JP2550043B2 - 抗タウマチンモノクローナル抗体およびそのモノクローナル抗体を用いたタウマチンの単離方法 - Google Patents

抗タウマチンモノクローナル抗体およびそのモノクローナル抗体を用いたタウマチンの単離方法

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Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、タウマチンとして知られる、甘味を呈する
ポリペプチドの生体液からの単離と定量のための免疫処
理のために用いる物質と方法に関する。特に、本発明
は、新規なハイブリドーマ細胞系（A.T.C.C.No.HB−892
1およびHB−8922）が産生する抗タウマチンモノクロー
ナル抗体に関する。また、アフィニティー精製法による
タウマチンの単離、タウマチンを検出するための分析
法、また、甘味を呈するタウマチン様ポリペプチドの研
究のための免疫学的手法へのこれら抗体の応用に関す
る。
〔従来の技術および発明が解決しようとする問題点〕
タウマチンは、タウマトコッカス ダニエリ ベント
（Thaumatococcus daniellii Benth）の学名を付与され
た、アフリカの低木の果実の仮種皮から得られる非常に
強い甘味を呈するタンパク質である。この果実は、西ア
フリカではココナツワイン、トウモロコシパン、および
酸味の強い果実の甘味増強剤として用いられている。重
量ベースで蔗糖の約5000倍もの甘味を呈するタウマチン
は、少なくとも、５種の形態、すなわち、タウマチン
Ｉ、II、ａ、ｂ、ｃの５種が認められている。イオン交
換カラムからの溶離の順番で名付けられたこのタンパク
質は、約22キロダルトンの分子量を持っている。〔文献
Higgenbotham等、食物の感覚的特性（Sensory Properti
es of Foods）（Birch等，編）London;Applied Science
s,pp.129〜149（1977）〕 無毒生タンパク質であるタウマチンＩおよびIIは、低
カロリーで、虫歯を起こさず、これらタンパク質と人間
の味蕾との間で安定な相互作用を示唆する、潜在的な味
覚反応を誘発する。従って、タウマチンは、砂糖代用品
としての食品添加物、甘味受容体の探査、あるいは味覚
反応をさらに解明する手段としての利用可能性を備えて
いる。
タウマチンを、許容できる食品添加物あるいは研究手
段として利用するには、高純度のタンパク質として大量
に供給しなければならない。タウマトコッカス ダニエ
リの果実を首尾よく増殖するには、熱帯気候と昆虫によ
る授粉が必要であり、その果実のハウス栽培には相当の
困難が伴う。これらの理由から、遺伝子を組換え微生物
に導入し、それらにタウマチンを合成させることに多大
な努力が払われてきた。
ある研究グループは，タウマチンＩのアミノ酸配列順
序を報告している。〔文献Iyengar等、Eur.J.Biochem.,
96,193−204（1979）〕 その研究グループは、また、メッセッンジャーRNA由
来の相補的DNA（cDNA）から、タウマチンII遺伝子のク
ローニングに成功したことを報告している。〔文献Eden
s等、Gene、18,1−12（1982）〕。先に引用した文献に
おいて,Edens等は、プレプロタウマチンIIの自然の配列
順序を有したポリペプチドが、微生物学的に産生された
ことを記している。
さらに、その文献と、欧州特許出願第54,330号及び第
54,331号は、天然の成熟タウマチンIIとプレプロタウマ
チンIIを作るためのcDNAのコード配列を開示し、また、
微生物における組換えに用いるためのDNA配列からなる
クローニングベクターも開示している。
1983年10月11日に出願された、共有に係る係属中の米
国特許出願第540,634号では、Iyengar等によって開示さ
れた配列を複製する一次構造のタウマチンＩのためのコ
ードを有する「製造された」遺伝子の合成に成功した
が、彼らは細菌や酵母を宿主として用いている。
発明の背景として、選択された抗原物質に対して高度
に特異的なモノクローナル抗体を生成する腫瘍細胞系を
産生するためのハイブリドーマ技術に関する最近の研究
が興味深い。モノクローナル抗体の産生に関する技術
は、技術的には一般によく知られている。これらの処理
の典型的な記述は、Wands,J.R.,＆ Zurawski,V.R.,Gast
roenterology 80:225（1981）;Marshak−Rothstein等,
J.Immunol.122:2491（1979）；および、Oi,V.T.＆ L.A.
Herzenberg,「免疫グロブリンを産生するハイブリッド
（Immunoglobulin Producing Hybrid）”」Mishell,B.
B.＆ S.M.Shiigi（編），細胞免疫学における方法（Sel
ected Methods in Cellular Immunology）,San Francis
co:W.H.Freeman Publishing,1979等がある。これらは要
約すると、関係する抗原を、予め注射した動物の脾臓か
ら取出したリンパ球をポリエチレングリコールの存在下
で骨髄腫細胞内に誘導し、その細胞と融合させる。何千
もの「ハイブリッド」骨髄腫細胞が融合によって産生さ
れる。それぞれの「ハイブリドーマ」細胞の増殖のため
の培養にて得られた上清は、目的の抗体活性の有無に関
して試験される。かような抗体活性が、一つの細胞培養
の上清中で見つかれば、限界希釈によりクローン化さ
れ、そのクローン化したものは、上清の活性について個
々に分析される。
それらクローン化したものの免疫性の高度な特異性の
ため、ハイブリドーマ技術に従って開発したモノクロー
ナル抗体については、診断薬、治療薬、あるいは特異的
な交差反応性のある天然資源に由来する抗原タンパク質
のアフィニティー精製薬としての利用が提案されてき
た。例えば、Trends in Biotechnology,Vol.3,No.7（19
85年７月）、米国特許第4,465,624号、第4,514,505号あ
るいは第4,514,507号を参照されたい。
さらに、タウマチンやタウマチン様のポリペプチド分
子の検出、単離、精製、研究への利用のために、特異的
なモノクローナル抗体に対する需要が実質的にあるにも
かかわらず、タウマチンに対するモノクローナル抗体を
得るためのハイブリドーマ技術利用に成功したという報
告は、未だにされていない。
〔問題点を解決するための手段〕
本発明はまず、タウマチンに特異的な免疫反応性のあ
るモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系
を提供する。本発明は、実施例として新規のマウス−マ
ウスハイブリドーマ細胞系であるA.T.C.C.HB−8922を提
供する。そしてこの細胞は、タウマチン及びタウマチン
様のポリペプチドの三次元の球状構造に特異的な反応性
をモノクロナール抗体を、そのハイブリドーマ細胞系の
増殖のための培養での上清の成分として産生する。本発
明は、また、新規のマウス−マウスハイブリドーマ細胞
系であるA.T.C.C.HB−8921を提供する。そしてこの細胞
は、タウマチンおよび特定のタウマチン様のポリペプチ
ドの一次元のポリペプチド構造を組み立てている一つ以
上の特定のアミノ酸配列に特異的な免疫反応性を有する
モノクロナール抗体を、そのハイブリドーマ細胞系の増
殖のための培養での上清成分として産生する。
腫瘍細胞系のA.T.C.C.HB−8922およびA.T.C.C.HB−89
21は、12301パークローン ドライヴ、ロックヴィル、
メリーランド州、20852に所在のAmerican Type Culture
Collectionに寄託している。同所は、細胞培養や微生
物の公認の寄託機関である。
本発明は、また、タウマチンあるいは同様なタンパク
質であるモネリンのようなタウマチンに類似するポリペ
プチドの三次元の球状構造と特異的な免疫反応性を有す
るモノクローナル抗体を提供する。さらに、タウマチン
およびタウマチン様のポリペプチドの一次構造を組立て
ている一つ以上の特定のアミノ酸配列に特異的な免疫反
応性を有するモノクローナル抗体を提供する。
本発明の実施例では、腫瘍細胞系は、Herzenbergおよ
びOiが前掲した「免疫グロブリンを産生するハイブリッ
ド」に記述した標準的な免疫学的方法によって産生され
る。すなわち、マウスからの脾臓細胞を、植物から単離
したタウマチンで高度に免疫化し、ポリエチレングリコ
ールの存在下でマウスの骨髄腫細胞系と融合させる。各
「ハイブリードーマ」細胞の増殖のための培養で得られ
た上清は、所望の抗体活性の有無に関して試験される。
細胞系を増殖するようクローン化され、選択されたバイ
ブリードーマ細胞系は、高度に特異的な抗タウマチン活
性を有する抗体を、その増殖培養での上清中に産生でき
る。
本発明のモノクローナル抗体、特に、ハイブリドーマ
A.T.C.C.HB−8921とA.T.C.C.HB−892が産生する新規の
二つのモノクローナル抗体の各々は、醗酵または他の培
地からのタウマチンあるいはタウマチン様ポリペプチド
の親和性による精製や分離のための免疫学的手法に使わ
れると考えられる。このような処理では、選択された抗
体は、（例えば、カラムで）固体化され、醗酵培地は固
定化された抗体と接触することになる。
タウマチンを抗体に結合した後、高純度の形で、固定
された抗体から溶離する。本発明の抗体はまた、醗酵、
その他の培地におけるタウマチン、あるいはモネリンの
ようなタウマチンに類似するポリペプチドの定量のため
の免疫学的処理において応用されるものと考えられる。
異種のモノクローナル抗体を組み合わせて用いる処理
は、タウマチンおよびタウマチン様の分子が、醗酵その
他の培地から単離された時、それらの自然コンフォメー
ションおよび変性状態のいずれにも存在するものも検出
・定量するために用いることができる。本発明は、さら
に酵素結合免疫吸収定量法（ELISA）を用いた、タウマ
チンおよびタウマチン様のポリペプチドの定量のための
免疫定量法を提供する。本発明の他の事項は、以下の説
明で明らかになるであろう。
〔実施例〕
以下の実施例は、本発明によるA.T.C.C.HB−8921およ
びA.T.C.C.HB−8922を含む多くのハイブリドーマ細胞系
の産生、タウマチンおよびタウマチン様のポリペプチド
に対する抗体の単離、ならびにタウマチンの抗原決定基
に対して各々免疫的な誘引力を有するモノクローナル抗
体の特性分析ならびに収量増加に関する。
すなわち、実施例１〜３は、マウス細胞に対する抗タ
ウマチンポリクローナルマウス血清抗体を産生させるた
めの刺激、マウス脾細胞とマウス骨髄腫細胞の融合、そ
してハイブリッド細胞のスクリーニング、クローニン
グ、増殖ならびにモノクローナル抗体の単離に関する。
実施例４〜46までは、かようにして産生したモノクロー
ナル抗体の特性分析であって、BLISA定量法および拮抗
的阻害定量法による特性分析に関する。実施例47は、腹
水症法によるモノクローナル抗体の収量の増加に関す
る。実施例48は、本発明のモノクローナル抗体を用いた
タウマチンとタウマチン様のポリペプチドの単離および
精製に関する。実施例49は、二つ以上の抗体を活用した
定量技術によるタウマチンおよびタウマチン様のポリペ
プチドの定量に関する。
実施例1:ポリクローナル血清の調製 A.T.C.C.HB−8921およびA.T.C.C.HB−8922を含むハイ
ブリッド細胞系の産生のための処理において、BALB/Cマ
ウスに２ヶ月以上の期間にわたって、完全フロイントア
ジュバント（細胞性免疫を増強する補助薬）と25μｇの
植物タウマチンＩ（Sigma Chemical社、セントルイス、
ミズーリー州）を二度にわたって筋肉内に注射した。そ
して、van der Wel and Loeb,European J.Biochem.31,2
21〜225（1972）の記載に従って、イオン交換カラムで
精製した。最初の注射から３ヶ月で、そのマウス20μｇ
のタウマチンＩを再注射した。そのマウスについては、
免疫状態になる前に血清を集めるため、タウマチンの３
回目の注射前と注射後、および４日目に、その尾から採
血した。
２回の血清試料を、抗タウマチン抗体に関して、酵素
結合免疫吸収定量（ELISA）の技術で測定した。この技
術では、天然植物タウマチンをELISAプレートに塗り固
めた。これにより、抗タウマチン抗体だけが、タウマチ
ンの最初の注射に先立って、マウスから得られた対照血
清よりも、それらと結合するようになる。両方の血清試
料は、抗タウマチン抗体に関しては陽性を示すが、前者
から得た血清の２倍以上の抗体力価が、後者の採血から
得た血清から得られた。
実施例2:細胞融合 ハイブリドーマ法では、脾細胞と骨髄腫細胞の細胞膜
が溶けて、当初は二つ以上の核と共に通常の細胞質を取
り囲む。細胞膜を融合した後、数日で核が溶け、同調的
有糸分裂が可能になる。これらの融合した細胞が分裂す
ると、両方の融合したパートナーの多くの種類の染色体
は、ハイブリッド細胞系が安定するまでに消失する。ヒ
ポキサンティンアミノプテリンチミジン（HAT）培地
は、SP2−0:SP2−０ハイブリッドの増殖を防止する。脾
臓：脾細胞ハイブリッドは、培養して通常２週間後に死
滅する。このように、SP2−0:脾臓ハイブリッド細胞だ
けが培養中で増殖する。
次に、接種されたマウスで、血清中でのタウマチンに
対するポリクローナル抗体の産生が確かめられた後、採
血し、心臓に孔が開いて死亡し、その脾臓を摘出した。
骨髄腫細胞〔（SP2−0/Ag 14）（Schulman等、Nature、
276、269（1978）〕を、50μg/mlのゲンタマイシン、2m
Mのグルタミン、25mMのHepesと10-5Mβ−メルカプトエ
タノールと10％のウマ血清を含むRPMI 1640（Irvine Sc
ientific社、GIBCO）中で増殖した。脾臓を、50μg/ml
のゲンタマイシン、2mMのグルタミンと25mMのHepesを含
むRPMI培地で２度洗浄し、25ゲージ針で潅流した。遠心
分離で細胞を潅流培地から分ける。脾細胞（６×10-6）
は、次に、2.4×106の骨髄腫細胞と共に50mlの円錐チュ
ーブに入れ、10分間、1000 rpmの回転速度で遠心分離す
る。上清を吸引し、その細胞に、５分間、37℃の湯浴を
施した。そして、脾細胞に、34％のポリエチレングリコ
ール1mlを、１分間以上かけて滴下し、骨髄種細胞と融
合した。次の３分間にわたって3mlの無血清RPMIを添加
した。そして、無血清RPMIを2ml/分の割合で５分間添加
した。さらに、無血清RPMIを、総量が40mlになるまで添
加した。そして、混合物をIEC−Centra−７の遠心分離
機により、1500 rpmの回転速度で７分間回転させた。そ
の遠心分離チューブを吸引し、細胞をHAT培地に再懸濁
させた。融合した後、細胞を0.088mg/mlのアミノプテリ
ン、1.94mg/mlのチミジンと、6.8mg/mlのヒポキサンチ
ンを含むRPMI培地に移し、６個の96ウェルの培養プレー
トの各々のウェルに２滴づつ入れた。
４日後に、各ウェルに、RPMIとHAT培地の各２滴を添
加し、さらに４日後、もう２滴のHAT培地を各ウェルに
添加した。クローンは、10〜30日後に現れ始める。ELIS
A測定によって、タウマチン陽性であるクローンは、続
いて24ウェルプレートのβ−メルカプトメタノール、グ
ルタミン、ウマ血清とゲンタマイシンを含むRPMI培地に
移した。
クローンが塊りになるほど増えると、ELISA法によっ
て試験し、タウマチン陽性クローンは、続いて48ウェ
ル、24ウェル、および６ウェルプレートに順次移した。
処理の進行に伴っても生存しているこれらタウマチン陽
性クローンを再びクローン化し、３ウェルに１つの細胞
の割合になるように希釈して96ウェルプレートに入れ
た。
再クローン化した細胞の培養を、より大きいウェルで
増殖するよう工程を踏んだが、それぞれ、後の工程にな
るごとにクローンの40〜50％が消失した。クローンを、
24ウェルプレート、それから、６ウェルプレート、そし
て最後にフラスコ中で増殖した。24ウェルプレートの段
階で、60ケの陽性クローンが生き残ったが、培養がフラ
スコに移される時までに、わずかに11個のタウマチン陽
性のクローンが、スケールアップしても生存していた。
これらのクローン番号は、３、10、24、27、29、30、3
6、37、371、38と41であった。結局、抗タウマチンモノ
クローナル抗体の典型的な二つのタイプとして、クロー
ンNo.3の試料がA.T.C.C.HB−8922として、また、クロー
ンNo.29の試料がA.T.C.C.HB−8921として寄託した。
フラスコ培養にまで至った時、その培地を遠心分離に
よって細胞から分離し、硫酸アンモンによりタンパク質
を沈澱した。沈澱は、1mMのPMSF（フエニルメチルスル
フォニルフルオライド）を含むリン酸緩衝塩に溶解し、
分取して、同じ緩衝液に対して透析した後、−80℃で凍
結させた。そして、その細胞を液体窒素で凍結させた。
実施例3:モノクローナル抗体のスクリーニング、クロー
ニング、および特性分析 以下の処理手順を、タウマチンに対する酵素結合免疫
吸収定量法（ELISA）を適用するために利用した。すべ
ての反応は、室温で実施され、ELISAプレートは全段階
にわたって、プラスチックラップ（商品名：「サラン」
で覆われ、湿潤室の中で培養する。ELISAプレートを、
実施例１の処理に従って、25mMのNaHCO3（pH 9.2）を含
む50μｌ溶液中で精製した10ngのタウマチンＩで薄く覆
う。
これを、室温で、２時間インキュベート。そのプレー
トは、400μｌのPBS〔50mMのリン酸カリウム、150 mMの
塩化ナトリウム（pH 7.4）とトゥウィーン20（界面活性
剤の種類）（0.05％）〕（sigma Chemical社により製造
された洗浄剤）で２度洗浄し、それから、400μｌの水
で２度洗浄する。
そして、そのプレートを、室温で、２時間、１％のウ
シ血清アルブミン（BSA）の〔PBS−トゥウィーン20（0.
025％溶液）〕溶液200μｌで薄く覆う。そのプレート
を、再び、400μｌのPBS−トゥウィーン溶液で２度洗浄
し、また、水で２度洗浄する。
そこで、試験される培養物から50μｌの培地を添加す
る。正常の融合していない骨髄腫細胞（SP2−0/Ag−1
4）培地を、陰性対照として用いる。1:500あるいは、そ
れ以上に希釈したマウス血清を、陽性対照として用い
る。培地は、室温で少なくとも４時間インキュベートさ
れる。そこで、再びプレートを、400μｌのトゥウィー
ン20溶液で２度、また水で２度洗浄する。
ウサギの抗マウスＫ型、およびλ型のＬ鎖を有する免
疫グロブリンを1:100に希釈したもの50μｌを添加す
る。そして、これを室温で２時間インキュベートする。
このプレートを再び、400μｌの0.5％のPBS−トゥウィ
ーン20溶液で２度、さらに水で２度洗浄する。そこで、
ヤギ抗ウサギ複合IgG/パーオキシダーゼの1:1000に希釈
したもの50μｌを添加し、室温で１時間インキュベート
する。このプレートは、もう一度、400μｌのPBS−トゥ
ウィーン20溶液で２度、さらに水で２度洗浄する。
0.01％の過酸化水素を含むｏ−フェニレンジアミンジ
ヒドロクロライド（OPD）溶液を、各ウェルに添加する
（OPD溶液は、18mgのOPDを、10.28mlの0.5Mのクエン酸
4.86ml＋0.5MのNa2HPO4を水で希釈して100mlにしたもの
であり、染色された緩衝液30ml単位に含まれる）。過酸
化水素水は、OPD溶液をウェルに加えるほんの数秒前
に、OPDに添加するべきである。
この混合物は、反応が停止するまで室温で５〜15分間
インキュベートされ、そこで50μｌの4N硫酸を添加し
た。その時、ウェルの吸光度を、Bio−Tek ELISAリーダ
で、490 nmで測定する。
実施例４−5:モノクローナル抗体の特性分析 これらの実施例では，実施例３に従ってクローンNo.3
およびNo.29によって産生されたモノクローナル抗体に
対して、これら抗体の特性を分析するために、植物タウ
マチンＩ、植物タウマチンII、再生した組換え酵母が産
生するタウマチン類似物、および組換え酵母が産生する
タウマチン様のグルタチオン付加物の存在下で、ELISA
拮抗分析を施した。
表１は、タウマチンＩ、タウマチンII、組換え酵母が
産生するタウマチン類似体、および組換え産物の再生に
おける中間物として形成する組換え酵母が産生するタウ
マチン類似体のグルタチオン付加物の、結合の阻害に関
する試験結果を示している。これらタウマチンタイプの
各々は、ELISA拮抗分析において、クローンNo.3抗体と
効果的に拮抗することが分かった。
しかし、組換え酵母が産生したタウマチン類似体のグ
ルタチオン付加物はクローンNo.3抗体とは拮抗しない。
このことはすなわち、この抗体が、ポリペプチドの三次
構造、あるいはポリペプチドの一次構造（ポリペプチド
におけるアミノ酸の連続的な配列）には作用するが、付
加物の形成によって、それらポリペプチドにおいて、そ
の抗体と特異的に反応するエピトープが不活性化するこ
とを示す。一方、クローンNo.29の抗体は、その天然コ
ンフォメーションにあるタウマチンＩおよびIIも、再生
組換え体が産生したタウマチンも同様に認識する。ま
た、それは、組換え酵母が産生するタウマチン類似体の
グルタチオン付加物をも認識する。これは、クローンN
o.29の抗体が、ポリペプチドの三次元の球状構造（グル
タチオン付加物の場合には崩壊している）に作用しよう
とせず、代わりに、その分子の一次構造、例えば、その
アミノ酸配列に作用することを示す傾向にある。
実施例６−14:モノクローナル抗体の特性分析 これらの実施例では、クローンNo.10、24、27、30、3
6、37、371、38および41により産生したモノクローナル
抗体に対してELISA拮抗分析を行った。
試験は、実施例３に記載の方法によって、自然のコン
フォメーションを有する天然のタウマチンＩと、過ギ酸
により酸化して変性したタウマチンＩについて行われ
た。その変性タウマチンＩは、98％のギ酸溶液の30％の
過酸化水素溶液を9:1の割合で混合し冷却（４℃）した
過ギ酸溶液0.5ml中に、タウマチンＩを1mgを入れたもの
をインキュベートして調製した。
表２は、クローンNo.10、24、27、30、36、37、371、
38と41によって産生したモノクローナル抗体が、自然コ
ンフォメーションにあるタウマチンのみを認識し、過ギ
酸で変性したタウマチンは認識しなかったことを示して
いる。このことは、これらのクローンが、タウマチンの
三次構造だけを認識することを示している。一方、クロ
ーンNo.30の抗体は、その自然コンフォメーションのタ
ウマチンと過ギ酸で変性したタウマチンの両方を認識し
た。クローンNo.30の抗体が、天然と変性の両方のタウ
マチンを認識することから、それはポリペプチドの一次
構造（例えば，ポリペプチドのアミノ酸の連続する配列
の部分）に作用することがわかる。
実施例15−28:モノクローナル抗体の特性分析 これらの実施例では，クローンNo.10、24、27、30、3
6、37、371、38と41によって産生したモノクローナル抗
体に関して、それら抗体の種々の濃度のタウマチンＩ、
同族の甘味のあるポリペプチドのモネリンあるいは、過
ギ酸で酸化したタウマチンＩに対する結合親和性を、EL
ISA拮抗分析により測定した。
ELISAプレートは、実施例３の方法によって、10ngの
タウマチンで薄く覆った。同時に種々のクローンから得
られたモノクローン抗体を含む培地を、硫酸アンモンで
処理し、100倍に希釈した。硫酸アンモンの分液の50μ
ｌを、異なる量のタウマチンＩ、モネリン（Sigma Chem
ical Co.,セントルイス、ミズーリー州）あるいは、過
ギ酸で酸化したタウマチンＩの存在下で種々なウェルに
添加した。
以下の表３に示したように、ELISA拮抗分析結果は、
クローンNo.24、27、36、371と41からのモノクローナル
抗体が、その自然コンフォメーションにあるタウマチン
とモネリンを、同様に認識することを示している。しか
し、それらは過ギ酸処理タウマチンを認識しない。この
ことは、これらのク ローンからの抗体が、タウマチンの三次構造の特定の部
分に対しても特異性があることを示している。
また、タウマチンやモネリンが、モノクローナル抗体
によって認識され、それらの甘味の根拠となるエピトー
プを共通して有していることを示すものである。
前記表４に示した結果、クローンNo.10、37と38によ
って産生したモノクローナル抗体が、タウマチンＩおよ
びモネリンを認識するが、過ギ酸で処理したタウマチン
は認識しないことを示している。このことは、これらの
抗体が、タウマチンおよびモネリンの両方の三次構造の
特定部分を認識することを示している。
一方、クローンNo.30によって産生した抗体は、モネ
リン、天然植物のタウマチン、および変性タウマチンに
より阻害される。このことは、クローンNo.29の抗体に
似たクローンNo.30の抗体が、タウマチンおよび同様に
モネリンの一次構造のある部分に特異的に反応性のある
ことを示している。
実施例29−36:モノクローナル抗体の特性分析 これらの実施例では、クローンNo.3（A.T.C.C.HB−89
22）およびNo.29（A.T.C.C.HB−8921）を、二つの主要
な抗体タイプの典型として選択した。
ELISAプレートは、実施例３の方法によって50μｌの
（１）ウシ血清アルブミン（BSA）（10mg/ml）、（２）
過ギ酸処理のタウマチンＩ（21μg/ml）、（３）タウマ
チン（１μg/ml）または（４）モネリン（４μg/ml）の
何れかで薄く覆った。
表５に、クローンNo.3の抗体が、モネリンと自然のコ
ンフォメーションにあるタウマチンだけを認識すること
を確定するELISA処理の結果を示した。一方、クローンN
o.29の抗体は、タウマチン、モネリン、変性タウマチン
を認識する。
実施例37−40:モノクローナル抗体の特性分析 これらの実施例では、クローンNo.3および29から得た
モノクローナル抗体を、二つの主要抗体型の典型として
選択した。ELISAプレートは、実施例３の方法により、5
0μｌの植物タウマチンＩ（0.2μg/ml）、タウマチン−
グルタチオン付加物（５μg/ml）、あるいは対照として
のウシ血清アルブミン（BSA）で薄く覆う。その付加物
は、Iyengar等の手順による組換え酵母が産生したタウ
マチンＩの再生プロセスの中間物であり、甘味は有して
いない。
前記表６に表した結果は、クローンNo.3によって産生
した抗体が、天然植物タウマチンＩのみを認識し、変性
組換え体付加物は認識しないことを示す。しかし、クロ
ーンNo.29に由来するモノクローナル抗体は、天然タウ
マチンと変性付加物の双方を同様に認識する。
実施例41:モノクローナル抗体に対する拮抗分析 本実施例では、クローンNo.3のモノクローナル抗体
と、天然の植物タウマチンＩの結合に対する、組換え酵
母が産生したタウマチン類似−グルタチオン付加物、お
よび過ギ酸酸化植物タウマチンの阻害効果を分析した。
ELISAプレートは、ウェル１個あたり、10ngの天然植
物タウマチンを薄く覆った。上記抗体は、対照の緩衝
液、または種々の量の試験材料で、２時間プレインキュ
ベートしてプレートに添加した。そのプレートは、実施
例３のELISA手法によって処理を進めた。
前記表６に示した結果は、500ngの天然のタウマチン
を添加したものが、50％まで効果的に結合を阻害するこ
とを示している。クローンNo.3の抗体と、タウマチン類
似グルタチオン付加物、または過ギ酸と酸化したタウマ
チンとをプレーインキュベートしたものは、阻害がほと
んどあるいは全く認められなかった。
実施例42:モノクローナル抗体に対する拮抗分析 本実施例では、クローンNo.29のモノクローナル抗体
と、天然植物タウマチンＩの結合に対する組換え酵母が
産生するタウマチン類似−グルタチオン付加物、および
過ギ酸で酸化したタウマチンの阻害効果を分析した。
ELISAプレートは、ウェルを天然の植物タウマチンＩ
の10ngで薄く覆った。上記抗体を、対照緩衝液または種
々の試験材料と共に２時間プレインキュベートし、その
プレートに添加した。そして、そのプレートは、実施例
３のELISAの方法によって処理した。
前記表８に示した結果は、ELISA拮抗分析にて、クロ
ーンNo.29の抗体に対してタウマチン−グルタチオン付
加物あるいは過ギ酸で酸化したタウマチンが、天然の植
物タウマチンと効果的に拮抗することを示している。
実施例43−45:モノクローナル抗体の特性分析 これらの実施例では、クローンNo.3および29によって
産生したモノクローナルの甘味料のモネリン、ショ糖、
あるいはアスパルテーム（Ｌ−アスパルテーム−Ｌ−フ
ェニルアラニンメチルエステル）に対する反応性を試験
した。二つのクローン（各100ml）の培養からの培地
を、硫酸アンモンの50％過飽和液で沈澱させた。
そして、その沈澱を5mlのPBS（pH 7.4）に溶解する。
両者のタンパク質の濃度は、20mg/mlであった。硫酸ア
ンモン濃縮された濃度1:20または1:60の培地に関して、
甘味料としての反応性を検査した。
ELISAプレートは、天然の植物タウマチンＩ（20mM Na
HCO3の50μｌ中に10mg）で薄く覆った。二通りに希釈し
たクローンNo.3および29から得た抗体は、0.5nMのモネ
リン、500nMのショ糖および170nMのアスパルテームと共
に、24℃で３分間、プレインキュベートした。そのプレ
ートは，実施例３のELISA拮抗法によって処理した。
前記表９に示した結果は、モノクローナル抗体が蔗糖
にも、アスパルテームにも反応しないことを示してい
る。この分析は、高濃度で存在するモネリンが、クロー
ンNo.3から産生した抗体とタウマチンとの結合を阻害し
ないことを示している。
実施例46:拮抗分析 本実施例では、実施例41に記述したようにして、天然
植物タウマチンＩとモネリンの間で拮抗分析を行った。
前記表10および表11に示された結果は、モネリンが、
タウマチンの約10倍の濃度で結合を阻害することを示し
ている。
従って、クローンNo.29モノクローナル抗体のモネリ
ンに対する親和力は、タウマチンに対してより10倍低い
ことになる。
実施例47:腹水症法による抗体収量の増加 組織培養にてより高濃度の抗体を得るために、本発明
のモノクローナル抗体を、Kenneth等編、モノクローナ
ル抗体、ハイブリドーマ；生物学的分析における新しい
次元P.403、New York:Plenum Press（1981）で、一般的
に詳述されている腹水症法で収量を増加せしめた。この
方法によれば、マウスに予めプリステイン（２、６、1
9、14−テトラメチルペンタデカン、Aldrich Chemical
社）0.6mlを、25から27ケージの針で、その腹腔内に注
射する。プリステインで処理すると、腹水症の症状で腹
腔内に腫瘍細胞が増殖する。３週間後、106個のハイブ
リドーマ細胞を、0.5mlの無血清のダルベッコ改良のイ
ーグル培地（DMEM）（Irvine Scientific社）と共に、
マウスの腹腔内に注射した。
二組のクローンNo.3およびNo.29による注射を、２匹
のマウスに行った。
ハイブリドーマ細胞注射の７日後、マウスに水と食物
（オートミール）をペトリ皿で与えた。ハイブリドーマ
細胞の注射の12日から14日の後、皮膚に小さい切口をつ
けマウスの腹腔から腹水をピペットで吸出した。その液
を、遠心分離し、その細胞を凍結用培地中に懸濁させ、
そこで液体窒素中で冷凍した。
腹水は、天然のタウマチン、モネリン、および対照
（BSA）に対して、1:3、1:9、1:27、および1:81の希釈
液で測定した。この処理で、組織培養で産生されるより
少量で力価の高いモノクローナル抗体が産生する。腹水
の抗体は、40％の硫酸アンモンで沈澱させ、イオン交換
クロマトグラフィに適用することで、腹水のアルブミン
からさらに精製することができる。
実施例48:タウマチン様ポリペプチドの単離と精製 高度の特異性と反応性を有する抗タウマチンモノクロ
ーナル抗体を提供することを通して、本発明は、公知の
アフィニティー精製処理によって、天然植物から得る場
合と同様に醗酵培養からタウマチンおよびタウマチン様
ポリペプチドを単離することを初めて可能にした。要約
すれば、好ましい単離処理は、固体の支持体（例えばク
ロマトグラフのカラム）に本発明の抗体を固定し、固定
された抗体と液体を含むタウマチンとの接触、さらに、
抗体との免疫複合体からの精製されたタウマチンの溶離
を含む。使用可能な特定の抗体を調製することにより、
不正常あるいは変性したタウマチンから、正しいコンフ
ォメーションにある天然タウマチンを単離するために、
その精製技術を適用することができる。タウマチン様ポ
リペプチドは単離され、タウマチン類似分子に特異的な
抗原エピトープに関する研究ができる。
実施例49:タウマチン様ポリペプチドの定量 高度に特異的な抗タウマチンモノクローナル抗体を調
製することを通じて、本発明は、二つ以上の抗体が含ま
れる液体試料中のタウマチンの定量のための、新規な測
定法を可能にした。このような定量法は、以下の三つの
工程を含む。
（１）試料液と固定化第一抗体との接触であって、その
抗体は液中で、タウマチンの第一抗原決定基と反応して
タウマチンの免疫複合体と第１抗体を形成する。
（２）工程（１）で形成した複合物と第二抗体との接触
であって、その第二抗体はタウマチンの第一抗原決定基
以外の抗原決定基と反応して、タウマチンの免疫複合体
と第二抗体を形成する。
（３）工程（２）で形成した免疫複合体と結合している
第二抗体を定量する。
このような測定処理は、好ましくは、上述のモノクロ
ーナル抗体の二つが含まれるようにする。しかしなが
ら、上述のモノクローナル抗体の内の一つと多価血清由
来のタウマチン抗体とを用いてもよい。
前述の好ましい態様に関する説明を考慮して、当業者
が発明の態様に多くの修正や変更を想到することが予測
される。従って、特許請求の範囲の欄に記載した限定の
みが本願発明に付加されるべきである。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/577 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ (56)参考文献 国際公開85／1746（ＷＯ，Ａ) Ｎａｔｕｒｅ，271（1978）Ｐ．381− 383 Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．96［１ ］（1979）Ｐ．193−204

Claims (10)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】タウマチンに特異的に結合する能力を有
    し、かつＬ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチ
    ルエステルとは特異的に結合しないモノクローナル抗体
    であって、マウス由来のハイブリドーマ細胞によってそ
    の増殖培地に産生されることを特徴とする、抗タウマチ
    ンモノクローナル抗体。
  2. 【請求項２】前記モノクローナル抗体が、タウマチンの
    三次構造の一部を含むエピトープと特異的に結合する特
    許請求の範囲第１項に記載のモノクローナル抗体。
  3. 【請求項３】前記モノクローナル抗体が、タウマチンの
    一次構造の一部を含むエピトープと特異的に結合する特
    許請求の範囲第１項に記載のモノクローナル抗体。
  4. 【請求項４】前記モノクローナル抗体が、ハイブリドー
    マ細胞ATCC HB−8922により産生される特許請求の範囲
    第２項に記載のモノクローナル抗体。
  5. 【請求項５】前記モノクローナル抗体が、ハイブリドー
    マ細胞ATCC HB−8921により産生される特許請求の範囲
    第３項に記載のモノクローナル抗体。
  6. 【請求項６】生物学的活性を有するタウマチンまたはタ
    ウマチン様ポリペプチドを生体液から単離する方法であ
    って、マウス由来のハイブリドーマ細胞によってその増
    殖培地に産生されるタウマチンに特異的に結合する能力
    を有し、かつＬ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン
    メチルエステルとは特異的に結合しない抗タウマチンモ
    ノクローナル抗体を生体液に接触し、およびタウマチン
    と前記モノクローナル抗体との免疫反応を検出する、工
    程を含むことを特徴とするタウマチンまたはタウマチン
    様ポリペプチドを生体液から単離する方法。
  7. 【請求項７】前記モノクローナル抗体が、タウマチンの
    三次構造の一部を含むエピトープと特異的に結合する特
    許請求の範囲第６項に記載の方法。
  8. 【請求項８】前記モノクローナル抗体が、タウマチンの
    一次構造の一部を含むエピトープと特異的に結合する特
    許請求の範囲第６項に記載の方法。
  9. 【請求項９】前記モノクローナル抗体が、ハイブリドー
    マ細胞ATCC HB−8922により産生される特許請求の範囲
    第７項に記載の方法。
  10. 【請求項１０】前記モノクローナル抗体が、ハイブリド
    ーマ細胞ATCC HB−8921により産生される特許請求の範
    囲第８項に記載の方法。
JP61505963A 1985-10-31 1986-10-28 抗タウマチンモノクローナル抗体およびそのモノクローナル抗体を用いたタウマチンの単離方法 Expired - Fee Related JP2550043B2 (ja)

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