JPH02145186A - 金属キレートに指向性のキメラ抗体 - Google Patents
金属キレートに指向性のキメラ抗体Info
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-
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- Health & Medical Sciences (AREA)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明は、金属キレートに特異的なキメラモノクローナ
ル抗体、並びに該抗体をコードしている組換えＤＮＡ化
合物およびベクターに関する。
ル抗体、並びに該抗体をコードしている組換えＤＮＡ化
合物およびベクターに関する。
［従来の技術］
モノクローナル抗体は、インビトロにおいては免疫検定
（イムノアッセイ）での利用、インビボにおいては疾患
の診断および治療にますますその重要性を増しつつある
。ＥＤＴＡのアミノベンジル誘導体の金属キレートに指
向性であるモノクローナル抗体は、結腸直腸癌や乳癌な
どのある種の癌について行われるインビボでの腫瘍のイ
メージングおよび治療に特に有用である。
（イムノアッセイ）での利用、インビボにおいては疾患
の診断および治療にますますその重要性を増しつつある
。ＥＤＴＡのアミノベンジル誘導体の金属キレートに指
向性であるモノクローナル抗体は、結腸直腸癌や乳癌な
どのある種の癌について行われるインビボでの腫瘍のイ
メージングおよび治療に特に有用である。
しかし、利用可能なモノクローナル抗体の大部分はネズ
ミ、即ちマウスのハイブリドーマから得られる。インビ
トロの免疫検定においてネズミ抗体を適用すると、血清
成分とネズミ免疫グロブリンの反応に起因する偽陽性に
関連した問題が起こる可能性がある。さらに重要なこと
は、ネズミ抗体のヒト医薬としてのインビボ適用はその
固有の免疫原性により制限されることが多いということ
である。ネズミ抗体の投与は、多数の患者において免疫
応答を誘導し、多数回の投与処方の間に抗体の効果が徐
々に減少してしまう。この効果の減少の少なくとも一部
は、患者の免疫応答によるネズミ抗体の薬物動態学的性
質の変化、または循環系からの迅速なりリアランス（清
掃）に帰することかできる。従って、ネズミモノクロー
ナル抗体に付随する免疫原性は、長期的な多数回投与を
妨げ、実質的にはその可能性ある臨床的価値に打撃を与
える。
ミ、即ちマウスのハイブリドーマから得られる。インビ
トロの免疫検定においてネズミ抗体を適用すると、血清
成分とネズミ免疫グロブリンの反応に起因する偽陽性に
関連した問題が起こる可能性がある。さらに重要なこと
は、ネズミ抗体のヒト医薬としてのインビボ適用はその
固有の免疫原性により制限されることが多いということ
である。ネズミ抗体の投与は、多数の患者において免疫
応答を誘導し、多数回の投与処方の間に抗体の効果が徐
々に減少してしまう。この効果の減少の少なくとも一部
は、患者の免疫応答によるネズミ抗体の薬物動態学的性
質の変化、または循環系からの迅速なりリアランス（清
掃）に帰することかできる。従って、ネズミモノクロー
ナル抗体に付随する免疫原性は、長期的な多数回投与を
妨げ、実質的にはその可能性ある臨床的価値に打撃を与
える。
ヒトモノクローナル抗体を臨床使用すると、ネズミモノ
クローナル抗体の使用に付随する制限が克服されるであ
ろうことが示唆されていた。しかし、抗原およびハプテ
ンに対して所望の特異性および親和性を有するヒトモノ
クローナル抗体を製造することは技術的に困難である。
クローナル抗体の使用に付随する制限が克服されるであ
ろうことが示唆されていた。しかし、抗原およびハプテ
ンに対して所望の特異性および親和性を有するヒトモノ
クローナル抗体を製造することは技術的に困難である。
ある種から導かれた抗体の結合または可変領域が別の種
から導かれた抗体の不変領域と結合しているキメラ抗体
が、組換えＤＮＡ法で構築されている。キメラ抗体は、
例えば次の文献に記載されている；欧州特許公開第１７
３４９４号；ショウら（Ｓｈａｗ）、ジャーナル・オブ
・イムノ、（Ｊ、Ｉｍｎｕｎ、）、１３８：４５３４（
１９８７）；サンら（：コｕＯＬ、に、）、プロシーデ
ィングズ・オブ・す、・１ナル・アカデミ−・オブ・サ
イエンシイズ（Ｐ ｒｏｃＮａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ
、 ＵＳＡ）、８４：２１４ ２１．８ （１９８７
）；ニューバーガーら（Ｎ ｅｕｂｅｒｇｅｒ。
から導かれた抗体の不変領域と結合しているキメラ抗体
が、組換えＤＮＡ法で構築されている。キメラ抗体は、
例えば次の文献に記載されている；欧州特許公開第１７
３４９４号；ショウら（Ｓｈａｗ）、ジャーナル・オブ
・イムノ、（Ｊ、Ｉｍｎｕｎ、）、１３８：４５３４（
１９８７）；サンら（：コｕＯＬ、に、）、プロシーデ
ィングズ・オブ・す、・１ナル・アカデミ−・オブ・サ
イエンシイズ（Ｐ ｒｏｃＮａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ
、 ＵＳＡ）、８４：２１４ ２１．８ （１９８７
）；ニューバーガーら（Ｎ ｅｕｂｅｒｇｅｒ。
Ｍ、Ｓ、）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３１４：２
６８（１９８５） ；ブリアンら（Ｂ ｏｕｌｉａｎｎ
ｅ、 Ｇ 、 Ｌ 、 ）、ネイチャー、３１２：６４
３−６４６（１９８４）；およびモリソンら（Ｍｏｒｒ
ｉｓｏｎ、 Ｓ 、 Ｌ 、 ）、プロシーデイングズ
・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシイ
ズ、８１：６８５１−６８５５（１９８４）。通常は、
ネズミ抗体の可変領域とヒト抗体の不変領域とが結合さ
れている。そのようなキメラ抗体の大部分はヒト成分で
あるために、実質上、ネズミ抗体よりも免疫原性が低い
と考えられる。従って、インビボでの適用にはキメラモ
ノクローナル抗体が極めて望ましい。
６８（１９８５） ；ブリアンら（Ｂ ｏｕｌｉａｎｎ
ｅ、 Ｇ 、 Ｌ 、 ）、ネイチャー、３１２：６４
３−６４６（１９８４）；およびモリソンら（Ｍｏｒｒ
ｉｓｏｎ、 Ｓ 、 Ｌ 、 ）、プロシーデイングズ
・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシイ
ズ、８１：６８５１−６８５５（１９８４）。通常は、
ネズミ抗体の可変領域とヒト抗体の不変領域とが結合さ
れている。そのようなキメラ抗体の大部分はヒト成分で
あるために、実質上、ネズミ抗体よりも免疫原性が低い
と考えられる。従って、インビボでの適用にはキメラモ
ノクローナル抗体が極めて望ましい。
［発明が解決しようとする課題］
キメラ抗体に関する一般的な概念は記載されているが、
その一方で、興味ある予め決めた金属キレートハプテン
、特にｐ−アミ／ベンジルＥＤＴＡ゛ド４−り金属錯体
に対する特異ｔ／ｌ ”上びはっきりど分かった（定
戊された）アミ７版配グ！域をｒ了する新規なキメラモ
ノクローナル抗体を開発することが、ヒトの治療および
腫瘍のイメージングに必要とされている。さらに、新規
なキメラ抗体を構成する軽鎖および重鎖可変領域のため
の定義されたＤＮＡ暗号配列を有するＤＮＡ構築物であ
って、真核細胞内でこれら新規なキメラタンパク質を発
現することができるＤＮＡ構築物の開発が要望されてい
る。本発明は、これらの要望に応えるものである。
その一方で、興味ある予め決めた金属キレートハプテン
、特にｐ−アミ／ベンジルＥＤＴＡ゛ド４−り金属錯体
に対する特異ｔ／ｌ ”上びはっきりど分かった（定
戊された）アミ７版配グ！域をｒ了する新規なキメラモ
ノクローナル抗体を開発することが、ヒトの治療および
腫瘍のイメージングに必要とされている。さらに、新規
なキメラ抗体を構成する軽鎖および重鎖可変領域のため
の定義されたＤＮＡ暗号配列を有するＤＮＡ構築物であ
って、真核細胞内でこれら新規なキメラタンパク質を発
現することができるＤＮＡ構築物の開発が要望されてい
る。本発明は、これらの要望に応えるものである。
本発明は、特許請求の範囲および後記の詳細な説明に記
載したように、キメラモノクローナル抗体、並びに該抗
体をコードしている組換えＤＮＡ化合物およびベクター
に関する。これらのキメラ抗体は、ＥＤＴＡ（エチレン
ジアミン四酢酸）の金属キレート錯体（本明細書中では
、「金属ハブテン錯体」、「錯体ハブテン」、「金属ハ
ブテン」または単に「キレート」と記す）に対して特異
性を示す：キレートは、Ｌ−またはＤ−ｐ−アミノベン
ジルＥＤＴＡが好ましく、Ｌ−またはＤ−ｐ−アミノベ
ンジルＥＤＴＡのインジウム（ＩＩＩ）キレートが最も
好ましい。金属錯体は、治療用およびイメージング用の
放射性核種の金属イオンを含んでいる。本抗体の可変領
域は、リアダン等［Ｄ、 Ｔ、Ｒｅａｒｄａｎ ｅｔ
ａｌ、、 Ｎａｔｕｒｅ、 ３１６． ２６５−２６８
（１９８５）コおよびメアレス等［Ｃ，ＦＪｅａｒｅｓ
ｅｔ ａｌ、 ；米国特許Ｎｏ、４゜７２２、８９２
； １９８８年２月２日発行］が記載しているネズミ
抗体ＣＨＡ２５５．５から得られる。また、ＣＨＡ２５
５．５可変領域中のアミノ酸配列が変異した変異体が、
ネズミＣＨＡ２５５．５可変領域が金属錯体ハブテンに
対して有しているのとほぼ同じ結合特異性を有している
ときには、そのような変異体は本抗体に包含される。
載したように、キメラモノクローナル抗体、並びに該抗
体をコードしている組換えＤＮＡ化合物およびベクター
に関する。これらのキメラ抗体は、ＥＤＴＡ（エチレン
ジアミン四酢酸）の金属キレート錯体（本明細書中では
、「金属ハブテン錯体」、「錯体ハブテン」、「金属ハ
ブテン」または単に「キレート」と記す）に対して特異
性を示す：キレートは、Ｌ−またはＤ−ｐ−アミノベン
ジルＥＤＴＡが好ましく、Ｌ−またはＤ−ｐ−アミノベ
ンジルＥＤＴＡのインジウム（ＩＩＩ）キレートが最も
好ましい。金属錯体は、治療用およびイメージング用の
放射性核種の金属イオンを含んでいる。本抗体の可変領
域は、リアダン等［Ｄ、 Ｔ、Ｒｅａｒｄａｎ ｅｔ
ａｌ、、 Ｎａｔｕｒｅ、 ３１６． ２６５−２６８
（１９８５）コおよびメアレス等［Ｃ，ＦＪｅａｒｅｓ
ｅｔ ａｌ、 ；米国特許Ｎｏ、４゜７２２、８９２
； １９８８年２月２日発行］が記載しているネズミ
抗体ＣＨＡ２５５．５から得られる。また、ＣＨＡ２５
５．５可変領域中のアミノ酸配列が変異した変異体が、
ネズミＣＨＡ２５５．５可変領域が金属錯体ハブテンに
対して有しているのとほぼ同じ結合特異性を有している
ときには、そのような変異体は本抗体に包含される。
本明細書中に開示した本発明のために、以下の短縮表示
を定義する。
を定義する。
（以下、余白）
アミノ酸
アラニン
アルギニン
アスパラギン
アスパラギン酸
／スティン
グルタミン酸
グルタミン
グリシン
ヒスチジン
イソロインン
ロイシン
リジン
メチオニン
フェニルアラニン
プロリン
セリン
トレオニン
トリブトファン
チロシン
バリン
核 酸
デオキシアデニル
デオキソグアニル
デオキシシチジル
チミジル
三文字短縮表示
ｌａ
ｒｇ
ｓｎ
ｓｐ
ｙｓ
ｌｕ
ｌｙ
ｉｓ
１ｅ
ｅｕ
ｙｓ
ｅｔ
ｈｅ
Ｐｒ。
ｅｔ
ｈｒ
ｒｐ
ｙｒ
ａｌ
第１図は、プラスミドｐＭＬＣＨ−１およびｐｃＣＨＡ
Ｋの制限部位および機能地図を示す模式図であり、プラ
スミドｐＭＬｃＨ１ｄＢを指す文字とともに示すもので
ある（本発明を開示する目的で挙げた図面は、すべて、
正確な尺度では描かれていない）。
Ｋの制限部位および機能地図を示す模式図であり、プラ
スミドｐＭＬｃＨ１ｄＢを指す文字とともに示すもので
ある（本発明を開示する目的で挙げた図面は、すべて、
正確な尺度では描かれていない）。
第２図は、プラスミドｐＨＫＦ−１の制限部位および機
能地図を示す模式図である。
能地図を示す模式図である。
第３図は、プラスミドｐＵＣＶＨＩｎｃ−ＩＡおよびｐ
ＨＧｆＺの制限部位および機能地図を示す模式図である
。
ＨＧｆＺの制限部位および機能地図を示す模式図である
。
第４図は、プラスミドｐＨＧｌ−ＣＨＡおよびｐＮｃＨ
ＡＧｔの制限部位および機能地図を示す模式図である。
ＡＧｔの制限部位および機能地図を示す模式図である。
第５図は、プラスミドｐｉ ９ＨＡＮおよびｐ１９ＨＡ
ＮＣＨの制限部位および機能地図を示す模式第６図は、
プラスミドｐＧＣＨＡＫ−３の制限部位および機能地図
を示す模式図である。
ＮＣＨの制限部位および機能地図を示す模式第６図は、
プラスミドｐＧＣＨＡＫ−３の制限部位および機能地図
を示す模式図である。
［課題を解決するための手段］
本発明の第１の態様は、第１の哺乳動物種由来のキレー
ト特異的な可変領域と、第２の別種哺乳動物種由来の不
変領域からなるキメラ抗体軽鎖をコードしているＤＮＡ
を含有する組換えＤＮＡ化合物であって（ｒＤＮＡ軽鎖
化合物」）、該軽鎖可変領域が、次の配列： Ｇｉｎ Ａｌａ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｉｎ Ｇ
ｌｕ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｓｅ
ｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｇｌｕ ＴｈｒＶａｌ Ｔｈｒ
Ｌａｕ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｓｅｔ Ｔ
ｈｒ Ｇｌｙ＾ｌａ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｓｅｒ
＾ｉｎ ＴｙｒＡｌａ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ｇｉ
ｎ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ｌａｕ
Ｉ’ｈ＠Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｉｌｅ （Ｆｌｙ
Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ａｌａ ｉ
’ｒｏ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｉ’ｒｏ Ａｌａ Ａｒｇ
Ｐｌｖ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ ＬｅｕＩＩｓ Ｇ
ｌｙ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｌ
ｅｕ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａ
ｌａ Ｇｉｎ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｕ
Ａｌａ Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｌ
ｅｕ Ｔｒｐ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｔｒ
ｐ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｇｌｙ ＧｌｙＧｌｙ Ｔｈｒ
Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｖａｌシｕ Ｇｌｙからなる
アミノ酸配列を有している組換えＤＮＡ化合物である。
ト特異的な可変領域と、第２の別種哺乳動物種由来の不
変領域からなるキメラ抗体軽鎖をコードしているＤＮＡ
を含有する組換えＤＮＡ化合物であって（ｒＤＮＡ軽鎖
化合物」）、該軽鎖可変領域が、次の配列： Ｇｉｎ Ａｌａ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｉｎ Ｇ
ｌｕ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｓｅ
ｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｇｌｕ ＴｈｒＶａｌ Ｔｈｒ
Ｌａｕ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｓｅｔ Ｔ
ｈｒ Ｇｌｙ＾ｌａ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｓｅｒ
＾ｉｎ ＴｙｒＡｌａ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ｇｉ
ｎ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ｌａｕ
Ｉ’ｈ＠Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｉｌｅ （Ｆｌｙ
Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ａｌａ ｉ
’ｒｏ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｉ’ｒｏ Ａｌａ Ａｒｇ
Ｐｌｖ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ ＬｅｕＩＩｓ Ｇ
ｌｙ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｌ
ｅｕ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａ
ｌａ Ｇｉｎ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｕ
Ａｌａ Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｌ
ｅｕ Ｔｒｐ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｔｒ
ｐ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｇｌｙ ＧｌｙＧｌｙ Ｔｈｒ
Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｖａｌシｕ Ｇｌｙからなる
アミノ酸配列を有している組換えＤＮＡ化合物である。
また、ＤＮＡ軽鎖化合物をコードしている組換えＤＮＡ
化合物であって（「軽鎖解読鎖」）、軽鎖可変領域の解
読鎖が、次の配列： ＣＡＧ ＧＣＴ ＧＴ’ｒ ＧＴＧ ＡＣＴ ＣＡＧ
ＧＡＡ ＴＣＴ ＧＣＡ ＣＴＣＡＣＣＡＣＡ ＴＣＡ
ＣＣＴ ＧＧＴ ＧＭ ＡＣＡＧＴＣＡＣＡ ＣＴＣ
ＡＣＡ Ｔｉ ＣＧＣＴＣＡ ＡＧＴ ＡＣＴ ＧＧＧ
ＧＣＴ ＧＴｒ ＡＣＡ ＡＣＴ ＡＧＴ ＡＡＣＴ
ＡＴＧＣＣＡＡＣＴＧＧ ＧＴＣＣＡＡ ＧＡＡ ＡＡ
Ａ ＣＣＡ ＯＡＴ ＣＡＴ ＴｒＡ ＴＴＣＡＣＴ
ＧＧＴ ＣＴＡ ＡＴＡ ａｃ’ｒＧＣＴ ＡＣＣＡＡ
Ｔ ＡＡＣＣＧＧ ＧＣＴ ＣＣＡ ＧＧＴ ＧＴＴ
ＣＣＴ ＧＣＣＡＧＡ ＴｒＣＴＣＡ ＧＣＣＴＣＣｌ
’ｒＧＡＴＴ ＧＧＡ ＧＡＣＡＡＧ ＧＣＴ ＧＣＣ
ＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＡ ＧＧＧ ＧＣＡ ＣＡＧ
ＡＣＴ ＧＡＡ ＧＡＴ ＧＡＧＧＣＡ ＡＧＡ ＴＡ
Ｔ ＴｒＣＴＧＴ ＧＣＴ ＣＴＡ ＴＧＧ ＴＡＣＡ
ＧＣＡＡＣＣＴＣＴＧＧ （ＴＡ ＴｒＣＧ［Ｔ ＣＧ
ＡＧＧＡ ＡＣＣＡＡＡ ＣＴＣＡＣＴ ＧＴＣＣＴＡ
Ｇ（ｉＧからなる組換えＤＮＡ化合物も本発明に含ま
れる（ＤＮＡ塩基が対になる相捕性の性質により、２本
鎖１） Ｎ Ａ分子の一方の配列は他方の配列を決める
のに十分である；従って、本開示ではＤＮＡ配列の解読
鎖のみを表示する）。
化合物であって（「軽鎖解読鎖」）、軽鎖可変領域の解
読鎖が、次の配列： ＣＡＧ ＧＣＴ ＧＴ’ｒ ＧＴＧ ＡＣＴ ＣＡＧ
ＧＡＡ ＴＣＴ ＧＣＡ ＣＴＣＡＣＣＡＣＡ ＴＣＡ
ＣＣＴ ＧＧＴ ＧＭ ＡＣＡＧＴＣＡＣＡ ＣＴＣ
ＡＣＡ Ｔｉ ＣＧＣＴＣＡ ＡＧＴ ＡＣＴ ＧＧＧ
ＧＣＴ ＧＴｒ ＡＣＡ ＡＣＴ ＡＧＴ ＡＡＣＴ
ＡＴＧＣＣＡＡＣＴＧＧ ＧＴＣＣＡＡ ＧＡＡ ＡＡ
Ａ ＣＣＡ ＯＡＴ ＣＡＴ ＴｒＡ ＴＴＣＡＣＴ
ＧＧＴ ＣＴＡ ＡＴＡ ａｃ’ｒＧＣＴ ＡＣＣＡＡ
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ＧＣＡＡＣＣＴＣＴＧＧ （ＴＡ ＴｒＣＧ［Ｔ ＣＧ
ＡＧＧＡ ＡＣＣＡＡＡ ＣＴＣＡＣＴ ＧＴＣＣＴＡ
Ｇ（ｉＧからなる組換えＤＮＡ化合物も本発明に含ま
れる（ＤＮＡ塩基が対になる相捕性の性質により、２本
鎖１） Ｎ Ａ分子の一方の配列は他方の配列を決める
のに十分である；従って、本開示ではＤＮＡ配列の解読
鎖のみを表示する）。
上記ＤＮＡ軽鎖化合物のさらに別の変異体は、第１の哺
乳動物種由来のキレート特異的な可変領域およびシグナ
ルペプチドと、第２の別種哺乳動物種由来の不変領域か
らなるキメラ抗体軽鎖をコードしているＤＮＡを含有す
る組換えＤＮＡ化合物であって、該軽鎖可変領域および
シグナルペプチドが次の配列： Ｍｅｔ＾ｌａ Ｔｒｐ Ｉｌａ Ｓｅｔ Ｌｅｕ Ｉｌ
ａ Ｌｅｕ Ｓａｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ＾ｌａ Ｌａｕ
Ｓａｒ Ｓａｒ Ｏ１ｙ＾１烏１１ａ ！３ｅｒ Ｇｌ
ｕＡｌａ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｉｎ Ｇｌｕ
９ｅｒ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｔｈｃ！ｊａｒ Ｐ
ｒｏ ＧＬｙＧｌｕ Ｔｈｒ Ｖａｔ Ｔｈｅ
Ｌａｕ Ｔｈｅ Ｃｙｓ Ａｒｃ Ｓｅｒ
Ｓａｔ Ｔｈｅ Ｏｌｙ Ａｌｍ Ｖａｌ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ ５ｅｒ＾釦 丁ｙｒ Ａｉｍ
Ａｍｎ Ｔｒｐ ＶａＬ Ｇｌｎ Ｇｌｕ
Ｌｙｅ ｆ’ｒｏ Ａｓｐ １（ｉｓ Ｌａｕ
Ｐｈ＠ Ｔｈｒ Ｏｌｙ Ｌａｕｌｌｅ Ｇｌｙ
ＧＬｙ Ｔｈｒ Ａｍｎ Ａｓｎ Ａｒｇ
Ａｌｍ Ｐｅａ Ｃ１ｙ Ｖａｌ Ｐｒｏ
Ａｌａ ＾ｒ怠 Ｐｈａ ！Ｊｅｔ ＧｌｙＳｅ
ｒ Ｌｅｕ Ｉｌａ Ｃ１１ｙ Ａｓｐ Ｌ
ｙｓ Ａｌｅ Ａｌｍ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｉ
ｌａ Ｔｈｒ Ｏｌｙ Ａｌｍ Ｇｉｎ Ｔ
ｈｒ Ｏ１ｕ＾ｓｐ ＧｌｕＡｌａ Ａｒｌ Ｔｙｒ
Ｐｈａ Ｃｙａ Ａｌｅ Ｅ、ｅｕ Ｔｒｐ ’ｒｙ
ｒ ！ｌａｒ＾ａｎ Ｌｅｕ↑ｒｐ Ｖａｊ ＰｈａＧ
ｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｙｅ Ｌ
ａｕ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｏｌｙからなる
アミノ酸配列を有している組換えＤＮＡ化合物である。
乳動物種由来のキレート特異的な可変領域およびシグナ
ルペプチドと、第２の別種哺乳動物種由来の不変領域か
らなるキメラ抗体軽鎖をコードしているＤＮＡを含有す
る組換えＤＮＡ化合物であって、該軽鎖可変領域および
シグナルペプチドが次の配列： Ｍｅｔ＾ｌａ Ｔｒｐ Ｉｌａ Ｓｅｔ Ｌｅｕ Ｉｌ
ａ Ｌｅｕ Ｓａｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ＾ｌａ Ｌａｕ
Ｓａｒ Ｓａｒ Ｏ１ｙ＾１烏１１ａ ！３ｅｒ Ｇｌ
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Ｓａｔ Ｔｈｅ Ｏｌｙ Ａｌｍ Ｖａｌ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ ５ｅｒ＾釦 丁ｙｒ Ａｉｍ
Ａｍｎ Ｔｒｐ ＶａＬ Ｇｌｎ Ｇｌｕ
Ｌｙｅ ｆ’ｒｏ Ａｓｐ １（ｉｓ Ｌａｕ
Ｐｈ＠ Ｔｈｒ Ｏｌｙ Ｌａｕｌｌｅ Ｇｌｙ
ＧＬｙ Ｔｈｒ Ａｍｎ Ａｓｎ Ａｒｇ
Ａｌｍ Ｐｅａ Ｃ１ｙ Ｖａｌ Ｐｒｏ
Ａｌａ ＾ｒ怠 Ｐｈａ ！Ｊｅｔ ＧｌｙＳｅ
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ｙｓ Ａｌｅ Ａｌｍ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｉ
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Ｐｈａ Ｃｙａ Ａｌｅ Ｅ、ｅｕ Ｔｒｐ ’ｒｙ
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ｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｙｅ Ｌ
ａｕ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｏｌｙからなる
アミノ酸配列を有している組換えＤＮＡ化合物である。
また、上記のＤＮＡ軽鎖化合物変異体の解読鎖である組
換えＤＮＡ化合物であって、シグナルペプチドと軽鎖可
変領域の解読鎖が次の配列：ＡＴＯ（ｉＣＣＴｏｅ Ａ
Ｔｒ ＴＣＡ ＣＴＴ ＡＴＡ ＣＴＣＴＣＴ ＣＴＣ
ＣＴＣＧＣＴ ＣＴＣＡＧＣＴＣＡ（ｉｃＴ ＧＣＣＡ
Ｔ’ｒ ＴＣＣＣＡＧ （ｉｃＴ ＧＴＴ （ｉ’ｒｏ
ＡｃｒＣＡＧ ＧＡＡ ＴＣＴ ＧＣＡ ＣＴＣＡｃ
ｅ＾Ｃ＾ＴＣ＾ｃｃ’ｒ ｃａｔＣＭ ＡＣＡ ＣＴＣ
ＡＣＡ ＣＴＣＡＣＴ ＴＯＴ ＣＣ１ＣＴＣＡ ＡＧ
Ｔ ＡＣＴ ＯＧｏ ＧＣＴ （７？ ＡＣ＾ＭゴＡＧ
’ＴＡＡＣＴＡＴ ＧＣＣＭＣＴＯＯＧＴＣＣＡＡ （
ｉＡＡ ＡＡＡ ＣＣＡ Ｇ＾ＴＣ＾７？７＾’ｒｒｃ
＾ＣＴ ＧＯＴ ＣＴＡＡＴＡ ＣＧＴ ＧＣＴ ＡＣ
ＣＭＴ ＡＡＣＣＯＯＧＣＴ ＣＣＡ にＣＣＴ （Ｘ
ＴＴ ＣＣＴ ＧＣＣＡＯＡ ｆｒｃ ＴＣＡＧ（ｉＣ
ＴＣＣＣＴＣＡＴＴ ＣＧＡ ＧＡＣＡＡＧ ＣＣＴ
（ｉｃｅ ＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＡ ＧＧＧ ＧＣＡ
ＣＡＯＡＣＴ ＣＡＡＧＡＴ ＧＡＧ ＧＣＡ
Ａｌｌ；Ａ ＴＡＴ ＴＴＣ丁ＧＴ ＣＣＴ Ｃ
ＴＡ ＴＧＧ ＴＡＣＡＧＣＡＡＣＣＴＣＴＧｉＧ
Ｇ’ＴＡ ’ＩＴＣＧＧ？ ＣＧＡ ＧＯＡ
ＡＣＣＡＡＡ ＣＴＣＡＩＩＴ にＴＣＣＴＡ
０００からなる組換えＤＮＡ化合物も本発明の−・部で
ある。
換えＤＮＡ化合物であって、シグナルペプチドと軽鎖可
変領域の解読鎖が次の配列：ＡＴＯ（ｉＣＣＴｏｅ Ａ
Ｔｒ ＴＣＡ ＣＴＴ ＡＴＡ ＣＴＣＴＣＴ ＣＴＣ
ＣＴＣＧＣＴ ＣＴＣＡＧＣＴＣＡ（ｉｃＴ ＧＣＣＡ
Ｔ’ｒ ＴＣＣＣＡＧ （ｉｃＴ ＧＴＴ （ｉ’ｒｏ
ＡｃｒＣＡＧ ＧＡＡ ＴＣＴ ＧＣＡ ＣＴＣＡｃ
ｅ＾Ｃ＾ＴＣ＾ｃｃ’ｒ ｃａｔＣＭ ＡＣＡ ＣＴＣ
ＡＣＡ ＣＴＣＡＣＴ ＴＯＴ ＣＣ１ＣＴＣＡ ＡＧ
Ｔ ＡＣＴ ＯＧｏ ＧＣＴ （７？ ＡＣ＾ＭゴＡＧ
’ＴＡＡＣＴＡＴ ＧＣＣＭＣＴＯＯＧＴＣＣＡＡ （
ｉＡＡ ＡＡＡ ＣＣＡ Ｇ＾ＴＣ＾７？７＾’ｒｒｃ
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ＣＭＴ ＡＡＣＣＯＯＧＣＴ ＣＣＡ にＣＣＴ （Ｘ
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ＡＣＣＡＡＡ ＣＴＣＡＩＩＴ にＴＣＣＴＡ
０００からなる組換えＤＮＡ化合物も本発明の−・部で
ある。
」二足のＤＮＡ軽鎖化合物、軽鎖解読鎖、またはそれら
のシグナルペプチド含有度”Ｘ４１本の好ましい態様を
以下に挙げる； ａ）第１の哺乳動物種由来のキレート特異的な軽鎖可変
領域が不ズミハイブリドーマから得られたものである、
組換えＤＮＡ軽鎖化合物、解読鎖、またはそのシグナル
ペプチド含有変異体；ｂ）第２の別種哺乳動物種由来の
不変領域がヒト供給源から得られたものである、ａ）の
組換えＤＮＡベクター Ｃ）第２の別種哺乳動物種由来の不変領域がヒト供給源
から得られたものであり、かつ該不変領域がヒトに軽鎖
から取られたちのである、ｂ）の組換えＤＮＡベクター ｄ）不ズミハイブリドーマ由来のキレート特異的な軽鎖
可変領域のプロモーターであって、不ズミハイブリドー
マ中の該遺伝子を発現させるものと同じプロモーターを
さらに含有している、Ｃ）の組換えＤＮＡベクター； ｅ）原核微生物におけるクローニングヘクターとして月
１いるのに適した、ｄ）の組換えＤＮＡベクＩ″）（１
核生物＜＋ｎ胞中て該１〕二匂Ａを発現ご（１う設置し
た翻訳活性化配列およびプロモーターをさらに含有する
、ｄ）の組換えＤＮＡベクター；ｇ）プラスミドｐｓＶ
２ｇｐＬまたはｐｓ Ｖ ２ ｎｅｏから導かれた、ｒ
）の組換えＤＮＡベクター；およびｈ）プラスミドｐＧ
ＣＨＡＫまたはｐＮＣＨＡＫである、ｇ）の組換えＤＮ
Ａベクター 本発明に関しては、「キメラ抗体」という語句は、第１
の哺乳動物種由来のキレート特異的な可変領域と第２の
別種哺乳動物種由来の不変領域からなる抗体を指す。従
って、本発明のキメラ抗体は、キレートに対する特異性
を有する可変領域と、天然にはこの可変領域に伴われな
い予め決めた構造的および生理学的性質を有する不変領
域をコードしている融合遺伝子の産物である。
のシグナルペプチド含有度”Ｘ４１本の好ましい態様を
以下に挙げる； ａ）第１の哺乳動物種由来のキレート特異的な軽鎖可変
領域が不ズミハイブリドーマから得られたものである、
組換えＤＮＡ軽鎖化合物、解読鎖、またはそのシグナル
ペプチド含有変異体；ｂ）第２の別種哺乳動物種由来の
不変領域がヒト供給源から得られたものである、ａ）の
組換えＤＮＡベクター Ｃ）第２の別種哺乳動物種由来の不変領域がヒト供給源
から得られたものであり、かつ該不変領域がヒトに軽鎖
から取られたちのである、ｂ）の組換えＤＮＡベクター ｄ）不ズミハイブリドーマ由来のキレート特異的な軽鎖
可変領域のプロモーターであって、不ズミハイブリドー
マ中の該遺伝子を発現させるものと同じプロモーターを
さらに含有している、Ｃ）の組換えＤＮＡベクター； ｅ）原核微生物におけるクローニングヘクターとして月
１いるのに適した、ｄ）の組換えＤＮＡベクＩ″）（１
核生物＜＋ｎ胞中て該１〕二匂Ａを発現ご（１う設置し
た翻訳活性化配列およびプロモーターをさらに含有する
、ｄ）の組換えＤＮＡベクター；ｇ）プラスミドｐｓＶ
２ｇｐＬまたはｐｓ Ｖ ２ ｎｅｏから導かれた、ｒ
）の組換えＤＮＡベクター；およびｈ）プラスミドｐＧ
ＣＨＡＫまたはｐＮＣＨＡＫである、ｇ）の組換えＤＮ
Ａベクター 本発明に関しては、「キメラ抗体」という語句は、第１
の哺乳動物種由来のキレート特異的な可変領域と第２の
別種哺乳動物種由来の不変領域からなる抗体を指す。従
って、本発明のキメラ抗体は、キレートに対する特異性
を有する可変領域と、天然にはこの可変領域に伴われな
い予め決めた構造的および生理学的性質を有する不変領
域をコードしている融合遺伝子の産物である。
本発明の第２の態様は、第１の哺乳動物種由来のキレー
ト特異的な可変領域と、第２の別種哺乳動物種由来の不
変領域からなるキメラ抗体重鎖をコードしているＤＮＡ
を含有する組換えＤＮＡ化合物であって、該重鎖可変領
域が、次の配列：Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｅ
ｕ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｓｅｒ ＧＬｙ Ｇｌ
ｙ Ａｓｐ Ｓｉｒ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｐｒｏ
Ｇｌｙ Ｇｌｙ ５ｅｒＬａｕ Ｌｙｓ Ｌｓｕ
Ｓｅｒ Ｃｙｇ Ａｌａ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ
Ｐｈａ Ｔｈｒ Ｌａｕ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｔ
ｈｒ Ｍｅ１５ｅｒ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｇｌｎ
Ｔｈｒ Ｅ’ｒｏ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ａｒｇ ＴＡｕ
Ｇｌｕ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ａｌａ Ｔｈｒ ＴｈｒＬ
ｅｕ Ｓａｒ （ｉｌｙ Ｇｌｙ Ｏｌｙ Ｐｈａ Ｔ
ｈｒ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｖａ
ｌ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｒｇ −ＰｈｅＴｈｒ ＩＬｅ
Ｓａｒ Ａｒｇ Ａｓｐ Ａｓｎ＾ｌａ Ｇｉｎ Ａ
ｓｎ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｇｉｎ Ｌａ
ｕ Ａｓｎ ５ｅｒＬａｕ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｇｌｕ
Ａｓｐ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｃ
ｙｓ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｈｉｓ＾ｒｇ ＰｈｅνａＬＨ
ｉｓ Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｏｌｙ Ｔｈｒムｕ
Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｖ社Ｓｅｒ Ａｌａ＾１ａからなるア
ミノ酸配列を有している組換えＤＮＡ化合物である（こ
の態様を、ｒＤＮＡＤＮＡ重鎖化合物ぶ）。
ト特異的な可変領域と、第２の別種哺乳動物種由来の不
変領域からなるキメラ抗体重鎖をコードしているＤＮＡ
を含有する組換えＤＮＡ化合物であって、該重鎖可変領
域が、次の配列：Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｅ
ｕ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｓｅｒ ＧＬｙ Ｇｌ
ｙ Ａｓｐ Ｓｉｒ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｐｒｏ
Ｇｌｙ Ｇｌｙ ５ｅｒＬａｕ Ｌｙｓ Ｌｓｕ
Ｓｅｒ Ｃｙｇ Ａｌａ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ
Ｐｈａ Ｔｈｒ Ｌａｕ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｔ
ｈｒ Ｍｅ１５ｅｒ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｇｌｎ
Ｔｈｒ Ｅ’ｒｏ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ａｒｇ ＴＡｕ
Ｇｌｕ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ａｌａ Ｔｈｒ ＴｈｒＬ
ｅｕ Ｓａｒ （ｉｌｙ Ｇｌｙ Ｏｌｙ Ｐｈａ Ｔ
ｈｒ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｖａ
ｌ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｒｇ −ＰｈｅＴｈｒ ＩＬｅ
Ｓａｒ Ａｒｇ Ａｓｐ Ａｓｎ＾ｌａ Ｇｉｎ Ａ
ｓｎ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｇｉｎ Ｌａ
ｕ Ａｓｎ ５ｅｒＬａｕ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｇｌｕ
Ａｓｐ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｃ
ｙｓ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｈｉｓ＾ｒｇ ＰｈｅνａＬＨ
ｉｓ Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｏｌｙ Ｔｈｒムｕ
Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｖ社Ｓｅｒ Ａｌａ＾１ａからなるア
ミノ酸配列を有している組換えＤＮＡ化合物である（こ
の態様を、ｒＤＮＡＤＮＡ重鎖化合物ぶ）。
また、ＤＮＡ重鎖化合物の一部として含まれるのは、重
鎖可変領域の解読路が、次の配列：ＣＭ ＧＴＧ ＡＣ
ＯＣＴＧ （ＴＣＧＡＣＴＣＴ ＧＧＧ ＧＧＡ ＧＡ
ＣＴＣＡ ＧＴＧ ＡＡＧ ＣＣＴ ＧＧＡ ＧＧＧ
ＴＣＣＣＴＧ ＡＡＡ ＣＴＣＴＣＣ賀＊ ＧＣＡ Ｇ
ＣＣＴＣＴ ＧＧＡ ＴｒＣＡＣＴ ＴｒＡ ＡＧＴ
ＧＧＴ ＧＡＡ ＡＣＣＡＴＧＴＣＴ ＴＧＧＣＧＣＣ
ＣＡＧ ＡＣＴ ＣＣＧ ＧＡＧ ＡＡＧ Ａ（：Ｇ
ＣＴＧ ＣＡＣＴＧＧ ＧＴＣＧＣＡ ＡＣＣＡＣＴＣ
丁Ｔ ＡＣＴ Ｇ（Ｔ Ｇ（Ｔ ＧＧＴ ＴＴＣＡＣＣ
ＴＴＣＴＡＴ ＴＣＡ ＧＣＣＡＧＴ ＧＴＣＡＡ
Ｇ ＧＧＴ ｃｃＴ ＴＴｃＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧ
Ａ ＧＡＣＡＡＴ ＧＣＣＣＡＧ ＡＡＣＡＡＣＣＴＣ
ＴＡＴ ＣＴＡ ＣＡＡ ＣＴＧ ＡＡＴ ＡＧＴＣＴ
ＯＡＧＯＴＣＴ ＣＡＧ ＧＡＣＡＣＧ ＧＣＣＴＴＧ
ＴＡＴ ＴＴＣＴＧ’ｒ ＧＣＡ ＡｃＴＣＡ’ｒ
ＣＧＧ ｍ ＧＴｒＣＡＣＴＧＧ ＧＣＣＣＡＣＧＡＧ
ＡＣＴ ＣＴＧ ＧＴＣＡＣＴ （ＹＣＴＣＴ ＧＣ
Ａ ＧＣＣからなる組換えＤＮＡ化合物である（「重鎖
解読路」）。
鎖可変領域の解読路が、次の配列：ＣＭ ＧＴＧ ＡＣ
ＯＣＴＧ （ＴＣＧＡＣＴＣＴ ＧＧＧ ＧＧＡ ＧＡ
ＣＴＣＡ ＧＴＧ ＡＡＧ ＣＣＴ ＧＧＡ ＧＧＧ
ＴＣＣＣＴＧ ＡＡＡ ＣＴＣＴＣＣ賀＊ ＧＣＡ Ｇ
ＣＣＴＣＴ ＧＧＡ ＴｒＣＡＣＴ ＴｒＡ ＡＧＴ
ＧＧＴ ＧＡＡ ＡＣＣＡＴＧＴＣＴ ＴＧＧＣＧＣＣ
ＣＡＧ ＡＣＴ ＣＣＧ ＧＡＧ ＡＡＧ Ａ（：Ｇ
ＣＴＧ ＣＡＣＴＧＧ ＧＴＣＧＣＡ ＡＣＣＡＣＴＣ
丁Ｔ ＡＣＴ Ｇ（Ｔ Ｇ（Ｔ ＧＧＴ ＴＴＣＡＣＣ
ＴＴＣＴＡＴ ＴＣＡ ＧＣＣＡＧＴ ＧＴＣＡＡ
Ｇ ＧＧＴ ｃｃＴ ＴＴｃＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧ
Ａ ＧＡＣＡＡＴ ＧＣＣＣＡＧ ＡＡＣＡＡＣＣＴＣ
ＴＡＴ ＣＴＡ ＣＡＡ ＣＴＧ ＡＡＴ ＡＧＴＣＴ
ＯＡＧＯＴＣＴ ＣＡＧ ＧＡＣＡＣＧ ＧＣＣＴＴＧ
ＴＡＴ ＴＴＣＴＧ’ｒ ＧＣＡ ＡｃＴＣＡ’ｒ
ＣＧＧ ｍ ＧＴｒＣＡＣＴＧＧ ＧＣＣＣＡＣＧＡＧ
ＡＣＴ ＣＴＧ ＧＴＣＡＣＴ （ＹＣＴＣＴ ＧＣ
Ａ ＧＣＣからなる組換えＤＮＡ化合物である（「重鎖
解読路」）。
上記ＤＮＡ重鎖化合物のさらに別の変異体は、第１の哺
乳動物種由来のキレート特異的な重鎖可変領域およびシ
グナルペプチドと、第２の別種哺乳動物種由来の不変領
域からなるキメラ抗体重鎖をコードしているＤＮＡを含
有する組換えＤＮＡ化合物であって、該重鎖可変領域が
次の配クリ：Ｍｅｅ Ｓｅｒ Ｐｈａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ
Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｉｌａ Ｐｈ＠Ｌｅｕ Ｖａｔ Ｌ
ｅｕ Ｉｌｅ ｔａｕ Ｌｙｓ Ｇｕｙ ＶａｌＧｉｎ
ＣｙａＧｌｕＶａＬＴｈｒＬｅｕＶａｌＧｌｕＳｅｒＧ
ＬｙＧＬｙＡｓｐＳｓｒＹａｋＬｙｓＰｒｏＧｌｙＧｌ
ｙ Ｓｅｒ Ｌａｕ Ｌｙｓ Ｌａｕ Ｓａｒ Ｃｙｓ
Ａｌａ＾ｌａ Ｓａｒ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｌ
ａｕ Ｓｅｒ Ｇｌｙ ＧｌｕＴｈｒ Ｍｅｔ Ｓ
ｅｔ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｇｉｎ Ｔ
ｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌ
ａｕ Ｇｌｕ Ｔｒｐ Ｖａｔ ＡｌａＴｈｒ
Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ
Ｇｕｙ Ｐｈａ Ｔｈｒ ｉ’ｈａ Ｔｙ
ｒ Ｂａｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｌｙ
ｓ ＧｌｙＡｒｇ Ｆ’ｈｅ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｓｅ
ｒ＾ｒｇ ＡＭＰ Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｉｎ Ａｓｎ
Ａｓｎ Ｌｅｕτｙｒ ｌａｕ Ｇｌａ ｋｕＡｓｎ
Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｔ
ｈｒ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｐｈａ Ｃｙ−Ａｌａ
Ｓｅｒ Ｈ１ｓ＾ｒ８Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｈｉｓ
Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｏｌｙ Ｔｈｒ
Ｌａｕ ！／ｍｌ Ｔｈｒ Ｍａｌ Ｓｅｒ
Ａｌａ Ａｌａからなるアミノ酸配列を何してい
る組換えＤＮＡ化合物である。
乳動物種由来のキレート特異的な重鎖可変領域およびシ
グナルペプチドと、第２の別種哺乳動物種由来の不変領
域からなるキメラ抗体重鎖をコードしているＤＮＡを含
有する組換えＤＮＡ化合物であって、該重鎖可変領域が
次の配クリ：Ｍｅｅ Ｓｅｒ Ｐｈａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ
Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｉｌａ Ｐｈ＠Ｌｅｕ Ｖａｔ Ｌ
ｅｕ Ｉｌｅ ｔａｕ Ｌｙｓ Ｇｕｙ ＶａｌＧｉｎ
ＣｙａＧｌｕＶａＬＴｈｒＬｅｕＶａｌＧｌｕＳｅｒＧ
ＬｙＧＬｙＡｓｐＳｓｒＹａｋＬｙｓＰｒｏＧｌｙＧｌ
ｙ Ｓｅｒ Ｌａｕ Ｌｙｓ Ｌａｕ Ｓａｒ Ｃｙｓ
Ａｌａ＾ｌａ Ｓａｒ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｌ
ａｕ Ｓｅｒ Ｇｌｙ ＧｌｕＴｈｒ Ｍｅｔ Ｓ
ｅｔ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｇｉｎ Ｔ
ｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌ
ａｕ Ｇｌｕ Ｔｒｐ Ｖａｔ ＡｌａＴｈｒ
Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ
Ｇｕｙ Ｐｈａ Ｔｈｒ ｉ’ｈａ Ｔｙ
ｒ Ｂａｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｌｙ
ｓ ＧｌｙＡｒｇ Ｆ’ｈｅ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｓｅ
ｒ＾ｒｇ ＡＭＰ Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｉｎ Ａｓｎ
Ａｓｎ Ｌｅｕτｙｒ ｌａｕ Ｇｌａ ｋｕＡｓｎ
Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｔ
ｈｒ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｐｈａ Ｃｙ−Ａｌａ
Ｓｅｒ Ｈ１ｓ＾ｒ８Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｈｉｓ
Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｏｌｙ Ｔｈｒ
Ｌａｕ ！／ｍｌ Ｔｈｒ Ｍａｌ Ｓｅｒ
Ａｌａ Ａｌａからなるアミノ酸配列を何してい
る組換えＤＮＡ化合物である。
また、シグナルペプチドと重鎖可変領域の解読路が次の
配列 ＡＴＧ ＡＧＣｍ ＧＧＧ ＣＴＧ ＡＧＣｆｒＧ Ａ
ＴＴ ＴｒＣＣＴＴ ＧＴＣＣＴＡＡＴｒ ＴＴＡ Ａ
ＡＡ ＧＧ’ｒ ＧＴＣＣＡＧ Ｔ（Ｔ ＧＡＡ
ＧＴＧ ＡＣＧ ＣＴＧ ＧＴＧ ＧＡＧ
ＴＣＴ ＧＧＧ ＣＧＡ ＣＡＣＴＣＡ ＣＴＣ
ＡＡＧ ＣＣＴ ＧＧｈＧＧＧ ＴＣＣＣＴＧ ＡＭ
ＣＴＣＴＣＣＴＧＴ ＧＣＡ ＧＣＣＴＣＴ ＧＧＡ
’ｒＴＣＡＣＴ ＴｒＡ Ａ（Ｔ Ｇ（Ｔ ０ＡＡＡ
ＣＣＡＴＯＴＣＴ ＴＧＧ ＧＴＴ ＣＧＣＣＡＧ Ａ
ＣＴ ＣＣＧ ＧＡＧ ＭＧ ＡＧＧ ＣＴＧ ＧＡＣ
ＴＯＣＧＴＣ０ＣＡＡＣＣＡＣＴ ＣＴｒＡＧＴ ＧＧ
’ｒ ＧｃＴＧ醒ＴＴＣＡＣＣＴｒＣＴＡＴ ＴＣＡ
ＧＣＣＡＧ’ｒ ＧＴＧ ＡＡＧ ＧＧＴＣＧＴ ＴＴ
ＣＡＣＣＡＴＣＴＣ（： ＡＧＡ ＧＡＣＡＡＴ ＧＣ
ＣＣＡＧ ＭＣＭＣＣＴＣ？Ａτσ＾ＣＡＡ ＣＴＧＡ
ＡＴ ＡＧＴ ＣＴＧ ＡＧＧ ＴＣＴ ＱｋＧ ＧＡ
ＣＡＣＧ ＧＣＣＴＴＧ ＴＡＴ ＴＴＣＴ（Ｔ ＧＣ
Ａ ＡＧ’ｒ ＣＡＴ Ｃ０Ｇｍ ＧＴｒ ＣＡＣＴＧ
Ｇ ’ＧＧＣＣＡＣＧＧＧ ＡＣＴ ＣＴＣＧＴＣＡＣ
Ｔ ＧＴＣＴＣＴ ＧＣＡ ＧＣＣからなる、上記のＤ
ＮＡ重鎖化合物変異体の組換えＤＮＡ化合物も本発明の
一部である。
配列 ＡＴＧ ＡＧＣｍ ＧＧＧ ＣＴＧ ＡＧＣｆｒＧ Ａ
ＴＴ ＴｒＣＣＴＴ ＧＴＣＣＴＡＡＴｒ ＴＴＡ Ａ
ＡＡ ＧＧ’ｒ ＧＴＣＣＡＧ Ｔ（Ｔ ＧＡＡ
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Ｔ ＧＴＣＴＣＴ ＧＣＡ ＧＣＣからなる、上記のＤ
ＮＡ重鎖化合物変異体の組換えＤＮＡ化合物も本発明の
一部である。
上記のＤＮＡ重鎖化合物、ｆｆｉ鎖解読鎖、またはそれ
らのシグナルペプチド含有変異体の好ましい態様を以下
に挙げる： ａ）第１の哺乳動物種由来のキレート特異的な可変領域
がネズミハイブリドーマから得られたものである、上記
のＤＮＡ重鎖化合物、解読路、またはシグナルペプチド
含有変異体のＤＮＡ配列を含有する組換えＤＮＡベクタ
ー； ｂ）第２の別種哺乳動物種由来の不変領域がヒト供給源
から得られたものである、ａ）の組換えＤＮＡベクター
； Ｃ）第２の別種哺乳動物種由来の不変領域がヒト供給源
から得られたものであり、かつ該不変領域がヒ）ＩｇＧ
１重鎖から取られた不変領域である、ｂ）の組換えＤＮ
Ａベクター； ｄ）原核微生物におけるクローニングベクターとして用
いるのに適した、Ｃ）の組換えＤＮＡベクター ｅ）プラスミドｐＨＧｌ−ＣＨＡである、ｄ）の組換え
ＤＮＡベクター； ｆ）真核系細胞中で該ＤＮＡを発現させるよう設置した
翻訳活性化配列およびプロモーターをさらに含イｆする
、ｃ）の組換えｌ） Ｎ Ａベクター；ｇ）プラスミド
ｐＳ Ｖ ２ｎｅｏまたはｐＳ Ｖ ２ ｇｐｔがら導
かれた、「）の４１１１％え１．Ｉ ＮΔべ々ンー；お
よび１＋）ブラスミ’ ＦｐＮＣＩＩＡＧ ｌまた１ｉ
ｐＧ（：ＩＩＡＧｌである、ｇ）の組換えＬ）Ｎへベク
ター。
らのシグナルペプチド含有変異体の好ましい態様を以下
に挙げる： ａ）第１の哺乳動物種由来のキレート特異的な可変領域
がネズミハイブリドーマから得られたものである、上記
のＤＮＡ重鎖化合物、解読路、またはシグナルペプチド
含有変異体のＤＮＡ配列を含有する組換えＤＮＡベクタ
ー； ｂ）第２の別種哺乳動物種由来の不変領域がヒト供給源
から得られたものである、ａ）の組換えＤＮＡベクター
； Ｃ）第２の別種哺乳動物種由来の不変領域がヒト供給源
から得られたものであり、かつ該不変領域がヒ）ＩｇＧ
１重鎖から取られた不変領域である、ｂ）の組換えＤＮ
Ａベクター； ｄ）原核微生物におけるクローニングベクターとして用
いるのに適した、Ｃ）の組換えＤＮＡベクター ｅ）プラスミドｐＨＧｌ−ＣＨＡである、ｄ）の組換え
ＤＮＡベクター； ｆ）真核系細胞中で該ＤＮＡを発現させるよう設置した
翻訳活性化配列およびプロモーターをさらに含イｆする
、ｃ）の組換えｌ） Ｎ Ａベクター；ｇ）プラスミド
ｐＳ Ｖ ２ｎｅｏまたはｐＳ Ｖ ２ ｇｐｔがら導
かれた、「）の４１１１％え１．Ｉ ＮΔべ々ンー；お
よび１＋）ブラスミ’ ＦｐＮＣＩＩＡＧ ｌまた１ｉ
ｐＧ（：ＩＩＡＧｌである、ｇ）の組換えＬ）Ｎへベク
ター。
本発明の第３の態様は、第１の１−１１乳動物種山米の
キレート特異的な可変領域と、第２の別種１１１１乳動
物種由来の不変領域からなるキメラモノクローナル抗体
であって、可変軽鎖領域が次の配列：からなるアミノ酸
配列を有しているキメラ抗体である。
キレート特異的な可変領域と、第２の別種１１１１乳動
物種由来の不変領域からなるキメラモノクローナル抗体
であって、可変軽鎖領域が次の配列：からなるアミノ酸
配列を有しているキメラ抗体である。
上記のキレート特異的な軽鎖キメラモアクローナル抗体
の変異体は、次の配列 Ｍｅｔ Ａｌａ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｓｅｒ
Ｌｅｕ ｌｉｅ Ｌａｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ
Ｌｅｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｓｅｔ
Ｇｌｙ ＾ｌ畠ＩＩｓ Ｓａｒ Ｇｌｎ＾１ｍ Ｖａ
ｌ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｉｎ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｌａ
Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｉ’ｒｏ Ｇｌｙ
Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌａｕ Ｔｈｒ Ｃ
ｙｍ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ＾ｌａ
Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｓｅｔ＾ｓｎ Ｔｙｒ Ａ
Ｌａ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ｇｉｎ Ｏｌｕ Ｌｙ
ｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ｌａｕ Ｐｂｅ ＴｈＣ
ＧＬｙ−Ｌｅｕｌｉｅ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｔｈｒ
Ａｓｎ Ａｓｎ Ａｒｃ Ａｌａ Ｐｒｏ
（ｉｌｙ Ｖａｌ Ｐｒｏ ＡＬａ Ａｒ
ｃ Ｐｈｅ Ｓａｒ ＧｌｙＳａｔ Ｌａｕ
ｌｉｅ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｌｙｓ ＾１１
Ａｌａ Ｌｅｕ 丁ｈｒ ｌｉｅ Ｔｈｒ Ｏ
ｌｙ Ａｌａ Ｇｉｎ Ｔｈｒ Ｇｌｕ＾ｓｐ
Ｇｌｕ Ａｌａ Ａｒｃ Ｔｙｒ Ｉ’ｈｅ
Ｃｙｓ Ａｌａ Ｌｅｕ 丁ｒｐ Ｔｙｒ
Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｔｔｐ Ｖａｌ
ＰｈｅＧｌｙ Ｇｌｙ （ｉｌｙ Ｔｈｒ
Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｖａｔ Ｌｅｕ
ＧＬｙからなるアミノ酸配列を有するｕｊなｌ１ｉＩｆ
Ｉ領域と対応のシグナルペプチドを含んでいる。
の変異体は、次の配列 Ｍｅｔ Ａｌａ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｓｅｒ
Ｌｅｕ ｌｉｅ Ｌａｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ
Ｌｅｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｓｅｔ
Ｇｌｙ ＾ｌ畠ＩＩｓ Ｓａｒ Ｇｌｎ＾１ｍ Ｖａ
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Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌａｕ Ｔｈｒ Ｃ
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ｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ｌａｕ Ｐｂｅ ＴｈＣ
ＧＬｙ−Ｌｅｕｌｉｅ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｔｈｒ
Ａｓｎ Ａｓｎ Ａｒｃ Ａｌａ Ｐｒｏ
（ｉｌｙ Ｖａｌ Ｐｒｏ ＡＬａ Ａｒ
ｃ Ｐｈｅ Ｓａｒ ＧｌｙＳａｔ Ｌａｕ
ｌｉｅ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｌｙｓ ＾１１
Ａｌａ Ｌｅｕ 丁ｈｒ ｌｉｅ Ｔｈｒ Ｏ
ｌｙ Ａｌａ Ｇｉｎ Ｔｈｒ Ｇｌｕ＾ｓｐ
Ｇｌｕ Ａｌａ Ａｒｃ Ｔｙｒ Ｉ’ｈｅ
Ｃｙｓ Ａｌａ Ｌｅｕ 丁ｒｐ Ｔｙｒ
Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｔｔｐ Ｖａｌ
ＰｈｅＧｌｙ Ｇｌｙ （ｉｌｙ Ｔｈｒ
Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｖａｔ Ｌｅｕ
ＧＬｙからなるアミノ酸配列を有するｕｊなｌ１ｉＩｆ
Ｉ領域と対応のシグナルペプチドを含んでいる。
上記のキレート特異的な軽鎖キメラモノクローナル抗体
、またはその対応シグナルペプチドを含む変異体の好ま
しいｊ島様を以下に挙げる一ａ）可変軽鎖領域がネズミ
ハイブリドーマから１ｉＪられたものである、牛し−ト
特７４的な軽鎖キメラモノクローナル抗体； ｂ）不変軽鎖領域がヒトＤＩ、給ｉｈ：’−から１ｉＩ
られたらのテする、ａ）のキメラモノクローナル抗体：
および Ｃ）不変軽鎖領域がヒト供給源から１１１られたちので
あり、かつヒトに不変領域である、ｂ）のキメラモアク
ローナル抗１本。
、またはその対応シグナルペプチドを含む変異体の好ま
しいｊ島様を以下に挙げる一ａ）可変軽鎖領域がネズミ
ハイブリドーマから１ｉＪられたものである、牛し−ト
特７４的な軽鎖キメラモノクローナル抗体； ｂ）不変軽鎖領域がヒトＤＩ、給ｉｈ：’−から１ｉＩ
られたらのテする、ａ）のキメラモノクローナル抗体：
および Ｃ）不変軽鎖領域がヒト供給源から１１１られたちので
あり、かつヒトに不変領域である、ｂ）のキメラモアク
ローナル抗１本。
本発明のさらに別の１ム（浪は、第１の哺乳動物種由来
のキレート特異的な重鎖可変領域と、第２の別種ｌＮ１
１乳動物種由来の不変領域からなるキメラモノクローナ
ル抗体であって、可変重鎖領域が次の配列： Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌ＠ｕ Ｖａｌ
Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｐ
Ｓｉｒ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｙ
Ｇｌｙ ５ａｒＬｅｕ Ｌｙｓ Ｌａｕ Ｓｅ
ｔ Ｃｙｓ Ａｌｍ Ａｌｅ Ｓｅｔ Ｏｌ
ｙ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｌｅｕ ！ｉｅｒ Ｏ
ｌｙ Ｇｌｕ 丁ｈｒＭａｔ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｖ
ａｌ Ａｒｇ Ｇｉｎ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｌｙ
ｓ Ａｒ畠Ｌａｕ Ｇｌｕ Ｔｒｐ ＶａＬ＾Ｌａ Ｔ
ｈｒＴｈｒ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｏｌｙ Ｇｌｙ
Ｏｌｙ Ｉ’ｈａ Ｔｈｒ Ｐｈａ Ｔｙ
ｒ Ｓａｒ Ａｌａ Ｓａｒ Ｖａｌ Ｌｙ
ｅ Ｏｌｙ ＡｒｇＰｈｅ Ｔｈｒ ＩＩｓ Ｓａ
ｔ Ａｒｇ Ａｓｐ Ａｓｎ＾ｌａ Ｇｉｎ Ａｓｎ
Ａｍｎ Ｌａｕ Ｔｙｒ Ｔｘｕ Ｇｉｎ Ｌｅｕ＾＄
ｌ５ｅｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｓａｔ Ｇｌｕ Ａｓｐ
Ｔｈｒ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｐｂｅ Ｃｙｓ＾ｌ
ａ Ｓｅｒ ）ｌｉｓ＾ｒｇ ＰｈｅＶａｌ ）Ｉｉ
ｓ Ｔｒｐ Ｏｌｙ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｔｈ
ｅ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｓａ
ｒ Ａｌｍ Ａｌｍからなるアミノ酸配列を有して
いるキメラ抗体である。
のキレート特異的な重鎖可変領域と、第２の別種ｌＮ１
１乳動物種由来の不変領域からなるキメラモノクローナ
ル抗体であって、可変重鎖領域が次の配列： Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌ＠ｕ Ｖａｌ
Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｐ
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ｅ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｓａ
ｒ Ａｌｍ Ａｌｍからなるアミノ酸配列を有して
いるキメラ抗体である。
上記のキレート特異的な重鎖キメラモノクロ−・ナル抗
体の変異体は、次の配列 Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌ
ｅｕ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｌｅｕ ＩＩ
ｓ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｇｌｙν社Ｇｉｎ Ｃｙｓ
（ｉｌｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ
Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｐ
Ｓａｒ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｐｒｏ ＧｌｙＧ
ｌｙ Ｓｅｒ Ｌｅｕ ＬｙｌＩ Ｌｅｕ Ｓ
ｅｒ Ｃｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇ
ｌｙ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｇ
ｌｙ ＧｌｕＴｈｒ Ｍｅｔ Ｓｅｒτｔｐ Ｖａｌ
Ａｒｇ Ｇｉｎ Ｔｂｒ Ｐｒｏ ＧＬｕ Ｌｙｓ＾
ｃ色Ｌｅｕ ＧＬｕ Ｔｒｐ ＶａＬ＾ＬａＴｈｒ Ｔ
ｈｒ Ｌｅｕ Ｓａｔ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｈ
ｅ Ｔｈｒ Ｐｈａ Ｔｙｒ Ｓｅｒ ＡＬａ Ｓａｒ
ＶａＬ Ｌｙｓ Ｇｌｙ＾ｒｇ Ｐｈｅ Ｔｈｒ
ｌｉｅ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｌ
ａ Ｇｉｎ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｔｙｒ
Ｌｅｕ Ｇｉｎ Ｌｅｕ八ｓへ Ｓｅｒ Ｌｅ
ｕ Ａｒｇ Ｓｅｔ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｔｈｒ
Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｐｂｅ Ｃｙｍ
Ａｌａ Ｓｅｔ １ｌｉｓ ＡｒｇＰｈｅ Ｖａｌ
１ｌｉｓ Ｔｒｐ Ｇｌｙ １ｌｌｓ Ｇｌｙ Ｔｈ
ｒ Ｌｅｕ ＶａＬ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｓｅｔ＾ｌａ
ＡＬａからなるアミノ酸配列を有する１、ＩＪ変市！Ｌ
”ｌ領域と対上記のキレート特異的な重鎖可変領域キメ
ラモノクローナル抗体、またはその対応シグナルペプチ
ドを含む変異体の好ましい態様には以下に挙げるものが
含まれる： ａ）可変重鎖領域がネズミハイブリドーマから得られた
ものである、キレート特異的な重鎖可変領域キメラモノ
クローナル抗体； ｂ）不変重鎖領域がヒト供給源から得られたちのである
、ａ）のキメラモノクローナル抗体；および Ｃ）不変重鎖領域かヒト供給源から得られたものであり
、かつヒトＩｇＧ１不変領域からのものである、ｂ）の
牛メラモノクローナル抗Ｋ。
体の変異体は、次の配列 Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌ
ｅｕ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｌｅｕ ＩＩ
ｓ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｇｌｙν社Ｇｉｎ Ｃｙｓ
（ｉｌｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ
Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｐ
Ｓａｒ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｐｒｏ ＧｌｙＧ
ｌｙ Ｓｅｒ Ｌｅｕ ＬｙｌＩ Ｌｅｕ Ｓ
ｅｒ Ｃｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇ
ｌｙ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｇ
ｌｙ ＧｌｕＴｈｒ Ｍｅｔ Ｓｅｒτｔｐ Ｖａｌ
Ａｒｇ Ｇｉｎ Ｔｂｒ Ｐｒｏ ＧＬｕ Ｌｙｓ＾
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ｅ Ｔｈｒ Ｐｈａ Ｔｙｒ Ｓｅｒ ＡＬａ Ｓａｒ
ＶａＬ Ｌｙｓ Ｇｌｙ＾ｒｇ Ｐｈｅ Ｔｈｒ
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ｕ Ａｒｇ Ｓｅｔ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｔｈｒ
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ＡＬａからなるアミノ酸配列を有する１、ＩＪ変市！Ｌ
”ｌ領域と対上記のキレート特異的な重鎖可変領域キメ
ラモノクローナル抗体、またはその対応シグナルペプチ
ドを含む変異体の好ましい態様には以下に挙げるものが
含まれる： ａ）可変重鎖領域がネズミハイブリドーマから得られた
ものである、キレート特異的な重鎖可変領域キメラモノ
クローナル抗体； ｂ）不変重鎖領域がヒト供給源から得られたちのである
、ａ）のキメラモノクローナル抗体；および Ｃ）不変重鎖領域かヒト供給源から得られたものであり
、かつヒトＩｇＧ１不変領域からのものである、ｂ）の
牛メラモノクローナル抗Ｋ。
さらに、本発明は、第１の哺乳動物種由来のキレート特
異的な可変領域と、第２の別種哺乳動物種由来の不変領
域からなるキメラモノクローナル抗体であって、可変軽
鎖領域か次の配列：応のシグナルペプチドをなんでいる
。
異的な可変領域と、第２の別種哺乳動物種由来の不変領
域からなるキメラモノクローナル抗体であって、可変軽
鎖領域か次の配列：応のシグナルペプチドをなんでいる
。
Ｇｉｎ Ａｌａ Ｖａｌ Ｖａｔ Ｔｈｒ Ｇｉｎ Ｇ
ｌｕ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｌ１ｒ Ｔｈｒ Ｓ
ｅｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｔｈｒνａｌ Ｔｈｒ
Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｓｅｒ
Ｔｈｒ ＧＬｙ Ａｌａ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｓ
ｅｒ Ａｍｎ ＴｙｒＡｌａ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｖａｎ
； Ｇｉｎ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ １ｌｉ
ｓ ［、ｅｕ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ ｌｉ
ｅ ＧｌｙＣ１！、ｌ Ｔｈｒ Ａａｎ Ａｓｎ Ａｒ
ｇ＾ｌａ Ｐｒｏ Ｃ１ｙ Ｖａｔ Ｐｒｏ＾１蟲＾ｒ
ｇ Ｐｈｅ Ｓｅｔ Ｇｌｙ Ｓｅｒ ＬｅｕＪｌｅ
Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｌａ
Ｌｅｕ Ｔｈｒ ｌｉｅ Ｔｈｒ Ｇｌｙ ＡＩ
ＪＩ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｏｌｕ Ａｓｐ Ｇｌ
ｕＡｌａ ＡｒＨＴｙｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｌ
ｅｕ Ｔｒｐ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｔｒ
ｐ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｇｌｙ ＧＬｙＧＬｙ Ｔｈｒ
Ｌｙｉ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｌｅｕ
Ｇｌｙからなる°７’ミノ酸配列配有しており；そ
して、可変軽鎖領域が次の配列： Ｇｌｕ ＶａＬ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｓ
ｅｒ Ｇｌｙ Ｏｌｙ Ａｓｐ Ｓｅｒ ＶａＬ Ｌｙ
ａＰｒｏ Ｇｌｙ Ｇｌｙ ５ｅｒＬｅｕ Ｌｙｓ
Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ａｌａ Ａｌａ
Ｓｅｒ Ｏｌｙ Ｐｈａ Ｔｈｒ Ｌｅｕ
Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｍｅ１５ｅ
ｒ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｔｈｒ ｌ”ｒ
ｏ Ｏｌｕ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｔｒｐ
Ｖａｌ Ａｌａ Ｔｈｒ ＴｈｒＬｅｕ Ｓｅｒ Ｇ
ｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｐｈａ Ｔｙ
ｒ Ｓｅｒ＾ｌａ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｌｙｍ Ｇｌｙ
ＡｒＢ ＰｈａＴｈｒ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ａｓ
ｐ Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｌｅｕ
Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｇｉｎ Ｌｅｕ Ａｓｎ ５ｅｔＬ
ｅｕ Ａｒｇ Ｓｅｔ （ｉｌｕ Ａｓｐ
Ｔｈｒ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｐｈｅ
Ｃｙｓ Ａｌａ Ｓｅｒ ｌ１ｉｓ ＡｒＢ
Ｐｈｅ Ｖａｌｌｌｉｓ Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ｈｉｓ
ｔｌｉｌｙ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｖａ
ｌ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｌａからなる゛ｒアミノ酸配列
ｆｆシているキメラ抗体を包含し”Ｃいる。
ｌｕ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｌ１ｒ Ｔｈｒ Ｓ
ｅｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｔｈｒνａｌ Ｔｈｒ
Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｓｅｒ
Ｔｈｒ ＧＬｙ Ａｌａ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｓ
ｅｒ Ａｍｎ ＴｙｒＡｌａ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｖａｎ
； Ｇｉｎ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ １ｌｉ
ｓ ［、ｅｕ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ ｌｉ
ｅ ＧｌｙＣ１！、ｌ Ｔｈｒ Ａａｎ Ａｓｎ Ａｒ
ｇ＾ｌａ Ｐｒｏ Ｃ１ｙ Ｖａｔ Ｐｒｏ＾１蟲＾ｒ
ｇ Ｐｈｅ Ｓｅｔ Ｇｌｙ Ｓｅｒ ＬｅｕＪｌｅ
Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｌａ
Ｌｅｕ Ｔｈｒ ｌｉｅ Ｔｈｒ Ｇｌｙ ＡＩ
ＪＩ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｏｌｕ Ａｓｐ Ｇｌ
ｕＡｌａ ＡｒＨＴｙｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｌ
ｅｕ Ｔｒｐ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｔｒ
ｐ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｇｌｙ ＧＬｙＧＬｙ Ｔｈｒ
Ｌｙｉ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｌｅｕ
Ｇｌｙからなる°７’ミノ酸配列配有しており；そ
して、可変軽鎖領域が次の配列： Ｇｌｕ ＶａＬ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｓ
ｅｒ Ｇｌｙ Ｏｌｙ Ａｓｐ Ｓｅｒ ＶａＬ Ｌｙ
ａＰｒｏ Ｇｌｙ Ｇｌｙ ５ｅｒＬｅｕ Ｌｙｓ
Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ａｌａ Ａｌａ
Ｓｅｒ Ｏｌｙ Ｐｈａ Ｔｈｒ Ｌｅｕ
Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｍｅ１５ｅ
ｒ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｔｈｒ ｌ”ｒ
ｏ Ｏｌｕ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｔｒｐ
Ｖａｌ Ａｌａ Ｔｈｒ ＴｈｒＬｅｕ Ｓｅｒ Ｇ
ｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｐｈａ Ｔｙ
ｒ Ｓｅｒ＾ｌａ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｌｙｍ Ｇｌｙ
ＡｒＢ ＰｈａＴｈｒ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ａｓ
ｐ Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｌｅｕ
Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｇｉｎ Ｌｅｕ Ａｓｎ ５ｅｔＬ
ｅｕ Ａｒｇ Ｓｅｔ （ｉｌｕ Ａｓｐ
Ｔｈｒ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｐｈｅ
Ｃｙｓ Ａｌａ Ｓｅｒ ｌ１ｉｓ ＡｒＢ
Ｐｈｅ Ｖａｌｌｌｉｓ Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ｈｉｓ
ｔｌｉｌｙ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｖａ
ｌ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｌａからなる゛ｒアミノ酸配列
ｆｆシているキメラ抗体を包含し”Ｃいる。
上記のキレート特異的な重鎖と軽鎖の抗体の変＋Ｊ４体
、即ち、次の配列： Ｍｅｔ Ａｌａ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｌｅｕ ｔ
ｉｅ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ＾ｌａ Ｌｅｕ
Ｓｅｒ Ｓｅｒ ＧＬｙ＾１ａｌｉｅ Ｓｅｒ Ｇｉ
ｎ Ａｌａ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｉｎ Ｇｌｕ
Ｓｅｒ＾ｌａ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｓａｒ Ｐ
ｒｏ ＧｌｙＧｌｕ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｅｕ
Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ
Ｇｌｙ Ａｌａ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｔｈｒ ５ａｒＡｓ
ｎ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａａｎ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ｇｉｎ
Ｇｌｕ Ｌｙｙｒ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｈｌｓ Ｌｅｕ
Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕｌｉｅ Ｇｌｙ Ｇ
ｌｙ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ａｍｎ Ａｒｇ＾ｌａ Ｐｒｏ
Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｌａ＾ｒｇ Ｐｈｅ Ｓ
ｅｒ ＧｌｙＳｅｒ Ｌｅｕ ｌｉｅ Ｇｌｙ Ａｓｐ
Ｌｙｍ Ａｌａ＾ｌａ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｔ
ｈｒ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｔｈｒ ＧｌｕＡｓｐ
Ｇｌｕ Ａｌａ Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ
Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｒｐ Ｔｙｒ Ｓｅｔ Ａｓｎ Ｌ
ｅｖ Ｔｒｐ Ｖａｌ ＰｈａＧｌｙ Ｃ１ｙ Ｃ１ｙ
Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｌｅｕ
Ｇｌｙからなるアミノ酸配列を何する可変軽鎖領域と対
応のシグナルペプチド；および、次の配列：Ｍｅｔ Ｓ
ｅｒ Ｐｈｅ Ｏｌｙ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｉｌ
ｅ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｌａｕ Ｉｌｅ Ｌｅｕ
Ｌｙｓ ＧＬｙ ＶａＬＴｈｒ Ｔｈｒ Ｌ＠ｕ Ｓ
ｅｒ ＧＬｙ ＧＬｙ Ｇｌｙ Ｐｈａ Ｔｈｅ Ｐｈ
ｅ Ｔｙｒ Ｓｅｒ＾ｌａ Ｓｅｔ Ｖａｌ Ｌｙｓ
ＧｌｙＡｒｇ Ｐｈａ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｓｅ
ｒ Ａｒｇ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｉ
ｎ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｔｌｔ Ｌａ
ｕ Ｇｌｎ ＬｅｕＡｓｎ Ｓｅｒ Ｌｅｕ
ＡｒＢ Ｓｅｔ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｔｈｒ
Ａｌａ Ｌａｕ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ
Ａｌａ Ｓｅｒ Ｈｌｇ ＾ｒｇＰｈｅ Ｖａ
Ｌ ）ｌｉｓ Ｔｔｐ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｔｈ
ｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ ＶａＬ Ｔｈｅ ＶａＬ
Ｓｅｒ Ａｌａからなるアミノ酸配列を有するＩＩＪ
変重鎖領域とλ・１応のシグナルペプチド； を含有する変異体も本発明の範囲内に含まれる。
、即ち、次の配列： Ｍｅｔ Ａｌａ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｌｅｕ ｔ
ｉｅ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ＾ｌａ Ｌｅｕ
Ｓｅｒ Ｓｅｒ ＧＬｙ＾１ａｌｉｅ Ｓｅｒ Ｇｉ
ｎ Ａｌａ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｉｎ Ｇｌｕ
Ｓｅｒ＾ｌａ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｓａｒ Ｐ
ｒｏ ＧｌｙＧｌｕ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｅｕ
Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ
Ｇｌｙ Ａｌａ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｔｈｒ ５ａｒＡｓ
ｎ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａａｎ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ｇｉｎ
Ｇｌｕ Ｌｙｙｒ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｈｌｓ Ｌｅｕ
Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕｌｉｅ Ｇｌｙ Ｇ
ｌｙ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ａｍｎ Ａｒｇ＾ｌａ Ｐｒｏ
Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｌａ＾ｒｇ Ｐｈｅ Ｓ
ｅｒ ＧｌｙＳｅｒ Ｌｅｕ ｌｉｅ Ｇｌｙ Ａｓｐ
Ｌｙｍ Ａｌａ＾ｌａ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｔ
ｈｒ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｔｈｒ ＧｌｕＡｓｐ
Ｇｌｕ Ａｌａ Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ
Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｒｐ Ｔｙｒ Ｓｅｔ Ａｓｎ Ｌ
ｅｖ Ｔｒｐ Ｖａｌ ＰｈａＧｌｙ Ｃ１ｙ Ｃ１ｙ
Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｌｅｕ
Ｇｌｙからなるアミノ酸配列を何する可変軽鎖領域と対
応のシグナルペプチド；および、次の配列：Ｍｅｔ Ｓ
ｅｒ Ｐｈｅ Ｏｌｙ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｉｌ
ｅ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｌａｕ Ｉｌｅ Ｌｅｕ
Ｌｙｓ ＧＬｙ ＶａＬＴｈｒ Ｔｈｒ Ｌ＠ｕ Ｓ
ｅｒ ＧＬｙ ＧＬｙ Ｇｌｙ Ｐｈａ Ｔｈｅ Ｐｈ
ｅ Ｔｙｒ Ｓｅｒ＾ｌａ Ｓｅｔ Ｖａｌ Ｌｙｓ
ＧｌｙＡｒｇ Ｐｈａ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｓｅ
ｒ Ａｒｇ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｉ
ｎ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｔｌｔ Ｌａ
ｕ Ｇｌｎ ＬｅｕＡｓｎ Ｓｅｒ Ｌｅｕ
ＡｒＢ Ｓｅｔ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｔｈｒ
Ａｌａ Ｌａｕ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ
Ａｌａ Ｓｅｒ Ｈｌｇ ＾ｒｇＰｈｅ Ｖａ
Ｌ ）ｌｉｓ Ｔｔｐ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｔｈ
ｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ ＶａＬ Ｔｈｅ ＶａＬ
Ｓｅｒ Ａｌａからなるアミノ酸配列を有するＩＩＪ
変重鎖領域とλ・１応のシグナルペプチド； を含有する変異体も本発明の範囲内に含まれる。
上記のキレ−１・特異的な重鎖と軽１Ｃ１のキメラモノ
クローナル抗体、および重鎖と軽鎖のシグナルペプチド
配列を含むその変異体の好ましい態様には以下に挙げる
ものが含まれる； ａ）可変領域がネズミハイブリドーマから得られたもの
である、キレート特異的な［１と軽鎖のキメラモノクロ
ーナル抗体； ｂ）不変領域がヒト供給源から得られたものである、ａ
）のキメラモノクローナル抗体；Ｃ）軽鎖不変領域がヒ
トに不変領域である、ｂ）のキメラモアクローナル抗体
； ｄ） ｊｉｌｌｆ鎖不変領域がヒト１ｇＧ１の不変領域
である、ｂ）のキメラモノクローナル抗体；および０）
軽鎖不変領域がヒトに不変領域であり、重鎖不変領域が
ヒトＩｇＧ１不変領域である、ｂ）のキメラモアクロー
ナル抗体。
クローナル抗体、および重鎖と軽鎖のシグナルペプチド
配列を含むその変異体の好ましい態様には以下に挙げる
ものが含まれる； ａ）可変領域がネズミハイブリドーマから得られたもの
である、キレート特異的な［１と軽鎖のキメラモノクロ
ーナル抗体； ｂ）不変領域がヒト供給源から得られたものである、ａ
）のキメラモノクローナル抗体；Ｃ）軽鎖不変領域がヒ
トに不変領域である、ｂ）のキメラモアクローナル抗体
； ｄ） ｊｉｌｌｆ鎖不変領域がヒト１ｇＧ１の不変領域
である、ｂ）のキメラモノクローナル抗体；および０）
軽鎖不変領域がヒトに不変領域であり、重鎖不変領域が
ヒトＩｇＧ１不変領域である、ｂ）のキメラモアクロー
ナル抗体。
本明細書中、「可変領域」という語句は、キレ−１・を
結合することができる軽鎖および電鎖抗体分丁−領域を
指す。可変領域のアミノ酸配列は、それか結合するキレ
ート決定因子およびそのキレート法定因子を認識する方
法によって様々に変化する。
結合することができる軽鎖および電鎖抗体分丁−領域を
指す。可変領域のアミノ酸配列は、それか結合するキレ
ート決定因子およびそのキレート法定因子を認識する方
法によって様々に変化する。
この多様性は、キレートの種類１．ｊｐひに可変領域を
コードしている遺伝子のエクソン配列に関係している。
コードしている遺伝子のエクソン配列に関係している。
本明細書中、［不変領域」という語句は、構造安定性お
よびその他の生物学的機能を与えるが、キレ−］・との
結合には無関係な、軽鎖および重鎖抗体分子領域を指す
。不変領域のアミノ酸配列および対応する遺伝子中のエ
クソン配列はそれを導いた種にＩｋｎするであろうが、
１つの種での特定の不変領域についてはアミノ酸配列の
変異は比較的限定されている。
よびその他の生物学的機能を与えるが、キレ−］・との
結合には無関係な、軽鎖および重鎖抗体分子領域を指す
。不変領域のアミノ酸配列および対応する遺伝子中のエ
クソン配列はそれを導いた種にＩｋｎするであろうが、
１つの種での特定の不変領域についてはアミノ酸配列の
変異は比較的限定されている。
シグナルペプチドに対して開示したＤＮＡ配列は、關訳
開始シグナル、すなわち、機能的なポリペプチドの翻訳
を開始させるＤＮＡ配列を含んでいる。当業者ならば、
リーダーペプチドはキレートとの結合に機能しないので
、池の真核性リーダーペプチドをコードしているＤＮＡ
配列も本発明における使用に適していることを認めるで
あろう。
開始シグナル、すなわち、機能的なポリペプチドの翻訳
を開始させるＤＮＡ配列を含んでいる。当業者ならば、
リーダーペプチドはキレートとの結合に機能しないので
、池の真核性リーダーペプチドをコードしているＤＮＡ
配列も本発明における使用に適していることを認めるで
あろう。
従って、本発明は特定の真核性シグナルペプチドの使用
に限定されない。最後に、本発明の別の態様は、変異体
において開示した軽鎖および重鎖シグナルペプチドおよ
びそれをコードしているＤＮＡ化合物である。
に限定されない。最後に、本発明の別の態様は、変異体
において開示した軽鎖および重鎖シグナルペプチドおよ
びそれをコードしているＤＮＡ化合物である。
また、当業者ならば、本発明のＤＮＡ構築物を措成して
いる第１のＤＮＡ暗号配列を、例えば部位指向性の突然
変異誘発によって修飾し、実質的に同等のＤＮＡ構築物
を得ることができることを認めるであろう。これらの修
飾されたＤＮＡ暗号配列は、本明細書に記載のものと実
質的に同一の牛メラポリペブチドに翻訳され得るもので
ある限り、本発明の範囲内に包合される。ある場合には
、部位指向性の突然変異誘発の使用により、得られた半
メラポリベブチドのキレートに対する親和性か変化する
ことらある。
いる第１のＤＮＡ暗号配列を、例えば部位指向性の突然
変異誘発によって修飾し、実質的に同等のＤＮＡ構築物
を得ることができることを認めるであろう。これらの修
飾されたＤＮＡ暗号配列は、本明細書に記載のものと実
質的に同一の牛メラポリペブチドに翻訳され得るもので
ある限り、本発明の範囲内に包合される。ある場合には
、部位指向性の突然変異誘発の使用により、得られた半
メラポリベブチドのキレートに対する親和性か変化する
ことらある。
本発明のＤＮＡ構築物の第１のＤＮＡ暗号配列は、キレ
ートに指向性であるモノクローナル抗体を発現するネズ
ミハイブリドーマのゲノムＤＮＡから導かれることが好
ましい。メアレス等［Ｃ，ｌ’’１ｌｅａｒｅｓ ｅｔ
ａｌ、 ；米国特許Ｎ ｏ、 ４．７２２．８９２］
が開示しているような、金属、特にＥＤＴＡ誘導体のイ
ンジウム■キレートに対して所望の特異性および親和性
を有する抗体を発現するＣＨＡ２５５．５と命名された
ネズミハイブリドーマを用いることか特に好ましい。し
かし、可変軽鎖および重鎖領域は、ＤＮＡ配列およびそ
の翻訳によって得られるアミノ酸配列が実質上、本発明
で開示した配列と同等のものであれば、ウサギ、ヤギ、
ウマ、クン、およびヒト以外の霊長類などの他の哺乳動
物種から得ることもできる。
ートに指向性であるモノクローナル抗体を発現するネズ
ミハイブリドーマのゲノムＤＮＡから導かれることが好
ましい。メアレス等［Ｃ，ｌ’’１ｌｅａｒｅｓ ｅｔ
ａｌ、 ；米国特許Ｎ ｏ、 ４．７２２．８９２］
が開示しているような、金属、特にＥＤＴＡ誘導体のイ
ンジウム■キレートに対して所望の特異性および親和性
を有する抗体を発現するＣＨＡ２５５．５と命名された
ネズミハイブリドーマを用いることか特に好ましい。し
かし、可変軽鎖および重鎖領域は、ＤＮＡ配列およびそ
の翻訳によって得られるアミノ酸配列が実質上、本発明
で開示した配列と同等のものであれば、ウサギ、ヤギ、
ウマ、クン、およびヒト以外の霊長類などの他の哺乳動
物種から得ることもできる。
本発明に用いるゲノムＤＮＡは、通常の方法わよび様々
な方法で得、クローニングすることかできる。そのよう
な方法は、デイビス（Ｌ、Ｇ、ＤａｖｉＳ）、デイブナ
−（Ｍ、 Ｄ、 Ｄ １ｂｎｅｒ）およびバッチイー編
（Ｊ 、 Ｆ、 Ｂａｔｔｅｙ）、ペイシック・メソッ
ド・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｂａｓｉｃ
Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｂ ｉｏｌ
ｏｇｙ）、エルスピア−（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）発行、ニ
ューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、（１９８６）；フェ
ダーら（Ｆ ｅｄｅｒ、 Ｊ 、）、アメリカ７−ジャ
ーナル・オブ・ヒユーマン・ジエ不テイックス（Ａ ｍ
、 Ｊ 、 Ｈｕｎ、 Ｇ ｅｎｅｔ １ｃｓ）、３７
：６３５−６４９（１９８５）：およびステツ７−（Ｓ
ｔｅｆｆ’ｅｒ、 Ｄ、）、ウィンバーブら（Ｗｅｉ
ｎｂｅｒｇ、 Ｒ、Ａ、 ）、セル（Ｃｅ１１）、１５
：１００３−１０１０ （１９７８）、に記載されてい
る。例えば、ハイブリドーマ細胞のＤＮＡは常法によっ
て単離することができる：即ち、制限エンドスフレアー
ゼによりゲノムＤＮＡを断片化して制限フラグメントと
し、得られたフラグメントを適当な組換えＤＮＡクロー
ニングベクター中でクローニングし、そして放射性標識
または酵素標識プローブを用いて本明細書中に開示した
ＤＮＡ配列のび在についてスクリーニングする。
な方法で得、クローニングすることかできる。そのよう
な方法は、デイビス（Ｌ、Ｇ、ＤａｖｉＳ）、デイブナ
−（Ｍ、 Ｄ、 Ｄ １ｂｎｅｒ）およびバッチイー編
（Ｊ 、 Ｆ、 Ｂａｔｔｅｙ）、ペイシック・メソッ
ド・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｂａｓｉｃ
Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｂ ｉｏｌ
ｏｇｙ）、エルスピア−（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）発行、ニ
ューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、（１９８６）；フェ
ダーら（Ｆ ｅｄｅｒ、 Ｊ 、）、アメリカ７−ジャ
ーナル・オブ・ヒユーマン・ジエ不テイックス（Ａ ｍ
、 Ｊ 、 Ｈｕｎ、 Ｇ ｅｎｅｔ １ｃｓ）、３７
：６３５−６４９（１９８５）：およびステツ７−（Ｓ
ｔｅｆｆ’ｅｒ、 Ｄ、）、ウィンバーブら（Ｗｅｉ
ｎｂｅｒｇ、 Ｒ、Ａ、 ）、セル（Ｃｅ１１）、１５
：１００３−１０１０ （１９７８）、に記載されてい
る。例えば、ハイブリドーマ細胞のＤＮＡは常法によっ
て単離することができる：即ち、制限エンドスフレアー
ゼによりゲノムＤＮＡを断片化して制限フラグメントと
し、得られたフラグメントを適当な組換えＤＮＡクロー
ニングベクター中でクローニングし、そして放射性標識
または酵素標識プローブを用いて本明細書中に開示した
ＤＮＡ配列のび在についてスクリーニングする。
本明細書中、「制限フラグメント」という語句は、１ま
たはそれ以上の制限エンドヌクレアーゼ酵素の作Ｉｌｌ
によって生成したあらゆる線状のＤＮＡ配列を指す。本
明細書中、［組換えＤＮＡクローニングへフタ−」とい
う語句は、ｌまたはそれ以上の別のＤＮＡセグメントを
付加することができるか、または既に付加したＤＮＡ分
子からなる自律的に復製するあらゆる媒体を指し、プラ
スミドおよびファージを含むがそれらに限定はされない
。
たはそれ以上の制限エンドヌクレアーゼ酵素の作Ｉｌｌ
によって生成したあらゆる線状のＤＮＡ配列を指す。本
明細書中、［組換えＤＮＡクローニングへフタ−」とい
う語句は、ｌまたはそれ以上の別のＤＮＡセグメントを
付加することができるか、または既に付加したＤＮＡ分
子からなる自律的に復製するあらゆる媒体を指し、プラ
スミドおよびファージを含むがそれらに限定はされない
。
また、ゲノムＤＮＡから得られたＤＮＡ配列はポリペプ
チドをコードしていない介在配列、即ちイントロンを含
んでいることもある：これらの配列は、次いで、常法に
よるヌクレオチドの欠失または置換により、改変するこ
とができる。例えば、クラマーら（Ｋ ｒａｎｅｒ、
Ｗ、 ）、ニュークレイツク・アノノズｅリサーチ（Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、）、＋２：９，４
４１（１９８４）、およびクンケル（Ｋｕ＋１ｋｃｌ、
Ｔ、 Ａ、）、プロシーデイングズ・オブ・ナシ１ナ
ル・アカデミ−・オブ・サイエンス、８２：４８８（１
９８５）参照。
チドをコードしていない介在配列、即ちイントロンを含
んでいることもある：これらの配列は、次いで、常法に
よるヌクレオチドの欠失または置換により、改変するこ
とができる。例えば、クラマーら（Ｋ ｒａｎｅｒ、
Ｗ、 ）、ニュークレイツク・アノノズｅリサーチ（Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、）、＋２：９，４
４１（１９８４）、およびクンケル（Ｋｕ＋１ｋｃｌ、
Ｔ、 Ａ、）、プロシーデイングズ・オブ・ナシ１ナ
ル・アカデミ−・オブ・サイエンス、８２：４８８（１
９８５）参照。
本発明のＤＮＡ構築物の内、キメラ抗体の可変軽鎖およ
び重鎖領域であるポリペプチドをコードしている第１の
ＤＮＡ配列はｃＤＮＡから得ることもできる。ｃＤＮＡ
を得、クローニングする方法は周知であり、オカヤマ（
Ｏｋａｙａｍａ、 Ｈ、）およびバー’）’ ラ（Ｂ
ｅｒｇ、 Ｐ、 ）、モレキュラー・アンド・セルラー
・バイオロジー（Ｍｏ１． Ｃｅｌ ｌ Ｂ ｉｏｌ、
）、２：１６１（１９８２）；ギコブラ−（Ｇ ｕｂ
ｌｅｒ、 Ｈ、）およびホフマンら（ＨｏｆＴｍａｎ、
Ｂ 、 Ｊ 、 ）、ジエーン（Ｇｅｎｅ）、２５：
２６３（１９８３）、によって記載されている。従って
、ｃＤＮＡを常法によってクローニングし、得られたク
ローンを本明細書中に明示した可変領域をコードしてい
るｃＤＮＡに関してＪ当なプローブでスクリーニングす
ることができる。所望のクローンを単離したのち、基本
的にはゲノムＤＮＡと同じ方法でｃＤＮＡを操作するこ
とができる。
び重鎖領域であるポリペプチドをコードしている第１の
ＤＮＡ配列はｃＤＮＡから得ることもできる。ｃＤＮＡ
を得、クローニングする方法は周知であり、オカヤマ（
Ｏｋａｙａｍａ、 Ｈ、）およびバー’）’ ラ（Ｂ
ｅｒｇ、 Ｐ、 ）、モレキュラー・アンド・セルラー
・バイオロジー（Ｍｏ１． Ｃｅｌ ｌ Ｂ ｉｏｌ、
）、２：１６１（１９８２）；ギコブラ−（Ｇ ｕｂ
ｌｅｒ、 Ｈ、）およびホフマンら（ＨｏｆＴｍａｎ、
Ｂ 、 Ｊ 、 ）、ジエーン（Ｇｅｎｅ）、２５：
２６３（１９８３）、によって記載されている。従って
、ｃＤＮＡを常法によってクローニングし、得られたク
ローンを本明細書中に明示した可変領域をコードしてい
るｃＤＮＡに関してＪ当なプローブでスクリーニングす
ることができる。所望のクローンを単離したのち、基本
的にはゲノムＤＮＡと同じ方法でｃＤＮＡを操作するこ
とができる。
別法として、可変軽鎖および重鎖領域のキレートに対す
る特異性について必要な遺伝情報を含有している第１の
ＤＮＡ配列を、常法により合成的に製造することもでき
る。ＤＮＡ配列の合成法は、シナら（Ｓ ｈｉｎａ、
Ｎ、 Ｄ、 ）、ニュークレイツク・アッシズ・リサー
チ、１２：４３５９（１９８４）；およびボカージｓ
（Ｂ ｅａｕｃａｇｅ、 Ｓ 、 Ｌ 、 ）、カルザ
ーズら（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、 Ｍ、 Ｈ，）、テトラ
ヒトロン・レターズ（Ｔ ｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌ
ｅｔｔｅｒｓ）、２０：１８５９（１９８１）、によっ
て記載されている。従って、軽鎖および重鎖可変領域を
コードしている第１のＤＮＡ配列を、通常のＤＮＡ合成
法によりヌクレオチドモノマーから合成して、本明細書
に記載のボ１ペプチドと実質上同一のポリペプチドに翻
訳され得るＤＮＡ暗号配列を得ることができる。この合
成りＮＡ配列は、縮重コドンで元のコドンが置換されて
いても、翻訳時の同一アミノ酸をコードしている限り、
クローニングした遺伝子と同一である必要はない。
る特異性について必要な遺伝情報を含有している第１の
ＤＮＡ配列を、常法により合成的に製造することもでき
る。ＤＮＡ配列の合成法は、シナら（Ｓ ｈｉｎａ、
Ｎ、 Ｄ、 ）、ニュークレイツク・アッシズ・リサー
チ、１２：４３５９（１９８４）；およびボカージｓ
（Ｂ ｅａｕｃａｇｅ、 Ｓ 、 Ｌ 、 ）、カルザ
ーズら（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、 Ｍ、 Ｈ，）、テトラ
ヒトロン・レターズ（Ｔ ｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌ
ｅｔｔｅｒｓ）、２０：１８５９（１９８１）、によっ
て記載されている。従って、軽鎖および重鎖可変領域を
コードしている第１のＤＮＡ配列を、通常のＤＮＡ合成
法によりヌクレオチドモノマーから合成して、本明細書
に記載のボ１ペプチドと実質上同一のポリペプチドに翻
訳され得るＤＮＡ暗号配列を得ることができる。この合
成りＮＡ配列は、縮重コドンで元のコドンが置換されて
いても、翻訳時の同一アミノ酸をコードしている限り、
クローニングした遺伝子と同一である必要はない。
キメラ抗体の不変軽鎖および重鎖領域をコードしている
本発明ＤＮＡ構築物の第２のＤＮＡ配列は、ゲノムＤＮ
ＡおよびｃＤＮＡからクローニングすることができるか
、あるいは合成することができる。不変領域ポリペプチ
ドをコードしている第２のＤＮＡ配列は、ヒトリンパ細
胞、例えばヒト末梢血リンパ細胞から導かれるのが好ま
しい。
本発明ＤＮＡ構築物の第２のＤＮＡ配列は、ゲノムＤＮ
ＡおよびｃＤＮＡからクローニングすることができるか
、あるいは合成することができる。不変領域ポリペプチ
ドをコードしている第２のＤＮＡ配列は、ヒトリンパ細
胞、例えばヒト末梢血リンパ細胞から導かれるのが好ま
しい。
ヒト不変領域をコードしているＤＮＡ配列を使用するこ
とにより、免疫原性を最小にするキメラ軽鎖および重鎖
ポリペプチドが得られると予測される。特に好ましいの
は、ヒト軽（に）鎖およびヒト重（γ）鎖遺伝子から導
かれるＤＮＡ配列であり、種々のアイソタイプクラス（
例えば、ＩｇＭＳ １ｇＡ）、サブクラス（例えば、Ｉ
ｇＡＩＳ １ｇＡ２）、タイプ（例えば、にまたはλ）
、サブグループ（Ｖに１．ＶＨＩなど）およびアロタイ
プ（Ｇ自グル−プなど）、とりわけγ−１遺伝子が含ま
れる［ハイターら（Ｈｅｉｔｅｒ、 Ｐ、Ａ、 ）、セ
ル、２２：１９７２０７（１９８０）およびタカハシら
（Ｔ ａｋａｈａｓｈｉ。
とにより、免疫原性を最小にするキメラ軽鎖および重鎖
ポリペプチドが得られると予測される。特に好ましいの
は、ヒト軽（に）鎖およびヒト重（γ）鎖遺伝子から導
かれるＤＮＡ配列であり、種々のアイソタイプクラス（
例えば、ＩｇＭＳ １ｇＡ）、サブクラス（例えば、Ｉ
ｇＡＩＳ １ｇＡ２）、タイプ（例えば、にまたはλ）
、サブグループ（Ｖに１．ＶＨＩなど）およびアロタイ
プ（Ｇ自グル−プなど）、とりわけγ−１遺伝子が含ま
れる［ハイターら（Ｈｅｉｔｅｒ、 Ｐ、Ａ、 ）、セ
ル、２２：１９７２０７（１９８０）およびタカハシら
（Ｔ ａｋａｈａｓｈｉ。
Ｎ、）、セル、２９：６７１−６７９（１９８２）］。
しかし、本発明は、軽鎖および重鎖キメラポリペプチド
のためのヒト不変領域をコードしている特定の第２ＤＮ
Ａ配列に限定されるものではない。
のためのヒト不変領域をコードしている特定の第２ＤＮ
Ａ配列に限定されるものではない。
また、当業者ならば、選択した種が可変領域を得た種と
異なるならば、不変領域遺伝子は他の哺乳動物種から導
かれたものであってもよいということを理解し得るであ
ろう。例えば、不変領域は、抗体がインビトロまたはイ
ンビボ適用のいずれであるかにより、ウサギ、ヤギ、ウ
シ、ウマ、ブタおよび非ヒト霊長類などの種から導かれ
得る。
異なるならば、不変領域遺伝子は他の哺乳動物種から導
かれたものであってもよいということを理解し得るであ
ろう。例えば、不変領域は、抗体がインビトロまたはイ
ンビボ適用のいずれであるかにより、ウサギ、ヤギ、ウ
シ、ウマ、ブタおよび非ヒト霊長類などの種から導かれ
得る。
本発明のキメラＤＮＡ構築物を調製し、適当な組換えＤ
ＮＡクローニングベクターおよび組換えＩ）ＮΔ発現ベ
クターに導入するのに必要な組換えＤＮＡ技術は、今日
では当業者周知であり、数多（の文献に記載されている
。グラズマンＩＩ （Ｙ。
ＮＡクローニングベクターおよび組換えＩ）ＮΔ発現ベ
クターに導入するのに必要な組換えＤＮＡ技術は、今日
では当業者周知であり、数多（の文献に記載されている
。グラズマンＩＩ （Ｙ。
Ｇ ｌｕｚｍａｎ）、ユーカリティック・ノ＜イラル・
ベクター（Ｅｕｋａｒｙｔｉｃ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔ
ｏｒｓ）、コールド・スプリング・ハーバ−φラボラト
リーズ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｔｌａｒｂｏｒ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）発行、ニューヨーク（１９８２
）；グラズマン編、ユーカリティック・トランスレーシ
ョン（Ｅ ｕｋａｒｙｏｔ ｉｃ Ｔ ｒａｎｓｃｒｉ
ｐｔｉｏｎ）、コールド・スプリング・ノ＼−バー・ラ
ボラトリーズ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔ。
ベクター（Ｅｕｋａｒｙｔｉｃ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔ
ｏｒｓ）、コールド・スプリング・ハーバ−φラボラト
リーズ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｔｌａｒｂｏｒ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）発行、ニューヨーク（１９８２
）；グラズマン編、ユーカリティック・トランスレーシ
ョン（Ｅ ｕｋａｒｙｏｔ ｉｃ Ｔ ｒａｎｓｃｒｉ
ｐｔｉｏｎ）、コールド・スプリング・ノ＼−バー・ラ
ボラトリーズ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔ。
ｒｉｅｓ）発行、ニューヨーク（１９８５）；カレンダ
ー（Ｒ，Ｃａ１ｅｎｄａｒ）およびゴールド編（Ｌ、Ｇ
ｏｌｄ）、セキュエンス・スベシフィシティー・イン・
トランスクリブシもン・アンド・トランスレーション（
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ５ｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｉｎ Ｔ
ｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ＆Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ
）、アラン・アール・リス、インコーホレーテッド（Ａ
１ｌａｎ Ｒ、Ｌ ｉｓｓ、 ［ｎｃ、 ）発行、ニ
ューヨーク（１９８５）；レズニコフ（Ｗ、Ｒｅｚｎｉ
ｋｏｆＴ）およびゴールド編（１，、、、Ｇｏｌｄ）、
マキシマイジング・ジエーン・エクスプレッション（Ｍ
ａｘｉｍｉｚｉｎｇ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
）、！＜ターワーシイーズ（Ｂ ｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ
ｓ）発行、ニューヨーク（１９８６）；シリー編（Ｗ、
Ｇ、 Ｔｈ１ｌｌｙ）、マンマリアン・セル・テクノロ
ジー（Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅ１ｌ Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ）、ハターワーシイース発行、ニューヨーク（１
９８６）：サンブロックおよびゲシング（Ｊ、Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋ ａｎｄ Ｍ、 Ｊ 、 Ｇｅｔｈｉｎｇ）、
フォーカス（Ｆｏｃｕｓ）、ｌＯ１＃３、ベセスダ・リ
サーチ・ラボラトリーズ／ライフ・チクノロシーズ社（
Ｂ ｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ／ Ｌ ｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ
ｓ Ｉ ｎｃ、）、４１−４８頁（＋９８８）参照。
ー（Ｒ，Ｃａ１ｅｎｄａｒ）およびゴールド編（Ｌ、Ｇ
ｏｌｄ）、セキュエンス・スベシフィシティー・イン・
トランスクリブシもン・アンド・トランスレーション（
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ５ｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｉｎ Ｔ
ｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ＆Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ
）、アラン・アール・リス、インコーホレーテッド（Ａ
１ｌａｎ Ｒ、Ｌ ｉｓｓ、 ［ｎｃ、 ）発行、ニ
ューヨーク（１９８５）；レズニコフ（Ｗ、Ｒｅｚｎｉ
ｋｏｆＴ）およびゴールド編（１，、、、Ｇｏｌｄ）、
マキシマイジング・ジエーン・エクスプレッション（Ｍ
ａｘｉｍｉｚｉｎｇ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
）、！＜ターワーシイーズ（Ｂ ｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ
ｓ）発行、ニューヨーク（１９８６）；シリー編（Ｗ、
Ｇ、 Ｔｈ１ｌｌｙ）、マンマリアン・セル・テクノロ
ジー（Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅ１ｌ Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ）、ハターワーシイース発行、ニューヨーク（１
９８６）：サンブロックおよびゲシング（Ｊ、Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋ ａｎｄ Ｍ、 Ｊ 、 Ｇｅｔｈｉｎｇ）、
フォーカス（Ｆｏｃｕｓ）、ｌＯ１＃３、ベセスダ・リ
サーチ・ラボラトリーズ／ライフ・チクノロシーズ社（
Ｂ ｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ／ Ｌ ｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ
ｓ Ｉ ｎｃ、）、４１−４８頁（＋９８８）参照。
本明細書中、「組換えＤＮＡ発現ベクター」という語句
は、ＤＮＡをＲＮＡに転写させるプロモーター配列、並
びにＲＮＡへの転写およびＲＮＡのポリペプチドへの翻
訳を開始および終止させるための適当な調節配列を含有
しているすべての組換えＤＮＡクローニングベクターを
指す。また、「組換えベクター」という語句は、組換え
ＤＮＡクローニングベクターまたは組換えＤＮＡ発現ベ
クターのどちらかを指す。
は、ＤＮＡをＲＮＡに転写させるプロモーター配列、並
びにＲＮＡへの転写およびＲＮＡのポリペプチドへの翻
訳を開始および終止させるための適当な調節配列を含有
しているすべての組換えＤＮＡクローニングベクターを
指す。また、「組換えベクター」という語句は、組換え
ＤＮＡクローニングベクターまたは組換えＤＮＡ発現ベ
クターのどちらかを指す。
本発明によれば、軽鎖および重鎖キメラポリペプチドを
コードしているＤＮＡ構築物は、発現ベクターの一部と
して適当な真核宿主細胞に導入される。これらの構築物
を単一の真核性発現ベクターに含有させることもできる
し、また、それぞれが１個のキメラ遺伝子構築物を含有
する別々の発現ベクターを用いて分けて維持してもよい
。しかし、キメラポリペプチドの発現のためには、選択
した真核宿主細胞内で機能する転写および翻訳調節配列
を含有していることが必要である。従って、キメラ遺伝
子は、５°および３°非翻訳領域並びにイントロン（介
在）配列を含有し、すべて真核宿主細胞内で機能するプ
ロモーター、エンハンサ−および転写ターミネータ−お
よびポリアデニル化部位（ｐｏｌｙＡ部位）などのホモ
ローガスな調節領域を包含する大きいＤＮＡフラグメン
トで単離してよい。本明細書中、「プロモーター」およ
び「エンハンサ−」という語句は、それぞれ、ＤＮＡの
ＲＮＡへの転写を指令するＤＮＡ配列、およびＤＮＡか
らＲＮＡへの転写を促進するＤＮＡ配列を指す。本明細
書中で用いる「転写ターミネータ−」という語句は、Ｄ
ＮＡのＲＮＡへの転写を終了させるＤＮＡ配列を指す。
コードしているＤＮＡ構築物は、発現ベクターの一部と
して適当な真核宿主細胞に導入される。これらの構築物
を単一の真核性発現ベクターに含有させることもできる
し、また、それぞれが１個のキメラ遺伝子構築物を含有
する別々の発現ベクターを用いて分けて維持してもよい
。しかし、キメラポリペプチドの発現のためには、選択
した真核宿主細胞内で機能する転写および翻訳調節配列
を含有していることが必要である。従って、キメラ遺伝
子は、５°および３°非翻訳領域並びにイントロン（介
在）配列を含有し、すべて真核宿主細胞内で機能するプ
ロモーター、エンハンサ−および転写ターミネータ−お
よびポリアデニル化部位（ｐｏｌｙＡ部位）などのホモ
ローガスな調節領域を包含する大きいＤＮＡフラグメン
トで単離してよい。本明細書中、「プロモーター」およ
び「エンハンサ−」という語句は、それぞれ、ＤＮＡの
ＲＮＡへの転写を指令するＤＮＡ配列、およびＤＮＡか
らＲＮＡへの転写を促進するＤＮＡ配列を指す。本明細
書中で用いる「転写ターミネータ−」という語句は、Ｄ
ＮＡのＲＮＡへの転写を終了させるＤＮＡ配列を指す。
ｒｐｏｌｙＡ部位」という語句は、ｐｏｌｙ−Ａテール
配列付加の位置を示すＤＮＡ配列を指す。別法によれば
、ウィルス性プロモーターエンハンサ−１転写ターミネ
ータ−およびｐｏｌｙＡ部位を含有する周知のＳＶ４０
およびＨｅｒｐｅｓ ＴＫ（ヘルペスＴＫ）ウィルス配
列などの様々なヘテロローガス（異種の）調節領域とキ
メラ遺伝子とを組換えて結合させてもよい。また、キメ
ラ遺伝子構築物は、調節要素が真核宿主細胞内で機能的
であり、該キメラ遺伝子に適切に融合されている限り、
合成の調節要素と結合していてもよい。さらに、ｃＤＮ
Ａクローンおよび合成遺伝子も、ポリペプチドとして発
現されるよう、ホモローガスまたはへテロローガスのい
ずれかの調節配列と結合させることができる。従って、
本発明のキメラ遺伝子の発現のためには、ホモローガス
、ヘテロローカスまたは合成の調節領域を相互に交換し
て用いることかできることは当業者の理解するところで
あろう。
配列付加の位置を示すＤＮＡ配列を指す。別法によれば
、ウィルス性プロモーターエンハンサ−１転写ターミネ
ータ−およびｐｏｌｙＡ部位を含有する周知のＳＶ４０
およびＨｅｒｐｅｓ ＴＫ（ヘルペスＴＫ）ウィルス配
列などの様々なヘテロローガス（異種の）調節領域とキ
メラ遺伝子とを組換えて結合させてもよい。また、キメ
ラ遺伝子構築物は、調節要素が真核宿主細胞内で機能的
であり、該キメラ遺伝子に適切に融合されている限り、
合成の調節要素と結合していてもよい。さらに、ｃＤＮ
Ａクローンおよび合成遺伝子も、ポリペプチドとして発
現されるよう、ホモローガスまたはへテロローガスのい
ずれかの調節配列と結合させることができる。従って、
本発明のキメラ遺伝子の発現のためには、ホモローガス
、ヘテロローカスまたは合成の調節領域を相互に交換し
て用いることかできることは当業者の理解するところで
あろう。
多種多様の組換え発現ベクターが周知であり、それらを
本発明に用いることができる。ｐＳ ｖ ２型ベクター
の使用が好ましい。ｐｓｖ２型ベクターは、よくわかっ
ている真核性転写単位を構成する５Ｖ４Ｑケノムのセグ
メントを含有しており、１１＋ｌｉ乳動物および池の真
核宿主細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれることにより、
これらの細胞を形質転換する。５Ｖ４Ｑプロモーターが
挿入遺伝子を転写させる様々なプラスミドｐｓＶ２型ベ
クター例えば、プラスミドｐＳ Ｖ ２−ｇｐＬ、 ｐ
ｓ Ｖ ２−ｎｅｏ。
本発明に用いることができる。ｐＳ ｖ ２型ベクター
の使用が好ましい。ｐｓｖ２型ベクターは、よくわかっ
ている真核性転写単位を構成する５Ｖ４Ｑケノムのセグ
メントを含有しており、１１＋ｌｉ乳動物および池の真
核宿主細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれることにより、
これらの細胞を形質転換する。５Ｖ４Ｑプロモーターが
挿入遺伝子を転写させる様々なプラスミドｐｓＶ２型ベ
クター例えば、プラスミドｐＳ Ｖ ２−ｇｐＬ、 ｐ
ｓ Ｖ ２−ｎｅｏ。
ｐＳ Ｖ ２−ｄＭｒ、およびｐＳＶ２Ｊ−グｏビンな
どが構築されている［グラズマン編、ユーカリティック
・バイラル・ベクター、コールド・スプリング・ハーバ
−奉ラボラトリーズ発行、コールド・スプリング・ハー
バ−、ニューヨーク（１９８２）ＩＭ］。
どが構築されている［グラズマン編、ユーカリティック
・バイラル・ベクター、コールド・スプリング・ハーバ
−奉ラボラトリーズ発行、コールド・スプリング・ハー
バ−、ニューヨーク（１９８２）ＩＭ］。
これらのベクターは、アメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクシリン（Ａ Ｔ ＣＣ）、ロックビレ、メリー
ランドおよびノーイン・リージョナル・ラボラトリ−、
ベオリア、イリノア（Ｎ ｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏ
ｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＮＲＲＬ）、
Ｐｅｏｒｉａ、 ［１ｌｉｎｏｉｓ）から入手する
ことができる。あるいは、ウシ乳頭腫ウィルスに基（発
現ベクターおよびエプスタイン−バールウィルス発現ベ
クターのごとくエピソーム的に維持される、即ち染色体
外で維持され得る発現ベクターを選択することもできる
。
・コレクシリン（Ａ Ｔ ＣＣ）、ロックビレ、メリー
ランドおよびノーイン・リージョナル・ラボラトリ−、
ベオリア、イリノア（Ｎ ｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏ
ｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＮＲＲＬ）、
Ｐｅｏｒｉａ、 ［１ｌｉｎｏｉｓ）から入手する
ことができる。あるいは、ウシ乳頭腫ウィルスに基（発
現ベクターおよびエプスタイン−バールウィルス発現ベ
クターのごとくエピソーム的に維持される、即ち染色体
外で維持され得る発現ベクターを選択することもできる
。
グラズマン編、ユーカリティック・バイラル・ベクター
、コールド・スプリング・ハーバ−・ラホラトリーズ発
行、コールド・スプリング・ハーバニューヨーク（１９
８２）；ハウリー（Ｐ、Ｍ。
、コールド・スプリング・ハーバ−・ラホラトリーズ発
行、コールド・スプリング・ハーバニューヨーク（１９
８２）；ハウリー（Ｐ、Ｍ。
Ｈｏｗｌｅｙ）およびブローカーｒＱ（Ｔ 、 Ｒ、Ｂ
ｒｏｋｅｒ）、バピロマビラシイズ（Ｐ ａｐｉ ｌ
ｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ）、アラン・アール・リス、イ
ンコーホレーテッド発行、ニューヨーク（１９８５）；
サソデンら（Ｓ ｕｇｄｅｎ。
ｒｏｋｅｒ）、バピロマビラシイズ（Ｐ ａｐｉ ｌ
ｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ）、アラン・アール・リス、イ
ンコーホレーテッド発行、ニューヨーク（１９８５）；
サソデンら（Ｓ ｕｇｄｅｎ。
１３）、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロ／
−１５：４１０−４１３ （１９８５）：およびキオー
／スら（Ｋ １ｏｏｓｉｓ、 Ｄ、 ）、エンボ（ＥＭ
ＢＯ）、６：３５５−３６１（１９８７）；およびサム
ブロックおよびゲ／ング、フォーカス、ｔｏ、＃３．４
１−４８頁（１９８８）参照。
−１５：４１０−４１３ （１９８５）：およびキオー
／スら（Ｋ １ｏｏｓｉｓ、 Ｄ、 ）、エンボ（ＥＭ
ＢＯ）、６：３５５−３６１（１９８７）；およびサム
ブロックおよびゲ／ング、フォーカス、ｔｏ、＃３．４
１−４８頁（１９８８）参照。
ｐｓｖ２クラスのベクター由来の発現ベクターから５Ｖ
４Ｑエンハンサ−を除去することにより、より高レベル
の発現を達成することができる。はとんとすべてのゲノ
ム性免疫グロブリン遺伝子がエンハンサ−配列を含有し
ている。ネズミのに可変領域遺伝子は、エンハンサ−配
列と共にプラスミドｐｃ ＣＨＡ Ｋ上に見いだされる
。当業者ならば、トランスフェクションされた細胞の免
疫グロブリン消産生能力を変化させることなく、これら
のエンハンサ−配列を発現ベクター上の多数の別の部位
に移動させ得ることを理解し得るであろう。
４Ｑエンハンサ−を除去することにより、より高レベル
の発現を達成することができる。はとんとすべてのゲノ
ム性免疫グロブリン遺伝子がエンハンサ−配列を含有し
ている。ネズミのに可変領域遺伝子は、エンハンサ−配
列と共にプラスミドｐｃ ＣＨＡ Ｋ上に見いだされる
。当業者ならば、トランスフェクションされた細胞の免
疫グロブリン消産生能力を変化させることなく、これら
のエンハンサ−配列を発現ベクター上の多数の別の部位
に移動させ得ることを理解し得るであろう。
しかし、発現ベクターｐＧ ＣＨＡ Ｋから５Ｖ４Ｑエ
ンハンサ−を除去すると、本発明抗体の５Ｐ２１０細胞
からの発現レベルは顕著に増大する。
ンハンサ−を除去すると、本発明抗体の５Ｐ２１０細胞
からの発現レベルは顕著に増大する。
プラスミドｐＭＬＣＥ−１０（ＡＴＣＣから取得番号Ａ
ＴＣＣ６７６３９のもとて入手できる）上に見いだされ
るＣＥＭにプロモーターもまた、ヘテロローガス免疫グ
ロブリン鎖の発現レベルを増加させるのに有用である。
ＴＣＣ６７６３９のもとて入手できる）上に見いだされ
るＣＥＭにプロモーターもまた、ヘテロローガス免疫グ
ロブリン鎖の発現レベルを増加させるのに有用である。
具体的には、上記のように、ネズミハイブリドーマＣＨ
Ａ２５５由来のλおよびγ可変領域をコードしている遺
伝子がクローニンフサしている。５Ｖ４Ｑエンハンサ−
含有ベタ９−上のＣＥＭにプロモーターによって作動す
るネズミλＣＨＡ可変領域およびヒト不変領域遺伝子を
含有するプラスミドｐＧ ＣＨＡ Ｋ −２を実施例１
４記載の方法に従って構築した。ＳＶ４０エンハンサ−
を欠如するベクター内のＣＥＭにプロモーターによって
作動するネズミλＣＨＡ可変領域およびヒト不変領域遺
伝子を含有するプラスミドｐＧｃＨＡＫ−３も、実施例
１４記載の方法に従って構築した。これらプラスミドの
どちらかでトランスフェクションした５Ｐ２１０細胞（
Ａ ′ＦＣＣから人手可能）は、ＣＨＡλプロモーター
を含有するベクターでトランスフェクションした細胞よ
り、はるかに高いに発現レベルを示した。
Ａ２５５由来のλおよびγ可変領域をコードしている遺
伝子がクローニンフサしている。５Ｖ４Ｑエンハンサ−
含有ベタ９−上のＣＥＭにプロモーターによって作動す
るネズミλＣＨＡ可変領域およびヒト不変領域遺伝子を
含有するプラスミドｐＧ ＣＨＡ Ｋ −２を実施例１
４記載の方法に従って構築した。ＳＶ４０エンハンサ−
を欠如するベクター内のＣＥＭにプロモーターによって
作動するネズミλＣＨＡ可変領域およびヒト不変領域遺
伝子を含有するプラスミドｐＧｃＨＡＫ−３も、実施例
１４記載の方法に従って構築した。これらプラスミドの
どちらかでトランスフェクションした５Ｐ２１０細胞（
Ａ ′ＦＣＣから人手可能）は、ＣＨＡλプロモーター
を含有するベクターでトランスフェクションした細胞よ
り、はるかに高いに発現レベルを示した。
事実、これらの、ＣＩ（Ａキメラに遺伝子を発現させる
ＣＥＭにプロモーターを含有するＳＶ４０エンハンサ−
欠如ベクターでトランスフェクションした細胞は、に発
現レベルにおいて、ＣＨＡλプロモーターによって作動
するＣＨＡキメラ遺伝子を３何する５Ｖ４Ｑエンハンサ
−含有ベクターで！・ランスフエクンヨンした細胞が示
すレベルの１０倍増を示した。次いで、これらの高産生
細胞をキメラ手鎖遺伝子含有ヘクターでトランスフエク
／、ｌｌンすると、に鎖ベクター中のＣＩ（Ａプロモー
ターを用いる細胞に比べ、対応する全抗体産生の増加か
得られるであろう。最高の発現を示す細胞をサブクロー
ニングし、次いでこれらの高発現サブクローンを明確に
定義した白清不念培地で培養することにより、より高い
発現レベルが達成され得る。このことから、ＣＥＭにプ
ロモーターがホモローガス（ＯＥＭ）配列およびヘテロ
ローガス（ＣＩＡその他）配列の両者を高レベルに発現
させる特別の能力を有していることが明らかである。実
施例１４の教示は約２．２ｋｂのＣ１ａｌ／５ｓｐｌ制
限フラグメント上にＣＥＭプロモーターが存在している
ことを示しているか、当業者はこのＣＥＭにプロモータ
ー配列を容易に得ることができる。
ＣＥＭにプロモーターを含有するＳＶ４０エンハンサ−
欠如ベクターでトランスフェクションした細胞は、に発
現レベルにおいて、ＣＨＡλプロモーターによって作動
するＣＨＡキメラ遺伝子を３何する５Ｖ４Ｑエンハンサ
−含有ベクターで！・ランスフエクンヨンした細胞が示
すレベルの１０倍増を示した。次いで、これらの高産生
細胞をキメラ手鎖遺伝子含有ヘクターでトランスフエク
／、ｌｌンすると、に鎖ベクター中のＣＩ（Ａプロモー
ターを用いる細胞に比べ、対応する全抗体産生の増加か
得られるであろう。最高の発現を示す細胞をサブクロー
ニングし、次いでこれらの高発現サブクローンを明確に
定義した白清不念培地で培養することにより、より高い
発現レベルが達成され得る。このことから、ＣＥＭにプ
ロモーターがホモローガス（ＯＥＭ）配列およびヘテロ
ローガス（ＣＩＡその他）配列の両者を高レベルに発現
させる特別の能力を有していることが明らかである。実
施例１４の教示は約２．２ｋｂのＣ１ａｌ／５ｓｐｌ制
限フラグメント上にＣＥＭプロモーターが存在している
ことを示しているか、当業者はこのＣＥＭにプロモータ
ー配列を容易に得ることができる。
このことは、同日出願の米国特許出願Ｎ ｏ、 ０７／
２７２゜５７７、「ヒトがん胎児性抗原に対するキメラ
抗体」（Ｃ，Ｂ、Ｂｅ１ｄｌｅｒ、 Ｍ、Ｊ、Ｊｏｈｎ
ｓｏｎ、 ａｎｄ Ｊ、Ｒ，Ｌｕｄｗｉｇ）に記載され
ている。、また、１９８８年３月９日出願の米国特許出
願Ｎｏ、 ０７／１６５．８５６（Ｍａｒｙ Ｊ、 Ｊ
ｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｔ、 ）も参照。
２７２゜５７７、「ヒトがん胎児性抗原に対するキメラ
抗体」（Ｃ，Ｂ、Ｂｅ１ｄｌｅｒ、 Ｍ、Ｊ、Ｊｏｈｎ
ｓｏｎ、 ａｎｄ Ｊ、Ｒ，Ｌｕｄｗｉｇ）に記載され
ている。、また、１９８８年３月９日出願の米国特許出
願Ｎｏ、 ０７／１６５．８５６（Ｍａｒｙ Ｊ、 Ｊ
ｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｔ、 ）も参照。
本発明において有用な真核宿主細胞としては、ハイブリ
ドーマ、骨髄腫、形質細胞腫、リンパ腫細胞等が好まし
い。しかし、哺乳動物宿主細胞がキメラ遺伝子の発現の
ための転写および胛訳ＤＮＡ配列を認識し、リーダーペ
プチドをブロセッシングしてリーダー配列を切断し、キ
メラタン７寸り質を分〆必させ、時にはキメラタンパク
質の翻訳後修飾（グリコンル化など）を行うことができ
るならば、他の真核宿主細胞も使用に適する。本発明の
さらに別の態様は、本キメラ抗体を分泌する形質転換宿
主細胞、特に５Ｐ２１０宿主細胞である。
ドーマ、骨髄腫、形質細胞腫、リンパ腫細胞等が好まし
い。しかし、哺乳動物宿主細胞がキメラ遺伝子の発現の
ための転写および胛訳ＤＮＡ配列を認識し、リーダーペ
プチドをブロセッシングしてリーダー配列を切断し、キ
メラタン７寸り質を分〆必させ、時にはキメラタンパク
質の翻訳後修飾（グリコンル化など）を行うことができ
るならば、他の真核宿主細胞も使用に適する。本発明の
さらに別の態様は、本キメラ抗体を分泌する形質転換宿
主細胞、特に５Ｐ２１０宿主細胞である。
好ましい管柱には、本明細書中に記載した哺乳動物発現
ベクターのどれかで形質転換した５Ｐ２１０宿主細胞が
含まれる。
ベクターのどれかで形質転換した５Ｐ２１０宿主細胞が
含まれる。
従って、本発明は、本明細書に開示したキメラ遺伝子構
築物を含有する組換え発現ベクターで形質転換された真
核宿主細胞であって、本発明のキメラタンパク質を発現
することができる宿主細胞を提供するものである。本明
細書中、「形質転換」という語句は、ＤＮＡを受容細胞
に導入することにより宿主細胞のゲノムに変化をもたら
すことをいう。従もて、本発明の形質転換された宿主細
胞は、本明細書に記載のキメラ軽鎖および重鎖遺伝子、
推びにキメラタンパク質を発現させるよう軽鎖および重
鎖をコードしているＤＮＡ配列に関連させて設置した転
写および翻訳用配列を含有する少なくとも１個のＤＮＡ
構築物を含有している。
築物を含有する組換え発現ベクターで形質転換された真
核宿主細胞であって、本発明のキメラタンパク質を発現
することができる宿主細胞を提供するものである。本明
細書中、「形質転換」という語句は、ＤＮＡを受容細胞
に導入することにより宿主細胞のゲノムに変化をもたら
すことをいう。従もて、本発明の形質転換された宿主細
胞は、本明細書に記載のキメラ軽鎖および重鎖遺伝子、
推びにキメラタンパク質を発現させるよう軽鎖および重
鎖をコードしているＤＮＡ配列に関連させて設置した転
写および翻訳用配列を含有する少なくとも１個のＤＮＡ
構築物を含有している。
本発明で用いる宿主細胞は、当業者周知の常法を用い、
種々の方法でトランスフェクションすることができる。
種々の方法でトランスフェクションすることができる。
常用のトランスフェクション法の内、電気穿孔（エレク
トロポレーション）法、プロトプラスト融合法、および
リン酸カルシウム沈澱法を用いることができる。そのよ
うな方法は、以下の文献に記載されている：トネグッゾ
ーら（Ｔ。
トロポレーション）法、プロトプラスト融合法、および
リン酸カルシウム沈澱法を用いることができる。そのよ
うな方法は、以下の文献に記載されている：トネグッゾ
ーら（Ｔ。
ｎｅｇｕｚｚｏ、 Ｆ 、 ）、モレキユラー・アンド
・セルラー・バイオロジー、６：７０３−７０６（１９
８６）；チューら（Ｃｈｕ＋ ｃ、 ）、ニュークレイ
ツク・アッシズ・リサーチ、１５：１３１１−１３２５
（１９８７）ニライスら（Ｒｉｃｅ、Ｄ、）、プロシー
ディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サ
イエンシイズ、７９ニア８６２−７８６５（１９７９）
：およびオイら（Ｏｉ、Ｖ、）、プロシーディングズ・
オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシイズ
、８０：８２５−８２９（１９８３）。
・セルラー・バイオロジー、６：７０３−７０６（１９
８６）；チューら（Ｃｈｕ＋ ｃ、 ）、ニュークレイ
ツク・アッシズ・リサーチ、１５：１３１１−１３２５
（１９８７）ニライスら（Ｒｉｃｅ、Ｄ、）、プロシー
ディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サ
イエンシイズ、７９ニア８６２−７８６５（１９７９）
：およびオイら（Ｏｉ、Ｖ、）、プロシーディングズ・
オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシイズ
、８０：８２５−８２９（１９８３）。
本発明のキメラ構築物を含有する組換光発現ベクターで
、宿主細胞を連続的にトランスフェクションするのが好
ましい。例えば、宿主細胞をまず、キメラ軽鎖ＤＮＡ構
築物を含有する発現ベクターでｉ・ランスフエク／ヨン
し、キメラ軽鎖ポリペプチドを発現している宿主細胞を
当業者周知の方法で選１尺する［エングボール（Ｅ ｎ
ｇｖａｌｌ、 Ｅ 、 ）およびバールマンら（Ｐｅｒ
ｌｍａｎ Ｐ、）、イムノケミストリー（ｌ ｍｍｕｎ
ｏｃｈｅ＋＋＋１ｓｔｒｙ）、８：８７１−８７４（１
９７１）］。その後、選択した宿主細胞を、キメラ単鎖
ＤＮＡ構築物を含有する発現ベクターでトランスフェク
ションする。しかし、キメラ軽鎖および重鎖発現ヘクタ
ーを同時に宿主細胞に導入してもよいことは理解されよ
う。別法として、両キメラ遺伝子構築物を宿主細胞トラ
ンスフェクション）１１の１１１−の発現ベクター上に
結合することもできる。トランスフェクションおよび選
択の後、通常の険定を行って、キレートに指向性の抗体
を検出し、本発明により明確にされたキメラ軽鎖および
ｒＴｒ ｋ’ｌ Ｊｉｆ伝子の両方を発現する形質転換
細胞を同定する。
、宿主細胞を連続的にトランスフェクションするのが好
ましい。例えば、宿主細胞をまず、キメラ軽鎖ＤＮＡ構
築物を含有する発現ベクターでｉ・ランスフエク／ヨン
し、キメラ軽鎖ポリペプチドを発現している宿主細胞を
当業者周知の方法で選１尺する［エングボール（Ｅ ｎ
ｇｖａｌｌ、 Ｅ 、 ）およびバールマンら（Ｐｅｒ
ｌｍａｎ Ｐ、）、イムノケミストリー（ｌ ｍｍｕｎ
ｏｃｈｅ＋＋＋１ｓｔｒｙ）、８：８７１−８７４（１
９７１）］。その後、選択した宿主細胞を、キメラ単鎖
ＤＮＡ構築物を含有する発現ベクターでトランスフェク
ションする。しかし、キメラ軽鎖および重鎖発現ヘクタ
ーを同時に宿主細胞に導入してもよいことは理解されよ
う。別法として、両キメラ遺伝子構築物を宿主細胞トラ
ンスフェクション）１１の１１１−の発現ベクター上に
結合することもできる。トランスフェクションおよび選
択の後、通常の険定を行って、キレートに指向性の抗体
を検出し、本発明により明確にされたキメラ軽鎖および
ｒＴｒ ｋ’ｌ Ｊｉｆ伝子の両方を発現する形質転換
細胞を同定する。
さらに、本発明で開示したキメラポリペプチドのアミノ
酸配列をわずかに修飾することにより、キレートとの結
合において実質的に等価な可変領域が得られることは理
解されよう。これらの修飾は、キレートに対する目的の
特異性が保持されている限り、本発明の範囲内に包含さ
れる。
酸配列をわずかに修飾することにより、キレートとの結
合において実質的に等価な可変領域が得られることは理
解されよう。これらの修飾は、キレートに対する目的の
特異性が保持されている限り、本発明の範囲内に包含さ
れる。
［作用］
特定イオンのキレート錯体を認識する本キメラモアクロ
ーナル抗体の能力は、本キレート化剤と他のイオンの錯
体との関連において、選択した金属がキレートを形成す
るときには他の金属を含む溶液から金属イオンを検出し
、分離することを可能にする。さらに、本抗体は、治療
およびイメージングの目的で投与したキレート化放射性
核種の血清半減期を変える（延ばすことが多い）。また
、ある場合には、本キメラモアクローナル抗体の投与に
よって、腫瘍での放射性活性の取り込みか身体の他の部
分と比較して増強されることもある１本キメラ抗体のネ
ズミ（即ち、非キメラ）類似体はそのような性質を示し
たコ。リアタン等［Ｄ、 Ｔ、 ｌｌｅａｒｄａｎ、
Ｃ，Ｐ、Ｍｅａｒｅｓ、 Ｄ、Ａ、Ｇｏｏｄｗｉｎ
、 ｌ１１．ＭｃＴｉｇｕｅ、 Ｇ、Ｓ、Ｄａｖｉｄ
、 Ｍ、Ｒ，５ｔｏｎｅ、 Ｊ、Ｐ、Ｌｅｕｎｇ、
Ｒ，Ｍ、Ｂａｒｔｈｏｌｅｍｅｗ。
ーナル抗体の能力は、本キレート化剤と他のイオンの錯
体との関連において、選択した金属がキレートを形成す
るときには他の金属を含む溶液から金属イオンを検出し
、分離することを可能にする。さらに、本抗体は、治療
およびイメージングの目的で投与したキレート化放射性
核種の血清半減期を変える（延ばすことが多い）。また
、ある場合には、本キメラモアクローナル抗体の投与に
よって、腫瘍での放射性活性の取り込みか身体の他の部
分と比較して増強されることもある１本キメラ抗体のネ
ズミ（即ち、非キメラ）類似体はそのような性質を示し
たコ。リアタン等［Ｄ、 Ｔ、 ｌｌｅａｒｄａｎ、
Ｃ，Ｐ、Ｍｅａｒｅｓ、 Ｄ、Ａ、Ｇｏｏｄｗｉｎ
、 ｌ１１．ＭｃＴｉｇｕｅ、 Ｇ、Ｓ、Ｄａｖｉｄ
、 Ｍ、Ｒ，５ｔｏｎｅ、 Ｊ、Ｐ、Ｌｅｕｎｇ、
Ｒ，Ｍ、Ｂａｒｔｈｏｌｅｍｅｗ。
ａｎｄ Ｊ、Ｍ、Ｆｒ１ｎｃｋｅ、 Ｎａｔｕｒｅ、
３１６．２６５−２６８（１９８５）］を参照。また
、メアレス等［Ｃ，Ｐ、 Ｍｅａｒｅｓ ｅｔ ａｔ、
；米国特許Ｎ ｏ、 ４．７２２．８９２（１９８８
年２月２日発行）］も参照。
３１６．２６５−２６８（１９８５）］を参照。また
、メアレス等［Ｃ，Ｐ、 Ｍｅａｒｅｓ ｅｔ ａｔ、
；米国特許Ｎ ｏ、 ４．７２２．８９２（１９８８
年２月２日発行）］も参照。
さらに、本キメラモアクローナル抗体を用いて二官能性
抗体、即ち２つの特異性を有する抗体を得ることができ
る。通常、この二官能性抗体の第２の特異性は、；１Φ
瘍、伝染性微生物、またはその他の疾忠状態に関連する
抗原である。そのような抗原には、発癌抗原（ＣＥＡ）
、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、前立腺特異的
抗原などの腫瘍関連抗原が含まれる。この二官能性抗体
を、本発明の抗〜金属錯体抗体のフラグメントまたは分
子の半分から組み立てることができる。二官能性抗体の
他の「半分」は、キメラの別の特異性の部分である。
抗体、即ち２つの特異性を有する抗体を得ることができ
る。通常、この二官能性抗体の第２の特異性は、；１Φ
瘍、伝染性微生物、またはその他の疾忠状態に関連する
抗原である。そのような抗原には、発癌抗原（ＣＥＡ）
、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、前立腺特異的
抗原などの腫瘍関連抗原が含まれる。この二官能性抗体
を、本発明の抗〜金属錯体抗体のフラグメントまたは分
子の半分から組み立てることができる。二官能性抗体の
他の「半分」は、キメラの別の特異性の部分である。
後の結合のための適当な抗体フラグメント（例えば、Ｆ
ａｂ’またはそのフラグメント）は、当分野でよ（知
られた方法によって調製することができる０パーハム［
Ｐａｒｈａｍ、 Ｊ、１ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、 １３ｆ
＋ ２８９５（１９８３）］ ；ラモイ等［Ｌａｍｏｙ
ｉ ａｔ ａｌ、、 Ｊ、 ＩｍＩｌｕｎｏｌｏｇｉ
ｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、 ５６．２３５（１９８３）
］ ；パーハム［ＰａｔｈａＩ、同上、 ５３． １３
３（１９８２）］；およびママツセラ［ｋｌａｔｔｈｅ
ｗ ｅｔ ａｔ、、同上、 ５０．２３９（１９８２）
］を参照。抗体半分子は全抗体から調製することができ
、これを当分野で周知の方法によって化学的に再組合せ
して本発明の抗−ハブテン抗体から作られた二官能性抗
体を得ることができる。例えば、オーデイトレーハーグ
レーブス［）（、Ａｕｄｉｔｏｒｅ−１１ａｒｇｒｅａ
ｖｅｓ ；米国特許Ｎｏ、 ４．４７９．８９５ ；
１９８４年１０月３０日発行］およびポーラス［Ｈ，Ｐ
、 Ｐａｕｌｕｓ ；米国特許Ｎ ｏ、 ４．４４４．
８７８ ； １９８４年４月２４日発行］を参照。例え
ば、架橋剤ビス（マレイミド）メチルエーテル（ｒＢＭ
ＭＥＪ ）を用いてフラグメントまたは半分子を結合さ
せることができる。
ａｂ’またはそのフラグメント）は、当分野でよ（知
られた方法によって調製することができる０パーハム［
Ｐａｒｈａｍ、 Ｊ、１ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、 １３ｆ
＋ ２８９５（１９８３）］ ；ラモイ等［Ｌａｍｏｙ
ｉ ａｔ ａｌ、、 Ｊ、 ＩｍＩｌｕｎｏｌｏｇｉ
ｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、 ５６．２３５（１９８３）
］ ；パーハム［ＰａｔｈａＩ、同上、 ５３． １３
３（１９８２）］；およびママツセラ［ｋｌａｔｔｈｅ
ｗ ｅｔ ａｔ、、同上、 ５０．２３９（１９８２）
］を参照。抗体半分子は全抗体から調製することができ
、これを当分野で周知の方法によって化学的に再組合せ
して本発明の抗−ハブテン抗体から作られた二官能性抗
体を得ることができる。例えば、オーデイトレーハーグ
レーブス［）（、Ａｕｄｉｔｏｒｅ−１１ａｒｇｒｅａ
ｖｅｓ ；米国特許Ｎｏ、 ４．４７９．８９５ ；
１９８４年１０月３０日発行］およびポーラス［Ｈ，Ｐ
、 Ｐａｕｌｕｓ ；米国特許Ｎ ｏ、 ４．４４４．
８７８ ； １９８４年４月２４日発行］を参照。例え
ば、架橋剤ビス（マレイミド）メチルエーテル（ｒＢＭ
ＭＥＪ ）を用いてフラグメントまたは半分子を結合さ
せることができる。
本発明のハブテン特異的なキメラ抗体から二官能性の抗
体を作るさらに別の方法は、哺乳動物細胞（例えば、Ｓ
Ｐ ２１０）を一対の哺乳動物発現ベクター、即ち、
一方のベクターが本重鎖および軽鎖の遺伝子を担持して
おり、他方のベクターが抗原特異的な半分子の重鎖およ
び軽鎖遺伝子を含有している一対のベクターでトランス
フェクションすることである。当分野で既知の方法、例
えばエレクトロポレーション法（電気穿孔法）により、
これらのベクターを用いてこのセルラインを連続して、
または同時にトランスフェクションすることかできる。
体を作るさらに別の方法は、哺乳動物細胞（例えば、Ｓ
Ｐ ２１０）を一対の哺乳動物発現ベクター、即ち、
一方のベクターが本重鎖および軽鎖の遺伝子を担持して
おり、他方のベクターが抗原特異的な半分子の重鎖およ
び軽鎖遺伝子を含有している一対のベクターでトランス
フェクションすることである。当分野で既知の方法、例
えばエレクトロポレーション法（電気穿孔法）により、
これらのベクターを用いてこのセルラインを連続して、
または同時にトランスフェクションすることかできる。
この方法による二官能性抗体の構築は、ジョンソンおよ
びヘルブス［Ｍ、 Ｊ、 Ｊｏｈｎｓｏｎ ａｎｄ Ｊ
、 Ｐｈｅｌｐｓ ； ｒ二官能性キメラ抗体」 ；
米国特許出願Ｎ ｏ、 ０７／２７４．１０５ ：本願
と同時出願］が開示している。
びヘルブス［Ｍ、 Ｊ、 Ｊｏｈｎｓｏｎ ａｎｄ Ｊ
、 Ｐｈｅｌｐｓ ； ｒ二官能性キメラ抗体」 ；
米国特許出願Ｎ ｏ、 ０７／２７４．１０５ ：本願
と同時出願］が開示している。
キメウニ官能性抗体の使用方法は非キメラニ官能性抗体
のものと同様である。二官能性抗体の例については上記
の米国特許Ｎ ｏ、 ４．４７９．８９５およびＮ ｏ
、 ４．４４４．８７８を参照。また、マルチニス等［
Ｊ、 Ｍａｒｔｉｎｉｓ ｅｔ ａｌ、］の米国特許出
願Ｎ ｏ、 ３６７、７８４（１９８２年４月１２日出
願）も参照。
のものと同様である。二官能性抗体の例については上記
の米国特許Ｎ ｏ、 ４．４７９．８９５およびＮ ｏ
、 ４．４４４．８７８を参照。また、マルチニス等［
Ｊ、 Ｍａｒｔｉｎｉｓ ｅｔ ａｌ、］の米国特許出
願Ｎ ｏ、 ３６７、７８４（１９８２年４月１２日出
願）も参照。
以下に実施例および図面を挙げて本発明をさらに詳しく
説明するが、これらは説明のために挙げたものであって
、本発明はこれらに限定されるものではない。
説明するが、これらは説明のために挙げたものであって
、本発明はこれらに限定されるものではない。
夫嵐利
ＣｌＡ２５５．５と呼ばれるネズミハイブリドーマ細胞
を以下の実施例で用い、軽鎖および重鎖可変領域のゲノ
ムＤＮＡを誘導し、クローンした。
を以下の実施例で用い、軽鎖および重鎖可変領域のゲノ
ムＤＮＡを誘導し、クローンした。
このネズミハイブリドーマＣＨＡ２５５．５由来のクロ
ーン化ゲノムＤＮＡ、およびヒト末梢血液リンパ球をキ
メラ遺伝子の構築に用いた。
ーン化ゲノムＤＮＡ、およびヒト末梢血液リンパ球をキ
メラ遺伝子の構築に用いた。
キメラ遺伝子のトランスフェクションは、実質的にトネ
グノゾ等［Ｔｏｎｅｇｕｚｚｏ、Ｆ、 ｅＬ ａｌ、、
Ｍｏ１ｅｃｕＪａｒ ａｎｄ Ｃｅ１１． Ｂｉｏｌ
、 、 ６ ： ７０３−７０６（１９８６）］および
チュー等［Ｃｈｕ、Ｇ、 ｅＬ ａｌ、、 Ｎｕｅｌｅ
ｉｃ Ａｃ１ｄ １ｉｅｓ１５ ： １３１１−１３２
５（１９ｇ？）］が記載しているような、エレクトロポ
レーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）法によ
って行った。宿主細胞ＳＰ２１０−Ａｇ１４ノ＼イブノ
ドーマ細胞がキメラ遺伝子の受容体であった。
グノゾ等［Ｔｏｎｅｇｕｚｚｏ、Ｆ、 ｅＬ ａｌ、、
Ｍｏ１ｅｃｕＪａｒ ａｎｄ Ｃｅ１１． Ｂｉｏｌ
、 、 ６ ： ７０３−７０６（１９８６）］および
チュー等［Ｃｈｕ、Ｇ、 ｅＬ ａｌ、、 Ｎｕｅｌｅ
ｉｃ Ａｃ１ｄ １ｉｅｓ１５ ： １３１１−１３２
５（１９ｇ？）］が記載しているような、エレクトロポ
レーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）法によ
って行った。宿主細胞ＳＰ２１０−Ａｇ１４ノ＼イブノ
ドーマ細胞がキメラ遺伝子の受容体であった。
使用したこのＳＰ２１０−Ａｇ１４７＼イブリドーマ細
胞はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション［
Ａ＋＋＋ｃｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃ
ｏ１１ｅｃｔｉｏｎ。
胞はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション［
Ａ＋＋＋ｃｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃ
ｏ１１ｅｃｔｉｏｎ。
Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、 Ｍａｒｙｌａｎｄ］から取得番
号ＡＴＣＣＣＲＬ Ｉ ５８１のもとて人手できる。
号ＡＴＣＣＣＲＬ Ｉ ５８１のもとて人手できる。
以下の実施例において、「マニアティス」および「デイ
ビス」と表示したのは、それぞれ、マニアティａｔｏｒ
ｙ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８２）］、およびデイビス等編
集（Ｌ、Ｇ、Ｄａｖｉｓ、 Ｍ、Ｄ、Ｄｉｂｒ＋ｅｒａ
ｎｄ Ｊ、 Ｆ、 ＢａｔＬｅｙ）のＢａ５ｉｃ Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｎ ｋｌｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇ
ｙ［Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８６
）］の短縮表示である。
ビス」と表示したのは、それぞれ、マニアティａｔｏｒ
ｙ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８２）］、およびデイビス等編
集（Ｌ、Ｇ、Ｄａｖｉｓ、 Ｍ、Ｄ、Ｄｉｂｒ＋ｅｒａ
ｎｄ Ｊ、 Ｆ、 ＢａｔＬｅｙ）のＢａ５ｉｃ Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｎ ｋｌｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇ
ｙ［Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８６
）］の短縮表示である。
また、以下の実施例では、酵素、試薬および装置の市販
供給元を短縮形で表す。多数のこれら供給元の所在地を
次に挙げる：ギブコーＢＲＬ （Ｇｉｂｃ。
供給元を短縮形で表す。多数のこれら供給元の所在地を
次に挙げる：ギブコーＢＲＬ （Ｇｉｂｃ。
ＢＲＬ、 Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ、 Ｍｄ、 ；
ｒギブコ」または［ＢＲＬＪ）、二ニー・イングランド
・バイオラブズ（Ｎｅｗ Ｃｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａ
ｂｓ、 Ｂｅｖｅｒ！ｙ＋ Ｍａｓｓ、）、シグマ・ケ
ミカル社（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅ＋５ｉｃａｌ Ｃｏ、、
ＳＬ、Ｌｏｕｉｓ。
ｒギブコ」または［ＢＲＬＪ）、二ニー・イングランド
・バイオラブズ（Ｎｅｗ Ｃｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａ
ｂｓ、 Ｂｅｖｅｒ！ｙ＋ Ｍａｓｓ、）、シグマ・ケ
ミカル社（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅ＋５ｉｃａｌ Ｃｏ、、
ＳＬ、Ｌｏｕｉｓ。
Ｍｏ、 ； ｒシグマ」）、シュライヒャー・アンド
・シュウエル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈ
ｗｅｌｌ、 Ｋｅｅｎｅ、 Ｎ、Ｉｌ、）、およびスト
ラタジーン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、 Ｉｎｃｏｒｐ
ｏｒａｔｅｄ、 Ｌａ Ｊｏｌｌａ、 Ｃａ、 ；
「ストラタジーン」）など。
・シュウエル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈ
ｗｅｌｌ、 Ｋｅｅｎｅ、 Ｎ、Ｉｌ、）、およびスト
ラタジーン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、 Ｉｎｃｏｒｐ
ｏｒａｔｅｄ、 Ｌａ Ｊｏｌｌａ、 Ｃａ、 ；
「ストラタジーン」）など。
制限酵素反応は、特記事項がなければ、ＢＲＬからの酵
素を用い、適切な反応緩衝１ｆｆｌ（ＢＲＬ）中、３７
°Ｃで約２時間行った。
素を用い、適切な反応緩衝１ｆｆｌ（ＢＲＬ）中、３７
°Ｃで約２時間行った。
酵素は、他に特記事項がなければＢ ＲＬ、シグマ、ま
たは二ニー・イングランド・バイオラブズから人手した
。
たは二ニー・イングランド・バイオラブズから人手した
。
実施例１ 突然変異ＣＨＡ２５５セルラインの誘導
次の実験の目的は、λｌ軽免疫グロブリンタンパク質鎖
または７１重免疫グロブリンタンパク質鎖のどちらかを
もはや産生しないＣＨＡ２５５５ハイブリドーマ由来の
サブクローンを誘導することにあった。次いで、これら
セルラインからのＤＮＡを、親セルラインＤＮＡとの比
較に用いて、特異的なＣＨＡ２５５Ｖ、Ｉおよび■、遺
伝子を含む制限フラグメントを同定することができる。
または７１重免疫グロブリンタンパク質鎖のどちらかを
もはや産生しないＣＨＡ２５５５ハイブリドーマ由来の
サブクローンを誘導することにあった。次いで、これら
セルラインからのＤＮＡを、親セルラインＤＮＡとの比
較に用いて、特異的なＣＨＡ２５５Ｖ、Ｉおよび■、遺
伝子を含む制限フラグメントを同定することができる。
ＣＩｌΔ２５５．５を田胞は、９．０％のウマ血を青［
ボク不ツタ・オーガニック・ケミカルズ（Ｂｏｃｈｎｅ
ｋＯｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｎｉｃａｌｓ）］、０．２％
のウシ胎児血清（ギブコ）およびｌ ０−５Ｍの２−メ
ルカプトエタノール［バイオラッド（Ｂｉｏｒａｄ）］
を追加したダルベツコの改変イーグル培地Ｈ２１［オン
タリオ・キャンサー・イア７、チチュート（Ｏｎｔａｒ
ｉｏ Ｃａｎｃｅｒ １ｎｓｔｉｔｕｔｅ）］中で増殖
させな。
ボク不ツタ・オーガニック・ケミカルズ（Ｂｏｃｈｎｅ
ｋＯｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｎｉｃａｌｓ）］、０．２％
のウシ胎児血清（ギブコ）およびｌ ０−５Ｍの２−メ
ルカプトエタノール［バイオラッド（Ｂｉｏｒａｄ）］
を追加したダルベツコの改変イーグル培地Ｈ２１［オン
タリオ・キャンサー・イア７、チチュート（Ｏｎｔａｒ
ｉｏ Ｃａｎｃｅｒ １ｎｓｔｉｔｕｔｅ）］中で増殖
させな。
次に、細胞を、９６ウエルの組織培養プレート［リンプ
ロ（！、ｉｍｂｒｏ）］で１細胞／ウェルにサブクロー
ンした。このサブクローンからの４−清を、イングハル
およびペールマン［Ｅｎｇｖａｌｌ、Ｅ、 ａｎｄ Ｐ
ｅｒｌｍａｎｎ Ｐ １ｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ ８．８７１−８７４（１９７１）］記載の標準ＥＬ
ＩＳＡｆｆｉを用いて分析した。
ロ（！、ｉｍｂｒｏ）］で１細胞／ウェルにサブクロー
ンした。このサブクローンからの４−清を、イングハル
およびペールマン［Ｅｎｇｖａｌｌ、Ｅ、 ａｎｄ Ｐ
ｅｒｌｍａｎｎ Ｐ １ｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ ８．８７１−８７４（１９７１）］記載の標準ＥＬ
ＩＳＡｆｆｉを用いて分析した。
この分析は基本的には以下の記載のようにして行った。
ＢＳΔベンジルＥＤＴＡを、メアレス等［Ｍｃａｒｃｓ
ｅｔ ａｔ、、 Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ １４２゜６８−７８（１９１ｊ４）］
のようにして調製した。ＢＳＡの各分子は分子あたり５
〜１０個のキレートを含んでいた。このＢＳＡ−キレー
トの溶液に、ノーブテンの１０５％モル過剰のＩｎＣＱ
３を加えることによってキレートをインジウムで処理し
、０．１３Ｍクエン酸塩（ｐＨ＝６）中で一晩インキユ
ベートした。１０ｍＭリン酸塩（ｐＨ＝７．２）を用い
てこの溶液を容量にした。最終の濃度は１０μ９／Ｒ１
２であった。
ｅｔ ａｔ、、 Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ １４２゜６８−７８（１９１ｊ４）］
のようにして調製した。ＢＳＡの各分子は分子あたり５
〜１０個のキレートを含んでいた。このＢＳＡ−キレー
トの溶液に、ノーブテンの１０５％モル過剰のＩｎＣＱ
３を加えることによってキレートをインジウムで処理し
、０．１３Ｍクエン酸塩（ｐＨ＝６）中で一晩インキユ
ベートした。１０ｍＭリン酸塩（ｐＨ＝７．２）を用い
てこの溶液を容量にした。最終の濃度は１０μ９／Ｒ１
２であった。
次に、９６ウエルプレートのそれぞれのウェルを５０μ
１２ Ｉｎ−ＢＳＡ／ウェルで被覆し、３７℃で一晩乾
燥させた。次いで、このプレートを水およびＰＢＳ＋Ｑ
、１％ツイーン（ｗ／ｖ）中で徹底的に洗浄した。それ
ぞれのサブクローンからの上清分画（５０μｍ２）をそ
れぞれのウェルに加え、室温で２時間インキュベートし
た。上記のようにしてプレートをもう一度すすいだ。ヤ
キ抗−ヒトに鎖アルカリホスファタシセコンシュゲート
（Ｔａｇｏ ＃２４９６）を上清原料と同じ培地でｔ：
ｔｏｏｏに希釈した。ウェルあたりに１００μＱを加え
、室温で１時間インキュベートシた。プレートを上記の
ようにして回度すすいだ。アルカリホスファターゼ基質
は包装の指示通り蒸留水３村につき１錠で調製し、この
基質（１５０μｍ２）をそれぞれのウェルに加え、３７
°Ｃで３０分間インキュベートした。この反応を５００
ｍＭのＥＤＴＡ（５０μｇ）で停止させ、次に４０５ｎ
Ｍでの吸収値を読み取った。シグナルを与えない上清を
、重鎖または軽鎖遺伝子のどちらかを欠いているものと
決定したくプレートに存在している抗原と結合していな
いので）。
１２ Ｉｎ−ＢＳＡ／ウェルで被覆し、３７℃で一晩乾
燥させた。次いで、このプレートを水およびＰＢＳ＋Ｑ
、１％ツイーン（ｗ／ｖ）中で徹底的に洗浄した。それ
ぞれのサブクローンからの上清分画（５０μｍ２）をそ
れぞれのウェルに加え、室温で２時間インキュベートし
た。上記のようにしてプレートをもう一度すすいだ。ヤ
キ抗−ヒトに鎖アルカリホスファタシセコンシュゲート
（Ｔａｇｏ ＃２４９６）を上清原料と同じ培地でｔ：
ｔｏｏｏに希釈した。ウェルあたりに１００μＱを加え
、室温で１時間インキュベートシた。プレートを上記の
ようにして回度すすいだ。アルカリホスファターゼ基質
は包装の指示通り蒸留水３村につき１錠で調製し、この
基質（１５０μｍ２）をそれぞれのウェルに加え、３７
°Ｃで３０分間インキュベートした。この反応を５００
ｍＭのＥＤＴＡ（５０μｇ）で停止させ、次に４０５ｎ
Ｍでの吸収値を読み取った。シグナルを与えない上清を
、重鎖または軽鎖遺伝子のどちらかを欠いているものと
決定したくプレートに存在している抗原と結合していな
いので）。
陰性のＥＬＩＳΔ読み値に対応している上清分画および
細胞を次に通常の５ＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、どの鎖か
多種の突然変異サブクローン中で欠けているかを調べた
。上清を、ＹＭ３０フィルターを備えたＡａ＋１ｃｏｎ
５ｔｉｒｒｅｄ Ｃｅ１ｌ装置で約１０倍濃縮した。
細胞を次に通常の５ＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、どの鎖か
多種の突然変異サブクローン中で欠けているかを調べた
。上清を、ＹＭ３０フィルターを備えたＡａ＋１ｃｏｎ
５ｔｉｒｒｅｄ Ｃｅ１ｌ装置で約１０倍濃縮した。
これらの濃縮上清、並びに親ハイブリドーマＣｔｌＡ２
５５．５由来のａ縮上清を改変レンムリ（Ｌａｅｉ＋ｍ
１ｉ） １０％５ＤＳ−ＰＡＧＥ還元ゲルで分析した。
５５．５由来のａ縮上清を改変レンムリ（Ｌａｅｉ＋ｍ
１ｉ） １０％５ＤＳ−ＰＡＧＥ還元ゲルで分析した。
試料あたり約２．５μ９の１ｇタンパク質が分析された
。還元試料はＳＤＳ試料緩衝液中に０．１ＭのＤＴＴを
含んでいた。ゲルにかける前に全ての試料を５分間煮沸
した。常法により、低分子量タンパク質標準［ファーマ
／ア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ。
。還元試料はＳＤＳ試料緩衝液中に０．１ＭのＤＴＴを
含んでいた。ゲルにかける前に全ての試料を５分間煮沸
した。常法により、低分子量タンパク質標準［ファーマ
／ア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ。
Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、 Ｎ、Ｊ、）］をゲルでクロマ
トグラフィーした。タンパク質ゲルをメタノール：酢酸
：水（４：１＋６）中で染色し、次に見えるようにして
、どのタンパク質産物が突然変異体サブクローン化セル
ライン中に欠けているかを調べた。
トグラフィーした。タンパク質ゲルをメタノール：酢酸
：水（４：１＋６）中で染色し、次に見えるようにして
、どのタンパク質産物が突然変異体サブクローン化セル
ライン中に欠けているかを調べた。
実施例２ プラスミドｐＭＬＣＨ−１：ネズミＣＨＡ２
５５．５ＶＬλ遺伝子を含有するベクターの構築 １ｇの発現を欠いた突然変異体サブクローンセルライン
およびＣＨＡ２５５．５からのゲノムＤＮＡを、基本的
にマニアティス記載（２８０〜２８１頁）の方法によっ
て単離した。約１ｘｌＯ１１個のハイブリドーマ細胞（
親または突然変異体）を遠心して集めたく１０分間、３
ＱＱｒｐｍ、ＩＥｃ臨床用遠心機）。この細胞をＰＢＳ
で２回洗浄した。次いで、細胞をＴＥＮ［即ち、１０ｍ
Ｍ）リス−＋−＋Ｃ（（ｐＨ＝８．０）、２１１Ｍ Ｅ
ＤＴＡ、および４０ａＭＮａＣＱを含む溶液］（４籾）
に再懸濁し、１０％５ＤＳ（２００μのおよびｌＯ渭ｙ
／ ｆｆ１２プロテアーゼに溶液（４２μＱ）（シグマ
）を加えて溶菌した。この細胞懸？蜀液を３７°Ｃて一
晩インキユベートした。この懸濁ｉｆ＆を等容量のフェ
ノール；クロロホルム；イソアミルアルコール（２５：
２４：１溶液）で２回、そして等容量のクロロホルム：
イソアミルアルコール（２４＋ １溶液）で２回以上抽
出することによって細胞懸濁液からＤＮＡを単離した。
５５．５ＶＬλ遺伝子を含有するベクターの構築 １ｇの発現を欠いた突然変異体サブクローンセルライン
およびＣＨＡ２５５．５からのゲノムＤＮＡを、基本的
にマニアティス記載（２８０〜２８１頁）の方法によっ
て単離した。約１ｘｌＯ１１個のハイブリドーマ細胞（
親または突然変異体）を遠心して集めたく１０分間、３
ＱＱｒｐｍ、ＩＥｃ臨床用遠心機）。この細胞をＰＢＳ
で２回洗浄した。次いで、細胞をＴＥＮ［即ち、１０ｍ
Ｍ）リス−＋−＋Ｃ（（ｐＨ＝８．０）、２１１Ｍ Ｅ
ＤＴＡ、および４０ａＭＮａＣＱを含む溶液］（４籾）
に再懸濁し、１０％５ＤＳ（２００μのおよびｌＯ渭ｙ
／ ｆｆ１２プロテアーゼに溶液（４２μＱ）（シグマ
）を加えて溶菌した。この細胞懸？蜀液を３７°Ｃて一
晩インキユベートした。この懸濁ｉｆ＆を等容量のフェ
ノール；クロロホルム；イソアミルアルコール（２５：
２４：１溶液）で２回、そして等容量のクロロホルム：
イソアミルアルコール（２４＋ １溶液）で２回以上抽
出することによって細胞懸濁液からＤＮＡを単離した。
水相を合わせ、”Ｉ’ Ｅ ｉ衝液に対して一晩透析し
た。このＤＮＡを５０μｇ／ ｍｏ、の濃度のＲＮアー
ゼＡ（シグマ）で２時間、続いて２００μ９／ ｆｆ１
２のａ度を与えるプロテアーゼにで１時間、３７°Ｃで
処理した。上記のようにしてＤＮＡをもう一度抽出し、
−晩透析した。透析後、ｌ／１０容量の２Ｍ酢酸ナトリ
ウム溶液および２容量の９５％エタノールを加えること
によって透析抽出物からＤＮＡを沈澱させ、３０分間、
−２０°Ｃに保った。この冷エタ／−ル溶妓を８０００
ｒｐｍで３０分間遠心した。得られたｌ） Ｎ Ａベ
レットを十分量のＴ Ｅ緩衝液に再懸濁し、２６０ｎｍ
での溶液の光学密度で測定して、５００μ９／村のＤＮ
Ａ溶液を得た（２６ Ｏｎ＋＋＋での吸収１単位は５０
μ９／ｘ（ｌに等しい）。
た。このＤＮＡを５０μｇ／ ｍｏ、の濃度のＲＮアー
ゼＡ（シグマ）で２時間、続いて２００μ９／ ｆｆ１
２のａ度を与えるプロテアーゼにで１時間、３７°Ｃで
処理した。上記のようにしてＤＮＡをもう一度抽出し、
−晩透析した。透析後、ｌ／１０容量の２Ｍ酢酸ナトリ
ウム溶液および２容量の９５％エタノールを加えること
によって透析抽出物からＤＮＡを沈澱させ、３０分間、
−２０°Ｃに保った。この冷エタ／−ル溶妓を８０００
ｒｐｍで３０分間遠心した。得られたｌ） Ｎ Ａベ
レットを十分量のＴ Ｅ緩衝液に再懸濁し、２６０ｎｍ
での溶液の光学密度で測定して、５００μ９／村のＤＮ
Ａ溶液を得た（２６ Ｏｎ＋＋＋での吸収１単位は５０
μ９／ｘ（ｌに等しい）。
Ｂ、ＣＨＡ２５５．５の細胞ＤＮＡの制限フラグメント
分析 再配列したＩｇγｌ ＣＨＡ２５５．５重鎖遺伝子を
含むＤＮＡフラグメントの大きさ（サイズ）を確認する
ため、制限フラグメント分析を行った。
分析 再配列したＩｇγｌ ＣＨＡ２５５．５重鎖遺伝子を
含むＤＮＡフラグメントの大きさ（サイズ）を確認する
ため、制限フラグメント分析を行った。
サザーン・プロットをプローブするのに用いたＤＮＡは
、タッカ−博士（叶、Ｐｈ１ｌｌｉｐ Ｔｕｃｋｅｒ、
Ｌｌｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｒＴｅｘａｓ、 Ｄａｌ
ｌａｓ、 Ｔｅｘａｓ）から入手した。
、タッカ−博士（叶、Ｐｈ１ｌｌｉｐ Ｔｕｃｋｅｒ、
Ｌｌｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｒＴｅｘａｓ、 Ｄａｌ
ｌａｓ、 Ｔｅｘａｓ）から入手した。
このプラスミドは、ＢａｍＨＩ −ＥｃｏＲｌフラグメ
ント上に不ズミＢａ１ｂ／Ｃ生殖系列ＪＨ３およびＪＨ
４配列を含んでいる［このフラグメントの配列は、Ｎ
Ｉ Ｉ＋データ（Ｎｌｌｌ Ｄａｔａ ＧｅｎｅＢａｎ
ｋ ；取得番号＃ＪＯＯ４５３）によって知ることかで
きる］。
ント上に不ズミＢａ１ｂ／Ｃ生殖系列ＪＨ３およびＪＨ
４配列を含んでいる［このフラグメントの配列は、Ｎ
Ｉ Ｉ＋データ（Ｎｌｌｌ Ｄａｔａ ＧｅｎｅＢａｎ
ｋ ；取得番号＃ＪＯＯ４５３）によって知ることかで
きる］。
突然変異体をサブクローンしたセルラインおよび親のＣ
ＨＡ２５５．５からのＤＮＡ（２０μ９）を、適当な反
応緩衝液を用い、そして制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｂ
ａｌ（単独で、および−緒にして）をｌμ９のＩ） Ｎ
Ａにｌ：ｊ してｌ〜２単位用いて、３７°Ｃで一晩
消化した。次いで、この消化ＤＮＡを、ＴＢＥｒ−Ｑｉ
ｊｉｉｆｆｌ（８９ｍＭ トリス１：８９ｍＭボレー
トおよび２ｍＭ［ＥＤＴΔ）を用いて４０ボルトで一晩
、１％アガロースゲル［シーケムＣＳｅａｋｅｍ）］の
電気泳動にかけた。次にこのＤＮＡをマニアティス記械
（３８３〜３８６頁）のようにしてニトロセルロースフ
ィルター（シュライヒャー・アンド・シュウエル）に移
した。次いで、このニトロセルロースフィルターを、ニ
ノクートランスレーンヨンした［リグハイ等（Ｐ、 Ｊ
、 Ｒｉｇｂｙ ｅｔ ａｌ、 、 Ｊ、 Ｍｏ１．
［３ｉｏ１ｏｇｙ、 １１３゜２３７（１９７７））］
Ｊ ）（プローブとハイブリダイズさせたくマニアテ
ィスの３８７〜３８９頁ヲ参照＞。ＣＦ（Ａ２５５５重
鎖免疫グロブリン遺伝子産物を発現するか、または発現
しない細胞由来のＤＮＡのこの比較によって、ＣＨＡ２
５５．５Ｖ、遺伝子が８６ｋｂのＢＡｉＨＩフラグメン
トに存在していることがわかった。
ＨＡ２５５．５からのＤＮＡ（２０μ９）を、適当な反
応緩衝液を用い、そして制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｂ
ａｌ（単独で、および−緒にして）をｌμ９のＩ） Ｎ
Ａにｌ：ｊ してｌ〜２単位用いて、３７°Ｃで一晩
消化した。次いで、この消化ＤＮＡを、ＴＢＥｒ−Ｑｉ
ｊｉｉｆｆｌ（８９ｍＭ トリス１：８９ｍＭボレー
トおよび２ｍＭ［ＥＤＴΔ）を用いて４０ボルトで一晩
、１％アガロースゲル［シーケムＣＳｅａｋｅｍ）］の
電気泳動にかけた。次にこのＤＮＡをマニアティス記械
（３８３〜３８６頁）のようにしてニトロセルロースフ
ィルター（シュライヒャー・アンド・シュウエル）に移
した。次いで、このニトロセルロースフィルターを、ニ
ノクートランスレーンヨンした［リグハイ等（Ｐ、 Ｊ
、 Ｒｉｇｂｙ ｅｔ ａｌ、 、 Ｊ、 Ｍｏ１．
［３ｉｏ１ｏｇｙ、 １１３゜２３７（１９７７））］
Ｊ ）（プローブとハイブリダイズさせたくマニアテ
ィスの３８７〜３８９頁ヲ参照＞。ＣＦ（Ａ２５５５重
鎖免疫グロブリン遺伝子産物を発現するか、または発現
しない細胞由来のＤＮＡのこの比較によって、ＣＨＡ２
５５．５Ｖ、遺伝子が８６ｋｂのＢＡｉＨＩフラグメン
トに存在していることがわかった。
円配列したλ軽鎖遺伝子を含む制限フラグメントの大き
さを測定するために、ＶＬＩ−ＪＬ３遺伝子を含む０．
５ｋｂのＤＮＡフラグメントをプローブとして用いた。
さを測定するために、ＶＬＩ−ＪＬ３遺伝子を含む０．
５ｋｂのＤＮＡフラグメントをプローブとして用いた。
λ群の可変領域は１１個のヌクレオチドか異なっている
だけであるので、λプローブはあらゆるλ遺伝子と交差
〜ハイブリダイズする。このＤＮＡはムリアルド博±［
叶、 Ｉｌ、 Ｍｕｒｉａｌｄｏ、 ｔｈｅ Ｕｎｉｖ
ｅｒｓｉｔｙ ｏｒＴｏｒｏｎｔｏ、 Ｄｅｐａｒｔｍ
ｅｎｔｏｆ １ｍｓｕｎｏｌｏｇｙ］から贈られたもの
である（このＶλ遺伝子の配列は、Ｎ１１ｌ Ｄａｔａ
ＧｅｎｅＢａｎｋ取得番号Ｊ００取得番号上００５７
ｇ７９から得ることかできる）。
だけであるので、λプローブはあらゆるλ遺伝子と交差
〜ハイブリダイズする。このＤＮＡはムリアルド博±［
叶、 Ｉｌ、 Ｍｕｒｉａｌｄｏ、 ｔｈｅ Ｕｎｉｖ
ｅｒｓｉｔｙ ｏｒＴｏｒｏｎｔｏ、 Ｄｅｐａｒｔｍ
ｅｎｔｏｆ １ｍｓｕｎｏｌｏｇｙ］から贈られたもの
である（このＶλ遺伝子の配列は、Ｎ１１ｌ Ｄａｔａ
ＧｅｎｅＢａｎｋ取得番号Ｊ００取得番号上００５７
ｇ７９から得ることかできる）。
重鎖遺伝子産物を同定するのに用いた方法とほぼ同じ方
法を用いてλを含有する制限フラグメントを同定した。
法を用いてλを含有する制限フラグメントを同定した。
ＤＮＡを種々の制限エンドヌクレアーゼで消化した。電
気泳動とニトロセルロースフィルターへの移動を行った
後、このフィルターを■λプローブでプローブした。こ
れらのハイブリダイゼーションによって、ＣＨＡ２５５
．５特異的な軽鎖遺伝子は１１ｋｂのＥｃｏＲＩフラグ
メント中に含まれていることがわかった。
気泳動とニトロセルロースフィルターへの移動を行った
後、このフィルターを■λプローブでプローブした。こ
れらのハイブリダイゼーションによって、ＣＨＡ２５５
．５特異的な軽鎖遺伝子は１１ｋｂのＥｃｏＲＩフラグ
メント中に含まれていることがわかった。
■１特巽的な遺伝子を含有している正しいサイズ（大き
さ）のフラグメントを富ませるため、反応緩衝液＃２を
用いてＣ１（Ａ２５５．５細胞ＤＮＡをＥｃｏＲＩ（１
〜２単位／μ９）で消化した。サイズ豊富化ＤＮＡを単
離する方法はホズミ等［ｆｌｏｚｕｍｉＮ、 、 Ｇ、
Ｅ、 Ｗｕ、 、 Ｉｌ、 Ｍｕｒｉａｌｄｏ、 Ｌ
、 Ｒｏｂｅｒｔｓ、 Ｄ、 Ｖｅｔｔｅｒ。
さ）のフラグメントを富ませるため、反応緩衝液＃２を
用いてＣ１（Ａ２５５．５細胞ＤＮＡをＥｃｏＲＩ（１
〜２単位／μ９）で消化した。サイズ豊富化ＤＮＡを単
離する方法はホズミ等［ｆｌｏｚｕｍｉＮ、 、 Ｇ、
Ｅ、 Ｗｕ、 、 Ｉｌ、 Ｍｕｒｉａｌｄｏ、 Ｌ
、 Ｒｏｂｅｒｔｓ、 Ｄ、 Ｖｅｔｔｅｒ。
Ｗ、Ｌ、Ｆｉｆｅ＋ ｌ１１．Ｗｈｉｔｅｌｅｙ、 ａ
ｎｄ Ｐ、Ｓａｄｏｗｓｋｉ、 Ｐｒｏｃ。
ｎｄ Ｐ、Ｓａｄｏｗｓｋｉ、 Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔ １． Ａｃａｄ、 Ｓｃ ｉ、 ＵＳ＾８ｔ、
２４８４（１９８１）］が記載している。サイズ選択
したライブラリーを作成するため、ＣｃｏＲ１消化のサ
イズ選択ＤＮＡ（０，２４μ９）を、予め消化したファ
ージベクターＥＭＢ Ｉ、４ＤＮＡアーム（ストラタジ
ーン）（２５μいにライゲートシた。これら２種類のＤ
ＮＡフラグメントを緒にして、ｌＯＸのりガーゼ緩衝液
１０．５μＱの５００ｍＭ）リス−〇（Ｊ！（ｐＨ＝８
）； ７０ｍＭ ＭｇＣＱ、； ０．ＩＭ ＡＴＰ ；
１０ｍＭジチオトレイトール（ｄｔｔ）］およびＴ４
ＤＮＡリガーゼ（２単位）＋１．１１°Ｃで一晩ラ
イケートした。ライゲートの後、ギカバ、り・インビト
ロ・パンケージング・システム（Ｇｉｇａｐａｃｋ Ｉ
ｎ Ｖｉｔｒｏ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）
（ストラタジーン）を用い、その製品プロトコールに従
って、および宿主大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）株Ｐ２．３９
２（ストラタジーン）を用いてパッケージンクヲ行った
。ギガパック・パッケージング混合物（５０μｇ）とラ
イゲート化ファージの希釈液（１０−”〜１０−”）（
５μＱ）を混合し、２２°Ｃで２時間インキュベートし
た。ファージ希釈緩衝液［ｔｇにつき、ＮａＣＣ（５゜
８９）、Ｍｇ＊ ｓ ｏ−６Ｈｔｏ （２９）、ｌ Ｍ
ト’） ス−ＨＣσ（ｐＨ＝ ７．５）（５０！ＩＱ
）、および２％ゼラチン（５ｍＱ）からなる溶Ｍ０．５
ｘｉ７］を加えた。次いで、マニアティス記載（２８６
〜２９４頁）の標準プロトコールを用いてファージを滴
定した。滴定の後、Ｐ２゜３９２細胞（ストラタジーン
）を用いてｌ００ｍＭプレートあたり２０，０００プラ
ークの密度でファージライブラリーを培養し、３７°Ｃ
で一晩インキユベートした。
２４８４（１９８１）］が記載している。サイズ選択
したライブラリーを作成するため、ＣｃｏＲ１消化のサ
イズ選択ＤＮＡ（０，２４μ９）を、予め消化したファ
ージベクターＥＭＢ Ｉ、４ＤＮＡアーム（ストラタジ
ーン）（２５μいにライゲートシた。これら２種類のＤ
ＮＡフラグメントを緒にして、ｌＯＸのりガーゼ緩衝液
１０．５μＱの５００ｍＭ）リス−〇（Ｊ！（ｐＨ＝８
）； ７０ｍＭ ＭｇＣＱ、； ０．ＩＭ ＡＴＰ ；
１０ｍＭジチオトレイトール（ｄｔｔ）］およびＴ４
ＤＮＡリガーゼ（２単位）＋１．１１°Ｃで一晩ラ
イケートした。ライゲートの後、ギカバ、り・インビト
ロ・パンケージング・システム（Ｇｉｇａｐａｃｋ Ｉ
ｎ Ｖｉｔｒｏ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）
（ストラタジーン）を用い、その製品プロトコールに従
って、および宿主大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）株Ｐ２．３９
２（ストラタジーン）を用いてパッケージンクヲ行った
。ギガパック・パッケージング混合物（５０μｇ）とラ
イゲート化ファージの希釈液（１０−”〜１０−”）（
５μＱ）を混合し、２２°Ｃで２時間インキュベートし
た。ファージ希釈緩衝液［ｔｇにつき、ＮａＣＣ（５゜
８９）、Ｍｇ＊ ｓ ｏ−６Ｈｔｏ （２９）、ｌ Ｍ
ト’） ス−ＨＣσ（ｐＨ＝ ７．５）（５０！ＩＱ
）、および２％ゼラチン（５ｍＱ）からなる溶Ｍ０．５
ｘｉ７］を加えた。次いで、マニアティス記載（２８６
〜２９４頁）の標準プロトコールを用いてファージを滴
定した。滴定の後、Ｐ２゜３９２細胞（ストラタジーン
）を用いてｌ００ｍＭプレートあたり２０，０００プラ
ークの密度でファージライブラリーを培養し、３７°Ｃ
で一晩インキユベートした。
Ｃ−）ＩＡ２５５．５λ軽鎖遺伝子を同定し、そして単
離するため、大腸菌Ｐ２．３９２（ストラタン−ン）中
の３．０ｘ１０５組換えファージを、グルンスタインお
よび゛ホブ不ス［Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｉ！ｏ
ｇｎｅｓｓ、 Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ
、７２．３９６１（１９７ｇ）］並びにマニアティス（
３１２頁）のプロトコールに従ってスクリーニングした
。ムリアルド（叶、 Ｈ，Ｍｕｒｉａｌｄｏ。
離するため、大腸菌Ｐ２．３９２（ストラタン−ン）中
の３．０ｘ１０５組換えファージを、グルンスタインお
よび゛ホブ不ス［Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｉ！ｏ
ｇｎｅｓｓ、 Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ
、７２．３９６１（１９７ｇ）］並びにマニアティス（
３１２頁）のプロトコールに従ってスクリーニングした
。ムリアルド（叶、 Ｈ，Ｍｕｒｉａｌｄｏ。
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｏｒｏｎｔｏ）から得
たプラスミド由来の不ズミ■λプローブを用いてこれを
行った。
たプラスミド由来の不ズミ■λプローブを用いてこれを
行った。
ニトロセルロースフィルターに拾い上げ、さらに分析を
行うために■λ領域プローブとハイブリダイズしている
ファージを選択した。マニアティスの方法（３６８〜３
６９頁）を用いて組換えファージからＤＮＡを単離し、
反応緩衝液＃３を用いてＥｃ。
行うために■λ領域プローブとハイブリダイズしている
ファージを選択した。マニアティスの方法（３６８〜３
６９頁）を用いて組換えファージからＤＮＡを単離し、
反応緩衝液＃３を用いてＥｃ。
Ｒ１で消化した。組換えファージ挿入体のサイズをゲル
電気泳動によって分析した。組換え体の１つは１ｌｋｂ
のＥｃｏＲＩフラグメント挿入体を有していると同定さ
れた。このファージからのＤＮＡを種々の・制限酵素に
よってさらに分析した。このファージをφＭＬＣＨ−Ｉ
ｎｃと命名した。
電気泳動によって分析した。組換え体の１つは１ｌｋｂ
のＥｃｏＲＩフラグメント挿入体を有していると同定さ
れた。このファージからのＤＮＡを種々の・制限酵素に
よってさらに分析した。このファージをφＭＬＣＨ−Ｉ
ｎｃと命名した。
構築
φＭＬＣＨ−Ｉｎｃ ＤＮＡを単離し、単１４ＤＮＡの
一部（２０μｇ）を、反応緩衝液＃３（２２０μのを用
いてＥｃｏＲＩ（１単位／μｇ）で消化した。０．５μ
ｙ／ ｔｘ（ｌの臭化エチジウムを含む０．７５％Ｔ
Ｂ Ｅアガロースゲル中、４０Ｖで一晩、ＥｃｏＲＩ消
化したＤＮＡを電気泳動することによって１ｌｋｂのＥ
ｃｏＲＩフラグメントを単離した。ＵＶ透過光箱で見え
るようにした後、１ｌｋｂのフラグメントをＤＥＡＥ８
１紙（シニライヒャー・アンド・シュウエル）に電気泳
動し、次いで１ＭＮａｃｆｉ中に溶出させ、エタノール
沈澱させた。次に、溶出したフラグメントをＴＥ緩衝液
（６μｇ）に再懸濁した。
一部（２０μｇ）を、反応緩衝液＃３（２２０μのを用
いてＥｃｏＲＩ（１単位／μｇ）で消化した。０．５μ
ｙ／ ｔｘ（ｌの臭化エチジウムを含む０．７５％Ｔ
Ｂ Ｅアガロースゲル中、４０Ｖで一晩、ＥｃｏＲＩ消
化したＤＮＡを電気泳動することによって１ｌｋｂのＥ
ｃｏＲＩフラグメントを単離した。ＵＶ透過光箱で見え
るようにした後、１ｌｋｂのフラグメントをＤＥＡＥ８
１紙（シニライヒャー・アンド・シュウエル）に電気泳
動し、次いで１ＭＮａｃｆｉ中に溶出させ、エタノール
沈澱させた。次に、溶出したフラグメントをＴＥ緩衝液
（６μｇ）に再懸濁した。
このフラグメントを、ＥｃｏＲ［ｌ肖化したプラスミド
ｐＳ Ｖ 、ｎｅｏ（５０ｎ９）にライゲートした：こ
のプラスミドはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒ
ｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、ＡＴＣＣ番号Ｎｏ、３７１
４９）から人手可能である；ｐｓＶ２ｎｅｏ ＤＮＡ（
１ｕｉに ５０ｎ９）、Ｅｃ。
ｐＳ Ｖ 、ｎｅｏ（５０ｎ９）にライゲートした：こ
のプラスミドはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒ
ｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、ＡＴＣＣ番号Ｎｏ、３７１
４９）から人手可能である；ｐｓＶ２ｎｅｏ ＤＮＡ（
１ｕｉに ５０ｎ９）、Ｅｃ。
Ｒ１消化した１ｌｋｂの組換えファージＤ Ｎ Ａ （
６μＣ；３００ｉ）、１０ｘリガーゼ緩衝液（ｌ μｇ
）およびＴ４ ＤＮＡリガーゼ（１μｇ）を用いた。
６μＣ；３００ｉ）、１０ｘリガーゼ緩衝液（ｌ μｇ
）およびＴ４ ＤＮＡリガーゼ（１μｇ）を用いた。
大腸菌ＨＢ Ｉ Ｏｌコンピテント細胞（Ｂ ＲＬ）を
常法によって形質転換した。具体的には、始めに）（Ｂ
ＩＯＩ細胞を水上で解凍し、次にライゲート反応混合物
（１０μＩ２）をＨＢ ｌ ０１細胞（２００μＩ２）
と混合し、得られた混合物を水上で３０分間インキュベ
ートした。この後、４２°Ｃで９０秒間、細胞に熱ショ
ックを与え、次に水上に２分間戻した。ＬＢブロス［１
１２あたり、１０９のＮａＣＣ１５ｆＩの酵母抽出物、
およびｌＯりのトリプトンからなる］（１ｍＱ）を加え
、細胞をニュー・ブルンスウィンク（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎ
ｓｖｉｃｋ）空気振盪型中、２２５ ｒｐＨ１，３７°
Ｃで１時間インキ」べ−トシた。次いで、その一部（２
００μＱ）をアンピンリン（５０μ９／ＲＱ）含有のＬ
Ｂ−アガロースに蒔き、３７°Ｃて一晩インキユベート
した。マニアティス（３１２頁）およびグルンスタイン
等［Ｍ、Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｄ、 ｌｌｏｇ
ｎｅｓｓ、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓ
ｃｉ、 、 ＵＳＡ、 ７２．３９６１（１９７５）］
か詳しく説明しているコロニースクリーニング法を用い
てチンピ／リン１耐性コロニーをスクリーニングした。
常法によって形質転換した。具体的には、始めに）（Ｂ
ＩＯＩ細胞を水上で解凍し、次にライゲート反応混合物
（１０μＩ２）をＨＢ ｌ ０１細胞（２００μＩ２）
と混合し、得られた混合物を水上で３０分間インキュベ
ートした。この後、４２°Ｃで９０秒間、細胞に熱ショ
ックを与え、次に水上に２分間戻した。ＬＢブロス［１
１２あたり、１０９のＮａＣＣ１５ｆＩの酵母抽出物、
およびｌＯりのトリプトンからなる］（１ｍＱ）を加え
、細胞をニュー・ブルンスウィンク（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎ
ｓｖｉｃｋ）空気振盪型中、２２５ ｒｐＨ１，３７°
Ｃで１時間インキ」べ−トシた。次いで、その一部（２
００μＱ）をアンピンリン（５０μ９／ＲＱ）含有のＬ
Ｂ−アガロースに蒔き、３７°Ｃて一晩インキユベート
した。マニアティス（３１２頁）およびグルンスタイン
等［Ｍ、Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｄ、 ｌｌｏｇ
ｎｅｓｓ、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓ
ｃｉ、 、 ＵＳＡ、 ７２．３９６１（１９７５）］
か詳しく説明しているコロニースクリーニング法を用い
てチンピ／リン１耐性コロニーをスクリーニングした。
もう−度λネズミブローブを用いて、得られた組換えｐ
Ｓ Ｖ ２ｎｅ。
Ｓ Ｖ ２ｎｅ。
プラスミドを同定した。このプラスミドをｐＭＬＣＨ−
１と命名し、ブダペスト条約に基づき１９８８年１１月
１４日に７−ザン・リージョナル・リサーチ・ラボラト
リ−（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅ５ｅ
ａｒｃｈ Ｌａｂ）に寄託した（Ｎ ＲＲＬ寄託番号Ｂ
−１８４３２のもとて入手可能）。プラスミドｐＭ Ｌ
ＣＨ−１の制限部位および機能地図は第１図中に示し
た。
１と命名し、ブダペスト条約に基づき１９８８年１１月
１４日に７−ザン・リージョナル・リサーチ・ラボラト
リ−（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅ５ｅ
ａｒｃｈ Ｌａｂ）に寄託した（Ｎ ＲＲＬ寄託番号Ｂ
−１８４３２のもとて入手可能）。プラスミドｐＭ Ｌ
ＣＨ−１の制限部位および機能地図は第１図中に示し
た。
実施例３ プラスミドｐＨＫＦ−１：ヒト不変に遺伝子
を含有するベクターの構築 Ａ ヒＩ−Ｄ Ｎ Ａの単離 ヒトγハブロタイブｆｂｎおよびａｚｇにホモ接合であ
る個体から全面（３Ｍ試料）を採取した。ソーパル（Ｓ
ｏｒｖａｌｌ）Ｇ Ｌ Ｃ−２Ｂ装置中、２５０ Ｏｒ
ｐｍ。
を含有するベクターの構築 Ａ ヒＩ−Ｄ Ｎ Ａの単離 ヒトγハブロタイブｆｂｎおよびａｚｇにホモ接合であ
る個体から全面（３Ｍ試料）を採取した。ソーパル（Ｓ
ｏｒｖａｌｌ）Ｇ Ｌ Ｃ−２Ｂ装置中、２５０ Ｏｒ
ｐｍ。
２２°Ｃでの遠心によって、この試料を遠心し、血液試
料から最上層（軟膜細胞）を集めた。軟膜細胞をパスツ
ールピペットで取り、ＰＢＳて１回洗浄した。この細胞
ベレットを、１０ｍＭ トリス−１−ＩＣＣ（ｐＨ＝
８．０）および４０ｍＭＮａＣ＆からなる溶液（５０
０μＱ）に再懸濁し、次いで１０％５ＤＳ（３０μのお
よび２０ｍ９／ｙｐＱブＯｆ７−ゼＫ （６μ＆）（シ
グマ）を加えて溶菌した。この試料を３７°Ｃで１５時
間インキュベートした。このＤＮＡを、等容量のフェノ
ール：クロロホルム：イソアミルアルコール混合液（２
５：２４＋１）で２回、クロロポルム：イソアミルアル
コールＵ合ｒｆｆｌ（２４＋ １ ） テ２回以上抽出
し、ＩＯ＋ｅＭ）リス−）Ｉ ＣＣ（ｐＨ＝ ８０）お
よびｌｎ＋ＭＥＤＴＡに対して透析した。次イテ、この
ＤＮＡを５０ μ９／Ｒ（１（Ｄ ＲＮ ７−ゼＡ（シ
グマ）で２時間処理し、続いて２００μｖ／ｘ（ｌのプ
ロテアーゼにで１時間、再消化した。上記実施例２Ｂと
同様にしてこのＤＮＡを抽出し、透析し、その濃度を０
Ｄ２Ｂ。で測定して１００〜２００゜／村の範囲にした
。
料から最上層（軟膜細胞）を集めた。軟膜細胞をパスツ
ールピペットで取り、ＰＢＳて１回洗浄した。この細胞
ベレットを、１０ｍＭ トリス−１−ＩＣＣ（ｐＨ＝
８．０）および４０ｍＭＮａＣ＆からなる溶液（５０
０μＱ）に再懸濁し、次いで１０％５ＤＳ（３０μのお
よび２０ｍ９／ｙｐＱブＯｆ７−ゼＫ （６μ＆）（シ
グマ）を加えて溶菌した。この試料を３７°Ｃで１５時
間インキュベートした。このＤＮＡを、等容量のフェノ
ール：クロロホルム：イソアミルアルコール混合液（２
５：２４＋１）で２回、クロロポルム：イソアミルアル
コールＵ合ｒｆｆｌ（２４＋ １ ） テ２回以上抽出
し、ＩＯ＋ｅＭ）リス−）Ｉ ＣＣ（ｐＨ＝ ８０）お
よびｌｎ＋ＭＥＤＴＡに対して透析した。次イテ、この
ＤＮＡを５０ μ９／Ｒ（１（Ｄ ＲＮ ７−ゼＡ（シ
グマ）で２時間処理し、続いて２００μｖ／ｘ（ｌのプ
ロテアーゼにで１時間、再消化した。上記実施例２Ｂと
同様にしてこのＤＮＡを抽出し、透析し、その濃度を０
Ｄ２Ｂ。で測定して１００〜２００゜／村の範囲にした
。
Ｂ、ヒトゲノム性ファージライブラリーの作成「ｂｎハ
ブロタイブのヒトＤＮＡ（実施例３Ａで単離した２１Ｏ
Ａ１ｇ）をＭｂｏｌで部分的に消化した。
ブロタイブのヒトＤＮＡ（実施例３Ａで単離した２１Ｏ
Ａ１ｇ）をＭｂｏｌで部分的に消化した。
ＤＮＡ（１０μ９）を、ＴＥ緩衝液（１１μＲ）、水（
２０ｕＱ）、ｆｏｘのコアー（Ｃｏｒｅ）制限消化緩衝
液［５００ｆｆ１Ｍトリス（ｐＨ＝８．０）、１００
ｍＭ ＭｇＣＱ、、５００ｍＭ ＮａＣｆ２］（１５μ
＜りに取り、これを試験管に分取した。制限酵素Ｍｂｏ
ｌを０．００３８から０．５単位／μｅに増加する単位
でそれぞれの試験管に加え、１時間３７°Ｃに保った。
２０ｕＱ）、ｆｏｘのコアー（Ｃｏｒｅ）制限消化緩衝
液［５００ｆｆ１Ｍトリス（ｐＨ＝８．０）、１００
ｍＭ ＭｇＣＱ、、５００ｍＭ ＮａＣｆ２］（１５μ
＜りに取り、これを試験管に分取した。制限酵素Ｍｂｏ
ｌを０．００３８から０．５単位／μｅに増加する単位
でそれぞれの試験管に加え、１時間３７°Ｃに保った。
次いで、試料の一部を０．７％ＴＢＥ［８９ｍＭ ト
リス、８９ＩＩＩＭホウ酸塩、および２ｍＭＥＤＴＡ］
アガロースゲルにかけ、４０Ｖで一晩、電気泳動を行っ
た。
リス、８９ＩＩＩＭホウ酸塩、および２ｍＭＥＤＴＡ］
アガロースゲルにかけ、４０Ｖで一晩、電気泳動を行っ
た。
このゲルの写真から、どの消化フラクションが正しい分
子型範囲（１２〜２４ ｋｂ）のＤＮＡを含んでいるか
を決定した。次に、上記の実験で決めた単位のＭｂｏｌ
を用い（２０倍にスケールアップ）、３７℃で１時間イ
ンキュベートすることによって、ゲノムＤＮＡ（２００
μ９）を消化した。このＤＮＡを用い、ストラタジーン
のプロトコールに記載されているように、ＥＭＢＬ−３
フアージＤＮＡ（ストラタジーン）を用いてＥＭＢＬ−
３ライブラリーを作成した。このストラタジーンのプロ
トコールは、い（つかの実験室マニュアル（例えば、デ
イビス）に記載されている方法に従うものである。
子型範囲（１２〜２４ ｋｂ）のＤＮＡを含んでいるか
を決定した。次に、上記の実験で決めた単位のＭｂｏｌ
を用い（２０倍にスケールアップ）、３７℃で１時間イ
ンキュベートすることによって、ゲノムＤＮＡ（２００
μ９）を消化した。このＤＮＡを用い、ストラタジーン
のプロトコールに記載されているように、ＥＭＢＬ−３
フアージＤＮＡ（ストラタジーン）を用いてＥＭＢＬ−
３ライブラリーを作成した。このストラタジーンのプロ
トコールは、い（つかの実験室マニュアル（例えば、デ
イビス）に記載されている方法に従うものである。
スクロース勾配で単離した後、大分子量のヒトＤＮＡ（
１２〜２４ ｋｂ）をＥＭＢＬ−３フアージアームにラ
イゲートシた：ＤＮＡ（ｌｏＯｎ９）、予め単離してお
いたＢａｍＨＩ消化のＥＭＢＬ−３アーム（１００ｎ９
）、ｆｏｘのりガーゼ緩衝１夜［５００１１Ｍトリス−
ＨＣ＆（ｐｉ（＝８．９）、７０ ｍＭ ＭｇＣｆ２ｅ
、１０ｍＭ ａｔｔ］（０，５μの、およびＴ４ Ｄ
ＮＡリガーセ（２単位）からなる反応混合物を調製し、
この〆捏合物を一晩、４°Ｃに保った。ストラタレーン
から市販のギガバッターゴールド・インビトロ・パッケ
ージング・７ステムをその製品プロトコール従ってｆｌ
ｊい、そしてストラタンーンから供給される宿主大腸菌
株Ｐ２ ３９２を用いてパッケージングを行った。ギ
ガバック・ゴールド・パッケージング混合物（５００μ
のとライゲート化ファーノ（５μのを２２°Ｃで２時間
インキュベートした。ファー／希釈緩衝液［１（にっき
、ＮａＣ（！（５．８９）、Ｍｇ２Ｓ ０４−６ ８
ｚＯ（２ｙ）、１Ｍトリス−ＨＣＣ（ｐ）ｉ７、５）（
５０次の、および２％ゼラチン（５肩の］（０ ５ｍの
を加えた。次いで、デイビス記載［１８２〜１８３頁（
１９８６）］の標準プロトコールを用いてファージを滴
定した。滴定の後、Ｐ２．３９２細胞を用いて１００ｍ
Ｍプレートあたり２０．０００プラークの密度でファー
ジライブラリーを蒔き、３７°Ｃで一晩インキユベート
した。
１２〜２４ ｋｂ）をＥＭＢＬ−３フアージアームにラ
イゲートシた：ＤＮＡ（ｌｏＯｎ９）、予め単離してお
いたＢａｍＨＩ消化のＥＭＢＬ−３アーム（１００ｎ９
）、ｆｏｘのりガーゼ緩衝１夜［５００１１Ｍトリス−
ＨＣ＆（ｐｉ（＝８．９）、７０ ｍＭ ＭｇＣｆ２ｅ
、１０ｍＭ ａｔｔ］（０，５μの、およびＴ４ Ｄ
ＮＡリガーセ（２単位）からなる反応混合物を調製し、
この〆捏合物を一晩、４°Ｃに保った。ストラタレーン
から市販のギガバッターゴールド・インビトロ・パッケ
ージング・７ステムをその製品プロトコール従ってｆｌ
ｊい、そしてストラタンーンから供給される宿主大腸菌
株Ｐ２ ３９２を用いてパッケージングを行った。ギ
ガバック・ゴールド・パッケージング混合物（５００μ
のとライゲート化ファーノ（５μのを２２°Ｃで２時間
インキュベートした。ファー／希釈緩衝液［１（にっき
、ＮａＣ（！（５．８９）、Ｍｇ２Ｓ ０４−６ ８
ｚＯ（２ｙ）、１Ｍトリス−ＨＣＣ（ｐ）ｉ７、５）（
５０次の、および２％ゼラチン（５肩の］（０ ５ｍの
を加えた。次いで、デイビス記載［１８２〜１８３頁（
１９８６）］の標準プロトコールを用いてファージを滴
定した。滴定の後、Ｐ２．３９２細胞を用いて１００ｍ
Ｍプレートあたり２０．０００プラークの密度でファー
ジライブラリーを蒔き、３７°Ｃで一晩インキユベート
した。
Ｃ．組換えプラスミドｐＨ Ｋ Ｆ − １の最終的な
構築ヒトに不変領域遺伝子を単離するため、ヒーター［
Ｄｒ．Ｐ．Ｉ！ｉｅｔｅｒ， Ｊｏｈｎｓ Ｉｌｏｐｋ
ｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ
， Ｍａｒｙｌａｎｄ］から供給を受けたヒトにプロー
ブ（このプローブの配列は、ＮＩＨ Ｄａｔａ Ｂａｓ
ｅがら取得番号ＪＯＯ２４＋のもとて人手できる）を用
い、実施例３Ｂ記載のようにして、ＩＥＭＢＬ−３ライ
ブラリーをスクリーニングした。合計５ｘ１０５の組換
えファージを実施例２Ｂ記載のようにスクリーニングし
た。単一のクローンを単離し、φＨＫ１７ー１と命名し
た。φＨＫＦ−Ｉ ＤＮＡ（１５μＱ）を、反応緩衝
液＃３中、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄｌｌｌで同時に消
化した。実施例２Ｅ記載のようにして、５、２ｋｂのフ
ラグメントをＤＥＡＥ８１１Ｅ上に単離し、ＢａｍＨＩ
およびＩ−１ｉｎｄｌｌｌで消化したクローニングベク
ターｐＢＲ３２２にライゲートした。
構築ヒトに不変領域遺伝子を単離するため、ヒーター［
Ｄｒ．Ｐ．Ｉ！ｉｅｔｅｒ， Ｊｏｈｎｓ Ｉｌｏｐｋ
ｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ
， Ｍａｒｙｌａｎｄ］から供給を受けたヒトにプロー
ブ（このプローブの配列は、ＮＩＨ Ｄａｔａ Ｂａｓ
ｅがら取得番号ＪＯＯ２４＋のもとて人手できる）を用
い、実施例３Ｂ記載のようにして、ＩＥＭＢＬ−３ライ
ブラリーをスクリーニングした。合計５ｘ１０５の組換
えファージを実施例２Ｂ記載のようにスクリーニングし
た。単一のクローンを単離し、φＨＫ１７ー１と命名し
た。φＨＫＦ−Ｉ ＤＮＡ（１５μＱ）を、反応緩衝
液＃３中、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄｌｌｌで同時に消
化した。実施例２Ｅ記載のようにして、５、２ｋｂのフ
ラグメントをＤＥＡＥ８１１Ｅ上に単離し、ＢａｍＨＩ
およびＩ−１ｉｎｄｌｌｌで消化したクローニングベク
ターｐＢＲ３２２にライゲートした。
アンピシリン耐性の組換えコロニーを再度ヒトにプロー
ブを用いて同定し、単一のクローンを単離し、ｐＨＫＦ
−１と命名シタ。ｐｌ−ｉＫＦ−１ｉ１＆、フタペスト
条約に基づき１９８８年３月４日にアメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクションに寄託され、Δ’ｒ ｃ
ｃ寄託番号＃６７６３７を得ている。プラスミドｐＨＫ
Ｆ−１の制限部位および機能地図は第２図中に含まれて
いる。
ブを用いて同定し、単一のクローンを単離し、ｐＨＫＦ
−１と命名シタ。ｐｌ−ｉＫＦ−１ｉ１＆、フタペスト
条約に基づき１９８８年３月４日にアメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクションに寄託され、Δ’ｒ ｃ
ｃ寄託番号＃６７６３７を得ている。プラスミドｐＨＫ
Ｆ−１の制限部位および機能地図は第２図中に含まれて
いる。
実施例４ プラスミドｐＧＣＨＡＫ＋ヒト不変領域に遺
伝子および不ズミＣＨＡ２５５．５ｖＬλ遺伝子を含有
するｔｌｉｉ乳動物発現ベクター１）プラスミドｐＭＬ
ｃＨ１ｄＢ ＣＩ（Ａ２５５．５可変領域遺伝子を発現ベクター中に
サブクローンするためには、いくつかの実験工程が必要
であった。始めに、第１図に示した遺伝子を含んでいる
Ｖλフラグメントの５°末端からＢａｌＨｌ部位を削除
した。「充填」反応の公知プロトコール（マニアティス
、１１３〜ｌ１４頁）ヲ用イてこれを行った。反応緩衝
液＃２を用い、ＢａｍＨｌで３分間、ｐＭＬｃＨｌ（ｌ
μｇ）を部分消化した。
伝子および不ズミＣＨＡ２５５．５ｖＬλ遺伝子を含有
するｔｌｉｉ乳動物発現ベクター１）プラスミドｐＭＬ
ｃＨ１ｄＢ ＣＩ（Ａ２５５．５可変領域遺伝子を発現ベクター中に
サブクローンするためには、いくつかの実験工程が必要
であった。始めに、第１図に示した遺伝子を含んでいる
Ｖλフラグメントの５°末端からＢａｌＨｌ部位を削除
した。「充填」反応の公知プロトコール（マニアティス
、１１３〜ｌ１４頁）ヲ用イてこれを行った。反応緩衝
液＃２を用い、ＢａｍＨｌで３分間、ｐＭＬｃＨｌ（ｌ
μｇ）を部分消化した。
次いで、マニアティス（１１３〜１１４頁）記載のよう
に、それぞれ５ｍＭａ度の４種のデオキシリボヌクレオ
チドｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＡＴＰ、２
単位のフレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）酵素、およびｌＯＸの
緩衝液［０，５Ｍ）リス−１−１ｃｃ（ｐＨ＝７．５）
： ＯＩＭ ＭｇＣ（ｂ： １０ｍＭジチオトレイトー
ル］を含む溶液（１０μＱ）を加え、全反応混合物容量
を５０ｕＱにして、ＢａｍＨＩ末端を平滑にした（Ｂａ
ｍ８１部位を削除するために）。この反応混合物を３０
分間インキュベートした後、ＤＮＡをフェノールクロロ
ホルム混合液で抽出し、次にエタノールで沈澱させた。
に、それぞれ５ｍＭａ度の４種のデオキシリボヌクレオ
チドｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＡＴＰ、２
単位のフレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）酵素、およびｌＯＸの
緩衝液［０，５Ｍ）リス−１−１ｃｃ（ｐＨ＝７．５）
： ＯＩＭ ＭｇＣ（ｂ： １０ｍＭジチオトレイトー
ル］を含む溶液（１０μＱ）を加え、全反応混合物容量
を５０ｕＱにして、ＢａｍＨＩ末端を平滑にした（Ｂａ
ｍ８１部位を削除するために）。この反応混合物を３０
分間インキュベートした後、ＤＮＡをフェノールクロロ
ホルム混合液で抽出し、次にエタノールで沈澱させた。
このＤＮＡを再懸濁し、実施例２Ｅの方法に類似する通
常のライゲート法により、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて
自己ライゲートさせた。ＨＢＩＯＩ細胞（Ｂ ＲＬ）を
用いて形質転換を行い、得られた形質転換体をプラスミ
ド ミニープレブ（ｍｉｎｉ−ｐｒｅｐ）法（マニアテ
イス、３６８〜３６９頁）でスクリーニングして、正し
いＢａｍ１１１部位がうまく削除されているプラスミド
を同定した。この構築物をｐＭＬｃ８１ｄＢと命名した
。第１図はプラスミドｐＭＬｃｌ−１１ｄＢとプラスミ
ドｐＭＬＣＨ−１の関係を示すものである。
常のライゲート法により、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて
自己ライゲートさせた。ＨＢＩＯＩ細胞（Ｂ ＲＬ）を
用いて形質転換を行い、得られた形質転換体をプラスミ
ド ミニープレブ（ｍｉｎｉ−ｐｒｅｐ）法（マニアテ
イス、３６８〜３６９頁）でスクリーニングして、正し
いＢａｍ１１１部位がうまく削除されているプラスミド
を同定した。この構築物をｐＭＬｃ８１ｄＢと命名した
。第１図はプラスミドｐＭＬｃｌ−１１ｄＢとプラスミ
ドｐＭＬＣＨ−１の関係を示すものである。
２）プラスミドｐＭＬｃＨ２
ｐＭＬＣ）［ｌｄＢ由来のプラスミドＤＮＡを単離し、
これを用いてｐＭ Ｌ ＣＨ２を構築した。反応緩衝液
＃３を用い、ｐＭＬＣ８１ｄＢ（１０Ｍｇ）を１１ｉｎ
ｄｌｌｌおよびＢａｍＨｌで消化した。同時に、ベクタ
ーｐＢＲ３２２を同じ酵素で消化した。消化したｐＢＲ
３２２ＤＮＡ（約１００ ｎｙ）をｐＭ Ｌ ＣＨ１ｔ
ｊＢ消化ＤＮＡ（３００ｎｇ）と混合し、上記のように
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いてライゲー１へした。再
び、このライゲート産物をＨＢ １０１細菌細胞（ＢＲ
Ｌ）に導入し、得られた形質転換体をプラスミド１）Ｎ
Ａのミニ−プレバレージョン（マニアティス）によって
スクリーニングして正しいサブクローンを同定した。こ
の正しいサブクローンからのプラスミドをＰＭＬＣＨ２
と命名した。このプラスミドは、ｐＢＲ３２２のＨ１ｎ
ｄｌｌｌ −ＢａｎＦ（［部位に挿入された５、７５ｋ
ｂのＣＨＡ ２５５ 。
これを用いてｐＭ Ｌ ＣＨ２を構築した。反応緩衝液
＃３を用い、ｐＭＬＣ８１ｄＢ（１０Ｍｇ）を１１ｉｎ
ｄｌｌｌおよびＢａｍＨｌで消化した。同時に、ベクタ
ーｐＢＲ３２２を同じ酵素で消化した。消化したｐＢＲ
３２２ＤＮＡ（約１００ ｎｙ）をｐＭ Ｌ ＣＨ１ｔ
ｊＢ消化ＤＮＡ（３００ｎｇ）と混合し、上記のように
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いてライゲー１へした。再
び、このライゲート産物をＨＢ １０１細菌細胞（ＢＲ
Ｌ）に導入し、得られた形質転換体をプラスミド１）Ｎ
Ａのミニ−プレバレージョン（マニアティス）によって
スクリーニングして正しいサブクローンを同定した。こ
の正しいサブクローンからのプラスミドをＰＭＬＣＨ２
と命名した。このプラスミドは、ｐＢＲ３２２のＨ１ｎ
ｄｌｌｌ −ＢａｎＦ（［部位に挿入された５、７５ｋ
ｂのＣＨＡ ２５５ 。
５−特異的な■λ遺伝子領域を含有していた。
３）プラスミドｐＳ Ｖ ２ ｇｐｔ−Ｃｌａ次に、こ
のプラスミド由来のＤＮＡを用いて発現ベクターｐｃ
ＣＨＡを構築した。このキメラ発現ベクターのベースと
して発現ベクターｐＳＶ２ｇｐｔ［アメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクションからＡＴＣＣ番号＃３７１
４５のもとで人手できる］を用いた。反応緩衝液＃３中
、ｐｓＶ２ｇｐｔＤ Ｎ Ａ （ｌ ｕｙ）を制限酵素
ＥｃｏＲＩ（１単位／μ９ＤＮＡ）で消化した。次いで
、マニアティス（１１３〜１１４頁）記載のように、そ
れぞれ５ｍＭの４種のデオキシリボヌクレオチドｄＴＴ
Ｐ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴ１〕およびｄＡＴＰ、２単位のフ
レノウ酵素、およびＩＯＸの緩衝液［０，５Ｍ＋−リス
−ｔｌ ＣＱ（ｐＴ−（−７５）； Ｏ，ＩＭ ＭｇＣ
ｆ１ｔ： ｌｏｍＭジチオトレイトールコの溶Ｍ（１０
μのを加え、全容ｆｆ１５０μσ中で、ＥｃｏＲ１末瑞
を平滑にした。この反応を室温で３０分間行い、続いて
ライゲート反応を行い、これにより、ホスホリル化した
Ｃ１ａ［リンカ−（２μｇ）（二ニー・イングランド・
バイオラブズ）をＥｃｏＲｌ−平滑末端化ｐＳ Ｖ ｔ
ｇｐｔ（５００ｎ９）にライゲートして、後のキメラベ
クター用の新しいＣｌａ Ｉ Ｈ位を６１１製した。Ｃ
１ａｌリンカ−の配列は、ｄ（ｐｃＡ’ｌ’ｃＧ＾ＴＧ
）であった。ライゲート反応は実施例２Ｅ記載のように
して行った。ライゲートの後、過剰のリンカ−をＤＮＡ
の電気泳動によって除き、実施例２Ｅのようにして直線
状のｐＳ Ｖ ２ ｇｐｔ−ＣｌａフラグメントをＤＥ
ＡＥ８１紙上に単離した。上記のプロトコールおよび試
薬を用いてこの単離ＤＮΔを自己ライゲートさせた。Ｉ
（Ｂ １０１コンピテント細胞を実施例２Ｅのように形
質転換し、アンピシリン耐性コロニーを制限酵素消化に
よって分析した。
のプラスミド由来のＤＮＡを用いて発現ベクターｐｃ
ＣＨＡを構築した。このキメラ発現ベクターのベースと
して発現ベクターｐＳＶ２ｇｐｔ［アメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクションからＡＴＣＣ番号＃３７１
４５のもとで人手できる］を用いた。反応緩衝液＃３中
、ｐｓＶ２ｇｐｔＤ Ｎ Ａ （ｌ ｕｙ）を制限酵素
ＥｃｏＲＩ（１単位／μ９ＤＮＡ）で消化した。次いで
、マニアティス（１１３〜１１４頁）記載のように、そ
れぞれ５ｍＭの４種のデオキシリボヌクレオチドｄＴＴ
Ｐ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴ１〕およびｄＡＴＰ、２単位のフ
レノウ酵素、およびＩＯＸの緩衝液［０，５Ｍ＋−リス
−ｔｌ ＣＱ（ｐＴ−（−７５）； Ｏ，ＩＭ ＭｇＣ
ｆ１ｔ： ｌｏｍＭジチオトレイトールコの溶Ｍ（１０
μのを加え、全容ｆｆ１５０μσ中で、ＥｃｏＲ１末瑞
を平滑にした。この反応を室温で３０分間行い、続いて
ライゲート反応を行い、これにより、ホスホリル化した
Ｃ１ａ［リンカ−（２μｇ）（二ニー・イングランド・
バイオラブズ）をＥｃｏＲｌ−平滑末端化ｐＳ Ｖ ｔ
ｇｐｔ（５００ｎ９）にライゲートして、後のキメラベ
クター用の新しいＣｌａ Ｉ Ｈ位を６１１製した。Ｃ
１ａｌリンカ−の配列は、ｄ（ｐｃＡ’ｌ’ｃＧ＾ＴＧ
）であった。ライゲート反応は実施例２Ｅ記載のように
して行った。ライゲートの後、過剰のリンカ−をＤＮＡ
の電気泳動によって除き、実施例２Ｅのようにして直線
状のｐＳ Ｖ ２ ｇｐｔ−ＣｌａフラグメントをＤＥ
ＡＥ８１紙上に単離した。上記のプロトコールおよび試
薬を用いてこの単離ＤＮΔを自己ライゲートさせた。Ｉ
（Ｂ １０１コンピテント細胞を実施例２Ｅのように形
質転換し、アンピシリン耐性コロニーを制限酵素消化に
よって分析した。
次いでぐ得られたベクターｐＳ Ｖ ２ ｇｐｔ−Ｃｌ
ａをＣ１ａｌおよびＢａｍＨＩ制限酵素（１単位／ＩＤ
ＮＡ）で同時に消化した。また、ベクターｐＭ Ｌ Ｃ
Ｈ２も２種類の同じ制限酵素で消化した。次にこれら消
化物からのＤＮＡを一緒にして上記実施例２Ｅのように
ライゲートし、これを用いて大腸菌Ｉ（ＢＩＯＩを形質
転換した。再度、形質転換体からのプラスミドＤＮＡを
制限消化によって分析し、ｇｐｔ薬物耐性遺伝子哺乳動
物発現ベクターおよびＣＨΔ２５５．５特異的な軽鎖λ
遺伝子を含有する発現プラスミドｐＧｃＨＡを同定した
。
ａをＣ１ａｌおよびＢａｍＨＩ制限酵素（１単位／ＩＤ
ＮＡ）で同時に消化した。また、ベクターｐＭ Ｌ Ｃ
Ｈ２も２種類の同じ制限酵素で消化した。次にこれら消
化物からのＤＮＡを一緒にして上記実施例２Ｅのように
ライゲートし、これを用いて大腸菌Ｉ（ＢＩＯＩを形質
転換した。再度、形質転換体からのプラスミドＤＮＡを
制限消化によって分析し、ｇｐｔ薬物耐性遺伝子哺乳動
物発現ベクターおよびＣＨΔ２５５．５特異的な軽鎖λ
遺伝子を含有する発現プラスミドｐＧｃＨＡを同定した
。
Ｂ、プラスミドｐＧ ＣＨＡ Ｋの構築ベクターｐｃ
ＣＨＡおよびｐＨＫＦｌを用いて、ヒトに遺伝子に融合
した不ズミＶ Ｊ域を含有する真核生物性の発現ベクタ
ーを構築した。プラスミドｐｃ ＣＨＡを制限酵素Ｂａ
ｍＨ１で消化し、約１１．１５ｋｂのフラグメントを単
離した。プラスミドｐＨＫＦ１（ＡＴＣＣから取得番号
６７６３７のもとて人手できる）を、反応緩衝液＃３中
、Ｈｉｎｄｌｌｌで消化した。このＨｉｎｄｌｌｌ消化
したプラスミドをフレノウで充填し、ホスホリル化した
ＢａａＨｌリンカ−にュー・イングランド・バイオラブ
ズ）を加え、次にベクターをＢａｍＨＩで切断し、約５
．２ｋｂの制限フラグメントを単離した。このプラスミ
ドｐＨＫＦ−１の５．２ｋｂ ＢａｎＨＩフラグメント
を、プラスミドｐｃ ＣＨＡの約１１．２ｋｂ１’３ａ
ｍｔｌｌフラグメントにライゲートしてプラスミドｐｃ
ＣＨΔＫを得た。プラスミドｐｃ Ｃ）（Ａ Ｋは、
ヒｉ・に領域をコードしている遺伝子に結合した、ネズ
ミλＣ１１Ａ可変領域をコードしている遺伝子を含有し
ている。このプラスミドの制限部位および機能地図は第
１図中に含まれている。
ＣＨＡおよびｐＨＫＦｌを用いて、ヒトに遺伝子に融合
した不ズミＶ Ｊ域を含有する真核生物性の発現ベクタ
ーを構築した。プラスミドｐｃ ＣＨＡを制限酵素Ｂａ
ｍＨ１で消化し、約１１．１５ｋｂのフラグメントを単
離した。プラスミドｐＨＫＦ１（ＡＴＣＣから取得番号
６７６３７のもとて人手できる）を、反応緩衝液＃３中
、Ｈｉｎｄｌｌｌで消化した。このＨｉｎｄｌｌｌ消化
したプラスミドをフレノウで充填し、ホスホリル化した
ＢａａＨｌリンカ−にュー・イングランド・バイオラブ
ズ）を加え、次にベクターをＢａｍＨＩで切断し、約５
．２ｋｂの制限フラグメントを単離した。このプラスミ
ドｐＨＫＦ−１の５．２ｋｂ ＢａｎＨＩフラグメント
を、プラスミドｐｃ ＣＨＡの約１１．２ｋｂ１’３ａ
ｍｔｌｌフラグメントにライゲートしてプラスミドｐｃ
ＣＨΔＫを得た。プラスミドｐｃ Ｃ）（Ａ Ｋは、
ヒｉ・に領域をコードしている遺伝子に結合した、ネズ
ミλＣ１１Ａ可変領域をコードしている遺伝子を含有し
ている。このプラスミドの制限部位および機能地図は第
１図中に含まれている。
実施例５ プラスミドｐＵＣＶＨＩｎｃ−ＩＡ ＋ネズ
ミＣＨＡ２５５．５可変重鎖領域を含有するプラスミド
の構築 ｖｈ特穴的な遺伝子を含有している正しいサイズ（大き
さ）のフラグメントを豊富化するため、反応緩衝液＃２
を用いてＣＨＡ２５５．５細胞ＤＮＡ’ｉ−［３ａｍｌ
（Ｉ（１〜２中位／μ９）で消化した。サイズみ富化Ｄ
ＮＡの単離方法は、ホズミ等［１１ｏｚｕｍｉ。
ミＣＨＡ２５５．５可変重鎖領域を含有するプラスミド
の構築 ｖｈ特穴的な遺伝子を含有している正しいサイズ（大き
さ）のフラグメントを豊富化するため、反応緩衝液＃２
を用いてＣＨＡ２５５．５細胞ＤＮＡ’ｉ−［３ａｍｌ
（Ｉ（１〜２中位／μ９）で消化した。サイズみ富化Ｄ
ＮＡの単離方法は、ホズミ等［１１ｏｚｕｍｉ。
！ｔ、、Ｇ、ｌシ、Ｙｕ、、 Ｉｌ、Ｍｕｒｉａｌｄ
ｏ、 Ｌ、Ｒｏｂｅｒｔｓ、 Ｄ、ＶｅｔＬｅｒ。
ｏ、 Ｌ、Ｒｏｂｅｒｔｓ、 Ｄ、ＶｅｔＬｅｒ。
Ｗ、１．、Ｐｉｆｅ Ｍ、Ｗｈｉｔｅｌｅｙ、 ａｎ
ｄ Ｐ、Ｓａｄｏｗｓｋｉ、 ＰｒｏｃＮａｔ １．
Ａｃａｄ、 Ｓｃ ｉ、 ＵＳＡ８１．２４８４（１９
８１）］が記載している。サイズ選択したライブラリー
を作成するため、ＢａｍＨＩ消化のサイズ選択ＤＮＡ（
０，２４μｙ）を、予め消化したファージベクターＥＭ
ＢＬ３ＤＮＡアーム（ストラタジーン）（２，５μｇ）
にライゲートした。これら２種類のＤＮＡフラグメント
を一緒にして、ＩＯＸのりガーゼ緩衝液［０，５μＱ１
５００ｎＭトリスー［−１（Ｊ！（ｐＨ＝８）； ７０
ｍＭ ＭｇＣ１２ｚ；１０ｍＭノチオトレイトール］お
よびＴ４ＤＮＡリガーゼ（２単位）中、４°Ｃで一晩ラ
イゲートした。ライゲートの後、キがバック・インビト
ロ・パフケージング・システム（ストラタシーン）を用
い、その製品プロトコールに従って、および宿主大腸菌
株Ｐ２．３９２（ストラタジーン）を用いてパッケージ
ングを行った。ギガバ、り・パッケージング混合物（５
０μＱ）とライゲート化ファージの希釈液（１０−”−
１０−’）（５μのを混合し、２２°Ｃで２時間インキ
コベートした。ファージ希釈緩衝液ＣｔＱにつき、Ｎａ
Ｃｌ２（５，８１？）、Ｍｇｗ Ｓ Ｏ４６Ｆ＋、０（
２９）、ＩＭＩ−リス州Ｃ（（ｐＨ＝７．５）（５０β
の、および２％ゼラチン（５Ｍ（Ｄからなる溶液０．５
ｘｌ！］を加えた。次いて、マニアティス記載（２８６
頁）の標準プロトコールを用いてファージを滴定した。
ｄ Ｐ、Ｓａｄｏｗｓｋｉ、 ＰｒｏｃＮａｔ １．
Ａｃａｄ、 Ｓｃ ｉ、 ＵＳＡ８１．２４８４（１９
８１）］が記載している。サイズ選択したライブラリー
を作成するため、ＢａｍＨＩ消化のサイズ選択ＤＮＡ（
０，２４μｙ）を、予め消化したファージベクターＥＭ
ＢＬ３ＤＮＡアーム（ストラタジーン）（２，５μｇ）
にライゲートした。これら２種類のＤＮＡフラグメント
を一緒にして、ＩＯＸのりガーゼ緩衝液［０，５μＱ１
５００ｎＭトリスー［−１（Ｊ！（ｐＨ＝８）； ７０
ｍＭ ＭｇＣ１２ｚ；１０ｍＭノチオトレイトール］お
よびＴ４ＤＮＡリガーゼ（２単位）中、４°Ｃで一晩ラ
イゲートした。ライゲートの後、キがバック・インビト
ロ・パフケージング・システム（ストラタシーン）を用
い、その製品プロトコールに従って、および宿主大腸菌
株Ｐ２．３９２（ストラタジーン）を用いてパッケージ
ングを行った。ギガバ、り・パッケージング混合物（５
０μＱ）とライゲート化ファージの希釈液（１０−”−
１０−’）（５μのを混合し、２２°Ｃで２時間インキ
コベートした。ファージ希釈緩衝液ＣｔＱにつき、Ｎａ
Ｃｌ２（５，８１？）、Ｍｇｗ Ｓ Ｏ４６Ｆ＋、０（
２９）、ＩＭＩ−リス州Ｃ（（ｐＨ＝７．５）（５０β
の、および２％ゼラチン（５Ｍ（Ｄからなる溶液０．５
ｘｌ！］を加えた。次いて、マニアティス記載（２８６
頁）の標準プロトコールを用いてファージを滴定した。
滴定の後、大腸菌Ｐ２．３９２（ストラタジーン）細胞
を用いて１１００ＯＩプレートあたり２０．０００プラ
ークの密度でファージライブラリーを蒔き、３７℃で一
晩インキユベートした。
を用いて１１００ＯＩプレートあたり２０．０００プラ
ークの密度でファージライブラリーを蒔き、３７℃で一
晩インキユベートした。
よび単離
ＣｌＡ２５５．５重（γｌ）鎖用に、大腸菌ｐ２゜３９
２（ストラタジーン）中の３．０ｘｌＯ’組換えファー
ジをマニアテイス（３２０頁）のプロトコールに従って
スクリーニングした。このスクリーニングは、タッカ−
（叶、Ｐｈ１ｌｌｉｐ Ｔｕｃｋｅｒ、υｎ１ｖｅｒｓ
ｉｔｙｏｆ Ｔｅｘａｓ、 Ｄａｌｌａｓ、 Ｔｅｘａ
ｓ ； Ｎ１１ｌ Ｄａｔａ Ｇｅｎｅｂａｎｋ取得番
号−ＪＯＯ４５３）から入手したプラスミド由来のネズ
ミＪＨ３−ＪＨ４プローブを用いて行った。
２（ストラタジーン）中の３．０ｘｌＯ’組換えファー
ジをマニアテイス（３２０頁）のプロトコールに従って
スクリーニングした。このスクリーニングは、タッカ−
（叶、Ｐｈ１ｌｌｉｐ Ｔｕｃｋｅｒ、υｎ１ｖｅｒｓ
ｉｔｙｏｆ Ｔｅｘａｓ、 Ｄａｌｌａｓ、 Ｔｅｘａ
ｓ ； Ｎ１１ｌ Ｄａｔａ Ｇｅｎｅｂａｎｋ取得番
号−ＪＯＯ４５３）から入手したプラスミド由来のネズ
ミＪＨ３−ＪＨ４プローブを用いて行った。
ニトロセルロースフィルター取上物をＩＩＬ、さらに分
析を行うためにＪ Ｈ領域プローブとノ＼イブリダイズ
するファージを選択した。マニアティスの方法（３６５
頁）を用いて組換えファージからＤＮＡを単離し、反応
緩衝液＃２を用いてＢａｍＨｆで消化した。組換えファ
ージ挿入体のサイズをゲル電気泳動によって分析した。
析を行うためにＪ Ｈ領域プローブとノ＼イブリダイズ
するファージを選択した。マニアティスの方法（３６５
頁）を用いて組換えファージからＤＮＡを単離し、反応
緩衝液＃２を用いてＢａｍＨｆで消化した。組換えファ
ージ挿入体のサイズをゲル電気泳動によって分析した。
組換え体の１つが８、６ｋｂ Ｂａｍ［（［フラグメン
トを有していると同定された。このファージからのＤＮ
Ａを種々の制限酵素によってさらに分析し、φＭＨＣＨ
−Ｉｎｃと命名した。
トを有していると同定された。このファージからのＤＮ
Ａを種々の制限酵素によってさらに分析し、φＭＨＣＨ
−Ｉｎｃと命名した。
終的な構築
ファージφＭＶＨＣＨ−Ｉｎｃ由来のＤ Ｎ Ａ （ｌ
ｕ９＞を、製造元（Ｂ ＲＬ）ｌ供の条件および緩衝
液を用い、ＢａａＨｌで消化した。ｐＵｃ１３（二ニー
・イングランド・バイオラブズ）からのＤ Ｎ Ａ（１
βｇ）も、Ｂａ５Ｈ１で消化した。次いで、Ｔ４ Ｄ
ＮＡリガーゼを用いてこれら２種類のＤＮＡをライゲー
トした。細菌株大腸菌ＪＭ１０９（ストラタジーン）を
このＤＮＡで形質転換し、次に２μｇ／ ｚ（１１ＰＴ
Ｇ、４μｖ／ｙ（ｌ Ｘ−ガル、および１００μ９／ｍ
Ｑアンピンリン含有のプレートに蒔いた。白色コロニー
を単離し、基本的にマニアティス記載（３６８〜３６９
頁）のような制限消化によってＤＮＡを分析した。この
制限地図により、８．６ｋｂのＢａｍＨＩ挿人体がＣｌ
Ａ２５５．５特異的ｖｈ遺伝子を含有しているプラスミ
ドｐＵｃＶＨ１ｎｃ−ＩＡを確認した。大腸菌に−１２
ＨＢ １０１／ｐＵｃＶＨＩｎｃＩＡの拾得物は１９８
８年１１月１４日にＮ ＲＲＬに寄託され、取得番号Ｎ
ＲＲＬ Ｂ−１８４３３のもとで入手可能である。こ
のプラスミドの制限部位および機能地図は第３図中に示
されている。
ｕ９＞を、製造元（Ｂ ＲＬ）ｌ供の条件および緩衝
液を用い、ＢａａＨｌで消化した。ｐＵｃ１３（二ニー
・イングランド・バイオラブズ）からのＤ Ｎ Ａ（１
βｇ）も、Ｂａ５Ｈ１で消化した。次いで、Ｔ４ Ｄ
ＮＡリガーゼを用いてこれら２種類のＤＮＡをライゲー
トした。細菌株大腸菌ＪＭ１０９（ストラタジーン）を
このＤＮＡで形質転換し、次に２μｇ／ ｚ（１１ＰＴ
Ｇ、４μｖ／ｙ（ｌ Ｘ−ガル、および１００μ９／ｍ
Ｑアンピンリン含有のプレートに蒔いた。白色コロニー
を単離し、基本的にマニアティス記載（３６８〜３６９
頁）のような制限消化によってＤＮＡを分析した。この
制限地図により、８．６ｋｂのＢａｍＨＩ挿人体がＣｌ
Ａ２５５．５特異的ｖｈ遺伝子を含有しているプラスミ
ドｐＵｃＶＨ１ｎｃ−ＩＡを確認した。大腸菌に−１２
ＨＢ １０１／ｐＵｃＶＨＩｎｃＩＡの拾得物は１９８
８年１１月１４日にＮ ＲＲＬに寄託され、取得番号Ｎ
ＲＲＬ Ｂ−１８４３３のもとで入手可能である。こ
のプラスミドの制限部位および機能地図は第３図中に示
されている。
実施例６ プラスミドｐＨＧＩＺ＋ヒト不変領域重鎖遺
伝子を含有するプラスミドの構築Ａ、ヒトＤＮＡの単離 前記実施例２Ｄにおいて詳しく説明したようにしてヒト
ＤＮＡを単離した。
伝子を含有するプラスミドの構築Ａ、ヒトＤＮＡの単離 前記実施例２Ｄにおいて詳しく説明したようにしてヒト
ＤＮＡを単離した。
１３ ヒトプラスミドライブラリーの作成ａｚｇハブ
ロタイブのヒトＤＮＡを１０μ９として、反応ｔ−Ｑｉ
Ｊｉ故＃ ３ ［５０ｍＭ ｌ・リス−〇 Ｃ１２（ｐ
Ｈ＝ ８ 。
ロタイブのヒトＤＮＡを１０μ９として、反応ｔ−Ｑｉ
Ｊｉ故＃ ３ ［５０ｍＭ ｌ・リス−〇 Ｃ１２（ｐ
Ｈ＝ ８ 。
０）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２ｔ１１００ｍＭ Ｎａ（Ｊ
！］中、制限エンドヌクレアーゼＢａ５ＨＩおよびＦ（
ｉｎｄｌｌ！（それぞれ３０単位）を用い、全量２００
μｇ中で消化した。消化したフラグメントをエタノール
沈澱によって２０μＱまで濃縮し、５０ｍアンペアで１
５時間、０．６％低ゲル化温度アガロース（ＦＭＣ）ゲ
ルにかけて分離した。大きさ（サイズ）が６〜７ｋｂの
ＤＮＡフラグメントをゲルから切り出した。
！］中、制限エンドヌクレアーゼＢａ５ＨＩおよびＦ（
ｉｎｄｌｌ！（それぞれ３０単位）を用い、全量２００
μｇ中で消化した。消化したフラグメントをエタノール
沈澱によって２０μＱまで濃縮し、５０ｍアンペアで１
５時間、０．６％低ゲル化温度アガロース（ＦＭＣ）ゲ
ルにかけて分離した。大きさ（サイズ）が６〜７ｋｂの
ＤＮＡフラグメントをゲルから切り出した。
また、クローニングベクターｐＵｃ１８［ヤニッシュペ
ロン等（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ Ｃ，ｅｔ ａ
ｌ、、 Ｇｅｎｅ ３３１０３（１９８５））が開示；
ニュー・イングランド・バイオラブズから人手可能であ
る１も、上記のよう１こＢａｎ）（ｌおよびＨｉｎｄｌ
ｌｌで〆肖化した。このヒトＤＮＡフラグメント（１５
０ｎ９）を、１５℃で７２時間、３０ｒ＠ＭトリスーＨ
Ｃ（！（ｐＨ＝７．６）、ｌＯＩＩＩＭ ＭｇＣ＋２ｔ
、５ｍＭジチオトレイトール、１ｍＭＡＴＰ、およびＴ
４ ＤＮＡリガーゼ（ｌμＱ：２重位）を含む全反応
容量４００μｇ中において、ｐＵＣ１８ベクター（５０
ｎｇ）にライゲートした。このライゲートＤＮＡ試料の
半分（１００ｎｇ）を用いて新鮮にＰ’＋！ｌ ％’２
したコンピテントな大腸ｉＪＭ１０９細胞（ストラタジ
ーン）（５００μのを形質転換し、得られた形質転換体
を、Ｘ−ガル、Ｉ ＰＴＧ、ＡＭＰプレート［４μｇ／
ｓ＋（ｌ Ｘ−ガル、２１／２１２１ ＰＴＧ、１００
μ９／村アンピシリン］に蒔いた。
ロン等（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ Ｃ，ｅｔ ａ
ｌ、、 Ｇｅｎｅ ３３１０３（１９８５））が開示；
ニュー・イングランド・バイオラブズから人手可能であ
る１も、上記のよう１こＢａｎ）（ｌおよびＨｉｎｄｌ
ｌｌで〆肖化した。このヒトＤＮＡフラグメント（１５
０ｎ９）を、１５℃で７２時間、３０ｒ＠ＭトリスーＨ
Ｃ（！（ｐＨ＝７．６）、ｌＯＩＩＩＭ ＭｇＣ＋２ｔ
、５ｍＭジチオトレイトール、１ｍＭＡＴＰ、およびＴ
４ ＤＮＡリガーゼ（ｌμＱ：２重位）を含む全反応
容量４００μｇ中において、ｐＵＣ１８ベクター（５０
ｎｇ）にライゲートした。このライゲートＤＮＡ試料の
半分（１００ｎｇ）を用いて新鮮にＰ’＋！ｌ ％’２
したコンピテントな大腸ｉＪＭ１０９細胞（ストラタジ
ーン）（５００μのを形質転換し、得られた形質転換体
を、Ｘ−ガル、Ｉ ＰＴＧ、ＡＭＰプレート［４μｇ／
ｓ＋（ｌ Ｘ−ガル、２１／２１２１ ＰＴＧ、１００
μ９／村アンピシリン］に蒔いた。
Ｃ１組換えプラスミドｐｌ−ＩＧＩＺの最終的な構築タ
カハシ等［Ｔａｋａｈａｓｈｉ、Ｎ、 ａｔ ａｌ、、
Ｃｅ１ｌ、 ２９：６７１、６７９（１９８２）］が
記載し、ホンジＥｌ −［Ｔ、 Ｈｏｎｊ。
カハシ等［Ｔａｋａｈａｓｈｉ、Ｎ、 ａｔ ａｌ、、
Ｃｅ１ｌ、 ２９：６７１、６７９（１９８２）］が
記載し、ホンジＥｌ −［Ｔ、 Ｈｏｎｊ。
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ０ｓａｋａ、 Ｊａｐ
ａｎ］から提供されたヒトγ２プローブを用い、実施例
２Ｅ記載の方法により、組換えヒトＤＮＡを含むアンピ
シリンｉｆ性のｐＵｃ１８コロニーをスクリーニングし
た。ヒトγ１遺伝子に対応する７、５ｋｂの挿入体を含
有しているクローンを同定し、ＨｙＨＧｌと命名した。
ａｎ］から提供されたヒトγ２プローブを用い、実施例
２Ｅ記載の方法により、組換えヒトＤＮＡを含むアンピ
シリンｉｆ性のｐＵｃ１８コロニーをスクリーニングし
た。ヒトγ１遺伝子に対応する７、５ｋｂの挿入体を含
有しているクローンを同定し、ＨｙＨＧｌと命名した。
このヒトγ不変領域遺伝子を含有している同じ７．５ｋ
ｂのＨ１ｎｄｌｌｌ −Ｂａ５Ｈｆフラグメントを、次
に、実施例３Ａ記載の方法と同じ方法を用いて、ｐＢＲ
３２２中に再クローンした。このヒトγ１遺伝子を含有
するｐＢ Ｒ３２２ベクターをｐＨＧＩＺと命名し、ブ
ダペスト条約に基づき１９８８年３月４日にアメリカン
・タイブーカルチャー・コレクションに寄託した（ＡＴ
ＣＣ寄託番号＃６７６３８）。
ｂのＨ１ｎｄｌｌｌ −Ｂａ５Ｈｆフラグメントを、次
に、実施例３Ａ記載の方法と同じ方法を用いて、ｐＢＲ
３２２中に再クローンした。このヒトγ１遺伝子を含有
するｐＢ Ｒ３２２ベクターをｐＨＧＩＺと命名し、ブ
ダペスト条約に基づき１９８８年３月４日にアメリカン
・タイブーカルチャー・コレクションに寄託した（ＡＴ
ＣＣ寄託番号＃６７６３８）。
このプラスミドの制限部位および機能地図は、第３図中
に含まれている。
に含まれている。
実施例７ プラスミドｐＨＧ １−ＣＨＡ ： ＣＨＡ
２５５ＶＨ領域遺伝子とヒトＣＩｌ領域遺伝子の両方を
含有するベクターの構築 ｐＵｃＶＨ［ｎｃ−１ａ由来のプラスミドＤＮＡをマニ
アナイス記載（８６〜９６頁）のようにして抽出した。
２５５ＶＨ領域遺伝子とヒトＣＩｌ領域遺伝子の両方を
含有するベクターの構築 ｐＵｃＶＨ［ｎｃ−１ａ由来のプラスミドＤＮＡをマニ
アナイス記載（８６〜９６頁）のようにして抽出した。
次いで、反応緩衝液＃２を用いてこのＤＮＡ（１０μ９
）を酵素Ｈｉｎｄｌｌｌで消化した。次に、トリスホウ
酸塩緩衝液を用い、この消化ＤＮＡを０７％アガロース
ゲルで一晩、電気泳動した。３゜４ｋｂのフラグメント
をＤＥＡＥ８１紙上に単１ｔｌした。プラスミドｐＨＧ
Ｉ Ｚ（ＡＴＣＣ寄託番号＃６７６３８）由来のＤ
Ｎ Ａ （１ｕ９）も、Ｈｉｎｄｌｌｌで消化し、次い
でウシ腸アルカリホスファターゼ［ベーリンガー会マン
ハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｓ）］
で処理したく酵素供給元のプロトコールによって）。
）を酵素Ｈｉｎｄｌｌｌで消化した。次に、トリスホウ
酸塩緩衝液を用い、この消化ＤＮＡを０７％アガロース
ゲルで一晩、電気泳動した。３゜４ｋｂのフラグメント
をＤＥＡＥ８１紙上に単１ｔｌした。プラスミドｐＨＧ
Ｉ Ｚ（ＡＴＣＣ寄託番号＃６７６３８）由来のＤ
Ｎ Ａ （１ｕ９）も、Ｈｉｎｄｌｌｌで消化し、次い
でウシ腸アルカリホスファターゼ［ベーリンガー会マン
ハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｓ）］
で処理したく酵素供給元のプロトコールによって）。
ホスファターゼ処理したｐＨｃ Ｉ Ｚ（２００ｎ９）
およびｐＵｃＶＨＩｎｃ−ＩＡ由来の３．４ｋｂ ＶＨ
Ｈｉｎｄｌｌｌフラグメント（ｌ ＯＯｎ９）を用い、
全容１１０μｇ中でライゲートを行った。ライゲートは
１２°Ｃで一晩行った。このライゲートＤＮＡを用いて
１０閑セルラインＨＢＩＯＩ（ＢＲＬ）を形質転換し、
形質転換されたセルラインをアンピシリンブレートに蒔
いた。始めにコロニーをニトロセルロースフィルターに
移し、次に標準プロトコール［グルンスタインおよびホ
グネス（上記； １９７５）およびリフハイ等（」１記
）］により］ニックートランスレーショしておいた３、
４ｋｂＶ＋−１フラグメントとハイブリクイズさせるこ
とによって、コロニーをスクリーニングした。次いで、
Ｖ ｌｉプローブとハイブリクイズしたコロニーをアン
ピシリン（５０μ９／ｘの含有のＬＢ（５ｉのにおいて
一晩増殖させ、ＤＮＡを単離し、制限消化によって分析
した。ヒトγ１不変領域遺伝子に融合したＣＨＡ２５５
．５ ＶＨ特異的な遺伝子を含有しているプラスミド
を同定し、ｐ＋−（Ｇ １−Ｃｌ・ＩＡと命名した。こ
のプラスミドは、ｖｈ領領域公知特異性の不ズミハイブ
リドーマ由来であり、不変領域がヒト供給源由来である
、キメラ免疫グロブリン重鎖遺伝子を生成させるよう構
成されている。このプラスミドの制限部位および機能地
図は第４図中に示されている。
およびｐＵｃＶＨＩｎｃ−ＩＡ由来の３．４ｋｂ ＶＨ
Ｈｉｎｄｌｌｌフラグメント（ｌ ＯＯｎ９）を用い、
全容１１０μｇ中でライゲートを行った。ライゲートは
１２°Ｃで一晩行った。このライゲートＤＮＡを用いて
１０閑セルラインＨＢＩＯＩ（ＢＲＬ）を形質転換し、
形質転換されたセルラインをアンピシリンブレートに蒔
いた。始めにコロニーをニトロセルロースフィルターに
移し、次に標準プロトコール［グルンスタインおよびホ
グネス（上記； １９７５）およびリフハイ等（」１記
）］により］ニックートランスレーショしておいた３、
４ｋｂＶ＋−１フラグメントとハイブリクイズさせるこ
とによって、コロニーをスクリーニングした。次いで、
Ｖ ｌｉプローブとハイブリクイズしたコロニーをアン
ピシリン（５０μ９／ｘの含有のＬＢ（５ｉのにおいて
一晩増殖させ、ＤＮＡを単離し、制限消化によって分析
した。ヒトγ１不変領域遺伝子に融合したＣＨＡ２５５
．５ ＶＨ特異的な遺伝子を含有しているプラスミド
を同定し、ｐ＋−（Ｇ １−Ｃｌ・ＩＡと命名した。こ
のプラスミドは、ｖｈ領領域公知特異性の不ズミハイブ
リドーマ由来であり、不変領域がヒト供給源由来である
、キメラ免疫グロブリン重鎖遺伝子を生成させるよう構
成されている。このプラスミドの制限部位および機能地
図は第４図中に示されている。
実施例８ プラスミドｐＮＣＨＡＧ ｌ ： ＣＨＡ２
５５Ｖ）ｌ領域遺伝子とヒトγ１Ｃ１（領域遺伝子の両
方を含有している哺乳動物発現ベクターの構築Ａ、プラ
スミドｐＳ Ｖ ２ ｎｅｏ−Ｃｌａ次に、ｐＨＧｌ−
ＣＨＡのキメラ部分と哺乳動物発現ベク９−ｐＳ Ｖ
２ ｎｅｏ［アメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ションからＡＴＣＣ［＃３７１４９のもとで人手可能］
を用いて、１乳動物細胞中で発現させ得るキメラ免疫グ
ロブリンベクターを構築した。ｐｓＶ２ｎｅｏ ＤＮＡ
（ｌμｇ）を反応緩衝液＃３中、ＥｃｏＲ’ｌ（１単位
／μ９ＤＮＡ）で消化した。次いで、マニアティス（１
１３頁）ｆｆａ載のように、それぞれ５ｍＭの４種のデ
オキシリボヌクレオチドｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ
およびｄΔ′ｒＰ、２単位のフレノウ酵素、およびＩＯ
Ｘの緩衝液［０，５Ｍトリス−ＨＣｆ！（ｐｉ（＝７．
５）； ０．１Ｍ ＭｇＣＱ２： ｌ ＯｍＭジチオト
レイトール］の溶液（１０μｍ２）を加え、全容ｆｆ１
５０μ＆中で、ＥｃｏＲ１末端を平滑にした。この反応
液を室温で３０分間インキュベートし、続いてライゲー
ト反応を行い、この反応によって、ホスホリル化ｃｌａ
ｌ’Ｊンヵー（２μｇ）（二ニー・イングランド・バイ
オラブズ）を１゛４ＤＮＡリガーゼでＥｃｏＲＩ−平滑
末端化ｐＳＶ ２ ｎｅｏ（５００ｎ９）にライゲート
して、後のキメラベクター用の新規Ｃ１ａ１部位を創製
した。このＣｌａ Ｉ ’） ンｔ）−（Ｄ配列は、ｄ
（＋）ＣＡＴＣＧＡＴＧ） テあった。
５５Ｖ）ｌ領域遺伝子とヒトγ１Ｃ１（領域遺伝子の両
方を含有している哺乳動物発現ベクターの構築Ａ、プラ
スミドｐＳ Ｖ ２ ｎｅｏ−Ｃｌａ次に、ｐＨＧｌ−
ＣＨＡのキメラ部分と哺乳動物発現ベク９−ｐＳ Ｖ
２ ｎｅｏ［アメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ションからＡＴＣＣ［＃３７１４９のもとで人手可能］
を用いて、１乳動物細胞中で発現させ得るキメラ免疫グ
ロブリンベクターを構築した。ｐｓＶ２ｎｅｏ ＤＮＡ
（ｌμｇ）を反応緩衝液＃３中、ＥｃｏＲ’ｌ（１単位
／μ９ＤＮＡ）で消化した。次いで、マニアティス（１
１３頁）ｆｆａ載のように、それぞれ５ｍＭの４種のデ
オキシリボヌクレオチドｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ
およびｄΔ′ｒＰ、２単位のフレノウ酵素、およびＩＯ
Ｘの緩衝液［０，５Ｍトリス−ＨＣｆ！（ｐｉ（＝７．
５）； ０．１Ｍ ＭｇＣＱ２： ｌ ＯｍＭジチオト
レイトール］の溶液（１０μｍ２）を加え、全容ｆｆ１
５０μ＆中で、ＥｃｏＲ１末端を平滑にした。この反応
液を室温で３０分間インキュベートし、続いてライゲー
ト反応を行い、この反応によって、ホスホリル化ｃｌａ
ｌ’Ｊンヵー（２μｇ）（二ニー・イングランド・バイ
オラブズ）を１゛４ＤＮＡリガーゼでＥｃｏＲＩ−平滑
末端化ｐＳＶ ２ ｎｅｏ（５００ｎ９）にライゲート
して、後のキメラベクター用の新規Ｃ１ａ１部位を創製
した。このＣｌａ Ｉ ’） ンｔ）−（Ｄ配列は、ｄ
（＋）ＣＡＴＣＧＡＴＧ） テあった。
ライゲート反応は実施例２Ｅ記載のようにして行った。
ライゲートの後、過剰のリンカ−をＤＮＡの電気泳動に
よって除き、実施例２Ｅのようにして直線状のｐＳ Ｖ
、ｎｅｏ−ＣｌａフラグメントをＤＥＡＥ８１紙上に
単離した。実施例４Ａに記載した試薬を用いてこの単１
１１１ＤＮＡを自己ライゲートさせた。
よって除き、実施例２Ｅのようにして直線状のｐＳ Ｖ
、ｎｅｏ−ＣｌａフラグメントをＤＥＡＥ８１紙上に
単離した。実施例４Ａに記載した試薬を用いてこの単１
１１１ＤＮＡを自己ライゲートさせた。
）Ｉ Ｂ １０ ’ｌコンピテント細胞（ＢＲＬ）を実
施例２Ｅのようにして形質転換し、アンピシリン耐性コ
ロニーを制限酵素消化によって分析した。
施例２Ｅのようにして形質転換し、アンピシリン耐性コ
ロニーを制限酵素消化によって分析した。
次いで、得られたベクターｐＳ Ｖ ｔｎｅｏ−Ｃｌａ
を、Ｃ１ａ＋およびＢａｍＨＩ制限酵素（１単位／μ９
ＤＮＡ）で同時に消化した。キメラベクターｐＨＧＩＣ
ＨＡもこれら２種類の酵素で消化した。実施例２Ｅ記載
のようにして５．０ｋｂのｐＳ Ｖ ｔｎｅｏ−Ｃｌａ
Ｂａｍフラグメントとｌｏ、５ｋｂのＣ１ａ−Ｂ ａｍ
ｐＨＧ１−ＣＨＡフラグメントをＤＥＡＥ３１紙上に
単離した。この１０．５ｋｂフラグメント挿入体ＤＮＡ
（３００ｎ９）と５．０ｋｂベクターｐＳ Ｖ ｔｎｅ
ｏ−Ｃｌａ（１５０ｎ９）を用いて、実施例２Ｄ記載の
ような通常のライゲート反応を行った。ＨＢＩＯＩ細胞
（ＢＲＬ）の形質転換の後、組換えプラスミド（ｐＮ
ＣＨＡＧＩと命名）をプラスミドＤＮＡの制限マツピン
グによって同定した。このプラスミドは、ＣＨＡキメラ
重鎖ポリペプチドを産生させるために用いるキメラ発現
ベクターであり、その制限部位および機能地図を第４図
に示す。
を、Ｃ１ａ＋およびＢａｍＨＩ制限酵素（１単位／μ９
ＤＮＡ）で同時に消化した。キメラベクターｐＨＧＩＣ
ＨＡもこれら２種類の酵素で消化した。実施例２Ｅ記載
のようにして５．０ｋｂのｐＳ Ｖ ｔｎｅｏ−Ｃｌａ
Ｂａｍフラグメントとｌｏ、５ｋｂのＣ１ａ−Ｂ ａｍ
ｐＨＧ１−ＣＨＡフラグメントをＤＥＡＥ３１紙上に
単離した。この１０．５ｋｂフラグメント挿入体ＤＮＡ
（３００ｎ９）と５．０ｋｂベクターｐＳ Ｖ ｔｎｅ
ｏ−Ｃｌａ（１５０ｎ９）を用いて、実施例２Ｄ記載の
ような通常のライゲート反応を行った。ＨＢＩＯＩ細胞
（ＢＲＬ）の形質転換の後、組換えプラスミド（ｐＮ
ＣＨＡＧＩと命名）をプラスミドＤＮＡの制限マツピン
グによって同定した。このプラスミドは、ＣＨＡキメラ
重鎖ポリペプチドを産生させるために用いるキメラ発現
ベクターであり、その制限部位および機能地図を第４図
に示す。
（以下、余白）
夫権珂旦 クローニングした遺伝子のＤＮＡ配列決定
クローニングしたＣＨＡ可変軽鎖および重鎖遺伝子の配
列決定は、ブルースクリプト（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）
／ Ｄ Ｎ Ａ 配列決定システム（ストラタジーン）
、および配列決定キットシークエナーゼ［５ｅｑｕｅｎ
ａｓｅ； Ｕ、Ｓ、Ｂｉｏｃｈｅｎｉｃａｌｓ＋ Ｃ１
ｅｖｅｌａｎｄ、 ０ｈｉｏ］により提１％されるプロ
トコールを用い、２本鎖および１本鎖鋳型の両方につい
て常法で行った。ＤＮＡスター（ＤＮＡＳＬａｒ、 Ｍ
ａｄｉｓｏｎ、 Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）から市販のコン
ピューターソフトウェアプログラムＭＡＰＳＥＱにより
、クローニングしたＣＨＡ可変軽鎖および重鎖領域遺伝
子について得られたＤＮＡ配列から、上記ＤＮＡ配列に
よってコードされているポリペプチドのアミノ酸配列を
推定した。
列決定は、ブルースクリプト（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）
／ Ｄ Ｎ Ａ 配列決定システム（ストラタジーン）
、および配列決定キットシークエナーゼ［５ｅｑｕｅｎ
ａｓｅ； Ｕ、Ｓ、Ｂｉｏｃｈｅｎｉｃａｌｓ＋ Ｃ１
ｅｖｅｌａｎｄ、 ０ｈｉｏ］により提１％されるプロ
トコールを用い、２本鎖および１本鎖鋳型の両方につい
て常法で行った。ＤＮＡスター（ＤＮＡＳＬａｒ、 Ｍ
ａｄｉｓｏｎ、 Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）から市販のコン
ピューターソフトウェアプログラムＭＡＰＳＥＱにより
、クローニングしたＣＨＡ可変軽鎖および重鎖領域遺伝
子について得られたＤＮＡ配列から、上記ＤＮＡ配列に
よってコードされているポリペプチドのアミノ酸配列を
推定した。
実施例１０ 牛メラ重鎖および軽鎖遺伝子を含有して
いる構築物によるｌｌｎ乳動物セルラインのトランスフ
ェクション 前記実施例１のように、トランスフェクションに用いた
軽鎖免疫グロブリンプラスミドはｐＧＣＨＡＫであった
。始めに、ヒトに遺伝子に融合したキメラ可変軽（ＶＫ
）ＣＨＡ遺伝子を含むｐＧ ＣＨＡＫプラスミドを、前
記のエレクトロポレーション法（電気穿孔法）によって
Ｓ Ｐ ２１０バイブリド−？細胞（ＡＴＣＣ）にトラ
ンスフェクションした。
いる構築物によるｌｌｎ乳動物セルラインのトランスフ
ェクション 前記実施例１のように、トランスフェクションに用いた
軽鎖免疫グロブリンプラスミドはｐＧＣＨＡＫであった
。始めに、ヒトに遺伝子に融合したキメラ可変軽（ＶＫ
）ＣＨＡ遺伝子を含むｐＧ ＣＨＡＫプラスミドを、前
記のエレクトロポレーション法（電気穿孔法）によって
Ｓ Ｐ ２１０バイブリド−？細胞（ＡＴＣＣ）にトラ
ンスフェクションした。
ＳＰ２１０−Ａｇｌ ４細胞を５％ＦＣ３含有の培地（
１−（Ｈ，、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩなど）で増殖させ、エ
レクトロポレーション前の３日間を対数増殖期に保った
。プラスミドベクターｐＧ ＣＨＡ Ｋ （２０μ９）
は制限酵素Ｒｖｕｌ（ｌｕ／μｇ）および反応緩衝液＃
７を用いて直線化した。トランスフェクション時に、Ｓ
Ｐ ２１０細胞をＩＥＣ臨床用遠心機で遠心して集め
た（８００ｒｐｍ、１０分間、室温）。次いで、６１１
Ｍデキストロースを含むバンクの緩衝食塩溶液（ギブコ
）で細胞を３回ｔし浄し、最終濃度１．５ｘｌＯ”細胞
／籾で再懸濁した。この細胞の一部（０，３１１２）を
０．５ｘ １０″１０．３ｍ＆の密度でキュベツトに分
取し、直線化したＤＮＡを加えた。
１−（Ｈ，、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩなど）で増殖させ、エ
レクトロポレーション前の３日間を対数増殖期に保った
。プラスミドベクターｐＧ ＣＨＡ Ｋ （２０μ９）
は制限酵素Ｒｖｕｌ（ｌｕ／μｇ）および反応緩衝液＃
７を用いて直線化した。トランスフェクション時に、Ｓ
Ｐ ２１０細胞をＩＥＣ臨床用遠心機で遠心して集め
た（８００ｒｐｍ、１０分間、室温）。次いで、６１１
Ｍデキストロースを含むバンクの緩衝食塩溶液（ギブコ
）で細胞を３回ｔし浄し、最終濃度１．５ｘｌＯ”細胞
／籾で再懸濁した。この細胞の一部（０，３１１２）を
０．５ｘ １０″１０．３ｍ＆の密度でキュベツトに分
取し、直線化したＤＮＡを加えた。
この混合物を水上に１０分間（７つな。Ｑ、３ｍｉ間隔
の電極（Ｐ／Ｎ ４７２）およびＢＴｘ１００トランス
フエクタ−（ＢＴＸ、 Ｉｎｃ、、 Ｓａｎ Ｄｉｅｇ
ｏ、 Ｃａ、）を用いてエレクトロポレーションを行っ
た。２５０Ｖ、１パルス５ミリ秒の持続時間を用いた。
の電極（Ｐ／Ｎ ４７２）およびＢＴｘ１００トランス
フエクタ−（ＢＴＸ、 Ｉｎｃ、、 Ｓａｎ Ｄｉｅｇ
ｏ、 Ｃａ、）を用いてエレクトロポレーションを行っ
た。２５０Ｖ、１パルス５ミリ秒の持続時間を用いた。
次いで、このエレクトロポレーションした細胞を、２ｘ
１０５／Ｒ１２（Ｔ７５フラスコ中）の密度で７２時間
、培地に再懸濁した（３７°Ｃ，５％ＣＯを雰囲気下）
。
１０５／Ｒ１２（Ｔ７５フラスコ中）の密度で７２時間
、培地に再懸濁した（３７°Ｃ，５％ＣＯを雰囲気下）
。
次に細胞を、２４ウエルのプレートに５ｘｌＯ’／ｌＩ
＆の密度で適当な抗生物質中に蒔いた；ｐｃｃＩＩ Ａ
Ｋを含む５Ｐ２１０細胞を、１μ９／肩ｇでＨＭＡＸ
ｌ、Ｏ培地［５０ｒ＋９／ １１２ヒボキサンチン、２
５０ｎ９／戻σミコフエノール酸、および５０μ９／１
１２キサンチン、シグマ］に蒔いた。ＨＭΔＸｆｒＨ’
ｌコロニーを含むウェルのそれぞれから上Ｉｆ（２００
μＱ）を集めた。次にこの上清を、以下のように、ｐｃ
ＣＨＡ Ｋのキメラ免疫グロブリン遺伝子の発現を示す
であろうヒトに不変領域遺伝子の存在について検定した
。
＆の密度で適当な抗生物質中に蒔いた；ｐｃｃＩＩ Ａ
Ｋを含む５Ｐ２１０細胞を、１μ９／肩ｇでＨＭＡＸ
ｌ、Ｏ培地［５０ｒ＋９／ １１２ヒボキサンチン、２
５０ｎ９／戻σミコフエノール酸、および５０μ９／１
１２キサンチン、シグマ］に蒔いた。ＨＭΔＸｆｒＨ’
ｌコロニーを含むウェルのそれぞれから上Ｉｆ（２００
μＱ）を集めた。次にこの上清を、以下のように、ｐｃ
ＣＨＡ Ｋのキメラ免疫グロブリン遺伝子の発現を示す
であろうヒトに不変領域遺伝子の存在について検定した
。
Ｂ、キメラＣＨＡ２５５．５を分ｌ必しているＳＰキメ
ラＣ）（Ａ〜ヒトに遺伝子を発現しているトランスフエ
フシリンした５Ｐ２１０を、ヒトにについて、イングバ
ル等［Ｅｎｇｖａｌｌ、Ｅ、 ａｎｄ Ｐｅｒｌｎａｎ
ｎ。
ラＣ）（Ａ〜ヒトに遺伝子を発現しているトランスフエ
フシリンした５Ｐ２１０を、ヒトにについて、イングバ
ル等［Ｅｎｇｖａｌｌ、Ｅ、 ａｎｄ Ｐｅｒｌｎａｎ
ｎ。
Ｐ、、 Ｉｎｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ８ ： ８
７１〜ｇ７４（１９７り］記載のような、通常の酵素−
結合した免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）によって同定した
。この検定の目的は、ネズミハイブリドーマＣＨＡ２５
５．５から単離したネズミ可変領域から構築し、ヒトに
遺伝子に融合させたｐｃ ＣＨＡ Ｋプラスミドベクタ
ーによってコードされているキメラに鎖ポリペプチドを
分泌している細胞を同定することである。１０ｍＭリン
酸ナトリウム（ｐＨ＝７．８）中、５μ９／ｘ（ｌのヤ
ギ抗−ヒトに鎖［ターボ（Ｔａｇｏ）＃ ４１０６］の
溶液を調製した。９６ウエルプレートのそれぞれのウェ
ルをこの溶液（５０μＱ）で被覆した。次いで、このプ
レートを３７℃で一晩インキユベートした。続いてプレ
ートを水およびＰＢＳ十０．１％ツイーン（豐／Ｖ）で
徹底的にすすいだ。上清フラクシヨン（５０μＱ）をそ
れぞれのウェルに加え、室温で２時間インキュベートし
た。プレートを上記のようにもう一度すすいだ。ヤギ抗
−ヒトに鎖アルカリホスファターゼコンジュゲート（タ
ーボ＃２４９６）を、土浦材料と同じ培地でｔ：ｔｏｏ
ｏ希釈した。
７１〜ｇ７４（１９７り］記載のような、通常の酵素−
結合した免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）によって同定した
。この検定の目的は、ネズミハイブリドーマＣＨＡ２５
５．５から単離したネズミ可変領域から構築し、ヒトに
遺伝子に融合させたｐｃ ＣＨＡ Ｋプラスミドベクタ
ーによってコードされているキメラに鎖ポリペプチドを
分泌している細胞を同定することである。１０ｍＭリン
酸ナトリウム（ｐＨ＝７．８）中、５μ９／ｘ（ｌのヤ
ギ抗−ヒトに鎖［ターボ（Ｔａｇｏ）＃ ４１０６］の
溶液を調製した。９６ウエルプレートのそれぞれのウェ
ルをこの溶液（５０μＱ）で被覆した。次いで、このプ
レートを３７℃で一晩インキユベートした。続いてプレ
ートを水およびＰＢＳ十０．１％ツイーン（豐／Ｖ）で
徹底的にすすいだ。上清フラクシヨン（５０μＱ）をそ
れぞれのウェルに加え、室温で２時間インキュベートし
た。プレートを上記のようにもう一度すすいだ。ヤギ抗
−ヒトに鎖アルカリホスファターゼコンジュゲート（タ
ーボ＃２４９６）を、土浦材料と同じ培地でｔ：ｔｏｏ
ｏ希釈した。
この１００μＱをウェル毎に加え、室温で１時間インキ
ュベートした。上記のようにプレートをすすいだ。アル
カリホスファターゼ基質を包装の指示通り、蒸留水３肩
Ｑにつき１錠の割合で調製し、この仄’Ｉ（１５０μぐ
）をそれぞれのウェルに加え、３７°Ｃで３０分間イン
キュベートした。この反応を５００１Ｍ ＥＤＴＡ（５
０μＱ）で停止させ、次いで４０５ｎｍでの吸収を測定
した。最高レベルのに発現を示した上清を同定し、対応
するウェルからの細胞を集め、キメラ構築物ｐＮＣＩ（
ＡＧＩの導入用に増やした。
ュベートした。上記のようにプレートをすすいだ。アル
カリホスファターゼ基質を包装の指示通り、蒸留水３肩
Ｑにつき１錠の割合で調製し、この仄’Ｉ（１５０μぐ
）をそれぞれのウェルに加え、３７°Ｃで３０分間イン
キュベートした。この反応を５００１Ｍ ＥＤＴＡ（５
０μＱ）で停止させ、次いで４０５ｎｍでの吸収を測定
した。最高レベルのに発現を示した上清を同定し、対応
するウェルからの細胞を集め、キメラ構築物ｐＮＣＩ（
ＡＧＩの導入用に増やした。
５Ｐ２１０細胞へのトランスフエクシクン用に用いた重
鎖免疫グロブリンプラスミドは、実施例８記載の構築物
由来のｐＮＣＨＡＧ１であった。
鎖免疫グロブリンプラスミドは、実施例８記載の構築物
由来のｐＮＣＨＡＧ１であった。
集めたキメラＣＨＡ−ヒトに遺伝子を発現する細胞集団
を、次に、キメラＣＥＭ重鎖遺伝子を含有しているプラ
スミド構築物とともにエレクトロポレーションした。に
遺伝子のエレクトロポレーションについては、５Ｐ２１
０キメラに産生細胞（ＳＰ ２１０−Ｋ）をエレクトロ
ポレーション前の３日間、対数増殖期に保った。プラス
ミドＤＮＡｐＮＣＨＡＧＩ（２０μ９）を反応緩衝液＃
７中、酵素Ｒｖｕｌで直線化した。実施例２Ａ記載のよ
うにして、細胞を集め、洗浄し、１．５ｘｌｏ７細胞／
ｆｆ＆の密度で再懸濁した。ＤＮＡを加尤、この混合物
をエレクトロポレーション前の１０分間、水上に保った
。用いた条件は、５ミリ秒で１パルス、２５０Ｖであっ
た。細胞を、哺乳動物組織培養培地、例えばＤＭＥＭ、
ＲＰＭＩまたはＨＨ２［後者はハイプリチック社（Ｈｙ
ｂｒｉｔｅｃｈ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、 Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ、 ＣＡ、）から人手できる］、５％ＦＣ３
＋ＨＭＡＸ １．０１：２．５ ｘ ｌ ０５／ｍ１２
テ蒔いた（３７℃、５％ＣＯｔ雰囲気下、７２時間）。
を、次に、キメラＣＥＭ重鎖遺伝子を含有しているプラ
スミド構築物とともにエレクトロポレーションした。に
遺伝子のエレクトロポレーションについては、５Ｐ２１
０キメラに産生細胞（ＳＰ ２１０−Ｋ）をエレクトロ
ポレーション前の３日間、対数増殖期に保った。プラス
ミドＤＮＡｐＮＣＨＡＧＩ（２０μ９）を反応緩衝液＃
７中、酵素Ｒｖｕｌで直線化した。実施例２Ａ記載のよ
うにして、細胞を集め、洗浄し、１．５ｘｌｏ７細胞／
ｆｆ＆の密度で再懸濁した。ＤＮＡを加尤、この混合物
をエレクトロポレーション前の１０分間、水上に保った
。用いた条件は、５ミリ秒で１パルス、２５０Ｖであっ
た。細胞を、哺乳動物組織培養培地、例えばＤＭＥＭ、
ＲＰＭＩまたはＨＨ２［後者はハイプリチック社（Ｈｙ
ｂｒｉｔｅｃｈ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、 Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ、 ＣＡ、）から人手できる］、５％ＦＣ３
＋ＨＭＡＸ １．０１：２．５ ｘ ｌ ０５／ｍ１２
テ蒔いた（３７℃、５％ＣＯｔ雰囲気下、７２時間）。
この後、細胞を、２４ウエルプレート中の、活性濃度（
５００Ｍｇ／ｘののＧ４１８抗生物質［ジェネチシン（
Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）、ギブツーＢＲＬ］およびＨＭＡ
Ｘｌ、０を含む培地に５ＸＩＯ’／ｆｆＱで蒔いた。選
択を１４日間行い、コノ時点でＨＭＡＸ／Ｇ４１８耐性
コロニーのウェルを同定し、さらに分析を行った。
５００Ｍｇ／ｘののＧ４１８抗生物質［ジェネチシン（
Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）、ギブツーＢＲＬ］およびＨＭＡ
Ｘｌ、０を含む培地に５ＸＩＯ’／ｆｆＱで蒔いた。選
択を１４日間行い、コノ時点でＨＭＡＸ／Ｇ４１８耐性
コロニーのウェルを同定し、さらに分析を行った。
実施例１１ ＣＥＭ−キメラ抗体を分泌する５Ｐ２１
０細胞、キメラ抗体の同定および分析Ａ、成厘桔介 スクリーニング検定を行って、キメラＣＨＡ軽および重
の両鏡の免疫グロブリン遺伝子産生の抗体（ベンジルＥ
ＤＴＡハブテンを結合している）を発現するトランスフ
ェクションされた５Ｐ２１０細胞を同定した。金属コン
プレックス抗原に指向性である抗体の検出に用いた検定
方法は、ワン等［Ｗａｎｇ、Ｒ，、ｅｔ ａｔ、、
ｌ５ａｕｎｏｌＪｅｔｈｏｄｓ、 １８： １
５ｌ５７−１６ｉ（ｔ］が記載しているような通常の固
相放射線免疫検定である。この検定を次のようにして行
った。実施例１の方法に従ってＢＳＡをベンジル−ＥＤ
ＴＡで誘導体化した。ＢＳＡの各分子は５〜ＩＯ個のキ
レート分子を含有していた。ハブテンに対して１０５％
モル過剰のＩｎＣＱ３をＢＳＡ−キレート溶液に加える
ことによってキレートをインジウムで処理し、０．１３
Ｍクエン酸塩（ｐＨ＝ ６ ）中で一晩インキユベート
した。この溶液を１０ａＭリン酸塩（ｐＨ−７，２）で
容量にしｔこ。このＢＳＡ−ＥＤＴＡ−Ｉｎ溶液を１０
μ９／ｘｃの濃度にし、５０μＱを９６ウエルの微量滴
定プレートのウェル毎に加えた。プレートを３７℃で一
晩乾燥した。
０細胞、キメラ抗体の同定および分析Ａ、成厘桔介 スクリーニング検定を行って、キメラＣＨＡ軽および重
の両鏡の免疫グロブリン遺伝子産生の抗体（ベンジルＥ
ＤＴＡハブテンを結合している）を発現するトランスフ
ェクションされた５Ｐ２１０細胞を同定した。金属コン
プレックス抗原に指向性である抗体の検出に用いた検定
方法は、ワン等［Ｗａｎｇ、Ｒ，、ｅｔ ａｔ、、
ｌ５ａｕｎｏｌＪｅｔｈｏｄｓ、 １８： １
５ｌ５７−１６ｉ（ｔ］が記載しているような通常の固
相放射線免疫検定である。この検定を次のようにして行
った。実施例１の方法に従ってＢＳＡをベンジル−ＥＤ
ＴＡで誘導体化した。ＢＳＡの各分子は５〜ＩＯ個のキ
レート分子を含有していた。ハブテンに対して１０５％
モル過剰のＩｎＣＱ３をＢＳＡ−キレート溶液に加える
ことによってキレートをインジウムで処理し、０．１３
Ｍクエン酸塩（ｐＨ＝ ６ ）中で一晩インキユベート
した。この溶液を１０ａＭリン酸塩（ｐＨ−７，２）で
容量にしｔこ。このＢＳＡ−ＥＤＴＡ−Ｉｎ溶液を１０
μ９／ｘｃの濃度にし、５０μＱを９６ウエルの微量滴
定プレートのウェル毎に加えた。プレートを３７℃で一
晩乾燥した。
検定前にプレートをＰＢＳおよび０．１％ツイーン２０
および脱イオン水で洗浄した。各ウェルに土浦（５０μ
Ｑ）をいれ、これを室温で２時間インキュベートした。
および脱イオン水で洗浄した。各ウェルに土浦（５０μ
Ｑ）をいれ、これを室温で２時間インキュベートした。
ウェルをＰＢＳ十〇、１％ツイーン２０および脱イオン
水でもう一度洗浄した。アルカリポスフ１ターゼにコン
ジュゲートしたヤギ抗−ヒトに（ターボ＃２４９６）を
ｌ：５００希釈し、１００μＱをそれぞれのウェルに加
えた。これを室温で１時間インキコベートした。上記の
ようにウェルを洗浄した。各ウェルに基質（１５０μＱ
）を入れた。この酵素反応液を回転機上、３７°Ｃで６
０分間インキュベートした。この反応を５００ｍＭのＥ
ＤＴ Ａ（ｐｌ（＝ ８）（５０μ１２）で停止させ
た。４０５ｎＭでの吸収を、ＢＩＯ−ＴＥＫ Ｅｌｉｓ
ａリーダーで測定した。
水でもう一度洗浄した。アルカリポスフ１ターゼにコン
ジュゲートしたヤギ抗−ヒトに（ターボ＃２４９６）を
ｌ：５００希釈し、１００μＱをそれぞれのウェルに加
えた。これを室温で１時間インキコベートした。上記の
ようにウェルを洗浄した。各ウェルに基質（１５０μＱ
）を入れた。この酵素反応液を回転機上、３７°Ｃで６
０分間インキュベートした。この反応を５００ｍＭのＥ
ＤＴ Ａ（ｐｌ（＝ ８）（５０μ１２）で停止させ
た。４０５ｎＭでの吸収を、ＢＩＯ−ＴＥＫ Ｅｌｉｓ
ａリーダーで測定した。
Ｂ−１鷹
親和性の検定を行って、ＥＯＴＵＢＥのインジウム（１
１１）コンプレックスに対する本キメラ抗体Ｃ１１Ａ２
５５．５のＫａを測定した。ＥＯＴＵＢＥはｐ−（アミ
ノベンジル）ＥＤＴＡの誘導体であり、アンダー七ン等
［Ｌ、 Ｄ、 Ａｎｄｅｒｓｅｎ、 Ｊ、 Ｍ、 Ｆｒ
１ｎｃｋｅ、 ａｎｄＤ、 Ｌ、 Ｍｅｙｅｒ ；米国
特許Ｎｏ、 １５１８５５ ； １９８８年２月３日出
廓］が開示している。
１１）コンプレックスに対する本キメラ抗体Ｃ１１Ａ２
５５．５のＫａを測定した。ＥＯＴＵＢＥはｐ−（アミ
ノベンジル）ＥＤＴＡの誘導体であり、アンダー七ン等
［Ｌ、 Ｄ、 Ａｎｄｅｒｓｅｎ、 Ｊ、 Ｍ、 Ｆｒ
１ｎｃｋｅ、 ａｎｄＤ、 Ｌ、 Ｍｅｙｅｒ ；米国
特許Ｎｏ、 １５１８５５ ； １９８８年２月３日出
廓］が開示している。
ＥＯＴＵＢＥの合成、および通常のスカッチャード分析
（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ）におけるそ
の使用を以下に説明する。
（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ）におけるそ
の使用を以下に説明する。
１、ＥＯＴＵＢＥの合成
具体的には、ＥＯＴＵＢＥは、Ｎ−（２−ヒドロキシエ
チル）−Ｎ’−＜ｐ−ベンジル）チオ尿素部分のベンジ
ル炭素によって内部エチレン炭素の１つが置換されてい
るＥＤＴＡである（置換されている炭素の立体化学はＳ
である）。ＥＯＴＵＢＥの合成は、可能な限り金属イオ
ンを排除して行った（例えば、すべてのガラス器具は６
Ｍ ＨＣｆ２で洗浄し、脱イオン水だけを用いた）。
チル）−Ｎ’−＜ｐ−ベンジル）チオ尿素部分のベンジ
ル炭素によって内部エチレン炭素の１つが置換されてい
るＥＤＴＡである（置換されている炭素の立体化学はＳ
である）。ＥＯＴＵＢＥの合成は、可能な限り金属イオ
ンを排除して行った（例えば、すべてのガラス器具は６
Ｍ ＨＣｆ２で洗浄し、脱イオン水だけを用いた）。
米国特許Ｎ ｏ、 ４．６２２．４２０およびメアレス
［Ｍｅａｒｅｓ。
［Ｍｅａｒｅｓ。
Ｃ，Ｆ、、 Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｔ、 １４２６
８−７５（１９８４）コ記載のようにして、（Ｓ）−ｐ
−二トロベンジルＥＤＴＡを調製し、（Ｓ）−４−イン
チオシアナトベンジルＥＤＴＡ（以下、ＩＴｃＢＥと略
称する）に変換した。
８−７５（１９８４）コ記載のようにして、（Ｓ）−ｐ
−二トロベンジルＥＤＴＡを調製し、（Ｓ）−４−イン
チオシアナトベンジルＥＤＴＡ（以下、ＩＴｃＢＥと略
称する）に変換した。
この凍結乾燥したＩＴＣＢＥをＱ、３ＭノＨＣｌ２［Ｕ
ＩＬｒｅｘ、 Ｊ、Ｔ、Ｂａｋｅｒ、 Ｐｈｉｌｌｉｐ
ｓｂｕｒｇ、 Ｎｕ、］に再懸濁して最終濃度がおよそ
５０ｉ＋Ｍになるようにした。この溶液を一７０°Ｃで
保存した。他に特記事項がなければ、すべての反応は４
０°Ｃの水溶液中で行った。
ＩＬｒｅｘ、 Ｊ、Ｔ、Ｂａｋｅｒ、 Ｐｈｉｌｌｉｐ
ｓｂｕｒｇ、 Ｎｕ、］に再懸濁して最終濃度がおよそ
５０ｉ＋Ｍになるようにした。この溶液を一７０°Ｃで
保存した。他に特記事項がなければ、すべての反応は４
０°Ｃの水溶液中で行った。
２０１ＭのＩＴＣＢＥ（２，５ｚυを２００ｍＭのエタ
ノールアミン（１，３！Ｍ２）に加え、ｌＯＮのＮａ０
ｔ（でそのｐＨを１１．０に調節した。その容量を水で
５ｘＱに調節し、混合物を１５分間反応させ、この時点
でＨＰＬＣ分析によりチエツクした。
ノールアミン（１，３！Ｍ２）に加え、ｌＯＮのＮａ０
ｔ（でそのｐＨを１１．０に調節した。その容量を水で
５ｘＱに調節し、混合物を１５分間反応させ、この時点
でＨＰＬＣ分析によりチエツクした。
ＩＴＣＢＥのすべては、ＨＰ Ｌ Ｃ［ヒューレットパ
ノカード（Ｉｌｅｗｌａｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）１０９
０機；Ｃ１８ツノラム５０ｍＭ酢酸トリエチルアンモニ
ウムの緩衝水溶液から純メタノールへの直線勾配で溶離
］で保持時間３．６分のＥＯＴＵＢＥに変換していた。
ノカード（Ｉｌｅｗｌａｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）１０９
０機；Ｃ１８ツノラム５０ｍＭ酢酸トリエチルアンモニ
ウムの緩衝水溶液から純メタノールへの直線勾配で溶離
］で保持時間３．６分のＥＯＴＵＢＥに変換していた。
この生成物を、０．１−ＩＭのギ酸アンモニウム（ｐｔ
ｌ ＝ ６ ）の勾配液（１１０肩ので溶離するＤＥＡ
ｒＥセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ） Ａ −２
５カラム（ｌｌ ｚｃ）のアニオン交換クロマトグラフ
ィーで精製した（このカラムを２８０ｎｎでモニターし
た）。生成物を含む分画を集め、凍結乾燥した。この生
成物は、２４６ｎａ＋で吸収最大値、吸光係数１８，０
００を有していた。
ｌ ＝ ６ ）の勾配液（１１０肩ので溶離するＤＥＡ
ｒＥセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ） Ａ −２
５カラム（ｌｌ ｚｃ）のアニオン交換クロマトグラフ
ィーで精製した（このカラムを２８０ｎｎでモニターし
た）。生成物を含む分画を集め、凍結乾燥した。この生
成物は、２４６ｎａ＋で吸収最大値、吸光係数１８，０
００を有していた。
その構造は１３ＣのＮＭＲスペクトルで調べた［バフア
ン・インス′ツルメン′ソ（Ｙａｒｉａｎ Ｉｎｓｔｒ
ｕｍｅｎｔｓ）ＸＬ−３００型３００ＭＩＩｚ機を使用
；重水中で行う］。ＩＴＣＢＥのインチオンアネート部
分中の炭素に対応するピークは１３９ ｐｐｍのところ
にあり、ＥＯＴＵＢＥでは１８２ ｐｐｍのピークに換
わった。このピークはチオ尿素結合中の炭素に対応して
いる。
ン・インス′ツルメン′ソ（Ｙａｒｉａｎ Ｉｎｓｔｒ
ｕｍｅｎｔｓ）ＸＬ−３００型３００ＭＩＩｚ機を使用
；重水中で行う］。ＩＴＣＢＥのインチオンアネート部
分中の炭素に対応するピークは１３９ ｐｐｍのところ
にあり、ＥＯＴＵＢＥでは１８２ ｐｐｍのピークに換
わった。このピークはチオ尿素結合中の炭素に対応して
いる。
ＩＴＣＢＥのスペクトルの芳香族領域（１２８〜１３８
ｐｐｍ）は４つのピークを示すが、ＥＯＴＵＢＥは３
つである。脂肪族領域では、ＩＴＣＢＥとＥＯＴＵＢＥ
に共通して５つのピークがあり、６４および４９ｐｐｍ
のさらに２つのピークがＥＯＴＵＢＥのスペクトルに存
在する。この後者ピークはそれぞれ、ヒドロキシおよび
チオ尿素部分に隣接する炭素に対応している。
ｐｐｍ）は４つのピークを示すが、ＥＯＴＵＢＥは３
つである。脂肪族領域では、ＩＴＣＢＥとＥＯＴＵＢＥ
に共通して５つのピークがあり、６４および４９ｐｐｍ
のさらに２つのピークがＥＯＴＵＢＥのスペクトルに存
在する。この後者ピークはそれぞれ、ヒドロキシおよび
チオ尿素部分に隣接する炭素に対応している。
方法
１、牛レートの放射線ラベル
Ａ、 ９．９５４０ｘ １ｏ−７ｊ１モルのＥＯＴＵ
ＢＥを６００μＣｉのＩｌｌ ｌ ｎでラベルする。
ＢＥを６００μＣｉのＩｌｌ ｌ ｎでラベルする。
１、他のいかなる金属も導入することなく次の成分を金
属不含の試験管に加える： ａ、０．Ｏ１５８ａＭの金属不含のＥＯＴＵＢＥ ６３
μｇ； ｂ、０．２６Ｍの金属不含のクエン酸アンモニウム（ｐ
Ｈ＝６．０）６３ｕＱ： ｃ、６００μＣｉの１’Ｉｎ（１，３０ｘ ＩＱ−”屑
モル）。
属不含の試験管に加える： ａ、０．Ｏ１５８ａＭの金属不含のＥＯＴＵＢＥ ６３
μｇ； ｂ、０．２６Ｍの金属不含のクエン酸アンモニウム（ｐ
Ｈ＝６．０）６３ｕＱ： ｃ、６００μＣｉの１’Ｉｎ（１，３０ｘ ＩＱ−”屑
モル）。
２、室温で一晩インキコベートする。
Ｂ、ＥＯＴＵＢＥに対して１．０５モル比のインジウム
（＋１１１＋１と基底状態のＩｎの両方）を与えるに十
分なコールドインジウムとともに工程Ａを行う。
（＋１１１＋１と基底状態のＩｎの両方）を与えるに十
分なコールドインジウムとともに工程Ａを行う。
１、上記（１，Ａ、２）の試験管に０．ＯＬ２ａＭの基
底状態１ ｎＣＱ３１０．２μ＋２（１，０４４ｘｌＯ
−”屑モル）を加える。
底状態１ ｎＣＱ３１０．２μ＋２（１，０４４ｘｌＯ
−”屑モル）を加える。
２ 室温で４時間インキュベートする。
Ｃ０薄層クロマトグラフィー分析を行ってインジウムの
導入を調べる。
導入を調べる。
■、長さ１０．５インチのシリカゲルプレート（Ｏ２５
インチ片に区画してレーンとする）の２つのレーンの底
からｌ ｃ＋ｙ＋こラベルした試料０．５μＱをスボッ
Ｉ・する。
インチ片に区画してレーンとする）の２つのレーンの底
からｌ ｃ＋ｙ＋こラベルした試料０．５μＱをスボッ
Ｉ・する。
２、試料スポットを乾燥させる。
３１０％酢酸アンモニウム：メタノール（１：１）溶媒
系を入れたＴ Ｌ Ｃ′ＮＪにプレートを置（。
系を入れたＴ Ｌ Ｃ′ＮＪにプレートを置（。
４゜９ｃｕの印のところまでプレートを展開させる。
５、プレートを引き上げ、乾燥させる。
６、プレートの各レーンを３つの部分に分ける。
ａ、初めの部分は底から２ｃｙの印のところまで。
ｂ、真中の部分は２〜３．５ｃｍの部分。
Ｃ８後ろの部分は３．５ｃ＊から頂上の部分。
７、両レーンについて各部分のｃｐ＋ｓを測定する。
８、各レーンの後ろの部分の％は、キレートに導入され
たインジウム％に等しい。
たインジウム％に等しい。
Ｄ、インジウムが９０％以上導入されたときには、検定
で使用するためＥＯＴＵＢＥをＰＢＳ（ｐト１＝７．５
）で４．４０ｐ９／μＣに希釈する。
で使用するためＥＯＴＵＢＥをＰＢＳ（ｐト１＝７．５
）で４．４０ｐ９／μＣに希釈する。
■、コールド競合体の調製
Ａ、５．５３０ｘ １０”’屑モルのＥＯＴＵＢＥをを
ＥＯＴＵＢＥに対してモル比１．０２ＸのＩｎＣｆ２３
でコールドインジウム処理する。
ＥＯＴＵＢＥに対してモル比１．０２ＸのＩｎＣｆ２３
でコールドインジウム処理する。
■、いかなる汚染金属も導入することなく次の成分を金
属不含の試験管に加える： ａ、７．９ｍＭの金属不含のＥＯＴＵＢＥ７０ｕ（！（
５，５３０ｘ １０−’ｘモル）ｂ、、０．２６Ｍの金
属不含のクエン酸アンモニウム（ｐＨ＝６．０）７０μ
！！ ｃ、１０．２＋Ｍの基底状態１１１Ｃ１２３５５，３μ
１２（５，６４ｌｘ １０−’ｚモル）。
属不含の試験管に加える： ａ、７．９ｍＭの金属不含のＥＯＴＵＢＥ７０ｕ（！（
５，５３０ｘ １０−’ｘモル）ｂ、、０．２６Ｍの金
属不含のクエン酸アンモニウム（ｐＨ＝６．０）７０μ
！！ ｃ、１０．２＋Ｍの基底状態１１１Ｃ１２３５５，３μ
１２（５，６４ｌｘ １０−’ｚモル）。
２、室温で４時間インキュベートする。
Ｂ、後記■で使用するため、１次Ｑの０．４０ｎ９／ｕ
Ｑとｌｘｆ！の０．３６ｎ９／μｉ２が得られるようＰ
ＢＳ（ｐＨ＝７．５）で希釈する。
Ｑとｌｘｆ！の０．３６ｎ９／μｉ２が得られるようＰ
ＢＳ（ｐＨ＝７．５）で希釈する。
１１、抗体感度曲線
Ａ、９６ウエルの微ｆｆ１ｌＴｉ定プレートに次の成分
を加える（３組）： １ 、 ４ 、４ ｐ９／ ｕ（ｌのＥＯＴＵＢＥ−目
’Ｉｎ基底状態Ｉｎ２５μＱ ２．２０．１Ｏ１５，２，５，１，２５，０６２３，０
，３１３，０，１５６，０，０８０，０，０４０，０，
０２０，またはＯμｔｉ／ｄの抗体希釈液（ＣＩＡ２５
５または誘導体）２５μＱ ３．１０％ウマ血清を含むＲＰＭＩ ５０μＱ４．２
０μＱが０．５μこのＡｂと結合するであろう濃度まで
希釈したセファロースビーズに結合させたヒツジ抗−マ
ウスＩｇＧ［マーチ等（Ｍａｒｃｈ、Ｓ、Ｃ，、Ｐａｒ
ｋｉｎ、 １． ａｎｄ ＣｕａＬｒｅｃａｃａｓ、
Ｐ、 Ａｎａｌｙｔ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ６０．１
４９（１９７４））］ ２０μＱ０ Ｂ、室温の回転機で一晩インキユベートする。
を加える（３組）： １ 、 ４ 、４ ｐ９／ ｕ（ｌのＥＯＴＵＢＥ−目
’Ｉｎ基底状態Ｉｎ２５μＱ ２．２０．１Ｏ１５，２，５，１，２５，０６２３，０
，３１３，０，１５６，０，０８０，０，０４０，０，
０２０，またはＯμｔｉ／ｄの抗体希釈液（ＣＩＡ２５
５または誘導体）２５μＱ ３．１０％ウマ血清を含むＲＰＭＩ ５０μＱ４．２
０μＱが０．５μこのＡｂと結合するであろう濃度まで
希釈したセファロースビーズに結合させたヒツジ抗−マ
ウスＩｇＧ［マーチ等（Ｍａｒｃｈ、Ｓ、Ｃ，、Ｐａｒ
ｋｉｎ、 １． ａｎｄ ＣｕａＬｒｅｃａｃａｓ、
Ｐ、 Ａｎａｌｙｔ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ６０．１
４９（１９７４））］ ２０μＱ０ Ｂ、室温の回転機で一晩インキユベートする。
Ｃ，ウェルの内容物をガラスファイバー濾紙に吸引する
。
。
Ｄ、濾紙ディスクを切り取り、計測する。
Ｅ、結合した分画と抗体希釈液＃の関係をグラフにする
。
。
Ｆ、どの点く希釈液＃）が９０％の最大結合に等しいか
を決定する。
を決定する。
Ｇ、上記により決定した希釈液をスカッチャード検定に
用いる。
用いる。
■、スカッチャード検定
Ａ、９６ウエルの微ｆｆ１Ａ１定プレートに次の成分を
加える（３組）： １．４．４μｇ／μｍ２（７）ＥＯＴＬＩＢＥ−”’Ｉ
ｎ基底状態Ｉｎ２５μＱ； ２、上記１１−Ｂで調製した０、 ４ Ｏｎ９／ｕ（ｌ
および０．３６ｎ９／μｉ２の連続希釈のＥＯＴＵ［３
Ｅ−基底状態Ｉｎ２５μ１２：それぞれ１１種類の希釈
とＯの点により、ｌ Ｏｎ９／ウェル〜４．４０ｐ９／
ウエルと０の２４個の点が得られる；１０％ウマ血清を
含むＲＰＭＩで希釈； ３．１０％ウマ血清を含むＲＰＭＩ ２５μＱ；４、
目的の抗体２５μＱ（感度検定で測定した濃度）； ５、セファロースビーズと結合させたヒツジ抗−マウス
ＩｇＧ（感度曲線検定で用いたものと同じ）２０μＱ０ Ｂ、室温の回転機で一晩インキユベートする。
加える（３組）： １．４．４μｇ／μｍ２（７）ＥＯＴＬＩＢＥ−”’Ｉ
ｎ基底状態Ｉｎ２５μＱ； ２、上記１１−Ｂで調製した０、 ４ Ｏｎ９／ｕ（ｌ
および０．３６ｎ９／μｉ２の連続希釈のＥＯＴＵ［３
Ｅ−基底状態Ｉｎ２５μ１２：それぞれ１１種類の希釈
とＯの点により、ｌ Ｏｎ９／ウェル〜４．４０ｐ９／
ウエルと０の２４個の点が得られる；１０％ウマ血清を
含むＲＰＭＩで希釈； ３．１０％ウマ血清を含むＲＰＭＩ ２５μＱ；４、
目的の抗体２５μＱ（感度検定で測定した濃度）； ５、セファロースビーズと結合させたヒツジ抗−マウス
ＩｇＧ（感度曲線検定で用いたものと同じ）２０μＱ０ Ｂ、室温の回転機で一晩インキユベートする。
Ｃウェルの内容物をガラスファイバー濾紙に吸引する。
Ｄ、 ｉｌ１紙ディスクを切り取り、計測する。
Ｅ、結合／遊離のモル数に対して結合モル数をプロット
する。
する。
Ｆ３曲線の直線部分の直線回帰をとる：負の傾きがＫａ
である。
である。
実施例１２ ＳＶ４０エンハンサ−不含のクローニン
グシステムの構築 Ａ、プラスミドｐＳ Ｖ ２ｇｐｔ（Ｅ −）の構築プ
ラスミドｐＳ Ｖ ２ ｇｐｔ −Ｃｌａ（実施例４Ａ
３で構築）（約２０μＱ；１０μ９）を、水（２１μの
、反応績＃Ｉ液＃６（５μ１２）、制限酵素Ｐｖｕｌｌ
（２μのおよび制限酵素５ｐｈｌｌ（２μのと混合し、
３７°Ｃで２時間インキュベートした。次いで、反応混
合物を０，５％ＴＢＥゲル電気泳動にかけ、実質的に実
施例２Ｅ記載の方法に従ってＤＥＡＥ８１紙からＰｖｕ
ｌｌ／５ｐｈ１１消化ベクターフラグメントを精製した
。
グシステムの構築 Ａ、プラスミドｐＳ Ｖ ２ｇｐｔ（Ｅ −）の構築プ
ラスミドｐＳ Ｖ ２ ｇｐｔ −Ｃｌａ（実施例４Ａ
３で構築）（約２０μＱ；１０μ９）を、水（２１μの
、反応績＃Ｉ液＃６（５μ１２）、制限酵素Ｐｖｕｌｌ
（２μのおよび制限酵素５ｐｈｌｌ（２μのと混合し、
３７°Ｃで２時間インキュベートした。次いで、反応混
合物を０，５％ＴＢＥゲル電気泳動にかけ、実質的に実
施例２Ｅ記載の方法に従ってＤＥＡＥ８１紙からＰｖｕ
ｌｌ／５ｐｈ１１消化ベクターフラグメントを精製した
。
これら制限部位の３°突出末端を充填するために、Ｐ
ｖｕｌｌ／ Ｓ ｐｈｌｌ消化のｐＳ Ｖ ２ｇｐｔ−
Ｃ１ａベクター（約２０μＩ２）を、１ＯＸＴ４ボリメ
ラーセ緩衝液［７００ｍＭトリス（ｐＨ７，４）、ｌ
００ ｒ＠Ｍ ＭｇＣＱ、、５０ｍＭ ＤＴＴＩ（３μ
Ｑ、）、ｄＮＴＰＵ合物（各０５ｍＭのｄ Ａ Ｔ ｌ
）、ｄＴＴＰＳｄｃ′ｒＰ、ｄＧＴＰ、ｐＨ７，０）（
３μ１２）、水（３μρ）およびＴ４ＤＮＡポリメラー
ゼ（ＢＩＬＬ、Ｘｉμり；５Ｕ）と混合した。
ｖｕｌｌ／ Ｓ ｐｈｌｌ消化のｐＳ Ｖ ２ｇｐｔ−
Ｃ１ａベクター（約２０μＩ２）を、１ＯＸＴ４ボリメ
ラーセ緩衝液［７００ｍＭトリス（ｐＨ７，４）、ｌ
００ ｒ＠Ｍ ＭｇＣＱ、、５０ｍＭ ＤＴＴＩ（３μ
Ｑ、）、ｄＮＴＰＵ合物（各０５ｍＭのｄ Ａ Ｔ ｌ
）、ｄＴＴＰＳｄｃ′ｒＰ、ｄＧＴＰ、ｐＨ７，０）（
３μ１２）、水（３μρ）およびＴ４ＤＮＡポリメラー
ゼ（ＢＩＬＬ、Ｘｉμり；５Ｕ）と混合した。
得られた混合物を３７°Ｃで１５分間インキュベートし
たのち、７０°Ｃで１０分間加熱した。フェノール抽出
およびエタノール沈澱の後、ＤＮＡをＴＥ緩衝液（５μ
Ｑ）に再懸濁した。このＤＮＡフラグメント（約１ ｕ
Ｑ ；約５００ ｎｇ）を水（１０ｕ１２）、５Ｘライ
ゲーシヨン緩衝液（５μＱ）、１１００ｎ ΔＴＰ（２
μの、およびＴ４リガーゼ（２μＱ）と混合した。
たのち、７０°Ｃで１０分間加熱した。フェノール抽出
およびエタノール沈澱の後、ＤＮＡをＴＥ緩衝液（５μ
Ｑ）に再懸濁した。このＤＮＡフラグメント（約１ ｕ
Ｑ ；約５００ ｎｇ）を水（１０ｕ１２）、５Ｘライ
ゲーシヨン緩衝液（５μＱ）、１１００ｎ ΔＴＰ（２
μの、およびＴ４リガーゼ（２μＱ）と混合した。
室温で２時間インキュベートしたのち、実質上、実施例
２Ｅの方法に従って、ライゲーション混合物で大腸菌１
−Ｉ Ｂ ｌ ０１細胞を形質転換した。形質転換体か
らプラスミドＤＮＡを単離し、５Ｖ４Ｑエンハンサ−領
域の適切な約０．２ｋｂの欠失を示すプラスミドをプラ
スミドｐＳ Ｖ ２ ｇｐｔ（Ｅ −）と命名した。
２Ｅの方法に従って、ライゲーション混合物で大腸菌１
−Ｉ Ｂ ｌ ０１細胞を形質転換した。形質転換体か
らプラスミドＤＮＡを単離し、５Ｖ４Ｑエンハンサ−領
域の適切な約０．２ｋｂの欠失を示すプラスミドをプラ
スミドｐＳ Ｖ ２ ｇｐｔ（Ｅ −）と命名した。
Ｂ、プラスミドｐＳ Ｖ ２ ｎｅｏ（Ｅ ）の構築
５Ｖ４Ｑエンハンサ−を含んでいないプラスミド［）Ｓ
Ｖ ２ ｎｅｏも構築した。プラスミドｐＳ Ｖ ２
ｎｅ。
５Ｖ４Ｑエンハンサ−を含んでいないプラスミド［）Ｓ
Ｖ ２ ｎｅｏも構築した。プラスミドｐＳ Ｖ ２
ｎｅ。
Ｃｌａ（実施例８Ａで構築）（約２０ｕ（！；１０μ９
）を、実質的に上記と同様にして、反応緩衝液＃３中、
制限酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄｌｌｌで消化した。
）を、実質的に上記と同様にして、反応緩衝液＃３中、
制限酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄｌｌｌで消化した。
電気泳動にかけたのち、ネオマイシン耐性付与遺伝子を
含有する約２．３ｋｂのＨ１ｎｄｌｌｌ／ Ｂ ａｍＨ
ＩフラグメントをＤＥＡＥ８１紙から単離、精製した。
含有する約２．３ｋｂのＨ１ｎｄｌｌｌ／ Ｂ ａｍＨ
ＩフラグメントをＤＥＡＥ８１紙から単離、精製した。
同様に、プラスミドｐＳ Ｖ ２ｇｐｔ（Ｅ−）を、制
限酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄｌｌｌで消化し、電気
泳動にかけて大きいベクターフラグメントを精製した。
限酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄｌｌｌで消化し、電気
泳動にかけて大きいベクターフラグメントを精製した。
次いで、実質的に上記の方法に従ってプラスミドｐＳ
Ｖ ２ｎｅｏ −Ｃｌａの約２．３ｋｂ Ｈｉｎｄｌｌ
ｌ／ＢａｍＨＩｎｅｏ含有制限フラグメントをプラスミ
ドｐｓｖ２ｇｐｔ（Ｅ −）のＨ１ｎｄｌｌｌ／ Ｂ
ａｓＨＩ消化ベクターフラグメントとライゲートさせた
。大腸菌ＨＢＩＯ１細胞を形質転換し、プラスミドＤＮ
Ａを単離した後、プラスミドｐＳ Ｖ ２ｎｅｏ −Ｃ
Ｉａの約２．３ｋｂＨ１ｎｄｌｌｌ／ ＢａｍＨ１ｎｅ
ｏ含有フラグメントがプラスミドｐＳ Ｖ ２ｇｐＬ（
Ｅ−）ベクターの主骨格と結合してなるこれらのプラス
ミドをｐｓＶ２ｎｅｏ（Ｅ ）と命名した。
Ｖ ２ｎｅｏ −Ｃｌａの約２．３ｋｂ Ｈｉｎｄｌｌ
ｌ／ＢａｍＨＩｎｅｏ含有制限フラグメントをプラスミ
ドｐｓｖ２ｇｐｔ（Ｅ −）のＨ１ｎｄｌｌｌ／ Ｂ
ａｓＨＩ消化ベクターフラグメントとライゲートさせた
。大腸菌ＨＢＩＯ１細胞を形質転換し、プラスミドＤＮ
Ａを単離した後、プラスミドｐＳ Ｖ ２ｎｅｏ −Ｃ
Ｉａの約２．３ｋｂＨ１ｎｄｌｌｌ／ ＢａｍＨ１ｎｅ
ｏ含有フラグメントがプラスミドｐＳ Ｖ ２ｇｐＬ（
Ｅ−）ベクターの主骨格と結合してなるこれらのプラス
ミドをｐｓＶ２ｎｅｏ（Ｅ ）と命名した。
１、プラスミドｐＧＣＨＡＫ（Ｅ−）
プラスミドｐｓＶ２ｇｐｔ（Ｅ−）ＤＮＡ（約ｌＯμ９
１００μのを、水（４μの、反応緩衝１α＃１（１２μ
Ｑ）、制限酵素Ｃ１ａｌ（２μ（りおよび制限酵素Ｂａ
１ｌ＋−１１（２μρ）と混合し、３７℃で一夜インキ
ユベートした。ＤＥＡＥ８１紙に電気泳動した後、大き
いベクターフラグメントを精製し、ＴＥ（１０μ１２）
にｉｆｊ懸濁した。プラスミドｐＧ ＣＨＡ Ｋ （実
施例４Ｂで構築）（約２０μｇ；５μｇ）を水（２３μ
Ｑ）、反応緩衝液＃ｌ（５μ（り、制限酵素Ｃ１ａｌ（
２μＣ）と混合した。３７°Ｃて５時間経過した後、反
応混合物をフェノール／クロロホルム抽出し、エタノー
ル沈澱に付した。次いで、消化したＤＮＡを水（２５μ
Ｑ）に１５懸濁し、反応緩衝液＃３（３μのおよび制限
酵素Ｂ ａｍｉ（ｌ （２ｕＱ）と混合した。３７°Ｃ
で２時間インキュベートしたのち、消化ＤＮＡを電気泳
動にかけ、約９．０ｋｂの不ズミ可変、ヒト不変にをコ
ードしているＣ１ａｌ／ＢａｍＨＩ制限フラグメントを
ＤＥＡＥ８１紙から精製した。次いで、この約９．Ｏｋ
ｂフラグメントを上記のごとく、Ｃ１ａｌ／Ｂａａ＋Ｈ
Ｉ消化プラスミドｐＳ Ｖ ２ｇｐｔ（Ｅ−）とライゲ
ートさせ、大腸菌細胞に導入した。プラスミドを単離し
たのち、正しい制限地図を有するプラスミドをプラスミ
ドｐＧＣＥＭＫ（Ｅ−）と命名した。
１００μのを、水（４μの、反応緩衝１α＃１（１２μ
Ｑ）、制限酵素Ｃ１ａｌ（２μ（りおよび制限酵素Ｂａ
１ｌ＋−１１（２μρ）と混合し、３７℃で一夜インキ
ユベートした。ＤＥＡＥ８１紙に電気泳動した後、大き
いベクターフラグメントを精製し、ＴＥ（１０μ１２）
にｉｆｊ懸濁した。プラスミドｐＧ ＣＨＡ Ｋ （実
施例４Ｂで構築）（約２０μｇ；５μｇ）を水（２３μ
Ｑ）、反応緩衝液＃ｌ（５μ（り、制限酵素Ｃ１ａｌ（
２μＣ）と混合した。３７°Ｃて５時間経過した後、反
応混合物をフェノール／クロロホルム抽出し、エタノー
ル沈澱に付した。次いで、消化したＤＮＡを水（２５μ
Ｑ）に１５懸濁し、反応緩衝液＃３（３μのおよび制限
酵素Ｂ ａｍｉ（ｌ （２ｕＱ）と混合した。３７°Ｃ
で２時間インキュベートしたのち、消化ＤＮＡを電気泳
動にかけ、約９．０ｋｂの不ズミ可変、ヒト不変にをコ
ードしているＣ１ａｌ／ＢａｍＨＩ制限フラグメントを
ＤＥＡＥ８１紙から精製した。次いで、この約９．Ｏｋ
ｂフラグメントを上記のごとく、Ｃ１ａｌ／Ｂａａ＋Ｈ
Ｉ消化プラスミドｐＳ Ｖ ２ｇｐｔ（Ｅ−）とライゲ
ートさせ、大腸菌細胞に導入した。プラスミドを単離し
たのち、正しい制限地図を有するプラスミドをプラスミ
ドｐＧＣＥＭＫ（Ｅ−）と命名した。
２、プラスミドｐＧｃＨＡＧｌ（Ｅ−）同様に、プラス
ミドｐＮｃＩ（ＡＧＩ（実施例８Ａで構築）（約４０μ
Ｑ；５μｇ）を、水（３μｇ）、反応緩ｉｉ液＃ １
（５ｕＱ）、制限酵素Ｃ１ａｌ（２μｌりと混合した。
ミドｐＮｃＩ（ＡＧＩ（実施例８Ａで構築）（約４０μ
Ｑ；５μｇ）を、水（３μｇ）、反応緩ｉｉ液＃ １
（５ｕＱ）、制限酵素Ｃ１ａｌ（２μｌりと混合した。
３７°Ｃで５時間経過した後、反応混合物をフェ／−ル
／クロロホルム抽出し、エタノール沈澱に付した。次い
で、消化したＤＮＡを水（２６μのに再懸濁し、反応緩
衝液＃３（３μＱ）および、制限酵素ＢａｍＨＩ（１μ
のと混合した。３７°Ｃで２分間経過後、反応混合物（
１５μＱ）をとり、２５０μＭＥＤＴＡ（１μＩ２）と
混合した。３７°Ｃで５分間経過後、反応混合物の残余
（１５μＱ）をとり、２５０μＭＥＤ Ｔ Ａ （１μ
Ｑ）と混合した。このＢａｍ８１部分消化により、すべ
ての可能なＣｌａ Ｉ ／ Ｂ ａｎｔ−１１制限フラ
グメントが得られた。０．５％’「Ｂ Ｅゲル電気泳動
にかけたのち、約１２．７ｋｂのＣ１ａｌ／Ｉ３ａｍＨ
＋ （部分）制限フラグメントをＣｌａ Ｉ ／ Ｂ
ａｍＨＩ消化プラスミドルＳ Ｖ ２ｇｐｔ（Ｅ−）と
ライゲートさせ、大腸菌細胞に導入した。これらのプラ
スミドをプラスミドｐＣ；ＣＨＡＧ １（Ｅ−）と命名
した。
／クロロホルム抽出し、エタノール沈澱に付した。次い
で、消化したＤＮＡを水（２６μのに再懸濁し、反応緩
衝液＃３（３μＱ）および、制限酵素ＢａｍＨＩ（１μ
のと混合した。３７°Ｃで２分間経過後、反応混合物（
１５μＱ）をとり、２５０μＭＥＤＴＡ（１μＩ２）と
混合した。３７°Ｃで５分間経過後、反応混合物の残余
（１５μＱ）をとり、２５０μＭＥＤ Ｔ Ａ （１μ
Ｑ）と混合した。このＢａｍ８１部分消化により、すべ
ての可能なＣｌａ Ｉ ／ Ｂ ａｎｔ−１１制限フラ
グメントが得られた。０．５％’「Ｂ Ｅゲル電気泳動
にかけたのち、約１２．７ｋｂのＣ１ａｌ／Ｉ３ａｍＨ
＋ （部分）制限フラグメントをＣｌａ Ｉ ／ Ｂ
ａｍＨＩ消化プラスミドルＳ Ｖ ２ｇｐｔ（Ｅ−）と
ライゲートさせ、大腸菌細胞に導入した。これらのプラ
スミドをプラスミドｐＣ；ＣＨＡＧ １（Ｅ−）と命名
した。
ｌ、プラスミドｐＮＣＨＡＫ（Ｅ−）
実質上、実施例１２ｃ記載の方法に従い、ブラスミ ド
ｐＳＶ２ｎｅｏ（Ｅ−）ＤＮＡ（約１０ｕ９；１００μ
ｇ）を制限酵素Ｃ１ａｌおよびＢａｍＨＩで消化し、ベ
クターフラグメントを単離し、精製した。次いで、ネズ
ミλ可変、ヒト不変領域をコードしている遺伝子を含有
するプラスミドｐｃ ＣＨＡ Ｋ （実施例１２で単離
）の約９．０ｋｂ Ｃ１ａｌ／ＢａｍＨｌ制限フラグメ
ントを、実質上、実施例１２ｃ記載の方法に従い、プラ
スミドｐｓ Ｖ ２ ｎｅｏ（Ｅ−）のＣ１ａ１ ／
Ｂ ａｍＨＩ消化フラグメントにライゲートさせてプラ
スミドｐＮＣＨＡＫ（Ｅ−）を得た。
ｐＳＶ２ｎｅｏ（Ｅ−）ＤＮＡ（約１０ｕ９；１００μ
ｇ）を制限酵素Ｃ１ａｌおよびＢａｍＨＩで消化し、ベ
クターフラグメントを単離し、精製した。次いで、ネズ
ミλ可変、ヒト不変領域をコードしている遺伝子を含有
するプラスミドｐｃ ＣＨＡ Ｋ （実施例１２で単離
）の約９．０ｋｂ Ｃ１ａｌ／ＢａｍＨｌ制限フラグメ
ントを、実質上、実施例１２ｃ記載の方法に従い、プラ
スミドｐｓ Ｖ ２ ｎｅｏ（Ｅ−）のＣ１ａ１ ／
Ｂ ａｍＨＩ消化フラグメントにライゲートさせてプラ
スミドｐＮＣＨＡＫ（Ｅ−）を得た。
２、プラスミドｐＮｃＨＡＧ１（Ｅ−）また、実施例１
２ｃの記載に従い、プラスミドｐＮＣＨＡＧ１の約１２
．７ｋｂのＣｌａ ｌ ／ Ｂ ａｒａｌ（１（部分）
制限フラグメントをプラスミドｐｓＶ２ｎｅ。
２ｃの記載に従い、プラスミドｐＮＣＨＡＧ１の約１２
．７ｋｂのＣｌａ ｌ ／ Ｂ ａｒａｌ（１（部分）
制限フラグメントをプラスミドｐｓＶ２ｎｅ。
（Ｅ−）のＣ１ａｌ／Ｂａ１ＨＩ消化フラグメントニラ
イゲートすることによってプラスミドｐＮＣＨＡＧ（Ｅ
−）を構築した。従って、プラスミドｐＮＣＨＡＧ（Ｅ
−）はネズミ可変、ヒト不変γをコードする遺伝子をＳ
Ｖ４０エンハンサー不含発現ベクター上に含有している
。
イゲートすることによってプラスミドｐＮＣＨＡＧ（Ｅ
−）を構築した。従って、プラスミドｐＮＣＨＡＧ（Ｅ
−）はネズミ可変、ヒト不変γをコードする遺伝子をＳ
Ｖ４０エンハンサー不含発現ベクター上に含有している
。
実施例１３ ＳＶ４０エンハンサー不含ベクターによ
るキメラ軽鎖および重鎖遺伝子のトランスフェクション 実質上、実施例１０記載の方法に従い、２種類の軽鎖用
ＳＶ４０エンハンサー不含発現ベクター［ｐＧＣＨＡＫ
（Ｅ−）およびｐＮＣＨＡＫ（Ｅ−）］、ｆｆｆ［ｌ：
Ｓ Ｖ ４ Ｑエンハンサ−含有重鎖発現ベクター［ｐ
ＧＣＨＡＧｌおよびｐＮＣＨＡＧ１コを用い、電気穿孔
法でＳ Ｐ ２１０ハイブリドーマ細胞をトランスフェ
クションした。各プラスミドを単独で、あるいは同時に
細胞にトランスフェクションしてよいか、始めにに鎖と
ｇｐｔマーカーとを含有するベクターで細胞をトランス
フェクションし、次いてγ鎖とｎｅｏマーカーとを含有
するベクターで第２のトランスフェクションを行うと、
最良の結果が得られる。
るキメラ軽鎖および重鎖遺伝子のトランスフェクション 実質上、実施例１０記載の方法に従い、２種類の軽鎖用
ＳＶ４０エンハンサー不含発現ベクター［ｐＧＣＨＡＫ
（Ｅ−）およびｐＮＣＨＡＫ（Ｅ−）］、ｆｆｆ［ｌ：
Ｓ Ｖ ４ Ｑエンハンサ−含有重鎖発現ベクター［ｐ
ＧＣＨＡＧｌおよびｐＮＣＨＡＧ１コを用い、電気穿孔
法でＳ Ｐ ２１０ハイブリドーマ細胞をトランスフェ
クションした。各プラスミドを単独で、あるいは同時に
細胞にトランスフェクションしてよいか、始めにに鎖と
ｇｐｔマーカーとを含有するベクターで細胞をトランス
フェクションし、次いてγ鎖とｎｅｏマーカーとを含有
するベクターで第２のトランスフェクションを行うと、
最良の結果が得られる。
■請不含培地を包含する通常の補乳動物細胞培逐培地を
用いて培養し、適当な抗生物質（ｇｐｔベクター含有細
胞についてはＨＭΔＸ、ｎｅｏベク９−含有細胞につい
ては０４１８）を用いて選択した後、実質上、実施例１
０およびｌｌ記載の方法に従い、全抗体の分泌について
細胞を分析した。これらの結果から、キメラ抗体または
抗体軽鎖の発ＪＪＪｉｉＳＶ４０エンハンサー不含軽鎖
ベクターでトランスフェクションされた細胞において増
加することがわかる。
用いて培養し、適当な抗生物質（ｇｐｔベクター含有細
胞についてはＨＭΔＸ、ｎｅｏベク９−含有細胞につい
ては０４１８）を用いて選択した後、実質上、実施例１
０およびｌｌ記載の方法に従い、全抗体の分泌について
細胞を分析した。これらの結果から、キメラ抗体または
抗体軽鎖の発ＪＪＪｉｉＳＶ４０エンハンサー不含軽鎖
ベクターでトランスフェクションされた細胞において増
加することがわかる。
実施例１４ ヘテロローガスな免疫グロブリン鎖の発現
のための高レベル発現システムの構築Ａ、プラスミドｐ
ｉ ９ＨＡＮＣＨの構築始めに、式： で示されるＤＮＡ配列を有するオリゴスクレオチドポリ
リンカーを調製することにより、中間体プラスミドｐｉ
９ＨＡＮＣＨを構築した。上記のリンカ−は、当業者
周知の方法で１本鎖デオキシオリゴスクレオチドから合
成した。１本鎖デオキシオリゴスクレオチドは、バイオ
サーチ社［Ｂｉｏｓｅａｒａｈ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔ
ｅｄ、 Ｓａｎ Ｒａｐｈａｅｌ ＣＡ、］から市販の
バイオサーチ８７００型ＤＮＡ合成機のような、ホスホ
ラミ、ダイトの化学を利用する市販の装置を用いて合成
することができる。ＤＮＡ合成の池の方法も当業者には
既知である。１本ｊｊｌ Ｄ Ｎ Ａ合成のための、伝
統的な改良ホスホトリエステル法は、イタクラ等［１ｔ
ａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ、 、 ５ｃｉｅｎｃｅ、 １
９８：１０５６（１９７７）］およびクフレア［Ｃｒｅ
ａ ｅｔ ａｌ、＋ Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、
Ｓｃ ｉ、 ＵＳＡ、 ７５ ： ５７６５（１９７
ｇ）］により示されている。
のための高レベル発現システムの構築Ａ、プラスミドｐ
ｉ ９ＨＡＮＣＨの構築始めに、式： で示されるＤＮＡ配列を有するオリゴスクレオチドポリ
リンカーを調製することにより、中間体プラスミドｐｉ
９ＨＡＮＣＨを構築した。上記のリンカ−は、当業者
周知の方法で１本鎖デオキシオリゴスクレオチドから合
成した。１本鎖デオキシオリゴスクレオチドは、バイオ
サーチ社［Ｂｉｏｓｅａｒａｈ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔ
ｅｄ、 Ｓａｎ Ｒａｐｈａｅｌ ＣＡ、］から市販の
バイオサーチ８７００型ＤＮＡ合成機のような、ホスホ
ラミ、ダイトの化学を利用する市販の装置を用いて合成
することができる。ＤＮＡ合成の池の方法も当業者には
既知である。１本ｊｊｌ Ｄ Ｎ Ａ合成のための、伝
統的な改良ホスホトリエステル法は、イタクラ等［１ｔ
ａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ、 、 ５ｃｉｅｎｃｅ、 １
９８：１０５６（１９７７）］およびクフレア［Ｃｒｅ
ａ ｅｔ ａｌ、＋ Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、
Ｓｃ ｉ、 ＵＳＡ、 ７５ ： ５７６５（１９７
ｇ）］により示されている。
加えて、特に好ましいＤＮＡ合成法が、ヒスイング等［
１１ｓｕｉｎｇ ｅＬ ａｌ、、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
１ｄ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ １１：３２２７（１９８３）
］およびナラン等［Ｎａｒａｎｇ ｅｔ ａｌ、、 Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｒ＋ｚｙｍｏ１ｏｇｙ、６８：
９０（１９８Ｇ）］により開示されている。
１１ｓｕｉｎｇ ｅＬ ａｌ、、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
１ｄ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ １１：３２２７（１９８３）
］およびナラン等［Ｎａｒａｎｇ ｅｔ ａｌ、、 Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｒ＋ｚｙｍｏ１ｏｇｙ、６８：
９０（１９８Ｇ）］により開示されている。
２種類のオリゴヌクレオチド鎖（それぞれ、約２．５μ
（りを２×アニーリング緩衝液（０，２ＭＮａＣＱ、２
０ｍＭ トリス−ＨＣｆ！（ｐＨ７，８）、および２ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ）（５０μｆ２）および水（５０μ＆）
と混合した。反応混合物を７０’Ｃで５分間加熱したの
ち、２本の一本鎖がアニールして一本のリンカ−セグメ
ントとなるよう、室温まで徐々に放冷した。
（りを２×アニーリング緩衝液（０，２ＭＮａＣＱ、２
０ｍＭ トリス−ＨＣｆ！（ｐＨ７，８）、および２ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ）（５０μｆ２）および水（５０μ＆）
と混合した。反応混合物を７０’Ｃで５分間加熱したの
ち、２本の一本鎖がアニールして一本のリンカ−セグメ
ントとなるよう、室温まで徐々に放冷した。
プラスミドｐＵｃ１９にュー・イングランド・バイオラ
ブズ）（約１μｇ）を、実質上、既述の方法に従い、制
限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄｌｌｌで消化した。約
２．６ｋｂのベクターフラグメントを精製したのち、Ｅ
ｃｏＲｌ ／ Ｈ１ｎｄｌｌｌ消化プラスミドｐＵＣ１
９に合成ポリリンカーをライゲートさせた。
ブズ）（約１μｇ）を、実質上、既述の方法に従い、制
限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄｌｌｌで消化した。約
２．６ｋｂのベクターフラグメントを精製したのち、Ｅ
ｃｏＲｌ ／ Ｈ１ｎｄｌｌｌ消化プラスミドｐＵＣ１
９に合成ポリリンカーをライゲートさせた。
大腸菌を形質転換し、再度、プラスミドＤＮＡを単離し
た後、リンカ−領域内にＨｉｎｄｌｌｌ、５ｓｐｌ。
た後、リンカ−領域内にＨｉｎｄｌｌｌ、５ｓｐｌ。
Ｐｓｔ ｌ 、 ５ｓｔｌｌおよびＥｃｏＲ１部位を有
するプラスミドをプラスミドｐ１９ＨＡＮと命名した。
するプラスミドをプラスミドｐ１９ＨＡＮと命名した。
プラスミド５（−）ＣＨＡＶＬは、実質的に既述の方法
に従い、最初にＢ １ｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｍ１
３（−）ＳＫ（ストラタジーン）を制限酵素Ｂａ巾１１
Ｉおよび５ｓｔｌで消化し、大きいベクターフラグメン
トを単離して構築した。次いで、プラスミドｐＭＬＣＨ
−１を制限酵素ＢａｎＨＩおよび５ｓｔｌで消化し、ネ
ズミＣＩＡ可変領域をコードしている遺伝子を含有する
約１１００ｂｐのフラグメントを単離した。プラスミド
ｐＭＬｃＨｉは、／−イン・リージコナル・リサーチ・
ラボラトリ−（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ
Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、 １８１
５Ｎｏｒｔｈ Ｌｌｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ５ｔｒｅｅｔ
、 Ｐｅｏｒｉａ、 ＩＬ ６１６０４）に寄託され、
その永久保存カルチャーコレクションの一部を構成して
いる大腸菌Ｋ１２ ＨＢＩＯＩ／ｐＭＬｃＨ−１から常
法によって単離することができる。大腸菌Ｋ １２
ＨＢ １０１／ｐＭＬＣ）ｌｌは取得番号ＮＲＲＬ Ｂ
−１８４３２のもとて人手可能である。プラスミドｐＭ
ＬＣＨ−１の約１１００ｂｐ ＢａｍＨＩ／Ｓｓｔ！制
限フラグメントをＢ ａｍｌ−１１／ Ｓ ｓｔ Ｉ消
化ベクターＭ１３（−）ＳＫとライゲートさせ、得られ
たプラスミドを用い、実質上、上の実施例記載の方法に
従い、大腸菌を形質転換した。再単離および制限マツピ
ングの後、適正な約１１００ｂｐのＢａｍＨＩ／５ｓｔ
１７ラグメントを含有するプラスミドをプラスミド５（
−）ＣＨＡ Ｖ Ｌと命名した。
に従い、最初にＢ １ｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｍ１
３（−）ＳＫ（ストラタジーン）を制限酵素Ｂａ巾１１
Ｉおよび５ｓｔｌで消化し、大きいベクターフラグメン
トを単離して構築した。次いで、プラスミドｐＭＬＣＨ
−１を制限酵素ＢａｎＨＩおよび５ｓｔｌで消化し、ネ
ズミＣＩＡ可変領域をコードしている遺伝子を含有する
約１１００ｂｐのフラグメントを単離した。プラスミド
ｐＭＬｃＨｉは、／−イン・リージコナル・リサーチ・
ラボラトリ−（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ
Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、 １８１
５Ｎｏｒｔｈ Ｌｌｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ５ｔｒｅｅｔ
、 Ｐｅｏｒｉａ、 ＩＬ ６１６０４）に寄託され、
その永久保存カルチャーコレクションの一部を構成して
いる大腸菌Ｋ１２ ＨＢＩＯＩ／ｐＭＬｃＨ−１から常
法によって単離することができる。大腸菌Ｋ １２
ＨＢ １０１／ｐＭＬＣ）ｌｌは取得番号ＮＲＲＬ Ｂ
−１８４３２のもとて人手可能である。プラスミドｐＭ
ＬＣＨ−１の約１１００ｂｐ ＢａｍＨＩ／Ｓｓｔ！制
限フラグメントをＢ ａｍｌ−１１／ Ｓ ｓｔ Ｉ消
化ベクターＭ１３（−）ＳＫとライゲートさせ、得られ
たプラスミドを用い、実質上、上の実施例記載の方法に
従い、大腸菌を形質転換した。再単離および制限マツピ
ングの後、適正な約１１００ｂｐのＢａｍＨＩ／５ｓｔ
１７ラグメントを含有するプラスミドをプラスミド５（
−）ＣＨＡ Ｖ Ｌと命名した。
実質上、既述の方法に従い、プラスミド５（−）ＣＩ−
Ｉ Ａ Ｖ Ｌ （約１ ｎ）を制限酵素Ｐｓｔ［で消
化した。
Ｉ Ａ Ｖ Ｌ （約１ ｎ）を制限酵素Ｐｓｔ［で消
化した。
ネズミＣＦｌＡ可変領域をコードしている遺伝子を含有
する約９００ｂｐのＰｓｔｌ制限フラグメントを単離し
、制限酵素Ｐｓｔｌでポリリンカー領域に切断を施して
おいたプラスミドｐ１９ＨＡＮとライゲートさせた。形
質転換、再単離および制限マツピングにより、ポリリン
カーの１４ｉｎｄｌ１１部位に最も近接してＣＨＡ遺伝
子のＪ領域を含有しているプラスミドをプラスミドｐ１
９ＨＡＮｃＨと１１名した。プラスミドｐ１９１（ＡＮ
およびｐ１９ｆ（ＡＮＣＩ−１の制限部位および機能地
図を第５図に示す。
する約９００ｂｐのＰｓｔｌ制限フラグメントを単離し
、制限酵素Ｐｓｔｌでポリリンカー領域に切断を施して
おいたプラスミドｐ１９ＨＡＮとライゲートさせた。形
質転換、再単離および制限マツピングにより、ポリリン
カーの１４ｉｎｄｌ１１部位に最も近接してＣＨＡ遺伝
子のＪ領域を含有しているプラスミドをプラスミドｐ１
９ＨＡＮｃＨと１１名した。プラスミドｐ１９１（ＡＮ
およびｐ１９ｆ（ＡＮＣＩ−１の制限部位および機能地
図を第５図に示す。
ＡＫ−３の構築
発癌抗原と反応するネズミ可変に鎖をコードしている遺
伝子を含有するプラスミドｐＭＬＣＥ−１０（約１０ｕ
９）［ＡＴＣＣに１９８８年３月４日に寄託されており
、ＡＴＣＣ番号６７６３９のもとて人手可能である］を
制限酵素Ｈｉｎｄ［ＩＩで消化し、完全なネズミ可変に
領域およびＣＥＭプロモーターを含有する約３．８ｋｂ
のＨｉｎｄｌｌｌ制限フラグメントを単離した。また、
プラスミドｐＨＫＦ−１（約ｔｕ９）［ｆｔ１番号ＡＴ
ＣＣ６７６３７のもとテＡ′ｒ’ＣＣから人手可能］も
制限酵素１−１ｉｎｄｌｌｌで消化し、最も大きいベク
ターフラグメントを単離した。プラスミドｐＭＬＣＥ−
１０の約３．８ ｋｂ Ｈ１ｎｄｌｌ！フラグメントを
、プラスミドｐＨＫＦ−１のＨｉｎｄ１１！１肖化ベク
ターフラグメント１こライゲートしてプラスミドｐＨＫ
ＣＥ−１ｏを得た。次に、プラスミドｐＨＫＣＥ−ＩＱ
を制限酵素Ｃ１ａｌおよびＢａｍＨ［で消化し、にプロ
モーター、ネズミに可変領域およびヒト不変領域をコー
ドしている遺伝子を含有する約９．０ｋｂの制限フラグ
メントを申離した。この約９．０ｋｂのＣｌａ Ｉ ／
Ｂ ａｍ）−１１フラグメントを、Ｃ１ａｌ／Ｂａ＋
ｌ１ｔ（Ｉ消化したプラスミドｐＳ Ｖ ２ ｇｐｔ
−Ｃｌａ（実施例４Δ３で構築）にライゲートしてプラ
スミドｐＧＣＥＭＫを得た。
伝子を含有するプラスミドｐＭＬＣＥ−１０（約１０ｕ
９）［ＡＴＣＣに１９８８年３月４日に寄託されており
、ＡＴＣＣ番号６７６３９のもとて人手可能である］を
制限酵素Ｈｉｎｄ［ＩＩで消化し、完全なネズミ可変に
領域およびＣＥＭプロモーターを含有する約３．８ｋｂ
のＨｉｎｄｌｌｌ制限フラグメントを単離した。また、
プラスミドｐＨＫＦ−１（約ｔｕ９）［ｆｔ１番号ＡＴ
ＣＣ６７６３７のもとテＡ′ｒ’ＣＣから人手可能］も
制限酵素１−１ｉｎｄｌｌｌで消化し、最も大きいベク
ターフラグメントを単離した。プラスミドｐＭＬＣＥ−
１０の約３．８ ｋｂ Ｈ１ｎｄｌｌ！フラグメントを
、プラスミドｐＨＫＦ−１のＨｉｎｄ１１！１肖化ベク
ターフラグメント１こライゲートしてプラスミドｐＨＫ
ＣＥ−１ｏを得た。次に、プラスミドｐＨＫＣＥ−ＩＱ
を制限酵素Ｃ１ａｌおよびＢａｍＨ［で消化し、にプロ
モーター、ネズミに可変領域およびヒト不変領域をコー
ドしている遺伝子を含有する約９．０ｋｂの制限フラグ
メントを申離した。この約９．０ｋｂのＣｌａ Ｉ ／
Ｂ ａｍ）−１１フラグメントを、Ｃ１ａｌ／Ｂａ＋
ｌ１ｔ（Ｉ消化したプラスミドｐＳ Ｖ ２ ｇｐｔ
−Ｃｌａ（実施例４Δ３で構築）にライゲートしてプラ
スミドｐＧＣＥＭＫを得た。
実質上、上記の方法に従い、プラスミドｐＧＣ１３ＭＫ
（約５μ９）を制限酵素Ｃ１ａｌおよび５ｓｐｌで消化
し、ＣＥＭにプロモーターを含有する約２゜２ｋｌ）の
Ｃ１ａｌ／５ｓｐｌ制限フラグメントを精製した。
（約５μ９）を制限酵素Ｃ１ａｌおよび５ｓｐｌで消化
し、ＣＥＭにプロモーターを含有する約２゜２ｋｌ）の
Ｃ１ａｌ／５ｓｐｌ制限フラグメントを精製した。
別の反応で、プラスミドｐＧｃＥＭＫを制限酵素Ｃ１ａ
ｌおよび５ｓｔｌｌで消化し、約９．４ｋｂのベクター
フラグメントを単離した。さらに、プラスミドｐ１９Ｈ
ＡＮｃＨを制限酵素５ｓｐｌおよび５ｓｔ１１で消化し
、ネズミにＣＨＡ可変領域をコードする遺伝子を含有し
ている約９３１ｂｐの制限フラグメントを単離した。３
成分ライゲーンション反応により、プラスミドｐＧＣＥ
ＭＫの約９．４ｋｂＣｌａ Ｉ ／ Ｓ ５ｔｌｌベク
ターフラグメント、プラスミドｐＧＣＥＭＫのＯＥＭプ
ロモーター含有の約２゜２ｋｂ Ｃ１ａｌ／５ｓｐｌ制
限フラグメント、およびネズミにＣ）［Ａ可変領域をコ
ードする遺伝子を含有しているプラスミドｐ１９１−Ｉ
Ａ Ｎ Ｃ）ｌの約９３１ｂｐ Ｓｓｐ［／５ｓｔｌ
ｌ制限フラグメントのすべてを、実質的に既述の方法に
従い、−緒にしてライゲートさせ、大腸菌を形質転換し
た。プラスミドを単離し、制限マツピングに付した後、
制限フラグメントのサイズが適切であるプラスミドをプ
ラスミドｐｃ ＣＨＡ Ｋ −２と命名した。
ｌおよび５ｓｔｌｌで消化し、約９．４ｋｂのベクター
フラグメントを単離した。さらに、プラスミドｐ１９Ｈ
ＡＮｃＨを制限酵素５ｓｐｌおよび５ｓｔ１１で消化し
、ネズミにＣＨＡ可変領域をコードする遺伝子を含有し
ている約９３１ｂｐの制限フラグメントを単離した。３
成分ライゲーンション反応により、プラスミドｐＧＣＥ
ＭＫの約９．４ｋｂＣｌａ Ｉ ／ Ｓ ５ｔｌｌベク
ターフラグメント、プラスミドｐＧＣＥＭＫのＯＥＭプ
ロモーター含有の約２゜２ｋｂ Ｃ１ａｌ／５ｓｐｌ制
限フラグメント、およびネズミにＣ）［Ａ可変領域をコ
ードする遺伝子を含有しているプラスミドｐ１９１−Ｉ
Ａ Ｎ Ｃ）ｌの約９３１ｂｐ Ｓｓｐ［／５ｓｔｌ
ｌ制限フラグメントのすべてを、実質的に既述の方法に
従い、−緒にしてライゲートさせ、大腸菌を形質転換し
た。プラスミドを単離し、制限マツピングに付した後、
制限フラグメントのサイズが適切であるプラスミドをプ
ラスミドｐｃ ＣＨＡ Ｋ −２と命名した。
ＩＯの構築
上記の方法を用い、完全なＣＥＭ２３１．６．７可変に
領域を含有するプラスミドｐＭＬＣＥ−１０由来の３．
８ ｋｂ Ｈ１ｎｄｌｌｌフラグメントを、さらにプラ
スミドｐＨＫＦ−１のＨｉｎｄｌ１１部位にサブクロー
ニングして、ヒト不変に領域遺伝子に融合したネズミＯ
ＥＭ２３１．６．７可変軽領域を含有するキメラプラス
ミドを得た。反応緩衝液＃２（ギブコーＢＲＬ）を用い
、ｐＭＬＣＥ−１０ＤＮＡ（１μ９）を１単位／μ９の
Ｈｉｎｄ［ｌＩで消化した。ｐｉ（ＫＦｌ（１μｇ）を
同様にして消化した。既述のように、ｐＭＬＣＥ−１０
の消化ＤＮＡを電気泳動にかけ、３８ｋｂのＨｉｎｄｌ
ｌ！フラグメントをＤＥＡＥ８１紙上に単離し、ＴＥ（
５μＱ）中に溶出させた。この＋１ｉｎｄｌｌｌ消化し
たｐＭＬＣＥ−ｔｏ（ｌμｙ； １μＱ）を、ｌＯｘの
ライゲート緩衝液、ｉｏＩＩＩＭＡＴＰ。
領域を含有するプラスミドｐＭＬＣＥ−１０由来の３．
８ ｋｂ Ｈ１ｎｄｌｌｌフラグメントを、さらにプラ
スミドｐＨＫＦ−１のＨｉｎｄｌ１１部位にサブクロー
ニングして、ヒト不変に領域遺伝子に融合したネズミＯ
ＥＭ２３１．６．７可変軽領域を含有するキメラプラス
ミドを得た。反応緩衝液＃２（ギブコーＢＲＬ）を用い
、ｐＭＬＣＥ−１０ＤＮＡ（１μ９）を１単位／μ９の
Ｈｉｎｄ［ｌＩで消化した。ｐｉ（ＫＦｌ（１μｇ）を
同様にして消化した。既述のように、ｐＭＬＣＥ−１０
の消化ＤＮＡを電気泳動にかけ、３８ｋｂのＨｉｎｄｌ
ｌ！フラグメントをＤＥＡＥ８１紙上に単離し、ＴＥ（
５μＱ）中に溶出させた。この＋１ｉｎｄｌｌｌ消化し
たｐＭＬＣＥ−ｔｏ（ｌμｙ； １μＱ）を、ｌＯｘの
ライゲート緩衝液、ｉｏＩＩＩＭＡＴＰ。
およびＴ４ＤＮＡリガーゼ（２中位）の存在下、合計容
ｆｆ１ｌｏμ１２中で、Ｈｉｎｄｌｌｌ消化したｐＨＫ
Ｆｌ（６００ｎ９）にライゲートした。１２°Ｃで一
晩、ライゲートを行い、上記のように、ＢＲＬからのＨ
Ｂ １０１コンピテント細胞をプラスミド形質転換に用
いた。ｐＨＫＣＥ−１０と命名したこのプラスミドをプ
ラスミドＤＮＡの制限マツピングによって同定した。
ｆｆ１ｌｏμ１２中で、Ｈｉｎｄｌｌｌ消化したｐＨＫ
Ｆｌ（６００ｎ９）にライゲートした。１２°Ｃで一
晩、ライゲートを行い、上記のように、ＢＲＬからのＨ
Ｂ １０１コンピテント細胞をプラスミド形質転換に用
いた。ｐＨＫＣＥ−１０と命名したこのプラスミドをプ
ラスミドＤＮＡの制限マツピングによって同定した。
２）プラスミドｐＧＣＥＭＫ（Ｅ−）の構築プラスミド
ｐＳ Ｖ ２ｇｐｔ（Ｅ ）（約１０μ９：１００μ
Ｑ）を、水（４μＱ）、ギブコ反応緩衝液＃１（１２μ
０．）、制限酵素Ｃ１ａｌ（２μｇ）および制限酵素Ｂ
ａｍ１１１（２μＱ）と混合し、次いで３７°Ｃで一晩
インキュベートした。ＤＥＡＥ８１紙に電気泳動した後
、大きいベクターフラグメントを精製し、ＴＥ（１０μ
のに再懸濁した。プラスミドｐＨＫＣＥ−１０（約２０
μＱ；５μｇ）を、水（２３μの、ギブフ反応緩衝液＃
１（５μ１２）および制限酵素Ｃ１ａｌ（２μＣ）と混
合した。３７℃で５時間保った後、反応液をフェノール
／クロロホルムで抽出し、エタノール沈澱させた。次い
で、この消化ＤＮＡを水（２５μＱ）に再懸濁し、ギブ
コ反応緩衝液＃３（３μＱ）および制限酵素ＢａｍＨＩ
（２μ０と混合した。３７°Ｃで２時間インキュベー
トした後、消化されたＤＮＡを電気泳動にかけ、約９．
０ｋｂの不ズミ可変ヒト不変にをコードしているＣ１ａ
ｌ／ＢａｎＨ［制限フラグメントをＤＥＡＥ８１紙から
精製した。次に既述のようにして、この約９．０ｋｂの
フラグメントをＣ１ａｌ／ＢａｍＨＮ消化のプラスミド
ｐＳＶ２ｇｐｔ（Ｅ）にライゲートし、大腸菌細胞に導
入した。プラスミドを単離した後、正しい制限地図を有
するプラスミドをプラスミドｐｃｃＥＭＫ（Ｅ−）と命
名した。
ｐＳ Ｖ ２ｇｐｔ（Ｅ ）（約１０μ９：１００μ
Ｑ）を、水（４μＱ）、ギブコ反応緩衝液＃１（１２μ
０．）、制限酵素Ｃ１ａｌ（２μｇ）および制限酵素Ｂ
ａｍ１１１（２μＱ）と混合し、次いで３７°Ｃで一晩
インキュベートした。ＤＥＡＥ８１紙に電気泳動した後
、大きいベクターフラグメントを精製し、ＴＥ（１０μ
のに再懸濁した。プラスミドｐＨＫＣＥ−１０（約２０
μＱ；５μｇ）を、水（２３μの、ギブフ反応緩衝液＃
１（５μ１２）および制限酵素Ｃ１ａｌ（２μＣ）と混
合した。３７℃で５時間保った後、反応液をフェノール
／クロロホルムで抽出し、エタノール沈澱させた。次い
で、この消化ＤＮＡを水（２５μＱ）に再懸濁し、ギブ
コ反応緩衝液＃３（３μＱ）および制限酵素ＢａｍＨＩ
（２μ０と混合した。３７°Ｃで２時間インキュベー
トした後、消化されたＤＮＡを電気泳動にかけ、約９．
０ｋｂの不ズミ可変ヒト不変にをコードしているＣ１ａ
ｌ／ＢａｎＨ［制限フラグメントをＤＥＡＥ８１紙から
精製した。次に既述のようにして、この約９．０ｋｂの
フラグメントをＣ１ａｌ／ＢａｍＨＮ消化のプラスミド
ｐＳＶ２ｇｐｔ（Ｅ）にライゲートし、大腸菌細胞に導
入した。プラスミドを単離した後、正しい制限地図を有
するプラスミドをプラスミドｐｃｃＥＭＫ（Ｅ−）と命
名した。
３）同様の方法でプラスミドｐＧＣＥＭＫ（Ｅ〜）（実
施例１２ｃで構築）を制限酵素Ｃ１ａｌおよび５ｓｔｌ
ｌ−＋ｊｆ’ｉ化し、約９．２ｋｂの制限フラグメント
（ＳＶ４０エンハンサ−不含）を単離した。次いで、こ
のフラグメントを、プラスミドｐＧＣＥＭＫのＣＥＭに
プロモーターを含有する約２．２ｋｂＣ１ａ１／５ｓｐ
ｌ制限フラグメント、およびプラスミドｐ ｌ ９ ）
Ｉ Ａ Ｎ ＣＨの約９３１ｂｐ ５ｓｐｌ／５ｓｔｌ
ｌ制限フラグメントとライゲートさせて、プラスミドｐ
ｃ ＣＨＡ Ｋ−３を構築した。プラスミドｐＧＣ）（
ＡＫ−３とプラスミドｐＧＣＨＡＫ−２は、プラスミド
ｐｃ ＣＨＡ Ｋ−３が５Ｖ４Ｑエンハンサ−を欠如し
ている点でのみ異なる。プラスミドｐｃＣＨΔに−３の
制限部位および機能地図を第６図に示す。
施例１２ｃで構築）を制限酵素Ｃ１ａｌおよび５ｓｔｌ
ｌ−＋ｊｆ’ｉ化し、約９．２ｋｂの制限フラグメント
（ＳＶ４０エンハンサ−不含）を単離した。次いで、こ
のフラグメントを、プラスミドｐＧＣＥＭＫのＣＥＭに
プロモーターを含有する約２．２ｋｂＣ１ａ１／５ｓｐ
ｌ制限フラグメント、およびプラスミドｐ ｌ ９ ）
Ｉ Ａ Ｎ ＣＨの約９３１ｂｐ ５ｓｐｌ／５ｓｔｌ
ｌ制限フラグメントとライゲートさせて、プラスミドｐ
ｃ ＣＨＡ Ｋ−３を構築した。プラスミドｐＧＣ）（
ＡＫ−３とプラスミドｐＧＣＨＡＫ−２は、プラスミド
ｐｃ ＣＨＡ Ｋ−３が５Ｖ４Ｑエンハンサ−を欠如し
ている点でのみ異なる。プラスミドｐｃＣＨΔに−３の
制限部位および機能地図を第６図に示す。
実施例１５ ＣＥＭプロモーターを用いるヘテロロー
ガスなＣＨＡ抗体の発現 Ａ）実質上、実施例３記載の方法に従い、様々なＣＩ−
Ｉ Ａ構築物で５Ｐ２１０細胞をトランスフェクション
し、実質上、実施例４記載の方法に従い、抗体特異性お
よび親和性を測定した。Ｉ−Ｉ Ｍ Ａ Ｘを選択に用
いるプラスミドｐＧＣＨＡＫによる最初のトランスフェ
クション、およびｌ−Ｉ Ｍ Ａ ＸとＧ４１８の両者
を選択に用いるプラスミドｐＮ ＣＨＡＧｌによる第２
トランスフエクシヨンの結果、上清に低レベルのキメラ
ＣＨＡ抗体が分泌された。
ガスなＣＨＡ抗体の発現 Ａ）実質上、実施例３記載の方法に従い、様々なＣＩ−
Ｉ Ａ構築物で５Ｐ２１０細胞をトランスフェクション
し、実質上、実施例４記載の方法に従い、抗体特異性お
よび親和性を測定した。Ｉ−Ｉ Ｍ Ａ Ｘを選択に用
いるプラスミドｐＧＣＨＡＫによる最初のトランスフェ
クション、およびｌ−Ｉ Ｍ Ａ ＸとＧ４１８の両者
を選択に用いるプラスミドｐＮ ＣＨＡＧｌによる第２
トランスフエクシヨンの結果、上清に低レベルのキメラ
ＣＨＡ抗体が分泌された。
プラスミドｐｃ ＣＨＡ Ｋ −２による第１のトラン
スフェクションの後、プラスミドｐＮＣＨＡＧ１でトラ
ンスフェクションすることにより、高レベルの抗体産生
が認められた。このデータはプラスミドｐＧＣＥＭＫか
ら単離されたプロモーターがヘテロローガスな免疫グロ
ブリン配列を高レベルに発現させるのに有用であるとい
うことを示している。
スフェクションの後、プラスミドｐＮＣＨＡＧ１でトラ
ンスフェクションすることにより、高レベルの抗体産生
が認められた。このデータはプラスミドｐＧＣＥＭＫか
ら単離されたプロモーターがヘテロローガスな免疫グロ
ブリン配列を高レベルに発現させるのに有用であるとい
うことを示している。
Ｂ）さらに、ｐＧＣＨＡＫ−３によるトランスフェクシ
ョンの結果、ｐＧＣＨＡＫとｐＮＣＨＡＫによるトラン
スフェクションの１０倍高いレベルでに鎖が発現された
。従って、プラスミドｐＧＣＥＭＫ由来のＣＥＭＫにプ
ロモーターは、５Ｖ４Ｑエンハンサ−を欠如した最初の
発現ベクターよりち良１ｊｒにヘテロローガスな免疫グ
ロブリン配列を発現させることができる。
ョンの結果、ｐＧＣＨＡＫとｐＮＣＨＡＫによるトラン
スフェクションの１０倍高いレベルでに鎖が発現された
。従って、プラスミドｐＧＣＥＭＫ由来のＣＥＭＫにプ
ロモーターは、５Ｖ４Ｑエンハンサ−を欠如した最初の
発現ベクターよりち良１ｊｒにヘテロローガスな免疫グ
ロブリン配列を発現させることができる。
第１図は、プラスミドｐＭＬＣＨ−１およびｐＧＣ１ｌ
八にの制限部位および機能地図を示す模式図であり、 第２図は、プラスミドｐｌ−ＩＫＦ−１の制限部位およ
び機能地図を示す模式図であり、 第３図は、プラスミドｐＵＣＶＨＩｎｃ−ＩＡおよびｐ
ｉ−１ｃ；１２の制限部位および機能地図を示す模式図
であり、 第４図は、プラスミドｐＨＧｌ−ＣＨＡおよびｐＮｃｌ
ＩＡＧｌの制限部位および機能地図を示す模式図であり
、 第５図は、プラスミドｐｉ ９ＨＡＮおよびｐ１９ＨＡ
Ｎ Ｃ）［の制限部位および機能地図を示す模式第６
図は、プラスミドｐｃ ＣＨＡ Ｋ −３の制限部位お
よび機能地図を示す模式図である。 ＦＩＣ！ ＦＩＧ ２ ＦＩＧ ３ −にＩＩ
八にの制限部位および機能地図を示す模式図であり、 第２図は、プラスミドｐｌ−ＩＫＦ−１の制限部位およ
び機能地図を示す模式図であり、 第３図は、プラスミドｐＵＣＶＨＩｎｃ−ＩＡおよびｐ
ｉ−１ｃ；１２の制限部位および機能地図を示す模式図
であり、 第４図は、プラスミドｐＨＧｌ−ＣＨＡおよびｐＮｃｌ
ＩＡＧｌの制限部位および機能地図を示す模式図であり
、 第５図は、プラスミドｐｉ ９ＨＡＮおよびｐ１９ＨＡ
Ｎ Ｃ）［の制限部位および機能地図を示す模式第６
図は、プラスミドｐｃ ＣＨＡ Ｋ −３の制限部位お
よび機能地図を示す模式図である。 ＦＩＣ！ ＦＩＧ ２ ＦＩＧ ３ −にＩＩ
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、キメラモノクローナル抗体のキレート特異的な軽鎖
可変領域をコードしている第１のＤＮＡ配列が、次の配
列： 【遺伝子配列があります】 からなるアミノ酸配列をコードしていることを特徴とす
る、該第１のＤＮＡ配列を含有する組換えＤＮＡ化合物
。 ２、第１のＤＮＡ鎖暗号配列が、次の配列：【遺伝子配
列があります】 を含有している請求項１記載の組換えＤＮＡ化合物。 ３、第１のＤＮＡ暗号配列が真核性シグナルペプチドを
コードしているＤＮＡ配列をさらに含有している請求項
１または２記載の組換えＤＮＡ化合物。 ４、ＤＮＡ構築物がキメラモノクローナル抗体の軽鎖不
変領域をコードしている第２のＤＮＡ鎖配列をさらに含
有している請求項１、２または３のいずれかに記載の組
換えＤＮＡ化合物。 ５、シグナルペプチドをコードしているＤＮＡ鎖配列が
、次の配列： 【遺伝子配列があります】 からなる請求項３記載の組換えＤＮＡ化合物。 ６、キメラモノクローナル抗体のキレート特異的な重鎖
可変領域をコードしている第１のＤＮＡ配列が、次の配
列： 【遺伝子配列があります】 からなるアミノ酸配列をコードしていることを特徴とす
る、該第１のＤＮＡ配列を含有する組換えＤＮＡ化合物
。 ７、第１のＤＮＡ鎖暗号配列が、次の配列：【遺伝子配
列があります】 を含有している請求項６記載の組換えＤＮＡ化合物。 ８、第１のＤＮＡ暗号配列が真核性シグナルペプチドの
ＤＮＡ配列をさらに含有している請求項６または７記載
の組換えＤＮＡ化合物。 ９、ＤＮＡ構築物がキメラモノクローナル抗体の重鎖不
変領域をコードしている第２のＤＮＡ鎖配列をさらに含
有している請求項６、７または８のいずれかに記載の組
換えＤＮＡ化合物。 １０、シグナルペプチドをコードしているＤＮＡ鎖配列
が、次の配列： 【遺伝子配列があります】 からなる請求項８記載の組換えＤＮＡ化合物。 １１、第１のＤＮＡ鎖暗号配列がネズミハイブリドーマ
から導かれたものである請求項１〜１０のいずれかに記
載の組換えＤＮＡ化合物。 １２、ネズミハイブリドーマがＣＨＡ２５５．５である
請求項１１記載の組換えＤＮＡ化合物。 １３、第２のＤＮＡ鎖暗号配列がヒトリンパ細胞から導
かれたものである請求項４または８記載の組換えＤＮＡ
化合物。 １４、第１図記載のプラスミドｐＭＬＣＨ−１または第
１図記載のプラスミドｐＭＬＣＨ１ｄＢである請求項１
または２記載の組換えＤＮＡ化合物。 １５、第３図記載のプラスミドｐＵＣＶＨＩｎｃ−１Ａ
である請求項６または７記載の組換えＤＮＡ化合物。 １６、第１図記載のプラスミドｐＧＣＨＡＫである請求
項４記載の組換えＤＮＡ化合物。 １７、第４図記載のプラスミドｐＨＧ１−ＣＨＡまたは
第４図記載のプラスミドｐＮＣＨＡＧ１である請求項８
記載の組換えＤＮＡ化合物。 １８、キメラモノクローナル抗体の軽鎖をコードしてい
る請求項１〜５のいずれかに記載の組換えＤＮＡ化合物
と、軽鎖が発現されるよう軽鎖をコードしているＤＮＡ
配列と関連させて設置した転写および翻訳用ＤＮＡ配列
を含有していることを特徴とする、キメラモノクローナ
ル抗体を発現させ得る真核宿主細胞。 １９、キメラ抗体の重鎖をコードしている請求項６〜１
０のいずれかに記載の化合物と、重鎖が発現されるよう
重鎖をコードしているＤＮＡ鎖配列と関連させて設置し
た転写および翻訳用ＤＮＡ配列を、第２の組換えＤＮＡ
化合物が含有しているか、または第１の組換えＤＮＡ化
合物がさらに含有している請求項１８記載の真核宿主細
胞。 ２０、次の配列： 【遺伝子配列があります】 からなるアミノ酸配列を有する第１の哺乳動物種由来の
キレート特異的な軽鎖可変領域と、第２の別種哺乳動物
種由来の不変領域を含有していることを特徴とするキメ
ラモノクローナル抗体。 ２１、次の配列： 【遺伝子配列があります】 からなるアミノ酸配列を有する第１の哺乳動物種由来の
キレート特異的な重鎖可変領域と、第２の別種哺乳動物
種由来の不変領域を含有していることを特徴とするキメ
ラモノクローナル抗体。 ２２、請求項２０記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変
領域と、請求項２１記載のアミノ酸配列を有する重鎖可
変領域を含有しているキメラモノクローナル抗体。 ２３、鎖の可変領域がネズミハイブリドーマから導かれ
たものである請求項２０、２１または２２のいずれかに
記載のキメラモノクローナル抗体。 ２４、ネズミハイブリドーマがＣＨＡ２５５．５である
請求項２３記載のキメラモノクローナル抗体。 ２５、抗体の不変領域がヒトリンパ細胞から導かれたも
のである請求項２０〜２４のいずれかに記載のキメラモ
ノクローナル抗体。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US27410688A | 1988-11-17 | 1988-11-17 | |
| US274106 | 1988-11-17 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02145186A true JPH02145186A (ja) | 1990-06-04 |
Family
ID=23046796
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1057674A Pending JPH02145186A (ja) | 1988-11-17 | 1989-03-08 | 金属キレートに指向性のキメラ抗体 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0369567A3 (ja) |
| JP (1) | JPH02145186A (ja) |
| AU (1) | AU608952B2 (ja) |
| DK (1) | DK108489A (ja) |
| IL (1) | IL89490A0 (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL89489A0 (en) * | 1988-03-09 | 1989-09-10 | Hybritech Inc | Chimeric antibodies directed against human carcinoembryonic antigen |
| IL89491A0 (en) * | 1988-11-17 | 1989-09-10 | Hybritech Inc | Bifunctional chimeric antibodies |
| US5532136A (en) * | 1993-06-22 | 1996-07-02 | Bionebraska, Inc. | Monoclonal antibody assay and kit for detecting metal cations in body fluids |
| WO2003048207A2 (en) * | 2001-11-28 | 2003-06-12 | Immunomedics, Inc. | Anti-dota antibody |
| CN108387537A (zh) * | 2018-02-01 | 2018-08-10 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 | 一种重金属离子的定量检测方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4722892A (en) * | 1984-08-31 | 1988-02-02 | Meares Claude F | Monoclonal antibodies against metal chelates |
| US4975369A (en) * | 1988-04-21 | 1990-12-04 | Eli Lilly And Company | Recombinant and chimeric KS1/4 antibodies directed against a human adenocarcinoma antigen |
| AU643189B2 (en) * | 1988-09-06 | 1993-11-11 | Xoma Corporation | Production of chimeric mouse-human antibodies with specificity to human tumor antigens |
| IL89491A0 (en) * | 1988-11-17 | 1989-09-10 | Hybritech Inc | Bifunctional chimeric antibodies |
-
1989
- 1989-03-06 IL IL89490A patent/IL89490A0/xx unknown
- 1989-03-07 AU AU31073/89A patent/AU608952B2/en not_active Ceased
- 1989-03-07 DK DK108489A patent/DK108489A/da not_active Application Discontinuation
- 1989-03-08 JP JP1057674A patent/JPH02145186A/ja active Pending
- 1989-03-08 EP EP19890302314 patent/EP0369567A3/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IL89490A0 (en) | 1989-09-10 |
| AU608952B2 (en) | 1991-04-18 |
| DK108489D0 (da) | 1989-03-07 |
| EP0369567A3 (en) | 1991-10-23 |
| EP0369567A2 (en) | 1990-05-23 |
| DK108489A (da) | 1990-05-18 |
| AU3107389A (en) | 1990-05-24 |
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