BR102016017782A2

BR102016017782A2 - Anticorpos monoclonais humanos antitetânicos neutralizantes para a infecção por c.tetani, método de obtenção dos ditos anticorpos monoclonais e seu uso na imunoterapia para acidentes susceptíveis à infecção pelo bacilo tetânico

Info

Publication number: BR102016017782A2
Application number: BR102016017782-0A
Authority: BR
Inventors: Maria Moro Ana; Elias Kalil Filho Jorge; Aliprandini Eduardo
Original assignee: Fundação Butantan
Priority date: 2016-07-29
Filing date: 2016-07-29
Publication date: 2018-02-14
Also published as: WO2018018123A2; AR125232A2; WO2018018123A3; AR125231A2; PH12019500431A1; AR109221A1

Abstract

a presente invenção se refere a anticorpos monoclonais humanos antitetânicos para a infecção por c. tetani, os quais são obtidos a partir de técnicas de engenharia genética tendo como base a informação de sequência gênica obtida a partir de linfócitos b do sangue periférico de pessoas imunizadas com o toxóide tetânico. a informação genética é inserida em vetores usados para transfecção de células de mamíferos com o objetivo de gerar linhagens celulares produtoras dos anticorpos monoclonais antitetânicos. em um outro aspecto, a presente invenção se refere a composições imunológicas contendo o dito anticorpo monoclonal, assim como seus usos no tratamento e/ou imunoterapia da infecção por tétano.

Description

SUMÁRIO DA INVENÇÃO [0034] Para solucionar os problemas acima mencionados, a presente invenção propiciará vantagens significativas em relação à obtenção de anticorpos monoclonais humanos com propriedades neutralizantes, possibilitando um aumento do seu desempenho e apresentando uma relação custo/benefício mais favorável.

[0035] A presente invenção propõe a obtenção de anticorpos monoclonais humanos com propriedades

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18/82 neutralizantes para o tratamento de pessoas com probabilidade de desenvolver tétano. Trata-se de produtos que podem ser obtidos de forma homogênea, com consistência de lotes e sem causar imunogenicidade.

[0036] Os anticorpos monoclonais da presente invenção são obtidos a partir de técnicas de engenharia genética tendo como base a informação de seguência gênica obtida a partir de linfócitos B do sangue periférico de pessoas imunizadas com o toxóide tetânico. A informação genética é inserida em vetores usados para transfecção de células de mamíferos com o objetivo de gerar linhagens celulares produtoras dos anticorpos monoclonais antitetânicos.

[0037] A presente invenção propõe um novo produto, que possa ser obtido de forma homogênea e consistente, de origem humana, para evitar reações de hipersensibilidade e imunogenicidade.

[0038] Os anticorpos monoclonais da presente invenção têm sequências únicas de nucleotídeos e aminoácidos.

[0039] Em um outro aspecto, a presente invenção se refere ao uso dos referidos anticorpos monoclonais humanos para imunoterapia da infecção acidental por tétano. A vacinação, embora eficiente, mostra proteção diminuída nos

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19/82 idosos, não recuperada pela revacinação. Também são suscetíveis à infecção por tétano as pessoas acidentadas que não receberam reforço da vacina.

[0040] Em um outro aspecto da presente invenção se refere ao tétano neonatal, veiculado pelo corte do cordão umbilical, onde os anticorpos monoclonais humanos da presente invenção poderíam ser utilizados em recém-nascidos

acometidos	pela	infecção, já	que outros	anticorpos
monoclonais	de combate a agentes	infecciosos são	usados em
bebês.
[0041]	As	sequências	gênicas dos	anticorpos

neutralizantes da presente invenção serão utilizadas para geração de linhagens celulares estáveis produtoras dos anticorpos, em produtividade para escalonamento e produção em biorreatores. O produto resultante é um anticorpo com consistência de lote, de potência e de efetividade para uso em casos de acidentes com potencial de infecção pelo tétano.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0042] A estrutura e operação da presente invenção, juntamente com vantagens adicionais da mesma podem ser mais bem entendidas mediante referência aos desenhos em anexo e a seguinte descrição:

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20/82 [0043] A Figura 1 é um fluxograma mostrando a estratégia experimental para obtenção dos anticorpos monoclonais da presente invenção;

[0044] A Figura 2 mostra o resultado de ELISA qualitativo de ligação dos anticorpos à toxina tetânica, onde os anticorpos da presente invenção foram testados nas concentrações de 0,4 a 50 ng/mL. Soro do doador com alto título de neutralização foi usado para validação do teste como controle positivo na diluição inicial de 1:50 e diluições seriadas 1:5. Placa sensibilizada com 100 pL de toxina tetânica a 5 pg/mL;

[0045] A figura 3 mostra o resultado ELISA qualitativo de ligação dos anticorpos à anatoxina tetânica.

Os anticorpos da presente invenção foram testados nas concentrações de 0,4 a 50 ng/mL. Soro do doador com alto título de neutralização foi usado para validação do teste como controle positivo na diluição inicial de 1:50 e diluições seriadas 1:5. Placa sensibilizada com 100 pL de anatoxina tetânica a 5 pg/mL; e [0046] A figura 4 mostra o resultado de ensaio de neutralização da toxina tetânica in vivo da mistura dos anticorpos monoclonais 243 + 143 + 120. A mistura dos AcMos garantiu a sobrevivência de 100% dos animais quando utilizados 28 e 14 pg dos ditos anticorpos; e

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21/82 [0047] A figura 5 mostra o resultado ELISA dos anticorpos monoclonais 120, 143 e 243 da presente invenção para teste de ligação com anatoxina diftérica. Anticorpos testados nas concentrações de 0,4 a 50 ng/mL em quatro diluições seriadas 1:5. Soro policlonal humano foi usado como controle positivo na diluição inicial de 1:50 e diluições seriadas 1:5. Placa sensibilizada com 100 pL de anatoxina diftérica a 2 pg/mL.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [0048] Embora a presente invenção possa ser suscetível a diferentes modalidades, é mostrada nos desenhos e na seguinte discussão detalhada, uma modalidade preferida com o entendimento de que a presente modalidade deve ser considerada uma exemplificação dos princípios da invenção e não pretende limitar a presente invenção ao que foi ilustrado e descrito aqui.

[0049] Em um primeiro aspecto a presente invenção propõe a obtenção de anticorpos monoclonais humanos com propriedades neutralizantes para o tratamento de pessoas com probabilidade de desenvolver tétano. Trata-se de produtos que podem ser obtidos de forma homogênea, com consistência de lotes e sem causar imunogenicidade.

[0050] Os anticorpos monoclonais da presente invenção são obtidos a partir de técnicas de engenharia

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22/82 genética tendo como base a informação de sequência gênica obtida a partir de linfócitos B do sangue periférico de pessoas imunizadas com o toxóide tetânico. A informação genética é inserida em vetores usados para transfecção de células de mamíferos com o objetivo de gerar linhagens celulares produtoras dos anticorpos monoclonais antitetânicos.

[0051] Em um segundo aspecto a presente invenção propõe um novo produto, que possa ser obtido de forma homogênea e consistente, de origem humana, para evitar reações de hipersensibilidade e imunogenicidade.

[0052] Os anticorpos monoclonais da presente invenção têm sequências únicas de nucleotídeos e aminoácidos.

[0053] Em um outro aspecto, a presente invenção se refere ao uso dos referidos anticorpos monoclonais humanos para imunoterapia da infecção acidental por tétano. A vacinação, embora eficiente, mostra proteção diminuída nos idosos, não recuperada pela revacinação. Também são suscetíveis à infecção por tétano as pessoas acidentadas que não receberam reforço da vacina.

[0054] Em um outro aspecto da presente invenção se refere ao tétano neonatal, veiculado pelo corte do cordão umbilical, onde os anticorpos monoclonais humanos da

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23/82 presente invenção poderíam ser utilizados em recém-nascidos acometidos pela infecção, já que outros anticorpos monoclonais de combate a agentes infecciosos são usados em bebês.

[0055] As sequências gênicas dos anticorpos neutralizantes da presente invenção serão utilizadas para geração de linhagens celulares estáveis produtoras dos anticorpos, em produtividade para escalonamento e produção em biorreatores. O produto resultante é um anticorpo com consistência de lote, de potência e de efetividade para uso em casos de acidentes com potencial de infecção pelo tétano.

[0056] A implantação da tecnologia para anticorpos monoclonais humanos demonstrada na presente invenção abrirá um caminho para o tratamento do tétano, e também de outras doenças infecciosas, tais como difteria, raiva, zika, etc.

[0057] A vacina contra o tétano é sempre administrada junto com a diftérica (DT). Diante deste fato, os anticorpos da presente invenção foram testados contra toxina diftérica e são exclusivos contra toxina tetânica.

CONCRETIZAÇÃO PREFERENCIAL DA PRESENTE INVENÇÃO [0058] A presente invenção baseia-se na clonagem e expressão dos genes produtores de imunoglobulinas obtidos diretamente de linfócitos B humanos. Por essa técnica,

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24/82 amplificam-se os genes dos domínios variáveis das imunoglobulinas de um único linfócito B humano produtor de um anticorpo específico, que são clonados em um vetor de expressão à montante da região constante humana respectiva (pesada ou leve).

[0059] Dessa forma, após transfecção, as células eucariotas produzirão uma molécula de anticorpo inteiro, com estrutura idêntica à humana. Para a produção de anticorpos por essa metodologia são necessários: a coleta de sangue de doadores que tenham células B circulantes contra um determinado antígeno e o antígeno purificado para a identificação dessas células por imunofenotipagem.

[0060] A presente invenção teve o objetivo de obter anticorpos monoclonais humanos antitetânicos através da captura de linfócitos B produtores de anticorpos específicos utilizando o antígeno ou pela separação de plasmablastos após reforço da vacinação. A separação das células coletada de doadores foi feita por equipamento de cell sorter, que depositou uma célula B específica em cada poço em placa de 96 poços. As regiões variáveis dos anticorpos foram amplificadas e clonadas em vetores de expressão que foram usados para transfectar transitoriamente células HEK293-F. Para a captura dos

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25/82 linfócitos B específicos raros foram usadas estratégias diferentes de marcação e cell sorting.

[0061] A utilização da toxina tetânica conjugada, independentemente, com dois marcadores diferentes, biotina e Alexa Fluor® 647 possibilitou a separação específica de linfócitos B produtores de anticorpos tetânicos, que foram avaliados por ELISA, western blotting e pela inibição da ligação da toxina ao gangliosídio GTlb. O ensaio in vivo mostrou proteção total dos animais quando três anticorpos monoclonais foram usados em conjunto, neutralizando a toxina tetânica da ligação e protegendo os animais

desafiados com o antígeno,	em	experimento no qual o soro
policlonal	produzido em	cavalos foi	utilizado como
controle.
[0062]	0 processo	de	obtenção	dos anticorpos

monoclonais da presente invenção é apresentado na Figura 1, e compreende as seguintes etapas:

1. Coleta de sangue de doadores com altos títulos de anticorpos neutralizantes para a toxina tetânica; 2.

Separação de linfócitos B produtores de anticorpos antitetânicos de sangue de voluntários humanos vacinados contra o tétano;

3. Amplificação das regiões variáveis dos anticorpos das células separadas por cell sorting;

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4. Clonagem das sequências em vetores de expressão de células de mamíferos;

5. Expressão dos anticorpos recombinantes, purificação e utilização no teste de atividade. Células mononucleares de sangue periférico (CMSP) de seis doadores adultos foram isoladas. Os experimentos referentes a presente invenção foram aprovados pela Comissão de Ética em Pesquisa

Envolvendo Seres Humanos do ICB da USP e pela Fundação PróSangue, onde foram coletadas as bolsas de sangue. De alguns, o sangue foi coletado tempos diferentes pós vacinação, de outros o sangue foi coletado dias após vacinação de reforço.

[0063] 0 teste de neutralização in vivo foi feito de acordo com o método utilizado pelo Controle de Qualidade do Instituto Butantan e a Farmacopeia Brasileira (Brasil 2010), em projeto aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de

Animais do Instituto Butantan.

[0064] Foram utilizados camundongos da linhagem

Swiss de ambos os sexos, entre 17 e 22 gramas. Ao todo, 250 animais procedentes do Biotério do Instituto Butantan foram divididos em cinco grupos experimentais com 50 animais: um controle com soro antitetânico de referência e quatro grupos teste. Cada anticorpo foi testado em cinco diluições, sendo 10 animais para cada diluição.

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Etapa 1 - Separação de linfócitos B produtores de anticorpos antitetânicos de sangue de voluntários humanos vacinados contra o tétano [0065] Foram realizados vários sortings com as células mononucleares (CMSP) dos doadores, visando separação de linfócitos B em modo single cell pelo uso de imunofenotipagem.

[0066] As células isoladas foram utilizadas para a realização da PCR e sequenciamento dos genes das regiões variáveis, leve e pesada, dos anticorpos. As estratégias para a captura de linfócitos B variaram para a obtenção de anticorpos específicos.

[0067] As estratégias foram refinadas para a captura de células raras.

- Sorting 1 - utilizou-se o toxoide tetânico conjudado à biotina.

- Sorting 2 - as células foram separadas pelo fenótipo CD19+/Streptavidina+.

- Sorting 3 - Os linfócitos B foram enriquecidos a partir de cerca de lOOxlO⁶ CMSP.

- Sorting 4 - as células foram coletadas após o doador ter recebido o reforço da vacina dT.

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- Sortíng 5 - este sorting foi realizado com células coletadas após o doador ter recebido o reforço da vacina dT.

- Sorting 6 - células coletadas após vacinação reforço pelo fenótipo CDl9 ⁺ IgG⁺TxT^DuP^lo+.

- Sorting 7 - mesma condição do sorting 6.

- Sorting 8 - células coletadas após vacinação de reforço. A marcação foi feita diretamente com cerca de 100 x 10⁶ CMSPs sem enriquecimento prévio.

- Sorting 9 - As células com o fenótipo CD19⁺CD27⁺⁺ foram separadas nos poços. Não foi utilizado o antigeno tetânico na marcação.

- Sorting 10 - A separação no cell sorter das células foi feita após o reforço da vacina dT.

A Tabela 2 mostra o número de pares de genes obtidos para as estratégias utilizadas.

Tabela 2: Pares de anticorpos obtidos nos sortings das células separadas com toxina tetânica e dos plasmablastos.

Sorting	Células separadas	Pares H+L amplificados
Kappa	Lambda
#6	Linf. B memória	20
		17	3

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29/82

#7	Linf. B memória	26
18	8
#8	Linf. B memória	59
55	4
#9	Plasmablastos	2!
15	13
#10	Plasmablastos	84
65	19

Etapa 2- Amplificação das regiões variáveis dos anticorpos das células separadas por cell sorting [0068] A transcrição reversa foi realizada na mesma placa onde as células foram separadas por cell sorting. Os controles realizados nos poços onde não havia célula foram:

dois controles negativos com adição de 1 pL de água, um controle da transcrição reversa com RNA de célula HeLa purificado e um controle da PCR das regiões variáveis com o conteúdo correspondente a 1000 linfócitos B que haviam sido separados previamente.

[0069] Em cada poço foram adicionados 3,5 pL de solução contendo 0,5 pL de oligonucleotídeos hexaméricos randômicos a 300 ng/pL (150 ng) , 0,5 pL de Igepal CA-630 (Sigma-Aldrich) a 10% em água, 6 U de RNAsin® (Promega) (0,15 pL a 40 U/pL) e 2,35 pL de água tipo 1 esterilizada.

O volume de 3,5 pL foi distribuído em cada poço usando

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30/82 micropipetador multicanal com homogeneização e troca de ponteiras a cada coluna. A placa foi selada, centrifugada rapidamente, incubada a 68 °C por 60 segundos no termociclador Mastercycler Nexus Gradient (Eppendorf,

Hamburgo, Alemanha) e imediatamente colocada e mantida no gelo. Adicionaram-se em cada poço 7 pL de solução contendo pL do tampão da enzima transcritase reversa SuperScript®

III	(Invitrogen)	5 vezes	concentrado com	15	mM	MgCl₂,
12, 5	nmols de cada	dNTP (0,	5 pL da solução a	25	mM	de cada
dNTP)	, 100 nmols	DTT (1	pL DTT 100 mM) ,	8	U	RNAsin®

(Promega) (0,2 pL a 40 U/pL) , 50 U da enzima transcritase reversa SuperScript® III (Invitrogen) (0,25 pL a 200 U/pL) e 2,05 pL de água tipo 1 esterilizada. 0 volume de 7 pL foi distribuído em cada poço usando micropipetador multicanal com homogeneização e troca de ponteiras a cada coluna. A placa foi selada e centrifugada rapidamente. A reação ocorreu a 42 °C por 5 min, 25 °C por 10 min, 50 °C por 60 min e 94 °C por 5 min e finalmente mantida a 4° C. O cDNA obtido foi aliquotado em quatro placas de 96 poços novas (3 pL por poço), respeitando o endereço inicial de cada poço na placa. Cada placa foi utilizada para amplificação independente das regiões variáveis das cadeias pesada, leve kappa, leve lambda, além do controle β-actina.

[0070] As reações foram feitas com um protocolo de

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31/82 nested PCR, sendo que a primeira reação com o cDNA aliquotado em cada placa. Os componentes (Oligonucleotídeo

5' / Mistura oligonucleotídeos 5' 50 μΜ, Oligonucleotídeo

3’ 50 μΜ, MgCl2, dNTP, HotStarTaq® Plus DNA polimerase e

Água tipo 1 esterilizada qsp) foram adicionados em cada poço (em volume final de 40 pL) , a placa foi selada e a

reação	feita	com ativação	da	enzima	por 5	min a 95 °C,
seguido	de 50	ciclos de 94	°C	por 30	s, 58 ^c	>C (Ig /Igx/p-
actina)	ou 6 0	°C (IgÀ) por	30	s, 72 °C	por 55	s, e extensão
final a	72 °C	por 10 min.	A	segunda	reação	(nested) foi

feita em outra placa com 3,5 pL do produto da primeira PCR transferido com micropipetador multicanal respeitando a posição inicial de cada poço e com os componentes descritos acima, em volume final de 40 pL. A condição foi: 5 min a °C, seguido de 50 ciclos de 94 °C por 30 s, 58 °C (IgH/Igx) ou 60 °C (IgÀ) por 30 s, 72 °C por 45 s, e extensão final a 72 °C por 10 min. As reações foram feitas nos termocicladores GeneAmp® PCR 9700 (Applied Biosystems,

Foster City, CA, EUA) e Mastercycler Nexus Gradient (Eppendorf, Hamburg, Alemanha). Os oligonucleotídeos usados estão descritos na Tabela seguinte.

Oligonucleotídeos utilizados na amplificação das regiões variáveis das cadeias de imunoglobulinas

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Nome do

Etapa

PCR oligonucleotíd eo

Sequência do oligonucleotídeo 5'-3'

I^a

Reaçã o Cadei a

pesad a

gama

5' L-VH 1

5' L-VH 3

5' L-VH 4/6

5' L-VH 5

5' IGHV1,7-X1

5' IGHV1-X1041

5' IGHV2-X1036

5' VH3 Leader5' RM-IGHV4-X1

3' Cy CHI

5' RMX2-A

Reaçã

Cadei pesad a

ACAGGTGCCCACTCCCAGGTGCAG

AAGGTGTCCAGTGTGARGTGCAG

CCCAGATGGGTCCTGTCCCAGGTGCAG

CAAGGAGTCTGTTCCGAGGTGCAG

ATGGACTGGACCTGGAG

TCCTCTTTGTGGTGGCAGCAGC

TCCACGCTCCTGCTRCTGAC

TAAAAGGTGTCCAGTGT

ATGAAACACCTGTGGTTCTTCC

GGAAGGTGTGCACGCCGCTGGTC

AGGTGCAGCTGCTGGAGTCKGG

3' IgG

Internai

GTTCGGGGAAGTAGTCCTTGAC

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gama
I^a	5' L Vk 1/2	ATGAGGSTCCCYGCTCAGCTGCTGG
Reaçã	5' L Vk 3	CTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAG
o -	5' L Vk 4	ATTTCTCTGTTGCTCTGGATCTCTG
Cadei
a
	3' Ck543	GTTTCTCGTAGTCTGCTTTGCTCA
leve
kappa
2^a	5' Pan Vk	ATGACCCAGWCTCCABYCWCCCTG
Reaçã
o -
Cadei
	3' Ck 494	GTGCTGTCCTTGCTGTCCTGCT
a
leve
kappa
I^a	5' L VÀ 1	GGTCCTGGGCCCAGTCTGTGCTG
Reaçã	5' L VÀ 2	GGTCCTGGGCCCAGTCTGCCCTG
o -	5' L VÀ 3	GCTCTGTGACCTCCTATGAGCTG
Cadei	5' L VÀ 4/5	GGTCTCTCTCSCAGCYTGTGCTG
a	5' L VÀ 6	GTTCTTGGGCCAATTTTATGCTG
leve	5' L VÀ 7	GGTCCAATTCYCAGGCTGTGGTG
lambd	5' L VÀ 8	GAGTGGATTCTCAGACTGTGGTG
a	3' CÀ	CACCAGTGTGGCCTTGTTGGCTTG

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34/82

CTGCTACCGGTTCCTGGGCCCAGTCTGTGCTGACK

5' Agel

VÁ 1

2^a

Reaçã o Cadei a

leve lambd

5' Agel

3' Xhol

VÁ

VÃ

VÁ

VÃ

CÃ

4/5

7/8

CAG

CTGCTACCGGTTCCTGGGCCCAGTCTGCCCTGACT

CAG

CTGCTACCGGTTCTGTGACCTCCTATGAGCTGACW

CAG

CTGCTACCGGTTCTCTCTCSCAGCYTGTGCTGACT

CA

CTGCTACCGGTTCTTGGGCCAATTTTATGCTGACT

CAG

CTGCTACCGGTTCCAATTCYCAGRCTGTGGTGACY

CAG

C T C C T CAC T CGAGGGYGGGAACAGAGT G

Fonte: BOSCARDIN (2013); WARDEMANN; KOFER (2013) [0071] O controle com β-actina foi feito em uma reação única com oligonucleotídeos

5' hp-actina 5' GAACCCCAAGGCCAACCGCGA e 3' ϊιβ-actina

5’CACGCACGATTTCCCGCTC.

[0072] Todas as amostras foram analisadas em gel de agarose 2% com SyBr Safe (Invitrogen) e visualizadas utilizando o transiluminador Safe Imager™ (Invitrogen) e sistema de fotodocumentação Gel Logic 112 (Carestream) . O tamanho esperado dos fragmentos era de: 450 pb para Ig ,

510 pb para Igx, 405 pb para IgÀ e 302 pb para β-actina.

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35/82 [0073] A quantificação dos produtos de PCR foi feita em gel de agarose 2% contendo SYBR® Safe DNA Gel Stain (Invitrogen) com corrida em paralelo com marcador de massas quantitativo Low DNA Mass (Invitrogen). A análise foi feita no software Carestream Molecular Imaging de acordo com manual do fabricante, com identificação das bandas do marcador de massas quantitativo, geração da curva-padrão e determinação da massa de DNA das bandas de cada amostra aplicada.

[0074] O sequenciamento foi realizado em todos os fragmentos amplificados da cadeia pesada e os das cadeias leves em cujo poço houve amplificação do par cadeia

pesada/leve.	As amostras foram	purificadas	com	ExoSAP-IT®
(Affymetrix)	misturando-se 5 pL	dos produtos	de	PCR e 2 pL
de ExoSAP-IT	e incubando-se por	15 min a 37	°c,	seguido de
15 min a 80°	C.
[0075] 0	sequenciamento foi	feito usando	o	kit BigDye

(Applied Biosystems) em sequenciador 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) com cerca de 20 ng de DNA, juntamente com 1,6 pmol do oligonucleotídeo 3' da reação nested da respectiva cadeia. Para a cadeia lambda foi sintetizado um oligonucleotídeo específico para sequenciamento, 3'ÀSeq -5' ACTCGAGGGYGGGAACAGAGTG. A

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36/82 condição da reação foi: 40 ciclos a 96° C por 10 s, 52 °C por 20 s e 60 °C por 4 min.

[0076] A análise das sequências foi feita usando o banco de dados IgBlast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/), com o sistema Kabat de delineamento do domínio V. Essa análise fornece a classificação dos segmentos V(D)J de acordo com a maior identidade com as sequências germinativas, além do número e localização das mutações somáticas. A sequência da CDR3 foi determinada pela contagem dos resíduos de aminoácidos posteriores à região do framework 3 até o motivo triptofano-glicina (WG) conservado nas sequências de cadeia pesada ou o motivo fenilalanina-glicina (FG) nas sequências das cadeias leves (WARDEMANN; KOFER, 2013).

[0077] As cadeias pesadas e leves foram pareadas conforme originalmente formaram o par correspondente.

Etapa 3- Clonagem das sequências em vetores de expressão de células de mamíferos.

[0078] Uma alíquota de bactérias Escherichia coli

DH5a quimiocompetentes (Invitrogen) foi plaqueada em meio

LB/ágar (triptona 10 g/L, extrato de levedura 5 g/L, NaCl g/L, ágar 1,5%) e incubada a 37 °C por 16-18 horas. Uma colônia foi inoculada em 10 mL de meio LB líquido durante

16-18 horas a 37 °C sob agitação de 200 RPM. Volume de 0,4

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37/82 mL da suspensão foi inoculado em 200 mL de meio LB liquido contendo 40 mM de glucose e 10 mM de MgCl2 e incubou-se a °C sob agitação de 200 RPM até ϋΟβοο atingir 0,8-0,9.

[0079] A cultura foi subdividida em tubos que foram mantidos em gelo por 20 min e em seguida centrifugados a

2500 xg por 20 min a 4 °C. O sobrenadante foi descartado e a células ressuspendidas em 50 mL de MgCl2 0,1 M estéril e gelado. Incubou-se em gelo por 20 min e centrifugou-se como indicado acima. O sedimento foi ressuspendido em 25 mL de

CaCÍ2 0,1 M estéril e gelado, incubado em gelo por 20 min e centrifugado como descrito. Finalmente, as bactérias foram ressuspendidas em 2,4 mL de CaCl2 0,1 M estéril e gelado e adição de 0,6 mL de glicerol. Após homogeneizada, a suspensão foi aliquotada em microtubos em banho de gelo/etanol e armazenados no freezer -80 °C. A eficiência de transformação foi determinada usando um plasmideo controle.

[0080] Os vetores utilizados para clonagem e expressão dos anticorpos foram gentilmente cedidos pela

Dra. Hedda Wardemann do Instituto Max Plank. Cada vetor contém a sequência que codifica para a região constante de uma das cadeias de imunoglobulina humana: pesada γΐ, κ ou λ. À montante da região constante está o sitio de clonagem

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38/82 para inserção da cadeia variável amplificada na PCR específica (Tiller et al, 2008).

[0081] Os vetores foram transformados em bactérias

E. coli DH5oí quimiocompetentes misturando-se 2 ng de cada vetor (em volume de 1 pL) independentemente em 10 pL da suspensão de bactérias. As suspensões foram incubadas em gelo por 30 min, seguido de choque térmico a 42 °C por 45 s e novamente incubação em gelo por 5 min. Adicionaram-se 100 pL de meio SOC (triptona 20 g/L, extrato de levedura 5 g/L,

NaCl 500 mg/L, KC1 2,5 mM, MgCl2 10 mM e glucose 20 mM) à suspensão de bactérias e incubou-se por uma hora a 37 °C sob agitação de 180 RPM. Inoculou-se toda a suspensão em uma placa de LB/ágar/ampicilina (triptona 10 g/L, extrato de levedura 5 g/L, NaCl 10 g/L, ágar 1,5%, ampicilina 100 pg/mL) e incubou-se a 37 °C por 16-18 horas. Uma colônia de cada vetor foi inoculada individualmente em 4 mL de meio

TB/ampicilina (Terrific Broth - triptona 12 g/L, extrato de levedura 24 g/L, glicerol 4 mL/L, KH2PO4 17 mM, K2HPO4 72 mM, ampicilina 75 pg/mL) e incubada a 37 °C por 16-18 horas sob agitação de 200 RPM. Cada suspensão foi dividida em duas alíquotas de 2 mL e foram usadas para isolamento dos vetores utilizando o kit Wizard® Plus SV Miniprep DNA

Purification (Promega). A determinação da concentração e

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39/82 pureza dos vetores foi feita por espectrofotometria a

260/280 nm.

[0082] Os vetores foram digeridos com as respectivas enzimas para serem linearizados:

[0083] plg - enzimas SalI-HF e Agel-HF (NEB - New

England Biolabs) [0084] plg* - enzimas Agel-HF e BsiWI (NEB) [0085] plgÀ - enzimas Xhol-HF e Agel (NEB) [0086] As digestões foram sequenciais, na ordem descrita acima com cada enzima na proporção de 2 U/pg de

DNA para as enzimas Agel e BsiWI e 10 U/pg para as enzimas

Sall e Xhol. A digestão procedeu por quatro horas a 37 °C para Agel, Sall e Xhol e 55 °C para BsiWI. Os vetores digeridos foram purificados por eletroforese em gel de agarose e kit Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega).

[0087] As amostras da RT-PCR provenientes dos poços selecionados após análise das sequências das cadeias variáveis foram submetidas à PCR com oligonucleotídeos específicos. Essa etapa serviu para amplificar o fragmento com um oligonucleotídeo em cada extremidade, evitando a inserção de mutações, além de adicionar sítios de restrição para clonagem nos vetores de expressão. O produto da primeira PCR foi usado como molde, com oligonucleotídeos 5'

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40/82 e 3' específicos para os genes V e J, respectivamente, contendo sítio de restrição específicos

Oligonucleotídeos utilizados na PCR específica

Cadeia amplificad

Nome de oligonucleotídeo

Cadeia pesada gama

5 '	Agel	VH	1/4/6
5 ’	Agel	VH	3/7
3 ’	Sall	JH
1/2/4/5
3 '	Sall	JH	3

' Sall JH 6

Cadeia leve kappa

5' Agel Vk específico

3' BsiWI Jk 1/4

3’ BsiWI Jk 2

3’ BsiWI Jk 3

Sequência do oligonucleotídeo

5'-3'

CTGCAACCGGTGTACATTCC[FRW1]

CTGCAACCGGTGTACATTCT[FRW1]

TGCGAAGTCGACGCTGAGGAGACGGTGAC

CAG

TGCGAAGTCGACGCTGAAGAGACGGTGAC

CATTG

TGCGAAGTCGACGCTGAGGAGACGGTGAC

CGTG

CTGCAACCGGTGTACAT[FRWl]

GCCACCGTACGTTTGATYTCCACCTTGGT

C

GCCACCGTACGTTTGATCTCCAGCTTGGT

C

GCCACCGTACGTTTGATATCCACTTTGGT

C

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41/82

GCCACCGTACGTTTAATCTCCAGTCGTGT

3’ BsiWI Jk 5

CTGCTACCGGTTCCTGGGCCCAGTCTGTG

5' Agei VÃ 1

CTGACKCAG

CTGCTACCGGTTCCTGGGCCCAGTCTGCC

5' Agei VÃ 2

5' Agei VÃ 3

CTGACTCAG

CTGCTACCGGTTCTGTGACCTCCTATGAG

Cadeia leve lambda

CTGACWCAG

CTGCTACCGGTTCTCTCTCSCAGCYTGTG

5’ Agei VÃ 4/5

CTGACTCA

CTGCTACCGGTTCTTGGGCCAATTTTATG

5' Agei VÃ 6

5’ Agei VÃ 7/8

3’ Xhoi CÃ

CTGACTCAG

CTGCTACCGGTTCCAATTCYCAGRCTGTG

GTGACYCAG

CTCCTCACTCGAGGGYGGGAACAGAGTG

Regiões sublinhadas correspondem aos sítios de restrição.

Fonte: WARDEMANN & KOFFER (2013).

[0088] Após a PCR específica, a amplificação das amostras foi confirmada por eletroforese em gel de agarose

2%. Os fragmentos obtidos foram purificados com kit

QIAquick® 96 PCR Purification (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante, eluídos com 60 pL de água tipo 1 esterilizada, digeridos com as enzimas de restrição cujos sítios foram inseridos durante a PCR específica, e clonados

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42/82 nos vetores de expressão que contêm as regiões constantes de cada cadeia do anticorpo.

[0089] Caso o fragmento amplificado contivesse sequência do sítio de restrição das enzimas utilizadas (verificado anteriormente à digestão através do site http://www.restrictionmapper.org/index.html), a digestão com a referida enzima era feita parcialmente, com diluições seriadas da enzima e incubação por 2 min na temperatura específica da enzima (CAMPEAU, 2009).

[0090] Após digestão, os produtos de PCR foram novamente purificados com QIAquick® 96 PCR Purification (Qiagen) e eluídos com 60 pL de água tipo 1 esterilizada.

[0091] A ligação do fragmento ao vetor foi feita em volume total de 10 pL com 8 pL do produto da PCR específica digerido e purificado, 0,5 pL do respectivo vetor linearizado a ng/pL, 1 pL do tampão da enzima T4 DNA ligase (NEB) e

0,5 pL da enzima T4 DNA ligase 400 U/pL (NEB). A incubação foi de duas horas a 23 °C. Procedeu-se à transformação como descrito em 3.11.2, utilizando 10 pL da suspensão de bactérias quimiocompetentes e 4,5 pL do produto de ligação.

As colônias obtidas foram triadas por PCR.

[0092] Três colônias de cada placa foram testadas para verificar a presença do inserto. A triagem foi feita

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43/82 por PCR utilizando oligonucleotídeos que se anelam na região líder à montante do sítio de clonagem e na região constante da respectiva cadeia.

[0093] A mistura da PCR utilizado continha para cada reação: 125 μΜ de cada dNTP, 400 nM do oligonucleotídeo 5', 400 nM do oligonucleotideo 3', 1,5 mM de MgCÍ2 e 1 U de Taq DNA polimerase recombinante (Invitrogen) em 25 pL de reação.

Oligonucleotídeos utilizados para verificação da presença do inserto no vetor de expressão

Nome do oligonucleotídeo	Sequência do oligonucleotídeo 5'-3'
5'Ab sense	GGTTCGTTAGAACGCGGCTAC
3' IgG (internai) - para cadeia	GTTCGGGGAAGTAGTCCTTGAC
3' Ck 494 - para cadeia κ	GTGCTGTCCTTGCTGTCCTGCT
3' CÃ - para cadeia λ	CACCAGTGTGGCCTTGTTGGCTT G

Fonte: WARDEMANN & KOFFER (2013).

[0094] A mistura foi distribuída em poços de uma placa de 96 poços para PCR. Usando uma ponteira de micropipeta estéril, retirou-se com a ponta uma colônia isolada que foi transferida para uma placa de petri com

LB/ágar/ampicilina sobressalente. Em seguida, a ponteira foi mergulhada na mistura da PCR aliquotada na placa de 96

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44/82 poços. A placa de petri foi incubada a 37° C por 16-18 horas e armazenada na geladeira. A reação da PCR foi na seguinte condição: 5 min 94° C; 27 ciclos de 94° C por 30 s, 58° C por 30 s, 72° C por 60 s; e extensão final a 72° C por 10 min. Os produtos de PCR foram analisados por eletroforese em agarose 2%, cujos tamanhos esperados eram:

650 pb para Ig 1, 700 pb para Igx e 590 pb para IgÀ. Os fragmentos considerados positivos foram purificados com

ExoSAP-IT (Affymetrix) e sequenciados de acordo como descrito anteriormente. 0 oligonucleotídeo utilizado para seguenciamento foi o 5'Absense.

[0095] As seguências obtidas da PCR de colônias foram comparadas com as obtidas na RT-PCR utilizando a ferramenta de alinhamento de duas ou mais seguências do

BLAST (bl2seg - Align Sequence Nucleotide BLAST).

Verificou-se a identidade das seguências, desconsiderando as regiões de anelamento dos oligonucleotídeos e determinou-se a colônia gue continha o vetor com a seguência variável idêntica àguela obtida na RT-PCR.

[0096] Uma parte da colônia selecionada foi coletada da placa sobressaiente e inoculada em 4 mL de meio

TB. O vetor foi isolado de uma das alíguotas de 2 mL da suspensão das bactérias e a outra foi congelada após centrif ugação a 10.000 xg por 5 min e remoção do

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45/82 sobrenadante. 0 isolamento foi feito com kit Wizard® Plus

SV Miniprep DNA Purification (Promega) e determinação da concentração e pureza por espectrofotometria a 260/280 nm.

Etapa 3- Expressão dos anticorpos recombinantes de forma transitória [0097] A expressão dos anticorpos foi feita com cotransfecção transitória do vetor da cadeia pesada e da leve correspondente ao par obtido do mesmo poço na RT-PCR.

[0098] Células FreeStyle™ 293-F HEK 293f (Invitrogen) foram cultivadas em suspensão em FreeStyle™

293 Expression Médium (Invitrogen) em estufa a 37° C com 8%

CO2 e agitação de 120 RPM. No dia anterior à transfecção, a suspensão foi preparada no volume de 30 mL de suspensão para cada anticorpo a ser transfectado na concentração de aproximadamente 0,5xl0⁶ células/mL. No dia da transfecção, a suspensão foi aliquotada em volume de 30 mL em erlenmeyers de 125 mL na concentração entre 0,9 e 1,1x10® células/mL para cada anticorpo a ser transfectado.

[0099] A solução de DNA para transfecção foi preparada em volume final de 1,5 mL de PBS. Inicialmente, pg dos vetores [15 pg de cada um (cadeia pesada e leve)] foram adicionados a volume de PBS e incubados por 5 minutos a temperatura ambiente. Adicionaram-se 103 pL de solução de

Polietilenimina - PEI (Sigma-Aldrich) a 0,45 mg/mL e

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46/82 agitou-se em vortex por 15 segundos, sendo incubada novamente por mais 10 min a temperatura ambiente protegida da luz antes de ser gotejada sobre a suspensão das células que foi mantida em cultivo por 72 horas. O sobrenadante foi coletado após centrifugação a 800 xg por 10 min em centrífuga de tubos (Sorval Legend RT, Newtown, CT, EUA).

[00100] Os anticorpos foram purificados por cromatografia de afinidade com proteína A utilizando o sistema ÀKTA Purifier (GE Healthcare, Suécia). O sobrenadante filtrado foi aplicado na coluna de proteína Asefarose (GE Healthcare, Suécia) equilibrada com tampão fosfato 20 mM pH 7. A coluna foi lavada com o mesmo tampão.

A primeira eluição foi feita com tampão citrato de sódio

100 mM pH 6 e a segunda com tampão citrato de sódio 100 mM pH 3,2, para recuperação dos AcMos. A amostra coletada foi neutralizada com quantidade suficiente de solução de Tris 1

Μ. O anticorpo purificado e neutralizado foi dialisado contra PBS e esterilizado por filtração.

[00101] A concentração de cada anticorpo foi determinada por absorbância em 280 nm usando o coeficiente

Ao,i% = 1,4.

[00102] Com as modificações nos protocolos foi possível obter sequências clonalmente relacionadas. A análise do repertório dos fragmentos V_H dos anticorpos

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M/V2.

obtidos e as mutações somáticas. Os segmentos mais representados nos três doadores são da família Vh3, seguido da V_H1 e V_H4 .

[00103] Os anticorpos foram testados ligação às formas disponíveis do antígeno:

anatoxina tetânicas, fragmento C recombinante tetânica.

quanto à toxina e da toxina [00104] As Figuras 2 e 3 mostram as curvas de ligação dos anticorpos contra a TxT e AnT.

[00105] A Figura 2 mostra o resultado de ELISA qualitativo de ligação dos anticorpos à toxina tetânica, onde os anticorpos da presente invenção foram testados nas concentrações de 0,4 a 50 ng/mL. Foi usado Soro do doador para validação do teste como controle positivo na diluição inicial de 1:50 e diluições seriadas 1:5. A Placa foi sensibilizada com 100 pL de toxina tetânica a 5 pg/mL;

[00106] A figura 3 mostra o resultado ELISA qualitativo de ligação dos anticorpos à anatoxina tetânica.

Os anticorpos da presente invenção foram testados nas concentrações de 0,4 a 50 ng/mL. Foi utilizado Soro do doador para validação do teste como controle positivo na diluição inicial de 1:50 e diluições seriadas 1:5. A Placa foi sensibilizada com 100 pL de anatoxina tetânica a 5 pg/mL.

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48/82 [00107] A interação dos anticorpos com a toxina tetânica foi testada por western blotting após SDS-PAGE na forma reduzida e não reduzida. Também foram testados em relação à inibição da ligação da toxina ao gangliosideo

GTlb. A ligação in vivo entre TxT e GTlb é necessária para a internalização da TxT no neurônio e geração dos efeitos tóxicos.

[00108] Os resultados do western blotting foram analisados juntamente com os resultados do ELISA e do ensaio de inibição da ligação ao GTlb para a escolha de alguns anticorpos para os ensaios in vivo em animais, visando conhecer a capacidade de neutralização da toxina tetânica pelos anticorpos humanos recombinantes.

[00109] 0 ensaio foi realizado no Infectório do

Instituto Butantan, com autorização do Comitê de Ética no

Uso de Animais do Instituto Butantan, segundo o protocolo descrito na Farmacopeia Brasileira (Brasil 2010). Foram testados quatro grupos de anticorpos:

[00110] - Mistura dos anticorpos BUT-TT-120, BUT-TT143 e BUT-TT-243. Os três anticorpos interagiram com a toxina tetânica no ELISA, e no ensaio de western blotting tiveram respostas diferentes: ligação na cadeia pesada, toxina inteira e cadeia leve, respectivamente.

[00111] Foi preparada mistura com mesma quantidade

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49/82 de cada anticorpo, testados em 50 animais em cinco grupos de 10 camundongos para teste de cinco diluições.

[00112] Foram preparadas misturas compostas da toxina tetânica na mesma concentração e quantidades diferentes dos anticorpos testados. Após incubação a 37° C por uma hora, aplicaram-se 200 pL de cada mistura subcutaneamente em 10 animais, que foram mantidos em observação por 96 horas, período em que foi verificado o número de camundongos saudáveis, mortos ou com sintomas de tétano.

[00113] A figura 4 mostra o resultado de ensaio de neutralização da toxina tetânica in vivo: Em D, mistura dos anticorpos BUT-TT-120, BUT-TT-143 e BUT-TT-243. A mistura dos AcMos garantiu a sobrevivência de 100% dos animais quando utilizados 28 e 14 pg dos anticorpos, sendo capaz de neutralizar a ação tóxica da toxina tetânica, garantindo a sobrevivência de todos os animais nos grupos com 28 e 14 pg de anticorpo.

[00114] A obtenção de anticorpos monoclonais humanos tem grande importância biotecnológica, sendo biofármacos com potencial terapêutico valioso pela baixa probabilidade de resposta imunogênica.

[00115] Com a presente invenção foi possível a obtenção de anticorpos humanos neutralizantes para a toxina

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50/82 tetânica pela modificação dos protocolos de marcação e captura dos linfócitos B produtores de anticorpos antitetânicos e pela estratégia de estabelecimento dos gates nos sortings, devido à baixa probabilidade da existência de células B de memória antitetânicos no sangue periférico.

[00116] A proposta da estratégia de separação com toxina tetânica e conjugação com dois marcadores, Biotina, para captura com Estreptavidina-PerCP-Cy™5.5 e Alexa

Fluor® 647, teve dois objetivos:

- selecionar os linfócitos produtores de anticorpos relevantes contra epítopos da toxina (por usar o antígeno adequado) e

- aumentar a especificidade da identificação de células produtoras de anticorpos antitetânicos (por diminuir o background da identificação da população rara de linfócitos específicos).

[00117] A estratégia garantiu a obtenção de sequências clonalmente relacionadas, sugestivo da seleção pelo antígeno.

[00118] Além disso, um indicativo da especificidade da marcação foi a menor quantidade de poços com uma célula obtida quando da marcação com as toxinas conjugadas, comparado com os sortings feitos com as estratégias

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51/82 iniciais .

[00119] De um modo geral, os anticorpos obtidos a partir da marcação com a toxina tetânica ou a partir de plasmablastos reconheceram o antigeno nos ensaios realizados.

[00120] 0 repertório de segmentos Vh detectado nas seguências obtidas parece concordar com o observado em outros doadores imunizados contra tétano (De Kruif et al.,

2009), além de outras doenças, como AIDS (Scheid et al.,

2009a) e febre do Nilo Ocidental (Throsby et al., 2006), em que a classificação da sequência VH da maior parte dos anticorpos eram das famílias 1, 3 e 4, que correspondem às famílias com maior número de representantes no lócus do cromossomo 14 [17 segmentos da família VhI, 4 da Vh2, 51 da

Vh3, 13 da Vh4, 3 da Vh5, 1 da Vh6 e 6 da Vh7, de um total de 95 segmentos (Cook et al;, 1995)].

[00121] A quantidade de mutações somáticas detectadas nas regiões variáveis também foi semelhante à observada em AcMos humanos anti-HIV (Scheid et al., 2009a).

[00122] Houve concordância quanto à interação dos anticorpos nos ELISAs, sendo que aqueles que interagiram com a TxT também o fizeram com AnT.

[00123] Os três AcMos obtidos na presente invenção (243, 143 e 120) e que misturados protegeram os camundongos

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52/82 da linhagem Swiss contra a ação da TxT interagem em locais diferentes na toxina, de acordo com o resultado de western blotting: cadeia pesada, cadeia leve a toxina inteira, não reduzida.

[00124] Parece ser um consenso no estado na técnica mostrar que a mistura de mais de um anticorpo monoclonal tem efeito neutralizante, mesmo se individualmente não o tenham, ou que seria necessária uma quantidade maior do

AcMo para obter o mesmo efeito.

[00125] Volk e colaboradores (1984) mostraram que a combinação de anticorpos monoclonais era cerca de duas ordens de magnitude mais eficiente na capacidade de neutralização da toxina do que os AcMos testados individualmente em concentração equivalente (concentração total de anticorpos). Propõe-se que, para manter a toxina neutralizada, o anticorpo monoclonal deva estar em quantidade para evitar a dissociação entre o AcMo e a TxT.

[00126] De acordo com a lei de ação de massas, quando em equilíbrio, ocorre associação e dissociação entre antígeno e anticorpo, sendo que, no caso de uma molécula de toxina ficar livre, ela estará disponível para exercer sua função tóxica.

[00127] Assim, quando misturados, dois ou mais anticorpos monoclonais podem ter efeito sinérgico e

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53/82 prevenir a liberação da toxina livre para exercer sua função tóxica.

[00128] De qualquer maneira, é necessário considerar que grande parte dos estudos do estado da técnica obtiveram os anticorpos monoclonais antitetânicos a partir de hibridomas murinos, após imunização e coleta de células de baço.

[00129] Os anticorpos monoclonais da presente invenção foram obtidos de células do sangue periférico humano após imunização. Já foi demonstrado que, em seres humanos, a frequência de células de memória produtoras de anticorpos antitetânicos é maior em órgãos linfoides secundários, como as tonsilas, e não no sangue periférico (Cao et al., 2010).

OBTENÇÃO DOS ANTICORPOS MONOCLONAIS DA PRESENTE INVENÇÃO

Anticorpo monoclonal 1-BUT-TT-120-VL [00130] SEQ ID NO 1: sequência de nucleotídeos da região variável da cadeia leve do anticorpo BUT-TT-120 [00131] SEQ ID NO 2: sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve do anticorpo BUT-TT-120

Primers utilizados:

Amplificação da sequência:

PCR 1

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54/82

5' L-Vkl/2	ATGAGGSTCCCYGCTCAGCTGCTGG
5' L-Vk3	CTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAG
5' L-Vk4	ATTTCTCTGTTGCTCTGGATCTCTG
3' Ck543	GTTTCTCGTAGTCTGCTTTGCTCA

PCR 2

5’ Pan-Vk	ATGACCCAGWCTCCABYCWCCCTG
3' Ck494	GTGCTGTCCTTGCTGTCCTGCT

Clonagem

5' Age Vk 3-20	TTGTGCTGCAACCGGTGTACATTCAGAAATTGTGTTGACGCAGTCT
3' BsiWI Jk 3	GCCACCGTACGTTTGATATCCACTTTGGTC

Anticorpo Monoclonal 1-BUT-TT-120-VH [00132] SEQ ID NO 3: sequência de nucleotideos da região variável da cadeia pesada do anticorpo BUT-TT-120 [00133] SEQ ID NO 4: sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada do anticorpo BUT-TT-120

Primers utilizados:

• Amplificação da sequência:

PCR 1:

5'L-VH1	ACAGGTGCCCACTCCCAGGTGCAG
5'IGHV1,7-X1	ATGGACTGGACCTGGAG
5'IGHVl-Xl-041	TCCTCTTTGTGGTGGCAGCAGC
5'IGHV2-X1-036	TCCACGCTCCTGCTRCTGAC

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55/82

5'5'L-VH3	AAGGTGTCCAGTGTGARGTGCAG
5'VH3 Leader-A	TAAAAGGTGTCCAGTGT
5'L-VH4/6	CCCAGATGGGTCCTGTCCCAGGTGCAG
5'RM-IGHV4-X1	ATGAAACACCTGTGGTTCTTCC
5 ' L-VH5	CAAGGAGTCTGTTCCGAGGTGCAG
3' Cg CHI (gamma)	GGAAGGTGTGCACGCCGCTGGTC

PCR 2

5ΉΜΧ2-Α	AGGTGCAGCTGCTGGAGTCKGG
3'IgG-internal	GTTCGGGGAAGTAGTCCTTGAC

Clonagem

5' Agel VH4-39	CTGCAACCGGTGTACATTCCCAGCTGCAGCTGCAGGAG
3' Sall JH 1/2/4/5	TGCGAAGTCGACGCTGAGGAGACGGTGACCAG

Anticorpo Monoclonal 2-BUT-TT-143-VL [00134] SEQ ID NO 5: seguência de nucleotídeos da região variável da cadeia leve do anticorpo BUT-TT-143 [00135] SEQ ID NO 6: seguência de aminoácidos da região variável da cadeia leve do anticorpo BUT-TT-143

Primers utilizados:

Amplificação da seguência:

PCR 1

5' L-Vkl/2	ATGAGGSTCCCYGCTCAGCTGCTGG
5' L-Vk3	CTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAG
5' L-Vk4	ATTTCTCTGTTGCTCTGGATCTCTG

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56/82

3' Ck543

GTTTCTCGTAGTCTGCTTTGCTCA

PCR 2

5’ Pan-Vk	ATGACCCAGWCTCCABYCWCCCTG
3’ Ck494	GTGCTGTCCTTGCTGTCCTGCT

• Clonagem:

5' Age Vk 3-20	TTGTGCTGCAACCGGTGTACATTCAGAAATTGTGTTGACGCAGTCT
3’ BsiWI Jk 1/4	GCCACCGTACGTTTGATYTCCACCTTGGTC

Anticorpo Monoclonal 2-BUT-TT-143-VH [00136] SEQ ID NO 7: sequência de nucleotídeos da região variável da cadeia pesada do anticorpo BUT-TT-143 [00137] SEQ ID NO 8: sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada do anticorpo BUT-TT-143

Primers utilizados:

• Amplificação da sequência:

PCR 1:

5'L-VH1	ACAGGTGCCCACTCCCAGGTGCAG
5'IGHV1,7-X1	ATGGACTGGACCTGGAG
5'IGHVl-Xl-041	TCCTCTTTGTGGTGGCAGCAGC
5'IGHV2-X1-036	TCCACGCTCCTGCTRCTGAC
5'5'L-VH3	AAGGTGTCCAGTGTGARGTGCAG
5'VH3 Leader-A	TAAAAGGTGTCCAGTGT
5'L-VH4/6	CCCAGATGGGTCCTGTCCCAGGTGCAG

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57/82

5'RM-IGHV4-X1	ATGAAACACCTGTGGTTCTTCC
5'L-VH5	CAAGGAGTCTGTTCCGAGGTGCAG
3' Cg CHI (gamma)	GGAAGGTGTGCACGCCGCTGGTC

PCR 2

5'RMX2-A	AGGTGCAGCTGCTGGAGTCKGG
3'IgG-internal	GTTCGGGGAAGTAGTCCTTGAC

• Clonagem:

5' Agel VH3-33	CTGCAACCGGTGTACATTCTCAGGTGCAGCTGGTGGAG
3' Sall JH 3	TGCGAAGTCGACGCTGAAGAGACGGTGACCATTG

Anticorpo Monoclonal 3-BUT-TT-243-VL [00138] SEQ ID NO 9: sequência de nucleotideos região variável da cadeia leve do anticorpo BUT-TT-243 [00139] SEQ ID NO 10: sequência de aminoácidos região variável da cadeia leve do anticorpo BUT-TT-243

Sequência dos primers:

• Amplificação da sequência:

PCR 1 da da

PCR 2

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58/82

5' Pan-Vk	ATGACCCAGWCTCCABYCWCCCTG
3' Ck494	GTGCTGTCCTTGCTGTCCTGCT

• Clonagem:

5' Age Vk 3-11	TTGTGCTGCAACCGGTGTACATTCAGAAATTGTGTTGACACAGTC
3' BsiWI Jk 1/4	GCCACCGTACGTTTGATYTCCACCTTGGTC

Anticorpo Monoclonal 3-BUT-TT-243-VH [00140] SEQ ID NO 11: sequência de nucleotídeos da região variável da cadeia pesada do anticorpo BUT-TT-243 [00141] SEQ ID NO 12: sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada do anticorpo BUT-TT-243

Primers utilizados:

• Amplificação da sequência:

PCR 1:

5'L-VH1	ACAGGTGCCCACTCCCAGGTGCAG
5'IGHV1,7-X1	ATGGACTGGACCTGGAG
5'IGHV1-X1-041	TCCTCTTTGTGGTGGCAGCAGC
5'IGHV2-X1-036	TCCACGCTCCTGCTRCTGAC
5'5’L-VH3	AAGGTGTCCAGTGTGARGTGCAG
5'VH3 Leader-A	TAAAAGGTGTCCAGTGT
5'L-VH4/6	CCCAGATGGGTCCTGTCCCAGGTGCAG
5'RM-IGHV4-X1	ATGAAACACCTGTGGTTCTTCC

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59/82

5 ' L-VH5	CAAGGAGTCTGTTCCGAGGTGCAG
3' Cg CHI (gamma)	GGAAGGTGTGCACGCCGCTGGTC

PCR 2

5ΉΜΧ2-Α	AGGTGCAGCTGCTGGAGTCKGG
3'IgG-internal	GTTCGGGGAAGTAGTCCTTGAC

• Clonagem:

5' Agel VH1	CTGCAACCGGTGTACATTCCCAGGTGCAGCTGGTGCAG
3' Sall JH 1/2/4/5	TGCGAAGTCGACGCTGAGGAGACGGTGACCAG

ANTICORPOS MONOCLONAIS DA PRESENTE INVENÇÃO [00142] Os anticorpos monoclonais da presente invenção foram obtidos de células do sangue periférico humano de invidíduos imunizados. Já foi demonstrado que, em seres humanos, a frequência de células de memória produtoras de anticorpos antitetânicos é maior em órgãos linfoides secundários, como as tonsilas, e não no sangue periférico (Cao et al., 2010).

1) Anticorpo monoclonal l-BUT-TT-120 [00143] O Anticorpo monoclonal humano antitoxina tetânica l-BUT-TT-120 é um anticorpo monoclonal compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) e região variável de cadeia leve (VL), em que a cadeia pesada

VH compreende uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 4 e a cadeia leve VL compreende uma

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60/82 sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2.

SEQ ID NO: 2 - Sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve de anticorpo monoclonal humano #1BUT-TT-120-VL antitoxina tetânica

variável da cadeia pesada de anticorpo monoclonal humano #l-BUT-TT-120 anti-toxina tetânica

Gin	Leu Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Vai Lys Pro Ser Glu
1	5	10	15

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[00144] O Anticorpo monoclonal 2-BUT-TT-143 humano antitoxina tetânica é um anticorpo monoclonal compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) e região variável de cadeia leve (VL) , em gue a cadeia pesada VH compreende uma seguência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 8 e a cadeia leve VL compreende uma seguência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 6.

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SEQ ID NO: 6 - Sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve de anticorpo monoclonal humano #2BUT-TT-143 anti-toxina tetânica

variável da cadeia pesada de anticorpo monoclonal humano #2-BUT-TT-143 anti-toxina tetânica

Gin Vai	Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Vai Vai Gin Pro Gly Gly
1	5	10	15

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[00145] O Anticorpo monoclonal humano antitoxina tetânica l-BUT-TT-243 é um anticorpo monoclonal compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) e região variável de cadeia leve (VL), em que a cadeia pesada

VH compreende uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 12 e a cadeia leve VL compreende uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 10.

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SEQ ID NO: 10 - Sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve de anticorpo monoclonal humano #3BUT-TT-243 anti-toxina tetânica

variável da cadeia leve de anticorpo monoclonal humano #1BUT-TT-243 anti-toxina tetânica

Gin Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly Ser
1	5	10	15

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ANTICORPOS MONOCLONAIS DA PRESENTE INVENÇÃO FORAM TESTADOS

CONTRA TOXINA DIFTÉRICA E SÃO EXCLUSIVOS CONTRA TOXINA

TETÂNICA [00146] Os anticorpos monoclonais BUT-TT-120, BUTTT-143 e BUT-TT-243 também foram testados na ligação com a anatoxina diftérica (AnD), pois o sangue de alguns doadores foi coletado alguns dias após o reforço da vacina dT, que é composta pelos toxoides tetânico e diftérico. Além disso, esse antígeno serviu como teste de ligação a uma proteína não relacionada à toxina tetânica.

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66/82 [00147] A figura 5 mostra o resultado ELISA dos anticorpos monoclonais 120, 143 e 243 da presente invenção para teste de ligação com anatoxina diftérica. Anticorpos testados nas concentrações de 0,4 a 50 ng/mL em guatro diluições seriadas 1:5. Soro policlonal humano foi usado como controle positivo na diluição inicial de 1:50 e diluições seriadas 1:5. Placa sensibilizada com 100 pL de anatoxina diftérica a 2 pg/mL.

[00148] Os resultados comprovam gue anticorpos monoclonais 120, 143 e 243 da presente invenção foram testados contra toxina diftérica e são exclusivos contra toxina tetânica.

COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS E/OU IMUNOLÓGICAS [00149] Os anticorpos monoclonais da presente invenção podem ser incorporados em composições farmacêuticas/imunológicas adeguadas para administração a um sujeito.

[00150] Tipicamente, a composição farmacêutica/ imunológica da presente invenção compreende um anticorpo monoclonal ou porção de anticorpo monoclonal da presente invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[00151] Tal como agui utilizado, veículo farmaceuticamente aceitável inclui gualguer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes de

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67/82 retardamento da absorção e isotônicos, os quais sejam fisiologicamente compatíveis. Exemplos de veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não se limitando a, um ou mais de água, solução salina, solução salina tamponada com fosfato, dextrose, e semelhantes, bem como combinações dos mesmos. Em muitos casos, será preferível incluir aminoácidos ou outros sais.

[00152] Os veículos farmaceuticamente aceitáveis podem compreender ainda quantidades menores de substâncias auxiliares, tais como agentes umectantes ou emulsionantes, conservantes ou tampões, os quais aumentam a meia-vida ou a

eficácia do	anticorpo monoclonal	ou porção	de	anticorpo
monoclonal da	presente invenção.
[00153]	As composições imunolígicas	da	presente
invenção podem estar numa variedade	de formas.
[00154]	A forma preferida	depende	do	modo de

administração pretendido e da aplicação terapêutica. As composições preferenciais típicas estão sob a forma de soluções injetáveis ou para infusão, tais como composições semelhantes às utilizadas para a imunização passiva de humanos com outros anticorpos. O modo preferido de administração é a parentérica (por exemplo, intravenosa, subcutânea, intraperitoneal, intramuscular).

[00155] Em uma concretização preferida, o anticorpo

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68/82 monoclonal da presente invenção é administrado por infusão ou injeção intravenosa. Em uma outra concretização preferida, o anticorpo monoclonal da presente invenção é administrado por injeção intramuscular ou subcutânea.

[00156] As composições imunológicas devem ser tipicamente estéreis e estáveis sob as condições de fabricação e armazenamento.

[00157] As soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas incorporando o composto ativo (isto é, o anticorpo monoclonal ou parte de anticorpo monoclonal) na quantidade requerida em um solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, como requerido, seguido, por exemplo, de esterilização por filtração.

[00158] Geralmente, as dispersões são preparadas por incorporação do composto ativo em um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários de entre os enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferidos de preparação são secagem por vácuo e liofilização que produz um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado de uma sua solução previamente esterilizada por filtração.

[00159] A fluidez apropriada de uma solução pode ser

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69/82 mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersão e pela utilização de surfactantes. Os anticorpos monoclonais da presente invenção podem ser administrados por uma variedade de métodos conhecido no estado da técnica, embora para muitas aplicações terapêuticas, a via / modo de administração preferido seja a injeção ou infusão.

[00160] Tal como será apreciado por um técnico versado no assunto, a via e/ou modo de administração irão variar dependendo dos resultados desejados.

[00161] Em algumas concretizações, agentes terapêuticos adicionais, é um agente ou agentes para o tratamento de uma doença ou condição que envolva a toxina tetânica.

[00162] Tal como aqui utilizado, os termos tratar e tratamento referem-se a tratamento terapêutico, incluindo medidas profiláticas ou preventivas, em que o objetivo é prevenir ou retardar (diminuir) uma alteração fisiológica indesejável associada com uma doença ou distúrbio. Resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, mas não estão limitados a, alívio de sintomas, diminuição da extensão de uma doença ou desordem, estabilização de uma doença ou distúrbio (isto é, em que a

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70/82 doença ou distúrbio não piora), atraso ou abrandamento da progressão de uma doença ou distúrbio, melhoria ou paliação da doença ou desordem, e remissão (quer parcial ou total) da doença ou desordem, quer detectável ou indetectável.

[00163] O termo tratamento também pode significar prolongar a sobrevivência, em comparação com a sobrevivência esperada se não recebesse o tratamento.

Aqueles que necessitam de tratamento incluem aqueles já estão com a doença ou desordem bem como aqueles propensos a ter a doença ou desordem ou aqueles em que a doença ou desordem se pretende prevenir.

[00164] As composições farmacêuticas da presente invenção podem incluir uma quantidade terapeuticamente eficaz ou uma quantidade profilaticamente eficaz de um anticorpo monoclonal humano antitoxina tetânica da presente invenção.

[00165] Uma quantidade terapeuticamente eficaz se refere a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para alcançar o resultado terapêutico desejado.

[00166] Uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo monoclonal da presente invenção pode variar de acordo com fatores, tais como o estado da doença, idade, sexo, e peso do indivíduo, e a capacidade do anticorpo ou

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71/82 porção de anticorpo para induzir uma resposta desejada no indivíduo.

[00167] Uma quantidade terapeuticamente eficaz é também aquela em que quaisquer efeitos tóxicos ou prejudiciais do anticorpo ou porção de anticorpo, são compensados pelos efeitos terapeuticamente benéficos.

[00168] Uma quantidade profilaticamente eficaz refere-se a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para alcançar o resultado profilático desejado. Tipicamente, uma vez que uma dose profilática é utilizada em sujeitos antes ou numa fase precoce da doença, a quantidade profilaticamente eficaz será inferior à quantidade terapeuticamente eficaz.

[00169] Uma faixa não limitativa para uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente exemplificativa eficaz do anticorpo monoclonal da presente invenção é de 0,4 a 50 ng / ml. Portanto, no ensaio com camundongos suíços essa faixa se mostrou suficiente.

[00170] É para ser notado que os valores de dosagem podem variar com o tipo e gravidade da condição a ser aliviada. É para ser compreendido adicionalmente que para qualquer sujeito particular, os regimes de dosagem específicos devem ser ajustados ao longo do tempo de acordo com a necessidade individual e o julgamento profissional da

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72/82 pessoa que administra ou supervisiona a administração das composições, e que as faixas de dosagem aqui estabelecidas são apenas exemplificativas e não se destinam a limitar o escopo ou a prática da composição reivindicada.

UTILIZAÇÕES TERAPÊUTICAS DOS ANTICORPOS MONOCLONAIS DA PRESENTE INVENÇÃO [00171] Os anticorpos da presente invenção podem ser utilizados para tratar qualquer doença ou distúrbio mediado por, associado com, ou causado pela ação da toxina tetânica.

[00172] Por exemplo, os anticorpos monoclonais da presente invenção podem ser utilizados para tratar uma doença ou distúrbio que resulta em tétano.

[00173] Os anticorpos monoclonais da presente invenção podem ser utilizados para tratar uma doença ou desordem causada pelo tétano localizado, em que o início dos sintomas ocorre com mialgia por contrações involuntárias dos grupos musculares próximos ao ferimento, podendo ficar restrito a um determinado membro.

[00174] Os anticorpos monoclonais da presente invenção podem ser utilizados para tratar uma doença ou desordem causada pelo tétano cefálico, em que ocorre devido a ferimentos em couro cabeludo, face, cavidade oral e orelha, levando a paralisia facial ipsilateral à lesão,

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73/82 trismo, disfagia e comprometimento dos pares cranianos iii, iv, ix, x, xii.

[00175] Os anticorpos monoclonais da presente invenção podem ser utilizados para tratar uma doença ou desordem causada pelo tétano generalizado, em gue este é caracterizado pelo trismo, devido à contração dos masseteres e músculos da mimica facial, ocasionando o riso sardônico. Outros grupos musculares são acometidos, como os retos abdominais e a musculatura paravertebral, podendo ocasionar opistótono (característico das crianças). Com a evolução da doença, os demais músculos do organismo são acometidos progressivamente. As contraturas musculares vêm logo a seguir e, dependendo de sua intensidade e freguência, o tétano poderá ser com menor ou maior gravidade, piorando aos estímulos auditivos, visuais e táteis. Dependendo de sua intensidade, esses espasmos podem evoluir até para fraturas de vértebras ou parada respiratória. O paciente tetânico, a despeito de sua gravidade, permanece sempre lúcido. A febre, guando presente, indica mal prognóstico ou infecção secundária.

Entre as manifestações de hiperatividade simpática, temos:

taguicardia, hipertensão arterial lábil, sudorese profusa, vasoconstrição periférica, arritmias cardíacas e até hipotensão arterial.

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74/82 [00176] Os anticorpos monoclonais da presente invenção podem ser utilizados para tratar uma doença ou desordem causada pelo tétano neonatal, em que é causado pela aplicação de substâncias contaminadas na ferida ou corte do cordão umbilical. O período de incubação é de aproximadamente sete dias e tem como característica principal o opistótono. No início, a criança pode apresentar apenas dificuldade para se alimentar. Geralmente ocorre em filhos de mães não-vacinadas ou inadequadamente vacinadas no pré-natal.

[00177] Os anticorpos monoclonais da presente invenção podem ser utilizados na imunoterapia para acidentes susceptíveis à infecção pelo bacilo tetânico.

[00178] Os anticorpos monoclonais da presente invenção podem ser utilizados para o tratamento de pessoas com probabilidade de desenvolver tétano. Trata-se de produtos que podem ser obtidos de forma homogênea, com consistência de lotes e sem causar imunogenicidade.

[00179] Assim, a presente invenção inclui métodos para tratar uma doença ou distúrbio mediado por, associada com, ou causado pela ação da toxina tetânica. Os métodos compreendem a administração a um paciente em necessidade da mesma de uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente do anticorpo monoclonal tal como aqui

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75/82 divulgado .

[00180] A expressão anticorpo monoclonal tal como aqui divulgado pretende significar qualquer anticorpo monoclonal compreendendo qualquer uma das regiões VH e/ou regiões VL aqui definidos pelas suas sequências identificadoras (SEQ ID), bem como qualquer anticorpo monoclonal compreendendo uma variante de qualquer uma das regiões VH estabelecidas pelas sequências identificadoras (SEQ ID) e/ou uma variante de qualquer uma das regiões VL aqui estabelecida.

[00181] Assim, embora tenham sido mostradas apenas algumas concretizações da presente invenção, será entendido que várias omissões, substituições e alterações nos anticorpos monoclonais humanos antitetânicos para a infecção por c.tetani podem ser feitas por um técnico versado no assunto, sem se afastar do espirito e escopo da presente invenção.

[00182] Ao menos que definido de outra forma, todos os termos científicos e técnicos são entendidos por terem os mesmos significados comumente utilizados na técnica a que pertencem. Para o propósito da presente divulgação, os termos a seguir são definidos.

[00183] É expressamente previsto que todas as combinações dos elementos que desempenham a mesma função

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76/82 substancialmente da mesma forma para alcançar os mesmos resultados estão dentro do escopo da invenção.

Substituições de elementos de uma concretização descrita para outra são também totalmente pretendidos e contemplados.

[00184] Também é preciso entender que os desenhos não estão necessariamente em escala, mas que eles são apenas de natureza conceituai. A intenção é, portanto, ser limitada, tal como indicado pelo escopo das reivindicações anexas.

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717766, 2000.

[00214] Schiavo, G. et al. Tetanus toxin is a zinc protein and its inhibition of neurotransmitter release and protease activity depend on zinc. The EMBO Journal, v. 11,

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[00215] Smith, K. et al. Human monoclonal antibodies generated following vaccination with AVA provide neutralization by blocking furin cleavage but not by preventing oligomerization. Vaccine, v. 30, n. 28, p. 42764283, 2012.

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[00219] Volk, W. A. et al. Neutralization of

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[00221] Weckx, L. Y. et al. Effect of a single tetanus-diphtheria vaccine dose on the immunity of elderly people in São Paulo, Brazil. Brazilian Journal of Medicai and Biological Research, v. 39, p. 519523, 2006.

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Claims

REINVIDICAÇÕES

1. Anticorpo monoclonal humano antitoxina tetânica, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo é um anticorpo monoclonal compreendendo uma combinação da região variável de cadeia pesada (VH) e região variável de cadeia leve (VL) selecionado de entre as seguintes possibilidades:

(i) a (iii) :

(i) anticorpo monoclonal l-BUT-TT-120 compreendendo região variável de cadeia pesada VH compreende uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 4 e região variável de cadeia leve VL compreende uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2.

(ii) anticorpo monoclonal 2-BUT-TT-143 compreendendo região variável de cadeia pesada VH compreende uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NQ: 8 e região variável de cadeia leve VL compreende uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO: 6.

(iii) anticorpo monoclonal 3-BUT-TT-243 compreendendo região variável de cadeia pesada VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 12 e região variável de cadeia leve VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 10.
2. Conjugado caracterizado pelo fato de compreender uma combinação do anticorpo monoclonal l-BUT-TT-120,

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2/4 anticorpo monoclonal l-BUT-TT-143 e anticorpo monoclonal 1BUT-TT-243 conforme definido pela reivindicação 1 acoplado a uma toxina, um radioisótopo, um fármaco ou um agente citotóxico.
3. Composição imunológica caracterizada pelo fato de compreender uma combinação do anticorpo monoclonal 1-BUTTT-120, anticorpo monoclonal l-BUT-TT-143 e anticorpo monoclonal l-BUT-TT-243 conforme definido pela reivindicação 1 um veículo farmaceuticamente aceitável.
4. Composição imunológica caracterizada pelo fato de compreender um conjugado conforme definido pela reivindicação 2 o veículo farmaceuticamente aceitável.

4. Uso do anticorpo monoclonal conforme definido pela reivindicação 1 caracterizado pelo fato de que é para preparação de uma composição imunológica para tratar e/ou prevenir tétano.
5. Uso do anticorpo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo monoclonal é para o tratamento de pessoas com probabilidade de desenvolver tétano.
6. Uso do anticorpo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que é para imunoterapia da infecção acidental por tétano.
7. Uso do anticorpo, de acordo com a reivindicação 4,

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3/4 caracterizado pelo fato de que é para tratar o tétano neonatal em recém-nascidos acometidos pela infecção, veiculado pelo corte do cordão umbilical.
8. Uso do anticorpo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que é tratar o tétano localizado, tétano cefálico ou tétano generalizado.
9. Processo de produção de um anticorpo monoclonal caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas:

(a) coletar o sangue de doadores que tenham células B de memória circulantes contra um determinado antígeno e o antígeno purificado para a identificação dessas células por imunofenotipagem;

(b) separar os linfócitos B produtores de anticorpos antitetânicos de sangue de seres-humanos vacinados contra o tétano;

(c) amplificar as regiões variáveis dos anticorpos das células separadas por cell sorting;

(d) clonar as sequências em vetores de expressão de células de mamíferos;

(e) expressar os anticorpos recombinantes de forma transitória.
10. Processo de produção de um anticorpo monoclonal, de acordo coma reivindicação 9, caracterizado pelo fato de

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4/4 que na etapa (b) a separação específica de linfócitos B produtores de anticorpos tetânicos utiliza-se toxina tetânica conjugada, independentemente, com dois marcadores diferentes, biotina e Alexa Fluor® 647.
11. Processo de produção de um anticorpo monoclonal, de acordo coma reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que na etapa (b) é selecionado os linfócitos produtores de anticorpos relevantes contra epítopos da toxina.
12. Processo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo monoclonal é obtido a partir da informação de sequência gênica obtida a partir de linfócitos B do sangue periférico de pessoas imunizadas com o toxóide tetânico.
13. Processo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a informação genética é inserida em vetores usados para transfecção de células de mamíferos para gerar linhagens celulares produtoras dos anticorpos monoclonais antitetânicos.

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Identificação dos doadores e coleta do sangue r <

Separação single cefl de linfócitos B de memória ou plasmablastos ^L

Amplificação individual das cadeias variáveis dos anticorpos t '

Avaliação da capacidade neutralizante dos anticorpos .b