HU218717B - Nukleinsav-termelést fokozó növényi eredetű génfragmentek és eljárás előállításukra - Google Patents

Description

R⁵ jelentése alkoxi- vagy -NR⁶R⁷-csoport;

R⁶ jelentése hidrogénatom, metoxi-, alkil-, cikloalkilcsoport vagy alkoxi-, vagy etoxi-etoxi-csoporttal helyettesített alkilcsoport, és

R⁷ jelentése hidrogénatom vagy alkilcsoport.

A találmány kiterjed a növények transzformálására alkalmas rekombináns DNS-konstrukcióra, a transzgenikus növényre, valamint a növényben egy kiválasztott géntermék expressziójának növelésére alkalmas eljárásra is.

A találmány tárgya kukorica, petúnia és dohány különböző génjeiből származó nukleinsav promoterfragmentek előállítása, amelyek igen jól reagálnak számos helyettesített benzolszulfonamidra és rokon vegyületekre. Kiméra gének készíthetők, amelyek egy kiválasztott génterméket kódoló nukleinsavszekvenciát tartalmaznak, működőképesen egy ilyen említett promoterfragmenthez kapcsolva rekombináns DNS-konstrukciókban. Növényeket transzformálva ilyen konstrukciókkal új növényeket kapunk, amelyekben az említett kiméra gének által kódolt termék expresszióját megfelelő indukáló vegyszerrel lehet szabályozni.

Szántóföldi növények kiválasztott génjei és ezáltal géntermékei expressziója kívülről való szabályozásának képessége a szántóföldén megfelelő kémiai anyagokkal nagy mezőgazdasági és élelmiszer-ipari jelentőséggel bír. Ez a szabályozás különösen azoknak a géneknek a szabályozása esetében fontos, amelyek transzgenikus növényekbe vihetők, és számos alkalmazási lehetőséggel rendelkeznek, beleértve (1) a kívánt, táplálkozási szempontból fontos tartalék tápanyagok felhalmozásának megismétlése vagy meghosszabbítása magvakban, gyökerekben vagy gumókban;

(2) a termékek a növényi szövetekben a fejlődési ciklus meghatározott idejében termelődjenek és halmozódjanak fel, hogy ezek a termékek megfelelőek legyenek a betakarításhoz és/vagy az izoláláshoz, és (3) a patogén támadásának helyén egy kártevő-specifikus toxin expressziójának indukálása. Ez az utóbbi példa lehetőséget nyújt arra, hogy elkerüljük az élelmiszer-ipari végtermékek szennyeződését a toxikus anyaggal, és minimalizáljuk a rezisztencia kifejlődését a kártevő-populációban a toxikus anyag szelektív, szövetspecifikus és nem konstitutív expressziójával. Ezek és más előnyök jelenleg nem elérhetők, mivel az ismert növényi gének külső szabályozás alá helyezésére a termőföldön jelenleg nincs gyakorlati eszköz.

Az eukarióta-rendszerekben a gének expresszióját egy DNS-régió irányítja, ennek a neve promoter. A promotert általában azon DNS-szakasznak tartják a kódoló régió előtt, amely a transzkripció iniciációs helyét tartalmazza. A promoterrégiók más elemeket is tartalmaznak, amelyek a gén expressziója szabályozójaként működnek. Ezek közé tartozik a „TATA benzil-oxi-karbonil”, körülbelül 30 bp távolságra 5’-irányban (-30) a transzkripciós starthelytől, és gyakran a „CAAT box” ~75 bp-nál. Más szabályozóelemek, amelyek szintén jelen lehetnek a promoterben, befolyásolják a gén expresszióját a külső ingerekre, például fényre, tápanyagok hozzáférhetőségére, hőre, anaerobiózisra, nehézfémek jelenlétére és hasonlókra. A promoterben lévő más DNS-szekvenciák befolyásolhatják a fejlődés során a gén expressziójának időzítését vagy szövetspecifikusságát. Emellett enhanszer típusú szekvenciákat is leírtak számos eukarióta-rendszerben, amelyek a pozíciótól és az orientációtól függetlenül hatva megnövelik a közelben lévő gének expresszióját. Ezeknek az enhanszerszerű szekvenciáknak a homológjait leírták növényekben is. A promoter funkció óriási változatossága az eukarióta-rendszerekben lehetőséget nyújt arra, hogy a transzkripciós aktiválásukhoz szigorú feltételekkel rendelkező promotereket izoláljanak, amelyek hasznosak lehetnek a géntermékek időzített expresszálásának szabályozásában transzgenikus növényekben.

Jóllehet jelenleg létezik technológia arra, hogy a növényeket kiválasztott termékeket kódoló génekkel transzformáljuk, ezeknek a géneknek az expressziója vagy folyamatos a teljes életciklusban (konstitutív promoter szabályozása alatt), vagy az érésnek a fejlődésben időzített programja szabályozza, amely az egyes szervekben/szövetekben/sejtekben öröklődik (állapotvagy szövetspecifikus promoterek), ahol a génterméknek expresszálódnia kell. A folyamatos expresszió kizárja a géntermékek folyamatos termelődését az életciklus egy bizonyos szakaszában vagy specifikus szövetekben, vagy külső, előre nem jelezhető eseményekre adott válaszként. Emellett az ilyen folyamatos expresszió nagyon nagy teher a termelésre, mert nagymértékben megnő az energiaigény, amely egyetlen géntermék magas szintű termeléséhez szükséges. A szövetvagy állapotspecifikus expresszió, jóllehet nagyon értékes a termékek időbeli vagy térbeli akkumulációja szempontjából, az egyes növények fejlődési programjának változó időzítése alatt áll. Az ilyen típusú gének promotereinek gyakorlati alkalmazásához ezért arra lenne szükség, hogy az összes, számunkra érdekes terményfajból számos állapot- és szövetspecifikus promotert izoláljunk.

Ideális esetben az lenne az előnyös, ha transzgenikus növényekben kívülről szabályoznánk a géntermék expresszióját egy indukálójel alkalmazásával, amely a kiválasztott gén expresszióját bármely szövetben stimulálja a növény életciklusának bármely időpontjában. Ezt a szabályozást úgy hajthatjuk végre, hogy a kívánt terméket kódoló struktúrgén expresszióját egy olyan promoterrel szabályozzuk, amely nagyon jól reagál az indukálójel alkalmazására. A javasolt inducer/promoter kombináció számos különböző növényfajban lenne működőképes azzal, hogy az indukálószemek nem lenne hatása a növény normális növekedésére, fejlődésére vagy morfológiájára. Azok a vegyi anyagok, amelyek

HU 218 717 Β megfelelnek a fenti kritériumoknak a gének expressziójának növényekben való szabályozására, nagyon jól használhatók lennének a termőföldeken, mivel használatuk kompatibilis lenne a jelenlegi mezőgazdasági gyakorlattal. Például egy kémiai indukálószer alkalmazása könnyen végrehajtható lenne a legtöbb növénytermesztőnek jelenleg is rendelkezésére álló berendezésekkel. Ideális esetben egy vegyszer és a vegyszerre reagáló promoter kombinációja működőképessé tehető lenne egy transzformálható növény bármely szövetében vagy fejlődési állapotában, hogy szabályozza egy kiválasztott géntermék expresszióját.

Nincsenek olyan inducer/promoter kombinációk, amelyekről igazolták, hogy idegen gének expresszióját szabályozzák mind baktérium, mind állati rendszerben. Számos indukálható bakteriális rendszer olyan promoterek alkalmazásán alapul, amelyek a baktérium fejlődését normálisan szabályozó metabolitokra vagy metabolitanalógokra reagálnak. Egy megfelelő metabolit hozzáadása aktívan növekedő baktériumtenyészetekhez, amelyeket az említett metabolitokra reagáló génekkel transzformáltunk, a kívánt géntermék expresszióját eredményezi. Ilyen inducer/promoter kombináció lehet például a 3-P-indolil-akrilsav és a Trp promoter, a foszfát és a foszfátéhezéssel indukálható promoter, valamint az L-arabinóz és az ara B promoter kombinációja. Hasonlóképpen, a nehézfém/metallotionein promoter és a hő/hősokk promoter kombinációkat is használják állati sejttenyészetrendszerekben, hogy idegen gének expresszióját szabályozzák.

Számos ismert, növényi génekből származó inducer/promoter kombináció létezik. Ezek közül a promoterek közül számosnak az aktivációját környezeti tényezők, például fény, hősokk és az anaerobiózis szabályozza. Ezeknek az indukálható géneknek a promotereit alaposan elemezték [Kuhlemeier és munkatársai, Ann. Rév. Plánt. Physiol., 38, 221-257 (1987)]. A környezeti inducerek alkalmazása idegen gének szabályozására azonban nem bír gyakorlati jelentőséggel, mivel az indukálójelek (azaz a fény, hőmérséklet és oxigénszint) nem könnyen vagy gyakorlatilag nem szabályozhatók a normál mezőgazdasági gyakorlatban. Leírtak más növényi géneket, amelyeket oligoszacharidokkal lehet indukálni, például azokat, amelyek a patogénnel való fertőzés vagy sebesülés hatására keletkeznek. A példák közé tartozik a fenil-alanin-ammónia-liáz és kaikon szintetáz glükánnal mint kiváltóval szójababban [Ebei,

J. et al., Arch. Biochem. Biophys., 232, 240-248 (1984)], valamint egy sebesüléssel indukálható gén indukciója burgonyában [Cleveland et al., Plánt. Mól. Bioi., 8, 199-208 (1987)]. A probléma ismét az, hogy ezeknek az indukálható géneknek a promotere nem rendelkezik azzal a képességgel, hogy idegen gének expresszióját szabályozza transzformált növényekben vagy az indukció gyakorlati kivitelezésének hiánya miatt (sebesülés), vagy amiatt a romboló hatás miatt, ami abból származik, hogy a növény növekedését szolgáló energiát olyan termékek nagy mennyiségben való szintézisére fordítjuk, amelyek célja a patogén támadása elleni harc (oligoszacharid indukálószerek).

Nagyszámú kémiai anyag mind természetes, mind szintetikus vegyület rendelkezik azzal a potenciális képességgel, hogy szabályozza a gének expresszióját növényekben. Azonban bármely vegyület, amely a termőföldön gének expressziójának használható indukálószere lehet, minimum biztonságos kell hogy legyen a környezetre, ne legyen hatása vagy minimális hatása legyen a növények normális növekedésére, morfológiájára és fejlődésére, és könnyen használható legyen a normál mezőgazdasági gyakorlatban.

Számos természetes termék ismert, amely befolyásolja a gének expresszióját. Ezek főleg a természetben előforduló növekedésszabályozók, például az auxinok, citokininek, gibberellinsav, etilén-abszcizinsav [lásd Davies, P. (szerk.), Plánt Hormones and Their Roles in Plánt Growth and Development, Martinus Nijhoff Publ., (1987)], míg más vegyszerek hasonlóan dramatikus hatással rendelkeznek, például a szalicilsav [Hoofl Vanhuijsduijnen et al., J. Gén. ViroL, 67, 235-243 (1986)]. Ha a fentiekben leírt növényi szabályozókat különböző növényekre vagy növényi eredetű sejtekre/szövetekre/szervekre alkalmazzuk, változás figyelhető meg a metabolizmusban, amelyekről kimutatták, hogy legalább részben új génexpressziónak tulajdonítható. Ezeknek a géneknek néhány termékét, valamint a géneket magukat izolálták és jellemezték. Mivel azonban azok a vegyi anyagok, amelyek ezeket a géneket indukálják, általában a növények növekedését és fejlődését szabályozó anyagként működnek, ezért nem lehetnek jelöltek transzgenikus növényekben lévő, kémiailag indukálható gének indukálószereire. Az alkalmasság hiánya közvetlen következménye a nem kívánt pleiotrop hatásoknak, amelyek a növény endogén, hormonérzékeny fejlődési programjának a kiválasztott rekombináns génnel való nem kívánt együtt aktiválásából származnak. Például ha egy idegen gént abszcizinsavval aktiválunk fejlődő növényekben, akkor ez számos nem kívánt hormonhatást indukál, beleértve a növény metabolizmusára gyakorolt negatív hatást is [Milborrow, Β. V., Ann. Rév. Plánt. Physiol., 25, 259-307 (1974)], azaz a növekedési sebesség éles csökkenését, a légzőnyílások bezáródását, valamint a fiatal levelek és gyümölcsök idő előtti eltávolítását. Más fitohormonok hasonló negatív hatással rendelkeznek a növények növekedésére és fejlődésére, ami kizárja alkalmazásukat idegen gének transzformáit növényekben való expressziójának szabályozásában. Egy alaposabb összefoglaló a fitohormonok hatásairól, beleértve az ABA-t, etilént, citokinineket és auxinokat, a következő kiadványban található: Phytohormones and Related Compounds: a Comprehensive Treatise I—II. kötet. Letham, D. S., Goodwin, P. S. és Higgins, T. G. V. (szerkesztők): Elsevier/North Holland (1978).

A potenciálisan vonzó kémiai anyagok között, amelyek alkalmasak lehetnek transzgenikus növényekben gének expressziójának szabályozására, található az általános herbicid ellenanyagok néven ismert vegyületek csoportja, az úgynevezett „safener”-ek. A „safener”-eket funkcionálisan úgy határozzuk meg, mint olyan kémiai anyagok, amelyek képesek egy haszonnövény herbici3

HU 218 717 Β dek toxikus hatásával szembeni tűrőképességét fokozni, ha a növényt „safener”-rel kezeljük. Most úgy tűnik, hogy ezeknek a vegyületeknek a biztonságot biztosító hatása azzal a tulajdonságukkal van összefüggésben, hogy megnövelik a herbicid metabolizmusát a „safener”-rel kezelt növényekben [Sweetser, Ρ. B., Proceedings of the 1985 British Crop. Protection Society ConferenceWeeds. 3, 1147-1153 (1985)]. Például a kukorica és más gabonanövények „safener”-ekkel, például diklóracetamiddal való kezelése megnöveli a tűrőképességüket számos herbiciddel szemben [Lay, Μ. M. and Casida, J. E., Pest. Biochem. Physiol., 6, 442-456 (1976); Parker, C„ Pesticide Science, 14, 533-536 (1983)]. Pontosabban az N,N-diallil-2,2-diklór-acetamid biztonságot biztosító hatása korrelál a glutation-S-transzferázok (GST-k) megnövekedett szintjével, amely enzimekről ismert, hogy detoxifikálnak számos nagy, kibújás előtti, szelektív herbicidcsoportot oly módon, hogy konjugálják őket glutationnal [Mozer et al., Biochemistry, 22, 1068-1072 (1983)]. A GST-aktivitásnak ez a megnövekedése korrelál a GST mRNS állandósult szintjének megnövekedésével a kezelt növényekben, amint azt Wiegand és munkatársai kimutatták munkájukban [Wiegand, R. et al., Plánt Mól. Bioi., 7, 235-243 (1986)]. Tehát a kiválasztott növények „safener”-rel való kezelése megnövelheti egy géntermék állandósult szintjét anélkül, hogy jelentős hatással lennének a növekedésre és a morfológiára.

Kimutatták, hogy a gabonanövényekben a szulfonil-karbamidok metabolikus detoxifikálása sebességének változását számos különböző „safener”-rel való kezeléssel lehet indukálni [Sweetser, Ρ. B., Proceedings of the 1985 British Crop. Protection Society Conference-Weeds. 3, 1147-153 (1985)]. Ennek a felgyorsult metabolikus detoxifikálásnak az eredménye a megnövekedett herbicid tűrőképesség a „safener”-rel kezelt növényekben. Például búzában és kukoricában a klórszulfüron és a metszulfüron-metil metabolizmusának sebességében 2-5-szörös növekedést figyeltek meg, a naftalinsavanhidrid, N,N-diallil-2,2-diklór-acetamid, vagy cyometrinil antidótumok alkalmazása után. Ez a növekedés a szulfonil-karbamid herbicidmetabolizmusában az antidótum adagolása után órákon belül megfigyelhető. Emellett a vegyületek biztonságot növelő hatása nem látható, ha a növényeket a fehérjeszintézist gátló cikloheximiddel kezeljük a „safener” kezelés előtt, jelezve, hogy a növekedés a herbicid metabolizmusában a de novo fehérjeszintézis függvénye. Ez az új fehérjeszintézisétől való függés azt mutatja, hogy a „safener”-rel való kezelés aktiválhatja specifikus nukleáris gének transzkripcióját, és egy „safener”/„safener”-rel indukált gén promoter kombináció létezhet, amely használható lehet transzgenikus növényekbe bejuttatott idegen gének expressziójának szabályozásában. A mai napig azonban még nem írtak le példát egy olyan, transzgenikus növényben lévő indukálható expressziós rendszerre, amely egy „safener’-érzékeny promoter/struktúrgén rekombináns DNS-konstrukciójának „safener” vagy „safener”-szerű vegyület külső alkalmazásával való aktiválásán alapul. Valóban transzgenikus növényekben nincs olyan, egy kiválasztott gén expressziójának külső szabályozásával rendelkező, reális hasznosíthatóságú rendszer, amely kompatibilis a jelenleg használt mezőgazdasági gyakorlattal.

A jelen találmány olyan DNS-promoterfragmentekre összpontosít, amelyek gabonatermés herbicid „safener”-jeivel indukálható növényfajokból származnak. Ezeket a promotereket arra használták, hogy egy „safener”/”safener”-rel indukálható génrendszert dolgozzanak ki a transzformált növényekben lévő idegen gének expressziójának szabályozására. Ez a rendszer azért hasznos, mert képes a kiválasztott gének kívülről való szabályozására transzgenikus növényekben a szántóföldön. Előnyei közé tartozik, hogy ezek közül a promoterek közül néhány magas szintű aktivitással rendelkezik a megfelelő indukáló vegyszer alkalmazására adott válaszként, valamint az, hogy az idáig vizsgált összes növényi szövetben látszólag expresszálódnak ezek a promoterek, valamint hiányoznak a pleiotrop hatások, amiket a növények ezekkel a vegyületekkel való kezelésére mutathatnának.

Ebért és munkatársai [Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 84, 5745-5749 (1987)] a nopalin szintetáz promotert tartalmazó DNS aktív fragmentjét tanulmányozták. Ez a promoter inkább konstitutív mint indukálható, és annak ellenére, hogy baktérium eredetű, sok különböző növényi szövetben működik. Egy olyan konstrukciót készítettek, amelyben a promoter a klór-amfenikol-acetil-transzferáz (CAT) reportergén expresszióját szabályozza. A szerzők közölték, hogy a DNS-nek egy 33 bp méretű ffagmentja (-97--130) elegendő volt a CAT-gén expressziójának kiváltására. Azt is leírták továbbá, hogy ha a fragment két másolatban fordul elő, akkor ez megháromszorozza a CAT-gén expresszióját. Ezek a stabilan transzformált dohányszövetből származó eredmények megismételhetők voltak tranziens vizsgálatokban, dohányprotoplasztokat alkalmazva. A tranziens expresszióban, valamint a stabilan transzformált dohányprotoplasztokban és -szövetekben mért CAT-aktivitás szintjének összehasonlítása különbségeket mutatott, ha a gének expresszióját a 33 bp méretű fragment szabályozta. A szerzők mindenesetre azt a véleményüket fejezték ki, hogy az ilyen tranziens vizsgálatok hasznosak a promoterszekvenciák stabil transzformációs rendszerekben végzett vizsgálatokban. Azonban a nopalin szintetáz promotemek egy struktúrgénhez való kapcsolása a transzformált növényben a géntermék konstitutív expresszióját eredményezi, ezzel kizárja az alkalmazását a génexpresszió külső szabályozásában.

A kukorica-alkohol-dehidrogenáz (Adh I) génje anaerob indukciójának vizsgálatát az Adh I génfragmenteknek szuszpenziós tenyészetből származó protoplasztokba való elektroporációjával végezték [Howard et al., Planta, 170, 535 - 540 (1987)]. A transzformált protoplasztokat csökkentett oxigénszintnek vetették alá, és 20 órával később vizsgálták az Adh I expresszióját. Az anaerobiózis által indukált Adh I génexpresszió mérésének megkönnyítése céljából a természetes Adh I gén 5’-promoterét vagy szabályozószakaszát (1096 bázis4

HU 218 717 Β pár) működésileg a CAT-génhez kapcsolták. Eredményeik az egyszikű kukoricából származó indukálható Adh I promoter/CAT-gén (például Adh I) anaerob szabályozását mutatják homológ sejttenyészetrendszerból származó protoplasztokban. Azt is kimutatták, hogy az Adh I promoterfragment, az Adh I gén kódoló és 3’-régiója nélkül is elegendő az idegen kódoló régió anaerob indukálására kukoricaprotoplasztokban.

Más kutatók [Lee et al., Plánt Physiology, 85, 327-330 (1987)] tovább közelítették a kukorica Adh I génje anaerob indukciójáért felelős DNS-ffagment méretét. Ezek a kutatók kukoricaprotoplasztokat transzformáltak egy rekombináns génnel, amely egy Adh I szabályozása alatt álló CAT kódoló régióból állt, és 24 órával később mérték a CAT termelődését. A konstrukcióban használt promoterfragment hosszának a módosításával Lee és munkatársai meghatározták, hogy a transzkripciós starthely előtti (5’-irányban lévő) 146 bp elegendő ahhoz, hogy a CAT expresszióját anaerob indukció alá helyezzük. A CAT expressziója azonban 5 χ, illetve 8 χ nagyobb, ha hozzáadjuk a 266, illetve 955 bp régiót az egybefüggő promoterszekvenciából.

Walker és munkatársai [Walter et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 84, 6624-6628 (1978)] tranziens vizsgálatokkal folytatták a kukorica Adh I génjének anaerob módon indukált génexpressziójához szükséges, a promoterrégióban lévő DNS-szekvencia tanulmányozását. Meghatározták, hogy a génexpresszió anaerob indukciójának szabályozása a promoter két szekvenciájától függ: a -133 és -124 bp közötti szekvenciától, valamint a -113 és -99 bp közötti szekvenciától (5’-irányban a transzkripciós starthelytől). Mindkét szekvenciára szükség van az indukcióhoz. A teljes 40 bp méretű elemnek egy nem rokon virális promoterhez való kapcsolásával előnyös lehet mérni a kiméra promoter anaerob szabályozását.

Mások kimutatták, hogy a CAT-gén expressziójának rendkívül alacsony szintje figyelhető meg megfelelő anaerob körülmények között, ha a kukorica Adh I génjének a -1094 és +106 bp közötti DNS-fragmentjét használjuk a CAT-gén expressziójának szabályozására stabilan transzformált dohánysejtekben [Ellis et al., EMBO Journal, 6, 11-16 (1987)]. Valójában csak CAT hírvivő RNS volt megfigyelhető. Azonban a baktériumok oktopin szintetáz génjéből vagy a karfiol-mozaikvírusból (CaMV) származó promoterelemek az Adh I promoterhez kapcsolva stimulálták a CAT-gén expresszióját, és lehetővé tették a CAT kimutatását az anaerob indukció után. Az Adh I struktúrgén transzkripciós starthelyétől 5’-irányban lévő szomszédos, 247 bp méretű DNS-fragment elegendő volt ahhoz, hogy a CATgén expresszióját anaerob szabályozás alá helyezze. Ennélfogva a 247 bp méretű DNS-fragment által végzett anaerob szabályozás fennmaradt, még akkor is, amikor az oktopin szintetáz és a CaMV ³⁵S promoterek (amelyek konstitutív promoterek) voltak jelen. A Howard és munkatársai, Lee és munkatársai és Walker és munkatársai által tranziens vizsgálati módszerekkel kimutatott anaerob indukcióért felelős Adh I promoterrégiók hasonlók és azonosak voltak azzal a régióval, amely anaerob indukciót mutatott stabilan transzformált növényekben (Ellis és munkatársai).

Szabadalmakat adtak meg állati és mikrobiális rendszerekben, amelyekben a kiválasztott génszekvencia expresszióját olyan vegyi anyagokkal indukálták, amelyek bizonyos szabályozószakaszokkal léptek kölcsönhatásba. A Palmiternek és Brinsternek megadott 4 579 821 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban közük az egér metallotionein-I génje promoter/regulátor szekvenciájának izolálását, valamint alkalmazását kiválasztott, a promoterhez kapcsolt DNSszekvenciák expressziójának szabályozásában, nehézfémionok vagy szteroid hormonok hatásának kitéve. A metallotionein-I promoterhez fuzionált timidin-kináz expresszióját felnőtt egerek differenciálódott sejtjeiben érték el kalcium vagy dexametazon adagolásával. A Nakatának és Shinagaua-nak megadott 4 703 005 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban közük a foszfátkötő fehéije (phoS) egy génjének az izolálását, amelyhez a phoS után 3’-irányban egy idegen gént fuzionáltattak. Az idegen gént a táptalajban lévő foszfáttal szabályozzák. Azonban egyik említett szabadalomnak sincs potenciális használhatósága a szántóföldön. A metallotionein promotert aktiváló nehézfémionok egyrészt mérgezők a növényekre, másrészt komoly környezeti veszélyt jelentenek a termőföldön. Hasonlóképpen a tápanyagokra, például a foszfáthiányra válaszoló promotereknek nincs jelentőségük, mivel a növénynek a termőföldön a normális növekedéshez ezekből a tápanyagokból egy állandó szintre van szükségük.

Számos kísérletet közöltek, amelyben megpróbálták a gének expresszióját transzgenikus növényekben szabályozni. A 159 884 számú európai szabadalmi leírásban közük négy hősokk fehérje izolálását szójababból, és védik felhasználásukat idegen gének transzgenikus növényekben való expressziójának szabályozására. A bejelentésben a szerzők védik ezeknek a promotereknek a felhasználását arra, hogy időlegesen expresszálják idegen gének, például a Bacillus thuringiensis kristályos toxikus fehérje struktúrgénjének vagy egy herbicidrezisztencia génnek az expresszióját in vivő hőstresszre adott válaszként. Ez azonban az ilyen hősokk promoterekhez kapcsolt gén expresszióját a napi hőmérsékletnek a termőföldön való változásához kapcsolja.

Marcotte és Quatrano [J. Cellular Biochem. Supplement 12C, (1980); Marcotte, W. R., Bayley, C. C. and Quatrano, R. S., Natúré, 335, 454-457 (1988)] közöltek kezdeti eredményeket olyan kiméra géneknek az indukálhatóságáról, amelyeknek a transzkripcióját két, búzából származó, abszcizinsavval (ABA)-indukálható génből (Em és egy 7S globulin) származó promoterfragment szabályozza. Ezeknek a géneknek e termékeiről igazolták, hogy az egész növényben indukálhatok ABA hozzáadásával. Az indukciót, legalábbis részlegesen, a transzkripció szintjén igazolták. Egy Em genomiális klón 5 ’-régiójából származó, különböző hosszúságú promoterfragmenteket transzláció szempontjából fuzionáltattak egy bakteriális β-glükoronidáz (GUS) kódoló régióhoz, amelyet egy CaMV ³⁵S transzkriptum

HU 218 717 Β poliadenilezési helyéhez kapcsoltak. Az ezeknek a különböző hosszúságú promoterfragmenteknek az alkalmazásával kapott GUS-aktivitás AB A-val való indukálhatóságát tranziens expressziós mérésekben vizsgálták mind egyszikű (rizs), mind kétszikű (dohány) protoplasztokat alkalmazva. Ezek azt mutatták, hogy az Em kódoló régió előtti régiók (650 bp) és a 7S globulint kódoló régiók (1800 bp) tartalmaznak olyan szekvenciákat, amelyek elegendők a GUS-aktivitás rizsprotoplasztokban tranziens vizsgálatokban való, ABA-val szabályozott expressziójához. Az Em promoter nem mutatott semmi reagálóképességet a kétszikű tranziens expressziós vizsgálatokban, jelezve, hogy a promoter esetleg nem működik a kétszikű növényfajokban. Amint azt azonban ennek a munkának egy előző részében részletesen megtárgyaltuk, a teljes növényekre a termőföldön a fitohormonok alkalmazásából (beleértve az ABA-t) származó, nem kívánt pleiotrop hatások indukciója kizárja ezeknek a vegyületeknek az alkalmazását gének expressziójának szabályozására transzformált növényekben.

A Dee Danske Sukkerfarb A/B 2 187 462 számú angol szabadalmának tárgya eljárás hüvelyes növények nitrogénkötő rendszerének javítására oly módon, hogy az érdekes gének expresszióját egy gyökér/gumó specifikus génből származó promoterrel szabályozták. Pontosabban a feltalálók kimutatták, hogy egy szójabab hemoglobin génből származó, promoterrel meghajtott klór-amfenikol-acetil-transzferáz- (CAT) gén indukálható transzformált növények gyökereiben, hasonlóan más gyökérspecifikus, a gumóképzés által érintett génekhez. A módszert erősen korlátozza, hogy a gének indukcióját a gumóképződés szimulálása korlátozza, és az indukció gyökérspecifikus. Ezáltal nem szolgáltathat egy igazi eszközt arra, hogy kívülről szabályozzuk gének expresszióját bármely időpontban, termőföldön növekedő transzformált növények összes szöveteiben.

A mai napig nem írtak le gyakorlati módszereket arra, hogy idegen gének transzgenikus növényekben való expresszióját kívülről szabályozzák oly módon, hogy az összeegyeztethető legyen a normális mezőgazdasági gyakorlatban alkalmazottakkal. Jóllehet közöltek olyan növényi promoterszekvenciákat, amelyeket fénnyel, hővel, anaerob stresszel, valamint fitohormonokkal lehet stimulálni, nem közöltek olyan specifikus indukálható promotereket, amelyek kémiai anyagokra reagálnak, és az alapját képezhetnék a génexpresszió szabályozása gyakorlati módszerének növényekben, a vegyi anyag termőföldön való alkalmazásával. Jelenleg világos igény mutatkozik ilyen promoterszekvenciákra rekombináns DNS-konstrukciókban való alkalmazás céljából, amelyek lehetővé tennék, hogy a megfelelő időben expresszálódva mezőgazdasági előnyöket biztosító gének expresszióját kívülről szabályozzuk. Emellett az expressziónak ez a specifitása kellene, hogy felelős legyen a kívülről való szabályozásért azáltal, hogy a növényeket olyan kémiai anyagoknak tesszük ki, amelyek könnyen alkalmazhatók különböző kezelési módokkal, és amelyek csak a megcélzott gén expresszióját indukálják.

Gyakorlati eljárást fedeztünk fel kiválasztott gének expressziójának szabályozására transzformált növényekben és növényi szövetekben kémiai anyagok alkalmazásával. A jelen találmány tárgya kukoricából, dohányból és petúniából származó nukleinsav promoterffagmentek és utánuk álló szekvenciák, amelyek expressziója számos benzolszulfonamidra és vegyületre reagál. Ezeket a nukleinsav promoterffagmenteket rekombináns DNSkunstrukciókba építjük, amelyek nem növényi eredetű struktúrgéneket tartalmaznak. Növényeket ilyen konstrukciókkal transzformálva kimutattuk, hogy a struktúrgén expressziójának szintjét kémiai kezeléssel lehet szabályozni. Pontosabban a jelen találmány egyik tárgya az (I-IX) általános képletű vegyületek egyikével szabályozható nukleinsavfragment, amelyekben

X jelentése hidrogén-, fluor-, klór-, brómatom, trifluor-metil- vagy 1 -2 szénatomos alkilcsoport,

X^I jelentése hidrogén-, fluor-, klóratom, 1-2 szénatomos alkilcsoport, -SO2NR'R² vagy -CO2R' általános képletű csoport,

Y jelentése hidrogén-, fluor-, klóratom, -SO₂NRiR2, -CO₂Rk -NO₂ vagy -P(O)(OR>)₂ általános képletű csoport,

R jelentése hidrogénatom, 1-6 szénatomos alkil-, 3-6 szénatomos cikloalkil-, benzil-, 2-4 szénatomos halogén-alkil-csoport vagy 1-2 szénatomos alkoxi- vagy 1 -2 szénatomos alkil-tio-csoporttal helyettesített 2-4 szénatomos alkilcsoport,

R¹ jelentése 1-3 szénatomos alkilcsoport,

R² jelentése 1-3 szénatomos alkilcsoport,

R³ jelentése -CO₂R² általános képletű csoport,

R⁴ jelentése 1-6 szénatomos alkil- vagy 3-6 szénatomos cikloalkilcsoport,

R⁵ jelentése 1-3 szénatomos alkoxi- vagy -NR⁶R⁷-csoport;

R⁶ jelentése hidrogénatom, metoxi-, 1-4 szénatomos alkil-, 3-6 szénatomos cikloalkilcsoport vagy 1-2 szénatomos alkoxi- vagy etoxi-etoxicsoporttal helyettesített 1-4 szénatomos alkilcsoport, és

R⁷ jelentése hidrogénatom vagy 1-2 szénatomos alkilcsoport, valamint ezeknek a mezőgazdaságban alkalmazható sói, amely promoterfragmenttel transzformált növényben az (I)—(IX) általános képletű vegyületek bármelyike az említett promoterffagmenthez működőképesen kapcsolt kiválasztott génterméket kódoló DNS-szekvencia expressziójának fokozódását idézi elő.

Az előnyösen használható nukleinsav promoterfragmenteket növényekből nyeljük ki, míg az előnyösebben használható nukleinsav promoterffagmenteket egyszikű növényekből nyerjük ki, beleértve a kukoricát, zabot, kölest, búzát, szalmát, árpát, cirokot, taréjfüt, hagymát, aszparáguszt és cukornádat, valamint a következő csoportból választott kétszikű növényekből nyerhetjük ki: alfalfa, szójabab, petúnia, gyapot, cukorrépa, napraforgó, répa, zeller, káposzta, uborka, bors, canola, paradicsom, burgonya, lencse, len, brokkoli, dohány, bab, saláta, olajrepce, karfiol, spenót, articsóka, borsó, gomba,

HU 218 717 Β tök, kelkáposzta, amerikai kelkáposzta, tea és kávé. Legelőnyösebbek azok a nukleinsav promoterfragmentek, amelyeket kukoricából nyertünk ki, főleg a 2-1., 2-2. és 5-2. számú cDNS-klónok.

Az aktivitás vagy a szintézis egyszerűsége alapján előnyösek azok az (I) általános képletű vegyületek, amelyekben

X jelentése hidrogénatom vagy 2-es helyzetű klóratom,

Y jelentése 3-as helyzetű klóratom vagy - SO₂N(CH₃)₂-csoport,

R jelentése hidrogénatom, 1-6 szénatomos alkilcsoport vagy 5-6 szénatomos cikloalkilcsoport, és a (II) általános képletű vegyületek, amelyekben

R jelentése 1-4 szénatomos alkilcsoport vagy 5-6 szénatomos cikloalkilcsoport,

R⁴ jelentése 1 -4 szénatomos alkilcsoport, és a (III) általános képletű vegyületek, amelyekben

R³ jelentése az 1. igénypontban megadott,

R⁵ jelentése metoxi- vagy -NR⁶R⁷ általános képletű csoport,

R⁶ jelentése hidrogénatom vagy 1 -4 szénatomos alkilcsoport és

R⁷ jelentése hidrogénatom.

Azokkal a rekombináns DNS-konstrukciókkal, amelyeknek az expresszióját a 2-1 promoter szabályozza, a következő vegyületek használhatók előnyösen: N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamid, 2-klór-N-(metil-amino-karbonil)-benzolszulfonamid, l-(n-butil)-3-metil-szulfonil-karbamid, l-ciklohexil-3-(metil-szulfonil)karbamid, dietil-[[2-(butil-amino-karbonil)-amino-szulfonil]-fenil]-foszfonát, metil-l-[amino-karbonil]aminoszulfonilj-benzoát, 2,3-diklór-N-[(ciklopentil-amino)karbonilj-benzolszulfonamid, és N-(amino-karbonil)2,3-diklór-benzolszulfonamid. Legelőnyösebb az N(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamid.

Még előnyösebb, ha azokkal a rekombináns DNSkonstrukciókkal, amelyeknek az expresszióját a 2-2 promoter szabályozza, a következő vegyületeket használjuk : dietil-[[2-(butil-amino-karbonil)-amino-szulfonil]fenilj-foszfonát, az N’-[2-(n-butil-amino-karbonil)]-6klór-N,N-dimetil-1,2-benzol-diszulfonamid, N-izopropil-karbamoil-benzolszulfonamid, 2-klór-N-(metil-amino-karbonil)-benzolszulfonamid, 2,5-diklór-acetanilid, N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamid és az 1ciklohexil-3-(metil-szulfonil-karbamid). A legelőnyösebb a dietil-[[2-[(butil-aminoxi-karbonil)-amino-szulfonil]-fenil]-foszfát.

Még előnyösebb, ha azokkal a rekombináns DNSkonstrukciókkal, amelyeknek az expresszióját az 5-2 promoter szabályozza, a következő vegyületeket használjuk: 2-klór-N-(metil-amino-karbonil)-benzolszulfonamid, l-(n-butil)-3-metil-szulfonil-karbamid, metil-2-[(amino-karbonil)-amino-szulfonil]-benzoát, N-izopropil-karbamoil-benzolszulfonamid, N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamid és az N’-[2-(n-butil-amino-karbonil)]-6-klór-N,N-dimetil-1,2-benzol-diszulfonamid. Legelőnyösebb a 2-klór-N-(metil-amino-karbonil)benzolszulfonamid.

A jelen találmány tárgya továbbá egy nukleinsav promoterfragment, amely lényegében specifikus cDNS-klónokkal homológ gének 5’-határoló promoterrégióinak egy nukleotidszekvenciáját tartalmazza, és az említett fragmenttel transzformált növényeket az (I)—(IX) általános képletű vegyület hatásának kitéve, az említett promoterfragment 3’-végéhez működésileg illesztett, kiválasztott géntermékeket kódoló DNS-szekvenciák expressziójának megnövekedését okozza. Előnyösek azok a gének, amelyek kukoricából származnak, és a 2-1, 2-2, 218 vagy 5-2 cDNS-klónokkal homológok; petúniából származnak és a P6.1 cDNS-klónnal homológok; valamint dohányból származnak és a T2.1 cDNS-klónnal homológok. Az (I)—(IX) általános képletű vegyületek hatásának kitéve, a kiválasztott géntermékeket kódoló DNSszekvenciák expressziójának szabályozására legelőnyösebb nukleinsav promoterfragmentek azok, amelyek a kukorica 2-2 génjéből származnak.

A jelen találmány tárgya továbbá egy rekombináns DNS-konstrukció, amely képes egy növényt transzformálni, tartalmaz egy, a találmány szerinti promoterfragmentet, egy kiválasztott génterméket kódoló DNS-szekvenciát működésileg az említett promoterfragmenthez kapcsolva, valamint egy megfelelő 3’-régiót, ezáltal az említett transzformált növényt egy, az (I)—(IX) általános képletű vegyület hatásának kitéve, egy kiválasztott géntermékre nézve az említett DNS-szekvencia megnövekedett expresszióját kapjuk. A kiválasztott géntermékeket kódoló előnyös DNS-szekvenciák a következők: a β-glükoronidázt kódoló gének, herbicidrezisztenciát, például mutáns acetolaktát-szintetázt és 5-enolpiruvil-sikimát-3-foszfát szinteázt kódoló gének, rovarrezisztenciát kódoló gének, proteáz inhibitorokat kódoló gének, Bacillus thuringiensis inszekticid endotoxinokat kódoló gének, fítohormon bioszintetikus enzimeket kódoló gének, auxin bioszintetikus enzimeket kódoló gének, citokinin bioszintetikus enzimeket kódoló gének, gibberellin bioszintetikus enzimeket kódoló gének, kitinázokat kódoló gének, olajtermelésben szereplő bioszintetikus enzimeket kódoló gének, restrikciós endonukleázokat kódoló gének, keményítő bioszintézis és/vagy lebontó enzimeket kódoló gének, hím sterilitás/fertilitás fenotípust kódoló gének, valamint transzpozonokat és/vagy transzprocesszorokat kódoló gének.

A jelen találmánynak még további tárgyai olyan növények, amelyeket a találmány szerinti rekombináns DNS-konstrukcióval transzformáltunk, és az említett transzgenikus növényeket az (I)—(IX) általános képletű vegyületnek kitéve az említett promoterfragment 3’-végéhez működőképesen kapcsolt, kiválasztott génterméket kódoló DNS-szekvencia megnövekedett expresszióját kapjuk. Az ilyen transzgenikus növények magvai is a jelen találmány oltalmi körébe tartoznak.

A találmány végső tárgya eljárás kiválasztott géntermék megnövekedett expressziójának kiváltására egy növényben, amely a következő lépéseket tartalmazza:

(a) az említett növényt egy, az előzőekben ismertetett rekombináns DNS-konstrukcióval transzformáljuk;

(b) a transzgenikus növényt egy (I)—(IX) általános képletű vegyület hatásának tesszük ki, és

HU 218 717 Β (c) az említett transzgenikus növénynél előidézzük, hogy az említett kiválasztott géntermék expresszióját megnövelje egy kiválasztott időpontban.

Az ábrák rövid ismertetése

Az 1. ábrán látjuk a jelen találmány egy előnyös megvalósítási módjának fő lépéseit.

A 2. ábrán a 21.14 jelű génből származó 2-1 génpromoter nukleotidszekvenciáját láthatjuk.

A 3. ábrán a 12.14 kukoricagénből származó pJE481-l (Ncol) és pJE484-62 (Xbal) plazmidok előállítását láthatjuk.

A 4. ábrán a 2-2 gén szubklónozását látjuk, jele 2-2 4, valamint a 2-2 4 génből származó promoter nukleotidszekvenciáját.

Az 5. ábrán az 51.422 jelű génből származó 5-2 gén promoterének nukleotidszekvenciáját látjuk.

A 6. ábrán az 5-2 kukoricagénből származó pMC75. j5 plazmid készítését látjuk.

A 8. ábrán a P6.1 jelű génből származó petúnia P6 gén 1-es promoter nukleotidszekvenciáját és a transzkripciós starthelyet látjuk.

A 9. ábrán a P614 és P654 plazmidok készítését látjuk.

A 10. ábrán a T217 plazmid készítését látjuk.

All. ábrán a pJE516 plazmid készítését látjuk.

A 12. ábrán a pHPH220 plazmid készítését látjuk.

A 13. ábrán a pTDS130 és pTDS133 plazmidok készítését látjuk.

A 14. ábrán a pTDS134 plazmid készítését látjuk.

A 15. ábrán a pTDS231 plazmid készítését látjuk.

A 16. ábrán a 21.14 gén promoterének nukleotidszekvenciáját látjuk, jelezve a promoterben tett deléciók helyét.

A 17. ábrán a pMC715. 83 plazmid készítését látjuk.

A 18. ábrán a pMC7113 plazmid készítését látjuk.

A 19. ábrán a P655, P657 és P658 plazmidok készítését látjuk.

A 20. ábrán a P660 plazmid készítését látjuk.

A 21. ábrán a 443-as promoter nukleotidszekvenciáját látjuk.

A 22. ábrán a 463-as promoter nukleotidszekvenciáját látjuk.

A 23. ábrán a 478-as promoter nukleotidszekvenciáját látjuk.

A 24. ábrán a 420-as promoter nukleotidszekvenciáját látjuk.

A 25. ábrán a P627 plazmid készítését látjuk.

A 26. ábrán az RN-áz protekciós analízis eredményeit látjuk, amelyek igazolják a P6.1 gén N-(aminokarbonil)-2-klór-benzolszulfonamidos indukcióját.

A 27. ábrán a P656, P661, P662 és P663 plazmidok készítését látjuk.

A 28. ábrán a pJE518 és pJE519 plazmidok előállítását látjuk.

Az ábrák szövegét az alábbiak szerint adjuk meg:

Az 1. ábra mondanivalója a következő :

1. A palántákat hidroponikusan növesztjük.

2. A növények felének hidroponikus táptalajához N(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamidot adunk, és hat óra hosszat növesztjük.

3. A kezelt és kezeletlen növények gyökereiből mRNS-t izolálunk.

4. A kezelt növényekből izolált mRNS-ből cDNSkönyvtárat készítünk, és a könyvtárról replikákat készítünk.

5. A kezelt és kezeletlen gyökér RNS-ekből készült cDNS-könyvtárak másolatait ³²P-DNS-sel vizsgáljuk át, így izoláljuk azokat a kiónokat, amelyek az N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamiddal indukált szekvenciákat tartalmazzák.

6. Kukorica genomiális könyvtárat készítünk.

7. A cDNS-klónt használjuk a megfelelő, kémiailag indukált gének izolálására.

8. Meghatározzuk a cDNS-klón és a gén szekvenciáját, azonosítjuk a promotert és a gén eltávolítandó 3’-downstream régióját.

9. A klónozás céljára megfelelő restrikciós helyeket adunk hozzá, ha szükséges, és rekombináns gént készítünk, működés szempontjából összekapcsolva a β-glükoronidáz régiót a promoterrel és az indukálható gén 3’-downstream régiójával.

10. A rekombináns géneket növényekbe transzformáljuk.

11. Megvizsgáljuk a növényekben a rekombináns gén N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamiddal indukálható expresszióját.

A találmány részletes leírása

A jelen találmány tárgyai DNS-promoterfragmentek, amelyek alkalmasak arra, hogy kiválasztott géntermékeket kódoló DNS-szekvenciák transzgenikus növényekben való expresszióját kívülről alkalmazott vegyi anyagokkal szabályozhatóvá tegyék. A jelen találmányban leírt promoteríragmentek kukorica-, dohány- és petúniagénekből származnak, amelyekről kiderült, hogy erősen indukálhatok számos helyettesített benzolszulfonamiddal, valamint gyengén indukálhatok számos, kereskedelmi forgalomban lévő herbicid antidótummal. A géntermék expresszióját a transzgenikus növény megfelelő indukálóvegyülettel való kezelésével érjük el.

A találmány végrehajtásához cDNS-könyvtárakat készítünk az (I) általános képletű N-(amino-karbonil)2-klór-benzolszulfonamiddal, amelyben X jelentése Hatom, Y jelentése Cl-atom, R jelentése H-atom, hidroponikusan kezelt növények gyökereiből kinyert RNS-ből. A könyvtárakat differenciáltan vizsgáljuk át egy olyan stratégiát alkalmazva, amelyet arra terveztek, hogy azokat a kiónokat azonosítsák vele, amelyek olyan mRNS-molekulákat jelentenek, amelyeknek állandósult szintje megemelkedik az ezzel a vegyülettel való kezelés hatására. Ezeket a cDNS-molekulákat azután jellemezzük, és hibridizációs próbákként alkalmazzuk, hogy izoláljuk a megfelelő növényi genomiális DNS-ből az(oka)t a gén(eke)t, amelyek az indukált RNS-(eke)t kódolják. A cDNS-ekből és a megfelelő genomiális kiónokból származó nukleotidszekvenciák összehasonlítása lehetővé tette minden egyes génnél a feltételezett promoter, struktúrgén és 3’-régiók azonosítását. Az ezekből a régiókból származó promoterrégiókat tartalmazó DNS-fragmenteket izoláljuk, majd működőképesen idegen kódoló régiókhoz kapcsoljuk,

HU 218 717 Β hogy új, kémiailag indukálható géneket állítsunk elő. Poliadenilezési jeleket tartalmazó megfelelő 3'-régiókat adunk a promoter/kódoló régió fúziókhoz, hogy befejezzük a kémiailag indukálható rekombináns gének készítését. Ezeket a géneket azután mind növényekbe, mind növényi eredetű szövetekbe transzformáljuk. Az ezekkel a DNS-konstrukciókkal transzformált és N(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamiddal kezelt növények és növényi szövetek vizsgálata igazolta, hogy ezek a promoterek működnek transzgenikus növényekben, és megtartják külső kémiai ingerlésre való reagálóképességüket.

Mivel három eltérő növényfaj génjeiről is azt találtuk, hogy számos, (I)—(IX) általános képletü vegyülettel indukálható promoterrel rendelkeznek, ezért valószínű, hogy számos növényfaj rendelkezik olyan promoterekkel, amelyek reagálnak az ebbe a vegyülettípusba tartozó kiválasztott vegyületekkel. Ennélfogva az elvárható, hogy a találmány érvényes az előzőekben leírtaktól eltérő promoterek alkalmazására mindaddig, amíg a promoter expressziója reagálóképes a jelen találmányban meghatározott vegyületekre. Várható valóban, hogy a találmány szerinti eljárás végrehajtható olyan génekből származó promotereket alkalmazva, amelyek az (I)—(IX) általános képletü vegyületekkel indukálhatok, és bármely prokarióta vagy eukarióta fajból izolálhatok.

A jelen találmányban ismertetett promotereket tovább lehet módosítani, ha szükséges, hogy megváltoztassuk expressziós jellemzőiket. Várható, hogy egy kis DNS-ffagment nyerhető ki egy kémiailag indukált promoterből, amely felelős az illető promoter kémiai ingerelhetőségére. Ezt a ffagmentet kombinálhatjuk más promoterekből származó megfelelő régiókkal, hogy olyan rekombináns promotereket állítsunk elő, amelyeknek az expressziós szintje megnövelhető transzformáit növényekben az (I)—(IX) általános képletü vegyületekkel való kezeléssel. Például a 4. ábra 264-340-es bázisainak megfelelő 77 bp méretű ffagmentet, amely úgy tűnik, hogy szükséges a 2-2 promoter kémiai reagálóképességéhez, beépíthetjük magspecifikus promoterekbe, például β-konglicin vagy fazeolin promoterekbe, ezzel olyan kiméra promotereket állítva elő, amelyek kémiailag indukálhatók, és csak a fejlődő magvakban aktívak. Hasonlóképpen tetszőleges számú kiméra promoter állítható elő oly módon, hogy egy, bármely igénypontban szereplő promoterben lévő DNS-fragmentet, amely elegendő ahhoz, hogy kémiai indukálhatóságot biztosítson, hozzáiigálunk egy promoterhez, hogy más specifitással rendelkező promotereket állítsunk elő, például szövetspecifíkus promotereket, fejlődés során szabályozott promotereket, fénnyel szabályozott promotereket, stresszre válaszoló promotereket, hormonra reagáló promotereket és így tovább. Ez eredményezheti olyan kiméra promoterek előállítását, amelyek képesek géntermékek expresszálására bármely növényi szövetben vagy szövetek kombinációjában, a növény életciklusának bármely specifikus időpontjában kémiai kezelésre adott válaszként.

Az alábbiakban ismertetett kémiailag indukálható promoterek közé tartoznak az említett promoterek lehetséges variációi, például a promoterek deléciójából, átrendeződéséből, véletlen vagy szabályozott mutageneziséből származók, az idegen operátorrégiókhoz való ligálással kapott promoterek a bármely forrásból, például a ³⁵S karfiol mozaikvírus transzkriptumok enhanszerszerű elemeiből stb. származó enhanszerszerű elemekhez (transzkripciós aktivátorok) ligáit promoterekből.

Az a vélemény, hogy bármely olyan 3’-régió, amely képes egy poliadenilezési jelet és más, egy mRNS helyes expressziójához és processzálásához szükséges szabályozószekvenciát biztosítani működőképesen struktúrgén 3’-végéhez kapcsolva, képes a találmány kivitelezésére. Ez magában foglalja egy homológ gén természetes 3’-végét, amelyből a kémiailag indukálható promoter származik, egy másik fajban ugyanazt a fehéijét kódoló heterológ génből származó 3’-vég, a 3’-vég vírus génekből, például a karfiol-mozaikvírus ³⁵S és ¹⁹S transzkriptumok 3’-vége, az Agrobacterium tumefaciens opin szintézis génjeinek 3’-vége, a CAB- vagy RUBISCOgének 3’-vége vagy bármely más forrásból származó 3'-szekvenciák úgy, hogy a használt szekvencia szolgáltatja a szükséges szabályozóinformációt a nukleinsavszekvencián belül, ennek eredménye a hozzá működésilég kapcsolt promoter/kódoló régió kombináció helyes expressziója.

Mivel az ebben a munkában leírt különböző gének transzkripciós starthelyeit még meg kell határozni az összes promoterre, a konstrukcióban használt különböző promoterffagmentek nukleotidpozíciója vagy az adott gén által kódolt fehérje transzlációja iniciáló-ATG-kodon A csoportjától mint 1-es nukleotidtól van meghatározva, vagy az aktuális transzkripciós starthelytől mint 1-es nukleotidtól van meghatározva. Az 1-es nukleotidtól 5'-irányban lévő nukleotidokat szekvenciálisán, -1től kiindulva számozzuk. Az érthető és várható, hogy az összes ilyen promoterffagmentben lévő transzkripciós starthely és transzlációs starthely közötti DNS-szekvencia, azaz a gének által kódolt mRNS-ek 5’ nem transzlálódó leaderszekvenciáit tartalmazó régió helyettesíthető más génekből származó más 5’ nem transzlálódó leaderszekvenciákkal anélkül, hogy az érintené a kapott DNSkonstrukciók kémiai indukálhatóságát.

Ennek a leírásnak a szövegében számos szakkifejezést használunk. Az alábbiakban a „promoter” és „promoterrégió” szakkifejezés olyan DNS-szekvenciára vonatkozik, általában 5’-irányban egy struktúrgén kódoló szekvenciájától, amely a kódoló régió expresszióját szabályozza, oly módon, hogy az RNS-polimeráz és/vagy más faktorok számára felismerési helyet biztosít, amelyek ahhoz szükségesek, hogy a transzkripció a megfelelő helyen kezdődjön. A promoterszekvenciák szükségesek, de nem mindig elegendők az adott gén expressziójának vezérlésére. A „promoterfragment” szakkifejezés jelentése a promoterrégió DNS-szekvenciájának egy frakciója. A „nukleinsav” szakkifejezés jelentése egy nagy molekula, amely lehet egyszálú vagy kétszálú, monomerekből (nukleotidok) áll, cukrot, foszfátot és/vagy purint vagy pirimidint tartalmaz. Magasabb rendű növényekben a dezoxiribonukleinsav (DNS) a genetikai

HU 218 717 Β anyag, míg a ribonukleinsav (RNS) a DNS-információ fehérjékké való transzlációjában vesz részt. A „nukleotidszekvencia” szakkifejezés DNS vagy RNS-polimerre vonatkozik, amely lehet egyszálú vagy kétszálú, adott esetben tartalmazhat szintetikus, nem természetes vagy megváltoztatott nukleotidbázisokat, amelyek képesek DNS vagy RNS-polimerekbe beépülni. A továbbiakban a „kiválasztott géntermék DNS-szekvenciája” szakkifejezés olyan DNS-szekvenciára vonatkozik, amely egy specifikus RNS transzkriptumot kódol. A „megfelelő szabályozószekvencia” szakkifejezés olyan nukleotidszekvenciára vonatkozik, amely 5’-irányban belül, és/vagy 3’-irányban található egy kiválasztott géntermék DNS-szekvenciájához viszonyítva, amelynek transzkripcióját és expresszióját a szabályozószekvencia irányítja potenciálisan a sejt bioszintetikus apparátusával kölcsönhatásban. Az „RNS transzkriptum” olyan termékre vonatkozik, amely egy DNS-szekvencia RNS-polimeráz által katalizált transzkripciójából származik. Az RNS transzkriptum lehet tökéletes komplementer másolata a DNS-szekvenciának, és primer transzkriptumként hivatkozunk rá, vagy lehet egy olyan RNS-szekvencia, amely a primer transzkriptum poszttranszlációs processzálásából származik, és érett RNS-ként hivatkozunk rá. A „szabályozás” és „szabályoz” szakkifejezés a génexpresszió modulálására vonatkozik, amelyet elsődlegesen, de nem kizárólag egy gén transzkripciós starthelyétől 5’-irányban található DNS-szekvencia-elemek indukálnak. A szabályozás eredményezhet teljes vagy nulla választ egy stimulálásra, vagy eredményezhet változásokat a génexpresszíóban. A „reagáló” vagy „reagálás” szakkifejezés, amint az alábbiakban alkalmazzuk, egy szabályozott promoter vagy gén expressziós szintjének a változására utal egy külső inger hatására. A „struktúrgén” szakkifejezés a génnek egy fehérjét, polipeptidet vagy ezeknek egy részét kódoló részére vonatkozik, kizárva a szabályozószekvenciákat, amelyek a transzkripció iniciálását vezérlik. A struktúrgén lehet olyan, amelyet normálisan meg lehet találni a sejtben, vagy lehet olyan, amely normálisan nem található meg a sejtnek azon részén, ahová bejuttatták, amely esetben heterológ génnek nevezik. Egy heterológ gén teljes egészében vagy részleteiben származhat bármely, a szakterületen ismert forrásból, beleértve bakteriális genomot vagy episzómát, eukarióta kromoszomális vagy plazmid-DNS-t, cDNS-t vagy kémiailag szintetizált DNS-t. A struktúrgén tartalmazhat egy megszakítatlan kódoló régiót, illetve tartalmazhat egy vagy több intront, amelyeket a megfelelő illesztőszekvenciák határolnak. A struktúrgén lehet különböző természetes vagy szintetikus fonásokból, szegmentumokból álló. A „3’-downstream régió” (vagy ,,3’-vég”) a génnek arra a DNSszakaszt tartalmazó részére vonatkozik, kizárva az 5'-szekvenciát, amely vezérli a transzkripció iniciációját és a gén szerkezeti részét, amely tartalmaz egy poliadenilezési jelet és bármely más szabályozószekvenciát, amely képes befolyásolni a mRNS processzálását vagy a gén expresszióját is. A poliadenilezési jelet általában az jellemzi, hogy befolyásolja poliadenilsavrészek hozzáadását a mRNS prekurzor 3’-végéhez. A poliadenilezési jeleket általában az 5’-AATAAA-3’ kanonikus képlettel való homológ jelenléte alapján ismerik fel, jóllehet az eltérés nem ritka. A „rekombináns DNS-konstrukció” szakkifejezés vonatkozik egy plazmidra, vírusra, autonóm replikálódó szekvenciára, fágra vagy nukleotidszekvenciára, lineárisra vagy kör alakúra, egyszálú vagy kétszálú DNS-re vagy RNS-re, származzon bármely forrásból, amelyben számos nukleotidszekvencia kapcsolódik össze vagy rekombinálódik egy egyedül álló konstrukcióvá, amely képes egy kiválasztott géntermékre vonatkozó promoterfragmentet és DNS-szekvenciát bejuttatni egy növénysejtbe, a megfelelő 3’ nem transzlálódó szekvenciával. A továbbiakban a „növény” szakkifejezés teljes növényekre és növényi eredetű szövetekre vonatkozik. A ,,növényi eredetű szövet” szakkifejezés differenciálódott és nem differenciálódott növényi szövetekre vonatkozik, ideértve, de nem korlátozva magunkat a gyökerekre, hajtásokra, levelekre, pollenre, magkezdeményekre, magokra, rákos szövetekre és sejtek különböző formáira tenyészetben, például érintetlen sejtekre, protoplasztokra, embriókra és kalluszszövetekre. A növényi eredetű szövetek lehetnek növényben, szervben, szövetben vagy sejttenyészetben. Az „egyszikű növény” szakkifejezés olyan növényre vonatkozik, amelynek a magvai csak egyetlen sziklevéllel rendelkeznek, vagy az embriónak arra a szervére, amely tárolja és felveszi a táplálékot. A „kétszikű növény” szakkifejezés olyan növényekre vonatkozik, amelyeknek a magvai két sziklevéllel rendelkeznek. A „protoplaszt” szakkifejezés olyan növényi sejtre vonatkozik, amelynek nincs sejtfala vagy sejten kívüli hordozója. A továbbiakban a „transzformálás” szakkifejezés jelentése olyan eljárás, amellyel a sejt/szövet/növény a sejtbe/szövetbe/növénybe bejuttatott nukleinsavmolekulán kódolt tulajdonságra tesz szert. Az „átvitel” szakkifejezés DNS-nek sejtekbe való bejuttatására szolgáló eljárást jelent, beleértve a mikroinjektálást vagy a sejtmembrán permeabilizálását különböző fizikai (például elektroporáció) vagy kémiai (például polietilénglikol, PEG) kezeléssel. Amint azt az alábbiakban használjuk, protoplasztok vagy növények „kitétele” kémiai anyagoknak az említett protoplasztok vagy növények kezelését, inkubálását vagy érintkezésbe hozását jelenti az anyaggal. A „működőképesen hozzákapcsolt” szakkifejezés két DNS-ffagment kémiai fúziójára vonatkozik a megfelelő orientációban és leolvasási fázisban, hogy funkcionális RNS-sé legyen átírható. Az alábbiakban a „homológ valamihez” szakkifejezés egy hasonlóságra utal két nukleinsavmolekula nukleotidszekvenciája vagy két fehérjemolekula aminosavszekvenciája között. Egy ilyen homológiát megbecsülhetünk akár DNS-DNS, akár DNS-RNS hibridizációval olyan feltételek között, amelyek jól ismertek a szakterületen jártas szakemberek számára [Hames and Higgins, szerk., Nucleic Acids Hybridization, IKL Press, Oxford, UK], vagy a két nukleinsav vagy fehérje szekvenciájának összehasonlításával. A továbbiakban a „lényegében homológ” szakkifejezés olyan nukleinsavmolekulákra utal, amelyek kevésbé szigorú körülmények között hibridizálnak egymással, mint az egymással homológ molekulák; valamint azokra a DNS fehérjekódoló szekven10

HU 218 717 Β ciákra, amelyek olyan báziscseréket tartalmaznak, amelyek nem okoznak változást a kódolt aminosavban, vagy amelyek olyan báziscseréket tartalmaznak, amelyek megváltoztathatnak egy aminosavat, de nem érintik a DNS-szekvencia által kódolt fehérje funkcionális tulajdonságait, vagy utalhat olyan DNS-szekvenciákra, amelyek egy gén transzkripciójának szabályozásában vesznek részt. Tehát az ismertetett nukleinsav promoterfragmentek közé olyan molekulák tartoznak, amelyekben elképzelhető a promoteríragmentnek a nukleotidbázisok deléciójából, átrendeződéséből, véletlenszerű vagy szabályozott mutageneziséből származó variációja mindaddig, amíg a promoterffagmentek DNS-szekvenciája homológ. Egy fehéijét kódoló DNS-szekvencia „hatékony szekvenciája” a DNS-szekvenciának egy csonkított változatára utal, amely az eredeti fehéije felhasználhatóságát illetően legalább részlegesen munkaképes. Az „expresszió” szakkifejezés az alábbiakban egy génterméket kódoló szekvencia géntermékké való transzkripcióját és/vagy transzlációját jelenti. Az expresszió során a géntermék szekvenciáját kódoló DNS-lánc először egy komplementer RNS-sé íródik át, amely gyakran egy hírvivő RNS, majd ezután az így átírt hírvivő RNS transzlálódik az említett géntermékké, ha a géntermék fehéije. Az expressziót, ha konstitutív, és tovább erősíthető egy kívülről szabályozott promoterfragmenttel, és ezáltal a hírvivő RNS-ről több másolat keletkezik, valamint nagy mennyiségben keletkezik a kiválasztott géntermék, akkor „túltermelés”-nek nevezzük. A „transzlációs startkodon” a nukleinsavon egy három nukleotidból álló egységre (kodon) utal, amely specifikálja a fehérjeszintézis iniciálását.

A jelen találmányban alkalmazott technikák a DNS rekombinálásárajól ismertek a szakterületen jártas szakemberek számára, leírásuk általánosságban megtalálható a Maniatis-féle kézikönyvben [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1982)].

A DNS enzimes kezelése

Restrikciós enzimes emésztések

A restrikciós enzimes emésztés puffereit, valamint az alkalmazott emésztési körülményeket az egyes enzimek szállítói biztosítják. Az enzimeket 5-10 egység per pg DNS-mennyiségben alkalmazzuk, és a reakcióelegy megfelelő végtérfogatát (általában 10-20 pl) vízzel állítjuk be. A használt restrikciós enzimes reakcióelegyek rutinszerűen 0,7-10 pg plazmid-DNS-t tartalmaznak. A reakcióelegyeket összekeverjük, majd általában a megfelelő hőmérsékleten inkubáljuk 2 óra hosszat. A DNS több enzimmel való emésztését egy időben végezzük, ha az egyes enzimek optimális sókoncentrációja és hőmérsékleti körülményei kompatibilisek. Ha ezek a körülmények lényegesen különbözőek, akkor az emésztéseket egymás után végezzük, a legalacsonyabb sókoncentrációt igénylő enzimmel kezdve. A következő reakcióelegyet a használt enzimnek megfelelő pufferösszetételre egészítjük ki.

A DNS gélelektroforézise

A DNS poliakrilamidgél-elektroforéziséhez a Bethesda Research Laboratories (Gaithersburg, MD, 0877) által leírt TRIS-borát-EDTA (TBE) puffért használjuk, amely 89 mmol TRIS-t, 89 mmol borátot (pH=8,3) és

2,5 mmol NaEDTA-t tartalmaz. Az alkalmazott gélek 100 ml ΙχΤΒΕ-ben oldott 5% akrilamidot és 0,2% bisz-akrilamidot tartalmaznak. Ehhez az oldathoz 0,25 ml 25%-os ammónium-perszulfát-oldatot adunk.

pl Ν,Ν,Ν’,Ν’-tetrametil-etilén-diamin (TEMED) hozzáadása után az oldatot gél öntőformába pipettázzuk. 1 mm-es távtartókat és fésűket alkalmazunk, és körülbelül 0,5-2 pg DNS-t viszünk fel egy lyukba. Az elektroforézist 150-250 V feszültségen végezzük 1 χ TBE-ben. Az elektroforézis után a gélt etidium-bromid 1 pg/ml koncentrációjú vizes oldatával festjük, majd a DNS-t ultraibolya fénnyel tesszük láthatóvá. A gélt polaroid kamerával és polaroid 667 filmmel fényképezzük (Polaroid Tech., Photo, Cambridge, MA 02139).

A DNS-t a következőképpen nyerjük ki a poliakrilamidgélből: A kiválasztott és etidium-bromid (EtBr) festéssel láthatóvá tett csíkot kivágjuk a gélből, Eppendorf-csőbe helyezzük, majd egy teflonpálcával eldörzsöljük. Azonos térfogatú 0,5 mólos ammónium-acetátot és 1 mmólos EDTA-oldatot adunk hozzá, majd a csövet egy éjszakán át 37 °C hőmérsékleten rázatjuk. A következő napon a csövet 14 000 xg-vei lecentrifugáljuk egy mikrofugában (10 perc, szobahőmérséklet), majd a felülúszót eltávolítjuk, fél térfogat eluálópuffert adunk az eldörzsölt poliakrilamidhoz, majd a cső tartalmát összekeveijük és vortexeljük. A csövet ismét lecentrifugáljuk az előzőek szerint, a felülúszót eltávolítjuk, és egyesítjük az eredeti mintával. Az egyesített felülúszókat egy üveggyapot oszlopon bocsátjuk keresztül, hogy a maradék poliakrilamiddarabokat eltávolítsuk, majd a mintában lévő DNS-t 2 térfogat etanol hozzáadásával etanolos szárazjégben inkubálva kicsapjuk. A DNS-t a mintának egy mikrofugában való centrifugálásával (15 perc, 4 °C) nyerjük ki. Az üledéket 70%-os etanollal mossuk, csökkentett nyomáson szárítjuk, majd a választott pufferben szuszpendáljuk a következő művelettől függően.

A DNS agarózgél-elektroforézisét 0,7%-os agarózgélben végezzük, az előzőekben a poliakrilamidgélekre leírt puffért alkalmazva. Az elektroforézist 50-150 V közötti feszültségtartományban végezzük, függően az egyes minták DNS-tartalmától és a futás kívánt idejétől. Az elektroforézis után a gélt 1 pg/ml EtBr-dal mossuk, majd a csíkokat ultraibolya fénnyel átvilágítva láthatóvá tesszük, és a fentiek szerint lefényképezzük.

A DNS-t gyakran alacsony olvadáspontú agaróz (Sea Plaque Agarose, FMC Corporation, Maríné Colloids Division, Rockland, ME 04841) alkalmazásával nyerjük ki az agarózgélből. Az elektroforéziseljárást az előzőekben leírtuk. A kiválasztott DNS láthatóvá tétele után a csíkot kivágjuk, és egy mikrocentrifugacsőbe helyezzük. A csövet -80 °C-on tartjuk 30 percig, majd megolvasztjuk. Az agarózt ezután egy pálcával szétnyomjuk, majd a mintát egy Beckman TL-100 asztali ultracentrifugával centrifugáljuk 25 000/perc fordulatszámmal 30 percig. A felülúszót eltávolítjuk a csőből anélkül, hogy felzavamánk az agarózüledéket a cső

HU 218 717 Β alján. A mintát 1/10 térfogat 3 mólos nátrium-acetát (pH=6,9) és 2 térfogat tanol hozzáadásával kicsapjuk, miután 15-30 percig inkubáltuk -80 °C hőmérsékleten. A DNS-t mikrocentrifugában való centrifugálással nyeljük ki (15 perc, 4 °C). A DNS-csapadékot ezután 70%-os etanollal mossuk, vákuumban szárítjuk és TE-pufferben szuszpendáljuk.

Plazmidizolálás és -tisztítás

Egy 25 ml-es, egy éjszakán át növesztett tenyészetet (vagy exponenciálisan növekvő tenyészetet) készítünk a kiválasztott plazmidot tartalmazó baktériumból. Az egy éjszakán át növesztett tenyészetből 2 ml-t 1 liter M9CA vagy L táptalajba viszünk, leírása megtalálható a Maniatis könyvben [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Ν. Y.], majd 16 órán át (egy éjszakán át) inkubáljuk 37 °C hőmérsékleten erős rázatás közben, a megfelelő antibiotikumos szelekciót alkalmazva. A baktériumokat lecentrifugáljuk [4000 χ g (5500/perc) GSA-rotorban, 5 perc, 40 °C]. Az üledékről leöntjük a felülúszót, majd 36 ml össztérfogatú GTE-pufferben (50 mmol glükóz, 25 mmol TRIS-HC1 pH=8 és 10 mmol EDTA) szuszpendáljuk. 40 mg/ml lizozimból négy millilitert adunk a baktériumszuszpenzióhoz, majd a keveréket szobahőmérsékleten inkubáljuk tíz percig. A sejtszuszpenziót jégben hűtjük, majd 80 ml frissen készített [0,2 normál NaOH, 1% SDS összetételű] oldatot adunk hozzá gyenge rázatás közben, a baktériumok lizálása céljából. A lizátumot jégen inkubáljuk 10 percig, majd 40 ml, 2 mólos ecetsavban oldott 3 mólos kálium-acetátot adunk hozzá. Az elegyet ezután 15 percig jégen inkubáljuk. A csapadékot centrifugálással eltávolítjuk [24 000xg (12 000/perc), 15 perc], majd a felülúszót 4-5 réteg finom gézen szüljük át. A nukleinsavakat 0,6 térfogat izopropanol hozzáadásával nyerjük ki. A kapott csapadékot centrifugálással nyerjük ki (12 000/perc, 10 perc, 15 °C GSA-rotorban). A csapadékot 70%-os etanollal (TE-pufferben) mossuk, majd a DNS-t az előzőek szerint újracentrifügáljuk. A nukleinsavüledéket 3,85 ml TE-ben oldjuk (pH=8,0). Miután a DNS-t feloldottuk, 4,4 g CsCl-ot adunk az oldathoz. A CsCl feloldása után 0,32 ml etidium-bromidot (EtBr) adunk az oldathoz egy 10 mg/ml-es törzsoldatból (végső koncentráció 600 pg/ml). A plazmid-DNS-t centrifugálással (65 000/perc, legalább 15 óra) egy sávba tömörítjük egy Beckman 70,1 Ti-rotorban. A gradiens általában három sávot tartalmaz. A legalsó sáv nem abszorbeál etidium-bromidot, míg a felső két sáv abszorbeálja a festéket. A kevésbé sűrű felső csík, amely megfelel a kromoszomális DNS-nek, ritkán látható. A plazmidcsíkot, amelyik a két EtBr-t abszorbeáló csík közül az alsó, eltávolítjuk a gradiensből, a csövet kilyukasztva a csík alatt egy 20-as fecskendővel, majd leszívjuk a DNS-t a csőből. Az EtBr-ot a DNS ismételt extrakciójával (NaCl-dal telített 2-propanol) távolítjuk el. Az extrahálóoldatot úgy állítjuk elő, hogy 10 ml 50 mmólos TRIS-HC1 (pH=8,0), 1 mmol EDTA összetételű oldatot, és 10 ml 5 mmólos NaCl-t adunk 80 ml 2-propanolhoz. Az extrahált plazmid-DNS-t háromszorosra hígítjuk TE-pufferrel (pH=8,0), majd 2 térfogat etanollal kicsapjuk -20 °C hőmérsékleten. A DNS-t centrifugálással nyerjük ki (lOOOOxg, 30 perc), TE-pufferben szuszpendáljuk, majd újra kicsapjuk nátrium-acetáttal és etanollal. A DNS-t újra szuszpendáljuk TE-pufferben és

-20 °C hőmérsékleten tároljuk.

Biológiai anyagok letétbe helyezése

Az alábbi sejtvonalakat és plazmidokat, amint azt az alábbiakban leírjuk, letétbe helyeztük az American Type Culture Collectionnál (12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 0852), és a következő ATCC jelzéseket kapták:

Dátum ATCC szám pIn2-2-3 plazmid

Escherichia coli HB101

törzsben	1988. 9. 27.	67803
pIn5-2.32 plazmid Escherichia coli HB101 törzsben	1988. 9. 27.	67804
pln2 -1.1A plazmid Escherichia coli HB101 törzsben	1988. 9. 27.	67723
pMSP-K plazmid Escherichia coli HB101 törzsben	1988. 10. 11.	67822
p6.1 plazmid Escherichia coli JM83 törzsben	1988. 10. 11.	67823
pJJ3431 plazmid Escherichia coli JM83 törzsben	1989. 2. 03.	67884

A jelen találmányt tovább definiáljuk az alábbi példákban, melyekben a százalék tömegszázalék, a hőfok pedig °C-ban van megadva, hacsak külön nem jelezzük. Nyilvánvaló, hogy ezeket a példákat, jóllehet a találmány előnyös megvalósítási módjait mutatják, csak az illusztrálás céljából adtuk meg. A fenti tárgyalásból és a példákból egy szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy ennek a találmánynak lényeges jellemzőin, anélkül, hogy eltérnénk a szellemétől és oltalmi körétől, különböző változtatások és módosítások tehetők, hogy különböző felhasználásokhoz és körülményekhez adaptáljuk. Továbbá a jelen találmány oltalmi körét nem korlátozzák a letétbe helyezett biológiai anyagok, mivel a letétbe helyezett célja, hogy illusztrálják a kiindulási anyagokat, amelyekből a találmány számos megvalósítási módja származik. Az összes ilyen módosítás a megadott igénypontok oltalmi körébe tartoznak.

1. példa

A 21.14 kukorica 2-1 génje promoter és 3'-régiójának azonosítása, izolálása és módosítása A növények növesztése és kémiai kezelése Missouri 17 kukoricamagvakat sterilezőnk a felszínükön oly módon, hogy 10%-os kereskedelmi forgalomban lévő fehérítő és 0,1% nátrium-dodecil-szulfát (SDS) oldatába mártjuk 30 percre. A magvakat ezután alaposan leöblítjük steril desztillált vízzel egy Büchnertölcsérben, majd előkészítjük őket a csírázáshoz, oly módon, hogy egy 20x25 cm-es üvegtepsiben lévő 5-6 réteg steril, nedves papírtörülközőre helyezzük őket. A tepsit alumíniumfóliával borítjuk, majd egy sö12

HU 218 717 Β tét 30 °C-os inkubátorba helyezzük 48-72 órára, hogy a magvak kicsírázzanak. A csírázás után a palántákat hidroponikusan növesztjük egy olyan berendezésben, amely egy 8 mesh-es rozsdamentes dróthálót tartalmaz egy 2 literes üvegedény fölé függesztve, amely steril, feles koncentrációjú Hoagland-oldatot tartalmaz (a továbbiakban 0,5xHoagland-oldat) oly módon, hogy a gyökerek átnőjenek a drótszitán, és belenőjenek a táptalajba. A hidroponikus berendezést oly módon levegőztetjük, hogy nedvesített levegőt juttatunk az edény aljára, egy gázoszlató kövön keresztül, amelyet általában trópusi halak akváriumaiban alkalmaznak. A berendezést alumíniumfóliával borítjuk, majd egy olyan kamrába helyezzük, amelyet mind fénycsővel, mind izzólámpával megvilágítunk 4400 lux erősséggel. A palántákat 28 °C hőmérsékleten növesztjük 75%-os relatív páratartalom mellett, 16 órás megvilágítást alkalmazva naponként. Két nap elteltével eltávolítjuk a fóliát, és a növényeket további 5-6 napig növesztjük. Az elpárolgott 0,5 χ Hoagland-táptalajt 2-3 naponként pótoljuk. A tizedik napon a növényeket átvisszük vagy friss 0,5 χ Hoagland-táptalajra (kezeletlen növények), vagy 0,2 g/liter 2-klór-benzolszulfonamidot tartalmazó 0,5 χ Hoaglandtáptalajra a kontrollnövények kémiai kezelése céljából, vagy 0,2 g/liter N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamidot tartalmazó 0,5 x Hoagland-táptalajra a növények kémiai kezelése céljából. A növényeket további 6 órán át hagyjuk növekedni a begyűjtésig.

A hidroponikusan növesztett növényekből begyűjtjük a gyökereket oly módon, hogy az edényekből a még érintetlen kukoricanövényekkel együtt eltávolítjuk a dróthálót. A gyökereket levágjuk a növényekről, pontosan az alatt, ahol beleértek a növesztő táptalajba, majd a gyökérszövetből 10-15 g-os részleteket alumíniumfóliába burkolunk, és cseppfolyós nitrogénbe merítjük. A fagyott szöveteket a cseppfolyós nitrogénből áttesszük egy -80 °C-os fagyasztóba, ahol akár egy évig is tárolható felhasználás előtt.

Össz-RNS izolálása gyökérszövetekből

A guanidin-tiocianát reagenst úgy állítjuk elő, hogy egy 100 g-os guanidin-tiocianát palack (Kodak Laboratory and Specialty Chemicals, CAT# 705) tartalmát 80 ml vízben oldjuk, majd 10,6 ml TRIS-HCl-t pH=7,6, és 10,6 ml 200 mmólos Na₂EDTA-t (pH=6) adunk hozzá. Az oldatot addig kevertetjük, amíg a palack tartalma feloldódik, és 4,24 g nátrium-laurilszarkozinátot, valamint 2,1 ml β-merkapto-etanolt adunk hozzá. Az oldat térfogatát steril desztillált vízzel 212 ml-re állítjuk, majd kétszer átszűijük 0,2 pm-es, eldobható steril szűrőn. A guanidin-tiocianát reagenst felhasználásig 4 °C hőmérsékleten tároljuk sötétben.

A fagyasztott gyökérszövetmintákat kivesszük a -80 °C-os fagyasztóból, és visszatesszük a cseppfolyós nitrogénbe. Mihelyt lehűlt a cseppfolyós nitrogén hőmérsékletére, 10-115 g szövetet átteszünk egy cseppfolyós nitrogénnel előre lehűtött mozsárba, majd a törővei finom porrá törjük. Az elporított szövetet ezután egy 150 ml-es Corex-centrifugapalackba visszük át, amely öt térfogat (térfogat/tömeg) jéghideg guanidin-tiocianát reagenst, 0,5 ml CHCl₃-at, 0,2 ml n-oktanolt, 1 csepp pouritot (American Scientific Products, McGraw Park, IL 60085, CAT# B 1162-1) és 2,5 ml vanadil-ribonukleozid komplexet (Bethesda Research Laboratories Gaithersburg, MD 20877 CAT# 5522SA). A szövetet ezután tovább aprítjuk egy Promoter-10/35 polytronban (Brinkmann Instruments) egy percig maximális sebességgel végzett alapos homogenizálással. A nyersszövet-kivonatot ezután 27 000 g-vel centrifugáljuk 10 percig 4 °C hőmérsékleten. A felülúszót leöntjük egy mérőhengerbe, és 1 g CsCl-t adunk a felülúszó minden 2,5 ml-éhez. Az oldatot ezután 36 000 g-vel centrifugáljuk 10 percig 4 °C hőmérsékleten, majd a kapott felülúszót 5,7 ml CsCl-ból (100 mmólos EDTAban pH = 7,6) készült 2 ml-es párnákra rétegezzük 9/16x3-l/2” poliallomer ultracentrifugacsövekben. A kapott lépcsős gradienst 15-20 órán át centrifugáljuk 10 °C hőmérsékleten 35 000/perc fordulatszámmal. Az ultracentrifugálást követően a felülúszót leszívással óvatosan eltávolítjuk, majd a csöveket megfordítjuk, és hagyjuk alaposan megszáradni. A még megfordított csöveknek a tetejét levágjuk borotvapengével, és eldobjuk, csak az alsó 1,5 cm-t tartjuk meg, amely tartalmazza az RNS-csapadékot. A cső oldalát óvatosan tisztára töröljük egy laboratóriumi törlőkendővel, majd a csapadékot 0,2 ml TES-pufferben oldjuk (10 mmol TRIS-HC1 pH=7,4, 5 mmol EDTA, 1% SDS), majd egy 15 ml-es Coprex-centrifugacsőbe visszük át. Minden egyes poliallomercsőnek az alját egy második, 0,2 ml-es TES-aliquottal átöblítjük, majd a két aliquotot egyesítjük. Az RNS-t azonos térfogatú kloroformbutanol (4:1) eleggyel kombináljuk, majd röviden vortexeljük. A kapott emulziót centrifugáljuk (8000 g, 5 perc 20 °C, vagy egy klinikai asztali centrifugában 10 percig nagy sebességgel). A vizes fázist friss 15 ml-es Corex-centrifugacsőbe visszük át, a szerves fázist extraháljuk azonos térfogatú TES-pufferrel, és a két vizes fázist egyesítjük. Az RNS-t -20 °C hőmérsékleten csapjuk ki, egytized térfogatnyi nátrium-acetát (pH=6,0) és két térfogat etanol hozzáadása után legalább két óra hosszat. Az RNS-t centrifügálással nyerjük ki (10 000 g, 20 perc, 4 °C). A felülúszóréteget óvatosan leszívatjuk, majd az RNS-t 0,5 ml steril vízben vagy 1 mmólos EDTA-ban (pH=7,6) oldjuk. Egy kis aliquotot százszorosra hígítunk vízzel, majd ennek a hígított oldatnak megmérjük az A₂₆₀ értékét az RNS-koncentráció meghatározására.

Poli (A)⁺ RNS izolálása

A poli (A)⁺ RNS-t 5 mg össz-RNS-ből tisztítjuk poli U Sephadexről végzett termoelúcióval. Felhasználás előtt minden puffért autoklávozással sterilezünk. Az össz-RNS-t 500 pg/ml-nél alacsonyabb koncentrációra hígítunk alacsony sótartalmú poli U pufferrel (20 mmol TRIS-HC1 pH=8,0, 1 mmol EDTA és 0,1 SDS). Az RNS-t hővel denaturáljuk (65 °C, 5 perc), majd gyorsan jégbe hűtjük, és ott tartjuk 5 percig. NaCl-ot adunk hozzá 150 mmol végkoncentrációban, majd ezt az oldatot egy vízköpenyes oszlopra töltjük (Bio-Rad, 1414 Harbour Way South, Richmond, CA 94804, CAT# 737-22231) töltjük, amely 2 g poli U Sephadexet tartalmaz (Bethesda Research Laboratories Gaithersburg,

HU 218 717 Β

MD 0877, CAT# 5941 SB), és amelyet magas sótartalmú poli U pufferrel hoztunk egyensúlyba (20 mmol TRIS-HC1 pH = 8,0, 1 mmol EDTA, 0,1% SDS és 150 mmol NaCl). Az oszlop hőmérsékletét keringő vízfürdővel 25-30 °C között tartjuk. Az oszlopot ezután egyszer mossuk 6-7 ml magas sótartalmú poli U pufferrel. Az oszlop futtatási hőmérsékletét 40 °C-ra emeljük, majd ismét mossuk 6-7 ml magas sótartalmú poli U pufferrel. Ezután 7 ml alacsony sótartalmú poli U puffért viszünk az oszlopra, és a hőmérsékletét 60 °C-ra emeljük. 5 percet várunk arra, hogy mind az oszlop, mind az alacsony sótartalmú poli U puffer hőmérséklete kiegyenlítődjön, majd a poli (A)⁺ RNS-t leoldjuk, és 0,5 ml-es frakciókban gyűjtjük. Az RNS-t tartalmazó frakciókat (meghatározva a frakciók kis aliquotjának A₂₆₀ értékének mérésével) egyesítjük, majd a korábbiakban leírt módon etanollal kicsapjuk. Az RNS-t újra kicsapjuk a fentiek szerint, de nátrium-acetát helyett kálium-acetátot alkalmazunk, majd vízben szuszpendáljuk 1 mg/ml koncentrációban, és -80 °C hőmérsékleten tároljuk.

cDNS-könyvtárak készítése A cDNS-t 5 pg N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamiddal kezelt poli (A)⁺ RNS-ből állítjuk elő, egy cDNS-szintézis-kitet alkalmazva (Amersham Corporation, CAT# RPN 1256). A gyártó által javasolt kísérleti felállítást követjük módosítás nélkül. A megszintetizált kétszálú (ds) cDNS mennyiségét az első és második szál szintézise közben beépült [a³²P]dCTP-mennyiségből számoljuk ki. A megszintetizált cDNS átlagos méretét az elektroforézis során lúgos agarózgélben mért mobilitása alapján becsüljük meg. Ezután kiszámoljuk az 5’-végek/pg cDNS átlagos számát. A kétszálú cDNS-t ezután etanollal kicsapjuk, majd centrifugálással kinyerjük (10 perc, 4 °C). A DNS-csapadékot röviden szárítjuk vákuumban, majd vízben oldjuk. 250 pCi [³H]dCTP 50%-os etanolban készült oldatát tesszük

1.5 ml-es mikrocentrifugacsőbe, és vákuumban szárítjuk. 1 pg ds cDNS 7 pl térfogatban lévő oldatát áttesszük ebbe a csőbe, majd 25 pl 2xfarkazó puffért (2,5 mmol β-merkapto-etanol, 100 mg/ml BSA,

3.5 mmol MnCl₂ és 135 mmol kálium-kakodilát pH=7,0) adunk hozzá. Tíz egység terminális dezoxinukleotidil-transzferázt adunk hozzá, majd a csövet 21 percig 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A farkazóreakciót 20 mmol végkoncentrációjú EDTA hozzáadásával állítjuk le, majd a csövet jégre tesszük. A C-farkazott reakcióterméket egyszer extraháljuk azonos térfogatú fenol-kloroform 1:1 arányú elegyével, majd centrifugált oszlopos kromatográfiával tisztítjuk. A centrifugált oszlopos kromatográfiát úgy hajtjuk végre, hogy 1 ml eldobható fecskendő alját steril üveggyapottal zárjuk le, majd feltöltjük Sephadex G-50-nel, amelyet STE-pufferrel (TE-puffer, pH=8,0, 100 mmol NaCl). A fecskendőt egy zárósapka nélküli 1,5 ml-es mikrocentrifügacsőbe illesztjük, amelyet egy 15 ml-es Corexcső aljába helyezünk. Az oszlopot 1600 g-vel centrifugáljuk 4 percig egy asztali klinikai centrifugában. További Sephadex G-50-et adunk hozzá, majd az oszlopot újracentrifugáljuk. Ezt az eljárást addig ismételjük, amíg

0,9 ml-es töltött térfogatot kapunk. Az oszlopot kétszer öblítjük 0,1 ml STE-pufferrel, majd a fecskendőt a fentiek szerint centrifugáljuk az egyes öblítések között. 0,1 ml-es DNS-mintákat viszünk az oszlopra STE-pufferben, majd az oszlopot egy zárósapka nélküli mikrocentrifugacsőben centrifugáljuk a fentiek szerint. A DNS-t úgy nyerjük ki, hogy az elfolyó oldatot egy mikrocentrifugacsőbe gyűjtjük, majd -20 °C hőmérsékleten tároljuk. A 3’-végekhez hozzáadott dC maradékok átlagos számát a cDNS-be beépült [³H]dCTP mennyiségéből számítjuk ki.

Ekvimoláris mennyiségű C-farkazott ds cDNS-t és dG-farkazott pBR322 vektor DNS-t (New England Nuclear Research Products, 549 Albany St., Boston, MA 02118 CAT# NEE-118) keverünk össze 0,1 mól NaCl, 10 mmol TRIS-HC1, pH=7,8 és 1 mmol EDTA összetételű oldattal kevesebb mint 10 pl térfogatban. Az elegyben lévő DNS-t összeillesztjük oly módon, hogy vízfürdőben először 10 percig 70 °C-ra melegítjük. A fürdőt ezután kikapcsoljuk, és hagyjuk, hogy az elegy lassan szobahőmérsékletre hűljön. Az elegyet ezután hűtőszobába visszük, és hagyjuk lassan 4 °C-ra hűlni. Az illesztett DNS-ből kis aliquot részeket használunk kompetens Escherichia coli HB101 törzs transzformálására. A kompetens sejteket úgy állítjuk elő, hogy egy LB-táptalajban egy éjszakán át növekvő tenyészetből 0,1 ml-t oltunk 50 ml ugyanilyen táptalajba. A friss tenyészetet 37 °C hőmérsékleten rázatjuk, amíg az A₆₅₀=0-0,5 értéket el nem éri. A sejteket ezután centrifügálással nyeljük ki (2500 g, 5 perc, 4 °C), 5 ml 0,5 mólos CaCl₂-oldatban szuszpendáljuk, majd 20 percig jégen tartjuk. A sejteket centrifügálással nyeljük ki, mint a fentiekben, 0,5 ml 0,1 mólos CaCl₂-ben szuszpendáljuk, majd jégen tároljuk, és 24 órán belül felhasználjuk. Ezekből a kompetens sejtekből 100 pl-es aliquot részeket steril 4 ml-es polipropiléncsövekbe teszünk, összekeverjük a fenti illesztőreakció aliquot részeivel, és a transzformációs elegyet jégen inkubáljuk 15 percig. A sejteket ezután hősokknak vetjük alá, 5 percre 37 °C-ra helyezzük rázás nélkül. A sejteket 2 percre visszatesszük a jégre, mielőtt a 2 ml LB-táptalajt hozzáadnánk. A sejteket ezután 1 óra hosszat növesztjük 37 °C hőmérsékleten rázatva, majd a transzformációs elegyből aliquot részeket LB-lemezekre szélesztünk, amelyek 1,5 pg/ml tetraciklint tartalmaznak. A lemezeket ezután egy éjszakán át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk.

2-1 cDNS-klónok izolálása

A transzformációból származó antibiotikumrezisztens telepeket izolálunk, majd 150 mm-es LB-agarlemezekre rendezzük előnyös, amelyek 12,5 pg/ml tetraciklint tartalmaznak. A telepeket felnövesztjük, majd 140 mm-es nitrocellulóz szűrőkre visszük át, az előre megnedvesített szűrőket (oly módon végezzük a nedvesítést, hogy a száraz szűrőket friss, 1,5 pg/ml tetraciklint tartalmazó LB-lemezekre helyezzük) az egyes lemezekre helyezve. Az átvitt telepeket a fentiek szerint felnövesztjük, majd ezeket a szűrőket használjuk a cDNS-könyvtár anyafiltereiként.

Mindegyik anyafilterről két replikafiltert készítünk, ennek kivitelezéséhez a nitrocellulóz filtereket először a fentiek szerint előnedvesítjük. Az egyes előnedvesített filtereket azután egy anyafilterre fektetjük, majd a filterpárokat néhány száraz 3MM lap közé helyezzük. Ezt a szendvicset azután két üveglap közé helyezzük, az üveglapokat összepréseljük, hogy a baktériumokat átvigyük az anyafilterről a replikafilterre. A filtereket ezután szétválasztjuk, majd a replikákat friss LB/tet lemezre helyezzük. Ezt az eljárást addig ismételjük, amíg mindegyik anyafilterről két replika készül. Az anyafiltereket visszatesszük friss lemezekre, és 4 °C hőmérsékleten tároljuk.

A replikafiltereket 37 °C hőmérsékleten addig növesztjük, amíg a telepek átmérője 1-2 mm lesz, majd a filtereket LB-lemezekre visszük át, amelyek 200 pg/ml klór-amfenikolt tartalmaznak. A lemezeket egy éjszakán át inkubáljuk 37 °C hőmérsékleten. A következő reggel a filtereken lévő baktériumokat lizáljuk, és DNS-üket in situ a filterekre rögzítjük. A baktériumok ellizálása céljából a filtereket eltávolítjuk az agarlemezekről, majd a telepekkel fölfelé három percre egy olyan üvegtálba helyezzük, amely 3 db 10%-os SDSsel telített Whatman 3MM papírlapot tartalmaz. A filtereket ezután 5 percre átvisszük egy olyan tálba, amely 3 db 0,5 normál NaOH, 1,5 mól NaCl összetételű oldattal telített Whatman 3MM papírt tartalmaz, ezt követően 6 percre átvisszük egy olyan tálba, amelyik 3 db 1 mól TRIS-HC1, pH=7,5,1,4 mól NaCl összetételű oldattal telített 3MM papírt tartalmaz. A filtereket levegőn szárítjuk, majd 2 órán át vákuumban sütjük.

A cDNS-könyvtár replikamásolatait differenciáltan vizsgáljuk át, hogy olyan kiónokat kapjunk, amelyekben az N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamid kezelés hatására bizonyos mRNS mennyisége megnő. Ennek végrehajtásához mindegyik anyafilter egy-egy replikáját hibridizáltatjuk olyan ³²P-vel jelzett egyszálú cDNS-próbával, amelyet úgy állítunk elő, hogy kezeletlen kukoricagyökerekből készített poli (A)⁺ RNS-t írunk át reverz transzkriptázzal, míg a másik replikafiltert olyan ³²P-vel jelzett egyszálú cDNS-próbával hibridizáltatjuk, amelyet N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamiddal kezelt kukoricagyökerekből izolált poli (A)+ RNS-ről írunk át reverz transzkriptázzal. A próbákat 5-5 pg poli (A)⁺ RNS-ről szintetizáljuk, az első szál szintézisét az Amersham cDNS-szintézis-kitjével végezve. Az első lánc szintézisét 20 mmol végkoncentrációjú EDTA hozzáadásával állítjuk le, majd az RNS hidrolizálására NaOH-t adunk hozzá 0,4 mól végkoncentrációban. Miután az RNS-t 6 órán át 22 °C hőmérsékleten elhidrolizáltuk, a cDNS-oldat pH-ját sósavval semlegesre állítjuk, majd az első szál reakcióelegyet 1 χ 100 cm-es Sephadex G-100 oszlopra visszük, amelyet 10 mmol TRIS-HC1 pH=8,0, 0 mmol NaCl, 0,2% SDS összetételű oldattal hoztunk egyensúlyba. Az átfolyó térfogattal eluálódó radioaktív anyagot egyesítjük, majd a DNS-t etanollal kicsapjuk. A jelzett DNS-t centrifugálással gyűjtjük össze (14 000 g, 20 perc, 4 °C). A csapadékot vákuumban szárítjuk, majd a DNS-t kis térfogatú TE-pufferben (pH = 8,0) szuszpendáljuk. A próbába beépült radioaktivitást úgy határozzuk meg, hogy egy 1 pl-es aliquot résznek a radioaktivitását 5 ml szcintillációs folyadékban megmérjük egy folyadékszcintillációs számlálóval.

A replikafiltereket két csoportra osztjuk, úgyhogy mindegyik csoport a cDNS-könyvtár egy másolatát jelenti. Az egyes csoportokból az összetartozó filtereket hővel lezárható zacskókba helyezzük, a telepeket tartalmazó oldallal kifelé. Mindegyik zacskót 70 ml hibridizációs pufferrel töltjük meg, lezárjuk, majd egy éjszakán át 65 °C-os vízfürdőben inkubáljuk. A hibridizálópuffer összetétele: 6xSSC, (az lxSSC összetétele 0,15 mól NaCl, 0,015 mól trinátrium-citrát (pH=7,0), 2 x Denhardt (az egyszer Denhardt-oldat összetétele 0,0% szarvasmarhaszérum-albumin (BSA), 0,0% poli(vinil-pirrolidon), 0,0% SDS, 50 mmol nátrium-foszfát pH=6,8, 2 mmol EDTA és 100 pg/ml boqútimusz-DNS).

A könyvtár átvizsgálását úgy végezzük, hogy az egyes zacskókban lévő hibridizációs puffért kiöntjük, majd 30 ml olyan hibridizációs pufferrel helyettesítjük, amely 5 χ 10⁶ cpm/ml próbát tartalmaz. A próbát hidroponikus rendszerben 6 óra hosszat N-(amino-karbonil)2-klór-benzolszulfonamiddal kezelt kukoricagyökérből tisztított poli (A)+ RNS-ről készítjük. A könyvtár másik másolatát képező filtereket hasonlóan kezeljük, azzal a különbséggel, hogy az 5 χ 10⁶ cpm/ml próbát kezeletlen gyökerű növényből izolált poli (A)+ RNS-ről készítjük. A filtereket 65 °C hőmérsékleten hibridizáljuk minimum 48 órán át. A filtereket ezután eltávolítjuk a zacskókból, és kétszer mossuk 15 percig szobahőmérsékleten 2xSSC, 1 mmol EDTA, 0,2% SDS és 1 mmol nátrium-pirofoszfát összetételű oldatban, majd egyszer mossuk egy órán át 65 °C hőmérsékleten 0,5 χ SSC és 0,1% SDS összetételű oldatban, végül egyszer mossuk 30 percig 65 °C-on 0,2 χ SSC és 0,1% SDS összetételű oldatban. A filtereket röviden szárítjuk levegőn, majd Kodak XAR-5 filmre exponáljuk -80 °C-on körülbelül 36 órán át, egyetlen Du Pont Lightning Plus erősítőfóliát alkalmazva. A filterek autoradiogramjait automata Kodak filmhívó-berendezésben hívjuk elő. Bármely telepet, amely az N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamiddal kezelt kukoricagyökérből tisztított poli (A)+ RNS-ről készült hibridizációs próbával erősebb jelet adott mint a kezeletlen növényből izolált RNS-ről készült próbával, pozitív telepnek tekintünk, és a további elemzés céljára kiválasztjuk.

A differenciális vizsgálatból egy telepet, jel 2-1, választottunk ki mint lehetséges pozitív kiónt, és a további elemzésbe ezt vontuk be. Plazmid-DNS-t izolálunk a 2-1 telepből, a kis mennyiségű plazmidizolálási módszer alkalmazásával. Ezt úgy hajtjuk végre, hogy 5 ml LB-táptalajt, amely a megfelelő antibiotikumot (tét) tartalmazza, egyetlen baktériumteleppel beoltunk. Egy éjszakán át 37 °C hőmérsékleten rázatjuk, majd a tenyészetből 1,5 ml-t mikrocentrifugacsőbe teszünk. A csövet 20 másodpercig egy mikrocentrifugában centrifugáljuk, majd a táptalajt leszívjuk, a baktériumcsapadékot a lehető legszárazabban hagyva. Újabb 1,5 ml tenyészetet adunk a csőhöz, és a fenti eljárást megismételjük. A csapadékot 100 μΐ GTE-pufferben szuszpendáljuk (50 mmol glükóz, 10 mmol EDTA, 5 mmol TRIS-HC1, pH=8,0) 4 mg/ml lizozimmel (közvetlenül felhaszná15

HU 218 717 Β lás előtt adjuk az oldathoz) vortexelve. 5 percig tartjuk szobahőmérsékleten, majd 200 μΐ frissen készült lízis puffért adunk a csőhöz (összetétele 0,2 normál NaOH, 1% SDS), majd a cső tartalmát összekeverjük oly módon hogy a csövet kétszer-háromszor gyorsan fejjel lefelé fordítjuk. A csövet 5 percre jégre tesszük, majd 150 μΐ jéghideg kálium-acetát-oldatot adunk hozzá (pH=4,8) (előállítása: 11,5 ml jégecetet és 28,5 vizet adunk 60 ml 5 mólos kálium-acetáthoz). A cső tartalmát összekeverjük, a csövet többször gyorsan fejjel lefelé fordítva. Miután 5 percig jégen tartottuk a csövet, lecentrifugáljuk egy mikrocentrifugában 4 °C hőmérsékleten. A felülúszót egy friss csőbe visszük át, majd azonos térfogatú fenol: kloroform 1:1 arányú elegyét adjuk hozzá keverés közben. A kapott emulziót 3 percig centrifugáljuk egy mikrocentrifugában, majd a felülúszót egy friss csőbe visszük át. Két térfogat etanolt adunk hozzá, és a cső tartalmát jól elkeverjük. Két percig szobahőmérsékleten tartjuk, majd a DNS-t centrifugálással kinyerjük (5 perc mikrocentrifugában). A felülúszót elöntjük, majd a csövet fejjel lefelé papirtörölközőre állítjuk, hogy minden folyadék kifolyjon belőle. A csapadékot 250 μΐ 70%-os etanollal mossuk, majd a csövet újra centrifugáljuk. A felülúszót elöntjük, majd a csapadékot röviden szárítjuk vákuumban. A nyersplazmid-DNS-t 50 μΐ TE-pufferben (pH=8,0) oldjuk. Az In 2 -1 kiónban lévő plazmid jele pin -1.

A plazmidkészítmény egy aliquot részét nick-transzlációval jelezzük a kereskedelmi forgalomban lévő kit felhasználásával (Bethesda Research Laboratories, CAT# 8160SB) a gyártó által javasolt módon. A jelzett DNS-t megtisztítjuk a beépületlen nukleotidoktól centrifugált oszlopkromatográfiával.

Egy RNS slot-blot eljárást használunk arra, hogy igazoljuk, a cDNS-könyvtár átvizsgálásával kapott, feltételezett pozitív klón egy olyan mRNS-t jelent, amely erősen indukálható N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamiddal. Egy nitrocellulóz filtert (Schleicher and Schüll, BA-85) megnedvesítünk oly módon, hogy kétszer 10 percre vízbe mártjuk, majd 10 percig 1 mólos ammónium-acetátba mártjuk. A filtert ezután egy slot-blot berendezésbe helyezzük (Schleicher and Schüll, Inc., Keene, NH 034331, CAT# SRC072/0). Kezeletlen kukoricagyökerekből, 2-klór-benzolszulfonamiddal kezelt kukoricagyökerekből és N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamiddal kezelt kukoricagyökérből izolált össz-RNS-ek 2,5 pg-os mintáit steril vízzel 80 μΐ végtérfogatra hígítjuk. 40 μΐ denaturálópuffert (összetétele 30% formaldehid, 100 mmol nátrium-foszfát pH=6,8) adunk minden egyes mintához, majd a mintákat 20-30 percig inkubáljuk 65 °C hőmérsékleten, és gyorsan lehűtjük jeges vízben, 5 percig tartva ott a mintákat. 30 μΐ 4 mólos ammóniumacetátot adunk minden egyes mintához, majd a 150 μΐ térfogatú mintákat a blotolócella slotjaiba visszük 10-15 Hgmm vákuum segítségével. A filtert ezután eltávolítjuk a cellából, levegőn megszárítjuk, és 2 órán át vákuumban 70 °C hőmérsékleten tartjuk.

A filtert hat darabra vágjuk, ezáltal mindegyik darabon van egy siót a fentiekben ismertetett mindegyik kezelésből származó RNS-sel. Az egyik filterdarabot 10 ml prehibridizációs pufferben inkubáljuk (összetétele 50% ionmentesített formamid, 5xSSC, 5 χ dDenhardt-oldat, 100 pg/ml denaturált boíjútimusz-DNS, 20 pg/ml homopoli (A), 40 mmol nátrium-foszfát pH=6,8 és 0,5% BSA) egy hővel zárható zacskóban 6 órán át 42 °C-on, alkalmanként megkeverve a mintát. A filterdarabot ezután nick-transzlációval jelzett pin 2-1 próbával jelezzük. Ezt úgy hajtjuk végre, hogy a prehibridizációs puffért eltávolítjuk a zacskóból, majd 2,5 ml hibridizációs pufferrel helyettesítjük (összetétele: 50% ionmentesített formamid, 5 χ SSC, 5 χ dDenhardt-oldat, 100 pg/ml denaturált borjútimusz-DNS, 20 pg/ml homopoli (A), 40 mmol nátriumfoszfát pH=6,8), amely 1,25xlO⁷ cpm nick-transzlációval jelzett, a fentiekben ismertetett 2-1 plazmidot tartalmaz. A nick-transzlációval jelzett plazmidot 10 percig forralva denaturáljuk, majd jégbe hűtjük. A filtert ezután prehibridizáljuk egy éjszakán át 42 °C hőmérsékleten, alkalmankénti kevertetéssel.

A filtert eltávolítjuk a zacskóból, majd kétszer mossuk szobahőmérsékleten 10-15 percig egy rázóasztalon 2 χ SSC, 1 mmol EDTA, 20 mmol nátrium-foszfát pH=6,8, 1 mmol nátrium-pirofoszfát és 0,5% SDS összetételű oldatban, majd 30 percig 65 °C hőmérsékleten mossuk 0,1 χ SSC és 0,5% SDS összetételű oldatban. A filtert röviden szárítjuk a levegőn, polietilén ételcsomagoló fóliával borítjuk, majd egy éjszakán át autoradiografáljuk, Kodak XAR-5 filmet és egyetlen Du Pont Lightning Plus erősítőfóliát alkalmazva.

A pin 2-1 jelű plazmid erősen hibridizál az N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamiddal kezelt növényből izolált gyökér-RNS-hez, és rendkívül gyengén hibridizált, ha egyáltalán hibridizált mind a kezeletlen növényekből, mind a 2-klór-benzolszulfonamiddal kezelt növényekből izolált RNS-hez. Ezeknek a kritériumoknak az alapján a 2-1 cDNS-klónról megerősítettük, hogy egy N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamiddal indukálható mRNS-t reprezentál.

A pin 2-1 plazmidot használjuk próbaként egy Northem-vizsgálatban, hogy meghatározzuk a megfelelő mRNS méretét. Két és fél pg-ot veszünk mind a kezeletlen, mind az N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamiddal kezelt növényből származó poli (A)+ RNSből, valamint a Brome mozaikvírus-RNS-ből (RNS-molekulasúly standard), majd külön 1,5 ml-es mikrocentrifugacsövekbe helyezzük, szárazra pároljuk, majd 8 pl Northem-mintapufferben vesszük fel (összetétele 25% ionmentesített formamid, 3% formaldehid, 5 mmol Na₂EDTA és 20 mmol nátrium-foszfát pH=6,8). Az RNS-t 15-20 percig 65 °C hőmérsékleten inkubáljuk, gyorsan jégbe hűtjük, majd 1 pl Northem-felvivőpuffert (összetétele 5 mmol nátrium-foszfát pH=6,8,50% glicerin és 0,2% bróm-fenolkék) adunk mindegyik csőbe. Az RNS-mintákat ezután 1,5% összetételű agarózgél 10 mmxl mm-es lyukaiba visszük fel, amely gélt 20 mmol nátrium-foszfát pH=6,8, 3% formaldehid összetételű oldatban készítettünk, majd az RNS-t egy éjszakán át elektroforetizáljuk 36-48 V feszültséggel szobahőmérsékleten 10 mmol nátrium-foszfát pH=6,8 és 3% formaldehid összetételű pufferben.

HU 218 717 Β

A BMV molekulasúly-markereket tartalmazó csíkokat kivágjuk a gélből egy borotvapengével, majd a gél megmaradt részét egy nejlonmembránra blotoljuk egy vegyi fülkében, lényegében Thomas P. S. leírása szerint [Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 77, 5200-5205 (1980)]. Az agarózgélt egy üveglapra borítjuk, amelyet 20xSSC-vel telített két Whatman 3MM papír borít. Az üveglapot 20 χ SSC-vel töltött tepsi fölé helyezzük oly módon, hogy a 3MM papír végei túlnyúljanak az üveglemezen, bele a tálban lévő 20xSSC-be. Egy Zeta-Probe nejlonmembránt (BioRad Laboratories) 0,5 cm-rel szélesebbre vágunk mint a gélt, vízben előre nedvesítjük, majd néhány percre 20xSSC-be merítjük. A membránt a gélre helyezzük, majd 20xSSC-be áztatott Whatman 541 papírlappal fedjük, majd néhány 20 χ SSC-be merített 3MM papírral. Egy 10 cm vastag papírtörölköző-köteget helyezünk a 3MM lapokra, hogy a puffért átszívassuk a gélen, ezzel a gélben lévő RNS-t egy éjszakán át szobahőmérsékleten átvisszük a membránra. A kapott RNSblotot ezután eltávolítjuk a gél tetejéről, miután megjelöltük a gélen lévő mintalyukak pozícióját a membránhoz viszonyítva. A filtert levegőn szárítjuk 1 órán át, majd 2 órán át 70 °C-on vákuumban megsütjük.

Az RNS molekulasúly-markereket 100 mól NaCl, pg/ml EtBr összetételű oldatban festjük 1 órán át, majd a fölösleges festéket eltávolítjuk 100 mmol ammónium-acetát, 10 mmol β-merkapto-etanol összetételű oldatban 2-3 órán át rázatva. Az RNS markerek helyzetét rögzítjük oly módon hogy a gélt ultraibolya fényben lefényképezzük. Az egyes RNS molekulasúly-markerek vándorlási távolságát ábrázoljuk molekulasúlyuk logaritmusa függvényében, hogy megállapítsunk egy kalibrációs görbét. Ezt a kalibrációs görbét használjuk arra, hogy meghatározzuk a 2-1 mRNS méretét, az ugyanabban az agarózgélben mért pozíciója alapján.

Az RNS-blotot előhibridizáljuk a Northern prehibridizációs pufferben (összetétele 50% ionmentesített formamid, 5xSSC, 5 χ Denhardt-oldat, 100 pg/ml forralt és ultrahanggal összetört boíjútimusz-DNS, 20 pg/ml homopoliA, 40 mmol nátrium-foszfát pH=6,8 és 0,5% BSA), 200 pl puffért használva a biot minden egyes négyzetcentiméterére egy hővel lezárt zacskóban. A prehibridizálást 6 óra hosszat 42 °C-on végezzük, időszakos keveréssel. A pln 2-1 plazmidot nick-transzlációba visszük egy nick-transzlációs kitet alkalmazva a fentiekben leírtak szerint, az elért specifikus aktivitás 5,9 χ 10⁸ cpm/pg DNS. A prehibridizációs puffért elöntjük, majd hibridizációs pufferrel helyettesítjük (összetétele 50% ionmentesített formamid, 5xSSC, 5 χ Denhardt-oldat, 100 pg/ml forralt és ultrahanggal összetört borjútimusz-DNS, 20 pg/ml homopoli A, 40 mmol nátrium-foszfát pH=6,8), amely 2x 10⁵ cpm/ml denaturált nick-transzlációba vitt pln 2-1 plazmidot tartalmaz 100 pl puffért alkalmazva egy négyzetcentiméter filterre.

A blotot 24 órán át 42 °C hőmérsékleten hibridizáljuk alkalmankénti keveréssel, majd kétszer mossuk szobahőmérsékleten 10-15 percig egy rázóasztalon x SSC, 5 mmol Na₂EDTA 25 mmol nátrium-foszfát pH=6,8, 1,5 mmol nátrium-pirofoszfát és 0,5% SDS összetételű oldattal. Ezt követi két 30-30 perces mosás 64 °C-on mindegyik 0,1 χ SSC és 0,5% SDS összetételű oldattal. A filtert levegőn szárítjuk, polietilén ételfóliába burkoljuk, majd egy éjszakán át Kodak XAR-5 filmre exponáljuk -80 °C-on, egyetlen Du Pont Lightning Plus erősítőt használva.

A Northem-blot eredményei megegyeznek a slotblot kísérlet eredményeivel. Nincs megfigyelhető hibridizáció a kezeletlen kukoricagyökér-RNS-sel, míg egyetlen intenzív hibridizációs jel látható egy 850-900 nukleotid méretű mRNS-hez az N-(amino-karbonil)-2-klórbenzolszulfonamiddal kezelt RNS-ben.

A pln 2-1 cDNS-inszert méretét úgy határozzuk meg, hogy a plazmidot teljesen megemésztjük Pst restrikciós enzimmel, majd az emésztési termékeket agarózgél-elektroforézisnek vetjük alá. Az eredmények azt mutatják, hogy a pln 2-1 inszert egyetlen 450 bp méretű PstI ffagment. A pln 2-1 inszert nem teljes hosszúságú másolata az mRNS-nek, mivel a Norther-analízis azt mutatta, hogy a 2-1 mRNS mérete 850-900 nukleotid. A pln 2-1 inszert azonban elég hosszú ahhoz, hogy próbaként lehessen használni a genomiális kiónok izolálásához. Egy teljes hosszúságú cDNS-klónra azonban még szükség van, hogy meghatározzuk a 2-1 gén(ek) struktúrgénje és szabályozórégiója határát.

Egy új cDNS-könyvtárat készítünk N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamiddal kezelt kukorica gyökereiből, azt az eljárást alkalmazva, amelyet arra terveztek, hogy maximalizálják a teljes hosszúságú cDNSklónok előállításának valószínűségét. Az első lánc szintézisét egy 100 pl-es reakcióelegyben végezzük, amely 50 pg/ml poli (A)⁺ RNS-t, 50 mmol TRIS-HCl-t pH=8,3 42 °C-on, 45 mmol KC1, 0,5 mmol dATP, dGTP és dTTP, 0,2 mmol dCTP, 5 mmol DTT,

7,5 pg/ml oligo (dT)12-18, 400 egység/ml placenta ribonukleáz inhibitor, 7,5 mmol MgCl₂, 4 mmol nátriumpirofoszfát, 0,4 mCi/ml [a³²P]dCTP és 560 egység/ml reverz transzkriptáz. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten inkubáljuk 5 percig, majd 45 percre 42 °C-ra visszük át. Az egyszálú cDNS-t egymás után extraháljuk fenol: kloroform 1:1 arányú elegyével, majd kloroformmal, ezt követően etanollal kicsapjuk ammónium-acetát jelenlétében.

A második láncot 1 pg első lánc cDNS-en szintetizáljuk egy 20 mmol TR1S-HC1 pH = 7,5, 5 mmol MgCl₂ 10 mmol (NH₄)₂SO₄,100 mmol KC1, 50 mg/ml BSA, 50 pmol dNTP-k, 0,1 mCi/ml [a³²P]dCTP, 230 egység/ml DNS-polimeráz I és 8,5 egység/ml RNáz H. A reakcióelegyet egy órán át 12 °C hőmérsékleten inkubáljuk, majd 1 órán át 20 °C-on. A második lánc szintézisreakciójának termékeit méret szerint elválasztjuk egy 1,0x15 cm-es Bio-Gel A-50m (Bio-Rad Laboratories) oszlopon, amelyet egyensúlyba hoztunk, majd eluálunk 0,3 mól nátrium-acetát TE-ben pH=8,0 készült oldatával. Az oszlopról eluált frakciókat összegyűjtjük, majd minden második frakcióból egy kis aliquot részt megvizsgálunk, megnézzük a cDNS méreteloszlását elektroforézissel, 1,2% összetételű lúgos agarózgélben. A gélben molekulasúly-marke17

HU 218 717 Β rekként a pUC18, pBR322 és SV40 ³²P-vel végjelzett HindlII restrikciós fragmentjeit futtatjuk. Az elektroforézis után a DNS-t fixáljuk a gélben oly módon, hogy 10-15 percig 15%-os TCA-ban áztatjuk. A fölösleges folyadékot eltávolítjuk a gélből oly módon, hogy a gélre 1-2 órára súllyal lenyomott papírtörölköző-köteget helyezünk, majd a gélt polietilénfóliába burkoljuk és Rtg-filmre exponáljuk. Az 500 bp-nál hosszabb cDNS-t tartalmazó oszlopfrakciókat egyesítjük, etanollal kétszer kicsapjuk, majd 8,5 μΐ vízben oldjuk.

Körülbelül 1-1,5 cDNS-t metilezünk a belső EcoRI hasítási helynél oly módon hogy 25 mmol TRIS-HC1 pH=7,5, 1,5 mmol EDTA, 2,5 mmol DTT, 10 pmól S-adenozil-metionin összetételű oldatban inkubáljuk 30 percig 37 °C-on 20 egység EcoRI metilázt használva egy mikrogramm cDNS-re. A metilázt úgy inaktiváljuk, hogy 10 percre 65 °C-ra melegítjük, majd fenol-kloroform 1:1 arányú elegyével extraháljuk, és etanollal kicsapjuk.

A cDNS-hez EcRI linkereket Egálunk oly módon, hogy 2 pg ds cDNS-t inkubálunk 7,5 pg foszforilezett linkerrel 66 mmol TRIS-DNS ligáz (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA 01915, CAT# 202) összetételű oldatban. A reakcióelegyet egy éjszakán át 15 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A linkerligálási reakció termékeit teljesen megemésztjük 500 egység EcoRI restrikciós enzimmel 4 órán át 37 °C-on. Az EcoRI emésztési elegyet 1x10 cm-es Bio-Gel A 50m oszlopra visszük, majd 0,3 mól nátrium-acetát TE-pufferben (pH=8,0) készült oldatával eluáljuk, hogy a cDNS-t elválasszuk a fölöslegben lévő linkerektől, és méret alapján frakcionáljuk a cDNS-t. A frakciókat lúgos agarózgél-elektroforézissel analizáljuk a fentiek szerint, majd a 600 bp-nál hosszabb cDNS-t tartalmazó frakciókat egyesítjük, és etanollal kicsapjuk. A cDNS-t 100 pl TE-pufferben (pH=8,0) szuszpendáljuk. A cDNS tömegét úgy becsüljük, hogy a cDNS egy aliquot részét megméijük, felhasználva a cDNS-szintézis reakcióban használt ³²PdCTP ismert specifikus aktivitását. A cDNS aliquot részeit EcoRI restrikciós enzimmel emésztett és defoszforilezett lambda-gtl 1 karokhoz ligáljuk (Stratagene, 11099 North Torrey Pines Rd., LaJolla, CA 92037, CAT# 200211), a fentiekben ismertetett ligálási körülményeket alkalmazva. A ligálási termékeket Gigapack Plus kivonatokkal (Stratagene) pakoljuk, az előállító által javasolt eljárást követve. A kapott fágkönyvtár titerét Escherichia coli Y1090 törzzsel mint gazdaszervezettel határozzuk meg.

A lambda-gtl 1 könyvtár átvizsgálása

Az Escherichia coli Y1090 NZC táptalajban exponenciálisan növekvő tenyészetéből egy 1,5 ml-es aliquot részt 0,6 ml SM pufferrel hígítunk (összetétele 0,01% zselatin, 50 mmol TRIS-HC1 pH=7,5, 5,8 g/1 NaCl, 2 g/1 MgSO₄), majd 2,1 ml 10 mmólos MgCl₂-ot, 10 mmol CaCl₂-ot adunk hozzá és 4 χ 10⁵ pfu-val fertőzzük a fág cDNS-könyvtárból 15 percig 37 °C hőmérsékleten. A fertőzött tenyészeteket ezután 10 ml 55 °C-os NZC-táptalajjal keveijük össze, amely 1% agarózt tartalmaz, majd olyan agarlemezekre szélesztjük, amelyek összetétele NZC-táptalaj + 1,5% bakto-agar, 150 mm-es

Petri-csészékben. A lemezeket egy éjszakán át 37 ^QC hőmérsékleten inkubáljuk, majd 4 °C-on tároljuk. Ezeket a lemezeket nevezzük az anya fág-DNS-könyvtámak.

Előre kivágott 82 mm-es HAHY nitrocellulóz filtereket (Millipore) nedvesítünk vízben, röviden belemerítjük 1 mólos NaCl-be, majd papírtörölközőn megszárítjuk. Többször lemásoljuk a lemezeket oly módon, hogy nedvesített nitrocellulóz filtereket teszünk a fágDNS-könyvtár minden egyes lehűtött anyalemezére 30-90 másodpercre. A filtereket összejelöljük a lemezzel oly módon, hogy aszimmetrikusan átszúrunk egy festéket tartalmazó 20-as injekciós tűt a filteren, bele az agarlemezbe. A filtereket ezután eltávolítjuk, és a fágDNS-t rögzítjük a filterhez, ugyanazt az eljárást alkalmazva, mint amelyet a baktériumtelepek lízisére leírtunk. A filtereket ezután levegőn szárítjuk 30-60 percig, majd 2 órán át 70 °C-on vákuumban sütjük. A filterpárokat hővel lezárható zacskóba tesszük a tarfoltos felükkel kifelé, majd előhibridizáljuk 6 χ SSC, 25 mmol nátrium-foszfát pH=6,8, 1 mmol EDTA, 1% SDS és 100 pg/ml összetört és denaturált borjútimusz-DNS összetételű oldattal 6-7 órán át 65 °C hőmérsékleten, alkalmankénti kevertetéssel.

A pln 2-1 plazmidot az előzőekben leírtak szerint nick-transzlációba visszük 2,5 χ 10⁸ cpm/pg DNS specifikus aktivitás elérésére, majd centrifugált oszlopos kromatográfiával tisztítjuk, Sephadex G-50-et alkalmazva. A prehibridizációs puffért eltávolítjuk a fágkönyvtár replikáit tartalmazó zacskókból, majd 20 ml ugyanilyen összetételű pufferrel helyettesítjük, amely 1,5 χ 10⁶ cpm denaturált pln 2-1 próbát tartalmaz 1 ml hibridizációs pufferre számítva. A filtereket egy éjszakán át 65 °C hőmérsékleten hibridizáljuk, időnként megkeverve. A filtereket eltávolítjuk a zacskókból, szobahőmérsékleten kétszer mossuk 15 percig 2 χ SSC, 0,5% SDS összetételű oldattal, majd kétszer 30 percig 65 °C hőmérsékleten 0,1 χ SSC, 0,1% SDS összetételű pufferben. A filtereket levegőn röviden szárítjuk, polietilénfóliába csomagoljuk, majd Kodak X-OMAT XAR-5 filmre exponáljuk -80 °C hőmérsékleten egy éjszakán át, egyetlen Du Pont Lightning Plus erősítőfóliát alkalmazva.

Az anyalemezekről izoláljuk azokat a tarfoltokat, amelyek a pln 2-1 próbával hibridizálnak. Ezekből a hibridizálódó fágokból törzstenyészeteket készítünk oly módon, hogy a megfelelő tarfoltokat tartalmazó lemezekből agarózdugókat távolítunk el, ezeket számozott mikrocentrifugacsövekbe helyezzük, amelyek 1 ml SM puffért és 1 csepp kloroformot tartalmaznak, majd hagyjuk hogy a fágok egy éjszakán át 4 °C-on kidiffundáljanak a dugókból. A tarfolt tisztítást úgy hajtjuk végre az egyes fágokon, hogy sorozathígítást készítünk az egyes fág törzstenyészetekből, a hígítások 100 pl-es aliquot részével Escherichia coli Y1090 törzs egy éjszakán át növesztett tenyészetének 100 pl-jét fertőzzük meg, majd a fentiek szerint NZC-lemezeken növesztjük őket. Ezekről a lemezekről lenyomatokat készítünk, majd ³²P pln 2-1 cDNS-sel hibridizáljuk az előzőekben leírtak szerint. A hibridizálódó tarfoltokat ismételten alávetjük ennek az eljárásnak, amíg egy adott lemezen az összes tarfolt nem hibridizál a 2-1 cDNS-próbával.

HU 218 717 Β

A lambda 2-1 kiónokból kis mennyiségű fág-DNS-t Maniatis et al. szerint izolálunk [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1982)]. A fág-DNS-t EcoRI restrikciós enzimmel teljesen megemésztjük, majd elektroforézissel vizsgáljuk 1%-os agarózgélben. Ennek a vizsgálatnak az eredménye egy fágklónt mutat, jelzése 2-1.12, és egy 900 bp méretű inszertet tartalmaz. Az inszert egyetlen belső EcoRI restrikciós hasítási helyet tartalmaz, amely egy 300 bp és egy 900 bp méretű fragmentet eredményez, ha EcoRI restrikciós enzimmel emésztjük. Ennek az inszertnek a mérete elég nagy ahhoz, hogy a 2-1 mRNS teljes hosszúságú másolata legyen. A pln 2-1 cDNS és a lambda 2-1.12 cDNS-inszertek restrikciós térképezése azt mutatja, hogy a lambda 2-1.12 a pln 2-1 cDNS teljes másolatát tartalmazza, és az összes hiányzó 2-1 mRNS-szekvencia valószínűleg jelen van a lambda 2-1.12 kiónon.

A lambda 2-1.12 600 bp méretű EcoRI fragmentjét a pUC18 plazmidvektorban szubklónozzuk. Ennek végrehajtásához a pUC18 DNS-t teljesen megemésztjük EcoRI restrikciós enzimmel. Az emésztés után egytized térfogatnyi 1 mólos TRIS-HC1 pH = 8,4 puffért adunk közvetlenül a csőbe. Borjúbél alkalikus foszfatázt (C1AP) adunk 0,5 egység/pg DNS-mennyiségben. A defoszforilezési reakciót 55 °C hőmérsékleten végezzük 30 percig. A CIAP-ot úgy inaktíváljuk, hogy a DNS-t egymás után extraháljuk azonos térfogatú fenollal, fenol: kloroform (1:1) eleggyel és kloroformmal. A DNS-t ezután etanollal kicsapjuk, 0,25 mól nátriumacetáttal (pH=6,0) centrifugálással összegyűjtjük, majd újra oldjuk TE-pufferben (pH=8,0).

A lambda 2-1.12 DNS-t teljesen megemésztjük EcoRI restrikciós enzimmel, majd ekvimoláris mennyiségű defoszforilezett, EcoRI restrikciós enzimmel emésztett pUC18 DNS-t és EcoRI restrikciós enzimmel emésztett lambda 2-1.12 DNS-t ligálunk össze egy éjszakán át 16 °C hőmérsékleten, a korábban ismertetett ligálási körülményeket alkalmazva. A ligálóelegy egy aliquot részét használjuk lefagyasztott kompetens Escherichia coli HB101 sejtek (Bethesda Research Laboratories) transzformálására. A kompetens sejtek transzformálását úgy végezzük, hogy a sejteket eltávolítjuk a -80 °C-os tárolóból, majd jégen megolvasztjuk. A ligálóelegyet ötszörösre hígítjuk vízzel, majd ebből egy aliquot részt összekeverünk 100 μΐ kompetens sejttel. Az elegyet 30 percig jégen inkubáljuk, majd hővel sokkoljuk oly módon, hogy 45 másodpercre 42 °C-os vízfürdőbe merítjük rázatás nélkül. A sejteket visszavisszük a jégre 2 percre, majd 0,9 ml S. O. C. táptalajjal hígítjuk (összetétele 2% Bacto-tripton, 0,5% élesztőkivonat, 10 mmol NaCl, 2,5 mmol KC1,10 mmol MgSO₄ és 20 mmol glükóz). A sejteket ezután 225/perc fordulatszámmal rázatjuk 37 °C hőmérsékleten egy órán át, majd a transzformációs elegyből aliquot részeket szélesztünk 50 pg/ml ampicillint tartalmazó LB-lemezekre. A lemezeket egy éjszakán át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Kis mennyiségű plazmid-DNS-t izolálunk az egyes ampicillinrezisztens telepekből, és a DNS aliquot részeit EcoRI restrikciós enzimmel emésztjük addig, amíg egy olyan telepet találunk, amely a pln

2-1.12 600 bp méretű EcoRI fragmentjét pUC18 plazmidba klónozva tartalmazza. Ezt a plazmidot nevezzük pIn2-1.12A-nak.

A 2-1 cDNS-klónok DNS-szekvencia-analizise

A 2-1 mRNS nukleotidszekvenciát a pln 2-1 és a lambda 21.12 p szekvenciaanalízisével határozzuk meg. A pln 2-1 inszertet M13mpl8 vektorba szubklónozzuk, hogy a didezoxi-szekvenálást el tudjuk végezni. A szubklónozáshoz a pln 2-1 egy aliquot részét Pst I restrikciós enzimmel teljesen megemésztjük, majd a kapott 450 bp méretű fragmentet az M13mpl8 RF vektor Pst hasítási helyére klónozzuk. A ligáló reakcióelegy egy aliquot részét használjuk Escherichia coli JM101 törzs transzfektálására, majd a transzfekciós reakcióelegy aliquot részeit LB-lemezekre szélesztjük, amelyek X-Gal-t és IPTG-t tartalmaznak, és egy éjszakán át növesztjük 37 °C hőmérsékleten. Az egyes fehér tarfoltokat addig analizáljuk, amíg egy olyan fágot nem találunk, amely a cDNS-inszertet az M13 fág PstI hasítási helyén tartalmazza. Ebből a fágból egy DNS-szekvenálási templátot készítünk oly módon, hogy a tarfolt egy részét leszedjük az agárról, majd ezt használjuk 3 ml 2 χ YT táptalaj beoltására, amely egy 15 ml-es csőben van, és 200 pl exponenciálisan növekvő Escherichia coli JM101 sejteket tartalmaz. A tenyészetet 37 °C hőmérsékleten 5 órán át növesztjük erős rázatás közben. A fágtenyészetből egy 1 ml-es aliquot részt kiveszünk, majd egy 1,5 ml-es mikrocentrifugacsőben 5-10 percig centrifugáljuk 4 °C hőmérsékleten. A fág felülúszóból 1 ml-t óvatosan kipipettázunk, majd egy friss csőbe helyezzük, amely 200 pl 20% PEG 8000,

2,5 mól NaCl összetételű oldatot tartalmaz. A csövet néhányszor megforgatjuk, majd 20-30 percig szobahőmérsékleten inkubáljuk. A fágokat 10 perces centrifugálással gyűjtjük össze egy mikrocentrifugában szobahőmérsékleten. A felülúszót óvatosan eltávolítjuk, majd a csövet újra centrifugáljuk, hogy a cső faláról az összes ott maradt felülúszót eltávolitsuk. A fágokat 100 pl 10 mmólos TRIS-HC1 pH=7,6 összetételű pufferben szuszpendáljuk, majd 50 pl fenol: kloroform 1:1 arányú elegyével extraháljuk a csövét vortexelve. A csövet 5 percig szobahőmérsékleten centrifugáljuk, majd a felső vizes fázist egy új csőbe visszük át. A fág-DNS-t 25 μΐ 2 mólos nátrium-acetát (pH=7,0) és 320 μΐ etanol hozzáadásával kicsapjuk (-70 °C, 10 perc vagy egy éjszakán át -20 °C). A DNS-t, amely alkalmas szekvenáló templátnak, centrifugálással összegyűjtjük (mikrocentrifuga 4 °C, 10-20 perc), majd TE-pufferben (pH=8,0) oldjuk.

Ezt a templát-DNS-t szekvenáljuk a Sanger-féle didezoxi-módszerrel [Sanger, F. et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA; 74, 5403 (1977)], egy didezoxi-szekvenáló kit felhasználásával [Pharmacia Inc., 800 Centennial Avenue, Piscataway, NJ 08854, CAT# 27-1555-01], a gyártó által javasolt eljárást követve.

Az M13 fágban lévő 2-1 DNS-inszert egy részét kivágjuk oly módon, hogy az RF DNS-t EcoRI restrik19

HU 218 717 Β ciós enzimmel hasítjuk, majd a DNS-t újra összeligáljuk. Ezáltal a cDNS-inszertből a vektorban lévő szekvenáló indítómolekula melletti körülbelül 170 bp méretű részt eltávolítjuk. Ezt a szubklónt szekvenáljuk az előzőek szerint, az univerzális indítómolekulát alkalmazva, hogy a pln 2-1 cDNS-klón szekvenálását teljesen végrehajtsuk.

A 2 -1.12A cDNS-klónt megszekvenáljuk, hogy teljessé tegyük a 2-1 mRNS szekvenciáját. A pln 2-1. 12A szekvenciáját Maxam és Gilbert módszerével határozzuk meg [Maxam, A. M. és Gilbert, W., Methods in Enzymology, 65, 499-512 (1980)], a Barker és munkatársai-féle módosításokat alkalmazva [Barker et al., Plánt Molecular Biology, 2, 335-350 (1983)]. A DNSszekvencia analízise megerősítette a pln 2-1 és a pln 2-1.12 azonosságát, mivel a két kiónban lévő közös 200 bp-os rész nukleotidszekvenciája azonos.

A 2—1 21.14 genomiális klón izolálása

A DNS-izoláláshoz használt növényi anyagot az üvegházban növesztett, beltenyésztett Missouri 17 (Mól 17) kukoricából nyerjük. A vegetatív növényekről származó leveleket begyűjtjük, majd cseppfolyós nitrogénben lefagyasztjuk. Nagy molekulasúlyú DNS-t izolálunk 30 g levélből az alábbiak szerint. A megfagyasztott levéltömeget egy kávéőrlőbe tesszük egy kis mennyiségű szárazjéggel együtt, majd finom porrá őröljük. Miután a szárzajég szublimált, a fagyott port áttesszük egy üvegpohárba, majd 100 ml hideg A pufferben szuszpendáljuk (összetétele 100 mmol TRIS-HC1 pH=9,0, 100 mmol NaCl, 100 mmol MgCl₂, 0,5 mmol szacharóz, 0,1% β-merkapto-etanol, 0,4% dietil-tiokarbaminsav). A szuszpenzióból kiülepitjük a magokat oly módon, hogy 10 000/perc fordulatszámmal centrifugáljuk 2 percig egy Sorvall GSA-rotorban. A felülúszót elöntjük, majd az üledéket 3 ml A pufferben szuszpendáljuk. A magokat ellizáljuk oly módon, hogy 20 ml lízispufferben szuszpendáljuk őket (100 mmol TRIS-HC1 pH = 8,3, 100 mmol NaCl, 50 mmol Na₂EDTA, 1,5% SDS, 15% fenol), majd az elegyet 10 percig 55 °C hőmérsékleten inkubáljuk állandó kevertetés közben. Ezután 10 ml 5 mólos kálium-acetátot adunk hozzá, majd az elegyet jégre tesszük 10 percre, hogy az SDS-t, SDS-fehérje-komplexet és az SDS-sejtfal-komplexet kicsapjuk. A csapadékot centrifugálással gyűjtjük össze (5000/perc, 10 perc, Sorvall asztali centrifugában). A felülúszót egy új csőbe visszük át, majd az oldatot azonos térfogatú kloroform: izoamil-alkohol (24:1 arányú elegy) eleggyel extraháljuk, miután 3 ml 10 mólos ammónium-acetátot adtunk hozzá. A DNS-t ezután azonos térfogatú izopropanol hozzáadásával kicsapjuk, centrifugálással összegyűjtjük, és 30 ml vízben szuszpendáljuk. Szilárd cézium-kloridot adunk hozzá 0,9 g/ml oldatmennyiségben, majd etidium-bromidot adunk hozzá 300 pg/ml koncentrációban. A DNS-t 16 órán át centrifugáljuk 45 000/perc fordulatszámmal Beckman Vti50 rotorban. A csíkozódott DNS-t kinyerjük a gradiensből oly módon, hogy a centrifúgacső oldatát 16-os tűvel kiszúrjuk, és eltávolítjuk a csíkot. A DNS-t 30 ml-re hígítjuk 1 g/ml CsCl (úgy állítjuk elő, hogy 100 g CsCl-t adunk 100 ml tenyészetpufferhez pH=8,0) oldattal, majd az előzőekben ismertetett módon újra tisztítjuk. Az etidium-bromidot a DNSből nátrium-kloriddal, valamint vízzel telített izopropanollal való ismételt extrakcióval távolítjuk el. A DNS-t ezután izopropanollal kicsapjuk. A Mól7 genomiális DNS-t centrifúgálással nyerjük ki, majd TE-pufferben (pH=8,0) szuszpendáljuk.

Egy Mól 7 genomiális könyvtárat a következőképpen állítunk elő: 100 pg Mol7 DNS-t 24 egység Sau3A restrikciós enzimmel emésztünk Cutsall-ban (összetétele 100 mmol kálium-klorid, 20 mmol TRIS-HC1 pH=7,5, 2 mmol β-merkapto-etanol, 7 mmol magnézium-klorid). A reakcióelegy egyötödét 2,4, 6, 8, illetve 10 perc elteltével eltávolítjuk, majd a reakciót 50 mmólra állított EDTA-val állítjuk le. Az öt időpontot egyesítjük, azonos térfogatú fenol:kloroform:izoamilalkohol eleggyel (25:24:1) extraháljuk, majd az összeöntött oldatban lévő DNS-t etanollal kicsapjuk, és centrifúgálással összegyűjtjük. A DNS-t 0,1 ml vízben oldjuk, majd egy 10-40%-os glicerin gradiensre töltjük (összetétele 10-40% glicerin 1 mólos NaCl-ban, 20 mmol TR1S-HC1 pH=8,0, 1 mmol EDTA). A centrifugálást 4000/perc fordulatszámmal végezzük 16 órán át Beckman SW 41-rotorban. A poliallomercső aljáról 0,4 ml-es frakciót szedünk egy széles tűn keresztül, majd a frakciók aliquot részeit elektroforézissel vizsgáljuk 0,9%-os agarózgélben. A 12-20 kb méretű DNSffagmenteket tartalmazó frakciókat egyesítjük, azonos térfogatú fenol: kloroform 1:1 eleggyel extraháljuk, etanollal kicsapjuk, majd TE-pufferben (pH=8,0) szuszpendáljuk. Ebből a méret szerint frakcionált DNS-ből 0,4 pg-ot Egálunk egy éjszakán át 1 pg EcoRI-BamHI restrikciós enzimekkel emésztett lambda-EMBL 3 DNShez (Stratagene), 5 Weiss-egység DNS-ligázt használva (New England Biolabs) ligázpufferben (50 mmol TRIS-HC1 pH = 8,0, 10 mmol ditiotreitol, 10 mmol magnézium-klorid, 1 mmol ATP) 15 °C hőmérsékleten. A ligáit DNS-t Gigapack Gold pakolóeleggyel pakoljuk (Stratagene), az előállító előírásait követve.

Egy 500 000 fágból álló könyvtárat kiszélesztünk 150 mm-es LAM-lemezekre (összetétele 10 g Bactotrypton, 5 g élesztőkivonat, 10 g NaCl, 2,5 g MgSO₄. 7H₂O, 10 g agaróz literenként, 80 ml táptalaj lemezenként), körülbelül 25 000 tarfolt/lemez sűrűségben. Ennek végrehajtására fágot (200 pl-nél kisebb térfogatban) adunk 200 μΐ 10 mmólos CaCl₂, 10 mmol MgCl₂ és 200 pl egy éjszakán át 2x YT-táptalajban növesztett Escherichia coli LE 392 tenyészetet tartalmazó oldathoz (a2χYTösszetétele lógBacto-trypton, 10gélesztőkivonat, 5 g NaCl, 0,2% maltóz vízzel 1 literre töltve), majd a fágokat hagyjuk a gazdasejtekhez adszorbeálódni 37 °C hőmérsékleten 10-15 percig. Majd ezt a tenyészetet adjuk 8 ml olvasztott 0,8%-os rétegzőagarhoz (összetétele 10 g Bacto-trypton, 2,5 g NaCl, 0,2 g MgCl₂, 8 g agaróz vízzel 1 literre feltöltve) 50 °C hőmérsékleten, majd LAM-lemezekre szélesztjük. Miután a rétegzőagaróz megkeményedett, a lemezeket éjszakán át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk.

Másnap reggel másolatokat készítünk a fágokról oly módon, hogy száraz nitrocellulóz filtereket (Millipore)

HU 218 717 Β helyezünk a lemezek felszínére 5 percre. A filtereket ezután egy 0,5 mól NaOH, 1,5 mól NaCl összetételű oldattal átitatott Whatman 3M papírdarabra tesszük át. 5 perc elteltével a filtereket 0,5 mól TRIS-HC1 pH=7,5,

1,5 mól NaCl összetételű oldattal átitatott 3MM papírlapra tesszük át. 5 perc elteltével a filtereket 2 χ SSC-vel telített 3MM papírlapra helyezzük 5-10 percre. A filtereket ezután 80 °C hőmérsékleten vákuumban sütjük.

A filtereket előhibridizáljuk 42 °C hőmérsékleten órán át egy 150 mm-es üveg kristályosítótálban 150 ml prehibridizációs puffért alkalmazva (összetétele 50% ionmentesített formamid 5xSSC, 100 pg/ml denaturált heringsperma-DNS, 0,05% SDS, 0,05 mól nátrium-foszfát 0,1% Ficoll, 0,1% poli(vinil-pirrolidon), 0,1% BSA). 1 pg pln 2-1 plazmid-DNS-t nick-transzlációba viszünk 50 pl, a következő összetételű oldatban: 50 mmol TRIS-HC1 pH=7,2, 10 mmol MgSO₄, 0,1 mmol DTT, 50 mg/ml BSA, 10 pCi ³²P dATP (Amersham), 2 pg/ml DN-áz (Sigma DN-EP), 20 pmol dATP, dTTP, dGTP, egység DNS-polimeráz I (BMB), 15 °C, 1 óra. A reakciót 1 pl 0,5 mólos EDTA hozzáadásával állítjuk le, majd a DNS-t kicsapjuk, 50 pl víz, 30 pl 10 mólos ammónium-acetát, 10 pg élesztő-tRNS-hordozó és 350 pl etanol hozzáadásával. A DNS-t centrifugálással gyűjtjük össze, 0,5 ml vízben oldjuk, majd hővel denaturáljuk, 5 percig forrásban lévő vízben tartva, majd gyorsan jégbe hűtjük. A prehibridizációs oldatot elöntjük, majd a filtereket egy éjszakán át 42 °C hőmérsékleten reagáltatjuk a nick-transzlációba vitt pln 2-1 DNS hibridizációs pufferben készült oldatával (50% ionmentesített formamid, 5xSSC, 100 6G/ml denaturált heringsperma-DNS, 0,05% SDS, 0,02 mól nátrium-foszfát, 0,2% Ficoll, 0,02 szarvasmarhaszérum-albumin, 10% dextran-szulfát) a használt aktivitás 5χ 10⁵ cpm/ml puffer. A következő reggel a filtereket kétszer 20 percig mossuk 1 χ SSC, 0,5% SDS összetételű oldatban szobahőmérsékleten, majd háromszor 20 percig 0,1% SSC, 0,5% SDS összetételű oldatban 65 °C hőmérsékleten, egy rázatott vízfürdőben. A filtereket két 3MM papír között megszárítjuk, polietilénfóliába tesszük, majd Kodak XAR-5 filmmel egy éjszakán át exponáljuk -80 °C hőmérsékleten, egyetlen Du Pont Lightning Plus erősítőfóliát alkalmazva. A filmeket Kodak XOMAT berendezésben hívjuk elő.

A pozitív tarfoltokat úgy izoláljuk, hogy az agarlemezből dugókat vágunk ki egy Pasteur vastag végével, majd 0,5 ml SM-pufferbe tesszük. Az egyes dugókban lévő fágokból készült hígításokat használjuk Escherichia coli LE392 törzs megfertőzésére úgy, mint az előzőekben, majd 80 mm átmérőjű LAM-lemezekre szélesztjük, 3 ml fedőagart, 100 ml 10 mmólos CaCl₂-ot, 10 mmol MgCl₂-ot és 100 pl egy éjszakán át növesztett Escherichia coli LE392 tenyészetet. Az egyes fág tarfoltok tisztítását az előzőek szerint végezzük. A fág másolatkészítés-izolálás-szélesztés ciklust addig ismételjük, amíg tiszta tarfoltokat nem kapunk. Tizenöt tiszta fágizolátumot, jelük 21.1-21.15, növesztünk folyadéktenyészetben, a DNS izolálása céljából. A különálló tiszta tarfoltokat eltávolítjuk a lemezekről, és 0,5 ml SM-be eluáljuk. Ezekből a fág törzstenyészetekből 5050 pl-t inkubálunk 50 pl, kétszeresre töményített, egy éjszakán át növesztett LE392 tenyészettel, 10 mmol MgCl₂-ban 37 °C hőmérsékleten, 15 percig. A megfertőzött baktériumokat ezután 20 ml előmelegített LB-táptalajhoz adjuk (10 g Bacto-trypton, 5 g Bacto-élesztőkivonat, 5 g NaCl, 1 g glükóz vízzel 1 literre feltöltve), majd 37 °C hőmérsékleten rázatjuk 180-200/perc fordulatszámmal. A tenyészetek általában 4-7 óra elteltével lizálnak. Kloroformot adunk hozzájuk 1% koncentrációban, majd a lizátumokat további 10 percig rázatjuk. A sejttörmeléket 10 000/fordulatszámon végzett centrifügálással távolítjuk el (10 perc, Sorvall SS34 rotor). A felülúszókat új csövekbe visszük át, majd DNáz I-et és RN-áz A-t adunk hozzá 20 pg/ml, illetve 10 pg/ml koncentrációban. 15-30 percig inkubáljuk 37 °C hőmérsékleten, majd a fágokat egyötöd térfogatnyi 20%-os PEG 8000, 2,5 mól NaCl összetételű oldatnak a lizátumhoz való hozzáadásával kicsapjuk. 15 percig tartjuk szobahőmérsékleten, majd a fágokat centrifugálással összegyűjtjük (15 000/perc, 15 perc, 4 °C, Sorvall SS34 rotor), majd 0,5 ml SM-ben szuszpendáljuk. A fágszuszpenzióhoz 50 pl 0,5 mólos EDTA-t, 70 pl 10%-os SDS-t és 300 pl fenolt adunk, hogy ellizáljuk a fágokat. A lizátumokat fenol:kloroform 1:1 arányú elegyével extraháljuk, majd a vizes fázisban lévő DNS-t kicsapjuk, tized térfogatnyi 3,0 mólos nátrium-acetát és kétharmad térfogatnyi izopropanol hozzáadásával. A DNS-t centrifugálással nyerjük ki, az üledéket 70%-os etanollal mossuk, szárítjuk és 50 pl vízben szuszpendáljuk.

A 21.14 genomiális klón azonosítása és jellemzése A tizenöt genomiális kiónt először restrikciós enzimes emésztéssel jellemezzük, hogy megtaláljuk azokat a régiókat a kiónokban, amelyek megfelelnek a 2-1 cDNS-nek. 2 pg DNS-t emésztünk különböző restrikciós enzimekkel 10 pl 1 χ cutsall-ban (vagy l,5xcutsall a Sall-hez), majd elektroforézissel analizáljuk, 1%-os agarózgélt használva. Az egyes kiónokról készített restrikciós térképek alapján nem lehetett a további elemzés céljára alkalmas géneket találni. Ennélfogva ezeket a genomiális kiónokat egy olyan próbával térképezzük, amely úgy készül, hogy N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamiddal kezelt kukoricagyökerekből izolált RNS-t használunk templátként véletlenszerűen indított cDNS-szintézisre, hogy azonosítsuk a különböző genomiális kiónokban azokat a régiókat, amelyek megfelelnek a gének kódoló régióinak. A fág-DNS-t különböző restrikciós enzimekkel emésztjük, majd a hasítási termékeket elektroforézissel választjuk szét 1%-os agarózgélen. A DNS-t Gene Screen Plus membránokra visszük át (New England Nuclear), majd egy véletlenszerűen indított cDNS-próbával hibridizáljuk, amelyet a következőképpen készítünk: N(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamiddal kezelt kukoricagyökerekből izolált 1 pg poli (A)⁺ RNS-t adunk 30 pl vízhez, majd a forrásban lévő vízfürdőbe helyezzük 5 percre. Miután jégbe hűtöttük, 10 pl 10 χ első szál puffért (0,5 mól TR1S-HC1 pH = 8,5, 0,4 mól KC1, 0,1 mól MgCl₂, 0,4 mól DTT), 2,5 pl 2 mmólos dATP-t, 2,5 pl 2 mmólos dGTP-t, 5 pl 20 mó21

HU 218 717 Β los dTTP-t, 1 μΐ RN-azint (Promega Biotech, Inc.), 20 μΐ random hexamer indítómolekulát (16 μg/μl, Pharmacia, CAT# 272266-01 vagy P-L Biochemicals, CAT# PLB9223), 10 pl a³²dATP-t (100 pCi), és 20 egység reverz transzkriptázt adunk mellé. A reakcióelegyet ezután 1 órán át 37 °C-on inkubáljuk. A reakciót 10 μΐ 0,5 mólos EDTA hozzáadásával állítjuk le. Az RNS-t elhidrolizáljuk 50 μΐ 0,15 mólos NaOH hozzáadásával, majd a reakcióelegyet egy órán át 65 °C hőmérsékleten tartjuk. A lúgot 25 μΐ 2 mólos TRIS-HC1 pH=8,0 és 50 μΐ 1 mólos HC1 hozzáadásával semlegesítjük. A DNS-t ammónium-acetáttal és etanollal csapjuk ki hordozó transzfer RNS jelenlétében az előzőek szerint. A véletlenszerűen indított cDNS-próbát ezután 0,5 ml vízben oldjuk. A hibridizálást és prehibridizálást a fentiek szerint a genomiális könyvtár átvizsgálására leírt módon végezzük. Az ebből a restrikciós térképezésből kapott adatok az egyes genomiális kiónokban olyan területeket határoznak meg, amelyek homológok a pln 2-1 -gyei, de nem sikerült olyan genomiális kiónt azonosítani, amely megfelel az In2-1 cDNS-nek. Ezért a genomiális kiónoknak azokat a ffagmentjeit, amelyek hibridizálódnak a random cDNS-próbához, vagy pUC19, vagy Bluescript pBS(+) (Stratagene) vektorban szubklónozzuk DNS-szekvencia-analízis céljára.

A genomiális cDNS-ek szubklónozását úgy hajtjuk végre, hogy 10 pg fág-DNS-t és egy megfelelő vektort emésztünk [vagy pUC19-et, vagy a pBS(+)-t] a megfelelő restrikciós enzimekkel. A DNS-eket fenol:kloroform 1:1 elegyével extraháljuk, etanollal kicsapjuk, majd 10 pl TE-pufferben oldjuk. A fág-DNS-t hozzáligáljuk a vektor DNS-hez 10 pl végtérfogatban. Miután egy éjszakán át inkubáltuk 15 °C hőmérsékleten, a ligálás termékét használjuk kompetens Escherichia coli JM83 sejtek transzformálására. A keresett plazmidot hordozó telepeket azonosítjuk oly módon, hogy kis mennyiségű plazmidpreparátumokat készítünk, majd a keletkező plazmidokból aliquot részeket emésztünk diagnosztikus restrikciós enzimekkel.

A szubklónozott genomiális fragmentek szekvenálásának stratégiáját úgy alakítjuk ki, hogy mindegyik szubklónból átfedő deléciók csoportját állítsuk elő Bal31 nukleáz alkalmazásával (New England Biolabs). 20 pg plazmid-DNS-t linearizálunk megfelelő restrikciós enzimmel, majd extraháljuk fenol: kloroform 1:1 arányú elegyével, és etanollal kicsapjuk. A DNS-t centrifugálással nyeljük ki, egyszer mossuk 70%-os etanollal, megszárítjuk, majd 100 pl vízben szuszpendáljuk. A nukleázos emésztést 250 pl össztérfogatban végezzük, 20 egység Bal31-et alkalmazva az előállító által javasolt reakciókörülmények között. 8 perc alatt különböző időpontokban 10 μΐ-es aliquot részeket veszünk ki, majd 5 csoportot képezünk belőlük. A reakciókat úgy állítjuk le, hogy az aliquot részeket 150 pl víz, 5 pl hordozó tRNS (5 mg/ml), 25 pl 0,2 mólos EGTA és 25 pl 3 mólos nátrium-acetát elegyéhez adjuk. Az öt deléciós poolt gélelektroforézissel vizsgáljuk, hogy megállapítsuk az emésztés megfelelő mértékét. Az egyesített DNS-eket fenol : kloroform 1:1 arányú elegy ével extraháljuk, etanollal kicsapjuk, majd 100 pl vízben oldjuk. A deléciók

5’-végét tompa véggé alakítjuk, feltöltési reakciót hajtunk végre, a DNS-polimeráz I Klenow-fragmentjét alkalmazva. A 10x Klenow-sók (0,5 mól TRIS-HC1 pH=7,2 vagy 7,5, 0,1 mól MgSO₄, 10 mmol DTT) tized térfogatnyi mennyiségét, 5 mmólos dezoxi-nukleotid-trifoszfátok térfogatnyi mennyiségét, 5 mmólos dezoxi-nukleotid-trifoszfátok (mind a négy dNTP) egyhuszad térfogatát és 1 egység Klenow-fragmentet adunk 1 pg DNS-hez, majd a feltöltési reakcióelegyet 30 percig inkubáljuk szobahőmérsékleten. A DNS-t ezután fenol:kloroform 1:1 arányú elegyével extraháljuk, etanollal kicsapjuk, majd 100 pl vízben szuszpendáljuk. A DNS-ek aliquot részeit vagy EcRI, vagy HindlII restrikciós enzimekkel teljesen megemésztjük, hogy a delécióval rendelkező inszertet kivágjuk. A DNS-eket fenol: kloroform 1:1 arányú elegyével extraháljuk, etanollal kicsapjuk, majd 100 pg/ml koncentrációban oldjuk vízben, 15-25 pl végtérfogatban. A DNS-ből 0,5 pl-t ligálunk 0,1 pg, Smal/EcoRI restrikciós enzimmel emésztett M13mpl9 DNS-sel, vagy 0,1 pg HindlII/Smal restrikciós enzimmel emésztett M13mpl9 DNS-sel 20 pl ligázpufferben egy éjszakán át 15 °C hőmérsékleten. Ezeknek a ligálóelegyeknek az egyharmadát vagy felét használjuk kompetens Escherichia coli JM101 sejtek transzfektálására. A transzfektált sejteket 3 ml 0,8%-os fedőagarózban szélesztjük, amely 10 pl 0,1 mól IPTG-t, 100 pl 2%-os X-gal-t és 100 pl 2xYTben egy éjszakán át növesztett Escherichia coli JM101 sejteket tartalmaz.

A fágokról az előzőekben leírtak szerint készítünk másolatokat. A lenyomatokat plazmidból származó, ³²P-vel jelzett, gélen tisztított inszertekkel mint próbákkal vizsgáljuk át, amelyekbe már deléciókat vittünk be, hozzácsepegtetünk a Bal31 deléciókkal rendelkező tarfoltokat kimutassuk. A próbával hibridizálódó tarfoltokat izoláljuk, és az alábbiak szerint növesztjük: egy pozitív tarfoltot steril fogpiszkálóval leveszünk, melyet azután 10 pl, egy éjszakán át növesztett Excherichia coli JM101 tenyészetet tartalmazó 2 ml 2χΥΤ táptalajba teszünk. A tenyészetet ezután 5 órán át 37 °C hőmérsékleten növesztjük, majd kis mennyiségű plazmidpreparátumot készítünk belőle. 1 ml egy éjszakán át növesztett tenyészetet egy mikrocentrifügacsőbe teszünk, majd 20 másodpercig centrifugáljuk. A felülúszót egy új csőbe öntjük át, majd eltesszük, a későbbiekben egyszálú DNS-t izolálunk belőle. Az ülepített sejteket 0,35 ml BPB-ben szuszpendáljuk (8% szacharóz, 0,5% Triton X-100, 50 mmol EDTA pH=8,0, 10 mmol TRIS-HC1 pH=8,0). Frissen készült lizozimoldatból (10 mg/ml BPB-ben) 25 pl-t adunk hozzá, majd a csövet forrásban lévő vízbe helyezzük 40 másodpercre, majd azonnal lecentrifugáljuk (10 perc szobahőmérsékleten) egy mikrocentrifugában. A kromoszomális DNS és a törmelék zselatinszerű csapadékot képez, ezt egy steril fogpiszkálóval eltávolítjuk. A plazmid-DNS-t kicsapjuk, 30 pl 3 mólos nátrium-acetát és 250 pl izopropanol hozzáadásával. A DNS-t centrifugálással nyerjük ki, mossuk 70%-os etanollal, szárítjuk, majd 75 pl vízben szuszpendáljuk. 6 pl-es aliquot részeket emésztünk (Cutsall-ban) a megfelelő enzimekkel, amelyek kivágják az inszerteket. Miután ezeket az emésztéseket gél22

HU 218 717 Β elektroforézissel megvizsgáltuk 1%-os agarózgélen, a szubklónokat csökkenő méret szerint rendezzük sorba (azaz növekvő méretű Bal31-es emésztés szerint), majd a kiónokat úgy választjuk ki, hogy a kiindulási klón növekvő 100 bp-es Bal31-es deléciót kapjuk.

A didezoxi láncterminációs szekvenáláshoz egyszálú DNS-t a kis mennyiségű plazmidizolálási eljárás kezdetén félretett 1 ml felülúszóból izolálunk. A felülúszót 150 μΐ 20%-os PEG és 2,5 mól centrifügálással nyerjük ki (5 perc mikrocentrifugában 15 perc elteltével szobahőmérsékleten). A felülúszó minden nyomát leszívással eltávolítjuk, majd a csapadékot 100 μΐ 0,3 mól nátrium-acetát, 1 mmol EDTA összetételű oldatban oldjuk. A fágot azonos térfogatú fenol: kloroform 1:1 arányú elegyével extraháljuk, majd a DNS-t etanollal kicsapjuk. A DNS-t centrifügálással nyerjük ki, 70%-os etanollal mossuk, röviden szárítjuk, majd 25 μΐ vízben oldjuk.

A szekvenálást univerzális M13 -10-es 17 tagú indítómolekulával (New England Biolabs, Inc.) hajtjuk végre. Az illesztőreakciót 60-65 °C hőmérsékleten végezzük 1 órán át, 3,5 μΐ templát DNS-t, 2,5 μΐ illesztőpuffert (100 mmol TRIS-HC1 pH=8,5, 50 mmol MgCl₂), 1 μΐ univerzális szekvenáló indítómolekulát (1 ng/μΐ) és 4 μΐ vizet tartalmazó oldatban. Az illesztett DNS-t ezután jégre tesszük. A szekvenálóreakció komponensei az alábbiak:

1) terminációs keverékek, amelyek didezoxi A-t, C-t, G-t és T-t plusz dezoxi A-t, C-t, G-t és T-t tartalmaznak megfelelő arányban;

2) polimeráz koktél, amelynek összetétele 0,9 μΐ 0,1 mól TRIS-HC1 pH=8,3, 1 μΐ (10 pCi) ³⁵S dATP, μΐ 0,1 mólos ditiotreitol, 6,1 μΐ víz, 0,25 μΐ Klenowffagment (5 egység/μΐ). Mindegyik komponensből két μΐ-t elegyítünk egy mikrotiter lemez lukaiban - 4 luk (A, C, G, T) mindegyik illesztéshez -, majd 20 percig 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Ekkor 2 μΐ leállítóoldatot (egy oldat, amely mind a négy dNTP-ből 0,5 mmólt tartalmaz) adunk mindegyik lukhoz. További 25 perc inkubálás után leállító festékelegyet (0,08% bróm-fenolkék, 0,08 xilén-cianol, 20 mmol EDTA ionmentesített formamidban) adunk a lukakhoz. A reakcióelegyeket lefedés nélkül 90 °C-ra melegítjük 10 percre egy kályhában, jégre tesszük, elektroforézissel vizsgáljuk 6%-os poliakrilamidgélben, 1 χ TBE-pufferrel (0,089 mól TRIS-borát, 0,089 mól bórsav, 0,00 mól EDTA), amely 8 mól karbamidot tartalmaz, 1500 V feszültséggel órán át. A karbamidot eltávolítjuk a gélből oly módon, hogy 15 percre 10% metanol, 10% ecetsav összetételű oldatba merítjük. A gélt ezután egy Whatman 3MM papírlapra visszük át, majd egy gélszárítón vákuumban megszárítjuk. A gélt Kodak X-AR filmen egy éjszakán át autoradiografáljuk szobahőmérsékleten, erősítőfólia nélkül. A DNS-szekvenciát leolvassuk a gélről, egy számítógépbe visszük, majd a Cold Spring Harbor programokkal elemezzük. A 21.14 gén promoterének szekvenciáját az Ncol hasítási helytől 5’-irányban, amely a fehérjeszintézist iniciálja, a 2. ábrán mutatjuk be. A szekvencia elemzése azt mutatja, hogy a 21.14 genomiális kiónnak egy 1.9 kb méretű EcoRI/Sall szubklónja tartalmazza a 2-1 mRNS 3’-felét. Ennek a szubklónnak a jelzése pJE482-62. Hasonlóképpen a 21.14 kiónnak egy 4.8 kb méretű EcoRI/Sall szubklónjáról kiderült, hogy a 2-1 mRNS 5’-felét tartalmazza. Ennek a kiónnak a jelzése pJE484-l. A teljes szekvenciaanalízis felfedte, hogy a 21.14 genomiális klón a 2-1 kódoló szekvenciának egy tökéletes másolatát tartalmazza 9 exon és 8 intron között elosztva. Ezért a21.14a2-l mRNS-t kódoló klón.

A 21.14 szabályozórégióinak klónozása és mutagenezise

Egy genomiális klón azonosítása után, amelynek a szekvenciája tökéletesen egyezik a 2-1 cDNS-klónok szekvenciájával, kutatás kezdődött a gén szabályozórégiói után. A hírvivő RNS-en a fehérjeszintézist iniciáló első kodont a 21.14 génben a pozíciója alapján és a konszenzus A...ATGG szekvencia alapján azonosítottuk, valamint azon az alapon, hogy a 21.14 genomiális szekvenciát a 2-1 cDNS-szekvencia nyitott leolvasási keretével hasonlítottuk össze.

A p484-l (Ncol) és p484-62 (Bgl II) plazmidok előállítása

Helyspecifikus mutagenezist végzünk a 21.14 genomiális klón szabályozórégiójában úgy, hogy az idegen kódoló szekvencia könnyen azoknak a vegyületeknek a szabályozása alá essen, amelyekről ismert, hogy a 2-1 gén expresszióját befolyásolják. Egy 5’-GAGCTGCGGTACCGGC-3’ szekvenciájú oligonukleotidot tervezünk, hogy egy Ncol restrikciós hasítási helyet vigyünk be a pJE484-l plazmidba az ATG kodonnál, amely megfelel a 2-1 fehérje kódoló szakasza kiindulási pontjának a hírvivő mRNS-en. Egy másik, 5’-TGAGATCTGACAAA-3’ szekvenciájú oligonukleotidot is tervezünk azzal a céllal, hogy egy BglII restrikciós hasítási helyet vigyünk be a pJE482-62 plazmidba a gén 3’-végénél, a 2-1 fehérje terminációs kodonja után 9 bázispárral. Mindkét oligonukleotidot egy Applied Biosystems DNS-szintetizátoron állítjuk elő.

A pJE484-l plazmidot a dut ung- Escherichia coli BW313 törzsbe transzformáljuk [Proceedings of the National Academy of Sciences, USA,. 79, 488-492 (1982)]. A tenyészeteket egyszálú DNS előállítása céljából növesztjük, amint azt előzőleg ebben a példában ismertettük. A telepeket steril fogpiszkálóval izoláljuk, majd ezzel két 5 ml-es csövet oltunk, amelyek 100 pg/ml ampicillint és 5 μΐ Mml307 törzstenyészetet (ez egy segítőfág az egyszálú DNS pakolásához, titere 10¹¹ pfu/ml) tartalmazó 2 χ YT-táptalajt tartalmaznak. A tenyészeteket 37 °C hőmérsékleten rázatjuk, majd kétórás növesztés után 50 pg/ml végkoncentrációban kanamicint adunk hozzá. Az inkubálást tovább folytatjuk egy éjszakán át 37 °C hőmérsékleten. A csöveket összeöntjük, majd a baktériumokat centrifügálással eltávolítjuk (8000/perc, 10 perc, 4 °C, Sorvall HB4 rotor). A felülúszóból 6 ml-t egy új csőbe teszünk át, majd

1,5 ml 20% PEG, 2,5 mól NaCl összetételű oldatot adunk hozzá, és jól összekeverjük. 15 perc elteltével (szobahőmérsékleten) a fágrészecskéket centrifugálással ülepítjük (8000/perc, 10 perc, Sorvall HB4 rotor).

HU 218 717 Β

A csapadékot 0,4 ml 2x YT-táptalajban szuszpendáljuk, majd egy új mikrofugacsőbe visszük át. A fágrészecskéket 0,1 ml 20%-os PEG és 2,5 mól NaCl összetételű oldat hozzáadásával kicsapjuk. 5 perc elteltével a fágokat centrifugálással összegyűjtjük, majd a felülúszó nyomait leszívással eltávolítjuk. A fágrészecskéket 0,5 ml 0,3 mól nátrium-acetát, 1 mmol EDTA összetételű oldatban szuszpendáljuk, majd fenol:kloroform 1:1 arányú elegyével extraháljuk. A fág-DNS-t ezután etanollal kicsapjuk, centrifugálással összegyűjtjük, mossuk egyszer etanollal, centrifügálással összegyűjtjük, majd 50 μΐ vízben szuszpendáljuk. A DNS koncentrációját úgy határozzuk meg, hogy az oldat ötvenszeres hígításának abszorbanciáját megmérjük. Ennek az egyszálú DNS-nek 0,5 pmólját illesztjük az 5’-GAGCTGCGGTACCGGC-3’ oligonukleotid 25 pmóljához 20 μΐ Fritz standard illesztőpufferben (a 8 χ illesztőpuffer összetétele 1,5 mól K.C1, 100 mmol TRIS-HC1 pH=7,5) 55 °C hőmérsékleten 30 percig, 37 °C-on 15 percig, majd 15 percig szobahőmérsékleten. Az illesztés után 2,3 μΐ lOxfeltöltőpuffert (0,625 mól K.C1, 0,275 mól TRIS-HC1 pH = 7,5, 0,15 mól MgCl₂, 20 mmol DTT, 2 mmol ATP, 1 mmol mindegyik dNTP-ből), 1 pg KJenow-fragmentet (5 egység/μΐ) és 1 pl 0,6 egység/μΐ koncentrációjú DNS-ligázt adunk hozzá. A csövet egy éjszakán át szobahőmérsékleten inkubáljuk. A következő napon kompetens Escherichia coli JM83 törzset transzformálunk ennek a ligálóreakciónak a termékével (a korábbiak szerint), majd 100 pg/ml ampicillint tartalmazó LB-lemezekre szélesztjük. A keletkező telepekből kis mennyiségben plazmidot izolálunk, majd a DNS-t Ncol restrikciós enzimmel emésztjük, egészen addig, amíg egy olyan transzformánst nem találunk, amely Ncol restrikciós enzimmel linearizálható plazmidot tartalmaz, jelezve, hogy a kívánt mutáció létrejött. Ennek az új plazmidnak a neve pJE484-l (Ncol) (3. ábra). Ugyanilyen módon a pJE484-62 plazmidot az 5’-TGAGGATCTGACAAA-3’ oligonukleotiddal mutagenizáljuk, így kapunk egy új BglII restrikciós hasítási helyet a 2-1 fehérje transzlációs stophelye után. Ennek az új plazmidnak a jele pJE484-62 (BglII) (3. ábra).

A 21.14 gén transzkripciós starthelyének azonosítása

Úgynevezett primer (indítómolekula) extenziós elemzést végzünk a 21.14 génen, hogy meghatározzuk a transzkripciós starthelyet, McKnight módszerét alkalmazva [McKnight, S., L., Cell, 31, 355-366 (1982)]. Egy HH17 jelű szintetikus oligonukleotidot szintetizálunk, amely a fordított komplementje a 21.14 gén kódoló lánca 572-593-as bázisainak (1. ábra). A szintézishez az Applied Biosystems Model 380A DNSszintetizátorát használjuk. A HH17 oligonukleotidot (5’-CATGTCGGTCGAGATGGGACTGG-3’) végjelezzük ³²P-gamma-ATP-vel (specifikus aktivitás 3000 Ci/mol, NEN Research Products) az alábbiak szerint: 5 pl (8. 34 pmol) ³²P-gamma ATP-t mikrofugacsőben vákuumban beszárítunk. Az üledéket 2 pl (5 pmol) HH17 indítómolekulában és 2 pl 2,5 χ kinázpufferben (az lxpuffer összetétele 50 mmol TRIS-HC1 pH=9,5, mmol MgCl₂, 5 mmol ditiotreitol, 1 mmol spermidin, 0,1 mmol EDTA) oldjuk. 1 μΐ T4 polinukleotid kinázt (5,3 egység/μΐ, Pharmacia) adunk hozzá, majd a jelzést hagyjuk lejátszódni 37 °C hőmérsékleten 15 percig. A reakciót úgy állítjuk le, hogy 75 pl TE-puffert (10 mmol TRIS-HC1 pH=8, 1 mmol EDTA), 54 pl 5 mólos ammónium-acetátot, 20 pg élesztő tRNS hordozót és 350 pl jéghideg etanolt adunk hozzá. Az oligonukleotidot szárazjégen 30 percig tartva csapjuk ki, majd centrifügálással nyerjük ki 4 °C-on. Az üledéket 90 pl TE-pufferben (pH=8) oldjuk, majd újra kicsapjuk szárazjégen 30 percig inkubálva, miután hozzáadtunk 10 pl 3 mólos nátrium-acetátot (pH=6) és 250 pl jéghideg etanolt. Az oligonukleotidüledéket az előzőek szerint gyűjtjük össze, 95%-os etanollal öblítjük, majd vákuumban szárítjuk. Az üledéket 50 pl TRIS-HC1 pH=8 pufferben oldjuk 0,1 pmol/pl végkoncentrációban, és 4 °C hőmérsékleten tároljuk.

A 6 órán át N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamiddal hidroponikusan kezelt Mól7 kukoricanövény gyökereiből izolált 8 pg össz-RNS-t keverünk össze 2 pl (0,2 pmol) ³²P-jelzett HH17 indítómolekulával, 2 pl 5 χ illesztőpufferrel (összetétele 1,25 mól K.C1, 10 mmol TRIS-HC1 pH=7,9) és 1 pl 30 mmol vanadilribonukleozid komplexszel (Bethesda Research Labs) 0 °C hőmérsékleten. Az illesztést úgy hajtjuk végre, hogy a reakcióelegyet 3 percre 65 °C-ra melegítjük, majd 2 óra alatt 35 °C-ra hagyjuk hűlni. A primer extenziót úgy hajtjuk végre, hogy 23 pl PE keveréket (10 mmol MgCl₂, 5 mmol ditiotreitol, 20 mmol TRIS-HC1 pH = 8,3, 0,33 mmol dATP, dCTP, dGTP és dTTP, 100 pg/ml aktinomicin-D) és 0,5 pl AMV reverz transzkriptázt (10 egység/pl, Molecular Genetic Resources) adunk a csövekhez, majd 45 percig 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A primer extenzió termékeit szárazjégen csapjuk ki 20 perc alatt 300 pl jéghideg etanol hozzáadása után. A csapadékot centrifugálással gyűjtjük össze (4 °C), 70%-os jéghideg etanollal öblítjük, majd vákuumban szárítjuk.

A HH17 oligonukleotidot használjuk indítómolekulaként a pJE516 plazmid szekvenálásához (leírása a 6. példában). 4 pg pJE516 plazmidot denaturálunk 200 mmol NaOH, 0,2 mmol EDTA összetételű oldatban szobahőmérsékleten 5 percig, majd a lúgot 2 mólos ammónium-acetáttal (pH=5,4) semlegesítjük 0 °C hőmérsékleten. A denaturált DNS-t szárazjégen csapjuk ki 10 perc alatt, miután 2 térfogat jéghideg etanolt hozzáadtunk. A DNS-t centrifugálással nyerjük ki (4 °C, 15 perc), 70%-os etanollal öblítjük, vákuumban szárítjuk, majd 10 pl vízben oldjuk. 7 pl denaturált pJE516 plazmidot szekvenálunk a HH17 oligonukleotiddal mint indítómolekulával, egy Sequenase Kitet alkalmazva (United States Biochemical Corporation), a gyártó által javasolt eljárással.

A fentiekből származó primer extenziós termékeket 3 pl 0,1 mólos NaOH, 1 mmol EDTA összetételű oldatban oldjuk 30 perc alatt, szobahőmérsékleten. A gélre felvivő pufferből 6 pl-t adunk hozzá, majd az oldatot 5 percig 90 °C hőmérsékleten tartjuk. A primer extenziós termékeket és az elindított pJE516 szekvenálóreak24

HU 218 717 Β ciókat elektroforézissel elválasztjuk egy 12%-os poliakrilamidgélen, 7 mól karbamidot tartalmazó 1 χ TBEpufferben. A gélt ezután megszárítjuk és autoradiografáljuk. A primer extenziós termékek elemzése azt mutatja, hogy egy fő csík van jelen, amelynek a hossza megfelel a 2, ábrán látható 21.14 gén promoterfragmentje 532-es bázispárjánál lévő transzkripciós starthelynek, valamint két kisebb csík, amelyek megfelelnek az 533-as és 536-os bázisoknak. Ezeknek a bázisoknak a pozícióját a 2. ábrán nyilakkal jelöljük. Ennek alapján a 21.14 jelű 2-1 kukoricagén-promoter 532-as bázisát tekintjük a fő transzkripciós starthelynek.

2. példa

A 2-2#4 kukorica 2-2 gén promoterének és 3 '-régióinak azonosítása és izolálása A 2—2 cDNS-klónok izolálása és azonosítása A 2. példa eljárásainak végrehajtásához szükséges technikák részleteit az 1. példában közöljük. Az N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamiddal hidroponikusan kezelt Missouri 17 kukoricanövény gyökereiből izolált poli (A)⁺ RNS felhasználásával készült cDNSkönyvtárat (leírása az 1. példában) vizsgáljuk, hogy van-e benne még helyettesített benzolszulfonamiddal indukálható mRNS-eket képviselő cDNS-klón. A könyvtárat differenciális szűrővizsgálatnak vetjük alá mint az előzőekben, majd egy új telepet azonosítunk, amely erősebb hibridizálást mutat azzal a cDNS-próbával, amelyet N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamiddal hidroponikusan kezelt Missouri 17 kukoricanövény gyökereiből izolált poli (A)⁺ RNS felhasználásával kaptunk. Ennek a telepnek a jele In 2-2.

Kis mennyiségű plazmidpreparátumot készítünk az In 2-2 telepben található plazmidból. Ennek a plazmidnak a jele pln 2-2. A pln 2-2 egy aliquot részét nicktranszlációnak vetjük alá a fentiek szerint. Slot-blotot készítünk, amely N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamiddal kezelt, illetve kezeletlen gyökerekből izolált össz-RNS-t tartalmaz, majd próbaként a pln 2-2 plazmidból készült próbát használjuk hozzá, amint azt az 1. példában a pln 2-1-re leírtuk. Ez az elemzés megerősítette, hogy a pln 2-2 tartalmaz egy olyan inszertet, amely erősen hibridizál az N-(amino-karbonil)-2-klórbenzolszulfonamiddal kezelt növények gyökereiből származó RNS-sel, de nem reagál kezeletlen gyökerekből származó RNS-sel.

A kis mennyiségű pln 2-2 plazmidpreparátumot teljesen megemésztjük Pstl restrikciós enzimmel, majd agarózgél-elektroforézissel elemezzük. A plazmidcDNS inszertjét a Pstl restrikciós enzim kivágja egyetlen 1200 bp méretű fragment formájában. A nicktranszlációba vitt pln 2-2 plazmidot használjuk próbaként egy Northem-blotban mind kezeletlen, mind N(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamiddal kezelt növények gyökereiből származó RNS-t vizsgálva. Ez a próba egyetlen, 1350 nukleotid hosszúságú mRNS-hez hibridizál, amely csak N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamiddal kezelt növények gyökereiből származó RNS-ben található meg. Ez azt jelzi, hogy a pln

2-2 plazmidban lévő inszert nem teljes hosszúságú másolata a 2-2 mRNS-nek.

Egy új plazmid-cDNS-könyvtárat készítünk a teljes hosszúságú 2-2 cDNS-klónok izolálására. A ds cDNS egy aliquot részét, amelyet az 1. példában leírt lambda-gtl 1-könyvtár készítésére használtunk, egy éjszakán át ligáljuk a pUC18 vektorba, amelyet teljesen megemésztettünk EcoRI restrikciós enzimmel, majd defoszforileztünk. A ligáló reakcióelegy aliquot részeit használjuk kompetens Escherichia coli δ_Η (CDC1₃)₅ transzformálására (Bethesda Research Laboratories), a gyártó által javasolt eljárást alkalmazva. Erről a könyvtárról anyafilterek egy készletét állítjuk elő oly módon, hogy az egyes ampicillinrezisztens telepeket nitrocellulóz filterre visszük át megfelelő elrendezésben, amint azt az 1. példában a plazmid-cDNS-könyvtárra leírtuk. Egy másik anyafilterkészletet is előállítottunk oly módon, hogy a telepeket közvetlenül visszük át nitrocellulózra, a száraz filtert közvetlenül lemezenként 150-250 transzformáit telepet tartalmazó lemezre fektetve. A filtert ezután eltávolítjuk, és a telepekkel felfelé friss LB/amp lemezre tesszük. A könyvtár három replika nitrocellulóz filter másolatát készítjük el, majd az egyes telepekben lévő DNS-t a filterekhez rögzítjük az előzőekben leírtak szerint. A replikafilterekből egy készletet előhibridizálunk, majd egy kevert próbával hibridizálunk, amely különböző forrásokból származó, beleértve a pln 2-2 plazmidot is, nick-transzlációba vitt plazmid-DNS-eket tartalmaz. A plazmid nick-transzlációját, a filter prehibridizációját és hibridizációját az 1. példában a lambda-gtl 1-cDNSkönyvtárból származó specifikus cDNS-klónok azonosítására leirt módon végezzük. Összesen 1500 telepet vizsgálunk át, majd ezek közül 12 telepet hibridizálunk a kevert cDNS-próbához.

Ezeknek a feltételezett pozitív kiónoknak a jellemzéséhez kis mennyiségű plazmid-DNS-t izolálunk az egyes telepekből. A plazmidokat teljesen megemésztjük EcoRI restrikciós enzimekkel, majd az emésztési termékeket agarózgél-elektroforézissel választjuk el. A gélben lévő DNS-fragmenteket Zeta Probe membránra blotoljuk, majd a blotot nick-transzlációba vitt pln 2-2 plazmiddal hibridizáljuk, hogy a kevert populációból azonosítsuk a 2-2 kiónokat, valamint hogy egy becslést tehessünk a talált új 2-2 kiónokban lévő inszert méretére. Öt telep hibridizált a 2-2 próbához, egyről úgy tűnt, hogy a teljes 1350 nukleotid hosszúságú inszertet tartalmazza. Ez a klón a pln 2-2-3 jelzést kapta.

A 2—2 #4 genomiális klón izolálása

A Mol7 genomiális DNS-ből készült könyvtárat, amelyet a 2-1 cDNS-nek megfelelő genomiális klón előállítására használtunk, átvizsgáljuk a 2-2 genomiális kiónokra is, az 1. példában leírt módon. Három 2-2 genomiális kiónt azonosítottunk és tisztítottunk tarfolttisztítással ebből a könyvtárból. A három kiónt térképezzük, random indított cDNS-szintézissel készült próbát használva, N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamiddal kezelt kukorica gyökeréből származó RNS-t használva erre a célra az 1. példában leírt módon. Ennek az elemzésnek az eredményei azt mutatják,

HU 218 717 Β hogy a 2-2 #4 jelzésű klón tartalmaz az inszertje közepén egy régiót, amely homológ a random indított cDNS-próbával, ezért ezt választottuk a további elemzések céljára.

Az In 2-2-3 és 2-2 #4 klánok DNS-szekvenciavizsgálata

A 2-2 #4 fág törzslemezét úgy állítjuk elő, hogy az Escherichia coli LE392 törzs egy éjszakán át növesztett tenyészetéből 100 μΐ-t azonos térfogatú 10 mmol MgCl₂, 10 mmol CaCl₂ összetételű oldattal hígítjuk. A hígított tenyészetet 37 °C hőmérsékleten 20 percig inkubáljuk 40 pl tarfolttisztított 2-2 #4 fággal. A tenyészetet 3 ml 55 °C-os olvasztott fedőagarózzal (0,7% agaróz NZC táptalajban) keveijük össze, 100 m átmérőjű NZC-agarlemezre visszük, majd 8 órán át 37 °C hőmérsékleten növesztjük. A lemez felszínét 6 ml SM-mel borítjuk, majd egy éjszakán át 4 °C-on rázatjuk egy körkörös rázón 50 ford/perc fordulatszámmal. Az SM-et eltávolítjuk a lemezről, 50 μΐ CHCl₃-mal elegyítjük, majd 4 °C hőmérsékleten tároljuk. Ebből a törzstenyészetből készült sorozathígításokat Escherichia coli LE392 törzsön titráljuk, hogy meghatározzuk a fágtitert.

A 2-2 #4 genomiális klón DNS-éből nagy mennyiségű plazmid-DNS-t izolálunk oly módon, hogy az Escherichia coli LE392 törzs egy éjszakán át NZC-táptalajban növesztett tenyészetéből 3 ml-t 3 ml 10 mmol MgCl₂, 10 mmol CaCl₂ összetételű oldattal hígítjuk, majd a baktériumokat a 2-2 #4 klónból 2χ 10⁶ tarfoltképzó egységgel (pfu) oltjuk be. Ezt a tenyészetet 15-20 percig 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk, majd 500 ml 37 °C-os NZC beoltására használjuk. A tenyészetet 37 °C hőmérsékleten erős rázatás közben kevertetjük, amíg nem lizál (körülbelül 7 óra). A lizátumot szobahőmérsékletre hűtjük jégen, 1-1 mg DN-áz I-et és RN-áz A-t adunk hozzá, majd a tenyészetet 30 percig szobahőmérsékleten hagyjuk állni. Szilárd NaCl-ot adunk hozzá 1 mól végkoncentrációban, és a tenyészetet 1 órára jégre tesszük. A törmeléket centrifugálással távolítjuk el a lizátumból (11 000/perc, Sorvall GSA rotor) és polietilénglikolt (PEG 8000) adunk hozzá 10 tömeg% végkoncentrációban. Miután 2 órán át inkubáltuk 4 °C hőmérsékleten, a fágot a fentiek szerint centrifugálva nyerjük ki, majd 15 ml össztérfogatú SM-ben szuszpendáljuk. A fágokat 15 ml kloroformmal extraháljuk, majd 1600 g-vel 15 percig centrifugáljuk HB-4 rotorban, majd a fágot tartalmazó felső fázist egy éjszakán át 4 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A fágokat megtisztítjuk oly módon, hogy egy lépcsős gradiensre visszük, amely úgy készül, hogy 6 ml 5 mólos CsCl TM-pufferes oldatát (összetétel: 10 mmol TRIS-HC1 pH=8,0, 10 mmol MgCl₂) rétegezzük 6 ml 3 mólos CsCl TM-pufferben készült oldata alá. A gradienst 22 000/perc fordulatszámmal centrifugáljuk Beckman SW28 rotorban 2 órán át 4 °C hőmérsékleten. A 3 mól CsCl/5 mól CsCl határfelületén összegyűlő fágokat eltávolítjuk, azonos térfogatú, TM-ben készült telített CsCl-dal elegyítjük, majd egy SW28 centrifugacső aljára rétegezzük. A fágokat ezután sorra rétegezzük 3 ml 6 mólos CsCl TM-es oldatával, 3 ml 3 mólos CsCl TM-es oldatával, majd annyi TMmel, amennyi a centrifugacső feltöltéséhez kell. A gradienst az előzőek szerint centrifugáljuk, és a fágokat azonos módszerrel nyerjük ki. A fágokat dializáljuk, háromszor cserélt 50 mmol TRIS-HC1 pH=8,0 10 mmol NaCl, 10 mmol MgCl₂ összetételű pufferrel szemben (egy-egy dialízis ideje egy óra), majd egy polipropiléncsőbe tesszük. A térfogatot 1,2 ml-re állítjuk dialízispufferrel, majd a fágot lizáljuk, 172 μΐ víz, 37,5 μΐ 20%-os SDS, 60 μΐ 0,5 mólos Na₂EDTA pH=8,0 és 30 μΐ 5 mg/ml proteinase K összetételű oldattal. A lízist 1 órán át végezzük 55 °C hőmérsékleten, majd a DNS-t egyszer extraháljuk azonos térfogatú fenollal, majd egyszer azonos térfogatú fenol:kloroform 1:1 arányú elegyével, és egyszer azonos térfogatú kloroformmal. A DNS-t 80 μΐ nátrium-acetát pH=6,0 és 3,2 ml etanol hozzáadásával kicsapjuk 5 percig szobahőmérsékleten inkubálva. A DNS-t Pasteur-pipettára tekerve nyerjük ki. A feltekert DNS-t 70% etanollal mossuk, majd egy éjszakán át hagyjuk oldódni oly módon, hogy a pipettát 1 ml TE-be tesszük (pH=8.0).

A 2-2#4 genomiális klón fragmentjeit szubklónozzuk oly módon, hogy részlegesen emésztünk 35 pg 2-2#4 DNS-t 80 egység EcoRI restrikciós enzimmel 37 °C hőmérsékleten. Az emésztés 7,5-45 perces időtartama alatt 8,5 pg DNS-eket tartalmazó aliquotokat veszünk, majd az EcoRI restrikciós enzimet inaktiváljuk oly módon, hogy az egyes időpontokból származó mintákat 10 percre 70 °C-ra melegítjük. A mintákból kis aliquotokat veszünk, és elektroforézissel vizsgáljuk 0,8%-os agarózban, hogy az emésztés mértékét meghatározzuk. A részleges EcoRI emésztési termékeket tartalmazó mintákat egy éjszakán át pUC18 plazmidba ligáljuk, amelyet előzőleg teljesen megemésztettünk EcoRI restrikciós enzimmel és defoszforileztünk. A ligálási reakcióelegyeket 4 térfogat vízzel hígítjuk, majd az egyes reakcióelegyekból vett aliquot részekkel transzformálunk kompetens Escherichia coli HB101 sejteket. A transzformáló reakcióelegy aliquot részeit ampicillintartalmú LB-lemezekre szélesztjük, majd a lemezeket éjszakán át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Az egyes antibiotikumrezisztens telepekből származó plazmidokat megvizsgáljuk, hogy tartalmaznak-e a 2-2#4 fág-DNSből származó EcoRI fragmentet. Nagy mennyiségű plazmidot izolálunk a 2-2 #2, 2-2 #11, 2-2 #17 és 2-2 #23 jelű genomiális kiónok szubklónjaiból, amelyeknek az inszertjei teljes átlapolási biztosítanak a 2-2 #4 genomiális klón régiójában, amely a 2-2 gént tartalmazza (4A. ábra).

Az In 2-2-3 cDNS-klón szekvenciáit és a #2, #11, #17 valamint a #23 plazmid genomiális szubklón megfelelő részeit Maxam és Gilbert módszerével határozzuk meg [Barker et al. leírása szerint, Plánt Mól. Bioi., 2, 335-350]. A genomiális szubklónok szekvenciáit összeállítva kapjuk a 2-2 gén teljes nukleotidszekvenciáját. A 2-2-3 cDNS-klón nukleotidszekvenciáját a 2-2 #4 genomiális szekvenciájával összehasonlítva azt látjuk, hogy a 2-2 #4 tartalmazza a teljes 2-2-3 cDNS-klónt néhány exonra szétosztva.

A 2-2 #4 gén 5’ nem transzlálódó és promoterrégiójának nukleotidszekvenciáját a 4B. ábrán mutatjuk be. A 2-2 fehéije transzlációs startkodonjaként mű26

HU 218 717 Β ködő ATG egy természetes Ncol helyben található a 2-2 #4 génben. A megfelelő promoterfragmenteket, amelyek felhasználhatók a rekombináns DNS-konstrukciók expressziójának szabályozására, eltávolíthatjuk ebből a szubklónból oly módon, hogy az Ncol restrikciós helyet elhasítjuk, és a promoter eltávolítása bármelyik, az Ncol hasítási helytől 5’-irányban lévő hasítási helynél, például az Xhol hasítási helynél egy 1.9 kb méretű fragmentet eredményez. A későbbi példákban bemutatjuk ezeknek a fragmenteknek a felhasználását.

3. példa

Az 52 411 kukorica 5-2 gén promoterének és downstream régiójának azonosítása és izolálása Az 5-2 cDNS-klónok izolálása és azonosítása A 3. példa végrehajtása során alkalmazott technikák részleteit az 1. példában közöltük. Az 1. példában leírt N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamiddal hidroponikusan kezelt Missouri 17 kukoricanövény gyökereiből izolált poli (A)⁺ RNS felhasználásával kapott cDNS-könyvtárat átvizsgáljuk, tartalmaz-e további, N(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamiddal indukálható mRNS-eket. Az 1. példában ismertetett differenciális átvizsgálási módszert használjuk egy új telep izolálására, amely erősebben hibridizál azzal a cDNS-próbával, amelyet N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamiddal kezelt gyökerek RNS-éből kaptunk. Ennek a telepnek a jelzése In 5-2.

Kis mennyiségű plazmidot izolálunk az In 5-2 egy éjszakán át növesztett tenyészetéből, majd a plazmid (jelzése pln 5-2) egy aliquot részét nick-transzlációba visszük slot-blot analízist végzünk az 1. példában leírtak szerint, a nick-transzlációval jelzett pln 5-2 plazmid felhasználásával. Ez az analízis megerősíti, hogy a pln 5-2 plazmid tartalmaz egy DNS-inszertet, amely erősen hibridizál az N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamiddal kezelt gyökerek RNS-éhez, de nem hibridizál a kontrollgyökerekből izolált RNS-hez. Ennek a plazmidnak a jelzése pln 5-2.

A kis mennyiségű pln 5-2 plazmidpreparátumot teljesen megemésztjük PstI restrikciós enzimmel, majd agarózgél-elektroforézissel elemezzük. A plazmid-cDNS-inszertjét egyetlen 420 bp méretű PstI fragment formájában hasítjuk ki. A pln 5-2 plazmidot nick-transzlációval jelezzük, majd próbaként használjuk egy Northem-blotban mind kezeletlen, mind N(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamiddaI kezelt gyökerek RNS-ének vizsgálatában. A plazmid hibridizál egy 2000 nukleotid méretű mRNS-hez, amely a gyökérszövetekben kémiai kezelés hatására indukálódik.

Mivel a pln 5-2 nem egy teljes hosszúságú másolata az 5-2 mRNS-nek, ezért az 1. példában készített lambda-gtl 1-fág cDNS-könyvtárat átvizsgáljuk, tartalmaz-e teljes hosszúságú 5-2 cDNS-klónokat. Ezt úgy hajtjuk végre, hogy a könyvtárat a pln 5-2-ből származó, nick-transzlációval jelzett, tisztított cDNS-inszerttel mint próbával vizsgáljuk át az 1. példában leírt módszereket alkalmazva. Hat különböző fágklón mutatott homológiát a pln 5-2 cDNS-inszerthez, ezeket tarfolttisztításnak vetettük alá. Ezekből a fágokból kis mennyiségű DNS-t készítünk, majd ezeknek a fágoknak az aliquot részeit teljesen megemésztjük EcoRI restrikciós enzimmel, és agarózgél-elektroforézissel vizsgáljuk. Három kiónt, amelyek az 5-2 mRNS-hez hasonló méretű inszertet tartalmaznak, pUC18 plazmidban szubklónozzuk, a fág-DNS-t teljesen megemésztve EcoRI restrikciós enzimmel, majd a keletkező DNS-t a pUC18 EcoRI helyére ligáivá. Egy szubklónt, jele pln 5-2.32, választunk ki a további elemzés céljára.

Az 52.411 genomiális klón izolálása

A 2-1 hírvivő mRNS genomiális kiónjainak előállítására használt Mol7 genomiális DNS-könyvtárat vizsgáljuk át az 1. példában leírt, nick-transzlációval jelzett pln 5-2 plazmiddal, hogy az 5-2 hírvivő mRNS-nek megfelelő genomiális kiónokat izoláljuk. Ily módon hat db 5-2 genomiális kiónt vetünk alá tarfolttisztításnak ebből a könyvtárból. Ezeket a genomiális kiónokat hibridizálással térképezzük, véletlenszerűen indított cDNS-t alkalmazva, amelyet N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamiddal kezelt kukoricagyökerek RNS-ét felhasználva állítunk elő, hogy az In 5-2 cDNS-sel homológ régiókat azonosítsuk az 1. példában leírtak szerint. Ennek az elemzésnek az eredményei azt mutatják, hogy mind a hat klón ugyanazt a véletlenszerűen indított-cDS próbával homológ régiót tartalmazza. Egy kiónt, jele 52.411, választunk ki a további elemzések céljára, hogy meghatározzuk kapcsolatát az In 5-2 cDNS-sel.

Az 52.411 genomiális kiónt teljesen megemésztjük EcoRI és Smal restrikciós enzimekkel, majd ugyanezzel a két enzimmel teljesen megemésztett pUC19 vektorba ligáljuk. Miután a ligáló reakcióeleggyel Escherichia coli sejteket transzformáltunk, kis mennyiségű plazmidpreparátumot készítünk a keletkező ampicillinrezisztens telepekből, egészen addig, amíg nem találunk egy olyan telepet, amely a pUC 19-be ligáit 12 kb méretű EcoRI/Smal fragmentet tartalmaz. Ennek a plazmidnak a jele pJE490.

A pJE490 plazmidot teljesen megemésztjük EcoRI és Sall restrikciós enzimekkel, majd a keletkező fragmenteket az ugyanezzel a két restrikciós enzimmel emésztett pUC19 vektorba ligáljuk. Miután a ligáló reakcióeleggyel Escherichia coli sejteket transzformáltunk, kis mennyiségű plazmidpreparátumot készítünk a keletkező ampicillinrezisztens telepekből egészen addig, amíg nem találunk egy olyan telepet, amely a pUC 19-be ligáit 4 kb méretű EcoRI/Sall fragmentet tartalmaz. Ennek a plazmidnak a jele pJE491, és az 52. 411 gén 5’-végét tartalmazza.

A pJE490 plazmidot teljesen megemésztjük Sall restrikciós enzimmel, majd a keletkező fragmenteket az ugyanezzel a restrikciós enzimmel emésztett pUC19 vektorba ligáljuk. Miután a ligáló reakcióelegy aliquot részével Escherichia coli sejteket transzformáltunk, kis mennyiségű plazmidpreparátumot készítünk a keletkező ampicillinrezisztens telepekből egészen addig, amíg nem találunk egy olyan telepet, amely a pUC19-be ligáit 4 kb méretű Sall fragmentet tartalmaz. Ennek a plazmidnak a jele pJE493, és az 52. 411 gén 3’-végét tartalmazza.

HU 218 717 Β

Az In 5-2.32 és az 52.411 DNS-szekvenciájának vizsgálata

A pln 5-2.32-ben lévő cDNS-klón szekvenciáját mind a didezoxi láncterminációs módszerrel, mind a Maxam-Gilbert-féle kémiai szekvenálással meghatározzuk. A Maxam-Gilbert kémiai szekvenálást az előző példákban ismertetett pln 5-2.32-n végezzük. A didezoxi szekvenáláshoz a pln 5-2.232 plazmidot EcoRI restrikciós enzimmel emésztjük, majd a kapott DNS-fragmenteket agarózgél-elektroforézissel választjuk el. A 2 kb méretű cDNS-inszertet a gélből tisztítjuk, majd teljesen megemésztjük Sau3A restrikciós enzimmel. A kapott DNS-fragmenteket az M13MP18 vektor RF formájának BamHI restrikciós hasítási helyére klónozzuk. A transzformációs reakcióelegy aliquot részét használjuk Escherichia coli JM101 törzs transzfektálására. A transzfekciós reakcióelegy aliquot részét X-gal-t és IPTG-t tartalmazó 2 χ YT táptalajon növesztjük. DNS-t izolálunk véletlenszerűen kiválasztott színtelen tarfoltokból, majd a didezoxi láncterminációs módszerrel szekvenáljuk, egy Sequenase Kitet (U. S. Biochemicals) alkalmazva a gyártó által javasolt előírások szerint. A Sau3A-fragmentek helyes sorrendjét a pln 5-2.32-ben úgy határozzuk meg, hogy összehasonlítjuk az egyes fragmentekből származó didezoxiszekvencia-adatokat a Maxam-Gilbert-módszerrel kapott adatokkal.

A pJE491 és pJE493 plazmidokban lévő genomiális DNS-inszerteket úgy szekvenáljuk, hogy átlapoló deléciókat készítünk minden egyes plazmidban az 1. példában leírtak szerint. A pJE491 régióiból származó szekvenciákat az In 5-2 kiónok szekvenciáival összehasonlítva egy 2.1 kb méretű BamHI/Sall genomiális DNSfragmentet azonosíthatunk, amely az 5-2 promoterből és az 5-2 struktúrgénből 3.5 kb-t tartalmaz. Ezt a fragmentet szubklónozzuk a pBS(-) vektorba. A kapott plazmid jelzése pMC 3167.13. Az 5-2 génnek az 5-2 fehérje transzlációs starthelyétől 5’-irányban lévő szekvenciáját az 5. ábrán mutatjuk be.

A pMC 3167.13 plazmidon helyspecifikus mutagenezist hajtunk végre, hogy az 5-2 kódoló régió transzlációs starthelyéhez egy Ncol restrikciós helyet építsünk be. Ezt úgy hajtjuk végre, hogy egy idegen kódoló szekvencia expresszióját könnyen olyan vegyületek szabályozása alá helyezzük, amelyekről ismert, hogy az 5-2 gén expresszióját indukálják. Egy 5’-TGCCCATGGTGCGTG-3’ szekvenciájú oligonukleotidot tervezünk, hogy az Ncol restrikciós hasítási helyet bejuttassuk az 5-2 fehérje kódoló régiója kezdetének megfelelő ATG kodonhoz. A mutagenezis végrehajtására az 1. példában leírt eljárást használjuk. A kapott plazmid, amely a mutagenizált 5-2 promotert tartalmazza, a pMC75. j5 jelzést kapja, és a 6. ábrán látható.

4. példa

A kukorica 218 gén promoterének azonosítása, izolálása és módosítása

A 218 cDNS-klónok izolálása és jellemzése

Az ebben a példában alkalmazott eljárások elvégzéséhez szükséges technikákat az 1. példában mutattuk be. Az 1. példában a lambda-gtll-fág cDNS-könyvtár készítéséhez használt cDNS és a pUC18 DNS, amelyet teljesen megemésztettünk EcoRI restrikciós enzimmel és defoszforileztünk, ekvimoláris aliquot részeit ligáljuk össze egy éjszakán át. A ligálóelegy aliquot részeivel transzformálunk Escherichia coli DH5 sejteket (BRL), majd 50 pg/ml ampicillint tartalmazó LB-lemezekre szélesztünk. Az antibiotikumrezisztens telepeket nitrocellulóz korongokra visszük ki rendezett módon, majd keressük azokat a kiónokat, amelyek az 1. példában leírt módon helyettesített szulfonamidokkal indukálható mRNSeket képviselnek. Egy telepet azonosítottunk, amely N(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamiddal kezelt gyökerek RNS-éből készült cDNS-próbával erős hibridizációs jelet ad. Ennek a kiónnak a jelzése IN 218, és a benne lévő plazmid jele p218. A p218 plazmid EcoRI restrikciós emésztési termékeinek agarózgél-elektroforézise azt mutatja, hogy a plazmid egy 900 bp inszertet tartalmaz. A nick-transzlációval jelzett p218 hibridizálása az N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamiddal kezelt gyökerek méret szerint ffakcionált RNS-éhez azt mutatja, hogy a cDNS teljes hosszúságú.

A Missouri 17 genomiális DNS-ből könyvtárat készítünk, majd megvizsgáljuk, hogy tartalmaz-e olyan genomiális szekvenciát, amely megfelel a 218 cDNSklónnak, nick-transzlációval jelzett p218-at használva, amint azt az 1. példában leírtuk a következő változtatásokkal : 1) a genomiális DNS-t Sau3A restrikciós enzim helyett EcoRI restrikciós enzimmel emésztjük, és 2) a megfelelő méretű EcoRI ffagmenteket a BamHI enzimmel emésztett lambda-EMBL3-vektor helyett EcoRI restrikciós enzimmel emésztett lambda-Dash-vektorba klónozzuk. Tizennyolc, a 218 cDNS-hez hibridizálódó genomiális kiónt azonosítunk és tarfolttisztítással tisztítunk ebből a könyvtárból. Az egyes csoportok tagjaiból származó EcoRI inszerteket a pBS(+) plazmidvektorba klónozzuk, majd a szubklónozott genomiális DNS-t különböző restrikciós enzimekkel emésztjük. Az emésztési termékeket agarózgél-elektroforézissel választjuk el, nitrocellulózra biotoljuk, majd nick-transzlációval jelzett pln 218 plazmiddal mint próbával vizsgáljuk át. A genomiális szubklónokra készített restrikciós térképeket a 218-aminosav cDNS-restrikciós készített térképekkel összehasonlítva azt láthatjuk, hogy az egyik genomiális szubklón, jel pMC730, egy 1,4 kb méretű Sacl/Xhol ffagmentet tartalmaz, amely nagyon hasonlít és hibridizál a 218 cDNS-klónnal.

A pMC730 plazmidot teljesen megemésztjük Xhol restrikciós enzimmel, majd a reakcióelegyet 200 pl-re hígítjuk. Miután az Xhol restrikciós enzim inaktiválása céljából 65 °C-ra melegítettük, a hígított emésztési terméket önmagával ligáljuk a plazmid cirkularizálása céljából, és ezzel kivágva egy 6 kb méretű Xhol ffagmentet a pMC730 plazmidból, amely nem hibridizál a cDNS-sel. Ennek a plazmidnak a jelzése pMC767. A pMC767 plazmidklónt megszekvenáltuk, az Xhol oldalról 244 bázist, és azt tapasztaltuk, hogy 190 bázishosszon jól összehasonlítható a cDNS-sel, ahol egy intron törési pont található. Hogy ezt az intront átugoijuk, a pMC767 plazmidot teljesen megemésztjük Ncol és Xhol restrikciós enzimekkel. Az 5’-túlnyúló végeket

HU 218 717 Β

T4 polimerázzal tompa végűre alakítjuk, majd a plazmidot a fentiek szerint recirkularizáljuk, így állítjuk elő a pMC791 plazmidot (7. ábra).

Ebből a plazmidból egy DN-áz deléciós sorozatot készítünk a didezoxi-szekvenálás céljára. A teljes NcoI-EcoRI régiót megszekvenáljuk (1710 bázis), majd összehasonlítjuk a cDNS-sel (8. ábra). A genomiális szekvencia egyezik a cDNS-szekvenciával az 5’-végen, és 1,5 kb hosszan túlnyúlik a cDNS 5’-végén (7. ábra). A 218-aminosav mRNS-kezdetét úgy határozzuk meg, hogy a genomiális kiónt használjuk egy ribopróba protekciós kísérletben, és az első ATG-kodont úgy határozzuk meg, hogy ettől a helytől 3’-irányban keressük, és az 1516-os nukleotidnál egy nyíllal jelöljük a 7. ábrán. A genomiális szekvencia számítógépes elemzésével egy Afl III hasítási helyet azonosítottunk, amely tartalmazza ezt az ATG-t (a 7. ábrán aláhúzva). Az ezzel az enzimmel való emésztés egy tapadós véget eredményez, amely a 218-aminosav géntermék ATG startkodonját tartalmazza, amely bármely kiválasztott kódoló régióval képes ligálódni. így kaphatjuk meg a funkcionális, 1,4 kb méretű 218-as promotert és az 5’ nem transzlálódó régiót a pMC791 részleges Afl III emésztésével, majd ezt követően teljes Smal restrikciós enzimes emésztéssel, így hasítva ki egy 1,4 kb méretű promoter/nem transzlálódó leaderfragmentet.

5. példa

A P6.1 petúniagén promoterének és 3'-régióinak azonosítása, izolálása és módosítása A növények növesztése és kémiai kezelése Petúnia (Mitchell) magvakat csíráztatunk talajban, majd egy hónapig növesztjük standard üvegházi körülmények között. A növényeket hidroponikus növesztőberendezésre visszük át az üvegházban, habdugókat alkalmazva a növények támasztékául. Ezeket a dugókat egy falap lukaiba tesszük, majd 0,5 χ Hoagland-oldatot tartalmazó rozsdamentes edénybe helyezzük. Az oldatot standard akváriumszivattyúval levegőztetjük és hetente cseréljük. Egyhónapos hidroponikus növesztés után a növényeket rozsdamentes acéltálcákra visszük át, amelyek vagy friss 0,5 χ Hoagland-oldatot, vagy 0,2 g/liter N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamidot tartalmazó 0,5 χ Hoagland-oldatot tartalmaznak. A gyökérszövetet a kezelés hatodik órájában gyűjtjük össze.

Az RNS izolálása

A gyökérszöveteket úgy gyűjtjük össze, hogy a gyökereket közvetlenül a habdugó alatt vágjuk le. A szövetet (2-5 g) alumíniumfóliába burkoljuk, gyorsan lefagyasztjuk -80 °C-ra, és felhasználásig ott tartjuk. A fagyasztott szövetet folyékony nitrogénnel előhűtött dörzsmozsárba visszük, majd behűtött törővei finom porrá őröljük. A port 50 ml-es polietiléncsövekbe tesszük át, amelyek 10 ml NTES-t tartalmaznak (0,01 mól TRIS-HC1 pH=7,5, 0,1 mól NaCl, 1 mmol EDTA, 1% SDS), valamint 10 ml vízzel telített fenolt és 10 ml kloroform : izoamil-alkohol 24:1 arányú elegyét. Az emulziót erősen rázatjuk 15-30 percig, majd 30 ml-es Corex-csövekben centrifugálva (5000 ford/perc, 10 perc Sorvall HB-4 rotor) elválasztjuk. A nukleinsavakat kicsapjuk a vizes fázisból 1 ml 3 mólos nátrium-acetát (pH=6,0) és 24 ml etanol hozzáadásával. 2 órán át -20 °C hőmérsékleten tartjuk, majd a csapadékot centrifugálással gyűjtjük össze (10 000 ford/perc, 20 perc, Sorvall SS34 rotor). A csapadékot jól leszárítjuk, majd 2 ml vízben oldjuk. 2 ml 4 mólos lítium-acetátot adunk hozzá, hogy szelektíven kicsapjuk az RNS-t, majd az oldatot 3 órán át jégen tartjuk. Az RNS-t centrifugálással nyerjük ki (10 000 ford/perc, 20 perc, SS-34 rotor), majd az RNS-t 400 pl vízben oldjuk, 1,5 ml-es mikrocentrifugacsövekbe visszük át, majd etanollal újra kicsapjuk (2 óra, -20 °C). Az RNS-t centrifugálással nyerjük ki (5 perc), majd a végső csapadékot 200 μΐ vízben oldjuk. Az RNS-koncentrációt az oldatok 260 nm-en mért abszorbanciája alapján határozzuk meg. Egy tipikus eljárásban a keletkező RNS mennyisége körülbelül 1 mg.

Poli (A)⁺ RNS izolálása

A poli (A)+ RNS-t az össz-RNS-ből oligo (dT) cellulózkromatográfiával tisztítjuk. 2,5 mg RNS-t 0,4 mg/ml koncentrációra hígítunk nulla sótartalmú pufferben (összetétele: 100 mm TRIS-HC1 pH=7,4, 0,5% SDS, mmol EDTA). Az RNS-t 65 °C hőmérsékleten tartjuk percig, így denaturáljuk, majd 10 percre jégbe hűtjük. Ezután nátrium-kloridot adunk hozzá, hogy a koncentrációt 0,4 mólra állítsuk. Az RNS-t műanyag eldobható oszlopra visszük, amelyet 0,1 g oligo (dT) cellulózzal (Worthington) töltöttünk, és magas sótartalmú pufferrel (nulla sótartalmú puffer, amely 0,4 mól nátrium-kloridot tartalmaz). Az RNS-t kétszer vagy háromszor bocsátjuk keresztül az oszlopon, hogy maximalizáljuk a poli (A)⁺ frakció kötődését. A kötődést követően az oszlopot 10 ml magas sótartalmú pufferrel mossuk. A poli (A)+ frakciót nulla sótartalmú pufferrel eluáljuk db 1 ml-es frakcióban. A frakciók abszorbanciáját 260 nm-en mérjük, majd az RNS-tartalmú frakciókat egyesítjük. Az RNS-t etanollal kicsapjuk, majd 100 μΐ vízben oldjuk. A poli (A)⁺ RNS mennyisége általában 0,5-1%-a az oszlopra vitt össz-RNS mennyiségének.

cDNS-könyvtár készítése

N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamiddal kezelt gyökerekből származó 5 pg poli (A)⁺ RNS-t etanollal kicsapunk, centrifugálással összegyűjtünk, majd 10 pl vízben oldunk. Az RNS-t 3 percre 65 °C-ra melegítjük, majd gyorsan jégbe hűtjük. A cDNS első láncát úgy állítjuk elő, hogy egy 10 pl RNS-t, 5 pl 10 χ első láncpuffert (összetétele 0,5 mól TRIS-HC1 pH = 8,5, 0,4 mól KC1, 0,1 mól MgCl₂, 0,4 mól DTT), 5 pl nukleotidkeveréket (amely a négy dNTP-t (ACGT) tartalmazza 10 mmol koncentrációban), 5 pl oligo (dT)₁₂_₁₈-at. 5 μΐ α-³²Ρ dCTP-t, 2 μΐ méhlepényből származó ribonukleáz inhibitort és 50 egység reverz transzkriptázt tartalmaz. A reakcióelegyet 1 órán át 42 °C hőmérsékleten tartjuk. A szintetizált cDNS mennyiségét a szintetizált DNS-be beépült a-³²dCTP mennyiségéből számítjuk ki. Az RNS:cDNS duplexet denaturáljuk oly módon, hogy 1,5 percre forrásban lévő vízfürdőbe tesszük, majd gyorsan jégbe hűtjük. Az 50 pl első láncreakcióelegyhez a következőket adjuk hozzá: 50 pl χ második lánc szintetizáló puffer (100 mmol HEPES

HU 218 717 Β pH = 6,9, 100 mmol KC1, 20 mmol MgCl₂), 1 μΐ 10 mmólos dNTP keverék és 2 μΐ DNS-polimeráz (50 egység/ml). A reakcióelegyet 5 órán át 15 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Ekkor 400 μΐ SÍ puffért adunk hozzá (összetétele 30 mmol nátrium-acetát pH=4,4, 250 mmol nátrium-klorid, 1 mmol ZnCl₂), valamint 500 egység SÍ nukleázt. Az inkubálást további 1 órán át folytatjuk 37 °C hőmérsékleten. Az SÍ reakció termékeit azonos térfogatú fenol-kloroform 1:1 arányú elegyével extraháljuk, majd etanollal kicsapjuk. A csapadékot 20 μΐ metilázpufferben (összetétele 50 mmol TRIS-HCl pH=7,5,1 mmol EDTA, 5 mmol DTT) oldjuk, melyhez 2 μΐ 100 mmólos S-adenozil-metionint adunk és 1 μΐ EcoRI metilázt (40 egység/μΐ). A metilezési reakciót 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk 15 percig, majd 10 percig 65 °C-on. A cDNS végeit 2,5 μΐ 0,1 mólos MgCl₂, 2,5 μΐ 0,2 mmólos d(ACGT)TP és 1 μΐ DNS-polimeráz (5 egység/μΐ) hozzáadásával feltöltjük, majd a feltöltési reakciót hagyjuk szobahőmérsékleten 20 percig lejátszódni. A cDNS-t ezután fenol:kloroform 1:1 arányú elegyével extraháljuk, majd etanollal kicsapjuk. A csapadékot 32 μΐ víz, 10 μΐ foszforilezett EcoRI linker (0,1 mg/ml), 5 μΐ lOxligázpuffer és 3 μΐ T4 DNS-ligáz (0,1 ml, 6 Weiss egység/μΐ) összetételű elegyben oldjuk. A ligálási reakciót 16 órán át 15 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A DNS-ligázt inaktiváljuk oly módon, hogy 10 percre 65 °C-ra melegítjük, majd az EcoRI linkereket órán át 37 °C hőmérsékleten emésztjük, 40 μΐ víz, 10 μΐ 10 χ EcoRI puffer és 3 μΐ EcoRI restrikciós enzim (20 egység/μΐ) hozzáadásával. A cDNS-t ezután etanollal kicsapjuk, 20 μΐ ΙχΤΒΕ-ben oldjuk, majd elektroforézisnek vetjük alá 6%-os poliakrilamidgélen. A gélt etidium-bromiddal festjük (1 μg/ml), hogy a gélben lévő cDNS-t láthatóvá tegyük. A 0,5 kb-nál nagyobb cDNSeket tartalmazó fragmenteket tartalmazó géldarabot kivágjuk, és a DNS-t kinyeijük, a cDNS-t elektroeluálva a dialíziszacskóba. Az elektroeluált cDNS-t fenol:kloroform 1:1 arányú elegyével extraháljuk, etanollal kicsapjuk, majd 20 μΐ vízben oldjuk. A cDNS egy μΐ-ét egy likvid szcintillációs spektrométerben számláljuk, majd a cDNS tömegét a cDNS-szintézisben használt ³²P-dCTP specifikus radioaktivitásának ismeretében számítjuk ki. 1 pg, EcoRI restrikciós enzimmel teljesen megemésztett és defoszforilezett lambda-gtlO-kart Egálunk 30 ng cDNS-hez 5 μΐ össztérfogatban. A ligálóelegyet ezután Gigapack extraktumokkal (Stratagene) pakoljuk a gyártó előírásai szerint. Egy ilyen eljárás során körülbelül 1 millió rekombinánst kapunk.

A P6 cDNS-klón izolálása

Körülbelül 10 000 fágot szélesztünk ki 5 db 150 nm-es LB-agarlemezre, amely 10 mmol MgCl₂-t tartalmaz (2000 fág lemezenként), gazdaként az Escherichia coli C600 törzset alkalmazva. A könyvtárról készült replikafilter-másolatokat a következőképpen készítjük az egyes lemezekről: száraz nitrocellulóz filtereket nedvesítünk oly módon, hogy a fág-cDNS-könyvtárat tartalmazó agarlemezek felszínére helyezzük őket. A filtereket ezután Whatman 3MM lapokra visszük át, amelyeket 0,5 mólos NaOH és 1,5 mólos NaCl összetételű oldattal telítettünk, és itt tartjuk fél-egy percig.

A filtereket ezután Whatman 3 MM lapokra visszük át, amelyeket 1 mólos TRIS-HCl pH=7,0 és 0,5 mólos NaCl összetételű oldattal telítettünk, és itt tartjuk 5 percig, 2xSSC-vel öblítjük, a levegőn szárítjuk 1 óra hosszat, majd vákuumban szárítjuk 2 órán át 80 °C hőmérsékleten. Ezt az eljárást mindegyik filterrel megismételjük, így kapunk a könyvtárról többszörös filtermásolatot.

A cDNS-könyvtárról készült replikafiltereket megvizsgáljuk, tartalmaznak-e olyan cDNS-klónokat, amelyek N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamiddal indukált mRNS-eket képviselnek, az 1. példában leírt differenciális hibridizálási módszert alkalmazva. Mind a kezeletlen, mind a kezelt gyökérszövetekből származó poli (A)⁺ RNS-ből, amint azt az első lánc szintézisénél leírtuk ebben a példában, a következő módosításokkal: egy pg poli (A)⁺ RNS-t, 2,5 μΐ 1 mmólos dCTP-t és 10 pl ³²P-dCTP-t (10 mCi/ml) használunk a reakcióban. A próba szintézisét követően az RNS-templátot hidrolizáljuk 25 pl 0,15 mólos NaOH hozzáadásával, majd a cDNS-t 1 órán át 65 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A lúgot 12,5 pl 2 mólos TRIS-HCl pH=8,0 és 25 μΐ 1 normál HCl hozzáadásával semlegesítjük. Az egyszálú cDNS-t Sephadex G-50 oszlopon választjuk el a beépületlen jelzéstől, amelyet 10 mmólos TRIS-HCl pH=7,5, 1 mmol EDTA összetételű pufferrel hoztunk egyensúlyba és eluálunk. Az üres térfogatban eluálódó frakciókat egyesítjük, etanollal kicsapjuk, majd vízben oldjuk.

A replikafiltereket 0,1% SDS, 4xSSC, 5xDenhardt-oldat, 50 mmol nátrium-foszfát (pH=6,8) összetételű oldatban prehibridizáljuk 5 órán át 42 °C hőmérsékleten. Az oldatot hibridizációs pufferrel helyettesítjük (összetétele prehibridizációs puffer, 50% ionmentesített formamidot tartalmaz), amelyben 5xl0⁵ cpm/ml próba van. A próbát kezeletlen és N-(amino-karbonil)2-klór-benzolszulfonamiddal kezelt gyökerekből származó RNS-ről készítettük. A hibridizálásokat 24 órán át 42 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A filtereket ezután kétszer mossuk szobahőmérsékleten 1 óra hosszat 2xSSC, 0,1% SDS összetételű oldatban. A végső mosást 50 °C hőmérsékleten végezzük 0,1 xSSC, 0,1% SDS összetételű oldattal egy óra hosszat. A filtere·: két röntgenfilmre exponáljuk -80 °C hőmérsékleten 60 óra hosszat egy erősítőfóliát alkalmazva.

Az N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamiddal kezelt gyökerekből származó próbával erősebben hibridizálódó tarfoltokat tekintjük pozitív kiónoknak a differenciális vizsgálatban. Ezeket a tarfoltokat eltávolítjuk a lemezekről 100 μΐ-es kapilláris pipettával, és 0,5 ml SM-be tesszük. A tarfolttisztítást ezekkel a hágókkal az 1. példában leírt ismételt differenciális vizsgálattal végezzük az előzőekben leírt hibridizációs eljárást alkalmazva. Az egyik ily módon tisztított klón jelzése P6.

A P6 fágból folyadéklizátumot készítünk oly módon, hogy egy tarfoltról eluált fág 10%-át 100 μΐ egy éjszakán át tenyésztett Escherichia coli BNN102 tenyészetre abszorbeáljuk, majd 30 ml NZCYM táptalajba oltjuk (összetétel: 10 g NZ-amin, 5 g élesztőkivonat, 5 g

HU 218 717 Β

NaCl, 1 g kazaminosav, 2 g MgSO₄, pH=7,5) a kapott fertőzött tenyészetet. Miután 5 órán át 37 °C hőmérsékleten növesztettük, a baktériumok teljesen lizálnak. A lizátumot centrifügálással tisztítjuk (10 000/perc, 10 perc Sorvall SS34 rotor), majd a felülúszót egy tiszta csőbe visszük át. RN-áz A-t és DN-áz I-et adunk hozzá 10 pg/ml, illetve 20 pg/ml koncentrációban, majd a lizátumot 15 percig 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Egyötöd térfogatú 20%-os PRG 6000,2,5 mól NaCl összetételű oldatot adunk a lizátumhoz, majd a fágot hagyjuk kicsapódni (szobahőmérséklet, 15 perc). A fágokat centrifugálással nyerjük ki (10 000/perc, 10 perc), majd az üledéket alaposan leszárítjuk. A fágokat 4% PEG6000, 0,5 mól NaCl összetételű oldatban szuszpendáljuk, majd egy mikrocentrifugacsőbe visszük át. A fágokat 0,5 ml fenol: kloroform 1:1 arányú elegyével extraháljuk, majd a DNS-t 2 térfogat etanol hozzáadásával kicsapjuk. A DNS-t centrifügálással nyerjük ki, majd 50 pl TE-pufferben oldjuk. A DNS-ből 5 pl-t teljesen megemésztünk EcoRI restrikciós enzimmel, majd a keletkező DNS-ffagmenteket agarózgél-elektroforézissel vizsgáljuk. Ennek a vizsgálatnak az eredményei azt mutatják, hogy a P6 cDNS-klón egyetlen 700 bp méretű inszertet tartalmaz.

A P6 EcoRI-es inszertjét a lambda-gtl 0-fágvektorból a pUCla9 plazmidba szubklónozzuk. 10 pg P6 DNS-t teljesen megemésztünk EcoRI restrikciós enzimmel, majd az emésztési termékeket 1%-os agarózgélen elektroforézisnek vetjük alá. A 700 bp méretű EcoRI fragmentet tartalmazó géldarabot kivágjuk, és egy dialízishüvelybe tesszük, amely 0,5 ml lxTAEpuffert tartalmaz (0,04 mólos TRIS-HC1, pH = 7,8, 2 mmol EDTA). A DNS-t a gélből elektroeluáljuk (100 V, 15 perc). A DNS-t tartalmazó puffért eltávolítjuk a hüvelyből, majd azonos térfogatú fenol:kloroform 1:1 arányú elegyével extraháljuk, majd a DNS-t etanollal kicsapjuk 0,3 mól nátrium-acetát jelenlétében. 10 pg pUC119 plazmid-DNS-t teljesen megemésztünk EcoRI restrikciós enzimmel, fenol: kloroform 1:1 arányú elegyével extraháljuk, majd etanollal kicsapjuk. Azonos molekuláris mennyiségű vektort és inszertet 10 pl térfogatban, 15 °C hőmérsékleten 2 óra hosszat Egálunk. A ligálóelegyet használjuk kompetens Escherichia coli JM83 sejtek transzformálására. A transzformációs elegy aliquot részét egy éjszakán át 37 °C hőmérsékleten növesztjük L8-lemezeken, amelyek 75 pg/ml ampicillint tartalmaznak, és X-Gal-lal, valamint IPTG-vel permeteztünk le. A fehér telepekből kis mennyiségű plazmidpreparátumokat készítünk, majd a DNS aliquot részeit teljesen megemésztjük EcoRI restrikciós enzimmel. Az eljárást addig folytatjuk, amíg nem találunk egy olyan plazmidot, amelyben a P6 keresett 700 bp méretű EcoRI ffagmentje a pUC119-be van klónozva. A kapott klón jele P6.1.

pg, a kontroll- és az N-(amino-karbonil)-2-klórbenzolszulfonamiddal kezelt gyökerekből származó össz-RNS-t denaturáljuk oly módon, hogy 10 pl ionmentesített formamidot, 3,5 pl formaldehidet, 4 pl 5 xMEN puffért (összetétele 40 mmol MOPS, pH=7,0, 10 mmol nátrium-acetát, 1 mmol EDTA) adunk hozzá, majd 15 percig 65 °C hőmérsékleten tartjuk. Az RNS-t 1,5%-os agarózgélben elektroforézisnek vetjük alá, amely formaldehidet és 1 χ ΜΕΝ puffért tartalmaz, egészen addig, amíg a bróm-fenolkék a gél aljáig vándorol. Az RNS-t 10 mmol nátrium-foszfát pH=6,8 és 1 pg/ml akridin-oranzs jelenlétében 30 percig festjük. A gélből ezután kioldjuk a fölösleges festéket (10 mmol nátriumfoszfát, 30 perc), majd az RNS-t UV átvilágítólámpa alatt tesszük láthatóvá, lefényképezzük, majd nitrocellulózra blotoljuk (Millipore HAWP). Ennek végrehajtásához Whatman 3MM papírt teszünk a gél alá egy üveglapra oly módon, hogy a papír végei beleéljenek a 20 χ SSC-oldatba. Egy 2 x SSC-vel előre nedvesített nitrocellulózt helyezünk a gélre, majd egy réteg Whatman 3MM papírt teszünk rá, majd egy köteg papírtörölközőt 10 cm vastagon. Egy üveglapot és egy súlyt helyezünk a köteg tetejére. Egy éjszakán át tartó transzfer után a filtert röviden leöblítjük 2 χ SSC-vel, levegőn szárítjuk, majd vákuumban szárítjuk 2 órán át 80 °C hőmérsékleten.

A filtereket 5 órán át műanyag tálcákban prehibridizáljuk 42 °C hőmérsékleten, a korábban ismertetett hibridizációs puffért alkalmazva. A p6.1 plazmidot nick-tanszlációval jelöljük oly módon, hogy 1 pg DNS-t elegyítünk 5 pl 10 χ pufferrel (összetétele: 0,5 mól TRIS-HC1, pH=8,0, 0,1 mól MgSO₄, 10 mmol DTT és 0,5 m/ml BSA), 5 pl 0,3 pmol d(AGT)TP-vel, 5 pl ³²PdCTP-vel (Amersham, 10 mCi/ml, 400 Ci/mmol), 1 pl DNS-polimeráz I-gyel (5 egység/pl, Boehringer-Mannheim), valamint 1 pl 0,1 pg/ml koncentrációjú DN-áz Igyel, 50 pl össztérfogatban. Az elegyet 1,5 órán át 14 °C hőmérsékleten inkubáljuk, majd a reakciót 5 pl 0,25 mól EDTA hozzáadásával állítjuk le. A reakcióelegyet 5 percig 70 °C hőmérsékleten inkubáljuk, majd a jelzett DNS-t Sephadex G-50 oszlopkromatográfiával elválasztjuk a beépületlen nukleotidoktól. A prehibridizációs oldatot eltávolítjuk a zacskóból, majd hibridizációs oldattal helyettesítjük, amely nick-transzlációval jelzett P6.1 DNS-t tartalmaz lxlO⁶ cpm/ml koncentrációban. A hibridizálást 42 °C hőmérsékleten végezzük, 24 órán át rázatva. A filtereket kétszer mossuk 2 χ SSC, 0,1% SDS összetételű oldattal 42 °C hőmérsékleten, majd kétszer mossuk 0,1 χ SSC, 0,1% SDS összetételű oldattal 60 °C hőmérsékleten. A filtert polietilénfóliába burkoljuk, majd röntgenfilmre exponáljuk -80 °C hőmérsékleten 16 órán át egy erősítőfóliát alkalmazva.

A P6.1 próba hibridizál egy 800 bp méretű hírvivő RNS-hez az N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamiddal kezelt gyökerekből származó össz-RNS-ben, amíg nincsen jel a kezeletlen növényekből származó RNS-ben. A cDNS-klón inszertjének mérete megközelíti a hibridizáló RNS méretét, jelezve, hogy a P6.1 potenciálisan egy teljes hosszúságú cDNS-klón.

A P6.1 cDNS-klón-szekvencia elemzése

A P6 nukleotidszekvenciáját átfedő deléciós mutánsok szekvenálásával határozzuk meg, a mutánsokat a cDNS-inszert Exo III nukleázos kezelésével állítjuk elő. A P6.1 cDNS-klónból származó EcoRI inszertet a Bluescript (-) (Stratagene) vektor EcoRI helyére klónozzuk. A kapott klón jele P612. A P612 DNS-ből

HU 218 717 Β pg-ot emésztünk Κρη I restrikciós enzimmel (3’-túlnyúló véget ad, amely rezisztens Exo III emésztésre), majd Xhol restrikciós enzimmel (5’-túlnyúló véget ad, amely érzékeny Exo ΠΙ-ra). A DNS-t fenol kloroform 1:1 arányú elegyével extraháljuk, etanollal kicsapjuk, majd 63,5 μΐ vízben szuszpendáljuk. 8 μΐ 10 χ Exo III puffért (összetétele: 0,5 mól TRIS-HC1 pH=8,0, 50 mmol MgCl₂, 100 mmol β-merkapto-etanol) és 3 μΐ Exo III enzimet (100 egység/μΐ) adunk hozzá, majd az elegyet 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. 15 percig 30 másodpercenként 2,5 μΐ aliquot részeket veszünk, és hozzáadjuk 13,5 jéghideg kioltópufferhez (összetétele: 100 mmol nátrium-acetát, pH=4,7, 600 mmol NaCl, 20 mmol cink-acetát). Az aliquot részekből az öt egymás utáni mintát egyesítjük, majd 1 egység SÍ nukleázzal 30 percig kezeljük szobahőmérsékleten. Minden egyes egyesített mintához 123 μΐ vizet adunk, majd mindegyikből 10 μΐ-t elemzünk agarózgél-elektroforézissel. A megmaradó DNS-t fenol:kloroform 1:1 arányú elegyével extraháljuk, majd etanollal kicsapjuk és 20 μΐ feltöltő/ligáló pufferben (összetétele: 20 mmol TRIS-HC1, pH=7,8, 25 mmol NaCl, 10 mmol MgCl₂, 20 mmol DTT, 1 mmol ATP, 0,1 mól dNTP-k) szuszpendáljuk. 40 egység DNS-ligázt és 2 egység Klenowfragmentet adunk a reakcióelegyhez, majd egy éjszakán át 15 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A ligálóelegyből 10 μΐ-t használunk kompetens Escherichia coli MV1193 gazdasejtek transzformálására, és a transzformálóelegy aliquot részeit 75 pg/ml ampicillint tartalmazó LB-lemezekre szélesztjük. Az egyes transzformációkból tíz telepet vizsgálunk át abból a szempontból, hogy mekkora az inszert mérete, majd egy sorozat kiónt választunk ki szekvenálásra, amelyek a kiindulási cDNSinszert egy olyan delécióit képviselik, amelyekben a deléció 150-150 bázispárral hosszabb. Az ezekből a klónokból származó egyszálú DNS-t megszekvenáljuk, M13 univerzális indítómolekulát, valamint az 1. példában leírt didezoxi láncterminációs módszert alkalmazva.

A P6 cDNS-nek megfelelő genomiális klón izolálása g petúnialevelet gyűjtünk, jeges vízbe merítjük, majd egy behűtött dörzsmozsárba tesszük. 20 ml A puffért (10 mmol Tricin, pH=7,6, 1,4 mól szacharóz, 5 mmol MgCl₂, 5 mmol β-merkapto-etanol) adunk a dörzsmozsárhoz, majd a levélszövetet finomra dörzsöljük. Az oldatot 100 ml-re hígítjuk A pufferrel, majd négy réteg gézen átszűrjük. A szűrletet ezután nyolc réteg gézen szüljük át, majd 2500/perc fordulatszámmal 10 percig centrifugáljuk Sorvall GSA rotorban. A csapadékot 100 ml A pufferben szuszpendáljuk, majd az előzőek szerint centrifugáljuk. Az üledéket 100 ml B pufferben szuszpendáljuk (összetétele: A puffer 0,4% Triton X-100), 10 percig 4 °C hőmérsékleten tartjuk, majd az előzőek szerint centrifugáljuk. A kapott üledéket 100 ml B pufferben szuszpendáljuk, majd a centrifugálást megismételjük 2000/perc fordulatszámmal 10 percig, így kapunk egy nyerssejtmag-üledéket. Ezt az üledéket szuszpendáljuk 4 ml 50 mmólos TRIS-HC1, pH=8,0 és 20 mmol EDTA összetételű oldatban, amelyhez 0,5 ml 10%-os szarkozilt adtunk. Az oldatot 5 percig 60 °C hőmérsékleten inkubáljuk, majd szobahőmérsékletre hűtjük. Egy 5 mg/ml koncentrációjú proteináz-K-oldatból 0,1 ml-t adunk hozzá, majd az inkubálást további 4 órán át folytatjuk enyhe rázatás közben. Az oldat térfogatát megmérjük, majd 1 g cézium-kloridot adunk minden 1,2 ml oldathoz. Etidium-bromidot adunk hozzá 0,5 mg/ml koncentrációban, majd a sűrűséget 1,55 g/mlre állítjuk CsCl-dal. A DNS-t 40 000/perc fordulatszámmal 30 órán át 15 °C hőmérsékleten végzett centrifugálással tisztítjuk Beckmann 70.1TÍ rotorban. A csíkot leszívjuk a CsCl gradiensről oly módon, hogy a centrifugacsövet oldalt kiszúrjuk. Az etidium-bromidot eltávolítjuk a DNS-ből oly módon, hogy TE-pufferrel (pH=8,0) egyensúlyba hozott izoamil-alkohollal ismételten extraháljuk. A DNS-t ezután 5 mmol TRIS-HC1, pH=8,0, 0,25 mmol EDTA összetételű oldattal szemben dializáljuk.

A petúnia genomiális DNS részleges emésztésének körülményeit előzetes restrikciós emésztésekkel határozzuk meg. 10 pg DNS-t 150 μΐ térfogatra töltünk fel a megfelelő restrikciós pufferral. A DNS-ből 30 μΐ-es aliquot részeket osztunk szét egy #l-gyel jelzett mikrocentrifugacsőbe. 15 μΐ-eket osztunk szét hét csőbe, jelük #2-8, majd a maradékot egy csőbe tesszük, ennek jele #9. Az összes csövet jégbe hűtjük, 4 egység Sau3A restrikciós enzimet adunk az 1-es csőhöz, majd a cső tartalmát jól összekeverjük. Az 1-es csőből 15 μΐ-t adunk a 2-es csőbe. Ezt a kétszeres sorozathígítást a 8-as csőig folytatjuk, majd az összes csövet 1 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A restrikciós emésztéseket a csövek 0 °C-ra hűtésével, valamint 20 mmol EDTA hozzáadásával állítjuk le. A mintákat elektroforézisnek vetjük alá, 0,8%-os agarózgélt és 1-2 V/cm feszültséget alkalmazva. Meghatározzuk azt az enzimkoncentrációt, amely a 15-20 kb tartományban a maximális intenzitású fluoreszcenciát biztosítja a gél etidium-bromiddal való festése után. A fentiekben meghatározott enzim/DNS arány felét használjuk a genomiális DNS preparatív emésztéséhez, abból a célból, hogy maximalizáljuk a 15-20 kbp mérettartományba tartozó DNS-fragmentek mennyiségét. Ez az enzimkoncentráció a 0,06-0,25 egység Sau3A/pg DNS-tartományba esik.

300 pg DNS-t szétosztunk három csőbe: az elsőbe a DNS egynegyedét, a másodikba a felét, a harmadikba az egynegyedét, majd a DNS koncentrációját 67 pg/ml-re állítjuk. A második csőhöz a Sau3A restrikciós enzimet abban a végkoncentrációban adjuk, amelyről azt véljük, hogy maximalizálja a 15-20 kbp méretű molekulák mennyiségét. Az első cső ennek a koncentrációnak a felét, a harmadik cső a kétszeresét tartalmazza. Mindegyik reakciót 1 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Miután a reakciókat a fentiek szerint leállítottuk, az egyes emésztésekből aliquot részeket elemzünk agarózgélelektroforézissel, majd a megfelelő emésztéseket, amelyek maximális mennyiségben tartalmaznak 15-20 kb méretű fragmenteket, egyesítjük. Az egyesített mintát 10-40%-os szacharóz gradiensre visszük, amely 1 mól NaCl, 20 mmol TRIS-HC1, pH=8 és 5 mmol EDTA összetételű oldatban készült, majd 24 órán át 20 °C hő32

HU 218 717 Β mérsékleten centrifugáljuk 26 OOO/perc fordulatszámmal Beckman SW41 rotorban. 0,5 ml-es frakciókat szedünk a gradiensről, és minden harmadik frakcióból 15 μΐ-t agarózgél-elektroforézissel vizsgálunk. A 15-20 kb méretű DNS-fragmenteket tartalmazó frakciókat egyesítjük, majd 4 liter TE-vel szemben dializáljuk. A dialízis után a DNS térfogatát 3-5 ml-re csökkentjük 2-butanollal való ismételt extrakció révén, majd a DNS-t etanollal kicsapjuk 0,3 mól nátrium-acetát jelenlétében. A DNS-t 300-500 pg/ml koncentrációban oldjuk TE-pufferben.

A genomiális DNS-t BamHI restrikciós enzimmel hasított és defoszforilezett EMBL3 karokhoz (Stratagene) ligáljuk az előállító előírásai szerint, a vektort az inszterthez viszonyítva kétszeres mólfeleslegben alkalmazva. A ligálást Gigapack extraktummal pakoljuk (Stratagene). Egy könyvtárat szélesztünk 20 000 fágot Escherichia coli LE392 törzs egy éjszakán át növesztett tenyészete 350 μΐ-ére abszorbeálva 15 percig 37 °C hőmérsékleten. Olvasztott fedőagaróz 7,5 ml-es aliquot részét (LB plusz 0,8% agaróz 50 °C hőmérsékleten) hozzáadjuk a baktériumhoz, majd a tenyészetet 10 mmol MgSO₄-et tartalmazó 150 m-es LB-lemezekre szélesztjük. Ily módon 260 000 fág teljes könyvtárát szélesztjük.

A genomiális könyvtárat P6 genomiális kiónok után vizsgáljuk át, próbaként a P6.1 klón cDNS-inszertjét használva. Ennek végrehajtásához az inszertet a BS(-) (Stratagene) transzkripciós vektorba klónozzuk. 10 pg P6.1 DNS-t teljesen megemésztünk EcoRI restrikciós enzimmel, majd a keletkező DNS-fragmenteket agarózgél-elektroforézissel elválasztjuk. A cDNS-inszert-fragmentet elektroeluáljuk a gélből, azonos térfogatú fenol : kloroform 1:1 arányú elegyével extraháljuk, majd etanollal kicsapjuk. 10 pg pBS(-) vektor DNS-t teljesen megemésztünk EcoRI restrikciós enzimmel, majd fenol-.kloroform 1:1 arányú elegyével extraháljuk, és etanollal kicsapjuk. Az inszertet és a vektort összeligáljuk 10 pl össztérfogatban 2 órán át 15 °C hőmérsékleten, majd a ligálóelegyből egy aliquot részt használunk kompetens Escherichia coli JM83 sejtek transzformálására. A transzformációs elegyet 75 pg/ml ampicillint tartalmazó LB-lemezekre szélesztjük, amelyet X-gal-lal és IPTG-vel permetezünk le a baktériumok szélesztése előtt. A fehér telepekből kis mennyiségű plazmidpreparátumot készítünk, majd a DNS-eket EcoRI restrikciós enzimekkel emésztjük. A keresett P6 cDNS-inszertet a pBS(-) vektorban tartalmazó telepet azonosítjuk, jele P6.11.

A P6.ll plazmidot BamHI restrikciós enzimmel emésztve linearizáljuk, és a ³²P UTP-vel jelzett RNStranszkriptumokat készítünk a plazmidról T3 polimeráz alkalmazásával a gyártó előírásait követve (Promega Biotech Inc.). A petúnia genomiális könyvtárról nitrocellulóz replikákat készítünk, majd az előzőekben leírtak szerint 3 óra hosszat előhibridizáljuk. A prehibridizáló oldatot hibridizáló oldattal helyettesítjük, amely a P6.11 RNS-próbát tartalmazza 2 χ 10⁶ cpm/ml mennyiségben. A hibridizálást 4 órán át végezzük 42 °C hőmérsékleten, enyhe rázatás közben. A filtereket kétszer mossuk 2xSSC, 0,1% SDS összetételű oldattal 42 °C hőmérsékleten, majd ezt követően kétszer mossuk 0,1% SSC, 0,1% SDS összetételű oldatban 42 °C hőmérsékleten. A filtereket röntgenfilmre exponáljuk -80 °C-on 24 órán át, egyetlen erősítőfóliát alkalmazva. Három fág mutatott erős hibridizálást a próbával, ezeket tarfolttisztításnak vetjük alá a korábbiak szerint, jelük 1, 2 és 3.

A genomiális klánok jellemzése

A fágokat folyadéktenyészetben növesztjük oly módon, hogy 300 ml NZCYM táptalajt 10¹⁰ fággal inokulálunk, amelyeket előzőleg 1 ml, egy éjszakán át növesztett Escherichia coli LE392 tenyészetre abszorbeáltunk. A fertőzött tenyészetet 37 °C hőmérsékleten növesztjük, rázatás közben, amíg a baktériumok teljes lízise be nem következik (általában 7 óra). A sejttörmeléket centrifugálással eltávolítjuk a lizátumból, majd a felülúszót 1-1 pg/ml DN-ázzal, illetve RN-ázzal kezeljük 1 óra hosszat szobahőmérsékleten. Szilárd nátriumkloridot adunk hozzá 1 mól végkoncentrációban, majd PEG 6000-et 10 tömeg% koncentrációban. A fágot hagyjuk egy éjszakán át kicsapódni, majd centrifugálással kinyerjük (Sorvall GSA rotor, 7000/perc, 15 perc). A fágüledékeket SM-ben szuszpendáljuk, majd minden ml SM-re számítva 0,75 g CsCl-t adunk hozzá. A gradienst Beckman 70,1 Ti rotorban centrifugáljuk 38 OOO/perc fordulatszámmal 24 óráig 15 °C hőmérsékleten. A fágokat tartalmazó csíkot a cső oldalán keresztül nyerjük ki, majd egy éjszakán át 4 °C hőmérsékleten dializáljuk 10 mmol NaCl, 50 mmol TRIS-HC1, pH=8, 10 mmol MgCl₂ összetételű pufferrel szemben. A tisztított fágokból a DNS-t 20 mmol pronáz, 0,5 mg/ml és SDS 0,5% végkoncentrációban való hozzáadásával extraháljuk, majd a kapott oldatot 1 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A mintát TE (pH=8) pufferrel szemben dializáljuk, majd etanollal kicsapjuk, így kapunk körülbelül 250 pg fág-DNS-t.

A fág-DNS-t Sál I restrikciós enzimmel emésztjük, hogy az inszertet kivágjuk a vektorból. Az emésztett DNS agarózgél-elektroforézise azt mutatja, hogy az 1es, 2-es és 3-as fág 13, 14, illetve 10 kb méretű inszertet tartalmaz. További restrikciós enzimes emésztéssel és a P6.1 cDNS-klónhoz való hibridizálással restrikciós térképeket készítünk, amelyek azt mutatják, hogy mindhárom fágban lévő inszert átlapol egymással, és mindegyik ugyanannak a petúnia-cDNS-régiónak a fragmentje.

Az 1-es és 3-as fágokból származó 0,6 kb, illetve 1,8 kb méretű EcoRI fragmentről azt találtuk, hogy a P6.1 cDNS-sel hibridizál a fentiekben ismertetett térképezési kísérletekben. Ez azt sugallja, hogy vagy egy nagy intron van jelen a P6 génben, vagy két homológ P6.1 gén található ugyanazon a genomiális DNS-fragmenten. Ezeknek a problémáknak a megközelítéséhez a két EcoRI fragmentet szubklónozzuk és szekvenáljuk. 10 pg 1-es fág-DNS-t teljesen megemésztünk EcoRI restrikciós enzimmel, majd a termékeket agarózgél-elektroforézissel választjuk el. Az 1.8 és 0,6 kb méretű fragmenteket elektroeluáljuk a gélből, fenol: kloroform 1:1 arányú elegyével extraháljuk, majd etanollal kicsapjuk. Mindegyik fragmentet EcoRI restrikciós en33

HU 218 717 Β zimmel emésztett pUC119 DNS-be ligáljuk 10 pl végtérfogatban, 2 órán át 15 °C hőmérsékleten. A ligálóelegyet használjuk kompetens Escherichia coli JM83 sejtek transzformálására. A transzformációs elegy aliquot részeit 75 pg/ml ampicillint tartalmazó LB-lemezekre szélesztjük, amelyeket előzőleg X-gal-lal és IPTG-vel permeteztünk le a baktériumok szélesztése előtt. Kis mennyiségű plazmidpreparátumokat készítünk a fehér telepekből, majd a kapott DNS-eket EcoRI restrikciós enzimmel emésztjük. A keresett 0,6 és 1,8 kb méretű fragmenteket mindkét orientációban tartalmazó szubklónokat választunk, hogy megkönnyítsük a ffagmentek mindkét végének szekvenálását. A két különböző orientációt úgy azonosítjuk, hogy a szubklónokat Sáli restrikciós enzimmel emésztjük a 0,6 kb méretű fragment esetében és Pvull restrikciós enzimmel az 1,8 kb méretű fragment esetében. A kapott plazmidok jele P619 és P620 (a 0,6 kb méretű genomiális fragment két orientációja), valamint P621, illetve P622 (az 1,8 kb méretű genomiális fragment két orientációja).

A plazmid-DNS-eket a didezoxi láncterminációs módszerrel szekvenáljuk, a korábbi példákban ismertetett módon, ³⁵S-dATP-t használva. A szekvenciaelemzések azt mutatják, hogy az 1,8 kb méretű EcoRI genomiális fragment egy olyan gént tartalmaz, amely teljesen homológ a P6.1 cDNS-sel, míg a 0,6 kb méretű genomiális fragment egy szoros rokonságban lévő gént tartalmaz. Az 1,8 kb méretű EcoRI ffagmentben lévő homológ gén jelzése P6.1.

Az 1-es gén végpontjainak térképezése

Primer extenziós elemzést végzünk, hogy a P6 RNS 5’-végét meghatározzuk. A P6 génben az első, fázisban lévő ATG utáni 12-33 bázis kódoló láncával komplementer oligonukleotidot szintetizálunk egy Applied Biosystems DNS-szintetizátorral. Az 5’-CCACTAAGACAATCTAAAGACC-3’ szekvenciájú oligonukleotidot ³²P-vel megjelöljük a végén, mikrocentrifugacsőben 50 pCi cr³²ATP-t beszárítva, egy Speedvac centrifugát használva. 2 pl oligonukleotidot (2,5 pmól/pl), 2 pl 5xkináz puffért (összetétele 125 mmol TRIS-HC1, pH=9,5, 25 mmol MgCl2, 12,5 mmol DTT, 2,5 mmol spermidin, 0,25 mmol EDTA) és 1 pl T4 polinukleotid kinázt (10 egység/pl) adunk hozzá, majd a csövet 15 percig 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A jelzett oligonukleotidokat ammónium-acetát jelenlétében etanolos kicsapással elválasztjuk a beépületlen jelzéstől, majd etanollal kicsapjuk nátrium-acetát jelenlétében. A csapadékot 50 pl TE-ben oldjuk, majd 1 pl-nek megmérjük a sugárzását a Cserenkov-sugárzás alapján. A ³²P beépülés ezzel a módszerrel 3-8xlO⁶ beütés/pmol oligonukleotid. Mind a kezeletlen, mind az N-(amino-karbonil)-2-klórbenzolszulfonamiddal kezelt növények gyökeréből 10 pg RNS-t illesztünk 0,2 pmól oligonukleotiddal 10 pl térfogatban, 0,25 mól KC1, 2 mmol TRIS-HC1, pH=7,9 és 0,3 mmol vanadil-ribonukleozid komplex (BRL) összetételű oldatban, 37 °C hőmérsékleten, 45 °C hőmérsékleten és 55 °C hőmérsékleten 3 órán át. Az illesztett RNS-hez 23,5 pl primer extenziós keveréket adunk (összetétele: 10 mmol MgCl2, 5 mmol DTT, 20 mmol TRIS-HC1 pH=8,3, 0,33 mmol d(GATC)TP,

100 pg/ml atinomicin D), majd 0,5 pl (10 egység) majom reverz transzkriptázt (Life Sciences) adunk, és az elegyet 45 percig 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A reakcióelegyben lévő nukleinsavakat etanollal kicsapjuk és szárítjuk. Az üledéket 3 pl 0,1 mmol NaOH, 1 mmol EDTA összetételű oldatban oldjuk, majd az oldatot 30 percig szobahőmérsékleten hagyjuk, hogy az RNS-templát hidrolizáljon. 6 pl stop-festékkeveréket (1. példa) adunk hozzá, majd a mintát 80 °C-ra melegítjük és gyorsan lehűtjük. A primer extenziós termékeket 6%-os denaturáló poliakrilamid szekvenálógélen választjuk el. Egy 110 bp méretű extenziós terméket figyelünk meg, amelyből egy 68 bp méretű nem transzlálódó leaderszekvenciára lehet következtetni.

A P6.1 gén 5’-végpontjának meghatározása céljából a gén két fragmentjét szubklónozzuk RN-áz protekciós elemzéshez. Mindkét fragment lefedi az első, fázisban lévő ATG-től 3’-irányban 40 bázisra lévő szakaszt (egy Nhel hasítási helyig), míg 5’-irányban vagy 130 bázisra (egy Dral hasítási hely) vagy 300 bázisra (Spel hasítási hely) levő szakaszt. 20 pg P622 DNS-t teljesen megemésztünk mind Spel, mind Nhel restrikciós enzimmel. A P622 DNS-nek egy aliquot részét mind Dral, mind Nhel restrikciós enzimmel teljesen megemésztjük. Az emésztési termékeket elektroforézissel választjuk el 5%-os poliakrilamidgélen, majd a 340 bp méretű Spel/Nhel fragmentet és 170 bp méretű Dral/Nhal fragmentet kivágjuk a gélből, majd elektroelúcióval kinyerjük. A DNS-eket fenol . kloroform 1:1 arányú elegyével extraháljuk, majd etanollal kicsapjuk. Ezeket a fragmenteket a Bluescript+(BS+) (Stratagene) transzkripciós vektorba szubklónozzuk. Ennek végrehajtásához 10 pg BS(+) DNS-t emésztünk Smal és Xbal restrikciós enzimekkel, hogy a Dral/Nhel fragmentet és Spel, valamint Xbal restrikciós enzimekkel emésztjük, az Spel/Nhel fragment szubklónozása céljából. A BS(+) DNS-t ezután fenol:kloroform 1:1 arányú elegyével extraháljuk és etanollal kicsapjuk. A ligálásokat szobahőmérsékleten végezzük 2 órán át 10 pl térfogatban. A ligálóelegy egy aliquot részét használjuk kompetens Escherichia coli MV1193 sejtek transzformálására X-gal szelekciót alkalmazva. Kis mennyiségű plazmidpreparátumokat készítünk néhány fehér telepből, majd a DNS-eket EcoRI és SacI restrikciós enzimekkel emésztjük. Egy telepet azonosítottunk, amely a BS(+)-ban tartalmazza a Dral/Nhel fragmentet, ennek jele P644. Egy másik telepet azonosítottunk, amely a BS(+)-ban tartalmazza a Spel/Nhel fragmentet, ennek jele P645.

Mind a P644-ben, mind a P645-ben lévő kódoló szállal komplementer RNS-próbákat szintetizálunk a következő reakcióelegyben: 50 pCi ³²P-UTP, 2 pl 5 χ transzkripciós puffer (összetétele: 200 mmol TRIS-HC1 pH=7,5, 30 mmol MgCl₂, 10 mmol spermidin), 0,5 pl 0,2 mól DTT és 0,5 pl T3 polimeráz (P645 plazmid) vagy T7 polimeráz (P644 plazmid). Az inkubálást 40 °C hőmérsékleten végezzük 1 óra hosszat. A DNS-templátot 15 percig hidrolizáljuk 37 °C hőmérsékleten, 30 pl víz, 1 pl RN-azin 2,5 pl vanadil-ribonukleozid komplex, 6 pl 5 χ transzkripciós puffer és 1 pl DN-áz I (1 mg/ml)

HU 218 717 Β hozzáadásával a transzkripciós reakcióelegyhez. A reakcióelegyet azonos térfogatú fenol:kloroform 1:1 arányú eleggyel extraháljuk. Az RNS-t egyszer kicsapjuk etanollal ammónium-acetát jelenlétében, majd még egyszer kicsapjuk etanollal nátrium-acetát jelenlétében. Az üledéket 25 μΐ TE-ben oldjuk. Mind a kezeletlen, mind az N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamiddal kezelt növények gyökeréből 10 pg RNS-t elegyítünk a próbák 1 χ 10⁶ cpm-jével 30 μΐ hibridizáló pufferben (összetétele 40 mmol PIPES, pH=6,7, 0,4 mól NaCl, 1 mmol EDTA). Az elegyet ezután 30 μΐ ásványolajra rétegezzük, majd a hibridizálást 16-24 órán át végezzük 45 °C hőmérsékleten. Az egyszálú RNS-t szelektíven emésztjük 300 μΐ RN-áz A és RN-áz TI 40 pg/ml, illetve 2 pg/ml koncentrációban való hozzáadásával, 10 mmol TRIS-HC1 pH=7,5, 5 mmol EDTA és 300 mmol NaCl összetételű oldatban. Az emésztést 1 óráig végezzük 30 °C hőmérsékleten, majd az RN-ázokat 20 pl 10%-os SDS és 50 pg proteináz K hozzáadásával, majd 15 percig 37 °C hőmérsékleten való inkubálással inaktiváljuk. A reakcióelegyet fenol:kloroform 1:1 arányú elegyével extraháljuk, majd az RNS-hibrideket 1 ml etanollal kicsapjuk, 20 pg élesztő-tRNS hozzáadása után. Az üledékeket megszárítjuk, majd formamidfelvivő pufferben oldjuk. A mintákat 3 percig 90 °C hőmérsékleten tartva denaturáljuk, majd denaturáló poliakrilamidgélen analizáljuk. 110 bp méretű megvédett fragmentek figyelhetők meg mindkét próba alkalmazásával az indukált RNS-ben, míg a kontroll-RNS-ben ez nem figyelhető meg. Ezek az eredmények megegyeznek a primer extenziós vizsgálatban előre jelzett transzkripciós starthellyel. A P6.1 gén 5’-vége és a transzlációs starthely közötti szakaszának szekvenciája a 8. ábrán látható. A nyíl a kikövetkeztetett transzkripciós starthelyet mutatja.

A gén 3’-szekvenciáját a genomiális és cDNS-klón szekvenciaadataiból következtettük ki.

A p614 előállítása

A P6.1 petúniagént tartalmazó 2-es fág egy 4,5 kb méretű HindlII/Sall genomiális fragmentjét pUC118 plazmidban szubklónozzuk. A genomiális 2-es fágból 20 pg-ot emésztünk HindlII és Sáli restrikciós enzimekkel, majd a termékeket agarózgél-elektroforézissel választjuk szét. A gént tartalmazó 4,5 kb méretű csíkot elektroelúcióval izoláljuk a korábbiak szerint. A pUC118 plazmidból 10 pg-ot teljesen megemésztünk HindlII és Sáli restrikciós enzimekkel, majd a vektort a polilinkerfragmenttől kromatográfiával választjuk el Sepharose CL-2B (Pharmacia) oszlopon. A vektort és az inszertet 10 pl térfogatban ligáljuk össze egy éjszakán át 15 °C hőmérsékleten, majd a ligálóelegy egy részét használjuk kompetens Escherichia coli JM83 sejtek transzformálására. A transzformációs elegyből aliquot részeket szélesztünk 75 pg/ml ampicillint tartalmazó LB-lemezekre, amelyeket előzőleg a baktériumok szélesztése előtt X-gal-lal és IPTG-vel permeteztünk le. Kis mennyiségű plazmidpreparátumokat készítünk a fehér telepekből, majd a DNS-eket HindlII és Sáli restrikciós enzimekkel emésztjük, egészen addig folytatva az eljárást, amíg a petúnia P6.1 génjét tartalmazó 4,5 kb méretű HindlII/Sall genomiális fragmentet hordozó telepet találunk. Ennek a plazmidnak a jele P614.

A P654 előállítása

Kényelmes restrikciós hasítási helyeket építünk be a P6.1 génbe a P6.1 kódoló régiója transzlációs start- és stophelyeinél, hogy az indukálható petúniagén szabályozórégióit használjuk annak megvizsgálására, hogy általánosan alkalmassá tehetők-e idegen kódoló régiók expesszálására transzformált növényekben. Helyspecifikus mutagenezist végzünk a P614-en, hogy egy Ncol hasítási helyet juttassunk be a géntranszláció iniciációs ATG helyénél, az 5’-TGTTAGCCATGGTTATGCTTA-3’ oligonukleotidot használva. A mutagenezis elvégzésére alkalmazott módszereket az 1. példában írtuk le. Ez a plazmid úgy keletkezik, hogy a P614-ben lévő P6.1 génfragment transzlációs starthelyéhez egy Ncol hasítási helyet viszünk be, jele P653. A P653 plazmidot tovább mutagenizáljuk oly módon, hogy az 5 ’ -GCATATGCATAGATCTTATTGAATTCC-3 ’ oligonukleotidot használjuk egy BglII hasítási helynek a P6.1 gén transzlációs stopkodonjához történő bevitelére. A keletkező végleges plazmidkonstrukciót, amely a petúnia P6.1 génjét a P6 kódoló régiót Ncol és BglII hasítási helyekkel határolva tartalmazza, P654-nek nevezzük (9. ábra).

6. példa

A T2.1 dohánygén izolálása

A TlcDNS izolálása

A 4. példában a petúnia P6.1 cDNS-klón izolálására leírt eljárást ismételjük meg, kiindulási növényi nyersanyagként N. tabacumot (Petite Havana SRI) alkalmazva. A kapott dohány-cDNS-könyvtár differenciális átvizsgálása során, amelyet N-(amino-karbonil)-2-klórbenzolszulfonamiddal kezelt dohánynövények gyökeréből izolált poli (A)⁺ RNS felhasználásával kaptunk, egy olyan cDNS-klónt kaptunk, amely egy N-(aminokarbonil)-2-klór-benzolszulfonamiddal indukálható mRNS fajtát képvisel. Ennek a kiónnak a jele T2.

A T2-ből származó inszertet a pUCl 19-be klónozzuk egyetlen EcoRI fragment formájában, a 4. példában a P6 cDNS-klón inszertjének szubklónozására leírt módszert alkalmazva. A kapott plazmid, amely a pUC119 plazmid EcoRI helyén a T2 cDNS-klónból származó, 1 kb méretű cDNS-inszertet tartalmazza, T2. 11-nek nevezzük.

A kezeletlen és N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamiddal kezelt dohánynövények gyökeréből származó össz-RNS-t vizsgálunk át Northem-blottal, nicktranszlációval jelzett T2.1 plazmidot használva próbaként, hogy a megfelelő mRNS méretét meghatározzuk. Az ezekben az eljárásokban alkalmazott módszereket a 4. példában ismertettük. A T2.1 plazmid egy 800 nukleotid hosszúságú mRNS-hez hibridizálódik a kémiailag kezelt növények gyökereiből származó mRNS-ben, amely nincs jelen a kontrollnövényekben. Ez azt mutatja, hogy a T2 cDNS N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamiddal indukálható mRNS-fajtát képvisel, és a cDNS-klónban lévő inszert teljes hosszúságú. A tény, hogy az RNS kisebbnek tűnt mint a cDNS-klón, azt mu35

HU 218 717 Β tatja, hogy a T2 valamilyen, a klónozása során bevitt műterméket tartalmaz.

A T2 cDNS DNS-szekvenciáját úgy határozzuk meg, hogy a korábbiakban leírt módon számos deléciós T2-t analizálunk. A szekvenciák analízise felfedi, hogy a T2 egy tökéletes mverted repeat szekvenciát tartalmaz a 11-164 és 518-671 bázisok között. Mivel a nyílt leolvasási keret a 164-es bázis után kezdődik, az a feltételezés, hogy az első 164 bázis a cDNS-szintézisnek és/vagy klónozásnak egy műterméke, amelynek eredménye egy olyan cDNS, amely hosszabb mint a megfelelő cDNS. A T2 cDNS által kódolt, kikövetkeztetett peptid ugyanolyan számú aminosavat tartalmaz mint a P6 petúniagén, és aminosavszinten 95%-ban homológok. Ezért az a feltételezés, hogy a dohányból származó T2 cDNS-klón a petúnia P6.1 génnel homológ gént képvisel.

A T2.1 genomiális klón izolálása

A 4. példában leírt módon SRI dohányból egy genomiális könyvtárat készítünk. Egy ³²P-RNS próbát szintetizálunk T7 DNS-polimerázzal, templátként a T2. 11 cDNS-inszertet alkalmazva, majd a keletkező RNS-transzkriptumokat használjuk az SRI genomiális könyvtár átvizsgálására, a korábban leírtak szerint. Ebből a vizsgálatból azonosítunk egy tarfoltot, amely homológiát mutat a T2 cDNS-hez. Ezt a fágot tarfolttisztításnak vetjük alá, jele #9. A #9 fágból tisztított DNS-t EcoRl, BamHI és Sáli restrikciós enzimekkel emésztjük, majd a kapott restrikciós ffagmenteket agarózgél-elektroforézissel elválasztjuk és nitrocellulózra biotoljuk. A blotot előhibridizáljuk, majd hibridizáljuk nick-transzlációval jelzett T2.11-gyei. Ennek a blotolási kísérletnek az eredményei azt mutatják, hogy a cDNS próba egyetlen 5,0 kb méretű BamHI/EcoRI fragmenthez hibridizál. Ezt a BamHI/EcoRI fragmentet, amelyről az a vélemény, hogy a teljes T2 gént tartalmazza, ezután pUC118 vektorba klónozzuk, majd teljesen megemésztjük BamHI és EcoRl restrikciós enzimekkel. A kapott plazmid jele T217 (10. ábra). A #9 fágban lévő gén jele T2.1.

A T2.1 mRNS 5’-végét primer extenziós elemzéssel térképezzük. Az ebben a vizsgálatban használt oligonukleotid ugyanaz, mint amelyet a petúnia P6.1 mRNS 5’-végének a vizsgálatára használtunk. Ennek következtében egy helyen, az oligonukleotid közepében, a dohánygénhez viszonyítva eltérés van. Az indítómolekula illesztését ezért a dohány mRNS esetében alacsonyabb hőmérsékleten végezzük (25 °C, 30 °C és 35 °C). A primer extenziót a 4. példában leírt módon végezzük. Az ebben a reakcióban megfigyelt primer extenziótermék 119 bázis hosszúságú, pontosan annyi, mint a petúnia P6.1 mRNS-t templátként használó reakcióban. Ez azt jelzi, hogy a T2.1 mRNS-ben lévő 5’nem transzlálódó régió szintén 68 bp hosszúságú.

Nyilvánvaló, hogy a szakterületen jártas szakemberek képesek lesznek a T2 gén promoter és downstream szabályozórégióinak azonosítására a 4. példában közölt módszerekkel és eljárásokkal. A további példák ezeknek a szabályozórégióknak a használatát mutatják meg.

7. példa

Rekombináns gének készítése, amelyeknek az expresszióját a 2-1 kukoricapromoter és 3’-downstream régió szabályozza

A pJE514 és pJE516 plazmidok előállítása

Az 1. példából származó p484-l (Ncol) és p48462 (BglII) plazmidokat, amelyek a 2-1 struktúrgén start- és stophelyeinél kényelmes restrikciós hasítási helyeket tartalmaznak, használjuk egy új 2-1 gén előállítására, amelyből a natív kódoló régió könnyen eltávolítható, és idegen struktúrgénnel helyettesíthető. Egy ilyen rekombináns gén bejuttatása egy transzgenikus növénybe egy idegen kódoló régiót helyettesített benzolszulfonamidok szabályozása alá helyezi.

Ennek az új 2-1 génnek az előállításához a pJE484-l-et (Ncol) (5. ábra) teljesen megemésztjük EcoRl és Smal restrikciós enzimekkel, majd 10 pg emésztett DNS-t elektroforézisnek vetünk alá egy éjszakán át 20 V feszültséggel, 1%-os agarózgélen. A gélt etidium-bromiddal festjük, majd a DNS-t hosszú hullámú UV átvilágítóasztalon tesszük láthatóvá. Közvetlenül a keresett 7,5 kb méretű inszert előtt belehasítunk a gélbe. A DNS-t ebbe elektroeluáljuk 300 V feszültséggel, majd a DNS-t tartalmazó puffért egy mikrocentrifiigacsőbe tesszük. A tisztított DNS-t ezután azonos térfogatú fenol: kloroform 1:1 arányú elegyével extraháljuk, etanollal kicsapjuk, majd 10 pl vízben szuszpendáljuk. A pJE484-62(BglII) plazmidot EcoRl és Ncol restrikciós enzimekkel emésztjük, majd egy 1,3 kb méretű fragmentet gélen tisztítunk az előzőek szerint. A 7,8 és 1,3 kb méretű DNS-fragmenteket összeligáljuk 10 pl ligázpufferben, amint azt az előző példákban leírtuk, majd a ligálási terméket használjuk kompetens Escherichia coli JM83 sejtek transzformálására. A transzformált telepekből kis mennyiségű plazmidpreparátumot készítünk, majd diagnosztikai restrikciós enzimes emésztést végzünk az egyes telepeken, amíg egy olyat találunk, amely a 2-1 gént tartalmazza a hozzáadott Ncol és BglII restrikciós hasítási helyekkel együtt, a megfelelő transzlációs start- és stophelyeken. Ennek a konstrukciónak a jele pJE514.

A pJE 514 2-1 kódoló szekvenciájának helyettesítésére kiválasztott kódoló szekvencia a β-glükoronidázszekvencia (GUS-ként hivatkozunk rá) [Jefferson R., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 83, 8447-8451 (1986)]. Egy GUS kódoló szekvenciát a pJJ 3892 plazmidból izolálunk, egy 1,8 kb méretű Ncol/Xbal restrikciós fragment formájában. Az azonos 1,8 kb méretű Ncol/Xbal fragment a pJJ 3431 (ATCC letéti száma 67884, 9. példa) plazmidon található, tehát ebben a példában a pJJ 3892 a pJJ 3431gyel helyettesíthető. Ebből a célból a pJJ 3892 plazmidot teljesen megemésztjük Xbal restrikciós enzimmel, majd a keletkező 5’-túlnyúló végeket tompa végre töltjük fel, a DNS-polimeráz I Klenow-fragmentjét használva, amint azt a korábbi példákban leírtuk. Miután fenol: kloroform 1:1 arányú elegyével extraháltuk és etanollal kicsaptuk, a DNS-t teljesen megemésztjük Ncol restrikciós enzimmel, majd a keletkező DNS-fragmenteket agarózgél-elektroforézissel választjuk el.

HU 218 717 Β

A GUS kódoló régiónak megfelelő 1,9 kb méretű DNS-fragmentet kinyerjük a gélből, majd a pJE 5514be ligáljuk, amelyet előtte teljesen megemésztettünk BglII restrikciós enzimmel, tompa végeket hoztunk létre rajta a DNS-polimeráz I Klenow-ffagmentjével, majd Ncol restrikciós enzimmel teljesen megemésztettük. Ennek a ligálóelegynek egy aliquot részét használjuk Escherichia coli HB101 transzformálására, majd az egyes transzformánsokat addig vizsgáljuk, amíg egy olyat nem találunk, amely a 2-1 struktúrgén helyett a GUS kódoló szekvenciát tartalmazza. Ennek a plazmidnak a jele pJE516 (11. ábra).

A pDUPE2 plazmid előállítása

Kiindulási anyagként egy pJE516 plazmidot használunk egy olyan deléciós sorozat előállítására, amely a GUS gén/2-1 3’-downstream régióját tartalmazza, és amelynek az expresszióját egyre kisebb 2-1 promoterfragmentek szabályozzák. A deléciós sorozatot úgy állítjuk elő, hogy 40 pg pJE 516 DNS-t linearizálunk 25 egység Hpal restrikciós endonukleázzal 20 mmol KC1, 10 mmol TRIS-HC1 pH=7,4, 10 mmol MgCl₂ és 1 mmol DTT összetételű oldatban, 100 pl végtérfogatban. A reakcióelegyet 3 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk, majd a DNS-t azonos térfogatú fenol: kloroform 1:1 arányú elegyével extraháljuk, és etanollal kicsapjuk. A linearizált DNS-t centrifugálással nyerjük ki, és vákuumban szárítjuk.

A DNS-üledéket 180 pl vízben oldjuk, és 30 pl 10xBal31 puffért adunk hozzá (végkoncentráció a reakcióelegyben 20 mmol TRIS-HC1 pH = 8, 12 mmol MgCl₂, 12 mmol CaCl₂ és 300 mmol NaCl). A Bal31 emésztést a gyártó (Bethesda Research Labs) előírásai szerint végezzük, 2 egység Bal31-et alkalmazva. Az elegyet különböző hosszú ideig inkubáljuk 30 °C hőmérsékleten (például 0, 2,5 vagy 5 percig), majd az egyes aliquot részekben lévő reakciót 50 pl 100 mmólos EDTA (pH=7,6) hozzáadásával állítjuk le. A DNS-t ezután kétszer extraháljuk 100 pl fenollal, kétszer 100 pl kloroformmal, majd 2,5 térfogat etanollal kicsapjuk. A Bal31 restrikciós enzimmel emésztett DNS-t centrifugálással nyerjük ki, és vákuumban szárítjuk.

A száraz DNS-üledéket 100 pl Sál I pufferben oldjuk (összetétele 150 mmol NaCl, 10 mmol TRIS-HC1, pH=8, 10 mmol MgCl₂ és 10 mmol β-merkapto-etanol), majd 50 egység Sáli restrikciós enzimmel emésztjük 37 °C hőmérsékleten 4 óra hosszat. A reakcióelegyet fenol:kloroform 1:1 arányú elegyével extraháljuk, majd a fentiek szerint etanollal kicsapjuk. A DNS végeit tompa véggé alakítjuk, a DNS-polimeráz I Klenowfragmentjét alkalmazva az alábbiak szerint: A DNS-t 60 pl 66 mmólos TRIS-HC1 pH=7,6, 6,6 mmol MgCl₂, 52 mmol NaCl, 1 mmol β-merkapto-etanol, 0,5 mmol dNTP-k és 10 egység Klenow-fragment összetételű elegyben oldjuk. A reakcióelegyet 2 óra hosszat szobahőmérsékleten inkubáljuk. A DNS-t ezután elektroforézissel frakcionáljuk 0,7%-os alacsony olvadáspontú gélben. A gélt 1 pg/ml koncentrációjú etidium-bromid-oldattal festjük, majd a keresett hosszúságú delécióval rendelkező DNS-fragmentet tartalmazó géldarabot kivágjuk a gélből UV megvilágítás mellett. A géldarabot percig -80 °C hőmérsékleten fagyasztjuk, megolvasztjuk, egy pipettaheggyel összetöijük, majd 30 percig egy mikrocentrifugában centrifugáljuk. A vizes oldatot egy friss csőbe visszük át, 0,3 mól nátrium-acetát végkoncentrációt állítunk be és 2,5 térfogat etanolt adunk hozzá. A kicsapott DNS-t centrifugálással nyerjük ki, 20 pl vízben oldjuk, majd önmagával ligáljuk (reciklizálás). A ligálási reakciókat 50 mmol TRIS-HC1 pH=7,8, 10 mmol MgCl₂, 20 mmol DTT és 1 mmol ATP összetételű oldatban végezzük. A ligálási reakciót szobahőmérsékleten végezzük 8 óra hosszat, majd ötszörösre hígítjuk vízzel, mielőtt felhasználnánk kompetens Escherichia coli HB101 sejtek transzformálására. A transzformációs elegy aliquot részeit 50 pg/ml ampicillint tartalmazó LB-lemezekre szélesztjük, és a lemezeket egy éjszakán át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk.

Az egyes ampicillinrezisztens telepeket izoláljuk, majd 37 °C hőmérsékleten növesztjük erős rázatás közben, 2 ml, 50 pg/ml ampicillint tartalmazó 2 χ TY táptalajban. A baktériumokból kis mennyiségben plazmid-DNS-t izolálunk, majd a DNS-ek aliquot részeit teljesen megemésztjük Ncol és Xhol restrikciós enzimekkel. A keletkező DNS-fragmenteket 1,5%-os agarózgél-elektroforézissel elemezzük, hogy meghatározzuk az egyes plazmidokban megmaradó 2-1 promoterfragment méretét. Az elemzés eredményei azt mutatják, hogy egy klón, jele pDuPE2 tartalmazza a pJE516 GUS konstrukcióját, működés szempontjából egy 900 bp méretű 2-1 promoterfragmenthez kapcsolva (a 2-1 gén transzlációs starthelyéhez viszonyítva).

A pDuPI8 és pDuPI9 plazmidok készítése

A Bal31 emésztési módszert ismételjük meg a pDuPE2 plazmidot mint kiindulási anyagot alkalmazva, hogy egyre rövidebb 2-1 promoterfragmenteket állítsunk elő. A DNS-t először linearizáljuk Xhol restrikciós enzimmel, majd különböző ideig emésztjük (2-5 perc) Bal31 enzimmel. A Bal31 enzimmel emésztett DNS-t fenol: kloroform 1:1 arányú elegyével extraháljuk, majd etanollal kicsapjuk, és a DNS 5’-végeit Klenow-fragment alkalmazásával feltöltjük. A DNS-t ezután tovább emésztjük BamHI restrikciós enzimmel, hogy a teljes megmaradó 2-1/GUS konstrukciót kihasítsuk a pBS(+) vektorból. A BamHI restrikciós enzimmel emésztett DNS-fragmenteket elektroforézissel választjuk el 1%-os alacsony olvadáspontú agarózgélen, majd a deletált konstrukciókat tartalmazó DNS-fragmenteket a fentiek szerint extraháljuk és a pBluescript (S/K)+ vektor (Stratagene) BamHI-Smal helyére ligáljuk. A ligálóelegyet négyszeresre hígítjuk vízzel, majd a transzformáló reakcióelegy aliquot részeit 50 pg/ml ampicillint tartalmazó LB-lemezekre szélesztjük, és egy éjszakán át 37 °C hőmérsékleten növesztjük. Az ampicillinrezisztens telepekből kis mennyiségű plazmidpreparátumokat készítünk, majd a DNS-eket teljesen megemésztjük Ncol és Xhol restrikciós enzimekkel. Ezek közül a telepek közül a kiónoknak egy olyan sorozatát választjuk ki, amelyekben a 2-1 promoterfragmentek mérete 500 és <100 között változik. Ezeknek a konstrukcióknak a neve, valamint a 2-1 promoterfragment mérete az 1. táblázatban található.

HU 218 717 Β

1. táblázat

A konstrukció jelzése	A promoter hossza (bp)
pDuPE2	-900
pDuPI8	421
pDuPI9	226

8. példa

Rekombináns gének készítése, amelyek expresszióját a 2—2 kukoricapromoter és különböző downstream régiók szabályozzák

A pHPH201(+) plazmid készítése

A pRAJ275 plazmidot (Clontech Laboratories, Inc., 4055 Fábián Way, Palo Alto, CA 94303) használjuk egy Escherichia coli β-glükoronidáz (GUS) fonásaként ebben a konstrukcióban. A PRAJ275-ben a GUS kódoló régióban egyetlen Ncol hasítási hely található, a fehéije kódoló szekvenciainiciáló ATG kodonjánál.

A 2—2#4—17 genomiális szubklónt (2. példa) (320 pg) részlegesen emésztjük Ncol restrikciós enzimmel 37 °C hőmérsékleten egy óra hosszat, 0,5 egység enzimet használva 1 pg plazmid-DNS-re. Az emésztést úgy állítjuk le, hogy Na₂EDTA-t adunk hozzá 20 mmol végkoncentrációban, majd a DNS-t etanollal kicsapjuk 0,3 mól nátrium-acetát (pH=6,0) jelenlétében. A részlegesen emésztett plazmidot 260 pl TE-ben oldjuk (pH=8,0), majd 20 pl elektroforézis festéket adunk hozzá. A DNS-t 4 cmx 1 cmx 2 mm-es lukakba töltjük egy 5%-os poliakrilamidgélben, TBE-pufferben, majd elektroforézisnek vetjük alá 325 V-on, 4 óra hosszat. A gélnek minden egyes sávjából a korábban leírtak szerint egy 1,68 kb méretű Ncol restrikciós ffagmentet izolálunk. A tisztított Ncol ffagment felét egy éjszakán át 10 pl össztérfogatban 0,5 pg pRAJ275 plazmiddal ligáljuk, amelyet előzőleg teljesen megemésztettünk Ncol restrikciós enzimmel s defoszforileztünk. A ligálóelegyet vízzel 50 μΐ-re hígítjuk, majd a hígításból 3 pl-t használunk 60 pl kompetens Escherichia coli HB 101 sejtek transzformálására. A transzformációs reakcióelegy aliquot részeit 50 pg/ml ampicillint tartalmazó LB-lemezekre szélesztjük, majd a lemezeket egy éjszakán át inkubáljuk. Az ampicillinrezisztens telepekből kis mennyiségű plazmid-DNS-t készítünk, addig, amíg egy olyat találunk, amelyben az Ncol promoterfragment úgy van beleligálva a pRAJ275-be, hogy működés szempontjából a GUS gén 5’-végéhez kötődjön. Ennek a plazmidnak a jele pHPH201(+).

A p2-2 HindlII 3 ’-végének előállítása

Egy konstrukciót állítunk elő, amely a 2-2 gén 3’-végét tartalmazza, amely általában használható olyan rekombináns gének előállítására, amelyeknek az expresszióját helyettesített benzolszulfonamidok szabályozzák. A 2—2#4—11 genomiális szubklónt (4A. ábra) teljesen megemésztjük HindlII restrikciós enzimmel. Az 5’ túlnyúló végeket a DNS-polimeráz I Klenow-ffagmentjével feltöltjük, majd a DNS-t egymás után extraháljuk azonos térfogatú fenol:kloroform 1:1 arányú elegyével, majd kloroformmal. A DNS-t etanollal kicsapjuk, centrifugálással kinyeijük, majd TE-pufferben (pH=8,0) oldjuk. A pUC18 vektort teljesen megemésztjük SacI és KpnI restrikciós enzimekkel, majd a túlnyúló 3’-végeket a DNS-polimeráz I Klenow-fragmentjével eltávolítjuk. A DNS-t fenol: kloroform 1:1 arányú elegyével extraháljuk, etanollal kicsapjuk, majd TE-pufferben (pH=8,0) oldjuk az előzők szerint. A genomiális 2—2#1 tompa végű HindlII emésztési termékeit (0,6 pg) ligáljuk 0,45 pg tompa végű pUC18 DNS-sel egy éjszakán át 16 °C hőmérsékleten. A ligálóelegyet ezután vízzel 50 pl-re hígítjuk, és a hígításból 1 pl-rel 20 pl kompetens Escherichia coli HB101 sejteket transzformálunk. A transzformációs reakcióelegy aliquot részeit 50 pg/ml ampicillint tartalmazó LB-lemezekre szélesztjük, majd a lemezeket egy éjszakán át inkubáljuk. Az ampicillinrezisztens telepekből kis mennyiségű plazmid-DNS-t állítunk elő, majd a keletkező DNS-t EcoRI és BamHI restrikciós enzimekkel emésztjük addig, amíg egy olyan telepet nem találunk, amely a 2—2#11 genomiális szubklón 2,3 kb méretű HindlII fragmentjét tartalmazza, a pUC plazmidban tompa végű KpnI/SacI hasítási helyén. Ennek a plazmidkonstrukciónak a jele p2-2 HindlII 3’-vég.

A pHPH102 plazmid készítése A p2-2 HindlII 3’-vég és a pMSP^rK (ATCC letéti száma 67723) vektorplazmidokat teljesen megemésztjük EcoRI és HindlII restrikciós enzimekkel. A pMSP^rK defoszforilezése után 1,6 pg vektort Egálunk egy éjszakán át 0,38 pg EcoRI-HindlIl restrikciós enzimekkel emésztett p2-2 HindlII 3’-vel 10 pl végtérfogatban. A ligálóelegyet vízzel 50 pl-re hígítjuk, majd a hígítás 1 pl-ét használjuk 60 pl kompetens HB101 sejtek transzformálására. A transzformálóelegy aliquot részét 100 pg/ml spektinomicint és streptomicint tartalmazó (spec/strep) LB-lemezekre szélesztjük, majd a lemezeket egy éjszakán át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A spec/strep rezisztens telepekből kis mennyiségű plazmid-DNS-t készítünk, majd a keletkező DNS-eket EcoTI és HindlII restrikciós enzimekkel emésztjük, addig, amíg egy olyat nem találunk, amely a 2-2 génnek e keresett downstream szekvenciáját tartalmazza egy 2,3 kb méretű EcoRI-HindlIl fragmenten. A kapott plazmid jele pHPH102.

A phPH220 plazmid készítése A pHPH102 plazmidot teljesen megemésztjük Xhol restrikciós enzimmel, majd a keletkező 5’-túlnyúló véget DNS-polimeráz I Klenow-fragmenttel töltjük fel. A tompa végű DNS-fragmentet defoszforilezzük az 1. példában leírtak szerint, majd teljesen megemésztjük HindlII restrikciós enzimmel. A pHPH201 (+) plazmidot részlegesen emésztjük EcoRI restrikciós enzimmel oly módon, hogy 37 °C hőmérsékleten 90 percig emésztjük 0,85 egység enzim/pg DNS koncentrációban. Az EcoRI restrikciós enzimet inaktiváljuk oly módon, hogy az emésztési reakcióelegyet 10 percig 70 °C hőmérsékleten tartjuk, majd a keletkező 5’-túlnyúló végeket a fentiek szerint Klenow-fragmenttel töltjük fel. Ezt a DNS-t azután teljesen megemésztjük HindlII restrikciós enzimmel, majd a keletkező DNS-ből 2,1 pg-ot egy éjszakán át 15 pl végtérfogatban ligáljuk 0,8 pg HindlII restrikciós enzimmel

HU 218 717 Β hasított pHPH102 plazmiddal, amelyet előzőleg tompa végűvé tettünk az egyetlen Xhol restrikciós hasítási helyénél. A ligálóelegyet vízzel 60 μΐ-re hígítjuk, majd 1 pl-t használunk 80 μΐ kompetens Escherichia coli HB101 sejtek transzformálására. A transzformálóelegy aliquot részét 100 pg/ml spektinomicint és streptomicint tartalmazó (spec/strep) LB-lemezekre szélesztjük, majd a lemezeket egy éjszakán át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A spec/strep rezisztens telepekből kis mennyiségű plazmid-DNS-t készítünk, majd a keletkező DNS-eket EcoRI és Hindlll restrikciós enzimekkel emésztjük addig, amíg egy olyat nem találunk, amely a pHPH201(+) HindlII-EcoRI fragmentjét tartalmazza (ebben található az 1,7 kb méretű 2-2 promoter/GUS régió fúziója), működés szempontjából a pMSP^rK vektorban lévő 2-2 gén 2,3 kb méretű downstream szekvenciájához kapcsolva. A kapott plazmid jele pHPH220 (12. ábra).

A pln 2-2(3.9) plazmid készítése

A 2-2#4 genomiális klónból (2. példa) származó két és fél pg DNS-t teljesen megemésztünk Sáli restrikciós enzimmel. 1 pg pUC18 DNS-t is teljesen megemésztünk Sáli restrikciós enzimmel. A DNS-eket azonos térfogatú fenol:kloroform 1:1 arányú elegyével és kloroformmal extraháljuk. 1 pg pUC18 DNS-t is teljesen megemésztünk Sáli restrikciós enzimmel. A DNS-eket azonos térfogatú fenollal, fenol és kloroform 1:1 arányú elegyével, majd kloroformmal extraháljuk. A DNS-eket ezután etanollal kicsapjuk nátrium-acetát jelenlétében. Egy ligálási reakciót végzünk egy éjszakán át 16 °C hőmérsékleten a 2-2#4 DNS és a pUC18 plazmid 3:1 arányát beállítva 16 °C hőmérsékleten, 10 pl térfogatban. A ligálóelegyet vízzel ötszörösre hígítjuk, majd a ligálóelegy aliquot részét használjuk kompetens Escherichia coli DH5 a-sejtek transzformálására. A transzformációs reakcióelegy aliquot részeit 50 pg/ml ampicillint, 25 mmol IPTG-t és 40 pg/ml X-gal-t tartalmazó LB-agarlemezekre szélesztjük. Az egyes fehér telepekből származó plazmid-DNS-t kinyeijük, és teljesen megemésztjük Sáli restrikciós enzimmel. Egy kiónt azonosítottunk, amely a 2-2#4 DNS-nek azt a 3,9 kb méretű Sáli restrikciós fragmentjét tartalmazza, amely a 2-2 génnek a 2-2 fehéije transzlációs starthelye előtt 5’-irányban 3,6 kb távolságban lévő helytől a fehéije kódoló régiójában 180 bp-ig teijedő régiót tartalmazza. Ennek a plazmidnak a jele pln 2-2(3.9).

A pTDS130 készítése pg pJE516 plazmidot teljesen megemésztünk Ncol és Xhol restrikciós enzimekkel. A DNS-lfagmenteket 24 egység boíjúbélfoszfatázzal defoszforilezzük, 37 °C hőmérsékleten 40 percig. 50 pg pln 2-2(3.9) plazmid-DNS-t teljesen megemésztünk Pvul restrikciós enzimmel, majd a fentiek szerint defoszforilezzük, etanollal kicsapjuk 0,3 mól nátrium-acetát jelenlétében, majd TE-pufferben (pH=8) oldjuk. Ezt a DNS-t teljesen megemésztjük Xhol restrikciós enzimmel. A kapott pln 2-2(3.9) plazmid részleges Ncol-es hasítását úgy végezzük, hogy az Xhol restrikciós enzimmel emésztett DNS-mintát 1 egység Ncol restrikciós enzimmel emésztjük 37 °C hőmérsékleten, majd 15 percenként eltávolítjuk a reakcióelegy egynegyedét. Az Ncol-es emésztést az egyes időpontokban 40 mmol végkoncentrációjú EDTA hozzáadásával állítjuk le. A DNS-eket azonos térfogatú fenol: kloroform 1:1 arányú elegyével és kloroformmal extraháljuk. A DNS-t 2 térfogat etanollal kicsapjuk, centrifugálással kinyeijük, majd 10 pl TE-pufferben oldjuk (pH=8,0). Az egyes emésztésekből származó DNS-ek kis aliquot részeit agarózgél-elektroforézissel elemezzük, hogy megtaláljuk azt az emésztést, amelyben a legnagyobb mennyiségben van a keresett 1,9 kb méretű Xho-Ncol promoterfragment. A részlegesen emésztett DNS-ből 0,5 pg-t 0,18 pg pJE 516 DNShez ligálunk egy éjszakán át 16 °C hőmérsékleten. A ligálási reakciót 10 percig 70 °C-on tartjuk, vízzel ötszörösre hígítjuk, majd a hígítás 2 pl-ét használjuk 100 pl kompetens Escherichia coli HB101 sejtek transzformálására. A transzformációs elegy aliquot részeit 50 pg/ml ampicillint tartalmazó agarlemezekre szélesztjük, majd egy éjszakán át növesztjük 37 °C hőmérsékleten. Az ampicillinrezisztens telepekből kinyert plazmid-DNS-t restrikciós emésztésekkel elemezzük addig, amíg egy olyat találunk, amely pJE516 plazmidban a 2-2 gén 1900 bp méretű Xhol/Ncol promoterfragmentjét működés szempontjából a GUS/2-1 3’-vége downstream régiójává fuzionálva tartalmazza. Ennek a kiónnak a jele pTDS130 (13. ábra).

A pTDS133 plazmid készítése

A pTDS-plazmidot teljesen megemésztjük mind EcoRI és Xhol restrikciós enzimekkel, majd az enzimeket inaktiváljuk oly módon, hogy a reakcióelegyet 20 percre 40 °C-ra melegítjük 0,02% dietil-pirokarbonát (DEP) jelenlétében. A fölöslegben lévő DEP-et úgy bontjuk el, hogy a reakcióelegyet 10 percre 70 °C-ra melegítjük, majd a DNS 5’-túlnyúló végeit DNS-polimeráz I Klenow-fragmentjével feltöltjük.

A DNS-t egymás után extraháljuk azonos térfogatú fenol: kloroform 1:1 arányú elegyével és kloroformmal, majd nátrium-acetát jelenlétében etanollal kicsapjuk. A DNS-t ezután recirkularizáljuk egy éjszakán át tartó önmagával való ligálással. A ligáló reakcióelegyet ötszörösre hígítjuk vízzel, majd az elegyből 2 pl-t használunk 100 pl kompetens Escherichia coli HB101 sejtek transzformálására. A transzformálóelegy aliquot részeit 50 pg/ml ampicillint tartalmazó LB-agarlemezekre szélesztjük, majd egy éjszakán át 37 °C hőmérsékleten hagyjuk növekedni. Az egyes ampicillinrezisztens telepekből kis mennyiségű plazmidpreparátumokat készítünk és restrikciós endonukleázos emésztéssel vizsgáljuk őket, amíg egy olyat találunk, amely a pTDS130 plazmidban a 2-2 gén 465 bp méretű promoterfragmentjét működés szempontjából a GUS/2-1 fúzióhoz kapcsolva tartalmazta. Ennek a plazmidnak a jele pTDS133 (13. ábra).

A pTDS134 és pTDS136plazmid előállítása

A pTDS133 DNS-ből 10 pg-ot és a pBluescript SK(+) DNS-ből is 10 pg-ot teljesen megemésztünk BamHI restrikciós enzimmel. A vektor DNS-t defoszforilezzük az előzőekben leírtak szerint. Mindkét DNS-t fenol: kloroform 1:1 arányú elegyével extraháljuk,

HU 218 717 Β majd etanollal kicsapjuk. A megemésztett pTDS133 és pBluescript SK(+) plazmidokat 3:1 (inszert:vektor) mólarányban összeligáljuk 10 μΐ végtérfogatban egy éjszakán át 16 °C hőmérsékleten. A ligálóelegyet ötszörösre hígítjuk vízzel, majd ebből a hígításból 2 μΐ-t használunk 100 μΐ kompetens Escherichia coli HB101 sejtek transzformálására. Az egyes ampicillinrezisztens telepekből kis mennyiségű plazmidpreparátumokat készítünk, majd restrikciós enzimes emésztéssel elemezzük, amíg egy olyat találunk, amely a pTDS 133-ból a 3,4 kb méretű BamHI fragmentet a pBluescript S/K(+)-ban a BamHI hasítási helyre klónozva tartalmazza olyan orientációban, amelyben a 2-2 promoter a vektor polilinkere Smal hasítási helyének közvetlen szomszédságában van. Ezt a plazmidkonstrukciót pTDS 134-nek nevezzük (14. ábra). Egy másik telepet is azonosítunk, amelyben ugyanez a 3,4 kb méretű BamHI fragment az ellenkező orientációban klónozva található, úgyhogy a 2-2 promoter a vektor polilinkere Spel hasítási helyének közvetlen szomszédságában van. Ennek a plazmidkonstrukciónak pTDS136 a jele.

A pTDS231 plazmid előállítása A pDH51 plazmidot Maciej Pietrzak és munkatársai közük (Nucleic Acids Research, 14, 5857-5868 (1986)].

pg pHPH201(+) DNS-t teljesen megemésztünk mind EcoRI, mind Pvul restrikciós enzimmel két óra hosszat 37 °C hőmérsékleten, majd a keletkező 5'-túlnyúló végeket DNS-polimeráz I Klenow-fragmentjével feltöltjük. 10 pg pDH51 DNS-t teljesen megemésztünk

Pstl és Ncol restrikciós enzimekkel, majd a keletkező 5’és 3'-túlnyúló végeket DNS-polimeráz I Klenow-fragmentjével feltöltjük. A DNS-mintákat egymás után extraháljuk fenol:kloroform 1:1 arányú elegyével és kloroformmal, majd etanollal kicsapjuk. A tompa végű pDH51 plazmidot ezután teljesen megemésztjük BamHI restrikciós enzimmel és defoszforilezzük. 0,25 pg pDH51 DNS-t és 0,75 pg emésztett pHPH201(+) DNS-t ligálunk egy éjszakán át 16 °C hőmérsékleten 10 pl végtérfogatban. A ligálóelegyet 10 percre 70 °C hőmérsékletre melegítjük, majd vízzel ötszörösre hígítjuk. Az elegyből 2 μΐ-t használunk 100 pl kompetens Escherichia coli HB101 sejtek transzformálására. A transzformálóelegy aliquot részeit 50 pg/ml ampicillint tartalmazó LB-agarlemezekre szélesztjük, majd egy éjszakán át 37 °C hőmérsékleten hagyjuk növekedni. Az egyes ampicillinrezisztens telepekből kis mennyiségű plazmidpreparátumokat készítünk, és restrikciós endonukleázos emésztéssel vizsgáljuk őket, amíg egy olyat találunk, amely a pHPH201(+)-ból származó 465 bp méretű EcoRI/NcoII 2-2 promoter/GUS fúziót működésileg a CaMV ³⁵S transzkriptum 3'-végéhez kapcsolva tartalmazza a pDH51 plazmidban. Ennek a kiónnak a jele pTDS231 (15. ábra).

A pTDS130 2-2 promoterdeléciók előállítása A pTDS130 plazmid egyetlen EcoRI hasítási helyet tartalmaz, amely a 2-2 promotert a 2-2 fehérje iniciációs ATG kodonjától 5'-irányban 465 bp távolságra hasítja. Ezt az EcoRI helyet hasítjuk el, hogy a pTDS 130 plazmidot linearizáljuk, és egy megfelelő kiindulási pontot hozzunk létre a promoter Bal31-es delécióinak a létrehozására ebben a DNS-konstrukcióban. Ezt, az ettől az EcoRI helytől való 2-2 promoterdeléciós-sorozat előállítására használt eljárást a 7. példában közöltük. Az összes deléciós származékot a pBluescript SK(+) plazmidba klónozzuk. Egy sorozat cDNSklónt szelektálunk a fentiekben előállított sorozatból, amelyek rövidebb, a GUS-expressziót szabályozó 2-2 promoterffagmenteket (növekvő Bal31-es emésztés) tartalmaznak. Az elemzésre kiválasztott plazmidkonstrukciókat a promoter 5'-végétől a transzlációs starthelyig terjedő a 2-2 promoterfragment hosszával együtt. A promoterfragment hosszát az egyes konstrukciók szekvenciaelemzésével határozzuk meg.

2. táblázat

A konstrukció neve	A promoter hossza (bp)
pTDS133	465
pTDS134	450
pDuPM17	248
pDUPN27	208
pDuPN4	150
pDuPN7	130

A 2-2 promoterrégió DNS-szekvenciáját az egyes, a GUS expresszióját a különböző konstrukciókban szabályozó promoterfragmentek starthelyeinek lokalizálásával együtt a 14. ábrán mutatjuk be.

A pDuPS22 plazmid készítése

Egy olyan konstrukciót készítünk, amelyben az acetolaktát-szintetáznak (ALS) egy szulfonil-karbamid rezisztens formáját kódoló rekombináns gén a kukorica 2-2 génjéből származó indukálható promoterfragment transzkripciós szabályozása alatt áll. Egy ilyen konstrukció előállításának itt bemutatott részletei csak az egyik lehetséges módszert képviselik, amellyel egy ilyen rekombináns gént elő lehet állítani. Nyilvánvaló, hogy a szakterületen jártas szakemberek képesek ilyen rekombináns gének előállítására, a pAGS148 plazmidban (ATCC letéti szám 67124) levő szulfonil-karbamid-rezisztens ALS-gén és bármely 2-2 promoterfragment felhasználásával, amelynek a felhasználását ebben a munkában magyaráztuk el.

A pUC119/HRA konstrukciót a pAGS plazmidot (ATCC letéti szám 67124 és a 0257993 számú európai szabadalmi bejelentésben írják le részletesen) kiindulási anyagként használva állítjuk elő. A pAGS148 plazmidot teljesen megemésztjük EcoRI restrikciós enzimmel, majd az 1.38 kb méretű, az ALS-fehérje transzlációs starthelyét tartalmazó EcoRI fragmentet szubklónozzuk a pUC119 vektor EcoRI hasítási helyére. Ennek a konstrukciónak a jele pUC119/AGS. A pUC119/AGS plazmidot teljesen megemésztjük Bbvl restrikciós enzimmel, majd a keletkező fragmentek 5'-túlnyúló végét DNS-polimeráz I Klenow-fragmentjével feltöltjük. Ezeket a tompa végű fragmenteket agarózgél-elektroforézissel elválasztjuk, majd az 1.2 kb méretű fragmentet kinyerjük a gélből. BamHI linkereket (New England

HU 218 717 Β

Biolabs, CAT#1017) adunk a fragmenthez, amelyet ezután a pUC119 plazzmid BamHI restrikciós hasítási helyére szubklónozunk, így kapjuk a pUC119/BbvI plazmidot.

A pUC119/BbvI és pAGS148 plazmidot teljesen megemésztjük BstEII és PstI restrikciós enzimekkel, majd a keletkező fragmenteket gélelektroforézissel elválasztjuk. A 4.58 kb méretű BstEII/PstI fragmentet a pUUC119/BbvI-ből és a 2.45 kb méretű BstEII/PstI fragmentet a pAGS148-ból kinyerjük a gélből, majd összeligálva kapjuk a pUCl 19/HRA plazmidot.

A dohány Sur A génjében mutációkat hozunk létre, hogy megváltoztassuk a 194-es számú aminosavat prolinról alaninra, valamint az 571-es aminosavat triptofánról leucinra, amint azt Bedbrook és munkatársai közölték a 0257993 számú európai szabadalmi bejelentésben. A SurA gén 533- 1952-es nukleotidjainak megfelelő 1.42 kb méretű NcoI/BglII fragmentet restrikciós endonukleázos hasítással kivágjuk, majd arra használjuk, hogy a pUC119/HRA-ban kicseréljük a megfelelő régiót, így kapjuk a pUCAD plazmidot.

A pTDS130 plazmidot teljesen megemésztjük Ncol restrikciós enzimmel. Az Ncol helyek 5’-túlnyúló végeit részlegesen feltöltjük a DNS-polimeráz I Klenow-fragmentje alkalmazásával, a Klenow-reakcióban csak dCTP-t és dGTP-t használva. A túlnyúló végek megmaradó nukleotidjait, amelyeket nem töltöttünk fel, mung bean nukleázos emésztéssel eltávolítjuk, majd a keletkező tompa végű DNS-fragmentet gélelektroforézissel elválasztjuk. Egyetlen 450 bp méretű DNS-fragmentet izolálunk a gélből, majd összeligáljuk ekvimoláris mennyiségű pUCADdal, amelyet előzőleg teljesen megemésztettünk BamHI restrikciós enzimmel, és mung bean nukleázos emésztéssel tompa végűvé tettünk. A kapott plazmidot, amely az enzim herbicidrezisztens formáját kódoló AhS gént tartalmazza a 450 bp méretű indukálható promoterfragment szabályozása alatt, pDuPS22-nek nevezzük el.

9. példa

Rekombináns gének készítése, amelyeknek az expresszióját az 5-2 kukoricapromoter szabályozza A pMC710 előállítása

A pJE516 konstrukcióban lévő 2-1 promoterfragmentet eltávolítjuk, majd egy 5-2 promoterrel helyettesítjük. Ebből a célból a pJE 516 plazmidot teljesen megemésztjük Sst II restrikciós enzimmel, majd a keletkező 3’-túlnyúló végeket T4 DNS-polimerázzal eltávolítjuk. Ezt a DNS-t azután teljesen megemésztjük Ncol restrikciós enzimmel, majd a DNS-fragmenteket agarózgél-elektroforézissel elválasztjuk. A 3.8 kb méretű, a pJE516-ból származó GUS/2-1 3’-fuziónak megfelelő csíkot kivágjuk a gélből, majd az előzőekben leírt módon kinyeqük. A pMC 75.5 plazmidot teljesen megemésztjük Xhol restrikciós enzimmel, majd a keletkező 5’-túlnyúló végeket DNS-polimeráz I Klenow-fragmentjével feltöltjük. Ezt a DNS-t azután teljesen megemésztjük Ncol restrikciós enzimmel és defoszforilezzük. A kapott DNS-t a pJE516 plazmidból származó 3.0 kb méretű Ncol tompa végű DNS-fragmentjéhez ligáljuk. Ennek a ligálóelegynek egy aliquot részét használjuk kompetens Escherichia coli HB101 sejtek transzformálására, és az egyes transzformánsokat addig vizsgáljuk, amíg nem találunk egy olyat, amely az 5-2 promotert működés szempontjából a GUS/2-1 3’-füzióhoz kapcsolva tartalmazza a pBS(-) vektorban. Ennek a konstrukciónak a jele pMC715.83 (17. ábra).

10. példa

Kiméra gén készítése, amelynek expresszióját a

218-as kukoricapromoter szabályozza

A pMC791 plazmidot (4. példa) részlegesen megemésztjük AflIII restrikciós enzimmel. A részlegesen emésztett pMC791 plazmidot teljesen megemésztjük Smal restrikciós enzimmel. Az emésztési termékeket gélelektroforézissel választjuk el, majd egy 1,4 kb méretű AflIII/Smal DNS-fragmentet izolálunk.

A pJE516 plazmidot teljesen megemésztjük Sáli restrikciós enzimmel, majd a keletkező 5’-túlnyúló végeket T4 DNS-polimerázzal feltöltjük. A DNS-t ezután teljesen megemésztjük Ncol restrikciós enzimmel, defoszforilezzük, majd ekvimoláris mennyiségű, gélen tisztított, a pMC791-ből származó 1.4 kb méretű AflIII/Smal fragmenttel ligáljuk össze. A ligálóelegy egy aliquot részét használjuk Escherichia coli HB101 sejtek transzformálására. A transzformálóelegy aliquot részeit ampicillintartalmú LB-agarlemezekre szélesztjük, majd a lemezeket egy éjszakán át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Az ampicillinrezisztens telepekből izolált plazmid DNS-eket restrikciós emésztéssel elemezzük, amíg nem találunk egy olyat, amely az 1.4 kb méretű, a 218-aminosav-génből származó Smal·AflIII promoterffagmentet működés szempontjából a pJE516-ban lévő GUS/2-1 3’-vég fúzióhoz kapcsolva tartalmazza. Ennek a plazmidnak a jele pMC7113 (18. ábra).

11. példa

Olyan rekombináns gének előállítása, amelyeknek az expresszióját a petúnia P6.1 gén promoterfragmentjei és a különböző 3 ’-downstream régiók szabályozzák

A P655, P657, P658 és P660 előállítása

A P655 előállítása

A fúziókban alkalmazott riportergén Escherichia coliból származó β-glükoronidáz, amint azt az előző példákban megbeszéltük. Ennek a génnek a fonása a pJJ3431 plazmid (ATCC letéti szám 67884), amely pUCl 18-ban tartalmazza a GUS kódoló régiót a ³⁵S CaMV promoterrégióhoz kapcsolva, és az oktopin szintetáz gén 3’-végét. A P6 génből származó szabályozórégiókat a pJJ3431-ben lépésenként helyettesítjük: először a ³⁵S promotert helyettesítjük a P6 gén 1-es promoterével, majd az oktopin szintetáz (ÖCS) gén 3’-végét helyettesítjük a P6 1-es gén 3’-végével.

A ³⁵S promoterrégióit eltávolítjuk a pJJ3431-ből oly módon, hogy 10 pg plazmid-DNS-t emésztünk EcoRI restrikciós enzimmel, majd a keletkező túlnyúló végeket Klenow-fragmenttel feltöltjük. Miután fenol: kloroform 1:1 arányú elegyével extraháltuk, és etanollal kicsaptuk, a DNS-t Ncol restrikciós enzimmel emésztjük, és a termékeket agarózgél-elektroforézissel elválasztjuk. A pUCl 18-ban lévő GUS/OCS 3’-vég fu41

HU 218 717 Β ziónak megfelelő 5.8 kb méretű DNS-fragmentet izolálunk oly módon, hogy a fragmentet tartalmazó géldarabot egy dialízishüvelybe tesszük 500 pl TAE-pufferrel együtt, majd a DNS-t elektroeluáljuk az agarózból. Az eluált DNS-t fenol: kloroform 1:1 arányú elegy ével extraháljuk, és etanollal kicsapjuk. A mutagenizált petúnia P6 gén 1-es promoterrégiót, amely egyetlen Ncol restrikciós hasítási helyet tartalmaz, megtisztítjuk oly módon, hogy a 4. példában szereplő P653 plazmidkonstrukcióból 10 pg-ot teljesen megemésztünk Ncol és Smal restrikciós enzimekkel, és az előzőekben leírt módon tisztítjuk az 1.3 kb méretű P6 promoterfragmentet. Ebből az 1.3 kb méretű promoterfragmentból és a GUS/OCS 3’-vég fragmentből ekvimoláris mennyiségeket ligálunk össze egy éjszakán át 15 °C hőmérsékleten, 10 pl térfogatban. A ligáit DNS-t használjuk kompetens Escherichia coli JM83 sejtek transzformálására, majd a transzformációs elegy aliquot részeit 75 pg/ml ampicillint tartalmazó LB-lemezre szélesztjük. Kis mennyiségű plazmidpreparátumot készítünk az ampicillinrezisztens telepekből, majd ezeket Ncol és BamHI restrikciós enzimekkel emésztve vizsgáljuk, amíg egy olyan telepet találunk, amelyben a plazmid tartalmazza az 1.3 kb méretű P6 gént működés szempontjából a pJJ3431 plazmidban lévő GUS/OCS fúzióhoz kapcsolva.

A P657 készítése

A P655 készítése során a petúnia P6/GUS fúziót működés szempontjából egy ÖCS 3’-véghez kötjük az Xbal helyen keresztül. Abból a célból, hogy az ÖCS 3’-vég fragmentet a P655-ben a P654-ben lévő mutagenizált P6 gén 3’-ffagmenttel helyettesítsük, az szükséges, hogy először részlegesen emésszük a P655-öt Xbal restrikciós enzimmel, mivel van egy Xbal hasítási hely a P655 polilinker régiójában az ÖCS 3’-vég fúzióban lévő mellett. Egy viszonylag inaktív Xbal készítmény következtében lehetséges volt részlegesen emésztett molekulákat előállítani oly módon, hogy 10 pg P655 DNS-t 30 egység enzimmel emésztettünk 1 óra hosszat. Miután a részleges emésztést agarózgél-elektroforézissel leellenőriztük, az Xbal hely 5’-túlnyúló végét DNS-polimeráz I Klenow-ffagmentjével feltöltjük. A DNS-t fenol:kloroform 1:1 arányú elegyével extraháljuk, etanollal kicsapjuk, majd HindlII restrikciós enzimmel teljesen megemésztjük. Ennek az emésztésnek a termékeit agarózgél-elektroforézissel elválasztjuk, majd a keresett, az ÖCS 3’-vég nélküli P655-nek megfelelő DNS-fragmentet a gélből tisztítjuk.

A P6.1 gén 3’-végét izoláljuk oly módon, hogy a P654 plazmidot teljesen megemésztjük BglII restrikciós enzimmel, majd a keletkező 5’-túlnyúló végeket Klenow-ffagmenttel feltöltjük. A DNS-t fenol:kloroform 1:1 arányú elegyével extraháljuk, etanollal kicsapjuk, feloldjuk, majd teljesen megemésztjük HindlII restrikciós enzimmel. A kapott termékeket agarózgél-elektroforézissel elválasztjuk, majd a 2.2 kb méretű fragmentet, amely a P6.1 gén 3’-végét tartalmazza, kivágjuk a gélből, és az előzőkben leírt módon tisztítjuk.

A 2.2 kb méretű P6 3’-vég fragmentet a fentiekben leírt P655 tisztított Xbal fragmentjével ligáljuk egy éjszakán át 15 °C hőmérsékleten 10 pl térfogatban. A ligáló reakcióelegy egy aliquot részét használjuk kompetens Escherichia coli JM83 sejtek transzformálására. Az egyes ampicillinrezisztens telepekből kis mennyiségű plazmidpreparátumot készítünk, majd HindlII és BamHI restrikciós enzimekkel emésztve analizáljuk addig, amíg találunk egyet, amely a P6.1 3’-véget működés szempontjából a P6.1 promoter/GUS fúzióhoz kapcsolva tartalmazza. A plazmid jelzése P657 (19. ábra).

A P658 készítése

Abból a célból, hogy a P6.1 promoterben lévő potenciális szabályozórégiókat feltérképezzük, egy 1 kb méretű részt kivágunk a P657 konstrukcióból, ezzel egy 300 bp méretű P6.1 promoterfragmentet hagyunk működés szempontjából a GUS/P6.1 3’-downstream végéhez kapcsolva. 10 pg P657 DNS-t teljesen megemésztünk Xbal és Spel restrikciós enzimekkel. A keletkező 5'-túlnyúló végeket Klenow-fragmenttel feltöltjük, majd agarózgél-elektroforézissel elválasztjuk. A 7.6 kb méretű fragmentet (P657 a kivágott promoter 1 kb méretű 5’-végével) elektroelúcióval kinyerjük a gélből, majd fenol : kloroform 1:1 arányú elegyével extraháljuk, és etanollal kicsapjuk. A DNS-t önmagával ligáljuk egy éjszakán át 15 °C hőmérsékleten 10 pl ligálóelegyben. A ligálóelegy aliquot részét használjuk kompetens Escherichia coli JM83 transzformálására. Az egyes ampicillinrezisztens telepekből származó plazmid-DNS-t HindlII és BamHI restrikciós enzimekkel emésztjük, amíg a keresett plazmidot tartalmazó telepet találunk. Ez a telep, amely a GUS/OCS 3’-vég fúziót működés szempontjából egy 300 bp méretű P6.1 promoterfragmenthez kapcsolva tartalmazza, a P658 jelet kapja (19. ábra).

A P660 készítése

Egy olyan konstrukciót készítünk, amelyben a GUS/OCS 3’-downstream vég működés szempontjából egy 600 bp méretű P6.1 promoterfragmenthez kapcsolódik. Az iniciációs ATG kodon előtt 600 bp-ral egy megfelelő EcoRI restrikciós hasítási helyet alkalmazunk arra, hogy a 600 bp méretű promoterfragmentet előállítsuk. Mivel azonban 2 EcoRI hasítási hely található a P6.1 gén 3’-downstream régiójában, ezért a P655 plazmidban egy promoterdeléciót készítünk, és az ÖCS 3’-véget a P6.1 génből származó 3’-downstream régióval helyettesítjük.

pg P655 DNS-t részlegesen emésztünk Xbal restrikciós enzimmel, majd fenol: kloroform 1:1 arányú elegyével extraháljuk, és etanollal kicsapjuk. A DNS-t ezután teljesen megemésztjük EcoRI restrikciós enzimmel, és a termékeket agarózgél-elektroforézissel választjuk el. Azt a 6.4 kb méretű DNS-fragmentet tisztítjuk, amely megfelel egy olyan P655-nek, amelyben a P6.1 promoter 5’-végéről hiányzik 700 bp, majd az 5’-túlnyúló végeket Klenow-fragmenttel feltöltjük. A DNS-t fenol: kloroform 1:1 arányú elegyével extraháljuk, majd etanollal kicsapjuk. A 6.4 kb méretű fragmentet önmagával ligáljuk egy éjszakán át 15 °C hőmérsékleten 10 pl térfogatban. A ligálóelegy aliquot részét használjuk kompetens Escherichia coli JM83 sejtek transzformálására. Az egyes ampicillinrezisztens telepekből származó plazmid-DNS-t HindlII

HU 218 717 Β és BamHI restrikciós enzimekkel emésztjük, amíg a keresett 3.2 kb méretű HindlII/BamHI fragmentet hordozó telepet találunk, ami a 600 bp méretű fragment jelenlétét mutatja a konstrukcióban. Ennek a plazmidnak a jele P659 (20. ábra).

Abból a célból, hogy a P659-ben az ÖCS 3’-végét a P6.1 gén 3’-végével helyettesítsük, 10 pg P659 DNS-t először Xbal restrikciós enzimmel részlegesen emésztünk. Az 5’ túlnyúló végeket Klenow-fragmenttel feltöltjük, majd a tompa végű DNS-t fenol: kloroform 1:1 arányú elegyével extraháljuk, és etanollal kicsapjuk. A DNS-t ezután teljesen megemésztjük HindlII restrikciós enzimmel, és a keletkező DNS-fragmenteket agarózgél-elektroforézissel választjuk el. Az 5.7 kb méretű fragmentet, amely megfelel a P659-nek az ÖCS 3’-vége nélkül, elektroeluáljuk a gélből, azonos térfogatú fenol: kloroform 1:1 arányú elegyével extraháljuk, majd etanollal kicsapjuk. Ezt a fragmentet egy éjszakán át ligáljuk 15 °C hőmérsékleten 10:1 térfogatban ugyanahhoz a BglIII-tompa végű/HindlII fragmenthez (a P654ből származik), amelyet a P657 készítésénél alkalmaztunk. A ligálóelegy aliquot részét használjuk kompetens Escherichia coli JM83 sejtek transzformálására. Az egyes ampicillinrezisztens telepekből származó plazmid-DNS-t BamHI és HindlII restrikciós enzimekkel emésztjük addig, amíg nem találunk egyet, amely egy 4.7 kb méretű BamHI/HindlII fragmentet tartalmaz. Ez a konstrukció, amely a GUS-t működés szempontjából egy 600 bp méretű P6.1 promoterfragmenthez és egy 1.3 kb méretű 3’-downstream fragmenthez kapcsolva tartalmazza, a P6660 jelzést kapja (20. ábra).

12. példa

A kukorica 2-2 promoterből származó indukálható szabályozóelemeket tartalmazó kiméra promoterek transzkripciós szabályozása alatt álló rekombináns gének előállítása

Oligonukleotidokat szintetizálunk Applied Biosystems Model 3 80A DNS-szintetizátor alkalmazásával. Mindegyik oligonukleotidot Applied Biosystems Oligonucleotide Purification Cartridgok (CAT# 400771) felhasználásával tisztítjuk, a gyártó által javasolt módszerrel.

A pHPH401 és a pHPH401 dcm~ előállítása

A 146/1 szekvenciával rendelkező komplementer oligonukleotidokat, valamint a 146/11 szekvenciájú 34-es és 35-ös oligonukleotidokat foszforilezzük oly módon, hogy mindegyik oligonukleotidból 10 pg-ot foszforilezünk 25-50 egység T4 polinukleotid kinázzal 50 pl 50 mmol TRIS-HC1, pH=7,5,10 mmol MgCl₂,10 mmol DTT összetételű oldatban 20 percig 37 °C hőmérsékleten. Továbbá 25 pl 50 mmol TRIS-HC1, pH=7,5, 10 mmol MgCl₂, 10 mmol DTT összetételű oldatban 12,5-25 egység polinukleotid kinázt adunk hozzá, majd az inkubálást tovább folytatjuk 20 percig 37 °C hőmérsékleten. A kináz reakcióelegyet 10 percig 70 °C hőmérsékleten tartjuk, majd jégbe hűtjük. A foszforilezett 32, 33, 34 és 35-ös oligonukleotidokat 13 pg/ml végkoncentrációban elegyítjük vízben, majd ebből az elegyből 1 pl-t egy éjszakán át 15 °C hőmérsékleten ligáljuk 1,5 pg pBluescript S/K(+) plazmidvektorral, amelyet előzőleg teljesen megemésztünk EcoRI és KpnI restrikciós endonukleázokkal, majd boíjúbél alkalikus foszfatázzal defoszforilezünk. A ligálóelegyet 60 pl-re hígítjuk vízzel, majd a hígításból 2 pl-t használunk 60 pl kompetens Escherichia coli HB101 sejt transzformálására. A transzformáló reakcióelegy aliquot részét 50 pg/ml ampicillint tartalmazó LB-lemezekre szélesztjük, majd a lemezeket egy éjszakán át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Kis mennyiségű plazmidpreparátumot készítünk az ampicillinrezisztens telepekből, és azokat a telepeket, amelyekben restrikciós emésztéssel 100 bp méretű EcoRI/Kpnl inszertet találunk, M13 univerzális primerrel szekvenálunk. Egy telepet, amely a 32-35-ös oligonukleotidokat tartalmazza, a pBluescript S/K(+) EcoRI/Kpn helyére klónozva pHPH401 jelzéssel látunk el.

A pHPH401 plazmidot dcm~ Escherichia coli NS2616 törzsbe visszük. Bármely általánosan hozzáférhető dcm- Escherichia coli törzs felhasználható erre a célra. Kompetens NS2216 sejteket készítünk oly módon, hogy 50 ml LB-táptalajt oltunk be 100 pl LB-táptalajban egy éjszakán át növesztett NS2216 tenyészettel, majd ezt az új tenyészetet 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk 37 °C-on rázatás közben addig, amíg az A₆₅₀ érték eléri a 0,25-öt. A tenyészetet jégen 0 °C-ra hűtjük. A baktériumokat centrifugálással nyerjük ki (1500xg, 10 perc), 25 ml 100 mmólos CaCl₂-ban szuszpendáljuk, majd jégen inkubáljuk 30 percig. A baktériumokat újra centrifugáljuk a fentiek szerint, majd 0,5 ml 100 mmólos CaCl₂-oldatban szuszpendáljuk. 4 óráig tartjuk jégen, majd 100 pl kompetens sejtet eltávolítunk, 4 ng pHPH401 plazmidot adunk hozzá, majd a sejteket 30 percig jégen inkubáljuk. A sejteket ezután hősokknak vetjük alá (5 perc 37 °C) vízfürdőben, rázatás nélkül. A sejteket ezután visszavisszük a jégre 2 percre, mielőtt 2 ml LB-táptalajt adnánk hozzá. A sejteket 1 óra hosszat 37 °C hőmérsékleten tartjuk, majd a transzformációs elegy alikvot részeit 50 pg/ml ampicillint tartalmazó LB-agarlemezre szélesztjük, majd egy éjszakán át hagyjuk növekedni 37 °C hőmérsékleten. Az egyes ampicillinrezisztens telepekből kis mennyiségű plazmidpreparátumot készítünk, majd restrikciós endonukleázokkal elemezzük, amíg egy olyat találunk, amely a pHPH401et tartalmazza. A törzs jelzése HPH401 dcm , és a törzsben található dcm- plazmid jelölése pHPH401 dcm-.

A pHPH410 plazmid előállítása

A 148/1 szekvenciájú 36-os és 37-es komplementer oligonukleotidokat foszforilezzük, majd az egyes oligonukleotidokat 33 ng/ml koncentrációra hígítjuk vízben. Ebből a hígításból 1 pl-t egy éjszakán át ligálunk. 1,4 pg KpnI és Stul restrikciós enzimekkel emésztett és defoszforilezett pHPH401 dcm- vektorral 10 pl térfogatban. A ligáló reakcióelegyet 50 pl-re hígítjuk vízzel, majd a hígított ligálóelegyből 2 pl-es aliquot részt használunk 40 pl kompetens Escherichia coli HB101 sejtek transzformálására. A transzformálóelegy aliquot részeit 50 pg/ml ampicillint tartalmazó LB-agarlemezre szélesztjük, majd éjszakán át 37 °C hőmérsékleten növesztjük. Az egyes ampicillinrezisztens telepekből kis mennyiségű plazmidpreparátumot készítünk, majd

HU 218 717 Β azokat a telepeket, amelyekben restrikciós emésztéssel 160 bp méretű EcoRI/KpnI inszertet találunk, az Ml3 univerzális prímért használva szekvenáljuk. Egy telepet, amely a 36-os és 37-es oligonukleotidokat tartalmazza a pHPH401 dcm- KpnI/StuI hasítási helyre ligáivá, pHPH410 jelzéssel látunk el.

A 443-as promoter előállítása a pHPH443 plazmidban

A 149/1 szekvenciájú 44-es és 45-ös komplementer oligonukleotidot a fentiek szerint foszforilezzük, majd mindegyik oligonukleotidot vízzel 13,3 ng/ml koncentrációra hígítjuk. Ebből a hígításból 1 μΐ-t ligálunk egy éjszakán át 1,5 pg Hpal és EcoRI restrikciós enzimekkel emésztett és defoszforilezett pHPH410 plazmiddal 15 pl térfogatban. A ligáló reakcióelegyet 60 pl-re hígítjuk vízzel, majd a hígított ligáló reakcióelegyből 2 pl-es aliquot részt használunk 40 pl kompetens Escherichia coli HB101 sejtek transzformálására. A transzformálóelegy aliquot részeit 50 pg/ml ampicillint tartalmazó LB-agarlemezekre szélesztjük, majd egy éjszakán át 37 °C hőmérsékleten hagyjuk növekedni. Az egyes ampicillinrezisztens telepekből kis mennyiségű plazmidpreparátumot készítünk, majd azokat a telepeket, amelyekről restrikciós emésztéssel kiderült, hogy 240 bp méretű Pstl/KpnI inszertet tartalmaznak, M13 univerzális primer alkalmazásával szekvenáljuk. Egy telepet, amely a 44-es és 45-ös oligonukleotidokat a pHPH410 plazmid EcoRI/Hpal helyére klónozva tartalmazza, pHPH43-nak nevezzük. A pHPH443 plazmidban lévő inszert szekvenciáját a 21. ábrán mutatjuk be. Ez a DNS-fragment egy olyan kiméra promoter, amely a kukorica 2-2 promoteréből egy 77 bp méretű kémiailag indukálható elemet tartalmaz (a 21. ábra 9-86-os nukleotidja), működésileg az alkohol-dehidrogenáz 1—IS alléljéhez kapcsolva [Dennis et al., Nucleic Acids Research, 12, 3893-4000 (1984)] (a 21. ábra 87-180-aminosav nukleotidjai), valamint a kukorica 2-2 génjéből származó 5’ nem transzlálódó régiót (a 21. ábra 181-225-ös nukleotidjai). A nyíl és az aláhúzás az ábrán a transzkripciós és transzlációs starhelyeket jelzi a promoteren.

A pHPP412 előállítása

A 150/1 szekvenciájú 46-os és 47-es komplementer oligonukleotidot a fentiek szerint foszforilezzük, majd mindegyik oligonukleotidot vízzel 13,3 ng/pl koncentrációra hígítjuk. Ebből a hígításból 1 pl-t ligálunk egy éjszakán át 1,4 pg KpnI és Stul restrikciós enzimekkel emésztett és defoszforilezett pHPH410 dcm plazmiddal 15 pl térfogatban. A ligáló reakcióelegyet 60 pl-re hígítjuk vízzel, majd a hígított ligáló reakcióelegyből 2 pl-es aliquot részt használunk 40 pl kompetens Escherichia coli HB101 sejtek transzformálására. A transzformálóelegy aliquot részeit 50 pg/ml ampicillint tartalmazó LB-agarlemezekre szélesztjük, majd egy éjszakán át 37 °C hőmérsékleten hagyjuk növekedni. Az egyes ampicillinrezisztens telepekből kis mennyiségű plazmidpreparátumot készítünk, majd azokat a telepeket, amelyekről restrikciós emésztéssel kiderült, hogy 240 bp méretű Pstl/KpnI inszertet tartalmaznak, Ml3 univerzális primer alkalmazásával szekvenáljuk. Egy telepet, amely a 45-ös és 46-os oligonukleotidokat a pHPH410 dcm' plazmid EcoRI/Hpal helyére klónozva tartalmazza, pHPH411-nek nevezzük.

A 151/1 szekvenciájú 48-as és 49-es komplementer oligonukleotidot a fentiek szerint foszforilezzük, majd mindegyik oligonukleotidot vízzel 20 ng/pl koncentrációra hígítjuk. Ebből a hígításból 1 pl-t ligálunk egy éjszakán át 1,4 pg KpnI és Stul restrikciós enzimekkel emésztett és defoszforilezett pHPH411 dcm- plazmiddal 15 pl térfogatban. A ligáló reakcióelegyet 50 pl-re hígítjuk vízzel, majd a hígított ligáló reakcióelegyből 2 pl-es aliquot részt használunk 40 pl, kompetens Escherichia coli HB101 sejtek transzformálására. A transzformálóelegy aliquot részeit 50 pg/ml ampicillint tartalmazó LB-agarlemezekre szélesztjük, majd egy éjszakán át 37 °C hőmérsékleten hagyjuk növekedni. Az egyes ampicillinrezisztens telepekből kis mennyiségű plazmidpreparátumot készítünk, majd M13 univerzális primer alkalmazásával szekvenáljuk. Egy telepet, amely a 48-as és 49-es oligonukleotidokat a pHPH411 dcm- plazmid KpnI/StuI helyére klónozva tartalmazza, pHPH412-nek nevezzük.

A pHPH460plazmid előállítása

A 151/11 szekvenciájú 62-es és 63-as oligonukleotidokat a fentiek szerint foszforilezzük, majd az egyes oligonukleotidokat 10 ng/pl koncentrációban vízzel elegyítjük. Ebből a hígításból 1 pl-t ligálunk 6 órán át 1 pg PstI és HindlII restrikciós enzimmel emésztett és defoszforilezett pBluescript S/K(+) vektorral 10 pl térfogatban. A ligáló reakcióelegyet 50 pl-re hígítjuk vízzel, majd a hígított ligáló reakcióelegyből 2 pl-es aliquot részt használunk 40 pl kompetens Escherichia coli HB101 sejtek transzformálására. A transzformálóelegy aliquot részeit 50 pg/ml ampicillint tartalmazó LB-agarlemezekre szélesztjük, majd egy éjszakán át 37 °C hőmérsékleten hagyjuk növekedni. Az egyes ampicillinrezisztens telepekből kis mennyiségű plazmidpreparátumot készítünk, majd Ml3 univerzális primerrel szekvenáljuk, amíg egy olyan telepet találunk, amely a 62-es és 63-as oligonukleotidokat a pBluescript S/K(+) Pstl/HindlII helyére klónozva tartalmazza. Ennek a plazmidnak a jelzése pHPH460.

A pHPH461 plazmid előállítása

A 152/1 szekvenciájú 75-ös és 76-os oligonukleotidokat a fentiek szerint foszforilezzük, majd az egyes oligonukleotidokat 12,5 ng/pl koncentrációban vízzel elegyítjük. Ebből a hígításból 1 pl-t ligálunk 6 órán át 1 pg Hpal és Xhol restrikciós enzimmel emésztett és defoszforilezett pHPH460 vektorral 10 pl térfogatban. A ligáló reakcióelegyet 50 pl-re hígítjuk vízzel, majd a hígított ligáló reakcióelegyből 2 pl-es aliquot részt használunk 40 pl kompetens Escherichia coli HB101 sejtek transzformálására. A transzformálóelegy aliquot részeit 50 pg/ml ampicillint tartalmazó LB-agarlemezekre szélesztjük, majd egy éjszakán át 37 °C-on hagyjuk növekedni. Az egyes ampicillinrezisztens telepekből kis mennyiségű plazmidpreparátumot készítünk, majd Ml3 univerzális primerrel szekvenáljuk, amíg egy olyan telepet találunk, amely a 75-ös és 76-os oligonukleotidokat a pHPH460 Hpal/Xhol helyére klónozva tartalmazza. Ennek a plazmidnak a jelzése pHPH461.

HU 218 717 Β

A pHPH462 plazmid eox

A 153/1 szekvenciájú 77-es és 78-as oligonukleotidokat a fentiek szerint foszforilezzük, majd az egyes oligonukleotidokat 10 ng/μΐ koncentrációban vízben elegyítjük. Ebből a hígításból 1 pl-t Egálunk 6 órán át 1 μg KpnI és Hindi restrikciós enzimmel emésztett és defoszforilezett pHPH4612 vektorral 10 μΐ térfogatban. A ligáló reakcióelegyet 50 μΐ-re hígítjuk vízzel, majd a hígított ligáló reakcióelegyből 2 μΐ-es aliquot részt használunk 40 μΐ kompetens Escherichia coli HB101 sejtek transzformálására. A transzformálóelegy aliquot részeit 50 pg/ml ampicillint tartalmazó LB-agarlemezekre szélesztjük, majd egy éjszakán át 37 °C hőmérsékleten hagyjuk növekedni. Az egyes ampicillinrezisztens telepekből kis mennyiségű plazmidpreparátumot készítünk, majd M13 univerzális primerrel szekvenáljuk, amíg egy olyan telepet találunk, amely a 77-es és 78-as oligonukleotidokat a KpnI/HindI helyére klónozva tartalmazza. Ennek a plazmidnak a jelzése pHPH462.

A pHPH463 éspHPH463 dam~ plazmid előállítása

A fentiekben ismertetett foszforilezett, komplementer oligonukleotidokat 25 ng/μΐ koncentrációban vízben elegyítjük. Ebből a hígításból 1 pl-t ligálunk 6 órán át 1 pg Stul és KpnI restrikciós enzimmel emésztett és defoszforilezett pHPH462 vektorral 10 pl térfogatban. A ligáló reakcióelegyet 50 μΐ-re hígítjuk vízzel, majd a hígított ligáló reakcióelegyből 2 μΐ-es aliquot részt használunk 40 pl kompetens Escherichia coli HB101 sejtek transzformálására. A transzformálóelegy aliquot részeit 50 pg/ml ampicillint tartalmazó LB-agarlemezekre szélesztjük, majd egy éjszakán át 37 °C hőmérsékleten hagyjuk növekedni. Az egyes ampicillinrezisztens telepekből kis mennyiségű plazmidpreparátumot készítünk, majd M13 univerzális primerrel szekvenáljuk, amíg egy olyan telepet találunk, amely a 48-as és 49-es oligonukleotidokat a pHPH462 StuI/KpnI helyére klónozva tartalmazza. Ennek a plazmidnak a jelzése pHPH463. A pHPH463 plazmidban lévő inszertet a 22. ábrán látjuk. Ez a DNS-fragment egy olyan kiméra promoter, amely a

2-2 promoter -1--136-os régióját tartalmazza (a

22. ábra 7-146-os nukleotidjai) működés szempontjából a kukorica-alkohol-dehidrogenáz 1-15 allélje [Dennis et al., Nucleic Acids Research, 12, 3983-4000 (1984)] 5’ nem transzlálódó leaderszekvenciájához kapcsolva (a 22. ábra 147-247-es nukleotidjai), és úgy van módosítva, hogy egy Ncol hasítási helyet tartalmazzon a transzlációs startkodonnál. Az ábrán látható nyíl és aláhúzás a promoter transzkripciós és transzlációs starthelyét jelzi.

A pHPH463 plazmidot a dam- Escherichia coli CHS26 törzsbe transzformáljuk az előzőekben ismertetett, a pHPH401 plazmidnak a dcm Escherichia coli NS2216 törzsbe való bejuttatására használt transzformációs eljárást alkalmazva. Az Escherichia coli CHS26 sejtben lévő pHPH463 plazmid jelölése pHPH463dam~.

A pHPH467 előállítása

A 115/1 szekvenciájú, 88-as és 89-es komplementer oligonukleotidokat előállítjuk, majd foszforilezzük oly módon, hogy minden egyes oligonukleotidból 5 pg-ot 25-50 egység T4 polinukleotid kinázzal inkubálunk 50 pl 50 mmol TRIS-HC1, pH=7,5, 10 mmol MgCl₂, mmol DTT összetételű oldatban 1 óra hosszat 37 °C hőmérsékleten. A kinázreakciókat 10 percre 70 °C-ra melegítjük, majd jégbe hűtjük. Az egyes oligonukleotidokat 35 ng/ml koncentrációban vízben elegyítjük. Ebből a hígításból 1 pl-t ligálunk 4 órán át 1 pg Pstl és Clal restrikciós enzimmel emésztett és defoszforilezett pHPH463dam~ vektorral 10 pl térfogatban. A ligáló reakcióelegyet 50 pl-re hígítjuk vízzel, majd a hígított ligáló reakcióelegyből 2 pl-es aliquot részt használunk 40 pl kompetens Escherichia coli HB101 sejtek transzformálására. A transzformálóelegy aliquot részeit 50 pg/ml ampicillint tartalmazó LB-agarlemezekre szélesztjük, majd egy éjszakán át 37 °C hőmérsékleten hagyjuk növekedni. Az egyes ampicillinrezisztens telepekből kis mennyiségű plazmidpreparátumot készítünk, majd a 49-es oligonukleotiddal mint primerrel szekvenáljuk, amíg egy olyan telepet találunk, amely a 88-as és 89-es oligonukleotidokat a pHPH463damPstl/Clal helyére klónozva tartalmazza. Ennek a plazmidnak a jelzése pHPH467.

A pHPH500 plazmid előállítása A 156/1 szekvenciájú 92-es és 93-as komplementer oligonukleotidokból, amelyek együtt a 2-2 promoter indukálható elemét képezik, 5 pg-ot a 88-as és 89-es oligonukleotidokra leírt módon foszforilezünk. Az oligonukleotidokat 20-20 ng/pl koncentrációban vízben összekeveqük. Ebből a hígításból 1 pl-t 4 órán át ligálunk 1 pg Smal restrikciós enzimmel emésztett és defoszforilezett pBluescript S/K(+) vektorral 10 pl térfogatban. A ligáló reakcióelegyet 50 pl-re hígítjuk vízzel, majd a hígított ligáló reakcióelegyből 2 pl-es aliquot részt használunk 40 pl kompetens Escherichia coli HB101 sejtek transzformálására. A transzformálóelegy aliquot részeit 50 pg/ml ampicillint tartalmazó LB-agarlemezekre szélesztjük, majd egy éjszakán át 37 °C hőmérsékleten hagyjuk növekedni. Az egyes ampicillinrezisztens telepekből kis mennyiségű plazmidpreparátumot készítünk, majd M13 univerzális primerrel szekvenáljuk. Egy telepet, amely a 92-es és 93-as oligonukleotidokat a pBluescript S/K (+) Smal helyére klónozva tartalmazza olyan orientációban, hogy az indukálható elem 5’-vége a vektor polilinker 3’-végéhez kapcsolódik, pHPH500nak nevezünk.

A pHPH478 plazmid előállítása A pHPH plazmidot teljesen megemésztjük BamHl és Hpal restrikciós enzimekkel. Az emésztési termékeket poliakrilamidgél-elektroforézissel választjuk el, majd a 2-2 promoter indukálható promoterének megfelelő 85 bp méretű fragmentet az előzőekben leírt módon kinyeijük. Ezt a fragmentet egy éjszakán át ligáljuk 1 pg BamHl és Hpal restrikciós enzimekkel emésztett és defoszforilezett pHPH567 plazmiddal 10 pl térfogatban. A ligáló reakcióelegyet 50 pl-re hígítjuk vízzel, majd a hígított ligáló reakcióelegyből 2 pl-es aliquot részt használunk 40 pl kompetens Escherichia coli HB101 sejtek transzformálására. A transzformálóelegy aliquot részeit 50 pg/ml ampicillint tartalmazó LB-agarlemezekre szélesztjük, majd egy éjszakán át 37 °C hőmérsékleten hagyjuk növekedni. Az egyes ampicillinrezisztens telepekből kis mennyiségű plazmidpreparátumot készítünk,

HU 218 717 Β majd restrikciós enzimes emésztéssel elemezzük, amíg egy olyan plazmidot találunk, amely a pHPH500 BamHI/Hpal fragmentjét a pHPH478 BamHI/Hpal helyére klónozva tartalmazza. Ennek a plazmidnak a jele pHPH478. A pHPH478 plazmidban lévő inszert szekvenciáját a 23. ábrán láthatjuk. Ez a DNS-ffagment egy kiméra promoter, amely a kukorica 2-2 promoteréből származó 76 bp méretű indukálható elemet tartalmaz (a

23. ábra 9-85-ös nukleotidjai), működés szempontjából a fitokróm 3-as típusú promoter -1--94-es régiójához kapcsolva [Hershey et al., Gene, 61, 339-348 (1987)] (a 23. ábra 65-155-ös nukleotidjai), és a kukorica alkoholdehidrogenáz 1—IS alléi 5’ nem transzlálódó régióját [Dennis et al., Nucleic Acids Research, 12, 3983-4000 (1984)] (a 23. ábra 156-256-os nukleotidjai) használja, és úgy van módosítva, hogy a transzlációs startkodonnál egy Ncol restrikciós hasítási helyet tartalmaz. Az ábrán a nyíl és az aláhúzás a promoter transzkripciós és transzlációs starthelyét jelöli.

A pHPH443GUS, pHPH410GUS, pHPH412GUS, pHPH463GUS és a pHPH478GGS plazmidok előállítása

A pHPH443 plazmidból 60 pg-ot teljesen megemésztünk Xbal és Ncol restrikciós enzimekkel. A keletkező DNS-fragmenteket elektroforézissel választjuk el, egy éjszakán át 180 V feszültséggel futtatva, TBE-ben készült 2 mm vastag, 25% glicerint tartalmazó 7,5%-os poliakrilamidgél egyetlen 1 cm vastag csíkjában. A DNSfragmenteket UV fényben tesszük láthatóvá, miután a gélt 0,5 pg/ml etidium-bromid vizes oldatával festettük 20 percig. A pHPH443 inszertnek megfelelő 230 bp méretű DNS-fragmentet kivágjuk a gélből, egy 1,5 ml-es mikrocentrifugacsőbe helyezzük, spatulával összetöijük, majd géleluáló pufferben szuszpendáljuk. A csövet ezután erősen rázatjuk egy éjszakán át 37 °C hőmérsékleten. A keletkező szuszpenzióból üveggyapoton keresztül való szűréssel eltávolítjuk a gélffagmenteket, majd a szűrletben lévő DNS-t 1 ml etanol hozzáadása után szárazjégben kicsapjuk. A DNS-t centrifugálással nyeljük ki, majd a felülúszót egy új csőbe tesszük át, 0,3 mól nátrium-acetát koncentrációt állítunk be, és az előzőekben leírt módon szárazjégen kicsapjuk. A DNS-t centrifugálással nyeljük ki, majd az üledéket 20 pl TE-ben (pH = 7,5) oldjuk, miután vákuumban szárítottuk. A pHPH443 inszertnek egy 0,5 pl-es aliquot részét 1 pg Xbal és Ncol restrikciós enzimekkel emésztett és defoszforilezett pTD136 plazmiddal (8. példa) ligáljuk 10 pl térfogatban. A ligáló reakcióelegyet 50 pl-re hígítjuk vízzel, majd a hígított ligáló reakcióelegyből 2 pl-es aliquot részt használunk 40 pl kompetens Escherichia coli HB101 sejtek transzformálására. A transzformálóelegy aliquot részeit 50 pg/ml ampicillint tartalmazó LB-agarlemezekre szélesztjük, majd egy éjszakán át 37 °C hőmérsékleten hagyjuk növekedni. Az egyes ampicillinrezisztens telepekből kis mennyiségű plazmidpreparátumot készítünk, majd a keletkező DNS-t Xbal és Ncol restrikciós enzimekkel emésztjük, amíg nem találunk egy telepet, amely a pHPH443-ból a 230 bp méretű Xbal/Ncol ffagmentet tartalmazza a pTD136 plazmidban. Ez a plazmid, amely a GUS/3-1 3’-vég konstrukciót működés szempontjából a pHPH443 promoterlfagmenthez kapcsolva tartalmazza a pTDS136 plazmidban, a pHPH443GUS jelzést kapja.

Hasonlóképpen a pHPH410, pHPH412, pHPH443 és pHPH478 Xbal/Ncol promoterfragmentjeit klónozzuk a pTDS136 Xbal/Ncol restrikciós hasítási helyére, így kapjuk a pHPH410GUS, pHPH412GUS, pHPH463GUS és pHPH478GUS plazmidokat.

A pHPH420GUS előállítása

A pHPH412 plazmidból 30 pg-ot teljesen megemésztünk Hpal és Ncol restrikciós enzimekkel. A keletkező DNS-fragmenteket elektroforézissel választjuk el egy éjszakán át 180 V feszültséggel futtatva, TBE-ben készült 2 mm vastag 25% glicerint tartalmazó, 7,5%-os poliakrilamidgél egyetlen 1 cm vastag csíkjában. A DNS-fragmenteket UV fényben tesszük láthatóvá, miután a gélt 0,5 pg/ml etidium-bromid vizes oldatával festettük 20 percig. A pHPH412 inszertnek megfelelő 200 bp méretű DNS-fragmentet kivágjuk a gélből, az előzőekben leírt módon kinyeijük és 20 pl TE-pufferben (pH=8,0) oldjuk. A pHPH412 inszert koncentrációját a 260 nm-en mért abszorpciója alapján határozzuk meg, majd a pHPH412 inszertből 40 ng-ot ligálunk 1 pg Hpal és Ncol restrikciós enzimekkel emésztett és defoszforilezett pHPH443GUS plazmiddal 10 pl térfogatban. A ligáló reakcióelegyet 50 pl-re hígítjukízzel, majd a hígított ligáló reakcióelegyből 2 pl-es aliquot részt használunk 40 pl kompetens Escherichia coli HB101 sejtek transzformálására. A transzformálóelegy aliquot részeit 50 pg/ml ampicillint tartalmazó LB-agarlemezekre szélesztjük, majd egy éjszakán át 37 °C hőmérsékleten hagyjuk növekedni. Az egyes ampicillinrezisztens telepekből kis mennyiségű plazmidpreparátumot készítünk, majd a keletkező DNS-t Xbal és Ncol restrikciós enzimekkel emésztjük, amíg nem találunk egy telepet, amely a pHPH412-ből a 200 bp méretű Hpal/Ncol promoterffagmentet tartalmazza a pHPH443GUS plazmidban. Ennek a plazmidkonstrukciónak a neve pHPH420GUS. A pHPHGUS plazmidban lévő inszert szekvenciáját a

24. ábrán mutatjuk be. Ez a DNS-ffagment egy kiméra promoter, amely a kukorica 2-2 promoterből származó 77 bp méretű kémiailag indukálható elemet tartalmazza (a 24. ábra 9-86-os nukleotidjai), működés szempontjából hozzákapcsolva a kukorica-alkohol-dehidrogenáz 1—IS alléi Dennis et al., Nucleic Acids Research, 12, 3983-4000 (1984)] (a 24. ábra 87-281-es nukleotidjai), és úgy van módosítva, hogy a transzlációs startkodonnál egy Ncol restrikciós hasítási helyet tartalmaz. Az ábrán a nyíl és az aláhúzás a promoter transzkripciós és transzlációs starthelyét jelöli.

13. példa

A 2-2 indukálható elem különböző módosításait tartalmazó rekombináns promoterek készítése A p 1-p 70 plazmid előállítása Külön oligonukleotidokat készítünk, amelyek a szekvenciájukban egy vagy több helyen különböző báziseltéréseket tartalmaznak. Az előállításhoz egy Applied Biosystems Model 380A DNS-szintetizátort alkalmazunk, a szintézis specifikus ciklusaiban nukleozid-foszfor46

HU 218 717 Β amiditek specifikus keverékét alkalmazva. Hasonlóképpen komplementer nukleotidok populációját állítjuk elő oly módon, hogy nukleotid-foszforamiditek keverékét építjük be a megfelelő szintézisciklusokban, hogy az első szálban lévő lehetséges bázisheterogenitásokat komplementáljuk. A komplementer oligonukleotidpárokat:

103 5’-CACCTCTTACGTGCATGGTTANATGNNACATNTGCAGTGANGTT-3’

104 5 ’-AACNTCACTGCANATGTNNCATNTAACCATGCACGTAAGAGGTGA

CGT-3’

105 5 ’-CACCTCTTACGTGCATGGTTATATGCGACATGTGNAGTPACGTT

106 5 ’-AACGTRACTNCACATGTCGCATATAACCATGCACGTAAGAGGTG

ACGT-3’

107 5’-CACCTCTTACGTGCATGGTTATATGCGACARGTGCPPRGACGTT

108 5 ’-AACGTCPRRGCACPTGTCGCATATAACCATGCACGTAAGAGGTG

ACGT-3’

109 5’-CACCTCTTAC GTGCATGGTTATATGCGPRPTGTGCAG TGACOTT

110 5’-AACGTCACTGCACARPRCGCATATAACCATGCACGTAAGAGCTG

ACGT-3’

1115 ’-C ACCTCTTACGTGC ATGGTTATATGCGAC ATGRPC AGTGPCOTT 112 5 ’-AACGRCACTGRPCATGTCGCATATAACCATGCACGTAAGAGGTG

ACGT-3’

115 5’-CACCTCTTACGTGCATGGTTPTPRPCGACATGTGCAGTGACGTT

116 5’-AACGTCACTGCACATGTCGRPRARAACCATGCACGTAAGAGGTG

ACGT-3’

117 5 ’-CACCTCTTACGTGRARGPTRATATGCGACATGTGCAGTGACGTT

118 5 ’-AACGTC ACTGC AC ATGTCGC ATATP ARCPTPCACGTAAG AGGTG

ACGT-3’ ahol

N=A, C, G, T

P=A, G

R=C, T 30 a 12. példában leírt módon foszforilezzük, majd mindegyik párt ekvimoláris arányban ligáljuk a pHPH443GUS plazmiddal, amelyet előzőleg Hpal és AatlI restrikciós enzimekkel teljesen megemésztettünk és defoszforileztünk. A ligáló reakcióelegyet 35 50 μΐ-re hígítjuk vízzel, majd a hígított ligáló reakcióelegyből 2 μΐ-es aliquot részt használunk 40 μΐ kompetens Escherichia coli HB101 sejtek transzformálására. A transzformálóelegy aliquot részeit 50 pg/ml ampicillint tartalmazó LB-agarlemezekre szélesztjük, 40 majd egy éjszakán át 37 °C hőmérsékleten hagyjuk növekedni. Az egyes ampicillinrezisztens telepekből kis mennyiségű plazmidpreparátumot készítünk, majd a keletkező DNS-t megszekvenáljuk, vagy a 35-ös oligonukleotidokat (12. példa), vagy a HH114 oligonukleotidokat használjuk primerként (a HH114 szekvenciája : 5 ’-GGAGGAAGAGATGGGAAACGACGGG-3’). Azokat a plazmidokat szelektáljuk, amelyekben ezeket a báziscseréket bevittük a pHPH443GUSba, amely megfelel a 2-2 promoter 77 bp méretű indukálható elemének. A 3. táblázat listázza azokat a plazmidokat, amelyek az érdekes régióban egyetlen bázisváltozást tartalmaznak. A komplementer oligonukleotidpárokat:

1215 ’-CTAGTGAATTCGTACCATATAGRAAGPCRRTGTATATAAGACGT-3 ’ 122 5 ’-CTTATATACAPPGRCTTPCTATATGGTACG AATTC A-3 ’

123 5’-CTAGTGAATTCGTACCATATAGTAAGACTTRPRATPTAAGACGT-3’

124 5 ’-CTTARATPRPAAGTCTTACTATATGGTACGAATTCA-3 ’

125 5 '-CTAGTGAATTCGTACCATATAGTAAGACTTTGTPRATPPGACGT-3 ’

126 5’-CRRATRPACAAAGTCTTACTATATGGTACGAATTCA-3’

127 5 ’-CTAGTGAATTCGTACC ATARAPTP APACTTTGTATATAAG ACGT-3 ’

128 5 '-CTTATATACAAAGTRIRARTPIATGGTACGAATTCA-3 ’ ahol

N=A, C, G, T P=A, G R=C, T a 12. példában leírt módon foszforilezzük, majd mindegyik párt ekvimoláris arányban ligáljuk a pHPH443GUS plazmiddal, amelyet előzőleg Xbal és

AatlI restrikciós enzimekkel teljesen megemésztettünk 55 és defoszforileztünk. A ligáló reakcióelegyet 50 μΐ-re hígítjuk vízzel, majd a hígított ligáló reakcióelegyből μΐ-es aliquot részt használunk 40 pl kompetens Escherichia coli HB101 sejtek transzformálására, és azokat a plazmidokat szelektáljuk az előzőekben leírt módon, amelyekben a pHPH443GUS-ban a 2-2 promoterből

HU 218 717 Β származó 77 bp méretű indukálható elemnek megfelelő régióba vittük be a bázisváltoztatásokat. A 3. táblázatban láthatjuk azokat a plazmidokat, amelyekről kiderült, hogy a 77 bp méretű indukálható elemben bázisváltozások vannak, valamint a változások helyét.

3. táblázat

Plazmid p #	Nukleotidváltozás	Pozíció
miről	mire
0	nincs változás
1	G	c	70
2	T	c	64
	G	c	70
	T	A	71
3	A	G	69
4	A	G	69
	G	A	70
	T	C	71
5	T	C	64
	A	G	69
	T	C	71
6	T	C	64
7	T	A	55
	c	T	59
	G	A	60
	G	A	65
	C	A	74
8	T	T	55
	G	T	60
	C	A	74
9	C	T	74
10	T	G	55
	C	A	59
	C	G	74
11	C	G	59
	G	T	60
	G	T	74
12	C	G	59
G	A	65
13	T	A	55
	C	G	59
	G	A	65
	C	T	74
14	T	C	55
	c	T	59
	G	T	65
15	C	A	68
	G	A	72
16	C	T	68
	G	A	72
17	C	G	68
	G	A	72
18	C	G	68
19	C	T	68

Plazmid p #	Nukleotidváltozás	Pozíció
miről	mire
20	A	G	61
	C	T	62
	A	G	63
21	A	G	61
22	C	T	62
23	A	G	61
	A	G	63
24	A	G	63
25	C	G	62
	A	T	63
26	G	A	67
27	T	C	66
	G	A	67
28	T	C	66
	G	A	67
	A	G	73
29	A	G	73
31	T	C	66
	A	G	73
32	A	G	67
	A	G	73
33	T	C	66
34	A	G	54
	T	C	57
35	A	G	16
	T	C	18
36	A	G	16
37	T	G	19
38	T	C	18
39	T	C	18
	T	T	19
40	T	c	12
41	G	A	21
	T	C	22
	A	G	25
42	G	A	21
43	T	C	20
	G	A	21
44	T	C	20
45	T	C	12
	A	G	16
	T	C	18
46	T	C	22
47	A	G	25
48	G	T	21
	T	c	22
49	T	c	20
	T	c	22
	A	G	25

HU 218 717 Β

3. táblázat (folytatás)

Plazmid p #	Nukleotidváltozás	Pozíció
miről	mire
50	T	c	20
	G	A	21
	T	C	22
51	A	T	56
	T	c	57
52	G	A	58
53	A	G	56
54	A	G	54
55	A	G	54
	A	G	56
56	T	C	12
57	G	C	25
58	T	C	24
59	A	G	23
	T	C	24
60	A	G	23
	A	G	28
61	A	G	23
62	A	G	27
	A	G	28
63	T	C	9
64	G	A	11
65	G	A	11
	G	A	15
66	T	C	9
	G	A	11
67	A	G	13
68	G	A	11
	A	G	13
69	G	A	15
70	C	T	47

14. példa

Az N-(amino-karbonil)-2-klór-benzotszulfonamid alkalmazása rekombináns GUS/2-1 kukorica génkonstrukciók expressziójának indukálására transzformált rizs protoplasztokban

Rizsprotoplasztok transzformálása

Rizs szuszpenziós tenyészeteket, amelyeket hím portok eredetű kalluszról indítottunk, heti átoltással tartjuk fenn, 1; 1 arányban friss folyékony N6 táptalajra átoltva, Chu et al. leírása szerint [Sci Sinica 18, 659-668 (1975)], amely táptalaj 2 mg/ml 2,4-diklór-fenoxiecetsavat és 3 tömeg% szacharózt (pH=6,0) tartalmaz. A protoplasztokat a rizssejtek szuszpenziójából izoláljuk 4-6 nappal az átoltás után oly módon, hogy éjszakán át (16-18 óra) inkubáljuk 4 ml enzimoldatban (2 tömeg% cellulóz „Onozuka” RS és 0,5 tömeg% Macerozym (mindegyik a Yakult Honsha, Nishinomiya, Japán) 13 tömeg% mannitol pH=5,6) 1 g sejtre számítva, majd az elegyet rotációs rázógépen rázatjuk 30/perc fordulatszámmal 25 °C hőmérsékleten. A felszabadult protoplasztokat 60 mesh méretű nejlonszűrőn szűrjük át 50 ml-es Pyrex csövekbe visszük át, majd kétszer mossuk centrifügálással 80 g-vel 10 percig Kren-féle F táptalajban (összetétele: 140 mmol NaCl, 3,6 mmol KC1, 0,75 mmol Na₂HPO₄x7H₂O, 5 mmol glükóz, 125 mmol CaCl₂, pH=7,0). A protoplasztokat úgy tisztítjuk, hogy az üledéket N6 táptalajban szuszpendáljuk 17 v% szacharózzal, 80 g-vel centrifugáljuk 20 percig, majd a lebegő réteget összegyűjtjük. A sejtszámot Fuchs-Rosenthal-hemocitométerrel határozzuk meg.

A protoplasztokat a következőképpen transzformáljuk: a protoplasztok több aliquot részét (5-10· 10⁶ sejt) óvatosan lecentrifugáljuk (80 g) 4 percig, steril csövekben. A felülúszót elöntjük, majd a sejteket 1 ml Krenféle F táptalajban szuszpendáljuk (pH=5,8). A transzformáló DNS-ből 10 pg-ot 15 μΐ-nél kevesebb TE-ben (pH=8,0) adjuk hozzá egymillió protoplaszthoz. A csöveket óvatosan megrázzuk, hogy a sejteket eloszlassuk a DNS-oldatban, majd 0,6 ml 40%-os PEG-et (Polysciences Inc., Warrington PA 18976, CAT#1102) és 3 mmol CaCl₂-ot tartalmazó oldatot adunk hozzá. A kapott protoplaszt sejtszuszpenziót óvatosan megkeverjük, majd szobahőmérsékleten inkubáljuk 20 percig. Ezután 13-15 ml Kren-féle F oldatot (pH=7,0) adunk hozzá, hogy a PEG-et kihígítsuk.

A transzformált rizs indukálása N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamiddal A transzformált protoplasztokat centrifügálással gyűjtjük össze (80 g, 4 perc). A felülúszót elöntjük, majd a protoplasztokat 2,0 ml Kren-féle F táptalajban szuszpendáljuk (pH=5,8). A protoplasztmintát 1 ml-es aliquot részekre osztjuk. A protoplaszt táptalaj 1 ml-ét hozzáadjuk a protoplasztok egyik aliquot részéhez, miközben 1 ml, 100 pg/ml N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamidot tartalmazó protoplaszt táptalajt adunk a másik aliquot részhez. A protoplasztokat ezután 16 óra hosszat sötétben inkubáljuk 25 °C hőmérsékleten.

A rekombináns GUS-gének indukálhatóságát, amelyeknek az expresszióját a 2-1 kukoricagén promotere, valamint a downstream szekvenciák szabályozzák, úgy határozzuk meg, hogy mérjük a β-glükoronidáz aktivitásszintjét N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamid nélkül, illetve annak jelenlétében tenyésztett protoplasztokban. A GUS-aktivitást úgy határozzuk meg, hogy a protoplasztokat klinikai centrifugában nyerjük ki 80 g-vel centrifugálva 5 percig, majd 1,0 ml lxGUS-lízis pufferben (összetétele 50 mmol nátriumfoszfát, pH = 7,0, 10 mmol β-merkapto-etanol, 10 mmol EDTA, 0,1% Triton X-100, 0,1% N-laurilszarkozin) szuszpendáljuk. A lizált protoplasztokat tartalmazó szuszpenziót vortexeljük, majd asztali klinikai centrifugával maximális sebességgel lecentrifugáljuk 5 percig. A felülúszóból 18 pl- viszünk át egy csőbe, amely 782 pl vizet tartalmaz, hogy meghatározzuk a protoplasztlizátum fehérjetartalmát. A hígított lizátumban lévő fehérjetartalmat a Bio-Rad Protein Assay kittel határozzuk meg (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA 94804), a gyártó előírását követve a mikrovizsgálat

HU 218 717 Β során. Egy fehérjekoncentráció-görbét készítünk, szarvasmarhaszérum-albumint használva standardként. Az így meghatározott fehérjetartalmat 7,2-vel szorozzuk, hogy megkapjuk a fehérjetartalmat az extraktum 130 μΐ-ében (ez az a mennyiség, amely az alábbi vizsgálat egy időpontjában található). A megmaradó felülúszóból 585 μΐ-t viszünk át egy friss csőbe.

A GUS-vizsgálatban alkalmazott szubsztrátum 4metil-umbelliferil-A-D-glükoronid (4-MUG), és a Sigma Chemical Co.-tól szerezhető be (St. Louis, MO 63178, CAT# 9130). A 4-MUG-ot 10 mmólos törzsoldat formájában készítjük el 1 xGUS-pufferben. Az előmelegített (37 °C) 10 mmólos 4-MUG törzsoldatból 65 μΐ-t hozzáadunk 585 μΐ előmelegített protoplasztkivonathoz, majd a kapott elegyből egy 100 ml-es aliquot részt egy 24 lukas mikrotiterlemez egyik lukába visszük át, amely 0,9 ml 0,2 mól Na₂CO₃-at tartalmaz. Hasonló mennyiségű aliquot részt veszünk ki 1 óra, 2 óra és 3 óra elteltével. Az egyes minták 4-MU fluoreszcenciáját minden egyes időpontban mennyiségileg meghatározzuk, 365 nm-es gerjesztő és 455 nm-es emissziós hullámhosszat alkalmazva. A 4-MU fluoreszcenciáról standard görbét készítünk, 100 nmólos és 1 pmólos 4-MU (Sigma Chemical Co., Cat# 1508) fluoreszcenciáját megmérve. A tranziens vizsgálatban mért GUS-aktivitást az 1 óra alatt 1 pg fehéije által termelt pikomól 4-MU-ban fejezzük ki.

Az előzőekben leírt módon végzett tranziens vizsgálatok eredményeit foglaljuk össze a 4. táblázatban, a pJE516, pDuPE2, a pDUPI8, pDuPI9, pDuPIó és pDuPI13 plazmidkonstrukciókra. A pBM117 plazmidot is mérjük minden egyes vizsgálatban, a konstitutív GUS-expressziót mint kontrollt alkalmazva. A plazmid tartalmazza a GUS kódoló régiót a CaMV ³⁵S promoter és 3’-downstream régiók szabályozása alatt. A 2-1 promoter és downstream régiók által vezérelt transzkripcióból származó GUS-aktivitás (pJE516) következetesen magasabb, ha a protoplasztoló táptalajhoz 100 pg/ml N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamidot adunk.

4. táblázat

Minta	Promotcr- méret (bp-ban)	GUS-aktivitás (Fu/pg-min.)	Az indukció mértéke
Induká- latlan*	Indukált*
Nincs DNS	N/A	ND	45,5	0x
pBM117	N/A	241,1	604,3
pJE516	=3000	569,4	4314,0	7,6 x
PDuPE2	=900	227,3	1793,0	7,9 x
pDuPI8	421	121,1	714,1	5,9 χ
pDuPI9	226	106,6	96,9	0x

* A táblázatban szereplő indukciót úgy hajtjuk végre, hogy a protoplasztoló táptalajhoz 100 pg/ml N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamidot adunk.

75. példa

Az N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamid alkalmazása rekombináns 2-2 kukoricapromoter/GUS-gén konstrukciók expressziójának indukálására traszformált rizsprotoplasztokban A rizs szuszpenziós tenyészeteket, amelyeket hím portok eredetű kalluszról indítottunk, használunk protoplasztforrásként a tranzienstranszformálásnál és az expresszióanalízisnél. Az izolálást eljárást, a protoplasztok transzformálását és a kémiai kezelést, valamint a GUS-vizsgálatot a 14. példában ismertettük. A protoplasztokat pBMl 17 plazmiddal és a 2-2 promoter/GUS fúziókkal transzformáljuk.

A pTDS130, pTDS133, pDS134, pDuPM17, pDuPN27, pDuPN4 és pDuPN7 rekombináns DNSkonstrukciók (mindegyik leírása szerepel a 7. példában) indukálását N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamiddal a transzformált protoplasztokban a 14. példában ismertetett tranziens expressziós módszerrel elemezzük. A GUS-expressziónak az ezekkel a konstrukciókkal transzformált protoplasztokban való indukálhatóságát N(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamiddal az 5. táblázatban mutatjuk be. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a vegyszer erősen indukálja minden olyan konstrukció expresszióját, amelyekben a 2-2 promoterfragment hosszabb 208 bp-nál. A GUS-aktivitás kémiai indukálhatóságának gyors elvesztése akkor áll elő, amikor a promoterben az 5’ transzlációs starthelytől mérve a 2-2 promoterfragment mérete 208 bp-nál kisebb. Ez azt mutatja, hogy a 2-2 promoterben van egy DNS-elem, amely legalábbis részben a GUS-gén 5’ transzlációs starthelytől -210 és -130 bp távolságra van, és ez szükséges a 2-2 promoteraktivitás N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamiddal való indukálhatóságához.

5. táblázat

Minta	Promoter- méret (bp-ban)	GUS-aktivitás (Fu^g-min.)	Az indukció mértéke
Induká- latlan*	Indukált*
Nincs DNS	N/A	ND	0,45	0,0 x
pBM117	N/A	1,68	7,47	4,5 χ
pTDS130	=1900	1,38	88,72	64,1 χ
pTDS133	465	1,52	102,72	67,7 χ
pTDS134	450	1,65	78,27	47,4 x
pDuPM17	248	1,25	75,92	60,5 x
pDuPN27	208	1,43	118,69	82,8 χ
pDuPN4	150	0,83	24,3	29,0 χ
pDuPN7	130	0,54	1,52	2,8 x

* Az 5. táblázatban az indukciót 100 pg/ml N-(amino-karbonil)-2klór-bcnzolszulfonamidnak a transzformált protoplasztokhoz adásával váltjuk ki.

HU 218 717 Β

16. példa

N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamid alkalmazása rekombináns 5-2 kukoricapromoter/GUSgén konstrukciók expressziójának indukálására transzformált rizsprotoplasztokban

Hím portok eredetű kalluszról indított rizsszuszpenziós tenyészeteket használunk protoplasztok forrásaként a tranziens transzformáláshoz és expressziós vizsgálatokhoz. A protoplasztok izolálásának és transzformálásának módszerét, valamint a GUS-vizsgálatokat a 14. példában írtuk le. A protoplasztokat pBM117-tel, valamint az előzőekben leírt 5-2 promoter/GUS fúziókkal transzformáljuk.

A pMC715. 53 válaszát rizsprotoplasztokban tranziens expressziós vizsgálatokkal elemezzük. GUS-expresszió figyelhető meg az N-(amino-karbonil)-2-klórbenzolszulfonamiddal kezelt transzformált protoplasztokban. Mivel az 5-2 gén in vivő indukciója a leggyengébb az összes vizsgált kukoricagén közül, azért lehetséges, hogy indukálhatósága nem mérhető tranziens vizsgálatokban.

17. példa

N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamid alkalmazása kiméra 218 kukoricapromoter/GUS-gén konstrukciójának indukálására transzformált rizsprotoplasztokban

Hím portok eredetű kalluszról indított rizsszuszpenziós tenyészeteket használunk protoplasztok forrásaként a tranziens transzformáláshoz és expressziós vizsgálatokhoz. A protoplasztok izolálásának és transzformálásának módszerét, valamint a GUS-vizsgálatokat a 14. példában írtuk le.

A GUS-aktivitás indukálását pTDS130-cal kezelt rizsprotoplasztokban (8. példa), valamint az N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamiddal kezelt pMC7113-ban tranziens expresszióban vizsgáljuk. Az eredmények a 6. táblázatban találhatók.

6. táblázat

Konstrukció	GUS-aktivitás (Fu/pg-min.)	Az indukció mértéke
Indukálatlan*	Indukált*
Nincs DNS	3	3	0
pHPH130	17,3	546	31,5
pMC7113	78,4	952	12,1

* A GUS-aktivitást fluoreszcencia egység/óra/10⁶ protoplasztban fejezzük ki.

A 6. táblázat eredményei azt mutatják, hogy a GUS génnek a 218-as promoter szabályozása alatti transzkripciójából származó aktivitás következetesen erősen indukálódik 100 pg/ml N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamidnak a protoplaszt táptalajhoz való hozzáadásával.

18. példa

N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamid alkalmazása rekombináns P6 petúniapromoter/GUS-gén konstrukciójának indukálására transzformált rizsprotoplasztokban

Hím portok eredetű kalluszról indított rizsszuszpenziós tenyészeteket használunk protoplasztok forrásaként a tranziens transzformáláshoz és expressziós vizsgálatokhoz. A protoplasztok izolálásának és transzformálásának módszerét, valamint a GUS-vizsgálatokat a 14. példában írtuk le.

A protoplasztokat pBMl 17-tel, valamint az előzőekben leírt különböző P6.1 promoter/GUS fúziókkal transzformáljuk.

A P655, P657, P658 és P660 válaszait rizsprotoplasztokban tranziens expressziós vizsgálattal elemezzük. A GUS-expresszió indukálásának mértékét transzformáit protoplasztokban az N-(amino-karbonil)-2klór-benzolszulfonamid kezelésre adott válaszként a 7. táblázatban mutatjuk be. A P6 promoter és különböző 3’-downstream régiók szabályozásával végzett transzkripció eredményeképpen kapott GUS-aktivitás következetesen indukálódott 100 pg/ml N-(amino-karbonil)2-klór-benzolszulfonamidnak a protoplasztoló táptalajba való adagolásával.

Továbbá az ehhez az indukcióhoz szükséges összes DNS-szekvencia valószínűleg a P6.1 promoterben található, mivel a 3’-véget egy nem indukálható génnek (ÖCS gén) a 3’-végével helyettesítve nem kaptunk változást a P6.1 promoter/GUS konstrukció indukálhatóságában.

7. táblázat

Minta	P6 promoter- méret (bp-ban)	GUS-aktivitás (Fu/pg-min.)	Az indukció mértéke
Induká- latlan*	Indukált*
Nincs DNS	N/A	ND	27,0	0,0 x
pBM117	N/A	174,8	325,7	l,9x
P655	1300	61,8	317,6	5,1 x
P657	1300	66,6	488,1	7,3 χ
P658	300	64,5	404,3	6,3 χ
P660	600	112,8	510,9	4,5 χ

* Az 5. táblázatban az indukciót 100 pg/ml N-(amino-karbonil)-2klór-bcnzolszulfonamidnak a transzformált protoplasztokhoz adásával váltjuk ki.

ND=nincs meghatározva.

19. példa

N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamid alkalmazása kukorica 2-2 promoter indukálható elemét tartalmazó kiméra promoterek transzkripciós szabályozása alatt álló rekombináns gének indukálására transzformált rizsprotoplasztokban

HU 218 717 Β

Hím portok eredetű kalluszról indított rizsszuszpenziós tenyészeteket használunk protoplasztok forrásaként a tranziens transzformáláshoz és expressziós vizsgálatokhoz. A protoplasztok izolálásának és transzformálásának módszerét, valamint a GUS-vizsgálatokat a 14. példában írtuk le.

A GUS-expresszió indukálásának mértékét pTDS130-cal, pHPH410GUS, pHPH412GUS, pHPH443GUS, pHPH463GUS és pHPH478GUS plazmidokkal transzformált protoplasztokban az N-(aminokarbonil)-2-klór-benzolszulfonamid kezelésre adott válaszként a 8. táblázatban mutatjuk be.

8. táblázat

Konstrukció	GUS-aktivitás	Az indukció mértéke
Induká- latlan*	Indukált*
Nincs DNS	10	8	0
pTDS130	124,4	849,2	6,8
pHPH410GUS	17	14	0,8
pHPH412GUS	21,5	26,6	1,2
pHPH420GUS	317,5	1674,5	5,3
pHPH443GUS	55,0	590,6	10,7
pHPH463GUS	90,7	781,3	8,6
pHPH478GUS	13	160,7	12,4

* A GUS-aktivitást fluoreszcencia cgyscg/óra/10⁶ protoplasztban fejezzük ki.

Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a kukorica 2-2 promoteréből származó 77 bp elem hozzáadása a nem indukálható GUS-génekhez azt okozza, hogy indukálhatóságot mutatnak 100 pg/ml N-(amino-karbonil)2-klór-benzolszulfonamiddal kezelt rizsprotoplasztokban.

20. példa

N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamid alkalmazása 77 bp méretű 2-2 indukálható elem különböző módosításait tartalmazó kiméra promoterek transzkripciós szabályozása alatt álló rekombináns gének indukálására transzformált rizsprotoplasztokban

Hím portok eredetű kalluszról indított rizsszuszpenziós tenyészeteket használunk protoplasztok forrásaként a tranziens transzformáláshoz és expressziós vizsgálatokhoz. A protoplasztok izolálásának és transzformálásának módszerét, valamint a GUS-vizsgálatokat a 14. példában írtuk le.

A p O-p 70 plazmidokkal transzformált rizsprotoplasztok N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamiddal való kezelésre adott GUS-aktivitás-indukciót tranziens expresszióval vizsgáljuk. A GUS-expresszió indukálásának mértékét N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamiddal való kezelés hatására a 9. táblázatban mutatjuk be.

9. táblázat

p Promoter	GUS-aktivitás	Az indukció mértéke
Indukálatlan*	Indukált*
Nincs DNS	10	8	0
pHPH443	89	954	10,7
pO	115	1100	9,5
1	86	1001	11,6
2	25,5	72	2,8
3	29,5	495	16,8
4	22	70,5	3,2
5	39	111,5	2,9
6	20	106	5,3
7	20	37,5	1,9
8	15	31,5	2,1
9	75	1465	19,5
10	20	95	4,75
11	26	133,5	5,1
12	127	1467	11,6
13	33	301,5	9,1
14	317	2280	7,2
15	18	32	1,8
16	10	24,5	2,4
17	8,5	23,5	2,8
18	19	161	8
19	32	223	7
20	64	543,5	8,5
21	54	802	14,9
22	21,5	137,5	6,4
23	107	1417	13,2
24	747	2925	3,9
25	47	725	15,4
26	16,5	61	3,7
27	11,5	61	5,3
28	13,5	14	1
29	44	491	11,2
30	19,5	103,5	5,3
31	41,5	182	4,4
32	27,5	125	4,5
33	98,5	1249,5	12,7
34	214,5	2256	10,5
35	69,5	774	11,1
36	94,5	1019,5	10,8
37	120,5	1073	8,9
38	117,5	1790	15,2
39	96,5	925	9,6
40	112,5	1501,5	13,3
41	97	1085	11,2
42	43,5	602,5	13,9

HU 218 717 Β

9. táblázat (folytatás)

p Promoter	GUS-akti vitás	Az indukció mértéke
Indukálatlan*	Indukált*
43	27,5	298	10,8
44	41,5	298	7,2
45	80	994,5	12,4
46	42,5	484,5	11,4
47	36	328,5	9,1
48	40,5	379,5	9,4
49	26	166	6,4
50	44,5	349,5	7,9
51	57,5	483,5	8,4
52	46	328	7,1
53	49	469,5	9,6
54	52	518	10
55	58,5	471,5	8,1
56	31	239,5	7,7
57	29	245	8,4
58	32	288,5	9,0
59	38,5	209,5	5,4
60	31,5	199	6,3
62	23	178	7,7
63	29	268	9,2
64	35	196,5	5,6
65	20,5	219,5	10,7
66	26	291,5	11,2
67	156,5	1256,5	8,0
68	132,5	1045	7,9
69	138,5	1101,5	7,9
70	397,5	1726	4,3

* A GUS-aktivitást fluoreszcencia egység/óra/10⁶ protoplasztban fejezzük ki.

Az eredmények azt mutatják, hogy a p 28 konstrukció kivételével a 2-2 promoterből származó 77 bp méretű elemnek mind a 70 módosítása képes a heterológ promoterek kémiai indukálhatóságát biztosítani. Az nem ismert, hogy a p 28 konstrukció miért nem volt képes N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamiddal való kezelésre reagálni.

21. példa

Az N-(amino-karbonil)-2-klör-benzolszulfonamid alkalmazása a petúnia P6.1 gén expressziójának indukálására transzgenikus dohányban

Az 5. példa 5’- és 3’-végtérképezési adatai azt mutatják, hogy a P614 konstrukció tartalmaz a petúnia P6 génből egy 1.3 kb méretű fragmentet és egy 2.2 kb méretű downstream fragmentet. A P614 konstrukciót dohányba transzformáljuk, hogy meghatározzuk egyrészt azt, hogy ez a petúnia-DNS-fragment tartalmazza-e a kémiai indukcióhoz szükséges összes elemet, másrészt azt, hogy ez a petúnia expresszálódik-e és kémiailag indukálható-e heterológ növényfajokban. A P614 plazmidot BamHI restrikciós enzimmel linearizáljuk, majd a pAGS135 bináris vektor BamHI helyére klónozzuk. Az ebben a példában alkalmazott pAGS135 bináris vektor csak egyike azon nagyszámú bináris vektornak, amelyek a jelen célokra alkalmazhatók. A pAGS135 egy kozmid bináris vektor, amelynek a replikációs origója a széles gazdaspecifitású pRK2 plazmidból származik, és a pTiAó, illetve pTiAch5 oktopin Ti plazmidok bal, illetve jobb oldali fragmentjét tartalmazza [van den Elzen et al., Plánt. Mól. Bioi., 5, 149-154 (1985)]. A határfragmentek határolják azt a DNS-szakaszt, amely beépül a gazdanövény genomjába az Agrobacterium által közvetített transzformációs folyamat során. Egy kiméra marker gént (amely egy neomicin-foszfortranszferáz (NPTII) kódoló régióját a nopalin szintetáz promoterhez és az oktopin szintetáz 3’-végéhez kapcsolva tartalmazza), amely növényi sejtekben kanamicinrezisztenciát kódol, a bal és jobb oldali fragmentek közé építjük. Az egyetlen BamHI restrikciós hasítási hely az NPTII gén után, az szolgál kényelmes klónozóhelyként. A pAGS135 plazmid annyiban különbözik a pAGS112 plazmidtól [van den Elzen et al., Plánt. Mól. Bioi., 5, 149-154 (1985)]. A határfragmentek határolják azt a DNS-szakaszt, amely beépül a gazdanövény genomjába az Agrobacterium által közvetített transzformációs folyamat során. Egy kiméra marker gént (amely egy neomicin-foszfotranszferáz (NPTII) kódoló régióját a nopalin szintetáz promoterhez és az oktopin szintetáz 3’-végéhez kapcsolva tartalmazza), amely növényi sejtekben kanamicinrezisztenciát kódol, a bal és jobb oldali fragmentek közé építjük. Az egyetlen BamHI restrikciós hasítási hely az NPTII gén után, az szolgál kényelmes klónozóhelyként. A pAGS135 plazmid annyiban különbözik a pAGS112 plazmidtól [van den Elzen et al., Plánt. Mól. Bioi., 5, 149-154 (1985)], hogy a pAGS112-ben a jobb oldali határolószakasz utáni Xhol restrikciós hasítási helyet eltávolítjuk oly módon, hogy a pAGS112-t Xhol restrikciós enzimmel emésztjük, majd az Xhol 5’-túlnyúló végeket tompa véggé alakítjuk, és a plazmidot önmagával ligáivá cirkularizáljuk. A ligálóelegy egy aliquot részét használjuk Escherichia coli HB101 sejtek transzformálására, majd a transzformánsokat 75 pg/ml ampicillint és 1 pg/ml tetraciklint tartalmazó LB-agarlemezen növesztjük. Kis mennyiségű plazmidpreparátumot készítünk az antibiotikumrezisztens telepekből, majd teljesen megemésztjük BamHI restrikciós enzimmel, hogy a keresett konstrukciót hordozó telepeket azonosítsuk. A P614 vektor orientációja olyan a bináris vektorban (HindlII emésztések alapján meghatározva), hogy a transzkripció a jobb oldali T-DNS határolószakasz felé halad, és pUC118 szekvenciák találhatók a petúniagén és a jobb oldali T-DNS határolószakasz között. A plazmid-DNS-konstrukciót P627-nek nevezzük (25. ábra).

A dohány transzformálása a petúnia P6.1 génnel A P627 plazmidot háromszülős keresztezéssel juttatjuk be Agrobacterium tumefaciens (AL4404/pAL4404) törzsbe. Az Agrobacteriumokat A minimáltáptalajon

HU 218 717 Β stacioner fázisig növesztjük A minimáltáptalajban, míg a P627-et és pRK2013-at (a plazmid mobilizálásához szükséges) néhány óra hosszat logaritmikus fázisig növesztjük LB-táptalajban. A három törzsből azonos mennyiséget (0,5 ml) töményítünk be, majd LB-lemezre szélesztjük, és egy éjszakán át hagyjuk növekedni 28 °C hőmérsékleten. A sejtekből egy kacsnyit leveszünk a lemezről, majd 3 ml 10 mmólos MgSO₄-ben szuszpendáljuk. Ezekből a sejtekből tízes sorozathígítást készítünk (10 mmol MgSO₄-ben), és 100 pg/ml rifampicint, valamint 1 pg/ml tetraciklint tartalmazó LB-táptalajra szélesztjük, és 3 napig 28 °C hőmérsékleten növesztjük. Az antibiotikumrezisztens telepeket 1 pg/ml tetraciklint tartalmazó A minimáltáptalajra szélesztjük, majd 3 napig 28 °C hőmérsékleten inkubáljuk.

Dohányt (SRI) használunk a transzformálás gazdaszervezeteként. In vitro nőtt növényi anyagot egy szikével csíkokra szabdalunk. A csíkokat P627 konstrukciót tartalmazó Agrobacterium tumefaciens szuszpenzióba merítjük (a baktérium koncentrációja 0,2 A_55O). A levéldarabokat MS minor sókat, MS major sókat, B5 vitamint, MS vasat, 3% szacharózt, 0,1 pg/l NAA-t, 1,0% BA-t, 0,7% TC agart (pH=5,8) tartalmazó táptalajra visszük, majd 2-3 napig fényben inkubáljuk. A levélanyagot eltávolítjuk, majd 500 pg/ml kefotaximot tartalmazó folyadéktáptalajba helyezve mossuk, 3-4 órán enyhén rázatva. A levéldarabokat ezután 100 pg/ml karbenicillint és 300 pg/ml kanamicint tartalmazó táptalajra visszük, és ezt a műveletet kéthetenként megismételjük. 2-8 hét elteltével hajtások jelennek meg, majd a leveleket gyökereztető táptalajba visszük át (összetétele: 0,5 xMS major sók, MS minor sók, vas, 1% szacharóz, 0,8% agar és 2 pmol indol-vajsav). Nyolc független transzformált növényt regenerálunk. A növényeket üvegházba visszük át, majd hidroponikus körülmények között növesztjük a 4. példában leirt berendezésben, amikor 7,5-10 cm magasak lesznek. Két növényt regeneráltunk a sejttenyészetből, de transzformálatlan növényeket is átvittünk és kontrollként használtunk.

A P6.1 gén expressziója transzgenikus dohányban

A transzformált és kontrollnövények hidroponikus körülmények közé való áttevése után három héttel az egyes növényekről a habdugón át kilógó gyökerek felét leszedjük, és folyékony nitrogénben tároljuk. A növényeket ezután hidroponikusan 200 mg/1 N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamiddal kezeljük a 4. példában leírtak szerint. 6 óra hosszat kezeljük kémiailag, majd a kilógó gyökerek felét is levesszük, és a fentiek szerint lefagyasztjuk. A növényeket a habdugójukkal együtt táptalajra visszük át lefedett edényekben üvegházban 3-3 napra, majd hagyjuk a még a habban levő gyökereket kinőni. A növényeket fényre tesszük, majd hagyjuk teljesen megnőni. Az előzőekben leírt módon RNS-t izolálunk belőle. Az RN-áz protekciós elemzést a 4. példában leírt módon végezzük, hogy meghatározzuk a transzformáló P6 petúniagén, valamint az endogén T2 gén indukálhatóságát a transzformált növényekben. Az ebben az elemzésben alkalmazott próbát úgy állítjuk elő, hogy a P611 plazmidot teljesen megemésztjük PvuII restrikciós enzimmel, majd egy RNS-próbát szintetizálunk, amely a P6.1 mRNS kódoló szálával komplementer a T3 RNS-polimeráz alkalmazásával. A P611 EcoRI fragmentjében a PvuII hasítási hely a 3’-végtől 150 bp távolságra van, ezért képes egy 150 bp méretű védett fragmentet generálni, ha a bevitt petúniagén expresszálódik dohányban. Mind a nyolc transzformánsban a bevitt gén indukálható expressziót mutatott a gyökerekben (26. ábra). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a 4.5 kb méretű petúnia genomiális ffagment tartalmazza az összes elemet, amely a gén N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamiddal való indukálásához kell, és ez az indukálhatóság átvihető más fajra is.

A P6.1 gén expressziója transzgenikus dohány kalluszban

A P6.1 gén indukálhatóságát transzformált dohánynövényekből származó kalluszszövetekben is vizsgáltuk. Úgy gondoltuk, hogy ha a kémiailag indukálható gének expressziója lenne a felelős a kémiai stimulálásért a kalluszban, akkor a teljes növénnyé regenerálandó kallusz vizsgálata és szelekciója felgyorsítható lenne. Ebből a célból a P6.1 dohánytranszformánsok közül az egyikből származó levélszövetet olyan táptalajra tesszük, amely a kallusz indukcióját elősegíti (MS-táptalaj, amely 0,1 pg/ml naffol-ecetsavat és 0,3 pg/ml kinetint tartalmaz). 5 hét elteltével 1-1,5 cm-es kalluszok növekednek. Ezeket a kalluszokat folyadéktáptalajra visszük át (MS táptalaj, amely 0,1 pg/ml naffolecetsavat és 0,1 pg/ml benzil-adenint tartalmaz), és egy éjszakán át 28 °C hőmérsékleten rázatjuk. A következő napon a kalluszdarabokat MS-táptalajra, illetve 100 pg/ml N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamidot tartalmazó MS-táptalajra visszük át, és egy éjszakán át 28 °C hőmérsékleten rázatjuk. A kalluszszövet mintáit 6 és 20 óra elteltével eltávolítjuk a lombikokból, majd cseppfolyós nitrogénben lefagyasztjuk. A 4. példában leírt eljárással RNS-t állítunk elő a kalluszszövetből. Mind a bevitt petúnia P6 gén és az endogén dohány T2.1 gén N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamid kezelés hatására való indukálhatóságát az előzőekben leírt RN-áz protekciós elemzéssel értékeljük ki. Mind az endogén dohánygén, mind a transzformáló petúniagén alig kimutatható a kezeletlen kalluszszövetben, míg mindkét gén erős expressziója figyelhető meg az N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfon-amiddal kezelt kalluszban. Mindkét gén esetében az expresszió megfigyelt szintje megközelíti azt, ami az érintetlen, kémiailag kezelt dohánynövények gyökerében megfigyelhető. Ebből azt a következtetést lehet levonni, hogy az idegen gének indukálhatóságát, amelyek expresszióját a helyettesített benzolszulfon-amidokra reagáló promoterek szabályozzák, a transzformáit kallusz szintjén lehet vizsgálni.

22. példa

Az N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszuljonamid használata rekombináns petúniagén P6.1 promoter/GUS fúziók expressziójónak indukálására transzgenikus dohánynövényekben

A P655 előállítása

HU 218 717 Β

A P655 plazmidot teljesen megemésztjük HindlII és BamHI restrikciós enzimmel, majd a keletkező DNSfragmenteket agarózgél-elektroforézissel választjuk el. A 3.9 kb méretű DNS-fragmentet, amely egy rekombináns gént tartalmaz, amelyben megtalálható a GUS kódoló régió, működés szempontjából egy 1.3 kb méretű P6.1 ffagmenthez és egy ÖCS 3’-downstream régióhoz kapcsolva, kivágjuk a gélből, és az előzőekben leírt módon elektroelúcióval kinyeijük. A DNS-t ezután azonos térfogatú fenol:kloroform 1:1 arányú elegyével extraháljuk, majd etanollal kicsapjuk. A pAGS502 bináris vektort teljesen megemésztjük HindlII és BamHI restrikciós enzimekkel, azonos térfogatú fenol:kloroform 1:1 arányú elegyével extraháljuk, majd etanollal kicsapjuk. A vektorból és a tisztított 3.9 kb méretű fragmentből ekvimoláris mennyiséget ligálunk össze 10 pl térfogatban 15 °C hőmérsékleten 4 óra hosszat. A ligálóelegy aliquot részét használjuk Escherichia coli HB101 sejtek transzformálására, majd a keletkezett transzformált sejteket 10 pg/ml tetraciklint tartalmazó LB-lemezekre szélesztjük. Tetraciklinrezisztens kis mennyiségű plazmidpreparátumot készítünk, majd HindlII és BamHI restrikciós enzimmel emésztjük, amíg egy olyan telepet nem találunk, amely a keresett 3.9 kb méretű DNS-fragmentet tartalmazza a pAGS 502 bináris vektorban. Az ebben a példában használt pAGS502 bináris vektor csak egy a sok elérhető és erre a célra alkalmazható bináris vektorok közül. A pAGS502 készítése céljából a pAGSlll [van den Elzen et al., Plánt. Mól. Bioi., 5, 149-154 (1985)] EcoRI-HindllI restrikciós fragmentjét (amely a NOS/NPTII/OCS 3’-vég gént tartalmazza a bal és jobb oldali T-DNS határolók között) tompa végűvé tesszük, majd a tompa végűvé tett széles gazdaspecifítású pRK290 plazmid [Ditta et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 77, 7347-7351 (1980)] EcoRl hasítási helyére klónozzuk. A jobb oldali határolószakasztól downstream irányban lévő Xhol restrikciós hasítási helyet kivágjuk oly módon, hogy Xhol restrikciós enzimmel emésztjük, majd a plazmidot recirkularizáljuk önmagával ligáivá, miután az Xhol 5’ túlnyúló végeit tompa végekké alakítottuk. Ezután az 5’-GGATCCTCTAGAAAGCTTCG AACTCGAGGAATTATTCGTT-3’ polilinker szekvenciát beépítjük a BamHI és Hpal hasítási helyek közé a T-DNS határolószakaszok között, így állítjuk elő a pAGS502 plazmidot. Ennek a plazmidkonstrukciónak a jelzése P656 (27. ábra).

A P661 plazmid előállítása

A P656 plazmid készítése során alkalmazott módszereket ismételjük meg, kiindulási anyagként a P658 és pAGS502 plazmidokat használva. Egy 4,7 kb méretű DNS-ffagment, amely egy GUS-struktúrgént tartalmaz működés szempontjából egy 600 bp méretű P6.1 promoterfragmenthez és egy 2.2 kb méretű P6.1 3’-véghez kapcsolva a P660 plazmid HindlII és BamHI restrikciós enzimekkel való emésztéséből származik. Ezt a 4.7 kb méretű DNS-fragmentet szubklónozzuk BamHI/HindlII restrikciós enzimekkel emésztett pAGS502 plazmidba az előzőekben leírt módon, majd a keletkező plazmidkonstrukciót P661-nek nevezzük el (27. ábra).

A P662 plazmid előállítása

A P656 plazmid készítése során alkalmazott módszereket ismételjük meg, kiindulási anyagként a P658 plazmidot használva. Egy 4.4 kb méretű DNS-ffagment, amely egy GUS-struktúrgént tartalmaz, működés szempontjából egy 300 bp méretű P6.1 promoterfragmenthez és egy 2.2 kb méretű P6.1 3’-véghez kapcsolva, a P658 plazmid HindlII és BamHI restrikciós enzimekkel való emésztéséből származik. Ezt a 4.4 kb méretű DNS-fragmentet szubklónozzuk BamHI/HindlII restrikciós enzimekkel emésztett pAGS502 plazmidba az előzőekben leírt módon, majd a keletkező plazmidkonstrukciót P662-nek nevezzük el (27. ábra).

A P663 plazmid előállítása

A P656 plazmid készítése során alkalmazott módszereket ismételjük meg, kiindulási anyagként a P657 és PAGS502 plazmidokat használva. Egy 5.4 kb méretű DNS-ffagment, amely egy GUS-struktúrgént tartalmaz működés szempontjából egy 1.3 kb méretű P6.1 promoterfragmenthez és egy 2.2 kb méretű P6.1 3’-véghez kapcsolva, a P658 plazmid HindlII és BamHI restrikciós enzimekkel való emésztéséből származik. Ezt az 5.4 kb méretű DNS-ffagmentet szubklónozzuk BamHI/HindlII restrikciós enzimekkel emésztett pAGS502 plazmidba az előzőekben leírt módon, majd a keletkező plazmidkonstrukciót P663-nak nevezzük (27. ábra).

Dohány transzformálása P661, P662 és P663 plazmidokkal

A P656, P662 és P663 plazmidokat bejuttatjuk Agrobacterium tumefaciensbe (AL4404/pAL4404) a háromszülős keresztezési eljárást alkalmazva, majd dohánylevél (SRI) darabot transzformálunk mind a négy kiméra GUS/P6.1 fúzióval, a 21. példában leírt eljárást alkalmazva.

A GUS-aktivitás indukálása N-(amino-karbonil)-2klör-benzolszulfonamiddal

Számos, P661, P662 és P663 konstrukciókkal transzformált regenerált növényt teszünk át az 5. példában leírt hidroponikus rendszerbe. A gyökérszövetet összegyűjtjük ezekről a hidroponikusan növesztett növényekről, majd N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamiddal kezeljük a 4. példában leírt módon. Ezután a gyökéranyagot használjuk nyersfehérje-kivonat előállítására, amelyeknek vizsgáljuk a GUS-aktivitását. A növényeket ezután edényekben lévő talajra tesszük, és üvegházban teljesen felnövesztjük az előzőekben leírt módon.

A gyökereket jéghideg GUS-vizsgálópufferben szuszpendáljuk (összetétele: 50 mmol nátrium-foszfát, pH=7,0, 10 mmol DTT, 0,1% Triton X-100, 1 mmol EDTA) egy Dounce típusú homogenizátort alkalmazva. A sejttörmeléket ezután centrifugálással eltávolítjuk. A fluorometriás GUS-vizsgálatokat Perkin-Elmer Fluorescence Spectrophotometer (650-40) alkalmazásával, a gerjesztő hullámhosszat 365 nm-re, az emissziós hullámhosszat 455 nm-re állítva. Egy standard fluoreszcencia MU-koncentráció-görbét készítünk, 50 pl különböző MU-koncentrációt hígítva 950 pl 0,2 mmólos Na₂CO₃-ban, majd a fluoreszcenciát megmérve.

HU 218 717 Β

A transzformált növények gyökérkivonataiban levő GUS-aktivitást megmérjük oly módon, hogy 15 pl szubsztrátot (1 mmol 4-metil-umbilliferril-glükoronid-mérő pufferben) adunk 1 ml nyersgyökér-kivonathoz, majd 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A fluoreszcenciaméréseket 0,15 és 30 perc elteltével végezzük oly módon, hogy mért mennyiségű (1-50 pl) GUS-reakcióelegyet adunk 1 ml 0,2 mólos Na₂CO₃-hoz, és a MU által generált fluoreszcenciát mérjük a GUS-reakcióelegyben. A nyersgyökér-kivonatok fehérjetartalmát Bradford-módszerrel vizsgáljuk. 10-20 μΐ gyökérkivonatot adunk 1 ml Bradford Assay Stainhez (10 pg/ml Coomassie Brilliant Blue G 8,5% foszforsavban), majd a minták abszorpcióját 595 nm-en mérjük. Egy fehérjekoncentráció-abszorbancia-görbét készítünk, BSA-t alkalmazva fehéijestandardként. Az egyes gyökérkivonatokban mért GUS-aktivitást a fehéijekoncentrációra standardizáljuk, majd GUS-aktivitás/mikrogramm fehérje formában fejezzük ki.

Egy ilyen elemzésnek az eredményeit mutatjuk be a 10. ábrán. Számos, a P661, P662 és P663 konstrukciókkal transzformált növény mutatja a GUS-aktivitás indukálását N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamiddal való kezelés után. A kiméra GUS-gén expressziójában megfigyelhető változékonyság általában akkor tapasztalható, ha primer transzformánsokban vizsgáljuk a transzformáló gén expresszióját.

10. táblázat

N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamiddal indukálható GUS-expresszió petúnia P6 promoter/GUS konstrukciókkal transzformált dohánynövényekben

A növény sorszáma	Promoter- méret (bp-ban)	GUS-aktivitás (Fu/pg-pcrc)	Az indukció mértéke
Induká- latlan*	Indukált*
P663/1	1300	7,4	13,6	1,8
P663/10	1300	3,1	8,9	2,9
P663/11	1300	6,7	21,0	3,1
P663/17	1300	8,5	44,9	5,3
P663/36	1300	31,5	31,2	1,0
P663/81	600	45,8	102,1	2,2
P661/105	600	4,3	7,0	1,6
P662/44	300	2,2	7,8	3,5
P662/55	300	25,8	76,6	3,0
P662/65	300	2,9	5,1	1,7

23. példa

Az N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamid alkalmazása rekombináns kukorica 2-1 promoter/GUS-gén konstrukciók dohánynövényekben való expressziójának indukálására

A pJE518 és pJE519 készítése

A pJE516 plazmidban lévő rekombináns 2-1/GUSgént stabilan bejuttatjuk dohányba, Agrobacteriummal végzett transzformációval. A pJE516 plazmidot teljesen megemésztjük BamHI és Xhol restrikciós enzimekkel, majd a keletkező 6,0 kb méretű DNS-fragmentet, amely egy 3 kb méretű 2-1 promoterffagment/GUS/ 1. 1 kb méretű 2-1 gén 3’-downstream fragmentet tartalmaz, gélen tisztítjuk. Ezt a pJE516-ból származó tisztított 6 kb méretű BamHI/XhoI fragmentet ezután a pJJ2644 bináris vektor csak egyike a számos elérhető bináris vektornak, amelyek ebben a példában használhatók. A széles gazdaspecifitású pRK2 vektorból származik, és egy higromicinrezisztencia gént tartalmaz (HYG) az Agrobacterium 1’, 2’ promoter és a nopalinszintetáz 3’-vége szabályozása alatt, a jobb és bal oldali T-DNS határolószakaszok között. A HYG gén higromicinrezisztenciát határoz meg a transzformált növényekben. Egy polilinkerszekvenciát építünk be a HYG gén mögé, hogy a klónozáshoz számos egyszeres hasítási helyet vigyünk be. A T-DNS jobb oldali határolószakaszától downstream lévő Xhol restrikciós hasítási helyet eltávolítjuk azzal a módszerrel, amelyet korábban a pAGS502 vektorra már leírtunk. A kapott plazmid jelzése pJE518 (28. ábra).

A pJE516 plazmidot is teljesen megemésztjük BamHI és Hpal restrikciós enzimekkel. Ezzel kivágunk a vektorból egy 4,5 kb méretű DNS-fragmentet, amely egy 1,5 kb méretű 2-1 promoterfragment (GUS) 1.1 kb 2-1 gén 3’-downstream ffagment fúziót tartalmaz. Ezt a fragmentet gélen tisztítjuk, majd a pJJ2644 BamHI/Hpal restrikciós hasítási helyére ligáljuk, így állítjuk elő a pJE519 plazmidot (28. ábra). Ezt a két plazmidkonstrukciót használjuk dohány (Petite Havanna) transzformálására.

A dohány transzformálása

A pJE518-ban és pJE519-ben lévő konstrukciókat Escherichia coli H8101-ből mobilizáltuk Agrobacterium tumefaciensbe abból a célból, hogy a dohány transzformálását végrehajtsuk. Az Agrobacterium AL4404 friss tenyészetét, amely a pAL4404 plazmidot hordozza, minimál A táptalajon növesztjük (összetétel: 10,5 g K2PO₄, 4,5 g KH₂PO₄, pg (NH₄)₂SO₄, 0,5 g nátrium-citrát χ2Η₂Ο, 1 ml 1 mól MgSO₄x7H₂O, 10 ml 20%-os glükóz vízzel 1 literre feltöltve). A pRK2013 plazmidot hordozó Escherichia coli HB101 törzset és a mobilizálandó plazmidokat (pJE518 és pJE519) hordozó Escherichia coli HB101 törzseket egy éjszakán át L táptalajban növesztjük. Az egyes sejttípusokból azonos mennyiséget keverünk össze, szélesztjük, majd egy éjszakán át hagyjuk 28 °C hőmérsékleten növekedni. A kapott baktériumokból egy kacsnyit 10 mmol MgSO₄-en szuszpendálunk, 100 pg/ml rifampicinnel és 1 pg/ml tetraciklinnel kiegészített LB-lemezre szélesztünk 10°, 10-' és 10~⁴-es hígításban, majd 2-3 napig növesztjük 28 °C hőmérsékleten. Az ezeken a lemezeken növekedő izolált telepeket 1 pg/ml tetraciklint tartalmazó A minimáltáptalajra (A minimáltáptalaj plusz 1% agar) szélesztjük. Ezekből a szélesztett telepekből egy éjszakán át növesztett folyadéktenyészeteket készítünk A minimáltáptalajon.

HU218 717B

Leveleket veszünk 7,5-10 cm magas dohánynövényekről (Petite Havana), amelyek Magenta-dobozokban növekedtek, majd keresztben 5 mm széles csíkokra szabdaljuk sebészeti szikével. A csíkokat rövid időre Agrobacterium egy éjszakán át növesztett tenyészetébe merítjük, majd baktérium-együtt-tenyésztő lemezekre tesszük. A baktérium-együtt-tenyésztő lemezek MS sókat tartalmaznak (összetétel: 1,9 g/1 KNO₃, 1,65 g NH₄NO₃, 0,44 g/1 CaCl₂xH₂O, 0,37 g/1 MgSO₄x/H₂O, 0,17 g/1 KH₂PO₄, 10,3 mg/1 ZnSO₄x7H₂O, 16,9 mg/1 MnSO₄xH₂0,6,2 mg/1 H₃BO₃,0,84 mg/1 KI, 0,25 mg/1 Na₂MoO₄x2H₂0,0,025 pg/l CuSO₄x5H₂0,0,025 mg/1 COCl₂x6H₂O, 37,2 pg/l Na₂EDTAx2H₂O, 27,8 pg/l FeSO₄x7H₂O), B5 vitaminokat (1 pg/l nikotinsav, 10 pg/l tiamin-HCl, 1 pg/l piridoxin-HCl, 100 pg/l mioinozit), 0,59 g/1 MES-t, 30 g/1 szacharózt, 8 g/1 agart, 0,1 pg/l naftil-ecetsavat és 1 pg/l benzil-adenint.

Miután három napig inkubáltuk 27 °C hőmérsékleten 16 óra világos/8 óra sötét megvilágítási ciklusban, a baktériumokat lemossuk a levelekről oly módon, hogy 3 óra hosszat rázatjuk folyékony MS-táptalajban (ugyanaz az összetétele, mint a baktérium együtttenyésztő lemezeké, de agar nélkül), amely 500 pg/ml kefotaximot tartalmaz. A levéldarabokat ezután MStáptalajra visszük, amely 100 pg/ml vankomicint és 30 pg/ml higromicint tartalmaz, majd 27 °C hőmérsékleten az előzőekben leírt módon inkubáljuk. A hajtások körülbelül egy hónap elteltével kezdenek megjelenni. Ezeket a hajtásokat 1 pmol indol-vaj savat és 30 pg/ml higromicint tartalmazó MS-táptalajra visszük át, amikor körülbelül 1 cm magasak. A palántákat Magentadobozokba tesszük át (ugyanezt a táptalajt tartalmazzák), majd 5-7 cm méretig hagyjuk nőni, mielőtt hidroponikus körülmények közé visszük.

A GUS-aktivitás indukálása N-(amino-karbonil)-2klór-benzolszulfonamiddal

Hét növényt transzformálunk a pJE518 konstrukcióval, és öt növényt transzformáljunk a pJE519 konstrukcióval, majd a 4. példában leírt hidroponikus rendszerbe visszük át őket. Ezeket a transzformánsokat hidroponikusan növesztjük addig, amíg elegendő mennyiségű gyökértömeget termelnek ahhoz, hogy kis mintákat a növény tönkretétele nélkül eltávolíthassunk. Ennél a pontnál a gyökér anyagának egyharmadát távolítjuk el az egyes növényekről, majd cseppfolyós nitrogénben lefagyasztjuk. A növényeket ezután 200 mg/1 N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamidot tartalmazó 0,5 χ Hoagland-oldatba visszük át. Miután a vegyszer jelenlétében 6 óra hosszat inkubáltuk, a gyökértömeg újabb egyharmadát is eltávolítjuk az egyes növényekről. A gyökér anyagát használjuk nyersfehérje-kivonatok készítésére, amelyeknek megvizsgáljuk a GUS-aktivitását. A növényeket ezután edényekben lévő talajra visszük át, és üvegházban teljesen felneveljük.

A gyökér anyagát jéghideg GUS-vizsgálópufferben szuszpendáljuk (összetétele: 50 mmol nátriumfoszfát, pH=7,0, 10 mmol DTT, 0,1% Triton X-100, 1 mmol EDTA) Polytron alkalmazásával (Brinkmann Instruments). A gyökerek GUS-aktivitását ezután 0,

1, 2 és 4 óra elteltével mérjük a 15. példában leírtak alapján.

Ennek az elemzésnek az eredményei láthatók all. táblázatban. Számos, a pJE518 és pJE519 konstrukciókkal transzformált növény mutatja a GUS-aktivitás egészen 13-szoros indukcióját N-(amino-karbonil)-2-klórbenzolszulfonamiddal való kezelés hatására. A rekombináns 2-1 promoter/GUS konstrukció expressziójában látható változékonyság általában akkor figyelhető meg, amikor primer transzformánsokban vizsgáljuk a transzformáló gén expresszióját. Azokat a növényeket, amelyek a legmagasabb szintű reagálóképességet mutatják a kémiai kezelésre, önmagukkal termékenyítjük meg és a Petite Havanával visszakeresztezzük. Számos ilyen növény visszakeresztezéséből származó magvakat kicsíráztatunk, és higromicinszelekció mellett Magenta-dobozokban növesztjük. Miután a gyökérszerkezet kialakult az egyes növényeken, mindegyikből kivágunk gyökérdarabokat, és egy éjszakán át gyökereztető táptalajon N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamiddal vagy anélkül inkubáljuk. A GUS-vizsgálatokat a következő napon végezzük ezekből a gyökerekből készült extraktumokon. Ennek a vizsgálatnak az eredményei a 12. táblázatban láthatók. A visszakeresztezések utódjaiból származó gyökerek N-(amino-karbonil)-2klór-benzolszulfonamiddal indukálható GUS-aktivitást mutatnak, két növény, amelyeket a pJE519 konstrukcióval transzformáltunk, tízszeres indukciót mutat. Ezeknek a keresztezéseknek további utódjait vizsgáljuk meg a rekombináns GUS-gén indukálhatósága szempontjából, az N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamiddal való hidroponikus, illetve levélen keresztül való kezelés hatására.

11. táblázat

N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamiddal indukálható GUS-expresszió 2-1 promoter/GUS konstrukciókkal transzformált dohánynövényekben A. Transzgenikus növények, amelyek a pJE518 konstrukciót tartalmazzák

Növény #	GUS-aktivitás (Fu/pg-perc)	Az indukció mértéke
Indukálatlan*	Indukált*
518-1	1,0	1,9	1,9
518-2	1,2	1,8	1,5
518-3	0,67	8,9	13,0
518-4	2,9	5,5	1,9
518-5	0,72	0,24	0,33
518-6	0,74	2,4	3,2
518-7	0,67	5,0	7,5

HU 218 717 Β

11. táblázat (folytatás)

B. Transzgenikus növények, amelyek a pJE519 konstrukciót tartalmazzák

Növény #	GUS-aktivitás (Fu/pg-perc)	Az indukció mértéke
Indukálatlan*	Indukált*
519-1	0,75	1,8	2,4
519-2	0,70	1,1	1,5
519-3	0,41	1,3	3,2

Növény #	GUS-aktivitás (Fu/pg-perc)	Az indukció mértéke
Indukálatlan*	Indukált*
519-4	1,56	7,2	4,6
519-5	0,39	3,9	10,0

* A 7. táblázatban az indukciót 200 mg/ml N-(amino-karbonil)-2-klór10 benzolszulfonamiddal végezzük transzformált növények hidroponikus kezelésével.

12. táblázat

GUS-vizsgálatok a visszakeresztezés utódjai GUS-aktivitására (Fu/mg-perc)

Növény	Keresztezés	-D5293	+ D5293	Az indukció mértéke	A szülőindukció mértéke
801-3	518,2xPetite Havana	1,04	4,4	4,2	1,5
801-4	518,2xPetite Havana	1,03	5,3	5,1	1,5
802-5	5. 8. 6xPetite Havana	1,39	7,9	5,7	3,2
802-6	5. 8.6xPetite Havana	1,46	4,8	3,3	3,2
803-5	519,3xPetite Havana	0,20	2,0	10	3,2
803-6	519,3xPetite Havana	0,16	1,5	9,4	3,2

24. példa

Az N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamid alkalmazása a kukorica 2-2 promoter szabályozása alatt álló rekombináns gének expressziójának indukálására

A pJE573, pJE578-l és pJE578-8 plazmidok készítése

A pTDS130 plazmidban lévő kiméra 2-2/GUSgént stabilan bejuttatjuk dohányba Agrobacteriummal végzett transzformációval. A pTDS130 plazmidot teljesen megemésztjük Xbal restrikciós enzimmel, majd a keletkező 4.3 kb méretű DNS-fragmentet, amely egy

1,2 kb méretű 2-2 promoterfragment/GUS/1.1 kb méretű 2-1 gén 3’-downstream fragmentkonstrukciót tartalmaz, gélen tisztítjuk. Ezt a pJE5516-ból származó tisztított 4.5 kb méretű Xbal fragmentet ligáljuk a pAGS502 bináris vektorba, így kapjuk a pJE573 plazmidot.

A pTDS130 plazmidot is teljesen megemésztjük BamHI restrikciós enzimmel, majd a 3.4 kb méretű DNS-fragmentet, amely a pJE516-ból származó 0,45 kb méretű 2-1 promoterfragment/GUS/1.1 kb méretű 2-1 gén 3’-downstream fragmentkonstrukciót ligáljuk a pAGS502 bináris vektorba, így kapjuk a pJE578-l és pJE578-8 plazmidokat. Ez a két plazmid a 2-2 rekombináns konstrukciók két lehetséges orientációját képviseli a bináris vektorban.

A pDuPU3 vektor készítése

A pDuPS22 plazmidban lévő kiméra 2-2/HRA gént KpnI és Sáli restrikciós enzimmel emésztjük, majd a keletkező 4.3 kb méretű fragmentet, amely egy 0,45 kb méretű 2-2 promoterfragment/HRA/1.1 kb méretű 2-1 gén 3’-downstream fragmentet tartalmaz, gélen tisztítjuk. Ezt a pDuPS22 plazmidból származó tisztított fragmentet ezután a pZS06 bináris vektorba ligáljuk, így kapjuk a pDuPU3 plazmidot.

A növények transzformálása

A pJE573, pJE578-l és pJE578-8 konstrukciók Escherichia coli HB101 törzsből Agrobacterium tumefaciensbe való mobilizálását, az SRI dohánylevélkorongok transzformálását és a növények regenerálását a 23. példában leírtak alapján végezzük.

A pDUPU3-ban lévő rekombináns ALS gént Escherichia coli HBlOl-bl Agrobacterium tumefaciens LBA4404 törzsbe háromszülős keresztezéssel végezzük. A pRK2013 plazmidot tartalmazó Escherichia coli HB101 törzset használjuk segítőként a plazmidmobilizálási keresztezésekben. A pDUPU3 plazmidot tartalmazó Escherichia coli HB101 törzset, apRK2013 Escherichia coli HB101 törzset és az LBA4404 törzset egy éjszakán át növesztjük 5 ml LA-táptalajban, megfelelő szelektív antibiotikumok jelenlétében. A baktériumokat centrifugálással nyerjük ki (4000 χ g, 10 perc, 22 °C), majd 5 ml LB-táptalajban szuszpendáljuk. A keresztezéseket úgy hajtjuk végre, hogy az egyes tenyészetekből 100 μΐ-t keverünk össze 1,5 ml-es centrifügacsőben, majd az elegyből aliquot részeket steril Millipore HA nitrocellulóz korongokra pipettázunk. A korongokat 6-8 réteg steril Whatman #1 szűrőpapírra tesszük, hogy a fölösleges folyadékot eltávolítsuk a tenyészetekről, majd 100 m-es Petri-csészében levő LB-agar táptalajra visszük át. Miután körülbelül 16 órán át 30 °C hőmérsékleten inkubáltuk, a baktériumokat lemossuk a nitrocellulóz korongokról steril 4 ml-es polipropiléncsövekbe, 1 ml 10 mm-1 MgSO₄-et használva. A baktériumokból sorozathígítást készítünk, majd a különböző hígításokat

HU 218 717 Β

100 pg/ml rifampicint és ampicillint tartalmazó LB-agarlemezekre szélesztjük, és 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A rezisztens telepekből kis mennyiségű plazmidpreparátumot készítünk, és a Ti-plazmidok Southem-blot-elemzésével vizsgáljuk, hogy jelen van-e a keresett inszert.

A növények transzformálása

A konstrukciókat a dohánylevélkorongok Agrobacterium tumefacienssel való fertőzése útján juttatjuk be a növényekbe. Standard aszeptius technikákat alkalmazunk a steril táptalajok és az idegen szervezet mentes növény/baktérium tenyészetek kezelésére, beleértve a lamináris boxok alkalmazását az összes transzfer során. A levélkorong-fertőzésekhez a dohánynövényeket edényben növesztjük egy növesztőkamrában, 12 óra fény, 24 °C és 12 óra sötét, 20 °C ciklusban, 80% relatív páratartalom mellett tartva őket, kevert hideg, fehér fluoreszcens és izzólámpa alatt. A dohánylevél-fertőzést lényegében Horsch és munkatársai módszerével végezzük [Horsch, R. B., Frakció, J. E., Hoffman, N. L., Eichholtz, D., Rogers, S. G. and Fraley, R. T., Science, 227,1229-1231 (1985)].

Fiatal, részlegesen megnyúlt, 10-15 cm hosszúságú leveleket szedünk egy szikével 4-6 hetes növényekről. A leveleket felületükön sterilezzük oly módon, hogy 30 percre körülbelül 500 ml 10%-os Clorox, 0,1% SDS összetételű oldatba merítjük őket, majd háromszor steril ionmentes vízzel öblítjük. Ezután előállítjuk a levélkorongokat oly módon, hogy steril 6 mm-es papírlyukasztót alkalmazunk, majd beoltjuk őket oly módon, hogy néhány percre 20 ml, a kiválasztott plazmidot hordozó Agrobacterium egy éjszakán át LB-táptalajon növesztett tenyészete 1:10-es hígításába merítjük. A beoltás után a levélkorongokat CN-agar táptalajt (MS sók (Gibco), 30 g szacharóz, 8 g agar, 0,1 ml 1 mg/ml koncentrációjú NAA és 1 ml 1 mg/ml koncentrációjú BAP/liter, pH=5,8) tartalmazó Petri-csészékbe tesszük. A lemezeket parafilmmel lezáquk, majd kevert fluoreszcens, valamint „Gro and Sho” növénylámpák (General Electric) alatt inkubáljuk 2-3 napig, körülbelül 25 °C-os hőmérsékleten tartott tenyésztő-szobában.

A levélkorongokat friss CN táptalajra visszük át, amely 500 mg/1 kefotaximot és 100 mg/1 kanamicint tartalmaz. A korongokat az előzőekben leírt növesztési körülmények között inkubáljuk 3 hétig, majd ugyanilyen összetételű friss táptalajra visszük át. Körülbelül 1-2 hét elteltével a kanamicinnel szelektált növényeken növekvő hajtásokat steril szikével kivágjuk, és A táptalajba ültetjük (MS sók (Gibco), 10 g szacharóz, 8 g agar/liter), amely 100 mg/1 kanamicint tartalmaz. A meggyökeresedett hajtásokat talajra visszük át, majd szaporítókamrában növesztjük, az előzőekben leírt módon.

A GUS-aktivitás indukálása fi-glükoronidáz génkonstrukciókkal kukorica 2-2 promoter szabályozása alatt álló rekombináns gének expessziójának indukálására

A pJE573, pJE578-l és pJE578-8 plazmidok készítése

A pTDS130 plazmidban lévő kiméra 2-2/GUSgént stabilan bejuttatjuk dohányba Agrobacteriummal végzett transzformációval. A pTDS130 plazmidot teljesen megemésztjük Xbal restrikciós enzimmel, majd a keletkező 4,3 kb méretű DNS-fragmentet, amely egy

1,2 kb méretű 2-2 promoterífagment/GUS/1.1 kb méretű 2-1 gén 3’-downstream fragmentkonstrukciót tartalmaz, gélen tisztítjuk. Ezt a pJE516-ból származó tisztított 4.5 kb méretű Xbal fragmentet ligáljuk a pAGS502 bináris vektorba, így kapjuk a pJE573 plazmidot.

A pTDS130 plazmidot is teljesen megemésztjük BamHl restrikciós enzimmel, majd a 3.4 kb méretű DNS-fragmentet, amely a pJE516-ból származó 0.45 kb méretű 2-1 promoterfragment/GUS/1.1 kb méretű 2-1 gén 3’-downstream fragmentkonstrukciót ligáljuk a pAGS502 bináris vektorba, így kapjuk a pJE578-l és pJE578-8 plazmidokat. Ez a két plazmid a 2-2 rekombináns konstrukciók két lehetséges orientációját képviseli a bináris vektorban.

A pDuPU3 vektor készítése

A pDUPS22 plazmidban lévő kiméra 2-2/HRA gént KpnI és Sáli restrikciós enzimmel emésztjük, majd a keletkező 4.3 kb méretű fragmentet, amely egy 0.45 kb méretű 2-2 promoterfragment/HRA/1.1 kb méretű 2-1 gén 3’-downstream fragmentet tartalmaz, gélen tisztítjuk. Ezt a pDUPS22 plazmidból származó tisztított fragmentet ezután a pZS96 bináris vektorba ligáljuk, így kapjuk a pDuPU3 plazmidot.

A növények transzformálása

A pJE573, pJE578-l és pJE578-8 konstrukciók Escherichia coli HB101 törzsből Agrobacterium tumefaciensbe való mobilizálását, az SRI dohánylevélkorongok transzformálását és a növények regenerálását a 23. példában leírtak alapján végezzük.

A pDuPU3-ban lévő rekombináns ALS-gént Escherichia coli HBlOl-bl Agrobacterium tumefaciens LBA4404 törzsbe háromszülős keresztezéssel végezzük. A pRK2013 plazmidot tartalmazó Escherichia coli HB101 törzset használjuk segítőként a plazmidmobilizálási keresztezésekben. A pDuPU3 plazmidot tartalmazó Escherichia coli HB101 törzset, a pRK2013 Escherichia coli HB101 törzset és az LBA4404 törzset egy éjszakán át növesztjük 5 ml LA-táptalajban, megfelelő szelektív antiobiotikumok jelenlétében. A baktériumokat centrifugálással nyerjük ki (4000xg, 10 perc, 22 °C), majd 5 ml LB-táptalajban szuszpendáljuk. A keresztezéseket úgy hajtjuk végre, hogy az egyes tenyészetekből 100 pl-t keverünk össze 1,5 ml-es centrifugacsőben, majd az elegyből aliquot részeket steril Millopora Ha nitrocellulóz korongokra pipettázunk. A korongokat 6-8 réteg steril Whatman #1 szűrőpapírra tesszük, hogy a fölösleges folyadékot eltávolítsuk a tenyészetekről, majd 100 mm-es Petri-csészében lévő LB-agar táptalajra visszük át. Miután körülbelül 16 órán át 30 °C hőmérsékleten inkubáltuk, a baktériumokat lemossuk a nitrocellulóz korongokról steril 4 ml-es polipropiléncsövekbe, 1 ml 10 mm1 MgSO₄-et használva. A baktériumokból sorozathígítást készítünk, majd a különböző hígításokat 100 pg/ml rifampicint és ampicillint tartalmazó LB-agarlemezekre szélesztjük, és 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk.

HU 218 717 Β

A rezisztens telepekből kis mennyiségű plazmidpreparátumot készítünk, és a Ti-plazmidok Southem-blotelemzésével vizsgáljuk, hogy jelen van-e a keresett inszert.

A növények transzformálása

A konstrukciókat a dohánylevélkorongok Agrobacterium tumefacienssel való fertőzése útján juttatjuk be a növényekbe. Standard aszeptius technikákat alkalmazunk a steril táptalajok és az idegen szervezet mentes növény/baktérium tenyészetek kezelésére, beleértve a lamináris boxok alkalmazását az összes transzfer során. A levélkorong-fertőzésekhez a dohánynövényeket edényben növesztjük egy növesztőkamrában, 12 óra fény, 24 °C és 12 óra sötét, 20 °C ciklusban, 80% relatív páratartalom mellett tartva őket, kevert hideg, fehér fluoreszcens és izzólámpa alatt. A dohánylevél-fertőzést lényegében Horsch és munkatársai módszerével végezzük [Horsch, R. B., Frakció, J. E., Hoffman, N. L., Eichholtz, D., Rogers, S. G. and Fraley, R. T., Science,

227,1229-1231 (1985)].

Fiatal, részlegesen megnyúlt, 10-15 cm hosszúságú leveleket szedünk egy szikével 4-6 hetes növényekről.

A leveleket felületükön sterilezzük oly módon, hogy 30 percre körülbelül 500 ml 10%-os Clorox, 0,1% SDS összetételű oldatba merítjük őket, majd háromszor steril ionmentes vízzel öblítjük. Ezután előállítjuk a levélkorongokat oly módon, hogy steril 6 mm-es papírlyukasztót alkalmazunk, majd beoltjuk őket oly módon, hogy néhány percre 20 ml, a kiválasztott plazmidot hordozó Agrobacterium egy éjszakán át LB-táptalajon növesz- 30 tett tenyészete 1:10-es hígításába merítjük. A beoltás után a levélkorongokat CN-agar táptalajt (MS sók (Gibco), 30 g szacharóz, 8 g agar, 0,1 ml 1 mg/ml koncentrációjú NAA és 1 ml 1 mg/ml koncentrációjú BAP/liter, pH=5,8) tartalmazó Petri-csészékbe tesszük. 35 A lemezeket parafilmmel lezárjuk, majd kevert fluoreszcens, valamint „Gro and Sho” növénylámpák (General Electric) alatt inkubáljuk 2-3 napig körülbelül 25 °C-os hőmérsékleten tartott tenyésztőszobában.

A levélkorongokat friss CN-táptalajra visszük át, 5 amely 500 mg/1 kefotaximot és 100 mg/1 kanamicint tartalmaz. A korongokat az előzőekben leírt növesztési körülmények között inkubáljuk 3 hétig, majd ugyanilyen összetételű friss táptalajra visszük át. Körülbelül

1- 2 hét elteltével a kanamicinnel szelektált növényeken 10 növekvő hajtásokat steril szikével kivágjuk, és A táptalajba ültetjük (MS sók (Gibco), 10 g szacharóz, 8 g agar/liter), amely 100 mg/1 kanamicint tartalmaz.

A meggyökeresedett hajtásokat talajra visszük át, majd szaporítókamrában növesztjük az előzőekben leírt módon.

A GUS-aktivitás indukálása fi-glükoronidáz génkonstrukciókkal transzformált növényekben A pJE573, pJE578-l és pJE578-8 konstrukciókkal transzformált növényeket hidroponikus körülmények 20 között növesztjük, majd 200 mg/1 N-(amino-karbonil)2- klór-benzollal kezeljük, és vizsgáljuk a GUS-aktivitás indukcióját a 23. példában leírtak alapján.

Ennek az elemzésnek az eredményei láthatók a 13. táblázatban. Számos, a pJE573, pJE578-l és 25 pJE578-8 konstrukciókkal transzformált növény mutatja a GUS-aktivitás indukálhatóságát N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamiddal való kezelés hatására. A kiméra GUS-gén expressziójában látható változékonyság általában akkor figyelhető meg, amikor primer transzformánsokban vizsgáljuk a transzformálógén expresszióját. Azokat a növényeket, amelyek a legmagasabb szintű reagálóképességet mutatják a kémiai kezelésre, önmagukkal termékenyítjük meg, majd ennek a keresztezésnek az utódjaiban vizsgáljuk a kiméra GUSgén stabilitását és indukálhatóságát az indukálóanyag levélen keresztül való alkalmazására adott válaszként.

13. táblázat

Növény I. D.	GUS-spccifikus aktivitás (Fu/pg protein/perc)	Az indukció mértéke	X utód szegregálása Kan-R/Kan-S	A lókuszok száma
573-as konstrukció
4	0,54	1,12	2,1	90/11	2
5	1,25	3,62	2,9	39/16	1
6	0,50	3,06	6,1	102/4	3
8	0,45	1,76	4,0	38/13	1
9	0,016	0,128	8,0	0/50	0
10	3,73	5,34	1,4	100/18	2
11	0,42	1,40	3,3	36/3	2
12	0,35	1,54	4,4	63/6	2
578-1-es konstrukció
13	0,006	0,003	1	41/22	1
14	0,003	0,003	1	NA	NA
19	0,094	0,128	1,4	118/4	>2
27	0,062	0,127	2	45/19	1

HU 218 717 Β

13. táblázat (folytatás)

Növény I. D.	GUS-specifikus aktivitás (Fu/pg protcin/pcrc)	Az indukció mértéke	X utód szegregálása KanR/KanS	A lókuszok száma
32	0,272	1,445	5,3	53/24	1
35	0,004	0,002	1	NA	NA
37	0,018	0,145	8,3	52/16	1
578-8-as konstrukció
6A	1,86	6,19	3,3	46/14	1
6B	1,18	2,73	2,3	80/35	1
7	0,79	1,80	2,3	125/0	>2
9	1,45	4,20	2,9	NA	NA
10	4,83	6,25	1,3	121/8	2

A herbicidrezisztens ALS indukálása a pDuPS22 plazmiddal transzformált növényekben A pDuPS22 konstrukcióval transzformált növényeket három hétig talajban neveljük, majd mindegyik növényről levesszük a két felső levelet. Az egyik levelet 0,5 χ Hoagland-oldatot tartalmazó főzőpohárba tesszük úgy, hogy a levél vágott végének alsó 2 cm-e merüljön a folyadékba. A második levelet egy olyan főzőpohárba helyezzük, amelyben a 0,5 χ Hoagland-táptalaj 200 mg/1 N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamidot tartalmaz. A leveleket ezután a növesztőkamrában inkubáljuk 16-24 óra hosszat, majd kétfelé osztjuk. Az egyik felében megvizsgáljuk az ALS mRNSexpresszióját, míg a másik felében elemezzük a szenzitív és herbicidrezisztens ALS enzimszintek expresszióját.

A transzformált növényekben a vad típusú és a transzformált ALS-génekről átírt stabil citoplazmatikus mRNS expresszióját RN-áz protekciós elemzéssel mérjük. Ily módon a pDuPS22 konstrukció expresszióját meg lehet különböztetni a vad típusú ALS-gének expressziójától azon az alapon, hogy a pDuPS22 transzkriptum egy egyedülálló 2-2 nem transzlálódó 2-2 nem transzlálódó leaderszakasszal rendelkezik, amely eltér a természetes ALS-gének nem transzlálódó leaderszekvenciájától. Ebből a célból a dohány SurB ALS-génből származó EcoRI/Ncol ffagmentet, amely a SurB transzlációs starthelytől 5’-irányban 133 bp-ra kezdődő régiótól a SurB transzlációs starthelytől 3'-irányban 348 bp-ra levő szakaszt a pTS64 vektorba klónozzuk, így állítjuk elő a pTSNTC jelű plazmidot (a vad típusú SurB-gén izolálását a 0257993 számú Európai szabadalmi leírásban közük, és egy herbicidrezisztens SurB-gén az ATCC-nél hozzáférhető 67124 letéti szám alatt, illetve a vad típusú SurB-génnel helyettesíthető, így is ugyanazt az eredményt kapjuk). A pTS64 plazmidot úgy állítjuk elő, hogy a pSP64 plazmidot (Promega Biotech., Inc.) teljesen megemésztjük BamHI restrikciós enzimmel, majd a vektort az alábbi szekvenciájú szintetikus kétszálú oligonukleotiddal ligáljuk.

5’-GATCTATCGATCCATGGTCTAGAAAA-3’ '-ATAGCTAGGTACCAGATCTTTT-5 ’

A ligálóelegyet ezután 65 °C-ra melegítjük 10 per20 cig, majd Xbal restrikciós enzimmel teljesen megemésztjük. Az emésztési reakcióelegyet ismét 10 percig 65 °C hőmérsékleten tartjuk, majd egy éjszakán át T4 DNS-ligázzal ligáljuk. A ligálóeleggyel való transzformálás után (Escherichia coli DH5) egy olyan telepet izolálunk, amely a keresett szekvenciát tartalmazza:

'-GATCTATCGATCCATGGT-3 ’ ’-ATAGCTAGGTACCAGATC-5 ’ amely egy Clal és Ncol hasítási helyet tartalmaz a pSP64 polilinkerbe építve.

EcoRI restrikciós enzimmel linearizált pTSNTC plazmidból egy 520 bp méretű ³²P-vel jelzett ellenértelmű ALS RNS-t izolálunk az SP6 polimeráz alkalmazásával a ³²P dCTP jelenlétében, egy kitet alkalmazva a gyártó előírásai szerint. A vad típusú ALS RNS-t ehhez az 520 bp méretű ³²P-vel jelzett ellenértelmű RNS-hez hibridizálva a próbából 420 bp-t megvédünk, míg a pDuPS22 transzkritumhoz hibridizálva a próbából csak 348 bp védhető meg, ami megfelel a pDuPS22 mRNS transzlációs starthelyétől 3’-irányban levő régiónak.

Az RN-áz protekciós vizsgálatokat Zinn és munkatársai leírása szerint végezzük [Zinn et al., Cell, 34, 865-879 (1983)]. A jelzett ellenértelmű RNS-szálat vagy a vad típusú dohánynövényekből származó összRNS-hez illesztjük, vagy a pDuPS22 konstrukcióval transzformált növényekből származó ossz-RNS 10 pgjához. Az RN-áz Tl-gyel és RN-áz A-val való emésztés után megmaradó jelzett RNS-ffagmentek méretét elektroforézissel meghatározzuk, 6%-os denaturáló poliakrilamidgélt alkalmazva. Az ilyen elemzések ered50 ményei azt mutatják, hogy a pDuPS22 2-2 promoter/HRA rekombináns génnel transzformált növények N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamiddal való kezelése nagy mennyiségű citoplazmatikus HRA mRNS indukcióját eredményezi.

A szulfonil-karbamid-rezisztens ALS-gén indukálhatóságának előzetes vizsgálataként számos kis levelet vágunk le a mind a 16 kanamicinrezisztens palántáról, 2-3 mm-es darabokra vágjuk, majd a kalluszindukáló táptalajra tesszük, amely MS sókat, 100 mg/1 i-inozitot, 0,4 mg/1 tiamint, 3 g szacharózt, 1 mg/1 NAA-t, 0,2 mg/1

HU 218 717 Β

BAP-ot, 0,8% agart, 500 mg/1 kefotaximot (pH=5,8) tartalmaz, emellett vagy 10 ppm klór-szulfuront, vagy 10 ppm klór-szuluront+100 ppm D5293-at, 1000 ppm D5293-at tartalmaz, illetve nem tartalmaz szelekciós ágenst. A kalluszképződést háromhetes növesztése után plusszal vagy mínusszal jelöljük. Az eredményeket az alábbiakban foglaljuk össze:

Nincs szelekció 10 ppb klórszulfuron 10 ppb klórszulfuron+ 100 ppm D5293 100 ppm D5293

16/16 képez kalluszt 12/16 képez kalluszt

0/16 képez kalluszt 0/16 képez kalluszt.

Számos kanamicinrezisztens és N-(amino-karbonil)2-klór-benzolszulfonamiddal kezelt növény leveleiből készítünk fehérjekivonatokat, és vizsgáljuk az ALS-en- 15 zimaktivitást Chaleff és Mauvais szerint [Chaleff R. C. and Mauvais C. J.: Acetolactate synthetase is the site of action of two suifonylurea herbicides induk higher plants, Science, 224,1443-1445 (1984)]. A reakció termékét, az acetoint 530 nm-en az optikai sűrűség alapján 20 mérjük [Westerfield WW: A colorimetric determination of blood acetoin, J. Bioi. Chem., 161, 495-502 (1945)]. Minden egyes kivonatnál párhuzamos enzimvizsgálatokat végzünk vagy herbicid nélkül, vagy 100 ppb klór-szulfuron jelenlétében. A klór-szulfuron je- 25 lenlétében mért átlagos ALS-aktivitást a herbicid távollétében mért átlagos ALS-összaktivitás százalékában fejezzük ki, és a 14. táblázatban mutatjuk be.

Ezek az eredmények azt mutatják hogy a hét növény közül kettő a kémiai kezelés hatására megnöveke- 30 dett szintű klór-szulfuron-rezisztens ALS-t mutat. Meg kell jegyezni, hogy létezik egy jól dokumentált biológiai mechanizmus, amely az ALS-specifikus aktivitást a dohányban rögzítve tartja. Ennélfogva jóllehet mindegyik vizsgált növény mutatja a herbicidrezisztens ALS 35 mRNS indukcióját, várható, hogy az össz-ALS-aktivitás nem képes növekedni a levelekben. Azok a növények, amelyek közel 100%-ig rezisztens ALS-aktivitást mutatnak indukció nélkül, olyan növények, amelyekben a rezisztens ALS-gén elegendő expresszióját kap- 40 juk kémiai kezelés nélkül, és így megfelelő mennyiségű rezisztens enzim keletkezik. A génexpresszió szintje a kezeletlen, 2-2 promoterrel vezérelt génekkel transzformáit növényben egy pozíciós hatás, és úgy látszik, hogy drámaian változik a kimutathatatlantól a nagyon magas 45 szintig mind a 2-2/ALS mind a 2-2/GUS konstrukcióknál. Az várható, hogy számos, nem indukálatlan ALS-aktivitást fogunk találni, ha a 2-2/ALS transzformánsok nagyobb populációját tanulmányozzuk.

14. táblázat

Növény	OD 530nincs herbicid	OD 530- 100 ppb klórszulfuron	Nem gátolt aktivitás
Transzformálatlan
Kezeletlen	0,204	0,010	5
D5293-mal kezelt	0,267	0,034	13

Növény	OD 530 nincs herbicid	OD 530- 100 ppb klórszulfuron	Nem gátolt aktivitás
#44B transzformáns
Kezeletlen	0,333	0,306	92
D5293-mal kezelt	0,385	0,365	95
#53 A transzformáns
Kezeletlen	0,224	0,251	103
D5203-mal kezelt	0,331	0,312	94
#61A transzformáns
Kezeletlen	0,376	0,347	92
D5293-mal kezelt	0,912	0,901	99
#63 A transzformáns
Kezeletlen	0,457	0,178	39
D5293-mal kezelt	0,835	0,732	88
#74C transzformáns
Kezeletlen	0,859	0,822	96
D5203-mal kezelt	0,400	0,408	102
#79A transzformáns
Kezeletlen	0,492	0,309	63
D5293-mal kezelt	0,366	0,325	89
#93A transzformáns
Kezeletlen	0,324	0,313	97
D5293-mal kezelt	0,989	1,003	101

25. példa

N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamid alkalmazása egy rekombináns 2-1 promoter/GUS konstrukció expressziójának indukálására transzgenikus káposztában

Standard aszeptikus technikát alkalmazunk a steril táptalajok és az idegen szervezet mentes növény/baktérium tenyészetek kezelésére, beleértve a lamináris boxok alkalmazását az összes transzfer során.

Brassica napus cv. Westar magvakat sterilezünk oly módon, hogy három percre 70%-os etanolba mártjuk, majd 20 percig 20 tömeg%-os fehérítőben (nátriumhipoklorit) kezeljük. A magvakat háromszor öblítjük steril desztillált vízzel, majd Magenta-dobozonként kilenc magot ültetünk csíráztató táptalajba (csíráztató talaj; MS (Murashige and Skoog) sók, 1%-os szacharóz, 3 mmol MES puffer és 0,8% Hazleton Tetraciklin agar). A magokat 24 °C hőmérsékleten csíráztatjuk 16 óra megvilágítás/8 óra sötét ciklust alkalmazva, 400 lux fényintenzitást alkalmazva. Öt nap elteltével a kicsíráztatott palántákból a hipokotilt (szik alatti szár) kivágjuk, darabokra vágjuk, amelyeknek a hossza 0,5 és 1,0 cm között változik.

A pJE519 plazmidot (23. példa) tartalmazó Agrobacterium tumefaciens LBA4404 törzs frissen szélesztett lemezeiről egyedi telepeket növesztünk egy éjszakán át A minimáltáptalajban (10,5 g/1 K₂HPO₄, 4,5 g/1

HU 218 717 Β

KH₂PO₄, 1,0 g/1 (NH₄)₂SO₄, 0,5 g/1 Na-citrát 2H₂O, 990 ml-re feltöltve; autoklávozzuk, majd az alábbi steril oldatokat adjuk hozzá: 1 ml MgSO₄, 10 ml 20%-os glükóz. Az LB4404 gazdasejt rifampicinrezisztens, és a bejuttatott bináris plazmid bakteriális tetraciklinrezisztenciát határoz meg.

Az Agrobacterium szuszpenziókat hormonmentes táptalajban szuszpendáljuk (MS sók, Gamborg-féle B5 vitaminok, 3% szacharóz, 3 mmol MES puffer, pH=5,8) 2,8xlO⁸ cfu/ml koncentrációban, a tenyészet 550 nm-en mért optikai sűrűségét alkalmazva a baktérium koncentrációjának megbecslésében.

A hipokotilszekciókat külön-külön mártjuk az agrobacterium szuszpenzióba, majd steril Whatman #1 szűrőpapírra tesszük, amelyet a kalluszregeneráló táptalaj tetejére teszünk (MS sók, Gamborg-féle B5 vitaminok, 3% szacharóz, 3 mmol MES puffer, 0,2 mg/1 2,4-D, 3 mg/1 kinetin, 0,8% Hazleton TC-agar). Ezután a hipokotilszekciókat két napig együtt tenyésztjük Agrobacteriumokkal, ugyanazt a hőmérsékletet és megvilágítási körülményeket alkalmazva, amelyeket a növények csíráztatásánál alkalmaztunk. Nem használunk táplálóréteget. Az együtt tenyésztést leállítjuk oly módon, hogy a hipokotilszekciókat Petri-csészékben levő, 500 mg/1 kefotaximot és 200 mg/1 vankomicint tartalmazó folyékony kalluszképző táptalajra visszük át, majd a lemezeket körülbelül 5 óra hosszat óvatosan rázatjuk.

A hipokotilrészeket szilárd kalluszképző táptalajra visszük át, amely 500 mg/1 kefotaximot tartalmaz, de nem tartalmaz szelektív antibiotikumokat, négy napig itt tartjuk, hogy biztosítsuk azt, hogy az agrobaktériumok elpusztultak, és a transzformált sejtek kiheverik az agrobaktérium-fertőzést, mielőtt a szelekciót alkalmazzuk. A negyedik napon a hipokotilszekciókat kalluszképző táptalajra visszük át, amelyek 500 mg/1 karbenicillint (Geopen) és 20 mg/1 higromicint tartalmaznak szelektív antibiotikumként. A fény- és hőmérséklet-tartomány ugyanaz, mint amit a magvak csíráztatásánál alkalmaztunk. 24 napos szelekció után a zöld transzformáit kalluszok láthatók 60%-ban kinőve a hipokotilszekciók vágott végéről. A transzformálásban alkalmazott negatív kontrollok, amelyek az Agrobacteriumnak ki nem tett hipokotilszekciók, nem mutatnak zöld kallusznövekedést a szelektív antibiotikumot tartalmazó táptalajokon.

Harminc nap elteltével a kalluszok már elég nagyok ahhoz (1-3 mm), hogy le lehessen vágni őket a hipokotilszekciókról. A levágott hipokotilokat regeneráló IT-5 táptalajra visszük át (MS sók, B5 vitaminok, 3% szacharóz, 3 mmol MES puffer, 2,5 mmol IBA, 15 mmol Dropp (tidiazeron), 0,2% Gel-rite, pH=5,8; kiegészítve 500 mg/1 Geopennel és 20 mg/1 higromicin B-vel). Ez a táptalaj támogatja az egészséges kallusznövekedést, valamint a hajtások gyors regenerálódását a nem szelektált hipokotolszekciókról.

A növényeket akkor regeneráljuk a kalluszokról, amikor átmérőjük legalább 0,5 cm, ekkor átvisszük őket 500 mg/1 Geopent és 20 mg/1 higromicint tartalmazó KR táptalajra. A KR táptalaj összetétele K3 major sók (35 mmol KN0₃, 1 mmol (NH₄)SO₄, 1 mmol

MgSO₄, 1,5 mmol KH₂PO₄, 3,1 mmol NH₄NO₃, a

6,3 mmol CaCl₂-t autoklávozás után adjuk hozzá, MS mikrotápanyagok, B5 vitaminok, 1% szacharóz, 0,25% xilóz, 3 mmol MES puffer, 0,1 mg/1 IAA, 2 mg/1 zeatin, 0,25% alacsony EEO-jú agaróz, pH=5,7). Kéthetenként levágjuk a kalluszok külső rétegét egy szikével, és friss táptalajra visszük át. Amikor a hajtások regenerálódnak a kalluszokról, akkor levágjuk őket a kalluszokról, és 500 mg/1 Geopent tartalmazó gyökereztető táptalajt tartalmazó Magenta-dobozokba tesszük át őket (0,5 χ MS sók, MS mikrotápanyagok B5 vitaminokkal, 1% szacharóz, 3 mmol MES puffer, 0,8% TC-agar, pH=5,8). Amikor a hajtások megüvegesednek, akkor a dobozok tetejét kicsit felnyitjuk, és a nyílást Micropore szalaggal zárjuk le, hagyjuk az etilént távozni.

A regenerált transzformánsokat hidroponikus közegbe visszük, felneveljük, majd N-(amino-karbonil)-2klór-benzolszulfonamiddal kezeljük a 23. példában leírtak alapján. Az várható, hogy a pJE519 konstrukciókkal transzformált káposztanövények kémiai kezelés hatására mind a GUS-mRNS, mind GUS-enzimaktivitás indukcióját mutatják.

26. példa

A 2-1, 2-2 és 5-2 kukoricagének indukciója különböző kémiai anyagokkal

A különböző helyettesített benzolszulfonamidok és rokon vegyületek azon képességét vizsgáljuk, hogy a Missouri 17 kukorica 2-1, 2-2 és 5-2 génjeinek az expresszióját indukálják-e. A kukoricamagvakat kicsíráztatjuk, majd hidroponiásan növesztjük 2 literes főzőpohárban, az 1. példában leírtak alapján. A tizedik napon a növényeket 0,5xHoagland táptalajra visszük át, amely a vizsgálandó vegyületeket tartalmazza. A kémiai kezelés hatodik órájában gyökérszövetet veszünk a növényekről, gyorsan lefagyasztjuk cseppfolyós nitrogénbe mártva, majd az elemzésig -80 °C hőmérsékleten tartjuk.

A kémiailag kezelt kukoricanövényekből származó

RNS slot-blot elemzése

Nz RNS-izolálás és slot-blot elemzés részleteit az 1. példában mutatjuk be. A vegyszerekkel kezelt növények gyökérszövetéből össz-RNS-t izolálunk a korábban leírt guanidin-tiocianát eljárással. A párhuzamos biotokat, amelyek a 8. és 9. táblázatban bemutatott vegyszerekkel kezelt szövetekből származó 2 pg összRNS-t tartalmaznak, nitrocellulóz membránon készítjük el, Minifold II slot-bloter-t alkalmazva (Schleicher and Schüll), a gyártó által javasolt eljárást követve. A párhuzamos biotokat előhibridizáljuk, majd a pln 2-1, pln 2-2-3 és pln 5-2 plazmidokból származó tisztított cDNS-inszertekből nick-transzlációval készített próbákkal hibridizáljuk. A slot-blotokat mossuk az

1. példában leírtak alapján, majd Kodak X-OMAT XAR-5 filmre exponáljuk 24 órán át -80 °C hőmérsékleten, Du Pont Lightning Plus erősítőfóliát alkalmazva. A filmet Kodak X-OMAT berendezéssel hívjuk elő. Egy vegyszernek azt a képességét, hogy indukálja-e a három indukálható gén által kódolt mRNS-t, két lehetséges módszer közül az egyikkel vizsgáljuk meg. A mi63

HU 218 717 Β kapcsolatban lévő vegyületek hidroponikus alkalmazására adott válaszát vizsgáljuk. Emellett a kukoricagéneknek a stresszingerekre adott válaszát is vizsgáljuk.

Az eredményeket aló. táblázatban foglaljuk össze.

nőségi értékelést közvetlen vizuális módszerrel végezzük, összehasonlítva az egyes próbáknak a különböző RNS-mintákhoz való hibridizálásának mértékét mutató, a filmen levő autoradiográfiás jelek intenzitását. A mennyiségi értékelést úgy végezzük, hogy az egyes siótokat, amelyek a blotból hibridizálódó RNS-t tartalmazzák, kivágjuk, majd 2 ml DuPont ECONOFLUOR szcintillációs koktélba merítjük, és szcintillációs számlálóban megmérjük az egyes slotokon lévő radioaktivitás mennyiségét. Az N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamiddal kezelt RNS-hez hibridizált radioaktivitás mennyiségét, kivonva belőle a kezeletlen RNS-hez hibridizált radioaktivitás mennyiségét, a 15. táblázatban mutatjuk be.

15. táblázat

Vegyület*	In 2-1	In 2-2	In 5-2
1.	204	332	47
2.	111	270	58
3.	70	260	61
4.	295	237	76
5.	296	136	59
6.	244	135	53
7.	251	129	72
8.	173	124	47
9.	53	110	33
10.	203	94	63
11.	102	70	36
12.	49	8	14
13.	60	1	55

* A kukoricagyökerekben a2-l,2-2és5-2 promoterek indukciójára vizsgált vegyületek nevét az alábbi listában adjuk meg. Mindegyik vegyületet 200 mg/1 mennyiségben alkalmaztuk.

1. dietil-[[2-[(butil-amino-karbonil)-amino-szulfonil]fenil]]-foszfonát

2. N’-[2-(n-butil-amino-karbonil)]-6-klór-N,N-dimetil-1,2-benzol-diszulfonamid

3. N-izopropil-karbamoil-benzolszulfonamid

4. 2-klór-N-(metil-amino-karbonil)-benzolszulfonamid

5. N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamid

6. 1 -ciklohexil-3-metil-szulfonil-karbamid 7.1 -butil-3-metil-szulfonil-karbamid

8. 2-klór-N-[[3-(2-etoxi-etoxi)-propil]-amino-karbonil-benzolszulfonamid

9. 2,3-diklór-N-[(ciklopropil-amino)-kabonil]-benzolszulfonamid

10. metil-2-[(amino-karbonil)-amino-szulfonil]-benzoát

11. N-(amino-karbonil)-2,3-diklór-benzolszulfonamid

12. 2,3-diklór-N-[(ciklopentil-amino)-karbonil]-benzolszulfonamid

13. N-(amino-karbonil)-4-( 1,1 -dimetil-etil)-2-nitrobenzolszulfonamid

A Missouri 17 kukorica 2-1, 2-2 és 5-2 génjeinek a növényi hormonok és különböző, a növényi stresszel

16. táblázat

Növényi hormonok	In 2-1	In 2-2	In 5-2
Abszcizinsav (100 ppm)	+	-	-
6-benziladenin (benzilamino-purin) (100 ppm)	+ +	-	-
2,4-diklór-fenoxi-ecetsav (100 ppm)	+ + +	+	-
Gibberellinsav (100 ppm)	-	-	-
Indol-ecetsav (100 ppm)	+ + +		n/a
Indol-vajsav (100 ppm)	+ +	+	n/a
Naftol-ecetsav (100 ppm)	+	-	-
p-klór-fenoxi-ecetsav (100 ppm)	+ +	+ +	+
Stresszingerlés
Acetil-szalicilsav (200 ppm)	+ +	+ +	+ +
NaCl (100 mM)	-	-	-
Prolin (20 mM)	-	-	-
Szalicilsav (200 ppm)	+	+	+
Szalicilamid (200 ppm)	+ +	-	-
Karbamid (100 mmol)	-	-	-

Az indukció maximális szintjét „+ + + + +”-mal jelezzük. Ez megfelel annak a szintnek, amelyet 100 ppm N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamiddal mint indukálóanyaggal megfigyeltünk.

27. példa

Egy rekombináns génnek, amelynek expresszióját

2-2 kukoricapromotere szabályozza, válasza helyettesített benzolszulfonamidokra és szerkezetileg rokon vegyületekre transzformált rizsprotoplasztokban

A különböző helyettesített benzolszulfonamidok és rokon vegyületek azon képességét vizsgáljuk, hogy indukálják-e a 2-2 kukoricagénből származó szabályozószekvenciával szabályozott rekombináns gének expresszióját transzformált rizsprotoplasztokban. A rizsszuszpenziós tenyészet létrehozását, a protoplasztok izolálását és transzformálását, valamint a GUS-aktivitás vizsgálatát a 14. példában leírtak alapján végezzük.

A rizsprotoplasztokat a pTD133 rekombináns DNS-konstrukcióval transzformáljuk, majd különböző vegyületekkel kezeljük 100 pg/ml koncentrációban a

10. példában leírt módon. A 17. táblázatban két ilyen elemzés eredményeit látjuk. Számos vizsgált helyettesített benzolszulfonamid mutatta azt a tulajdonságot, hogy képes a GUS-aktivitást indukálni transzformált protoplasztokban N’-[2-(n-butil-amino-karbonil)]-6klór-N,N-dimetil-l,2-benzoldiszulfonamiddal mint a legaktívabb anyaggal.

HU 218 717 Β

Ebben a példában a különböző helyettesített benzolszulfonamidoknak azt a képességét mutatjuk be, hogy egy rekombináns 2-2 promoter/GUS konstrukció transzformált protoplasztban való expresszióját indukálják, azzal összefüggésben, hogy ugyanezek a vegyületek indukálják az endogén 2-1 és 2-2 gének expresszióját hidroponikusan növesztett Missouri 17 kukoricában is (17. példa). Ez a vizsgálat azt mutatja, hogy a rizsprotoplaszt tranziens vizsgálórendszer egy értékes előzetes módszer arra, hogy megállapítsuk egy vegyületről, képes-e olyan géneket indukálni, amelyeknek az expresszióját helyettesített benzolszulfonamidokkal és rokon vegyületekkel indukálható promoterek szabályozzák teljes növényekben.

17. táblázat

Vegyület	1. vizsgálat	2. vizsgálat	3. vizsgálat	Átlagos indukció
1.	0	0		0
2.	1	1		1
3.	7,67	N/A		7,67
4.	29,8	N/A		29,8
5.	8,7	6,8	43	7,75
6.	N/A	4		4
7.	8,9	5,4		7,15
8.	27	14,5		20,75
9.	7,4	11,2		9,3
10.	N/A	1,6		1,6
11.	N/A	3,6		3,6
12.	N/A	N/A	17	17
13.	N/A	N/A	16	16
14.	N/A	N/A	27,3	27,3
15.	N/A	N/A	24,1	24
16.	N/A	N/A	30,2	30
17.	N/A	N/A	16,6	16,6
18.	N/A	N/A	1,6	1,6
19.	N/A	N/A	5,2	5,2
20.	N/A	N/A	38,6	38,6
21.	N/A	N/A	24,2	24,2

A 2-2 promoter/GUS fúziók indukálásában vizsgált vegyületek kémiai neveit az alábbiakban soroljuk fel:

1. Nincs DNS 2.35S-GUS kontroll

3. metil-2-[(amino-karbonil)-amino-szulfonil]-benzoát

4. N’-[2-(n-butil-amino-karbonil)]-6-klór-N,N-dimetil-1,2-benzol-diszulfonamid

5. N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamid

6. N-(amino-karbonil)-4-( 1,1 -dimetil-etil)-2-nitrobenzolszulfonamid

7. N-(amino-karbonil)-2,3-diklór-benzolszulfonamid

8. 2,3-diklór-N-[(ciklopentil-amino)-karbonil]-benzolszulfonamid

9. 2-klór-N-(metil-amino-karbonil)-benzolszulfonamid

10. a-[(l,3-dioxolán-2-il-metoxi)-imino]-benzil-acetonitril

11. fenil-metil-2-klór-4-(trifluor-metil)-5-tiazolil-karboxilát

12. metil-3-[(butil-amino-karbonil)-amino-szulfonil)2- tiofén-karboxilát

13. metil-2-[[(butil-amino)-amino-szulfonil]-6-klórbenzoát

14. metil-3-[[(butil-amino)-amino-szulfonil]-2-furánkarboxilát

15. N’-[(butil-amino)-karbonil]-3-metil-2-propil-szulfonil-benzolszulfonamid

16. N’-[(butil-amino)-karbonil]-N-metil-N-(l,l,2,2tetrafluor-etil)-1,2-benzol-diszulfonamid

17. 2-metoxi-6-metil-N-(metil-amino-karbonil)-benzolszulfonamid

18. N,N-dimetil-2- [(amino-karbonil)-amino-szulfonil]3- piridin-karboxamid

19. N-(butil-amino-karbonil)-4-klór-3-piridin-szulfonamid

20. N-(propil-amino-karbonil)-2-piridin-szulfonamid

21. 2,6-diklór-N-[(l,l-dimetil)-amino-karbonil]-3-piridinszulfonamid

28. példa

A petúnia P6 gén és a dohány T2 gén indukciója szalicilsavval

A petúnia- és dohánynövényeket az 5. példában leírtak alapján növesztjük és kezeljük hidroponikusan, vagy 200 mg/1 N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamiddal vagy 100 mg/1 szalicilsavval 2, 4, 6 és 22 órán át. A kezelt növények gyökereiből össz-RNS-t izolálunk, és a P6 mRNS expresszióját elemezzük RNáz protekciós módszerrel a 4. példában leírtak alapján. A P6 RNS az N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamiddal való kezelés után 2 órával kimutatható, a maximális szintet 6 óra elteltével éri el. A maximális P6 RNS szint azonban szalicilsavas kezelés esetében a 2 órán észlelhető, és 6 óra elteltével ez a kezeletlen növényeknél megfigyelhető szintre esik vissza. Ez az eredmény a vegyületek eltérő hatásmódjára utal.

Alkalmazás

A 2., 4., 5. és 7. ábrán bemutatott promoterek alkalmasak olyan struktúrgének expressziójának szabályozására, amelyek működés szempontjából az (I)—(IX) általános képletü vegyületek külső alkalmazására reagáló génekből származó növényi promoterekhez vannak kapcsolva. A gének szabályozása oly módon érhető el, hogy az (I)—(IX) általános képletü vegyületeket olyan transzgenikus növényekre alkalmazzuk, amelyek szabályozandó génterméket kódoló struktúrgéneket tartalmaznak, működés szempontjából az XX-YY ábrákon ismertetett promoterekhez és származékaihoz kapcsolva.

Számos módszer ismert az ismertetett indukálóvegyületek alkalmazására. Az indukálószer alkalmazható közvetlenül a magvakra. A magvak egyenletesen beboríthatok az indukálószerrel ültetés előtt, a standard magkezelési módszerrel. Egy másik módszer szerint az in65

HU 218 717 Β dukálószer alkalmazható közvetlenül a kitett magvakra a kiültetésnél nyitott barázdákban, közvetlenül, mielőtt a magokat talajjal borítjuk (barázdakezelés). Az indukálószert alkalmazhatjuk megjelenés után abban az időpontban, amikor a keresett gén(ek) expressziója előnyös. A megjelenés utáni alkalmazást úgy irányíthatjuk, hogy az indukálószert elsőként a termésre visszük. Az indukálószer mennyisége változhat a specifikus indukálószertói és a kezelés módjától függően. A fajoknak és a termesztési gyakorlatnak is lehet hatása.

Az várható, hogy bizonyos növényi tulajdonságokért felelős gének expressziójának időleges szabályozása mezőgazdaságilag hasznos lehet a transzgenikus növényeknél. A tulajdonság lehet például herbicidrezisztencia, ahol a növény rezisztenciájának egy bizonyos herbicidosztályra való korlátozása előnyös lehet. Ily módon azok a nem kívánt növények, amelyek a mezőn kihajtanak a begyűjtés idején bekövetkező magelhullás következtében, könnyen eliminálhatók, ha az indukálógént inaktiválatlanul hagyjuk. Az ilyen herbicidrezisztencia génekre példa az acetolaktát-szintetáz (szulfonilkarbamid-rezisztencia) gén, az 5-enol-piruvil-sikímát3-foszfát-szintetáz (glifozátrezisztencia) gén és a BAR gén (Basta-rezisztenciát kódol).

A patogén és rovarrezisztens tulajdonságot biztosító gének expressziójának szabályozása szintén hasznos lenne mezőgazdasági szempontból. Ezeknek a rezisztenciagéneknek az expresszióját a kártevő életciklusának olyan időszakára korlátozva, amikor a fertőzés bekövetkezik, korlátozni lehetne a kártevő populációban lévő géntermékre való rezisztencia kialakulását a rezisztenciagének expressziójának rövid időtartamra való korlátozásával. A rezisztenciagének expresszióját a növény növekedési ciklusában viszonylag rövid időre korlátozva könnyen minimalizálni lehetne bármely, a kiválasztott gén konstitutív expressziójához kapcsolódó termésveszteséget. Az ilyen gének közé tartoznak például a Bacillus thuringiensis inszekticid endotoxinokat kódoló gének, a kitinázgének, proteáz inhibitor gének, a nematódarezisztenciát kódoló gének stb. A rekombináns, kémiailag indukálható promoterek alkalmazása lehetőséget ad arra is, hogy egy kártevő toxint csak az érintett szövetekben expresszáljunk, és megelőzzük expressziójukat olyan növényi részekben, amelyeket élelmiszerként lehet használni.

Kémiailag szabályozva a fitohormon bioszintézisben szereplő gének expresszióját transzgenikus növényekben, szintén elérhetünk mezőgazdasági szempontból előnyös eredményeket. Például az 1-amino-ciklopropán-1-karbonsav szintetáz gén kémiai indukciója közvetlenül a begyűjtés előtt felgyorsíthatja a gyümölcsök érését, etilénszintézis hirtelen beindításával segítve a begyűjtést. Hasonlóképpen más fitohormonok, például a citokininek, auxinok, gibberellinek és az abszcizinsav bioszintézisében részt vevő más gének expressziójának szabályozásával szabályozzuk a hormonszintet a mezőn növő növényekben, és ennek nagy mezőgazdasági jelentősége lehet.

Jelentős mezőgazdasági előnyökkel járna számos növényi tulajdonság expressziójának szabályozása, ha nálunk valaki tudná, hogy mely gén(ek) kódolja(ják) az ezekért a tulajdonságokért felelős fehérjé(ke)t. Amint ezeket a géneket és termékeiket felfedezik, expressziójuk külső kémiai szabályozása mezőgazdasági hasznot hajthat. Ily módon az a termésveszteség, amely egy viszonylag rövid ideig szükséges tulajdonság konstitutív expressziója következtében lép fel, minimalizálható. Az ilyen génekre és tulajdonságokra példák lehetnek a szárazságtűrő gének, sótűrési gének, patogén rezisztenciagének stb.

Lebontó enzimeket kódoló géneknek közvetlenül a begyűjtés előtt specifikus növényi szövetekben való expressziójával csökkenteni lehet a feldolgozási költségeket, ami a növényi anyagok használható formára alakításával áll kapcsolatban. Ilyen lehet például az aamiláz expressziója a rizsszemekben közvetlenül aratás előtt, ami lecsökkenti az erjedésipar feldolgozási költségeit, vagy megnöveli a cukorrépa cukortartalmát közvetlenül a begyűjtés előtt expresszálva, vagy megnöveli a szójabab tápértékét, ha az α-galaktozidázt közvetlenül a begyűjtés előtt magas szinten expresszáljuk, és csökkentjük a raffinóz, illetve a raffinoszacharidok mennyiségét, vagy a papíripar által használt növényi szövetekben ligninázt expresszálunk.

Claims (53)

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1) a 23. igénypont szerinti nukleinsav promoterfragmentet tartalmaz, beépítve egy

1. Egy (I)—(IX) általános képletű vegyülettel indukálható promoterfragment, amely képletekben

X jelentése hidrogén-, fluor-, klór-, brómatom, trifluor-metil- vagy 1-2 szénatomos alkilcsoport,

X^I jelentése hidrogén-, fluor-, klóratom, 1-2 szénatomos alkilcsoport, -SO₂NR’R² vagy -CO^¹ általános képletű csoport,

Y jelentése hidrogén-, fluor-, klóratom, -SO₂NRiR², -CO₂R', -NO₂ vagy -P(O)(OR!)₂ általános képletű csoport,

R jelentése hidrogénatom, 1-6 szénatomos alkil-, 3-6 szénatomos cikloalkil-, benzil-, 2-4 szénatomos halogénalkilcsoport vagy 1-2 szénatomos alkoxi- vagy 1 -2 szénatomos alkil-tio-csoporttal helyettesített 2-4 szénatomos alkilcsoport,

R¹ jelentése 1-3 szénatomos alkilcsoport,

R² jelentése 1-3 szénatomos alkilcsoport,

R³ jelentése -CO₂R² általános képletű csoport,

R⁴ jelentése 1-6 szénatomos alkil- vagy 3-6 szénatomos cikloalkilcsoport,

R⁵ jelentése 1-3 szénatomos alkoxi- vagy -NR⁶R⁷-csoport;

R⁶ jelentése hidrogénatom, metoxi-, 1 -4 szénatomos alkil-, 3-6 szénatomos cikloalkilcsoport vagy 1-2 szénatomos alkoxi- vagy etoxi-etoxicsoporttal helyettesített 1-4 szénatomos alkilcsoport, és

R⁷ jelentése hidrogénatom vagy 1-2 szénatomos alkilcsoport, valamint ezeknek a mezőgazdaságban alkalmazható sói, azzal jellemezve, hogy az emített promoterfrag66

HU 218 717 Β menttel transzformált növényben az (I)-(IX) általános képleté vegyületek bármelyike az említett promoterffagmenthez működőképesen kapcsolt kiválasztott génterméket kódoló DNS-szekvencia expressziójának fokozódását idézi elő.

2) promoterszekvenciába, amely választható a CaMV 10S és ³⁵S promoterek, az Agrobacterium opinszintetáz gén NOS és ÖCS promotere, a RUBISCO kis alegységének promotere, a klorofill A/B kötőfehérje gének promotere, egy gyökérspecifikus promoter, egy levélspecifikus promoter, egy szárspecifikus promoter, egy magspecifikus promoter, egy pollenspecifikus promoter, egy magrügyspecifikus promoter, egy stresszel indukálható promoter, egy, a fejlődés során szabályozott promoter és egy konstitutív promoter közül,

2. ábra 169-532-es bázispárjainak felel meg, illetve bármely, az előzővel homológ promoterfragment.

2. Az 1. igénypont szerinti nukleinsav promoterfragment, azzal jellemezve, hogy az (I) általános képletben

X jelentése hidrogénatom vagy 2-es helyzeté klóratom,

Y jelentése 3-as helyzetű klóratom vagy - SO₂N(CH₃)₂-csoport,

R jelentése hidrogénatom, 1-6 szénatomos alkilcsoport vagy 5-6 szénatomos cikloalkilcsoport.

3) egy DNS-szekvenciát, amely egy kiválasztott génterméket kódol, működőképesen az említett promoterszekvenciához kapcsolva, és

3. Az 1. igénypont szerinti nukleinsav promoterfragment, azzal jellemezve, hogy a (II) általános képletben

R jelentése 1-4 szénatomos alkilcsoport vagy 5-6 szénatomos cikloalkilcsoport,

R⁴ jelentése 1 -4 szénatomos alkilcsoport.

4) egy megfelelő 3’-downstream szekvenciát oly módon, hogy az említett promoterszekvencia az említett transzformált növényben az (I)—(IX) általános képletű vegyületek bármelyike az említett, kiválasztott génterméket kódoló DNS-szekvencia expressziójának fokozódását idézi elő.

4. Az 1. igénypont szerinti nukleinsav promoterfragment, azzal jellemezve, hogy a (III) általános képletben

R³ jelentése az 1. igénypontban megadott,

R⁵ jelentése metoxi- vagy -NR⁶R⁷ általános képleté csoport,

R⁶ jelentése hidrogénatom vagy 1 -4 szénatomos alkilcsoport és

R⁷ jelentése hidrogénatom.

5. Az 1. igénypont szerinti promoterfragment, azzal jellemezve, hogy egy alábbi (I)—(IX) általános képleté vegyülettel indukálható:

dietil-[[2-(butil-amino-karbonil)-amino-szulfonil]-fenil]-foszfát, N-izopropil-karbamoil-benzolszulfonamid, l-ciklohexil-3-(metil-szulfonil)-karbamid, l-(n-butil)-3metil-szulfonil-karbamid, metil-2-[(amino-karbonil)-2klór-benzolszulfonamid, N’-[2-(n-butil-amino-karbonil)] -6-klór-N,N-dimetil-1,2-benzol-diszulfonamid, 2klór-N-(metil-amino-karbonil)-benzolszulfonamid, 2,3diklór-N-[(ciklopentil-amino)-karbonil-benzolszulfonamid vagy N-(amino-karbonil)-2,3-diklór-benzolszulfonamid.

6. Az 1. igénypont szerinti nukleinsav promoterfragment, azzal jellemezve, hogy növényből származik.

7. A 6. igénypont szerinti nukleinsav promoterfragment, azzal jellemezve, hogy egyszikű növényből származik.

8. A 7. igénypont szerinti nukleinsav promoterfragment, azzal jellemezve, hogy az említett egyszikű növény kukorica, zabok, köles, búza, rizs, árpa, cirok, kakastaréj, hagyma, aszparágusz vagy cukorrépa.

9. A 8. igénypont szerinti nukleinsav promoterfragment, azzal jellemezve, hogy az említett egyszikű növény vagy kukorica, vagy rizs.

10. A 6. igénypont szerinti nukleinsav promoterfragment, azzal jellemezve, hogy az említett növény kétszikű növény.

11. A 10. igénypont szerinti nukleinsav promoterfragment, azzal jellemezve, hogy az említett növény egy kétszikű növény: lucerna, szójabab, petúnia, gyapot, cukorrépa, napraforgó, répa, zeller, káposzta, uborka, bors, canola, paradicsom, burgonya, lencse, len, brokkoli, dohány, bab, saláta, olajrepce, karfiol, spenót, kelbimbó, articsóka, borsó, gomba, tök, kelkáposzta, amerikai kelkáposzta, tea vagy kávé.

12. Nukleinsav promoterfragment, azzal jellemezve, hogy a 2-1 cDNS-klónnal homológ kukoricagén 5’ határoló promoter régiója nukleotidszekvenciáját tartalmazza, letétbe helyezve az American Type Culture Collectionnál (ATCC), ATCC 67805 letéti szám alatt.

13. A 12. igénypont szerinti nukleinsav promoterfragment, amely a 2-1 cDNS-klónnal homológ kukoricagén 5’ határoló promoterrégiója nukleotidszekvenciáját tartalmazza, letétbe helyezve az American Type Culture Collectionnál (ATCC), ATCC 67805 letéti szám alatt, azzal jellemezve, hogy az említett promoterfragmenttel transzformált növényekben az (I)—(IX) általános képleté vegyületek bármelyike az említett promoterfragment 3’-végéhez működőképesen hozzákapcsolt kiválasztott génterméket kódoló DNS-szekvencia expressziójának fokozódását idézi elő.

14. A 13. igénypont szerinti nukleinsav promoterfragment, azzal jellemezve, hogy az (I)—(IX) általános képleté vegyület N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszul· fonamid, dietil-[[2-(butil-amino-karbonil)-amino-szulfonil]-fenil]]-foszfát, 1 -ciklohexil-3-(metil-szulfonil)karbamid, metil-2- [(amino-karbonil)-amino-szulfonilfoszfonát, N’-[2-(n-butil-amino-karbonil)]-6-klór-N,Ndimetil-1,2-benzol-diszulfonamid, 2,3-diklór-N-[(ciklopentil-amino)-karbonil-benzolszulfonamid vagy N(amino-karbonil)-2,3-diklór-benzolszulfonamid.

15. A 14. igénypont szerinti nukleinsav promoterfragment, azzal jellemezve, hogy az (I)—(IX) általános képleté vegyület az N(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamid.

16. A 11. igénypont szerinti nukleinsav promoterfragment, azzal jellemezve, hogy 590 bázispárból áll, 5’-3’-irányban futva a 2. ábrán látható, a 2-1 cDNSklónnal homológ gén 1-590-es bázispárjai között.

17. A 16. igénypont szerinti nukleinsav promoterfragment, azzal jellemezve, hogy 363 bp hosszú, a

18. Nukleinsav promoterfragment, azzal jellemezve, hogy a 2-2 cDNS-klónnal homológ kukoricagén 5’ határoló promoterrégiója nukleotidszekvenciáját tartalmazza, letétbe helyezve az American Type Culture Collectionnál (ATCC), ATCC 67803 letéti szám alatt.

19. A 12. igénypont szerinti nukleinsav promoterfragment, amely a 2-2 cDNS-klónnal homológ kukoricagén 5’ határoló promoterrégiója nukleotidszekvenciáját tartalmazza, letétbe helyezve az American Type Culture Collectionnál (ATCC), ATCC 67803 letéti szám alatt, azzal jellemezve, hogy az említett promoterfragmenttel transzformált növényekben az (I)—(IX) általános képleté vegyületek bármelyike az említett promoterfragment 3’-végéhez működőképesen hozzákapcsolt, egy kiválasztott génterméket kódoló DNS-szekvencia expressziójának fokozódását idézi elő.

20. A 19. igénypont szerinti nukleinsav promoterfragment, azzal jellemezve, hogy az említett (I)—(IX) általános képleté vegyület dietil-[[2-(butil-amino-karbonil)-amino-szulfonil]-fenil]-foszfonát, N’-[2-(n-butil67

HU 218 717 Β amino-karbonil)]-6-klór-N,N-dimetil-1,2-benzol-diszulfonamid, N-izopropil-karbamoil-benzolszulfonamid, 2klór-N(metil-amino-karbonil)-benzolszulfonamid, N(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamid vagy 1ciklohexil-3-(metil-szulfonil)-karbamid.

21. A 20. igénypont szerinti nukleinsav promoterfragment, azzal jellemezve, hogy az (I)—(IX) általános képletű vegyület a dietil-[2-(butil-amino-karbonil)-amino-szulfonil]-fenil-foszfonát.

22. A 18. igénypont szerinti nukleinsav promoterfragment, azzal jellemezve, hogy 207 bázispárból áll, 5’-3’-irányban futva a 4. ábrán látható a 2-2 cDNSklónnal homológ gén 264-470-es bázispárjai között.

23. A 22. igénypont szerinti nukleinsav promoterfragment, azzal jellemezve, hogy 77 bp hosszú, a 4. ábra 292-368-aminosav bázispárjainak felel meg, illetve bármely, az előzővel homológ promoterffagment.

24. Nukleinsav promoterfragment, azzal jellemezve, hogy az 5-2 cDNS-klónnal homológ kukoricagén 5’ határoló promoterrégiója nukleotidszekvenciáját tartalmazza, letétbe helyezve az American Type Culture Collectionnál (ATCC), ATCC 67804 letéti szám alatt.

25. A 24. igénypont szerinti nukleinsav promoterffagment, amely az 5-2 cDNS-klónnal homológ kukoricagén 5’ határoló promoterrégiója nukleotidszekvenciáját tartalmazza, letétbe helyezve az American Type Culture Collectionnál (ATCC), ATCC 67804 letéti szám alatt, azzal jellemezve, hogy az említett promoterfragmenttel transzformált növényekben az (I)—(IX) általános képletű vegyületek bármelyike az említett promoterfragment 3’-végéhez működőképesen hozzákapcsolt kiválasztott génterméket kódoló DNS-szekvencia expressziójának fokozódását idézi elő.

26. A 25. igénypont szerinti nukleinsav promoterfragment, azzal jellemezve, hogy az említett (I)—(IX) általános képletű vegyület 2-klór-N-(metil-amino-karbonil)-benzolszulfonamid, 1 -(n-butil)-3-metil-szulfonil-karbamid, metil-2-[(amino-karbonil)-amino-szulfonil]-benzoát, N-izopropil-karbamoil-benzolszulfonamid, N(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamid vagy N’-[2(n-butil-amino-karbonil)]-6-klór-N,N-dimetil-l,2-benzol-diszulfonamid.

27. A 26. igénypont szerinti nukleinsav promoterfragment, azzal jellemezve, hogy az (I)—(IX) általános képletű vegyület a 2-klór-N-(metil-amino-karbonil)benzolszulfonamid.

28. A 24. igénypont szerinti nukleinsav promoterfragment, azzal jellemezve, hogy 889 bázispárból áll, 5’-3’-irányban futva az 5. ábrán látható, az 5-2 cDNSklónnal homológ gén 264-470-es bázispárjai között.

29. Nukleinsav promoterfragment, azzal jellemezve, hogy a P6.1 cNDS-klónnal homológ petúniagén 5’ határoló promoterrégiója nukleotidszekvenciáját tartalmazza, letétbe helyezve az American Type Culture Collectionnál (ATCC), ATCC 67823 letéti szám alatt.

30. A 29. igénypont szerinti nukleinsav promoterfragment, amely a P6.1 cNDS-klónnal homológ petúnia gén 5’ határoló promoterrégiója nukleotidszekvenciáját tartalmazza, letétbe helyezve az American Type

Culture Collectionnál (ATCC), ATCC 67823 letéti szám alatt, azzal jellemezve, hogy az említett promoterffagmenttel transzformált növényekben az (I)—(IX) általános képletű vegyületek bármelyike az említett promoterfragment 3’-végéhez működőképesen hozzákapcsolt kiválasztott génterméket kódoló DNS-szekvencia expressziójának fokozódását idézi elő.

31. A 30. igénypont szerinti nukleinsav promoterfragment, azzal jellemezve, hogy az említett (I)—(IX) általános képletű N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamid, N’-[2-(n-butil-amino-karbonil)]-6-klór-N,Ndimetil-1,2-benzol-diszulfonamid, 2-klór-N-(metil-amino-karbonil)-benzolszulfonamid, 2,3-diklór-N-[(ciklopentil-amino)-karbonil]-benzolszulfonamid vagy N(amino-karbonil)-2,3-diklór-benzolszulfonamid.

32. A 31. igénypont szerinti nukleinsav promoterfragment, azzal jellemezve, hogy az (I)—(IX) általános képletű vegyület az N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamid.

33. A 29. igénypont szerinti nukleinsav promoterfragment, azzal jellemezve, hogy 595 bázispárból áll, 5’-3’-irányban futva a 4. ábrán látható, a P6.1 cDNSklónnal homológ gén 1-595-ös bázispárjai között.

34. A 33. igénypont szerinti nukleinsav promoterfragment, azzal jellemezve, hogy 240 bp hosszú, a 8. ábra 356-595-aminosav bázispáijainak felel meg, illetve bármely, az előzővel homológ promoterfragment.

35. Nukleinsav promoterfragment, azzal jellemezve, hogy a T-2. 1 cDNS-klónnal homológ dohány gén 5’ határoló promoterrégiója nukleotidszekvenciáját tartalmazza, letétbe helyezve az American Type Culture Collectionnál (ATCC), ATCC 67822 letéti szám alatt.

36. A 34. igénypont szerinti nukleinsav promoterfragment, amely a T-2.1 cDNS-klónnal homológ dohánygén 5’ határoló promoterrégiója nukleotidszekvenciáját tartalmazza, letétbe helyezve az American Type Culture Collectionnál (ATCC), ATCC 67822 letéti szám alatt, azzal jellemezve, hogy az említett promoterfragmenttel transzformált növényekben az (I)—(IX) általános képletű vegyületek bármelyike az említett promoterfragment 3’-végéhez működőképesen hozzákapcsolt kiválasztott génterméket kódoló DNS-szekvencia expressziójának fokozódását idézi elő.

37. A 36. igénypont szerinti nukleinsav promoterfragment, azzal jellemezve, hogy az említett (I)—(IX) általános képletű vegyület N-(amino-karbonil)-2-klórbenzolszulfonamid, N’-[2-(n-butil-amino-karbonil)]6-klór-N,N-dimetil-l,2-benzol-diszulfonamid, 2-klórN-(metil-amino-karbonil)-benzolszulfonamid, 2,3-diklór-N-[(ciklopentil-amino)-karbonil]-benzolszulfonamid vagy N-(amino-karbonil)-2,3-diklór-benzolszulfonamid.

38. A 37. igénypont szerinti nukleinsav promoterfragment, azzal jellemezve, hogy az (I)—(IX) általános képletű vegyület az N(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamid.

39. Nukleinsav promoterfragment, azzal jellemezve, hogy a 218-as cDNS-klónnal homológ kukoricagén 5’ határolószakasza nukleotidszekvenciáját tartalmazza.

HU 218 717 Β

40. A 39. igénypont szerinti nukleinsav promoterfragment, amely a 218-as cDNS-klónnal homológ kukoricagén 5’ határoló nukleotidszekvenciáját tartalmazza, azzal jellemezve, hogy az említett promoterfragmenttel transzformált növényekben (I)—(IX) általános képletű vegyületek bármelyike az említett promoterfragment 3’-végéhez működőképesen hozzákapcsolt kiválasztott génterméket kódoló DNS-szekvencia expressziójának fokozódását idézi elő.

41. A 40. igénypont szerinti nukleinsav promoterfragment, azzal jellemezve, hogy az említett (I)—(IX) vegyület N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamid, 2-klór-N-(metil-amino-karbonil)-benzolszulfonamid, l-(n-butil)-3-metil-szulfonil-karbamid, 1-ciklohexil-3-(metil-szulfonil)-karbamid, dietil-[[2-(butil-amino-karbonil)-amino-szulfonil]-fenil]-foszfonát, metil-2-[(amino-karbonil)-amino-szulfonil]-benzoát, 2,3-diklór-N-[(ciklopentil-amino)-karbonil]-benzolszulfonamid vagy N-(amino-karbonil)-2,3-diklórbenzolszulfonamid.

42. A 41. igénypont szerinti nukleinsav promoterfragment, azzal jellemezve, hogy az (I)—(IX) általános képletű vegyület az N-(amino-karbonil)-2-klór-benzolszulfonamid.

43. A 39. igénypont szerinti nukleinsav promoterfragment, azzal jellemezve, hogy 1574 bázispárból áll, 5’-3’-irányban futva a 7, ábrán látható, a 218 cDNSklónnal homológ gén 1-1574-es bázispárjai között.

44. Növény transzformálására alkalmas rekombináns DNS-konstrukció, azzal jellemezve, hogy tartalmaz egy 1-42. vagy 43. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsav promoterfragmentet, egy, a kiválasztott génterméket kódoló DNS-szekvenciát, amely működőképesen kapcsolódik az említett promoterfragmenthez, valamint egy alkalmas 3’-végi régiót oly módon, hogy a konstrukcióval transzformált növényben az (I)—(IX) általános képletű vegyületek bármelyike a kiválasztott génterméket kódoló DNS-szekvencia expressziójának fokozódását idézi elő.

45. A 44. igénypont szerinti rekombináns DNSkonstrukció, azzal jellemezve, hogy az említett, egy kiválasztott génterméket kódoló DNS-szekvenciát az alábbi csoportból választjuk ki: β-glükoronidáz, acetolaktát-szintetáz, 5-enol-piruvil-sikimát-3-foszfát-szintetáz; egy rovarrezisztenciát okozó gén, egy proteáz inhibitort kódoló gén, egy Bacillus thuringiensis rovarendotoxint kódoló gén, egy fitohormon bioszintézisét kódoló gén, az 1-amino-ciklopropán-l-karbonsav-szintetázt kódoló gén, egy auxin bioszintézisben szereplő gén, egy citokinin bioszintézisben szereplő gén, egy kitinázt kódoló gén, és olajtermelés bioszintézisét kódoló gének.

46. Egy növény transzformálására képes rekombináns DNS-konstrukció, azzal jellemezve, hogy

47. Egy transzgenikus növény, azzal jellemezve, hogy az 1-42. vagy 43. igénypont szerinti nukleinsav promoterfragmentet tartalmazza oly módon, hogy az említett transzgenikus növényben az (I)—(IX) általános képletű vegyületek bármelyike az említett promoterfragment 3’-végéhez működőképesen hozzákapcsolt kiválasztott génterméket kódoló szekvencia expressziójának fokozódását idézi elő.

48. A 47. igénypont szerinti transzgenikus növény, azzal jellemezve, hogy az említett növény egy egyszikű növény, mégpedig kukorica, zabok, köles, búza, rizs, árpa, cirok, kakastaréj, hagyma, aszparágusz vagy cukorrépa.

49. A 48. igénypont szerinti transzgenikus növény, azzal jellemezve, hogy az említett növény vagy kukorica, vagy rizs.

50. A 47. igénypont szerinti transzgenikus növény, azzal jellemezve, hogy az említett növény egy kétszikű növény, és a következő csoportból választható: lucerna, szójabab, petúnia, gyapot, cukorrépa, napraforgó, répa, zeller, káposzta, uborka, bors, canola, paradicsom, burgonya, lencse, len, brokkoli, dohány, bab, saláta, olajrepce, karfiol, spenót, kelbimbó, articsóka, borsó, gomba, tök, kelkáposzta, amerikai kelkáposzta, tea, kávé, geránium, szekfü, orchidea, rózsa, nebáncsvirág, petúnia, begónia, fukszia, körömvirág, krizantén, gladiólusz, astromeria, szalvia, veronika, százszorszép és írisz.

51. Mag, azzal jellemezve, hogy egy 1-42. vagy 43. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsav promoterfragmentet tartalmaz.

52. Eljárás egy kiválasztott géntermék expressziójának megnövelésére egy növényben, azzal jellemezve, hogy

a) az említett növényt egy, a 44. igénypont szerinti rekombináns DNS-konstrukcióval transzformáljuk,

b) az említett transzgenikus növényt egy (I)—(IX) általános képletű vegyület hatásának tesszük ki, és

c) ezzel az említett transzgenikus növényben megnöveljük az említett kiválasztott gén expresszióját egy kiválasztott időpontban.

53. Eljárás egy kiválasztott géntermék expressziójának megnövelésére egy kétszikű növényben, azzal jellemezve, hogy

HU 218 717 Β

a) az említett kétszikű növényt egy, a kiválasztott génterméket kódoló DNS-szekvenciát a 29. vagy 35. igénypont szerinti nukleinsav promoterfragmenthez és a megfelelő 3’ szabályzószekvenciához működőképesen kapcsolva tartalmazó rekombináns DNS-konstruk- 5 cióval transzformáljuk,

b) az említett kétszikű transzgenikus növényt szalicilsav hatásának tesszük ki, és

c) ezzel az említett transzgenikus növényben megnöveljük az említett, kiválasztott gén expresszióját egy kiválasztott időpontban.