JPH04281798A - ヒト型単クローン性抗肺ガン細胞抗体及びそれを産生するハイブリドーマ - Google Patents

ヒト型単クローン性抗肺ガン細胞抗体及びそれを産生するハイブリドーマ

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JPH04281798A
JPH04281798A JP3069272A JP6927291A JPH04281798A JP H04281798 A JPH04281798 A JP H04281798A JP 3069272 A JP3069272 A JP 3069272A JP 6927291 A JP6927291 A JP 6927291A JP H04281798 A JPH04281798 A JP H04281798A
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lung cancer
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進 佐藤
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和彦 黒田
Masanori Kamei
優徳 亀井
Shuichi Hashizume
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒト肺ガン細胞に特異
的に反応し、IgGタイプであるヒト型単クローン性抗
体及びこの抗体を産生するハイブリドーマに関する。
【0002】
【従来の技術】近年、単クローン性抗体が、ガンの免疫
学的研究、臨床診断、免疫治療等に応用されつつあり、
また、ガン特異抗原の精製手段としても利用されるよう
になってきた。このように、単クローン性抗体を、予防
、治療又は診断を目的としてヒトに投与する場合、ヒト
型単クローン性抗体は、マウス型単クローン性抗体に比
べて抗原性に関する問題が少ないと考えられており、臨
床治療上利用範囲が非常に大きい。更に、IgGタイプ
のヒト型単クローン性抗体は、プロテインAカラムによ
って精製が容易であり、また、制ガン剤等との複合体の
作成も容易であるという利点を有している。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、ヒト肺
ガン細胞と特異的に強く反応するIgGタイプのヒト型
単クローン性抗体は、未だ得られていなかった。
【0004】本発明の目的は、ヒト肺ガン細胞と特異的
に強く反応し、かつ、IgGタイプであるヒト型単クロ
ーン性抗体及びその抗体を産生するハイブリドーマを提
供することにある。
【0005】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成するため鋭意研究した結果、肺ガン患者から摘出
された多数のヒト抗体産生リンパ球と、(ヒト・マウス
)ヘテロミエローマ細胞株とを繰り返し融合させてハイ
ブリドーマを作成し、これらのハイブリドーマについて
、患者のガン組織あるいはPC−10(ヒト肺ガン細胞
株)のヌードマウス移植ガン組織の薄切り切片との免疫
染色を行うことによりスクリーニングを行ない、目的と
するヒト型単クローン性抗肺ガン細胞抗体を産生するハ
イブリドーマを得ることに成功し、本発明を完成するに
至った。
【0006】すなわち、本発明のヒト型単クローン性抗
肺ガン細胞抗体は、肺ガン患者の抗体産生細胞と、(ヒ
ト・マウス)ヘテロミエローマ細胞株との融合によって
形成されたハイブリドーマによって産生され、次の特徴
を有するものである。 (イ)肺ガン細胞と強く反応する。 (ロ)正常細胞とは反応しない。 (ハ)IgGクラスに属する。
【0007】また、本発明のハイブリドーマは、肺ガン
患者の抗体産生細胞と、(ヒト・マウス)ヘテロミエロ
ーマ細胞株との融合によって形成され、上記(イ)〜(
ハ)の特徴を有するヒト型単クローン性抗肺ガン細胞抗
体を産生するものである。
【0008】以下、本発明について具体例を挙げて詳細
に説明する。
【0009】本発明において、肺ガン患者の抗体産生細
胞としては、肺ガン患者から摘出したリンパ節の中で特
にガン細胞が混入しているものを選び、それから調整し
たリンパ球細胞を用いることが好ましい。
【0010】また、親細胞株である(ヒト・マウス)ヘ
テロミエローマ細胞株としては、融合効率がよく、得ら
れたハイブリドーマが安定してIgGタイプの抗体を産
生する細胞株RF−S1(ヒトミエローマ細胞株とマウ
スミエローマ細胞株との融合細胞突然変異株)(微工研
菌寄第12091号)を用いることが好ましい。このヘ
テロミエローマ細胞株は、ヒトミエローマ細胞株(RP
MI−8226)と、マウスミエローマ細胞株(FO)
とを融合して得られたものであり、その詳細については
、本出願人が既に提案した特願平1−322118号に
開示されている。
【0011】肺ガン患者の抗体産生細胞と、(ヒト・マ
ウス)ヘテロミエローマ細胞株とを融合してハイブリド
ーマを得る方法は、例えばポリエチレングリコールを用
いて融合させ、HAT培地に交換して2週間程度培養し
、増殖が見られたウェルを選択するという公知の方法で
行なうことができる。
【0012】出現したハイブリドーマから目的とする抗
体を産生するハイブリドーマをスクリーニングする方法
は、次のようにして行なうことができる。すなわち、ハ
イブリドーマの増殖が見られたウェルの培養上清を採取
し、上清中に含まれる免疫グロブリンをEIA法で測定
して、抗体産生が陽性のウェルを選択する。更に、陽性
ウェルについて、患者のガン組織あるいはPC−10(
ヒト肺ガン細胞株)のヌードマウス移植ガン組織の薄切
りを用いた免疫染色法によって肺ガン細胞との反応性を
調べ、強い反応性を示すウェルを選択する。
【0013】このウェル中の細胞について、限界希釈法
等によりクローニングを行ない、肺ガン細胞に対する強
い反応性を示すクローンを選択することにより、本発明
のハイブリドーマを得ることができる。
【0014】また、このハイブリドーマを培養し、その
培養液上清中から硫安分画法及び/又はプロテインAカ
ラムを用いて抗体を分離することにより、本発明のヒト
型単クローン性抗肺ガン細胞抗体を高純度に安定して得
ることができる。
【0015】本発明のハイブリドーマの具体例としては
、後述する実施例で得られたハイブリドーマH9−F7
(ヘテロミエローマとヒトリンパ球の融合細胞株)(微
工研菌寄第12090号)、及びH48−G11(ヘテ
ロミエローマとヒトリンパ球の融合細胞株)(微工研菌
寄第12089号)が挙げられる。これらのハイブリド
ーマを用いれば、本発明のヒト型単クローン性抗肺ガン
細胞抗体を容易に得ることができる。
【0016】なお、以下の説明において、上記のハイブ
リドーマの名称は、それらが産生する単クローン性抗体
の名称にも準用することとする。
【0017】
【作用】本発明のハイブリドーマは、肺ガン患者の抗体
産生細胞と、(ヒト・マウス)ヘテロミエローマ細胞株
、好ましくはRF−S1とを融合し、前述した方法でス
クリーニングして得られたものであるため、肺ガン細胞
と強く反応し、IgGクラスに属するヒト型単クローン
性抗肺ガン細胞抗体を安定して産生することができる。
【0018】また、本発明のヒト型単クローン性抗肺ガ
ン細胞抗体は、肺ガン細胞との反応性が強く、IgGク
ラスに属するので、プロテインAカラムによって精製が
容易であり、制ガン剤等との複合体の作成も容易である
。したがって、ガンの臨床診断、免疫治療等の医学的分
野での応用や、ガン特異抗原の精製手段として利用する
ことが期待される。
【0019】
【実施例】実施例1 (1)ヒト抗体産生リンパ球細胞の調製ヒトリンパ球細
胞は、肺ガン患者から摘出したリンパ節のうち特にガン
細胞の混入しているリンパ節を選び、すみやかにこれを
15%FCS添加RDF(RPMI  1640:DM
E:HamF12=2:1:1の混合培地)中で細切し
、ピンセットでほぐしてリンパ球細胞を浮遊させた後、
パーコールを用いた比重遠心法によりリンパ球細胞を分
離した。
【0020】(2)ハイブリドーマの作成親細胞株とし
て、(ヒト・マウス)のヘテロミエローマであるRF−
S1を用いた。RF−S1と上記のリンパ球をRDF培
地で2回洗浄後、1:3の割合で混合する。再度遠心後
、細胞ペレットをよく分散し、1ml の50%ポリエ
チレングリコールを1分間にわたって滴下する。更に1
分間 37 ℃で反応後、5分間で10mlのRDF培
地を加える。遠心した後、15%FCSを含むRDF培
地に懸濁し、96ウェルのマイクロプレートに、1ウェ
ル当り2×104 個の親細胞が含まれるように分注す
る。
【0021】翌日HAT培地(0.1mM ヒポキサン
チン、16μM チミジン及び0.4 μM アミノプ
テリン添加15%FCS/RDF培地)に交換し、37
℃、5 %CO2 の条件下で培養する。2〜3日間隔
でHAT培地を交換する。約2週間後に、ハイブリドー
マの増殖が見られたウェルの培養上清を採取し、免疫ク
ロブリン量をEIA法で測定し陽性ウェルを選択する。
【0022】更に、それら陽性ウェルの培養上清を用い
て、免疫染色法によって肺ガン細胞との反応性を調べた
。免疫染色法は、肺ガン細胞株PC10をヌードマウス
に移植しガン細胞を作らせ、それを10%ホルマリンで
固定した後薄切として、常法通りのABC法による酵素
抗体法によって染色して反応性を調べることによって行
なった。
【0023】以上の結果を表1に示す。表に示されるよ
うに、ガン細胞との反応性を示すウェルが1つ得られた
。そのウェル中の細胞を限界希釈法によりクローニング
を行った。良好な反応性を示すクローンを選択し、H4
8−G11とした。
【0024】
【表1】
【0025】(3)抗体の精製 上記ハイブリドーマH48−G11を10%FCS添加
RDF培地で培養し、その培養上清をプロテインAカラ
ムに通して吸着させた。この吸着画分を2%酢酸を含む
0.15 M NaCl 水溶液で溶出することにより
、高純度に精製されたIgGを回収率50%で得た。
【0026】(4)肺ガン細胞との反応性試験こうして
得られたIgGタイプの抗体(H48G11)について
、肺ガン細胞との反応性を以下のような方法で調べた。
【0027】ヌードマウス移植肺ガン細胞株又は肺ガン
患者組織を、10%ホルマリンで固定した後、パラフィ
ンで包埋し、5μm の薄切とする。脱パラフィンした
後、ヤギ血清でブロッキングを行う。0.4 μg/m
lのH48G11の溶液と反応させた後、ビオチン化抗
ヒトIgGと反応させる。次に、アビジン−ビオチン化
ペルオキシターゼ複合体と反応させた後、DABで発色
させる。評価は、特異的な発色が50%以上認められた
場合を+とし、50%以下の場合を−とした。
【0028】この結果を表2に示す。表2から明らかな
ようにH48−G11は、肺ガン細胞と高い反応性を示
し、正常細胞とは反応しなかった。
【0029】
【表2】
【0030】実施例2 ヒト抗体産生リンパ球細胞として、実施例1とは別の肺
ガン患者のリンパ節から調製したものを使用し、親細胞
株としては、実施例1と同じ(ヒト・マウス)ヘテロミ
エローマRF−S1を用い、RF−S1とリンパ球細胞
を1:2の割合で混合し、実施例1と同様にして、ハイ
ブリドーマを作成し、目的とする抗体産生細胞株のスク
リーニングを行なった。この結果を表3に示す。
【0031】
【表3】
【0032】表3に示すようにヌードマウス移植PC1
0との反応性を示すウェルが1つ得られた。このウェル
中の細胞について限界希釈法によりクローニングを行い
、良好な反応性を示すクローンを選択し、H9−F7と
した。
【0033】実施例1と同様にして、このハイブリドー
マH9F7を培養し、培養液上清をプロテインAカラム
を用いて分画し、高純度に精製されたIgGを回収率4
0%で得た。
【0034】こうして得られたIgGタイプの抗体(H
9F7)について、肺ガン細胞との反応性を実施例1と
同様にして調べた。この結果を表4に示す。このように
H9F7は、肺ガン細胞と高い反応性を示し、正常細胞
とは反応しなかった。
【0035】
【表4】
【0036】
【発明の効果】以上説明したように、本発明によれば、
肺ガン細胞と特異的に強く反応するIgGタイプのヒト
型単クローン性抗体及びそれを安定して産生するハイブ
リドーマを提供することができる。このようなIgGタ
イプのヒト型単クローン性抗体は、プロテインAカラム
によって精製が容易であり、また制ガン剤等との複合体
の作成も容易であるため、ガンの臨床診断、免疫治療等
の医学的分野での応用やガン特異抗原の精製手段として
の利用に役立つものと期待される。

Claims (6)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】  肺ガン患者の抗体産生細胞と、(ヒト
    ・マウス)ヘテロミエローマ細胞株との融合によって形
    成されたハイブリドーマによって産生され、次の特徴を
    有するヒト型単クローン性抗肺ガン細胞抗体。 (イ)肺ガン細胞と強く反応する。 (ロ)正常細胞とは反応しない。 (ハ)IgGクラスに属する。
  2. 【請求項2】  前記(ヒト・マウス)ヘテロミエロー
    マ細胞株が、ヒトミエローマ細胞株(RPMI−822
    6)とマウスミエローマ細胞株(FO)との融合細胞株
    RF−S1(微工研菌寄第12091号)である請求項
    1記載のヒト型単クローン性抗肺ガン細胞抗体。
  3. 【請求項3】  肺ガン患者の抗体産生細胞と、(ヒト
    ・マウス)ヘテロミエローマ細胞株との融合によって形
    成され、次の特徴を有するヒト型単クローン性抗肺ガン
    細胞抗体を産生するハイブリドーマ。 (イ)肺ガン細胞と強く反応する。 (ロ)正常細胞とは反応しない。 (ハ)IgGクラスに属する。
  4. 【請求項4】  前記(ヒト・マウス)ヘテロミエロー
    マ細胞株が、ヒトミエローマ細胞株(RPMI−822
    6)とマウスミエローマ細胞株(FO)との融合細胞株
    RF−S1(微工研菌寄第12091号)である請求項
    3記載のハイブリドーマ。
  5. 【請求項5】  ハイブリドーマH9−F7(微工研菌
    寄第12090号)である請求項4記載のハイブリドー
    マ。
  6. 【請求項6】  ハイブリドーマH48−G11(微工
    研菌寄第12089号)である請求項4記載のハイブリ
    ドーマ。
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