JPS62166897A - 核内非ヒストン蛋白質に対するモノクロ−ナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野コ 本発明は核内非ヒスＩ・ン蛋白質ハイモビリティーグル
ープ−１に対するモノクローナル抗体にに関するもので
あり、更に詳くは核内非ヒストン蛋白質ハイモビリティ
ーグループ−１（以下ＨＭＧ−１と略称する）に特異的
なモノクローナル抗体、このモノクローナル抗体を産生
ずることのできるクローン化されたハイブリドーマ細胞
及びこのモノクローナル抗体の製造方法に関するもので
ある。

ＨＭＧ−１は均一に精製され、アミノ酸配列も知られて
いる数少ない非ヒストン蛋白質の一つである。ＨＭＧ−
１は様々なタイプの動物の様々なタイプの細胞でその存
在が認められている。またＤＮＡやヒストンＨ−１等と
結合する性質を持ち、ヌクレオソームのリンカ−リージ
ョンに局在する。

ＨＭＧ−１の生物学的な機能として細胞の核内でのＲＮ
Ａの転写、或いはＤＮＡの複製等に関与しているといわ
れている。また、ＨＭＧ−１は細胞の細胞質内に導入さ
れた時、直に核に移行する性質が知られている。

はとんどすべての遺伝情報は核中に保存されており、物
質を用いて直接それに影響を与えるためには、まずその
物質が核中に移行することが相変である。細胞質から核
に、ＨＭＧ−１と共に移行していくモノクロナル抗体は
、ＲＮＡへの転写、ＤＮＡの復製等の核内の機能を調べ
ることに有用である。また、ＨＭＧ−１を直接測定する
ことに関しても有用である。また、ＨＭＧ−１を精製す
る際にもを用な手段を提供する。

［従来の技術］ 肺臓細胞と骨髄腫細胞とのハイブリドーマは文献中に記
載されている。例えばＫｏｅｈｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｎａｔｕｒｅ　２５Ｂ、　４３５（１９７５）及びＥｕ
ｒ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ。

５１１　（１９７Ｂ）、Ｍｉｌｓｔｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ
、、　Ｎａｔｕｒｅ、　２８６゜５５０（１９７７）等
があげられる。それ以来、ヒトインスリン（特開昭６０
−５７２５３）　、インターロイキン　２　（０開昭６
Ｏ−５１１２１）等を抗原とした単クローン性抗体がＣ
Ｂ報告されている。

ところで、ＨＭＧ−１と共存する場合に細胞質から核に
移行する性質を持つ抗ＨＭＧ−１モノクローナル抗体は
従来報告されていない。

［問題を解決するための手段〕 本発明はＨＭＧ−１に対して特異性を示すモノクローナ
ル抗体及びこのモノクロナル−抗体を産生ずることので
きるハイブリドーマクローン及び該クローンが産生ずる
抗ＨＭＧ−１モノクローナル抗体を提供するものである
。

本発明のモノクローナル抗体はＩｇＡ等のイムノグロブ
リンからなる。

本発明のハイブリドーマクローンは骨髄腫細胞とトリニ
トロフェノール（以下ＴＮＰと略称する）などの修飾剤
により化学的に修飾されたＨＭＧ−１で免疫された晴れ
動物、特にマウス、ラット等の肺臓又はリンパ節の細胞
中に存在する抗体産生細胞とのハイブリドーマを作成し
、このハイブリドーマクロンを培養及びクローン化して
ＨＭＧ−１に特異性を示す抗体を産生ずるクローンとし
て選択されるものである。

ＨＭＧ−１としては、ヒト、ウシ等の高等動物の組織又
は細胞由来のものを用いることができる。

ＨＭ　Ｇ　−１を抗原として使用するため、ＨＭＧ−１
を精製する。ＨＭＧ−１の精製に関しては文献に記載さ
れている。ここではｒｓａｎｄｃｒｓ、　Ｃ，。

Ｂｉｏｃｂｉｍ、　ｌ１ｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、　
７３．１０３４−１０４２（１９７７）Ｊの方法を用い
ることができる。精製されたＨＭＧ−１はその抗原性を
高めるためｒＧａｒｒａｙ、　Ｊ、　Ｓ、　Ｏｔ　ａｌ
、、　Ｍｃｔｂｏｄｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏ−ｇｙ
；　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｔｅｘｔ　ｆｏｒ　Ｉ
ｎ５ｔｒｕｃｔｉｏｎ　＆Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　３ｒｄ
　Ｅｄ、、　１５３−１５８．　Ａｄｄｉｓｉｏｎ　−
Ｗｅｓｌｅｙ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、＋　Ｒｅ
ａｄｉｎｇ　ＨＡ　Ｊの方法を用いて化学的に修飾する
ことができる。修飾されたＨＭＧ−１は、生理食塩水、
或いは緩衝液などに溶解し、例えばマウス又はラットの
場合−匹あたり一回に１０〜１００μｇを投与するのが
好ましい。免疫操作は数回にわけて行なうが、最後の免
疫操作をのぞいてアジュバントと共に行なわれる。免疫
は１〜２週間の間隔で行ない、最終免疫はアジュバント
を使用せず、生理食塩水などに溶解し腹腔内或いは静脈
内に投与する。免疫動物としては一般にはラット及びマ
ウスが般用される。

これは細胞融合に使用する腫瘍細胞株によって決められ
る為で、マウスの中でも免疫グロブリンを産生しないＢ
ＡＬＢ／ｃがよく用いられる。最終免疫２〜４日後にリ
ンパ節或いは肺臓を摘出し、得られたリンパ球を細胞融
合に供する。

一方細胞融合に使用される腫瘍細胞株としては、免疫グ
ロブリンを産生しないＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８−ＵｌやＳ
　Ｐ２１０−Ａ　ｇ　１４などが使用される。細胞融合
時にはリンパ球を腫瘍細胞の５−２０倍口多く用いるの
が適当である。ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭ１１６４０培地或
いは、生理食塩水で洗浄後、リンパ球と腫瘍細胞を遠心
操作でペレット状態にする。ペレットをほぐした後、ポ
リエチレングリコール（以下ＰＥＧと略称する）を加え
、細胞融合を行なうが、通常はＰＥＧの平均分子量１．
０００〜８，０００の４０−６０％溶液を０．５〜２ｍ
ｌ使用する。融合促進剤としてＰＥＧ添加時にジメチル
スルホキシドなどを少量加えることも有効である。ＰＥ
Ｇ溶液を細胞に添加し、融合反応を１〜１０分間程度行
なった後、Ｄ　！ＶＩ　Ｅ　Ｍ培地或いはＲＰＭ１１６
４０培地などを１０〜５０ｍ１徐々に加え反応を停止す
る。融合反応停止後直ちに遠心し、上清を除去する。牛
胎児血清（以下ＦＣＳと略称する）を５〜２０％含むＤ
ＭＥＭ培地或いはＲＰＭ１１６４０培地に細胞を懸濁し
、９６穴培養プレートにリンパ球が１穴ああたりｌＸ１
０５〜５Ｘ１０６個となるよう分注する。次にヒポキサ
ンチン（１ｘ　１０’Ｍ）、チミジン（１，６ｘ　１０
’Ｍ）　、アミノプテリン（４ｘ　１０’Ｍ）を含むＤ
ＭＥＭ培地（或いはＲＰＭ１１６４０培地）、即ちＨＡ
Ｔ培地に換えていく。ＨＡＴ培地交換の方法は一般には
、翌日培養プレートにはじめに分注した容量と当容量加
え、その後、２〜３日毎にＨＡＴ培地で半量ずつ交換す
る。融合後１０〜１４日目にアミノプテリンを除いたＨ
Ｔ培地で２〜３日毎に培養液交換を続ける。融合細胞（
ハイブリドーマ）の増殖のさかんな穴の培養上清を種々
の分析法、例えばＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ等で目的の抗体産
生ハイブリドーマを選択する。得られた抗ＨＭＧ−１抗
体価をもつ抗体を産生ずるハイブリドーマを次にクロー
ニングする。クローニングには寒天培地中でコロニーを
ひろう方法、限界希釈法などがある。どの方法を用いて
もクローニングは２回以上くり返し、完全に単一クロー
ンとする。確立したクローンは、その細胞をｉｎ　ｖｉ
ｔｒｏ又はｉｎ　ｖｉｖｏ　　で培養することによって
単りローン性抗ＨＭＧ−１抗体が得られる。目的とする
モノクローナル抗体はこのようなりローンを培養した培
養上清から塩析、イオン交換クロマトグラフィー等の精
製操作により回収できる。また抗ＨＭＧ−１産生ハイブ
リドーマを組織適合性動物の腹腔内に移植し、増殖させ
、該動物の腹水中に産生されたモノクローナル抗体を精
製回収することもできる。

本方法によりヒト型のＨＭＧ−１と結合しうるモノクロ
ーナル抗体を作成することができる。

また本方法により分子Ｌ″Ｌ【約９０万のＩｇＭ。

１６万前後の他のタイプのイムノグロブリンを作成する
ことができる。

［作用］ 本発明のモノクローナル抗体は抗原−抗体反応によりＨ
ＭＧ−１と結合させて複合体を形成させることができる
。この複合体は細胞中に注入されたとき、核膜を透過し
て核内に移行する。

細胞質中に物質を注入する方ｌ−相は、マイクロピペッ
トを用いて直接細胞内に注入する方法（Ｇｒａｃ−ｓｓ
ｍａｎｎ、Ｍ、　ａｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ
ｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ。

ＵＳ、見、　３１３Ｇ　（１９７０）、赤血球ゴースト
を利用する方法（ｌｌｉｒｏｓａｗａ、　Ｍ、　ａｔ　
ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　２４９．４４９（１９７４）
）等が知られている。この時、物質をあらかじめ、ラジ
オアイソトープあるいは蛍光色素等で標識しておくと、
その物質の細胞内での局在を知ることができる。標識さ
れた物質を細胞質中に注入後、一定時間後、細胞を細胞
質両分と核画分とに分け、その両分中の標識物質の瓜を
定量することにより、物質の細胞内での局在を知ること
ができる。細胞の分画の方法は文献ｒ　Ｙａｍａｉｚｕ
ｍｉ。

Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、＋　Ｎａｔｕｒｅ　２７３．７８２
−７８４（１９７８）Ｊにある。

ここで開発した抗ＨＭＧ−１モノクローナル抗体だけ単
独で細胞質に注入される場合は、細胞質から核への標識
物の移行は観察されないが、該モノクローナル抗体をあ
らかじめ抗原であるＨＭＧ−１と共に混合し、充分反応
させてから細胞質中に注入すると標識物は核中に移行す
る現象が観察される。

以下に実施例により本発明の詳細な説明する。

実施例１ 文献ｒＧａｒｖｃｙ、　Ｊ、　Ｓ、　ａｔ　ａｌ、、　
Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ１＋＋＋ｎ＋ｕｎｏｌｏｇｙ：　
Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｔｅｘｔ　ｆ’ｏｒ　１ｎ
ｓｔｒｕ−ｃｔｉｏｎ　＆　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　３ｒ
ｄ　Ｅｄ、、　１５３−１５８　Ａｄｄｉｓｉｏｎ−Ｗ
ｃｓｌｃｙ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、、　Ｒｅａ
ｄｉｎｇ　ＨＡ　Ｊに従い、ウシ型ＨＭＧ−１（ウシ脚
線由来）、１分子に対し、６分子のＴＮＰ分子を化学的
に結合させたＴＮＰ修飾ＨＭＧ−１蛋白質５０μｇを完
全フロインドアジュバントとまぜ、８週令のＢＡＬＢ／
Ｃマウスに腹腔的注射した。１０日後に不完全フロイン
ドアジュバントとまぜた該蛋白質５０μｇを１０日毎に
６［１１ｉ１注射した。最後の感作後１０日後に５０μ
ｇのＨＭＧ−１蛋白質によりブーストした。４日後該マ
ウスから肺臓細胞をとり出し、４５％（Ｗ／Ｖ）　ＰＥ
０４．　０００．　　１５％（Ｗ／Ｖ）ジメチルスルホ
キシを用いて５Ｐ２１０細胞と細胞融合した。細胞融合
後、細胞を９６穴培養プレートに分注し、ＨＡＴ培地中
で培養した。該細胞を１４日間ＨＡＴ培地中で増殖させ
、ついで徐々にＨＴ培地にうつした。抗体産生ハイブリ
ドーマの選択はＲＩＡによりなされた。すなわち０．２
μｇ／ｍｌのＨＭＧ−１でコートされた後２％子ウシ血
清でコートされたポリビニルクロライドマイクロタイタ
ープレートを生理食塩水で洗浄した後、ハイブリドーマ
培養上清１００μＡをマイクロタイタープレートの穴の
中に入れ４０”Ｃ１−夜放置した。該プレートを生理食
塩水で洗浄後１２５Ｉで標゛識した抗マウスＩｇＧウサ
ギＩｇＧＦａｂフラグメントを加え、室温で４時間放置
した。該プレートを再び生理食塩水で洗浄後完全に乾か
し、γ−カウンターにより、ラジオアクティダイティー
を測定した。ラジオアクティダイティーの陽性のハイブ
リドーマすなわち抗ＨＭＧ−１抗体を産生じているハイ
ブリドーマを限界希釈法により２回クローニングし、本
発明のモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマを
得た。

本操作により３株の陽性ハイブリドーマ、ＦＲ−１、Ｆ
Ｒ−２及びＦＲ−３を得た。

こうして得たハイブリドーマ、ＦＲ−１株を５匹のＢ　
Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウス腹腔内に注射し、１０日後に
モノクローナル抗体を含む腹水１０ｍ１を得た。

得られた腹水１（１ｍｌを遠心し上清を集め、０．７倍
容の１００％飽和硫安を加えた後、１０分間４℃、２０
００Ｍｇで遠心した。沈殿を４０％飽和硫安で３回洗浄
し、１０ａ＋ＭＥＤＴＡ溶液に溶解し、２０ｍＭリン酸
緩衡液（ｐｉ（８，０）に対して透析した。透析後、２
０ｍＭリン酸酸緩衡液（ａｌ１８．　０）で平衡化され
たＤＥＡＥセルロースカラムにより分離した。すなわち
、２０ｍＭから０．３Ｍのリン酸緩衡液の直線濃度勾配
をがけ、蛋白質を分離した。１５ｎｇの抗ＨＭＧ−１モ
ノクローナル抗体が０．２Ｍリン酸緩衡液付近で溶出し
てきた。

二次元拡散法により精製したＦＲ−１産生抗体はＩｇＡ
タイプであることが確認された。また１、５Ｘ８０ｃｍ
のセファデックスＧ−２００にょるカラムクロマトグラ
フィーにより分子量を推定したが、ＦＲ−１産生モノク
ロ一ナル抗体は分子；約１５万のＩｇＧと同一画分に回
収され、その分子量は約１７万と推定された。

精製したこのモノクローナル抗体は抗原として用いたウ
シ型ＨＭＧ−１だけでなく、ヒト型のＨＭＧ−１とも結
合した。すなわちヒト培養細胞、ＦＬ細胞から精製した
ＨＭＧ−１を１２５Ｉで標識し、精製したこのモノクロ
ーナル抗体をセファロースに結合し、免疫沈殿法を行っ
たところラジオアクテヴイティーはセファロースとの沈
殿に移行した。

実施例２ １２５■で標識された抗ＨＭＧ−１モノクローナル抗体
をＨＭＧ−１と共に又はＨＭＧ−１なしで４℃−夜放置
した後、赤血球ゴースト法により、ＦＬ細胞に注入した
。すなわち、１．４μｇ　／　ｍｌの１２５■で標識さ
れた抗ＨＭＧ−１モノクローナル抗体と２．２ｍｇ／ｍ
ｌのＨＭＧ−１とを含む赤血球ゴーストあるいは、１．
４μｇ　／　ｍｌの該モノクローナル抗体と２．２μ＋
ｇ／ｍｌの卵アルブミンを含む赤血球ゴーストをセンダ
イウィルスを用いて、同数のＦＬ細胞と融合した。融合
後、細胞混合液は、１０％の子ウシ血清を含むＭＥＭ培
地（以下１゜ＣＳ−ＭＥＭと略称する）で３回洗った後
、さらに融合していない赤面液ゴーストを完全に除くた
め１５５１１１ＭＮＨＣＪ、１０ｍＭＫＨＣ０，１ｍＭ
Ｎ　ａ　２　　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　（ｐＨ７、０）溶液中
に懸濁し、０℃で７分間放置した。さらに一度ＦＬ細胞
を１０　ＣＳ−ＭＥＭで洗った後、ＩＯＣＳ−ＭＥＭ中
で培養した。

融合、３０分、１時間、６時間後に細胞をトリプシンと
ＥＤＴＡを用いて浮遊させ回収した。該細胞を２０１１
１ＭＫＣＪ２　５ｄＭｇＣ４５０ｍＭＭＴ　ｒ　ｉ　ｓ
　（ｐＨ７，６）溶液を用いて一回洗った後、０、　５
％Ｔｒｉ　ｔｏｎＸ−１００，１（１＋ＭＮａＣＩｔ、
１．５ａ＋ＭＭｇＣｊ２２１０ｍＭＴｒ　ｉ　ｓ　（ｐ
Ｈ７，４）溶液中でホモジナイズし、遠心し、上清と沈
殿に分けた。上清を細胞質画分、沈殿を抗菌分として用
いた。　　　■標識モノクローナル抗体をＨＭＧ−１と
共にＦＬ細胞に注入した時には３０分後に注入したラジ
オアクティヴイティーの１５％が核両分中に存在し、１
時間後には約２５％にまで増え、そのまま６時間後まで
その状態は続いた。一方１２５■標識モノクローナル抗
体だけで細胞に導入した場合は、導入したラジオアクテ
ィヴイティーの２〜３％のみが核両分にあるだけであっ
た。本実施例により本発明のモノクローナル抗体が単独
ではなくＨＭＧ−１とともに核内に移行することが証明
された。

［発明の効果］ 本発明のモノクローナル抗体は核内非ヒストン蛋白質と
複合体を形成し核膜を通過して核内に移行することがで
きるので、核内非ヒストン蛋白質の細胞内、特に核膜近
傍でのこの蛋白質の挙動を調べるために有用であり、細
胞レベルでの生体の診断用の試薬として有用であると考
えられる。

特許出願人東洋曹達工業株式会社 同　内田貌

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）核内非ヒストン蛋白質ハイモビリティーグループ
   −１と共に細胞質から核に移行するモノクローナル抗体
   。
2. （２）核内非ヒストン蛋白質ハイモビリティーグループ
   −１と共に細胞質から核に移行することのできるモノク
   ローナル抗体の産生能を持つクローン化されたハイブリ
   ドーマ細胞。
3. （３）核内非ヒストン蛋白質ハイモビリティーグループ
   −１で免疫した哺乳動物の抗体産生細胞と骨髄腫細胞と
   の間にハイブリドーマを形成させ、該ハイブリドーマを
   クローン化して核内非ヒストン蛋白質ハイモビリティー
   グループ−１に対する抗体を選択し、該クローンを哺乳
   動物腹腔内又は培地中で増殖させ該哺乳動物腹水中又は
   培地中に抗核内非ヒストン蛋白質ハイモビリティーグル
   ープ−１抗体を産生させ、これを分離回収することを特
   徴とする核内非ヒストン蛋白質ハイモビリティーグルー
   プ−１に対するモノクローナル抗体の製造法。