JPH02145186A - 金属キレートに指向性のキメラ抗体 - Google Patents

金属キレートに指向性のキメラ抗体

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JPH02145186A
JPH02145186A JP1057674A JP5767489A JPH02145186A JP H02145186 A JPH02145186 A JP H02145186A JP 1057674 A JP1057674 A JP 1057674A JP 5767489 A JP5767489 A JP 5767489A JP H02145186 A JPH02145186 A JP H02145186A
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JP
Japan
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dna
sequence
plasmid
recombinant dna
chimeric
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Application number
JP1057674A
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Inventor
Mary Jacqueline Johnson
メアリー・ジャクリン・ジョンソン
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Hybritech Inc
Original Assignee
Hybritech Inc
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Publication date
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    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K16/00Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/461Igs containing Ig-regions, -domains or -residues form different species
    • C07K16/462Igs containing a variable region (Fv) from one specie and a constant region (Fc) from another
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered

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  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 [産業上の利用分野] 本発明は、金属キレートに特異的なキメラモノクローナ
ル抗体、並びに該抗体をコードしている組換えDNA化
合物およびベクターに関する。
[従来の技術] モノクローナル抗体は、インビトロにおいては免疫検定
(イムノアッセイ)での利用、インビボにおいては疾患
の診断および治療にますますその重要性を増しつつある
。EDTAのアミノベンジル誘導体の金属キレートに指
向性であるモノクローナル抗体は、結腸直腸癌や乳癌な
どのある種の癌について行われるインビボでの腫瘍のイ
メージングおよび治療に特に有用である。
しかし、利用可能なモノクローナル抗体の大部分はネズ
ミ、即ちマウスのハイブリドーマから得られる。インビ
トロの免疫検定においてネズミ抗体を適用すると、血清
成分とネズミ免疫グロブリンの反応に起因する偽陽性に
関連した問題が起こる可能性がある。さらに重要なこと
は、ネズミ抗体のヒト医薬としてのインビボ適用はその
固有の免疫原性により制限されることが多いということ
である。ネズミ抗体の投与は、多数の患者において免疫
応答を誘導し、多数回の投与処方の間に抗体の効果が徐
々に減少してしまう。この効果の減少の少なくとも一部
は、患者の免疫応答によるネズミ抗体の薬物動態学的性
質の変化、または循環系からの迅速なりリアランス(清
掃)に帰することかできる。従って、ネズミモノクロー
ナル抗体に付随する免疫原性は、長期的な多数回投与を
妨げ、実質的にはその可能性ある臨床的価値に打撃を与
える。
ヒトモノクローナル抗体を臨床使用すると、ネズミモノ
クローナル抗体の使用に付随する制限が克服されるであ
ろうことが示唆されていた。しかし、抗原およびハプテ
ンに対して所望の特異性および親和性を有するヒトモノ
クローナル抗体を製造することは技術的に困難である。
ある種から導かれた抗体の結合または可変領域が別の種
から導かれた抗体の不変領域と結合しているキメラ抗体
が、組換えDNA法で構築されている。キメラ抗体は、
例えば次の文献に記載されている;欧州特許公開第17
3494号;ショウら(Shaw)、ジャーナル・オブ
・イムノ、(J、Imnun、)、138:4534(
1987);サンら(:コuOL、に、)、プロシーデ
ィングズ・オブ・す、・1ナル・アカデミ−・オブ・サ
イエンシイズ(P rocNatl、Acad、Sci
、  USA)、84:214 21.8 (1987
);ニューバーガーら(N euberger。
M、S、)、ネイチャー(Nature)、314:2
68(1985) ;ブリアンら(B ouliann
e、 G 、 L 、 )、ネイチャー、312:64
3−646(1984);およびモリソンら(Morr
ison、 S 、 L 、 )、プロシーデイングズ
・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシイ
ズ、81:6851−6855(1984)。通常は、
ネズミ抗体の可変領域とヒト抗体の不変領域とが結合さ
れている。そのようなキメラ抗体の大部分はヒト成分で
あるために、実質上、ネズミ抗体よりも免疫原性が低い
と考えられる。従って、インビボでの適用にはキメラモ
ノクローナル抗体が極めて望ましい。
[発明が解決しようとする課題] キメラ抗体に関する一般的な概念は記載されているが、
その一方で、興味ある予め決めた金属キレートハプテン
、特にp−アミ/ベンジルEDTA゛ド4−り金属錯体
に対する特異t/l  ”上びはっきりど分かった(定
戊された)アミ7版配グ!域をr了する新規なキメラモ
ノクローナル抗体を開発することが、ヒトの治療および
腫瘍のイメージングに必要とされている。さらに、新規
なキメラ抗体を構成する軽鎖および重鎖可変領域のため
の定義されたDNA暗号配列を有するDNA構築物であ
って、真核細胞内でこれら新規なキメラタンパク質を発
現することができるDNA構築物の開発が要望されてい
る。本発明は、これらの要望に応えるものである。
本発明は、特許請求の範囲および後記の詳細な説明に記
載したように、キメラモノクローナル抗体、並びに該抗
体をコードしている組換えDNA化合物およびベクター
に関する。これらのキメラ抗体は、EDTA(エチレン
ジアミン四酢酸)の金属キレート錯体(本明細書中では
、「金属ハブテン錯体」、「錯体ハブテン」、「金属ハ
ブテン」または単に「キレート」と記す)に対して特異
性を示す:キレートは、L−またはD−p−アミノベン
ジルEDTAが好ましく、L−またはD−p−アミノベ
ンジルEDTAのインジウム(III)キレートが最も
好ましい。金属錯体は、治療用およびイメージング用の
放射性核種の金属イオンを含んでいる。本抗体の可変領
域は、リアダン等[D、 T、Reardan et 
al、、 Nature、 316. 265−268
(1985)コおよびメアレス等[C,FJeares
 et al、 ;米国特許No、4゜722、892
 ; 1988年2月2日発行]が記載しているネズミ
抗体CHA255.5から得られる。また、CHA25
5.5可変領域中のアミノ酸配列が変異した変異体が、
ネズミCHA255.5可変領域が金属錯体ハブテンに
対して有しているのとほぼ同じ結合特異性を有している
ときには、そのような変異体は本抗体に包含される。
本明細書中に開示した本発明のために、以下の短縮表示
を定義する。
(以下、余白) アミノ酸 アラニン アルギニン アスパラギン アスパラギン酸 /スティン グルタミン酸 グルタミン グリシン ヒスチジン イソロインン ロイシン リジン メチオニン フェニルアラニン プロリン セリン トレオニン トリブトファン チロシン バリン 核  酸 デオキシアデニル デオキソグアニル デオキシシチジル チミジル 三文字短縮表示 la rg sn sp ys lu ly is 1e eu ys et he Pr。
et hr rp yr al 第1図は、プラスミドpMLCH−1およびpcCHA
Kの制限部位および機能地図を示す模式図であり、プラ
スミドpMLcH1dBを指す文字とともに示すもので
ある(本発明を開示する目的で挙げた図面は、すべて、
正確な尺度では描かれていない)。
第2図は、プラスミドpHKF−1の制限部位および機
能地図を示す模式図である。
第3図は、プラスミドpUCVHInc−IAおよびp
HGfZの制限部位および機能地図を示す模式図である
第4図は、プラスミドpHGl−CHAおよびpNcH
AGtの制限部位および機能地図を示す模式図である。
第5図は、プラスミドpi 9HANおよびp19HA
NCHの制限部位および機能地図を示す模式第6図は、
プラスミドpGCHAK−3の制限部位および機能地図
を示す模式図である。
[課題を解決するための手段] 本発明の第1の態様は、第1の哺乳動物種由来のキレー
ト特異的な可変領域と、第2の別種哺乳動物種由来の不
変領域からなるキメラ抗体軽鎖をコードしているDNA
を含有する組換えDNA化合物であって(rDNA軽鎖
化合物」)、該軽鎖可変領域が、次の配列: Gin Ala Val Val Thr Gin G
lu Ser Ala Leu Thr Thr Se
r Pro Gly Glu ThrVal Thr 
Lau Thr Cys Arg Ser Set T
hr Gly^la Val Thr Thr Ser
^in TyrAla Asn Trp Val Gi
n Glu Lys Pro Asp His Lau
 I’h@Thr Gly Leu Ile (Fly
Gly Thr Asn Asn Arg Ala i
’ro Gly Val I’ro Ala Arg 
Plv Ser Gly Ser LeuIIs  G
ly  Asp  Lys  Ala  Ala  L
eu  Thr  Ile  Thr  Gly  A
la  Gin Thr  Glu Asp  Glu
Ala Arg Tyr Phe Cys Ala L
eu Trp Tyr Ser Asn Leu Tr
p Val Phe Gly GlyGly Thr 
Lys Leu Thr Valシu Glyからなる
アミノ酸配列を有している組換えDNA化合物である。
また、DNA軽鎖化合物をコードしている組換えDNA
化合物であって(「軽鎖解読鎖」)、軽鎖可変領域の解
読鎖が、次の配列: CAG GCT GT’r GTG ACT CAG 
GAA TCT GCA CTCACCACA TCA
 CCT GGT GM ACAGTCACA CTC
ACA Ti CGCTCA AGT ACT GGG
 GCT GTr ACA ACT AGT AACT
ATGCCAACTGG GTCCAA GAA AA
A CCA OAT CAT TrA TTCACT 
GGT CTA ATA ac’rGCT ACCAA
T AACCGG GCT CCA GGT GTT 
CCT GCCAGA TrCTCA GCCTCCl
’rGATT GGA GACAAG GCT GCC
CTCACCATCACA GGG GCA CAG 
ACT GAA GAT GAGGCA AGA TA
T TrCTGT GCT CTA TGG TACA
GCAACCTCTGG (TA TrCG[T CG
AGGA ACCAAA CTCACT GTCCTA
 G(iGからなる組換えDNA化合物も本発明に含ま
れる(DNA塩基が対になる相捕性の性質により、2本
鎖1) N A分子の一方の配列は他方の配列を決める
のに十分である;従って、本開示ではDNA配列の解読
鎖のみを表示する)。
上記DNA軽鎖化合物のさらに別の変異体は、第1の哺
乳動物種由来のキレート特異的な可変領域およびシグナ
ルペプチドと、第2の別種哺乳動物種由来の不変領域か
らなるキメラ抗体軽鎖をコードしているDNAを含有す
る組換えDNA化合物であって、該軽鎖可変領域および
シグナルペプチドが次の配列: Met^la Trp Ila Set Leu Il
a Leu Sar Leu Leu^la Lau 
Sar Sar O1y^1烏11a !3er Gl
uAla Val Val Thr Gin Glu 
9er Ala Leu Thr Thc!jar P
ro GLyGlu  Thr  Vat  The 
 Lau  The  Cys  Arc  Ser 
 Sat  The  Oly  Alm  Val 
 Thr  Thr  5er^釦 丁yr Aim 
 Amn Trp  VaL  Gln  Glu  
Lye  f’ro Asp  1(is  Lau 
 Ph@ Thr Oly  Laulle  Gly
  GLy Thr  Amn  Asn  Arg 
 Alm  Pea  C1y  Val  Pro 
 Ala  ^r怠 Pha !Jet  GlySe
r  Leu  Ila  C11y  Asp  L
ys  Ale  Alm  Leu  Thr  I
la  Thr  Oly  Alm  Gin  T
hr  O1u^sp GluAla Arl Tyr
 Pha Cya Ale E、eu Trp ’ry
r !lar^an Leu↑rp Vaj PhaG
ly  Gly  Gly  Thr  Lye  L
au Thr  Val  Leu  Olyからなる
アミノ酸配列を有している組換えDNA化合物である。
また、上記のDNA軽鎖化合物変異体の解読鎖である組
換えDNA化合物であって、シグナルペプチドと軽鎖可
変領域の解読鎖が次の配列:ATO(iCCToe A
Tr TCA CTT ATA CTCTCT CTC
CTCGCT CTCAGCTCA(icT GCCA
T’r TCCCAG (icT GTT (i’ro
 AcrCAG GAA TCT GCA CTCAc
e^C^TC^cc’r catCM ACA CTC
ACA CTCACT TOT CC1CTCA AG
T ACT OGo GCT (7? AC^MゴAG
’TAACTAT GCCMCTOOGTCCAA (
iAA AAA CCA G^TC^7?7^’rrc
^CT GOT CTAATA CGT GCT AC
CMT AACCOOGCT CCA にCCT (X
TT CCT GCCAOA frc TCAG(iC
TCCCTCATT CGA GACAAG CCT 
(ice CTCACCATCACA GGG GCA
 CAOACT CAAGAT  GAG  GCA 
 All;A  TAT TTC丁GT CCT  C
TA  TGG TACAGCAACCTCTGiG 
 G’TA  ’ITCGG?  CGA  GOA 
 ACCAAA  CTCAIIT にTCCTA  
000からなる組換えDNA化合物も本発明の−・部で
ある。
」二足のDNA軽鎖化合物、軽鎖解読鎖、またはそれら
のシグナルペプチド含有度”X41本の好ましい態様を
以下に挙げる; a)第1の哺乳動物種由来のキレート特異的な軽鎖可変
領域が不ズミハイブリドーマから得られたものである、
組換えDNA軽鎖化合物、解読鎖、またはそのシグナル
ペプチド含有変異体;b)第2の別種哺乳動物種由来の
不変領域がヒト供給源から得られたものである、a)の
組換えDNAベクター C)第2の別種哺乳動物種由来の不変領域がヒト供給源
から得られたものであり、かつ該不変領域がヒトに軽鎖
から取られたちのである、b)の組換えDNAベクター d)不ズミハイブリドーマ由来のキレート特異的な軽鎖
可変領域のプロモーターであって、不ズミハイブリドー
マ中の該遺伝子を発現させるものと同じプロモーターを
さらに含有している、C)の組換えDNAベクター; e)原核微生物におけるクローニングヘクターとして月
1いるのに適した、d)の組換えDNAベクI″)(1
核生物<+n胞中て該1〕二匂Aを発現ご(1う設置し
た翻訳活性化配列およびプロモーターをさらに含有する
、d)の組換えDNAベクター;g)プラスミドpsV
2gpLまたはps V 2 neoから導かれた、r
)の組換えDNAベクター;およびh)プラスミドpG
CHAKまたはpNCHAKである、g)の組換えDN
Aベクター 本発明に関しては、「キメラ抗体」という語句は、第1
の哺乳動物種由来のキレート特異的な可変領域と第2の
別種哺乳動物種由来の不変領域からなる抗体を指す。従
って、本発明のキメラ抗体は、キレートに対する特異性
を有する可変領域と、天然にはこの可変領域に伴われな
い予め決めた構造的および生理学的性質を有する不変領
域をコードしている融合遺伝子の産物である。
本発明の第2の態様は、第1の哺乳動物種由来のキレー
ト特異的な可変領域と、第2の別種哺乳動物種由来の不
変領域からなるキメラ抗体重鎖をコードしているDNA
を含有する組換えDNA化合物であって、該重鎖可変領
域が、次の配列:Glu  Val  Thr  Le
u  Val  Glu  Ser  GLy  Gl
y Asp  Sir Val  Lys  Pro 
 Gly  Gly  5erLau Lys Lsu
 Ser Cyg Ala Ala Ser Gly 
Pha Thr Lau Ser Gly Glu T
hr Me15er Trp Val Arg Gln
 Thr E’ro Glu Lys Arg TAu
 Glu Trp Val Ala Thr ThrL
eu Sar (ily Gly Oly Pha T
hr Phe Tyr Ser Ala Ser Va
l Lys Gly Arg −PheThr ILe
 Sar Arg Asp Asn^la Gin A
sn Asn Leu Tyr Leu Gin La
u Asn 5erLau Arg Ser Glu 
Asp Thr Ala Leu Tyr Phe C
ys Ala Ser His^rg PheνaLH
is Trp Gly His Oly Thrムu 
Val Thr V社Ser Ala^1aからなるア
ミノ酸配列を有している組換えDNA化合物である(こ
の態様を、rDNADNA重鎖化合物ぶ)。
また、DNA重鎖化合物の一部として含まれるのは、重
鎖可変領域の解読路が、次の配列:CM GTG AC
OCTG (TCGACTCT GGG GGA GA
CTCA GTG AAG CCT GGA GGG 
TCCCTG AAA CTCTCC賀* GCA G
CCTCT GGA TrCACT TrA AGT 
GGT GAA ACCATGTCT TGGCGCC
CAG ACT CCG GAG AAG A(:G 
CTG CACTGG GTCGCA ACCACTC
丁T ACT G(T G(T GGT TTCACC
TTCTAT TCA  GCCAGT  GTCAA
G  GGT ccT TTcACCATCTCCAG
A GACAAT GCCCAG AACAACCTC
TAT CTA CAA CTG AAT AGTCT
OAGOTCT CAG GACACG GCCTTG
 TAT TTCTG’r GCA AcTCA’r 
CGG m GTrCACTGG GCCCACGAG
 ACT CTG GTCACT (YCTCT GC
A GCCからなる組換えDNA化合物である(「重鎖
解読路」)。
上記DNA重鎖化合物のさらに別の変異体は、第1の哺
乳動物種由来のキレート特異的な重鎖可変領域およびシ
グナルペプチドと、第2の別種哺乳動物種由来の不変領
域からなるキメラ抗体重鎖をコードしているDNAを含
有する組換えDNA化合物であって、該重鎖可変領域が
次の配クリ:Mee Ser Pha Gly Leu
 Ser Leu Ila Ph@Leu Vat L
eu Ile tau Lys Guy ValGin
CyaGluVaLThrLeuValGluSerG
LyGLyAspSsrYakLysProGlyGl
y Ser Lau Lys Lau Sar Cys
 Ala^la Sar Gly Phe Thr L
au Ser Gly GluThr  Met  S
et  Trp  Val  Arg  Gin  T
hr  Pro  Glu  Lys  Arg  L
au  Glu  Trp  Vat  AlaThr
  Thr  Leu  Ser  Gly  Gly
  Guy  Pha  Thr  i’ha  Ty
r  Bar  Ala  Ser  Val  Ly
s  GlyArg F’he Thr Ile Se
r^rg AMP Asn Ala Gin Asn 
Asn Leuτyr lau Gla kuAsn 
Ser Leu Arg Ser Glu Asp T
hr Ala Leu Tyr Pha Cy−Ala
 Ser H1s^r8Phe  Val  His 
 Trp  Gly  His  Oly  Thr 
 Lau  !/ml  Thr  Mal  Ser
  Ala  Alaからなるアミノ酸配列を何してい
る組換えDNA化合物である。
また、シグナルペプチドと重鎖可変領域の解読路が次の
配列 ATG AGCm GGG CTG AGCfrG A
TT TrCCTT GTCCTAATr TTA A
AA GG’r GTCCAG  T(T  GAA 
 GTG  ACG  CTG  GTG  GAG 
TCT  GGG CGA  CACTCA  CTC
AAG  CCT GGhGGG TCCCTG AM
 CTCTCCTGT GCA GCCTCT GGA
 ’rTCACT TrA A(T G(T 0AAA
CCATOTCT TGG GTT CGCCAG A
CT CCG GAG MG AGG CTG GAC
TOCGTC0CAACCACT CTrAGT GG
’r GcTG醒TTCACCTrCTAT TCA 
GCCAG’r GTG AAG GGTCGT TT
CACCATCTC(: AGA GACAAT GC
CCAG MCMCCTC?Aτσ^CAA CTGA
AT AGT CTG AGG TCT QkG GA
CACG GCCTTG TAT TTCT(T GC
A AG’r CAT C0Gm GTr CACTG
G ’GGCCACGGG ACT CTCGTCAC
T GTCTCT GCA GCCからなる、上記のD
NA重鎖化合物変異体の組換えDNA化合物も本発明の
一部である。
上記のDNA重鎖化合物、ffi鎖解読鎖、またはそれ
らのシグナルペプチド含有変異体の好ましい態様を以下
に挙げる: a)第1の哺乳動物種由来のキレート特異的な可変領域
がネズミハイブリドーマから得られたものである、上記
のDNA重鎖化合物、解読路、またはシグナルペプチド
含有変異体のDNA配列を含有する組換えDNAベクタ
ー; b)第2の別種哺乳動物種由来の不変領域がヒト供給源
から得られたものである、a)の組換えDNAベクター
; C)第2の別種哺乳動物種由来の不変領域がヒト供給源
から得られたものであり、かつ該不変領域がヒ)IgG
1重鎖から取られた不変領域である、b)の組換えDN
Aベクター; d)原核微生物におけるクローニングベクターとして用
いるのに適した、C)の組換えDNAベクター e)プラスミドpHGl−CHAである、d)の組換え
DNAベクター; f)真核系細胞中で該DNAを発現させるよう設置した
翻訳活性化配列およびプロモーターをさらに含イfする
、c)の組換えl) N Aベクター;g)プラスミド
pS V 2neoまたはpS V 2 gptがら導
かれた、「)の4111%え1.I NΔべ々ンー;お
よび1+)ブラスミ’ FpNCIIAG lまた1i
pG(:IIAGlである、g)の組換えL)Nへベク
ター。
本発明の第3の態様は、第1の1−11乳動物種山米の
キレート特異的な可変領域と、第2の別種1111乳動
物種由来の不変領域からなるキメラモノクローナル抗体
であって、可変軽鎖領域が次の配列:からなるアミノ酸
配列を有しているキメラ抗体である。
上記のキレート特異的な軽鎖キメラモアクローナル抗体
の変異体は、次の配列 Met  Ala  Trp  Ile  Ser  
Leu  lie  Lau  Ser  Leu  
Leu  Ala  Leu  Ser  Set  
Gly  ^l畠IIs Sar Gln^1m Va
l Val Thr Gin Glu Ser Ala
 Leu Thr Thr Ser I’ro Gly
Glu Thr Val Thr Lau Thr C
ym Arg Ser Ser Thr Gly^la
 Val Thr Thr Set^sn Tyr A
La Asn Trp Val Gin Olu Ly
s Pro Asp His Lau Pbe ThC
GLy−Leulie  Gly  Gly  Thr
  Asn  Asn  Arc  Ala  Pro
  (ily  Val  Pro  ALa  Ar
c  Phe  Sar  GlySat  Lau 
 lie  Gly  Asp  Lys  ^11 
Ala  Leu  丁hr  lie  Thr O
ly  Ala  Gin Thr  Glu^sp 
 Glu  Ala  Arc  Tyr  I’he
  Cys  Ala  Leu  丁rp  Tyr
  Ser  Asn Leu  Ttp  Val 
 PheGly  Gly  (ily  Thr  
Lys  Leu  Thr  Vat  Leu  
GLyからなるアミノ酸配列を有するujなl1iIf
I領域と対応のシグナルペプチドを含んでいる。
上記のキレート特異的な軽鎖キメラモノクローナル抗体
、またはその対応シグナルペプチドを含む変異体の好ま
しいj島様を以下に挙げる一a)可変軽鎖領域がネズミ
ハイブリドーマから1iJられたものである、牛し−ト
特74的な軽鎖キメラモノクローナル抗体; b)不変軽鎖領域がヒトDI、給ih:’−から1iI
られたらのテする、a)のキメラモノクローナル抗体:
および C)不変軽鎖領域がヒト供給源から111られたちので
あり、かつヒトに不変領域である、b)のキメラモアク
ローナル抗1本。
本発明のさらに別の1ム(浪は、第1の哺乳動物種由来
のキレート特異的な重鎖可変領域と、第2の別種lN1
1乳動物種由来の不変領域からなるキメラモノクローナ
ル抗体であって、可変重鎖領域が次の配列: Glu  Val  Thr  L@u  Val  
Glu  Ser  Gly  Gly  Asp  
Sir  Val  Lys  Pro  Gly  
Gly  5arLeu  Lys  Lau  Se
t  Cys  Alm  Ale  Set  Ol
y  Phe  Thr  Leu  !ier  O
ly  Glu  丁hrMat Ser Trp V
al Arg Gin Thr Pro Glu Ly
s Ar畠Lau Glu Trp VaL^La T
hrThr  Leu  Ser  Oly  Gly
  Oly  I’ha  Thr  Pha  Ty
r  Sar  Ala  Sar  Val  Ly
e  Oly  ArgPhe Thr IIs Sa
t Arg Asp Asn^la Gin Asn 
Amn Lau Tyr Txu Gin Leu^$
l5er Leu Arg Sat Glu Asp 
Thr Ala Leu Tyr Pbe Cys^l
a Ser )lis^rg PheVal  )Ii
s  Trp  Oly  His  Gly  Th
e  Leu  Val  Thr  Val  Sa
r  Alm  Almからなるアミノ酸配列を有して
いるキメラ抗体である。
上記のキレート特異的な重鎖キメラモノクロ−・ナル抗
体の変異体は、次の配列 Met Ser Phe Gly Leu Ser L
eu Ile Phe Leu Val Leu II
s Leu Lys Glyν社Gin  Cys  
(ilu  Val  Thr  Leu  Val 
 Glu  Ser  Gly  Gly  Asp 
 Sar  Val  Lys  Pro  GlyG
ly  Ser  Leu  LylI Leu  S
er  Cys  Ala  Ala  Ser  G
ly  Phe  Thr  Leu  Ser  G
ly  GluThr Met Serτtp Val
 Arg Gin Tbr Pro GLu Lys^
c色Leu GLu Trp VaL^LaThr T
hr Leu Sat Gly Gly Gly Ph
e Thr Pha Tyr Ser ALa Sar
 VaL Lys Gly^rg  Phe Thr 
 lie  Ser Arg  Asp Asn Al
a  Gin Asn  Asn  Leu Tyr 
 Leu Gin  Leu八sへ  Ser  Le
u Arg Set  Glu  Asp  Thr 
Ala  Leu  Tyr  Pbe  Cym  
Ala  Set 1lis  ArgPhe Val
 1lis Trp Gly 1lls Gly Th
r Leu VaL Thr Val Set^la 
ALaからなるアミノ酸配列を有する1、IJ変市!L
”l領域と対上記のキレート特異的な重鎖可変領域キメ
ラモノクローナル抗体、またはその対応シグナルペプチ
ドを含む変異体の好ましい態様には以下に挙げるものが
含まれる: a)可変重鎖領域がネズミハイブリドーマから得られた
ものである、キレート特異的な重鎖可変領域キメラモノ
クローナル抗体; b)不変重鎖領域がヒト供給源から得られたちのである
、a)のキメラモノクローナル抗体;および C)不変重鎖領域かヒト供給源から得られたものであり
、かつヒトIgG1不変領域からのものである、b)の
牛メラモノクローナル抗K。
さらに、本発明は、第1の哺乳動物種由来のキレート特
異的な可変領域と、第2の別種哺乳動物種由来の不変領
域からなるキメラモノクローナル抗体であって、可変軽
鎖領域か次の配列:応のシグナルペプチドをなんでいる
Gin Ala Val Vat Thr Gin G
lu Ser Ala Leu Tl1r Thr S
er Pro Gly Glu Thrνal Thr
 Leu Thr Cys Arg Ser Ser 
Thr GLy Ala Val Thr Thr S
er Amn TyrAla Asn Trp Van
; Gin Glu Lys Pro Asp 1li
s [、eu Phe Thr Gly Leu li
e GlyC1!、l Thr Aan Asn Ar
g^la Pro C1y Vat Pro^1蟲^r
g Phe Set Gly Ser LeuJle 
 Gly Asp  Lys  Ala  Ala  
Leu Thr  lie  Thr  Gly AI
JI  Gln  Thr  Olu Asp  Gl
uAla ArHTyr Phe Cys Ala L
eu Trp Tyr Ser Asn Leu Tr
p Val Phe Gly GLyGLy  Thr
  Lyi  Leu  Thr  Val  Leu
  Glyからなる°7’ミノ酸配列配有しており;そ
して、可変軽鎖領域が次の配列: Glu VaL Thr Leu Val Glu S
er Gly Oly Asp Ser VaL Ly
aPro Gly Gly 5erLeu  Lys 
 Leu  Ser  Cys  Ala  Ala 
 Ser  Oly  Pha  Thr  Leu 
 Ser  Gly  Glu  Thr Me15e
r Trp Val Arg Gln Thr l”r
o Olu Lys Arg Leu Glu Trp
 Val Ala Thr ThrLeu Ser G
ly Gly Gly Phe Thr Pha Ty
r Ser^la Ser Val Lym Gly 
ArB PhaThr Ile Ser Arg As
p Asn Ala Gln Asn Asn Leu
 Tyr Leu Gin Leu Asn 5etL
eu  Arg  Set  (ilu  Asp  
Thr  Ala  Leu  Tyr  Phe  
Cys  Ala  Ser  l1is  ArB 
 Phe  Valllis Trp Gly His
 tlily Thr Leu Val Thr Va
l Ser Ala Alaからなる゛rアミノ酸配列
ffシているキメラ抗体を包含し”Cいる。
上記のキレート特異的な重鎖と軽鎖の抗体の変+J4体
、即ち、次の配列: Met Ala Trp Ile Ser Leu t
ie Leu Ser Leu Leu^la Leu
 Ser Ser GLy^1alie Ser Gi
n Ala Val Val Thr Gin Glu
 Ser^la Leu Thr Thr Sar P
ro GlyGlu Thr Val Thr Leu
 Thr Cys Arg Ser Ser Thr 
Gly Ala Val Thr Thr 5arAs
n Tyr Ala Aan Trp Val Gin
 Glu Lyyr Pro Asp Hls Leu
 Phe Thr Gly Leulie Gly G
ly Thr Asn Amn Arg^la Pro
 Gly Val Pro Ala^rg Phe S
er GlySer Leu lie Gly Asp
 Lym Ala^la Leu Thr Ile T
hr Gly Ala Gln Thr GluAsp
 Glu Ala Arg Tyr Phe Cys 
Ala Leu Trp Tyr Set Asn L
ev Trp Val PhaGly C1y C1y
 Thr Lys Leu Thr Val Leu 
Glyからなるアミノ酸配列を何する可変軽鎖領域と対
応のシグナルペプチド;および、次の配列:Met S
er Phe Oly Leu Ser Leu Il
e Phe Leu Val Lau Ile Leu
 Lys GLy VaLThr Thr L@u S
er GLy GLy Gly Pha The Ph
e Tyr Ser^la Set Val Lys 
GlyArg  Pha  Thr  Ile  Se
r  Arg  Asp  Asn  Ala  Gi
n  Asn  Asn  Leu  Tlt  La
u  Gln  LeuAsn  Ser  Leu 
 ArB  Set  Glu  Asp  Thr 
 Ala  Lau  Tyr  Phe  Cys 
 Ala  Ser  Hlg  ^rgPhe Va
L )lis Ttp Gly His Gly Th
r Leu Val Thr VaL The VaL
 Ser Alaからなるアミノ酸配列を有するIIJ
変重鎖領域とλ・1応のシグナルペプチド; を含有する変異体も本発明の範囲内に含まれる。
上記のキレ−1・特異的な重鎖と軽1C1のキメラモノ
クローナル抗体、および重鎖と軽鎖のシグナルペプチド
配列を含むその変異体の好ましい態様には以下に挙げる
ものが含まれる; a)可変領域がネズミハイブリドーマから得られたもの
である、キレート特異的な[1と軽鎖のキメラモノクロ
ーナル抗体; b)不変領域がヒト供給源から得られたものである、a
)のキメラモノクローナル抗体;C)軽鎖不変領域がヒ
トに不変領域である、b)のキメラモアクローナル抗体
; d) jillf鎖不変領域がヒト1gG1の不変領域
である、b)のキメラモノクローナル抗体;および0)
軽鎖不変領域がヒトに不変領域であり、重鎖不変領域が
ヒトIgG1不変領域である、b)のキメラモアクロー
ナル抗体。
本明細書中、「可変領域」という語句は、キレ−1・を
結合することができる軽鎖および電鎖抗体分丁−領域を
指す。可変領域のアミノ酸配列は、それか結合するキレ
ート決定因子およびそのキレート法定因子を認識する方
法によって様々に変化する。
この多様性は、キレートの種類1.jpひに可変領域を
コードしている遺伝子のエクソン配列に関係している。
本明細書中、[不変領域」という語句は、構造安定性お
よびその他の生物学的機能を与えるが、キレ−]・との
結合には無関係な、軽鎖および重鎖抗体分子領域を指す
。不変領域のアミノ酸配列および対応する遺伝子中のエ
クソン配列はそれを導いた種にIknするであろうが、
1つの種での特定の不変領域についてはアミノ酸配列の
変異は比較的限定されている。
シグナルペプチドに対して開示したDNA配列は、關訳
開始シグナル、すなわち、機能的なポリペプチドの翻訳
を開始させるDNA配列を含んでいる。当業者ならば、
リーダーペプチドはキレートとの結合に機能しないので
、池の真核性リーダーペプチドをコードしているDNA
配列も本発明における使用に適していることを認めるで
あろう。
従って、本発明は特定の真核性シグナルペプチドの使用
に限定されない。最後に、本発明の別の態様は、変異体
において開示した軽鎖および重鎖シグナルペプチドおよ
びそれをコードしているDNA化合物である。
また、当業者ならば、本発明のDNA構築物を措成して
いる第1のDNA暗号配列を、例えば部位指向性の突然
変異誘発によって修飾し、実質的に同等のDNA構築物
を得ることができることを認めるであろう。これらの修
飾されたDNA暗号配列は、本明細書に記載のものと実
質的に同一の牛メラポリペブチドに翻訳され得るもので
ある限り、本発明の範囲内に包合される。ある場合には
、部位指向性の突然変異誘発の使用により、得られた半
メラポリベブチドのキレートに対する親和性か変化する
ことらある。
本発明のDNA構築物の第1のDNA暗号配列は、キレ
ートに指向性であるモノクローナル抗体を発現するネズ
ミハイブリドーマのゲノムDNAから導かれることが好
ましい。メアレス等[C,l’’1leares et
 al、 ;米国特許N o、 4.722.892]
が開示しているような、金属、特にEDTA誘導体のイ
ンジウム■キレートに対して所望の特異性および親和性
を有する抗体を発現するCHA255.5と命名された
ネズミハイブリドーマを用いることか特に好ましい。し
かし、可変軽鎖および重鎖領域は、DNA配列およびそ
の翻訳によって得られるアミノ酸配列が実質上、本発明
で開示した配列と同等のものであれば、ウサギ、ヤギ、
ウマ、クン、およびヒト以外の霊長類などの他の哺乳動
物種から得ることもできる。
本発明に用いるゲノムDNAは、通常の方法わよび様々
な方法で得、クローニングすることかできる。そのよう
な方法は、デイビス(L、G、DaviS)、デイブナ
−(M、 D、 D 1bner)およびバッチイー編
(J 、 F、 Battey)、ペイシック・メソッ
ド・イン・モレキュラー・バイオロジー(Basic 
Method in Mo1ecular B iol
ogy)、エルスピア−(Elsevier)発行、ニ
ューヨーク(New York)、(1986);フェ
ダーら(F eder、 J 、)、アメリカ7−ジャ
ーナル・オブ・ヒユーマン・ジエ不テイックス(A m
、 J 、 Hun、 G enet 1cs)、37
:635−649(1985):およびステツ7−(S
 teff’er、 D、)、ウィンバーブら(Wei
nberg、 R、A、 )、セル(Ce11)、15
:1003−1010 (1978)、に記載されてい
る。例えば、ハイブリドーマ細胞のDNAは常法によっ
て単離することができる:即ち、制限エンドスフレアー
ゼによりゲノムDNAを断片化して制限フラグメントと
し、得られたフラグメントを適当な組換えDNAクロー
ニングベクター中でクローニングし、そして放射性標識
または酵素標識プローブを用いて本明細書中に開示した
DNA配列のび在についてスクリーニングする。
本明細書中、「制限フラグメント」という語句は、1ま
たはそれ以上の制限エンドヌクレアーゼ酵素の作Ill
によって生成したあらゆる線状のDNA配列を指す。本
明細書中、[組換えDNAクローニングへフタ−」とい
う語句は、lまたはそれ以上の別のDNAセグメントを
付加することができるか、または既に付加したDNA分
子からなる自律的に復製するあらゆる媒体を指し、プラ
スミドおよびファージを含むがそれらに限定はされない
また、ゲノムDNAから得られたDNA配列はポリペプ
チドをコードしていない介在配列、即ちイントロンを含
んでいることもある:これらの配列は、次いで、常法に
よるヌクレオチドの欠失または置換により、改変するこ
とができる。例えば、クラマーら(K raner、 
W、 )、ニュークレイツク・アノノズeリサーチ(N
ucleic Ac1ds Res、)、+2:9,4
41(1984)、およびクンケル(Ku+1kcl、
 T、 A、)、プロシーデイングズ・オブ・ナシ1ナ
ル・アカデミ−・オブ・サイエンス、82:488(1
985)参照。
本発明のDNA構築物の内、キメラ抗体の可変軽鎖およ
び重鎖領域であるポリペプチドをコードしている第1の
DNA配列はcDNAから得ることもできる。cDNA
を得、クローニングする方法は周知であり、オカヤマ(
Okayama、 H、)およびバー’)’ ラ(B 
erg、 P、 )、モレキュラー・アンド・セルラー
・バイオロジー(Mo1. Cel l B iol、
 )、2:161(1982);ギコブラ−(G ub
ler、 H、)およびホフマンら(HofTman、
 B 、 J 、 )、ジエーン(Gene)、25:
263(1983)、によって記載されている。従って
、cDNAを常法によってクローニングし、得られたク
ローンを本明細書中に明示した可変領域をコードしてい
るcDNAに関してJ当なプローブでスクリーニングす
ることができる。所望のクローンを単離したのち、基本
的にはゲノムDNAと同じ方法でcDNAを操作するこ
とができる。
別法として、可変軽鎖および重鎖領域のキレートに対す
る特異性について必要な遺伝情報を含有している第1の
DNA配列を、常法により合成的に製造することもでき
る。DNA配列の合成法は、シナら(S hina、 
N、 D、 )、ニュークレイツク・アッシズ・リサー
チ、12:4359(1984);およびボカージs 
(B eaucage、 S 、 L 、 )、カルザ
ーズら(Caruthers、 M、 H,)、テトラ
ヒトロン・レターズ(T etrahedron L 
etters)、20:1859(1981)、によっ
て記載されている。従って、軽鎖および重鎖可変領域を
コードしている第1のDNA配列を、通常のDNA合成
法によりヌクレオチドモノマーから合成して、本明細書
に記載のボ1ペプチドと実質上同一のポリペプチドに翻
訳され得るDNA暗号配列を得ることができる。この合
成りNA配列は、縮重コドンで元のコドンが置換されて
いても、翻訳時の同一アミノ酸をコードしている限り、
クローニングした遺伝子と同一である必要はない。
キメラ抗体の不変軽鎖および重鎖領域をコードしている
本発明DNA構築物の第2のDNA配列は、ゲノムDN
AおよびcDNAからクローニングすることができるか
、あるいは合成することができる。不変領域ポリペプチ
ドをコードしている第2のDNA配列は、ヒトリンパ細
胞、例えばヒト末梢血リンパ細胞から導かれるのが好ま
しい。
ヒト不変領域をコードしているDNA配列を使用するこ
とにより、免疫原性を最小にするキメラ軽鎖および重鎖
ポリペプチドが得られると予測される。特に好ましいの
は、ヒト軽(に)鎖およびヒト重(γ)鎖遺伝子から導
かれるDNA配列であり、種々のアイソタイプクラス(
例えば、IgMS 1gA)、サブクラス(例えば、I
gAIS 1gA2)、タイプ(例えば、にまたはλ)
、サブグループ(Vに1.VHIなど)およびアロタイ
プ(G自グル−プなど)、とりわけγ−1遺伝子が含ま
れる[ハイターら(Heiter、 P、A、 )、セ
ル、22:197207(1980)およびタカハシら
(T akahashi。
N、)、セル、29:671−679(1982)]。
しかし、本発明は、軽鎖および重鎖キメラポリペプチド
のためのヒト不変領域をコードしている特定の第2DN
A配列に限定されるものではない。
また、当業者ならば、選択した種が可変領域を得た種と
異なるならば、不変領域遺伝子は他の哺乳動物種から導
かれたものであってもよいということを理解し得るであ
ろう。例えば、不変領域は、抗体がインビトロまたはイ
ンビボ適用のいずれであるかにより、ウサギ、ヤギ、ウ
シ、ウマ、ブタおよび非ヒト霊長類などの種から導かれ
得る。
本発明のキメラDNA構築物を調製し、適当な組換えD
NAクローニングベクターおよび組換えI)NΔ発現ベ
クターに導入するのに必要な組換えDNA技術は、今日
では当業者周知であり、数多(の文献に記載されている
。グラズマンII (Y。
G luzman)、ユーカリティック・ノ<イラル・
ベクター(Eukarytic Viral Vect
ors)、コールド・スプリング・ハーバ−φラボラト
リーズ(ColdSpring Tlarbor La
boratories)発行、ニューヨーク(1982
);グラズマン編、ユーカリティック・トランスレーシ
ョン(E ukaryot ic T ranscri
ption)、コールド・スプリング・ノ\−バー・ラ
ボラトリーズ(Cold Spring Harbor
 Laborat。
ries)発行、ニューヨーク(1985);カレンダ
ー(R,Ca1endar)およびゴールド編(L、G
old)、セキュエンス・スベシフィシティー・イン・
トランスクリブシもン・アンド・トランスレーション(
Sequence 5pecificity in T
ranscription &Translation
)、アラン・アール・リス、インコーホレーテッド(A
 1lan R、L iss、 [nc、 )発行、ニ
ューヨーク(1985);レズニコフ(W、Rezni
kofT)およびゴールド編(1,、、、Gold)、
マキシマイジング・ジエーン・エクスプレッション(M
aximizing Gene Expression
)、!<ターワーシイーズ(B utterworth
s)発行、ニューヨーク(1986);シリー編(W、
G、 Th1lly)、マンマリアン・セル・テクノロ
ジー(Mammalian Ce1l Technol
ogy)、ハターワーシイース発行、ニューヨーク(1
986):サンブロックおよびゲシング(J、Samb
rook and M、 J 、 Gething)、
フォーカス(Focus)、lO1#3、ベセスダ・リ
サーチ・ラボラトリーズ/ライフ・チクノロシーズ社(
B ethesda Research Labora
tories/ L ife Technologie
s  I nc、)、41−48頁(+988)参照。
本明細書中、「組換えDNA発現ベクター」という語句
は、DNAをRNAに転写させるプロモーター配列、並
びにRNAへの転写およびRNAのポリペプチドへの翻
訳を開始および終止させるための適当な調節配列を含有
しているすべての組換えDNAクローニングベクターを
指す。また、「組換えベクター」という語句は、組換え
DNAクローニングベクターまたは組換えDNA発現ベ
クターのどちらかを指す。
本発明によれば、軽鎖および重鎖キメラポリペプチドを
コードしているDNA構築物は、発現ベクターの一部と
して適当な真核宿主細胞に導入される。これらの構築物
を単一の真核性発現ベクターに含有させることもできる
し、また、それぞれが1個のキメラ遺伝子構築物を含有
する別々の発現ベクターを用いて分けて維持してもよい
。しかし、キメラポリペプチドの発現のためには、選択
した真核宿主細胞内で機能する転写および翻訳調節配列
を含有していることが必要である。従って、キメラ遺伝
子は、5°および3°非翻訳領域並びにイントロン(介
在)配列を含有し、すべて真核宿主細胞内で機能するプ
ロモーター、エンハンサ−および転写ターミネータ−お
よびポリアデニル化部位(polyA部位)などのホモ
ローガスな調節領域を包含する大きいDNAフラグメン
トで単離してよい。本明細書中、「プロモーター」およ
び「エンハンサ−」という語句は、それぞれ、DNAの
RNAへの転写を指令するDNA配列、およびDNAか
らRNAへの転写を促進するDNA配列を指す。本明細
書中で用いる「転写ターミネータ−」という語句は、D
NAのRNAへの転写を終了させるDNA配列を指す。
rpolyA部位」という語句は、poly−Aテール
配列付加の位置を示すDNA配列を指す。別法によれば
、ウィルス性プロモーターエンハンサ−1転写ターミネ
ータ−およびpolyA部位を含有する周知のSV40
およびHerpes TK(ヘルペスTK)ウィルス配
列などの様々なヘテロローガス(異種の)調節領域とキ
メラ遺伝子とを組換えて結合させてもよい。また、キメ
ラ遺伝子構築物は、調節要素が真核宿主細胞内で機能的
であり、該キメラ遺伝子に適切に融合されている限り、
合成の調節要素と結合していてもよい。さらに、cDN
Aクローンおよび合成遺伝子も、ポリペプチドとして発
現されるよう、ホモローガスまたはへテロローガスのい
ずれかの調節配列と結合させることができる。従って、
本発明のキメラ遺伝子の発現のためには、ホモローガス
、ヘテロローカスまたは合成の調節領域を相互に交換し
て用いることかできることは当業者の理解するところで
あろう。
多種多様の組換え発現ベクターが周知であり、それらを
本発明に用いることができる。pS v 2型ベクター
の使用が好ましい。psv2型ベクターは、よくわかっ
ている真核性転写単位を構成する5V4Qケノムのセグ
メントを含有しており、11+li乳動物および池の真
核宿主細胞の染色体DNAに組み込まれることにより、
これらの細胞を形質転換する。5V4Qプロモーターが
挿入遺伝子を転写させる様々なプラスミドpsV2型ベ
クター例えば、プラスミドpS V 2−gpL、 p
s V 2−neo。
pS V 2−dMr、およびpSV2J−グoビンな
どが構築されている[グラズマン編、ユーカリティック
・バイラル・ベクター、コールド・スプリング・ハーバ
−奉ラボラトリーズ発行、コールド・スプリング・ハー
バ−、ニューヨーク(1982)IM]。
これらのベクターは、アメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクシリン(A T CC)、ロックビレ、メリー
ランドおよびノーイン・リージョナル・ラボラトリ−、
ベオリア、イリノア(N orthern Regio
nal  Laboratory(NRRL)、   
Peoria、   [1linois)から入手する
ことができる。あるいは、ウシ乳頭腫ウィルスに基(発
現ベクターおよびエプスタイン−バールウィルス発現ベ
クターのごとくエピソーム的に維持される、即ち染色体
外で維持され得る発現ベクターを選択することもできる
グラズマン編、ユーカリティック・バイラル・ベクター
、コールド・スプリング・ハーバ−・ラホラトリーズ発
行、コールド・スプリング・ハーバニューヨーク(19
82);ハウリー(P、M。
Howley)およびブローカーrQ(T 、 R、B
 roker)、バピロマビラシイズ(P api l
lomaviruses)、アラン・アール・リス、イ
ンコーホレーテッド発行、ニューヨーク(1985);
サソデンら(S ugden。
13)、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロ/
−15:410−413 (1985):およびキオー
/スら(K 1oosis、 D、 )、エンボ(EM
BO)、6:355−361(1987);およびサム
ブロックおよびゲ/ング、フォーカス、to、#3.4
1−48頁(1988)参照。
psv2クラスのベクター由来の発現ベクターから5V
4Qエンハンサ−を除去することにより、より高レベル
の発現を達成することができる。はとんとすべてのゲノ
ム性免疫グロブリン遺伝子がエンハンサ−配列を含有し
ている。ネズミのに可変領域遺伝子は、エンハンサ−配
列と共にプラスミドpc CHA K上に見いだされる
。当業者ならば、トランスフェクションされた細胞の免
疫グロブリン消産生能力を変化させることなく、これら
のエンハンサ−配列を発現ベクター上の多数の別の部位
に移動させ得ることを理解し得るであろう。
しかし、発現ベクターpG CHA Kから5V4Qエ
ンハンサ−を除去すると、本発明抗体の5P210細胞
からの発現レベルは顕著に増大する。
プラスミドpMLCE−10(ATCCから取得番号A
TCC67639のもとて入手できる)上に見いだされ
るCEMにプロモーターもまた、ヘテロローガス免疫グ
ロブリン鎖の発現レベルを増加させるのに有用である。
具体的には、上記のように、ネズミハイブリドーマCH
A255由来のλおよびγ可変領域をコードしている遺
伝子がクローニンフサしている。5V4Qエンハンサ−
含有ベタ9−上のCEMにプロモーターによって作動す
るネズミλCHA可変領域およびヒト不変領域遺伝子を
含有するプラスミドpG CHA K −2を実施例1
4記載の方法に従って構築した。SV40エンハンサ−
を欠如するベクター内のCEMにプロモーターによって
作動するネズミλCHA可変領域およびヒト不変領域遺
伝子を含有するプラスミドpGcHAK−3も、実施例
14記載の方法に従って構築した。これらプラスミドの
どちらかでトランスフェクションした5P210細胞(
A ′FCCから人手可能)は、CHAλプロモーター
を含有するベクターでトランスフェクションした細胞よ
り、はるかに高いに発現レベルを示した。
事実、これらの、CI(Aキメラに遺伝子を発現させる
CEMにプロモーターを含有するSV40エンハンサ−
欠如ベクターでトランスフェクションした細胞は、に発
現レベルにおいて、CHAλプロモーターによって作動
するCHAキメラ遺伝子を3何する5V4Qエンハンサ
−含有ベクターで!・ランスフエクンヨンした細胞が示
すレベルの10倍増を示した。次いで、これらの高産生
細胞をキメラ手鎖遺伝子含有ヘクターでトランスフエク
/、llンすると、に鎖ベクター中のCI(Aプロモー
ターを用いる細胞に比べ、対応する全抗体産生の増加か
得られるであろう。最高の発現を示す細胞をサブクロー
ニングし、次いでこれらの高発現サブクローンを明確に
定義した白清不念培地で培養することにより、より高い
発現レベルが達成され得る。このことから、CEMにプ
ロモーターがホモローガス(OEM)配列およびヘテロ
ローガス(CIAその他)配列の両者を高レベルに発現
させる特別の能力を有していることが明らかである。実
施例14の教示は約2.2kbのC1al/5spl制
限フラグメント上にCEMプロモーターが存在している
ことを示しているか、当業者はこのCEMにプロモータ
ー配列を容易に得ることができる。
このことは、同日出願の米国特許出願N o、 07/
272゜577、「ヒトがん胎児性抗原に対するキメラ
抗体」(C,B、Be1dler、 M、J、John
son、 and J、R,Ludwig)に記載され
ている。、また、1988年3月9日出願の米国特許出
願No、 07/165.856(Mary J、 J
ohnson et at、 )も参照。
本発明において有用な真核宿主細胞としては、ハイブリ
ドーマ、骨髄腫、形質細胞腫、リンパ腫細胞等が好まし
い。しかし、哺乳動物宿主細胞がキメラ遺伝子の発現の
ための転写および胛訳DNA配列を認識し、リーダーペ
プチドをブロセッシングしてリーダー配列を切断し、キ
メラタン7寸り質を分〆必させ、時にはキメラタンパク
質の翻訳後修飾(グリコンル化など)を行うことができ
るならば、他の真核宿主細胞も使用に適する。本発明の
さらに別の態様は、本キメラ抗体を分泌する形質転換宿
主細胞、特に5P210宿主細胞である。
好ましい管柱には、本明細書中に記載した哺乳動物発現
ベクターのどれかで形質転換した5P210宿主細胞が
含まれる。
従って、本発明は、本明細書に開示したキメラ遺伝子構
築物を含有する組換え発現ベクターで形質転換された真
核宿主細胞であって、本発明のキメラタンパク質を発現
することができる宿主細胞を提供するものである。本明
細書中、「形質転換」という語句は、DNAを受容細胞
に導入することにより宿主細胞のゲノムに変化をもたら
すことをいう。従もて、本発明の形質転換された宿主細
胞は、本明細書に記載のキメラ軽鎖および重鎖遺伝子、
推びにキメラタンパク質を発現させるよう軽鎖および重
鎖をコードしているDNA配列に関連させて設置した転
写および翻訳用配列を含有する少なくとも1個のDNA
構築物を含有している。
本発明で用いる宿主細胞は、当業者周知の常法を用い、
種々の方法でトランスフェクションすることができる。
常用のトランスフェクション法の内、電気穿孔(エレク
トロポレーション)法、プロトプラスト融合法、および
リン酸カルシウム沈澱法を用いることができる。そのよ
うな方法は、以下の文献に記載されている:トネグッゾ
ーら(T。
neguzzo、 F 、 )、モレキユラー・アンド
・セルラー・バイオロジー、6:703−706(19
86);チューら(Chu+ c、 )、ニュークレイ
ツク・アッシズ・リサーチ、15:1311−1325
(1987)ニライスら(Rice、D、)、プロシー
ディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サ
イエンシイズ、79ニア862−7865(1979)
:およびオイら(Oi、V、)、プロシーディングズ・
オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシイズ
、80:825−829(1983)。
本発明のキメラ構築物を含有する組換光発現ベクターで
、宿主細胞を連続的にトランスフェクションするのが好
ましい。例えば、宿主細胞をまず、キメラ軽鎖DNA構
築物を含有する発現ベクターでi・ランスフエク/ヨン
し、キメラ軽鎖ポリペプチドを発現している宿主細胞を
当業者周知の方法で選1尺する[エングボール(E n
gvall、 E 、 )およびバールマンら(Per
lman P、)、イムノケミストリー(l mmun
oche+++1stry)、8:871−874(1
971)]。その後、選択した宿主細胞を、キメラ単鎖
DNA構築物を含有する発現ベクターでトランスフェク
ションする。しかし、キメラ軽鎖および重鎖発現ヘクタ
ーを同時に宿主細胞に導入してもよいことは理解されよ
う。別法として、両キメラ遺伝子構築物を宿主細胞トラ
ンスフェクション)11の111−の発現ベクター上に
結合することもできる。トランスフェクションおよび選
択の後、通常の険定を行って、キレートに指向性の抗体
を検出し、本発明により明確にされたキメラ軽鎖および
rTr k’l Jif伝子の両方を発現する形質転換
細胞を同定する。
さらに、本発明で開示したキメラポリペプチドのアミノ
酸配列をわずかに修飾することにより、キレートとの結
合において実質的に等価な可変領域が得られることは理
解されよう。これらの修飾は、キレートに対する目的の
特異性が保持されている限り、本発明の範囲内に包含さ
れる。
[作用] 特定イオンのキレート錯体を認識する本キメラモアクロ
ーナル抗体の能力は、本キレート化剤と他のイオンの錯
体との関連において、選択した金属がキレートを形成す
るときには他の金属を含む溶液から金属イオンを検出し
、分離することを可能にする。さらに、本抗体は、治療
およびイメージングの目的で投与したキレート化放射性
核種の血清半減期を変える(延ばすことが多い)。また
、ある場合には、本キメラモアクローナル抗体の投与に
よって、腫瘍での放射性活性の取り込みか身体の他の部
分と比較して増強されることもある1本キメラ抗体のネ
ズミ(即ち、非キメラ)類似体はそのような性質を示し
たコ。リアタン等[D、 T、 lleardan、 
 C,P、Meares、  D、A、Goodwin
、  l11.McTigue、 G、S、David
、  M、R,5tone、  J、P、Leung、
  R,M、Bartholemew。
and J、M、Fr1ncke、 Nature、 
 316.265−268(1985)]を参照。また
、メアレス等[C,P、 Meares et at、
 ;米国特許N o、 4.722.892(1988
年2月2日発行)]も参照。
さらに、本キメラモアクローナル抗体を用いて二官能性
抗体、即ち2つの特異性を有する抗体を得ることができ
る。通常、この二官能性抗体の第2の特異性は、;1Φ
瘍、伝染性微生物、またはその他の疾忠状態に関連する
抗原である。そのような抗原には、発癌抗原(CEA)
、前立腺酸性ホスファターゼ(PAP)、前立腺特異的
抗原などの腫瘍関連抗原が含まれる。この二官能性抗体
を、本発明の抗〜金属錯体抗体のフラグメントまたは分
子の半分から組み立てることができる。二官能性抗体の
他の「半分」は、キメラの別の特異性の部分である。
後の結合のための適当な抗体フラグメント(例えば、F
 ab’またはそのフラグメント)は、当分野でよ(知
られた方法によって調製することができる0パーハム[
Parham、 J、1mmunology、 13f
+ 2895(1983)] ;ラモイ等[Lamoy
i at al、、  J、 ImIlunologi
cal Methods、 56.235(1983)
] ;パーハム[PathaI、同上、 53. 13
3(1982)];およびママツセラ[klatthe
w et at、、同上、 50.239(1982)
]を参照。抗体半分子は全抗体から調製することができ
、これを当分野で周知の方法によって化学的に再組合せ
して本発明の抗−ハブテン抗体から作られた二官能性抗
体を得ることができる。例えば、オーデイトレーハーグ
レーブス[)(、Auditore−11argrea
ves ;米国特許No、 4.479.895 ; 
1984年10月30日発行]およびポーラス[H,P
、 Paulus ;米国特許N o、 4.444.
878 ; 1984年4月24日発行]を参照。例え
ば、架橋剤ビス(マレイミド)メチルエーテル(rBM
MEJ )を用いてフラグメントまたは半分子を結合さ
せることができる。
本発明のハブテン特異的なキメラ抗体から二官能性の抗
体を作るさらに別の方法は、哺乳動物細胞(例えば、S
 P 210)を一対の哺乳動物発現ベクター、即ち、
一方のベクターが本重鎖および軽鎖の遺伝子を担持して
おり、他方のベクターが抗原特異的な半分子の重鎖およ
び軽鎖遺伝子を含有している一対のベクターでトランス
フェクションすることである。当分野で既知の方法、例
えばエレクトロポレーション法(電気穿孔法)により、
これらのベクターを用いてこのセルラインを連続して、
または同時にトランスフェクションすることかできる。
この方法による二官能性抗体の構築は、ジョンソンおよ
びヘルブス[M、 J、 Johnson and J
、 Phelps ;  r二官能性キメラ抗体」 ;
米国特許出願N o、 07/274.105 :本願
と同時出願]が開示している。
キメウニ官能性抗体の使用方法は非キメラニ官能性抗体
のものと同様である。二官能性抗体の例については上記
の米国特許N o、 4.479.895およびN o
、 4.444.878を参照。また、マルチニス等[
J、 Martinis et al、]の米国特許出
願N o、 367、784(1982年4月12日出
願)も参照。
以下に実施例および図面を挙げて本発明をさらに詳しく
説明するが、これらは説明のために挙げたものであって
、本発明はこれらに限定されるものではない。
夫嵐利 ClA255.5と呼ばれるネズミハイブリドーマ細胞
を以下の実施例で用い、軽鎖および重鎖可変領域のゲノ
ムDNAを誘導し、クローンした。
このネズミハイブリドーマCHA255.5由来のクロ
ーン化ゲノムDNA、およびヒト末梢血液リンパ球をキ
メラ遺伝子の構築に用いた。
キメラ遺伝子のトランスフェクションは、実質的にトネ
グノゾ等[Toneguzzo、F、 eL al、、
 Mo1ecuJar and Ce11. Biol
、 、 6 : 703−706(1986)]および
チュー等[Chu、G、 eL al、、 Nuele
ic Ac1d 1ies15 : 1311−132
5(19g?)]が記載しているような、エレクトロポ
レーション(electroporation)法によ
って行った。宿主細胞SP210−Ag14ノ\イブノ
ドーマ細胞がキメラ遺伝子の受容体であった。
使用したこのSP210−Ag147\イブリドーマ細
胞はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション[
A+++crican Type Cu1ture C
o11ection。
Rockville、 Maryland]から取得番
号ATCCCRL I 581のもとて人手できる。
以下の実施例において、「マニアティス」および「デイ
ビス」と表示したのは、それぞれ、マニアティator
y、  Co1d Spring Harbor、  
New York(1982)]、およびデイビス等編
集(L、G、Davis、 M、D、Dibr+era
nd J、 F、 BatLey)のBa5ic Me
thods in klolecularBiolog
y[Elsevier、 New York(1986
)]の短縮表示である。
また、以下の実施例では、酵素、試薬および装置の市販
供給元を短縮形で表す。多数のこれら供給元の所在地を
次に挙げる:ギブコーBRL (Gibc。
BRL、 Gaithersberg、 Md、 ; 
rギブコ」または[BRLJ)、二ニー・イングランド
・バイオラブズ(New Cngland Biola
bs、 Bever!y+ Mass、)、シグマ・ケ
ミカル社(Sigma Che+5ical Co、、
 SL、Louis。
Mo、 ;  rシグマ」)、シュライヒャー・アンド
・シュウエル(Schleicher and Sch
well、 Keene、 N、Il、)、およびスト
ラタジーン社(Stratagene、 Incorp
orated、 La Jolla、 Ca、 ;  
「ストラタジーン」)など。
制限酵素反応は、特記事項がなければ、BRLからの酵
素を用い、適切な反応緩衝1ffl(BRL)中、37
°Cで約2時間行った。
酵素は、他に特記事項がなければB RL、シグマ、ま
たは二ニー・イングランド・バイオラブズから人手した
実施例1 突然変異CHA255セルラインの誘導 次の実験の目的は、λl軽免疫グロブリンタンパク質鎖
または71重免疫グロブリンタンパク質鎖のどちらかを
もはや産生しないCHA2555ハイブリドーマ由来の
サブクローンを誘導することにあった。次いで、これら
セルラインからのDNAを、親セルラインDNAとの比
較に用いて、特異的なCHA255V、Iおよび■、遺
伝子を含む制限フラグメントを同定することができる。
CIlΔ255.5を田胞は、9.0%のウマ血を青[
ボク不ツタ・オーガニック・ケミカルズ(Bochne
kOrganic Chenicals)]、0.2%
のウシ胎児血清(ギブコ)およびl 0−5Mの2−メ
ルカプトエタノール[バイオラッド(Biorad)]
を追加したダルベツコの改変イーグル培地H21[オン
タリオ・キャンサー・イア7、チチュート(Ontar
io Cancer 1nstitute)]中で増殖
させな。
次に、細胞を、96ウエルの組織培養プレート[リンプ
ロ(!、imbro)]で1細胞/ウェルにサブクロー
ンした。このサブクローンからの4−清を、イングハル
およびペールマン[Engvall、E、 and P
erlmann P  1mmunochemistr
y 8.871−874(1971)]記載の標準EL
ISAffiを用いて分析した。
この分析は基本的には以下の記載のようにして行った。
BSΔベンジルEDTAを、メアレス等[Mcarcs
 et at、、 Analytical Bioch
emistry 142゜68−78(191j4)]
のようにして調製した。BSAの各分子は分子あたり5
〜10個のキレートを含んでいた。このBSA−キレー
トの溶液に、ノーブテンの105%モル過剰のInCQ
3を加えることによってキレートをインジウムで処理し
、0.13Mクエン酸塩(pH=6)中で一晩インキユ
ベートした。10mMリン酸塩(pH=7.2)を用い
てこの溶液を容量にした。最終の濃度は10μ9/R1
2であった。
次に、96ウエルプレートのそれぞれのウェルを50μ
12 In−BSA/ウェルで被覆し、37℃で一晩乾
燥させた。次いで、このプレートを水およびPBS+Q
、1%ツイーン(w/v)中で徹底的に洗浄した。それ
ぞれのサブクローンからの上清分画(50μm2)をそ
れぞれのウェルに加え、室温で2時間インキュベートし
た。上記のようにしてプレートをもう一度すすいだ。ヤ
キ抗−ヒトに鎖アルカリホスファタシセコンシュゲート
(Tago #2496)を上清原料と同じ培地でt:
toooに希釈した。ウェルあたりに100μQを加え
、室温で1時間インキュベートシた。プレートを上記の
ようにして回度すすいだ。アルカリホスファターゼ基質
は包装の指示通り蒸留水3村につき1錠で調製し、この
基質(150μm2)をそれぞれのウェルに加え、37
°Cで30分間インキュベートした。この反応を500
mMのEDTA(50μg)で停止させ、次に405n
Mでの吸収値を読み取った。シグナルを与えない上清を
、重鎖または軽鎖遺伝子のどちらかを欠いているものと
決定したくプレートに存在している抗原と結合していな
いので)。
陰性のELISΔ読み値に対応している上清分画および
細胞を次に通常の5DS−PAGEで分析し、どの鎖か
多種の突然変異サブクローン中で欠けているかを調べた
。上清を、YM30フィルターを備えたAa+1con
 5tirred Ce1l装置で約10倍濃縮した。
これらの濃縮上清、並びに親ハイブリドーマCtlA2
55.5由来のa縮上清を改変レンムリ(Laei+m
1i) 10%5DS−PAGE還元ゲルで分析した。
試料あたり約2.5μ9の1gタンパク質が分析された
。還元試料はSDS試料緩衝液中に0.1MのDTTを
含んでいた。ゲルにかける前に全ての試料を5分間煮沸
した。常法により、低分子量タンパク質標準[ファーマ
/ア(Pharmacia。
Piscataway、 N、J、)]をゲルでクロマ
トグラフィーした。タンパク質ゲルをメタノール:酢酸
:水(4:1+6)中で染色し、次に見えるようにして
、どのタンパク質産物が突然変異体サブクローン化セル
ライン中に欠けているかを調べた。
実施例2 プラスミドpMLCH−1:ネズミCHA2
55.5VLλ遺伝子を含有するベクターの構築 1gの発現を欠いた突然変異体サブクローンセルライン
およびCHA255.5からのゲノムDNAを、基本的
にマニアティス記載(280〜281頁)の方法によっ
て単離した。約1xlO11個のハイブリドーマ細胞(
親または突然変異体)を遠心して集めたく10分間、3
QQrpm、IEc臨床用遠心機)。この細胞をPBS
で2回洗浄した。次いで、細胞をTEN[即ち、10m
M)リス−+−+C((pH=8.0)、211M E
DTA、および40aMNaCQを含む溶液](4籾)
に再懸濁し、10%5DS(200μのおよびlO渭y
/ ff12プロテアーゼに溶液(42μQ)(シグマ
)を加えて溶菌した。この細胞懸?蜀液を37°Cて一
晩インキユベートした。この懸濁if&を等容量のフェ
ノール;クロロホルム;イソアミルアルコール(25:
24:1溶液)で2回、そして等容量のクロロホルム:
イソアミルアルコール(24+ 1溶液)で2回以上抽
出することによって細胞懸濁液からDNAを単離した。
水相を合わせ、”I’ E i衝液に対して一晩透析し
た。このDNAを50μg/ mo、の濃度のRNアー
ゼA(シグマ)で2時間、続いて200μ9/ ff1
2のa度を与えるプロテアーゼにで1時間、37°Cで
処理した。上記のようにしてDNAをもう一度抽出し、
−晩透析した。透析後、l/10容量の2M酢酸ナトリ
ウム溶液および2容量の95%エタノールを加えること
によって透析抽出物からDNAを沈澱させ、30分間、
−20°Cに保った。この冷エタ/−ル溶妓を8000
 rpmで30分間遠心した。得られたl) N Aベ
レットを十分量のT E緩衝液に再懸濁し、260nm
での溶液の光学密度で測定して、500μ9/村のDN
A溶液を得た(26 On+++での吸収1単位は50
μ9/x(lに等しい)。
B、CHA255.5の細胞DNAの制限フラグメント
分析 再配列したIgγl  CHA255.5重鎖遺伝子を
含むDNAフラグメントの大きさ(サイズ)を確認する
ため、制限フラグメント分析を行った。
サザーン・プロットをプローブするのに用いたDNAは
、タッカ−博士(叶、Ph1llip Tucker、
 Llniversity orTexas、 Dal
las、 Texas)から入手した。
このプラスミドは、BamHI −EcoRlフラグメ
ント上に不ズミBa1b/C生殖系列JH3およびJH
4配列を含んでいる[このフラグメントの配列は、N 
I I+データ(Nlll Data GeneBan
k ;取得番号#JOO453)によって知ることかで
きる]。
突然変異体をサブクローンしたセルラインおよび親のC
HA255.5からのDNA(20μ9)を、適当な反
応緩衝液を用い、そして制限酵素BamHIおよびXb
al(単独で、および−緒にして)をlμ9のI) N
 Aにl:j してl〜2単位用いて、37°Cで一晩
消化した。次いで、この消化DNAを、TBEr−Qi
jiiffl(89mM  トリス1:89mMボレー
トおよび2mM[EDTΔ)を用いて40ボルトで一晩
、1%アガロースゲル[シーケムCSeakem)]の
電気泳動にかけた。次にこのDNAをマニアティス記械
(383〜386頁)のようにしてニトロセルロースフ
ィルター(シュライヒャー・アンド・シュウエル)に移
した。次いで、このニトロセルロースフィルターを、ニ
ノクートランスレーンヨンした[リグハイ等(P、 J
、 Rigby et al、 、 J、 Mo1. 
[3io1ogy、 113゜237(1977))]
 J )(プローブとハイブリダイズさせたくマニアテ
ィスの387〜389頁ヲ参照>。CF(A2555重
鎖免疫グロブリン遺伝子産物を発現するか、または発現
しない細胞由来のDNAのこの比較によって、CHA2
55.5V、遺伝子が86kbのBAiHIフラグメン
トに存在していることがわかった。
円配列したλ軽鎖遺伝子を含む制限フラグメントの大き
さを測定するために、VLI−JL3遺伝子を含む0.
5kbのDNAフラグメントをプローブとして用いた。
λ群の可変領域は11個のヌクレオチドか異なっている
だけであるので、λプローブはあらゆるλ遺伝子と交差
〜ハイブリダイズする。このDNAはムリアルド博±[
叶、 Il、 Murialdo、 the Univ
ersity orToronto、 Departm
entof 1msunology]から贈られたもの
である(このVλ遺伝子の配列は、N11l Data
 GeneBank取得番号J00取得番号上0057
g79から得ることかできる)。
重鎖遺伝子産物を同定するのに用いた方法とほぼ同じ方
法を用いてλを含有する制限フラグメントを同定した。
DNAを種々の制限エンドヌクレアーゼで消化した。電
気泳動とニトロセルロースフィルターへの移動を行った
後、このフィルターを■λプローブでプローブした。こ
れらのハイブリダイゼーションによって、CHA255
.5特異的な軽鎖遺伝子は11kbのEcoRIフラグ
メント中に含まれていることがわかった。
■1特巽的な遺伝子を含有している正しいサイズ(大き
さ)のフラグメントを富ませるため、反応緩衝液#2を
用いてC1(A255.5細胞DNAをEcoRI(1
〜2単位/μ9)で消化した。サイズ豊富化DNAを単
離する方法はホズミ等[flozumiN、 、 G、
 E、 Wu、 、 Il、 Murialdo、 L
、 Roberts、 D、 Vetter。
W、L、Fife+ l11.Whiteley、 a
nd P、Sadowski、 Proc。
Nat 1. Acad、 Sc i、 US^8t、
 2484(1981)]が記載している。サイズ選択
したライブラリーを作成するため、CcoR1消化のサ
イズ選択DNA(0,24μ9)を、予め消化したファ
ージベクターEMB I、4DNAアーム(ストラタジ
ーン)(25μいにライゲートシた。これら2種類のD
NAフラグメントを緒にして、lOXのりガーゼ緩衝液
10.5μQの500mM)リス−〇(J!(pH=8
); 70mM MgCQ、; 0.IM ATP ;
 10mMジチオトレイトール(dtt)]およびT4
  DNAリガーゼ(2単位)+1.11°Cで一晩ラ
イケートした。ライゲートの後、ギカバ、り・インビト
ロ・パンケージング・システム(Gigapack I
n Vitro packaging system)
(ストラタジーン)を用い、その製品プロトコールに従
って、および宿主大腸菌(E、coli)株P2.39
2(ストラタジーン)を用いてパッケージンクヲ行った
。ギガパック・パッケージング混合物(50μg)とラ
イゲート化ファージの希釈液(10−”〜10−”)(
5μQ)を混合し、22°Cで2時間インキュベートし
た。ファージ希釈緩衝液[tgにつき、NaCC(5゜
89)、Mg* s o−6Hto (29)、l M
 ト’) ス−HCσ(pH= 7.5)(50!IQ
)、および2%ゼラチン(5mQ)からなる溶M0.5
xi7]を加えた。次いで、マニアティス記載(286
〜294頁)の標準プロトコールを用いてファージを滴
定した。滴定の後、P2゜392細胞(ストラタジーン
)を用いてl00mMプレートあたり20,000プラ
ークの密度でファージライブラリーを培養し、37°C
で一晩インキユベートした。
C−)IA255.5λ軽鎖遺伝子を同定し、そして単
離するため、大腸菌P2.392(ストラタン−ン)中
の3.0x105組換えファージを、グルンスタインお
よび゛ホブ不ス[Grunstein and I!o
gness、 Proc、Natl、Acad、Sci
、72.3961(197g)]並びにマニアティス(
312頁)のプロトコールに従ってスクリーニングした
。ムリアルド(叶、 H,Murialdo。
University of Toronto)から得
たプラスミド由来の不ズミ■λプローブを用いてこれを
行った。
ニトロセルロースフィルターに拾い上げ、さらに分析を
行うために■λ領域プローブとハイブリダイズしている
ファージを選択した。マニアティスの方法(368〜3
69頁)を用いて組換えファージからDNAを単離し、
反応緩衝液#3を用いてEc。
R1で消化した。組換えファージ挿入体のサイズをゲル
電気泳動によって分析した。組換え体の1つは1lkb
のEcoRIフラグメント挿入体を有していると同定さ
れた。このファージからのDNAを種々の・制限酵素に
よってさらに分析した。このファージをφMLCH−I
ncと命名した。
構築 φMLCH−Inc DNAを単離し、単14DNAの
一部(20μg)を、反応緩衝液#3(220μのを用
いてEcoRI(1単位/μg)で消化した。0.5μ
y/ tx(lの臭化エチジウムを含む0.75%T 
B Eアガロースゲル中、40Vで一晩、EcoRI消
化したDNAを電気泳動することによって1lkbのE
coRIフラグメントを単離した。UV透過光箱で見え
るようにした後、1lkbのフラグメントをDEAE8
1紙(シニライヒャー・アンド・シュウエル)に電気泳
動し、次いで1MNacfi中に溶出させ、エタノール
沈澱させた。次に、溶出したフラグメントをTE緩衝液
(6μg)に再懸濁した。
このフラグメントを、EcoR[l肖化したプラスミド
pS V 、neo(50n9)にライゲートした:こ
のプラスミドはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クション(American Type Cu1tur
e Co11ection、ATCC番号No、371
49)から人手可能である;psV2neo DNA(
1uiに 50n9)、Ec。
R1消化した1lkbの組換えファージD N A (
6μC;300i)、10xリガーゼ緩衝液(l μg
)およびT4  DNAリガーゼ(1μg)を用いた。
大腸菌HB I Olコンピテント細胞(B RL)を
常法によって形質転換した。具体的には、始めに)(B
IOI細胞を水上で解凍し、次にライゲート反応混合物
(10μI2)をHB l 01細胞(200μI2)
と混合し、得られた混合物を水上で30分間インキュベ
ートした。この後、42°Cで90秒間、細胞に熱ショ
ックを与え、次に水上に2分間戻した。LBブロス[1
12あたり、109のNaCC15fIの酵母抽出物、
およびlOりのトリプトンからなる](1mQ)を加え
、細胞をニュー・ブルンスウィンク(New Brun
svick)空気振盪型中、225 rpH1,37°
Cで1時間インキ」べ−トシた。次いで、その一部(2
00μQ)をアンピンリン(50μ9/RQ)含有のL
B−アガロースに蒔き、37°Cて一晩インキユベート
した。マニアティス(312頁)およびグルンスタイン
等[M、Grunstein and D、 llog
ness、 Proc、 Natl、 Acad、 S
ci、 、 USA、 72.3961(1975)]
か詳しく説明しているコロニースクリーニング法を用い
てチンピ/リン1耐性コロニーをスクリーニングした。
もう−度λネズミブローブを用いて、得られた組換えp
S V 2ne。
プラスミドを同定した。このプラスミドをpMLCH−
1と命名し、ブダペスト条約に基づき1988年11月
14日に7−ザン・リージョナル・リサーチ・ラボラト
リ−(Northern Regional Re5e
arch Lab)に寄託した(N RRL寄託番号B
−18432のもとて入手可能)。プラスミドpM L
 CH−1の制限部位および機能地図は第1図中に示し
た。
実施例3 プラスミドpHKF−1:ヒト不変に遺伝子
を含有するベクターの構築 A ヒI−D N Aの単離 ヒトγハブロタイブfbnおよびazgにホモ接合であ
る個体から全面(3M試料)を採取した。ソーパル(S
orvall)G L C−2B装置中、250 Or
pm。
22°Cでの遠心によって、この試料を遠心し、血液試
料から最上層(軟膜細胞)を集めた。軟膜細胞をパスツ
ールピペットで取り、PBSて1回洗浄した。この細胞
ベレットを、10mM  トリス−1−ICC(pH=
 8.0)および40mMNaC&からなる溶液(50
0μQ)に再懸濁し、次いで10%5DS(30μのお
よび20m9/ypQブOf7−ゼK (6μ&)(シ
グマ)を加えて溶菌した。この試料を37°Cで15時
間インキュベートした。このDNAを、等容量のフェノ
ール:クロロホルム:イソアミルアルコール混合液(2
5:24+1)で2回、クロロポルム:イソアミルアル
コールU合rffl(24+ 1 ) テ2回以上抽出
し、IO+eM)リス−)I CC(pH= 80)お
よびln+MEDTAに対して透析した。次イテ、この
DNAを50 μ9/R(1(D RN 7−ゼA(シ
グマ)で2時間処理し、続いて200μv/x(lのプ
ロテアーゼにで1時間、再消化した。上記実施例2Bと
同様にしてこのDNAを抽出し、透析し、その濃度を0
D2B。で測定して100〜200゜/村の範囲にした
B、ヒトゲノム性ファージライブラリーの作成「bnハ
ブロタイブのヒトDNA(実施例3Aで単離した21O
A1g)をMbolで部分的に消化した。
DNA(10μ9)を、TE緩衝液(11μR)、水(
20uQ)、foxのコアー(Core)制限消化緩衝
液[500ff1Mトリス(pH=8.0)、100 
mM MgCQ、、500mM NaCf2](15μ
<りに取り、これを試験管に分取した。制限酵素Mbo
lを0.0038から0.5単位/μeに増加する単位
でそれぞれの試験管に加え、1時間37°Cに保った。
次いで、試料の一部を0.7%TBE[89mM  ト
リス、89IIIMホウ酸塩、および2mMEDTA]
アガロースゲルにかけ、40Vで一晩、電気泳動を行っ
た。
このゲルの写真から、どの消化フラクションが正しい分
子型範囲(12〜24 kb)のDNAを含んでいるか
を決定した。次に、上記の実験で決めた単位のMbol
を用い(20倍にスケールアップ)、37℃で1時間イ
ンキュベートすることによって、ゲノムDNA(200
μ9)を消化した。このDNAを用い、ストラタジーン
のプロトコールに記載されているように、EMBL−3
フアージDNA(ストラタジーン)を用いてEMBL−
3ライブラリーを作成した。このストラタジーンのプロ
トコールは、い(つかの実験室マニュアル(例えば、デ
イビス)に記載されている方法に従うものである。
スクロース勾配で単離した後、大分子量のヒトDNA(
12〜24 kb)をEMBL−3フアージアームにラ
イゲートシた:DNA(loOn9)、予め単離してお
いたBamHI消化のEMBL−3アーム(100n9
)、foxのりガーゼ緩衝1夜[50011Mトリス−
HC&(pi(=8.9)、70 mM MgCf2e
、10mM att](0,5μの、およびT4  D
NAリガーセ(2単位)からなる反応混合物を調製し、
この〆捏合物を一晩、4°Cに保った。ストラタレーン
から市販のギガバッターゴールド・インビトロ・パッケ
ージング・7ステムをその製品プロトコール従ってfl
jい、そしてストラタンーンから供給される宿主大腸菌
株P2  392を用いてパッケージングを行った。ギ
ガバック・ゴールド・パッケージング混合物(500μ
のとライゲート化ファーノ(5μのを22°Cで2時間
インキュベートした。ファー/希釈緩衝液[1(にっき
、NaC(!(5.89)、Mg2S 04−6 8 
zO(2y)、1Mトリス−HCC(p)i7、5)(
50次の、および2%ゼラチン(5肩の](0 5mの
を加えた。次いで、デイビス記載[182〜183頁(
1986)]の標準プロトコールを用いてファージを滴
定した。滴定の後、P2.392細胞を用いて100m
Mプレートあたり20.000プラークの密度でファー
ジライブラリーを蒔き、37°Cで一晩インキユベート
した。
C.組換えプラスミドpH K F − 1の最終的な
構築ヒトに不変領域遺伝子を単離するため、ヒーター[
Dr.P.I!ieter, Johns Ilopk
ins University, Baltimore
, Maryland]から供給を受けたヒトにプロー
ブ(このプローブの配列は、NIH Data Bas
eがら取得番号JOO24+のもとて人手できる)を用
い、実施例3B記載のようにして、IEMBL−3ライ
ブラリーをスクリーニングした。合計5x105の組換
えファージを実施例2B記載のようにスクリーニングし
た。単一のクローンを単離し、φHK17ー1と命名し
た。φHKF−I  DNA(15μQ)を、反応緩衝
液#3中、BamHIおよびHindlllで同時に消
化した。実施例2E記載のようにして、5、2kbのフ
ラグメントをDEAE811E上に単離し、BamHI
およびI−1indlllで消化したクローニングベク
ターpBR322にライゲートした。
アンピシリン耐性の組換えコロニーを再度ヒトにプロー
ブを用いて同定し、単一のクローンを単離し、pHKF
−1と命名シタ。pl−iKF−1i1&、フタペスト
条約に基づき1988年3月4日にアメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクションに寄託され、Δ’r c 
c寄託番号#67637を得ている。プラスミドpHK
F−1の制限部位および機能地図は第2図中に含まれて
いる。
実施例4 プラスミドpGCHAK+ヒト不変領域に遺
伝子および不ズミCHA255.5vLλ遺伝子を含有
するtlii乳動物発現ベクター1)プラスミドpML
cH1dB CI(A255.5可変領域遺伝子を発現ベクター中に
サブクローンするためには、いくつかの実験工程が必要
であった。始めに、第1図に示した遺伝子を含んでいる
Vλフラグメントの5°末端からBalHl部位を削除
した。「充填」反応の公知プロトコール(マニアティス
、113〜l14頁)ヲ用イてこれを行った。反応緩衝
液#2を用い、BamHlで3分間、pMLcHl(l
μg)を部分消化した。
次いで、マニアティス(113〜114頁)記載のよう
に、それぞれ5mMa度の4種のデオキシリボヌクレオ
チドdTTP、dGTP、dCTPおよびdATP、2
単位のフレノウ(Klenow)酵素、およびlOXの
緩衝液[0,5M)リス−1−1cc(pH=7.5)
: OIM MgC(b: 10mMジチオトレイトー
ル]を含む溶液(10μQ)を加え、全反応混合物容量
を50uQにして、BamHI末端を平滑にした(Ba
m81部位を削除するために)。この反応混合物を30
分間インキュベートした後、DNAをフェノールクロロ
ホルム混合液で抽出し、次にエタノールで沈澱させた。
このDNAを再懸濁し、実施例2Eの方法に類似する通
常のライゲート法により、T4DNAリガーゼを用いて
自己ライゲートさせた。HBIOI細胞(B RL)を
用いて形質転換を行い、得られた形質転換体をプラスミ
ド ミニープレブ(mini−prep)法(マニアテ
イス、368〜369頁)でスクリーニングして、正し
いBam111部位がうまく削除されているプラスミド
を同定した。この構築物をpMLc81dBと命名した
。第1図はプラスミドpMLcl−11dBとプラスミ
ドpMLCH−1の関係を示すものである。
2)プラスミドpMLcH2 pMLC)[ldB由来のプラスミドDNAを単離し、
これを用いてpM L CH2を構築した。反応緩衝液
#3を用い、pMLC81dB(10Mg)を11in
dlllおよびBamHlで消化した。同時に、ベクタ
ーpBR322を同じ酵素で消化した。消化したpBR
322DNA(約100 ny)をpM L CH1t
jB消化DNA(300ng)と混合し、上記のように
T4  DNAリガーゼを用いてライゲー1へした。再
び、このライゲート産物をHB 101細菌細胞(BR
L)に導入し、得られた形質転換体をプラスミド1)N
Aのミニ−プレバレージョン(マニアティス)によって
スクリーニングして正しいサブクローンを同定した。こ
の正しいサブクローンからのプラスミドをPMLCH2
と命名した。このプラスミドは、pBR322のH1n
dlll −BanF([部位に挿入された5、75k
bのCHA 255 。
5−特異的な■λ遺伝子領域を含有していた。
3)プラスミドpS V 2 gpt−Cla次に、こ
のプラスミド由来のDNAを用いて発現ベクターpc 
CHAを構築した。このキメラ発現ベクターのベースと
して発現ベクターpSV2gpt[アメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクションからATCC番号#371
45のもとで人手できる]を用いた。反応緩衝液#3中
、psV2gptD N A (l uy)を制限酵素
EcoRI(1単位/μ9DNA)で消化した。次いで
、マニアティス(113〜114頁)記載のように、そ
れぞれ5mMの4種のデオキシリボヌクレオチドdTT
P、dGTP、dCT1〕およびdATP、2単位のフ
レノウ酵素、およびIOXの緩衝液[0,5M+−リス
−tl CQ(pT−(−75); O,IM MgC
f1t: lomMジチオトレイトールコの溶M(10
μのを加え、全容ff150μσ中で、EcoR1末瑞
を平滑にした。この反応を室温で30分間行い、続いて
ライゲート反応を行い、これにより、ホスホリル化した
C1a[リンカ−(2μg)(二ニー・イングランド・
バイオラブズ)をEcoRl−平滑末端化pS V t
gpt(500n9)にライゲートして、後のキメラベ
クター用の新しいCla I H位を611製した。C
1alリンカ−の配列は、d(pcA’l’cG^TG
)であった。ライゲート反応は実施例2E記載のように
して行った。ライゲートの後、過剰のリンカ−をDNA
の電気泳動によって除き、実施例2Eのようにして直線
状のpS V 2 gpt−ClaフラグメントをDE
AE81紙上に単離した。上記のプロトコールおよび試
薬を用いてこの単離DNΔを自己ライゲートさせた。I
(B 101コンピテント細胞を実施例2Eのように形
質転換し、アンピシリン耐性コロニーを制限酵素消化に
よって分析した。
次いでぐ得られたベクターpS V 2 gpt−Cl
aをC1alおよびBamHI制限酵素(1単位/ID
NA)で同時に消化した。また、ベクターpM L C
H2も2種類の同じ制限酵素で消化した。次にこれら消
化物からのDNAを一緒にして上記実施例2Eのように
ライゲートし、これを用いて大腸菌I(BIOIを形質
転換した。再度、形質転換体からのプラスミドDNAを
制限消化によって分析し、gpt薬物耐性遺伝子哺乳動
物発現ベクターおよびCHΔ255.5特異的な軽鎖λ
遺伝子を含有する発現プラスミドpGcHAを同定した
B、プラスミドpG CHA Kの構築ベクターpc 
CHAおよびpHKFlを用いて、ヒトに遺伝子に融合
した不ズミV J域を含有する真核生物性の発現ベクタ
ーを構築した。プラスミドpc CHAを制限酵素Ba
mH1で消化し、約11.15kbのフラグメントを単
離した。プラスミドpHKF1(ATCCから取得番号
67637のもとて人手できる)を、反応緩衝液#3中
、Hindlllで消化した。このHindlll消化
したプラスミドをフレノウで充填し、ホスホリル化した
BaaHlリンカ−にュー・イングランド・バイオラブ
ズ)を加え、次にベクターをBamHIで切断し、約5
.2kbの制限フラグメントを単離した。このプラスミ
ドpHKF−1の5.2kb BanHIフラグメント
を、プラスミドpc CHAの約11.2kb1’3a
mtllフラグメントにライゲートしてプラスミドpc
 CHΔKを得た。プラスミドpc C)(A Kは、
ヒi・に領域をコードしている遺伝子に結合した、ネズ
ミλC11A可変領域をコードしている遺伝子を含有し
ている。このプラスミドの制限部位および機能地図は第
1図中に含まれている。
実施例5 プラスミドpUCVHInc−IA +ネズ
ミCHA255.5可変重鎖領域を含有するプラスミド
の構築 vh特穴的な遺伝子を含有している正しいサイズ(大き
さ)のフラグメントを豊富化するため、反応緩衝液#2
を用いてCHA255.5細胞DNA’i−[3aml
(I(1〜2中位/μ9)で消化した。サイズみ富化D
NAの単離方法は、ホズミ等[11ozumi。
!t、、G、lシ、Yu、、  Il、Muriald
o、  L、Roberts、  D、VetLer。
W、1.、Pife  M、Whiteley、 an
d P、Sadowski、 ProcNat 1. 
Acad、 Sc i、 USA81.2484(19
81)]が記載している。サイズ選択したライブラリー
を作成するため、BamHI消化のサイズ選択DNA(
0,24μy)を、予め消化したファージベクターEM
BL3DNAアーム(ストラタジーン)(2,5μg)
にライゲートした。これら2種類のDNAフラグメント
を一緒にして、IOXのりガーゼ緩衝液[0,5μQ1
500nMトリスー[−1(J!(pH=8); 70
mM MgC12z;10mMノチオトレイトール]お
よびT4DNAリガーゼ(2単位)中、4°Cで一晩ラ
イゲートした。ライゲートの後、キがバック・インビト
ロ・パフケージング・システム(ストラタシーン)を用
い、その製品プロトコールに従って、および宿主大腸菌
株P2.392(ストラタジーン)を用いてパッケージ
ングを行った。ギガバ、り・パッケージング混合物(5
0μQ)とライゲート化ファージの希釈液(10−”−
10−’)(5μのを混合し、22°Cで2時間インキ
コベートした。ファージ希釈緩衝液CtQにつき、Na
Cl2(5,81?)、Mgw S O46F+、0(
29)、IMI−リス州C((pH=7.5)(50β
の、および2%ゼラチン(5M(Dからなる溶液0.5
xl!]を加えた。次いて、マニアティス記載(286
頁)の標準プロトコールを用いてファージを滴定した。
滴定の後、大腸菌P2.392(ストラタジーン)細胞
を用いて1100OIプレートあたり20.000プラ
ークの密度でファージライブラリーを蒔き、37℃で一
晩インキユベートした。
よび単離 ClA255.5重(γl)鎖用に、大腸菌p2゜39
2(ストラタジーン)中の3.0xlO’組換えファー
ジをマニアテイス(320頁)のプロトコールに従って
スクリーニングした。このスクリーニングは、タッカ−
(叶、Ph1llip Tucker、υn1vers
ityof Texas、 Dallas、 Texa
s ; N11l Data Genebank取得番
号−JOO453)から入手したプラスミド由来のネズ
ミJH3−JH4プローブを用いて行った。
ニトロセルロースフィルター取上物をIIL、さらに分
析を行うためにJ H領域プローブとノ\イブリダイズ
するファージを選択した。マニアティスの方法(365
頁)を用いて組換えファージからDNAを単離し、反応
緩衝液#2を用いてBamHfで消化した。組換えファ
ージ挿入体のサイズをゲル電気泳動によって分析した。
組換え体の1つが8、6kb Bam[([フラグメン
トを有していると同定された。このファージからのDN
Aを種々の制限酵素によってさらに分析し、φMHCH
−Incと命名した。
終的な構築 ファージφMVHCH−Inc由来のD N A (l
 u9>を、製造元(B RL)l供の条件および緩衝
液を用い、BaaHlで消化した。pUc13(二ニー
・イングランド・バイオラブズ)からのD N A(1
βg)も、Ba5H1で消化した。次いで、T4  D
NAリガーゼを用いてこれら2種類のDNAをライゲー
トした。細菌株大腸菌JM109(ストラタジーン)を
このDNAで形質転換し、次に2μg/ z(11PT
G、4μv/y(l X−ガル、および100μ9/m
Qアンピンリン含有のプレートに蒔いた。白色コロニー
を単離し、基本的にマニアティス記載(368〜369
頁)のような制限消化によってDNAを分析した。この
制限地図により、8.6kbのBamHI挿人体がCl
A255.5特異的vh遺伝子を含有しているプラスミ
ドpUcVH1nc−IAを確認した。大腸菌に−12
HB 101/pUcVHIncIAの拾得物は198
8年11月14日にN RRLに寄託され、取得番号N
RRL  B−18433のもとで入手可能である。こ
のプラスミドの制限部位および機能地図は第3図中に示
されている。
実施例6 プラスミドpHGIZ+ヒト不変領域重鎖遺
伝子を含有するプラスミドの構築A、ヒトDNAの単離 前記実施例2Dにおいて詳しく説明したようにしてヒト
DNAを単離した。
13  ヒトプラスミドライブラリーの作成azgハブ
ロタイブのヒトDNAを10μ9として、反応t−Qi
Ji故# 3 [50mM l・リス−〇 C12(p
H= 8 。
0)、10mM MgCl2t1100mM Na(J
!]中、制限エンドヌクレアーゼBa5HIおよびF(
indll!(それぞれ30単位)を用い、全量200
μg中で消化した。消化したフラグメントをエタノール
沈澱によって20μQまで濃縮し、50mアンペアで1
5時間、0.6%低ゲル化温度アガロース(FMC)ゲ
ルにかけて分離した。大きさ(サイズ)が6〜7kbの
DNAフラグメントをゲルから切り出した。
また、クローニングベクターpUc18[ヤニッシュペ
ロン等(Yanisch−Perron C,et a
l、、 Gene 33103(1985))が開示;
ニュー・イングランド・バイオラブズから人手可能であ
る1も、上記のよう1こBan)(lおよびHindl
llで〆肖化した。このヒトDNAフラグメント(15
0n9)を、15℃で72時間、30r@MトリスーH
C(!(pH=7.6)、lOIIIM MgC+2t
、5mMジチオトレイトール、1mMATP、およびT
4  DNAリガーゼ(lμQ:2重位)を含む全反応
容量400μg中において、pUC18ベクター(50
ng)にライゲートした。このライゲートDNA試料の
半分(100ng)を用いて新鮮にP’+!l %’2
したコンピテントな大腸iJM109細胞(ストラタジ
ーン)(500μのを形質転換し、得られた形質転換体
を、X−ガル、I PTG、AMPプレート[4μg/
s+(l X−ガル、21/2121 PTG、100
μ9/村アンピシリン]に蒔いた。
C1組換えプラスミドpl−IGIZの最終的な構築タ
カハシ等[Takahashi、N、 at al、、
 Ce1l、 29:671、679(1982)]が
記載し、ホンジEl −[T、 Honj。
University of 0saka、  Jap
an]から提供されたヒトγ2プローブを用い、実施例
2E記載の方法により、組換えヒトDNAを含むアンピ
シリンif性のpUc18コロニーをスクリーニングし
た。ヒトγ1遺伝子に対応する7、5kbの挿入体を含
有しているクローンを同定し、HyHGlと命名した。
このヒトγ不変領域遺伝子を含有している同じ7.5k
bのH1ndlll −Ba5Hfフラグメントを、次
に、実施例3A記載の方法と同じ方法を用いて、pBR
322中に再クローンした。このヒトγ1遺伝子を含有
するpB R322ベクターをpHGIZと命名し、ブ
ダペスト条約に基づき1988年3月4日にアメリカン
・タイブーカルチャー・コレクションに寄託した(AT
CC寄託番号#67638)。
このプラスミドの制限部位および機能地図は、第3図中
に含まれている。
実施例7 プラスミドpHG 1−CHA : CHA
255VH領域遺伝子とヒトCIl領域遺伝子の両方を
含有するベクターの構築 pUcVH[nc−1a由来のプラスミドDNAをマニ
アナイス記載(86〜96頁)のようにして抽出した。
次いで、反応緩衝液#2を用いてこのDNA(10μ9
)を酵素Hindlllで消化した。次に、トリスホウ
酸塩緩衝液を用い、この消化DNAを07%アガロース
ゲルで一晩、電気泳動した。3゜4kbのフラグメント
をDEAE81紙上に単1tlした。プラスミドpHG
 I Z(ATCC寄託番号#67638)由来のD 
N A (1u9)も、Hindlllで消化し、次い
でウシ腸アルカリホスファターゼ[ベーリンガー会マン
ハイム(Boehringer Mannheis)]
で処理したく酵素供給元のプロトコールによって)。
ホスファターゼ処理したpHc I Z(200n9)
およびpUcVHInc−IA由来の3.4kb VH
Hindlllフラグメント(l OOn9)を用い、
全容110μg中でライゲートを行った。ライゲートは
12°Cで一晩行った。このライゲートDNAを用いて
10閑セルラインHBIOI(BRL)を形質転換し、
形質転換されたセルラインをアンピシリンブレートに蒔
いた。始めにコロニーをニトロセルロースフィルターに
移し、次に標準プロトコール[グルンスタインおよびホ
グネス(上記; 1975)およびリフハイ等(」1記
)]により]ニックートランスレーショしておいた3、
4kbV+−1フラグメントとハイブリクイズさせるこ
とによって、コロニーをスクリーニングした。次いで、
V liプローブとハイブリクイズしたコロニーをアン
ピシリン(50μ9/xの含有のLB(5iのにおいて
一晩増殖させ、DNAを単離し、制限消化によって分析
した。ヒトγ1不変領域遺伝子に融合したCHA255
.5  VH特異的な遺伝子を含有しているプラスミド
を同定し、p+−(G 1−Cl・IAと命名した。こ
のプラスミドは、vh領領域公知特異性の不ズミハイブ
リドーマ由来であり、不変領域がヒト供給源由来である
、キメラ免疫グロブリン重鎖遺伝子を生成させるよう構
成されている。このプラスミドの制限部位および機能地
図は第4図中に示されている。
実施例8 プラスミドpNCHAG l : CHA2
55V)l領域遺伝子とヒトγ1C1(領域遺伝子の両
方を含有している哺乳動物発現ベクターの構築A、プラ
スミドpS V 2 neo−Cla次に、pHGl−
CHAのキメラ部分と哺乳動物発現ベク9−pS V 
2 neo[アメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ションからATCC[#37149のもとで人手可能]
を用いて、1乳動物細胞中で発現させ得るキメラ免疫グ
ロブリンベクターを構築した。psV2neo DNA
(lμg)を反応緩衝液#3中、EcoR’l(1単位
/μ9DNA)で消化した。次いで、マニアティス(1
13頁)ffa載のように、それぞれ5mMの4種のデ
オキシリボヌクレオチドdTTP、dGTP、dCTP
およびdΔ′rP、2単位のフレノウ酵素、およびIO
Xの緩衝液[0,5Mトリス−HCf!(pi(=7.
5); 0.1M MgCQ2: l OmMジチオト
レイトール]の溶液(10μm2)を加え、全容ff1
50μ&中で、EcoR1末端を平滑にした。この反応
液を室温で30分間インキュベートし、続いてライゲー
ト反応を行い、この反応によって、ホスホリル化cla
l’Jンヵー(2μg)(二ニー・イングランド・バイ
オラブズ)を1゛4DNAリガーゼでEcoRI−平滑
末端化pSV 2 neo(500n9)にライゲート
して、後のキメラベクター用の新規C1a1部位を創製
した。このCla I ’) ンt)−(D配列は、d
(+)CATCGATG) テあった。
ライゲート反応は実施例2E記載のようにして行った。
ライゲートの後、過剰のリンカ−をDNAの電気泳動に
よって除き、実施例2Eのようにして直線状のpS V
 、neo−ClaフラグメントをDEAE81紙上に
単離した。実施例4Aに記載した試薬を用いてこの単1
111DNAを自己ライゲートさせた。
)I B 10 ’lコンピテント細胞(BRL)を実
施例2Eのようにして形質転換し、アンピシリン耐性コ
ロニーを制限酵素消化によって分析した。
次いで、得られたベクターpS V tneo−Cla
を、C1a+およびBamHI制限酵素(1単位/μ9
DNA)で同時に消化した。キメラベクターpHGIC
HAもこれら2種類の酵素で消化した。実施例2E記載
のようにして5.0kbのpS V tneo−Cla
Bamフラグメントとlo、5kbのC1a−B am
 pHG1−CHAフラグメントをDEAE31紙上に
単離した。この10.5kbフラグメント挿入体DNA
(300n9)と5.0kbベクターpS V tne
o−Cla(150n9)を用いて、実施例2D記載の
ような通常のライゲート反応を行った。HBIOI細胞
(BRL)の形質転換の後、組換えプラスミド(pN 
CHAGIと命名)をプラスミドDNAの制限マツピン
グによって同定した。このプラスミドは、CHAキメラ
重鎖ポリペプチドを産生させるために用いるキメラ発現
ベクターであり、その制限部位および機能地図を第4図
に示す。
(以下、余白) 夫権珂旦 クローニングした遺伝子のDNA配列決定 クローニングしたCHA可変軽鎖および重鎖遺伝子の配
列決定は、ブルースクリプト(Bluescript)
/ D N A 配列決定システム(ストラタジーン)
、および配列決定キットシークエナーゼ[5equen
ase; U、S、Biochenicals+ C1
eveland、 0hio]により提1%されるプロ
トコールを用い、2本鎖および1本鎖鋳型の両方につい
て常法で行った。DNAスター(DNASLar、 M
adison、 Wisconsin)から市販のコン
ピューターソフトウェアプログラムMAPSEQにより
、クローニングしたCHA可変軽鎖および重鎖領域遺伝
子について得られたDNA配列から、上記DNA配列に
よってコードされているポリペプチドのアミノ酸配列を
推定した。
実施例10  牛メラ重鎖および軽鎖遺伝子を含有して
いる構築物によるlln乳動物セルラインのトランスフ
ェクション 前記実施例1のように、トランスフェクションに用いた
軽鎖免疫グロブリンプラスミドはpGCHAKであった
。始めに、ヒトに遺伝子に融合したキメラ可変軽(VK
)CHA遺伝子を含むpG CHAKプラスミドを、前
記のエレクトロポレーション法(電気穿孔法)によって
S P 210バイブリド−?細胞(ATCC)にトラ
ンスフェクションした。
SP210−Agl 4細胞を5%FC3含有の培地(
1−(H,、DMEM、RPMIなど)で増殖させ、エ
レクトロポレーション前の3日間を対数増殖期に保った
。プラスミドベクターpG CHA K (20μ9)
は制限酵素Rvul(lu/μg)および反応緩衝液#
7を用いて直線化した。トランスフェクション時に、S
 P 210細胞をIEC臨床用遠心機で遠心して集め
た(800rpm、10分間、室温)。次いで、611
Mデキストロースを含むバンクの緩衝食塩溶液(ギブコ
)で細胞を3回tし浄し、最終濃度1.5xlO”細胞
/籾で再懸濁した。この細胞の一部(0,3112)を
0.5x 10″10.3m&の密度でキュベツトに分
取し、直線化したDNAを加えた。
この混合物を水上に10分間(7つな。Q、3mi間隔
の電極(P/N 472)およびBTx100トランス
フエクタ−(BTX、 Inc、、 San Dieg
o、 Ca、)を用いてエレクトロポレーションを行っ
た。250V、1パルス5ミリ秒の持続時間を用いた。
次いで、このエレクトロポレーションした細胞を、2x
105/R12(T75フラスコ中)の密度で72時間
、培地に再懸濁した(37°C,5%COを雰囲気下)
次に細胞を、24ウエルのプレートに5xlO’/lI
&の密度で適当な抗生物質中に蒔いた;pccII A
 Kを含む5P210細胞を、1μ9/肩gでHMAX
l、O培地[50r+9/ 112ヒボキサンチン、2
50n9/戻σミコフエノール酸、および50μ9/1
12キサンチン、シグマ]に蒔いた。HMΔXfrH’
lコロニーを含むウェルのそれぞれから上If(200
μQ)を集めた。次にこの上清を、以下のように、pc
CHA Kのキメラ免疫グロブリン遺伝子の発現を示す
であろうヒトに不変領域遺伝子の存在について検定した
B、キメラCHA255.5を分l必しているSPキメ
ラC)(A〜ヒトに遺伝子を発現しているトランスフエ
フシリンした5P210を、ヒトにについて、イングバ
ル等[Engvall、E、 and Perlnan
n。
P、、 Inmunochemistry 8 : 8
71〜g74(197り]記載のような、通常の酵素−
結合した免疫吸着検定(ELISA)によって同定した
。この検定の目的は、ネズミハイブリドーマCHA25
5.5から単離したネズミ可変領域から構築し、ヒトに
遺伝子に融合させたpc CHA Kプラスミドベクタ
ーによってコードされているキメラに鎖ポリペプチドを
分泌している細胞を同定することである。10mMリン
酸ナトリウム(pH=7.8)中、5μ9/x(lのヤ
ギ抗−ヒトに鎖[ターボ(Tago)# 4106]の
溶液を調製した。96ウエルプレートのそれぞれのウェ
ルをこの溶液(50μQ)で被覆した。次いで、このプ
レートを37℃で一晩インキユベートした。続いてプレ
ートを水およびPBS十0.1%ツイーン(豐/V)で
徹底的にすすいだ。上清フラクシヨン(50μQ)をそ
れぞれのウェルに加え、室温で2時間インキュベートし
た。プレートを上記のようにもう一度すすいだ。ヤギ抗
−ヒトに鎖アルカリホスファターゼコンジュゲート(タ
ーボ#2496)を、土浦材料と同じ培地でt:too
o希釈した。
この100μQをウェル毎に加え、室温で1時間インキ
ュベートした。上記のようにプレートをすすいだ。アル
カリホスファターゼ基質を包装の指示通り、蒸留水3肩
Qにつき1錠の割合で調製し、この仄’I(150μぐ
)をそれぞれのウェルに加え、37°Cで30分間イン
キュベートした。この反応を5001M EDTA(5
0μQ)で停止させ、次いで405nmでの吸収を測定
した。最高レベルのに発現を示した上清を同定し、対応
するウェルからの細胞を集め、キメラ構築物pNCI(
AGIの導入用に増やした。
5P210細胞へのトランスフエクシクン用に用いた重
鎖免疫グロブリンプラスミドは、実施例8記載の構築物
由来のpNCHAG1であった。
集めたキメラCHA−ヒトに遺伝子を発現する細胞集団
を、次に、キメラCEM重鎖遺伝子を含有しているプラ
スミド構築物とともにエレクトロポレーションした。に
遺伝子のエレクトロポレーションについては、5P21
0キメラに産生細胞(SP 210−K)をエレクトロ
ポレーション前の3日間、対数増殖期に保った。プラス
ミドDNApNCHAGI(20μ9)を反応緩衝液#
7中、酵素Rvulで直線化した。実施例2A記載のよ
うにして、細胞を集め、洗浄し、1.5xlo7細胞/
ff&の密度で再懸濁した。DNAを加尤、この混合物
をエレクトロポレーション前の10分間、水上に保った
。用いた条件は、5ミリ秒で1パルス、250Vであっ
た。細胞を、哺乳動物組織培養培地、例えばDMEM、
RPMIまたはHH2[後者はハイプリチック社(Hy
britech Incorporated、 San
Diego、 CA、)から人手できる]、5%FC3
+HMAX 1.01:2.5 x l 05/m12
テ蒔いた(37℃、5%COt雰囲気下、72時間)。
この後、細胞を、24ウエルプレート中の、活性濃度(
500Mg/xののG418抗生物質[ジェネチシン(
Geneticin)、ギブツーBRL]およびHMA
Xl、0を含む培地に5XIO’/ffQで蒔いた。選
択を14日間行い、コノ時点でHMAX/G418耐性
コロニーのウェルを同定し、さらに分析を行った。
実施例11  CEM−キメラ抗体を分泌する5P21
0細胞、キメラ抗体の同定および分析A、成厘桔介 スクリーニング検定を行って、キメラCHA軽および重
の両鏡の免疫グロブリン遺伝子産生の抗体(ベンジルE
DTAハブテンを結合している)を発現するトランスフ
ェクションされた5P210細胞を同定した。金属コン
プレックス抗原に指向性である抗体の検出に用いた検定
方法は、ワン等[Wang、R,、et  at、、 
  l5aunolJethods、  18:  1
5l57−16i(t]が記載しているような通常の固
相放射線免疫検定である。この検定を次のようにして行
った。実施例1の方法に従ってBSAをベンジル−ED
TAで誘導体化した。BSAの各分子は5〜IO個のキ
レート分子を含有していた。ハブテンに対して105%
モル過剰のInCQ3をBSA−キレート溶液に加える
ことによってキレートをインジウムで処理し、0.13
Mクエン酸塩(pH= 6 )中で一晩インキユベート
した。この溶液を10aMリン酸塩(pH−7,2)で
容量にしtこ。このBSA−EDTA−In溶液を10
μ9/xcの濃度にし、50μQを96ウエルの微量滴
定プレートのウェル毎に加えた。プレートを37℃で一
晩乾燥した。
検定前にプレートをPBSおよび0.1%ツイーン20
および脱イオン水で洗浄した。各ウェルに土浦(50μ
Q)をいれ、これを室温で2時間インキュベートした。
ウェルをPBS十〇、1%ツイーン20および脱イオン
水でもう一度洗浄した。アルカリポスフ1ターゼにコン
ジュゲートしたヤギ抗−ヒトに(ターボ#2496)を
l:500希釈し、100μQをそれぞれのウェルに加
えた。これを室温で1時間インキコベートした。上記の
ようにウェルを洗浄した。各ウェルに基質(150μQ
)を入れた。この酵素反応液を回転機上、37°Cで6
0分間インキュベートした。この反応を500mMのE
 DT A(pl(= 8)(50μ12)で停止させ
た。405nMでの吸収を、BIO−TEK Elis
aリーダーで測定した。
B−1鷹 親和性の検定を行って、EOTUBEのインジウム(1
11)コンプレックスに対する本キメラ抗体C11A2
55.5のKaを測定した。EOTUBEはp−(アミ
ノベンジル)EDTAの誘導体であり、アンダー七ン等
[L、 D、 Andersen、 J、 M、 Fr
1ncke、 andD、 L、 Meyer ;米国
特許No、 151855 ; 1988年2月3日出
廓]が開示している。
EOTUBEの合成、および通常のスカッチャード分析
(Scatchard Analysis)におけるそ
の使用を以下に説明する。
1、EOTUBEの合成 具体的には、EOTUBEは、N−(2−ヒドロキシエ
チル)−N’−<p−ベンジル)チオ尿素部分のベンジ
ル炭素によって内部エチレン炭素の1つが置換されてい
るEDTAである(置換されている炭素の立体化学はS
である)。EOTUBEの合成は、可能な限り金属イオ
ンを排除して行った(例えば、すべてのガラス器具は6
M HCf2で洗浄し、脱イオン水だけを用いた)。
米国特許N o、 4.622.420およびメアレス
[Meares。
C,F、、 Anal、Biochet、  1426
8−75(1984)コ記載のようにして、(S)−p
−二トロベンジルEDTAを調製し、(S)−4−イン
チオシアナトベンジルEDTA(以下、ITcBEと略
称する)に変換した。
この凍結乾燥したITCBEをQ、3MノHCl2[U
ILrex、 J、T、Baker、 Phillip
sburg、 Nu、]に再懸濁して最終濃度がおよそ
50i+Mになるようにした。この溶液を一70°Cで
保存した。他に特記事項がなければ、すべての反応は4
0°Cの水溶液中で行った。
201MのITCBE(2,5zυを200mMのエタ
ノールアミン(1,3!M2)に加え、lONのNa0
t(でそのpHを11.0に調節した。その容量を水で
5xQに調節し、混合物を15分間反応させ、この時点
でHPLC分析によりチエツクした。
ITCBEのすべては、HP L C[ヒューレットパ
ノカード(Ilewlatt−Packard)109
0機;C18ツノラム50mM酢酸トリエチルアンモニ
ウムの緩衝水溶液から純メタノールへの直線勾配で溶離
]で保持時間3.6分のEOTUBEに変換していた。
この生成物を、0.1−IMのギ酸アンモニウム(pt
l = 6 )の勾配液(110肩ので溶離するDEA
 rEセファデックス(Sephadex) A −2
5カラム(ll zc)のアニオン交換クロマトグラフ
ィーで精製した(このカラムを280nnでモニターし
た)。生成物を含む分画を集め、凍結乾燥した。この生
成物は、246na+で吸収最大値、吸光係数18,0
00を有していた。
その構造は13CのNMRスペクトルで調べた[バフア
ン・インス′ツルメン′ソ(Yarian Instr
uments)XL−300型300MIIz機を使用
;重水中で行う]。ITCBEのインチオンアネート部
分中の炭素に対応するピークは139 ppmのところ
にあり、EOTUBEでは182 ppmのピークに換
わった。このピークはチオ尿素結合中の炭素に対応して
いる。
ITCBEのスペクトルの芳香族領域(128〜138
 ppm)は4つのピークを示すが、EOTUBEは3
つである。脂肪族領域では、ITCBEとEOTUBE
に共通して5つのピークがあり、64および49ppm
のさらに2つのピークがEOTUBEのスペクトルに存
在する。この後者ピークはそれぞれ、ヒドロキシおよび
チオ尿素部分に隣接する炭素に対応している。
方法 1、牛レートの放射線ラベル A、  9.9540x 1o−7j1モルのEOTU
BEを600μCiのIll l nでラベルする。
1、他のいかなる金属も導入することなく次の成分を金
属不含の試験管に加える: a、0.O158aMの金属不含のEOTUBE 63
μg; b、0.26Mの金属不含のクエン酸アンモニウム(p
H=6.0)63uQ: c、600μCiの1’In(1,30x IQ−”屑
モル)。
2、室温で一晩インキコベートする。
B、EOTUBEに対して1.05モル比のインジウム
(+111+1と基底状態のInの両方)を与えるに十
分なコールドインジウムとともに工程Aを行う。
1、上記(1,A、2)の試験管に0.OL2aMの基
底状態1 nCQ310.2μ+2(1,044xlO
−”屑モル)を加える。
2 室温で4時間インキュベートする。
C0薄層クロマトグラフィー分析を行ってインジウムの
導入を調べる。
■、長さ10.5インチのシリカゲルプレート(O25
インチ片に区画してレーンとする)の2つのレーンの底
からl c+y+こラベルした試料0.5μQをスボッ
I・する。
2、試料スポットを乾燥させる。
310%酢酸アンモニウム:メタノール(1:1)溶媒
系を入れたT L C′NJにプレートを置(。
4゜9cuの印のところまでプレートを展開させる。
5、プレートを引き上げ、乾燥させる。
6、プレートの各レーンを3つの部分に分ける。
a、初めの部分は底から2cyの印のところまで。
b、真中の部分は2〜3.5cmの部分。
C8後ろの部分は3.5c*から頂上の部分。
7、両レーンについて各部分のcp+sを測定する。
8、各レーンの後ろの部分の%は、キレートに導入され
たインジウム%に等しい。
D、インジウムが90%以上導入されたときには、検定
で使用するためEOTUBEをPBS(pト1=7.5
)で4.40p9/μCに希釈する。
■、コールド競合体の調製 A、5.530x 10”’屑モルのEOTUBEをを
EOTUBEに対してモル比1.02XのInCf23
でコールドインジウム処理する。
■、いかなる汚染金属も導入することなく次の成分を金
属不含の試験管に加える: a、7.9mMの金属不含のEOTUBE70u(!(
5,530x 10−’xモル)b、、0.26Mの金
属不含のクエン酸アンモニウム(pH=6.0)70μ
!! c、10.2+Mの基底状態111C12355,3μ
12(5,64lx 10−’zモル)。
2、室温で4時間インキュベートする。
B、後記■で使用するため、1次Qの0.40n9/u
Qとlxf!の0.36n9/μi2が得られるようP
BS(pH=7.5)で希釈する。
11、抗体感度曲線 A、96ウエルの微ff1lTi定プレートに次の成分
を加える(3組): 1 、 4 、4 p9/ u(lのEOTUBE−目
’In基底状態In25μQ 2.20.1O15,2,5,1,25,0623,0
,313,0,156,0,080,0,040,0,
020,またはOμti/dの抗体希釈液(CIA25
5または誘導体)25μQ 3.10%ウマ血清を含むRPMI  50μQ4.2
0μQが0.5μこのAbと結合するであろう濃度まで
希釈したセファロースビーズに結合させたヒツジ抗−マ
ウスIgG[マーチ等(March、S、C,、Par
kin、 1.  and CuaLrecacas、
 P、 Analyt、 Biochem、 60.1
49(1974))] 20μQ0 B、室温の回転機で一晩インキユベートする。
C,ウェルの内容物をガラスファイバー濾紙に吸引する
D、濾紙ディスクを切り取り、計測する。
E、結合した分画と抗体希釈液#の関係をグラフにする
F、どの点く希釈液#)が90%の最大結合に等しいか
を決定する。
G、上記により決定した希釈液をスカッチャード検定に
用いる。
■、スカッチャード検定 A、96ウエルの微ff1A1定プレートに次の成分を
加える(3組): 1.4.4μg/μm2(7)EOTLIBE−”’I
n基底状態In25μQ; 2、上記11−Bで調製した0、 4 On9/u(l
および0.36n9/μi2の連続希釈のEOTU[3
E−基底状態In25μ12:それぞれ11種類の希釈
とOの点により、l On9/ウェル〜4.40p9/
ウエルと0の24個の点が得られる;10%ウマ血清を
含むRPMIで希釈; 3.10%ウマ血清を含むRPMI  25μQ;4、
目的の抗体25μQ(感度検定で測定した濃度); 5、セファロースビーズと結合させたヒツジ抗−マウス
IgG(感度曲線検定で用いたものと同じ)20μQ0 B、室温の回転機で一晩インキユベートする。
Cウェルの内容物をガラスファイバー濾紙に吸引する。
D、 il1紙ディスクを切り取り、計測する。
E、結合/遊離のモル数に対して結合モル数をプロット
する。
F3曲線の直線部分の直線回帰をとる:負の傾きがKa
である。
実施例12  SV40エンハンサ−不含のクローニン
グシステムの構築 A、プラスミドpS V 2gpt(E −)の構築プ
ラスミドpS V 2 gpt −Cla(実施例4A
3で構築)(約20μQ;10μ9)を、水(21μの
、反応績#I液#6(5μ12)、制限酵素Pvull
(2μのおよび制限酵素5phll(2μのと混合し、
37°Cで2時間インキュベートした。次いで、反応混
合物を0,5%TBEゲル電気泳動にかけ、実質的に実
施例2E記載の方法に従ってDEAE81紙からPvu
ll/5ph11消化ベクターフラグメントを精製した
これら制限部位の3°突出末端を充填するために、P 
vull/ S phll消化のpS V 2gpt−
C1aベクター(約20μI2)を、1OXT4ボリメ
ラーセ緩衝液[700mMトリス(pH7,4)、l 
00 r@M MgCQ、、50mM DTTI(3μ
Q、)、dNTPU合物(各05mMのd A T l
)、dTTPSdc′rP、dGTP、pH7,0)(
3μ12)、水(3μρ)およびT4DNAポリメラー
ゼ(BILL、Xiμり;5U)と混合した。
得られた混合物を37°Cで15分間インキュベートし
たのち、70°Cで10分間加熱した。フェノール抽出
およびエタノール沈澱の後、DNAをTE緩衝液(5μ
Q)に再懸濁した。このDNAフラグメント(約1 u
Q ;約500 ng)を水(10u12)、5Xライ
ゲーシヨン緩衝液(5μQ)、1100n ΔTP(2
μの、およびT4リガーゼ(2μQ)と混合した。
室温で2時間インキュベートしたのち、実質上、実施例
2Eの方法に従って、ライゲーション混合物で大腸菌1
−I B l 01細胞を形質転換した。形質転換体か
らプラスミドDNAを単離し、5V4Qエンハンサ−領
域の適切な約0.2kbの欠失を示すプラスミドをプラ
スミドpS V 2 gpt(E −)と命名した。
B、プラスミドpS V 2 neo(E  )の構築
5V4Qエンハンサ−を含んでいないプラスミド[)S
 V 2 neoも構築した。プラスミドpS V 2
 ne。
Cla(実施例8Aで構築)(約20u(!;10μ9
)を、実質的に上記と同様にして、反応緩衝液#3中、
制限酵素BamHIおよびHindlllで消化した。
電気泳動にかけたのち、ネオマイシン耐性付与遺伝子を
含有する約2.3kbのH1ndlll/ B amH
IフラグメントをDEAE81紙から単離、精製した。
同様に、プラスミドpS V 2gpt(E−)を、制
限酵素BamHIおよびHindlllで消化し、電気
泳動にかけて大きいベクターフラグメントを精製した。
次いで、実質的に上記の方法に従ってプラスミドpS 
V 2neo −Claの約2.3kb Hindll
l/BamHIneo含有制限フラグメントをプラスミ
ドpsv2gpt(E −)のH1ndlll/ B 
asHI消化ベクターフラグメントとライゲートさせた
。大腸菌HBIO1細胞を形質転換し、プラスミドDN
Aを単離した後、プラスミドpS V 2neo −C
Iaの約2.3kbH1ndlll/ BamH1ne
o含有フラグメントがプラスミドpS V 2gpL(
E−)ベクターの主骨格と結合してなるこれらのプラス
ミドをpsV2neo(E  )と命名した。
1、プラスミドpGCHAK(E−) プラスミドpsV2gpt(E−)DNA(約lOμ9
100μのを、水(4μの、反応緩衝1α#1(12μ
Q)、制限酵素C1al(2μ(りおよび制限酵素Ba
1l+−11(2μρ)と混合し、37℃で一夜インキ
ユベートした。DEAE81紙に電気泳動した後、大き
いベクターフラグメントを精製し、TE(10μ12)
にifj懸濁した。プラスミドpG CHA K (実
施例4Bで構築)(約20μg;5μg)を水(23μ
Q)、反応緩衝液#l(5μ(り、制限酵素C1al(
2μC)と混合した。37°Cて5時間経過した後、反
応混合物をフェノール/クロロホルム抽出し、エタノー
ル沈澱に付した。次いで、消化したDNAを水(25μ
Q)に15懸濁し、反応緩衝液#3(3μのおよび制限
酵素B ami(l (2uQ)と混合した。37°C
で2時間インキュベートしたのち、消化DNAを電気泳
動にかけ、約9.0kbの不ズミ可変、ヒト不変にをコ
ードしているC1al/BamHI制限フラグメントを
DEAE81紙から精製した。次いで、この約9.Ok
bフラグメントを上記のごとく、C1al/Baa+H
I消化プラスミドpS V 2gpt(E−)とライゲ
ートさせ、大腸菌細胞に導入した。プラスミドを単離し
たのち、正しい制限地図を有するプラスミドをプラスミ
ドpGCEMK(E−)と命名した。
2、プラスミドpGcHAGl(E−)同様に、プラス
ミドpNcI(AGI(実施例8Aで構築)(約40μ
Q;5μg)を、水(3μg)、反応緩ii液# 1 
(5uQ)、制限酵素C1al(2μlりと混合した。
37°Cで5時間経過した後、反応混合物をフェ/−ル
/クロロホルム抽出し、エタノール沈澱に付した。次い
で、消化したDNAを水(26μのに再懸濁し、反応緩
衝液#3(3μQ)および、制限酵素BamHI(1μ
のと混合した。37°Cで2分間経過後、反応混合物(
15μQ)をとり、250μMEDTA(1μI2)と
混合した。37°Cで5分間経過後、反応混合物の残余
(15μQ)をとり、250μMED T A (1μ
Q)と混合した。このBam81部分消化により、すべ
ての可能なCla I / B ant−11制限フラ
グメントが得られた。0.5%’「B Eゲル電気泳動
にかけたのち、約12.7kbのC1al/I3amH
+ (部分)制限フラグメントをCla I / B 
amHI消化プラスミドルS V 2gpt(E−)と
ライゲートさせ、大腸菌細胞に導入した。これらのプラ
スミドをプラスミドpC;CHAG 1(E−)と命名
した。
l、プラスミドpNCHAK(E−) 実質上、実施例12c記載の方法に従い、ブラスミ ド
pSV2neo(E−)DNA(約10u9;100μ
g)を制限酵素C1alおよびBamHIで消化し、ベ
クターフラグメントを単離し、精製した。次いで、ネズ
ミλ可変、ヒト不変領域をコードしている遺伝子を含有
するプラスミドpc CHA K (実施例12で単離
)の約9.0kb C1al/BamHl制限フラグメ
ントを、実質上、実施例12c記載の方法に従い、プラ
スミドps V 2 neo(E−)のC1a1 / 
B amHI消化フラグメントにライゲートさせてプラ
スミドpNCHAK(E−)を得た。
2、プラスミドpNcHAG1(E−)また、実施例1
2cの記載に従い、プラスミドpNCHAG1の約12
.7kbのCla l / B aral(1(部分)
制限フラグメントをプラスミドpsV2ne。
(E−)のC1al/Ba1HI消化フラグメントニラ
イゲートすることによってプラスミドpNCHAG(E
−)を構築した。従って、プラスミドpNCHAG(E
−)はネズミ可変、ヒト不変γをコードする遺伝子をS
V40エンハンサー不含発現ベクター上に含有している
実施例13  SV40エンハンサー不含ベクターによ
るキメラ軽鎖および重鎖遺伝子のトランスフェクション 実質上、実施例10記載の方法に従い、2種類の軽鎖用
SV40エンハンサー不含発現ベクター[pGCHAK
(E−)およびpNCHAK(E−)]、fff[l:
S V 4 Qエンハンサ−含有重鎖発現ベクター[p
GCHAGlおよびpNCHAG1コを用い、電気穿孔
法でS P 210ハイブリドーマ細胞をトランスフェ
クションした。各プラスミドを単独で、あるいは同時に
細胞にトランスフェクションしてよいか、始めにに鎖と
gptマーカーとを含有するベクターで細胞をトランス
フェクションし、次いてγ鎖とneoマーカーとを含有
するベクターで第2のトランスフェクションを行うと、
最良の結果が得られる。
■請不含培地を包含する通常の補乳動物細胞培逐培地を
用いて培養し、適当な抗生物質(gptベクター含有細
胞についてはHMΔX、neoベク9−含有細胞につい
ては0418)を用いて選択した後、実質上、実施例1
0およびll記載の方法に従い、全抗体の分泌について
細胞を分析した。これらの結果から、キメラ抗体または
抗体軽鎖の発JJJiiSV40エンハンサー不含軽鎖
ベクターでトランスフェクションされた細胞において増
加することがわかる。
実施例14 ヘテロローガスな免疫グロブリン鎖の発現
のための高レベル発現システムの構築A、プラスミドp
i 9HANCHの構築始めに、式: で示されるDNA配列を有するオリゴスクレオチドポリ
リンカーを調製することにより、中間体プラスミドpi
 9HANCHを構築した。上記のリンカ−は、当業者
周知の方法で1本鎖デオキシオリゴスクレオチドから合
成した。1本鎖デオキシオリゴスクレオチドは、バイオ
サーチ社[Biosearah Incorporat
ed、 San Raphael CA、]から市販の
バイオサーチ8700型DNA合成機のような、ホスホ
ラミ、ダイトの化学を利用する市販の装置を用いて合成
することができる。DNA合成の池の方法も当業者には
既知である。1本jjl D N A合成のための、伝
統的な改良ホスホトリエステル法は、イタクラ等[1t
akura et al、 、 5cience、 1
98:1056(1977)]およびクフレア[Cre
a et al、+ Proc、Natl、^cad、
 Sc i、 USA、 75 : 5765(197
g)]により示されている。
加えて、特に好ましいDNA合成法が、ヒスイング等[
11suing eL al、、Nucleic Ac
1d Re5earch 11:3227(1983)
]およびナラン等[Narang et al、、 M
ethods in Er+zymo1ogy、68:
90(198G)]により開示されている。
2種類のオリゴヌクレオチド鎖(それぞれ、約2.5μ
(りを2×アニーリング緩衝液(0,2MNaCQ、2
0mM トリス−HCf!(pH7,8)、および2m
M  EDTA)(50μf2)および水(50μ&)
と混合した。反応混合物を70’Cで5分間加熱したの
ち、2本の一本鎖がアニールして一本のリンカ−セグメ
ントとなるよう、室温まで徐々に放冷した。
プラスミドpUc19にュー・イングランド・バイオラ
ブズ)(約1μg)を、実質上、既述の方法に従い、制
限酵素EcoRIおよびHindlllで消化した。約
2.6kbのベクターフラグメントを精製したのち、E
coRl / H1ndlll消化プラスミドpUC1
9に合成ポリリンカーをライゲートさせた。
大腸菌を形質転換し、再度、プラスミドDNAを単離し
た後、リンカ−領域内にHindlll、5spl。
Pst l 、 5stllおよびEcoR1部位を有
するプラスミドをプラスミドp19HANと命名した。
プラスミド5(−)CHAVLは、実質的に既述の方法
に従い、最初にB 1uescriptベクター、M1
3(−)SK(ストラタジーン)を制限酵素Ba巾11
Iおよび5stlで消化し、大きいベクターフラグメン
トを単離して構築した。次いで、プラスミドpMLCH
−1を制限酵素BanHIおよび5stlで消化し、ネ
ズミCIA可変領域をコードしている遺伝子を含有する
約1100bpのフラグメントを単離した。プラスミド
pMLcHiは、/−イン・リージコナル・リサーチ・
ラボラトリ−(Northern Regional 
Re5earch Laboratory、  181
5North Llniversity 5treet
、 Peoria、 IL 61604)に寄託され、
その永久保存カルチャーコレクションの一部を構成して
いる大腸菌K12 HBIOI/pMLcH−1から常
法によって単離することができる。大腸菌K 12  
HB 101/pMLC)llは取得番号NRRL B
−18432のもとて人手可能である。プラスミドpM
LCH−1の約1100bp BamHI/Sst!制
限フラグメントをB aml−11/ S st I消
化ベクターM13(−)SKとライゲートさせ、得られ
たプラスミドを用い、実質上、上の実施例記載の方法に
従い、大腸菌を形質転換した。再単離および制限マツピ
ングの後、適正な約1100bpのBamHI/5st
17ラグメントを含有するプラスミドをプラスミド5(
−)CHA V Lと命名した。
実質上、既述の方法に従い、プラスミド5(−)CI−
I A V L (約1 n)を制限酵素Pst[で消
化した。
ネズミCFlA可変領域をコードしている遺伝子を含有
する約900bpのPstl制限フラグメントを単離し
、制限酵素Pstlでポリリンカー領域に切断を施して
おいたプラスミドp19HANとライゲートさせた。形
質転換、再単離および制限マツピングにより、ポリリン
カーの14indl11部位に最も近接してCHA遺伝
子のJ領域を含有しているプラスミドをプラスミドp1
9HANcHと11名した。プラスミドp191(AN
およびp19f(ANCI−1の制限部位および機能地
図を第5図に示す。
AK−3の構築 発癌抗原と反応するネズミ可変に鎖をコードしている遺
伝子を含有するプラスミドpMLCE−10(約10u
9)[ATCCに1988年3月4日に寄託されており
、ATCC番号67639のもとて人手可能である]を
制限酵素Hind[IIで消化し、完全なネズミ可変に
領域およびCEMプロモーターを含有する約3.8kb
のHindlll制限フラグメントを単離した。また、
プラスミドpHKF−1(約tu9)[ft1番号AT
CC67637のもとテA′r’CCから人手可能]も
制限酵素1−1indlllで消化し、最も大きいベク
ターフラグメントを単離した。プラスミドpMLCE−
10の約3.8 kb H1ndll!フラグメントを
、プラスミドpHKF−1のHind11!1肖化ベク
ターフラグメント1こライゲートしてプラスミドpHK
CE−1oを得た。次に、プラスミドpHKCE−IQ
を制限酵素C1alおよびBamH[で消化し、にプロ
モーター、ネズミに可変領域およびヒト不変領域をコー
ドしている遺伝子を含有する約9.0kbの制限フラグ
メントを申離した。この約9.0kbのCla I /
 B am)−11フラグメントを、C1al/Ba+
l1t(I消化したプラスミドpS V 2 gpt 
−Cla(実施例4Δ3で構築)にライゲートしてプラ
スミドpGCEMKを得た。
実質上、上記の方法に従い、プラスミドpGC13MK
(約5μ9)を制限酵素C1alおよび5splで消化
し、CEMにプロモーターを含有する約2゜2kl)の
C1al/5spl制限フラグメントを精製した。
別の反応で、プラスミドpGcEMKを制限酵素C1a
lおよび5stllで消化し、約9.4kbのベクター
フラグメントを単離した。さらに、プラスミドp19H
ANcHを制限酵素5splおよび5st11で消化し
、ネズミにCHA可変領域をコードする遺伝子を含有し
ている約931bpの制限フラグメントを単離した。3
成分ライゲーンション反応により、プラスミドpGCE
MKの約9.4kbCla I / S 5tllベク
ターフラグメント、プラスミドpGCEMKのOEMプ
ロモーター含有の約2゜2kb C1al/5spl制
限フラグメント、およびネズミにC)[A可変領域をコ
ードする遺伝子を含有しているプラスミドp191−I
 A N C)lの約931bp Ssp[/5stl
l制限フラグメントのすべてを、実質的に既述の方法に
従い、−緒にしてライゲートさせ、大腸菌を形質転換し
た。プラスミドを単離し、制限マツピングに付した後、
制限フラグメントのサイズが適切であるプラスミドをプ
ラスミドpc CHA K −2と命名した。
IOの構築 上記の方法を用い、完全なCEM231.6.7可変に
領域を含有するプラスミドpMLCE−10由来の3.
8 kb H1ndlllフラグメントを、さらにプラ
スミドpHKF−1のHindl11部位にサブクロー
ニングして、ヒト不変に領域遺伝子に融合したネズミO
EM231.6.7可変軽領域を含有するキメラプラス
ミドを得た。反応緩衝液#2(ギブコーBRL)を用い
、pMLCE−10DNA(1μ9)を1単位/μ9の
Hind[lIで消化した。pi(KFl(1μg)を
同様にして消化した。既述のように、pMLCE−10
の消化DNAを電気泳動にかけ、38kbのHindl
l!フラグメントをDEAE81紙上に単離し、TE(
5μQ)中に溶出させた。この+1indlll消化し
たpMLCE−to(lμy; 1μQ)を、lOxの
ライゲート緩衝液、ioIIIMATP。
およびT4DNAリガーゼ(2中位)の存在下、合計容
ff1loμ12中で、Hindlll消化したpHK
 Fl(600n9)にライゲートした。12°Cで一
晩、ライゲートを行い、上記のように、BRLからのH
B 101コンピテント細胞をプラスミド形質転換に用
いた。pHKCE−10と命名したこのプラスミドをプ
ラスミドDNAの制限マツピングによって同定した。
2)プラスミドpGCEMK(E−)の構築プラスミド
pS V 2gpt(E  )(約10μ9:100μ
Q)を、水(4μQ)、ギブコ反応緩衝液#1(12μ
0.)、制限酵素C1al(2μg)および制限酵素B
am111(2μQ)と混合し、次いで37°Cで一晩
インキュベートした。DEAE81紙に電気泳動した後
、大きいベクターフラグメントを精製し、TE(10μ
のに再懸濁した。プラスミドpHKCE−10(約20
μQ;5μg)を、水(23μの、ギブフ反応緩衝液#
1(5μ12)および制限酵素C1al(2μC)と混
合した。37℃で5時間保った後、反応液をフェノール
/クロロホルムで抽出し、エタノール沈澱させた。次い
で、この消化DNAを水(25μQ)に再懸濁し、ギブ
コ反応緩衝液#3(3μQ)および制限酵素BamHI
 (2μ0と混合した。37°Cで2時間インキュベー
トした後、消化されたDNAを電気泳動にかけ、約9.
0kbの不ズミ可変ヒト不変にをコードしているC1a
l/BanH[制限フラグメントをDEAE81紙から
精製した。次に既述のようにして、この約9.0kbの
フラグメントをC1al/BamHN消化のプラスミド
pSV2gpt(E)にライゲートし、大腸菌細胞に導
入した。プラスミドを単離した後、正しい制限地図を有
するプラスミドをプラスミドpccEMK(E−)と命
名した。
3)同様の方法でプラスミドpGCEMK(E〜)(実
施例12cで構築)を制限酵素C1alおよび5stl
l−+jf’i化し、約9.2kbの制限フラグメント
(SV40エンハンサ−不含)を単離した。次いで、こ
のフラグメントを、プラスミドpGCEMKのCEMに
プロモーターを含有する約2.2kbC1a1/5sp
l制限フラグメント、およびプラスミドp l 9 )
I A N CHの約931bp 5spl/5stl
l制限フラグメントとライゲートさせて、プラスミドp
c CHA K−3を構築した。プラスミドpGC)(
AK−3とプラスミドpGCHAK−2は、プラスミド
pc CHA K−3が5V4Qエンハンサ−を欠如し
ている点でのみ異なる。プラスミドpcCHΔに−3の
制限部位および機能地図を第6図に示す。
実施例15  CEMプロモーターを用いるヘテロロー
ガスなCHA抗体の発現 A)実質上、実施例3記載の方法に従い、様々なCI−
I A構築物で5P210細胞をトランスフェクション
し、実質上、実施例4記載の方法に従い、抗体特異性お
よび親和性を測定した。I−I M A Xを選択に用
いるプラスミドpGCHAKによる最初のトランスフェ
クション、およびl−I M A XとG418の両者
を選択に用いるプラスミドpN CHAGlによる第2
トランスフエクシヨンの結果、上清に低レベルのキメラ
CHA抗体が分泌された。
プラスミドpc CHA K −2による第1のトラン
スフェクションの後、プラスミドpNCHAG1でトラ
ンスフェクションすることにより、高レベルの抗体産生
が認められた。このデータはプラスミドpGCEMKか
ら単離されたプロモーターがヘテロローガスな免疫グロ
ブリン配列を高レベルに発現させるのに有用であるとい
うことを示している。
B)さらに、pGCHAK−3によるトランスフェクシ
ョンの結果、pGCHAKとpNCHAKによるトラン
スフェクションの10倍高いレベルでに鎖が発現された
。従って、プラスミドpGCEMK由来のCEMKにプ
ロモーターは、5V4Qエンハンサ−を欠如した最初の
発現ベクターよりち良1jrにヘテロローガスな免疫グ
ロブリン配列を発現させることができる。
【図面の簡単な説明】
第1図は、プラスミドpMLCH−1およびpGC1l
八にの制限部位および機能地図を示す模式図であり、 第2図は、プラスミドpl−IKF−1の制限部位およ
び機能地図を示す模式図であり、 第3図は、プラスミドpUCVHInc−IAおよびp
i−1c;12の制限部位および機能地図を示す模式図
であり、 第4図は、プラスミドpHGl−CHAおよびpNcl
IAGlの制限部位および機能地図を示す模式図であり
、 第5図は、プラスミドpi 9HANおよびp19HA
 N C)[の制限部位および機能地図を示す模式第6
図は、プラスミドpc CHA K −3の制限部位お
よび機能地図を示す模式図である。 FIC! FIG 2 FIG  3 −にII

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1、キメラモノクローナル抗体のキレート特異的な軽鎖
    可変領域をコードしている第1のDNA配列が、次の配
    列: 【遺伝子配列があります】 からなるアミノ酸配列をコードしていることを特徴とす
    る、該第1のDNA配列を含有する組換えDNA化合物
    。 2、第1のDNA鎖暗号配列が、次の配列:【遺伝子配
    列があります】 を含有している請求項1記載の組換えDNA化合物。 3、第1のDNA暗号配列が真核性シグナルペプチドを
    コードしているDNA配列をさらに含有している請求項
    1または2記載の組換えDNA化合物。 4、DNA構築物がキメラモノクローナル抗体の軽鎖不
    変領域をコードしている第2のDNA鎖配列をさらに含
    有している請求項1、2または3のいずれかに記載の組
    換えDNA化合物。 5、シグナルペプチドをコードしているDNA鎖配列が
    、次の配列: 【遺伝子配列があります】 からなる請求項3記載の組換えDNA化合物。 6、キメラモノクローナル抗体のキレート特異的な重鎖
    可変領域をコードしている第1のDNA配列が、次の配
    列: 【遺伝子配列があります】 からなるアミノ酸配列をコードしていることを特徴とす
    る、該第1のDNA配列を含有する組換えDNA化合物
    。 7、第1のDNA鎖暗号配列が、次の配列:【遺伝子配
    列があります】 を含有している請求項6記載の組換えDNA化合物。 8、第1のDNA暗号配列が真核性シグナルペプチドの
    DNA配列をさらに含有している請求項6または7記載
    の組換えDNA化合物。 9、DNA構築物がキメラモノクローナル抗体の重鎖不
    変領域をコードしている第2のDNA鎖配列をさらに含
    有している請求項6、7または8のいずれかに記載の組
    換えDNA化合物。 10、シグナルペプチドをコードしているDNA鎖配列
    が、次の配列: 【遺伝子配列があります】 からなる請求項8記載の組換えDNA化合物。 11、第1のDNA鎖暗号配列がネズミハイブリドーマ
    から導かれたものである請求項1〜10のいずれかに記
    載の組換えDNA化合物。 12、ネズミハイブリドーマがCHA255.5である
    請求項11記載の組換えDNA化合物。 13、第2のDNA鎖暗号配列がヒトリンパ細胞から導
    かれたものである請求項4または8記載の組換えDNA
    化合物。 14、第1図記載のプラスミドpMLCH−1または第
    1図記載のプラスミドpMLCH1dBである請求項1
    または2記載の組換えDNA化合物。 15、第3図記載のプラスミドpUCVHInc−1A
    である請求項6または7記載の組換えDNA化合物。 16、第1図記載のプラスミドpGCHAKである請求
    項4記載の組換えDNA化合物。 17、第4図記載のプラスミドpHG1−CHAまたは
    第4図記載のプラスミドpNCHAG1である請求項8
    記載の組換えDNA化合物。 18、キメラモノクローナル抗体の軽鎖をコードしてい
    る請求項1〜5のいずれかに記載の組換えDNA化合物
    と、軽鎖が発現されるよう軽鎖をコードしているDNA
    配列と関連させて設置した転写および翻訳用DNA配列
    を含有していることを特徴とする、キメラモノクローナ
    ル抗体を発現させ得る真核宿主細胞。 19、キメラ抗体の重鎖をコードしている請求項6〜1
    0のいずれかに記載の化合物と、重鎖が発現されるよう
    重鎖をコードしているDNA鎖配列と関連させて設置し
    た転写および翻訳用DNA配列を、第2の組換えDNA
    化合物が含有しているか、または第1の組換えDNA化
    合物がさらに含有している請求項18記載の真核宿主細
    胞。 20、次の配列: 【遺伝子配列があります】 からなるアミノ酸配列を有する第1の哺乳動物種由来の
    キレート特異的な軽鎖可変領域と、第2の別種哺乳動物
    種由来の不変領域を含有していることを特徴とするキメ
    ラモノクローナル抗体。 21、次の配列: 【遺伝子配列があります】 からなるアミノ酸配列を有する第1の哺乳動物種由来の
    キレート特異的な重鎖可変領域と、第2の別種哺乳動物
    種由来の不変領域を含有していることを特徴とするキメ
    ラモノクローナル抗体。 22、請求項20記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変
    領域と、請求項21記載のアミノ酸配列を有する重鎖可
    変領域を含有しているキメラモノクローナル抗体。 23、鎖の可変領域がネズミハイブリドーマから導かれ
    たものである請求項20、21または22のいずれかに
    記載のキメラモノクローナル抗体。 24、ネズミハイブリドーマがCHA255.5である
    請求項23記載のキメラモノクローナル抗体。 25、抗体の不変領域がヒトリンパ細胞から導かれたも
    のである請求項20〜24のいずれかに記載のキメラモ
    ノクローナル抗体。
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