CN105153305B - 一种全人源抗破伤风毒素单克隆抗体及其衍生物制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种人源抗破伤风毒素单克隆抗体,所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:3,轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:4。优选地,所述单克隆抗体的重链的氨基酸序列为SEQ ID NO:1,所述单克隆抗体的轻链的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。另一方面,本发明还提供了上述抗破伤风毒素单克隆抗体及其衍生物的制备方法及用途。本发明提供的人源抗破伤风毒素抗体可消除过敏反应和病毒污染的生物风险,有充分长的半衰期,具有较高的效价和体内活性,并且可以大规模工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于生物免疫技术领域,具体涉及中和破伤风毒素的基因重组全人源单克隆抗体。
背景技术
破伤风(Tetanus)是由破伤风梭状芽孢杆菌(Clostridium tetani)感染所引起的,是一种常见的且死亡率很高的人畜共患的严重疾病。破伤风梭状芽孢杆菌广泛地存在于土壤,灰尘和铁锈等处,在多种动物的消化道和粪便中也都有发现,人群中的携带率最高可达25%。破伤风梭状芽孢杆菌很容易通过创伤感染人体,例如一般性外伤、妇女生产时的创伤等。当人被破伤风梭状芽孢杆菌感染之后,在七天左右的潜伏期内,破伤风梭状芽孢杆菌在厌氧条件下于创口处大量生长繁殖并释放毒素。破伤风毒素通过破坏人体神经细胞而侵害中枢神经系统,导致患者全身性肌肉强直性痉挛,形成破伤风特有的牙关禁闭、角弓反张等症状,严重者最后会死于窒息及全身性衰竭,死亡率在40%-78%之间。产妇分娩感染时,其病死率可高达90%以上。
破伤风梭状芽孢杆菌为严格厌氧菌,其芽孢可抗高温抗干燥,对大多数防腐剂有抗性,但对碘的水溶液及中性戊二醛溶液很敏感,可在短时间内被这些试剂杀灭。破伤风梭状芽孢杆菌可以产生两种外毒素:一种是具有溶血作用的破伤风溶血毒素;另一种是破伤风痉挛毒素,即常说的破伤风毒素。
破伤风毒素是由破伤风梭状芽孢杆菌产生并分泌至菌体外的一种蛋白质,由1315个氨基酸组成,相对分子质量为150kDa。破伤风毒素在菌体内表达后是单一的一条蛋白质链,在分泌过程中被蛋白酶裂解成由二硫键链接的轻链和重链。依据功能的不同,破伤风毒素分子分为A、B、C三个部分:破伤风毒素的轻链片段为A片段,重链N端的一半为B片段,另一半为C片段。破伤风毒素的毒性过程一般分为结合、导入和作用三步。研究结果表明,破伤风毒素的C片段可以和破伤风毒素的受体结合。破伤风毒素的受体一般认为是神经节苷脂,破伤风毒素的C片段具有逆行轴突运输进入中枢神经系统的功能,已被用于研究亚单位疫苗;B片段可以在人工磷脂膜上形成离子通道,将破伤风毒素的活性片段导入到细胞内;破伤风毒素的A片段分子是Zn蛋白酶,具有蛋白酶活性,它可以裂解神经细胞膜上的传送神经递质的蛋白质-囊泡相关膜蛋白,从而抑制神经递质的释放,使兴奋的冲动不停传递,导致患者产生强直性痉挛的临床症状。
破伤风毒素是已知最毒的毒素之一,经纯化的破伤风毒素对小鼠的致死剂量为0.l ng/kg,对豚鼠的致死剂量为0.3ng/kg,推测对人的致死剂量为0.25ng/kg。破伤风类毒素疫苗作为主动免疫疗法被应用于破伤风的预防。破伤风类毒素是用破伤风梭状芽孢杆菌菌种在适宜的培养基中培养产生的毒素,经甲醛脱毒、精制并加入氢氧化铝佐剂后可以制成疫苗。虽然注射破伤风疫苗可以完全预防破伤风的临床症状,但由于没有接种疫苗或免疫效应过期从而导致破伤风杆菌感染的情况依然非常普遍。
破伤风毒素毒性极强,作用迅速。当病人被确诊为感染破伤风杆菌后,由于此时体内已有大量细菌和毒素,使用抗菌素已来不及拯救病人生命。因此预防和治疗方法破伤风的唯一有效的方法是及时注射抗破伤风毒素的抗体,与毒素进行中和反应而使毒素失活,并通过抗体受体的介导将毒素从体内清除。
抗破伤风毒素的抗体主要分为破伤风抗毒素(Tetanus antitoxin,TAT)和破伤风人血免疫球蛋白(Human tetanus immunoglobulin,HTIG)。目前,我国用于临床的抗破伤风毒素的抗体绝大部分为动物抗血清(主要为马的抗破伤风毒素抗血清)。马的免疫血清,虽然经过了剪切纯化精制,仍然保留很强的异源性,常导致过敏反应的发生,即使在皮试阴性者注射时也会发生过敏反应。大量临床资料显示反应率为5%-30%,其中0.001%的过敏反应严重者可导致死亡。有关技术人员统计了某医院自2000年1月至2002年8月120例TAT使用者的过敏皮试情况,结果皮试阳性率为45%。
据对北京地区几家医院的TAT应用情况的调查表明,一般每家医院每天平均大约有十几至几十人接受TAT的预防注射,几乎所有医院均不采用破伤风毒素的主动免疫预防,而且不管患者是否经过破伤风毒素的主动免疫,均一律给予TAT注射。其注射范围也很广,几乎所有外伤,甚至有些新鲜清洁伤口均一律注射TAT。对同一患者的反复应用也较普遍,由此增加了过敏反应的发生率。
从药理学角度讲,预防注射1500-3000IU的TAT,2-3天内血清抗体能保持在0.3-0.6IU/ml的水平。但由于TAT是异种蛋白,在体内的半衰期短(2-14天),很快就被机体排斥掉,十几天后其抗体水平几乎测不到,因而不利于预防作用。欧美发达国家已停止使用马血清TAT,而采用HTIG。
据报道,在停止使用TAT前每年接受TAT注射的人数超过300万,其中因过敏休克病死率为1/5万-1/20万,与受伤后不用TAT预防而患破伤风的死亡率几无差别。据我国有关学者对几十家医院的调查来看,死于过敏的人数也与患破伤风死亡人数相近。尤其是若有大量人群已使用过破伤风抗毒素,再次使用的可能性较大,因此产生血清过敏的风险更大。
破伤风人血免疫球蛋白(HITG)是从经破伤风疫苗或类毒素免疫、抗体滴度较高的健康献血者血清中分离制备出来的,具有较好的防治效果。它属于人源性同种蛋白,较为安全,几乎不会发生血清病与过敏反应(过敏反应率很低,仅为0.2%)。而且,该免疫球蛋白半衰期长,可达3-4周,大大提升了破伤风的防治水平。在操作性方面,由于使用TAT常发生过敏反应,所以使用前必须先做过敏试验,过敏反应阳性者,须采取脱敏注射法。注射期间需严密观察,这对医患双方都很不方便。而HTIG则无需皮试,使用方便。
但由于人血来源困难,供应链存在较大风险,且工业化生产复杂、易受病毒污染等因素,使HITG的应用受到了极大地限制。相对于临床需要的上升趋势,破伤风人血免疫球蛋白供不应求(仅满足不到1%的市场需求),价格也比普通免疫球蛋白高数倍。仅2012年1-4月份,至少有574282瓶破伤风免疫球蛋白通过中检所及北京、四川等省(市)级药品检验机构的审核批准上市,但正规医院仍然集体缺货。因此,目前主要还是由马血清破伤风抗毒素这种亟待淘汰的产品占领着市场。
近年来有一些关于发明和制备人-鼠嵌合或人源抗破伤风毒素单克隆专利和文献。这些抗体虽能与破伤风毒素结合,但中和毒素的效价不高,且抗体的产业化生产问题尚未解决。
在申请号为201110106518.X国专利申请中瞿爱东等公开了两种人-鼠嵌合抗体9B5和8C10。这些嵌合抗体是在小鼠的IgG2a抗体的基础上,用人的IgG1恒定区替换小鼠的抗体恒定区而获得的。可是,人-鼠嵌合抗体在应用于人体时会在两周左右的时间内诱发人体免疫系统产生抗小鼠抗体的抗抗体,因此其安全性和长期的有效性是非常值得怀疑的。而且,根据该专利申请的记载这两种抗体的效价都不高。9B5经2.5倍稀释后(最高有效稀释倍数)治疗的小鼠其死亡时间处于96~120h,和对照组小鼠的死亡时间基本相同,因此9B5的效价为1.25IU/ml(抗体浓度为10mg/ml,即0.125IU/mg)。同样,8C10经5倍稀释后(最高有效稀释倍数)治疗的小鼠其死亡时间处于96~120h,和对照组小鼠的死亡时间基本相同,因此8C10的效价为2.5IU/ml(抗体浓度为10mg/ml,即0.25IU/mg)。
申请号为201010512416.3的中国专利申请中公开了另外两种人-鼠嵌合抗体6D12和8D9,效价分别为1.0IU/mg和<0.25IU/mg。
申请号为200610144981.2的中国专利申请中公开了从人的外周血B细胞中克隆到人源抗破伤风抗体,由此得到的抗体粗制品的效价约31IU/mg。研究者称“本试验使用的抗体是利用含有牛血清培养液生产的,蛋白质粗制备物中含有大量的非特异免疫球蛋白。所以本发明的人源抗破伤风毒素抗体真实的中和效价应是31IU/mg的至少若干倍,效价相当高。”在该报道中,研究者给小鼠注射0.4mg/kg的抗体,能完全保护小鼠。按每只小鼠20g计算,8μg抗体能完全保护小鼠。在本发明的实验中,500ng即0.5μg抗体能完全保护小鼠不死。按标准抗毒素与标准毒素混合后注射的小鼠于72~120h内全部死亡为标准,定义抗毒素效价为0.5IU/ml x 0.4ml(注射的抗体体积)即0.2IU。
申请号为200410070711.2的中国专利申请中公开了采用噬菌体展示技术获得人源抗破伤风抗体HTAT-Fab。但是,该Fab抗体是在大肠杆菌中表达,活性和产量都很成问题。该工作没有显示任何毒素中和活性和小鼠存活的数据(所有4个图和表格都只是与分子克隆和蛋白鉴定有关),而且在仅仅是文字描述的动物实验部分,研究者先给小鼠注射HTAT-Fab抗体,然后再注射破伤风毒素以显示中和作用。但是这种“具有很强的中和破伤风外毒素”的HTAT-Fab,经十多年至今未见市场化。
因此,利用先进的技术,寻找更加高效的、安全的抗破伤风类毒素单克隆抗体在本领域中具有非常重要的意义。采用基因工程方法制备完全人源的破伤风毒素中和抗体,不仅可解决异种蛋白的过敏问题,而且用国际产业界通用的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)来大量生产,可大大降低成本并避免血源制品的病毒污染问题。目前国际和国内抗破伤风基因工程抗体的研究仅限于实验室阶段,尚未见到临床应用的报告。据不完全统计,国内需要TAT和HTIG累计达1000万人份/年以上,国际需要为1.2亿人份/年以上,市场空间广阔。
发明内容
针对全人源破伤风毒素单克隆抗体的需要,本发明的主要目的在于提供一种高效、安全的抗破伤风毒素的完全人源单克隆抗体的可变区序列及三种不同形式的重组抗体:即含有全长的重链(H)和轻链(L)的单克隆抗体;L-P2A-H型单克隆抗体和ScFv单链抗体。
一种全人源抗破伤风病毒单克隆抗体,所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:3所示,所述单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸 序列为SEQ ID NO:4所示。
在根据本发明的一个实施方案中,所述抗破伤风毒素单克隆抗体的重链的氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示;所述单克隆抗体的轻链的氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示;优选地,编码所述单克隆抗体的重链的DNA序列为SEQ ID NO:5所示,编码所述单克隆抗体的轻链的DNA序列为SEQ ID NO:6所示。
在根据本发明的另一个实施方案中,所述单克隆抗体的重链和轻链通过自剪切序列连接,所述自剪切序列选自2A肽段。自剪切序列2A肽段源于口蹄疫病毒(foot-and-mouthdisease viruses,FMDV)。所述2A肽段或2A类似肽段均由18~22个氨基酸组成,C末端序列高度保守:-DxE xNPGP-。在核糖体翻译至该序列时,因发生“跳跃”而实现无需蛋白酶的自动断裂(自剪切)。自剪切发生在C末端G-P残基之间。(参阅“基于2A肽策略构建多基因表达载体的研究进展”,China Biotechnology,2013,33(1):104-108)。优选地选自P2A(SEQID NO:25ATNFSLLKQAGD VEENPGP)、T2A(SEQ ID NO:26EGRGSLLTCGDVEENPGP)或E2A(SEQ IDNO:27QCTNYALLKLAGDVESNPGP);更优选地,所述自剪切序列为P2A,因其自剪切的效率最高。
在根据本发明的另一个实施方案中,所述单克隆抗体的氨基酸序列为SEQ ID NO:7所示;优选地,编码所述重组抗体氨基酸序列的DNA序列为SEQ ID NO:8所示。
在根据本发明的另一个实施方案中,所述单克隆抗体是重组单链抗体(ScFv)。所述重组单链抗体(ScFv)的重链可变区和轻链可变区通过第一短肽区(第一Linker区)连接,所述第一短肽区(第一Linker区)的氨基酸序列为SEQ ID NO:23AGGGGSGGGGSGGGGS。
在根据本发明的进一步地实施方案中,所述重组单链抗体与人源重链恒定区和轻链恒定区连接,优选地,所述人源重链恒定区和轻链恒定区选自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定区;更优选地,所述人源重链恒定区和轻链恒定区为人IgG1恒定区。
在根据本发明的进一步地实施方案中,所述重组单链抗体通过第二短肽区(第二Linker区)和重链恒定区连接形成重组抗体,所述第二短肽区(第二Linker区)的氨基酸序列为SEQ ID NO:24SGGGGSGGGGS;优选地,所述重组抗体的氨基酸序列为SEQ ID NO:9;更优选地,编码所述重 组抗体的氨基酸序列的DNA序列为SEQ ID NO:10。
本发明进一步提供了上述单克隆抗体的制备方法,所述方法包括以下步骤:
1)以破伤风类毒素疫苗免疫过的正常人外周血细胞为材料,提取B淋巴细胞,与小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0融合,获得可表达抗破伤风毒素单克隆抗体的如上所述的杂交瘤细胞株;
2)由步骤1)得到的杂交瘤细胞株中克隆表达抗破伤风毒素单克隆抗体的基因;
3)提供表达载体,所述表达载体包含步骤2)所克隆得到的基因以及与所述基因操作性相连的表达调控序列;
4)将步骤3)所述的表达载体转化宿主细胞;
5)培养步骤4)得到的宿主细胞;
6)分离纯化得到单克隆抗体;
优选地,步骤1)中B淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0细胞以10:1比例混合后进行融合操作,进一步优选地,所述融合操作所使用的细胞培养基中含有100ng/ml人源白介素-6(rhIL-6);
优选地,所述表达载体选自哺乳动物表达载体pDirect系列,更优选为pDirect4.0;
优选地,步骤2)克隆得到的基因包括编码所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列SEQ ID NO:3和轻链可变区的氨基酸序列SEQ ID NO:4的DNA序列;
优选地,由所述表达载体表达的单克隆抗体的轻链氨基酸序列经由2A肽段与单克隆抗体的重链的氨基酸序列相连;更优选的所述2A肽段为P2A肽段;进一步优选地,所述表达载体表达的单克隆抗体的氨基酸序列为SEQ ID NO:7;尤其优选地,所述表达载体包含编码单克隆抗体的DNA序列SEQ ID NO:8。
优选地,由所述表达载体表达的重组单链抗体的氨基酸序列为SEQ ID NO:9;尤其优选地,所述表达载体包含编码重组单链抗体的DNA序列SEQ ID NO:10。
优选地,所述宿主细胞是哺乳动物细胞,更优选为人、鼠、羊、马、狗或猫的细胞,进一步优选为中国仓鼠卵巢细胞。
另一方面,本发明提供了用于上述制备方法的杂交瘤细胞株,其保藏 号为CGMCCNO.:10407。
进一步地,本发明还提供了上述单克隆抗体在制备用于预防和/或治疗破伤风的药物中的应用。
本发明制备了分泌特异性抗破伤风毒素单克隆抗体的人-鼠杂交瘤,利用分子生物学技术克隆了该抗体的重链和轻链序列(百分之百人的基因),构建了三种形式的重组抗破伤风毒素人源单克隆抗体,并由CHO细胞来表达生产抗体。这些抗体具有较高的中和破伤风毒素的能力。通过小鼠实验证明,它们可保护动物抵御致死剂量的破伤风毒素的攻击。此外,这些全人源的抗体作为药物与国内现有抗体比较,具有以下有益效果:
1)本发明提供的抗破伤风毒素单克隆抗体可消除过敏反应和病毒污染的生物风险。目前我国市场上治疗破伤风的抗血清制剂主要有两类。一类是从马血清中提取,但人体对动物异源蛋白的过敏反应很大,该制品的毒副作用高。大量临床资料显示过敏反应率为5%-30%,反应严重者可导致死亡。第二类“人破伤风免疫球蛋白”,是从人血清中提取,但血源制品来源非常有限,且有病毒污染的风险。用基因工程方法生产完全人源的单克隆抗体药物,在生物安全性方面有独到的优势。
2)本发明的抗破伤风毒素单克隆抗体具有充分长的体内半衰期。使用马抗血清的另一个问题是,因其是异源蛋白而被人体迅速排斥,从而导致体内疗程短。本发明提供的抗体是完全人源的IgG1抗体,有与正常人IgG1抗体一样的21天左右的体内半衰期,可确保体内长久地维持有效的药物浓度。
3)本发明的抗破伤风毒素单克隆抗体可无限量生产。本发明所提供的抗破伤风毒素单克隆抗体采用世界上最先进的CHO细胞无血清培养技术生产,用CHO细胞表达生产蛋白制剂是目前世界上最成熟和最受欢迎的办法。其大规模工业化生产工艺已非常成熟,得到国际认可,已经有30多种重组抗体药物用CHO细胞生产,完全达到临床合格标准。CHO细胞可在无血清培养基中传代生长,不使用任何动物来源的产品,避免了动物和人的病毒的污染。
4)本发明的抗破伤风毒素单克隆抗体有非常高的效价和体内活性。
抗体中和毒素的效价越高,其临床应用的价值越大,也才具有市场开发的价值。值得注意的是:在背景技术所述的所述有技术方案中,研究者采用的测活体系,基本上都是先在体外将抗体和毒素孵育一小时,然后才将混合物注入小鼠体内,观察抗体的保护作用。即使是在高尚先等人的研究中,抗体分子也是先注入小鼠体内,然后才注射毒素。然而,发明人发现这种测活方法与实际病理情况和治疗方法(先暴露于毒素,而后才用抗 体保护)完全不符,既不反映抗体在体内的扩散、分布、清除等药代动力学,也有可能高估对毒素亲合力并不高的抗体在体内保护作用。
而在本发明中,先将致死剂量的毒素单独注入小鼠腹腔,经过2.5小时后,本发明的抗体才被注入背部、肋部皮下或肌肉。小鼠在注入毒素后的2.5小时才接受抗体治疗,这在以往的测活方法中是没有的。
另外,本发明的上述实验采用的是ScFv-IgG1形式的抗体。由于去掉了与抗原结合无关的重链CH1和轻链CL的恒定区,因而它比带有完整的重链和轻链的野生型抗体分子要小四分之一。破伤风细菌是厌氧菌,它一般在组织深度创伤的缺氧部位繁殖并释放毒素。通常,皮下、肌肉、或静脉注射的完整抗体很少或很慢进入到组织深度创伤的部位同毒素相遇。破伤风毒素一旦与神经细胞受体结合后会不可逆地发生毒性作用,任何抗毒素都无法中和其毒力,只能等新的神经细胞出芽生长以后才可恢复神经的正常传到作用。分子更小的ScFv-IgG1形式的抗体比完整抗体更具组织穿透力。同时,它比不带有Fc区域的Fab半分子(高尚先等发明)要大,不易从肾脏过滤掉。Fc部分通过与FcRn的结合和回收,能增加抗体分子的体内半衰期。毒素被抗体的Fc部分带到表达FcR受体的抗原提呈细胞处,能被内吞,提呈给免疫细胞,进而激发主动免疫。
5)本发明的表达抗破伤风毒素抗体的CHO细胞株比其他专利文献报道的细胞株更具有产业化前景。
龚小迪等报道的CHO细胞株的产量是每天3mg/109细胞/L(即3pg/cell/day)。按表达15天到20天计算,一次每升只能产45-60mg的蛋白,扣除纯化步骤的损失,每升最终也许只能获得30mg。在临床治疗上,HTIG的预防用量是250IU,治疗用量是3000-6000IU。就算其粗品效价31IU/mg在去除杂蛋白后,可上升到150IU/mg,那么一次治疗用量需20-40mg,相当于1升培养液15-20天的培养量,其代价非常高昂。
而在本发明中,未经工艺优化的CHO细胞的产量可以达到1-1.2g/L,经流加等工艺优化,可望达到2-5g/L。就算1升培养液最终获得1600-2000mg蛋白,效价按400IU/mg计算,那么一次治疗用量需7.5-15mg,来自1升培养液的蛋白可用于治疗100-300个破伤风发病的病人,可提供1000-1250人份的预防剂量。
按我国一年需1000万人份的预防剂量算,本发明提供的细胞株可在1万升发酵体系中生产。这可以由两条生产线完成:每条生产线可以有3个300升的发酵罐,每年生产5-6批次。因而,如果细胞株的产能低,抗体的活性也低,那么将无法实现产业化。
附图说明
图1显示了抗破伤风毒素单抗轻链可变区(VL)、重链可变区(VH)、单链融合蛋白(ScFv)和单链抗体(ScFv-IgG1)基因的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。其中,VL基因为342bp,VH基因为372bp,ScFv基因为762bp,ScFv-IgG1基因为1494bp。
图2显示了带有抗破伤风毒素单链抗体(ScFv-IgG1)基因的pDirect4.0载体(13.8kb),其启动子(CMV)及单酶切位点(NheI、EcoRI、XhoI)。其中,VH为抗破伤风毒素单抗重链可变区,VL为其轻链可变区,IgGl为人IgGl抗体恒定区Fc片段基因。用EcoRI和XhoI(E+X)可切出750bp的IgG1抗体Fc片段;用NheI和EcoRI(N+E)可切出762bp的ScFv片段;用NheI和XhoI(N+X)可切出1.5kb的ScFv-IgG1片段。
图3显示了CHO细胞表达的人源抗破伤风毒素抗体(L-P2A-H形式)的SDS-PAGE(A)和Western Blot(B)电泳图。箭头所指是非还原条件下(泳道2和5)的完整抗体,分子量在180kDa左右。在还原条件下(泳道3和6),该抗体的重链(55kDa左右,*)和轻链(27kDa左右,**)与带有人IgG1Fc的人-鼠嵌合抗体Erbitux(泳道1和4)的重链和轻链的分子量相同。
图4显示了人源抗破伤风毒素抗体(L-P2A-H形式)在小鼠体内中和破伤风毒素的效果。
图5显示了抗破伤风毒素单链抗体ScFv-IgG1经Protein A亲和层析柱纯化后的SDS-PAGE还原的电泳图。
图6显示了人源抗破伤风毒素单链抗体ScFv-IgG1在小鼠体内中和破伤风毒素的剂量效果。
具体实施方式
为了更加清楚的解释本发明的目的、技术方案和优点,以下结合实施例进一步说明本发明。此处所描述的具体实施例仅用以说明和解释本发明,并不是限定本发明的应用范畴。
发明人经过长期而深入的研究,以破伤风类毒素疫苗免疫过的正常人外周血细胞为材料,提取B淋巴细胞,与小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0融合,获得可表达高特异性的抗破伤风毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株。进而,发明人利用基因重组技术,克隆了该人源抗体的重链和轻链基因,并构建了不同形式的抗破伤风毒素抗体,用CHO细胞进行表达。在验证了抗体的小鼠体内保护活性的基础上,发明人完成了本发明。
本发明涉及抗破伤风毒素人源单克隆抗体,包括该抗体的基因和蛋白序列和生物功能。本发明的抗破伤风毒素人源单克隆抗体是通过下述几个主要步骤实现的:1)抗破伤风毒素人源单克隆抗体杂交瘤的制备;2)单克隆抗体可变区和恒定区编码序列的克隆与鉴定;3)带有完整重链和轻链的单克隆抗体、L-P2A-H型单克隆抗体和ScFv单链抗体在CHO真核表达载体中的构建;4)所述人源抗体在CHO细胞中的表达、纯化及体内功能鉴定。
近年来,人们利用基因抗体工程技术对鼠源单克隆抗体进行改造,制成嵌合抗体(即将鼠抗可变区基因与人IgG恒定区连接)和人源化抗体(即将鼠抗可变区的互补决定区移植入人IgG的骨架区中)。这些基因工程抗体能在一定程度上降低,但不能完全消除异种鼠源血清蛋白引起的过敏反应。为进一步降低鼠抗引起的免疫反应,全人源抗体是最终趋势。该类抗体不含任何外来基因,不会造成过敏反应,是目前基因工程抗体研究的热点之一。本发明提供了一种能高效中和破伤风毒素,消除异种蛋白引起的过敏反应的完全人源单抗以用于治疗。
本文所用的术语“单克隆抗体(单抗)”是指从一类基本均一的细胞群体获得的抗体,即该群体中所包含的单个抗体是相同的(除少数可能存在的天然发生的突变外),且都源自于同一个母细胞克隆。而且,与常规多克隆抗体(通常是具有针对不同抗原决定簇的不同抗体)不同,单克隆抗体高特异性地针对单个抗原决定簇。除了它们的特异性外,单抗的好处还在于它们可以通过培养分泌该单抗的杂交瘤来生产,也可以将抗体基因从该杂交瘤细胞株中分离出来,克隆进CHO细胞中生产,因而不会被其它免疫球蛋白污染。
本文所用的术语中,“分离”或“分离纯化”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质,原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有被分离纯化的,但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中共同存在的其他物质中分开,则被分离纯化。对于多聚核苷酸而言,经常用的术语“克隆”指的是将特定的多聚核苷酸序列(多为DNA序列)以分子生物学的方法复制成序列一致的分子,例如下面提到的抗体VH和VL序列的克隆。
本文所用的术语“抗体”和“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白,其由两个相同的重链(H)和两个相同的轻链(L)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连,而不同免疫球蛋白亚型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH),其后是多个恒定区。每条轻链的一端 有可变区(VL),另一端有恒定区;轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对,轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。
本文所用的术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同,它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而,可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区,它们大致上呈β-折叠构型,由形成连接环的三个CDR相连,在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR—起形成了抗体的抗原结合部位。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合,但是它们表现出不同的效应功能,例如参与依赖于抗体的细胞毒性(Antibody-Dependent Cell Cytotoxicity,ADCC)。
脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可根据其恒定区的氨基酸序列归为明显不同的两类(称为K和λ)中的一类。根据其重链恒定区的氨基酸序列,免疫球蛋白可以分为不同的种类。主要有5类免疫球蛋白:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,其中一些还可进一步分成亚类(isotype),如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。
本发明还提供了抗破伤风毒素单克隆抗体的氨基酸序列(SEQ ID NO:1,SEQ IDNO:2)及其可变区序列(SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4),以及具有这些序列的融合蛋白产物(SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:9)。具体地,本发明包括具有含重链和轻链可变区的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(当它们的超变区与本发明的重链和轻链的超变区相同或至少90%同源性)。
本发明不仅包括完整的单克隆抗体,还包括具有免疫活性的抗体片段,如Fab或(Fab’)2片段;只包括抗体重链或轻链的单域抗体;重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过不同长度及序列的肽链经N端或C端连成的单链Fv分子(ScFv)或二聚单链Fv分子(diabody)及三聚单链Fv分子(triabody)。
本发明中,各种形式的完整单抗或抗体融合蛋白,其恒定区Fc片段不仅可以源自人的IgG1,还可以源自人的其他亚型(IgG2、IgG3、IgG4)和种类(IgA和IgM)。
单克隆抗体可用本领域技术人员熟知的杂交瘤方法(由Kohler等,Nature,256:495(1975)首先提出)来制得。所不同的是,为了获得人源而非鼠源抗体,本发明以破伤风类毒素疫苗免疫过的正常人外周血细胞为材料, 提取B淋巴细胞,与小鼠骨髓瘤细胞系SP20融合。通常,人-鼠异种融合细胞是很不稳定的,染色体容易丢失。但是,Dessain等报道,用逆转录病毒载体介导过表达IL-6的Sp2/0细胞,可获得稳定的人-鼠杂交瘤(Dessain等,Journal of Immunological Methods,291:109-122(2004))。本发明中,在细胞融合时,通过外源性地添加并保持高剂量的IL-6(100ng/ml)而获得稳定的人-鼠异种融合细胞,进而将人源抗体的序列克隆。
本发明还提供了编码抗破伤风单克隆抗体之重链和轻链氨基酸序列的DNA分子。在一个较佳的实例中,该DNA分子含有SEQ ID NO:5所示的编码所述单克隆抗体重链的核苷酸序列,以及SEQ ID NO:6所示的编码所述单克隆抗体轻链的核苷酸序列。本发明还提供了编码上述单克隆抗体L-P2A-H形式或ScFv-IgG1形式的DNA分子:前者的序列如SEQ ID NO:8所示,后者的序列如SEQ ID NO:10所示。
在获得上述编码本发明的单克隆抗体重链和轻链的核苷酸序列后,通常可通过以下方法制备本发明的单克隆抗体。
首先,提供含有编码本发明单克隆抗体的核苷酸序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列的表达载体。在本发明中,无论L-P2A-H形式的单克隆抗体还是ScFv-IgG1形式的单链抗体,都是单链。L-P2A-H形式只是经由P2A的自剪切才将轻链(L)和重链(H)断开成独立的两条链。因而,本发明方便地使用如图2所示的带有同一个CMV启动子的pDirect载体。但是,本领域普通技术人员也能预计到,将编码本发明单克隆抗体重链和轻链的核苷酸序列分别插入任何真核表达载体,或使用不同的表达载体进行共表达也能获得本发明的单克隆抗体。
本文所用的术语“表达调控序列”通常指参与控制核苷酸序列表达的序列。表达调控序列包括与目标核苷酸序列操作性相连的启动子和终止信号(PolyA信号等)。通常还包括核苷酸序列适当翻译所需的序列(Kozak顺序等)。“操作性相连”是指线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的mRNA转录和蛋白转译活性。例如,如果启动子或增强子增加了编码序列的转录,则是与编码序列是操作性相连的。
编码本发明单克隆抗体的DNA序列可用本领域技术人员熟知的常规手段来制得。例如,可根据本发明公开的序列人工合成得到编码该单克隆抗体重链和轻链的核苷酸序列。然后,用分子生物学领域熟知的各种方法通过选择合适的酶切位点将这些核苷酸序列插入合适的表达载体中。本发明中的pDirect表达载体使用了本领域技术人员所熟知的各种“表达调控序列”,例如CMV启动子、真核细胞翻译所需的Kozak顺序、PolyA终止信号等。这些在市售的表达载体(例如购自Clontech和Promega公司的表达 载体)上都可获得,可通过基本的分子生物学技术将它们组装在同一载体上。
随后,用上述获得的表达载体转化合适的宿主细胞。“宿主细胞”一般包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞,昆虫细胞和哺乳动物细胞。在本发明中,基于抗体糖基化的原因,优选为哺乳动物细胞。通常用可商购的无限增殖的哺乳动物细胞系来作为表达真核细胞来源的蛋白和多肽的宿主细胞。较佳的哺乳动物细胞系包括但不局限于,中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、Vero细胞、海拉(HeLa)细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝癌细胞(如HepG2)和其它许多细胞系。它们为蛋白质分子提供了翻译后修饰,包括正确的折叠、正确的二硫键形成以及正确位点的糖基化。尽管在下文实施例中,本发明仅列举了以CHO细胞作为宿主细胞的例子,但是本领域技术人员在阅读了本发明的详细描述和具体实施例后应当理解,本发明也能够采用上述这些细胞系实现。
用表达载体转化宿主细胞的方法有很多种,所用的转化程序取决于待转化的宿主。将异源多核苷酸导入哺乳动物细胞的方法是本领域所知的,其包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、电转化、脂质体介导转染以及将DNA直接显微注射到胞核中。在本发明中,较佳的方法是电转化法或脂质体介导法等。例如可采用Invitrogen公司的Neon电转化仪或Roche公司的FuGene6脂质体法试剂盒来转染诸如CHO细胞等宿主细胞。
然后,在适合本发明单克隆抗体表达的条件下,用无血清培养基培养转化所得的宿主细胞。本发明中使用的无血清是HyClone公司的HyCell培养基。当然也可使用其他市售的无血清培养基。然后用常规的免疫球蛋白纯化步骤,如蛋白A-Sepharose、轻基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、离子交换层析、疏水层析、分子筛层析或亲和层析等本领域技术人员熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的人源抗破伤风单克隆抗体。
本发明中,小鼠在注入毒素后的2.5小时才接受抗体治疗,更可靠全面的反映抗体的真实效果。实验发现,本发明的抗体在毒素注射后的2.5小时仍然有保护作用。
本发明中,不仅用简洁的单启动子载体表达出完整的全长双链抗体(L-P2A-H形式),而且还提供了分子量比全长单克隆抗体要小四分之一的单链ScFv-IgG1抗体。破伤风杆菌是厌氧菌,居于组织深部。抗体能否从血液渗入到组织深处,以及这种扩散的快慢,是毒素的中和抗体体内效价的重要方面。因而,分子量要小四分之一的单链ScFv-IgG1抗体比完整的全长双链抗体要更具渗透性。这可以从已报道的很多实体肿瘤的抗体同 位素显影实验中得出结论:单链ScFv-IgG1抗体比完整的全长双链抗体渗入肿瘤内部的能力要好很多。
本发明中,CHO细胞的表达量高,产出的抗体活性高,使得大规模产业化成为可能。
总之,本发明克服了现有产品和方法的缺点,提供了具有真正市场开发价值的全人源抗破伤风毒素的抗体。下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。
应当理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本发明实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件(例如可参考《分子克隆:实验室指南》中所述的条件、或按照制造厂商所建议的条件)即可实现。除非另行定义,文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外,任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
本发明使用的保藏号为:CGMCC NO.:10407的杂交瘤细胞株(3B10)的保藏单位为:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号),保藏日期为2015年3月12日,分类命名为人抗破伤风毒素杂交瘤。
实施例1抗破伤风毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备
从商业公司(www.AllCells.com)购得经破伤风类毒素疫苗免疫过的健康献血员的5×108外周血单核细胞(商品名LeukoPak)。然后在冰上,将细胞与抗CD19-FITC和抗CD27-PE的抗体(购自eBioscience)孵育20分钟,细胞用含1%FBS的PBS洗涤两次后,经AriaII(BD Biosciences)流式细胞仪筛选出CD19+CD27+的记忆B细胞。同时,取在RPM 1640+10%FBS培养液中处于对数生长期的Sp2/0-Agl4小鼠骨髓瘤细胞(购自美国ATCC公司),用无血清RPM 1640培养液洗涤三次,计数备用。上述分选出的记忆B细胞与Sp2/0细胞以10:1比例混合,1500rpm离心7分钟。洗去上清液,准备融合。
融合时,1分钟内缓缓加入1mL PEG(分子量1450),轻摇90秒;再在2.5分钟中内加入5mL无血清RPM 1640培养液,最后再加入5mL无血清培液终止反应,静置5分钟后,1280rpm离心8分钟,弃去上清,加入常规RPM 1640培养液(含有20%胎牛血清和100ng/ml rhIL-6),制备成细胞悬液。
将上述细胞悬液以每孔2×105个细胞的密度种入96孔板,每孔200μL,置于37℃、8%CO2细胞培养箱中孵育。培养24小时后,更换含有HAT(购自Sigma)的常规RPM1640培养液(含有20%胎牛血清和100ng/ml rhIL-6),于37℃、8%CO2细胞培养箱中继续孵育。培养14天后用ELISA法检测各个孔中上清液是否含有抗破伤风毒素抗体。用于 ELISA筛选的破伤风毒素购自美国Sigma公司。抗原的包被采用常规的ELISA方法,只是所有的上清需小心地在BL2生物安全柜中用碘伏灭活后处置。
阳性克隆采用有限稀释法进行亚克隆。将细胞用含有HT的常规RPMI1640培养液(含有20%胎牛血清和100ng/ml rhIL-6)培养液稀释至10-20个/mL,于96孔板中每孔加200μL(约2-4个细胞/孔)。接种2排,剩余细胞悬液用培养液作倍比稀释,再接种2排。重复一次。置37℃、8%CO2细胞培养箱中孵育。每隔2-3天,更换1/2培养液。培养约10天后,选择单个克隆生长的阳性孔进行第二次筛选和亚克隆。连续三次亚克隆后,经ELISA法检测抗体阳性率为100%时,确定该杂交瘤细胞株(3B10)能稳定表达目的抗体,保种建库。该杂交瘤细胞株(3B10)的保藏号为:CGMCC NO.:10407。
在整个细胞融合过程中,在所用培养基中加入高浓度的人rhIL-6是一个关键,可帮助保持人-鼠异种杂交瘤细胞的稳定。另一个成功的关键是,经由流式细胞仪分选出记忆B细胞,这样大大增加了富集表达抗破伤风毒素抗体的B细胞的可能性。
实施例2抗破伤风毒素单抗全长重链、轻链基因及其可变区基因的克隆
首先,用Qiagen的RNeasy Plus Mini试剂盒提取实施例1中获得的抗破伤风毒素杂交瘤(3B10)的总RNA。然后用 II First Strand cDNA Synthesis试剂盒(New England Biolabs)用Oligo(dT)18为引物,逆转录mRNA成cDNA。以此cDNA为模板,根据抗体信号肽及恒定区基因的保守性,设计并合成兼并引物(其中W=A/T,K=G/T,R=A/G,Y=C/T,M=A/C,S=C/G,N=C/G/T,V=A/C/G)。
以下为实施例2中分别用来克隆抗体重链及轻链基因的上下游引物:
重链上游引物SEQ ID NO:11
5'-TGATCAGSACTGMACACAGAGRACTCACCATG-3'
重链下游引物SEQ ID NO:12
5'-CTGACTCGAGTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGG-3'
轻链上游引物SEQ ID NO:13
5'-ATGGACATGRDRVYCCYHGYKCASCTY-3'
轻链下游引物SEQ ID NO:14
5'-GGCCAAAGGATGGGAGGGGGTCAGG-3'
用上游兼并引物以及下游引物(参考已知重、轻链恒定区序列设计),利用PCR技术,克隆抗破伤风毒素人源单抗的重链和轻链基因。经基因测序,编码重链和轻链的开放阅读框分别为该抗体的重链(SEQ ID NO:5)和轻链(SEQ ID NO:6)基因。经与NCBI的GenBank数据库比对,重链为人的IgG1亚型,轻链为k型。
接着,以重链或链轻基因为模板,PCR扩增两者的可变区基因。PCR体系和参数设置如下:
扩增重链可变区基因(VH):
10′Pfx缓冲液5μL;
10mM dNTP混合液1.5μL;
Anti-TT heavy NheI UP.primer 1.5μL
SEQ ID NO:15 5'-GTGGGCTAGCGAGGTGCAACTG TTGGAGTCTGG-3';
Linker anti-TT heavy AS.primer 1.5μL
SEQ ID NO:16 5'-CCGGATCCGCCTCCTCCGGAGCCTCCTCCGCCGGCTGAGGAGACGGTGACCAGG-3';
重链模板cDNA 2μL;
Pfx DNA聚合酶(Invitrogen)0.5μL;
ddH2O 38μL,至总量50μL/反应。
扩增轻链可变区基因(VL):
10′Pfx缓冲液5μL;
10mM dNTP混合液1.5μL;
Linker anti-TT light sense.primer 1.5μL
SEQ ID NO:17(5'-GGCTCCGGAGGAGGCGGATCCGGCGGCGGAGGAAGCGACTACCAGATGACCCAG-3');
Anti-TT light EcoRI DN.primer 1.5μL
SEQ ID NO:18(5'-CGCTGAATTCGCCGCTTCCGCCGCCTCCCTTCATATCCACTTTGGTCCCAG-3');
轻链模板cDNA 2μL;
Pfx DNA聚合酶(Invitrogen)0.5μL;
ddH2O 38μL,至总量50μL/反应。
PCR参数设置:94℃,预变性,2分钟;20轮如下循环:94℃变性,25秒,56℃复性,25秒,68℃延伸,25秒;68℃延伸,5分钟。
用1.5%的琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增结果,并与1kb DNA分子量标记(NewEngland BioLabs)判断扩增片段的大小(如图1所示)。结果 显示:PCR扩增出轻链和重链可变区基因,其大小分别为:VL基因342bp,VH基因372bp,条带单一,与轻/重链可变区基因片段的预期大小一致。
实施例3抗破伤风毒素单抗L-P2A-H形式和ScFv-IgG1形式表达载体的构建
L-P2A-H形式是将抗体轻链(L)和重链(H)用自剪切的P2A肽段连接。其构建采用了overlapping PCR的方法。首先,在与上述相同的PCR反应体系中,轻链部分由下面的引物扩增:
Anti-TT light UP NheI.primer:
SEQ ID NO:19 5'-GTGGGCTAGCGACTACCAGATGACCCAGTCTCC-3'
P2A-TT light antisense.primer:
SEQ ID NO:20 5'-CCGGCCTGCTTCAGCAGGCTGAAGTTGGTGGCTCCGCTGCCACACTCTCCCCTGTTGAAG-3'
重链部分由下面的引物扩增:
P2A-TT heavy sense.primer:
SEQ ID NO:21 5'-CTGCTGAAGCAGGCCGGCGATGTGGAGGAGAATCCTGGCCCCATGGAGTTTGGGCTGAGC-3'
Anti-TT heavy AS XhoI.primer:
SEQ ID NO:22 5'-CTGACTCGAGTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGG-3'
采用Qiagen公司的胶回收试剂盒回收750bp的轻链和1.5kb的重链。两者按1:1的分子比例加入PCR的反应体系,用Anti-TT light UP NheI.primer和Anti-TT heavy ASXhoI.primer引物扩增2.2kb的L-P2A-H的终产物。胶回收后,用NheI和XhoI酶切,克隆进入pDirect载体上的NheI和XhoI单酶切位点。基因测序验证所构建质粒完全正确。
ScFv-IgG1形式的构建也采用overlapping PCR的方法。从实施例2中获得的VH和VL按1:1的分子比例加入PCR的反应体系,以Anti-TT heavy NheI UP.primer和Anti-TTlight EcoRI DN.primer引物扩增750bp左右的ScFv片段(如图2所示)。该片段进而与人IgG1Fc片段进行overlapping PCR,引物分别为Anti-TT heavy NheI UP.primer和Anti-TTheavy AS XhoI.primer,ScFv-IgG1终产物长度在1.5kb左右(如图2所示)。胶回收后,ScFv-IgG1用NheI和XhoI酶切,克隆进入pDirect载体上的NheI和XhoI单酶切位点。正确的质粒经双酶切鉴定:用EcoRI和 XhoI(E+X)可切出750bp的IgG1抗体Fc片段;用NheI和EcoRI(N+E)可切出762bp的ScFv片段;用NheI和XhoI(N+X)可切出1.5kb的ScFv-IgG1片段(如图2所示)。通过基因测序验证所构建质粒。
实施例4抗破伤风毒素人源抗体在CHO细胞中的表达及鉴定
采用Invitrogen公司的Neon电转化仪,将带有抗破伤风毒素人源抗体L-P2A-H形式或ScFv-IgG1形式的pDirect4.0载体(6-8μg)导入2-4′106CHO K1细胞(购自ATCC),以未转化的空细胞作对照。转化后,细胞铺在10厘米培养皿中(培养基为DMEM+5%FBS)。培养48h后,加Zeocin(300μg/mL)。筛选8-10天后,对照细胞都已死亡,而转化质粒的细胞在平皿中出现明显可见的100-200个细胞团。
将平皿中的细胞团以胰酶消化,制成单细胞悬液。细胞计数后,在96-孔培养板中进行亚克隆。培养10天后,采用常规ELISA法,以HRP标记的羊抗人IgG抗体筛选高表达抗破伤风毒素人源抗体的细胞株。
选取细胞形态好、倍增速度快的高表达细胞株20个左右,在普通培养基(DMEM+5%FBS)中扩增,细胞冻存备份。然后,将细胞在HyClone公司的HyCell无血清培养基中驯化。细胞在100mL摇瓶中,在37℃和5%CO2条件下悬浮摇动培养。通过监测细胞在此种条件下的倍增和抗体表达,最后筛选出1-2株生产用细胞株。通常,在HyCell无血清培养基中,没有经过亚克隆、直接由药物筛选出的细胞群,悬浮摇动培养10天左右的产量可达250mg/L。单个生产用细胞株的产量则更高达1000-1200mg/L。
图3显示了CHO细胞表达的人源抗破伤风毒素抗体(L-P2A-H形式)的SDS-PAGE(A)和Western Blot(B)电泳图。箭头所示为非还原条件下(泳道2和5)的完整抗体,分子量在180kDa左右。在还原条件下(泳道3和6),该抗体的重链(55kDa左右,*)和轻链(27kDa左右,**)与带有人IgG1Fc的人-鼠嵌合抗体Erbitux(泳道1和4)的重链和轻链的分子量相同。
图5显示了由CHO细胞表达,经Protein A亲和柱纯化的人源抗破伤风毒素抗体(ScFv-IgG1形式)的SDS-PAGE(还原状态)的电泳图。在还原状态下,ScFv-IgG1的分子量在60kDa左右,比带有完整的重链(55kDa左右)和轻链(27kDa左右)的野生型抗体分子要小四分之一。
实施例5抗破伤风类毒素单克隆抗体对动物的保护作用实验
将0.8ng破伤风毒素(Sigma)用0.4ml含0.01%BSA的PBS溶解,皮下注射给17-19g的雌性Balb/c小鼠(每组5只)。2.5小时后,2.5μg人 源抗破伤风毒素抗体(anti-TT,L-P2A-H形式)或Erbitux对照抗体(Ctrl Mab),以0.4ml含0.01%BSA的PBS溶解后,腹腔注射小鼠。注射anti-TT的小鼠可存活30天以上,而对照组的小鼠在3-5天内均已死亡。全人源抗破伤风毒素抗体(L-P2A-H形式)在小鼠体内中和破伤风毒素的效果如图4所示。
L-P2A-H形式的抗体和重链(H)与轻链(L)分别单独表达的抗体在结构和分子量上高度相似。前者以单链形式是为了方便表达。可以预期,H+L双链抗体与L-P2A-H抗体的体内活性是一致的。然而,由于破伤风菌感染一般发生在组织深部,能否迅速扩散进入组织或许是更重要的治疗指标。为了进一步说明分子量更小的抗破伤风毒素抗体的保护作用,现以ScFv-IgG1单链抗体为例,进行抗体剂量实验。具体地,将1.0ng破伤风毒素(Sigma)以0.2ml含0.01%BSA的PBS溶解,右侧背部皮下注射于17-19g的雌性Balb/c小鼠(每组5只)。2.5小时后,分别在注射过破伤风毒素的小鼠的左侧背部皮下注射剂量为50ng、100ng、200ng或500ng的ScFv-IgG1抗体。实验结果如图6所示,未注射抗体的对照组小鼠在3天后死亡2只,在第4、5天又分别死亡1只,而剩下的那只小鼠则出现腿瘸现象。注射了本发明的抗体的实验组,未出现小鼠死亡。在抗体注射剂量为50ng的实验组中,有4只出现腿瘸现象。随着注射的抗体剂量的增加,各实验组中腿瘸的小鼠数目逐渐减少。在给予500ng抗体的实验组中,只有1-2只小鼠出现腿瘸现象,其余的小鼠都表现正常。
根据本发明的实验数据,以最保守剂量计算,500ng即0.5μg抗体能完全保护小鼠存活。按标准抗毒素与标准毒素混合后注射的小鼠于72~120h内全部死亡为标准,定义抗毒素效价为0.5IU/ml x 0.4ml(注射的抗体体积)即0.2IU计算,本发明的抗体的效价为0.2IU/0.5μg,即>400IU/mg。
尽管已经对本发明的具体实施方式进行了详细说明和描述,但应当认识到,本发明不受所述具体实施方式的限制。在不脱离本发明主旨和范围的情况下,可以对本发明做出各种改进、修饰和变化,而这些改进、修饰和变化均在本发明的范围之内。
Claims (18)
1.一种全人源抗破伤风毒素单克隆抗体,其特征在于,所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:3所示,所述单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列为SEQ IDNO:4所示。
2.如权利要求1所述的单克隆抗体,其特征在于,所述单克隆抗体的重链的氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示;所述单克隆抗体的轻链的氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示。
3.如权利要求1所述的单克隆抗体,其特征在于,编码所述单克隆抗体的重链的DNA序列为SEQ ID NO:5所示,编码所述单克隆抗体的轻链的DNA序列为SEQ ID NO:6所示。
4.如权利要求1所述的单克隆抗体,其特征在于,所述单克隆抗体的重链和轻链通过自剪切序列连接,所述自剪切序列选自2A肽段。
5.如权利要求4所述的单克隆抗体,其特征在于,所述自剪切序列选自序列为SEQ IDNO:25所示的P2A、序列为SEQ ID NO:26所示的T2A或序列为SEQ ID NO:27所示的E2A。
6.如权利要求5所述的单克隆抗体,其特征在于,所述自剪切序列为SEQ ID NO:25所示的P2A。
7.如权利要求1所述的单克隆抗体,其特征在于,所述单克隆抗体的氨基酸序列为SEQID NO:7所示。
8.如权利要求1所述的单克隆抗体,其特征在于,编码所述单克隆抗体的DNA序列为SEQID NO:8所示。
9.如权利要求1所述的单克隆抗体,其特征在于,所述单克隆抗体是重组单链抗体(ScFv)。
10.如权利要求9所述的单克隆抗体,其特征在于,所述重组单链抗体(ScFv)的重链可变区和轻链可变区通过第一短肽区连接,所述第一短肽区的氨基酸序列为SEQ ID NO:23所示。
11.如权利要求9或10所述的单克隆抗体,其特征在于,所述重组单链抗体与人源重链恒定区和轻链恒定区连接。
12.如权利要求11所述的单克隆抗体,其特征在于,所述人源重链恒定区和轻链恒定区选自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定区。
13.如权利要求11所述的单克隆抗体,其特征在于,所述人源重链恒定区和轻链恒定区为人IgG1恒定区。
14.如权利要求9所述的单克隆抗体,其特征在于,所述重组单链抗体通过第二短肽区和重链恒定区连接形成重组抗体,所述第二短肽区的氨基酸序列为SEQ ID NO:24所示。
15.如权利要求14所述的单克隆抗体,其特征在于,所述重组抗体的氨基酸序列为SEQID NO:9所示。
16.如权利要求14所述的单克隆抗体,其特征在于,编码所述重组抗体的DNA序列为SEQID NO:10所示。
17.一种杂交瘤细胞株,其保藏号为CGMCC NO.:10407。
18.如权利要求1-16中任一项所述的单克隆抗体在制备用于预防和/或治疗破伤风的药物中的应用。
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