JP2627076B2 - 抗破傷風毒素ヒト型モノクローナル抗体、それを利用した破傷風毒素中和剤及びヒト型モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ - Google Patents
抗破傷風毒素ヒト型モノクローナル抗体、それを利用した破傷風毒素中和剤及びヒト型モノクローナル抗体産生ハイブリドーマInfo
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、破傷風菌の感染による破傷風の発症防止と
治療を行い得る抗破傷風毒素ヒト型モノクローナル抗
体、同抗体を利用した破傷風毒素中和剤及び同抗体を産
生するヒト型モノクローナル抗体産生ハイブリドーマに
関する。
治療を行い得る抗破傷風毒素ヒト型モノクローナル抗
体、同抗体を利用した破傷風毒素中和剤及び同抗体を産
生するヒト型モノクローナル抗体産生ハイブリドーマに
関する。
（従来の技術） 抗体を、予防、治療又は診断を目的としてヒトに投与
する場合、ヒト型モノクローナル抗体は、マウスモノク
ローナル抗体に比べ抗原性に関する問題が少ないと考え
られており臨床治療上利用範囲が非常に大きい。破傷風
についても、従来の馬抗血清又は供血に頼るヒト抗血清
に代わるものとして期待されている。
する場合、ヒト型モノクローナル抗体は、マウスモノク
ローナル抗体に比べ抗原性に関する問題が少ないと考え
られており臨床治療上利用範囲が非常に大きい。破傷風
についても、従来の馬抗血清又は供血に頼るヒト抗血清
に代わるものとして期待されている。
ところで、ヒト型モノクローナル抗体の作製は、マウ
スの場合と比べて、融合効率が悪い、抗体産生の安定生
が悪い、抗体を大量に得ることが困難である、免疫され
たリンパ球が自由に得られない、IgGタイプの抗体を得
ることが難しいなどの不利な点があった。これらを克服
するためにヒトの親細胞株の改良、（ヒト・マウス）ヘ
テロミエローマを親細胞として用いる方法〔プロシーデ
ィング オブ ナショナル アカデミー オブ サイエ
ンス（Proc.Nat.Acad.Sci.USA）80,7308,（1983）
等〕、又はマウスミエローマを親細胞として用いる方法
〔ジャーナル オブ クリニカル インベスティゲーシ
ョン（J.Clin.Invest.）70,1306,（1982）等〕などが考
えられている。その他にin vitroで抗原刺激することに
より特異抗体産生ハイブリドーマを効率よく得る方法
〔ヨーロピアン ジャーナル オブ イミュノロジー
（Eur.J.Immunol.14,23,（1984）等〕、又は向リンパ性
ウイルスであるエプスタイン・バーウイルス（EBV）で
抗体産生細胞を形質転換する方法〔サイエンス（Scienc
e）199,1439,（1978）等〕、更にはEBV形質転換細胞を
親細胞と融合する方法〔プロシーディング オブ ナシ
ョナル アカデミー オブ サイエンス（Proc.Nat.Aca
d.Sci.USA）79,6651,（1982）等〕などが試みられてい
る。
スの場合と比べて、融合効率が悪い、抗体産生の安定生
が悪い、抗体を大量に得ることが困難である、免疫され
たリンパ球が自由に得られない、IgGタイプの抗体を得
ることが難しいなどの不利な点があった。これらを克服
するためにヒトの親細胞株の改良、（ヒト・マウス）ヘ
テロミエローマを親細胞として用いる方法〔プロシーデ
ィング オブ ナショナル アカデミー オブ サイエ
ンス（Proc.Nat.Acad.Sci.USA）80,7308,（1983）
等〕、又はマウスミエローマを親細胞として用いる方法
〔ジャーナル オブ クリニカル インベスティゲーシ
ョン（J.Clin.Invest.）70,1306,（1982）等〕などが考
えられている。その他にin vitroで抗原刺激することに
より特異抗体産生ハイブリドーマを効率よく得る方法
〔ヨーロピアン ジャーナル オブ イミュノロジー
（Eur.J.Immunol.14,23,（1984）等〕、又は向リンパ性
ウイルスであるエプスタイン・バーウイルス（EBV）で
抗体産生細胞を形質転換する方法〔サイエンス（Scienc
e）199,1439,（1978）等〕、更にはEBV形質転換細胞を
親細胞と融合する方法〔プロシーディング オブ ナシ
ョナル アカデミー オブ サイエンス（Proc.Nat.Aca
d.Sci.USA）79,6651,（1982）等〕などが試みられてい
る。
（発明が解決しようとする課題） 従来の技術では、破傷風の予防、治療に有用な、高い
中和能を有するヒト型モノクローナル抗体、特にIgGタ
イプのヒト型モノクローナル抗体を安定にしかも大量に
提供することが困難であった。本発明はこのような問題
点を解決しようとして行ったものである。
中和能を有するヒト型モノクローナル抗体、特にIgGタ
イプのヒト型モノクローナル抗体を安定にしかも大量に
提供することが困難であった。本発明はこのような問題
点を解決しようとして行ったものである。
（課題を解決するための手段） 本発明者らは、IgGタイプの抗破傷風毒素ヒト型モノ
クローナル抗体を安定にしかも大量に産生する細胞株の
樹立を目的として検討した結果、抗破傷風毒素中和抗体
価が高く、かつIgGタイプの抗体を産生するヒト由来リ
ンパ球を選択し、EBVで形質転換する方法又はこのリン
パ球由来のハイブリドーマを作製する方法により、目的
に適合する抗破傷風毒素ヒト型モノクローナル抗体産生
細胞株が得られ、これに基づいて本発明を完成するに至
った。
クローナル抗体を安定にしかも大量に産生する細胞株の
樹立を目的として検討した結果、抗破傷風毒素中和抗体
価が高く、かつIgGタイプの抗体を産生するヒト由来リ
ンパ球を選択し、EBVで形質転換する方法又はこのリン
パ球由来のハイブリドーマを作製する方法により、目的
に適合する抗破傷風毒素ヒト型モノクローナル抗体産生
細胞株が得られ、これに基づいて本発明を完成するに至
った。
すなわち、本発明の第１は、ヒト由来抗体産生細胞と
（ヒト・マウス）ヘテロミエローマ細胞とを融合させて
得られたハイブリドーマが産生し、下記（ａ）、（ｂ）
及び（ｃ）の性質を有することを特徴とする抗破傷風毒
素ヒト型モノクローナル抗体である。
（ヒト・マウス）ヘテロミエローマ細胞とを融合させて
得られたハイブリドーマが産生し、下記（ａ）、（ｂ）
及び（ｃ）の性質を有することを特徴とする抗破傷風毒
素ヒト型モノクローナル抗体である。
（ａ）破傷風毒素に対して高い中和能を有する。
（ｂ）下記のヒト型モノクローナル抗体（イ）、（ロ）
及び（ハ）からなる群から選ばれた１種又は２種以上の
ヒト型モノクローナル抗体と混合することにより破傷風
毒素中和能が３倍以上に上昇する。
及び（ハ）からなる群から選ばれた１種又は２種以上の
ヒト型モノクローナル抗体と混合することにより破傷風
毒素中和能が３倍以上に上昇する。
（イ）ヒト由来抗体産生細胞と（ヒト・マウス）ヘテロ
ミエローマ細胞とを融合させて得られたハイブリドーマ
が産生し、以下の性質を有するヒト型モノクローナル抗
体。
ミエローマ細胞とを融合させて得られたハイブリドーマ
が産生し、以下の性質を有するヒト型モノクローナル抗
体。
Igクラス:IgG 反応性：破傷風毒素の［Ａ・Ｂ］フラグメントを認識す
る。
る。
（ロ）向リンパ球ウイルスによって形質転換されたヒト
由来抗体産生細胞が産生し、以下の性質を有するヒト型
モノクローナル抗体。
由来抗体産生細胞が産生し、以下の性質を有するヒト型
モノクローナル抗体。
Igクラス:IgG 反応性：破傷風毒素の［Ａ・Ｂ］フラグメントを認識す
る。
る。
（ハ）向リンパ球ウイルスによって形質転換されたヒト
由来抗体産生細胞と（ヒト・マウス）ヘテロミエローマ
細胞とを融合させて得られたハイブリドーマが産生し、
以下の性質を有するヒト型モノクローナル抗体。
由来抗体産生細胞と（ヒト・マウス）ヘテロミエローマ
細胞とを融合させて得られたハイブリドーマが産生し、
以下の性質を有するヒト型モノクローナル抗体。
Igクラス:IgG 反応性：破傷風毒素の［Ａ・Ｂ］フラグメントを認識す
る。
る。
（ｃ）Igクラス:IgG 反応性：破傷風毒素の［Ａ・Ｂ］及びＣフラグメントを
認識する。
認識する。
また、本発明の第２は、上記（ａ）、（ｂ）及び
（ｃ）に記載した性質を有する第１の発明のヒト型モノ
クローナル抗体と、上記（イ）、（ロ）及び（ハ）に記
載したヒト型モノクローナル抗体の１種又は２種以上と
を混合したことを特徴とする破傷風毒素中和剤である。
（ｃ）に記載した性質を有する第１の発明のヒト型モノ
クローナル抗体と、上記（イ）、（ロ）及び（ハ）に記
載したヒト型モノクローナル抗体の１種又は２種以上と
を混合したことを特徴とする破傷風毒素中和剤である。
更に、本発明の第３は、（ヒト・マウス）ヘテロミエ
ローマSHMD−33（ATCC CRL1668）とヒト由来抗体産生
細胞とのハイブリドーマで、上記（ａ）、（ｂ）及び
（Ｃ）に記載する性質を有する第１の発明のモノクロー
ナル抗体を産生することを特徴とする微工研菌寄第1021
3号のヒト型モノクローナル抗体産生ハイブリドーマTTG
2である。
ローマSHMD−33（ATCC CRL1668）とヒト由来抗体産生
細胞とのハイブリドーマで、上記（ａ）、（ｂ）及び
（Ｃ）に記載する性質を有する第１の発明のモノクロー
ナル抗体を産生することを特徴とする微工研菌寄第1021
3号のヒト型モノクローナル抗体産生ハイブリドーマTTG
2である。
以下に本発明について詳細に説明する。
本発明において用いられたリンパ球は、破傷風トキソ
イド（T.T.）によって免疫され、高い抗破傷風毒素中和
抗体を有しているヒトから採取されたものである。これ
をin vitroにおいて更にT.T.により抗原刺激した後に親
細胞との融合を行った。リンパ球は末梢血からフィコー
ルパック（ファルマシア社）を用いた比重遠心法により
分離した。EBVで形質転換を行う場合は、上記のリンパ
球から更に、羊赤血球を用いたロゼット法によりＢリン
パ球を分離し、これにB95−８細胞（マーモセット由
来）培養上清から得たEBVを感染させ、37℃、５％CO2下
で約２週間培養を行った。形質転換した細胞は、限界希
釈法によりクローニングを行うか、又は更に親細胞との
融合を行った。親細胞としては融合効率がよく、得られ
たハイブリドーマが比較的安定にIgGタイプの抗体を産
生し、しかもヌードマウスで腹水を容易に生産すること
のできるSHM Ｄ−33（ヒト・マウスヘテロミエロー
マ、ATCC CRL 1668）を用いた。親細胞との融合はポ
リエチレングリコールを用いた公知の方法で行い、特異
抗体を産生するハイブリドーマの判定は、T.T.をコート
したプレートを用いたEIA法（酵素免疫測定法）により
行った。クローニングは限界希釈法又は軟寒天法により
行った。抗体はヌードマウスの腹水、又は連続培養装置
を用いた培養上清中から硫安分画法及び／又はProtein
−Ａカラムを用いて容易に高純度品を大量に得ることが
可能である。
イド（T.T.）によって免疫され、高い抗破傷風毒素中和
抗体を有しているヒトから採取されたものである。これ
をin vitroにおいて更にT.T.により抗原刺激した後に親
細胞との融合を行った。リンパ球は末梢血からフィコー
ルパック（ファルマシア社）を用いた比重遠心法により
分離した。EBVで形質転換を行う場合は、上記のリンパ
球から更に、羊赤血球を用いたロゼット法によりＢリン
パ球を分離し、これにB95−８細胞（マーモセット由
来）培養上清から得たEBVを感染させ、37℃、５％CO2下
で約２週間培養を行った。形質転換した細胞は、限界希
釈法によりクローニングを行うか、又は更に親細胞との
融合を行った。親細胞としては融合効率がよく、得られ
たハイブリドーマが比較的安定にIgGタイプの抗体を産
生し、しかもヌードマウスで腹水を容易に生産すること
のできるSHM Ｄ−33（ヒト・マウスヘテロミエロー
マ、ATCC CRL 1668）を用いた。親細胞との融合はポ
リエチレングリコールを用いた公知の方法で行い、特異
抗体を産生するハイブリドーマの判定は、T.T.をコート
したプレートを用いたEIA法（酵素免疫測定法）により
行った。クローニングは限界希釈法又は軟寒天法により
行った。抗体はヌードマウスの腹水、又は連続培養装置
を用いた培養上清中から硫安分画法及び／又はProtein
−Ａカラムを用いて容易に高純度品を大量に得ることが
可能である。
以上のような手段を用いることにより、下記に示す５
種類の抗体産生細胞を得ることができた。
種類の抗体産生細胞を得ることができた。
TTG1…向リンパ球ウイルスによって形質転換されたヒト
由来抗体産生細胞であって、IgGタイプで、破傷風毒素
の［Ａ・Ｂ］フラグメントを認識するヒト型モノクロー
ナル抗体を産生する。
由来抗体産生細胞であって、IgGタイプで、破傷風毒素
の［Ａ・Ｂ］フラグメントを認識するヒト型モノクロー
ナル抗体を産生する。
TTG1H…上記TTG1と、（ヒト・マウス）ヘテロミエロー
マ細胞とを融合させて得られたハイブリドーマであっ
て、IgGタイプで、破傷風毒素の［Ａ・Ｂ］フラグメン
トを認識するヒト型モノクローナル抗体を産生する。
マ細胞とを融合させて得られたハイブリドーマであっ
て、IgGタイプで、破傷風毒素の［Ａ・Ｂ］フラグメン
トを認識するヒト型モノクローナル抗体を産生する。
TTG2…ヒト由来抗体産生細胞と（ヒト・マウス）ヘテロ
ミエローマ細胞とを融合させて得られたハイブリドーマ
であって、IgGタイプで、破傷風毒素の［Ａ・Ｂ］及び
Ｃフラグメントを認識するヒト型モノクローナル抗体
（第１の発明の抗体）を産生する。
ミエローマ細胞とを融合させて得られたハイブリドーマ
であって、IgGタイプで、破傷風毒素の［Ａ・Ｂ］及び
Ｃフラグメントを認識するヒト型モノクローナル抗体
（第１の発明の抗体）を産生する。
TTG3…ヒト由来抗体産生細胞と（ヒト・マウス）ヘテロ
ミエローマ細胞とを融合させて得られたハイブリドーマ
であって、IgGタイプで、破傷風毒素の［Ａ・Ｂ］フラ
グメントを認識するヒト型モノクローナル抗体を産生す
る。
ミエローマ細胞とを融合させて得られたハイブリドーマ
であって、IgGタイプで、破傷風毒素の［Ａ・Ｂ］フラ
グメントを認識するヒト型モノクローナル抗体を産生す
る。
TTG4…ヒト由来抗体産生細胞と（ヒト・マウス）ヘテロ
ミエローマ細胞とを融合させて得られたハイブリドーマ
であって、IgGタイプで、破傷風毒素の［Ａ・Ｂ］フラ
グメントを認識するヒト型モノクローナル抗体を産生す
る。なお本発明で得られたハイブリドーマTTG1H、TTG
2、TTG3、TTG4そして形質転換細胞TTG1は工業技術院微
生物工業技術研究所に寄託してある。寄託番号は、それ
ぞれ微工研菌寄第10216号、微工研菌寄第10213号、微工
研菌寄第10214号、微工研菌寄第10215号、微工研菌寄第
10212号である。なお上記のハイブリドーマ及び形質転
換細胞の名称は、それらが産生するモノクローナル抗体
の名称にも準用する。
ミエローマ細胞とを融合させて得られたハイブリドーマ
であって、IgGタイプで、破傷風毒素の［Ａ・Ｂ］フラ
グメントを認識するヒト型モノクローナル抗体を産生す
る。なお本発明で得られたハイブリドーマTTG1H、TTG
2、TTG3、TTG4そして形質転換細胞TTG1は工業技術院微
生物工業技術研究所に寄託してある。寄託番号は、それ
ぞれ微工研菌寄第10216号、微工研菌寄第10213号、微工
研菌寄第10214号、微工研菌寄第10215号、微工研菌寄第
10212号である。なお上記のハイブリドーマ及び形質転
換細胞の名称は、それらが産生するモノクローナル抗体
の名称にも準用する。
（発明の効果） 本発明により、IgGタイプの抗破傷風毒素ヒト型モノ
クローナル抗体が安定にしかも大量に得られるようにな
り、更にモノクローナル抗体を混合することにより実用
化が可能な、高い抗破傷風毒素中和能が得られたことか
ら、ヒトの破傷風の予防、治療への臨床応用が大いに期
待される。
クローナル抗体が安定にしかも大量に得られるようにな
り、更にモノクローナル抗体を混合することにより実用
化が可能な、高い抗破傷風毒素中和能が得られたことか
ら、ヒトの破傷風の予防、治療への臨床応用が大いに期
待される。
（実施例） （１）ヒトリンパ球の調製 抗破傷風毒素抗体産生ハイブリドーマを効率よく得る
ために、T.T.を追加免疫したボランティアの血清中の破
傷風毒素中和抗体価を調べた。約20国際単位/mlの中和
抗体価を示した２人のボランティアから各々20mlずつ採
血し、フィコールパックを用いた比重遠心法によりリン
パ球を分離した。EBVを感染させ形質転換細胞を得る場
合には、更に羊赤血球を用いたロゼット法によりＢリン
パ球を分離した。
ために、T.T.を追加免疫したボランティアの血清中の破
傷風毒素中和抗体価を調べた。約20国際単位/mlの中和
抗体価を示した２人のボランティアから各々20mlずつ採
血し、フィコールパックを用いた比重遠心法によりリン
パ球を分離した。EBVを感染させ形質転換細胞を得る場
合には、更に羊赤血球を用いたロゼット法によりＢリン
パ球を分離した。
（２）in vitro抗原刺激 特異抗体産生リンパ球の数を増加させるため、及び後
に行う融合効率を向上させる目的でin vitroで抗原刺激
を行った。培地はRPMI−1640、ダルベッコMEM（DME
M）、ハムF12を2:1:1の割合で混合したRDF培地85％と牛
胎児血清（FCS）15％とを混合した培地に芽球化因子（P
WM）を10000培希釈で添加し、更にT.T.を10ng/mlの濃度
になるように加えた。24ウェルマイクロプレートの各ウ
ェルに分注した5x105個のリンパ球を上記の培地で、37
℃、５％CO2の条件で５−６日間培養し、以後の融合に
用いた。
に行う融合効率を向上させる目的でin vitroで抗原刺激
を行った。培地はRPMI−1640、ダルベッコMEM（DME
M）、ハムF12を2:1:1の割合で混合したRDF培地85％と牛
胎児血清（FCS）15％とを混合した培地に芽球化因子（P
WM）を10000培希釈で添加し、更にT.T.を10ng/mlの濃度
になるように加えた。24ウェルマイクロプレートの各ウ
ェルに分注した5x105個のリンパ球を上記の培地で、37
℃、５％CO2の条件で５−６日間培養し、以後の融合に
用いた。
（３）EBV形質転換法 （１）で調製したＢリンパ球1x105個に対し、B95−８
細胞の７日目培養上清を0.45μｍメンブレンフィルター
で濾過した濾過液をEBVとして1ml加え、37℃、５％CO2
で３時間吸着させた。その後、15％FCSとT.T.10ng/mlを
加えたRDF培地に懸濁し、Ｕ底96ウェルマイクロプレー
トに１ウェル当り1x104個の感染細胞を分注した。10日
から２週間培養することにより細胞が増殖してくる。こ
れらの増殖したウェルから培養上清を採取し、EIA法に
より陽性ウェルを判定後、フィーダー細胞（マイトマイ
シンＣ処理したリンパ球）を用いたＵ底96ウェルマイク
ロプレートでクローニングを行うか、又はスケールアッ
プ後、親細胞と更に融合を行った。
細胞の７日目培養上清を0.45μｍメンブレンフィルター
で濾過した濾過液をEBVとして1ml加え、37℃、５％CO2
で３時間吸着させた。その後、15％FCSとT.T.10ng/mlを
加えたRDF培地に懸濁し、Ｕ底96ウェルマイクロプレー
トに１ウェル当り1x104個の感染細胞を分注した。10日
から２週間培養することにより細胞が増殖してくる。こ
れらの増殖したウェルから培養上清を採取し、EIA法に
より陽性ウェルを判定後、フィーダー細胞（マイトマイ
シンＣ処理したリンパ球）を用いたＵ底96ウェルマイク
ロプレートでクローニングを行うか、又はスケールアッ
プ後、親細胞と更に融合を行った。
第１表に示したように、形質転換細胞はすべてのウェ
ルに出現し、しかもその約70％が抗破傷風毒素IgG抗体
を産生していた。
ルに出現し、しかもその約70％が抗破傷風毒素IgG抗体
を産生していた。
（４）融合操作 親細胞として、（ヒト・マウス）のヘテロミエローマ
であるSHM Ｄ−33を用い、15％ FCSを含むRDF培地で
培養した。SHM Ｄ−33及び上記（２）又は（３）のヒ
トリンパ球をRDF培地で２回洗浄後、1:2の割合で混合す
る。再度遠心後、細胞ペレットをよく分散し、1mlの50
％ポリエチレングリコールを１分間にわたって滴下す
る。更に１分間37℃で反応後、５分間で10mlのRDF培地
を加える。遠心した後、15％FCS培地を含むRDF培地に懸
濁し96ウェルマイクロプレートに１ウェル当り2x104個
の親細胞が含まれるように分注する。翌日、HAT培地
（0.1mMヒポキサンチン、16μＭチミジン及び0.4μＭア
ミノプテリン添加15％FCS/RDF培地）に交換し37℃、５
％CO2の条件下で培養する。２−３日間隔でHAT培地を交
換する。約２週間後に、ハイブリドーマの増殖が見られ
たウェルの培養上清を採取し、特異抗体産生ウェルをEI
A法で判定する。抗破傷風毒素抗体を産生している細胞
は、限界希釈法又は軟寒天法によりクローニングを行っ
た。ハイブリドーマの抗体産生量は、ディッシュで培養
した場合、５日間の培養で約10−15μg/mlの抗体濃度が
得られ、現在まで６カ月以上にわたって安定に生産して
いる。
であるSHM Ｄ−33を用い、15％ FCSを含むRDF培地で
培養した。SHM Ｄ−33及び上記（２）又は（３）のヒ
トリンパ球をRDF培地で２回洗浄後、1:2の割合で混合す
る。再度遠心後、細胞ペレットをよく分散し、1mlの50
％ポリエチレングリコールを１分間にわたって滴下す
る。更に１分間37℃で反応後、５分間で10mlのRDF培地
を加える。遠心した後、15％FCS培地を含むRDF培地に懸
濁し96ウェルマイクロプレートに１ウェル当り2x104個
の親細胞が含まれるように分注する。翌日、HAT培地
（0.1mMヒポキサンチン、16μＭチミジン及び0.4μＭア
ミノプテリン添加15％FCS/RDF培地）に交換し37℃、５
％CO2の条件下で培養する。２−３日間隔でHAT培地を交
換する。約２週間後に、ハイブリドーマの増殖が見られ
たウェルの培養上清を採取し、特異抗体産生ウェルをEI
A法で判定する。抗破傷風毒素抗体を産生している細胞
は、限界希釈法又は軟寒天法によりクローニングを行っ
た。ハイブリドーマの抗体産生量は、ディッシュで培養
した場合、５日間の培養で約10−15μg/mlの抗体濃度が
得られ、現在まで６カ月以上にわたって安定に生産して
いる。
第２表は、細胞融合法によるハイブリドーマの出現率
と抗破傷風毒素IgG抗体産生ハイブリドーマの出現率を
示している。
と抗破傷風毒素IgG抗体産生ハイブリドーマの出現率を
示している。
（５）抗体が認識する抗原部位（Ａ・Ｂ・Ｃフラグトメ
ント）の決定 抗体が認識する抗原部位の決定は、破傷風毒素をパパ
イン処理をして得られる〔Ａ・Ｂ〕フラグメント（Ａフ
ラグメントとＢフラグメントの複合物）又はＣフラグメ
ントをそれぞれコートしたプレートを用いたEIA法によ
り行った。〔Ａ・Ｂ〕及びＣフラグメントの精製法は、
まず精製破傷風毒素を25℃で16時間パパイン処理を行っ
た。次いでG3000SWカラム（東ソー社製）を用いた高速
液体クロマトグラフィーによるゲル濾過を行い、〔Ａ・
Ｂ〕フラグメントとＣフラグメントに分離精製した。更
に、〔Ａ・Ｂ〕フラグメント画分は、ハイドロキシアパ
タイトによる吸着クロマトグラフィーを行い、その後、
抗Ｃフラグメント抗体をリガンドとしたカラムを通過さ
せて混在する微量の毒素を除き〔Ａ・Ｂ〕フラグメント
を高度に精製した。これらの精製フラグメントを、コー
ティング緩衝液で10μg/mlに希釈してプレートにコート
した。以後のEIA実験は常法にしたがった。
ント）の決定 抗体が認識する抗原部位の決定は、破傷風毒素をパパ
イン処理をして得られる〔Ａ・Ｂ〕フラグメント（Ａフ
ラグメントとＢフラグメントの複合物）又はＣフラグメ
ントをそれぞれコートしたプレートを用いたEIA法によ
り行った。〔Ａ・Ｂ〕及びＣフラグメントの精製法は、
まず精製破傷風毒素を25℃で16時間パパイン処理を行っ
た。次いでG3000SWカラム（東ソー社製）を用いた高速
液体クロマトグラフィーによるゲル濾過を行い、〔Ａ・
Ｂ〕フラグメントとＣフラグメントに分離精製した。更
に、〔Ａ・Ｂ〕フラグメント画分は、ハイドロキシアパ
タイトによる吸着クロマトグラフィーを行い、その後、
抗Ｃフラグメント抗体をリガンドとしたカラムを通過さ
せて混在する微量の毒素を除き〔Ａ・Ｂ〕フラグメント
を高度に精製した。これらの精製フラグメントを、コー
ティング緩衝液で10μg/mlに希釈してプレートにコート
した。以後のEIA実験は常法にしたがった。
（６）マウスを用いた破傷風毒素中和実験 マウスを用いた破傷風毒素中和実験に使用する抗体は
以下のようにして調製した。（４）の操作で得られたハ
イブリドーマの培養をスケールアップし、その培養上清
を40％飽和硫酸アンモニウムで塩析、遠心後、そのペレ
ットをリン酸緩衝化生理食塩水〔PBS（−）〕で溶解し
た後PBS（−）で透析した。遠心後、上清を中和実験に
用いた。抗体濃度は、濃度の既知の標準ヒトIgGを用い
たEIA法により決定した。
以下のようにして調製した。（４）の操作で得られたハ
イブリドーマの培養をスケールアップし、その培養上清
を40％飽和硫酸アンモニウムで塩析、遠心後、そのペレ
ットをリン酸緩衝化生理食塩水〔PBS（−）〕で溶解し
た後PBS（−）で透析した。遠心後、上清を中和実験に
用いた。抗体濃度は、濃度の既知の標準ヒトIgGを用い
たEIA法により決定した。
中和実験は以下のようにして行った。試験毒素とモノ
クローナル抗体を混合し、37℃で１時間反応させその0.
5mlをマウス（OF−１株）の後肢に筋肉内注射を行っ
た。対照として抗破傷風ヒト免疫グロブリン、テタノブ
リン（ミドリ十字社製）、を用い同様の実験を行った。
中和抗体価は96時間、１週間、２週間マウスを観察し、
症状の変化及び致死で判定した。
クローナル抗体を混合し、37℃で１時間反応させその0.
5mlをマウス（OF−１株）の後肢に筋肉内注射を行っ
た。対照として抗破傷風ヒト免疫グロブリン、テタノブ
リン（ミドリ十字社製）、を用い同様の実験を行った。
中和抗体価は96時間、１週間、２週間マウスを観察し、
症状の変化及び致死で判定した。
第３表に結果を示したように、モノクローナル抗体TT
G2は〔Ａ・Ｂ〕及びＣフラグメントの両方を認識し、高
い抗破傷風毒素中和抗体価を有している。しかも第４表
に示したように、モノクローナル抗体TTG2と本発明のそ
の他のモノクローナル抗体１種又は２種以上とを混合す
ることにより抗破傷風毒素中和抗体価が３倍以上上昇し
た。
G2は〔Ａ・Ｂ〕及びＣフラグメントの両方を認識し、高
い抗破傷風毒素中和抗体価を有している。しかも第４表
に示したように、モノクローナル抗体TTG2と本発明のそ
の他のモノクローナル抗体１種又は２種以上とを混合す
ることにより抗破傷風毒素中和抗体価が３倍以上上昇し
た。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (3)
- 【請求項１】ヒト由来抗体産生細胞と（ヒト・マウス）
ヘテロミエローマ細胞とを融合させて得られたハイブリ
ドーマが産生し、下記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の性質
を有することを特徴とする抗破傷風毒素ヒト型モノクロ
ーナル抗体。 （ａ）破傷風毒素に対して高い中和能を有する。 （ｂ）下記のヒト型モノクローナル抗体（イ）、（ロ）
及び（ハ）からなる群から選ばれた１種又は２種以上の
ヒト型モノクローナル抗体と混合することにより破傷風
毒素中和能が３倍以上に上昇する。 （イ）ヒト由来抗体産生細胞と（ヒト・マウス）ヘテロ
ミエローマ細胞とを融合させて得られたハイブリドーマ
が産生し、以下の性質を有するヒト型モノクローナル抗
体。 Igクラス:IgG 反応性：破傷風毒素の［Ａ・Ｂ］フラグメントを認識す
る。 （ロ）向リンパ球ウイルスによって形質転換されたヒト
由来抗体産生細胞が産生し、以下の性質を有するヒト型
モノクローナル抗体。 Igクラス:IgG 反応性：破傷風毒素の［Ａ・Ｂ］フラグメントを認識す
る。 （ハ）向リンパ球ウイルスによって形質転換されたヒト
由来抗体産生細胞と（ヒト・マウス）ヘテロミエローマ
細胞とを融合させて得られたハイブリドーマが産生し、
以下の性質を有するヒト型モノクローナル抗体。 Igクラス:IgG 反応性：破傷風毒素の［Ａ・Ｂ］フラグメントを認識す
る。 （ｃ）Igクラス:IgG 反応性：破傷風毒素の［Ａ・Ｂ］及びＣフラグメントを
認識する。 - 【請求項２】請求項１の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）に記
載する性質を有する請求項１記載のヒト型モノクローナ
ル抗体と、請求項１の（イ）、（ロ）及び（ハ）に記載
されたヒト型モノクローナル抗体の１種又は２種以上と
を混合したことを特徴とする破傷風毒素中和剤。 - 【請求項３】（ヒト・マウス）ヘテロミエローマSHMD−
33（ATCC CRL1668）とヒト由来抗体産生細胞とのハイ
ブリドーマで、請求項１の（ａ）、（ｂ）及び（Ｃ）に
記載する性質を有する請求項１記載のモノクローナル抗
体を産生することを特徴とする微工研菌寄第10213号の
ヒト型モノクローナル抗体産生ハイブリドーマTTG2。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63206182A JP2627076B2 (ja) | 1988-08-19 | 1988-08-19 | 抗破傷風毒素ヒト型モノクローナル抗体、それを利用した破傷風毒素中和剤及びヒト型モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63206182A JP2627076B2 (ja) | 1988-08-19 | 1988-08-19 | 抗破傷風毒素ヒト型モノクローナル抗体、それを利用した破傷風毒素中和剤及びヒト型モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0257195A JPH0257195A (ja) | 1990-02-26 |
| JP2627076B2 true JP2627076B2 (ja) | 1997-07-02 |
Family
ID=16519174
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63206182A Expired - Fee Related JP2627076B2 (ja) | 1988-08-19 | 1988-08-19 | 抗破傷風毒素ヒト型モノクローナル抗体、それを利用した破傷風毒素中和剤及びヒト型モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2627076B2 (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| BR102016017782A2 (pt) | 2016-07-29 | 2018-02-14 | Fundação Butantan | Anticorpos monoclonais humanos antitetânicos neutralizantes para a infecção por c.tetani, método de obtenção dos ditos anticorpos monoclonais e seu uso na imunoterapia para acidentes susceptíveis à infecção pelo bacilo tetânico |
| CN108314730B (zh) * | 2017-12-29 | 2019-01-08 | 珠海泰诺麦博生物技术有限公司 | 抗破伤风毒素中和抗体及其制备与应用 |
| CN108314731B (zh) * | 2017-12-29 | 2019-02-12 | 珠海泰诺麦博生物技术有限公司 | 一种针对破伤风毒素的全人源单克隆中和抗体及其应用 |
| BR112020013094A2 (pt) * | 2017-12-29 | 2021-03-30 | Zhuhai Trinomab Biotechnology Co., Ltd. | Anticorpo monoclonal neutralizante totalmente humano nativo contra toxina tetânica e suas aplicações |
| CN108218984B (zh) * | 2017-12-29 | 2018-10-26 | 珠海泰诺麦博生物技术有限公司 | 一种抗破伤风毒素的全人源中和抗体 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4624921A (en) * | 1984-04-26 | 1986-11-25 | Cetus Corporation | Human lymphoblastold cell line and hybridomas derived therefrom |
| EP0183876A1 (en) * | 1984-11-27 | 1986-06-11 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Monoclonal antibodies for endotoxin core and their use |
| JPS6263525A (ja) * | 1985-09-13 | 1987-03-20 | Green Cross Corp:The | モノクロ−ナル抗体 |
-
1988
- 1988-08-19 JP JP63206182A patent/JP2627076B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0257195A (ja) | 1990-02-26 |
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