JPS62210985A - 牛のｃ−反応性蛋白に対するモノクロ−ナル抗体産生ハイブリド−マとその抗体を用いた牛ｃ−反応性蛋白の分離精製法 - Google Patents

牛のｃ−反応性蛋白に対するモノクロ−ナル抗体産生ハイブリド−マとその抗体を用いた牛ｃ−反応性蛋白の分離精製法

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JPS62210985A
JPS62210985A JP61054115A JP5411586A JPS62210985A JP S62210985 A JPS62210985 A JP S62210985A JP 61054115 A JP61054115 A JP 61054115A JP 5411586 A JP5411586 A JP 5411586A JP S62210985 A JPS62210985 A JP S62210985A
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JP
Japan
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bovine
crp
antibody
reactive protein
protein
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JP61054115A
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English (en)
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Shigetaka Shibata
柴田　重孝
Shizuo Yamamoto
静雄 山本
Tetsuya Sakano
阪野　哲也
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National Federation of Agricultural Cooperative Associations
Original Assignee
National Federation of Agricultural Cooperative Associations
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Publication date
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Pending legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4737—C-reactive protein

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はモノクローナル抗生Ｃ−反応性蛋白抗体を産す
るハイブリドーマと、牛の血清等から牛のＣ−反応性蛋
白を分離精製する方法に関する。
従来の技術 Ｃ−反応性蛋白（Ｃ−Ｒｅ５ｚｃｔｉｖｅ　ｐｒｏｔｅ
ｉｎ　、以下ＣＲＰと略記）はＣａ”＋の存在下で肺炎
双球菌の細胞壁に含有されるＣ多糖体と特異的に沈降反
応を呈する血清蛋白成分として発見された。
このＣＲＰは人では急性炎症時や組繊破壊時の病態把握
の指標として必須の検査項目の一つとされている。
獣医学ではＣＲＰについてその存在すら報告されること
なく存在の生理学的意義についての報告もみられていな
い。
発明者等は犬の血清よシ初めてＣＲＰを分離し、その物
理化学的性状について報告した。
牛のＣＲＰについても今回初めて分離し、その性状を明
らかにすることが出来た。
みられないことから発明者等の得た牛のＣＲＰはこの牛
のＣＲＰも文中の炎症や、組織破壊に伴って増加し、回
復に伴って減少し、臨床面では極めて有力な病態把握の
指標とな夛得る蛋白質である。
発明の目的 牛のＣＲＰと反応する特異的な抗体を産生ずるハイブリ
ドーマを作出することと、その抗体を用いて抗原である
ＣＲＰを、高純度且っ高収率で分離精製することを目的
とした。
発明の構成 １、　モノクローナル抗生ＣＲＰ抗体産生ハイブリドー
マの作出。
牛ＣＲＰあるいは牛のＣＲＰを含有する分画とフロイン
ト完全アジュバントを混合して得られる混合物でマウス
を免疫し、マウスよシ摘出した肺臓から採取した肺臓リ
ンパ球とマウス骨髄腫細胞とを公知の方法で融合させて
抗生ＣＲＰ抗体産生ハイブリドーマを得る。
実施例 牛ＣＲＰあるいは牛のＣＲＰを含有する分画と、フロイ
ント完全アジュバント番当量混合して得られる当量混合
物を６〜８週令のマウスの腹腔に０．２ｄ宛接種、８週
及び４週後に同様に接種、最後の８日間は連続して接種
、最後の免疫後８〜４日目白目出した肺臓からリンパ球
を採取する。肺臓りンパ球とマウス骨髄腫細胞ＳＰ　２
１０−Ａｇ／１４（以下ミエローマ細胞と略記）とを７
対ｌの割合に混合し、融合促進剤として分子ｆｔ４，０
００のガスクロマトグラフィー用５０％ポリエチレング
リコール（メルク社製）をおよそ１分間作用させた。
この細胞浮遊液を１．０００　ｒ、　ｐ、ｍ、で５分間
遠心してポリエチレングリコールを含む上清を除き、１
０％牛脂児血清を含むＨＡＴ培地（ヒボキサンチン、ア
ミノプテリン、チミヂン）を加え、細胞数が４Ｘ１０／
−になるよう再浮遊させ、之を９６穴培養用プレートに
まき、５％炭酸ガスを含んだ８７℃の温度に設定した条
件下で培養を行った。
ハイブリドーマのコロニーが大きくなったら細胞を分散
させ細胞数が十分型になる迄培養を続ける。
細胞数が十分な増殖をしめした段階で培養上清中のハイ
ブリドーマのモノクローナル抗体の産生をエライザ−法
（ＥＬ　Ｉ　ＳＡ法）でチェックした。
抗体産生を示した穴のバイブリドにつき限界希釈法によ
シクロー二ングを行った。
ハイフリトーマのコロニー形成率　　９２％牛ＣＲＰに
対する抗体の産生率は 精製したＣＲＰで免疫したマウスを用いた場合１０〜１
５％ ＣＲＰ分画で免疫したマウスを用いた場合８〜６％。
であった。
抗体産生を示したハイブリドーマを９６穴プレート上で
増殖させ、十分に増殖したものを２４穴のプレート上に
移し、１０％牛脂児血清を含むＨＴ培地（ヒポキサンチ
ン、チミヂン）中で培養を継続し、ハイブリドーマが１
〜８Ｘ１０／ｓＩｌに増殖した段階で限界希釈によるク
ローニングを行った。限界希釈法には、発育促進のため
フィーｉｉ胞としてマウスの脂腺細胞をＩ×１０／１Ｒ
１加え、浮遊させたＨＴ培地（ヒボキサンチン＋チミジ
ン十゛ｌＯ％牛脂児血清を含むギフコＲＰ　Ｍ　Ｉ　　
１６４０培地）で希釈を行いハイブリドーマが計算上各
つェル当シェフになるように分注してハイブリドーマの
単一コロニーを得た。
この操作を８回行いモノクロール化された特異抗体産生
ハイブリドーマを得た。
２、抗生ＣＲＰ抗体の産生 上述のようにして得られたハイブリドーマは公知の方法
に従ってＨＴ培地で培養し、得られた上清を予めブリス
タンを投与したマウスの腹腔内に接種し、２〜８週間後
腹水を採取した。これらの腹水を回収するか、或は培地
中で培養してその上清液を回収し、硫安で塩析し、得ら
れた沈澱蛋白をプロティンＡ　−Ｓｅｐ！１ａｒｏｓｅ
　ＣＬ　４　Ｂ　（ファルマシアファインケミカルズ）
又は陰イオン交換体を用いて精製することによ）モノク
ローナル抗生ＣＲＰ抗体を得ることができた。
これらの結果から発明者らの得たノ１イブリドーマは発
明者らが牛において初めて分離し、その作用を報告した
特異な蛋白質抗生ＣＲＰ抗体を産生ずる新生酸物である
ことを知った。
８、モノクローナル抗生ＣＲＰ抗体を用いて牛血清よシ
牛ＣＲＰを分離、柄裂する方法。
本発明では上述のようにして形成したハイブリドーマが
産生ずるモノクローナル抗生ＣＲＰ抗体をアフィニティ
ークロマトグラフィー用担体のような不溶性担体、例え
ばＣＮＢｒ−アクチベイテツドセファロース４Ｂ（ファ
ルマシアファインケミカルズ）と公知の方法により結合
させて固定し、アフィニティーカラムとして牛血清から
のＣＲＰの分離、精製に用いた。
モノクローナル抗生ＣＲＰ抗体をアフィニティーゲルの
ような担体に固定し得たものは０．１％アジ化ナトリウ
ムを含むｐＨ８，０の食塩加リン酸緩衝液（ＰＢＳ）中
に分散させておけば４℃の温度下で６〜１２ケ月程度保
存することが可能となる。
該アフィニティーカラムに２５℃以下の温度、好ましく
は４℃以下で試料を通液してカラムに対する非吸着画分
を溶出させた後、ｐＨ８，０の食塩加すン酸綬衝液でＯ
，Ｄ、値が０．００２以下になるまで洗滌し、０．０５
Ｍ、ｐＨ４．３以下好ましくは４．８〜２．８のグリシ
ン塩酸緩衝液で溶出して、抗体に吸着している牛ＣＲＰ
を解離させる。得られたＣＲＰ分画は直ちにアルカリ剤
を加えて中性に戻す。好ましくは中和に用いる適量のア
ルカリ剤を加えた試験管内に解離した溶出液を採取する
。
本発明に従ってモノクローナル抗生ＣＲＰ抗体を固定し
たアフィニティーカラムを用いて牛血清から牛ＣＲＰを
分離精製すると、従来の方法のように各種クロマトグラ
フィーを行う必要がなく、アフィニティーカラムに１回
通すのみで牛血清から牛ＣＲＰを容易に分離し得る。
得られた牛ＣＲＰは薄層ディスク電気泳動法で分画し銀
染色を行った結果単一なバンドが見られ、他成分の混入
が認められず純度の高いものであることを知った。その
回収率は９５％以上であった。
この分離精製した牛ＣＲＰをフロイント完全アジュバン
トと共に家兎に６〜７回免疫して得た抗血清は牛ＣＲＰ
と反応する特異抗血清であった。
よって本発明によって得られた牛ＣＲＰの純度はほぼ１
００％と判断した。
発明の効果 本発明は極めて特異性の高い生物学的親和力を利用した
牛ＣＲＰの分離精製法で従来の物理、化学的方法とは本
質的に異なったものである。本法によって初めて高純度
の牛ＣＲＰを効率よく提供することが可能となった。発
明者らは先に牛において今迄知られていなかった特異蛋
白質である牛ＣＲＰを初めて分離し、その物理化学的性
状を明らかにし、この牛ＣＲＰが炎症時疾患の病態把握
の指標となることを報告した。
更に本発明によって高純度の牛ＣＲＰを単離し、その抗
体の入手を容易ならしめたことは牛の疾患の診断、予後
判定に貢献するところが極めて大きいものと思われる。

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）牛Ｃ−反応性蛋白で免疫したマウスの脾臓リンパ
    球と、マウスの骨髄腫細胞とを融合させて成るモノクロ
    ーナル抗牛抗体産生ハイブリドーマの製法。
  2. （２）モノクローナル牛Ｃ−反応性蛋白抗体を不溶性の
    担体に吸着させて成生したアフイニテイークロマトグラ
    フイー用カラムを用いて牛血清、腹水ならびに胸水から
    Ｃ−反応性蛋白を分離、精製する方法。
  3. （３）不溶性の担体がアフイニテイーゲルである特許請
    求の範囲第２項記載の方法。
  4. （４）アフイニテイーカラムに吸着した牛Ｃ−反応性蛋
    白の溶出をｐＨ４．３以下、好ましくはｐＨ４．３〜２
    ．３で行い、ついで得られた牛ＣＲＰ分画のｐＨを直ち
    に中性に戻す特許請求の範囲第２項記載の方法。
JP61054115A 1986-03-12 1986-03-12 牛のｃ−反応性蛋白に対するモノクロ−ナル抗体産生ハイブリド−マとその抗体を用いた牛ｃ−反応性蛋白の分離精製法 Pending JPS62210985A (ja)

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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1990012884A1 (fr) * 1989-04-25 1990-11-01 Iatron Laboratories, Inc. Anticorps monoclonal inhibiteur de proteines c-reactives
US5500345A (en) * 1989-04-25 1996-03-19 Iatron Laboratories, Inc. Hybridomas producing monoclonal antibodies specific for C-reactive protein and methods for detection of C-reactive protein

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