CN104853771A - 巨细胞病毒蛋白的复合物 - Google Patents

巨细胞病毒蛋白的复合物 Download PDF

Info

Publication number
CN104853771A
CN104853771A CN201380036145.0A CN201380036145A CN104853771A CN 104853771 A CN104853771 A CN 104853771A CN 201380036145 A CN201380036145 A CN 201380036145A CN 104853771 A CN104853771 A CN 104853771A
Authority
CN
China
Prior art keywords
hcmv
membrane protein
protein complex
complex
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201380036145.0A
Other languages
English (en)
Inventor
A·卡尔菲
Y·闻
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Novartis AG
Original Assignee
Novartis AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=48783208&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CN104853771(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Novartis AG filed Critical Novartis AG
Publication of CN104853771A publication Critical patent/CN104853771A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/245—Herpetoviridae, e.g. herpes simplex virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/01—DNA viruses
    • C07K14/03—Herpetoviridae, e.g. pseudorabies virus
    • C07K14/04—Varicella-zoster virus
    • C07K14/045—Cytomegalovirus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C12N7/02—Recovery or purification
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55588—Adjuvants of undefined constitution
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/572—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 cytotoxic response
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16111—Cytomegalovirus, e.g. human herpesvirus 5
    • C12N2710/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16111—Cytomegalovirus, e.g. human herpesvirus 5
    • C12N2710/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16111—Cytomegalovirus, e.g. human herpesvirus 5
    • C12N2710/16151—Methods of production or purification of viral material

Abstract

本发明提供了一种分离的人巨细胞病毒(HCMV)膜蛋白复合物，其中所述复合物包含gH、gL和至少一种其他HCMV糖蛋白。在一些实施方式中，所述复合物由gH、gL和gO组成。在其他实施方式中，所述复合物由gH、gL、pUL128、pUL130和pUL131A组成。本发明还提供了用于表达和纯化所述复合物的方法以及所述复合物在免疫原性组合物和疫苗中的后续用途。

Description

巨细胞病毒蛋白的复合物
本申请要求2012年7月6日提交的美国临时申请第61/668,975号和2013年2月27日提交的美国临时申请第61/770,257号的权益，上述各文献的全部内容均通过引用纳入本文以用于所有目的。
技术领域
本发明的技术领域是针对人巨细胞病毒(HCMV)的疫苗，且具体是对纯化的复合物进行分离，所述复合物包含gH、gL和至少一种其他HCMV糖蛋白，优选是三聚体gH/gL/gO复合物或五聚体gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131A复合物，以及其在疫苗中的后续用途。
背景技术
巨细胞病毒(CMV)是属于被称作疱疹病毒科或疱疹病毒的病毒科的病毒属。感染人的该物种通常称作HCMV或人疱疹病毒-5(HHV-5)。在疱疹病毒科中，HCMV属于β疱疹病毒亚科，其还包括来自其他哺乳动物的巨细胞病毒。
虽然在全身各处都有发现，但HCMV感染通常与唾液腺相关。HCMV感染了美国50％至80％的成年人(全世界的40％)，如大量普通人群中存在的抗体所示。在健康的人中HCMV感染通常是未被发现的，但对于免疫功能低下者(如感染HIV的人、器官移植接受者或新生婴儿)而言可以是致命的(Mocarski、Shenk和Pass 2006)。HCMV是最频繁地传播给发育中的胎儿的病毒。感染后，HCMV能够在体内维持潜伏状态，伴随宿主终生，伴随偶尔地由潜伏状态再激活。
HCMV似乎在之后的生命中对免疫参数具有重大影响并导致发病率和最终的死亡率增加(Simanek等(2011))。
迄今为止，已对超过20种不同HCMV毒株的基因组进行了测序，包括实验室毒株和临床毒株。例如，已对以下HCMV毒株进行了测序：Towne(GI:239909366)、AD169(GI:219879600)、Toledo(GI:290564358)和Merlin(GI:155573956)。HCMV毒株AD169、Towne和Merlin可获自美国典型培养物保藏中心(分别是ATCC VR538、ATCC VR977和ATCC VR1590)。
HCMV含有未知数目的膜蛋白复合体。在病毒包衣中的约30种已知糖蛋白中，已发现gH和gL具有特别的吸引力，原因在于其存在于数种不同的复合物中：二聚体gH/gL、三聚体gH/gL/gO(也称作gCIII复合物)和五聚体gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131A(后一种蛋白也称作pUL131)。HCMV被认为使用五聚体复合物通过胞吞作用和低pH依赖的融合进入上皮和内皮细胞，但其被认为在涉及gH/gL或可能涉及gH/gL/gO的过程中在质膜处通过直接融合进入成纤维细胞。gH/gL和/或gH/gL/gO复合物足以感染成纤维细胞，但需要五聚体来感染内皮和上皮细胞(Ryckman、Rainish等，2008)。
Genini等(2011)公开了在初次和再激活的HCMV感染中对HCMV的五聚体复合物作出应答的血清抗体。该应答通过使用固定或裂解的上皮(ARPE-19)细胞的间接免疫荧光(IFA)和ELISA确定，其中使用一种或多种腺病毒载体(各携带一个HCMV基因)和平行地使用对照腺病毒载体感染所述细胞。通过识别复合物的两种、三种或四种蛋白的人中和单克隆抗体的反应性确定结果的特异性。在初次感染的14个病例中，在感染开始的2-4周内可稳定地检测到IgG抗体血清转换为UL128–131基因产物，同时抗体持续至少12个月。IgG抗体对UL128–131基因产物的应答通常优于对gH的应答并似乎在中和抗体应答之后(如上皮细胞中所测定的那样)。在再激活感染中，抗体应答显示出的趋势令人联想到加强应答。在HCMV血清阳性健康成年对照中检测到了IgG抗体，但在HCMV血清阴性个体中未检测到。
Kinzler等(2002)使用重组杆状病毒在昆虫细胞中共表达了gH、gL和gO，但无法生产gH/gL/gO三联复合物。而是仅检测到了gH/gL异源二聚体、gH/gL异源多聚体和gO同源多聚体。相反地，哺乳动物细胞中gH、gL和gO的共表达产生了与HCMV感染的细胞中形成的gH/gL/gO复合物非常类似的高分子量复合物。细胞表面免疫荧光显示这些复合物在被感染的细胞表面表达并显示。
US7704510公开了pUL131A是上皮细胞趋向性所必须的。US7704510还公开了pUL128和pUL130与gH/gL形成复合物，其整合为病毒颗粒。该复合物是感染内皮和上皮细胞而非感染成纤维细胞所必需的。已发现抗CD46抗体抑制上皮细胞的HCMV感染。然而，US7704510并未公开HCMV复合物的分离。
迄今为止，研究者无法纯化包含HCMV gH、gL和至少一种其他HCMV糖蛋白的复合物，如三聚体gH/gL/gO复合物或五聚体gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131A复合物。这类纯化的复合物可用作用于诊断应用的抗原和用作用于针对HCMV的疫苗的免疫原。
发明内容
本发明是基于HCMV膜蛋白复合物的重组表达和纯化，其中所述复合物包含gH、gL和至少一种其他HCMV糖蛋白。
本发明提供了一种生产HCMV膜蛋白复合物的方法，所述复合物包含gH、gL和至少一种其他HCMV糖蛋白，所述方法包括在使所述gH、gL和至少一种其他HCMV糖蛋白组装以形成蛋白复合物的条件下重组共表达HCMV gH蛋白、HCMV gL蛋白和至少一种其他HCMV糖蛋白。可选地，该方法可涉及蛋白复合体的分离，从而以纯化的形式对其进行制备。在一些实施方式中，该方法不涉及任何非包膜HCMV蛋白，如被膜或衣壳蛋白的共表达。
本发明还提供了通过此方法生产的蛋白复合物。例如，所述复合物可包含(i)gH、gL和gO或者(ii)gH、gL、pUL128、pUL130和pUL131A。
在一些实施方式中，可以高产量生产本发明的复合物。例如，在涉及在生长培养基中生长本发明的细胞的方法中，本发明的膜蛋白复合物可积累至超过每升生长培养基0.4mg的水平(例如每升生长培养基0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2、2.5、3、3.5、4、4.5或5mg或更多)。
本发明还提供了一种分离的蛋白复合物，其包含HCMV gH、HCMV gL和至少一种其他HCMV糖蛋白。包含gH和gL的蛋白复合物的一个示例是由gH、gL和gO组成的三聚体复合物。包含gH和gL的蛋白复合物的另一个示例是由gH、gL、pUL128、pUL130和pUL131A组成的五聚体复合物。
本发明还提供了一种包含本发明的蛋白复合物的组合物。在一些实施方式中，所述组合物不含聚丙烯酰胺。在一些实施方式中，所述组合物是液体，例如水性液体，不是凝胶。在一些实施方式中，所述蛋白复合物并非固定在组合物中。例如，所述HCMV膜蛋白复合物可以不存在于凝胶中，或者薄膜、膜、纸或载玻片上。
本发明还提供了一种包含本发明的蛋白复合物的组合物，所述组合物不含任何非包膜HCMV蛋白，如HCMV被膜或HCMV衣壳蛋白。
本发明还提供了一种经修饰的HCMV gH多肽，所述多肽缺少跨膜(TM)结构域。TM结构域的缺失表明该经修饰的多肽不存在于脂质双层中。在一些实施方式中，所述gH多肽缺少全长天然TM结构域；在其他实施方式中，其可保留一部分天然TM结构域，但不足以使蛋白存在于脂质双层中。因此，该多肽可含有天然gH TM结构域的至多10个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)。除了缺少一些或全部的TM结构域，所述多肽还可缺少HCMV gH的天然C端结构域或者可缺少该C端结构域的一部分。本发明还提供了编码所述经修饰的gH多肽的核酸分子和例如通过重组表达或(至少部分)通过化学合成来生产所述经修饰的gH多肽的方法
本发明提供了一种涉及将一种或多种核酸分子导入细胞的转染方法，所述核酸分子编码所述HCMV膜蛋白复合物的蛋白组分。可将所述一种或多种核酸分子稳定地导入细胞(例如通过染色体整合)和瞬时导入细胞。本发明还提供了来源于所述转染的细胞。优选地，来源于所述转染的细胞是稳定地导入了所述一种或多种核酸分子的细胞。本发明还提供了所述细胞的后代，所述细胞的克隆或已由所述细胞进行传代的细胞。可培养这些细胞以表达本发明的复合物，随后可对其进行纯化。
本发明还提供了一种生产HCMV膜蛋白复合物的细胞，所述细胞不(i)含有HCMV基因组和/或(ii)生产HCMV病毒颗粒和/或(iii)表达任何非包膜HCMV蛋白。理想情况下，所述细胞缺少(i)、(ii)或(iii)中的一个；优选地，其缺少两个；更优选地，其缺少(i)、(ii)和(iii)的全部三个。
本发明提供了识别分离的本发明的HCMV膜蛋白复合物但不结合分离的gH、gL、gO、pUL128、pUL130或pUL131A多肽中的任意一个和/或不结合分离的gH-gL异源二聚体的抗体。可使用分离的本发明的HCMV膜蛋白复合物作为抗原产生本发明的抗体。优选地，本发明的抗体是中和抗体。可使用体外选择方法(如使用多种抗体文库的噬菌体展示技术)鉴定本发明的抗体。如下文所述，本发明的抗体可以是人或人源化抗体和/或其可以是单克隆或多克隆抗体。
本发明还提供了一种使用分离的本发明的HCMV膜蛋白复合物产生抗体的方法。或者，分离的本发明的HCMV膜蛋白复合物可用于使用体外选择方法(如使用多种抗体文库的噬菌体展示技术)鉴定抗体。
本发明的抗体可用于诊断试验并可被直接或间接标记。在一些实施方式中，本发明的抗体可用于治疗，例如用于HCMV感染的治疗。
本发明的蛋白质
由UL75基因编码的HCMV糖蛋白H(gH)是一种病毒颗粒糖蛋白，其是感染性所必需的且在α-、β-和γ-疱疹病毒的成员间保守。其与gL形成稳定的复合物，且该复合物的形成促进了gH的细胞表面表达。基于HSV-2和EBVgH/gL复合物的晶体结构，gL亚基和gH的N端残基在该结构的一端(“头部”)处形成了球形结构域，其涉及与gB的相互作用和膜融合的激活。靠近病毒膜(“尾部”)的gH的C端结构域也涉及膜融合。gH展示了被宿主因子TLR2识别的决定簇，且其与宿主因子TLR2和TLR1之间形成的异源二聚体直接相互作用。TLR2介导NF-κB激活和来自细胞的炎症细胞因子应答(Boehme、Guerrero和Compton，2006)。
来自HCMV毒株Merlin的gH已被报道(GI:52139248,SEQ ID NO:1)由742个氨基酸组成。来自HCMV毒株Towne的gH(GI:138314,SEQ ID NO:2)也由742个氨基酸组成，且已被报道具有6个N-糖基化位点(在残基55、62、67、192、641和700处)，并且由其N端处的疏水信号序列(氨基酸残基1-23)、从细胞中凸出至胞外空间的胞外域(残基24-717)、疏水TM结构域(残基718-736)和C端胞质结构域(残基737-742)组成。SEQ ID NO:2与SEQ ID NO:1和来自HCMV毒株AD169的gH(GI:138313,SEQ ID NO:3)分别具有99％和96％的氨基酸相似性。
通常，gH蛋白的N端信号序列被宿主细胞的信号肽酶切割以产生成熟的gH蛋白。本发明的HCMV膜复合物中的gH蛋白可缺少N端信号序列。优选地，(分离的本发明的HCMV膜复合物中发现的)成熟形式的gH缺少N端信号序列、TM结构域和C端结构域。
全长UL75基因序列的表达阻碍了包含gH的可溶性复合物的纯化。相反地，可通过省略至少一部分的gH的TM结构域来以高产量和纯度纯化包含gH的复合物。例如，可使用仅编码gH的N端信号序列和胞外域的构建体表达容易纯化的gH形式。所述构建体可编码gH的胞外域的大部分(例如70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多)，但仅编码TM结构域的一小部分或不编码TM结构域。本发明的gH蛋白可包括全部的gH胞外域或截短形式的gH胞外域。相对于全长HCMV gH蛋白，截短形式的胞外域可缺少其N端和/或C端处1至20个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸残基)。本发明的gH蛋白的一个示例是SEQ ID NO:4，其由SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-715组成。优选的本发明的gH蛋白的一个示例是SEQ ID NO:29，其缺少gH的N端信号序列、TM结构域和C端结构域且由SEQ ID NO:1的氨基酸残基24-715组成。
本发明的gH蛋白可含有额外的氨基酸残基，如N端或C端延伸。这类延伸可包括一个或多个标签，其可促进gH蛋白的检测(例如用于通过单克隆抗体进行检测的表位标签)和/或纯化(例如用于在镍螯合树脂上进行纯化的聚组氨酸标签)。包括myc标签和聚组氨酸标签的C端延伸的一个示例是SEQ ID NO:5。因此，本发明的gH蛋白(例如SEQ ID NO:6和30)可在其C端处包括与SEQ ID NO:5中所列序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的氨基酸序列。本发明的gH蛋白可包含与C端延伸融合的截短的gH胞外域。
gH的胞外域对应缺少疏水性TM的部分gH。可基于将给定序列与SEQ IDNO:1进行成对比对来预测胞外域的位置和长度，例如通过比对感兴趣的gH多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:1并鉴定与SEQ ID NO:1的残基24-717对齐的序列。类似地，可通过将感兴趣的gH多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:1进行成对比对来预测TM和C端结构域的位置，并分别鉴定与SEQ ID NO:1的残基718-736和737-742对齐的序列。或者，可基于沿给定gH蛋白序列长度的疏水性计算机分析来预测胞外域、信号序列和TM结构域的位置和长度。信号序列和TM结构域具有最高水平的疏水性且这两个区域在疏水性较低的胞外域的两侧。
本发明的gH蛋白可与SEQ ID NO:4具有多种程度的相同性，如与SEQ IDNO:4所列序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性。本发明的gH蛋白可与SEQ IDNO:6具有多种程度的相同性，如与SEQ ID NO:6所列序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性。本发明的gH蛋白可与SEQ ID NO:29具有多种程度的相同性，如与SEQ ID NO:29所列序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性。本发明的gH蛋白可与SEQ ID NO:30具有多种程度的相同性，如与SEQ ID NO:30所列序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性。优选的gH蛋白：(i)可与HCMV gL二聚化；(ii)形成三聚体gH/gL/gO复合物的一部分；(iii)形成五聚体gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131A复合物的一部分；(iv)包含至少一个来自SEQID NO:4或SEQ ID NO:29的表位；和/或(v)可在体内引发与HCMV病毒颗粒进行免疫交叉反应的抗体。
HCMV糖蛋白L(gL)由UL115基因编码。gL被认为是病毒复制所必需的且gL的全部已知功能特性都与其与gH的二聚化直接相关。gL/gH复合物是病毒与质膜的融合所必需的，所述融合导致病毒进入宿主细胞。已报道来自HCMV毒株Merlin(GI:39842115,SEQ ID NO:7)和HCMV毒株Towne(GI:239909463,SEQ ID NO:8)的gL的长度为278个氨基酸。已报道来自HCMV毒株AD169(GI:2506510,SEQ ID NO:9)的gL的长度为278个氨基酸，包括位于其N端的信号序列(氨基酸残基1-35)，具有两个N-糖基化位点(在残基74和114处)并缺少TM结构域(Rigoutsos等，2003)。预测SEQ ID NO:7的N端信号序列包含氨基酸残基1-30。SEQ ID NO:8与SEQ ID NO:7具有98％的氨基酸相同性。对来自22至39个临床分离物以及实验室毒株AD169、Towne和Toledo的全长gL基因的测序显示，分离物之间的氨基酸序列中存在小于2％的差异(Rasmussen等，2002)。
通常，gL蛋白的N端信号序列被宿主细胞的信号肽酶切割以产生成熟的gL蛋白。本发明的HCMV膜复合物中的gL蛋白可缺少N端信号序列。优选的本发明的gL蛋白的一个示例是SEQ ID NO:31，其缺少N端信号序列且由SEQ ID NO:7的氨基酸残基31-278组成。
本发明的gL蛋白可与SEQ ID NO:7具有多种程度的相同性，如与SEQ IDNO:7所列序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性。本发明的gL蛋白可与SEQ IDNO:31具有多种程度的相同性，如与SEQ ID NO:31所列序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性。优选的gL蛋白：(i)可与HCMV gH二聚化；(ii)形成三聚体gH/gL/gO复合物的一部分；(iii)形成五聚体gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131A复合物的一部分；(iv)包含至少一个来自SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:31的表位；和/或(v)可在体内引发与HCMV病毒颗粒进行免疫交叉反应的抗体。
已报道由UL74基因编码的HCMV糖蛋白O(gO)可作为分子伴侣发挥作用，增加gH/gL ER输出和整合至病毒颗粒中。已经提出gO与pUL128-131A竞争结合在gH/gL上但从gH/gL上释放，使得gH/gL(缺少pUL128-131A)整合至病毒颗粒中(Ryckman、Chase和Johnson，2010)。与其他病毒基因相比，在不同的HCMV毒株之间HCMV gO是异常可变的：22至39个临床分离物以及实验室毒株AD169、Towne和Toledo之间gO氨基酸序列的可变性接近45％(即不同分离物之间gO氨基酸序列之间只存在55％的相同性)(Rasmussen等，2002)。已报道来自HCMV毒株Merlin(GI:39842082,SEQ ID NO:10)、AD169(GI:136968,SEQ ID NO:11)和Towne(GI:239909431,SEQ ID NO:12)的gO分别由472、466和457个氨基酸组成。与SEQ ID NO:10具有73％氨基酸相似性的HCMV毒株AD169的gO具有18个N-糖基化位点(在残基75、83、87、103、130、157、162、171、219、242、288、292、350、385、392、399、433和454处)且可在其N端包括成熟多肽中缺失的可切割信号序列(预测由氨基酸残基1-30组成)。Rigoutsos(2003)预测了TM结构域(在区域10-28和190-212中)和卷曲螺旋区域(残基240-272)的存在。
通常，gO蛋白的N端信号序列被宿主细胞的信号肽酶切割以产生成熟的gO蛋白。本发明的HCMV膜复合物中的gO蛋白可缺少N端信号序列。优选的本发明的gO蛋白的一个示例是SEQ ID NO:32，其缺少N端信号序列且由SEQ ID NO:10的氨基酸残基31-472组成。
本发明的gO蛋白可与SEQ ID NO:10具有多种程度的相同性，如与SEQID NO:10所列序列具有至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性。本发明的gO蛋白可与SEQ ID NO:32具有多种程度的相同性，如与SEQ ID NO:32所列序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性。优选的gO蛋白：(i)能够形成三聚体gH/gL/gO复合物的一部分；(ii)不能形成五聚体gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131A复合物的一部分；(iii)包含至少一个来自SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:32的表位；和/或(iv)可在体内引发与HCMV病毒颗粒进行免疫交叉反应的抗体。
已报道来自HCMV毒株Merlin的pUL128(GI:39842124,SEQ ID NO:13)由130个氨基酸组成且含有1个引起成熟前终止的核苷酸取代。已报道来自HCMV毒株Towne(GI:39841882,SEQ ID NO:14)和AD169(GI:59803078,SEQ ID NO:15)的pUL128由171个氨基酸组成。由于SEQ ID NO:13的成熟前终止，SEQ ID NO:13和15仅与SEQ ID NO:15的全长具有75％的相同性。预测pUL128具有N端信号序列，其位于SEQ ID NO:13的残基1-27处，但预测其缺少TM结构域。优选的本发明的pUL128蛋白的一个示例是SEQ ID NO:33，其缺少N端信号序列且由SEQ ID NO:14的氨基酸残基28-171组成。SEQID NO:33还由SEQ ID NO:15的氨基酸残基28-171组成。
本发明的pUL128蛋白可与SEQ ID NO:15具有多种程度的相同性，如与SEQ ID NO:15所列序列具有至少60％、70％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性。本发明的pUL128蛋白可与SEQ ID NO:33具有多种程度的相同性，如与SEQ ID NO:33所列序列具有至少60％、70％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性。优选的pUL128蛋白：(i)能够形成五聚体gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131A复合物的一部分；(ii)包含至少一个来自SEQID NO:15或SEQ ID NO:33的表位；和/或(iii)可在体内引发与HCMV病毒颗粒进行免疫交叉反应的抗体。
UL130是UL131A-128基因座的中央和最大(214个密码子)的基因。基因的概念翻译预测了长(25个氨基酸)的在亲水性蛋白之前的N端信号序列，其含有推定的趋化因子结构域(氨基酸46至120)中的两个潜在的N连接的糖基化位点(Asn85和Asn118)和靠近独特的C端区域末端的其他N-糖基化位点(Asn201)。预测pUL130缺少TM结构域。已报道它是一个腔糖蛋白，低效地分泌自被感染的细胞但以成熟的高尔基体形式整合至病毒包膜中(Patrone等，2005)。来自HCMV毒株Merlin和Towne的pUL130序列是可从公共渠道获得的(分别为GI:39842125，SEQ ID NO:16和GI:239909473，SEQ ID NO:17)且其分别由214和229个氨基酸组成。已报道SEQ ID NO:17在pUL130的C端区域中含有一个移码突变，且其在SEQ ID NO:16的全长之上与HCMVSEQ ID NO:16具有94％的相同性。
通常，pUL130蛋白的N端信号序列被宿主细胞的信号肽酶切割以产生成熟的pUL130蛋白。本发明的HCMV膜复合物中的pUL130蛋白可缺少N端信号序列。优选的本发明的pUL130蛋白的一个示例是SEQ ID NO:34，其缺少N端信号序列且由SEQ ID NO:16的氨基酸残基26-214组成。
本发明的pUL130蛋白可与SEQ ID NO:16具有多种程度的相同性，如与SEQ ID NO:16所列序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性。本发明的pUL130蛋白可与SEQ ID NO:34具有多种程度的相同性，如与SEQ ID NO:34所列序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性。或者，本发明的pUL130蛋白可与SEQ ID NO:17具有多种程度的相同性，如与SEQ ID NO:17所列序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性。优选的pUL130蛋白：(i)能够形成五聚体gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131A复合物；(ii)包含至少一个分别来自SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:17的表位；和/或(iii)可在体内引发与HCMV病毒颗粒进行免疫交叉反应的抗体。
pUL131A功能是HCMV复制所必需的，不仅是在内皮细胞中而且在上皮细胞中也是如此。已报道来自HCMV毒株Merlin(GI:39842126,SEQ ID NO:18)和Towne(GI:239909474,SEQ ID NO:19)和AD169(GI:219879712,SEQ IDNO:20)的pUL131A分别由129、129和76个氨基酸组成。预测pUL131A含有位于SEQ ID NO:18的残基1-18处的N端信号序列，并预测其缺少TM结构域。已报道来自毒株AD169的UL131A含有1个碱基对的插入，其导致移码(Wang和Shenk，2005)。SEQ ID NO:18在N端的28个氨基酸上与SEQ ID NO:20具有96％的相同性，但由于AD169UL131A基因中的移码其在SEQ ID NO:18的全长上仅与SEQ ID NO:20具有36％的相同性。
通常，pUL131A蛋白的N端信号序列被宿主细胞的信号肽酶切割以产生成熟的pUL131A蛋白。本发明的HCMV膜复合物中的pUL131A蛋白可缺少N端信号序列。优选的本发明的pUL131A蛋白的一个示例是SEQ ID NO:35，其缺少N端信号序列且由SEQ ID NO:18的氨基酸残基19-129组成。SEQ ID NO:35还由SEQ ID NO:19的氨基酸残基19-129组成。
本发明的pUL131A蛋白可与SEQ ID NO:17具有多种程度的相同性，如与SEQ ID NO:18所列序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性。本发明的pUL131A蛋白可与SEQ ID NO:35具有多种程度的相同性，如与SEQ ID NO:35所列序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性。优选的pUL131A蛋白：(i)能够形成五聚体gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131A复合物；(ii)包含至少一个来自SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:35的表位；和/或(iii)可在体内引发与HCMV病毒颗粒进行免疫交叉反应的抗体。
如果在成纤维细胞中对临床分离物进行传代，其会非常快地在UL131A-128基因座中积累突变，使其无法感染其他细胞类型。事实上，成纤维细胞中少至3次的传代即足以使这类突变出现在病毒母液中。例如，与未在成纤维细胞中进行传代的临床分离物相比，Merlin和Toledo携带UL128中的突变，Towne携带UL130ORF中的突变且AD169含有突变的UL131AORF。由于临床分离物而非实验室毒株有效地感染并在上皮细胞中产生感染性后代，因此该细胞类型与内皮细胞一样有望作为实验室宿主以生产不对UL131A-UL128基因座中的突变进行选择的临床HCMV母液(Wang和Shenk，2005)。
本发明提供了一种包含HCMV复合物的免疫原性组合物，所述复合物包含gH、gL和至少一种其他HCMV糖蛋白，例如gH/gL/gO或gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131A。这类免疫原性组合物还可包含其他HCMV蛋白(但优选不是非包膜HCMV蛋白)，如糖蛋白B(gB)。
gB由UL55编码并介导病毒和细胞膜之间的融合。因此，其在病毒的进入和感染过程中起重要作用。与许多其他病毒融合蛋白类似，gB含有插入细胞膜中的疏水环且其在进入期间经历大的结构变化(融合前和融合后构象)。与gH类似，gB展示了被宿主因子TLR2识别的决定簇，且其与宿主因子TLR2和TLR1之间形成的异源二聚体直接相互作用。TLR2介导NF-κB激活和来自细胞的炎症细胞因子应答(Boehme、Guerrero和Compton，2006)。
糖蛋白B(gB)是保守程度最高的人疱疹病毒的包膜糖蛋白。虽然目前HCMV gB的结构是未知的，但基于序列同源性假定HCMV gB的结构与HSV和EBV的gB类似。虽然HSV-1和EBV与VSV-G的gB之间缺少序列相似性，但HSV-1和EBV的gB的融合后构象与水泡性口炎病毒(VSV)蛋白的融合蛋白(G)的融合后构象之间也显示出令人意外的结构同源程度。
已报道来自HCMV毒株Merlin(GI:39842076,SEQ ID NO:21)和Towne(GI:138193,SEQ ID NO:22)的gB由907个氨基酸组成。已报道来自HCMV毒株AD169(GI:138192,SEQ ID NO:23)的gB由906个氨基酸组成，具有19个N-糖基化位点(在残基37、68、73、85、208、281、286、302、341、383、405、409、417、447、452、464、465、554和585处)且由位于其N端的信号序列(在氨基酸残基1-25处)、胞外域(残基26-751)、TM结构域(残基752-772)和胞质结构域(残基773-907)组成(Rigoutsos等，2003)。在一项53名女性的研究中，发现了5种gB亚型，其中核苷酸多态性的范围为28至124bp(Murthy等，2011)。HCMV毒株Merlin和AD169的gB具有95％的氨基酸相似性。预测在HCMV毒株Merlin的gB中，N端信号序列由SEQ ID NO:21的氨基酸残基1-22组成。
通常，gB蛋白的N端信号序列被宿主细胞的信号肽酶切割以产生成熟的gB蛋白。本发明的HCMV膜复合物中的gB蛋白可缺少N端信号序列。优选的本发明的gB蛋白的一个示例是SEQ ID NO:36，其缺少N端信号序列且由SEQ ID NO:21的氨基酸残基23-907组成。
本发明的gB蛋白可与SEQ ID NO:21具有多种程度的相同性，如与SEQ IDNO:21所列序列具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性。本发明的gB蛋白可与SEQ ID NO:36具有多种程度的相同性，如与SEQ ID NO:36所列序列具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性。优选的gB蛋白：(i)包含至少一个来自SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:36的表位；和/或(ii)可在体内引发与HCMV病毒颗粒进行免疫交叉反应的抗体。
糖基化
虽然gH、gL、gO、gB和pUL130可被称作糖蛋白，但不应认为该名称表示这些蛋白在本发明中使用时必须被糖基化。相反，在本发明的一些实施方式中，一种或多种多肽是非糖基化的。然而，在通常情况下，本发明的复合物中的一种或多种(或全部)多肽是糖基化的。在一些实施方式中，本发明的复合物中的一种或多种(或全部)多肽是由培养的细胞的糖基化突变体(如突变的哺乳动物细胞)糖基化的。这类糖基化突变体生产不同于野生型糖基化模式的多肽糖基化模式，即所得的多肽糖形不同于野生型糖形。
糖基化的水平和类型取决于宿主细胞的种类。通常，在进化中与人距离最远的物种(如细菌、酵母、真菌、昆虫和植物)具有与人最不类似的糖基化库。在细菌细胞中蛋白质通常是非糖基化的，但已报道了N连接的糖基化系统向大肠杆菌中的转移(Langdon、Cuccui和Wren，2009)。在昆虫细胞中蛋白质可以是糖基化的。然而，与脊椎动物细胞不同，昆虫细胞无法产生倒数第二个是半乳糖且最后一个是唾液酸的复杂的N连接的侧链。因此，对于治疗性蛋白而言，昆虫细胞中的糖基化类型是次佳的。酵母细胞可以使用甘露糖进行N连接的(连接至天冬酰胺)和O连接的(连接至丝氨酸/苏氨酸)糖基化。高尔基体中的高糖基化(外部链延伸)是酵母细胞的特征，但不是哺乳动物细胞的特征，且这可导致抗体反应性相关的问题。同样，与哺乳细胞不同，酵母细胞无法整合甘露糖以外的糖。与酵母和昆虫细胞相反，在哺乳动物细胞中表达的哺乳动物糖蛋白是真正糖基化的，使得重组产物与体内形成的蛋白非常类似。
因此，优选地，本发明的复合物中的糖基化多肽：(i)具有哺乳动物糖基化模式；和/或(ii)不含昆虫细胞的糖基化模式。在一些实施方式中，本发明的一种或多种蛋白含有倒数第二个是半乳糖且最后一个是唾液酸的复杂的N连接的侧链。
本发明的膜蛋白复合物
本发明的HCMV膜蛋白复合物是gH、gL和至少一种其他HCMV蛋白之间的异源寡聚体连接物。这些复合物中的蛋白可以通过非共价和/或共价相互作用来连接。在gH/gL/gO三聚体复合物中，二硫键将gH与gO和gL相连接。在本发明的五聚体复合物中，gH、gL和pUL128通常通过二硫键连接，但pUL130和pUL131A通常通过非共价相互作用整合至五聚体复合物中(如实施例7所示)。在一些实施方式中，本发明的pUL130蛋白和/或本发明的pUL131A蛋白通过非共价相互作用整合至五聚体复合物中。此外，本发明的pUL130蛋白和/或pUL131A可通过非共价相互作用相互连接。
假定三聚体和五聚体复合物的化学计量比分别为1:1:1(Huber和Compton，1999)和1:1:1:1:1(Ryckman、Chase和Johnson，2010)，但这尚未得到完全确认。
发明人发现，本发明的膜蛋白复合物能够诱导免疫原性应答。因此，本发明的膜蛋白复合物能够诱导针对HCMV感染的免疫。这两种功能取决于本发明的膜蛋白复合物上能引发抗体(包括中和抗体)生产的表位的保留程度。五聚体复合物的多种构象表位是已知的。例如，Macagno(2010)分离了一组中和内皮细胞、上皮细胞和骨髓细胞的HCMV感染的人单克隆抗体。除了与UL128基因产物中的保守表位结合的抗体的单个例外以外，所有其他抗体都与需要表达gH/gL/UL128-131A复合物的两种或多种蛋白的构象表位结合。优选地，本发明的五聚体复合物具有Macagno(2010)所鉴定的一种或多种构象表位。
本发明的各蛋白可含有突变，如相对于HCMV的Merlin毒株和/或AD169毒株的插入、缺失和取代，前提是这些突变对这些蛋白作为抗原的用途没有不利影响，特别是其保留了一种或多种能够引发抗体生产的表位，所述抗体能够结合HCMV的Merlin毒株和/或AD169毒株的至少一种膜蛋白复合物和/或能够中和所述HCMV膜蛋白复合物的生物学作用。此外，这类突变不应阻止蛋白形成本发明的膜蛋白复合物的能力。可通过进行蛋白纯化并通过非还原性PAGE、Western印迹和/或尺寸排阻色谱对蛋白进行分析来测试形成本发明的膜蛋白复合物的能力。如果蛋白形成了复合物的一部分，则其全部在天然PAGE胶上以单一条带的形式存在和/或在尺寸排阻色谱中以单峰的形式存在。
可以多种纯度水平制备本发明的HCMV膜蛋白复合物，例如总蛋白的至少80％、85％、90％、95％或99％(以质量计)，即复合物构成了组合物中总蛋白质量的至少80％。该组合物可不含聚丙烯酰胺。
表达系统
在一个方面，本发明提供了一种用于表达本发明的膜蛋白复合物的方法。用于本发明的合适的表达系统是本领域技术人员熟知的，且许多详细描述于Doyle(2008)中。通常，适用于维持、增殖和表达核酸分子以生成宿主所需多肽的任何系统或载体都是可用的。可通过多种熟知且常规的技术中的任意一种将合适的核苷酸序列插入表达系统中，例如通过Sambrook(2000)中所述的那些。通常，可将编码基因置于控制元件(如启动子和可选的操纵子)的控制下，使得编码所需肽的DNA序列在经转化的宿主细胞中转录为RNA。
合适的表达系统的示例包括例如染色体、附加体和病毒来源的系统，包括例如来源于以下物质的载体：细菌质粒、噬菌体、转座子、酵母附加体、插入元件、酵母染色体元件、病毒(如杆状病毒、乳多空病毒(如SV40)、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、伪狂犬病病毒和逆转录病毒)或其组合，如来源于质粒和噬菌体遗传元件的那些，包括粘粒和噬菌粒。人工染色体(HAC)也可用于递送较大片段的DNA，所述DNA的大小大于可包含于质粒中并在质粒中表达的DNA。
合适的表达系统包括微生物体(如重组噬菌体、质粒或粘粒DNA表达载体转化的细菌)、酵母表达载体转化的酵母、病毒表达载体(如杆状病毒)转化的昆虫细胞系统、病毒表达载体(如花椰菜花叶病毒CaMV、烟草花叶病毒TMV)或细菌表达载体(如Ti或pBR322质粒)转化的植物细胞系统，或者动物细胞系统。无细胞翻译系统也可用于生产本发明的蛋白。优选地，在真核细胞(如哺乳动物细胞)中生产本发明的蛋白。
可瞬时或稳定地表达重组多肽。优选地，稳定地表达重组蛋白。例如，可使用表达载体转染稳定表达感兴趣的肽的细胞系，所述表达载体可含有相同或独立的载体上的病毒复制起始点和/或内源性表达元件和可选择的标记基因。在导入载体之后，将细胞在富集培养基中培养1-2天，随后转移至选择性培养基中。选择性标记物的目的是产生选择抗性，其存在允许成功表达导入序列的细胞生长和恢复。可使用与细胞类型相适应的组织培养技术对稳定转化的细胞的抗性克隆进行增殖。
可用作表达宿主的哺乳动物细胞系为本领域已知，并且包含很多获自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)的永生化细胞系，包括但不限于中华仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾(COS)细胞、C127细胞、3T3细胞、BHK细胞、人胚胎肾(HEK)293细胞、Bowes黑色素瘤细胞和人肝细胞癌(如Hep G2)细胞和很多其他细胞系。优选在哺乳动物细胞中进行表达，因为生产的蛋白会具有真正的哺乳动物糖基化模式，并因此具有感染性HCMV颗粒上存在的表位。因此，哺乳动物细胞中本发明的膜蛋白复合物的生产会导致在感染期间产生能够结合天然HCMV颗粒的抗体。
在杆状病毒系统中，用于杆状病毒/昆虫细胞表达系统的材料以试剂盒的形式购自加利福尼亚州圣迭戈的英杰公司(Invitrogen)等(“MaxBac”试剂盒)。这些技术通常是本领域技术人员已知的且完整地描述于Summers等(Summers和Smith，1987)中。特别适用于该系统的宿主细胞包括昆虫细胞(如果蝇(Drosophila)S2，即重组杆状病毒感染的稳定转染的果蝇S2细胞)和灰夜蛾(Spodoptera)Sf9细胞。在一些实施方式中，不在昆虫细胞中生产本发明的蛋白。
本领域中已知许多植物细胞培养和全植物遗传表达系统。合适的植物细胞遗传表达系统的示例包括美国专利5,693,506、美国专利5,659,122、美国专利5,608,143和Zenk(1991)23中描述的那些。具体而言，可利用所有能从其中分离出原生质体并培养以生成整株再生植物的植物，如此恢复的植物含有转移的基因。实际上，所有植物都可再生自培养的细胞或组织，包括但不限于以下植物的所有主要种类：甘蔗、甜菜、棉花、果树和其他树木、豆科植物和蔬菜。
原核表达系统的示例包括使用链球菌(streptococci)、葡萄球菌(staphylococci)、大肠杆菌(E.coli)、链霉菌(Streptomyces)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)作为宿主细胞的那些。
真菌表达系统的示例包括使用酵母(例如酿酒酵母(S.cerevisiae))和曲霉(Aspergillus)作为宿主细胞的那些。
HEK293细胞适用于本发明的HCMV蛋白的瞬时表达，原因在于其通过各种技术进行的转染的可转染性高，所述技术包括磷酸钙法和聚乙烯亚胺(PEI)法。一个有用的HEK293细胞系是表达EBV的EBNA1蛋白的HEK293细胞系，如293-6E(Loignon等，2008)。已证明，转化的HEK293细胞向生长培养基中分泌高水平的本发明的蛋白复合物，从而允许从生长培养基中直接纯化这类蛋白复合物。
CHO细胞是特别适用于用作免疫原或抗原的本发明的HCMV蛋白的工业生产的哺乳动物宿主，因为其允许长期、稳定的基因表达和高蛋白产量。
在一些实施方式中，本发明的膜蛋白复合物分泌自其中表达该膜蛋白复合物的细胞。在本发明的其他实施方式中，不分泌本发明的蛋白。例如，在大肠杆菌中，非分泌的蛋白可积累在包涵体中。从包涵体中纯化重组蛋白的方法是本领域熟知的。
可使用多种方法进行转染，包括使用磷酸钙、电穿孔或通过将阳离子脂质与材料混合以生成与细胞膜融合并将运载物保存于其中的脂质体。
核酸构建体
本发明提供了一种编码gL、缺少TM结构域的gH和至少一种其他HCMV糖蛋白的重组核酸。优选地，所述重组核酸：(a)不是自复制的RNA分子；(b)不是α病毒复制子；(c)不编码任何α病毒非结构蛋白，如NSP1、NSP2、NSP3和NSP4；(d)不含有内部核糖体进入位点(IRES)，如EMCV或EV71；和/或(e)不含有病毒2A位点，如FMDV。所述重组核酸的一个示例可以是编码本发明的gL蛋白、本发明的gH蛋白、本发明的pUL128蛋白、本发明的pUL130蛋白和本发明的pUL131蛋白的单个构建体。
本发明还提供了多个重组核酸，所述重组核酸编码一种或多种本发明的蛋白。例如，在本发明的一个实施方式中，提供了两种核酸构建体：编码本发明的gH蛋白和本发明的gL蛋白的第一构建体和编码本发明的pUL128蛋白、本发明的pUL130蛋白和本发明的pUL131A蛋白的第二构建体。
本发明还提供了多个重组核酸，包括：编码本发明的gL蛋白的第一重组核酸分子、编码本发明的gH蛋白的第二重组核酸分子和编码一种或多种其他HCMV蛋白的一个或多个第三重组核酸分子。优选地，所述第一、第二和/或第三重组核酸分子：(a)不是自复制的RNA分子；(b)不是α病毒复制子；(c)不编码任何α病毒非结构蛋白，如NSP1、NSP2、NSP3和NSP4；(d)不含有内部核糖体进入位点(IRES)，如EMCV或EV71；和/或(e)不含有病毒2A位点，如FMDV。
在一个实施方式中，所述第三重组核酸分子编码本发明的gO蛋白；而在另一个实施方式中，所述第三重组核酸分子编码本发明的pUL128、pUL130和pUL131A蛋白。因此，编码复合物中各单个多肽的序列可存在于单个核酸分子中，或者分散在两个或多个核酸分子中。
在一个实施方式中，本发明提供了多个重组核酸，包括：(i)编码本发明的gL蛋白的第一重组核酸分子、(ii)编码本发明的gH蛋白的第二重组核酸分子、(iii)编码本发明的pUL128蛋白的第三重组核酸分子、(iv)编码本发明的pUL130蛋白的第四重组核酸分子和(v)编码本发明的pUL131A蛋白的第五重组核酸分子。优选地，所述第一、第二、第三、第四和/或第五重组核酸分子：(a)不是自复制的RNA分子；(b)不是α病毒复制子；(c)不编码任何α病毒非结构蛋白，如NSP1、NSP2、NSP3和NSP4；(d)不含有内部核糖体进入位点(IRES)，如EMCV或EV71；和/或(e)不含有病毒2A位点，如FMDV。
编码本发明的gH蛋白的核酸分子可与SEQ ID NO:24具有多种程度的相同性，如与SEQ ID NO:24所列序列具有至少89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性。编码本发明的gL蛋白的核酸分子可与SEQ ID NO:25具有多种程度的相同性，如与SEQ ID NO:25所列序列具有至少89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性。编码本发明的pUL128蛋白的核酸分子可与SEQ ID NO:26具有多种程度的相同性，如与SEQ ID NO:26所列序列具有至少74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性。编码本发明的pUL130蛋白的核酸分子可与SEQ IDNO:27具有多种程度的相同性，如与SEQ ID NO:27所列序列具有至少74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性。编码本发明的pUL131A蛋白的核酸分子可与SEQ ID NO:28具有多种程度的相同性，如与SEQ ID NO:28所列序列具有至少74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性。
本发明的核酸可包含基因组DNA和/或cDNA。与cDNA不同，基因组DNA可含有内含子。一些基因在内含子存在时更有效地表达。基因组UL128和UL131A基因各由两个外显子组成，而UL130不含任何内含子。如果使用基因组序列，则所生成的蛋白将取决于剪接，所述剪接可根据所用表达系统而发生变化。
本发明提供了包含所述核酸的载体，所述载体包含合适的启动子和终止子。所述重组核酸可以是质粒，或者可整合至细胞的基因组中。这些载体中的启动子可以是HCMV启动子或非HCMV启动子。
本发明还提供了一种用于表达HCMV膜蛋白复合物的方法，所述HCMV膜蛋白复合物包含gH、gL和至少一种其他HCMV糖蛋白，所述方法为将编码gH、gL和至少一种其他HCMV糖蛋白的一种或多种重组核酸分子导入表达系统中，在所述表达系统中表达所述一种或多种核酸并纯化所述HCMV膜蛋白复合物。在一些实施方式中，该方法包括使用第一核酸构建体转染细胞，所述第一核酸构建体编码：本发明的gH、gL、pUL128、pUL130和pUL131A蛋白或者本发明的gH、gL和gO蛋白。在一些实施方式中，该方法可包括使用编码本发明的gH蛋白的第一核酸构建体、编码本发明的gL蛋白的第二核酸构建体和编码本发明的一种或多种其他HCMV糖蛋白的一个或多个第三核酸构建体转染细胞。在一些实施方式中，该方法可包括使用编码本发明的gH蛋白和本发明的gL蛋白的第一核酸构建体和编码本发明的一种或多种其他HCMV糖蛋白(如gO或pUL128、pUL130和pUL131A)的第二核酸构建体转染细胞。
可以在哺乳动物细胞中表达所述HCMV膜蛋白复合物。可选地，可纯化所述分离的HCMV膜蛋白复合物。
本发明的细胞
本发明还提供了一种表达本发明的一种核酸分子或多种核酸分子的细胞，所述细胞不包含完整的HCMV基因组。可使用本发明的所述核酸分子或多种核酸分子稳定地转化所述细胞。优选地，所述细胞是哺乳动物细胞，例如CHO细胞。
本发明提供了一种包含gH、gL和至少一种其他HCMV糖蛋白的细胞，所述细胞不含有HCMV基因组和/或不生产HCMV病毒颗粒和/或不表达任何非包膜HCMV蛋白。
膜蛋白复合物的分离和纯化
优选以分离的形式制备和使用本发明的复合物。本文所用术语“分离的”表示从其天然环境中移出的。因此，“分离的HCMV膜蛋白复合物”不包括HCMV感染的细胞表面上或者感染性HCMV病毒颗粒中的HCMV膜蛋白复合物。
可使用实施例中所述表达方法以高产量生产本发明的复合物[参见上文]。
本发明提供了用于纯化本发明的HCMV膜复合物的方法。本发明的这类方法允许以>85％、>86％、>87％、>88％、>89％、>90％、>91％、>92％、>93％、>94％或>95％的总蛋白的纯度(以质量计)生产HCMV膜蛋白复合物，所述纯度由凝胶电泳测定。这些高水平的纯度使复合物适用于作为诊断应用中的免疫原或作为疫苗制剂中的抗原。
本发明提供了一种用于纯化本发明的HCMV膜蛋白复合物的方法，所述纯化包括一个或多个色谱步骤。所述色谱步骤可包括亲和色谱(如Ni2+亲和色谱)和/或尺寸排阻色谱。
组合物
本发明还提供了包含分离的本发明的HCMV膜蛋白复合物的组合物。本发明还提供了包含纯化的本发明的HCMV膜蛋白复合物的组合物。
可将HCMV膜蛋白复合物纳入免疫原性组合物或疫苗组合物中。这类组合物可用于在哺乳动物(例如人)中产生抗体。
本发明提供了包含本发明的HCMV膜蛋白复合物的药物组合物。类似地，本发明提供了用于制备药物组合物的方法，涉及将本发明的HCMV膜蛋白复合物与药学上可接受的运载体混合。
除其抗原以外，本发明的免疫原性组合物和药物组合物通常还包含药学上可接受的运载体，关于此类运载体的详细讨论可见Remington:The Science andPractice of Pharmacy(《雷明顿：药物科学与实践》)。
组合物的pH通常为6-8，并且更优选6.5-7.5(例如，约7)。稳定pH可通过采用缓冲剂(例如Tris缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂或组氨酸缓冲剂)来维持。因此，组合物通常可包含缓冲剂。
组合物可以是无菌和/或无热原的。组合物可与人体等张。
组合物可包含免疫学有效量的其抗原。“免疫学有效量”是指当给予对象时有效引发针对所述抗原的抗体应答的量。该量可视待治疗个体的健康和生理状况、其年龄、该个体免疫系统合成抗体的能力、所需保护程度、疫苗配方、治疗医生对医疗状态的评估以及其它相关因素而变化。预计所述量将落入可通过常规试验确定的较宽范围内。本发明的组合物的抗原含量通常以每剂量中蛋白质的质量表示。10-500μg(例如50μg)/抗原的剂量可以是有用的。
免疫原性组合物可包含免疫学佐剂。因此，例如，它们可以包括铝盐佐剂或水包油乳液(例如包含鲨烯的水包油乳液，如MF59或AS03)。合适的铝盐包括氢氧化物(例如羟基氧化物)、磷酸盐(例如羟基磷酸盐、正磷酸盐)(例如，参见Vaccine Design(《疫苗设计》)的第8和第9章，1995，Powell和Newman编，ISBN:030644867X，普莱努出版社(Plenum))，或其混合物。这些盐可以是任意合适的形式(例如，凝胶、结晶、无定形物等)，优选抗原吸附于盐。给予患者的组合物中Al+++的浓度优选小于5mg/ml，例如小于4mg/ml、小于3mg/ml、小于2mg/ml、小于1mg/ml等。优选范围是0.3至1mg/ml。优选最大值0.85mg/剂量。氢氧化铝和磷酸铝佐剂特别适用于本发明。
一种合适的免疫学佐剂包含吸附于铝盐上的WO2011/027222中定义的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐。可使用多种其他佐剂，包括Powell和Newman(1995)中所公开的那些中的任意一种。
组合物可包含抗微生物剂，特别是以多剂量形式包装时。在疫苗中常见诸如硫柳汞和2-苯氧乙醇的抗微生物剂，但是优选使用不含汞的防腐剂或完全不用防腐剂。
组合物可包含去污剂，如聚山梨酯，如聚山梨酯80。去污剂以通常低水平存在，如小于0.01％。
组合物可含有钠盐(如氯化钠)以产生张力。NaCl浓度通常为10±2mg/ml，例如约9mg/ml。
本发明的组合物通常直接给予对象。可以通过胃肠道外注射(例如，皮下、腹膜内、静脉内、肌肉内或递送至组织间隙)，或通过任意其他合适的途径实现直接递送。优选肌肉内给予，例如给予到大腿或上臂。注射可以通过针头(例如皮下针头)进行，但也可以采用无针注射。肌肉内剂量体积通常是0.5ml。
给予可涉及单剂量方案或多剂量方案。
被免疫的对象是人类，其可以是任何年龄，例如0-12个月、1-5岁、5-18岁、18-55岁或超过55岁。
本发明的疫苗可以是预防性(即预防疾病)或治疗性(即减少或消除疾病症状)。
分离的和/或纯化的本发明的HCMV膜蛋白复合物可单独给予或在混合疗法方案(mixed-modality regime)中作为初免或加强方案给予，如在RNA初免后进行蛋白加强。与蛋白初免蛋白加强策略相比，RNA初免蛋白加强策略的益处包括例如抗体效价增加、IgG1:IgG2a亚型比例更平衡、与病毒颗粒的免疫应答类似的TH1型CD4+T细胞介导的免疫应答的诱导，以及产生的非中和抗体减少。RNA初免方案可增加组合物的免疫原性，这与其是否含有佐剂无关。
在RNA初免-蛋白加强策略中，RNA和蛋白针对同一靶抗原。合适的递送RNA的方式的示例包括病毒样复制子颗粒(VRP)、α病毒RNA、包封在脂质纳米颗粒(LNP)中的复制子或配制的RNA，如使用阳离子纳米乳液(CNE)配制的复制子。合适的阳离子水包油纳米乳液公开于WO2012/006380中，例如包含油核心(例如包含鲨烯)和阳离子脂质(例如DOTAP、DMTAP、DSTAP、DC-胆固醇等)。
WO2012/051211公开了在使用VRP和配制的RNA(CNE和LNP)免疫的小鼠中生产针对五聚体复合物的抗体，所述RNA编码五聚体复合物的蛋白组分。已发现这些抗体能够中和上皮细胞中的HCMV感染。RNA初免-蛋白加强方案可涉及首先(例如0-8周)使用编码本发明的HCMV膜蛋白复合物的一种或多种蛋白组分的RNA(其可作为VRP、LNP、CNE等进行递送)进行一次或多次初免免疫，并随后(例如24-58周时)使用以下物质进行一次或多次加强免疫：分离的本发明的HCMV膜蛋白复合物(可选使用佐剂配制)或者纯化的本发明的HCMV膜蛋白复合物(可选使用佐剂配制)。
因此，本发明提供一种免疫原性组合物，其包含：编码包含第一表位的第一多肽HCMV抗原的自复制RNA分子和包含第二表位的第二多肽HCMV抗原。本发明还涉及试剂盒，其包含：(i)包含编码第一多肽抗原的自复制RNA分子的初免组合物，所述第一多肽抗原包含来自病原体的第一表位，以及(ii)包含第二多肽抗原的加强组合物，所述第二多肽抗原包含来自病原体的第一表位。
抗原可独立地选自gB、gH、gL、gO、pUL128、pUL130和pUL131A。所述第一多肽HCMV抗原优选是本发明的HCMV膜蛋白复合物，如三聚体gH/gL/gO复合物或五聚体复合物。所述第二多肽HCMV抗原优选是：分离的本发明的HCMV膜蛋白复合物，如三聚体gH/gL/gO复合物或五聚体复合物或者纯化的本发明的HCMV膜蛋白复合物，如三聚体gH/gL/gO复合物或五聚体复合物。第一和第二多肽抗原可以是基本相同的。第一多肽抗原可以是可溶性或膜锚定的多肽，且第二多肽抗原可以是可溶性多肽。第一多肽抗原可以是融合多肽。第二多肽抗原可以是融合多肽。自复制RNA可以是α病毒来源的RNA复制子。
自复制RNA分子可包含一种或多种修饰的核苷酸。在一些实施方式中，自复制RNA分子编码本发明的HCMV膜蛋白复合物，如本发明的三聚体gH/gL/gO复合物或五聚体复合物。在一些实施方式中，第二多肽抗原是纯化的本发明的HCMV膜蛋白复合物，如纯化的本发明的三聚体gH/gL/gO复合物或五聚体复合物。
在一些实施方式中，RNA分子包封于以下物质中、结合以下物质或者吸附在以下物质上：阳离子脂质、脂质体、螺旋状物、病毒体、免疫刺激复合物、微粒、微球、纳米球、单层囊泡、多层囊泡、水包油乳液、油包水乳液、乳脂体(emulsome)、聚阳离子肽、阳离子纳米乳液或其组合。
在一些实施方式中，试剂盒的初免组合物或免疫组合物还包括：阳离子脂质、脂质体、螺旋状物、病毒体、免疫刺激复合物、微粒、微球、纳米球、单层囊泡、多层囊泡、水包油乳液、油包水乳液、乳脂体、聚阳离子肽或阳离子纳米乳液。
本发明的抗体
本发明提供了识别分离的和/或纯化的本发明的HCMV膜蛋白复合物但不结合分离的gH、gL、gO、pUL128、pUL130或pUL131A多肽中的任意一个和/或不结合分离的gH-gL异源二聚体的抗体。
如下文所述，本发明的抗体可以是人或人源化抗体和/或其可以是单克隆或多克隆抗体。
本发明的抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。在许多情况下优选单克隆抗体(mAb)。在最初与抗体联用时，术语“单克隆”指由免疫细胞的单克隆系产生的抗体，与之相反的是“多克隆”抗体，虽然全部识别相同的靶蛋白，但其由不同的B细胞产生并针对该蛋白上的不同表位。本文所用术语“单克隆”不暗示任何特定细胞来源，但指展示针对相同靶蛋白指特别表位具有单一结合特异性和亲和性的任何抗体群体。该用法是本领域中常见的。
因此，可使用任何合适的蛋白合成系统生产mAb，包括免疫细胞、非免疫细胞、无细胞系统等。因此，可通过多种技术产生mAb，包括传统的单克隆抗体方法(例如Kohler和Milstein的标准体细胞杂交技术)、通过B淋巴细胞的病毒或致癌转化、通过组合合成、通过噬菌体展示等。因此，可使用以下物质在体内产生本发明的抗体：作为抗原的分离的本发明的HCMV膜蛋白复合物或者作为抗原的纯化的本发明的HCMV膜蛋白复合物。产生抗体的动物可以是小鼠、大鼠、兔、山羊等。作为替代方法，可使用体外选择法鉴定抗体，如抗体的噬菌体展示。
本发明的抗体可以采用多种形式。例如，其可以是天然抗体，如天然状态下在哺乳动物中发现的那些。天然抗体由重链和轻链构成。重链和轻链都可分为可变结构域和恒定结构域。不同抗体识别不同抗原的能力来源于其轻链和重链中可变结构域的差异。脊椎动物物种中天然抗体的轻链是κ或λ，这取决于其恒定结构域的氨基酸序列。天然抗体重链的恒定结构域是α、δ、ε、γ或μ，分别形成IgA、IgD、IgE、IgG或IgM类的抗体。各类还可进一步分为亚类或同种型，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgA2等。还可通过同种异型对抗体进行分类，例如γ重链可具有G1m同种异型a、f、x或z、G2m同种异型n或者G3m同种异型b0、b1、b3、b4、b5、c3、c5、g1、g5、s、t、u或v；κ轻链可具有Km(1)、Km(2)或Km(3)同种异型。天然IgG抗体含有两条相同的轻链(一个恒定结构域CL和一个可变结构域VL和)和两条相同的重链(三个恒定结构域CH1、CH2和CH3和一个可变结构域VH)，其通过二硫桥键连接在一起。不同类天然抗体的结构域和三维结构是众所周知的。
当本发明的抗体具有带有恒定结构域的轻链时，其可以是κ或λ轻链。当本发明的抗体具有带有恒定结构域的重链时，其可以是δ、ε、γ或μ重链。优选γ类的重链(即IgG抗体)。
本发明的抗体可以是保留抗原结合活性的天然抗体片段。例如，对天然抗体进行木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段(其被称为“Fab”片段，各具有单个抗原结合位点)和残余的没有抗原结合活性的“Fc”片段。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点的“F(ab')2”片段。“Fv”是含有完整抗原结合位点的最小的天然抗体片段，由一条重链和一条轻链可变结构域的二聚体组成。因此，本发明的抗体可以是天然抗体的Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或任何其他类型的片段。
本发明的抗体可以是“单链Fv”(“scFv”或“sFv”)，包含作为单个多肽链的VH和VL结构域。通常，VH和VL结构域通过VH和VL结构域之间的短多肽接头(即大于12个氨基酸)连接在一起，其确保scFv形成抗原结合所需的结构。至少对于最初选择，表达scFv蛋白的典型方式是在噬菌体展示文库或其他组合文库中。可在单条多肽链中连接多个scFv。
本发明的抗体可以是“双抗体”或“三抗体”等，包含多个连接的Fv(scFv)片段。通过使用过短而不能彼此配对(例如小于12个氨基酸)的位于VH和VL结构域之间的接头，迫使其与另一个Fv片段的互补结构域配对并从而形成两个抗原结合位点。这些抗体可包括CH和/或CL结构域。
本发明的抗体可以是单个可变结构域或VHH抗体。天然发现于驼科动物(例如骆驼和美洲驼)和鲨鱼中的抗体含有重链但不含轻链。因此，抗原识别是由单个可变结构域确定的，这与哺乳动物天然抗体不同。这类抗体的恒定结构域可以省略，同时还保留抗原结合活性。至少对于最初选择，表达单个可变结构域抗体的一个方式是在噬菌体展示文库或其他组合文库中。
本发明的抗体可以是“结构域抗体”(dAb)。这类dAb是基于人抗体的重链或轻链的可变结构域且具有约13kDa的分子量(小于全长抗体大小的十分之一)。通过使识别不同靶标的重链和轻链dAb配对，可制备具有双重特异性的抗体。dAb可从体内快速清除并因此受益于缓释系统，但可通过与结合血液蛋白(例如结合血清白蛋白)的第二dAb融合、通过与聚合物偶联(例如与聚乙二醇偶联)或通过其他技术再使其维持在循环中。
抗体可具有基于纤连蛋白III型结构域的骨架，例如腺连蛋白或三活菌素(trinectin)。基于纤连蛋白的骨架不是免疫球蛋白，但总体折叠与最小功能的抗体片段的折叠密切相关。由于该结构，非免疫球蛋白抗体模拟了在性质和亲和力上与天然抗体类似的抗原结合特性。FnIII结构域具有分散在两个β片层之间的7或8个β链，其互相堆积形成了蛋白核心，此外还含有使β链彼此连接并接触溶剂的环(类似于抗体CDR)。在β片层夹层的各边缘处具有至少三个这类环，其中边缘是垂直于β链方向的蛋白边界。可使用标准克隆技术用免疫球蛋白CDR代替FnIII环，且FnIII环可用于与体内抗体的亲和成熟过程类似的体外环随机化和替换策略。FnIII骨架可基于纤连蛋白III型的第10个模块(即10Fn3)。
因此，本文所用术语“抗体”包括具有不同结构特征的多种蛋白，但通常包括至少一种免疫球蛋白结构域，在两个β片层之间排布了具有反平行β链的2层夹层的全β蛋白折叠。
本发明所用抗体可包括单个抗原结合位点(例如在Fab片段或scFv中)或多个抗原结合位点(例如在F(ab’)2片段或双抗体或天然抗体中)。当抗体具有超过一个抗原结合位点时，优选其可导致抗原的交联。
当抗体具有超过一个抗原结合位点时，该抗体可以是单特异性的(即所有抗原结合位点都识别同一抗原)或其可以是多特异性的(即抗原结合位点识别超过一种抗原)。
本发明的抗体可包括非蛋白物质，例如通过共价偶联。例如，抗体可包含放射性同位素，例如ZEVALINTM和BEXXARTM产品分别包含90Y和131I同位素。作为其他示例，抗体可包含细胞毒性分子，例如MYLOTARGTM与N-乙酰-γ卡奇霉素(一种细菌毒素)相连。作为其他示例，抗体可包括共价连接的聚合物，例如已报道与聚氧乙烯化的多元醇或聚乙二醇(PEG)的连接可增加抗体的循环半衰期。
在一些实施方式中，抗体可包括一个或多个恒定结构域(例如包括CH或CL结构域)。如上文所述，恒定结构域可形成κ或λ轻链或者α、δ、ε、γ或μ重链。当抗体包含恒定结构域时，其可以是天然恒定结构域或者修饰的恒定结构域。重链可包含三个(如在α、γ、δ类中)或四个(如在μ、ε类中)恒定结构域。恒定结构域不直接涉及抗体和抗原之间的结合相互作用，但其可提供多种效应功能，包括但不限于：使抗体参与抗体依赖的细胞毒性(ADCC)、C1q结合、补体依赖的细胞毒性、Fc受体结合、吞噬作用和细胞表面受体的下调。
恒定结构域可形成“Fc区”，即天然抗体重链的C端区域。当本发明的抗体包含Fc区时，其可以是天然的Fc区或修饰的Fc区。Fc区对于一些抗体的功能是重要的，例如HERCEPTINTM的活性是Fc依赖的。虽然天然抗体的Fc区的边界会发生变化，但通常将人IgG重链Fc区定义为从位于Cys226或Pro230氨基酸残基处延伸至重链的C端。Fc区通常能够结合一种或多种Fc受体，如FcγRI(CD64)、FcγRII(例如FcγRIIA、FcγRIIB1、FcγRIIB2、FcγRIIC)、FcγRIII(例如FcγRIIIA、FcγRIIIB)、FcRn、FcαR(CD89)、FcδR、FcμR、FcεRI(例如FcεRIαβγ2或FcεRIαγ2)、FcεRII(例如FcεRIIA或FcεRIIB)等。此外或或者，Fc区可结合补体蛋白，如C1q。对抗体Fc区的修饰可用于改变其效应功能，例如增加或减少受体结合亲和性。
抗体通常是糖基化的。例如，与重链的CH2结构域连接的N-连接的多糖可影响C1q和FcR结合，而无糖基化的抗体对这些受体的亲和性较低。多糖结构还可影响活性，例如补体介导的细胞死亡中的差异可取决于多糖的二天线链(biantennary chain)的末端处半乳糖的数目(0、1或2)。优选地，给药后抗体的多糖不会导致人免疫原性应答。
可以不含天然状态下与抗体发生结合的产品的形式制备抗体。抗体的天然环境的污染组分包括诸如酶、激素或其他宿主细胞蛋白的材料。
有用的抗体对于其靶抗原具有纳摩尔或皮摩尔级亲和常数，例如10-9M、10-10M、10-11M、10-12M、10-13M或更紧密。可使用常规分析技术测定这类亲和性，例如使用BIAcoreTM仪器中实施并根据生产商说明书使用的表面等离振子共振技术。
本发明所用的单克隆抗体可以是人抗体、人源化抗体、嵌合抗体或(如用于兽用目的)非人抗体。
在一些实施方式中，所述抗体是人mAb。可通过多种方法制备这些抗体。例如，可通过例如使用爱泼斯坦-巴尔二氏病毒(EBV)感染的方式使产生感兴趣的抗原的人B细胞永生化，可选在多克隆B细胞激活剂存在的情况下进行上述永生化。还可在非人宿主中通过使用有功能的人免疫系统(例如对Scid小鼠或Trimera小鼠)代替宿主自身的免疫系统来生产人单克隆抗体。已成功地使用转基因和转染色体小鼠来制备人单克隆抗体，包括来自Medarex的“humab小鼠”和来自Abgenix的“异源性小鼠(xeno-mouse)”，在本文中统称为“人Ig小鼠”。噬菌体展示也已被成功地用于该目的。不同于非人抗体，人抗体在给予人时不会引发针对其恒定结构域的免疫应答。此外，这些人抗体的可变结构域是完全人的(具体而言，除互补决定区(CDR)外，可变结构域的框架区也是完全人的)，因此其在给予人时不会引发针对可变结构域框架区的免疫应答(潜在的例外是任何抗独特型应答)。人抗体不包括任何不具有人来源的序列。
在一些实施方式中，所述抗体是人源化mAb、CDR移植mAb或嵌合mAb。可通过多种方法制备这些抗体。例如，可基于非人(例如鼠)单克隆抗体的序列进行制备。可使用标准分子生物学技术获得编码非人重链和轻链免疫球蛋白的DNA并对其进行基因工程改造以使其含有人免疫球蛋白序列。例如，为制备嵌合抗体，可使用本领域已知方法将鼠可变区连接至人恒定区。为制备CDR移植mAb，可将鼠CDR区插入人框架中。为制备人源化抗体，还可改变一个或多个非CDR可变框架残基。可将H1、H2和H3CDR一起转移至受体VH结构域中，但仅转移其中的一种或两种也是适当的。类似地，可将L1、L2和L3CDR中的一种、两种或全部三种转移至受体VL结构域中。优选的抗体含有1种、2种、3种、4种、5种或全部6种供体CDR。当只有一种CDR被转移时，其通常不会是六种CDR中最短的L2CDR。通常，供体CDR都来自于同一人抗体，但也可将其混合以例如转移来自第一抗体的轻链CDR和来自第二抗体的重链CDR。
在一些实施方式中，所述抗体是非人mAb。可通过多种方法制备这些抗体，例如最初的用于制备鼠mAb的Kohler和Milstein技术。
用于产生本发明抗体的方法
本发明还提供了一种产生抗体的方法，该方法使用：分离的本发明的HCMV膜蛋白复合物和纯化的本发明的HCMV膜蛋白复合物。这些抗体可以是人或人源化的。优选地，这些抗体特异性针对分离的本发明的HCMV膜蛋白复合物但不结合分离的gH、gL、gO、pUL128、pUL130或pUL131A。这类抗体可用于诊断试验，并可被直接或间接标记。本领域技术人员已知多种抗体标记。在本发明的其他实施方式中，本发明的抗体可用于治疗，例如治疗HCMV感染，并可以是中和抗体的形式，其可抑制或中和抗原的生物活性。
定义
本文中用于描述多核苷酸的“重组”指基因组、cDNA、半合成或合成来源的多核苷酸，根据其来源或操作，所述多核苷酸：(1)与天然情况下与其相关的全部或部分多核苷酸不相关；和/或(2)连接至除天然情况下与其相连的多核苷酸以外的多核苷酸。与蛋白或多肽联用时，术语“重组”指由重组多核苷酸表达生成的多肽。
术语“包括”涵盖“包含”以及“由……组成”，例如，“包括”X的组合物可以仅由X组成或可包含其它物质，例如X+Y。
术语“基本上”不排除“完全”，如“基本上不含”Y的组合物可能完全不含Y。如有需要，“基本上”一词可从本发明的定义中省略。
与数值x相关的术语“约”是可任选的，并且表示，例如x±10％。
除非另有明确说明，包括混合两种或更多种组分的步骤的工艺不要求任何特定的混合顺序。因此，组分可以任何顺序混合。在有三种组分时，可将两种组分相互合并，然后可将组合与第三种组分混合等。
将动物(特别是牛)材料用于培养细胞时，其应获自未患传染性海绵状脑病(TSE)，具体是未患牛海绵状脑病(BSE)的来源。总之，优选在完全不含动物来源物质的条件下培养细胞。
将化合物作为组合物的一部分给予机体时，该化合物或可由合适的前药替代。
优选通过使用Needleman-Wunsch全局比对算法(Needleman和Wunsch，1970)的逐对比对算法、使用默认参数(如缺口开放罚分＝10.0，缺口延伸罚分＝0.5，使用EBLOSUM62积分矩阵)来测定多肽序列之间的序列相同性。用EMBOSS软件包中的needle工具能方便地实施这种算法(Rice、Longden和Bleasby，2000)。应在本发明多肽序列的全长上计算序列相同性。
本发明的具体实施方式
本发明的具体实施方式包括：
28.一种用于生产分离的HCMV膜蛋白复合物的方法，所述HCMV膜蛋白复合物包含gH、gL和至少一种其他HCMV糖蛋白，所述方法包括重组表达所述gH、gL和至少一种其他HCMV糖蛋白。
29.如权利要求1所述的方法，所述方法包括HCMV膜蛋白复合物的纯化。
30.一种用于表达HCMV膜蛋白复合物的方法，所述HCMV膜蛋白复合物包含gH、gL和至少一种其他HCMV糖蛋白，所述方法包括：
-将编码gH、gL和至少一种其他HCMV糖蛋白的一种或多种重组核酸分子导入表达系统中；
-在所述表达系统中表达所述一种或多种核酸；以及
-纯化所述膜蛋白复合物。
31.如权利要求3所述的方法，所述方法包括使用编码缺少跨膜结构域的gH片段的第一核酸构建体、编码gL蛋白的第二核酸构建体和编码至少一种其他HCMV糖蛋白的第三核酸构建体转染细胞的步骤。
32.如权利要求3或4所述的方法，所述HCMV膜蛋白复合物在哺乳动物细胞中表达。
33.一种用于生产纯化的HCMV膜蛋白复合物的方法，所述HCMV膜蛋白复合物包含gH、gL和至少一种其他HCMV糖蛋白，所述方法包括根据权利要求3的方法表达所述HCMV膜蛋白复合物并纯化分离的HCMV膜蛋白复合物。
34.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述HCMV膜蛋白复合物由gH、gL和gO组成。
35.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述HCMV膜蛋白复合物由gH、gL、pUL128、pUL130和pUL131A组成。
如前述权利要求中任一项所述的方法，所述gH包含SEQ ID NO:1、2、3、4、6、29或30或由其组成；和/或所述gL包含SEQ ID NO:7、8、9或31或由其组成。
36.如权利要求7所述的方法，所述gO包含SEQ ID NO:10、11、12或32或由其组成。
37.如权利要求8或9所述的方法，其中：
-所述pUL128包含SEQ ID NO:13、14、15或33或由其组成；
-所述pUL130包含SEQ ID NO:16、17或34或由其组成；和/或
-所述pUL131A包含SEQ ID NO:18、19、20或35或由其组成。
38.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中：
-所述gH包含与SEQ ID NO:1、2、3、4、6、29或30具有至少70％相同性的序列或由其组成；和/或
-所述gL包含与SEQ ID NO:7、8、9或31具有至少70％相同性的序列或由其组成。
39.如权利要求11所述的方法，所述gO包含与SEQ ID NO:10、11、12或32具有至少70％相同性的序列或由其组成。
40.如权利要求12所述的方法，其中：
-所述pUL128包含与SEQ ID NO:13、14、15或33具有至少70％相同性的序列或由其组成；
-所述pUL130包含与SEQ ID NO:16、17或34具有至少70％相同性的序列或由其组成；和/或
-所述pUL131A包含与SEQ ID NO:18、19、20或35具有至少70％相同性的序列或由其组成。
41.一种用于纯化前述权利要求中任一项所定义的HCMV膜蛋白复合物的方法，所述纯化包括一个或多个色谱步骤。
42.如权利要求14所述的方法，所述色谱步骤包括亲和色谱(优选Ni2+亲和色谱)和/或尺寸排阻色谱。
43.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述HCMV膜蛋白复合物具有以质量计>85％、>86％、>87％、>88％、>89％、>90％、>91％、>92％、>93％、>94％或>95％的纯度。
44.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述HCMV膜蛋白复合物中的一种或多种gH、gL、gO、pUL128、pUL130和pUL131A：
-具有哺乳动物糖基化模式；和/或
-不含有昆虫细胞糖基化模式。
45.一种包含gH、gL和至少一种其他HCMV糖蛋白的纯化的HCMV膜蛋白复合物。
46.一种包含gH、gL和至少一种其他HCMV糖蛋白的HCMV膜蛋白复合物，所述复合物通过前述权利要求中任一项所述的方法生产。
47.一种包含权利要求18或19所述的分离的HCMV膜蛋白复合物的组合物。
48.如权利要求20所述的组合物，所述组合物不含聚丙烯酰胺。
49.如权利要求20或21所述的组合物，所述组合物不含HCMV被膜或衣壳蛋白。
50.如权利要求20-22中任一项所述的组合物，所述组合物是液体。
51.如权利要求20-23中任一项所述的组合物，所述组合物是免疫原性组合物。
52.如权利要求24所述的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物含有gB。
53.如权利要求25所述的免疫原性组合物，所述gB包含SEQ ID NO:21、22、23或36或由其组成。
54.如权利要求26所述的免疫原性组合物，所述gB包含与SEQ ID NO:21、22、23或36具有至少70％相同性的序列或由其组成。
55.如权利要求25-27中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述gB：
-具有哺乳动物糖基化模式；和/或
-不含有昆虫细胞糖基化模式。
56.如权利要求24-28中任一项所述的免疫原性组合物，所述组合物是疫苗。
57.如权利要求24-29中任一项所述的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含佐剂。
58.如权利要求30所述的免疫原性组合物，所述佐剂是水包油乳剂或铝盐。
59.一种免疫原性组合物，其包含：
-编码HCMV膜蛋白复合物的自复制RNA分子；以及
-权利要求18或19所述的HCMV膜蛋白复合物。
60.一种试剂盒，所述试剂盒包括：
-包含编码HCMV膜蛋白复合物的自复制RNA分子的初免组合物；以及
-包含权利要求18或19所述的HCMV膜蛋白复合物的加强组合物。
61.一种编码gL、缺少跨膜结构域的gH和至少一种其他HCMV糖蛋白的重组核酸分子，所述重组核酸：
(a)不是自复制RNA分子；
(b)不是α病毒复制子；
(c)不编码任何α病毒非结构蛋白，如NSP1、NSP2、NSP3和NSP4；
(d)不含：内部核糖体进入位点(IRES)，如EMCV或EV71；和/或
(e)不含病毒2A位点，如FMDV。
62.如权利要求34所述的重组核酸分子，所述重组核酸分子编码：
-gL、缺失跨膜结构域的gH、pUL128、pUL130和pUL131A；或
-gL、缺失跨膜结构域的gH和gO。
63.多种重组核酸，所述多种重组核酸编码gL、缺失跨膜结构域的gH和至少一种其他HCMV糖蛋白，其中一种或多种或者全部所述多种重组核酸：
(a)不是自复制RNA分子；
(b)不是α病毒复制子；
(c)不编码任何α病毒非结构蛋白，如NSP1、NSP2、NSP3和NSP4；
(d)不含：内部核糖体进入位点(IRES)，如EMCV或EV71；和/或
(e)不含病毒2A位点，如FMDV。
64.如权利要求36所述的多种重组核酸，包括：
-编码缺少跨膜结构域的gH和gL的第一构建体；以及
-编码一种其他HCMV糖蛋白的第二构建体。
65.如权利要求37所述的多种重组核酸，所述第二构建体编码：
-pUL128、pUL130和pUL131A；或
-gO。
66.如权利要求36所述的多种重组核酸，包括：
-编码gL的第一重组核酸分子；
-编码缺少跨膜结构域的gH片段的第二重组核酸分子；以及
-编码一种或多种其他HCMV蛋白的一种或多种第三重组核酸分子。
67.如权利要求34或35所述的重组核酸分子，或如权利要求36-39中任一项所述的重组核酸分子，其中：
(a)编码gH的所述核酸分子与SEQ ID NO:24中所列序列具有89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性；
(b)编码gL的所述核酸分子与SEQ ID NO:25中所列序列具有89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性；
(c)编码pUL128的所述核酸分子与SEQ ID NO:26中所列序列具有74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性；
(d)编码pUL130的所述核酸分子与SEQ ID NO:27中所列序列具有74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性；和/或
(e)编码pUL131A的所述核酸分子与SEQ ID NO:28中所列序列具有74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性。
68.一种表达权利要求34-40中任一项所述的重组核酸或多种重组核酸的细胞，所述细胞不含有完整的HCMV基因组。
69.如权利要求41所述的细胞，其中使用所述重组核酸或多种重组核酸稳定地转化所述细胞。
70.如权利要求41或42所述的细胞，所述细胞是哺乳动物细胞。
71.一种包含gH、gL和至少一种其他HCMV糖蛋白的细胞，所述细胞：
(a)不含HCMV基因组；
(b)不生产HCMV病毒颗粒；
(c)不含编码所述gH、gL和至少一种其他HCMV糖蛋白的自复制RNA分子；和/或
(d)不含α病毒复制子。
72.一种用于生产分离的或纯化的HCMV膜蛋白复合物的方法，所述HCMV膜蛋白复合物包含gH、gL和至少一种其他HCMV糖蛋白，所述方法涉及在生长培养基中生长权利要求41-44中任一项所述的细胞。
73.如权利要求45所述的方法，所述HCMV膜蛋白复合物被分泌至所述生长培养基中。
74.如权利要求46所述的方法，所述HCMV膜蛋白复合物累积至每升生长培养基中>0.8mg、>0.85mg、>0.88mg、>0.9mg、>0.95mg、>1mg、>1.5mg、>2mg、>2.5mg、>3mg、>3.5mg、>4mg、>4.5mg、>5mg复合物的浓度。
75.如权利要求45-47中任一项所述的方法，所述方法包括从所述生长培养基中纯化所述HCMV膜蛋白复合物。
76.一种使用权利要求18或19所述的HCMV膜蛋白复合物产生抗体的方法。
77.如权利要求49所述的方法，所述抗体是人或人源化的。
78.如权利要求49或50所述的方法，所述抗体是中和抗体。
79.一种通过权利要求49-51中任一项所述的方法生产的抗体。
80.一种通过权利要求49-52中任一项所述的方法生产的抗体，所述抗体结合分离的前述权利要求中任一项所述的HCMV膜蛋白复合物，但不结合分离的gH、gL、gO、pUL128、pUL130或pUL131A。
81.如权利要求52或53所述的抗体，所述抗体用于诊断试验。
82.如权利要求52-54中任一项所述的抗体，所述抗体被直接或间接标记。
83.如权利要求52-53中任一项所述的抗体，所述抗体用于治疗。
58.一种RNA初免-蛋白加强方案，所述方案包括：
-使用编码HCMV膜蛋白复合物的一种或多种蛋白组分的RNA进行一次或多次初免免疫，所述HCMV膜蛋白复合物包含gH、gL和至少一种其他HCMV糖蛋白；
-随后使用纯化的HCMV膜蛋白复合物进行一次或多次加强免疫，所述纯化的HCMV膜蛋白复合物包含gH、gL和至少一种其他HCMV糖蛋白。
附图简要说明
图1显示了用于在哺乳动物细胞中表达His标记的可溶性gH的7591bp构建体的质粒图。该构建体的核苷酸序列如SEQ ID NO:23所示。该构建体包含CMV启动子、与myc-聚组氨酸标签融合的编码SEQ ID NO:4(由全长gH蛋白的氨基酸残基1-715组成的gH可溶性蛋白)的基因、牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化(bgh-PolyA)信号终止序列、F1噬菌体复制起点、SV40复制起点、新霉素抗性基因、pUC亚基因组启动子和氨苄青霉素抗性基因。
图2显示了用于在哺乳动物细胞中表达gL的5156bp构建体的质粒图。该构建体的核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示。该构建体包含含有内含子A的CMV启动子/增强子、编码SEQ ID NO:7(gL)的基因、牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化(bgh-PolyA)信号终止序列、卡那霉素抗性基因和ColE1复制起点。
图3显示了用于在哺乳动物细胞中表达UL128的4835bp构建体的质粒图。该构建体的核苷酸序列如SEQ ID NO:25所示。该构建体包含含有内含子A的CMV启动子/增强子、UL128基因、牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化(bgh-PolyA)信号终止序列、卡那霉素抗性基因和ColE1复制起点。
图4显示了用于在哺乳动物细胞中表达UL130的4964bp构建体的质粒图。该构建体的核苷酸序列如SEQ ID NO:26所示。该构建体包含含有内含子A的CMV启动子/增强子、UL130基因、牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化(bgh-PolyA)信号终止序列、卡那霉素抗性基因和ColE1复制起点。
图5显示了用于在哺乳动物细胞中表达UL131A的4709bp构建体的质粒图。该构建体的核苷酸序列如SEQ ID NO:27所示。该构建体包含含有内含子A的CMV启动子/增强子、UL131A基因、牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化(bgh-PolyA)信号终止序列、卡那霉素抗性基因和ColE1复制起点。
图6泳道A-C对应于银染SDS-PAGE，而泳道E-K对应于Western印迹分析。在泳道E-G中，绿色＝抗APP标签(gH)且红色＝抗gL，而在泳道H-K中，红色＝抗6His(gO)。梯标记物在泳道A、E和H中显示。泳道B、F和I对应于已在二硫苏糖醇(DTT)存在的情况下被简单加热至接近沸腾的样品，而泳道C、G和K对应于未受热或DTT处理的样品。
图7显示了尺寸排阻色谱。全部五种蛋白均洗脱为单峰，因此表明存在完整的五聚体复合物。
图8显示了SDS-PAGE和Western印迹分析。
图9显示了单独的gH/gL或使用MF59配制的gH/gL引发的中和效价与单独的五聚体复合物或使用MF59配制的五聚体复合物引发的中和效价之间的比较。与未配制的蛋白相比，纯化的使用MF59配制的五聚体复合物引发了更高的中和效价。
图10显示了单独的五聚体复合物(A)、使用MF59配制的五聚体复合物(B)、使用羟基氧化铝配制的五聚体复合物(C)和使用吸附有TLR7激动剂的氢氧化铝配制的五聚体复合物(D)引发的中和效价。
图11显示了单独或联用的自扩增RNA和亚基引发了高中和抗体效价。具体而言，显示了由以下物质引发的中和效价：编码HCMV五聚体复合物的自扩增RNA(包封在LNP中的自复制RNA)、佐剂为MF59的纯化的五聚体亚基、之后是MF59中亚基的自扩增RNA的不同序列，或者自扩增RNA和亚基的组合。自扩增RNA和亚基剂量为1μg，混合的剂量为1+1μg。中和试验：在补体存在的情况下ARPE-19细胞的VR1814感染。
图12显示了针对在(A)3wp3(第64天)和(B)4wp3(第71天)使用纯化的gH/gL和五聚体亚基接种的CD4+T细胞应答(以CD4+T细胞的净百分比和Th0、Th1和Th2CD4的百分比表示)。
图13显示了针对在(A)3wp3(第64天)和(B)4wp3(第71天)使用纯化的五聚体复合物接种的CD4+T细胞应答(以CD4+T细胞的净百分比表示)。
图14显示了针对在(A)3wp3(第64天)和(B)4wp3(第71天)使用纯化的五聚体复合物接种的CD8+T细胞应答(以CD8+T细胞的净百分比表示)。
图15显示了针对在(A)3wp3(第64天)和(B)4wp3(第71天)使用gH肽池2接种的CD8+T细胞应答(以CD8+T细胞的净百分比表示)。
实施例
实施例1–表达五聚体复合物的复制子的免疫原性
在WO 2012/051211中，生产了从单个构建体中表达五聚体复合物的全部五种蛋白(gH、gL、pUL128、pUL130和pUL131A)的α病毒复制子载体。通过使复制子与CNE复合或者通过将复制子包封在LNP中来将通过该载体表达的RNA包装为VRP或配制为RNA疫苗。VRP和配制的RNA用于以三周间隔免疫BALB/c小鼠。来自免疫的小鼠的血清被用于微中和试验以阻断(不存在补体的情况下)HCMV TB40对上皮细胞的感染。HCMV TB40毒株与临床毒株类似且感染HCMV在体内的天然靶细胞，内皮细胞和上皮细胞(17)。微中和试验数据显示，表达五聚体复合物的复制子比表达gH/gL的复制子引发更强效的中和抗体。微中和试验数据还显示，由表达五聚体复合物的RNA引发的抗体能够在上皮细胞中中和HCMV感染(因为抗体靶向五聚体复合物)，但不能在成纤维细胞中中和HCMV感染(在成纤维细胞中感染不需要五聚体复合物)，因此表明表达五聚体复合物的RNA引发特异性靶向完整的五聚体复合物而非gH/gL二聚体的抗体。该工作表明，可针对五聚体复合物产生抗体，且这些抗体能够中和HCMV感染。
实施例2–用于在哺乳动物细胞中稳定表达五聚体复合物的构建体
生产了5种核酸构建体以在哺乳动物细胞中表达和纯化五聚体复合物。当构建体包括编码全长gH蛋白的基因时，先前纯化五聚体复合物的尝试是不成功的。在克服该问题的尝试中，发明人生产了仅编码具有C端myc-(His)6标签的gH(gHecto)的胞外域(SEQ ID NO:6)而非全长序列的构建体。使用了以下5种构建体以生产五聚体复合物：编码SEQ ID NO:6的构建体(图1和SEQ IDNO:23)、编码全长gL的构建体(图2和SEQ ID NO:24)、编码全长pUL128的构建体(图3和SEQ ID NO:25)、编码全长pUL130的构建体(图4和SEQID NO:26)和编码全长pUL131A的构建体(图5和SEQ ID NO:27)。
实施例3–用于在293-6E细胞中转染和表达蛋白复合物的实验方案
材料：
哺乳动物293-6E细胞(吉布可公司(Gibco)FreeStyle 293表达培养基)；Opti-MEM和直链聚乙烯亚胺(PEI)，MW 25,000。
细胞的制备
293-6E细胞维持在无血清293表达培养基中。一旦细胞每24小时倍增一次且处于超过90％的活性，则将细胞稀释为1x106/1mL培养基的浓度。
转染
使用体积为待转染细胞培养物体积的2.5％的Opti-MEM稀释对应于各构建体的DNA。将DNA构建体以适当比例混合以使总DNA等于1μg/1mL培养物体积。例如，对于使用1L细胞培养物的五聚体复合物的稳定表达，向25mL Opti-MEM中加入200μg的各SEQ ID NO:23-27。
使用体积为待转染细胞培养物体积的2.5％的Opti-MEM在Opti-MEM中稀释PEI。将稀释的PEI在室温下孵育5分钟并偶尔涡旋以进行混合。每1mL培养物使用3μg PEI(例如对于1L细胞培养物，将3mg PEI稀释在25mLOpti-MEM中)。
向PEI混合物中加入DNA混合物(使得每1mL培养物使用1μg总DNA+3μg PEI)，涡旋并在室温下孵育30分钟。向细胞中加入DNA-PEI混合物，期间逐渐加入混合物并偶尔涡旋细胞使得混合物均匀地加入培养物中。随后立即使细胞回复至初始生长条件。
表达和收获
转染后3天，通过对细胞以2,000rpm进行离心来收获培养基。随后将培养基浓缩约10倍并透析至含300mM NaCl、25mM Tris pH 7.5的缓冲液中。最后，在-80℃下冷冻透析的培养基。向培养物中加入新鲜培养基并在三天后收获培养基并如上文所述进行浓缩/透析。
实施例4–纯化HCMV复合物的实验方案
材料：
GE公司的AKTAxpress；凯杰公司(Qiagen)的Ni-NTA超流筒(SuperflowCartridge)，5ml；96孔干净的V形底2mL聚丙烯块；缓冲液A(＝结合缓冲液)50mM Tris-HCl pH 7.5、300mM NaCl、5mM咪唑；缓冲液B(＝洗脱缓冲液)50mM Tris-HCl pH 7.5、300mM NaCl、1M咪唑；SEC缓冲液(＝用于缓冲液交换和尺寸排阻色谱)；用于系统清洁的2x 500ml 0.5M NaOH溶液；英杰公司(Invitrogen)的Novex 4-12％Bis-Tris凝胶1.0mm，12孔；LDS样品缓冲液(4X)和样品还原剂(10X)。
方法
使用无内毒素的储液和过滤的Milli-Q水配制缓冲液。
在温水浴中对待纯化的培养基进行解冻。同时，使用0.5M NaOH清洗AKTAxpress以除去可能的内毒素污染以及残留的蛋白/培养基，并随后使用过滤的无内毒素Milli-Q水洗涤。
将Ni-NTA超流筒与AKTAxpress系统连接，并使水和缓冲液A和B就位。随后启动程序“Ni-NTA prep”以使用缓冲液冲洗系统，洗去柱中的乙醇，并使缓冲液A通过柱以对其进行平衡。
通过向各孔中加入3.5μl 500mM EDTA溶液来准备组分收集96孔。也在即将加载前准备加载样品。在培养基解冻后，加入1/500体积的2.5M咪唑储液，并温和混合。随后使加载样品就位。
随后启动纯化程序。该程序进行以下步骤：将样品加载至柱上；使用缓冲液A洗去未结合的化合物直至基线稳定；使用15个柱体积的2.5％缓冲液B(＝30mM咪唑)洗去非特异性结合的化合物；使用10个柱体积的25％缓冲液B(＝254mM咪唑)洗脱HCMV蛋白复合物；并最后使用5个柱体积的100％缓冲液B(＝1M咪唑)清洗柱。样品加载速率是2.5ml/分钟，而清洗和洗脱速率是5mL/分钟。收集了全部通过的流体和1.75ml来自清洗和洗脱的各组分。
选择来自250mM咪唑洗脱峰的6或7个组分以通过SDS-PAGE进行分析。将根据SDS-PAGE凝胶具有最高蛋白量的4或5个组分收集在一起，并使其对2L SEC缓冲液在室温下透析1小时，共进行两次透析。回收透析液并使用BCA法测量浓度。通过Western印迹验证纯化的蛋白池中复合物的所有组分是否存在。
为提高一些样品的纯度，进行尺寸排阻色谱(SEC)。在使用SEC缓冲液平衡Superdex 20010/300GL(GE医疗保健公司(GE Healthcare)，17-5175-01)时，平衡超过两个柱体积。加载透析的池，使一个柱体积缓冲液通过柱，并收集1mL组分。进行SDS-PAGE以确定哪个组分是需要收集并保留的。
实施例5–三聚体gH/gL/gO复合物的表达、纯化和表征
生产以下三个构建体：带有C端APP标签的gH胞外域、全长gL和带有C端(His)6标签的全长gO。根据实施例3所述方法在HEK 293细胞中共表达这三个构建体。进行涉及Ni2+亲和色谱的实施例4的纯化方法。
随后对纯化的样品进行SDS-PAGE，之后使用抗APP标签(gH)、抗gL和抗6His(gO)抗体进行Western印迹分析。这三个抗体在还原条件(+热、+DTT)下结合不同蛋白，但在非还原条件(-热、-DTT)下均结合单个复合物。这些结果显示了作为三聚体复合物的gH/gL/gO的成功纯化。从HEK 293细胞中纯化了约0.5mg/L培养基的复合物。SEC提高了gH/gL/gO复合物的纯度。
实施例6–五聚体复合物的表达和纯化
根据实施例3所述的方法使用实施例2所述的5种构建体共转染HEK293细胞，在转染后3天和6天收获培养基，并根据实施例4的方法通过Ni-NTA色谱纯化表达的蛋白。
纯化的五聚体复合物的尺寸排阻色谱中的单峰(图7)显示已成功地纯化了完整的单聚体复合物。为评估是否全部5种五聚体复合物成员(gH胞外域-His、gL、pUL128、pUL130和pUL131A)均存在于纯化的复合物中，进行SDS-PAGE和Western印迹分析。
实施例7–HCMV五聚体复合物的Western印迹
材料：
伯乐公司(BioRad)的Trans-Blot SD半干电转槽；英杰公司的硝酸纤维素膜，0.2μm孔；转移缓冲液(20X)；甲醇；封闭缓冲液；DPBS；10x PBS；一抗：小鼠抗His标签、兔抗gL 27-46、小鼠抗pUL1284B10、小鼠抗UL1303E3和兔抗UL131A 90-136；二抗：IRDye 800CW山羊抗兔IgG(H+L)、IRDye 680LT山羊抗小鼠IgG(H+L)。
方法
使用三组抗体，一组用于gH胞外域-His/gL的检测，一组用于pUL128/pUL131A的检测且一组用于pUL130的检测。
将9μl的蛋白与3μl的LDS样品缓冲液/还原剂混合物(9:1)混合并在100℃下煮沸3分钟。将煮沸的样品加载在孔上并在200V下运行35分钟。随后使用Trans-Blot SD半干电转槽将蛋白转移至0.2μm硝酸纤维素膜，在20V下转移35分钟。使用封闭缓冲液在室温下对膜封闭30分钟。将膜与一抗在室温下孵育1小时。一抗溶液由以下物质组成：(A)1:10000稀释的抗His标签和1:5000稀释的抗gL、(B)1:500稀释的抗pUL128和1:1000稀释的抗UL131A和(C)1:500稀释的抗UL130，所有抗体均稀释在封闭缓冲液和DPBS的1:1混合物中。使用PBS+0.1％吐温在室温下对膜清洗三次，随后将膜与二抗溶液在室温下孵育1小时。对于膜(A)和(B)，使用封闭缓冲液和DPBS的1:1混合物中1:25000稀释的各抗小鼠和抗兔抗体。对于膜(C)，仅使用1:25000稀释的抗小鼠抗体。使用PBS+0.1％吐温在室温下对膜清洗三次，随后使用DPBS在室温下清洗一次。使用Odyssey红外成像系统(Li-Cor 9201)对膜进行扫描并使用Odyssey软件2.1.12版进行分析。
通过SDS-PAGE和Western印迹鉴定到五聚体复合物的全部5种成员(gH胞外域-His、gL、pUL128、pUL130和pUL131A)均存在于纯化的复合物中(图8)，从而确认已成功地对五聚体复合物进行了纯化。
在没有热和DTT的情况下，gH胞外域-His、gL和pUL128在SDS Bis-tris凝胶中共迁移，但在DTT存在的情况下pUL128与gH/gL的连接完全消失了(数据未显示)，因此表明pUL128与gH/gL通过二硫键连接。pUL130/pUL131A不与gH/gL/pUL128共迁移，显示其通过非共价键整合在五聚体复合物中。
在非还原非煮沸条件下凝胶上最明显的条带在靠近gH/gL复合物的位置，并因此被认为对应于HCMV五聚体复合物。预测纯度为90％(以质量计)。使用SEC纯化后，纯度提高至接近100％。可通过Ni-NTA纯化方法从每升培养基中纯化约0.6mg的五聚体复合物。
实施例8–重组五聚体复合物结合构象依赖的中和抗体
从血清阳性个体的记忆B细胞中分离了一组人中和抗体(HumAb)。进行直接ELISA，其中五聚体复合物蛋白固定在板上并以10倍梯度稀释加入中和抗体。该ELISA的结果如表1所示。HumAb结合数种UL蛋白和gH/gL/pUL128/pUL130，确认了五聚体复合物形式的正确构象。HumAb针对gH的结合暗示这些表位在重组复合物上暴露。
表1
实施例9–五聚体复合物比gH/gL引发更高的中和效价
使用或不使用MF59配制0.1/1μg纯化的gH/gL和0.16μg/1.6μg五聚体复合物蛋白并用于小鼠免疫。3wp3的中和效价显示了与gH/gL相比五聚体复合物约4倍的增长，其中与gB相比gH/gL引发了更高的中和效价(图9)。与未配制的蛋白相比，纯化的使用MF59配制的五聚体引发了更高的中和效价(图9)。使用吸附了TLR7激动剂的氢氧化铝配制的五聚体复合物甚至引发了比使用羟基氧化铝和/或MF59配制更高的中和效价(图10)。
实施例10–使用纯化的gH/gL/gO作为抗原生产单克隆抗体
将纯化的gH/gL/gO复合物在150mM NaCl、25mM Tris(pH 7.5)、1mMEDTA中稀释至0.4mg/mL并冷冻。在接种日解冻gH/gL/gO复合物并向解冻的gH/gL/gO复合物中加入438μl的佐剂并通过颠倒试管至少10次进行充分混合。在混合的1小时内使用所得组合物。
使用包含50μg纯化的gH/gL/gO和MF59佐剂的组合物免疫两组小鼠，每组含有3只6-8周龄的雌性BALB/c小鼠。在各股四头肌中使用125μL免疫各小鼠(即各小鼠接受250μL)并从其眶窦中取血。
对于各含三只小鼠的组，免疫计划如下文表2所示：
表2
周 0 0 3 5 6 8
方案 取血0 免疫1 免疫2 取血2 免疫3 取血3
为纯化针对gH/gL/gO的单克隆抗体，将gH/gL/gO抗原用于初步ELISA筛选，随后使用gH/gL抗原对来自初步筛选的阳性克隆进行进一步筛选。
使用类似方法使用纯化的五聚体复合物作为抗原以生产单克隆抗体。
实施例11：使用HCMV五聚体抗原的SAMTM疫苗初免、蛋白加强和共同给予RNA和亚基
使用SAM疫苗对小鼠进行三次免疫，间隔三周，所述SAM疫苗是本文所述的自复制RNA，编码HCMV五聚体复合物、使用MF59作为佐剂的纯化的五聚体亚基、之后是MF59中亚基的SAM疫苗的不同序列，或两者的组合(表3)。SAM疫苗包封在合成的LNP中用于非病毒递送。一组对照小鼠不接受任何疫苗。
表3
在各次免疫后3周收获血清并用于ELISA以确定结合抗体效价，在试验中使用与亚基疫苗相同的纯化的抗原。该血清还用于使用TB40或VR1814感染ARPE-19上皮细胞的HCMV微中和试验。在第3次免疫后3或4周，从处死的小鼠中提取脾。使用对应于gH蛋白的c端一半的纯化的蛋白或15聚体肽(重叠11个氨基酸)的池在体外刺激脾细胞，对细胞因子表达进行染色并使用流式细胞术进行分析。
三次剂量后单独的SAM疫苗和亚基/MF59引发了强力的中和抗体应答(图11)。MF59中的五聚体亚基以及五聚体SAM疫苗不对疫苗的第一和第二剂量作出应答，但第3次剂量后亚基/MF59引发的效价超过了SAM疫苗引发的效价。一次SAM疫苗初免和之后的单剂量亚基/MF59引发了比两次剂量的亚基/MF59强的中和应答，但与单独的SAM相同。向这些动物给予第2次亚基/MF59加强产生的中和应答水平超过三次亚基/MF59剂量或SAM疫苗后所见的中和应答。与单独的亚基/MF或SAM疫苗相比，两次SAM疫苗剂量和之后的单次亚基/MF59剂量似乎不会有助于中和应答。在不加入MF59的情况下混合SAM疫苗和亚基在第1次剂量后引发了强应答，与单独的RNA类似，并且在第2和第3次剂量后引发了强中和效价。
分析了针对使用纯化的gH/gL和五聚体亚基接种的CD4+T细胞应答。与单独的SAM疫苗或亚基/MF59相比，SAM疫苗初免蛋白加强和混合的SAM疫苗+亚基引发了更多的针对gH/gL再刺激的CD4+T细胞应答(图12)。针对单独的RNA的CD4+应答是不显著的，而针对单独的亚基/MF59的应答是Th2/Th0表型。来自使用SAM疫苗和亚基组合免疫的小鼠的相应细胞的表型主要是Th1/Th0。在使用纯化的五聚体复合物对细胞进行再刺激时可以看到类似的趋势，但应答通常更强(图13)。
还分析了针对使用纯化的五聚体亚基或对应于gH的肽池接种的CD8+T细胞应答。使用五聚体亚基进行再刺激时可见的唯一显著CD8应答出现在使用两次剂量的SAM疫苗和之后的一次剂量的亚基/MF59免疫的小鼠中(图14)。使用gH肽进行再刺激时，来自这些动物的细胞还显示了最强的应答(图15)。使用SAM疫苗+亚基、使用一次剂量的SAM疫苗之后两次剂量的亚基/MF59或者使用单独的SAM疫苗免疫的小鼠也显示出针对再刺激的显著应答(图15)。
结论：一次剂量的SAM疫苗之后两次剂量的亚基/MF59以及SAM疫苗+亚基引发了比单独的亚基/MF59更高的中和效价。针对SAM疫苗+亚基的应答不需要添加MF59佐剂。SAM疫苗初免亚基/MF59加强的最大影响是对于细胞免疫应答的。包括SAM疫苗的任何组合主要产生Th1/Th0CD4+应答。此外，使用SAM疫苗进行两次免疫之后使用亚基/MF59进行一次免疫产生了最强的CD8+应答。该研究显示，可对SAM疫苗初免蛋白加强方案进行优化以产生所需的免疫应答，即细胞或体液免疫应答。
参考文献：
Akter,P等，“Two novel spliced genes in human cytomegalovirus.(人巨细胞病毒中两个全新的剪接基因)”Journal of General Virology 84(2003):1117-1122.
Boehme,KW,M Guerrero和T Compton，“Human cytomegalovirus envelopeglycoproteins B and H are necessary for TLR2activation in permissive cells.(人巨细胞病毒包膜糖蛋白B和H是感受细胞中TLR2激活所必需的)”Journal ofImmunology 177(2006):7094-7102.
Doyle,Sharon A编，High Throughput Protein Expression and Purification:Methodsand Protocols(高通量蛋白表达和纯化：方法和实验方案)(Methods inMolecular Biology(《分子生物学方法》))，休曼出版社(Humana Press)2008.
Genini,E,E Percivalle,A Sarasini,MG Revello,F Baldanti和G Gerna.“Serumantibody response to the gH/gL/pUL128–131five-protein complex of humancytomegalovirus(HCMV)in primary and reactivated HCMV infections.(原发和再激活人巨细胞病毒(HCMV)感染中针对人HCMV的gH/gL/pUL128–131五蛋白复合体的血清抗体应答)”Journal of Clinical Virology 52(2011):113-118.
Huber,MT和T Compton.“Intracellular Formation and Processing of theHeterotrimeric gH-gL-gO(gCIII)Glycoprotein Envelope Complex of HumanCytomegalovirus.(人巨细胞病毒的异源三聚体gH-gL-gO(gCIII)糖蛋白包膜复合物的胞内形成和加工)”Journal of Virology 73(1999):3886-3892.
Kinzler,Eric R,Regan N Theiler和Teresa Compton.“Expression and reconstitution ofthe gH/gL/gO complex of human cytomegalovirus.(人巨细胞病毒的gH/gL/gO复合物的表达和重建)”Journal of Clinical Virology,2002:87–95.
Langdon,RH,J Cuccui和BW.Wren.“N-linked glycosylation in bacteria:anunexpected application.(细菌中N连接的糖蛋白：意料之外的应用)”FutureMicrobiology 4(2009):401-412.
Loignon,M等，“Stable high volumetric production of glycosylated human recombinantIFNalpha2b in HEK293cells.(HEK293细胞中糖基化的人重组IFNα2b的稳定高体积生产)”BMC Biotechnology 8(2008):65.
Macagno,A等，“Isolation of human monoclonal antibodies that potently neutralizehuman cytomegalovirus infection by targeting different epitopes on thegH/gL/UL128-131A complex.(通过靶向gH/gL/UL128-131A复合物上的不同表位来分离强力中和人巨细胞病毒感染的人单克隆抗体)”Journal of Virology84(2010):1005-13.
Melnicka,M,PP Sedghizadehb,CM Allenc和T Jaskolla.“Human cytomegalovirus andmucoepidermoid carcinoma of salivary glands:Cell-specific localization of activeviral and oncogenic signaling proteins is confirmatory of a causal relationship.(人巨细胞病毒和唾液腺的粘液表皮样癌：活性病毒和癌基因信号蛋白的细胞特异性定位确认了因果关系)”Experimental and Molecular Pathology 92(2012):118-125.
Mocarski,ES,T Shenk和RF Pass.“Cytomegalovirus.(巨细胞病毒)”，参见FieldsVirology(《费氏病毒学》)，David M Knipe和Peter M Howley编，美国宾夕法尼亚州费城：LWW出版社(Lippincott Williams and Wilkins)2006.
Murthy,S等，“Detection of a Single Identical Cytomegalovirus(CMV)Strain inRecently Seroconverted Young Women.(近期血清转化的年轻女性中单个相同巨细胞病毒(CMV)毒株的检测)”PLoS One 6(2011):e15949.
Needleman,SB和CD Wunsch.“A general method applicable to the search forsimilarities in the amino acid sequences of two proteins.(适用于搜索两种蛋白的氨基酸序列相似性的通用方法)”Journal of Molecular Biology 48(1970):443–453.
Patrone,M,M Secchi,L Fiorina,M Ierardi,G Milanesi和A Gallina.“HumanCytomegalovirus UL130Protein Promotes Endothelial Cell Infection through aProducer Cell Modification of the Virion.(人巨细胞病毒UL130蛋白通过病毒颗粒的生产者细胞修饰促进内皮细胞感染)”Journal of Virology 79(2005):8361-8373.
Rasmussen,L,A Geissler,C Cowan,A Chase和M Winters.“The Genes Encoding thegCIII Complex of Human Cytomegalovirus Exist in Highly Diverse Combinationsin Clinical Isolates.(编码人巨细胞病毒的gCIII复合物的基因存在于临床分离物的高度多样性组合中)”Journal of Virology 76(2002):10841-10888.
Rice,P,I Longden和A Bleasby.“EMBOSS:The European Molecular Biology OpenSoftware Suite.(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件包)”Trends Genetics 16(2000):276-277.
Rigoutsos,I等，“In silico pattern-based analysis of the human cytomegalovirus genome.(人巨细胞病毒基因组的基于计算机模式的分析)”Journal of Virology 77(2003):4326-44.
Ryckman,BJ等，“Characterization of the Human Cytomegalovirus gH/gL/UL128-131Complex That Mediates Entry into Epithelial and Endothelial Cells.(介导进入上皮和内皮细胞的人巨细胞病毒gH/gL/UL128-131复合物的表征)”Journal ofVirology 82(2008):60–70.
Ryckman,BJ,MC Chase和DC Johnson.“Human Cytomegalovirus TR StrainGlycoprotein O Acts as a Chaperone Promoting gH/gL Incorporation into Virionsbut Is Not Present in Virions.(人巨细胞病毒TR毒株糖蛋白O作为促进gH/gL整合至病毒颗粒的伴侣蛋白发挥作用但不存在于病毒颗粒中)”Journal ofVirology 84(2010):2597–2609.
Sambrook,J，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(《分子克隆：实验室手册》)第三版，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，2000.
Simanek,Amanda M.,Jennifer Beam Dowd,Graham Pawelec,David Melzer,Ambarish Dutta和Allison E.Aiello.“Seropositivity to Cytomegalovirus,Inflammation,All-Cause and Cardiovascular Disease-Related Mortality in theUnited States.(美国巨细胞病毒、炎症、所有原因和心血管疾病相关死亡率的血清阳性)”PLoS ONE 6((2011)):e16103.
Summers,MD和GE Smith.“A manual of methods for baculovirus vectors and insectcell culture procedures.(用于杆状病毒载体和昆虫细胞培养过程的方法指南)”Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No.1555,1987.
Wang,D和T Shenk.“Human Cytomegalovirus UL131Open Reading Frame IsRequired for Epithelial Cell Tropism.Human Cytomegalovirus UL131OpenReading Frame Is Required for Epithelial Cell Tropism.(人巨细胞病毒UL131开放阅读框是上皮细胞趋向性所必需的)”Journal of Virology 79(2005):10330–10338.
序列表
SEQ ID NO:1(来自HCMV毒株Merlin的gH＝GI:52139248)
MRPGLPSYLIILAVCLFSHLLSSRYGAEAVSEPLDKAFHLLLNTYGRPIRFLRENTTQCTYNSSLRNSTVVRENAISFNFFQSYNQYYVFHMPRCLFAGPLAEQFLNQVDLTETLERYQQRLNTYALVSKDLASYRSFSQQLKAQDSLGEQPTTVPPPIDLSIPHVWMPPQTTPHGWTESHTTSGLHRPHFNQTCILFDGHDLLFSTVTPCLHQGFYLIDELRYVKITLTEDFFVVTVSIDDDTPMLLIFGHLPRVLFKAPYQRDNFILRQTEKHELLVLVKKDQLNRHSYLKDPDFLDAALDFNYLDLSALLRNSFHRYAVDVLKSGRCQMLDRRTVEMAFAYALALFAAARQEEAGAQVSVPRALDRQAALLQIQEFMITCLSQTPPRTTLLLYPTAVDLAKRALWTPNQITDITSLVRLVYILSKQNQQHLIPQWALRQIADFALKLHKTHLASFLSAFARQELYLMGSLVHSMLVHTTERREIFIVETGLCSLAELSHFTQLLAHPHHEYLSDLYTPCSSSGRRDHSLERLTRLFPDATVPATVPAALSILSTMQPSTLETFPDLFCLPLGESFSALTVSEHVSYIVTNQYLIKGISYPVSTTVVGQSLIITQTDSQTKCELTRNMHTTHSITVALNISLENCAFCQSALLEYDDTQGVINIMYMHDSDDVLFALDPYNEVVVSSPRTHYLMLLKNGTVLEVTDVVVDATDSRLLMMSVYALSAIIGIYLLYRMLKTC
SEQ ID NO:2(来自HCMV毒株Towne的gH＝GI:138314)
MRPGLPSYLIVLAVCLLSHLLSSRYGAEAISEPLDKAFHLLLNTYGRPIRFLRENTTQCTYNSSLRNSTVVRENAISFNFFQSYNQYYVFHMPRCLFAGPLAEQFLNQVDLTETLERYQQRLNTYALVSKDLASYRSFSQQLKAQDSLGEQPTTVPPPIDLSIPHVWMPPQTTPHGWTESHTTSGLHRPHFNQTCILFDGHDLLFSTVTPCLHQGFYLIDELRYVKITLTEDFFVVTVSIDDDTPMLLIFGHLPRVLFKAPYQRDNFILRQTEKHELLVLVKKDQLNRHSYLKDPDFLDAALDFNYLDLSALLRNSFHRYAVDVLKSGRCQMLDRRTVEMAFAYALALFAAARQEEAGAQVSVPRALDRQAALLQIQEFMITCLSQTPPRTTLLLYPTAVDLAKRALWTPNQITDITSLVRLVYILSKQNQQHLIPQWALRQIADFALKLHKTHLASFLSAFARQELYLMGSLVHSMLVHTTERREIFIVETGLCSLAELSHFTQLLAHPHHEYLSDLYTPCSSSGRRDHSLERLTRLFPDATVPTTVPAALSILSTMQPSTLETFPDLFCLPLGESFSALTVSEHVSYVVTNQYLIKGISYPVSTTVVGQSLIITQTDSQTKCELTRNMHTTHSITAALNISLENCAFCQSALLEYDDTQGVINIMYMHDSDDVLFALDPYNEVVVSSPRTHYLMLLKNGTVLEVTDVVVDATDSRLLMMSVYALSAIIGIYLLYRMLKTC
SEQ ID NO:3(来自HCMV毒株AD169的gH＝GI:138313)
MRPGLPPYLTVFTVYLLSHLPSQRYGADAASEALDPHAFHLLLNTYGRPIRFLRENTTQCTYNSSLRNSTVVRENAISFNFFQSYNQYYVFHMPRCLFAGPLAEQFLNQVDLTETLERYQQRLNTYALVSKDLASYRSFSQQLKAQDSLGQQPTTVPPPIDLSIPHVWMPPQTTPHDWKGSHTTSGLHRPHFNQTCILFDGHDLLFSTVTPCLHQGFYLMDELRYVKITLTEDFFVVTVSIDDDTPMLLIFGHLPRVLFKAPYQRDNFILRQTEKHELLVLVKKAQLNRHSYLKDSDFLDAALDFNYLDLSALLRNSFHRYAVDVLKSGRCQMLDRRTVEMAFAYALALFAAARQEEAGTEISIPRALDRQAALLQIQEFMITCLSQTPPRTTLLLYPTAVDLAKRALWTPDQITDITSLVRLVYILSKQNQQHLIPQWALRQIADFALQLHKTHLASFLSAFARQELYLMGSLVHSMLVHTTERREIFIVETGLCSLAELSHFTQLLAHPHHEYLSDLYTPCSSSGRRDHSLERLTRLFPDATVPATVPAALSILSTMQPSTLETFPDLFCLPLGESFSALTVSEHVSYVVTNQYLIKGISYPVSTTVVGQSLIITQTDSQTKCELTRNMHTTHSITAALNISLENCAFCQSALLEYDDTQGVINIMYMHDSDDVLFALDPYNEVVVSSPRTHYLMLLKNGTVLEVTDVVVDATDSRLLMMSVYALSAIIGIYLLYRMLKTC
SEQ ID NO:4(由SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-715组成的gH蛋白)
MRPGLPSYLIILAVCLFSHLLSSRYGAEAVSEPLDKAFHLLLNTYGRPIRFLRENTTQCTYNSSLRNSTVVRENAISFNFFQSYNQYYVFHMPRCLFAGPLAEQFLNQVDLTETLERYQQRLNTYALVSKDLASYRSFSQQLKAQDSLGEQPTTVPPPIDLSIPHVWMPPQTTPHGWTESHTTSGLHRPHFNQTCILFDGHDLLFSTVTPCLHQGFYLIDELRYVKITLTEDFFVVTVSIDDDTPMLLIFGHLPRVLFKAPYQRDNFILRQTEKHELLVLVKKDQLNRHSYLKDPDFLDAALDFNYLDLSALLRNSFHRYAVDVLKSGRCQMLDRRTVEMAFAYALALFAAARQEEAGAQVSVPRALDRQAALLQIQEFMITCLSQTPPRTTLLLYPTAVDLAKRALWTPNQITDITSLVRLVYILSKQNQQHLIPQWALRQIADFALKLHKTHLASFLSAFARQELYLMGSLVHSMLVHTTERREIFIVETGLCSLAELSHFTQLLAHPHHEYLSDLYTPCSSSGRRDHSLERLTRLFPDATVPATVPAALSILSTMQPSTLETFPDLFCLPLGESFSALTVSEHVSYIVTNQYLIKGISYPVSTTVVGQSLIITQTDSQTKCELTRNMHTTHSITVALNISLENCAFCQSALLEYDDTQGVINIMYMHDSDDVLFALDPYNEVVVSSPRTHYLMLLKNGTVLEVTDVVVDATD
SEQ ID NO:5(包括myc标签和聚组氨酸标签的C端延伸)
GTKLGPEQKLISEEDLNSAVDHHHHHH
SEQ ID NO:6(包含SEQ ID NO:4和5的gH蛋白)
MRPGLPSYLIILAVCLFSHLLSSRYGAEAVSEPLDKAFHLLLNTYGRPIRFLRENTTQCTYNSSLRNSTVVRENAISFNFFQSYNQYYVFHMPRCLFAGPLAEQFLNQVDLTETLERYQQRLNTYALVSKDLASYRSFSQQLKAQDSLGEQPTTVPPPIDLSIPHVWMPPQTTPHGWTESHTTSGLHRPHFNQTCILFDGHDLLFSTVTPCLHQGFYLIDELRYVKITLTEDFFVVTVSIDDDTPMLLIFGHLPRVLFKAPYQRDNFILRQTEKHELLVLVKKDQLNRHSYLKDPDFLDAALDFNYLDLSALLRNSFHRYAVDVLKSGRCQMLDRRTVEMAFAYALALFAAARQEEAGAQVSVPRALDRQAALLQIQEFMITCLSQTPPRTTLLLYPTAVDLAKRALWTPNQITDITSLVRLVYILSKQNQQHLIPQWALRQIADFALKLHKTHLASFLSAFARQELYLMGSLVHSMLVHTTERREIFIVETGLCSLAELSHFTQLLAHPHHEYLSDLYTPCSSSGRRDHSLERLTRLFPDATVPATVPAALSILSTMQPSTLETFPDLFCLPLGESFSALTVSEHVSYIVTNQYLIKGISYPVSTTVVGQSLIITQTDSQTKCELTRNMHTTHSITVALNISLENCAFCQSALLEYDDTQGVINIMYMHDSDDVLFALDPYNEVVVSSPRTHYLMLLKNGTVLEVTDVVVDATDGTKLGPEQKLISEEDLNSAVDHHHHHH
SEQ ID NO:7(来自HCMV毒株Merlin的gL＝GI:39842115)
MCRRPDCGFSFSPGPVILLWCCLLLPIVSSAAVSVAPTAAEKVPAECPELTRRCLLGEVFEGDKYESWLRPLVNVTGRDGPLSQLIRYRPVTPEAANSVLLDEAFLDTLALLYNNPDQLRALLTLLSSDTAPRWMTVMRGYSECGDGSPAVYTCVDDLCRGYDLTRLSYGRSI FTEHVLGFELVPPSLFNVVVAIRNEATRTNRAVRLPVSTAAAPEGITLFYGLYNAVKEFCLRHQLDPPLLRHLDKYYAGLPPELKQTRVNLPAHSRYGPQAVDAR
SEQ ID NO:8(来自HCMV毒株Towne的gL＝GI:239909463)
MCRRPDCGFSFSPGPVALLWCCLLLPIVSSATVSVAPTVAEKVPAECPELTRRCLLGEVFQGDKYESWLRPLVNVTRRDGPLSQLIRYRPVTPEAANSVLLDDAFLDTLALLYNNPDQLRALLTLLSSDTAPRWMTVMRGYSECGDGSPAVYTCVDDLCRGYDLTRLSYGRSIFTEHVLGFELVPPSLFNVVVAIRNEATRTNRAVRLPVSTAAAPEGITLFYGLYNAVKEFCLRHQLDPPLLRHLDKYYAGLPPELKQTRVNLPAHSRYGPQAVDAR
SEQ ID NO:9(来自HCMV毒株AD169的gL＝GI:2506510)
MCRRPDCGFSFSPGPVVLLWCCLLLPIVSSVAVSVAPTAAEKVPAECPELTRRCLLGEVFQGDKYESWLRPLVNVTRRDGPLSQLIRYRPVTPEAANSVLLDDAFLDTLALLYNNPDQLRALLTLLSSDTAPRWMTVMRGYSECGDGSPAVYTCVDDLCRGYDLTRLSYGRSIFTEHVLGFELVPPSLFNVVVAIRNEATRTNRAVRLPVSTAAAPEGITLFYGLYNAVKEFCLRHQLDPPLLRHLDKYYAGLPPELKQTRVNLPAHSRYGPQAVDAR
SEQ ID NO:10(来自HCMV毒株Merlin的gO＝GI:39842082)
MGKKEMIMVKGIPKIMLLISITFLLLSLINCNVLVNSRGTRRSWPYTVLSYRGKEILKKQKEDILKRLMSTSSDGYRFLMYPSQQKFHAIVISMDKFPQDYILAGPIRNDSITHMWFDFYSTQLRKPAKYVYSEYNHTAHKITLRPPPCGTVPSMNCLSEMLNVSKRNDTGEKGCGNFTTFNPMFFNVPRWNTKLYIGSNKVNVDSQTIYFLGLTALLLRYAQRNCTRSFYLVNAMSRNLFRVPKYINGTKLKNTMRKLKRKQALVKEQPQKKNKKSQSTTTPYLSYTTSTAFNVTTNVTYSATAAVTRVATSTTGYRPDSNFMKSIMATQLRDLATWVYTTLRYRNEPFCKPDRNRTAVSEFMKNTHVLIRNETPYTIYGTLDMSSLYYNETMSVENETASDNNETTPTSPSTRFQRTFIDPLWDYLDSLLFLDKIRNFSLQLPAYGNLTPPEHRRAANLSTLNSLWWWSQ
SEQ ID NO:11(来自HCMV毒株AD169的gO＝GI:136968)
MGRKEMMVRDVPKMVFLISISFLLVSFINCKVMSKALYNRPWRGLVLSKIGKYKLDQLKLEILRQLETTISTKYNVSKQPVKNLTMNMTEFPQYYILAGPIQNYSITYLWFDFYSTQLRKPAKYVYSQYNHTAKTITFRPPPCGTVPSMTCLSEMLNVSKRNDTGEQGCGNFTTFNPMFFNVPRWNTKLYVGPTKVNVDSQTIYFLGLTALLLRYAQRNCTHSFYLVNAMSRNLFRVPKYINGTKLKNTMRKLKRKQAPVKEQFEKKAKKTQSTTTPYFSYTTSAALNVTTNVTYSITTAARRVSTSTIAYRPDSSFMKSIMATQLRDLATWVYTTLRYRQNPFCEPSRNRTAVSEFMKNTHVLIRNETPYTIYGTLDMSSLYYNETMFVENKTASDSNKTTPTSPSMGFQRTFIDPLWDYLDSLLFLDEIRNFSLRSPTYVNLTPPEHRRAVNLSTLNSLWWWLQ
SEQ ID NO:12(来自HCMV毒株Towne的gO＝GI:239909431)
MGRKGEMRGVFNLFFLMSLTFLLFSFINCKIAVARFRVKSQKAKEEERQLKLRILQELASKTGDYYKFFTFPSQQKLYNITVEMKQFPPNSILAGPIRNHSITHLWFDFHTTQLRKPAKYVYSEYNHTGQKITFRPPSCGTIPSMTCLSEMLNVSRRNNTGEENCGNFTTFNPMFFNVPRWNTKLYVGPSKVNVDSQTIYFLGLAALLLRYAQRNCTRSFYLVNAMSRNIFRVPKYINSTKLKNTMRKLKRKQAPVKSISKKSRVSTTTPYSSYTSTIFNVSTNVTYSPIVPTRIPTSTIGYRPDENFMKSILTTQLKDLATWVYTTLRYRDEPFCKPNRNRTAVSEFMKNTHVLIRNETPYTIYGTLDMSSLYYNDTMPVENETASDNNKTTPTSPSTRFQRTFIDPMWDYLDSLLFLSEIRNFSLQSSTYGNLTPPEHRRAVNLSTLNSLWWWLQ
SEQ ID NO:13(来自HCMV毒株Merlin的pUL128＝GI:39842124)
MSPKDLTPFLTALWLLLGHSRVPRVRAEECCEFINVNHPPERCYDFKMCNRFTVALRCPDGEVCYSPEKTAEIRGIVTTMTHSLTRQVVHNKLTSCNYNPLYLEADGRIRCGKVNDKAQYLLGAAGSVPY
SEQ ID NO:14(来自HCMV毒株Towne的pUL128＝GI:39841882)
MSPKNLTPFLTALWLLLGHSRVPRVRAEECCEFINVNHPPERCYDFKMCNRFTVALRCPDGEVCYSPEKTAEIRGIVTTMTHSLTRQVVHNKLTSCNYNPLYLEADGRIRCGKVNDKAQYLLGAAGSVPYRWINLEYDKITRIVGLDQYLESVKKHKRLDVCRAKMGYMLQ
SEQ ID NO:15(来自HCMV毒株AD169的pUL128＝GI:59803078)
MSPKDLTPFLTTLWLLLGHSRVPRVRAEECCEFINVNHPPERCYDFKMCNRFTVALRCPDGEVCYSPEKTAEIRGIVTTMTHSLTRQVVHNKLTSCNYNPLYLEADGRIRCGKVNDKAQYLLGAAGSVPYRWINLEYDKITRIVGLDQYLESVKKHKRLDVCRAKMGYMLQ
SEQ ID NO:16(来自HCMV毒株Merlin的pUL130＝GI:39842125)
MLRLLLRHHFHCLLLCAVWATPCLASPWSTLTANQNPSPPWSKLTYSKPHDAATFYCPFLYPSPPRSPLQFSGFQRVSTGPECRNETLYLLYNREGQTLVERSSTWVKKVIWYLSGRNQTILQRMPRTASKPSDGNVQISVEDAKIFGAHMVPKQTKLLRFVVNDGTRYQMCVMKLESWAHVFRDYSVSFQVRLTFTEANNQTYTFCTHPNLIV
SEQ ID NO:17(来自HCMV毒株Towne的pUL130＝GI:239909473)
MLRLLLRHHFHCLLLCAVWATPCLASPWSTLTANQNPSPPWSKLTYSKPHDAATFYCPFLYPSPPRSPLQFSGFQRVLTGPECRNETLYLLYNREGQTLVERSSTWVKKVIWYLSGRNQTILQRMPRTASKPSDGNVQISVEDAKIFGAHMVPKQTKLLRFVVNDGTRYQMCVMKLESWAHVFRDYSVSFQVRLTFTEANNQTFTPSAPIPISSFEPVARAGNFENRAS
SEQ ID NO:18(来自HCMV毒株Merlin的pUL131A＝GI:39842126)
MRLCRVWLSVCLCAVVLGQCQRETAEKNDYYRVPHYWDACSRALPDQTRYKYVEQLVDLTLNYHYDASHGLDNFDVLKRINVTEVSLLISDFRRQNRRGGTNKRTTFNAAGSLAPHARSLEFSVRLFAN
SEQ ID NO:19(来自HCMV毒株Towne的pUL131A＝GI:239909474)
MRLCRVWLSVCLCAVVLGQCQRETAEKNDYYRVPHYWDACSRALPDQTRYKYVEQLVDLTLNYHYDASHGLDNFDVLKRINVTEVSLLISDFRRQNRRGGTNKRTTFNAAGSLAPHARSLEFSVRLFAN
SEQ ID NO:20(来自HCMV毒株AD169的pUL131A＝GI:219879712)
MRLCRVWLSVCLCAVVLGQCQRETAEKKRLLPSTALLGRVLSRAARPNPLQVCGTARGPHVELPLRCEPRLGQL
SEQ ID NO:21(来自HCMV毒株Merlin的gB＝GI:39842076)
MESRIWCLVVCVNLCIVCLGAAVSSSSTRGTSATHSHHSSHTTSAAHSRSGSVSQRVTSSQTVSHGVNETIYNTTLKYGDVVGVNTTKYPYRVCSMAQGTDLIRFERNIVCTSMKPINEDLDEGIMVVYKRNIVAHTFKVRVYQKVLTFRRSYAYIHTTYLLGSNTEYVAPPMWEIHHINSHSQCYSSYSRVIAGTVFVAYHRDSYENKTMQLMPDDYSNTHSTRYVTVKDQWHSRGSTWLYRETCNLNCMVTITTARSKYPYHFFATSTGDVVDISPFYNGTNRNASYFGENADKFFIFPNYTIVSDFGRPNSALETHRLVAFLERADSVISWDIQDEKNVTCQLTFWEASERTIRSEAEDSYHFSSAKMTATFLSKKQEVNMSDSALDCVRDEAINKLQQIFNTSYNQTYEKYGNVSVFETTGGLVVFWQGIKQKSLVELERLANRSSLNLTHNRTKRSTDGNNATHLSNMESVHNLVYAQLQFTYDTLRGYINRALAQIAEAWCVDQRRTLEVFKELSKINPSAILSAIYNKPIAARFMGDVLGLASCVTINQTSVKVLRDMNVKESPGRCYSRPVVIFNFANSSYVQYGQLGEDNEILLGNHRTEECQLPSLKIFIAGNSAYEYVDYLFKRMIDLSSISTVDSMIALDIDPLENTDFRVLELYSQKELRSSNVFDLEEIMREFNSYKQRVKYVEDKVVDPLPPYLKGLDDLMSGLGAAGKAVGVAIGAVGGAVASVVEGVATFLKNPFGAFTIILVAIAVVIITYLIYTRQRRLCTQPLQNLFPYLVSADGTTVTSGSTKDTSLQAPPSYEESVYNSGRKGPGPPSSDASTAAPPYTNEQAYQMLLALARLDAEQRAQQNGTDSLDGRTGTQDKGQKPNLLDRLRHRKNGYRHLKDSDEEENV
SEQ ID NO:22(来自HCMV毒株Towne的gB＝GI:138193)
MESRIWCLVVCVNLCIVCLGAAVSSSSTRGTSATHSHHSSHTTSAAHSRSGSVSQRVTSSQTVSHGVNETIYNTTLKYGDVVGVNTTKYPYRVCSMAQGTDLIRFERNIVCTSMKPINEDLDEGIMVVYKRNIVAHTFKVRVYQKVLTFRRSYAYIHTTYLLGSNTEYVAPPMWEIHHINSHSQCYSSYSRVIAGTVFVAYHRDSYENKTMQLMPDDYSNTHSTRYVTVKDQWHSRGSTWLYRETCNLNCMVTITTARSKYPYHFFATSTGDVVDISPFYNGTNRNASYFGENADKFFIFPNYTIVSDFGRPNSALETHRLVAFLERADSVISWDIQDEKNVTCQLTFWEASERTIRSEAEDSYHFSSAKMTATFLSKKQEVNMSDSALDCVRDEAINKLQQIFNTSYNQTYEKYGNVSVFETTGGLVVFWQGIKQKSLVELERLANRSSLNLTHNRTKRSTDGNNATHLSNMESVHNLVYAQLQFTYDTLRGYINRALAQIAEAWCVDQRRTLEVFKELSKINPSAILSAIYNKPIAARFMGDVLGLASCVTINQTSVKVLRDMNVKESPGRCYSRPVVIFNFANSSYVQYGQLGEDNEILLGNHRTEECQLPSLKIFIAGNSAYEYVDYLFKRMIDLSSISTVDSMIALDIDPLENTDFRVLELYSQKELRSSNVFDLEEIMREFNSYKQRVKYVEDKVVDPLPPYLKGLDDLMSGLGAAGKAVGVAIGAVGGAVASVVEGVATFLKNPFGAFTIILVAIAVVIIIYLIYTRQRRLCMQPLQNLFPYLVSADGTTVTSGNTKDTSLQAPPSYEESVYNSGRKGPGPPSSDASTAAPPYTNEQAYQMLLALVRLDAEQRAQQNGTDSLDGQTGTQDKGQKPNLLDRLRHRKNGYRHLKDSDEEENV
SEQ ID NO:23(来自HCMV毒株AD169的gB＝GI:138192)
MESRIWCLVVCVNLCIVCLGAAVSSSSTSHATSSTHNGSHTSRTTSAQTRSVYSQHVTSSEAVSHRANETIYNTTLKYGDVVGVNTTKYPYRVCSMAQGTDLIRFERNIICTSMKPINEDLDEGIMVVYKRNIVAHTFKVRVYQKVLTFRRSYAYIYTTYLLGSNTEYVAPPMWEIHHINKFAQCYSSYSRVIGGTVFVAYHRDSYENKTMQLIPDDYSNTHSTRYVTVKDQWHSRGSTWLYRETCNLNCMLTITTARSKYPYHFFATSTGDVVYISPFYNGTNRNASYFGENADKFFIFPNYTIVSDFGRPNAAPETHRLVAFLERADSVISWDIQDEKNVTCQLTFWEASERTIRSEAEDSYHFSSAKMTATFLSKKQEVNMSDSALDCVRDEAINKLQQIFNTSYNQTYEKYGNVSVFETSGGLVVFWQGIKQKSLVELERLANRSSLNITHRTRRSTSDNNTTHLSSMESVHNLVYAQLQFTYDTLRGYINRALAQIAEAWCVDQRRTLEVFKELSKINPSAILSAIYNKPIAARFMGDVLGLASCVTINQTSVKVLRDMNVKESPGRCYSRPVVIFNFANSSYVQYGQLGEDNEILLGNHRTEECQLPSLKIFIAGNSAYEYVDYLFKRMIDLSSISTVDSMIALDIDPLENTDFRVLELYSQKELRSSNVFDLEEIMREFNSYKQRVKYVEDKVVDPLPPYLKGLDDLMSGLGAAGKAVGVAIGAVGGAVASVVEGVATFLKNPFGAFTIILVAIAVVIITYLIYTRQRRLCTQPLQNLFPYLVSADGTTVTSGSTKDTSLQAPPSYEESVYNSGRKGPGPPSSDASTAAPPYTNEQAYQMLLALARLDAEQRAQQNGTDSLDGQTGTQDKGQKPNLLDRLRHRKNGYRHLKDSDEEENV
SEQ ID NO:24(编码与C端myc-(His)6标签融合的gH(胞外域)的构建体)
gacggatcgggagatctcccgatcccctatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttggaggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaatttaagctacaacaaggcaaggcttgaccgacaattgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttgcgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgcgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctctctggctaactagagaacccactgcttactggcttatcgaaattaatacgactcactatagggagacccaagctggctagcgccaccatgaggcctggcctgccctcctacctgatcatcctggccgtgtgcctgttcagccacctgctgtccagcagatacggcgccgaggccgtgagcgagcccctggacaaggctttccacctgctgctgaacacctacggcagacccatccggtttctgcgggagaacaccacccagtgcacctacaacagcagcctgcggaacagcaccgtcgtgagagagaacgccatcagcttcaactttttccagagctacaaccagtactacgtgttccacatgcccagatgcctgtttgccggccctctggccgagcagttcctgaaccaggtggacctgaccgagacactggaaagataccagcagcggctgaatacctacgccctggtgtccaaggacctggccagctaccggtcctttagccagcagctcaaggctcaggatagcctcggcgagcagcctaccaccgtgccccctcccatcgacctgagcatcccccacgtgtggatgcctccccagaccacccctcacggctggaccgagagccacaccacctccggcctgcacagaccccacttcaaccagacctgcatcctgttcgacggccacgacctgctgtttagcaccgtgaccccctgcctgcaccagggcttctacctgatcgacgagctgagatacgtgaagatcaccctgaccgaggatttcttcgtggtcaccgtgtccatcgacgacgacacccccatgctgctgatcttcggccacctgcccagagtgctgttcaaggccccctaccagcgggacaacttcatcctgcggcagaccgagaagcacgagctgctggtgctggtcaagaaggaccagctgaaccggcactcctacctgaaggaccccgacttcctggacgccgccctggacttcaactacctggacctgagcgccctgctgagaaacagcttccacagatacgccgtggacgtgctgaagtccggacggtgccagatgctcgatcggcggaccgtggagatggccttcgcctatgccctcgccctgttcgccgctgccagacaggaagaggctggcgcccaggtgtcagtgcccagagccctggatagacaggccgccctgctgcagatccaggaattcatgatcacctgcctgagccagaccccccctagaaccaccctgctgctgtaccccacagccgtggatctggccaagagggccctgtggacccccaaccagatcaccgacatcacaagcctcgtgcggctcgtgtacatcctgagcaagcagaaccagcagcacctgatcccccagtgggccctgagacagatcgccgacttcgccctgaagctgcacaagacccatctggccagctttctgagcgccttcgccaggcaggaactgtacctgatgggcagcctggtccacagcatgctggtgcataccaccgagcggcgggagatcttcatcgtggagacaggcctgtgtagcctggccgagctgtcccactttacccagctgctggcccaccctcaccacgagtacctgagcgacctgtacaccccctgcagcagcagcggcagacgggaccacagcctggaacggctgaccagactgttccccgatgccaccgtgcctgctacagtgcctgccgccctgtccatcctgtccaccatgcagcccagcaccctggaaaccttccccgacctgttctgcctgcccctgggcgagagctttagcgccctgaccgtgtccgagcacgtgtcctacatcgtgaccaatcagtacctgatcaagggcatcagctaccccgtgtccaccacagtcgtgggccagagcctgatcatcacccagaccgacagccagaccaagtgcgagctgacccggaacatgcacaccacacacagcatcaccgtggccctgaacatcagcctggaaaactgcgctttctgtcagtctgccctgctggaatacgacgatacccagggcgtgatcaacatcatgtacatgcacgacagcgacgacgtgctgttcgccctggacccctacaacgaggtggtggtgtccagcccccggacccactacctgatgctgctgaagaacggcaccgtgctggaagtgaccgacgtggtggtggacgccaccgacggtaccaagcttgggcccgaacaaaaactcatctcagaagaggatctgaatagcgccgtcgaccatcatcatcatcatcattgagtttaaacggtctccagcttaagtttaaaccgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatggcttctgaggcggaaagaaccagctggggctctagggggtatccccacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattaattctgtggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctctgcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttgcaaaaagctcccgggagcttgtatatccattttcggatctgatcaagagacaggatgaggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcgggactctggggttcgaaatgaccgaccaagcgacgcccaacctgccatcacgagatttcgattccaccgccgccttctatgaaaggttgggcttcggaatcgttttccgggacgccggctggatgatcctccagcgcggggatctcatgctggagttcttcgcccaccccaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctgtataccgtcgacctctagctagagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtc
SEQ ID NO:25(编码全长gL的构建体)
gccgcggaatttcgactctaggccattgcatacgttgtatctatatcataatatgtacatttatattggctcatgtccaatatgaccgccatgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtccgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttacgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacaccaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaataaccccgccccgttgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctccgcggccgggaacggtgcattggaacgcggattccccgtgccaagagtgacgtaagtaccgcctatagactctataggcacacccctttggctcttatgcatgctatactgtttttggcttggggcctatacacccccgcttccttatgctataggtgatggtatagcttagcctataggtgtgggttattgaccattattgaccactcccctattggtgacgatactttccattactaatccataacatggctctttgccacaactatctctattggctatatgccaatactctgtccttcagagactgacacggactctgtatttttacaggatggggtcccatttattatttacaaattcacatatacaacaacgccgtcccccgtgcccgcagtttttattaaacatagcgtgggatctccacgcgaatctcgggtacgtgttccggacatgggctcttctccggtagcggcggagcttccacatccgagccctggtcccatgcctccagcggctcatggtcgctcggcagctccttgctcctaacagtggaggccagacttaggcacagcacaatgcccaccaccaccagtgtgccgcacaaggccgtggcggtagggtatgtgtctgaaaatgagctcggagattgggctcgcaccgctgacgcagatggaagacttaaggcagcggcagaagaagatgcaggcagctgagttgttgtattctgataagagtcagaggtaactcccgttgcggtgctgttaacggtggagggcagtgtagtctgagcagtactcgttgctgccgcgcgcgccaccagacataatagctgacagactaacagactgttcctttccatgggtcttttctgcagtcaccgtcgtcgacgccaccatgtgcagaaggcccgactgcggcttcagcttcagccctggacccgtgatcctgctgtggtgctgcctgctgctgcctatcgtgtcctctgccgccgtgtctgtggcccctacagccgccgagaaggtgccagccgagtgccccgagctgaccagaagatgcctgctgggcgaggtgttcgagggcgacaagtacgagagctggctgcggcccctggtcaacgtgaccggcagagatggccccctgagccagctgatccggtacagacccgtgacccccgaggccgccaatagcgtgctgctggacgaggccttcctggataccctggccctgctgtacaacaaccccgaccagctgagagccctgctgaccctgctgtccagcgacaccgcccccagatggatgaccgtgatgcggggctacagcgagtgtggagatggcagccctgccgtgtacacctgcgtggacgacctgtgcagaggctacgacctgaccagactgagctacggccggtccatcttcacagagcacgtgctgggcttcgagctggtgccccccagcctgttcaacgtggtggtggccatccggaacgaggccaccagaaccaacagagccgtgcggctgcctgtgtctacagccgctgcacctgagggcatcacactgttctacggcctgtacaacgccgtgaaagagttctgcctccggcaccagctggatccccccctgctgagacacctggacaagtactacgccggcctgcccccagagctgaagcagaccagagtgaacctgcccgcccacagcagatatggccctcaggccgtggacgccagatgataatctagaaagccatggatatcggatccactacgcgttagagctcgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggggggtgggcgaagaactccagcatgagatccccgcgctggaggatcatccagccggcgtcccggaaaacgattccgaagcccaacctttcatagaaggcggcggtggaatcgaaatctcgtgatggcaggttgggcgtcgcttggtcggtcatttcgaaccccagagtcccgctcagaagaactcgtcaagaaggcgatagaaggcgatgcgctgcgaatcgggagcggcgataccgtaaagcacgaggaagcggtcagcccattcgccgccaagctcttcagcaatatcacgggtagccaacgctatgtcctgatagcggtccgccacacccagccggccacagtcgatgaatccagaaaagcggccattttccaccatgatattcggcaagcaggcatcgccatgggtcacgacgagatcctcgccgtcgggcatgcgcgccttgagcctggcgaacagttcggctggcgcgagcccctgatgctcttcgtccagatcatcctgatcgacaagaccggcttccatccgagtacgtgctcgctcgatgcgatgtttcgcttggtggtcgaatgggcaggtagccggatcaagcgtatgcagccgccgcattgcatcagccatgatggatactttctcggcaggagcaaggtgagatgacaggagatcctgccccggcacttcgcccaatagcagccagtcccttcccgcttcagtgacaacgtcgagcacagctgcgcaaggaacgcccgtcgtggccagccacgatagccgcgctgcctcgtcctgcagttcattcagggcaccggacaggtcggtcttgacaaaaagaaccgggcgcccctgcgctgacagccggaacacggcggcatcagagcagccgattgtctgttgtgcccagtcatagccgaatagcctctccacccaagcggccggagaacctgcgtgcaatccatcttgttcaatcatgcgaaacgatcctcatcctgtctcttgatcagatcttgatcccctgcgccatcagatccttggcggcaagaaagccatccagtttactttgcagggcttcccaaccttaccagagggcgccccagctggcaattccggttcgcttgctgtccataaaaccgcccagtctagctatcgccatgtaagcccactgcaagctacctgctttctctttgcgcttgcgttttcccttgtccagatagcccagtagctgacattcatccggggtcagcaccgtttctgcggactggctttctacgtgttccgcttcctttagcagcccttgcgccctgagtgcttgcggcagcgtgaagctaattcatggttaaatttttgttaaatcagctcattttttaaccaataggccgaaatcggcaaaatcccttataaatcaaaagaatagcccgagatagggttgagtgttgttccagtttggaacaagagtccactattaaagaacgtggactccaacgtcaaagggcgaaaaaccgtctatcagggcgatggccggatcagcttatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctactgaacggtgatccccaccggaattgcg
SEQ ID NO:26(编码全长pUL128的构建体)
gccgcggaatttcgactctaggccattgcatacgttgtatctatatcataatatgtacatttatattggctcatgtccaatatgaccgccatgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtccgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttacgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacaccaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaataaccccgccccgttgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctccgcggccgggaacggtgcattggaacgcggattccccgtgccaagagtgacgtaagtaccgcctatagactctataggcacacccctttggctcttatgcatgctatactgtttttggcttggggcctatacacccccgcttccttatgctataggtgatggtatagcttagcctataggtgtgggttattgaccattattgaccactcccctattggtgacgatactttccattactaatccataacatggctctttgccacaactatctctattggctatatgccaatactctgtccttcagagactgacacggactctgtatttttacaggatggggtcccatttattatttacaaattcacatatacaacaacgccgtcccccgtgcccgcagtttttattaaacatagcgtgggatctccacgcgaatctcgggtacgtgttccggacatgggctcttctccggtagcggcggagcttccacatccgagccctggtcccatgcctccagcggctcatggtcgctcggcagctccttgctcctaacagtggaggccagacttaggcacagcacaatgcccaccaccaccagtgtgccgcacaaggccgtggcggtagggtatgtgtctgaaaatgagctcggagattgggctcgcaccgctgacgcagatggaagacttaaggcagcggcagaagaagatgcaggcagctgagttgttgtattctgataagagtcagaggtaactcccgttgcggtgctgttaacggtggagggcagtgtagtctgagcagtactcgttgctgccgcgcgcgccaccagacataatagctgacagactaacagactgttcctttccatgggtcttttctgcagtcaccgtcgtcgacgccaccatgagccccaaggacctgacccccttcctgacaaccctgtggctgctcctgggccatagcagagtgcctagagtgcgggccgaggaatgctgcgagttcatcaacgtgaaccacccccccgagcggtgctacgacttcaagatgtgcaaccggttcaccgtggccctgagatgccccgacggcgaagtgtgctacagccccgagaaaaccgccgagatccggggcatcgtgaccaccatgacccacagcctgacccggcaggtggtgcacaacaagctgaccagctgcaactacaaccccctgtacctggaagccgacggccggatcagatgcggcaaagtgaacgacaaggcccagtacctgctgggagccgccggaagcgtgccctaccggtggatcaacctggaatacgacaagatcacccggatcgtgggcctggaccagtacctggaaagcgtgaagaagcacaagcggctggacgtgtgcagagccaagatgggctacatgctgcagtgataatctagaaagccatggatatcggatccactacgcgttagagctcgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggggggtgggcgaagaactccagcatgagatccccgcgctggaggatcatccagccggcgtcccggaaaacgattccgaagcccaacctttcatagaaggcggcggtggaatcgaaatctcgtgatggcaggttgggcgtcgcttggtcggtcatttcgaaccccagagtcccgctcagaagaactcgtcaagaaggcgatagaaggcgatgcgctgcgaatcgggagcggcgataccgtaaagcacgaggaagcggtcagcccattcgccgccaagctcttcagcaatatcacgggtagccaacgctatgtcctgatagcggtccgccacacccagccggccacagtcgatgaatccagaaaagcggccattttccaccatgatattcggcaagcaggcatcgccatgggtcacgacgagatcctcgccgtcgggcatgcgcgccttgagcctggcgaacagttcggctggcgcgagcccctgatgctcttcgtccagatcatcctgatcgacaagaccggcttccatccgagtacgtgctcgctcgatgcgatgtttcgcttggtggtcgaatgggcaggtagccggatcaagcgtatgcagccgccgcattgcatcagccatgatggatactttctcggcaggagcaaggtgagatgacaggagatcctgccccggcacttcgcccaatagcagccagtcccttcccgcttcagtgacaacgtcgagcacagctgcgcaaggaacgcccgtcgtggccagccacgatagccgcgctgcctcgtcctgcagttcattcagggcaccggacaggtcggtcttgacaaaaagaaccgggcgcccctgcgctgacagccggaacacggcggcatcagagcagccgattgtctgttgtgcccagtcatagccgaatagcctctccacccaagcggccggagaacctgcgtgcaatccatcttgttcaatcatgcgaaacgatcctcatcctgtctcttgatcagatcttgatcccctgcgccatcagatccttggcggcaagaaagccatccagtttactttgcagggcttcccaaccttaccagagggcgccccagctggcaattccggttcgcttgctgtccataaaaccgcccagtctagctatcgccatgtaagcccactgcaagctacctgctttctctttgcgcttgcgttttcccttgtccagatagcccagtagctgacattcatccggggtcagcaccgtttctgcggactggctttctacgtgttccgcttcctttagcagcccttgcgccctgagtgcttgcggcagcgtgaagctaattcatggttaaatttttgttaaatcagctcattttttaaccaataggccgaaatcggcaaaatcccttataaatcaaaagaatagcccgagatagggttgagtgttgttccagtttggaacaagagtccactattaaagaacgtggactccaacgtcaaagggcgaaaaaccgtctatcagggcgatggccggatcagcttatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctactgaacggtgatccccaccggaattgcg
SEQ ID NO:27(编码全长pUL130的构建体)
gccgcggaatttcgactctaggccattgcatacgttgtatctatatcataatatgtacatttatattggctcatgtccaatatgaccgccatgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtccgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttacgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacaccaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaataaccccgccccgttgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctccgcggccgggaacggtgcattggaacgcggattccccgtgccaagagtgacgtaagtaccgcctatagactctataggcacacccctttggctcttatgcatgctatactgtttttggcttggggcctatacacccccgcttccttatgctataggtgatggtatagcttagcctataggtgtgggttattgaccattattgaccactcccctattggtgacgatactttccattactaatccataacatggctctttgccacaactatctctattggctatatgccaatactctgtccttcagagactgacacggactctgtatttttacaggatggggtcccatttattatttacaaattcacatatacaacaacgccgtcccccgtgcccgcagtttttattaaacatagcgtgggatctccacgcgaatctcgggtacgtgttccggacatgggctcttctccggtagcggcggagcttccacatccgagccctggtcccatgcctccagcggctcatggtcgctcggcagctccttgctcctaacagtggaggccagacttaggcacagcacaatgcccaccaccaccagtgtgccgcacaaggccgtggcggtagggtatgtgtctgaaaatgagctcggagattgggctcgcaccgctgacgcagatggaagacttaaggcagcggcagaagaagatgcaggcagctgagttgttgtattctgataagagtcagaggtaactcccgttgcggtgctgttaacggtggagggcagtgtagtctgagcagtactcgttgctgccgcgcgcgccaccagacataatagctgacagactaacagactgttcctttccatgggtcttttctgcagtcaccgtcgtcgacgccaccatgctgcggctgctgctgagacaccacttccactgcctgctgctgtgtgccgtgtgggccaccccttgtctggccagcccttggagcaccctgaccgccaaccagaaccctagccccccttggtccaagctgacctacagcaagccccacgacgccgccaccttctactgcccctttctgtaccccagccctcccagaagccccctgcagttcagcggcttccagagagtgtccaccggccctgagtgccggaacgagacactgtacctgctgtacaaccgggagggccagacactggtggagcggagcagcacctgggtgaaaaaagtgatctggtatctgagcggccggaaccagaccatcctgcagcggatgcccagaaccgccagcaagcccagcgacggcaacgtgcagatcagcgtggaggacgccaaaatcttcggcgcccacatggtgcccaagcagaccaagctgctgagattcgtggtcaacgacggcaccagatatcagatgtgcgtgatgaagctggaaagctgggcccacgtgttccgggactactccgtgagcttccaggtccggctgaccttcaccgaggccaacaaccagacctacaccttctgcacccaccccaacctgatcgtgtgataatctagaaagccatggatatcggatccactacgcgttagagctcgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggggggtgggcgaagaactccagcatgagatccccgcgctggaggatcatccagccggcgtcccggaaaacgattccgaagcccaacctttcatagaaggcggcggtggaatcgaaatctcgtgatggcaggttgggcgtcgcttggtcggtcatttcgaaccccagagtcccgctcagaagaactcgtcaagaaggcgatagaaggcgatgcgctgcgaatcgggagcggcgataccgtaaagcacgaggaagcggtcagcccattcgccgccaagctcttcagcaatatcacgggtagccaacgctatgtcctgatagcggtccgccacacccagccggccacagtcgatgaatccagaaaagcggccattttccaccatgatattcggcaagcaggcatcgccatgggtcacgacgagatcctcgccgtcgggcatgcgcgccttgagcctggcgaacagttcggctggcgcgagcccctgatgctcttcgtccagatcatcctgatcgacaagaccggcttccatccgagtacgtgctcgctcgatgcgatgtttcgcttggtggtcgaatgggcaggtagccggatcaagcgtatgcagccgccgcattgcatcagccatgatggatactttctcggcaggagcaaggtgagatgacaggagatcctgccccggcacttcgcccaatagcagccagtcccttcccgcttcagtgacaacgtcgagcacagctgcgcaaggaacgcccgtcgtggccagccacgatagccgcgctgcctcgtcctgcagttcattcagggcaccggacaggtcggtcttgacaaaaagaaccgggcgcccctgcgctgacagccggaacacggcggcatcagagcagccgattgtctgttgtgcccagtcatagccgaatagcctctccacccaagcggccggagaacctgcgtgcaatccatcttgttcaatcatgcgaaacgatcctcatcctgtctcttgatcagatcttgatcccctgcgccatcagatccttggcggcaagaaagccatccagtttactttgcagggcttcccaaccttaccagagggcgccccagctggcaattccggttcgcttgctgtccataaaaccgcccagtctagctatcgccatgtaagcccactgcaagctacctgctttctctttgcgcttgcgttttcccttgtccagatagcccagtagctgacattcatccggggtcagcaccgtttctgcggactggctttctacgtgttccgcttcctttagcagcccttgcgccctgagtgcttgcggcagcgtgaagctaattcatggttaaatttttgttaaatcagctcattttttaaccaataggccgaaatcggcaaaatcccttataaatcaaaagaatagcccgagatagggttgagtgttgttccagtttggaacaagagtccactattaaagaacgtggactccaacgtcaaagggcgaaaaaccgtctatcagggcgatggccggatcagcttatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctactgaacggtgatccccaccggaattgcg
SEQ ID NO:28(编码全长pUL131A的构建体)
gccgcggaatttcgactctaggccattgcatacgttgtatctatatcataatatgtacatttatattggctcatgtccaatatgaccgccatgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtccgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttacgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacaccaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaataaccccgccccgttgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctccgcggccgggaacggtgcattggaacgcggattccccgtgccaagagtgacgtaagtaccgcctatagactctataggcacacccctttggctcttatgcatgctatactgtttttggcttggggcctatacacccccgcttccttatgctataggtgatggtatagcttagcctataggtgtgggttattgaccattattgaccactcccctattggtgacgatactttccattactaatccataacatggctctttgccacaactatctctattggctatatgccaatactctgtccttcagagactgacacggactctgtatttttacaggatggggtcccatttattatttacaaattcacatatacaacaacgccgtcccccgtgcccgcagtttttattaaacatagcgtgggatctccacgcgaatctcgggtacgtgttccggacatgggctcttctccggtagcggcggagcttccacatccgagccctggtcccatgcctccagcggctcatggtcgctcggcagctccttgctcctaacagtggaggccagacttaggcacagcacaatgcccaccaccaccagtgtgccgcacaaggccgtggcggtagggtatgtgtctgaaaatgagctcggagattgggctcgcaccgctgacgcagatggaagacttaaggcagcggcagaagaagatgcaggcagctgagttgttgtattctgataagagtcagaggtaactcccgttgcggtgctgttaacggtggagggcagtgtagtctgagcagtactcgttgctgccgcgcgcgccaccagacataatagctgacagactaacagactgttcctttccatgggtcttttctgcagtcaccgtcgtcgacgccaccatgcggctgtgcagagtgtggctgtccgtgtgcctgtgtgccgtggtgctgggccagtgccagagagagacagccgagaagaacgactactaccgggtgccccactactgggatgcctgcagcagagccctgcccgaccagacccggtacaaatacgtggagcagctcgtggacctgaccctgaactaccactacgacgccagccacggcctggacaacttcgacgtgctgaagcggatcaacgtgaccgaggtgtccctgctgatcagcgacttccggcggcagaacagaagaggcggcaccaacaagcggaccaccttcaacgccgctggctctctggcccctcacgccagatccctggaattcagcgtgcggctgttcgccaactgataatctagaaagccatggatatcggatccactacgcgttagagctcgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggggggtgggcgaagaactccagcatgagatccccgcgctggaggatcatccagccggcgtcccggaaaacgattccgaagcccaacctttcatagaaggcggcggtggaatcgaaatctcgtgatggcaggttgggcgtcgcttggtcggtcatttcgaaccccagagtcccgctcagaagaactcgtcaagaaggcgatagaaggcgatgcgctgcgaatcgggagcggcgataccgtaaagcacgaggaagcggtcagcccattcgccgccaagctcttcagcaatatcacgggtagccaacgctatgtcctgatagcggtccgccacacccagccggccacagtcgatgaatccagaaaagcggccattttccaccatgatattcggcaagcaggcatcgccatgggtcacgacgagatcctcgccgtcgggcatgcgcgccttgagcctggcgaacagttcggctggcgcgagcccctgatgctcttcgtccagatcatcctgatcgacaagaccggcttccatccgagtacgtgctcgctcgatgcgatgtttcgcttggtggtcgaatgggcaggtagccggatcaagcgtatgcagccgccgcattgcatcagccatgatggatactttctcggcaggagcaaggtgagatgacaggagatcctgccccggcacttcgcccaatagcagccagtcccttcccgcttcagtgacaacgtcgagcacagctgcgcaaggaacgcccgtcgtggccagccacgatagccgcgctgcctcgtcctgcagttcattcagggcaccggacaggtcggtcttgacaaaaagaaccgggcgcccctgcgctgacagccggaacacggcggcatcagagcagccgattgtctgttgtgcccagtcatagccgaatagcctctccacccaagcggccggagaacctgcgtgcaatccatcttgttcaatcatgcgaaacgatcctcatcctgtctcttgatcagatcttgatcccctgcgccatcagatccttggcggcaagaaagccatccagtttactttgcagggcttcccaaccttaccagagggcgccccagctggcaattccggttcgcttgctgtccataaaaccgcccagtctagctatcgccatgtaagcccactgcaagctacctgctttctctttgcgcttgcgttttcccttgtccagatagcccagtagctgacattcatccggggtcagcaccgtttctgcggactggctttctacgtgttccgcttcctttagcagcccttgcgccctgagtgcttgcggcagcgtgaagctaattcatggttaaatttttgttaaatcagctcattttttaaccaataggccgaaatcggcaaaatcccttataaatcaaaagaatagcccgagatagggttgagtgttgttccagtttggaacaagagtccactattaaagaacgtggactccaacgtcaaagggcgaaaaaccgtctatcagggcgatggccggatcagcttatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctactgaacggtgatccccaccggaattgcg
SEQ ID NO: 29(由SEQ ID NO: 1的氨基酸残基24-715组成的gH成熟蛋白)
RYGAEAVSEPLDKAFHLLLNTYGRPIRFLRENTTQCTYNSSLRNSTVVRENAISFNFFQSYNQYYVFHMPRCLFAGPLAEQFLNQVDLTETLERYQQRLNTYALVSKDLASYRSFSQQLKAQDSLGEQPTTVPPPIDLSIPHVWMPPQTTPHGWTESHTTSGLHRPHFNQTCILFDGHDLLFSTVTPCLHQGFYLIDELRYVKITLTEDFFVVTVSIDDDTPMLLIFGHLPRVLFKAPYQRDNFILRQTEKHELLVLVKKDQLNRHSYLKDPDFLDAALDFNYLDLSALLRNSFHRYAVDVLKSGRCQMLDRRTVEMAFAYALALFAAARQEEAGAQVSVPRALDRQAALLQIQEFMITCLSQTPPRTTLLLYPTAVDLAKRALWTPNQITDITSLVRLVYILSKQNQQHLIPQWALRQIADFALKLHKTHLASFLSAFARQELYLMGSLVHSMLVHTTERREIFIVETGLCSLAELSHFTQLLAHPHHEYLSDLYTPCSSSGRRDHSLERLTRLFPDATVPATVPAALSILSTMQPSTLETFPDLFCLPLGESFSALTVSEHVSYIVTNQYLIKGISYPVSTTVVGQSLIITQTDSQTKCELTRNMHTTHSITVALNISLENCAFCQSALLEYDDTQGVINIMYMHDSDDVLFALDPYNEVVVSSPRTHYLMLLKNGTVLEVTDVVVDATD
SEQ ID NO: 30(包含SEQ ID NO: 29和5的gH成熟蛋白)
RYGAEAVSEPLDKAFHLLLNTYGRPIRFLRENTTQCTYNSSLRNSTVVRENAISFNFFQSYNQYYVFHMPRCLFAGPLAEQFLNQVDLTETLERYQQRLNTYALVSKDLASYRSFSQQLKAQDSLGEQPTTVPPPIDLSIPHVWMPPQTTPHGWTESHTTSGLHRPHFNQTCILFDGHDLLFSTVTPCLHQGFYLIDELRYVKITLTEDFFVVTVSIDDDTPMLLIFGHLPRVLFKAPYQRDNFILRQTEKHELLVLVKKDQLNRHSYLKDPDFLDAALDFNYLDLSALLRNSFHRYAVDVLKSGRCQMLDRRTVEMAFAYALALFAAARQEEAGAQVSVPRALDRQAALLQIQEFMITCLSQTPPRTTLLLYPTAVDLAKRALWTPNQITDITSLVRLVYILSKQNQQHLIPQWALRQIADFALKLHKTHLASFLSAFARQELYLMGSLVHSMLVHTTERREIFIVETGLCSLAELSHFTQLLAHPHHEYLSDLYTPCSSSGRRDHSLERLTRLFPDATVPATVPAALSILSTMQPSTLETFPDLFCLPLGESFSALTVSEHVSYIVTNQYLIKGISYPVSTTVVGQSLIITQTDSQTKCELTRNMHTTHSITVALNISLENCAFCQSALLEYDDTQGVINIMYMHDSDDVLFALDPYNEVVVSSPRTHYLMLLKNGTVLEVTDVVVDATDGTKLGPEQKLISEEDLNSAVDHHHHHH
SEQ ID NO: 31(由SEQ ID NO: 7的氨基酸残基31-278组成的gL成熟蛋白)
AAVSVAPTAAEKVPAECPELTRRCLLGEVFEGDKYESWLRPLVNVTGRDGPLSQLIRYRPVTPEAANSVLLDEAFLDTLALLYNNPDQLRALLTLLSSDTAPRWMTVMRGYSECGDGSPAVYTCVDDLCRGYDLTRLSYGRSIFTEHVLGFELVPPSLFNVVVAIRNEATRTNRAVRLPVSTAAAPEGITLFYGLYNAVKEFCLRHQLDPPLLRHLDKYYAGLPPELKQTRVNLPAHSRYGPQAVDAR
SEQ ID NO:32(由SEQ ID NO:10的氨基酸残基31-472组成的gO成熟蛋白)
CNVLVNSRGTRRSWPYTVLSYRGKEILKKQKEDILKRLMSTSSDGYRFLMYPSQQKFHAIVISMDKFPQDYILAGPIRNDSITHMWFDFYSTQLRKPAKYVYSEYNHTAHKITLRPPPCGTVPSMNCLSEMLNVSKRNDTGEKGCGNFTTFNPMFFNVPRWNTKLYIGSNKVNVDSQTIYFLGLTALLLRYAQRNCTRSFYLVNAMSRNLFRVPKYINGTKLKNTMRKLKRKQALVKEQPQKKNKKSQSTTTPYLSYTTSTAFNVTTNVTYSATAAVTRVATSTTGYRPDSNFMKSIMATQLRDLATWVYTTLRYRNEPFCKPDRNRTAVSEFMKNTHVLIRNETPYTIYGTLDMSSLYYNETMSVENETASDNNETTPTSPSTRFQRTFIDPLWDYLDSLLFLDKIRNFSLQLPAYGNLTPPEHRRAANLSTLNSLWWWSQ
SEQ ID NO:33(由SEQ ID NO:14和15的氨基酸残基28-171组成的pUL128成熟蛋白)
EECCEFINVNHPPERCYDFKMCNRFTVALRCPDGEVCYSPEKTAEIRGIVTTMTHSLTRQVVHNKLTSCNYNPLYLEADGRIRCGKVNDKAQYLLGAAGSVPYRWINLEYDKITRIVGLDQYLESVKKHKRLDVCRAKMGYMLQ
SEQ ID NO:34(由SEQ ID NO:16的氨基酸残基26-214组成的pUL130成熟蛋白)
SPWSTLTANQNPSPPWSKLTYSKPHDAATFYCPFLYPSPPRSPLQFSGFQRVSTGPECRNETLYLLYNREGQTLVERSSTWVKKVIWYLSGRNQTILQRMPRTASKPSDGNVQISVEDAKIFGAHMVPKQTKLLRFVVNDGTRYQMCVMKLESWAHVFRDYSVSFQVRLTFTEANNQTYTFCTHPNLIV
SEQ ID NO:35(由SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19的氨基酸残基19-129组成的pUL131A成熟蛋白)
QCQRETAEKNDYYRVPHYWDACSRALPDQTRYKYVEQLVDLTLNYHYDASHGLDNFDVLKRINVTEVSLLISDFRRQNRRGGTNKRTTFNAAGSLAPHARSLEFSVRLFAN
SEQ ID NO:36(由SEQ ID NO:21的氨基酸残基23-907组成的gB成熟蛋白)
VSSSSTRGTSATHSHHSSHTTSAAHSRSGSVSQRVTSSQTVSHGVNETIYNTTLKYGDVVGVNTTKYPYRVCSMAQGTDLIRFERNIVCTSMKPINEDLDEGIMVVYKRNIVAHTFKVRVYQKVLTFRRSYAYIHTTYLLGSNTEYVAPPMWEIHHINSHSQCYSSYSRVIAGTVFVAYHRDSYENKTMQLMPDDYSNTHSTRYVTVKDQWHSRGSTWLYRETCNLNCMVTITTARSKYPYHFFATSTGDVVDISPFYNGTNRNASYFGENADKFFIFPNYTIVSDFGRPNSALETHRLVAFLERADSVISWDIQDEKNVTCQLTFWEASERTIRSEAEDSYHFSSAKMTATFLSKKQEVNMSDSALDCVRDEAINKLQQIFNTSYNQTYEKYGNVSVFETTGGLVVFWQGIKQKSLVELERLANRSSLNLTHNRTKRSTDGNNATHLSNMESVHNLVYAQLQFTYDTLRGYINRALAQIAEAWCVDQRRTLEVFKELSKINPSAILSAIYNKPIAARFMGDVLGLASCVTINQTSVKVLRDMNVKESPGRCYSRPVVIFNFANSSYVQYGQLGEDNEILLGNHRTEECQLPSLKIFIAGNSAYEYVDYLFKRMIDLSSISTVDSMIALDIDPLENTDFRVLELYSQKELRSSNVFDLEEIMREFNSYKQRVKYVEDKVVDPLPPYLKGLDDLMSGLGAAGKAVGVAIGAVGGAVASVVEGVATFLKNPFGAFTIILVAIAVVIITYLIYTRQRRLCTQPLQNLFPYLVSADGTTVTSGSTKDTSLQAPPSYEESVYNSGRKGPGPPSSDASTAAPPYTNEQAYQMLLALARLDAEQRAQQNGTDSLDGRTGTQDKGQKPNLLDRLRHRKNGYRHLKDSDEEENV

Claims (27)

1.一种用于生产分离的HCMV膜蛋白复合物的方法，所述HCMV膜蛋白复合物包含gH、gL和至少一种其他HCMV糖蛋白，所述方法包括重组表达所述gH、gL和至少一种其他HCMV糖蛋白。
2.一种用于表达HCMV膜蛋白复合物的方法，所述HCMV膜蛋白复合物包含gH、gL和至少一种其他HCMV糖蛋白，所述方法包括：
-将编码gH、gL和至少一种其他HCMV糖蛋白的一种或多种重组核酸分子导入表达系统中；
-在所述表达系统中表达所述一种或多种核酸分子；以及
-纯化所述膜蛋白复合物。
3.如权利要求2所述的方法，所述方法包括使用编码缺少跨膜结构域的gH片段的第一核酸构建体、编码gL蛋白的第二核酸构建体和编码至少一种其他HCMV糖蛋白的第三核酸构建体转染哺乳动物细胞的步骤。
4.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述HCMV膜蛋白复合物由gH、gL和gO组成。
5.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述HCMV膜蛋白复合物由gH、gL、pUL128、pUL130和pUL131A组成。
6.如权利要求5所述的方法，其中：
-所述pUL128包含SEQ ID NO:13、14、15或33或由其组成；
-所述pUL130包含SEQ ID NO:16、17或34或由其组成；和/或
-所述pUL131A包含SEQ ID NO:18、19、20或35或由其组成。
7.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述HCMV膜蛋白复合物具有以质量计>85％、>86％、>87％、>88％、>89％、>90％、>91％、>92％、>93％、>94％或>95％的纯度。
8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述HCMV膜蛋白复合物中的一种或多种gH、gL、gO、pUL128、pUL130和pUL131A：
-具有哺乳动物糖基化模式；和/或
-不含有昆虫细胞糖基化模式。
9.一种包含gH、gL和至少一种其他HCMV糖蛋白的纯化的HCMV膜蛋白复合物。
10.一种包含gH、gL和至少一种其他HCMV糖蛋白的HCMV膜蛋白复合物，所述复合物通过前述权利要求中任一项所述的方法生产。
11.一种包含权利要求9或10所述的分离的HCMV膜蛋白复合物的免疫原性组合物。
12.如权利要求11所述的免疫原性组合物，所述组合物是疫苗。
13.如权利要求11所述的免疫原性组合物，所述组合物包含佐剂。
14.如权利要求12所述的免疫原性组合物，所述佐剂是水包油乳剂或铝盐。
15.一种免疫原性组合物，其包含：
-编码HCMV膜蛋白复合物的自复制RNA分子；和
-权利要求9或10所述的HCMV膜蛋白复合物。
16.一种试剂盒，所述试剂盒包含：
-包含编码HCMV膜蛋白复合物的自复制RNA分子的初免组合物；以及
-包含权利要求9或10所述的HCMV膜蛋白复合物的加强组合物。
17.一种编码gL、缺少跨膜结构域的gH和至少一种其他HCMV糖蛋白的重组核酸分子，所述重组核酸：
(a)不是自复制RNA分子；
(b)不是α病毒复制子；
(c)不编码任何α病毒非结构蛋白，如NSP1、NSP2、NSP3和NSP4；
(d)不含：内部核糖体进入位点(IRES)，如EMCV或EV71；和/或
(e)不含病毒2A位点，如FMDV。
18.如权利要求17所述的重组核酸分子，所述重组核酸分子编码：
-gL、缺失跨膜结构域的gH、pUL128、pUL130和pUL131A；或
-gL、缺失跨膜结构域的gH和gO。
19.多种重组核酸，所述多种重组核酸编码gL、缺失跨膜结构域的gH和至少一种其他HCMV糖蛋白，其中一种或多种或者全部所述多种重组核酸：
(a)不是自复制RNA分子；
(b)不是α病毒复制子；
(c)不编码任何α病毒非结构蛋白，如NSP1、NSP2、NSP3和NSP4；
(d)不含：内部核糖体进入位点(IRES)，如EMCV或EV71；和/或
(e)不含病毒2A位点，如FMDV。
20.如权利要求19所述的多种重组核酸，包括：
-编码缺少跨膜结构域的gH，和gL的第一构建体；以及
-编码一种其他HCMV糖蛋白的第二构建体。
21.如权利要求20所述的多种重组核酸，所述第二构建体编码：
-pUL128、pUL130和pUL131A；或
-gO。
22.如权利要求21所述的多种重组核酸，包括：
-编码gL的第一重组核酸分子；
-编码缺少跨膜结构域的gH片段的第二重组核酸分子；以及
-编码一种或多种其他HCMV蛋白的一种或多种第三重组核酸分子。
23.一种包含gH、gL和至少一种其他HCMV糖蛋白的细胞，所述细胞：
(a)不含HCMV基因组；
(b)不生产HCMV病毒颗粒；
(c)不含编码所述gH、gL和至少一种其他HCMV糖蛋白的自复制RNA
分子；和/或
(d)不含α病毒复制子。
24.一种用于生产分离的或纯化的HCMV膜蛋白复合物的方法，所述HCMV膜蛋白复合物包含gH、gL和至少一种其他HCMV糖蛋白，所述方法涉及在生长培养基中生长权利要求23所述的细胞。
25.如权利要求24所述的方法，所述HCMV膜蛋白复合物被分泌至所述生长培养基中。
26.如权利要求25所述的方法，所述HCMV膜蛋白复合物累积至每升生长培养基中>0.8mg、>0.85mg、>0.88mg、>0.9mg、>0.95mg、>1mg、>1.5mg、>2mg、>2.5mg、>3mg、>3.5mg、>4mg、>4.5mg、>5mg复合物的浓度。
27.一种RNA初免-蛋白加强方案，所述方案包括：
-使用编码HCMV膜蛋白复合物的一种或多种蛋白组分的RNA进行一次或多次初免免疫，所述HCMV膜蛋白复合物包含gH、gL和至少一种其他HCMV糖蛋白；
-随后使用纯化的HCMV膜蛋白复合物进行一次或多次加强免疫，所述纯化的HCMV膜蛋白复合物包含gH、gL和至少一种其他HCMV糖蛋白。
CN201380036145.0A 2012-07-06 2013-06-29 巨细胞病毒蛋白的复合物 Pending CN104853771A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261668975P 2012-07-06 2012-07-06
US61/668,975 2012-07-06
US201361770257P 2013-02-27 2013-02-27
US61/770,257 2013-02-27
PCT/EP2013/063750 WO2014005959A1 (en) 2012-07-06 2013-06-29 Complexes of cytomegalovirus proteins

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN104853771A true CN104853771A (zh) 2015-08-19

Family

ID=48783208

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380036145.0A Pending CN104853771A (zh) 2012-07-06 2013-06-29 巨细胞病毒蛋白的复合物

Country Status (17)

Country Link
US (4) US9683022B2 (zh)
EP (1) EP2869843B1 (zh)
JP (3) JP2015522581A (zh)
KR (1) KR20150031322A (zh)
CN (1) CN104853771A (zh)
AU (1) AU2013286093B2 (zh)
CA (1) CA2878344A1 (zh)
ES (1) ES2753138T3 (zh)
GB (1) GB2513768B (zh)
HK (1) HK1210037A1 (zh)
IL (1) IL236261A0 (zh)
IN (1) IN2014KN02929A (zh)
MX (1) MX355469B (zh)
RU (1) RU2015103891A (zh)
SG (1) SG11201408328VA (zh)
WO (1) WO2014005959A1 (zh)
ZA (1) ZA201409364B (zh)

Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104853771A (zh) 2012-07-06 2015-08-19 诺华股份有限公司 巨细胞病毒蛋白的复合物
DK2877580T3 (en) 2012-07-27 2019-04-23 Hope City VAT VACCINE TO DELIVER A UL128 COMPLEX AND PREVENT CMV INFECTION
EP3052106A4 (en) 2013-09-30 2017-07-19 ModernaTX, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
EP3077519B1 (en) * 2013-12-03 2021-03-31 Hookipa Biotech GmbH Cmv vaccines
WO2015165480A1 (en) * 2014-04-30 2015-11-05 Institute For Research In Biomedicine Human cytomegalovirus vaccine compositions and method of producing the same
US20170119874A1 (en) * 2014-04-23 2017-05-04 Institute For Research In Biomedicine Human cytomegalovirus vaccine compositions and method of producing the same
RU2016147987A (ru) * 2014-05-08 2018-06-13 Пфайзер Инк. Средства и способы лечения cmv
EP3015475A1 (en) 2014-10-31 2016-05-04 Novartis AG Mammalian cells expressing cytomegalovirus antigens
EP3048114A1 (en) * 2015-01-22 2016-07-27 Novartis AG Cytomegalovirus antigens and uses thereof
EP3047856A1 (en) * 2015-01-23 2016-07-27 Novartis AG Cmv antigens and uses thereof
WO2017044895A2 (en) 2015-09-10 2017-03-16 City Of Hope MVA-gH/gL-PC VACCINE DERIVED ANTIBODIES NEUTRALIZING HUMAN CYTOMEGALOVIRUS INFECTIVITY AND METHODS THEREOF
WO2017070613A1 (en) 2015-10-22 2017-04-27 Modernatx, Inc. Human cytomegalovirus vaccine
CN108778365B (zh) 2016-01-11 2021-05-25 沃达瑞公司 微针组合物及其使用方法
US10611800B2 (en) 2016-03-11 2020-04-07 Pfizer Inc. Human cytomegalovirus gB polypeptide
CA3041307A1 (en) 2016-10-21 2018-04-26 Giuseppe Ciaramella Human cytomegalovirus vaccine
CN111094323B (zh) 2017-04-19 2024-02-06 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 修饰的巨细胞病毒蛋白和稳定的复合物
US11174322B2 (en) * 2017-07-24 2021-11-16 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Antibodies and peptides to treat HCMV related diseases
US11235051B2 (en) 2017-07-28 2022-02-01 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Methods and compositions for heterologous repRNA immunizations
US11524069B2 (en) * 2017-09-13 2022-12-13 Sanofi Pasteur Human cytomegalovirus immunogenic composition
EP3758747A1 (en) 2018-02-28 2021-01-06 University of Washington Self-asssembling nanostructure vaccines
WO2019211630A2 (en) 2018-05-04 2019-11-07 SpyBiotech Limited Vaccine composition
MX2021004273A (es) 2018-10-17 2021-12-10 Glaxosmithkline Biologicals Sa Proteinas de citomegalovirus modificadas y complejos estabilizados.
US11629172B2 (en) 2018-12-21 2023-04-18 Pfizer Inc. Human cytomegalovirus gB polypeptide
EP4004018A1 (en) 2019-07-24 2022-06-01 GlaxoSmithKline Biologicals SA Modified human cytomegalovirus proteins
TWI810589B (zh) 2020-06-21 2023-08-01 美商輝瑞股份有限公司 人巨細胞病毒糖蛋白Ｂ（ｇＢ）多肽
US11406703B2 (en) 2020-08-25 2022-08-09 Modernatx, Inc. Human cytomegalovirus vaccine
JP2023547197A (ja) 2020-10-28 2023-11-09 サノフィ・パスツール Ｔｌｒ４アゴニストを含有するリポソーム、その製造および使用
CA3211449A1 (en) * 2021-02-24 2022-09-01 Pfizer Inc. Novel druggable regions in the human cytomegalovirus glycoprotein b polypeptide and methods of use thereof
WO2023144665A1 (en) 2022-01-28 2023-08-03 Glaxosmithkline Biologicals Sa Modified human cytomegalovirus proteins

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007146024A2 (en) * 2006-06-07 2007-12-21 The Trustees Of Princeton University Cytomegalovirus surface protein complex for use in vaccines and as a drug target
WO2012051211A2 (en) * 2010-10-11 2012-04-19 Novartis Ag Antigen delivery platforms
WO2013006842A2 (en) * 2011-07-06 2013-01-10 Novartis Ag Immunogenic compositions and uses thereof

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE217887T1 (de) 1988-12-22 2002-06-15 Genentech Inc Verfahren zur herstellung von wasserlöslichen polypeptiden
AU638448B2 (en) 1989-03-17 1993-07-01 E.I. Du Pont De Nemours And Company External regulation of gene expression
WO1992002628A1 (en) 1990-08-02 1992-02-20 Chiron Corporation Expression of human cmv glycoprotein-h using the baculovirus-insect cell expression system
US5474914A (en) 1992-07-29 1995-12-12 Chiron Corporation Method of producing secreted CMV glycoprotein H
US5362865A (en) 1993-09-02 1994-11-08 Monsanto Company Enhanced expression in plants using non-translated leader sequences
US5693506A (en) 1993-11-16 1997-12-02 The Regents Of The University Of California Process for protein production in plants
US5815900A (en) 1995-03-06 1998-10-06 Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. Method of manufacturing a surface acoustic wave module
US20040228842A1 (en) * 2003-02-27 2004-11-18 Shan Lu Compositions and methods for cytomegalovirus treatment
US7947274B2 (en) * 2007-01-04 2011-05-24 Humabs, LLC. Human cytomegalovirus neutralising antibodies and use thereof
US9439960B2 (en) 2007-10-10 2016-09-13 The Trustees Of Princeton University Cytomegalovirus vaccines and methods of production
JP5988492B2 (ja) 2009-09-02 2016-09-07 ノバルティス アーゲー Ｔｌｒ活性モジュレーターを含む免疫原性組成物
WO2011106607A2 (en) * 2010-02-26 2011-09-01 Juvaris Biotherapeutics, Inc. Subunit vaccines for herpes viruses and methods of use
HUE026646T2 (en) 2010-07-06 2016-07-28 Glaxosmithkline Biologicals Sa Preferred liposomes containing lipids of PKA value for delivery of RNA
MX343410B (es) 2010-07-06 2016-11-04 Novartis Ag * Emulsiones cationicas de agua en aceite.
WO2012015211A2 (ko) 2010-07-30 2012-02-02 주식회사종근당 사이클로스포린 에이 함유 점안제 조성물
EP2614072A4 (en) * 2010-09-09 2014-03-19 Univ Virginia Commonwealth VACCINE AGAINST THE HUMAN CYTOMEGALOVIRUS
KR20140007404A (ko) 2011-01-31 2014-01-17 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 신규 허피스 항원을 암호화하는 핵산 분자, 이것을 포함하는 백신 및 이것의 사용 방법
BR112014000235A8 (pt) * 2011-07-06 2018-03-06 Novartis Ag emulsões de óleo em água catiônicas
CA2846043A1 (en) * 2011-08-31 2013-03-07 Novartis Ag Pegylated liposomes for delivery of immunogen-encoding rna
CN104853771A (zh) 2012-07-06 2015-08-19 诺华股份有限公司 巨细胞病毒蛋白的复合物
EP3015475A1 (en) 2014-10-31 2016-05-04 Novartis AG Mammalian cells expressing cytomegalovirus antigens

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007146024A2 (en) * 2006-06-07 2007-12-21 The Trustees Of Princeton University Cytomegalovirus surface protein complex for use in vaccines and as a drug target
WO2012051211A2 (en) * 2010-10-11 2012-04-19 Novartis Ag Antigen delivery platforms
WO2013006842A2 (en) * 2011-07-06 2013-01-10 Novartis Ag Immunogenic compositions and uses thereof

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
RYCKMAN BRENT J等: "Characterization of the human cytomegalovirus gH/gUUL128-131 complex that mediates entry into epithelial and endothelial cells", 《JOURNAL OF VIROLOGY》 *
YVES DUROCHER等: "High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cell", 《NUCLEIC ACIDS RESEARCH》 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20220106364A1 (en) 2022-04-07
US20170320916A1 (en) 2017-11-09
US20190211064A1 (en) 2019-07-11
JP2015522581A (ja) 2015-08-06
SG11201408328VA (en) 2015-02-27
GB2513768A (en) 2014-11-05
IN2014KN02929A (zh) 2015-05-08
JP2017192399A (ja) 2017-10-26
RU2015103891A (ru) 2016-08-27
KR20150031322A (ko) 2015-03-23
US10287322B2 (en) 2019-05-14
AU2013286093B2 (en) 2018-01-04
US9683022B2 (en) 2017-06-20
GB2513768B (en) 2015-04-15
MX2014015496A (es) 2015-03-06
US20160159864A1 (en) 2016-06-09
EP2869843B1 (en) 2019-08-07
WO2014005959A1 (en) 2014-01-09
HK1210037A1 (zh) 2016-04-15
ZA201409364B (en) 2017-08-30
AU2013286093A1 (en) 2015-02-12
ES2753138T3 (es) 2020-04-07
JP2017192400A (ja) 2017-10-26
IL236261A0 (en) 2015-02-26
GB201413863D0 (en) 2014-09-17
CA2878344A1 (en) 2014-01-09
MX355469B (es) 2018-04-19
EP2869843A1 (en) 2015-05-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104853771A (zh) 巨细胞病毒蛋白的复合物
CN106999566B (zh) 结合埃博拉病毒糖蛋白的抗体及其用途
CN107530424A (zh) 针对nkg2d和肿瘤相关抗原的二价抗体
CN102378814B (zh) 与存在于人巨细胞病毒gB糖蛋白的AD1区域的特定的不连续表位结合的单克隆抗体及其抗原结合片段
CN105153305B (zh) 一种全人源抗破伤风毒素单克隆抗体及其衍生物制备方法和应用
CN107847591A (zh) 多价人免疫缺陷病毒抗原结合分子及其应用
JP2023081967A (ja) ジスルフィド結合の還元を最小限にする抗体製造法
KR20200015756A (ko) Ig-유사 분자의 제조방법 및 제조수단
CN102936284A (zh) 人抗狂犬病抗体及其用途
US20170158753A1 (en) Monoclonal antibodies directed against envelope glycoproteins from multiple filovirus species
Zhao et al. Immunization with Fc-based recombinant Epstein–Barr virus gp350 elicits potent neutralizing humoral immune response in a BALB/c mice model
AU2018204011A1 (en) Flavivirus Neutralizing Antibodies and Methods of Use Thereof
CN106188281A (zh) 抗诺如病毒gii.4型鼠源单克隆抗体的制备和应用
CN106188282B (zh) 抗诺如病毒gi.1型鼠源单克隆抗体的制备和应用
CA3198333A1 (en) Antibody compositions for treatment of corona virus infection
CN107417788A (zh) 抗埃博拉病毒的中和性单克隆抗体
CN107074964A (zh) 抗丙型肝炎抗体及其抗原结合片段
JP2022525535A (ja) 単純ヘルペスウイルス感染の予防及び処置のためのモノクローナル抗体
Bae et al. Identification of the amino acid residues involved in human IgG transport into egg yolks of Japanese quail (Coturnix japonica)
GB2576914A (en) Antigen-binding molecules comprising unpaired variable domains produced in mammals
Aristiguieta Nanobodies targeting SARS-CoV-2
NO326197B1 (no) Humaniserte antistoffer, fremgangsmate for deres fremstilling, farmasoytisk preparat, anvendelse samt cellelinje
US20210139599A1 (en) Recombinant immunoglobulins of a new igg5 class, encoded by the human heavy chain pseudo-gamma gene
JP2022552805A (ja) ハイブリッド抗体
CN117736314A (zh) 针对SARS-CoV-2和其变异株的中和抗体及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
EXSB Decision made by sipo to initiate substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20150819