiden, wie Amyloplasten, Chloroplasten, Chromoplasten, den extrazellulären Raum, die Mito- chondrien, das Endoplasmatische Retikulum, Olkörper, Peroxisomen und andere Kom- partimente von Pflanzenzellen.
Die Pflanzengenexpression lässt sich auch wie oben beschrieben über einen chemisch induzierbaren Promotor erleichtern (siehe eine Übersicht in Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol, 48:89-108). Chemisch induzierbare Promotoren eignen sich besonders, wenn gewünscht wird, dass die Genexpression auf zeitspezifische Weise erfolgt. Beispiele für solche Promotoren sind ein Salicylsäure-induzierbarer Promotor (WO 95/19443), ein Tetracyclin-induzierbarer Promotor (Gatz et al. (1992) Plant J. 2, 397-404) und ein Ethanol-induzierbarer Promotor.
Auch Promotoren, die auf biotische oder abiotische Stressbedingungen reagieren, sind geeignete Promotoren, beispielsweise der pathogeninduzierte PRP1 -Gen-Promotor (Ward et al. Plant. Mol. Biol. 22 (1993) 361-366), der hitzeinduzierbare hspδO- Promotor aus Tomate (US 5,187,267), der kälteinduzierbare Alphaamylase-Promotor aus Kartoffel (WO 96/12814) oder der durch Wunden induzierbare pinll-Promotor (EP-A-0375091). Es sind insbesondere solche Promotoren bevorzugt, welche die Genexpression in Geweben und Organen herbeiführen, in denen die Fettsäure-, Lipid- und Ölbio- synthese stattfindet, in Samenzellen, wie den Zellen des Endosperms und des sich entwickelnden Embryos. Geeignete Promotoren sind der Napingen-Promotor aus Raps (US 5,608,152), der USP-Promotor aus Vicia faba (Baeumlein et al, Mol Gen Genet, 1991 , 225 (3):459-67), der Oleosin-Promotor aus Arabidopsis (WO 98/45461), der Phaseolin-Promotor aus Phaseolus vulgaris (US 5,504,200), der Bce4-Promotor aus Brassica (WO 91/13980) oder der Legumin-B4-Promotor (LeB4; Baeumlein et al, 1992, Plant Journal, 2 (2):233-9) sowie Promotoren, welche die samenspezifische Expression in Monokotyledonen-Pflanzen, wie Mais, Gerste, Weizen, Roggen, Reis usw. herbeiführen. Geeignete beachtenswerte Promotoren sind der lpt2- oder Ipt1-
Gen-Promotor aus Gerste (WO 95/15389 und WO 95/23230) oder die in WO 99/16890 beschriebenen (Promotoren aus dem Gersten-Hordein-Gen, dem Reis-Glutelin-Gen, dem Reis-Oryzin-Gen, dem Reis-Prolamin-Gen, dem Weizen-Gliadin-Gen, Weizen- Glutelin-Gen, dem Mais-Zein-Gen, dem Hafer-Glutelin-Gen, dem Sorghum-Kasirin- Gen, dem Roggen-Secalin-Gen). Insbesondere kann die multiparallele Expression der im Verfahren verwendeten ω-3- Desaturasen, Δ-9-Elongasen, Δ-6-Desaturasen, Δ-8-Desaturasen, Δ-6-Elongasen, Δ-5-Desaturasen, Δ-5-Elongasen und/oder Δ-4-Desaturasen gewünscht sein. Die Einführung solcher Expressionskassetten kann über eine simultane Transformation mehrerer einzelner Expressionskonstrukte erfolgen oder bevorzugt durch Kombination mehrerer Expressionskassetten auf einem Konstrukt. Auch können mehrere Vektoren mit jeweils mehreren Expressionskassetten transformiert und auf die Wirtszelle übertragen werden.
Ebenfalls besonders geeignet sind Promotoren, welche die plastidenspezifische Expression herbeiführen, da Piastiden das Kompartiment sind, in dem die Vorläufer sowie einige Endprodukte der Lipidbiosynthese synthetisiert werden. Geeignete Promotoren, wie der virale RNA-Polymerase-Promotor, sind beschrieben in WO 95/16783 und WO 97/06250, und der clpP-Promotor aus Arabidopsis, beschrieben in WO 99/46394. Vektor-DNA lässt sich in prokaryotische oder eukaryotische Zellen über herkömmliche Transformations- oder Transfektionstechniken einbringen. Die Begriffe "Transformation" und "Transfektion", Konjugation und Transduktion, wie hier verwendet, sollen eine Vielzahl von im Stand der Technik bekannten Verfahren zum Einbringen fremder Nukleinsäure (z.B. DNA) in eine Wirtszelle, einschließlich Calciumphosphat- oder Calciumchlorid-Copräzipitation, DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion, Lipq- fektion, natürliche Kompetenz, chemisch vermittelter Transfer, Elektroporation oder Teilchenbeschuss, umfassen. Geeignete Verfahren zur Transformation oder Transfektion von Wirtszellen, einschließlich Pflanzenzellen, lassen sich finden in Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Labora- tory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NΫ, 1989) und anderen Labor-Handbüchern, wie Methods in Molecular Biology, 1995, Bd. 44, Agrobacterium protocols, Hrsgb: Gartland und Davey, Humana Press, Totowa, New Jersey.
Wirtszellen, die im Prinzip zum Aufnehmen der erfindungsgemäßen Nukleinsäure, des erfindungsgemäßen Genproduktes oder des erfindungsgemäßen Vektors geeignet sind, sind alle prokaryotischen oder eukaryotischen Organismen. Die vorteilhafterweise verwendeten Wirtsorganismen sind Mikroorganismen, wie Pilze oder Hefen oder Pflanzenzellen vorzugsweise Pflanzen oder Teile davon. Pilze, Hefen oder Pflanzen werden vorzugsweise verwendet, besonders bevorzugt Pflanzen, ganz besonders bevorzugt Pflanzen, wie Ölfruchtpflanzen, die große Mengen an Lipidverbindungen enthalten, wie Raps, Nachtkerze, Hanf, Diestel, Erdnuss, Canola, Lein, Soja, Safflor, Sonnenblume, Borretsch, oder Pflanzen, wie Mais, Weizen, Roggen, Hafer, Triticale, Reis, Gerste, Baumwolle, Maniok, Pfeffer, Tagetes, Solanaceen-Pflanzen, wie Kartoffel, Tabak, Aubergine und Tomate, Vicia-Arten, Erbse, Alfalfa, Buschpflanzen (Kaffee, Kakao, Tee), Salix-Arten, Bäume (Ölplame, Kokosnuss) sowie ausdauernde Gräser und Futterfeldfrüchte. Besonders bevorzugte erfindungsgemäße Pflanzen sind Ölfruchtpflanzen, wie Soja, Erdnuss, Raps, Canola, Lein, Hanf, Nachtkerze, Sonnenblume, Safflor, Bäume (Ölpalme, Kokosnuss). Ein weiterer erfindungsgemäßer Gegenstand sind wie oben beschrieben isolierte Nukleinsauresequenz, die für Polypeptide mit ω-3-Desaturase-Aktivität codieren, wobei die durch die Nukleinsauresequenzen codierten ω-3-Desaturasen C18-, C20- und C^- Fettsäuren mit zwei, drei, vier oder fünf Doppelbindungen und vorteilhaft mehrfach ungesättigte Cι8-Fettsäuren mit zwei oder drei Doppelbindungen und mehrfach ungesättigte C20-Fettsäuren mit zwei, drei oder vier Doppelbindungen umsetzt. Auch C22- Fettsäuren mit vier oder fünf Doppelbindungen werden desaturiert.
Der Begriff "Nukleinsäure(molekül)", wie hier verwendet, umfasst in einer vorteilhaften Ausführungsform zudem die am 3'- und am 5'-Ende des kodierenden Genbereichs gelegene untranslatierte Sequenz: mindestens 500, bevorzugt 200, besonders bevorzugt 100 Nukleotide der Sequenz stromaufwärts des 5'-Endes des kodierenden Bereichs und mindestens 100, bevorzugt 50, besonders bevorzugt 20 Nukleotide der Sequenz stromabwärts des 3'-Endes des kodierenden Genbereichs. Ein "isoliertes" Nukleinsäuremolekül wird von anderen Nukleinsäuremolekülen abgetrennt, die in der natürlichen Quelle der Nukleinsäure vorliegen. Eine "isolierte" Nukleinsäure hat vorzugsweise keine Sequenzen, welche die Nukleinsäure in der genomischen DNA des Organismus, aus dem die Nukleinsäure stammt, natürlicherweise flankieren (z.B. Sequenzen, die sich an den 5'- und 3'-Enden der Nukleinsäure befinden). Bei verschiedenen Ausführungsformen kann das isolierte ω-3-Desaturasemolekül zum Bei- spiel weniger als etwa 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb oder 0,1 kb an Nukleotid- sequenzen enthalten, die natürlicherweise das Nukleinsäuremolekül in der genomischen DNA der Zelle, aus der die Nukleinsäure stammt flankieren.
Die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuremoleküle, z.B. ein Nukleinsäuremolekül mit einer Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 1 oder eines Teils davon, kann unter Verwendung molekularbiologischer Standardtechniken und der hier bereitgestellten Sequenzinformation isoliert werden. Auch kann Mithilfe von Vergleichsalgorithmen beispielsweise eine homologe Sequenz oder homologe, konservierte Sequenzbereiche auf DNA oder Aminosäureebene identifiziert werden. Diese können als Hybridi- sierungssonde sowie Standard-Hybridisierungstechniken (wie z.B. beschrieben in Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) zur Isolierung weiterer im Verfahren nützlicher Nukleinsauresequenzen verwendet werden. Überdies lässt sich ein Nukleinsäuremolekül, umfassend eine vollständige Sequenz der SEQ ID NO: 1 oder einen Teil davon, durch Polymerasekettenreaktion isolieren, wobei Oligonukleotidprimer, die auf der Basis dieser Sequenz oder von Teilen davon, verwendet werden (z.B. kann ein Nukleinsäuremolekül, umfassend die vollständigen Sequenz oder einen Teil davon, durch Polymerasekettenreaktion unter Verwendung von Oligonukleotidprimem isoliert werden, die auf der Basis dieser gleichen Sequenz erstellt worden sind). Zum Beispiel lässt sich mRNA aus Zellen isolieren (z.B. durch das Guanidiniumthiocyanat-Extraktionsverfahren von Chirgwin et al. (1979) Bio- chemistry 18:5294-5299) und cDNA mittels Reverser Transkriptase (z.B. Moloney- MLV-Reverse-Transkriptase, erhältlich von Gibco/BRL, Bethesda, MD, oder AMV- Reverse-Transkriptase, erhältlich von Seikagaku America, Inc., St.Petersburg, FL) herstellen. Synthetische Oligonukleotidprimer zur Amplifizierung mittels Polymerasekettenreaktion lassen sich auf der Basis der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Sequenz oder Mithilfe der in SEQ ID NO: 2 dargestellten Aminosäuresequenz erstellen. Eine erfindungsgemäße Nukleinsäure kann unter Verwendung von cDNA oder alternativ von genomischer DNA als Matrize und geeigneten Oligonukleotidprimern gemäß Standard- PCR-Amplifikationstechniken amplifiziert werden. Die so amplifizierte Nukleinsäure kann in einen geeigneten Vektor Moniert werden und mittels DNA-Sequenzanalyse charakterisiert werden. Oligonukleotide, die einer Desaturase-Nukleotidsequenz entsprechen, können durch Standard-Syntheseverfahren, beispielsweise mit einem auto- matischen DNA-Synthesegerät, hergestellt werden.
Homologe der verwendeten ω-3-Desaturase-Nukleinsäuresequenz mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 bedeuten beispielsweise allelische Varianten mit mindestens etwa 60 %, vorzugsweise mindestens 70 %, stärker bevorzugt mindestens 80 %, 90 % oder 95 % und noch stärker bevorzugt mindestens etwa 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % oder mehr Identität bzw. Homologie zu einer in SEQ ID NO: 1 gezeigten Nukleotidsequenz oder ihren Homologen, Derivaten oder Analoga oder Teilen davon. Weiterhin sind Homologe isolierte Nukleinsäuremoleküle mit einer Nukleotidsequenz, die an die in SEQ ID NO: 1 gezeigten Nukleotidsequenz oder einen Teil davon hybridisieren, z.B. unter stringenten Bedingungen hybridisiert. Allelische Varianten umfassen ins- besondere funktionelle Varianten, die sich durch Deletion, Insertion oder Substitution von Nukleotiden aus/in der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz erhalten lassen, wobei aber die Absicht ist, dass die Enzymaktivität der davon herrührenden synthetisierten Proteine für die Insertion eines oder mehrerer Gene vorteilhafterweise beibehalten wird. Proteine, die noch die enzymatische Aktivität der ω-3-Desaturase besitzen, das heißt deren Aktivität im wesentlichen nicht reduziert ist, bedeuten Proteine mit mindestens 10 %, vorzugsweise 20 %, besonders bevorzugt 30 %, ganz besonders bevorzugt 40 % der ursprünglichen Enzymaktivität, verglichen mit dem durch SEQ ID NO: 1 kodierten Protein. Die Homologie wurde über den gesamten Aminosäure- bzw. Nukleinsäuresequenzbereich berechnet. Für das Vergleichen verschiedener Sequen- zen stehen dem Fachmann eine Reihe von Programmen, die auf verschiedenen Algorithmen beruhen zur Verfügung. Dabei liefern die Algorithmen von Needleman und Wunsch oder Smith und Waterman besonders zuverlässige Ergebnisse. Für die Sequenzvergleiche wurde das Programm PileUp verwendet (J. Mol. Evolution, 25, 351-360, 1987, Higgins et al, CABIOS, 5 1989: 151-153) oder die Programme Gap und BestFit [Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48; 443-453 (1970) und Smith and Waterman (Adv. Appl. Math. 2; 482-489 (1981)], die im GCG Software-Packet [Gene- tics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711 (1991)] enthalten sind. Die oben in Prozent angegebenen Sequenzhomologiewerte wurden mit dem Programm GAP über den gesamten Sequenzbereich mit folgenden Einstellungen ermittelt: Gap Weight: 50, Length Weight: .3, Average Match: 10.000 und Average Mismatch: 0.000. Die falls nicht anders angegeben als Standardeinstellungen immer für Sequenzvergleiche verwendet wurden. Homologe der SEQ ID NO: 1 bedeuten beispielsweise auch bakterielle, Pilz- und Pflanzenhomologe, verkürzte Sequenzen, einzelsträngige DNA oder RNA der kodierenden und nicht-kodierenden DNA-Sequenz. Homologe der SEQ ID NO: 1 bedeuten auch Derivate, wie beispielsweise Promotor- Varianten. Die Promotoren stromaufwärts der angegebenen Nukleotidsequenzen können durch einen oder mehrere Nukleotidaustausche, durch lnsertion(en) und/oder Deletion(en) modifiziert werden, ohne dass jedoch die Funktionalität oder Aktivität der Promotoren gestört wird. Es ist weiterhin möglich, dass die Aktivität der Promotoren durch Modifikation ihrer Sequenz erhöht ist oder dass sie vollständig durch aktivere Promotoren, sogar aus heterologen Organismen, ersetzt werden. Die vorgenannten Nukleinsäuren und Proteinmoleküle mit ω-3-Desaturase-Aktivität, die am Stoffwechsel von Lipiden und Fettsäuren, PUFA-Cofaktoren und Enzymen o- der am Transport lipophiler Verbindungen über Membranen beteiligt sind, werden im erfindungsgemäßen Verfahren zur Modulation der Produktion von PUFAs in trans- genen Organismen vorteilhaft in Pflanzen, wie Mais, Weizen, Roggen, Hafer, Triticale, Reis, Gerste, Sojabohne, Erdnuss, Baumwolle, Linum Arten wie Öl- oder Faserlein, Brassica-Arten, wie Raps, Canola und Rübsen, Pfeffer, Sonnenblume, Borretsch, Nachtkerze und Tagetes, Solanacaen-Pflanzen, wie Kartoffel, Tabak, Aubergine und Tomate, Vicia-Arten, Erbse, Maniok, Alfalfa, Buschpflanzen (Kaffee, Kakao, Tee), Salix-Arten, Bäume (Ölpalme, Kokosnuss) und ausdauernden Gräsern und Futterfeld- , fruchten, entweder direkt (z.B. wenn die Überexpression oder Optimierung eines Fettsäurebiosynthese-Proteins einen direkten Einfluss auf die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion der Fettsäure aus modifizierten Organismen hat) verwendet und/oder können eine indirekt Auswirkung haben, die dennoch zu einer Steigerung der Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion der PUFAs oder einer Abnahme unerwünschter Verbindungen führt (z.B. wenn die Modulation des Stoffwechsels von Lipiden und Fettsäuren, Cofaktoren und Enzymen zu Veränderungen der Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion oder der Zusammensetzung der gewünschten Verbindungen innerhalb der Zellen führt, was wiederum die Produktion einer oder mehrerer Fettsäuren beeinflussen kann). Die Kombination verschiedener Vorläufermoleküle und Biosyntheseenzyme führt zur Herstellung verschiedener Fettsäuremoleküle, was eine entscheidende Auswirkung auf die Zusammensetzung der Lipide hat. Da mehrfach ungesättigte Fettsäuren (= PUFAs) nicht nur einfach in Triacylglycerin sondern auch in Membranlipide eingebaut werden. Besonders zur Herstellung von PUFAs, beispielsweise Stearidonsäure , Eicosapentaensäure und Docosahexaensäure eignen sich Boraginaceen, Primulaceen, oder Linaceen. Besonders vorteilhaft eignet sich Lein (Linum usitatissimum) zur Herstellung von PUFAS mit dem erfindungsgemäßen Nukleinsauresequenzen vorteilhaft, wie beschrieben, in Kombination mit weiteren Desaturasen und Elongasen. Die Lipidsynthese lässt sich in zwei Abschnitte unterteilen: die Synthese von Fettsäuren und ihre Bindung an sn-Glycerin-3-Phosphat sowie die Addition oder Modi- fikation einer polaren Kopfgruppe. Übliche Lipide, die in Membranen verwendet werden, umfassen Phospholipide, Glycolipide, Sphingolipide und Phosphoglyceride. Die Fettsäuresynthese beginnt mit der Umwandlung von Acetyl-CoA in Malonyl-CoA durch die Acetyl-CoA-Carboxylase oder in Acetyl-ACP durch die Acetyltransacylase. Nach einer Kondensationsreaktion bilden diese beiden Produktmoleküle zusammen Acetoacetyl-ACP, das über eine Reihe von Kondensations-, Reduktions- und Dehydra- tisierungsreaktionen umgewandelt wird, so dass ein gesättigtes Fettsäuremolekül mit der gewünschten Kettenlänge erhalten wird. Die Produktion der ungesättigten Fettsäuren aus diesen Molekülen wird durch spezifische Desaturasen katalysiert, und zwar entweder aerob mittels molekularem Sauerstoff oder anaerob (bezüglich der Fettsäuresynthese in Mikroorganismen siehe F.C. Neidhardt et al. (1996) E. coli und Salmonella. ASM Press: Washington, D.C, S. 612-636 und darin enthaltene Literaturstellen; Lengeier et al. (Hrsgb.) (1999) Biology of Procaryotes. Thieme: Stuttgart, New York, und die enthaltene Literaturstellen, sowie Magnuson, K, et al. (1993) Microbiological Reviews 57:522-542 und die enthaltenen Literaturstellen). Die so hergestellten an Phospholipide gebundenen Fettsäuren müssen anschließend wieder für die weitere Elongationen aus den Phospholipiden in den FettsäureCoA-Ester-Pool überführt werden. Dies ermöglichen Acyl-CoA:Lysophospholipid-Acyltransferasen. Weiterhin können diese Enzyme die elongierten Fettsäuren wieder von den CoA- Estern auf die Phospholipide übertragen. Diese Reaktion'sabfolge kann gegebenenfalls mehrfach durchlaufen werden.
Vorläufer für die PUFÄ-Biosynthese sind beispielsweise Ölsäure, Linol- und Linolensäure. Diese Cι8-Kohlenstoff-Fettsäuren müssen auf C20 und C22 verlängert werden, damit Fettsäuren vom Eicosa- und Docosa-Kettentyp erhalten werden. Mithilfe der im Verfahren verwendeten ω-3-Desaturase kann Arachidonsäure zu Eicosapentaensäure und Docosapentaensäure zu Docosahexaensäure umgesetzt werden und anschließend für verschiedene Zwecke bei Nahrungsmittel-, Futter-, Kosmetik- oder pharmazeutischen Anwendungen verwendet werden. Mit den genannten Enzymen können C18-, C20- und/oder C22-Fettsäuren mit mindestens zwei vorteilhaft mindestens drei, vier, fünf oder sechs Doppelbindungen im Fettsäuremolekül, vorzugsweise C20- oder C22-Fettsäuren mit vorteilhaft vier, fünf oder sechs Doppelbindungen im Fettsäuremolekül hergestellt werden. Die Desaturierung kann vor oder nach Elongation der entsprechenden Fettsäure erfolgen. Daher führen die Produkte der Desaturaseaktivitäten und der möglichen weiteren Desaturierung und Elongation zu bevorzugten PUFAs mit höherem Desaturierungsgrad, einschließlich einer weiteren Elongation von C20 zu C22- Fettsäuren. Substrate der verwendeten Desaturase im erfindungsgemäßen Verfahren sind C18-, C20- oder C22-Fettsäuren wie zum Beispiel Linolsäure, γ-Linolensäure, Dihomo-γ-linolensäure, Arachidonsäure, Docosatetraensäure oder Docosapentaensäure. Bevorzugte Substrate sind Arachidonsäure, Docosatetraensäure oder Docosa- pentaensäure. Die synthetisierten C20- oder C22-Fettsäuren mit mindestens zwei Doppelbindungen in der Fettsäure fallen im erfindungsgemäßen Verfahren in Form der freien Fettsäure oder in Form ihrer Ester beispielsweise in Form ihrer Glyceride an. Unter dem Begriff "Glycerid" wird ein mit ein, zwei oder drei Carbonsäureresten verestertes Glycerin verstanden (Mono-, Di- oder Triglycerid). Unter "Glycerid" wird auch ein Gemisch an verschiedenen Glyceriden verstanden. Das Glycerid oder das Gylceridgemisch kann weitere Zusätze, z.B. freie Fettsäuren, Antioxidantien, Proteine, Kohlenhydrate, Vitamine und/oder andere Substanzen enthalten.
Unter einem "Glycerid" im Sinne des erfindungsgemäßen Verfahrens werden ferner vom Glycerin abgeleitete Derivate verstanden. Dazu zählen neben den oben beschriebenen Fettsäureglyceriden auch Glycerophospholipide und Glyceroglycolipide. Bevorzugt seien hier die Glycerophospholipide wie Lecithin (Phosphatidylcholin), Cardiolipin, Phosphatidylglycerin, Phosphatidylserin und Alkylacylglycerophospholipide beispielhaft genannt.
Ferner müssen Fettsäuren anschließend an verschiedene Modifikationsorte transportiert und in das Triacylglycerin-Speicherlipid eingebaut werden. Ein weiterer wichtiger Schritt bei der Lipidsynthese ist der Transfer von Fettsäuren auf die polaren Kopf- gruppen, beispielsweise durch Glycerin-Fettsäure-Acyltransferase (siehe Frentzen, 1998, Lipid, 100(4-5): 161 -166).
Veröffentlichungen über die Pflanzen-Fettsäurebiosynthese, Desaturierung, den Lipidstoffwechsel und Membrantransport von fetthaltigen Verbindungen, die Beta- oxidation, Fettsäuremodifikation und Cofaktoren, Triacylglycerin-Speicherung und -Assemblierung einschließlich der Literaturstellen darin siehe in den folgenden Artikeln; Kinney, 1997, Genetic Engeneering, Hrsgb.: JK Setlow, 19:149-166; Ohlrogge und Browse, 1995, Plant Cell 7:957-970; Shanklin und Cahoon, 1998, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 49:611-641; Voelker, 1996, Genetic Engeneering, Hrsgb.: JK Setlow, 18:111-13; Gerhardt, 1992, Prog. Lipid R. 31 :397-417; Gühnemann-Schäfer & Kindl, 1995, Biochim. Biophys Acta 1256:181-186; Kunau et al, 1995, Prog. Lipid Res. 34:267-342; Stymne et al, 1993, in: Biochemistry and Molecular Biology of Membrane and Storage Lipids of Plants, Hrsgb.: Murata und Somerville, Rockville, American Society of Plant Physiologists, 150-158, Murphy & Ross 1998, Plant Journal. 13(1): 1-16. Die im Verfahren hergestellten PUFAs, umfassen eine Gruppe von Molekülen, die höhere Tiere nicht mehr synthetisieren können und somit aufnehmen müssen oder die höhere Tiere nicht mehr ausreichend selbst herstellen können und somit zusätzlich aufnehmen müssen, obwohl sie leicht von anderen Organismen, wie Bakterien, synthetisiert werden, beispielsweise können Katzen Arachidonsäure nicht mehr syn- thetisieren.
Unter Phospholipiden, die vorteilhaft von der erfindungsgemäßen ω-3-Desaturase umgesetzt werden, im Sinne der Erfindung sind zu verstehen Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylserin, Phosphatidylglycerin und/oder Phosphatidylinositol vorteilhafterweise Phosphatidylcholin. Die Begriffe Produktion oder Pro- duktivität sind im Fachgebiet bekannt und beinhalten die Konzentration des Fermentationsproduktes (Verbindungen der Formel I), das in einer bestimmten Zeitspanne und einem bestimmten Fermentationsvolumen gebildet wird (z.B. kg Produkt pro Stunde pro Liter). Der Begriff Effizienz der Produktion umfasst die Zeit, die zur Erzielung einer bestimmten Produktionsmenge nötig ist (z.B. wie lange die Zelle zur Aufrichtung einer bestimmten Durchsatzrate einer Feinchemikalie benötigt). Der Begriff Ausbeute oder Produkt/Kohlenstoff-Ausbeute ist im Fachgebiet bekannt und umfasst die Effizienz der Umwandlung der Kohlenstoffquelle in das Produkt (d.h. die Feinchemikalie). Dies wird gewöhnlich beispielsweise ausgedrückt als kg Produkt pro kg Kohlenstoffquelle. Durch Erhöhen der Ausbeute oder Produktion der Verbindung wird die Menge der gewonnenen Moleküle oder der geeigneten gewonnenen Moleküle dieser Verbindung in einer bestimmten Kulturmenge über einen festgelegten Zeitraum erhöht. Die Begriffe Biosynthese oder Biosyntheseweg sind im Fachgebiet bekannt und umfassen die Synthese einer Verbindung, vorzugsweise einer organischen Verbindung, durch eine Zelle aus Zwischenverbindungen, beispielsweise in einem Mehrschritt- und stark regulierten Pro- zess. Die Begriffe Abbau oder Abbauweg sind im Fachgebiet bekannt und umfassen die Spaltung einer Verbindung, vorzugsweise einer organischen Verbindung, durch eine Zelle in Abbauprodukte (allgemeiner gesagt, kleinere oder weniger komplexe -. Moleküle) beispielsweise in einem Mehrschritt- und stark regulierten Prozess. Der Begriff Stoffwechsel ist im Fachgebiet bekannt und umfasst die Gesamtheit der biochemischen Reaktionen, die in einem Organismus stattfinden. Der Stoffwechsel einer bestimmten Verbindung (z.B. der Stoffwechsel einer Fettsäure) umfasst dann die Gesamtheit der Biosynthese-, Modifikations- und Abbauwege dieser Verbindung in der Zelle, die diese Verbindung betreffen.
Zusätzlich zu den in SEQ ID NO: 1 gezeigten ω-3-Desaturasen erkennt der Fachmann, dass DNA-Sequenzpolymorphismen, die zu Änderungen in den Aminosäuresequenzen der ω-3-Desaturase führen, innerhalb einer Population existieren können. Diese genetischen Polymorphismen im ω-3-Desaturase-Gen können zwischen Individuen innerhalb einer Population aufgrund von natürlicher Variation existieren. Diese natürlichen Varianten bewirken üblicherweise eine Varianz von 1 bis 5 % in der Nukleotidsequenz des ω-3-Desaturase-Gens. Sämtliche und alle dieser Nukleotidvariationen und daraus resultierende Aminosäurepolymorphismen in der ω-3-Desaturase, die das Ergebnis natürlicher Variation sind und die funktionelle Aktivität von nicht verändern, sollen im Umfang der Erfindung enthalten sein.
Für das erfindungsgemäße Verfahren vorteilhafte Nukleinsäuremoleküle können auf der Grundlage ihrer Homologie zu den hier offenbarten ω-3-Desaturase-Nuklein- säuren unter Verwendung der Sequenzen oder eines Teils davon als Hybridisierungs- sonde gemäß Standard-Hybridisierungstechniken unter stringenten Hybridisierungs- bedingungen isoliert werden. Dabei können beispielsweise isolierte Nukleinsäuremoleküle verwendet werden, die mindestens 15 Nukleotide lang sind und unter stringenten Bedingungen mit dem Nukleinsäuremolekülen, die eine Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 1 umfassen, hybridisieren. Es können auch Nukleinsäuren mindestens 25, 50, 100, 250 oder mehr Nukleotide verwendet werden. Der Begriff "hybridisiert unter stringenten Bedingungen", wie hier verwendet, soll Hybridisierungs- und Waschbedingungen beschreiben, unter denen Nukleotidsequenzen, die mindestens 60 % homolog zueinander sind, gewöhnlich aneinander hybridisiert bleiben. Die Bedingungen sind vorzugsweise derart, dass Sequenzen, die mindestens etwa 65 %, stärker bevorzugt mindestens etwa 70 % und noch stärker bevorzugt mindestens etwa 75 % oder stärker zueinander homolog sind, gewöhnlich aneinander hybridisiert bleiben. Diese stringenten Bedingungen sind dem Fachmann bekannt und lassen sich in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6, finden. Ein bevorzugtes, nicht einschränkendes Beispiel für stringente Hybridisierungs- bedingungen sind Hybridisierungen in 6 x Natriumchlorid/Natriumcitrat (sodium chloride/sodiumcitrate = SSC) bei etwa 45°C, gefolgt von einem oder mehreren Waschschritten in 0,2 x SSC, 0,1 % SDS bei 50 bis 65°C. Dem Fachmann ist bekannt, dass diese Hybridisierungsbedingungen sich je nach dem Typ der Nukleinsäure und, wenn beispielsweise organische Lösungsmittel vorliegen, hinsichtlich der Temperatur und der Konzentration des Puffers unterscheiden. Die Temperatur unterscheidet sich beispielsweise unter "Standard-Hybridisierungsbedingungen" je nach dem Typ der Nukleinsäure zwischen 42°C und 58°C in wässrigem Puffer mit einer Konzentration von 0,1 bis 5 x SSC (pH 7,2). Falls organisches Lösungsmittel im obengenannten Puffer vorliegt, zum Beispiel 50 % Formamid, ist die Temperatur unter Standardbedingungen etwa 42°C. Vorzugsweise sind die Hybridisierungsbedingungen für DNA: DNA-Hybride zum Beispiel 0,1 x SSC und 20°C bis 45°C, vorzugsweise zwischen 30°C und 45°C. Vorzugsweise sind die Hybridisierungsbedingungen für DNA:RNA- Hybride zum Beispiel 0,1 x SSC und 30°C bis 55°C, vorzugsweise zwischen 45°C und 55°C. Die vorstehend genannten Hybridisierungstemperaturen sind, beispielsweise für eine Nukleinsäure mit etwa 100 bp (= Basenpaare) Länge und einem G + C-Gehalt von 50 % in Abwesenheit von Formamid bestimmt. Der Fachmann weiß, wie die erforderlichen Hybridisierungsbedingungen anhand von Lehrbüchern, wie dem vorstehend erwähnten oder aus den folgenden Lehrbüchern Sambrook et al, "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989; Harnes und Higgins (Hrsgb.) 1985, "Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach", IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (Hrsgb.) 1991, "Essential Molecular Biology: A Practical Approach", IRL Press at Oxford University Press, Oxford, bestimmt werden können.
Zur Bestimmung der prozentualen Homologie (= Identität) von zwei Aminosäuresequenzen (z.B. der Sequenz SEQ ID NO: 2) oder von zwei Nukleinsäuren (z.B. SEQ ID NO: 1) werden die Sequenzen zum Zweck des optimalen Vergleichs untereinander geschrieben (z.B. können Lücken in die Sequenz eines Proteins oder einer Nukleinsäure eingefügt werden, um ein optimales Alignment mit dem anderen Protein oder der anderen Nukleinsäure zu erzeugen). Die Aminosäurereste oder Nukleotide an den entsprechenden Aminosäurepositionen oder Nukleotidpositionen werden dann verglichen. Wenn eine Position in einer Sequenz durch den gleichen Aminosäurerest oder das gleiche Nukleotid wie die entsprechende Stelle in der anderen Sequenz be- legt wird, dann sind die Moleküle an dieser Position homolog (d.h. Aminosäure- oder Nukleinsäure-'Ηomologie", wie hier verwendet, entspricht Aminosäure- oder Nuklein- säure-"ldentitä ). Die prozentuale Homologie zwischen den beiden Sequenzen ist eine Funktion der Anzahl an identischen Positionen, die den Sequenzen gemeinsam sind (d.h. % Homologie = Anzahl der identischen Positionen/Gesamtanzahl der Positionen x 100). Die Begriffe Homologie und Identität sind damit als Synonym anzusehen. Die verwendeten Programme bzw. Algorithmen sind oben beschrieben.
Ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das eine ω-3-Desaturase kodiert, die zur Proteinsequenz der SEQ ID NO: 2 homolog ist, kann durch Einbringen einer oder mehrerer Nukleotidsubstitutionen, -additionen oder -deletionen in eine Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 1 erzeugt werden, so dass eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen, -additionen oder -deletionen in das kodierte Protein eingebracht werden. Mutationen können in eine der Sequenz der SEQ ID NO: 1 durch Standardtechniken, wie stellenspezifische Mutagenese und PCR-vermittelte Mutagenese, eingebracht werden. Vor- zugsweise werden konservative Aminosäuresubstitutionen an einer oder mehreren der vorhergesagten nicht-essentiellen Aminosäureresten hergestellt. Bei einer "konservativen Aminosäuresubstitution" wird der Aminosäurerest gegen einen Aminosäurerest mit einer ähnlichen Seitenkette ausgetauscht. Im Fachgebiet sind Familien von Aminosäureresten mit ähnlichen Seitenketten definiert worden. Diese Familien umfassen Aminosäuren mit basischen Seitenketten (z.B. Lysin, Arginin, Histidin), sauren Seitenketten (z.B. Asparaginsäure, Glutaminsäure), ungeladenen polaren Seitenketten (z.B. Glycin, Asparagin, Glutamin, Serin, Threonin, Tyrosin, Cystein), unpolaren Seitenketten, (z.B. Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin, Trypto- phan), beta-verzweigten Seitenketten (z.B. Threonin, Valin, Isoleucin) und aroma- tischen Seitenketten (z.B. Tyrosin, Phenylalanin, Tryptophan, Histidin). Ein vorhergesagter nicht-essentieller Aminosäurerest in einer Lysophosphatidsäure Acyltrans- ferase, Glycerin-3-phosphat Acyltransferase, Diacylglycerin Acyltransferase oder Lecithin Cholesterin Acyltransferase wird somit vorzugsweise durch einen anderen Aminosäurerest aus der gleichen Seitenkettenfamilie ausgetauscht. Alternativ können bei einer anderen Ausführungsform die Mutationen zufallsgemäß über die gesamte oder einen Teil der Lysophosphatidsäure Acyltransferase, Glycerin-3-phosphat Acyltransferase, Diacylglycerin Acyltransferase oder Lecithin Cholesterin Acyltransferase kodierenden Sequenz eingebracht werden, z.B. durch Sättigungsmutagenese, und die resultierenden Mutanten können nach der hier beschriebenen Lysophosphatid- säure Acyltransferase-, Glycerin-3-phosphat Acyltransferase-, Diacylglycerin Acyltransferase- oder Lecithin Cholesterin Acyltransferase-Aktivität durchmustert werden, um Mutanten zu identifizieren, die die Lysophosphatidsäure Acyltransferase-, Glycerin- 3-phosphat Acyltransferase-, Diacylglycerin Acyltransferase- oder Lecithin Cholesterin Acyltransferase-Aktivität beibehalten haben. Nach der Mutagenese einer der Sequen- zen der SEQ ID NO: 1 kann das kodierte Protein rekombinant exprimiert werden, und die Aktivität des Proteins kann z.B. unter Verwendung der hier beschriebenen Tests bestimmt werden.
Weitere Erfindungsgegenstände sind transgene nicht-humane Organismen, die die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren SEQ ID NO: 1 enthalten oder ein Genkonstrukt oder einen Vektor, die diese erfindungsgemäßen Nukleinsauresequenzen enthalten. Vorteilhaft handelt es sich bei dem nicht-humanen Organismus um einen Mikroorganismus, ein nicht-humanes Tier oder eine Pflanze, besonders bevorzugt um eine Pflanze. Diese Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele weiter veranschaulicht, die nicht als beschränkend aufgefasst werden sollten. Der Inhalt sämtlicher in dieser Patentanmeldung zitierten Literaturstellen, Patentanmeldungen, Patente und veröffentlichten Patentanmeldungen ist hier durch Bezugnahme aufgenommen. Beispiele Beispiel 1 : Allgemeine Klonierungsverfahren: Die Klonierungsverfahren wie z.B. Restriktionsspaltungen, Agarose-Gelelektrophorese, Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf Nitrozellulose und Nylon Membranen, Verknüpfen von DNA-Fragmenten, Transformation von Escherichia coli Zellen, Anzucht von Bakterien und die Sequenzanalyse rekombinanter DNA wurden wie bei Sambrook et al. (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6) beschrieben durchgeführt. Beispiel 2: Sequenzanalyse rekombinanter DNA: Die Sequenzierung rekombinanter DNA-Moleküle erfolgte mit einem Laserfluoreszenz- DNA-Sequenzierer der Firma ABI nach der Methode von Sanger (Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sei. USA74, 5463-5467). Fragmente resultierend aus einer Polymerase Kettenreaktion wurden zur Vermeidung von Polymerasefehlern in zu expri- mierenden Konstrukten sequenziert und überprüft. Beispiel 3: Klonierung der ω-3-spezifischen Desaturase aus Phytophthora infestans Durch Suche nach konservierten Bereichen in den Proteinsequenzen entsprechend der in der Beschreibung aufgeführten Desaturase-Gene, wurde eine Sequenz mit entsprechenden für eine Desaturase charakteristischen Motiven in einer EST- Sequenzdatenbank identifiziert.
Figure imgf000056_0001
Gesamt-RNA von Phytophthora infestans wurde mit Hilfe des RNAeasy Kits der Firma Qiagen (Valencia, CA, US) isoliert und zur Herstellung einer EST-Sequenzdatenbank verwendet. Aus der Gesamt-RNA wurde mit Hilfe von oligo-dT-Cellulose poly-A+ RNA (mRNA) isoliert (Sambrook et al, 1989). Die RNA wurde mit dem Reverse Transcription System Kit von Promega revers transcribiert und die synthetisierte cDNA in den lambda ZAP Vektor (lambda ZAP Gold, Stratagene) Moniert. Entsprechend Herstellerangaben wurde die cDNA zur Plasmid-DNA entpackt. Die cDNA-Plasmid- Bank wurde dann für die PCR zur Klonierung von Expressionsplasmiden verwendet. Die Sequenzdaten wurden in einer entsprechenden Datenbank abgeledgt. Beispiel 4: Klonierung eines Expressionsplasmides zur heterologen Expression der Pi-omega3Des in Hefen
Der Pi-omega3Des Klon wurde für die heterologe Expression in Hefen über PCR mit entsprechenden Pi-omega3Des spezifischen Primern in den Hefe-Expressions- vektor pYES3 Moniert. Dabei wurde ausschließlich der für das Pi-omega3Des Protein kodierende offene Leseraster des Gens amplifiziert und mit zwei Schnittstellen für die Klonierung in den pYES3 Expressionsvektor versehen:
Forward Primer: δ'-TAAGCTTACATGGCGACGAAGGAGG Reverse Primer: 5'-TGGATCCACTTACGTGGACTTGGT
Zusammensetzung des PCR-Ansatzes (50 μL):
5,00 μL Template cDNA
5,00 μL 10x Puffer (Advantage-Polymerase)+ 25mM MgCI2 5,00 μL 2mM dNTP
1 ,25 μL je Primer (10 pmol/μL des 5'-ATG sowie des 3'-Stopp Primers)
0,50 μL Advantage-Polymerase
Die Advantage-Polymerase von Clontech wurden eingesetzt.
Reaktionsbedingungen der PCR:
Anlagerungstemperatur: 1 min 55°C Denaturierungstemperatur: 1 min 94°C Elongationstemperatur: 2 min 72°C Anzahl der Zyklen: 35
Das PCR Produkt wurde für 2 h bei 37 °C mit den Restriktionsenzymen Hindill und BamHI inkubiert. Der Hefe-Expressionsvektor pYES3 (Invitrogen) wurde in gleicherweise inkubiert. Anschließend wurde das 1104 bp große PCR Produkt sowie der Vektor durch Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und die entsprechenden DNA- Fragmente ausgeschnitten. Die Aufreinigung der DNA erfolge mittels Qiagen Gel puri- fication Kit gemäss Herstellerangaben. Anschließend wurden Vektor und Desaturase- cDNA ligiert. Dazu wurde das Rapid Ligation Kit von Röche verwendet. Das entstandene Plasmid pYES3-Pi-omega3Des wurde durch Sequenzierung überprüftt und in den Saccharomyces Stamm INVSd (Invitrogen) durch Elektroporation (1500 V) transformiert. Zur Kontrolle wurde pYES3 parallel transformiert. Anschliessend wurden die Hefen auf Komplett-Minimalmedium ohne Tryptophan mit 2 % Glucose ausplattiert. Zellen, die auf ohne Tryptophan im Medium wachstumsfähig waren, enthalten damit die entsprechenden Plasmide pYES3, pYES3-Pi-omega3Des. Nach der Selektion wurden je zwei Transformaten zur weiteren funktioneilen Expression ausgewählt. Beispiel 5: Klonierung von Expressionsplasmiden zur Samen-spezifischen Expression in Pflanzen Für die Transformation von Pflanzen wurde ein weiterer Transformationsvektor auf Basis von pSUN-USP erzeugt. Dazu wurde mit folgendem Primerpaar Notl- Schnittstellen am 5' und 3'-Ende der kodierenden Sequenz eingefügt: - PSUN-Pi-omega3Des
Reverse: 3'-GCGGCCGCTTACGTGGACTTGGTC Forward: 5'-GCGGCCGCatGGCGACGAAGGAGG
Zusammensetzung des PCR-Ansatzes (50 μL): 5,00 μL Template cDNA 5,00 μL 10x Puffer (Advantage-Polymerase)+ 25mM MgCI2 5,00 μL 2mM dNTP 1,25 μL je Primer (10 pmol/μL) 0,50 μL Advantage-Polymerase Die Advantage-Polymerase von Clontech wurden eingesetzt.
Reaktionsbedingungen der PCR:
Anlagerungstemperatur: 1 min 55°C Denaturierungstemperatur: 1 min 94°C Elongationstemperatur: 2 min 72°C Anzahl der Zyklen: 35
Die PCR Produkte wurden für 4 h bei 37 °C mit dem Restriktionsenzym Notl inkubiert. Der Pflanzen-Expressionsvektor pSUN300-USP wurde in gleicherweise inkubiert. Anschließend wurde die PCR Produkte sowie der 7624 bp große Vektor durch Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und die entsprechenden DNA-Fragmente ausgeschnitten. Die Aufreinigung der DNA erfolge mittels Qiagen Gel purification Kit gemäss Herstellerangaben. Anschliessend wurden Vektor und PCR-Produkte ligiert. Dazu wurde das Rapid Ligation Kit von Röche verwendet. Das entstandene Plasmid pSUN-Piomega3Des wurde durch Sequenzierung verifiziert.
Beispiel 6: Expression von Pi-omega3Des in Hefen Hefen, die wie unter Beispiel 4 mit dem Plasmid pYES3 oder pYES3- Pi-omega3Des transformiert wurden, wurden folgendermaßen analysiert: Die Hefezellen aus den Hauptkulturen wurden durch Zentrifugation (100 x g, 5 min, 20°C) geerntet und mit 100 mM NaHCO3, pH 8,0 gewaschen, um restliches Medium und Fettsäuren zu entfernen. Aus den Hefe-Zellsedimenten wurden Fettsäuremethyl- ester (FAMEs) durch saure Methanolyse hergestellt. Hierzu wurden die Zellsedimente mit 2 ml 1 N methanolischer Schwefelsäure und 2% (v/v) Dimethoxypropan für 1 h bei 80°C inkubiert. Die Extraktion der FAMES erfolgte durch zweimalige Extraktion mit Petrolether (PE). Zur Entfernung nicht derivatisierter Fettsäuren wurden die organischen Phasen je einmal mit 2 ml 100 mM NaHCO3, pH 8,0 und 2 ml Aqua dest. gewaschen. Anschließend wurden die PE-Phasen mit Na2SO getrocknet, unter Argon eingedampft und in 100 μl PE aufgenommen. Die Proben wurden auf einer DB-23- Kapillarsäule (30 m, 0,25 mm, 0,25 μm, Agilent) in einem Hewlett-Packard 6850- Gaschromatographen mit Flammenionisationsdetektor getrennt. Die Bedingungen für die GLC-Analyse waren wie folgt: Die Ofentemperatur wurde von 50°C bis 250°C mit einer Rate von 5°C/min und schließlich 10 min bei 250°C(halten) programmiert. Die Identifikation der Signale erfolgte durch Vergleiche der Retentionszeiten mit entsprechenden Fettsäurestandards (Sigma). Die Methodik ist beschrieben zum Beispiel in Napier and Michaelson, 2001, Lipids. 36(8):761-766; Sayanova et al, 2001, Journal of Experimental Botany. 52(360): 1581 -1585, Sperling et al, 2001, Arch. Biochem. Biophys. 388(2):293-298 und Michaelson et al, 1998, FEBS Letters. 439(3):215-218.
Beispiel 7: Funktionelle Charakterisierung von Pi-omega3Des:
Die Substratspezifität der konnte nach Expression und Fütterung verschiedener Fettsäuren ermittelt werden (Figur 2 bis 8). Die gefütterten Substrate liegen in großen Mengen in allen transgenen Hefen vor, wodurch die Aufnahme dieser Fettsäuren in die Hefen bewiesen ist. Die transgenen Hefen zeigen die Synthese neuer Fettsäuren, den Produkten der Pi-omega3Des-Reaktion. Dies bedeutet, dass das Gen Pi-omega3Des funktional exprimiert werden konnte.
Figur 2 gibt die Desaturierung von Linolsäure (18:2 ω-6-Fettsäure) zu α-Linolensäure (18:3 ω-3-Fettsäure) durch die Pi-omega3Des wieder. Die Synthese der Fettsäuremethylester erfolgte durch saure Methanolyse intaMer Zellen, die mit dem Leervektor pYES2 (Figur 2 A) oder dem Vektor pYes3-Pi-omega3Des (Figur 2 B) transformiert worden waren. Die Hefen wurden in Minimalmedium in Gegenwart von C18:2Δ9,12-
Fettsäure (300 μM) kultiviert. Anschließend wurden die FAMEs über GLC analysiert.
In Figur 3 ist die Desaturierung von γ-Linolensäure (18:3 ω-6-Fettsäure) zu Stearidon- säure (18:4 ω-3-Fettsäure) durch Pi-omega3Des wiedergegeben. Die Synthese der Fettsäuremethylester erfolgte durch saure Methanolyse intakter Zellen, die mit dem Leervektor pYES2 (Figur 3 A) oder dem Vektor pYes3-Pi- ohnega3Des (Figur 3 B) transformiert worden waren. Die Hefen wurden in Minimal- medium in Gegenwart von γ-C18:3 ' ' -Fettsäure (300 μM) kultiviert. Anschließend wurden die FAMEs über GLC analysiert. Figur 4 gibt die Desaturierung von C20:2-ω-6-Fettsäure zu C20:3-ω-3-Fettsäure durch Pi-omega3Des wieder. Die Synthese der Fettsäuremethylester erfolgte durch saure Methanolyse intakter Zellen, die mit dem Leervektor pYES2 (Figur 4 A) oder dem Vektor pYes3-Pi-omega3Des (Figur 4 B) transformiert worden waren. Die Hefen wurden in Minimalmedium in Gegenwart von C20:2Δ11,14-Fettsäure (300 μM) kultiviert. Anschließend wurden die FAMEs über GLC analysiert.
Figur 5 gibt die Desaturierung von C20:3-ω-6-Fettsäure zu C20:4-ω-3-Fettsäure durch Pi-omega3Des wieder. Die Synthese der Fettsäuremethylester erfolgte durch saure Methanolyse intakter Zellen, die mit dem Leervektor pYES2 (Figur 5 A) oder dem VeMor pYes3-Pi-omega3Des (Figur 5 B) transformiert worden waren. Die Hefen wurden in Minimalmedium in Gegenwart von C20:3Δ8,1 ,14-Fettsäure (300 μM) kultiviert. Anschließend wurden die FAMEs über GLC analysiert.
In Figur 6 wird die Desaturierung von Arachidonsäure (C20:4-ω-6-Fettsäure) zu Eicosapentaensäure (C20:5-ω-3-Fettsäure) durch die Pi-omega3Des gezeigt. Die Synthese der Fettsäuremethylester erfolgte durch saure Methanolyse intakter Zellen, die mit dem Leervektor pYES2 (Figur 6 A) oder dem Vektor pYes3-Pi- omega3Des (Figur 6 B) transformiert worden waren. Die Hefen wurden in Minimal- medium in Gegenwart von C20:4Δ5,8' 1,14-Fettsäure (300 μM) kultiviert. Anschließend wurden die FAMEs über GLC analysiert.
Figur 7 gibt die Desaturierung von Docosatetraensäure (C22:4-ω-6-Fettsäure) zu Docosapentaensäure (C22:5-ω-3-Fettsäure) durch Pi-omega3Des wieder. Die Syn- these der Fettsäuremethylester erfolgte durch saure Methanolyse intakter Zellen, die mit dem Leervektor pYES2 (Figur 7 A) oder dem Vektor pYes3-Pi-omega3Des (Figur 7 B) transformiert worden waren. Die Hefen wurden in Minimalmedium in Gegenwart von C22:4Δ7,10' 3'16-Fettsäure (300 μM) kultiviert. Anschließend wurden die FAMEs über GLC analysiert.
Die Substratspezifität der Pi-omega3Des gegenüber verschiedenen Fettsäuren ist Figur 8 zu entnehmen. Die Hefen, die mit dem Vektor pYes3-Pi-omega3Des transformiert worden waren, wurden in Minimalmedium in Gegenwart der angegebenen Fettsäuren kultiviert. Die Synthese der Fettsäuremethylester erfolgte durch saure Methanolyse intakter Zellen. Anschließend wurden die FAMEs über GLC analysiert. Jeder Wert gibt einen Mittelwert aus drei Messungen wieder. Die Umsetzungsraten (% Desaturation) wurden mit der Formel: [Produkt]/[Produkt]+[Substrat]*100 errechnet. Beispiel 8: Lipidextraktion aus Samen:
Die Auswirkung der genetischen Modifikation in Pflanzen, Pilzen, Algen, Ciliaten oder auf die Produktion einer gewünschten Verbindung (wie einer Fettsäure) kann bestimmt werden, indem die modifizierten Mikroorganismen oder die modifizierte Pflanze unter geeigneten Bedingungen (wie den vorstehend beschriebenen) gezüchtet werden und das Medium und/oder die zellulären Komponenten auf die erhöhte Produktion des gewünschten Produktes (d.h. von Lipiden oder einer Fettsäure) untersucht wird. Diese Analysetechniken sind dem Fachmann bekannt und umfassen Spektroskopie, Dünnschichtchromatographie, Färbeverfahren verschiedener Art, enzymatische und mikrobiologische Verfahren sowie analytische Chromatographie, wie Hochleistungs- Flüssigkeitschromatographie (siehe beispielsweise Ullman, Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. A2, S. 89-90 und S. 443-613, VCH: Weinheim (1985); Fallon, A, et al, (1987) "Applications of HPLC in Biochemistry" in: Laboratory Techniques in Bio- chemistry and Molecular Biology, Bd. 17; Rehm et al. (1993) Biotechnology, Bd. 3, Kapitel III: "Product recovery and purification", S. 469-714, VCH: Weinheim; Belter, P.A., et al. (1988) Bioseparations: downstream processing for Biotechnology, John Wiley and Sons; Kennedy, J.F, und Cabral, J.M.S. (1992) Recovery processes for biological Materials, John Wiley and Sons; Shaeiwitz, J.A, und Henry, J.D. (1988) Biochemical Separations, in: Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. B3; Kapitel 11 , S. 1-27, VCH: Weinheim; und Dechow, F.J. (1989) Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publications).
Neben den oben erwähnten Verfahren werden Pflanzenlipide aus Pflanzenmaterial wie von Cahoon et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 96 (22): 12935-12940, und Browse et al. (1986) Analytic Biochemistry 152:141-145, beschrieben extrahiert. Die qualitative und quantitative Lipid- oder Fettsäureanalyse ist beschrieben bei Christie, William W, Advances in Lipid Methodology, Ayr/Scotland: Oily Press (Oily Press Lipid Library; 2); Christie, William W, Gas Chromatography and Lipids. A Practical Guide - Ayr, Scot- land: Oily Press, 1989, Repr. 1992, IX, 307 S. (Oily Press Lipid Library; 1); "Progress in Lipid Research, Oxford: Pergamon Press, 1 (1952) - 16 (1977) u.d.T.: Progress in the Chemistry of Fats and Other Lipids CODEN.
Zusätzlich zur Messung des Endproduktes der Fermentation ist es auch möglich, andere Komponenten der Stoffwechselwege zu analysieren, die zur Produktion der gewünschten Verbindung verwendet werden, wie Zwischen- und Nebenprodukte, um die Gesamteffizienz der Produktion der Verbindung zu bestimmen. Die Analyse- verfahren umfassen Messungen der Nährstoffmengen im Medium (z.B. Zucker,
Kohlenwasserstoffe, Stickstoffquellen, Phosphat und andere Ionen), Messungen der Biomassezusammensetzung und des Wachstums, Analyse der Produktion üblicher Metabolite von Biosynthesewegen und Messungen von Gasen, die während der Fermentation erzeugt werden. Standardverfahren für diese Messungen sind in Applied Microbial Physiology; A Practical Approach, P.M. Rhodes und P.F. Stanbury, Hrsgb, IRL Press, S. 103-129; 131-163 und 165-192 (ISBN: 0199635773) und darin angegebenen Literaturstellen beschrieben. Ein Beispiel ist die Analyse von Fettsäuren (Abkürzungen: FAME, Fettsäuremethylester; GC-MS, Gas-Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie; TAG, Triacyl- glycerin; TLC, Dünnschichtchromatographie).
Der unzweideutige Nachweis für das Vorliegen von Fettsäureprodukten kann mittels Analyse rekombinanter Organismen nach Standard-Analyseverfahren erhalten werden: GC, GC-MS oder TLC, wie verschiedentlich beschrieben von Christie und den Literaturstellen darin (1997, in: Advances on Lipid Methodology, Vierte Aufl.: Christie, Oily Press, Dundee, 119-169; 1998, Gaschromatographie-Massenspektrometrie- Verfahren, Lipide 33:343-353). Das zu analysierende Material kann durch Ultraschallbehandlung, Mahlen in der Glasmühle, flüssigen Stickstoff und Mahlen oder über andere anwendbare Verfahren aufgebrochen werden. Das Material muss nach dem Aufbrechen zentrifugiert werden. Das Sediment wird in Aqua dest. resuspendiert, 10 min bei 100°C erhitzt, auf Eis abgekühlt und erneut zentrifugiert, gefolgt von Extraktion in 0,5 M Schwefelsäure in Methanol mit 2 % Dimethoxypropan für 1 Std. bei 90°C, was zu hydrolysierten Öl- und Lipidverbin- dungen führt, die transmethylierte Lipide ergeben. Diese Fettsäuremethylester werden in Petrolether extrahiert und schließlich einer GC-Analyse unter Verwendung einer Kapillarsäule (Chrompack, WCOT Fused Silica, CP-Wax-52 CB, 25 mikrom, 0,32 mm) bei einem Temperaturgradienten zwischen 170°C und 240°C für 20 min und 5 min bei 240°C unterworfen. Die Identität der erhaltenen Fettsäuremethylester muss unter Verwendung von Standards, die aus kommerziellen Quellen erhältlich sind (d.h. Sigma), definiert werden.
Pflanzenmaterial wird zunächst mechanisch durch Mörsern homogenisiert, um es einer Extraktion zugänglicher zu machen. Dann wird 10 min auf 100°C erhitzt und nach dem Abkühlen auf Eis erneut sedi- mentiert. Das Zellsediment wird mit 1 M methanolischer Schwefelsäure und 2 % Dimethoxypropan 1 h bei 90°C hydrolysiert und die Lipide transmethyliert. Die resultierenden Fettsäuremethylester (FAME) werden in Petrolether extrahiert. Die extrahierten FAME werden durch Gasflüssigkeitschromatographie mit einer Kapillarsäule (Chrompack, WCOT Fused Silica, CP-Wax-52 CB, 25 m, 0,32 mm) und einem
Temperaturgradienten von 170°C auf 240°C in 20 min und 5 min bei 240°C analysiert. Die Identität der Fettsäuremethylester wird durch Vergleich mit entsprechenden FAME- Standards (Sigma) bestätigt. Die Identität und die Position der Doppelbindung kann durch geeignete chemische Derivatisierung der FAME-Gemische z.B. zu 4,4-Dimeth- oxyoxazolin-Derivaten (Christie, 1998) mittels GC-MS weiter analysiert werden. Beispiel 9: Erzeugung von transgenen Pflanzen a) Erzeugung transgener Rapspflanzen (verändert nach Moloney et al, 1992, Plant Gell Reports, 8:238-242)
Zur Erzeugung transgener Rapspflanzen wurden binäre Vektoren in Agrobacterium tumefaciens C58C1 :pGV2260 oder Escherichia coli genutzt (Deblaere et al, 1984, Nucl. Acids. Res. 13, 4777-4788). Zur Transformation von Rapspflanzen (Var. Drakkar, NPZ Nordeutsche Pflanzenzucht, Hohenlieth, Deutschland), wurde eine 1:50 Verdünnung einer Übernachtkultur einer positiv transformierten Agrobakterienkolonie in Murashige-Skoog Medium (Murashige und Skoog 1962 Physiol. Plant. 15, 473) mit 3 % Saccharose (3MS-Medium) benutzt. Petiolen oder Hypokotyledonen frisch ge- keimter steriler Rapspflanzen (zu je ca. 1 cm2) wurden in einer Petrischale mit einer 1:50 Agrobakterienverdünnung für 5-10 Minuten inkubiert. Es folgt eine 3-tägige Colnkubation in Dunkelheit bei 25°C auf 3MS-Medium mit 0,8 % Bacto-Agar. Die Kultivierung wurde nach 3 Tagen mit 16 Stunden Licht / 8 Stunden Dunkelheit weitergeführt und in wöchentlichem Rhythmus auf MS-Medium mit 500 mg/l Claforan (Cefotaxime- Natrium), 50 mg/l Kanamycin, 20 mikroM Benzylaminopurin (BAP) und 1 ,6 g/l Glukose weitergeführt. Wachsende Sprosse wurden auf MS-Medium mit 2 % Saccharose, 250 mg/l Claforan und 0,8 % Bacto-Agar überführt. Bildeten sich nach drei Wochen keine Wurzeln, so wurde als Wachstumshormon 2-lndolbuttersäure zum Bewurzeln zum Medium gegeben. i
Regenerierte Sprosse wurden auf 2MS-Medium mit Kanamycin und Claforan erhalten, nach Bewurzelung in Erde überführt und nach Kultivierung für zwei Wochen in einer Klimakammer oder im Gewächshaus angezogen, zur Blüte gebracht, reife Samen geerntet und auf ω-3-Desaturase-Expression mittels Lipidanalysen untersucht. Linien mit erhöhten Gehalten an C20- und C22 mehrfachungesättigten Fettsäuren wurden so identifiziert. b) Herstellung von transgenen Leinpflanzen
Die Herstellung von transgenen Leinpflanzen können zum Beispiel nach der Methode von Bell et al, 1999, In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant. 35(6):456-465 mittels particle bombartment erzeugt werden. Agrobakterien-vermittelte Transformationen können zum Beispiel nach Mlynarova et al. (1994), Plant Cell Report 13: 282-285 hergestellt werden.
Äquivalente
Der Fachmann erkennt oder kann viele Äquivalente der hier beschriebenen erfindungs- gemäßen spezifischen Ausführungsformen feststellen, indem er lediglich Routineexperimente verwendet. Diese Äquivalente sollen von den Patentansprüchen umfasst sein.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der allgemeinen Formel
Figure imgf000064_0001
in transgenen Organismen mit einem Gehalt von mindestens 1 Gew.-% dieser Verbindungen bezogen auf den Gesamtlipidgehalt des transgenen Organismus gelöst, dadurch gekennzeichnet, dass es folgende Verfahrensschritte umfasst: a) Einbringen mindestens einer Nukleinsauresequenz in den Organismus, welche für eine ω-3-Desaturase-Aktivität codiert, und b) Anzucht des Organismus unter Bedingungen, die die Herstellung der Verbindungen der allgemeinen Formel I ermöglicht, und wobei die Variablen und Substituenten in der Formel I die folgende Bedeutung haben: R1 = Hydroxyl-, CoenzymA-(Thioester), Lyso-Phosphatidylcholin-, Lyso-Phosphatidylethanolamin-, Lyso-Phosphatidylglycerol-, Lyso-Diphosphatidylglycerol-, Lyso-Phosphatidylserin-, Lyso- Phosphatidylinositol-, Sphingobase-, oder einen Rest der allgemeinen Formel II
Figure imgf000064_0002
R2 = Wasserstoff-, Lyso-Phosphatidylcholin-, Lyso-Phosphatidylethanolamin- Lyso-Phosphatidylglycerol-, Lyso-Diphosphatidylglycerol-, Lyso- Phosphatidylserin-, Lyso-Phosphatidylinositol- oder gesättigtes oder ungesättigtes C2-C24-Alkylcarbonyl-, R3 = Wasserstoff-, gesättigtes oder ungesättigtes C2-C24-Alkylcarbonyl-, oder R2oder R3 unabhängig voneinander einen Rest der allgemeinen Formel la:
9 Fig / 2 Seq
Figure imgf000065_0001
n = 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 9, m = 2, 3, 4, 5 oder 6 und p = 0 oder 3.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich zur unter Punkt a) eingebrachten Nukleinsauresequenz, die für eine ω-3-Desaturase-Aktivität codiert, weitere Nukleinsauresequenzen eingebracht werden, die für Polypeptide mit Δ-9-Elongase-, Δ-6-Desaturase-, Δ-8-Desaturase-, Δ-6-Elongase-, Δ-5-Desaturase-, Δ-5-Elongase- oder Δ-4-Desaturaseaktivität codieren.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Substituenten R2 oder R3 unabhängig voneinander gesättigtes oder ungesättigtes C18-C22-Alkylcarbonyl- bedeuten.
4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Substituenten R2oderR3 unabhängig voneinander ungesättigtes Cι8-, C20- oder C22-Alkylcarbonyl- mit mindestens zwei Doppelbindungen bedeuten. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der transgene Organismus ein transgener Mikroorganismus oder eine transgene Pflanze ist. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der transgene Organismus eine Öl-produzierende Pflanze, eine Gemüsepflanze oder Zierpflanze ist.
7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die transgene Organismus eine transgene Pflanze ausgewählt aus der Gruppe der Pflanzenfamilien Adelotheciaceae, Anacardiaceae, Asteraceae, Apiaceae, Betulaceae, Boraginaceae, Brassicaceae, Bromeliaceae, Caricaceae, Canna- baceae, Convolvulaceae, Chenopodiaceae, Crypthecodiniaceae, Cucurbitaceae, Ditrichaceae, Elaeagnaceae, Ericaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae, Geraniaceae, Gramineae, Juglandaceae, Lauraceae, Leguminosae, Linaceae oder Prasinophyceae ist.
8. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindungen der allgemeinen Formel I aus dem Organismus in Form ihrer Öle, Lipide oder freien Fettsäuren isoliert werden.
9. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindungen der allgemeinen Formel I in einer Konzentration von mindestens 5 Gew.-% bezogenen auf den gesamten Lipidgehalt des transgenen Organismus isoliert werden.
10. Öl, Lipide oder Fettsäuren oder eine Fraktion davon, hergestellt durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9. 11. Öl-, Lipid- oder Fettsäurezusammensetzung, die PUFAs hergestellt nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9 umfasst und von transgenen Pflanzen stammt.
12. Verfahren zur Herstellung von Ölen, Lipiden oder Fettsäurezusammensetzungen durch Mischen von Öl, Lipide oder Fettsäuren gemäß Anspruch 10 oder Öl-, Lipid- oder Fettsäurezusammensetzung gemäß Anspruch 11 mit tierischen Ölen, Lipiden oder Fettsäuren.
13. Verwendung von Öl, Lipide oder Fettsäuren gemäß Anspruch 10, öl-, Lipid- oder Fettsäurezusammensetzung gemäß Anspruch 11 oder Ölen, Lipiden oder Fettsäurezusammensetzungen hergestellt gemäß Anspruch 12 in Futter, Nahrungsmitteln, Kosmetika oder Pharmazeutika.
14. Isolierte Nukleinsauresequenzen, die für Polypeptide mit ω-3-Desaturase- aktivität codieren, ausgewählt aus der Gruppe: a) einer Nukleinsauresequenz mit der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz, b) Nukleinsauresequenzen, die sich als Ergebnis des degenerierten genetischen Codes von der in SEQ ID NO: 2 dargestellten Aminosäuresequenz ableiten lassen, oder c) Derivate der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Nukleinsauresequenz, die für Polypeptide mit mindestens 60 % Identität auf Aminosäureebene mit SEQ ID NO: 2 codieren und eine ω-3-Desaturaseaktivität aufweisen.
15. Isolierte Nukleinsauresequenz nach Anspruch 14, wobei die Sequenz von einer Alge, einem Pilz, einem Mikroorganismus oder einem nicht-humanen Tier stammt.
16. Isolierte Nukleinsauresequenz nach Anspruch 14 oder 15, wobei die Sequenz aus der Familie der Pythiaceae stammt.
17. Aminosäuresequenz, die von einer isolierten Nukleinsauresequenz nach einem der Ansprüche 14 bis 16 codiert wird.
18. Genkonstrukt, enthaltend eine isolierte Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 14 bis 16, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem oder mehreren Regulationssignalen verbunden ist.
19. Genkonstrukt nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass das Nuklein- säurekonstrukt zusätzliche Biosynthesegene des Fettsäure- oder Lipidstoffwechsels enthält ausgewählt aus der Gruppe Acyl-CoA-Dehydrogenase(n), Acyl-ACP[= acyl carrier protein]-Desaturase(n), Acyl-ACP-Thioesterase(n), Fettsäure-Acyl-Transferase(n), Acyl-CoA:Lysophospholipid-Acyltrans- ferase(n), Fettsäure-Synthase(n), Fettsäure-Hydroxylase(n), Acetyl-Coenzym A-Carboxylase(n), Acyl-Coenzym A-Oxidase(n), Fettsäure-Desaturase(n), Fettsäure-Acetylenasen, Lipoxygenasen, Triacylglycerol-Lipasen, Allenoxid- Synthasen, Hydroperoxid-Lyasen oder Fettsäure-Elongase(n). 20. Genkonstrukt nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, dass das Nukleinsäurekonstrukt zusätzliche Biosynthesegene des Fettsäure- oder Lipidstoffwechsels enthält ausgewählt aus der Gruppe der Δ-4-Desaturase-, Δ-5-Desaturase-, Δ-6-Desaturase-, Δ-8-Desatuase-, Δ-9-Desaturase-, Δ-12-Desaturase-, Δ-6-EIongase-, Δ-5-Elongase- oder Δ-9-Elongase. 21. Vektor, enthaltend eine Nukleinsäure nach den Ansprüchen 14 bis 16 oder ein Genkonstrukt nach Anspruch 18.
22. Transgener nicht-humaner Organismus, enthaltend mindestens eine Nukleinsäure nach den Ansprüchen 14 bis 16, ein Genkonstrukt nach Anspruch 18 oder einen Vektor nach Anspruch 21. 23. Transgener nicht-humaner Organismus nach Anspruch 22, wobei der Organismus ein Mikroorganismus, ein nicht-humanes Tier oder eine Pflanze ist.
24. Transgener nicht-humaner Organismus nach Anspruch 22 oder 23, wobei der Organismus eine Pflanze ist.
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