CN102016046A

CN102016046A - 用于区别性调节膜脂和种子油中脂肪酸不饱和性的组合物和方法

Info

Publication number: CN102016046A
Application number: CN2009801158202A
Authority: CN
Inventors: 约翰·布朗斯; 陆朝福; 信占国
Original assignee: Washington State University WSU
Current assignee: Washington State University WSU
Priority date: 2008-03-04
Filing date: 2009-03-04
Publication date: 2011-04-13
Also published as: JP2015109867A; UA108597C2; US9200293B2; ZA201007018B; EP2257628A2; JP5822466B2; EP2257628A4; WO2009111587A2; WO2009111587A3; AU2009221899A1; AU2009221899B2; CA2717747A1; US20160272985A1; US10287600B2; US20110131678A1; JP2011512847A; EA201071028A1; EA020628B1

Abstract

本发明的方面提供基于先前未知的生物合成途径的调节来区别性调节植物种子油和膜脂中脂肪酸不饱和性的方法，其涉及调节发育中的含油种子植物中磷脂酰胆碱生物合成的新型磷脂酰胆碱:二酰甘油磷酸胆碱转移酶(PDCT)。具体方面涉及本发明的PDCT多肽包括，例如，其变体、缺失、突变蛋白、融合蛋白、和直向同源物(总的来说，PDCT蛋白)，涉及编码它们的核酸，涉及包含所述PDCT序列或蛋白或缺乏或耗尽所述PDCT蛋白或序列的植物，且涉及用于生成具有改变的或无PDCT表达和/或活性的植物的方法，包括但不仅限于包括诱变，重组DNA，转基因学等方法。

Description

用于区别性调节膜脂和种子油中脂肪酸不饱和性的组合物和方法

发明领域

本发明的方面一般地涉及脂肪酸生物合成，膜脂和植物种子油，且更具体地涉及不饱和脂肪酸及相关酰基甘油，以及涉及基于先前未知的生物合成途径的调节，区别性调节植物种子油和膜脂中脂肪酸不饱和性的组合物和方法，所述途径涉及在发育的含油种子植物(例如，拟南芥(Arabidopsis)，大豆(Glycine max)，油菜(甘蓝型油菜(Brassica napus)或白菜型油菜(B.rapa))，向日葵(Helianthus annuus)，等)中调节磷脂酰胆碱生物合成的新型磷脂酰胆碱:二酰甘油磷酸胆碱转移酶(PDCT)。具体的方面涉及本发明的PDCT多肽包括，例如，其变体、缺失、突变蛋白、融合蛋白、和直向同源物(总的来说，PDCT蛋白)，涉及编码它们的分离的核酸，涉及包含所述PDCT蛋白或缺乏所述PDCT蛋白的植物，且涉及用于生成具有改变的或无PDCT表达和/或活性的植物的方法，包括但不仅限于包括诱变，基因沉默，反义，siRNA，重组DNA，转基因学等方法。

相关申请的交叉参考

本发明要求2009年2月2日提交的标题为“用于区别性调节膜脂和种子油中脂肪酸不饱和性的组合物和方法”的美国临时专利申请系列号61/149,288，和2008年3月4日提交的具有相同标题的美国临时专利申请系列号61/033,742的优先权，将这二者通常参考整体结合于此。

关于联邦资助研究的声明

本发明是至少部分地在由美国农业部(USDA)颁发的政府资金2006-35318-17797和97-35301-4426支持下完成的，因此美国政府对本发明具有一定的权利。

背景

许多植物物种包括，例如，拟南芥(Arabidopsis thaliana)在它们的种子中储存三酰甘油(TAGs)作为碳储备。这些TAGs是在植物生命早期支持种子发育的主要能量和碳物质来源。来自大豆(Glycine max)，油菜(甘蓝型油菜或白菜型油菜)，向日葵(Helianthus annuus)和许多其他含油种子农作物的植物油也是人类饮食或工业应用包括，但不仅限于生物燃料、生物润滑剂、尼龙前体、和清洁剂原料的重要来源。植物油的多不饱和脂肪酸的程度和/或量是关于油在食品或非食品工业中应用的特有决定性特性。更具体地，植物油的特有特性和效用主要由其在TAG中的脂肪酰基组合物决定。

主要的植物油主要包括棕榈酸(16:0)，硬脂酸(18:0)，油酸(18:1cisΔ⁹)，亚油酸(18:2cisΔ^9，12)，和α-亚油酸(18:3cisΔ^9，12，15)。至少一个世纪以来试图寻求脂肪酸组合物的修饰，从而为人类营养和化学(例如油化学)应用提供最佳油产品(1-3)。具体地，多不饱和脂肪酸(18:2和18:3)已经受到大量关注，因为它们是影响营养价值和油稳定性的主要因素。然而，尽管这两种脂肪酸为人类和动物提供基本营养，但是它们增加油的不稳定性，因为它们包含多个在加工和保存过程中易被氧化的双键。

现有技术的局限性。18:1至18:2的去饱和作用是合成多不饱和脂肪酸的关键步骤。在保存脂质生物合成的过程中，已知该反应受脂肪酸去饱和酶FAD2，即一种位于内质网(ER)上的膜结合酶的催化(4)。FAD2底物18:1必须在磷脂酰胆碱(PC)，即植物细胞的主要膜磷脂的sn-2位置上酯化(5，6)。因此，不意外的是，FAD2(和FAD3)基因的下调成为避免对氢化植物油和不希望的副产物反式脂肪酸的需要的优选策略。例如，大豆具有种子特异性和组成型FAD2去饱和酶二者，因此种子特异性同种型的基因沉默容许产生高油酸的栽培种(在油中＞88％18:1)，在所述栽培种中膜不饱和性和植物表现主要不受影响。然而，显著地，所述FAD2基因沉默策略受到很大局限，因为，例如，油菜及其它含油种子植物仅具有组成型FAD2酶。因此，在油菜和其他所述组成型FAD2农作物中，FAD2的沉默或下调不仅改变种子中储存三酰甘油(TAG)的脂肪酸组成，而且改变细胞膜的脂肪酸组成，这严重危害植物的生长和产量。例如，拟南芥突变体fad2中的缺陷性FAD2改变种子和植物组织的脂肪酸组成，且严重危害植物生长(4)。在油中产生最高18:1水平的FAD2突变和沉默也减少植物和种子组织中的膜不饱和性，由此产生发芽和生长不良的植物。结果，仅部分下调FAD2表达是可能的，其在商业栽培种诸如Nexera/Natreon(Dow AgroSciences)和Clear Valley 75(Cargill)的油中产生约70-75％18:1。

因此，本领域中明确需要在不存在对膜脂成分不饱和性的有害变化的条件下，区别性调节植物种子油和膜脂中脂肪酸不饱和性的新型组合物和方法，和在种子油中具有减小的脂肪酸不饱和性的可生存植物(例如油菜等)。

示范性实施方案概述

具体方面提供在不存在对膜脂成分不饱和性的有害变化的条件下，区别性调节种子油和膜脂中脂肪酸不饱和性的新型组合物和方法。

另外的方面提供基于先前未知的生物合成途径的调节来区别性调节植物种子油和膜脂中脂肪酸不饱和性的组合物和方法，所述途径涉及在发育的含油种子植物(例如，拟南芥(Arabidopsis)，大豆(Glycine max)，油菜(白菜型油菜或甘蓝型油菜)，向日葵(Helianthus annuus)，等)中调节磷脂酰胆碱生物合成的新型磷脂酰胆碱:二酰甘油磷酸胆碱转移酶(PDCT)。

其他方面提供本发明的PDCT多肽包括，例如，其变体、缺失、突变蛋白、融合蛋白、和直向同源物(总的来说，PDCT蛋白)。

另外的方面提供包含所述PDCT序列或蛋白或缺乏或耗尽所述PDCT蛋白或序列的植物，和用于生成具有改变的或无PDCT表达和/或活性的植物的方法，包括但不仅限于包括诱变，基因沉默，反义，siRNA，重组DNA，转基因学等方法。

具有方面提供用于调节种子油中的脂肪酸不饱和性的方法，其包括：获得具有含油种子的植物；和调节至少一种磷脂酰胆碱:二酰甘油磷酸胆碱转移酶(PDCT)在所述植物的一个或多个种子或发育种子中的表达或活性，其中所述种子油中的脂肪酸不饱和性的水平、量或分布相对于具有PDCT正常种子表达的植物的种子油而变化。在某些实施方案中，调节至少一种PDCT的表达或活性包括下调所述表达或活性，其中所述种子油中的脂肪酸不饱和性的水平、量或分布改变，下降。优选地，所述方法包括相对于一种或多种膜脂中的脂肪酸不饱和性来区别性调节种子油中的脂肪酸不饱和性。优选地，在种子油中相对于一种或多种膜脂中的脂肪酸不饱和性区别性减小种子油中的脂肪酸不饱和性。

另外的方面提供产生具有含油种子的植物或其部分的方法，其包括赋予具有含油种子植物品种的种质突变或遗传变化，所述突变或遗传变化改变至少一种PDCT在所述植物的一个或多个种子或发育种子中表达或活性，其中所述种子油中的脂肪酸不饱和性的水平、量或分布相对于具有PDCT正常种子表达的植物的种子油而变化。

其他实施方案包括具有含油种子的植物或其部分，其包括突变或遗传变化，所述突变或遗传变化改变至少一种磷脂酰胆碱:二酰甘油磷酸胆碱转移酶(PDCT)在所述植物的一个或多个种子或发育种子中表达或活性，其中所述种子油中的脂肪酸不饱和性的水平、量或分布相对于具有PDCT正常种子表达的植物的种子油而变化。尽管突变或遗传变化可以是直接或间接改变PDCT表达和/或活性的突变或遗传变化，在具体方面，突变包括至少一种PDCT序列的突变，所述突变改变其在所述植物的一个或多个种子或发育种子中表达或活性，其中所述种子油中的脂肪酸不饱和性的水平、量或分布相对于具有PDCT正常种子表达的植物的种子油而变化。

另外的方面提供源自本文中提供的具有含油种子的植物或其部分的种子或纯育种子(true-breeding seed)。

其他方面提供源自本文中提供的具有含油种子的植物或其部分的油。

另外的实施方案提供至少部分地基于至少一种源自本文中提供的具有含油种子的植物或其部分的油的燃料(例如，生物燃料)。

附图简述

图1A-1D显示拟南芥发育种子中的脂质合成。发育种子用放射性乙酸(用于标记脂肪酸)(图1C和1D)和放射性甘油(用于标记脂质主链)(图1A和1B)来标记。用[14-C]标记的甘油(C)或乙酸酯(D)脉冲15min后，追踪进行180min。在0，30，60和180min时间点时确定PC，DG和TG中的放射性。

图1E-1H显示来自开花后9天的发育种子的TG，DG，PC和PE中rodl和WT之间的脂肪酸组成比较。

图2A-2C显示ROD1基因在拟南芥中被确定为At3g15820。

图2D显示基于图谱确定拟南芥染色体3上的ROD1基因座。

图3A-3C显示ROD1起磷脂酰胆碱:二酰甘油磷酸胆碱转移酶作用。

图4显示DH4中的ROD1突变体截短氨基酸序列(SEQ ID NO：5)。根据具体的方面，磷脂酰胆碱:二酰甘油磷酸胆碱转移酶(PDCT)突变体(rodl)编码序列(SEQ ID NO：4)在核苷酸位置228处包含G＞A改变，从而引起PDCT蛋白的过早终止，由此提供75个氨基酸的截短的ROD1突变体序列(SEQ ID NO：5)。

图5显示，根据具体的示范性方面，LPT家族成员之间的主要序列关系。根据具体方面，ROD1属于脂质磷酸酶/磷酸转移酶家族。

图6显示，根据具体的示范性方面，不同生物体中与拟南芥ROD1同源的已知的序列。根据具体方面，ROD1调节含油种子中二酰甘油和磷脂酰胆碱之间的平衡。

图7显示，根据具体的示范性方面，拟南芥和酵母细胞中ROD1和At3g15830表达的RT-PCR。泳道1-8是关于ROD1的结果，且泳道9-16是关于At3g15830的结果。RT-PCR样品是来自WT拟南芥的发芽苗(1，9)，嫩叶(2，10)，花(3，11)，长角果(4，12)和来自rodl突变植物的长角果(5，13)的总RNA；包含p424GPD(7，15)或p424ROD1(8)和p424-At3g15830(16)的酵母细胞；和来自rodl的基因组DNA。

图8显示，根据具体的示范性方面，拟南芥中ROD1基因的数字Northern分析。用于构建数字Northern的数据由Genevestigator站点(genevestigator.ethz.ch/)的AtGenExpress获得。信号强度对该图中包括的全部阶段进行平均化。

图9A-9G显示，根据具体的示范性方面，ROD1具有磷脂酰胆碱二酰甘油磷酸胆碱转移酶(PDCT)活性。(A)CPT测定的TLC图像。(B)PDCT测定的TLC图像。使用用p424GPD(V)或p424ROD1(R)转化的DBY746(WT)和HJ091酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞的微粒体，且所有实验中的TLC溶剂系统是：氯仿/甲醇/水＝65/25/4(体积)。底物，关于CPT是CDP-[14C]胆碱和二油精，关于PDCT分别是[14C-甘油]二18:1-DG和PC(0或1mM)。b＝煮沸的微粒体蛋白。(C)ROD1-转化的酵母微粒体在[14C-甘油]二18:1-DG分别与PC(0或1mM)，CDP-胆碱，磷酸胆碱和溶解-PC的反应中的PDCT活性。(D)用载体p424GPD(V)或p424ROD1(R)转化的HJ091细胞的微粒体用二14:0-PC[14C-胆碱]和二18:1-DG温育，以进行PDCT测定。(E)pH对PDCT活性的影响。(F-H)PDCT活性分别作为温育时间、添加的微粒体蛋白和PC函数的线性。数据表示三次独立反应的平均值和标准偏差。

示范性实施方案详述

另外的方面提供基于先前未知的生物合成途径的调节来区别性调节植物种子油和膜脂中脂肪酸不饱和性的组合物和方法，所述途径涉及在发育的含油种子植物(例如，拟南芥(Arabidopsis)，大豆(Glycine max)，油菜(甘蓝型油菜或白菜型油菜)，向日葵(Helianthus annuus)，等)中调节磷脂酰胆碱生物合成的新型磷脂酰胆碱:二酰甘油磷酸胆碱转移酶(PDCT)。

其他方面提供本发明的PDCT序列和多肽包括，例如，其突变体(例如，SEQ ID NOS：4和5)、变体、缺失、突变蛋白、融合蛋白、和直向同源物(总的来说，PDCT蛋白)。

另外的方面提供包含所述PDCT蛋白或缺乏或缺少所述PDCT序列或蛋白和/或活性的植物，和用于生成具有改变的或无PDCT表达和/或活性的植物的方法，包括但不仅限于包括诱变，基因沉默，反义，siRNA，重组DNA，转基因学等本领域公知方法。关于诱变剂和诱变种子或花粉的信息，例如在IAEA的Manual on Mutation Breeding(突变育种手册)(IAEA，1977)中介绍。在某些实施方案中，诱变包括化学诱变(例如包括用甲磺酸乙酯处理种子)。在下文中详细讨论有效用于提供本发明植物的多种植物育种法。

如下文中所述，本发明的具体的示范性方面提供在种子脂肪酸中具有减小的去饱和作用的拟南芥突变植物的遗传或生物化学特征(见以下实施例2的表1)。突变植物，最初确定并命名为DH4(7)，不能与其在标准条件下生长的亲本野生型Col-0植物相区分。申请人此处公开了编码PDCT的基因ROD1(Reduced Oleate Desaturation 1)，这种在DH4拟南芥突变体中的突变导致种子油中减小的油酸去饱和水平。DH4中的rodl等位基因是单隐性孟德尔突变，如通过遗传分析所确定地。如本文中所示(工作实施例2)，rodl突变体中的缺陷性PDCT活性导致发育种子中三酰甘油合成过程中减少的18:1脂肪酸到磷脂酰胆碱(PC)转化。该结果说明PDCT是调节脂质流到磷脂酰胆碱的主要因素，其中大部分脂肪酸修饰在含油种子中发生。

显著地，与fad2突变体相比(5，7)，DH4中的脂肪酸组成变化局限于种子油。

如下文中在工作实施例3中所述，本发明的具体的示范性方面显示DH4的拟南芥突变体rodl基因座被显示在种子油中介导减小的油酸去饱和作用，这归因于通过由二酰甘油(DAG)的从头合成减少的18:1至PC的转化。

根据另外的方面，如下文中实施例4中所述，对DH4的拟南芥突变体rodl进行精细绘图，且At3g15820(SEQ ID NO：2)在本文中确定为rodl突变体(SEQ ID NO：4)的基因座，且首次显示不仅是磷脂酰胆碱:二酰甘油磷酸胆碱转移酶(PDCT)，而且是在发育种子中高度表达的PCDT，其最高水平在种子发育的第6阶段，这与储存沉积的峰值阶段相一致。

显著地，At3g15820(SEQ ID NO：2)以前已经被注解为推定2型磷脂酸磷酸酶(PAP2)样蛋白。然而，意外地，根据申请人分析，其没有显示出与已知表征的拟南芥中的PAP基因(AtLPP1，AtLPP2和AtLPP3)(13，14)的强同源性，且本申请人在本文中确定ROD1基本不含与这些真PAP2直向同源物的序列同源性，并推断ROD1编码不同的功能。

本申请人在缺乏全部CDP-胆碱:二酰甘油磷酸胆碱转移酶活性的双突变酵母菌株HJ091(17)中，通过在可诱导的GAL1启动子的控制下表达At3g15820的cDNA来测试了ROD1的PDCt活性。如本文中详述地(实施例4)，这些结果说明ROD1不具有PA磷酸酶活性，且基本证实ROD1而是赋予PDCT活性，这与rodl突变体在发育种子中的PC合成中具有缺陷的事实相一致。

根据另外的方面，如在下文中的实施例5中所述，确定ROD1(At3g15820)直向同源物具有显著的序列同源性/同一性。实施例5的表2和3分别显示来自芸苔(Brassica)(SEQ ID NO：6；SEQ ID NO：7)，苔藓(Moss)(SEQ ID NO：16；SEQ ID NO：17)，云杉(Spruce)(SEQ ID NO：14；SEQID NO：15)，葡萄(Grape)(SEQ ID NO：12；SEQ ID NO：13)，稻米(Rice)(SEQID NO：10；SEQ ID NO：11)和蓖麻(Castor)(SEQ ID NO：8；SEQ ID NO：9)的示范性ROD1直向同源物的核苷酸相似性(％同一性)和蛋白序列相似性(％同一性)，其显示约46-80％的核酸同一性范围，和约42-85％的蛋白序列同一性范围。

根据另外的方面，如下文中实施例6中所述，甘蓝型油菜单基因Bna.6194确定为真拟南芥ROD1(At3g15820)同源物。申请人将Bna.6194命名为BnROD1。定量RT-PCR显示BnROD1在油菜发育种子中高度表达。甘蓝型油菜是双二倍体，包括白菜型油菜和甘蓝(Brassica oleracea)两种亚基因组。序列比对也提示BnROD1可能是白菜型油菜单基因Bra.2038和甘蓝ES948687的真同源物。

根据其他方面，如下文中实施例7中所述，如本文中提供的包含相对高浓度的具有适度不饱和性的长链脂肪的生物材料(例如，植物种子油)提供用于生产生物柴油及其相关产品，以及食物油的改良原料。

特别优选的示范性实施方案

具体方面提供调节种子油中脂肪酸不饱和性的方法，包括：获得具有含油种子的植物；和调节至少一种磷脂酰胆碱:二酰甘油磷酸胆碱转移酶(PDCT)在所述植物的一个或多个种子或发育种子中的表达或活性，其中所述种子油中的脂肪酸不饱和性的水平、量或分布相对于具有PDCT正常种子表达的植物的种子油而变化。在某些实施方案中，调节至少一种PDCT的表达或活性包括下调所述表达或活性，其中所述种子油中的脂肪酸不饱和性的水平、量或分布改变或下降。优选地，所述方法包括相对于一种或多种膜脂中的脂肪酸不饱和性来区别性调节种子油中的脂肪酸不饱和性。优选地，在种子油中相对于一种或多种膜脂中的脂肪酸不饱和性区别性减小种子油中的脂肪酸不饱和性。在具体的实施方案中，所述至少一种PDCT包括选自由以下组成的组的至少一种序列：SEQ ID NO：3，与其具有至少46％，至少48％，至少58％，至少64％，至少71％或至少85％氨基酸序列同一性的序列，及其PDCT活性部分。在某些实施方案中，所述至少一种PDCT包括选自由以下组成的组的至少一种序列：SEQ ID NOS：7，9，11，13，15，17，及其PDCT活性部分。在某些实施方案中，调节至少一种PDCT的表达或活性包括至少一种诱变和重组DNA方法的应用，包括但不仅限于基因沉默，反义法，siRNA法，转基因法中至少一种的应用。

另外的方面提供生产具有含油种子的植物或其部分的方法，包括赋予具有含油种子植物品种的种质突变或遗传变化，所述突变或遗传变化改变至少一种PDCT在所述植物的一个或多个种子或发育种子中表达或活性，其中所述种子油中的脂肪酸不饱和性的水平、量或分布相对于具有PDCT正常种子表达的植物的种子油而变化。本发明的具体实施方案包括：提供具有含油种子植物品种的种质；用诱变剂处理所述种质以生成诱变的种质；由所述诱变的种质中选择由所述诱变剂导致具有这样的基因型的具有含油种子的植物种子，所述基因型改变至少一种磷脂酰胆碱:二酰甘油磷酸胆碱转移酶(PDCT)在所述植物的一个或多个种子或发育种子中表达或活性，其中所述种子油中的脂肪酸不饱和性的水平、量或分布相对于具有PDCT正常种子表达的植物的种子油而变化；和由所述种子生长具有含油种子的植物。在本方法的具体执行中，生成诱变的种质包括生成至少一种磷脂酰胆碱:二酰甘油磷酸胆碱转移酶(PDCT)序列的突变，所述突变改变其在所述植物的一个或多个种子或发育种子中表达或活性，其中所述种子油中的脂肪酸不饱和性的水平、量或分布相对于具有PDCT正常种子表达的植物的种子油而变化。

另外的实施方案包括具有含油种子的植物或其部分，其包括突变或遗传变化，所述突变或遗传变化改变至少一种磷脂酰胆碱:二酰甘油磷酸胆碱转移酶(PDCT)在所述植物的一个或多个种子或发育种子中表达或活性，其中所述种子油中的脂肪酸不饱和性的水平、量或分布相对于具有PDCT正常种子表达的植物的种子油而变化。尽管突变或遗传变化可以是直接或间接改变PDCT表达和/或活性的突变或遗传变化，在具体方面，突变包括至少一种PDCT序列的突变，所述突变改变其在所述植物的一个或多个种子或发育种子中表达或活性，其中所述种子油中的脂肪酸不饱和性的水平、量或分布相对于具有PDCT正常种子表达的植物的种子油而变化。在某些方面，具有含油种子的植物或其部分是不同于拟南芥。优选地，在这样的植物中，调节至少一种PDCT的表达或活性包括下调表达或活性，其中所述种子油中的脂肪酸不饱和性的水平、量或分布改变，下降。优选地，调节表达或活性包括相对于一种或多种膜脂中的脂肪酸不饱和性来区别性调节种子油中的脂肪酸不饱和性。具体的植物实施方案包括两种以上不同突变或遗传变化，所述突变或遗传变化改变种子油中脂肪酸不饱和性的水平、量、或分布，其中所述两种以上不同突变或遗传变化中的至少一种是改变至少一种磷脂酰胆碱:二酰甘油磷酸胆碱转移酶(PDCT)在所述植物的一个或多个种子或发育种子中表达或活性的突变或遗传变化。在所述植物的具体实施方案中，所述两种以上不同突变中的至少一种是减小或消除种子或发育种子中FAD2活性或量的FAD2去饱和酶突变。在某些方面中，所述至少一种PDCT包括选自由以下各项组成的组的至少一种序列：SEQID NO：3，与其具有至少46％，至少48％，至少58％，至少64％，至少71％或至少85％氨基酸序列同一性的序列，及其PDCT活性部分。在具体实施方案中，所述至少一种PDCT包括选自由以下组成的组的至少一种序列：SEQ ID NOS：7，9，11，13，15，17，及其PDCT活性部分。

另外的方面提供源自本文中提供的具有含油种子的植物或其部分的种子或纯育种子。

另外的实施方案提供至少部分地基于源自本文中提供的具有含油种子的植物或其部分的油的燃料。

植物和植物育种

具体方面提供具有含油种子的植物或其部分，其包括突变或遗传变化，所述突变或遗传变化改变至少一种磷脂酰胆碱:二酰甘油磷酸胆碱转移酶(PDCT)在所述植物的一个或多个种子或发育种子中表达或活性，其中所述种子油中的脂肪酸不饱和性的水平、量或分布相对于具有PDCT正常种子表达的植物的种子油而变化。尽管突变或遗传变化可以是改变PDCT表达和/或活性的任何突变或遗传变化，在优选的方面，所述突变包括至少一种磷脂酰胆碱:二酰甘油磷酸胆碱转移酶(PDCT)序列的突变，所述突变改变其在所述植物的一个或多个种子或发育种子中表达或活性，其中所述种子油中的脂肪酸不饱和性的水平、量或分布相对于具有PDCT正常种子表达的植物的种子油而变化。

多种植物育种法也有效用于基于所述突变或遗传变化构建有效植物品种。

植物育种

另外的发明包括用于在植物育种中使用具有含油种子的植物的方法，所述植物包括改变至少一种磷脂酰胆碱:二酰甘油磷酸胆碱转移酶(PDCT)(如本文中提供的)在所述植物的一个或多个种子或发育种子中的表达或活性的突变，其中所述种子油中的脂肪酸不饱和性的水平、量或分布相对于具有PDCT正常种子表达的植物的种子油而变化。一个这样的实施方案是使具体PDCT突变品种与另一植物品种杂交，以形成第一代F1植物群。由该方法产生的第一代F1植物群也是本发明的实施方案。该第一代F1植物群应该包括基本整套具体PDCT突变品种的等位基因。本领域中的普通技术人员可以利用育种者书籍或分子方法来识别利用具体PDCT突变品种产生的具体F1植物，且任何这样的个体植物也属于本发明。这些实施方案还包括具体PDCT突变品种的转基因或回交转变用于产生第一代F1植物的应用。

另外的方面包括发育具体PDCT突变体-后代植物的方法，包括使具体PDCT突变品种与第二种植物杂交和执行育种方法，其也是本发明的实施方案。

一般性育种和选择法

总述。植物育种是植物的遗传操作。植物育种的目的是开发新型、独特且优越植物品种。在植物育种程序的具体应用中，且如下文中更具体讨论地，育种者最初选择并杂交两种以上亲本品系，随后重复“自交”和选择，产生许多新遗传组合。育种者理论上可以通过杂交、“自交”和天然诱导的突变生成数十亿不同的遗传组合。育种者对细胞水平不具有直接的控制，且因此两名育种者永远不会开发完全相同的品系。每年，植物育种者选择种质，以进展至下一代。该种质可以在独特且不同的地理、气候和土壤条件下生长，且进一步的选择可以在生长季过程中和结束时进行。

适当的测试可以检测主要缺陷和确定超越目前品种的优越性或改进水平。除显示优越表现外，对新品种的需要是理想的。新品种最好应该与工业标准相一致，或创建新的市场。新品种的引入可以对种子生产者、生长者、加工者和消费者引起另外的关于具体广告和行销、改变的种子和商业生产实践、和新产品利用的成本。该测试在释放新品种前应该考虑研究和开发成本以及最终品种的技术优越性。理想地，容易和经济地生产种子也应该是可行的。

术语“纯合植物”在此定义为在其基因座95％以上具有纯合基因的植物。

术语“近交”用于本文中时，意指纯合植物或纯合植物的集合。

育种或选择法的选择。育种或选择法的选择取决于植物繁殖的模式，改良特性的遗传力，和商业上所用品种的类型(例如，F1杂交品种、纯品系品种等)。对于高度可遗传的特性，在单位置处评估的优越个体植物选择应该是有效的，而对于具有低遗传力的特性，选择应该基于获自相关植物家族的重复评估的平均值。遗传复杂性也影响育种法的选择。育种通常由交叉杂交两种基因型(“育种杂交”)开始，每种基因型可以具有一种或多种所需特征，所述特征是另一基因型中所缺乏的或补充另一基因型。如果两种初始的亲本不提供所有所需的特征，则可以通过进行更多杂交引入其他来源。在每个连续杂交后代(例如，F1→F2；F2→F3；F3→F4；F4→F5，等)中，植物“自交”，以增加品系的纯合性。典型地，在育种程序中，进行5代以上选择和“自交”，以获得纯合植物。每个植物育种程序应该包括周期性客观评估育种步骤的效率。评估标准取决于目的和目标而变化，但应该包括基于与适当标准的比较每年来自选择的增加，先进育种品系的总价值，和每单位输入(例如，每年、每花费一元等)所产生的成功品系的数量。

回交转变

另外的实施方案包括或是具有含油种子的植物的回交转变，所述植物包括改变至少一种磷脂酰胆碱:二酰甘油磷酸胆碱转移酶(PDCT)(如本文中提供的)在所述植物的一个或多个种子或发育种子中的表达或活性的突变，其中所述种子油中的脂肪酸不饱和性的水平、量或分布相对于具有PDCT正常种子表达的植物的种子油而变化。当通过传统(非转化)育种技术，诸如回交引入DNA序列时，发生回交转变。DNA序列，无论是天然存在或转基因的，可以利用这些传统育种技术引入。通过该方法转移的所需特性包括，但不仅限于营养增强、工业增强、抗病性、抗昆虫性、抗除草剂性、农业增强、谷物质量增强、蜡质淀粉、育种增强、种子生产增强、和雄性不育。另外的实施方案包括或是开发回交转变植物的方法，其包括与所述PDCT突变体的重复回交。进行的回交次数可以是2，3，4，5，6次或更多，且所用回交的具体次数应该取决于供方亲本的遗传学，和是否在回交程序中使用分子标记。

基本衍生品种

本发明另一个实施方案是具有含油种子的植物的基本衍生品种，所述品种包括改变至少一种磷脂酰胆碱:二酰甘油磷酸胆碱转移酶(PDCT)(如本文中提供的)在所述植物的一个或多个种子或发育种子中的表达或活性的突变，其中所述种子油中的脂肪酸不饱和性的水平、量或分布相对于具有PDCT正常种子表达的植物的种子油而变化。如通过UPOV大会所确定地，基本衍生品种可以例如通过选择天然的或诱导的突变体或体细胞克隆变体，由最初品种植物选择变体个体，回交，或通过遗传工程转化来获得。所述PDCT突变体的基本衍生品种进一步定义为这样的品种，所述品种的产生需要对其进行反复使用，或其主要源自具体PDCT突变体的基因型。如1991年3月19日修改的International Convention for the Protection ofNew Varieties of Plants(国际植物新品种保护大会)，第V章，文章14，部分5(c)。

DNA构建体

本发明还预期制造DNA构建体(例如，表达载体、重组载体、反义构建体、siRNA构建体，等)，其包括分离的核酸序列，所述核酸序列包含来自公开的PDCT突变品种的遗传元件和/或编码序列，其与植物基因表达控制序列可操作连接。“DNA构建体”在本文中定义为有效用于将DNA引入宿主细胞的构建的(非天然存在的)DNA分子，且该术语包括嵌合基因、表达盒、和载体。

用于本文中时，“可操作连接”意指处于表达编码蛋白的方式的DNA序列(包括序列的顺序、序列的方向、和不同序列的相对间隔)连接。使表达控制序列与编码序列可操作连接的方法是本领域中公知的。参见，例如，Maniatis等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，Cold Spring Harbor(冷泉港)，N.Y.，1982；和Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，ColdSpring Harbor(冷泉港)，N.Y.，1989。

“表达控制序列”是以任何方式参与控制转录或翻译的DNA序列。合适的表达控制序列和制备和使用它们的方法是本领域中公知的。

表达控制序列优选包括启动子。启动子可以是可诱导的或组成型的。其可以是天然存在的，可以由多种天然存在的启动子的部分组成，或可以是部分或全部合成的。设计启动子的指导是通过研究启动子结构提供的，诸如Harley和Reynolds，Nucleic Acids Res.(核酸研究)，15，2343-2361，1987。而且，可以最优化启动子相对于转录起始的位置。参见，例如，Roberts等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)，76：760-764，1979。

许多适合用于植物中的启动子是本领域中公知的。例如，适合用于植物中的组成型启动子包括植物病毒启动子，诸如花生褪绿条死病花椰菜花叶病毒(PC1SV)启动子(美国专利号5,850,019)；来自花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S和19S启动子(Odell等，I313：3810-812，1985)；小球藻病毒甲基转移酶基因的启动子(美国专利号5,563,328)；来自玄参花叶病毒(FMV)的全长转录启动子(美国专利号5,378,619)；来自如稻米肌动蛋白的基因的启动子(McElroy等，Plant Cell(植物细胞)2：163-171(1990))，泛蛋白(Christiansen等，Plant Mol.Biol.(植物分子生物学)12：619-632，1989)，和(Christiansen等，Plant Mol.Biol.(植物分子生物学)18：675-689，1992)，pEMU(Last等，Theor.Appl.Genet.(理论和应用遗传学)81：581-588，1991)，MAS(Velten等，Embo J.3：2723-2730，1984)，小麦组蛋白(Lepetit等，Mol.Gen.Genet.(分子和普通遗传学)231：276-285，1992)，和Atanassova等，Plant Journal(植物杂志)2：291-300，1992)，甘蓝型油菜ALS3(国际公开号WO 97/41228)；和多种土壤杆菌属(Agrobacterium)基因的启动子(参见美国专利号4,771,002；5,102,796；5,182,200；和5,428,147)。

合适用于植物中的可诱导启动子包括：来自对铜响应的ACE1系统的启动子(Mett等，Proc.Natl.Acad.Sci.(美国国家科学院学报)90：4567-4571，1993)：对苯磺胺除草剂安全剂响应的小麦In 2基因的启动子(美国专利号5,364,780和Gatz等，Mol.Gen.Genet.(分子和普通遗传学)243：32-38，1994)，和来自Tn10的Tet阻抑物的启动子(Gatz等，Mol.Gen.Genet.(分子和普通遗传学)227：229-237，1991)。根据一个实施方案，用于植物中的启动子是对植物正常不对其响应的诱导剂响应的启动子。这种类型的示范性可诱导启动子是来自类固醇激素基因的可诱导启动子，其转录活性通过葡糖类固醇激素(Schena等，Proc.Natl.Acad.Sci.(美国国家科学院学报)88：10421，1991)或嵌合转录活化剂XVE用在由雌二醇活化的基于雌激素受体的可诱导植物表达系统中的应用(Zou等，Plant J.(植物杂志)24265-273，2000)来诱导。用于植物中的其他可诱导启动子记述在欧洲专利号332104，国际公开号WO 93/21334和国际公开号WO 97/06269中，并在Gatz和Lenk Trends Plant Sci.(植物科学趋势)，3：352-358，1998，和Zou和Chua，Curr.Opin.Biotechnol.(当前生物技术观点)，11：146-151，2000中讨论。最后，可以使用由其他启动子的部分和部分或全部合成的启动子组成的启动子。参见，例如，Ni等，Plant J.(植物杂志)7：661-676，1995，和国际公开号WO 95/14098，其描述所述用于植物中的启动子。

启动子可以包括，或被修饰以包括，一个或多个增强子元件。优选地，启动子应该包括多个增强子元件。含有增强子元件的启动子与不含有增强子元件的启动子相比，提供更高的转录水平。合适用于植物中的增强子元件包括PC1SV增强子元件(美国专利号5,850,019)，CaMV 35S增强子元件(美国专利号5,106,739和5,164,316)，和FMV增强子元件(Maiti等，Transgenic Res.(转基因研究)，6：143-156，1997).还参见，国际公开号WO96/23898和Enhancers and Eukaryotic Expression(增强子和真核表达)(Cold Spring Harbor Press(冷泉港出版社)，Cold Spring Harbor(冷泉港)，N.Y.，1983)。

为了有效表达，编码序列优选还与3’未翻译序列可操作连接。3’未翻译序列优选地包括转录终止序列和多腺苷酸化序列。3’未翻译区可以由来自土壤杆菌属(Agrobacterium)、植物病毒、植物和其他真核细胞的基因的旁侧区获得。合适用于植物的3’未翻译序列包括花椰菜花叶病毒35S基因、菜豆蛋白种子贮藏蛋白基因、豌豆核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亚基E9基因、小麦7S贮藏蛋白基因、章鱼碱合酶基因和胭脂氨酸合酶基因的那些。

还可以任选地使用5’未翻译前导序列。5’未翻译前导序列是mRNA的一部分，其由5’CAP位点延伸至翻译起始密码子。mRNA的这个区域是植物中翻译起始所必需的且在调节基因表达中起重要作用。合适用于植物中的5’未翻译前导序列包括苜蓿花叶病毒、黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因、和烟草花叶病毒的那些。

DNA构建体可以是“载体”。载体可以包含一种或多种容许其在宿主细胞中复制的复制系统。自我复制载体包括质粒、粘粒和病毒载体。备选地，载体可以是容许编码根腐病抗性基因产物的DNA序列整合进入宿主细胞染色体的整合载体。载体理想地还具有用于插入DNA序列的唯一限制性位点。如果载体不具有唯一的限制性位点，则可以对其进行修饰，以引入或消除限制性位点，以使其更适合于进一步操作。

适合用于表达核酸的载体包括但不仅限于pMON979、pMON977、pMON886、pCaMVCN、和由Rogers等，Meth.Enzymol.(酶学方法)，153：253-277，1987所述的源自根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的肿瘤诱导(Ti)质粒的载体，其在植物中表达时调节至少一种磷脂酰胆碱:二酰甘油磷酸胆碱转移酶(PDCT)(如本文中提供的)在所述植物的一个或多个种子或发育种子中的表达或活性，其中所述种子油中的脂肪酸不饱和性的水平、量或分布相对于具有PDCT正常种子表达的植物的种子油而变化。将核酸插入至载体中，以使其与合适的植物活性启动子可操作连接。适合与核酸一起使用的植物活性启动子包括，但不仅限于CaMV35S，ACTJN，FMV35S，NOS和PCSLV启动子。包含核酸的载体可以利用多种已知方法插入至植物细胞中。例如，植物细胞的DNA转化包括但不仅限于土壤杆菌属-介导的植物转化，原生质体转化，电穿孔，基因转移进入花粉，注射入生殖器，注射入不成熟胚胎和粒子轰击。这些方法更完整地记述在美国专利号5,756,290中，和美国专利号6,153,812及其中引用的参考文献中所述的关于小麦的特别有效的方案中。还可以使用位点特异性重组系统，以减少拷贝数和核酸进入植物基因组的随机整合。例如，Cre/lox系统可以用于介导植物细胞中的lox位点特异性重组。该方法可以至少参见Choi等，Nuc.AcidsRes.(核酸研究)28：B19，2000)。

转基因：

分子生物学技术容许分离和表征具有特定功能，诸如编码特定蛋白产物的遗传元件。植物生物学领域中的科学家在改造植物基因组以包含和表达外源遗传元件，或另外的，或修饰形式的天然或内源遗传元件，从而以特定方式改变植物特性的方面形成强烈的兴趣。利用转化插入基因组中的任何DNA序列，无论来自不同物种或来自相同物种，在本文中总称为“转基因”。已经开发了若干产生转基因植物的方法，且本发明，在具体实施方案中，也涉及本发明的基因型的转化形式和/或包含一种或多种转基因的转化形式直接或间接地改变至少一种磷脂酰胆碱:二酰甘油磷酸胆碱转移酶(PDCT)(如本文中提供的)在所述植物的一个或多个种子或发育种子中的表达或活性，其中所述种子油中的脂肪酸不饱和性的水平、量或分布相对于具有PDCT正常种子表达的植物的种子油而变化。

已经开发了许多植物转化方法，包括生物和物理植物转化方案。参见，例如，Miki等，“Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants(用于将外源DNA引入植物的程序)”在Methods in Plant Molecular Biology andBiotechnology(植物分子生物学和生物技术方法)中，Glick，B.R.和Thompson，J.E.编.(CRC Press，Inc.(CRC出版公司)，Boca Raton，1993)第67-88页。另外，存在植物的植物细胞或组织转化和再生的表达载体和体外培养方法。参见，例如，Gruber等，″Vectors for Plant Transformation(植物转化载体)″在Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology(植物分子生物学和生物技术方法)中，Glick，B.R.和Thompson，J.E.编.(CRC Press，Inc.(CRC Press，Inc.(CRC出版公司)，Boca Raton，1993)第89-119页。

最普遍的植物转化类型包括表达载体的构建。所述载体包括含有受调节元件，例如启动子控制或与其可操作连接的基因的DNA序列。载体可以含有一种或多种基因和一种或多种调节元件。可以利用转化将多种遗传元件引入植物基因组。这些元件包括但不仅限于基因；编码序列(有义或反义方向)；可诱导、组成型、和组织特异性启动子；增强序列；和信号和靶向序列。

利用转化技术改造到具体植物中的遗传特性可以利用植物育种技术中公知的传统育种技术转移到另一品系中。例如，回交法可以用于将转基因由转化的具有含油种子的植物转移至原种植物品种，并且由此产生的后代应该包含转基因。用于本文中时，“杂交”可以指简单的X和Y杂交，或回交过程，这取决于上下文。术语“育种杂交”排除自我或同胞过程。

利用根据本发明的转基因植物，可以以商业量生产外源蛋白和/或改变的表达的内源蛋白或产物(例如，油)。因此，本领域中公知的用于选择和繁殖转化植物的技术产生许多转基因植物，所述转基因植物以常规方式收获，且可以然后从目的组织或从总生物量中提取植物产物。由植物生物质提取蛋白和油可以通过已知方法实现，所述方法在例如Heney和Orr，Anal.Biochem.(分析生物化学)114：92-96，1981中讨论。

根据优选的实施方案，为了商业生产外源蛋白而提供的转基因植物是油菜(例如，甘蓝型油菜或白菜型油菜)，大豆(例如，Glycine max)，或向日葵(例如，Helianthus annuus)。在另一个优选实施方案中，目的生物量是种子。遗传图谱可以主要通过常规RFLP，PCR，和SSR分析产生，所述分析确定整合DNA分子的近似染色体位置。关于这一点的示范性方法，参见Glick和Thompson，Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology(植物分子生物学和生物技术方法)269-284(CRC Press，Boca Raton，1993)。关于染色体位置的图谱信息对于本发明转基因植物的所有权保护很有效。如果进行未经许可的繁殖和与其他种质进行杂交，则整合区的图谱可以与可疑植物的类似图谱进行比较，从而确定后者是否与本发明植物具有共同家系。图谱比较应该包括杂交、RFLP、PCR、SSR和测序，全部这些都是常规技术。

通过转化引入农业目标转基因

农业基因可以在转化植物中表达。例如，可以遗传改造植物，以表达多种农业目标表现型，或，备选地，转基因可以通过与具有该转基因的植物一起育种而引入至植物中。通过植物的转化，可以调节基因表达，以增强抗病性、昆虫抗药性、除草剂抗性、水压力耐受性和农业特性以及种子质量特性。转化还可以用于插入控制或帮助控制雄性不育的DNA序列。具体植物的天然DNA序列以及非天然DNA序列可以转化并用于调节天然或非天然蛋白的水平。反义技术，siRNA技术，多种启动子，靶向序列，增强序列，和其他DNA序列可以插入至具体基因组中，以获得调节蛋白表达的目的。在这一点上包括的许多示范性基因是本领域中已知的。磷脂酰胆碱:二酰甘油磷酸胆碱转移酶(PDCT)核酸和蛋白的变体

用于本文中时，“生物活性”指多肽的功能，包括但不仅限于配位作用、二聚作用、多聚作用、受体相关配体结合和/或内吞作用，受体相关蛋白酶活性、磷酸化作用、脱磷酸作用、自磷酸化作用、与其他分子形成复合物的能力、配体结合、催化或酶活性、活化作用包括自活化作用和其他多肽的活化作用、抑制或调节另一种分子功能、刺激或抑制信号转导和/或细胞响应诸如细胞增殖、转移、分化、和生长、退化、膜定位、和膜结合。生物活性可以通过本文中所述的测定和通过本领域中技术人员已知的任何合适测定来评估，包括但不仅限于体外测定，包括基于细胞的测定，体内测定，包括关于具体疾病的动物模型内的测定。

优选地，磷脂酰胆碱:二酰甘油磷酸胆碱转移酶(PDCT)，或其变体，包括SEQ ID NO：3的氨基酸序列(或具有1至约3，至约5，至约10，或至约20个保守氨基酸置换的SEQ ID NO：5的氨基酸序列)，或SEQ ID NO：3的序列(或具有1至约3，至约5，至约10，或至约20个保守氨基酸置换的SEQ ID NO：5的序列)的片段。优选地，磷脂酰胆碱:二酰甘油磷酸胆碱转移酶(PDCT)，或其变体，包括SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：5，或其保守氨基酸置换变体的序列。

功能性磷脂酰胆碱:二酰甘油磷酸胆碱转移酶(PDCT)，变体是表现出(或缺乏)磷脂酰胆碱:二酰甘油磷酸胆碱转移酶(PDCT)的一种或多种生物活性的那些蛋白。

用于本文中时，术语“野生型ROD1或PDCT”意指植物中存在的天然存在的ROD1或PDCT等位基因，其编码功能性ROD1或PDCT蛋白。相反，术语“突变ROD1或PDCT”，用于本文中时，意指不编码功能性ROD1或PDCT蛋白的ROD1或PDCT等位基因，即编码非功能性ROD1或PDCT蛋白或完全不编码ROD1或PDCT蛋白的ROD1或PDCT等位基因，所述非功能性ROD1或PDCT蛋白用于本文中时，意指无生物活性或具有与相对应的野生型功能性ROD1或PDCT蛋白相比显著降低的生物活性的ROD1或PDCT蛋白。所述“突变ROD1或PDCT等位基因”(也称为“全敲除”或“无效”等位基因)是野生型ROD1或PDCT等位基因，其在其核酸序列中包括一个或多个突变，由此突变优选地在体内导致细胞中功能性ROD1或PDCT蛋白(决定或相对)量的显著减少。编码ROD1或PDCT蛋白的核酸序列的突变等位基因在本文中命名为“rodl或pdct”。突变等位基因可以是“天然突变”等位基因，其是自然界中存在的突变等位基因(例如，在无人为使用诱变剂的条件下自发产生的)，或“诱导突变”等位基因，其由人为干扰，例如通过诱变来诱导。

用于本文中时，术语“野生型ROD1或PDCT”意指植物中存在的天然存在的ROD1或PDCT等位基因，其编码功能性ROD1或PDCT蛋白。相反，在具体方面，术语“突变ROD1或PDCT”，用于本文中时，意指不编码功能性ROD1或PDCT蛋白的ROD1或PDCT等位基因，即编码非功能性ROD1或PDCT蛋白，或完全不编码ROD1或PDCT蛋白的ROD1或PDCT等位基因，所述非功能性ROD1或PDCT蛋白用于本文中时，意指无生物活性或具有与相对应的野生型功能性ROD1或PDCT蛋白相比显著降低的生物活性的ROD1或PDCT蛋白。所述“突变ROD1或PDCT等位基因”(也称为“全敲除”或“无效”等位基因)是野生型ROD1或PDCT等位基因，其在其核酸序列中包括一个或多个突变，由此突变优选地在体内导致细胞中功能性ROD1或PDCT蛋白(决定或相对)量的显著减少。编码ROD1或PDCT蛋白的核酸序列的突变等位基因在本文中命名为“rodl或pdct”。突变等位基因可以是“天然突变”等位基因，其是自然界中存在的突变等位基因(例如，在无人为使用诱变剂的条件下自发产生的)，或“诱导突变”等位基因，其由人为干扰，例如通过诱变来诱导。

磷脂酰胆碱:二酰甘油磷酸胆碱转移酶(PDCT)的变体具有关于本发明多方面的效用。变体可以是天然或非天然存在的。天然存在的变体(例如，多态性)在多种物种中存在并包括与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列。蛋白的物种同源物可以利用本发明的亚基因组多核苷酸来获得，如下所述，以制备用于从其他物种，诸如小鼠、猴、酵母、或细菌中筛选cDNA表达文库，鉴定编码蛋白同源物的cDNA，和如本领域中已知地表达cDNA的合适探针或引物。直向同源物在本文中提供。

基本保持(或缺乏)与天然存在蛋白变体相同的生物活性的非天然存在变体也包括在此。优选地，天然或非天然存在变体具有与SEQ ID NOS：3或5中所示氨基酸序列至少85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或大于99％相同的氨基酸序列。更优选地，该分子至少98％，99％或大于99％相同。百分比同一性利用本领域中已知的任何方法来确定。非限制性实例是Smith-Waterman同源搜索运算法则，其利用亲和裂隙搜索，裂隙开放罚分12且裂隙延伸罚分1。Smith-Waterman同源搜索运算法则在Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.(现代应用数学)2：482-489，1981中教导。

用于本文中时，“氨基酸残基”意指当多肽在其肽键处化学消化(水解)时形成的氨基酸。本文中所述的氨基酸残基通常采用“L”异构形式。采用“D”异构形式的残基可以置换任何L-氨基酸残基，条件是该多肽保持所需的功能特性。NH2指多肽的氨基端存在的自由氨基基团。COOH指多肽的羧基端存在的自由羧基基团。与J.Biol.Chem.(生物化学杂志)，243：3552-59(1969)中所述的标准多肽命名法相一致，并被37C.F.R..§§.1.821-1.822采用，氨基酸残基的缩写显示在表2中：

表2-对应表

符号

1-字母	3-字母	氨基酸
			Y	Tyr	酪氨酸
G	Gly	甘氨酸
			F	Phe	苯丙氨酸
M	Met	甲硫氨酸
			A	Ala	丙氨酸
S	Ser	丝氨酸

I	Ile	异亮氨酸
			L	Leu	亮氨酸
T	Thr	苏氨酸
			V	Val	缬氨酸
P	Pro	脯氨酸
			K	Lys	赖氨酸
H	His	组氨酸
			Q	Gln	谷氨酰胺
E	Glu	谷氨酸
			Z	Glx	Glu和/或Gln
W	Trp	色氨酸
			R	Arg	精氨酸
D	Asp	天冬氨酸
			N	Asn	天冬酰胺
B	Asx	Asn和/或Asp
			C	Cys	半胱氨酸
X	Xaa	未知或其他

应该注意，本文中通过通式表示的全部氨基酸残基序列具有常规氨基端到羧基端方向的左到右的方向。另外，短语“氨基酸残基”定义为包括对应表中列出的氨基酸和修饰的和非普通氨基酸，诸如在37C.F.R..§§1.821-1.822中提到的，和通过参考结合于此的那些。此外，应该注意，氨基酸残基序列开头或结尾处的破折号表示与一个或多个氨基酸残基的其他序列或与氨基端基团诸如NH₂或与羧基端基团诸如COOH结合的肽。

确定在不破坏生物或免疫活性的条件下可以置换、插入、或缺失的氨基酸残基的指导可以利用本领域中公知的计算机程序，诸如DNASTAR软件得到。优选地，本文中公开的蛋白变体中的氨基酸改变是保守的氨基酸改变，即，置换类似带电或不带电的氨基酸。保守的氨基酸改变包括置换与其侧链中有关的氨基酸家族中的一员。天然存在的氨基酸一般分为4个家族：酸性(天冬氨酸，谷氨酸)，碱性(赖氨酸，精氨酸，组氨酸)，非极性(丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸)，和不带电极性(甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，胱氨酸，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸)氨基酸。苯丙氨酸，色氨酸，和酪氨酸有时共同分类为芳族氨基酸。优选地，猪磷脂酰胆碱:二酰甘油磷酸胆碱转移酶(PDCT)多肽变体中的氨基酸改变是保守氨基酸改变，即置换类似带电或不带电的氨基酸。

有理由预期单独地用异亮氨酸或缬氨酸替代亮氨酸，用谷氨酸替代天冬氨酸，用丝氨酸替代苏氨酸，或用结构相关氨基酸类似替代氨基酸应该对由此产生的变体的生物学特性没有很大影响。磷脂酰胆碱:二酰甘油磷酸胆碱转移酶(PDCT)多肽蛋白或多肽变体的性质和功能是与包含由SEQ IDNOS：3和5中所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列的蛋白相同的类型，尽管变体的性质和功能可以在一定程度上不同。

本文中公开的磷脂酰胆碱:二酰甘油磷酸胆碱转移酶(PDCT)多肽的变体包括糖基化形式、与其他分子的聚集缀合物、和与无关化学结构部分(例如，加入聚乙二醇的分子)的共价缀合物。共价变体可以通过使功能性与氨基酸链中或N-或C-端残基处存在的基团相联系来制备，如本领域中已知地。变体还包括等位基因变体，物种变体和突变蛋白。影响或不影响蛋白功能活性的区域的截短或缺失也是变体。共价变体可以通过使功能性与氨基酸链中或N-或C-端残基处存在的基团相联系来制备，如本领域中已知地。

突变体的一个子集，称为突变蛋白，是一组多肽，其中中性氨基酸，诸如丝氨酸，置换不参与二硫键的半胱氨酸残基。这些突变体可以在比天然分泌蛋白更宽的温度范围内稳定(参见，例如，Mark等，美国专利号4,959,314)。

本领域中应该公认本发明的磷脂酰胆碱:二酰甘油磷酸胆碱转移酶(PDCT)多肽的一些氨基酸序列可以在不显著影响蛋白结构或功能的条件下变化。如果预期所述序列差异，应该记住蛋白上存在决定活性的关键区域。一般地，可能替代形成三级结构的残基，条件是使用执行类似功能的残基。在其他实例中，残基的类型可能完全不重要，条件是变化发生在蛋白的非关键区域处。氨基酸的替代也可以改变与细胞表面受体结合的配体的选择性(Ostade等，Nature(自然)361：266-268，1993)。因此，本发明的磷脂酰胆碱:二酰甘油磷酸胆碱转移酶(PDCT)多肽可以包括一个或多个氨基酸置换、缺失或添加，其来自天然突变或人为操作。

本发明的磷脂酰胆碱:二酰甘油磷酸胆碱转移酶(PDCT)多肽中的对功能所必需的氨基酸可以通过本领域中已知的方法，诸如位点定向诱变或丙氨酸扫描诱变来鉴别(Cunningham和Wells，Science(科学)244：1081-1085(1989))。后一种方法在分子的每个残基处引入单丙氨酸突变。然后测试由此产生的突变分子的生物活性，诸如与天然或合成结合配偶体的结合。对于配体-受体结合非常关键的位点也可以通过结构分析诸如结晶化、核磁共振或光亲和标记来确定(Smith等，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)224：899-904(1992)和de Vos等Science(科学)255：306-312(1992))。

如所指出地，具体方面的变化优选是微小的性质，诸如不显著影响蛋白折叠或活性的保守氨基酸置换。当然，技术人员会进行的氨基酸置换的次数取决于许多因素，包括上述的那些。其他实施方案包括非保守置换。一般而言，对任何给定磷脂酰胆碱:二酰甘油磷酸胆碱转移酶(PDCT)多肽置换的次数应该不多于50，40，30，25，20，15，10，5或3。

融合蛋白

还可以构建包含磷脂酰胆碱:二酰甘油磷酸胆碱转移酶(PDCT)多肽的蛋白或多肽片段的融合蛋白。融合蛋白有效用于生成抗氨基酸序列的抗体和用在多种靶向和测定系统中。例如，融合蛋白可以用于鉴别与本发明的磷脂酰胆碱:二酰甘油磷酸胆碱转移酶(PDCT)多肽相互作用或干扰其生物功能的蛋白。物理方法，诸如蛋白亲合层析法，或基于文库的蛋白-蛋白相互作用测定，诸如酵母双杂交或噬菌体展示系统，也可以用于该目的。所述方法在本领域中公知的，且也可以用作药物筛选。可以使用包含信号序列的融合蛋白。

融合蛋白包含通过肽键融合在一起的两个蛋白区段。用于本发明融合蛋白中的氨基酸序列可以利用SEQ ID NOS：3或5中所示的氨基酸序列，或可以由SEQ ID NOS：3或5的生物活性变体，诸如上述那些制备。所述第一蛋白区段可以包括全长磷脂酰胆碱:二酰甘油磷酸胆碱转移酶(PDCT)多肽。其他第一蛋白区段可以由SEQ ID NOS：3和5的差不多功能性部分组成。

第二蛋白区段可以是全长蛋白或多肽片段。普遍用于融合蛋白结构的蛋白包括β-半乳糖苷酶，β-葡糖苷酸酶(β-glucuronidase)，绿色荧光蛋白(GFP)，自发荧光蛋白，包括蓝色荧光蛋白(BFP)，谷胱甘肽-S-转移酶(GST)，荧光素酶，辣根过氧化物酶(HRP)，和氯霉素乙酰转移酶(CAT)。另外，表位标记物可以用于融合蛋白结构中，包括组氨酸(His)标记物，FLAG标记物，流感血凝素(HA)标记物，Myc标记物，VSV-G标记物，和硫氧还蛋白(Trx)标记物。其他融合结构可以包括麦芽糖结合蛋白(MBP)，S-tag，Lex DNA结合结构域(DBD)融合体，GAL4DNA结合结构域融合体，和病毒蛋白融合体。

这些融合体可以例如通过共价连接两个蛋白区段或通过分子生物学领域中的标准方法制备。重组DNA方法可以用于制备融合蛋白，例如，通过制备DNA构建体，所述DNA构建体包括处于适当阅读框中的SEQ IDNOS：3和5的蛋白序列的编码区和编码第二蛋白区段的核苷酸，和在宿主细胞内表达DNA构建体，如本领域中已知地。许多用于构建融合蛋白的试剂盒可获自为研究实验室供应实验工具的公司，包括PromegaCorporation(Madison，WI)，Stratagene(La Jolla，CA)，Clontech(MountainView，CA)，Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，CA)，MBL InternationalCorporation(MIC；Watertown，MA)，和Quantum Biotechnologies(Montreal，Canada；1-888-DNA-KITS)。

编码突变ROD1或PDCT蛋白的核酸序列

相对于野生型核酸序列包含一个或多个核苷酸缺失、插入或置换的核酸序列是本发明的另一个实施方案，如所述突变核酸分子的片段。所述突变核酸序列(称为ROD1或PDCT序列)可以利用多种已知方法产生和/或鉴别，如下文中进一步所述。此外，所述核酸分子以内源型和隔离型提供。在一个实施方案中，突变导致编码的ROD1或PDCT蛋白的氨基酸序列中的一个或多个改变(缺失、插入和/或置换)(即，其不是“沉默突变”)。在另一个实施方案中，核酸序列中的突变导致编码的ROD1或PDCT蛋白相对于野生型蛋白显著减小的或完全破坏的生物活性。

核酸分子因此可以包括一个或多个突变，诸如：

(a)“错义突变”，其是核酸序列中导致氨基酸置换为另一种氨基酸的改变；

(b)“无义突变”或“终止密码子突变”其是核酸序列中导致引入过早的终止密码子并由此终止翻译(导致截短的蛋白)的改变；植物基因包含翻译终止密码子“TGA”(RNA中UGA)、“TAA”(RNA中UAA)和“TAG”(RNA中UAG)；因此导致这些密码子之一处于被翻译的成熟mRNA中(阅读框中)的任何核苷酸置换、插入、缺失将终止翻译。

(c)一个或多个氨基酸的“插入突变”，其归因于在核酸的编码序列中添加了一个或多个密码子；

(d)一个或多个氨基酸的“缺失突变”，其归因于在核酸的编码序列中缺失了一个或多个密码子；

(e)“移码突变”，其导致核酸序列在突变下游的不同读框中翻译。移码突变可以具有不同的原因，诸如一个或多个核苷酸的插入、缺失或复制。

理想地，核酸序列中的突变优选导致具有显著减小体内生物活性或无体内生物活性的突变蛋白或导致不产生蛋白。基本上，导致相对于野生型蛋白包括至少一个氨基酸插入、缺失和/或置换的蛋白的任何突变可以导致显著减小的或无生物活性。然而，理解在蛋白某些部分中的突变更可能导致突变ROD1或PDCT蛋白的减小的功能，诸如引起截短的蛋白的突变，由此缺少功能结构域的大部分。

因此，在一个实施方案中，提供包括一个或多个上述任意类型突变的核酸序列。在另一个实施方案中，提供包括一个或多个终止密码子(无义)突变，一个或多个错义突变和/或一个或多个移码突变的ROD1或PDCT序列。提供任何以上突变核酸序列本身(处于隔离型)，也提供内源性包含所述序列的植物和植物部分。在下文的表中，描述最优选的ROD1或PDCT等位基因。

ROD1或PDCT等位基因中的无义突变，用于本文中时，是ROD1或PDCT等位基因中这样的突变，通过该突变一个或多个翻译终止密码子被引入相应野生型ROD1或PDCT等位基因的编码DNA和相应mRNA序列中。翻译终止密码子是TGA(mRNA中UGA)，TAA(UAA)和TAG(UAG)。因此，导致在编码序列中生成符合读框的终止密码子的任何突变(缺失、插入或置换)应该导致翻译的终止和氨基酸链的截短。在一个实施方案中，包括无义突变的突变ROD1或PDCT等位基因是这样的ROD1或PDCT等位基因，其中符合读框的终止密码子通过单核苷酸置换，诸如CAG到TAG，TGG到TAG，TGG到TGA，或CAA到TAA的突变引入至ROD1或PDCT密码子序列中。在另一个实施方案中，包括无义突变的突变ROD1或PDCT等位基因是这样的ROD1或PDCT等位基因，其中符合读框的终止密码子通过双核苷酸置换，诸如CAG到TAA，TGG到TAA，或CGG到TAG或TGA的突变引入至ROD1或PDCT密码子序列中。在另一个实施方案中，包括无义突变的突变ROD1或PDCT等位基因是这样的ROD1或PDCT等位基因，其中符合读框的终止密码子通过三核苷酸置换，诸如CGG到TAA的突变引入至ROD1或PDCT密码子序列中。截短的蛋白缺少由突变下游的编码DNA编码的氨基酸(即ROD1或PDCT蛋白的C端部分)并保持由突变上游的编码DNA编码的氨基酸(即ROD1或PDCT蛋白的N端部分)。

下文中的表描述本文中提供的ROD1或PDCT序列中的一定范围的可能的无义突变：

表1a At-ROD1(SEQ ID NO：1)中的潜在终止密码子突变

表2b来自甘蓝型油菜(SEQ ID NO：....)的ROD1直向源物中的潜在终止密码子突变

明显地，突变不仅限于上表中所示的那些，并应该理解除序列表中所述的和上表中提到的那些外，类似的终止突变可以存在于ROD1或PDCT等位基因中。

ROD1或PDCT等位基因中的错义突变，用于本文中时，是ROD1或PDCT等位基因中的任意这样的突变(缺失、插入或置换)，通过所述突变改变相应野生型ROD1或PDCT等位基因的编码DNA和相应mRNA序列中的一个或多个密码子，由此导致野生型ROD1或PDCT蛋白中的一个或多个氨基酸置换突变ROD1或PDCT蛋白中的一个或多个氨基酸。

ROD1或PDCT等位基因中的移码突变，用于本文中时，是ROD1或PDCT等位基因中这样的突变(缺失、插入、复制等)，所述突变导致核酸序列在突变下游的不同读框中翻译。

ROD1的下调：

本领域中存在若干用于产生沉默RNA分子，即在其表达时减少具体基因或基因组表达的RNA分子的方法，包括所谓的“有义”或“反义”RNA技术。

反义技术。因此，在一个实施方案中，编码嵌合基因的抑制性RNA分子基于所谓的反义技术。换言之，嵌合基因的编码区包括ROD1或其直向同源物的核苷酸序列的补体的至少19或20个保守核苷酸的核苷酸序列。所述嵌合基因可以通过使包含来自ROD1编码基因或其直向同源物的至少19或20个核苷酸的DNA片段，以反转方向与植物可表达启动子和参与转录终止和多腺苷酸化的3’末端形成区可操作连接来构建。

共抑制技术。在另一个实施方案中，编码嵌合基因的抑制性RNA分子基于所谓的共抑制技术。换言之，嵌合基因的编码区包括ROD1编码基因或其直向同源物(或在一些实施方案中，纤维选择性β-1，3内切葡聚糖酶基因)的核苷酸序列的至少19或20个保守核苷酸的核苷酸序列。所述嵌合基因可以通过使包含来自ROD1编码基因或其直向同源物的至少19或20个核苷酸的DNA片段，以顺行方向与植物可表达启动子和参与转录终止和多腺苷酸化的3’末端形成区可操作连接来构建。

上述嵌合基因减少ROD1编码基因或其直向同源物(或在一些实施方案中，纤维选择性β-1，3内切葡聚糖酶基因)表达的效率可以进一步通过包含DNA元件来增强，所述DNA元件导致异常、未多腺苷酸化抑制性RNA分子的表达或导致抑制性RNA分子在细胞核中保持。一种所述适合于该目的的DNA元件是编码自剪接核酶的DNA区，如WO 00/01133中所述(通过参考将其整体和特别是其关于自剪接核酶的教导结合于此)。另一种所述适合于该目的的DNA元件是编码RNA核定位或保持信号的DNA区，如以WO03/076619公开的PCT/AU03/00292中所述(通过参考结合)。

双链RNA(dsRNA)或干扰RNA(RNAi)。一种方便且非常有效的下调目的基因表达的方法使用所谓的双链RNA(dsRNA)或干扰RNA(RNAi)，如在WO99/53050中所述(通过参考将其整体和特别是其关于RNAi的教导结合于此)。在该技术中，将RNA分子引入至植物细胞中，由此RNA分子能够在至少约19-约21个核苷酸的范围内形成双链RNA区，且由此该双链RNA的一条链与靶基因的核苷酸序列近似一致(“有义区”)，而另一条链与靶基因或所述有义区的补体的核苷酸序列近似一致(“反义区”)。预期为了沉默靶基因表达，19个保守核苷酸序列的核苷酸序列可以具有一个错配，或所述有义和反义区可以有一个核苷酸的区别。为了实现所述RNA分子或编码嵌合基因的构建，可以使用如WO 02/059294中所述的载体。

因此，在本发明的一个实施方案中，提供一种用于调节种子油中脂肪酸不饱和性的方法，其包括将嵌合基因引入植物细胞的步骤，其中所述嵌合基因包括以下可操作连接的DNA元件：

(a)植物可表达启动子；

(b)转录的DNA区，其在转录时产生能够特定减少ROD1或其直向同源物表达的双链RNA分子，和包括第一和第二RNA区的RNA分子，其中

i)所述第一RNA区包括至少19个保守核苷酸的核苷酸序列，其与ROD1或其直向同源物的核苷酸序列具有至少约94％的序列同一性；

ii)所述第二RNA区包括与所述第一RNA区的至少19个保守核苷酸互补的核苷酸序列；

iii)所述第一和第二RNA区能够碱基配对，从而在所述第一和第二区的至少19个保守核苷酸之间形成双链RNA分子；和

c)3’末端区，其包括在植物细胞中起作用的转录终止和多腺苷酸化信号。

所述第一或第二RNA区(有义或反义区)的长度可以从约19个核苷酸(nt)到至多与参与胼胝体去除的内源基因长度(核苷酸数)相等的长度范围内变化。有义或反义核苷酸序列的总长度可以因此是至少25nt，或至少约50nt，或至少约100nt，或至少约150nt，或至少约200nt，或至少约500nt。预期不存在对有义或反义核苷酸序列总长度的上限。然而，为了实践原因(诸如例如嵌合基因的稳定性)，预期有义或反义核苷酸序列的长度应该不超过5000nt，特别地应该不超过2500nt且可以限制到约1000nt。

应该理解，有义或反义区的总长度越长，这些区域和ROD1基因及其直向同源物或其补体的相应序列之间的序列同一性要求越不严格。优选地，目的核酸应该与相应靶序列具有至少约75％，特别地至少约80％，更特别地至少约85％，相当特别地约90％，特别约95％，更特别约100％的序列同一性，非常特别地与靶序列或其补体的相应部分一致。然而，优选地，目的核酸通常包括约19个保守核苷酸，特别地约25nt，更特别地约50nt，特别约100nt，相当特别约150nt的序列，所述保守核苷酸与靶核酸的相应部分具有100％序列同一性。优选地，为了计算序列同一性和设计相应的有义或反义序列，应该最小化裂隙数，特别是对于较短的有义序列。

根据本发明的dsRNA编码嵌合基因可以包括内含子，诸如异源内含子，其位于例如根据WO 99/53050(通过参考结合于此)公开的有义和反义RNA区之间的间隔序列中。

合成微小RNAs(miRNAs)。合成微小RNA下调植物细胞中具体基因表达的应用提供非常高的靶基因序列特异性，并因此方便地容许在密切相关的等位基因之间区分待下调其表达的靶基因。

因此，在本发明的另一个实施方案中，生物活性RNA或沉默RNA或抑制性RNA分子可以是微小RNA分子，其被设计、合成和/或调节为靶向和引起植物中的分裂ROD1编码基因或其直向同源物。已经描述了多种生成和使用关于特定靶基因的miRNA的方法(包括但不仅限于Schwab等(2006，Plant Cell(植物细胞)，18(5)：1121-1133)，WO2006/044322，WO2005/047505，EP 06009836，通过参考将其整体，和特别是其各自关于miRNA的教导全部结合与此)。通常，在靶基因识别部分中修饰现有的miRNA支架，从而使产生的miRNA现在指导RISC复合物将转录的RNA分子与靶核酸分裂。miRNA支架可以被修饰或合成，以使得miRNA现在包括ROD1编码核苷酸序列或其直向同源物的21个保守核苷酸，诸如序列表中表示的序列，并且容许按照下文所述的规则错配。

因此，在一个实施方案中，本发明提供一种调节种子油中脂肪酸不饱和性的方法，其包括以下步骤：

a.将嵌合基因引入具有含油种子的植物的细胞中，所述嵌合基因包括以下可操作连接的DNA区：

i.植物可表达启动子；

ii.DNA区，其在植物细胞中引入和转录时被加工为miRNA，由此所述miRNA能够识别和指导所述植物的ROD1编码基因或其直向同源物的mRNA的分裂；和

iii.任选地，参与转录终止和多腺苷酸化的3’DNA区。

所述被加工为miRNA的DNA区可以包括与ROD1编码基因或其直向同源物的至少21个保守核苷酸的核苷酸序列基本互补的核苷酸序列，条件是容许一个或多个以下错配：

a.在miRNA的5’末端处的核苷酸和RNA分子中相应核苷酸序列之间的错配；

b.在miRNA的1位-9位中任一个核苷酸和RNA分子中相应核苷酸序列之间的错配；和/或

c.在miRNA的12位-21位中任一个核苷酸和RNA分子中相应核苷酸序列之间的3个错配，条件是不存在多于2个保守错配。

用于本文中时，“miRNA”是长度约20-22个核苷酸的RNA分子，其可以被加载到RISC复合物中并指导另一个RNA分子的分裂，其中所述另一个RNA分子包括与miRNA分子的核苷酸序列基本互补的核苷酸序列，由此可以发生一个或多个以下错配：

d.在所述miRNA的5’末端处的核苷酸和靶RNA分子中相应核苷酸序列之间的错配；

e.在所述miRNA的1位-9位中任一个核苷酸和靶RNA分子中相应核苷酸序列之间的错配；

f.在所述miRNA的12位-21位中任一个核苷酸和靶RNA分子中相应核苷酸序列之间的3个错配，条件是不存在多于2个保守错配；和/或

g.在miRNA的10和11位处不容许错配(所有miRNA位置由miRNA分子的5’末端开始表示)。

miRNA由“前miRNA”分子，通过任何植物细胞中存在的的蛋白，诸如DicerLike(DCL)蛋白加工而来，并加载在RISC复合物上，在此可以指导靶RNA分子的分裂。

用于本文中时，“前miRNA”分子是约100-约200个核苷酸，优选约100-约130个核苷酸的RNA分子，其可以采用二级结构，所述二级结构包括双链RNA干和单链RNA环且还包括该双链RNA干中的miRNA(及其补体序列)的核苷酸序列。优选地，miRNA及其补体位于距miRNA双链RNA干自由末端约10-约20个核苷酸的位置。单链环区域的长度和序列不是关键的，且可以，例如在长度30-50nt之间相当大地变化。优选地，未配对和配对的RNA结构之间的自由能差别为-20至-60kcal/摩尔，特别地约-40kcal/摩尔。miRNA和miRNA*之间的互补性不需要是完美的，且可以容忍约1-3个未配对核苷酸凸起。RNA分子采用的二级结构可以通过本领域中的常规计算机运算法则，诸如mFOLD来预测。来自前miRNA的双链RNA干的由DCL活性释放并加载在RISC复合物上的具体链通过5’末端处的互补性程度确定，由此将在其5’末端处最少参与分裂的dsRNA干的不同链核苷酸之间氢键的链加载在RISC复合物上并确定靶RNA分子降解的序列特异性。然而，如果经验上，来自具体合成前miRNA分子的miRNA分子不是功能性的(因为将“错”链加载在RISC复合物上，则应该直接证明这个问题可以通过交换miRNA分子和其补体在各自的前miRNA dsRNA干的链上的位置而得以解决。如本领域中已知地，A和U之间涉及2个氢键的结合，或G和U之间涉及2个氢键的结合不如G和C之间涉及3个氢键的结合强。

天然存在的miRNA分子可以包含在它们的天然存在的前miRNA分子内，但是它们也可以通过将由所述现有前miRNA分子正常加工而来的miRNA分子的核苷酸序列换成另一种目的miRNA的核苷酸序列而被引入现有前miRNA分子支架中。前miRNA的支架也可以是完全合成的。同样地，合成miRNA分子可以包含在现有前miRNA分子支架或合成前miRNA支架内，和由其加工而来。

前miRNA分子(且因此还有miRNA分子)可以通过提供具有这样的基因的植物细胞而被方便地引入至植物细胞中，所述基因包括与DNA区可操作连接的植物可表达启动子，所述基因转录时产生前miRNA分子。植物可表达启动子可以是与前miRNA分子天然相关的启动子或其可以是异源启动子。

实施例1

(材料与方法)

植物材料。拟南芥(Arabidopsis thaliana)Col-0背景中的突变品系rodl由用甲磺酸乙酯诱变后的约3,000株植物M3群，通过由气相色谱法直接分析种子样品的脂肪酸组成来分离(1)。植物在土壤上，在人工气候室(controlled environment chamber)中，22℃，连续荧光照射下生长(150μmol量子/m²/s)。

脂肪酸和脂质分析。如(2)所述确定种子和其他组织的总脂肪酸组成。脉冲-追踪标记在发育在开花后9天时由长角果收获的种子中进行。种子用[1-¹⁴C]甘油或[1-¹⁴C]乙酸酯脉冲15min。标记后，组织用未标记的乙酸酯或甘油来追踪。在不同时间间隔时，提取总脂质并在硅石-TLC中分析，并如(3)所述地通过闪烁计数确定PC，DG和TG中的放射性。

ROD1的遗传分析和基于图谱的克隆。为了确定rodl突变的遗传基础，将rodl植物与Col-O野生型(WT)杂交。F1种子表现出与WT亲本类似的脂肪酸特征。生长F1植物，并容许其自交。在分析的263株F2植物中，69株具有与初始rodl种子类似的种子脂肪酸特征，而剩余194株具有与WT类似的脂肪酸组成。这种分离模式良好地适合假设的3∶1比率(χ²＝0.21，p＞0.05)。

rodl基因座通过基于图谱的克隆，利用800株源自rodl突变体与Landsberg erecta WT杂交的F2植物来鉴定。通过一组20个在拟南芥基因组中均匀分布(4)的简单序列长度多态性(SSLP)标记物的分离群体分离法(bulk segregant analysis)进行的最初筛选导致染色体3中rodl与标记物NGA162连接(图2D)。为了精细绘图rodl基因座，鉴定196株单独的F2植物，其通过种子脂肪酸组成增高18∶1说明，在rodl基因座处纯合。利用邻近NGA162存在的多态性SSLP标记物的分离分析将rodl突变限定在NGA162和NT204之间的间隔。然后利用PCR引物设计更多多态性标记物，并随后将rodl基因座定位在由BAC克隆MJK13，MQD17和MSJ11涵盖的染色体3的区域内(图2D)。

在该区域内，将8个基因注解为具有已知的或可能的脂质代谢功能的编码蛋白。在考虑公开的信息后(5，6)，本申请人通过PCR扩增与这些基因中的6个，包括At3g15820相对应的rodl基因组DNA。在该基因中鉴定G→A转变，其被预测将Trp⁷⁶改变为终止密码子。剩余的5个基因不显示与WT的变化。

为了验证作为rodl基因座的At3g15820，含有At3g15820基因的3,961bp的PCR片段利用由Col-O WT植物提取的基因组DNA来扩增。将该基因组片段克隆至二元载体pGate-Phas-DsRed中AflII和EcoRI位点处(2)，并然后转移至根瘤土壤杆菌菌株GV3101(pMP90)中，用于rodl突变植物的转化。转化体基于DsRed表达来选择(7)。源自10个红色转基因种子和3个褐色非转基因种子的单独种子的脂肪酰甲酯用于利用气相色谱法来确定种子脂肪酸组成。

ROD1酶活性测定。ROD1可读框通过PCR扩增并克隆至p424GPD酵母表达载体中(8)，从而用于在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，在磷酸甘油醛脱氢酶启动子的控制下表达。将由此产生的构建体p424ROD1和空p424GPD载体分别转化至Dr.C.McMaster(DalhousieUniversity，NS，加拿大)友情提供的HJ091(cpt1::LEU2，ept1-)的细胞中。ROD1转录物的表达通过RT-PCR验证(图7)。

酵母细胞由过夜培养物接种并通过旋转摇动，在30℃，缺乏尿嘧啶和色氨酸、增补2％葡萄糖的液态合成基本培养基中生长至中对数期(OD₆₀₀＝0.5-1.5)(Clontech，Mountain View，CA)。为了制备微粒体，通过在1,000g离心10min收获酵母细胞。细胞沉淀物用无菌水清洗一次并重新悬浮在冰冷的GTE缓冲液(20％甘油，50mM Tris-HCl(pH 7.4)，1mM EDTA)中，从而如(9)所述利用玻璃珠制备膜级分。CDP-胆碱:二酰甘油磷酸胆碱转移酶(CPT)测定(图9A中的反应)如(9)所述，利用0.1μmol二油精和1nmol[¹⁴C]CDP-胆碱作为底物进行。

磷脂酰胆碱:二酰甘油磷酸胆碱转移酶(PDCT)在用p424GPD(模拟)或p424ROD1转化的HJ091细胞的膜制剂中的活性被确定为由[¹⁴C-甘油]二油精(反应A)或[14C-胆碱]二肉豆蔻基-磷脂酰胆碱(反应B)生产的[¹⁴C]二油酰基-PC的量。底物1.8nmol(200,000cpm)[¹⁴C-甘油]二油精(AmericanRadiolabeled Chemicals(美国放射标记化学制品)，St.Louis，MO)和0.1μmol二油酰基-PC(反应A)或0.1μmol二油精和1nmol[¹⁴C-胆碱]二-14:0-PC和0.1μmol二油酰基-PC(反应B)在氮气下干燥并借助于超声波浴重新悬浮在50μl 4×反应缓冲液(终浓度：50mM MOPS/NaOH pH 7.5，20mM MgCl₂，0.45％Triton X-100)中(9)。反应(200μl)通过加入悬浮在GTE缓冲液中的20-250μg微粒体蛋白起始。除非另外指出，测定在15℃温育15min并通过添加3ml氯仿/乙醇(2∶1，v/v)及随后1.5ml 0.9％KCl来终止。通过涡旋使管混合并且通过在2000g离心2min来促进相分离。吸出水相，并用1.5ml 40％(v/v)乙醇清洗有机相2次。样品通过氯仿/甲醇/水(65∶25∶4，基于体积)溶剂系统中硅胶板上的TLC，及随后的感光成像仪分析或放射自显照相术来分析。刮下相应的条带并通过闪烁计数确定放射性。

ROD1和At3g15830的表达。ROD1(affymetrixarrayelement258249_s_at)数据库的表达数据显示在图8中。相同的数组元素也检测第二基因At3g15830的转录物，但是来自拟南芥大规模平行信号序列(MassivelyParallel Signal Sequence(MPSS))数据库(mpss.udel.edu/at/)的数据显示该第二基因仅在花组织中表达(数据未显示)。为了验证这些数据，本申请人由WT植物的发芽的幼苗、莲座叶、花和绿色长角果，以及Rodl突变植物的绿色长角果制备RNA。利用特异于ROD1和At3g15830的寡核苷酸引物，对每种RNA样品，利用Superscript III一步系统，按照制造商(Invitrogen，Carlsbad，CA)的说明进行反转录PCR(RT-PCR)。图7中所示的结果显示At3g15830的表达局限于花且该基因的转录物不能在WT或rodl植物的发育的长角果中检测到。为了测试At3g15830是否还具有PDCT活性，如上所述将cDNA克隆至p424GPD载体中。然后将由此产生的构建体p424-At3g15830转化到HJ091中并通过RT-PCR验证其表达(图7，泳道16)。利用对ROD1相同的反应条件的PDCT测定不产生放射性标记的PC，这说明At3g15830蛋白不具有PDCT活性(数据未显示)。

系统发育分析。用于生成简约自引树(parsimony bootstrap tree)(10)的方法包括1000个自引复制数据组，其分别利用树二分重接(tree bisectionreconnection)、最急剧升降的适合性(steepest decent)、和其他用于最大化整体最适度检测或最大化简约最优性标准的设置来分析。

用于生成贝叶斯共有树(Bayesian consensus tree)的方法(11)包括关于最复杂的WAG+F+I+G氨基酸置换模型的优先设置并使两个马尔可夫链(Markov chains)分别运行1,000,000代(足以使2个单独运行在制备第二参数样品前会聚)，同时在相似稳态下，每10,000代取样，从而避免自相关参数评估。

本文中关于该实施例1引用和结合的参考文献

1.B.Lemieux，M.Miquel，C.Somerville，J.Browse，Theor.Appl.Genetics(理论和应用遗传学)80，234(1990).

2.C.Lu，M.Fulda，J.G.Wallis，J.Browse，Plant J.(植物杂志)45，847(2006).

3.C.R.Slack，P.G.Roughan，N.Balasingham，Biochem.J.(生物化学杂)170，421(1978).

4.W.Lukowitz，C.S.Gillmor，W.R.Scheible，Plant Physiol.(植物生理学)123，795(2000).

5.L.Fan，S.Zheng，X.Wang，Plant Cell(植物细胞)9，2183(1997).

6.I.Heilmann，S.Mekhedov，B.King，J.Browse，J.Shanklin，PlantPhysiol.(植物生理学)136，4237(2004).

7.A.R.Stuitje，Plant Biotech.J.(植物生物技术杂志)1，301(2003).

8.D.Mumberg，R.Müller，M.Funk，Gene(基因)156，119(1995).

9.R.Hjelmstad，R.Bell，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)266，4357(1991).

10.D.L.Swofford.PAUP*.Phylogenetic Analysis Using Parsimony(利用简约的系统发育分析)(*和其他方法)，第4版(Sinauer Associates，Sunderland，MA，2003).

11.F.Ronquist，J.P.Huelsenbeck，Bioinformatics(生物信息学)19，1572(2003).

实施例2

(显示拟南芥突变体rodl种子中具有明显减少的多不饱和脂肪酸)

表1A和1B显示DH4的拟南芥突变rodl种子中具有明显减少的多不饱和脂肪酸(PUFA)。rodl突变体的种子脂肪酸组成与拟南芥野生型(WT)和fad2突变体的种子脂肪酸组成不同。与fad2突变体(5，7)相比，DH4中的脂肪酸组成局限于种子油。

表1A和1B。rodl突变体的种子脂肪酸组成与拟南芥野生型(WT)和fad2突变体的种子脂肪酸组成不同。TAG，三酰甘油；DAG，二酰甘油；PC，磷脂酰胆碱；PE，磷脂酰乙醇胺。

如表1A和1B中所示，为了进一步表征rodl对种子脂质合成的影响，在成熟(表1A)和发育种子(表1B)在开花后9天，即脂肪酸合成峰值阶段，分析不同种类甘油脂的脂肪酸组成。与野生型相比，拟南芥rodl突变体的种子油具有明显减少的多不饱和脂肪酸，但是对叶或根组织的脂肪酸组成无影响。拟南芥的rodl突变体在DAG和TAG二者中均具有增加的水平的18:1，但是表现出减少量的18:2和18:3(表1A和1B)。然而，关于磷脂酰乙醇胺中的脂肪酸，在rodl和野生型之间检测非常少的差别。有趣的是，来自rodl和野生型发育种子的单独脂质分析揭示rodl突变体与野生型相比，在PC中具有略微降低水平的18:1和18:2，和相对于野生型增加的18:3。因此，18:2和18:3中的缺乏限于发育rodl种子的DAG和TAG。这些发现与减少的18:1到PC的转移相一致，并说明减小的油酸(oleate)去饱和作用不是由去饱和活性引起的，而是归因于减少的18:1到PC的转移，所述转移通过由二酰甘油(DAG)的从头合成(8)，或通过酰基-CoA:lyso-PC酰基转移酶交换(9)实现。

这些变化类似于，但小于，fad2突变体(5，7)中观察到的那些，这说明rodl代表fad2的减效等位基因的可能性。尽管fad2处的突变减少叶和根以及种子中的PUFA合成，脂肪酸组成的变化仅在rodl植物的种子中观察到(表1A和B，和表1C)。

表1C.rodl叶和根脂质中的脂肪酸组成与野生型的脂肪酸组成相似

rodl和fad2之间的杂交产生PUFA水平显著高于任一亲本的PUFA水平的F1种子，由此验证rodl突变处于与fad2不同的基因座处。这些及另外的测试杂交说明rodl是单隐性孟德尔突变。

如表1A(成熟种子)中所示，DH4和fad2突变体之间的遗传互补测试进一步验证DH4中的突变体基因座rodl不是fad2的等位基因。突变(如在下文中的实施例4中更详细讨论地)发生在基因座At3g15820处，其根据本发明的具体方面，通常(野生型)编码如通过利用酵母中的异源表达的酶活性测定确定的新型磷脂酰胆碱:二酰甘油磷酸胆碱转移酶(PDCT)。本申请人已经将该突变等位基因指定为rodl(reduced oleate desaturation1)，其是如通过标准遗传分析确定的单隐性孟德尔突变(数据未显示)。

实施例3

(显示DH4的拟南芥突变体rodl种子油中具有减小的油酸去饱和作用，这归因于减少的通过由二酰甘油(DAG)从头合成实现的18:1到PC的转移)

rodl植物的生长、发育和种子产生不能与WT相区别。成熟rodl种子的重量不能与WT相区别(分别地，17.7±0.2和17.9±0.1μg/种子(av.±s.e.))。与WT的油含量4.6±0.19μg/种子相比，成熟rodl种子的油含量为4.9±0.32μg/种子(av.±s.e.)，且脂质积聚的时刻在两品系中相似，在授粉后7-9天时最大量(数据未显示)。由种子提取的不同种类的甘油脂的脂肪酸组成在该最大量三酰甘油合成阶段过程中分析。与WT相比，rodl突变体在TG和直接前体二酰甘油(DG)中具有充分降低的PUFA水平(图1E-1H)。然而，令人意外地，PC包含增加的PUFA，其具有最多的高度不饱和脂肪酸18:3，与WT中的19.9％相比，占总酰基基团的31.7％。种子中其次丰富的磷脂，即磷脂酰乙醇胺，在TG合成中不具有任何重要作用，且该脂质的脂肪酸组成在WT和rodl样品中类似。

因为PC是将18:1转变为18:2和18:3PUFA的FAD2和FAD3去饱和酶的底物，所以这些数据说明rodl突变为了去饱和作用减少18:1到PC的转移的可能性。含油种子中TG合成的现有技术模型提示18:1可以通过酰基-CoA:lyso-PC酰基转移酶(LPCAT)的作用或通过CDP-胆碱:DAG磷酸胆碱转移酶(CPT)对18:1-DAG的作用进入PC库。

为了区分减小的油酸去饱和作用是否归因于减少的通过由二酰甘油(DAG)从头合成(8)，或通过酰基-CoA:lyso-PC酰基转移酶交换(9)实现的18∶1到PC的转移，用放射性乙酸酯(acetate)(用于标记脂肪酸)(图1C和1D)和放射性甘油(用于标记脂质主链)(图1A和1B)标记发育种子。在甘油追踪实验中，PC是野生型种子中最大量标记的脂质(30％)，且其在追踪期过程中保持相对稳定。在脉冲结束时，DAG中也存在类似的标记量(27％)，其在追踪期过程中减少，且因此失去的标记存在于TAG中(图1A)。在rodl种子中，在PC中仅检测到8％的标记，但是DAG在脉冲结束时包含51％的总放射性。rodl种子中TAG中存在的标记与野生型中的标记处于类似水平。类似的结果也获自乙酸酯追踪实验。这些结果说明rodl种子具有减少的从DAG到PC的从头合成，这是因为不预期酰基-CoA:lyso-PC酰基转移酶中的损害限制甘油流入PC。

图1A-1D显示拟南芥的发育种子中的脂质合成。用[14-C]标记的甘油或乙酸酯脉冲15分钟后，进行追踪180分钟。以0，30，60和180分钟时间点时确定PC，DAG和TAG中的放射性。发育种子用放射性乙酸酯(用于标记脂肪酸)(图1C和1D)和放射性甘油(用于标记脂质主链)(图1A和1B)来标记。

实施例4

(进行DH4的拟南芥突变体rodl的精细绘图并且At3g15820在本文中确定为rodl突变体的基因座，且首次显示不仅是磷脂酰胆碱:二酰甘油磷酸胆碱转移酶(PDCT)，而且是在发育种子中高度表达的PDCT，其在种子发育的第6阶段具有最高水平，这与储存沉积的峰值阶段相一致)

已知含油种子中的从头PC合成由CDP-胆碱:DAG磷酸胆碱转移酶(CPT)催化。在拟南芥基因组中存在2种关于CPT的同源基因(10)。因此，本申请人最初假设(错误地)rodl可能是这两种拟南芥CDP-胆碱:DAG磷酸胆碱转移酶(CPT)基因，At1g13560(AAAPT1)或At3g25585(AAPT2)之一中的突变。然而，令人意外地，本申请人关于rodl的最初绘图数据将该基因置于染色体3上AAPT2以北约20cM处。

特别地，对包含这2个CPT编码区的基因组DNA进行测序，但是rodl突变体中CPT基因中不存在序列突变。该结果说明CPT通常处于rodl功能中且可能存在另一种在发育种子中合成PC的机制。因此利用源自rodl和Landsberg erecta野生型之间杂交的F2植物进行基于图谱的克隆法，以确定rodl基因座(参见“Genetic analysis and map-based cloning of ROD1(ROD1的遗传分析和基于图谱的克隆)”，在以上实施例1的“材料和方法”中)。该方法容许确定染色体3上基因座At3g15820处的突变。At3g15820的第一外显子中G到A的单核苷酸变化导致Trp76到终止密码子的变化(参见图2C)。与野生型核酸序列(SEQ ID NO：2)相比，该基因编码序列的rodl等位基因核酸序列(SEQ ID NO：4)包含在预测的可读框的残基76处创建终止密码子的突变。

ROD1和At3g15820的同一性随后通过使rodl突变体与野生型～4-kb基因组序列(SEQ ID NO：1)包括At3g15820编码区及其内源启动子和终止子(野生型DNA的4kb基因组片段，包括At3g15820的编码区和总共2kb的5′和3′旁侧序列)互补来验证(图2A)。利用DsRed作为选择标记物将该DNA片段克隆至二元植物转化载体中(11)。转基因种子通过DsRed表达来确定，且它们的脂肪酰甲酯(FAMEs)通过气相色谱法分析并与来自相同植物的未转化种子的那些进行比较。转基因种子的脂肪酸组成与野生型的脂肪酸组成近似相同(图2B)，这证实rodl突变的确处于At3g15820基因座处。

图2A-2C显示ROD1基因在拟南芥中被确定为At3g15820。(A)ROD1基因的结构，其具有分子损害在该突变体中的位置。显示外显子(粗体箭头)的约4Kb区域(SEQ ID NO：1)和未翻译区域(方框)用于rodl中的补体突变。(B)At3g15820-转化体(白色阴影线)和Col野生型(白色)的种子脂肪酸组成的比较说明At3g15820完全恢复rodl突变(黑色)，由此证实ROD1的身份。(C)At3g15820的推导氨基酸序列(SEQ ID NO：3)排列显示由HMMTOP预测的推定跨膜区(画下划线)。星号标记突变序列SEQ IDNO：4中Trp76密码子变化为终止密码子的位置(单点突变；在第一外显子序列中的G到A)。推定的磷酸脂质磷酸酶(lipid phosphate phosphatase基序以粗斜体显示。

图4显示DH4中ROD1突变截短氨基酸序列(SEQ ID NO：5)。根据具体方面，磷脂酰胆碱:二酰甘油磷酸胆碱转移酶(PDCT)突变体(rodl)编码序列(SEQ ID NO：4)包括在核苷酸位置228处的G＞A改变，由此导致PDCT蛋白的过早终止，从而提供75个氨基酸截短的ROD1突变序列(SEQID NO：5)。

分析可公开获得的微阵列数据(https://www.genevestigator.ethz.ch/)(12)显示At3g15820在发育种子中高度表达，其在种子发育的第6阶段具有最高水平，这与储存沉积的峰值阶段相一致。这与rodl突变体中种子特异性减小的油酸去饱和作用相一致(表1)。根据另外的方面，拟南芥中与At3g15820共享高同源性的唯一基因是At3g15830，其位于仅1.2kb下游。然而，At3g15830仅在开花期表达，且本申请人的RT-PCR结果也证实At3g15830在发育种子中不表达。

显著地，At3g15820被注解为推定的2型磷脂酸磷酸酶(PAP2)样蛋白，然而，根据申请人分析，其没有显示出与已知表征的拟南芥中的PAP基因(AtLPP1，AtLPP2和AtLPP3)的强同源性(13，14)。特别地，针对PFAM数据库再核查ROD1，且识别PAP2结构域的E值(0.017)高于推荐截取值。不仅序列匹配差，15个最保守的残基中仅8个存在于ROD1中，而且比对也显示ROD1具有(应该需要具有)位于基序序列中心的总共61个残基(176个中)的缺失。拟南芥基因组包含至少4个具有清楚确定的PAP2结构域的基因(E值＜e^-40)包括LPP1(At3g02600)和LPP2(At1g15080)，其已经显示具有PA磷酸酶活性。本申请人因此确定ROD1基本不含与这些真PAP2直向同源物的序列同源性，并由此推断ROD1编码不同的功能。另外，当由本申请人在酵母(酿酒酵母)中表达时，ROD1不赋予比对照品系显著更高的PAP活性。这些结果显示ROD1不可能具有PA磷酸酶活性。

使用位置特异性叠代BLAST(PSI-BLAST)运算法则，且第三叠代识别非植物蛋白磷脂酰胆碱：神经酰胺胆碱磷酸转移酶(哺乳动物磷脂酰胆碱:神经酰胺胆碱磷酸转移酶(EC 2.7.8.27))，其属于大磷酸脂质磷酸酶(LPP)家族。该酶，也称为鞘磷脂合酶(15)，催化磷酸胆碱头部基团由PC至神经酰胺醇基团的转移。本申请人理解在鞘脂的结构和代谢中，神经酰胺具有类似于DAG对甘油脂的作用。ROD1是膜结合蛋白，其包含5个根据HMMTOP程序(16)预测的跨膜结构域，且其序列包含LPP基序(图2C)。这些结果提示本申请人ROD1应该能够在植物中将磷酸胆碱头部基团由PC转移至DAG，其是动物中PC与神经酰胺的类似反应。本申请人因此将该推定新酶称为磷脂酰胆碱:二酰甘油磷酸胆碱转移酶(PDCT)。

系统发育分析将ROD1置于与LPT家族中的SMS1和SMS2蛋白的紧密联系中(图5)，且拓扑预测程序将ROD1确定为具有至多6个推定跨膜结构域的整合膜蛋白——类似于对其他LPT蛋白的预测。另外，SMS1、SMS2和其他LPT蛋白的C2和C3结构域中的5个高度保守残基在ROD1蛋白中的相似位置处识别(图2C，和图5)。植物不含鞘磷脂，但是神经酰胺的结构与DG的结构类似，因此本申请人考虑ROD1在与动物中由SMS介导的反应类似的反应中催化磷酸胆碱由PC转移至DG的可能性。遵从生物化学惯例，本申请人将该推定酶命名为IUPAC亚类EC 2.7.8中的磷脂酰胆碱:二酰甘油磷酸胆碱转移酶(PDCT)。

测试ROD1的PDCT活性。CDP-胆碱:DAG磷酸胆碱转移酶负责PC的最初合成，且已经借助于该反应容易在体外可逆的观察来解释发育含油种子中发生的PC和DAG库之间的迅速平衡。然而，在实验上(在利用膜制剂的标记研究和测定中)，很难区分CDP-胆碱:DAG磷酸胆碱转移酶的双重作用(以下反应流程1)和由PC:DAG磷酸胆碱转移酶催化的单步反应(以下反应流程2)。反应流程2简单并与PC与神经酰胺的反应类似，但是据本申请人所知，以前尚未在任何生物体中描述过——可能很大程度上归因于难以将其与反应流程1相区分。虽然如此，已知类似的转移反应。

因此，本申请人推断测试ROD1的PC:DAG磷酸胆碱转移酶活性的最简单方式应该是在缺乏全部CDP-胆碱:DAG磷酸胆碱转移酶活性的双突变酵母菌株(例如，HJ091)中表达重组蛋白。在该菌株中，PC仅通过这样的反应顺序合成，所述反应顺序包括磷脂酰丝氨酸(PS)到磷脂酰乙醇胺(PE)的脱羧作用及随后的三次甲基化循环，从而生成PC。来自该酵母菌株的微粒体制剂将不支持将[³H]-标记的DAG或[¹⁴C]-标记的胆碱(作为CDP-胆碱提供)引入PC。本申请人因此推断如果ROD1的表达导致³H-DAG到PC的转变，则应该说明ROD1起PC:DAG胆碱-磷酸转移酶的作用。

因此，为了测试ROD1的PDCT活性，使At3g15820的cDNA在可诱导的GAL1启动子的控制下在缺乏全部CDP-胆碱:二酰甘油磷酸胆碱转移酶活性的Δcpt Δept双突变酵母菌株HJ091(17)中表达。在该菌株中，PC仅通过这样的反应顺序合成，所述反应顺序包括PS到PE的脱羧作用及随后的三次甲基化反应循环(17)。来自该酵母菌株的微粒体制剂不支持将二酰甘油和CDP-胆碱引入PC。如预期地，ROD1转化的酵母微粒体在与二油精和[14C]-标记的CDP-胆碱(未显示)，或[¹⁴C-甘油]-二油精和CDP-胆碱一起温育时，不能合成放射性PC(图3A)。然而，当[¹⁴C]-二油精和PC作为底物提供时，清楚地检测到[¹⁴C]-标记的PC。因为[¹⁴C]-放射性标记在二油精的甘油主链上，所以放射性PC显然由磷酸胆碱头部基团转移至二油精中而产生。

为了进一步验证该PDCT活性，用[¹⁴C-胆碱]-PC和二-8:0-DAG温育ROD1转化的酵母微粒体。如图3B所示，在该测定中检测到放射性标记的二-8:0-PC，这说明磷酸胆碱头部基团到二-8:0-DAG的转移。这些结果说明ROD1不具有PA磷酸酶活性，且基本证实ROD1相反赋予PDCT活性，这与rodl突变体在发育种子的PC合成中具有缺陷的事实相一致。

图3A-3C显示ROD1起磷脂酰胆碱:二酰甘油磷酸胆碱转移酶作用。来自用ROD1转化的酵母菌株HJ091的微粒体将[14C]甘油-标记的二油酰基甘油转变为1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(A)，或在用[¹⁴C]胆碱-标记的二棕榈酰基磷酸胆碱和1，2-二辛酰基-sn-3-甘油温育时，生成1，2-二辛酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(B)。在利用用空载体pYES2转化的HJ091的反应中没有检测新的放射性-标记的PC(A，B，C)。

更具体地，首先测试来自表达ROD1的JH091细胞和来自空载体对照的微粒体制剂的由DG和CDP-[¹⁴C]胆碱合成PC的能力(20)。在对照微粒体或来自表达ROD1的细胞的那些中均没有检测到活性(图9A)。然而，当用二油酰基-[¹⁴C]甘油温育ROD1微粒体时生成¹⁴C-标记的PC，且该活性在存在添加的PC时增强(图9B)。对照微粒体在该测定中不具有活性，且在测定前煮沸过的ROD1微粒体也失活。因为[¹⁴C]放射性标记处于[¹⁴C]-DG底物的甘油结构部分中，所以这些测定说明ROD1通过将磷酸胆碱头部基团由PC转移至[¹⁴C]-DG而合成[¹⁴C]-PC。在无添加PC的测定中观察到的活性大概依赖于酵母微粒体的内源PC。

关于其他可能的磷酸胆碱供体的测定说明只有PC的磷酸胆碱头部基团易受ROD1酶的影响。添加1mM CDP-胆碱、磷酸胆碱或lyso-PC不支持以比无添加PC的ROD1微粒体更高的速率进行[¹⁴C]-PC合成(图9C)。为了具体测试PC头部基团的转移，我们用[¹⁴C]胆碱-标记的二豆蔻酰基-PC和未标记的二油酰基-DG温育微粒体。在该测定中，ROD1微粒体，而非对照，合成二油酰基-[¹⁴C]-PC，其以薄层色谱法与二豆蔻酰基-[¹⁴C]PC底物分离(图9D)。另外的测定说明PDCT活性在pH 6.5-7时最高(图9E)。在所用测定条件下，[¹⁴C]-PC合成随至多3min的温育时间，和随至多50μg微粒体蛋白的蛋白浓度而线性增加(图9F、G)。在最优化的测定条件下，PDCT活性在缺乏添加PC的条件下是0.6nmol/min/mg微粒体蛋白，在具有1mM添加的PC的条件下增加至4.5nmol/min/mg(图9H)。

总之，本申请人关于拟南芥中rodl突变体的分析和利用异源酵母表达的生物化学功能测定意外地确定ROD1(At3g15820)起磷脂酰胆碱二酰甘油磷酸胆碱转移酶作用。特别地，它是造成种子油植物，包括但不仅限于，例如拟南芥的发育种子中由DAG流至PC的原因。

经由PDCT的流量的最小值评估可以由表1中的数据来进行。在WT种子中，49.1％的脂肪酸是18:2+18:3，即FAD2在PC上去饱和的两种产物。在rodl突变体中，这些脂肪酸仅是总量的29.4％，说明40％

\frac{49.1 - 29.4}{49.1} x \frac{100}{1}

的转变为18:2+18:3的18:1通过PDCT酶进入PC。与拟南芥ROD1的序列同源性在许多更高等植物，包括油料作物诸如油菜(甘蓝型油菜)，向日葵(Helianthus annua)和蓖麻籽(Ricinus communis)中是可确定的，且因此PDCT可能是许多植物中TG合成的重要酶。

我们关于拟南芥中PDCT的发现对理解TG合成和对利用生物技术改变植物油脂肪酸组成具有重要暗示。例如，因为PDCT有助于控制种子中的PUFA合成，所以ROD1表达的调节可以减少对油氢化的需要，和不健康的反式脂肪伴随物产生(3，4)，以及提供具有增加的氧化稳定性的生物燃料的产生(22)。因为PC也是生成羟基-，环氧基-，乙炔类的和其他修饰的脂肪酸(23-25)的酶的底物，我们关于PDCT的发现为更好地理解不同含油种子物种中的TG合成和为了人类健康和工业应用改进植物油脂肪酸特性提供许多机会。

实施例5

(确定ROD1(At3g15820)直向同源物具有显著的序列同源性/同一性)

根据本发明的其他方面，自然界中的许多重要脂肪酸修饰通过对在PC上酯化的脂肪酰基链作用来实现，且在本文中在许多其他植物物种包括油料作物诸如葡萄籽和蓖麻(Ricinus communis)，等中确定ROD1基因的直向同源物。

根据具体方面，cDNA在酵母菌株HJ091中的表达提供编码蛋白的活性测定，如我们对ROD1所进行地。一旦确定油菜ROD1直向同源物，它们可以由于下调而被靶定，并评估由此产生的植物在育种程序中的价值，从而生成种子油中具有增加的18:1的品系。

表2和3分别显示来自芸苔(SEQ ID NO：6；SEQ ID NO：7)，苔藓(SEQID NO：16；SEQ ID NO：17)，云杉(SEQ ID NO：14；SEQ ID NO：15)，葡萄(SEQ ID NO：12；SEQ ID NO：13)，稻米(SEQ ID NO：10；SEQ ID NO：11)和蓖麻(SEQ ID NO：8；SEQ ID NO：9)的示范性ROD1直向同源物的核苷酸相似性(％同一性)和蛋白序列相似性(％同一性)，其显示约46-80％的核酸同一性范围，和约42-85％的蛋白序列同一性范围。根据另外的方面，编码这些直向同源物的克隆cDNA与拟南芥rodl突变体转基因互补。

表2.ROD1核苷酸相似性(％同一性)

表3.ROD1蛋白序列相似性(％同一性)

因此，根据优选的实施方案，含油种子中PDCT的操作提供改变植物油中脂肪酸特性的新方法(例如，遗传方法)，从而根据具体的最终使用要求定制和/或最优化植物油。不考虑ROD1的酶身份，rodl突变对TAG、DAG和PC的脂肪酸组成的影响说明农作物中ROD1同源物的下调对在保持膜脂质不饱和的同时，调节或降低油中18:2和18:3水平具有重要的效用。

实施例6

(甘蓝型油菜，白菜型油菜(2038和370)和甘蓝序列)

根据本发明的其他方面，甘蓝型油菜单基因Bna.6194被确定为真拟南芥ROD1(At3g15820)同源物。本申请人将Bna.6194命名为BnROD1。定量RT-PCR显示BnROD1在油菜发育种子中高度表达。甘蓝型油菜是双二倍体，包括白菜型油菜和甘蓝两种亚基因组。

序列比对也提示BnROD1可能是白菜型油菜单基因Bra.2038和甘蓝ES948687真同源物。尽管另一种白菜型油菜单基因Bra.370也与BnROD1共享高度同一性，但是它不能由发育种子cDNA通过RT-PCR扩增。单基因Bna.6194(或TIGR中TC71619)(SEQ ID NO：27)

GAGATGAGAAAATAGCAAAGACTTGCGTAAACGTCGCTCTCAAACCTCATCTCATACTCATCGTTTTCGTATGAGTTTTT

GTAGCCCAAACAATCTTCCTTTCTACAGTTTATAATATAAGAAACAATACTTCCTTCGTAATCTCCGCCTCGTATCTCTT

ATATAACTCATCTCTCTAAACCTAAAAAATGTTCCTCTCCGTTAAATCTAACGGTCATGTCAACTAATACCGTCGTCCCT

CTCCGTCGCAGATCTAACGGATATCACACTAACGGCGTGGCCTTTAACGGAATGGATAATATTGTCAAGAAAACCGACGA

CTGCTACACCAACGGCAACGGCAACGGAGGAGTAGAGAGAAGCAAAGCCTCGTTTCTGACATGGACCATGCGTGACGCTG

TCTACGTAGCGAGATACCATTGGATACCGTGTTTCTTTGCGGTCGGAGTTCTGTTCTTTATGGGGGTTGAGTACACGCTC

CAGATGGTTCCGGCGAAGTCTGAGCCGTTCGATATTGGGTTTGTGGCCACGCGCTCTCTAAACCGCGTCTTGGCGAGTTC

ACCGGATCTTAACACCCTTTTAGCGGCTCTAAACACGGTATTCGTAGCGATGCAAACGACGTATATTGTATGGACATGGT

TGATGGAAGGAAGACCACGAGCCACTATCTCGGCTTGCTTCATGTTTACTTGTCGCGGCATTCTTGGTTACTCTACTCAG

CTCCCTCTACCACAGGATTTTTTAGGATCAGGAGTTGATTTTCCGGTGGGAAACGTCTCATTCTTCCTCTTCTATTCTGG

CCACGTAGCCGGTTCAATGATCGCATCCTTGGACATGAGGAGAATGCAGAGGTTGAGACTAGCGATGCTTTTTGACATCC

TCAACATATTACAATCGATCAGACTGCTCGGGACGAGAGGACACTACACGATCGATCTTGCGGTCGGAGTTGGCGCTGGG

ATTCTCTTTGACTCATTGGCCGGGAAGTACGAAGAGATGATGAGCAAGAGACACAATTTAGCCAATGGTTTTAGTTTGAT

TTCTAAAGACTCGCTAGTCAATTAATCTTTTGTTTTCATTTTAAATGATTAGTTGAACTTGAACATATTTGATTTAGTTA

AAGTCCAATGAATTACA

下划线区是用于扩增BnROD1 ORF的引物。

粗体字区是用于实时PCR的引物。

BnROD1编码区序列(来自Bna6194)(SEQ ID NO：19)

1 ATGTCAACTA ATACCGTCGT CCCTCTCCGT CGCAGATCTA ACGGATATCA CACTAACGGC

61 GTGGCCTTTA ACGGAATGGA TAATATTGTC AAGAAAACCG ACGACTGCTA CACCAACGGC

121 AACGGCAACG GAGGAGTAGA GAGAAGCAAA GCCTCGTTTC TGACATGGAC CATGCGTGAC

181 GCTGTCTACG TAGCGAGATA CCATTGGATA CCGTGTTTCT TTGCGGTCGG AGTTCTGTTC

241 TTTATGGGGG TTGAGTACAC GCTCCAGATG GTTCCGGCGA AGTCTGAGCC GTTCGATATT

301 GGGTTTGTGG CCACGCGCTC TCTAAACCGC GTCTTGGCGA GTTCACCGGA TCTTAACACC

361 CTTTTAGCGG CTCTAAACAC GGTATTCGTA GCGATGCAAA CGACGTATAT TGTATGGACA

421 TGGTTGATGG AAGGAAGACC ACGAGCCACT ATCTCGGCTT GCTTCATGTT TACTTGTCGC

481 GGCATTCTTG GTTACTCTAC TCAGCTCCCT CTACCACAGG ATTTTTTAGG ATCAGGAGTT

541 GATTTTCCGG TGGGAAACGT CTCATTCTTC CTCTTCTATT CTGGCCACGT AGCCGGTTCA

601 ATGATCGCAT CCTTGGACAT GAGGAGAATG CAGAGGTTGA GACTAGCGAT GCTTTTTGAC

661 ATCCTCAACA TATTACAATC GATCAGACTG CTCGGGACGA GAGGACACTA CACGATCGAT

721 CTTGCGGTCG GAGTTGGCGC TGGGATTCTC TTTGACTCAT TGGCCGGGAA GTACGAAGAG

781 ATGATGAGCA AGAGACACAA TTTAGCCAAT GGTTTTAGTT TGATTTCTAA AGACTCGCTA

841 GTCAATTAA

BnROD1翻译的ORF序列)(SEQ ID NO：20)

MSTNTVVPLRRRSNGYHTNGVAFNGMDNIVKKTDDCYTNGNGNGGVERSKASFLTWTMRDAVYV

ARYHWIPCFFAVGVLFFMGVEYTLQMVPAKSEPFDIGFVATRSLNRVLASSPDLNTLLAALNTV

FVAMQTTYIVWTWLMEGRPRATISACFMFTCRGILGYSTQLPLPQDFLGSGVDFPVGNVSFFLF

YSGHVAGSMIASLDMRRMQRLRLAMLFDILNILQSIRLLGTRGHYTIDLAVGVGAGILFDSLAG

KYEEMMSKRHNLANGFSLISKDSLVN

单基因Bra.2038(白菜型油菜))(SEQ ID NO：28)

GATGGTAAGGAAACTCTCGTACTCTTCTCTATCTTTTTGTGTGTGTTTCTCGTGTAAAATATTA

TACACTTAAGACGTATAAAAAGAACAACAAGTAAAGCCCAACAAAGACAGATGAGAAAATAGCA

AAGACTTGCGTAAACGTCGCTCTCAAACCTCATCTCATACTCATCGTTTTCGTATGAGTTTTTG

TAGCCCAAACAATCTTCCTTTCTACAGTTTATAATATAAGAAACAATACTTCCTTCGTAATCTC

CGCCTCGTATCTCTTATATAACTCATCTCTCTAAACCTAAAAAATGTTCCTCTCCGTTAAATCT

AACGGTCATGTCAACTAATACCGTCGTCCCTCTCCGTCGCAGATCTAACGGATATCACACTAAC

GGCGTGGCCTTTAACGGAATGGAGAACATTGTCAAGAAAACCGACGACTGCTACACCAACGGCA

ACGGCAACGGAGGAGTAGAGAGAAGCAAAGCCTCGTTTCTGACATGGACCATGCGTGACGCTGT

CTACGTAGCGAGATACCATTGGATACCGTGTTTCTTTGCGGTCGGAGTTCTGTTCTTTATGGGG

GTTGAGTACACGCTCCAGATGGTTCCGGCGAAGTCTGAGCCGTTCGATATTGGGTTTGTGGCCA

CGCGCTCTCTGAACCGCGTCTTGGCGAGTTCACCGGATCTTAACACCCTTTTAGCGGCTCTAAA

CACGGTATTCGTAGCGATGCAGACGACGTATATTGTATGGACATGGTTGATGGAAGGAAGACCA

CGAGCCACTATCTCGGCTTGCTTCATGTTTACTTGTCGCGGCATTCTTGGTTACTCTACTCAGC

TCCCTCTACCACAGGATTTTTTAGGATCAGGAGTTGATTTTCCGGTGGGAAACGTCTCATTCTT

CCTCTTCTATTCTGGCCACGTAGCCGGTTCAATGATCGCATCCTTGGACATGAGGAGAATGCAG

AGGTTGAGACTAGCGATGCTTTTTGACATCCTCAACATATTACAATCGATCAGACTGCTCGGGA

CGAGAGGACACTACACGATCGATCTTGCGGTCGGAGTTGGCGCTGGGATTCTCTTTGACTCATT

GGCCGGGAAGTACGAAGAGATGATGAGCAAGAGACACAATTTAGCCAATGGTTTTAGTTTGATT

TCTAAAGACTCGCTAGTCAATTAATCTTTTGTTTTTATTTTAAATGATTAGTTGAACTTGAACA

TATTTGATTTAGTTAAAGTCCAATGAATTACATTTTTTTCTTTCAACTTTAATTGAATAGGGTT

TCATTAGTTTACTTGAACCTAATTAAATGTGTACGTTATTGTGAAATAAAGAAGTTTGTTGTGG

CCTTCCTACAACTATTTCATCAAAAAAAAAAAAA

BrROD1编码序列：)(SEQ ID NO：21)

ATGTCAACTAATACCGTCGTCCCTCTCCGTCGCAGATCTAACGGATATCACACTAACGGCGTGG

CCTTTAACGGAATGGAGAACATTGTCAAGAAAACCGACGACTGCTACACCAACGGCAACGGCAA

CGGAGGAGTAGAGAGAAGCAAAGCCTCGTTTCTGACATGGACCATGCGTGACGCTGTCTACGTA

GCGAGATACCATTGGATACCGTGTTTCTTTGCGGTCGGAGTTCTGTTCTTTATGGGGGTTGAGT

ACACGCTCCAGATGGTTCCGGCGAAGTCTGAGCCGTTCGATATTGGGTTTGTGGCCACGCGCTC

TCTGAACCGCGTCTTGGCGAGTTCACCGGATCTTAACACCCTTTTAGCGGCTCTAAACACGGTA

TTCGTAGCGATGCAGACGACGTATATTGTATGGACATGGTTGATGGAAGGAAGACCACGAGCCA

CTATCTCGGCTTGCTTCATGTTTACTTGTCGCGGCATTCTTGGTTACTCTACTCAGCTCCCTCT

ACCACAGGATTTTTTAGGATCAGGAGTTGATTTTCCGGTGGGAAACGTCTCATTCTTCCTCTTC

TATTCTGGCCACGTAGCCGGTTCAATGATCGCATCCTTGGACATGAGGAGAATGCAGAGGTTGA

GACTAGCGATGCTTTTTGACATCCTCAACATATTACAATCGATCAGACTGCTCGGGACGAGAGG

ACACTACACGATCGATCTTGCGGTCGGAGTTGGCGCTGGGATTCTCTTTGACTCATTGGCCGGG

AAGTACGAAGAGATGATGAGCAAGAGACACAATTTAGCCAATGGTTTTAGTTTGATTTCTAAAG

ACTCGCTAGTCAATTAA

单基因Bra.2038翻译的ORF序列(SEQ ID NO：22)

MSTNTVVPLRRRSNGYHTNGVAFNGMENIVKKTDDCYTNGNGNGGVERSKASFLTWTMRDAVYV

ARYHWIPCFFAVGVLFFMGVEYTLQMVPAKSEPFDIGFVATRSLNRVLASSPDLNTLLAALNTV

FVAMQTTYIVWTWLMEGRPRATISACFMFTCRGILGYSTQLPLPQDFLGSGVDFPVGNVSFFLF

YSGHVAGSMIASLDMRRMQRLRLAMLFDILNILQSIRLLGTRGHYTIDLAVGVGAGILFDSLAG

KYEEMMSKRHNLANGFSLISKDSLVN

ES948687(甘蓝)(SEQ ID NO：29)

GAGATGAGAAAATAGCAAAGACTTGCGTAAACGTCGCTCTCAAATCTCATCTCATACTCATCGT

TTTCGTATGAGTTTTTGTAGCCCAAACAATCTTCCTTTCTACGGTTTATAATATAAGAAACAAT

ACTTCCTTCGTAATCTCCGCCTTGTATCTCTTATATAACTCATCTCTCTAAACCTAAAAAATGT

TCCTCTCCGTTAAATCTAACGGTCATGTCAACTAATACCGTCGTCCCTCTCCGTCGCAGATCTA

ACGGATATCACACTAACGGCGTGGCCTTCAACGGAATGGAGAACATTGTCAAGAAAACCGACGA

CTGCTACACCAATGGCAACGGAGTAGGAGGGAAGAGCAAGGCGTCATTTCTGACATGGACCATG

CGTGACGCTGTCTTCGTAGCGAGATACCATTGGATACCATGTTTCTTTGCTGTCGGAGTTCTGT

TCTTTATGGGGGTTGAGTACACGCTCCAGATGGTTCCGGCGAAGTCTGAGCCGTTCGATATTGG

GTTTGTGGCCACGCGCTCTCTGAACCGCGTCTTGGCGAGTTCACCGGATCTTAACACCCTTTTA

GCGGCTCTAAACACGGTATTCGTAGCGATGCAAACGACGTATATTG...

ES948687部分编码序列：(SEQ ID NO：23)

ATGTCAACTAATACCGTCGTCCCTCTCCGTCGCAGATCTAACGGATATCACACTAACGGCGTGG

CCTTCAACGGAATGGAGAACATTGTCAAGAAAACCGACGACTGCTACACCAATGGCAACGGAGT

AGGAGGGAAGAGCAAGGCGTCATTTCTGACATGGACCATGCGTGACGCTGTCTTCGTAGCGAGA

TACCATTGGATACCATGTTTCTTTGCTGTCGGAGTTCTGTTCTTTATGGGGGTTGAGTACACGC

TCCAGATGGTTCCGGCGAAGTCTGAGCCGTTCGATATTGGGTTTGTGGCCACGCGCTCTCTGAA

CCGCGTCTTGGCGAGTTCACCGGATCTTAACACCCTTTTAGCGGCTCTAAACACGGTATTCGTA

GCGATGCAAACGACGTATATTG......

ES948687翻译的氨基酸序列(SEQ ID NO：24)

MSTNTVVPLRRRSNGYHTNGVAFNGMENIVKKTDDCYTNGNGVGGKSKASFLTWTMRDAVFVAR

YHWIPCFFAVGVLFFMGVEYTLQMVPAKSEPFDIGFVATRSLNRVLASSPDLNTLLAALNTVFV

AMQTTYI......

单基因Bra.370(白菜型油菜))(SEQ ID NO：30)

GCTCTCAAATCTCATATTCATCGTTTTCGTATGAACTTTTGTAGCCCAAACAACCTTCCTTTCC

TTCCACAAGTTTCATATAATATCTCTTATATAACCCATCTCTCTAAGCCTCTCAAAACGTTCTT

CTCCGTTAAATCTAACGGCCATGTCAACTACAACAATCGTCCCTCTCCGTCGCACTTCTAACTC

TCTCAATGAATACCACACTAACGCAGTCGCCTTTGACGGAATCGTCGGGTCAGCAAGTACTAGC

CAAATGGAGGAGATTGTTACGCAAACCGACGACTGCTACGCCAACCCCAACGGAGATGGAGGGA

GAAGCAAGACGTCGTTAATGACGTGGAGGATGTGCAATCCTGTCCACGTGGTGAGAGTCCATTG

GATACCGTGTTTGTTTGCGGTAGGAGTTCTGTTCTTCACGTGCGTAGAGGAGTACATGCTCCAG

ATGATTCCGGCGAGTTCTGAGCCGTTCGATATTGGTTTTGTGGCGACGGGCTCTCTGTATCGCC

TCTTGGCTTCTTCACCGGATCTTAATACCGTTTTAGCTGCTCTCAACACGGTGTTTGTAGGGAT

GCAAACGACGTATATTTTATGGACATGGTTGGTGGAAGGACGACCACGAGCGACCATCTCGGCT

TGCTTCATGTTTACTTGCCGTGGCATTCTGGGTTACTCTACTCAGCTCCCTCTTCCTCAGGATT

TTCTAGGATCAGGGGTAGATTTTCCGGTAGGAAACGTCTCGTTCTT

部分编码序列：(SEQ ID NO：25)

ATGTCAACTACAACAATCGTCCCTCTCCGTCGCACTTCTAACTCTCTCAATGAATACCACACTA

ACGCAGTCGCCTTTGACGGAATCGTCGGGTCAGCAAGTACTAGCCAAATGGAGGAGATTGTTAC

GCAAACCGACGACTGCTACGCCAACCCCAACGGAGATGGAGGGAGAAGCAAGACGTCGTTAATG

ACGTGGAGGATGTGCAATCCTGTCCACGTGGTGAGAGTCCATTGGATACCGTGTTTGTTTGCGG

TAGGAGTTCTGTTCTTCACGTGCGTAGAGGAGTACATGCTCCAGATGATTCCGGCGAGTTCTGA

GCCGTTCGATATTGGTTTTGTGGCGACGGGCTCTCTGTATCGCCTCTTGGCTTCTTCACCGGAT

CTTAATACCGTTTTAGCTGCTCTCAACACGGTGTTTGTAGGGATGCAAACGACGTATATTTTAT

GGACATGGTTGGTGGAAGGACGACCACGAGCGACCATCTCGGCTTGCTTCATGTTTACTTGCCG

TGGCATTCTGGGTTACTCTACTCAGCTCCCTCTTCCTCAGGATTTTCTAGGATCAGGGGTAGAT

TTTCCGGTAGGAAACGTCTCGTTCTT......

单基因Bra.370翻译的氨基酸序列)(SEQ ID NO：26)

MSTTTIVPLRRTSNSLNEYHTNAVAFDGIVGSASTSQMEEIVTQTDDCYANPNGDGGRSKTSLM

TWRMCNPVHVVRVHWIPCLFAVGVLFFTCVEEYMLQMIPASSEPFDIGFVATGSLYRLLASSPD

LNTVLAALNTVFVGMQTTYILWTWLVEGRPRATISACFMFTCRGILGYSTQLPLPQDFLGSGVD

FPVGNVSF......

表4.甘蓝型油菜、白菜型油菜和甘蓝中ROD1和其他推定同源物的蛋白同一性。

实施例7

(本文中提供的包含相对高浓度适度不饱和长链脂肪的生物材料为生产生物柴油和相关产品提供改良的原料)

根据本发明的其他方面，生物柴油的质量源自来源生物材料内组成脂肪的化学特征。尽管可以进行化学和物理加工，以在生物柴油合成和加工过程中改变脂肪特性，但是这些增加终产物的成本。因此，在生长和成熟过程中改变生物材料脂肪组成的方法特别有价值。

与生物柴油质量有关的特殊变量来源于浊点、氧化稳定性和能量密度之间的相互影响。例如，最佳浊点来源于高熔点油，其典型地包括高度不饱和和/或短链脂肪，然而，该组成的混合物通常氧化不稳定且具有低能量密度。类似地，最佳氧化稳定性和能量密度来源于具有长链脂肪、低/少不饱和的油，然而，这样的混合物典型地具有不理想的低温浊点。

因此，本文中提供的包含相对高浓度适度不饱和长链脂肪的生物材料为生产生物柴油和相关产品提供改良的原料。

关于实施例3-8引用的其他参考文献(并通过参考结合于此，以获得其所提到的教导)：

1.F.D.Gunstone，Prog.Lipid Res.(脂质研究进展)37，277-305(1998).

2.P.Broun，S.Gettner，C.Somerville，Annu Rev Nutr(营养年度综述)19，197-216(1999).

3.J.Jaworski，E.B.Cahoon，Curr.Opin.Plant Biol.(当前植物生物学观点)6，178-184(2003).

4.J.Browse，C.Somerville，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.(植物生理学植物分子生物学年度综述)42，467-506(1991).

5.M.Miquel，J.Browse，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)267，1502-1509(1992).

6.J.Okuley等，Plant Cell(

物细胞)6，147-158(1994).

7.B.Lemieux，M.Miquel，C.Somerville，J.Browse，Theor.Appl.Genet.(理论和应用遗传学)80，234-240(1990).

8.C.R.Slack，L.C.Campbell，J.A.Browse，P.G.Roughan，Biochem.J.(生物化学杂)263，217-228(1983).

9.S.Stymne，A.K.Stobart，Biochem.J.(生物化学杂)223，305-314(1984).

10.J.H.Goode，R.E.Dewey，Plant Physiol.Biochem.(植物生理学和生物化学)37，445-457(1999).

11.C.Lu，M.Fulda，J.G.Wallis，J.Browse，Plant J.(

物杂志)45，847-56(2006).

12.P.Zimmermann，M.Hirsch-Hoffmann，L.Hennig，W.Gruissem，PlantPhysiol.(

物生理学)136，2621-32(2004).

13.T.Katagiri等，Plant J.(

物杂志)43，107-17(2005).

14.O.Pierrugues等，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)276，20300-8(2001).

15.K.Huitema，J.van den Dikkenberg，J.F.Brouwers，J.C.Holthuis，EmboJ(Embo杂志)23，33-44(2004).

16.G.E.Tusnady，I.Simon，J Mol Biol(分子生物学方法)283，489-506(1998).

17.S.C.Morash，C.R.McMaster，R.H.Hjelmstad，R.M.Bell，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)269，28769-76(1994).

18.C.D.Funk，Science(科学)294，1871(2001).

19.J.G.Wallis，J.L.Watts，J.Browse，Trends Biochem.Sci.(生物化学科学趋势)27，467(2002).

20.H.Steinhart，R.Rickert，K.Winkler，Eyr.J.Med.Res.(欧洲医学研究杂志)8，358(2003).

21.D.M.Muoio，C.B.Newgard，Annu.Rev.Biochem.(生物化学年度综述)75，367(2006).

22.G.Vogel，J.Browse，Plant Physiol.(物生理学)110，923(1996).

23.A.Voelker，A.J.Kinney，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.(植物生理学植物分子生物学年度综述)52，335(2001).

24.R.Zimmermann等，Science(科学)306，1383(2004).

25.Y.Guo等，Nature(自然)453，657(2008).

26.A.Dahlqvist等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(美国国家科学院学报)97，6487(2000).

27.S.Cases等，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)276，38870(2001).

28.B.Lemieux，M.Miquel，C.Somerville，J.Browse，Theor.Appl.Genetics(理论和应用遗传学)80，234(1990).

29.M.Miquel，J.Browse，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)267，1502(1992).

30.S.Stymne，A.K.Stobart，Biochem.J.(生物化学杂)223，305(1984).

31.U.

K.

S.Stymne，H.Ronne，FEBS Lett.(FEBS书信)582，305(2008).

32.J.H.Goode，R.E.Dewey，Plant Physiol.Biochem.(

物生理学和生物化学)37，445(1999).

33.C.Lu，M.Fulda，J.G.Wallis，J.Browse，Plant J.(

物杂志)45，847(2006).

34.O.Pierrugues等，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)276，20300(2001).

35.K.Huitema，J.van den Dikkenberg，J.F.Brouwers，J.C.Holthuis，EMBO J.(Embo杂志)23，33(2004).

36.Y.J.Sigal，M.I.McDermott，A.J.Morris，Biochem.J.(生物化学杂)387，281(2005).

37.S.C.Morash，C.R.McMaster，R.H.Hjelmstad，R.M.Bell，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)269，28769(1994).

38.M.Schmid等，Nat.Genet.(自然遗传学)37，501(2005).

39.A.J.Kinney，T.E.Clemente，Fuel Process.Technol.(燃料加工技术)86，1137(2005).

40.M.Lee等，Science(科学)280，915(1998).

41.P.Broun，J.Shanklin，E.Whittle，C.Somerville，Science(科学)282，1315(1998).

42.E.B.Cahoon等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(美国国家科学院学报)96，12935(1999).

Claims

1.一种用于调整种子油中脂肪酸不饱和性的方法，包括：

获得具有含油种子的植物；和

调节至少一种磷脂酰胆碱:二酰甘油磷酸胆碱转移酶(PDCT)在所述植物的一个或多个种子或发育中的种子中的表达或活性，其中所述种子油中的脂肪酸不饱和性的水平、量或分布相对于具有PDCT正常种子表达的植物的种子油被改变。

2.权利要求1的方法，其中调节所述至少一种磷脂酰胆碱:二酰甘油磷酸胆碱转移酶(PDCT)的表达或活性是下调所述表达或活性，其中所述种子油中的脂肪酸不饱和性的水平、量或分布改变，下降。

3.权利要求1和2中任一项的方法，包括相对于一种或多种膜脂中的脂肪酸不饱和性来区别性调节种子油中的脂肪酸不饱和性。

4.权利要求3的方法，其中在种子油中相对于一种或多种膜脂中的脂肪酸不饱和性区别性减小种子油中的脂肪酸不饱和性。

5.权利要求1和2中任一项的方法，其中所述至少一种磷脂酰胆碱:二酰甘油磷酸胆碱转移酶(PDCT)包括选自由以下组成的组的至少一种序列：SEQ ID NO：3，与其具有至少46％，至少48％，至少58％，至少64％，至少71％或至少85％氨基酸序列同一性的序列，及其PDCT活性部分。

6.权利要求5的方法，其中所述至少一种磷脂酰胆碱:二酰甘油磷酸胆碱转移酶(PDCT)包括选自由以下组成的组的至少一种序列：SEQ ID NO：7，9，11，13，15，17，20，22，24，26，及其PDCT活性部分。

7.权利要求1和2中任一项的方法，其中调节至少一种磷脂酰胆碱:二酰甘油磷酸胆碱转移酶(PDCT)的表达或活性包括使用至少一种诱变和重组DNA方法。

8.权利要求7的方法，包括使用基因沉默，反义法，siRNA法，转基因法中的至少一种。

9.一种用于生产具有含油种子的植物或其部分的方法，包括赋予具有含油种子植物品种的种质突变或遗传变化，所述突变或遗传变化改变至少一种磷脂酰胆碱:二酰甘油磷酸胆碱转移酶(PDCT)在所述植物的一个或多个种子或发育中的种子中的表达或活性，其中所述种子油中的脂肪酸不饱和性的水平、量或分布相对于具有PDCT正常种子表达的植物的种子油被改变。

10.权利要求9的用于生产具有含油种子基因型或植物或其部分的方法，包括利用合适的方法向选择的品种中引入转基因，所述转基因改变至少一种磷脂酰胆碱:二酰甘油磷酸胆碱转移酶(PDCT)在所述植物的一个或多个种子或发育中的种子中的表达或活性，其中所述种子油中的脂肪酸不饱和性的水平、量或分布相对于具有PDCT正常种子表达的植物的种子油而变化。

11.权利要求9的用于生产具有含油种子基因型或植物或其部分的方法，包括：

提供具有含油种子植物品种的种质；

用诱变剂处理所述种质以生成诱变的种质；

从所述诱变的种质中选择由所述诱变剂导致包含这样的基因型的具有含油种子的植物种子，所述基因型改变至少一种磷脂酰胆碱:二酰甘油磷酸胆碱转移酶(PDCT)在所述植物的一个或多个种子或发育中的种子中的表达或活性，其中所述种子油中的脂肪酸不饱和性的水平、量或分布相对于具有PDCT正常种子表达的植物的种子油而变化；和

由所述种子生长具有含油种子的植物。

12.权利要求11的方法，其中生产诱变的种质包括产生至少一种磷脂酰胆碱:二酰甘油磷酸胆碱转移酶(PDCT)序列的突变，所述突变改变所述序列在所述植物的一个或多个种子或发育中的种子中的表达或活性，其中所述种子油中的脂肪酸不饱和性的水平、量或分布相对于具有PDCT正常种子表达的植物的种子油被改变。

13.具有含油种子的植物或其部分，其包括突变或遗传变化，所述突变或遗传变化改变至少一种磷脂酰胆碱:二酰甘油磷酸胆碱转移酶(PDCT)在所述植物的一个或多个种子或发育中的种子中的表达或活性，其中所述种子油中的脂肪酸不饱和性的水平、量或分布相对于具有PDCT正常种子表达的植物的种子油被改变。

14.权利要求13的具有含油种子的植物或其部分，其中所述突变包括至少一种磷脂酰胆碱:二酰甘油磷酸胆碱转移酶(PDCT)序列的突变，所述突变改变所述序列在所述植物的一个或多个种子或发育中的种子中的表达或活性，其中所述种子油中的脂肪酸不饱和性的水平、量或分布相对于具有PDCT正常种子表达的植物的种子油而变化。

15.权利要求13的具有含油种子的植物或其部分，其中所述植物或其部分是不同于拟南芥(Arabidopsis)。

16.权利要求13的具有含油种子的植物或其部分，其中调节所述至少一种磷脂酰胆碱:二酰甘油磷酸胆碱转移酶(PDCT)的表达或活性包括下调所述表达和活性中的至少一种，其中所述种子油中的脂肪酸不饱和性的水平、量或分布改变，下降。

17.权利要求16的具有含油种子的植物或其部分，其包括相对于一种或多种膜脂中的脂肪酸不饱和性来区别性调节种子油中的脂肪酸不饱和性。

18.权利要求13的具有含油种子的植物或其部分，其包括两种以上不同突变或遗传变化，所述突变或遗传变化改变种子油中脂肪酸不饱和性的水平、量、或分布，其中所述两种以上不同突变或遗传变化中的至少一种是改变至少一种磷脂酰胆碱:二酰甘油磷酸胆碱转移酶(PDCT)在所述植物的一个或多个种子或发育中的种子中的表达和活性的至少一种的突变。

19.权利要求18的具有含油种子的植物或其部分，其中所述两种以上不同突变中的至少一种是减小或消除种子或发育种子中FAD2活性或量的FAD2去饱和酶突变。

20.权利要求13-19中任一项的具有含油种子的植物或其部分，其中所述至少一种磷脂酰胆碱:二酰甘油磷酸胆碱转移酶(PDCT)包括选自由以下各项组成的组的至少一种序列：SEQ ID NO：3，与其具有至少46％，至少48％，至少58％，至少64％，至少71％或至少85％氨基酸序列同一性的序列，及其PDCT活性部分。

21.权利要求20的具有含油种子的植物或其部分，其中所述至少一种磷脂酰胆碱:二酰甘油磷酸胆碱转移酶(PDCT)包括选自由以下组成的组的至少一种序列：SEQ ID NO：7，9，11，13，15，17，20，22，24，26，及其PDCT活性部分。

22.来源于权利要求13-21中任一项的具有含油种子的植物或其部分的种子或纯育种子。

23.来源于权利要求13-21中任一项的具有含油种子的植物或其部分的油。

24.权利要求23的油，其中所述油是食物油。

25.权利要求24的油，其中所述油相对于具有正常(野生型)PDCT调节的植物是更高度饱和的或不饱和的。

26.一种易燃燃料，其至少部分地基于来源于权利要求13-21中任一项的具有含油种子的植物或其部分的油。

27.一种分离的核酸，其包括编码含有选自由以下各项组成的组的氨基酸序列的多肽的序列：SEQ ID NO：3，与其具有至少46％，至少48％，至少58％，至少64％，至少71％或至少85％氨基酸序列同一性的序列，及其PDCT活性部分；其中所述多肽包括磷脂酰胆碱:二酰甘油磷酸胆碱转移酶(PDCT)。

28.一种分离的多肽，其包括选自由以下各项组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：3，与其具有至少46％，至少48％，至少58％，至少64％，至少71％或至少85％氨基酸序列同一性的序列，及其PDCT活性部分；其中所述多肽包括磷脂酰胆碱:二酰甘油磷酸胆碱转移酶(PDCT)。

29.一种分离的核酸，其包括选自由以下各项组成的组的序列：SEQ IDNO：4，与其具有至少46％，至少47％，至少51％，至少52％，至少53％，至少55％，至少62％，至少64％，至少66％，至少71％，和至少80％序列同一性的序列，其中所述序列在位置228处包括腺苷核苷酸。

30.由权利要求28的核酸序列编码的分离的多肽。

31.权利要求30的分离的多肽，其由SEQ ID NO：5组成。

32.重组植物细胞，其包括根据权利要求27和29中任一项的转染的核酸。