JPH06506927A

JPH06506927A - Ｐｅｍムチン縦列繰り返し配列特異性単クローン抗体の最小識別単位

Info

Publication number: JPH06506927A
Application number: JP4508061A
Authority: JP
Inventors: コートニー−ラック，　ナイジェル　ステファン
Original assignee: キャンサー　セラピューティクス　リミテッド
Priority date: 1991-04-23
Filing date: 1992-04-23
Publication date: 1994-08-04
Anticipated expiration: 2017-05-13
Also published as: GB9319300D0; JP3280966B2; US5591593A; DE69222956T2; DE69222956D1; US5833943A; EP0672063B1; EP0672063A1; GB9108652D0; US6174691B1; GR3025982T3; US6107469A; ATE159727T1; ES2111066T3; DK0672063T3; WO1992018534A1; GB2270078A; GB2270078B

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

ＰＥＭムチン献列繰り返し配列特異性単り

【コー７抗体の最小識別Ｗ位本発明は、免疫反応性化合物、特に、遺伝子工学的手法で製造された抗体に関する。抗体は、病原微生物による感染を防止する一方、自己免疫、アレルギー、炎症、あるいは拒否反応のような他の免疫反応にも係わる等、免疫系で重要な役割を果たしている。抗体は、それぞれ固有の特異性を有し、かつ抗原の非常に類似した抗原決定基を識別することができる。そして、他者に対するこの特性により、抗原の同定、存在位置の特定、定量等には欠がせない存在となっている。抗体は、元来免疫化された動物から得られる。しがしながら、複数抗原に対し４！興性を有したり、または複数の同位体でラベルされた種々の抗体が存在する抗血清では、抗体源として抗血清を用いた場合、再現性のある研究を行うことは困難である。一方、プラズマ細胞の腫瘍である多発性骨髄腫がらは、単一の抗体が多量に産生されることが知られており、免疫グロブリンの構造に関する多数の報告が、骨髄腫タンパクを用いた研究からなされている。そして、バイブリドーマ技術の発達に伴い、必要な特異性を有する単りローノ抗体を、基本的には常時供給することが可能となっている。抗体は、非共有結合とＳ−５結合とで連結されｔ：ポリペプチド鎖から構成され、一対の相同なし鎖（ｌｉｇｈｔ　ｃｈａｉｎ、２１４基のアミノ酸配列からなる）が、２個の相同なＨＩｌ（ｈｅａｖｙ　ｃｈａｉｎ）に結合し、左右対称の構造を形成している。このポリペプチド鎖には、ペプチド分節の短配列が球状のドメインとして折り量まれでおり、Ｈ鎖はアイツタイブからなる４ない１，５個のドメインを有し、Ｌ鎖は２個のドメインを有している。また、それぞれの鎖のＮ末端は、可変部（Ｖ部、ｖｏまたは■、）を構成している。一対の■。部、７５部は抗原結合部をなし、かつ抗体の特異性に寄与している。それぞれの鎖の残りの部分は不変部（０部）と呼ばれ、例λば、ＦＣレセプターの結合や、補体の結合、異化、あるいは胎盤におＩする物質通過等のような作用に分子レベルで関与している。免疫グロブリンは、興なる生理活性を有するアイツタイブ（ヒトの場合、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ］〜４．ＩｇＡ−２、およびＩｇＥ）に応じて異なる０部を有している。殆どのアイソタイプはヒンジ部を介してＣＨｌとＣ１２に分けられ、その結果、免疫グロブリン分子はこのヒツジ部により屈曲可能となっている。免疫グロブリン分子はヒンジ部の近傍にて、バパイノという酵素によりＦ、ゎおよびＦｏという部分に分断される。マウス単りローノ抗体は研究には不可欠な存在である。しかし、ヒト免疫グロブリンは、患者の免疫系に対してより効果的に作用することから、診断や免疫療法等に適用する場合には、より望ましいものである。マウス抗体をヒトｊこ投与すると、種間差異によりアレルギーを起こし、その結果、血清病や免疫陵合体病を誘発する可能性があるが、これは、同種の単クローン抗体を繰り返し投与することにより予防できる。このことは、ヒトの抗体が投与されたマウスの単クローン抗体を中和し、かつその素早いクリアランスの原因となるという臨床試験の結果にも示されている。一方、白色マウス−ラット間のハイブリドーマは容易に得ることができるが、ヒト単りローノ抗体の産生はまだ部分的成功しか収めていない〇マウスーヒト間のハイブリドーマは、多くの場合遺伝的に不安定である。また、ヒト−ヒト間のハイブリドーマの形成は、ハイブリドーマに適した恒常的なヒト細胞系と、感作されたヒトＢ細胞の欠如とにより阻害されている。更に、倫理的な配慮から、ヒト生体内における免疫処置は非常に制限されている。単クロー７抗体産生のための他の方法に、遺伝子のトランスフェク７璽ンがある。この方法によれば、野生梨の１部鎖のみならず、新蜆な免疫グロブリンや突然変異体を、試験管内で産生ずることができる。すなわち、適当な遺伝子を、マウスの多発性骨髄腫あるいはハイブリドーマ等の培養細胞にトランスフェクンＢノすることにより、結合親和性、アイソタイプ、あるいは由来する種等について必要な特性を有する抗体を得ることができるのである。遺伝子のトランスフ二り／１１ノによれば、ハイブリドーマの手法が内在する問題の多くを回避できる。そのため、ヒトまたはヒトＣ部のキメラ抗体を、免疫原性の問題なしに、または問題が発生しても最小に抑制しつつ得ることができる。また、トランスフエタン９ノを行ったマフス細胞をマウス腹腔内に注射して、このマウス細胞を増殖させることにより、腹水中から多量の抗体が回収可能なことも、マウス−ヒト間あるいはヒト−ヒト間のバイブリドーマ形成に対して有利な点である。最初のマウス−ヒト間のキメラ抗体は、コリンリン酸にＬＰ！Ｒ性を有する多発性骨髄１１Ｓ１０７由来のｖ部の遺伝子を再配列し、これを発現させることにより得られた。この場合、まずｓＶＨ部はヒト由来のｃＲであるＣ１０またはＣ７２に結合され、７５部は、ヒト由来のＣＫ［１］に結合された。これらを同一の細胞内で発現させたところ、ＨＩＭとＬ鎖は、Ｈ２Ｌ　、四量体として分泌された。この抗体は抗原と結合し、かつ抗原に結合するトメイノを形成するよう適当に折り畳まれたポリペプチド鎖からなる３基の抗−抗原決定基型クローン抗体と反応した。Ｂｏｚｕ璽】らの実験には、再配列されたマウスのＴＮＰ特異性μ遺伝子および、遺伝子を、プラズマサイトーマやハイブリドーマ系に対してイノフェクンツンさせると、ハプテンと結合して補体の作用に依らない溶血を起こすＩｇＭ五量体が生じることが示されている［２．３］。この場合、ＴＮＰ特異性■。およびｖＬ遺伝子はそれぞれヒトのＣμおよびＣ，分節に結合され、その結果、野生グマウス抗体としての特徴を示すマウス−ヒトキメラ１ｇＭが得られる。また、細胞膜上に抗原が架橋されたマスト細胞の脱ｌｊ１粒を誘発させるマウス −ヒ）＋メラＩｇＥ二■体も得られている［５．　６］。一方、癌の治療におけるキメラ抗体利用の可能性については、腫瘍の表面に結合する銀を識別するマウス単クローン抗体１７−ＩＡに由来するｖ部と、ヒトのＣ１０から成っている抗体がある［７］。このキメラ抗体は、元のマウス単クローン抗体と同じ結合能力を持っている。更に、ヒトの表皮性癌腫に結合する抗原に対し特異性を有するマウス−ヒトキメラ抗体には、ヒトの表皮性癌腫に対し結合能力を持つものがあることも知られている［８］。このように、マウスのＶ部はヒトのＣ部と結合させることができる。そして、ゲ１歯類の抗体を人間に適応させるための更なる過程としては、ヒト由来の骨格残基と、マウス抗体由来の補体識別部（ＣＤＲｓ）とのハイブリッドからなるＶ部の合成が挙げられる。ＮＰ特異抗原の場合、それは、抗ＮＰハイブリドーマ由来のＣＤＲ５を、ヒト骨髄腫のタフバク骨格に導入することによって得られ、その結果、抗原への特異性が付与される［９］。ハブテン抗原に対し得られたこの結果は、ヒトＴ細胞表面抗原、あるいは鶏卵リゾチームに対する抗体にも適用されている。すなわち、ＣＤＨの移植は、キメラ抗体の形成を容易とするばかりではなく、ヒト以外の抗体のみから由来するＣＤＲを用いた治療薬の製造をも可能このうち、ＣＤＲ３は、抗体の特異性を決定する際に特に重要となるものである。Ｔａｕｂら［５２］は、血小板フィブリ／−ゲン受容体に対する抗体の特異性が、主として、抗体のＩ（鎖由来のＣＤＲａ中のＲ’ＶＤ配列により決定されていることを示した。また、１ＦＩＩＩｉａｓｓら［５３］は、抗体のＬ鎖由来のＣＤＲ２から合成されたペプチドを用いて、抗体と受容体との相互作用を阻害した。すなわち、ＷｌｎｔｅｒとＭＩＩｓＬｅｌｎ　［５４］により示唆された”最小識別単位”の存在は、概念的にはあらゆる抗体にあてはまると推察される。本発明者らは、今回、上皮の腫瘍に関するムチン分子に特異的なマウス単クローン抗体の”最小識別単位“が、ＥＰＰＴというアミノ酸（Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ）配列であることを見い出しｌ；。すなわち、本発明の目的のうちの一つは、ＥＰＰＴアミノ酸配列を有する分子を提供するものである。以下、全てのペプチドはＨ２Ｎ、、、Ｃ０ＯＨとして記載し、また、アミノ酸は通常り体として存在するものとした。本発明に係る分子は、ＥＰＰＴという配列からなっている。この短いペプチド自体が以下に述べるような結合性を有するか否かについては後述するが、もし結合性がないとすれば、ターゲットに結合する分子の配列はより長いものと考えられる。実際のところ、ＥＰＰＴ配列は、例えば、ＥＰＰＴＲＴＦＡＹ、ＲＥＰＰＴＲＴＦＡＹＷＧ、あるいはＭＹＹＣＡＲＥＰＰＴＲＴＦＡＹＷＧＱＧ、その他ＥＰＰＴ配列を含むあらゆるフラグメントのように、Ｎ末端および／またはＣ末端に延びる更なるアミノ酸を含んでいることが望ましい。このペプチドは、抗体のＶ部骨格中のＣＤＲ（望ましくはＣＤＲ３）の代わりに挿入されるか、このＣＤＨの一部をなすと考えられる。更に、このＶ部骨格は、ヒト由来のものであることが望ましい。このように、このペプチドは（望ましくはヒトの）抗体の一部を形成し得るものである。このペプチドは完全な（望ましくはヒトの）ｖＨ部またはｖＬ部の一部を形成するのに適し、更に、完全な（望ましくは人体に適応した）抗体を形成する他の部分にも連結可能である。また、ＦＩｋ＋　（Ｆｅｂ）２＋　Ｆｌ７．＠ＣＦｕあるいはｄＡｂ分子のような、抗体中のより小さなフラグメントの一部や、ファージの一部を形成してもよい。以下、単離されたＥＰＰＴペプチド自体、あるいは、３０以下のアミノ酸配列からなるＥＰＰＴ配列含有ペプチド、ＥＰＰＴ配列を含むポリペプチド、タンパク質、抗体形成フラグメント、ファージ等）：ＰＰＴ配列を含む分子を、一般的に、”本発明に係る分子２と呼称するものとする。本発明に係る分子では、ＥＰＰＴ配列の一部が分子の表面に露出し、他の分子との相互作用が可能となった状態で最も効果を発揮する。しかし、このような分子は、ＥＰＰＴ配列の一部が包埋されていても、それを露出させるよう構造を変えることができる。例えば、本発明に係る分子を、細菌内では不溶性タンパクとなる一方、試験管内にて発明に係る方法で使用する際には発現可能な構造をとる分子とすることも可能である。本発明に係る分子は、この分子が特異的に結合するムチンの研究または分離精製、あるいはムチン産生細胞の推定または処理に関する多くの目的に使用可能である。例えば、ムチンは細胞から放出されるので、この分子を、く例えば、この分子を放射線でラベルし、その抗原に特異的な抗体の間で、固定された抗原を競合させる等の方法により、）血液または血清に基づく、体内におけるその細胞の存在に関する臨床検査に用いることができる。また、他の具体例としては、本発明に係る分子を、ンンチグラフ測定用の放射性物質、細胞毒性物質、放射性同位体、無毒の前駆物質を細胞毒性化する酵素、あるいは、例えば癌細胞や細胞刺激性化合物のような、体内のｍ胞と複合体を形成するため免疫系を活性化させる化合物等と結合させたものがある。これらの複合体は、ＥＰＰＴ配列を含む本発明に係る分子からなる”結合部位”と、放射性物質、毒性物質、酵素等からなる”作用部位”とを有している。一方、本発明に係る分子は、単一で（あるいは、特に生体内における安定性を増すため、不活性のポリペプチドを添加し、このペプチドとともに、完全な抗体または抗体のフラグメントを形成して）、単にムチンの活性阻害、特にムチンと他の化合物との結合性に対する物理的干渉のためにも使用される。この複合体（ペプチドまたはポリペプチド）における結合部位と作用部位とは、参考文献［１８］に一般的に説明されているような、ポリペプチド同士の通常の架橋結合により互いに連結されている。その例としては、一方の部位がチオール基に富み、他の部位が、例えばヨード酢酸のＮ−ヒドロキシサクンニイミドエステル（Ｎ１１夏Ａ）、あるいはＮ−サク／ニイミジル−３（−２−ピリジｌレジチオ）ブロビオノ酸エステル（ＳＰＤＰ）のような、チオール基と結合可能な二価性物質と反応している場合が挙げられる。また、例えば、ｍ−マレイミドベンジル−Ｎ−ヒドロキシサクンニイミドエステルによりなされるアミド結合およびチオエチル結合は、生体内では一般にジスルフィド結合より安定である。この複合体の作用部位には、例えば、Ｂｅ＋＋ｓｂａｗｅらの報告［１９〜２１］、あるいはシアン化物放出系［２２］における化合物のように、無毒性前駆物質を細胞毒性化する酵素が使用される場合がある。この複合体には、完全な酵素が必要なわけではないが、触媒を行う部位はもちろん必要である。これには、単クローン抗体中にあって、触媒しようとする反応中に含まれる化合物を増加させる、′アプザイム”と呼ばれる部分が使用される。その結果、抗体は、その反応において酵素としての機能をも果たすことができる。この複合体は、ゲル濾過あるいはアフィニティークロマトグラフィーにより精製可能て、かつ、ペプチドの免疫活性と酵素活性の、２つの生理活性が試験される。ペプチドの免疫活性は、イムノソルベントを用いた酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）、あるいは生細胞中における放射線免疫測定により測定される。また、酵素活性は、β−グルフ／ダーゼを基質とし、グルコース残基が加水分解された際の吸光度の変化から測定される。これには、例えば、０−ニトロフェニル−β−Ｄ− グルコピラノシド（ｏ−ＮＰＣ）から遊離したジニトロフヱノールの量を、４０５ｎｍでの吸光度から測定する方法がある。この複合体の安定性を測定する際には、ＦＰＬＣによるゲルｍ過後、３７°の血清中で保温し、試験管内における安定性を測定する。また、生体内における安定性を測定する際には、マウスに複合体を注射し、注射後のマウス血清中における複合体の安定性を経時的に測定する。更に、複合体の形成前に、ペプチドおよび酵素をそれぞれ１２ｓＬ　＋ｕｌでラベルし、マウス体内における複合体、あるいハ遊離のペプチドおよび酵素の挙動を測定する方法もある。一方、この複合体は、遺伝子組替え技術による化合物、すなわち、この複合体の二つの部分が隣接もしくは符号化されたペプチドによりその特性を失うことなく分かれて符号化された部分を有する、−列のＤＮＡに由来する化合物としても得ることができる。ここで、これら二つの部分は、完全に、もしくは一部重複していると推定される。また、このＤＮＡは、適当なポストを用いて、公知の方法で発現させることができる。更に、この複合体を任意の方法で、通常は、静脈注射、腹膜内注射、あるいは嵩包内（ＩＰ４えば、膀胱癌の場合には膀胱内）に、通常の滅菌方法で、非熱処理された希釈液や媒質（例えば、静脈注射の場合には等張の塩溶液）を用いて非経口的に投与することも可能である。複合体は約１日程度で標的細胞に結合し、血流から排除されるので、（必要であれば、）通常−回分の注入量、または予想される膿瘍に応じて前駆物質を投与する。投与した複合体が免疫原性のものである場合には、必要に応じ、サイクロスポリンや他の免疫抑制剤を、複合体の投与期間以上の長期間にわたり投与してもよい。しかし、この処置は通常不要である。複合体の投与と前駆物質の投与との間隔は、常法により最適化される。腫瘍が形成された細胞または通常の細胞と、複合体との比は、（少なくとも以下の静脈注射の場合には、）４〜６日後に最高となるが、この時には、全ての複合体が、ａｌｌに結合している半面、ダラム当りの複合体量は、投与時に比べ減少する。従って、複合体の投与と前駆物質の投与とのＩ！ｋｊ！ｌな開隔は、酵素濃度の最大値と、Ｉ１１瘍が形成された細胞と通常の細胞との最適な量的比率との関係によって決まる。また、複合体の投与量は、常法に則って選択される。例えば、酵素と、毒性前駆体としてのアミグダリンとを静脈注射する際には、１〜５０日間、体表部１立方メートルに対ｌ７、−日当り０．１−１０ｇ、望ましくは１．Ｏ〜５．０ｇを投与する。一方、経口投与の場合には、−日当り０．０５〜ＩＯｇ、望ましくは１．　０〜５．Ｏｇを３回に分け、１〜５０日間投与する。他の複合体を投与する場合も、特に、腫瘍のタイプ、進行段階、形成部位および帝者の体重に注意したうえ、先の場合と同様、常法に月１１７で選択する。なお、上記処置の期間は、複合体の作用の速度および範囲の双方に依存する。この複合体は、基本的には、ＥＰＰＴにより識別されるムチンを選択的に放出する腸瘍または他のあらゆる細胞を、必要に応じて適当な前駆物質とともに破壊するものである。また、このムチンは、肺、胸部および泌尿器系（特に膀胱）を含む上皮細胞の腫瘍の多くに見出される。この複合体は、基本的にはヒトへの施用を目的とするものであるが、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタおよびヒツジのような他の動物にも適用可能である。本発明に係る方法は、特に、自然状態の膀胱癌に、抗体−酵素複合体とアミグダリンとを静脈注射する際に適した方法である。発明者らの研究によれば、放射線で標識された抗体を上記経路を介して処置したところ、抗体を投与しない場合と比較して、腫瘍形成／通常細胞比が向上するという結果が得られた。膀胱癌はヒトの全悪性腫瘍のうち２％を占め、かつそのうち約７０％は診断時においては表層部のものである。また、外科手術による削除後、そのうちの約８０％が再発し、かつその１０％は腫瘍が進行して予後も不良である。本発明に係る複合体を診断に用いる場合、その作用部位は、通常、例えばテクネチウム−９９ｍ　（””Ｔｃ）　、ヨウ素−１２３（’２”ｌ）のようなシンチグラフ測定用の放射性物質、あるいは先のヨウ素−１２３の他、ヨウ素−１３１、インジウム−１１，１、フ１素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マ／ガノ、鉄のような核磁気共鳴（ＮＭＲ）（または磁気共鳴（Ｍ　Ｒ＋　１）用の放射性元素を有している。特に、この複合体を腫瘍の選択的破壊に使用する場合、作用部位には、ヨウ素− １３１，レニウム−１８６、レニウム−１８８、あるいはイツトリウム〜９０のように、周囲の細胞を破壊するのに十分なエネルギーを有する放射性元素か、メトトレキセート、アトリアマイノン、ビッカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンプラスチ／、エトボ／ド）、ダウノルビシンその他の挿入剤のような、細胞毒性化学物質を用いる。これら、放射性その他のラベルは、常法により複合体に導入される。例えば、ＥＰＰＴ配列を含むペプチドは、例えば水素の代わりにフッ素−１９を用いた適当なアミノ酸前駆体を用いて、生合成あるいは化学的方法により合成される。このような化合物では、ＣＤＲ３が放射性でラベルされる。なお、１ｌｌｌｂ　７　ｃ、１２３！、１＃８Ｒｈ、　ｌｌｌｌＲｈ、または目’Ｉｎのようなラベルはペプチドの７ステイン残基を冒す可能性があり、かつイツトリウム−９０はりジン残基を冒す可能性がある。これらの導入方法は、参考文献［２４］に記載されている。また、ヨウ素−１２３の導入に際しては、Ｉｏｄｏｇｅｎ法［２３］が使用可能である。次に、本発明に係る分子（ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク）がエンコードされた核酸の配列についても述べる。これらの配列は、ベクターと、（遺伝子の）発現手段とに含まれ、かつこれらベクターと発現手段とは、ホスト（大腸菌（Ｅ、Ｃｏｌ＋）、Ｓ、　ｃｅｒａｖｉｓｉｄａｅのような酵母、骨髄腫細胞のようなリンパ球細胞系に代表される哺乳類の細胞、トランスジェニック動物、あるいは植物等）内に含まれている。このうち、特に、Ｂ−リンパ球を除く細胞においては、形質転換された遺伝子が、ナストの細胞の培養と、本発明に係る分子の単離による、本発明に係る遺伝子の発現および分子の形成の主体となる。すなわち、本発明における以下の記載は、ＥＰＰＴ配列を含むペプチド、ポリペプチド、タンパク、またはファージがエンコードされたポリヌクレオチドの提供に関するものである。このようなポリヌクレオチドは、Ｓａｍｂｒｏｏｋらのマニュアル［５５］において知られているような方法で考案されたものである。特に、ファージに抗体（本発明の場合は、ＥＰＰＴ配列）を組み込んだ、”　Ｐｈａｇｅ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”の技術は、ｌ１ｌｅｃａｆｆｅｒｔｙら［５６］により用いられている。ＥＰＰＴ配列の存在部位は、ファージのＩＩ＋遺伝子タンパクのＮ末端部となっている。また、ＩＩ＋遺伝子タンパクは、ファージの先端にて発現する。更に、発現可能なポリヌクレオチドをフードする／−フェンスは、（１）始めにコードされる／−フェンスに、ＥＰＰＴ配列を含むペプチド、ポリペプチド、またはタンパクがエンコードされている細胞がある、（１１）コードされたノーフェンスに対応するＤＮＡが得られる、（ｉｉｌ）このＤＮＡが、土ストＤＮＡの適切な発現部位に挿入される、というステップを経て形成される。ここで、ステップ（１）遂行のための手技は、一般的な免疫学的手法および単クローン抗体の産生方法に類似のものである。本来、動物は、抗体および例えば肺臓のような細胞免疫系細胞により免疫化されている。従って、骨髄腫細胞との融合による不易化も随意である。一方、最近の技術では、Ｂ−リンパ球の単個細胞か、ＥＢＶ−不易化細胞を用いる。また、ステ、プ（ｉｆン遂行のための手技は、Ｐ　ＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｓ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔ−ｉｏｎ　）法に基づき、７部骨格に特異的なプライマーを用い、細胞から、ＥＰＰＴ配列をｑｔＩｊｌｉ的にエンコードする（か、よりＥＰＰＴ配列をエンコードする活性の高い）ＤＮＡを分離することである。こうしたＤＮＡの更に単一なものは、ＰＣＲ法、化学合成、生体内における再生産等任意の方法で合成できる。更に、ステップ（１ｉｉ）遂行のための手技は、プロモーターと、ホストに遇した他の制御ノーフェンスとを用いた一般的な組替えＤＮＡ連結技術である。以下に、本発明の具体的内容およびその実施方法について、図面に基づいて更に詳しく説明する。図１は、Ｓａ！１−Ｂａ■旧により切断された転回でクローニングされたヒト０１部の遺伝子を示すものである。γ、のＣ８１，Ｃ，２、ＣＨ３エキソンおよび γ４のＣＨｌ・Ｃ，２、Ｃ，３エキソ／はそれぞれ白ヌキおよび格子縞で示されている。また、野生型γ、のヒンジ部は、斜線で示された独占の工牛ノ／ｌと、白ヌキで示された同一のエキソン２，３．４とからなる４つのエキソンによりエンコードされている。一方、野生梨７４のヒンジ部は、横線で示されたエキソンのみによりエンコードされている。小さな矢印の部分はイントロン中の５ｔｕｌの認識部位で、リンカ −の挿入によりＰｖｕｌの認識部位に変化している。１〜６は、いずれもヒンジ部が改変されたもので、１および２はγと、γ４のヒンジ部が入れ替わったものである。３〜６はいずれもγ、の改造で、３はヒンジ部がエキノン夏のみのもの、４はヒンジ部がエキソン４のみのもの、５はヒンジ部のエキンノがエキンン１．　２．　３．　４゜２、　３．　４の順で配列しているもの、６はヒンジ部をエンコードするエキソンがないものである。また、図２は、固定されたムチン受容ペプチドに対する各種ＥＰＰＴペプチドの結合性を示したもので、図３は、図２の結果を棒グラフで示したものである。 −りｍ：Ｊｕ月ｉ作トランスフエタノ３ノされた　か′の　≦　−の１９８３年以来、免疫グロブリノＨ鎖またはＬ鎖をコードするＤＮＡをリンパ球細胞系に導入しようとするさまざまな試みがなされてきた［２５〜２８コ。これらの全てにおいて、免疫グロブリンポリペプチドをコードするＤＮＡは、ｇｐｔまたはｎｅｏ系のプラスミドをベクターとしてクローニングされたもので、これらのプラスミドは、リノ酸カル／ウムまたはＤＥＡＥ−デキストラフ等、ＤＮＡの取り込みを促進させる物質との共沈か、プラスミドの母体たる大腸菌のスフェロプラストとリンパ球細胞系との融合のいずれかの方法により、リンパ球細胞系に導入されていた。その後、エレクトロｆ−レー／Ｍンが、多様なリンパ球細胞系にＤＮＡを導入する効果的な手法として広く用いられるに至った。そして、これらの実験および後の実験から、トラノスフェクンヲ／された遺伝子が、特定の細胞系から発現する傾向があることが明かとなっている。換言すれば、骨髄腫細胞ではトランスフェク／！＋ンされた遺伝子は多量に転写され、かつ多量の抗体が産生されるのに対し、ｐｒｅ −ＢおよびＢ細胞系では、−入された遺伝子はより低水準でしか発現せず、更に、非リンパ球細胞系では、導入された遺伝子は正しく発現しないのである。従って、骨髄腫細胞は、抗体の産生による免疫グロブリン遺伝子の転位が確認可能で、かつタンパク合成能が高いという点から、抗体遺伝子の導入とその発現には最適なホストであると言える。これらの典型的なものとして、必要な抗体のＨ鎖および／または！、鎖を、ベクターであるｇｐｔまたはｎｅｏ系のプラスミドにクローニングする場合がある。この場合、導入される免疫グロブリンの遺伝子は、真核細胞内で発現するベクター内にクローニングされる必要がある。最も一般的なものとしては、Ｂｅｒｇら［４２〜４４］により確立された。　ｐＳＶ−２プラスミドが用いられる。これらのプラスミドは自己複製能力と、細ｌの細胞内から選別する際のマーカーとを持ち、かつ遺伝子操作に際しては、多（のＤＮＡが容易に得られるという利点を有している。更に、これらのプラスミドをベクターとした場合の他の特長として、真核細胞内からの選別に際して優れたマーカーを有する点がある。このマーカーは、ＳＶ４０の上流側プロモーターの制御下にて転写される細菌由来の遺伝子で、ＳＶ４０ンークエンスのスプライシングとポリアデニル化により、真核細胞の３′末端に導入される。これらの識別マーカーは、遺伝的に優性で、しかも通常の細胞の表現形に識別し得る変化を生じさせるものであるため、ホストの細胞系を、薬品等のマーカーでラベルせずに済むという点でＩＩ要である。これらのマーカーとして選択されるもののひとつに、大腸菌の遺伝子がエンコードする、本すンチンーグアニンー士スホーイボンルトランスフェラーゼ（ｇｐＬ）がある。この酵素によれば、類似の内在性酵素と異なり、キサンチンを牛サンチンｌ−リン酸の前駆体として用いることが可能で、かつ細胞にキサンチンを供給し、イノノンｌ−リン酸からキサンチン１−リノ酸への転化によるプリン生合成を阻害する物質であるミコフェノール酸の存在下における細胞の生存性を向上させるものである。また、これらのマーカーとして第二に選択されるものとしては、ＴｎＳ　）ラノスヂゾ／由来のｎｅｏ遺伝子がある。この遺伝子は、８０Ｓリポソームに作用して真核細胞のタンパク合成を阻害する抗生物質の一種である、ｃ４】８を活性化するナスナトランスフェラーゼをエンコードするものである。このようなプラスミドである、ｐｓＶ２ｇｐｌおよびｐｓＶ２ｎｅｏ　（図１参照）は、ｐＢＲ３２２由来の自己！１［製能力と、＾璽ｐＲ由来のβ−ラクタマーゼ活性を有している。更に、最近開発されたベクターであるｐｓｖ１８４ｎｅｏでは、Ｃｍ”遺伝子と、ｐＡｃＹｃＩ８４プラスミド由来の自己複製能力とを有している［４５］。また、これらｐＢＲとｐＡＣＹＣ由来のプラスミドは共存可能で、かつ細菌の体内で競合することなく増殖可能である。これらのベクターがマウス細胞内のエビソームのように複製されるかは明かではないが、むしろ、染色体内に取り込まれるようである。これらのベクターは、必要な抗体を得るための安定した形質転換体として有用である。一方、上流側にポリオーマウィルスの遺伝子を含むｐｓｖｓベクターは、マウス細胞１個あたり数千の単位で複製可能であるものの、免疫グロブリンの遺伝子を過渡的にしか発現できない［４６］。免疫グロブ１７７遺伝子を最も効果的に発現させるＤＮＡ配列の正確な範囲は、まだ完全には同定されていない。初期の実験では、完全なゲノムＤＮＡを、側方の数キロベースの／−フェンスとともに用いていたが、実際のところ、抗体の遺伝子を構成するＩ）ＮＡの殆どは、イントロンに座位し、かつその多（は単離可能と推定される。マウスのＩ（鎖が座位する主たるイノトロンは、他に転写促進因子を含んでいる［２９，３０，２６］が、この因子は、免疫グロブリフ遺伝子の上流側に位置するイントロンから単離できる。すなわち、免疫グロブリンの１１鎖が座位する主たる他のイントロンの多くは、トラノスフェクン１ンの後における抗体の産生量を減することなく、除去可能となっている［３１］。免疫グロブリン遺伝子内における他のイントロンが、抗体産生に必須であるかについての明確な証拠はない。しかしながら、μＨ鎖のｃ　ＤＮＡの転位が、特定のイノトロンではないが、イン；・口／の存在を必要とするＶ□ブａモーターと１ｇ１４エノハンサーの組み合せによりなされていることが、実験的に示されている［３２］。そして、結局のところ、トラノスフエクノタンされた免疫グロブリフ遺伝子は・ハイブリドーマの内因性遺伝子から得られた免疫グロブリン遺伝子より、少量の抗体しか分泌できない。このことは、免疫グロブリンの遺伝子を高水準で発現させるには、通常トランスフェクン冒ンの実験に用いられるＤＮＡ範囲以外の、すなわち０部のエキソンから離れた塩基配列を必要とするという、トランスジェ二戸りマウスを用いた類似の実験結果からも推定できる。トランスフェク／ｇンされた　リンパ　からの　２　のリンパ球系細胞における、トランスフェクンヲンされた免疫グロブリン遺伝子は、免疫グロブリンに対するものではない転位信号からも発現可能である。例えば、熱シー１　ｙり遺伝子やＳＶ４０、またはヒトサイトメガロウィルス等のプロモーターが効果的に使用される［３３〜３５］。これらの転位因子は、リンパ球細胞に特異的なものではなく、かつそれぞれ利点を有している。転位による抗体の生産量も、ｖ８プロモーターまたはＪｇＨエンハンサ−による転位の場合と同等である（このことは、免疫グロブリン遺伝子のゲノムが転位信号としての重要性が低いものからも発現するということを反映している）。更に、ウィルス由来の転位因子のうちのあるものは、イノトロンの明白な必要性なしに、免疫グロブリンのＣＤＮＡを発現可能としている。これは、人為的に改良された抗体または抗体を構成するフラグメントを産生する場合に効果があると推察される。熱シＷνり遺伝子やウィルス等のプロモーターの使用は、トランスフェクシ茸ノされた非リンパ球細胞系による抗体産生を可能としている。哺乳類の非リンパ球細胞系によるＩｇＭとＩｇＧの産生は既に達成されている〔３３〜３５コので、実際のところ、グリコジル化の経路が、限密な作用機序によらないとすれば、非リンパ球細胞を、人為的に改良された抗体産生のホストとして使用することは可能である。トラ／スノエニノク　か゛の免疫グロブリン遺伝子ＤＮＡのマウス生殖系列への導入１３６］には、単クロー７抗体産生用のトランスジェニックマウスを用いたものが開示され、その応用例としては、ｌ・ラノスジＪ二ｙクマウスを用いて得たヒトキメラｌ　ｇＡ２抗体の遺伝子を、マウスの生殖系列に導入ずしたもの［３９］がある。トランスジェニックマウスは血清内に適量（約１００μｇ　／　ｍ　ｌ　）のキメラ抗体を有し、かつこの抗体は母乳内に分泌される。または　からの参考文献３８．３９には、抗体を構成するフラグメント（Ｉ　ｇＥの、ＦｖｌＦ、−１およびＦｅ）をバクテリアを用いて発現させる方法が開示されている。そして、今や人為的に改良された抗体産生のための多くの方法が開示され、かつ現在も開発中である。ヒトの　、。　とのキメラ−のり骨髄腫細胞への導入に先立ち、試験管内にて免疫グロブリンＤＮＡを操作することにより、マウスまたはラットの７部とヒトの０部とを結合させたキメラ抗体の産生が可能となっている。このような抗体を形成するには、対象となる抗原に特異的なマウスまたはラットのノーイブリドーマを常法により作成し、このハイブリドーマから７部の遺伝子を単離し、更に、試験管内においてヒト由来の０部の遺伝子と結合させた後、このキメラ抗体の遺伝子を含むプラスミドを骨Ｎ！ｌ細胞系に導入する方法が採られる。このようにして、ＴＮＰ、　十スホクロリン、およびＮＰに特異的なヒトキメラＩｇＭ、ＩｇＧ、およびＩｇＥがそれぞれ産生されている［４０．４１．３１］。 −させる　グロブリノ　云−のクローニング　人馬配列された免疫グロブリノｖ部の遺伝子は、適当なりＮＡプローブを用ＬＸることにより、ハイブリドーマの遺伝子ライブラリーから単離することができる。殆どの場合、クロー二／グに際しては、７８部と■５部の双方が、発現可能となる以前に、Ｊ鎖（Ｊｏｉｎｉｎｇ　Ｃｈａｉｎ）に連結している必要がある。このＪ鎖により、発現させる７部を、他の多くの発現させない７部から識別することができる。この過程においては、異常な配列に再配列された７部がしばしば混入するので、再度検査を行い、異常なり部を除去する必要がある［８］。ゲノムＤＮＡからクローニングされた７部は、通常自らのプロモーターとして発現される。再配列されたｖ部の遺伝子を、ｃＤＮＡのライブラリーからクローニングし、発現させることもできる［４７．４８］。ｃＤＮＡからの発現には２つの方法がある。一つは、ヒト免疫グロブリンプロモーターをクローニングするゲノムとして単離された７部を形成するｃＤＮＡを用いるもの［４７］。もう一つは、ＳＶ４０プロモーターから、発現に好適な免疫グロブリンの部位を得るために用いられた、試験管内での突然変異誘発である「４８」。これらの方法は、いずれも、必要な７部を発現させるためのゲノムをクローニングするものである。このような機能化された抗体の製造に際しては、Ｈ鎖とＬ鎖とを適当な方法で合成し、かつ組立てる必要がある。一つのベクターにこれら双方の遺伝子をトラノスフェク／Ｊンすることも可能である［３］が、天皇のプラスミドでは、制限部位に限りがあるという問題がある。従って、より小型のプラスミドが遺伝子操作やＤＮＡの調製に用いられる。また、より実際的な方法としては、例えば先に図１に示したように、■（鎖の遺伝子をｐｓＶ２−ｇｌに導入し、Ｌ鎖の遺伝子をｐｓＶＩ８４−ｎｅｏに導入する等、Ｈ鎖とＬ鎖とをそれぞれ別のブラスミＦｌこクロー二／グする方法がある。これらのプラスミドはいずれも大腸菌にトラノスフエクノコノし、ａｓｐＲｃ宵Ｒクローンとして単離される。プロトプラストを融合させた場合、これらのベクターは同時に受容細胞１こトランスフエクンヲンされる。Ｈ鎖とＬ鎖の遺伝子が異なるプラスミドζこある場合、一方の鎖の遺伝子が変性して６、他の鎖は独立して産生される。まＩこ、異なる）Ｉ鎖とＬ鎖との組み合せによるトランスフエク／ｇノも容易である０６部の遺伝子に、他の完全な遺伝子のエキツノを混合するか、７部の遺伝子を連結する（もしくはその逆を行う）場合には、制限酵素による遺伝子の”カセメビを形成するとよい。その結果、リンカ−を、遺伝子中の特定の制限部位１こ導入することができる。キメラＩｇＳを発現させるための元のベクターで（ｉ、０部は、５ｉｌｌと、Ｂｓｔ旧のカセットから成っている。更には、図１中下部に示すよう：こ、本発明に係る配列を含むヒト０７部のドメインに、Ｐｖｕによる制限部位を形成する場合もある。この場合、リンカ−は、翻訳のための遺伝子配列を乱さなζ）よう、それらの配列の間に挟まれた配列内に導入される。また、エキソン間１こおける制限部位の存在により、エキノ／は更に直接的に混合される。免疫グロブリノの鎖は、ＣＬ部へのＶ−の連結および０８部へのｖＬ部の連結？こより構成されている［４９〜５］］。そして、これらの分子はそれぞれの分泌後組み立てられ、適当な７部を有する抗体として結合される。これらのし鎖のへテロ二量体は、潜在的に抗体結合活性のみを有しており、かつこれらの分子およびその類似体は、本発明による生体内の反応では得ることができなｔｌ。Ｕ先血ｌ　クロー７Ｂの■。ドメインのクローンＢは、リッパ球幼若細胞系（Ｍ瘍に関連するムチ７分子（こ対して抗体から分泌される。）で、ＥＢＶ−形質転換体に由来し、史書の末梢１ツノ／ぐ系Ｂ細胞からクローニングされたものである。ＤＮＡの単離後、免疫グロブリンＨ鎖とＬ鎖の７部に特異的なオリゴヌクレオチドブライマーを用Ｌ／’、ＰＣＲ法による遺伝子増幅を行った（表１）。表１．オリゴヌクレオチドブライマーの例およびその詳細特異的なトメイノ　） ■鎖ｖ部（ＶＨ）プライマー名　プライマー塩基配列ｙＨＢａｍＢａｃｋ　ＡＴＣＧＧＡＴＣＣＡＧＧＴＳＭＡＲＣＴＧＣＡＧＳＡＧＴＣＷＧＧ注：　Ｓ＝ＣまたはＧ＋Ｍ＝ＡまたはＣ＋Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｗ＝ＡまたはＴここで、フォワードブライマーはＥｃｏＲＩおよびＢｓｔ　ｌ　ｌ　Ｉの制限部位を含み、ノイ。クプライマーはＢｓｔ旧およびＰｓｔｌを念んでいる。単離されたＤＮＡは、アガロースゲル電気泳動による調査の結果、３５０塩基対の大きさを有することが明かとなった。更に、この、ｖｏ部をエンコードするＤＮＡを、不要な塩基配列を除去した後、プラスミド（ｐＵｃ＋８）に連結する一方、口のプラスミドを含む、ＴＯ−１と呼ばれる細菌を単離し、このコロニーを拡大させることにより、単離されたＤＮＡを含む塩基配列を得た。そして、この塩基配列から、制限酵素を用いて、先にクローノーＢと命名したヒトＶ。部をエンフードする遺伝子を単離腰この遺伝子をファージ（ＭＩ３鵬ｐ１ｇ）に連結した。このファージ遺伝子をＴＧ−１に形質転換した後、増殖後のＴＧ−１から１本鎖ＤＮＡを単離した。この１本鎖ＤＮＡの塩基配列を、ノークエナーゼを用（１て解析するとともに、単離したＤＮＡは、０．４ｍｍ厚の０．６％アクリｌレアミドゲル内に重層させた。解析されたクロー７−Ｂの７８部をエンコードする遺伝子の塩基配列ζよ、ヒトＩａｂａｔＨ鎖のサブグループ２と一致するものであった（表２参照）。表２゛ヒト抗ムチノｉ１１クロー７抗体のＤＮＡおよびアミノ酸配列九虹］忍二２ｐ工星匹住−ジ−１Ｎ　Ｍ　−２抗体は、マウスＬａｍｂｄａｌ−鎖のＩｇＧ、２由来の単りローノ抗体で、ムチン分子に対し特異性を有している。この抗体は、上皮Ｍｌａの９５％と反応し、かつムチンとも交差反応する。ＮＭ−２のＶ部ドメインのクロー二／グ■８部およびＶ５部を、実験例１と同様の方法によりクローニングし、かつ塩基配列を解析した。使用した全プライマーおよびその塩基配列を表３に示す。表３：オリゴヌクレオチドブライマーおよびその詳細（＋＞　特異的なドメイン　、）（鎖Ｖ部（ＶＨ）プライマー名　プライマー塩基配列（１１）特異的なトメイノ　：Ｌ鎖Ｖ部（Ｖ　ｔ）プライマー名　プライマー塩基配列ｖ　Ｂａｃｋ　Ｅｃｏ　ＣＡＧＧＣＴＧＴＴＧＴＧＡＣＴＣＡＧＧＡＡＴＴＣＧＣＡＣＴＣＡＣＣＶ　Ｆｏｒ　Ｘｂａ　ＡＣＣＴＡにＴＣＴＡＧＡＣＡＧＴＴＴＧＧＴＴＣＣＴＣＣＡＣＣ注、全てのプライマーは５−〜３−向きに記載本発明者は、解析の結果得られた、ＮＭ−２をエリコードする■。部および■。部遺伝子の塩基配列について、ここに、その配列中の全ＣＤＲ配列を明かにした（表４および表５参照）。表４：ＮＭ−２Ｖ□部単クローン抗体のＤＮＡおよびアミノ酸配列ＤＲ３表５　：　ＮＭ　−２ＬａｍｂｄａのＤＮＡおよびアミノ酸配列ＧＧＴ　ＧＭ　ＡＣＡ　ＧＴＣＡＣＡ　ＣＴＣＡＣＴ　ＴＧＴ　ＣＧＣＴＣＡ　ＡＧＴ　ＡＣＴ　ＧＧＧヨＧｌｙ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　ＡｌａＶａｌ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ｇｌｎ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｐｒ。Ｄ５　１６２　ＣＤＲ，２ＧＡＴ　ＣＡＴ　ＴＴＡ　ＣＴＡ　ＡＣＴ　ＧＧＴ　ＣＴＡ　ＡＴＡ　ＧＧＴＥ召口秤］り不＝璽ベベ日トトクづ召冨Ａｓｐ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ工ｌｅ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　ＡｒｇＡｌａ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　工ｌｅ　ＧｌｙＧｌｕ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｔｒｐ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｈｉｓ　Ｔｒｐ更に、ＮＭ−２のｖｌｊ部のＣＤＲ５に対応して、６種のペプチドが合成された（表６参照）。表６４合成されたペプチドのアミノ酸配列１、５ｅｑｕｅｎｃｅＮＨ２−５ＬＴＳＹＧＶＩ（ＷＶＲ−ＣＯＯＨ２、５ｅｑｕｅｎｃｅ　Ｈｌ（２−ＹＣＡＲＥＰＰＴＲＴＦＡＹＷＧＱＧ−Ｃｏｏ）１３、５ｅｑｕｅｎｃｅ　ＮＯ３−ＭＹＹＣＡＲＥＰＰＴＲＴＦＡＹＷＧＱＧ−α）ＯＨ４、５ｅｑｕｅｎｃｅ　ＮＯ３−ＥＰＰＴＲＴＦＡＹ　−ＣＯＯＨ５、５ｅｑｕｅｎｃｅ　ＮＯ３−ＲＥＰＰＴＲＴＦＡＹＷＧ−Ｃｏｏ）１６、５ｅｑｕｅｎｃｅ　ＮＯ３−ＷＬＶＶニジＩＳＤＧＳＴＴＹＮＳＡＬＮＳＲＣＭ−ＣＯＯＨＣＤＲ３ペプチドは、抗原に対する特異的結合性を示ずＥＰＰＴ配列をコア。／−クエ／スとするアミノ酸を含んでいた。また、興味深いことに、このＥＰＰＴ配列は、マウス（ＮＭ−２）およびヒト（クロー７Ｂ）の抗体に由来するＣＤＲ３の双方に存在していた。ＣＤＲ３の移植ＥＰＰＴ配列がヒトまたはマウス抗体におけるＣＤＲ３の５−末端に配置された抗体は、抗ムチン特異性を示す。そこで、本発明者は、（ＤＲ３を移植するだけで、抗体に抗腫瘍特異性が付与されることを示した。すなわち、少なくともある種の抗体については、抗１１１１特異性の発現に際し、（ＧＪｉ＋ｕｅｒらが述べているように、）ＣＤＲ３の移植とともに、例えばＣＤＲＩやＣＤＲ２のような他のＣＤＲを加えることは不要であった。３　日１こ、る　の、　でラベルされたムチンペプチドへの　Ａ固定されたムチン受容ペプチドの調製ｐＨ８のリン酸ナトリウムバッフｙ　−１００ｍ　Ｍに、７．５ｍｇのＶＸＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴ　（ムチ７分子の抗原決定基を構成するポリペプチド）を溶解し、７．５ｍｇのウノ血清アルブミノ（ＢＳＡ）を加えた後、前記バブファーで０．５ｍｌとした。次いで、２５％のグルタルアルデヒドを５μｍ加えて混合後、室温で１５分間放置し、グルタルアルデヒドを更に２５μｍ加えて混合後、室温で１５分間放置した。更に、ＩＭのグリ／ノ（ｐ　Ｈ６）をＩ　ＯＯｆ７１加え、１０分間放置してグルタルアルデヒドを不活化させた後、１００μｍずつに分け、使用までの間−２０℃にて保存した。結合反応に先立つＥＰＰＴペプチドの放射線ラベルペプチドは、リン酸バッファー、１００ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐ　Ｈ８）、あるいはＤＭＳＯを含むリン酸ナトリウムに溶解した。また、このペプチドは全て、ｌｏｄｏｇｅｎ反応により、１１２５でラベルした。口の場合、溶解性に応じた１ｍｇ以上のペプチドを、１本の試験管で２００μＩあたり約１３７ＭＢｑの１１２６でラベルし、室温で１時間以上反応させた。反応後の試験管は１ｍｌの７１′ツフアーで洗浄後、ベラ；′体積５ｍｌの５ｅｐｈａｄｅｘ　ＧＩＯカラムを通過させ、通過液を１ｍｌずつのフラクンコノに回収し、それぞれの放射能を測定した。例えば、２００７１１のＲＥｌ’ＰＴＲＴＦＡＹＷＧペプチド日０μｌの１１２５とを混合し、室温で６０分装いた場合、カラム通過後の各フラクンＢンζこ回収された溶液の放射能は以下に示す通りであった。表７二１ム乙１Ｚ乃　−・　ＭＢ校正用　Ｏこの場合、フラク／ｇンＮｏ、　２〜１２（総量でペプチドｌ　ｍｇｌこ相当）の縁故ｌＮ能は３４．６２ＭＢｑであった。従って、最も放射能の高−一フラク ’７　Ｗ　７　Ｎｏ、　３　Ｅは、８．９２／’３４．６２ｘｌ　（ｍｇ）＝０．２５８ｍｇ／ｍｌのペプチドカ；含まれていた。固定されたムチ７受容ペプチドへのＥＰＰＴペプチドの結合固定されたムチン受容ペプチドへのＥＰｒ’Ｔペプチドの結合性を調査するに当たっては、平衡透析法を用いた。これは、低分子（ｌＩ［量１２０００〜１４０００ドルトン以下の分子）のみ通過かつ平衡可能な透析膜によって２室に分割された容器を用いるものである。透析膜を通過しない受容体は２室の一方に入れられ、他方には溶媒が入れられる。放射能でラベルされた透析膜を通過可能なペプチドが受容体と結合を開始すると、膜の浸透性とは無関係に、２室間のペプチド濃度が平衡となるよう変化する。平衡後の試料はそれぞれ取り出され、放射能が測定される。本実験例の場合、透析膜により等しく分割された容積１ｍｌの容器が用いられた。そして、固定されたムチ／受容ペプチドを、最終濃度が８３．３μｇとなるよう２室の一方に入れた後、２室の双方に、異なった濃度のＥＰＰＴペプチドを添加し、容器を攪拌しつつ室温で２４〜４８時間保持して２室間のＥＰＰＴペプチド濃度を平衡状態とした。また、ある容器にはそれぞれ１１２５でラベルされたＥＰＰＴを同濃度添加したのに加え、非特異的な結合を調べるため、更に１０倍量のラベルされていないペプチドを添加した。最後に、平衡後の試料をそれぞれ取り出して１１２５活性を測定し、ごの放射線量から、固定されたムチン受容ペプチドへのＥＰＰＴペプチドの結合量を算出した。ムチ／受容ペプチドへのＥＰＰＴペプチドの結合量を図２および図３に示す。図２は、試験に用いたＥＰＰＴペプチドおよびその添加量と結合量の一覧を示すもので、図３は、試験に用いたＥＰＰＴペプチドの間における、結合量の差を明かとするため、特定の添加量における各Ｅ　Ｐ　Ｐ　Ｔペプチドの結合量を比較したものである。ＥＰＰＴＲＴＦＡＹペプチドは、ムチ／受容ペプチドへの結合性を示していないが、これは、偏重したアミノ酸を、結合部位のグルタミン残基から離す必要があることを示唆している。ＥＰＰＴＲＴＦＡＹペプチドは、全くのＶＨＣＤＲ−３ドメインで、他の残基を有さないため、それ自体では、ムチ／受容ペプチドへの結合性を示さないが、この配列に　１ｍ接し、た免疫グロブリン骨格由来の３つの残基を結合（Ｎ末端へのＡ１１Ｇ配列の結合およびＣ末端へのＴＲＰとＧＬＹ配列の結合）させると、ムチ／受容ペプチドへの結合性を向上させることができるが、これは、Ｎ末端のアミノ酸が、グルタミン残基から離れるためと考えられる。ｔＪｕｌ（全て、本文中に参考文献として使用し、た。）１、　Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、　Ｓ、Ｌ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　ＡｃａｃＬ　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８１．。２、．０ｃｈｉ、Ａ、ｅｔａｌ、Ｎａｔｕｒｔｉ（Ｌｏｎｄｏｎ）３０２，３４０−３４２゜Ｌ　０ｃｈｉ、Ａ、ａｔ　ａｌ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ− Ｓｃｉ、ＵｓＡ　８０゜６３５１−６３５５゜４、　Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ、ｃ、ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、Ｒｅｄ、４．　コアー４９゜５、Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ、Ｇ、Ｌ、ｅｔａｌ、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３１２，６４３−６４６゜６、　Ｌｉｕ、　ＦＪ、　ａｎｄ　Ｇｒｉｔｚｍａｃｈｅｒ、　Ｃ，Ａ、（１９８７）　Ｊ−Ｉｍｎｕｎｏｌ。１３８、３２４−３２９゜？、　Ｓｕｎ、　Ｌ、に、　ｅｔ　ａｌ　（１９８６１Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　５　（Ｓｕｐｐｌ、　１）、　５１７−８、　Ｓａｈａｇａｎ、Ｂ、Ｇ、ｅｔ　ａｌ　（１９８６）　Ｊ、Ｉｍｎｕｎｏｌ、１３７゜９、　Ｊｏｎａｓ、　Ｐ、Ｔ、　ｅｔ　ａｌ　（１９８５）　Ｎａｔｕｒｅ　３２１．５２２−５２５゜１０、　Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ、Ｍ、ｅｔ　ａｌ　（１９８８）　５ｃｉｅｎｃｅ　２３９．　１５３４−１５：１６゜１１、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ、　Ｌ、　ｅｔ　ａｌ　（１９８８）　Ｎａｔｕｒｅ　３３２．３２３−３２１゜１８、　０’５ｕｌｌｉｖａｎ　ｅｔ　ａｌ　（１９７９）　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　ｉｏｏ、　１００−１０８゜１９、８ｍｇｓｈａｗａ　（１９８７）　Ｂｒ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ　５６．５３Ｌ２０、Ｅａｇｓｈａｗｅ　ｅｔ　ａｌ　（１９８８）　Ｂｒ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ　ｓ８．７００゜２１、Ｗｏ　８８１０７３７Ｂ。２２、　Ｒｏｗｌｉｎｓｏｎ−Ｂｕｓｚａ　ｅｔ　ａｌ　（ｉｎ　ｐｒｅｓｓ、　”Ｉｎ　Ｖユｔｒ。ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉセｙ　ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ　５ｐｅｃｉｆｉｃ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆａｒｎｙｇｄａｌｉｎ　ｂｙ　ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　３−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ”ｌ　。２：１．　Ｆｒａｋｅｒ、Ｐ、Ｊ、ｅｔ　ａｌ　（１９７８１Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ。Ｃｏｍｍｕｎ、　ｓｏ、　４９−５７゜２４、　”ｌづｏｎｏｃｌｏｎａｌ　八ｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｉｎ　Ｔ、ｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｙ”、Ｊ− Ｆ。Ｃｈａｔａｌ　（ＣＲＣＰｒｅｓｓ、１９８９１゜２５、　Ｒｉｃｅ、Ｄ、ａｎｄ　Ｂａ１ｔｉｒｎｏｒｅ、　Ｄ、（１９８２）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７９．７８６２−７８６５゜２６、　Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、　Ｍ、Ｓ、（１９ＥＤ）　’ＥＭＢＯ、Ｊ、　２．　Ｄ７３−１３７８゜２７、０ｃｈｉ、Ａ、ｅｔ　ａｌ　（１９８３）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　ｇｏ。２Ｂ、　Ｏｉ、　Ｖ、Ｔ、　ｅｔ　ａｌ　（１９８３）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８０゜２９、　Ｂａｎｅｒｊｉ、　Ｊ、　ｅｔ　ａｌ　（１９８：１１　Ｃｅ１ｌ　３３．７２９−７４０゜３０、　Ｇ１１ｌｉｅｓ、Ｓ、Ｄ、ｅｔ　ａｌ　（１９８：ｌ）　Ｃｅ１ｌ　３３．　７１７ −７２８゜３１、　Ｎａｕｂｅｒｇｅｒ、　Ｍ、Ｓ、　ｅｔ　ａｌ　（１９８５）　Ｎａｔｕｒｅ　３１４．２６８−２７０゜３２、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、　Ｍ、Ｓ、　ａｎｄ　Ｗｉｌｌｉａｍｓ　Ｇ、Ｔ、　（１９８８１Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ：ｌ：１．　Ｃａｔｔａｎｅｏ、Ａ、ａｎｄ　Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、　Ｍ、Ｓ、（１９８７）　ＥＭＢＯＪ、６゜３４、　Ｗｅｉｄｌｅ、　Ｕ、Ｈ，ｅｔ　ａｌ　（１９８７）　Ｇｅｎｅ　５１．　２１−２９゜３５、Ｗｈｉｔｔｌｅ、Ｎ、ｅｔ　ａｌ　（１９８７１Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉ、ｎｅｅｒｉｎｇ　１゜３６、Ｒｉｔｃｈｉｅ、　Ｋ、Ａ、　ｅｔ　ａｌ　（１９８４）　Ｎａｔｕｒｅ　３１２．５１７−５２１３１、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、Ｍ、ｓ、、ｃａｓｋｅｙ、Ｈ，Ｍ、、Ｐｅｔｔｅｒｓｓｅｎ、Ｓ、。Ｗｉｌｌｉａｍｓ　Ｇ、Ｔ、ａｎｄ　５ｕｒａｎｉ、Ｍ、Ａ、（１９８８）３８、　５ｋａｒｒａ、Ａ、ａｎｄ　ＰＩＬｉｃｋｔｈｕｎ、Ａ、（１９８８）　５ｃｉｅｎｃｅ　２４ｏ。３９、　Ｂｅｔｔｅｒ、Ｍ、ｅｔ　ａｌ　（１９８８）　５ｃｉｅｎｃｅ　２４０．　１０４１−１０４：ｌ。４０、　Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ、　Ｇ、Ｌ、　ｅｔ　ａｌ　（１９８４１Ｎａｔｕｒｅ　３１２．６４３−６４６゜４１、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｓ、Ｌ、　ｅｔ　ａｌ　（１９８４１Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ−Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。ＵＳＡ　８１，６８５１−６８５５゜図］ｇＧ、◆　（１５ａｌＯＩＪＪ（ｌ！　、（４−Ａ　＞　＠　２１　）８　（Ｓｃ３１０ｕＪ）　ｉｉ　、砦Ａ　＞　’８　’ｄ国際調査報告１５１ｍ＋ｓｍ＋ｌ。□ｌ　Ａ＊ｓ１１．＋ｌい□１　ρＣＴ／鑓９２１００７４６−１−ｍ５＋１ｍｗ１ＡＩ？ｌｉ　ｅｍ＋＋−＋＋、、　ＰＣＴ／ＱＢ　９２１００７４６国際調査報告Ｅ二本ミミ・（虱・°ミ三ヨ：（母ミミニ：＝７．°ニ＝こ：な“［−“自”フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃ０７Ｋ　７／１０Ｃ１２Ｐ　２１１０８　８２１４−４Ｂ／／　Ｃ１２Ｎ　１５／１３ＧＯＩＮ　３３１５３　Ｄ　８３１０−２ＪＣ０７Ｋ　９９：００Ｉ

Claims

【特許請求の範囲】

１．ＥＰＰＴアミノ酸配列を含む分子。
２．前記ＥＰＦＴアミノ酸配列からなる請求項１記載の分子。
３．３０個以下のアミノ酸からなる直列のペプチドを形成する、前記ＥＰＰＴアミノ酸配列と更なるアミノ酸とからなる請求項１記載の分子。
４．前記ＥＰＰＴアミノ酸配列が抗体の可変部のＣＤＲの一部をなす、抗体の可変部を含む請求項１記載の分子。
５．バクテリオファージを含む請求項１記載の分子。
６．請求項１，２，３，４，５または６に記載の分子と、かつ物理活性、化学反応性、触媒作用または生体内において起こり得る作用を有する作用部位とを含む複合体。
７．前記作用部位が、細胞毒性を示す化合物、相対的に無毒な前駆物質を細胞毒性を示す化合物に代謝させ得る酵素活性を有する部位、前記複合体の結合が予想される細胞に対するラベル、前記複合体の細胞への結合を阻害し得る不活化部位、または細胞刺激性化合物を含む請求項６記載の複合体。
８．請求項１，２，３，４，５または６に記載の分子、あるいは（前記複合体がポリペプチドである場合には、）請求項６または７に記載の複合体をエンコードするポリヌクレオチド。
９．請求項８のポリヌクレオチドが形質転換され、請求項１，２，３，４，５または６に記載の分子、あるいは請求項６または７に記載の複合体を発現し得るホスト。
１０．（ｉ）表面に露出されたＥＰＰＴアミノ酸配列を有する化合物に選択的に結合され得る存在を細胞表面に持つ細胞、または（ｉｉ）細胞表面から分離された前記存在、に対する同定、位置確認、または干渉の方法であって、前記細胞または前記存在に対し、請求項１，２，３，４，５または６に記載の分子、あるいは請求項６または７に記載の複合体を表出させることを含む、前記細胞または前記存在に対する同定、位置確認、または干渉の方法。