JPH02500329A - ターゲット化多機能蛋白質 - Google Patents
ターゲット化多機能蛋白質Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
ターゲット化多機能蛋白質
発明の背景
本発明は、たとえば特異的結合アッセイ法、アフィニテイ精製法、生物触媒反応
、薬物ターゲット処理、画1象形成、各種の腫瘍形成性および感染性扶患の免疫
学的処理、ならびに他の状態に使用される新規な組成物−以下ターゲット化多機
能蛋白質(targeted multifunctional protei
ns Jと呼ぶ−に関する。より詳細には本発明は組換えDNAから複数の領域
を含む単一ポリペプチド鎖として発現される生合成蛋白質であって、これらの領
域のうちの1つは抗体結合す位に類似の構造およびあらかじめ選ばれた抗原決定
基に対する親和性を備え℃おり、これらのうち他の1つは別個の機能をもち、生
物活性を備え、イオンに結合すべくデザインされ、または該蛋白質の固定化を容
易にすべくデザインされているものに関する。本発明は結合蛋白質自体、および
それらの構成法にも関する。
ヒト抗体には5つの群がある。それぞれ同じ基本構造(第1図診照〕またはそれ
らの多を木であり、これは重(HJ Q (分子量約50,0OOdJと呼ばれ
る2個の等しいポリペプチド、および2個の等しい軽(LJ鎖(分子量約25,
000dJからなる。5群の抗体はそれぞれ類似する一組のL鎖および独自の一
組のH鎖を備えている。L鎖は1個の可変領域および1個の定常領域からなり、
一方H@は1個の可変領域および3イ固以上の定常領域からなる。対合したL鎖
およびH@の可変領域は合わせてFv領領域または単に“Fv”とし℃知られて
いる。このFvが免疫グロブリンの特異性な決定し、定常領域は他の機能をもつ
。
アミノ酸配列データは可変領域がそれぞれ3個の高可変領域またはループな含み
、これらは時に相補性決定領域、すなわち“CDR”と呼ばれ、比較的不変のフ
レームワーク(枠組み〕領域、すなわちFR″4個によりフランクされているこ
とな示す(カハト(kabat )ら、免疫学的に興味深い蛋白質の配列〔米国
保健福祉省、第3版、1983年、第4版、1987年〕ノ。
高可変領域は個々の抗体の結合特異性に関与し、蛋白へ群としての抗体の結合の
多様性に寄与すると推定されている。
モノクローナル抗体は診断薬および治療薬の双方として用いられている。これら
は確立された方法に従って、マウスリンパ球様細胞と適宜なマウス骨セ腫細胞系
の融合により形成されたハイブリドーマによってルーティンに製造される。
この文献には、悪性細側を破壊し、もしくは位置を判定するために、または局在
させた薬物もしくは酵素の作用を誘導するために、生物活性な有する物質、たと
えば薬物、毒素および酵素を体内の特定の地点にターゲット化するという概念に
関する多数の参考文献が含まれている。生物活性物質なモノクローナル抗体に結
合させることによりこの効果を達成することが提唱された(たとえば7.−グル
(Vogel 、 Immunoconj ugates。
Antibody Conjugates in Radioimaging
and Therapyof Cancer、 1987人ニューヨーク、オッ
クスフォード大学出版;オヨヒコースラ(GhO8eeta1.(1978ノJ
、Natl。
Cancer In5t、61:657−676ノ診照ノ。しかし非ヒト抗体は
ヒトに注射された場合、免疫反応を誘発する。ヒトモノクロ−ナル杭内はこの問
題を軽減するでろろうが、特にヒトハイブリドーマが著しく不安定であり、また
免疫処理された牌臓細胞をヒトから摘出することが実現不可能であるため、これ
らを細胞融合法によって製造するのは困舞である。
ヒトアミノ酸配列および非ヒトアミノ酸配列から構成されるキメラ抗体は非ヒト
免疫グロブリン配列に対する循環性ヒト抗体の誘発がより少ないと思われるので
、潜在的に治療上の価値が高い。従って異なる囃乳動物源からのアミノ酸配列よ
りなるハイブリッド抗i分子が提示された。これまでデザインされたキメラ抗体
はらる覗孔動物源からの可変領域、およびヒトまたは他の隔乳動物源からの定常
領域よりなる(モリソンら(MOrrisOn et al、(1984J P
r0C0Natl、ACad、SCi 。
U、S、A、、81:5851−6855J ;ノイベルゲルら(Neuber
geret al、(1984J Nature 312:604−608ノ
:サーガ/ら(Sahagan et al、(1986J J、Immuno
l、137 :1066−1074J ; 欧州特許出願EPO8430236
8,0,ジェネンテツク; 85102665.8. リサーチ・ディベロップ
メント社、日本; 85305604.2 、スタンフォード;国際特許出願P
CT/GB85100392 、セルチック・リミティッドノ。
結合機能は抗体のH鎖およびL鎖双方のアミン末端に位置する可変領域に局在す
ることが報告され℃いる。可変領域は天然の抗体分子から蛋白分解により開裂し
たのちですら非共有的に会合しており(vHvL二量体として、Fv領領域呼ば
れるハそれらの抗原認識能および結合能の大部分を保持する(たとえばインA−
にう(Inbar e t al、 、 Pr0C,Na tl 、ACad、
Sci 。
U、S、A、(1972ノロ9:2659−2662ノ; ホッホマンら(Ho
chman e t−al−(1973J Brochem−12:1130
1135:および(1976J BiOChem、 15:2706−2710
J ; ’/ヤロryおよびギホーk (Sharon anc! GiVOl
(1976JBiOC]1em。
15:1591−1594ノ;ローインブラットおよびハーバ−(RO8enb
latt and Haber(1978〕Biochem、17:3877−
3882J ;z−リ−)ヒら(Ehrlich et al、(198,OJ
BiO−chem、19:4091−40996J参照〕。 実質的ニ定常領、
VV含まない2本鎖Fvk組換えDNA 技術により製造する方法は米国特許第
4.642,334号および対応する公告された欧州豐許第088,994号明
紀曹に示されている。
発明の要約
一観点におい℃は本発明は組換えDNA技術により得られた単一遺伝子から発現
した1本鎖多う能蚤白質を提供する。この蛋白質はあらかじめ選ばれた抗原決定
基に結合しうる簀白質領域少なくとも1mV含む生合成抗体結合部位(BABS
Jを含む。
この領域のアミノ酸配列は、あらかじめ選ばれた抗原決定基と結合しつる、免疫
グロブリン分子の可変領域の配列の少なくとも一部と相同である。この結合部位
に結合したペプチドは、哺乳動物における生物活性に適した立体配座をもつエフ
ェクター蛋白質からなるポリペプチド、イオンを封鎖しつるアミノ酸配列、また
は固形支持体に選択的に結合しうるアミノ酸配列である。
他の観点においては、本発明はポリペプチドリンカ−により結合したポリペプチ
ド領域2個な定めるポリペプチド1本鎖す含む、生合成結合部位蛋白質な提供す
る。各領域のアミノ酸配列は一組の枠組み領域(FRJ間に位置する一組の相補
性決定領域(CDRJを含み、これらはそれぞれ免疫グロブリン分子からのCD
RおよびFRの少なくとも一部と相同である。これらの領域の少なくとも1個は
、異なる免疫グロブリンに少な(とも部分的に相同である一組のCDRアミノ酸
配列配列び一組のFBアミノ酸配列な含む。2個のポリペプチド領域は一緒にな
って、選ばれたCDHにより決定される、あらかじめ選ばれた抗原に対する特異
性な備えたハイブリッド合成結合部位を定める。
さらに他の観点におい℃は、本発明はポリペプチドリンカ−により結合した2個
の領域を定めるポリペプチド1本鎖を含む生合成結合蛋白質を提供する。各領域
のアミノ酸配列は一組のFH間に位置する一組のCDRを含み、これらはそrそ
れ、;吹免疫グロブリン分子からのCDFiおよびFRの少なくとも一部と相同
である。リンカ−は、結合蛋白質が結合に適した立体配座なとる場合に一方の領
域のC末端と他方の領域のN末端との間の距離を埋めるのに十分な長さのポリペ
プチドを定める複数のペプチド結合アミノ酸からなる。このリンカ−は、−緒に
なっ℃好ましくは親水性配列を構成する親水性アミノ酸からなる。
水溶液中で無接造形ポリペプチド立体配置をとるリンカ−が良好に作用する。結
合蓋白質は一組のFHによって適切な立体配座に保持された一組のCDHの集合
的三次構造により定められ、あらかじめ選ばれた抗原部位に結合しうる。好まし
くは結合蛋白質はCDR領域のデザインの鋳型として用いた免疫グロブリン分子
の結合特異性と少な(とも美質的に等しい特異性なもつ。
この種の構造は少なくとも106M−1、好ましくは108 M −1の結合親
和性な有しうる。
好ましい観点においては結合並白質のFRはヒト免疫グロブリンからのFHの少
なくとも一部と相同であり、リンカ−は少なくとも約40オングストロームに及
び;ポリペプチドスペーサーが多機能蛋白質の結合部位と第2ポリペプチドの間
に挿入されており;結合蛋白質はあらかじめ定められた抗原決定基に対し、その
結合蛋白質のCDR領域のための鋳型として用いた免疫グロブリン分子の結合親
和性より2オーダー劣ることのない親和性なもつ、好ましいリンカ−およびスペ
ーサーはシスティンな含まない。リンカ−は好ましくは非反応性側基を有するア
ミノ酸、たとえばアラニンおよびグリシンを含む。リンカ−およびスペーサは複
数の連続的なアミノ酸配列コピーを結合させることにより作成できる。たとえば
(Gly4Ser) 30 本発明はこれらの蛋白質をコード化するDNA、お
よびこれらのDNAQ宿し、かつ発現し5る宿主細胞をも提供する。
ここで用いる生合成抗体結合部位すなわちBABSという句は、組換え技術によ
り誘導されたDNAから発現した合成蛋白質な意味する。BABSはあらかじめ
定められた抗原性物質と結合重べくデザインされたポリペプチドを定める、生合
成により製造されたアミノ酸配列からなる。こnらの合成ポリペプチドの構造は
、天然の抗体、それらの断片、たとえばFvl または既知の合成ポリペプチド
もしくは“キメラ抗体”とは、以下の点において異なる。すなわち結合の特異性
および親和性に関与するBABSの各領域(天然抗体の可変領域とアナログであ
る)が単−DNAから発現したペプチド結合によって結合しτおり、それら自体
かキメラでらっ℃もよく、たとえば少なくとも2種の異なる抗体分子の各部分に
相同の各アミノ酸配列からなっていてもよい。本発明の一形態ななすBABSは
、合成りNA。
すなわち複数の化学合図オリゴヌクレオチドのリゲーシ曹ン、またはハイブリド
ーマ、成熟B細胞クローンのゲノムから誘導されたDNAの断片、もしくはこの
種の天然源から誘導されたCDNAライブラリーのリゲーションにより形成され
た組換えDNAを発現すべく形成された細胞性宿主におい工合成されるという点
で生合成によるものである。本発明の蛋白質は、これらの合成分子があらかじめ
選ばれた抗原決定基に対する特異的親和性をもつべくデザインされているという
点で°結合部位”として特性づげるのが適切である。本発明のポリペプチドは、
天然抗体の抗原認識に関与することが知られている領域に習ってパターン化され
た構造を含む。
従っ℃本発明の目的は、1または2以上のエフェクター蛋白質、およびlまたは
2以上の生合成抗体結合部位からなる新規な多機能蛋白質、ならびにこれらの蛋
白質をコード化するDNA配列を提供することでろる。他の目的は、目的とする
いずれかの特異性な備えた生合成抗体結合部位ポリペプチドを形成するための一
般的方法を提供することである。
図面の簡単な説明
以上および他の本発明の目的、その種々の特色、ならびに本発明自体は、以下の
記述を添付の図面と合わせて読むことにより℃より十分に理解されるであろう。
第1A図は2本のL鎖(それぞれ1個の可変領域および1個の定常領域からなる
)ならびに2本のH鎖(それぞれ1個の可変領域および3伽の定常領域からなる
)な含む無傷の工(抗体分子の模式図である。第1B図は■ヨおよび■1領域−
それぞれ4個の枠組み(FRJ領域および31固の相補性決定(CDRJ領域か
らなる−を示すFv蛋白質(およびそれらなコードするDNAJの構造の俟式図
である。CDHの境界はたとえばモノクローナル26−10.すなわちジゴキシ
ンに対し特異性である周知の解明されたネズミモノクローナルについて示されて
いる。
第2A〜2F図は、それぞれ生合成抗体結合部位を含む、本発明に従って構成さ
れた幾つかの群の物質の模式図である。
、第3図は本発明の理解を容易にするために一列にまっすぐに並べた1文字記号
で表わした5種のアミノ酸配列(H鎖ノを示す。配列1はネズミモノクローナル
glp4(抗すゾチームノからの■ウノ既知の天然配列である。配列2はネズミ
モノクローナル26−10(抗ジゴキシyノからのV□の既知の天然配列である
。配列3は、26−10V からのFRおよびglp ’VHからのCDRより
なるBABSである。これらのCDRは下側の文字において確認される。キメラ
配列3を形成するために用いたDNA中の制限部位も確認される。配列4はヒト
骨髄腫抗体NEWMからのV□の既知の天然配列である。配列5はN E’WM
VHからのFRおよびglp 4vHからのCDRよりなるBABSであり、す
なわちヒト枠組み構造を有するが、ネズミg1p−4に類似のリゾチームに対す
る親和性な備えた“ヒト化(huma−nized)″結合部位な示す。
第4A〜4Fは以下の合成核酸配列およびコード化アミノ酸配列である。(4A
Jネズミ抗ジゴキシンモノクローナル26−10のH鎖町変領域;(4BJネズ
ミ抗ジゴキシンモノクローナル26−10のL鎖町変領域; (4CJ glp
−4のCDRおよび26−10のFRからなるBABSのH鎖町変領域;(4D
ノ同BABSのL鎖町変領域; (4EJ glp−4のCDRおよびNEWM
のFBからなるBABSのH鎖町変領域;ならびに(4F ) glp 4のC
DRおよびNEWMのFRからなるL鎖可変領域。図示されるのはFR,CDR
,およびエンドヌクレアーゼ消化に関する制限部位であり、それらは大部分がD
NAなデザインする際に導入された。
第5図は選ばれたCDHの挿入な容易に丁べくデザインされた宿主DNA(Vヨ
ノの核酸配列およびコード化アミノ酸配列でおる。このDNAは、CDRを直接
にフランクし、従ってCDHの部分を定める比較的小型のオリゴヌクレオチドを
容易に挿入できる独自の6塩基部位を含むべく、かつ一定の構造において結合特
性な最適化するためにDNAの操作を容易にする他の部位を含むべくデザインさ
れた。この分子の枠組み領域はネズミFR(第4A図〕に相当する。
第6Aおよび6B図は、ネズミ七ツクローナル26−10の特異性を備え、スペ
ーサを介してプロティンA(蛋白質AJのFB断片−ここではリーダーとして融
合−に結合し、F。
に対する結合部を構成する1重鎖BABSからなる多機能蛋白質(およびそれら
なコード化するDNAJである。スペーサーはASp −Pro (希酸開裂部
位]を従えたFBのC末端アミノ酸11個からなる。この1重鎖BABSはネズ
ミモノクローナル26−10のvHおよびvI、(6A)、tx ラD K V
r、 オヨヒV u(6BJを模倣した配列からなる。構造6A中の■1は残基
4において変更でき、ここでバリンが母体26−10配列中に存在するメチオニ
ン?置換する。これらの構造はF。およびジゴキシンの双方に対する結合部位を
含む。それらの構造は以下のように要約できる。
(6AJ FB−Asp−Pro−VH−(Gly4−3er]、−V、L’お
よび
(68) FB−Asp−Pro−VL−(Gly4−3er)a−vH’ここ
で (Gly4−3er)、はポリペプチドリンカ−である。
第4A〜4Eならびに6Aおよび6Bにおいて発現生成物のアミノ酸配列はGA
ATTC配列の後方から開始する。これはEcoRIスプライス部位なコードし
、図面ではGzu−Phe として翻訳されている。
第7A図は、放射性ヨ、つ素化ジゴキシンの最大結合カウント(%)をプレート
に吸着された結合蛋白質の濃度に対して示したグラフであり、天然26−10(
曲線1,1、ならびに2種の異なる方法により再生した第6A図および第2B図
の構造(曲線2および3〕を比較している。第7B図はミクロタイタープレート
にプレート上のジゴキシン−BSA被膜に対する結合部位の特異的結合により吸
着したFB −(26−10)BABSの2機能性な示すグラフである。第7B
図は、FB−BABSのFB領域゛に対する125I−家兎IgGの結合がIg
G、蛋白質A、FB、ネズミIgG2aおよびネズミIgG1の添加により抑制
される%を示す。
第8図はリーダーペプチド(発現を補助するのに使われ、のちに開裂するハ結合
部位、スペーサー、およびトレーラ−配列として結合したエフェクターからなる
多機能生合成蛋白質をコード化するDNA配列を組合わせたモデルの模式図であ
る。
第9A〜9Eは以下の異なる特異性をもつ結合部位の合成核酸配列および対応す
るコード化アミノ酸配列の例である。(んNEWMからのFRおよび26−10
からのCDR,ネズミモノクローナル26−10のジゴキシン特異性を保有;(
B+26−10からのFRおよびG−ループ−4(glp−4ノからのCDR。
リゾチーム特異性を保有;[C)MOPC−315からのFRおよびCDR、ジ
ニトロフェノール(DNFJ特異性を保有:山抗−CEAモノクローナル抗体か
らのFRおよびCDR;IEI抗−CiEA%ツクローナル抗体からの■ヨおよ
びvL双方中のFR。
ならびにvH中のCDR3、ならびKvL中のCDR1、CDR2およびCDR
3;vH中のCDR2は大部分の免疫グロブリン■ヨ領域中に見出されるコンセ
ンサス配列である。
第10A図はリーダーペプチド(MLEJ蛋白質のDNA配列およびアミノ酸配
列の模式図であり、対応するDNA配列および若干の主要な制限部位な示す。@
10B図はMLE−BABS(26−10Jを発現するために用(゛られる発現
プラスミドのデザインを示す。遺伝子の構成に際しては、リーダー配列の一部と
して示したEcoR1部位におい″CI@合パードパ−トナーさせた。独自の(
ユニークな、)SspIおよびPstI 各部位において開いたpBR322プ
ラスミドを3成分リゲーションによって、trpプロモーターおよびMLEリー
ダーを保有するSspIからE。oRIまでの断片、ならびにBABS遺伝子を
保有するEcoRIからPstIまでの断片と結合させた。形成された発現ベク
ターは陽性の形質転換体にテトラサイクリン耐性な付与する。
第11図は精製の各段階における( 26−10J BABSの5DS−ポリア
クリルアミドゲル(15%〕である。列Oは低分子量標品;列1はMLE−BA
BS融合蛋白質;列2はこの物質の酸消化物;列3はDE−s2 クロマトグラ
フィー処理蛋白質をプールしたもの;列4および5は同じ1本QBABSのウワ
バインーセファロースプールであり、ただし列4の蛋白質は還元したもの、列5
の蛋白質は未還元のものである。
第12図は26−1OBABsおよび26−10Fab各種に関する抑制(阻害
)曲線を示し、指示した強心配糖捧に対する抗体断片の相対的親和性を表わす。
第13Aおよび13B図はジゴキシン結合曲線のプロットである。fAlは26
−10BABS結合の等混線およびシップスプロット(差込み図)を示し、tB
+は26−1O−Fab結合の等混線およびシップスプロット(差込み図を示す
。
第14図は修飾されたFB二量体リーダー配列の核酸配列および対応するアミノ
酸配列、ならびに各種制限部位である。
第15A〜15H図はスペーサー配列な介して結合した1重鎖BABSおよび各
種の生物活性蛋白質トレーラ−を含む、生合成多機能蛋白質の核酸配列および対
応するアミノ酸配列でらる。各種エンドヌクレアーゼ消化部位も示される。トレ
ーラ−配列は(A1表皮発育因子(EGFに tBlストレプトアビジン;(C
1腫瘍え死因子(TNFにtD+カルモジュリン;(預血小板由来発胃因子−べ
−p (ppCTF−ヘ−p J ; IFIリシ7 (ricin ) ;
オよび+Glインターロイキンー2、ならびにfHIFB−FB二量体である。
説明
本発明をまずその広義の全体的観点から説明し、続いてより詳細に説明する。
生合成抗体結合部位、または”BABS”、すなわち選択的な抗原認識および優
先的な抗原結合が可能な構造を定める生合成ポリペプチド、ならびにあらかじめ
定められた特性をもつべくデザインされた付加的なペプチド結合蛋白質またはポ
リペプチド1種または2種以上からなる、一群の新規な生合成による2機能また
は多機能蛋白質がデザインされ、工学的に製造された。第2@域の例にはイオン
を封鎖すべくデザインされたアミノ酸配列−これは蛋白質を画像形成剤として用
いるのに適したものにするーおよび蛋白質をアフィニティクロマトグラフィーお
よび固相イムノアヴセイ法に用いるために固定化を容易にすべくデザインされた
配列が含まれる。第2領域の他の例は生物活性エフェター分子、すなわち生物活
性に適した立体配座を備えた蛋白質、たとえば酵素、毒素、レセプター、結合部
位、発育因子、細胞分化因子、リンホカイン、サイトカイン、ホルモン、または
代謝拮抗物質である。本発明の特色は、これらの領域が1または2以上の生合成
抗体結合部位、あらかじめ選ばれた抗原決定基に高い親和性および特異性なもっ
て結合すべくデザインされた合成1本鎖蛋白質、互いに鞘合して多地点抗原結合
ならびに高い最終親和性および特異性乞与える複数の結合部位な含む構造にペプ
チド結合したものからなる合成多機能蛋白質、これらの蛋白質なコード化する、
組換え技術により形成されたDNA、これらのDNAQ宿した宿主細胞、ならび
にこれらの蛋白質およびDNAの製法である。
本発明はおうかしめ定められた抗原決定基に対するR相性および特異性を備えた
1本釦結合部位な組換え技術により形成する必要がある。この技術は開発されて
おり、ここに示されている。この記述を考慮して、組換えDNA技術、蛋白質の
デザイン、および蛋白質化学の分野における専門家は、溶液中に置かれた場合に
高い結合定数(少なくとも106、好ましくは108M−”)および卓越した特
異性を備えたこの種の部位な形成することができる。
BABSのデザインは天然の免疫グロブリン分子のH鎖およびL鎖それぞれの可
変領域の小領域3個が集合的に抗原の認識および結合に関与するという知見に基
づく。これらの小領域−ここでは°相補性決定領域”すなわちCDRと呼ぶ−は
それぞれ、高可変領域またはループのうちの1つ:および選ばれたアミノ酸類ま
たはアミノ酸配列からなり、これらはその高可変領域をフランクする各枠組み領
域すなわちFR内に配置される。
多様な種からのFRが他の多様な種からのCDRな、生合成蛋白質における真の
免疫化学的結合特性を達成するのに適した立体配座に保持するのに有効であるこ
とが見出された。また、免疾グロブリンの結合部位の2本の鎖の構造な模倣した
生合成による各領域を、それらの集合的結合特性に近似し、それらを保持し、し
ばしば改良した状態でポリペプチドリンカ−により結合しうろことも見出された
。
多機能蛋白質の結合部位領域は少なくとも1個、好ましくは2個の領域からなり
、これらはそれぞれ免役グロブリンのL鎖またはH鎖の可変領域のCDR部分に
相同のアミノ酸配列、およびこれと同一かまたは異なる第2の免疫グロブリンの
L鎖またはH鎖の可変領域のFHに相同な配列な含む。2領域型締合部位構造は
これらの領域な結合するポリペプチドをも含む。こうして構成されたポリペプチ
ドは、各FRおよびリンカ−によって適切な立体配座に保持されたCDRにより
て決定される、特定のあらかじめ選ばれた抗原を結合する。好ましい構造はヒ)
FRを含み、すなわちヒト免疫グロブリンの枠組み領域の少なくとも一部のアミ
ノ酸配列を模倣し、かつ免疫グロブリンの2本の鎖からなる結合部位■□−vL
またはVl−Vヨな模倣した構造を合わせて構成する結合した各領域を含む。■
乳動物免疫グロブリンのCDR%たとえばマウス、ラットまたはヒト由来のもの
が好ましい。好ましい一形態においては、上記の生合成抗体結合部位はヒト免疫
グロブリンのFHの一部と相同なFRおよびマウスまたはラットの免疫グロブリ
ンからのCDRと相同なCDRを含む。この型のキメラポリペプチドはマウスま
たはラットの免疫グロブリンの抗体結合特注な表わし、一方ヒトからの枠組みは
ヒトの免疫反応を最小限に抑える。さらにこのキメラポリペプチドは他のアミノ
酸配列を含んでいてもよい。
これはたとえば免疫グロブリンの定常領域の一部に相同の配列な含んでいてもよ
いが、定常領域(FR以外リすナ含まない方が好ましい。
従ってキメラ蛋白質の結合部位領域は、溶液中で抗体結合部位と同様な挙動を示
す構造からなる単一鎖の覆合ポリペプチドである。この2領域型の1重鎖複合ポ
リペプチドはタンデムvHおよびV、領域に習ってパターン化された構造をもつ
が、ただし一方のカルボキシル末端が結合用アミノ酸配列によって他方のアミン
末端に結合し℃いる。この結合用アミノ酸配列はそれ自体が抗原性または生物活
性を備えていてもよ(、そうでなくてもよい。これは好ましくは少なくとも約4
OAの距離を埋め、すなわち約14個のアミノ酸からなり、かつ−緒になって親
水性の、比較的無構造形の領域を呈する残基からなる。二次構造をほとんど、ま
たは全く有しない結合用アミノ酸配列が良好に作用する。所望により、部位特異
性開裂剤によって認識され5る独自のアミノ酸またはアミノ酸配列が1個または
1対、リンカ−に含まれていてもよい。これによってVI(およびvL様領領域
発現後に分離することができ、または結合部位のリフオールティング(折り畳み
ノ後にリンカ−を切除することができる。
これらキメラ型1重鎖結合部位のアミン末端またはカルボキシル末端の一方(ま
たは両末端ノは、それ自体が生物活性をもつかまたは2伝能もしくは多機能蛋白
質を形成する他の何れかの機能をもつアミノ酸配列に結合している。たとえば上
記の合成結合部位は、酵素活性、この結合部位が目的とする抗原とは異なる抗原
に対する独立した親和性をもつか、または他の俄能、たとえば放射性イオンの結
合に好都合な部位を与えるか、もしくは固形支持体に化学的に結合すべくデザイ
ンされた残基な与える機能をもつポリペプチドを定めるリーダーおよび/または
トレーラ−配列な含んでいてもよい。この融合した、独立した機能なもつ蛋白質
セクションは、前核生物由来の宿主細腺または酵母における発現な高めるために
のみ用いられる融合リーダーと区別すべきでおる。本発明の多機能蛋白質も、発
現後に第2部分に化学的に結合する、先行技術に示さnた°結合体(conju
gate )″と区別すべきである。
しばしば、′スペーサー”としてデザインされた一連のアミノ酸が多機能蛋白質
の活性領域間に配#さnる。この種のスペーサーを採用すると、蛋白質の各領域
の独立したりフォールディングが促進される。このスペーサーもたとえばターゲ
ット細胞にとって内在性の、エンドペプチダーゼにより認識される特異的アミノ
酸配列(たとえば結合部位により認識される表面蛋白質をもつもの)を含むこと
ができ、これにより生物活性エフェクター蛋白質はターゲットにおいて開裂し、
放出される。第2の機能性蛋白質は好ましくは後続(トレーラーノ配列として存
在する。トレーラ−はBABSの結合挙動を妨げる傾向な示すことが少ないから
である。
この種の°自己ターゲット化”生物活性蛋白質は免疫グロブリン断片または光合
抗体分子の結合体な上回る多数の利点を与える。すなわちそれらは安定でるり、
免疫原性がより低く、より小さな分子量なもち:それらは寸法が小さいため画像
形成またはドラッグテリバリーの目的で身体組織をより速やかに透過することが
でき;またそれらはターゲット化アイソトープまたは薬物のクリアランス促進を
容易にでることかできる。さらに、ここに開示されるようにこの種の構造7DN
Aレベルでデザインすることにより生物字面特注および特異江を容易に選択でる
ことができるので、本質的に無限の結合部位および生物活性蛋白質の組合わせか
oJ能であり、それらのそれぞれ?ここに開示さrるように合成蛋白質の各領域
における独立した活性を最適なものにするたのに悄装することができる。こねら
の合成蛋白質は原核生物、たとえば大腸−(E、c○11)において発現させる
ことかでき、従って培養?!m;7+細胞系における発埃乞必要とする免疫グロ
ブリンまたはそれらの断片を製造するより経費が少ない。
従って本発明は単−DNA片から発現した一部の組換え蛋白質を提供し、これら
はすべてあらかじめ定められた抗原決定基と特異的に結合する能力をもつ。好ま
しい種類の蛋白質は結合領域と別伽に機能する第2領域を含む。この観点におい
て本発明は、生物活江俄能ケもち、その機能な結合部位の特異性によって決定さ
れる位置ヘデリバリーする、一連の“自己ターゲット化″蛋白質を提供する。ま
た本発明は、アフィニティクロマトグラフィーおよび固相イムノアヴセイ法に用
いられる固定化用マトリックスに付着するのに適した、またはインビボ画像形成
に用いられるイオン、たとえば放射性イオンの付着に適したポリペプチドが結合
した生合成結合部位をも提供する。
本発明の蛋白質のデザインおよび製造の成功は、生合収結合部位、きわめて好ま
しくはリンカ−により連結された、免疫グロブリンの可変領域を模倣した2イ固
の領域からなる部位を製造しつるか否かによる。
現在坂知のように、Fv5丁なわち完全な抗原認識部位および結合部位な含む最
小の抗体断片は、非共有的に会合した1個のH鎖町変領域および1個のL9町変
領域の二量体からなる(¥1図)。各可変領域の相補!E次定領域3個が相互作
用してこの■ヨーvI、二量体の表面上の抗原結合部位を定めるのは、この立体
配置においてである。これら・6個の相補性決定領域(第1B図参照」が集合的
に抗原結合特異性な抗体に与える。
これらGDRflフランクするFRはヒトとマウスはどに異なる種の天然免疫グ
ロブリンにおいてさえ、本質的に類似した三次構造をもつ。これらのFRはCD
Rなそれらの適宜な配向に保持てる役割なもつ。定常領域は結合機能には必要な
いが、vH−v1相互作用ヲ女定化するのを補助しうる。単一の可変領域(抗原
に対して特異的なCnH2個のみからなる、Fvの半分〕ですら抗原な認識し、
結合する能力をもつ。ただし結合部位全体より低い親和性においてである(ペイ
ンターら(Pa1nteret al、(1972J Biochem、11:
1327 1337ノノ。
免疫グロブリン蛋白質の構造につい℃のこの知見が今回、生合成抗体結合部位お
よびlまたは2以上の他の領域からなる多機能融合蛋白質の開発に利用された。
上記蛋白質に結合特性を付与する領域におけるこnら生合成蛋白質の構造は天然
抗体のFv領領域類似させる。これはリンカ−により連結された■ およびv1
様ポリペプチドセグメ/トを定めるアミノ酸からなる領域を少なくとも[6、好
ましくする三次分子構造な形成する。各領域は、天然抗体のFv断片の枠組み領
域(FR〕に対しアナログな一組の配列によって適切な立匹配座に保持された、
免役グロブリンCDHにアナログな一組のアミノ酸配列からなる。
ここで用いるCDRという語は天然免疫グロブリンの結合部位の天然Fv領領域
もつ結合栽札性および特異性な全体とし℃定めるアミノ酸配列、またはこの機能
す模倣する合成ポリペプチドな意味する。CDRは一般に天然Fvの高可変領域
に完全に相同ではなく、むしろ高可変領域なフランクし、これまで直接には相補
注す決定しない枠組みであると考えられている特定のアミノ酸類またはアミノ酸
配列なも含みつる。ここで用いるFBという語はCDRをフランクする、または
それらの間に配置t′:!−nたアミノ酸配列を意味する。
CDRおよびFBポリペプチドセグメントは、既存の抗体のFv領領域またはそ
れらをコード化するDNAの配列分析に基づいてデザインされる。一形態におい
℃は、BABSのFR領領域vIi511i:するアミノ酸配列は、既存の菓1
抗体、たとえばヒトIgGのFR配列にアナログである。CDR領域な構成する
アミノ酸配列は第2の異なる既存の抗体からの配列、たとえばネズミIgGのC
DRにアナログである。あるいはたとえば不安定な、または培養し難いハイブリ
ドーマからの既存の単一抗体からのCDRおよびFRはそれら全体をコピーし℃
もよい。
本発明の実施によって、すべてがあらかじめ選ばれた抗原決定基に対する親和性
な備えた領域なを色とする、各種試薬のデザインおよび生合成が可能となる。こ
れら生合成蛋白質の結合部位および他の領域は、目的とする蛋白質の特定の計画
された有用性をもつべくデザインされる。従っ℃その物質が硼乳動物の血管内で
用いるためにデザインされる場合、FR領領域その蒲乳動物種に対する自然杭木
の枠組み領域のアミノ酸の少なくとも一部に類似または同一のアミノ酸からなる
であろう。他方、CDRを構成するアミノ酸は既知の親和性および特異性な漏え
た抗体、たとえばネズミまたはラットのモノクローナル抗体の高可変領域(およ
び特定のフランキングアミノa)の一部に対しアナログであってもよい。
天然免疫グロブリン蛋白質構造の他のセクション、たとえばCHおよびOLは存
在する必要がなく、普通は生合成蛋白質から故意に省かれる。しかし本発明の蛋
白質は普通は生物活性領域な定める付加的なポリペプチドまたは蛋白質領域、た
とえば毒素もしくは酵素、または毒素もしくは遠隔的に恢出できる物質が付着し
うる部位を含んでい℃もよい。
従って本発明は、非共有的に会合し、またはジスルフィド結合し、または好まし
くはポリペプチド配列により連結されて、本質的に抗体の定常領域乞含まない複
合VH−V1または■、−■ ポリペプチドな形成した、vH−VL二普体に対
しアナログな無傷の生合成抗体結合部位を提供しうる。本発明は独立した■ も
しくは■1領域またはそれらの二量体に対しアナログな蛋白質をも提供する。こ
れらの蛋白質はいずれも生物活性分子、たとえばホルモンまたは毒素に対しアナ
ログまたは相同のアミノ酸に結合した形で提供されてもよい。
上記蛋白質の独立した機能なもつ領域な結合するものは短いアミノ酸配列からな
るスペーサーであり、その機能は慨能性領域の分離であり、これによりこれらが
独立してそれらの活性三次構造なとることができる。スペーサーはその配列白木
はその機能に必要でない、機能性蛋白質の末端に存在するアミノ酸配列、および
/またはDNAレベルで蛋白質に工字円に組込まれた特異的配列からなる。
スペーサーは一般に5〜25伽の残基からなる。その最適な長さは、たとえばア
ミノ酸5個の単位で異なる、種々のスペーサー長さの構造を用いて判定すること
ができる。スペーサーの個々のアミノ酸は変更しうる。システィンは避けるべき
である。
親水性アミノ酸が好ましい。スペーサー配列は免疫グロブリンのヒンジ領域の配
列を模倣したものであってもよい。これはある構造、たとえばらせん構造なとる
べくデザインされてい℃もよい。可変領域様配列?他のペンダント配列から分離
するスペーサーには蛋白分解による開裂部位が組込まれていてもよく、これによ
り旬の蛋白質な含まない無傷のBABSの開裂が容易になり、あるいはインビボ
において生物活性蛋白質が放出される。
第2A〜2E図はここに開示される技術によって製造できる、本発明の具体的な
蛋白質構造5例を示す。すべ℃、しばしば異なる免疫グロブリンに由来するCD
RおよびFRを構成するアミノ酸配列、または異なる免疫グロブリンからのCD
RおよびFRの一部に相同の配列からなる、結合部位3を定める生合成ポリペプ
チドによって特色づけられる。第2A図は免疫グロブリンH鎖の可変領域にアナ
ログなアミノ酸配列をもつポリペプチド領域10を含む1本鎖構造を表わし、こ
の領域はそのカルボキシル末端を介してポリペプチドリンカ−12に結合し、こ
れはさらに免疫グロブリンL鎖のq=領領域アナログなアミノ酸配列?もつポリ
ペプチド領域14に結合し℃いる。もちろんL鎮およびH鎖の各領域は逆の順序
であってもよい。あるいは結合部位は、免疫グロブリンのH鎖またはL鎖の可変
領域に双方ともアナログである2個の実質的に相同のアミノ酸配列な含んでいて
もよい。
υツカー12は鎖10と14が適当な偽造をとりうるためにきである。リンカ−
12は、薬物使用が予定される場合に、投与される動物種によって「自己」と見
なされる配列に等しいアミノ酸配列を含むことができる。例えば、リンカ−は免
疫グロブリンのヒンジ領域後に形成されたアミノ酸配列な含むことができる。リ
ンカ−は親水性アミノ酸配列な含むことが好ましい。
リンカ−はまた、結合部位によっ℃標的化される細胞毒素または、例えば結合部
位によって認識されるエピトープを含む腫瘍部位に投与される予定の放射性試薬
によって容易に標識されるセグメントのような生物活性ポリペプチドを含むこと
もできる。
リンカ−はまた、1つもしくは2つの固有の切断部位すなわち下記のような部位
特異性切断剤の作用な受けやすいアミノ酸またはアミノ酸配列を含むこともでき
る。この方法は■ヨとvL様領領域表現後の分離を可能にする、または結合部位
構造を非共有関係に保持しながらの折りたたみ後のリンカ−の切断を可能にする
。リンカ−のアミノ酸は比較的小さい非反応性側@す有するアミノ酸から選択す
るのが好ましい。アラニン、セリン及びグリシンが好ましい。
一般にリンカ−の設計はスペーサーの設計に類似した考察を含むが、リンカ−配
列の長さがf120Aより短いすなわち約lO未滴の残基な含む場合には、連結
した領域のは合性は非常に分解しやすい。生の可変部位のN末端と姉妹鎖のC未
遂との間の約4OAの距離よりも長いリンカ−を用いることができるが、BAB
S結合性な減する可能性もある。12残基〜18残基から収るリンカ−が好まし
い。特定構造の好ましい長さはリンカ−長さな最初に5残基の単位によって変え
、ペンタマー出発単位の最良の集合を決定した後に菓二に1〜4残基の単位によ
ってリンカ−長さを変えることによって決定される。
結合部位のアミン末端またはカルボキシル末端のいずれかまたは両方に付加的な
S白質またはポリペプチドを結合させて、第2B図〜第2E図に説明した型の多
機能蛋白質を製造することもできる。1例とし℃、第2B図では、らせんコイル
状ポリヘフチド構造16はvH様ドメイン10のアミン末端にスペーサー18な
介して結合したプロティンAフラグメント(FB)な含む。第2C図は結合蛋白
質セグメント2のポリペプチド140カルボキシル末端にスペーサー22を介し
て結合したエフェクターポリペプチド20を含む2官能性蛋白質を有する。この
エフェクター・ポリペプチド20は例えば毒素、治療薬、結合蛋白質、酵素また
は酵素フラグメント、イメージング剤の付着部位(例えばインジウムのような放
射性イオンをキレート化するため)または、BABS’にアフイニテイクロマト
グラフイーもしくは固相結合分析法に用いることができるよ・うに、固定マトリ
ックスへの選択的付着部位から構成することができる。このエフェクターは代替
的にポリペプチド°lOのアミン末端に連結することができるが、トレーラ−が
好ましい。第2D図は第1結合蛋白質セグメントのN末端に付着した他の異なる
蛋白質ドメイン20な含むBABS2の結合対を有する三機能蛋白質な示す。単
一蛋白質への多重BABSの使用は、a胞表面蛋白質のような多重エピトープ部
位への非常に高い選択的アフイニティを有する偽造の製造を可能にする。
独立的な機能ドメインは、結合蛋白質セグメント2の第1ドメイン10のN末端
に蛋白質16または2カのC末端を共有結合させるスペーサー18によって(第
2B図と第2B図ハまたは他の蛋白質のN末端に第2結合ドメイン14のC末端
を結合させるスペーサー22によって(第2C図とに2B図〕付着する。このス
ペーサーはリンカ−配列12に等しいアミノ酸配列であるか、または他の形式を
取りうる。上述したように、スペーサーの主要な機能は活性蛋白質部分な分離さ
せてそれらの生物活性な促進させ、各部分にその隣接構造からの干渉のない生物
活性配置をとらせることでるる。
第2E図は、例えば抗原に対するアフィニテイの尺度を保有するH鎖可変邪に類
似した、3CDHの1セツトのみを有するB A B S triむ、他の型の
試薬を示す。結合部位3を構成するFRとCDR配列な含むポリペプチド10ま
たは14のカルボキシル端部にスペーサー22を介して、エフェクターポリペプ
チド20が上述のように付着する。
前述の説明から明らかなように、本発明は少なくとも1部が免疫グロブリンの可
変部後に形Fy、される結合部位を定義する蛋白質を含む大きい試薬群を提供す
る。本発明を具体化する試薬のために用いて、BABSに結合させる蛋白質フラ
グメントの性質が本質的に制限のないこと、及び本発明の本質が望ましい抗原に
対して特異性な有する結合部位の単独のまたは他の蛋白質に結合した形成である
ことは明らかであろう。
BABSを含む多機能蛋白質またはBABSのみの臨床投与は、完全に天然のも
しくはキメラの抗体分子、そのフラグメント、及び第2生物活性収分に化学的に
結合したこのような抗体な含む複合体の使用を凌駕して多くの利益をもたらす。
ここに述べる多機能蛋白質は循環蛋白分解酵素に対して切断部位を殆んど与えず
、これらの機能性ドメインはペプチド結合によってポリペプチド・す/カーまた
はスペーサー配列に結合しているため、蛋白質は改良された安定性を有する。こ
こに述べる多機能蛋白質はサイズが小ぎく、効果的な設計であるため、これらの
標的組織に迅速に達し、身体から急速に排泄される。これらはまた低下した免疫
原性を有する。さらに、これらの設計は薬物ターゲツティング、イメージング用
途において他の成分への結合を容易にする。このような結合はBABSの表現後
に、DNAレベルで蛋白質に形成される結合生成物の付着部位に対して化学的に
行われる。毒性、酵素性、結合性、調節性、細胞分化性、ホルモン性、またはそ
の他の生物活性を有する活性なエフェクター蛋白質はリーダー及び/またはトレ
ーラ−配列、BABSに結合したペプチドとしての単−DNAから表現される。
設計と製造
本発明の蛋白質はDNAレベルで設計される。次にキメラDNAまたは合成りN
AQ適当なホスト系で表現し、表現された蛋白質を回収し、必要に応じて再生す
る。蛋白質をコード化するDNAの好ましい一般構造を第8図に示す。図示した
ように、これはリーダーを表現後に除去するための部位特異性切断剤(例えばエ
ンドペプチダーゼノによって認識される固有の切断部位を有する原核生物(pr
ocaryole ) における表現の促進に用いられる最適リーダー配列なコ
ード化する。これの後にCDRとFRから成るvH様ドメイ/、リンカ−;再び
CDRとFRから成るvL様ドメイン、スペーサー;及びエフェクター蛋白質を
コード化するDNAが続く。表現、たたみこみ(fOlding J及びリーダ
ー切断後に、CDfiによって特異性が決定される結合部分とペプチド結合独立
機能性エフェクタ一部分とを有する二機能蛋白質が形成される。
本発明のBABSな設計する可能性は、問題のモノクローナル抗体の可変部分に
おけるアミノ酸またはそれらをコード化するDNAの配列?決定できるか否かに
依存する。ハイプリドーマ技術は免疫反応な生ずる本質的な目的物質に対する抗
体を分泌する#1胞ライ/の形成な可能にする。免疫グロブリンのL鎖とH鎖な
コード化するRNAがハイブリドーマの細胞質から得られる。mRNAの5′端
部な用いて、CDNAな製造し、次に配列形成することができる。または側面を
接した高度に可変なフレーム部分のアミノ酸配列がH鎖とL鎖の7部分フラグメ
ントのアミノ酸配列によって決定される。このような配列分析は現在ルーチンに
行われている。この知識は、観淡と免疫グロブリンF’vs の−膜化構造の推
理と共に、抗原と結合すると考えられる、FBとCDR配列なコード化する合成
遺伝子の設計な可能にする。これらの合成遺伝子を次に公知の技術ヲ用いて、ま
たは下記に述べる技術を用いて製造し、適当なホストに挿入し、表現し、表現さ
れた蛋白質な精製する。適当な構造な得るために、ホスト*+tlll飽に依存
して、再生技術が必要である。次に種々な蛋白質な結合の可能性に関してテスト
し、上記タイプの試薬に導入するために適当なアフイニティな有する蛋白質を選
択する。必要な場合には、慣習的なカセット突然変麹誘発または下記のような、
他の蛋白質処理方法な用いて、結合を最適にするだめの点責換をDNAにおいて
実施する。
本発明の蛋白質の製造は、例えば酵素、毒素、成長因子、細胞分化因子、レセプ
ター、代謝拮抗剤、ホルモンまたは種々なサイトカインもしくはリンホカインの
ような生物活性蛋白質のアミノ酸配列(または対応DNAもしくはFiNA配列
〕の知識に依存する。このような配列は文献に報告されており、コンピユータ化
されたデータ・バンクから入手可能である。
結合部位と第2蛋白質ドメインのDNA配列な慣習的な方法な用いて融合させる
か、または合成したオリゴヌクレオチドから組立て、次に同様に慣習的な方法を
用いて表現する。
問題のアミノ酸配列なコード化するDNAの操作、増強1組換え方法は技術上周
知であるので、ここでは詳述しない。問題の抗体なコード化する遺伝子を確認し
単離する方法は部分に理解されており、特許その他の文献に述べられている。一
般に、この方法は関連するCDRとFBな含む、問題の蛋白質な定義するアミノ
酸を指定する遺伝性材料を遺伝コードに従つ℃選択することな含む。
従って、ここに品示するように蛋白質なコード化するDNAの構図は、DNA*
配夕lJを異的に切断してプラント端部または付着端部、DNAIJガーゼ、を
形成する種々な制限酵素;プラント端部な有するDNAへの粘着性端部の酵素に
よる付着な可能にする技術:短鎖または中等鎖オリゴヌクレオチドの組合せによ
る合@:DNAの構成; cDNA合成技術;及び免疫グロブリンもしくは他の
生物活性蛋白質遺伝子を単離するための合成プルーブの使用を含む公知の方法を
用い℃実#Iスることができる。表現の実施に用いる種々なプロモーター配列そ
の他の調節DNA配列、及び種々な種類のホスト細胞も公知であり、利用可能で
ある。慣習的な形質転換技術、DNAのクローニングまたはサブクローニングの
同様に慣習的な技術も本発明の実施に有用であり、当業者に公知である。例えば
プラスミドとウィルス(動物ウィルスとバクテリオファージを含む)のような種
々な種類のベクターを用いることができる。ベクターは種々のマーカー遺伝子を
利用して、好都合に形質転換した細胞に検出可能な表現型特性を与えて、この特
性を利用してクローン群のいずれがベクターの組換えDN・AI上首尾に結合し
たかを確認することができる。
ここに開示した蛋白質なコード化するDNAを得る1つの方法は、慣習的な自動
化ポリヌクレオチド合成装置で製造した合成オリゴヌクレオチドを組合せ、適当
なりガーゼによって連結することである。例えば、15塩基から収る重複相補的
DNAフラグメントなホスホラミシト化学な用いτ半手動で合成することができ
る、この場合に端部セグメントは非ホスホリル化の状態で残して、連結中の重合
を隔止する。合成りNAの1端は特定の制限エンドヌクレアーゼの作用部位に対
応して「粘着性端部」を付けて残し、他の端部は他の制限エンドヌクレアーゼの
作用部位に対応する端部が付いた状態とする。または、このアプローチな完全に
自動化することもできる。蛋白質をコード化するDNAは、例えばバイオサーチ
(B 1osearchノオリゴヌクレオチド合成装置で艮い単釧フラグメント
(例えは、50〜100 オリゴヌクレオチド長さ〕を合成し、次にフラグメン
トを連結することによって形成することができる。
不発明のBABS製造方法は、例えばヒ)FRと介在「ダミーJCDRまたは、
適当に配置された固有制限部位を明確にする以外には機能を有さないアミノ酸か
ら成るポリペプチドなコード化する合成りNAを製造することである。次に、こ
の合成りNAをDNA置換によって変化させ、制限と連結な用いて、FB間の適
当な位置に望ましく・結合特異性を明確にするCDRコード化合成オリゴヌクレ
オチドな挿入する。このアプローチはBABSの結合性の経験的な改良を容易に
する。
この方法は可変ドメイン遺伝子に構造が一致するDNAをCDRコード化ヌジヌ
クレオチド配列面を接する特定部位で切断しうるか否かに依存する。ある場合に
はこれらの制限部位が天然遺伝子に検出される。または、非天然制限部位をヌク
レオチド配列内に形成して、天然遺伝子とは異なるヌクレオチド配列を有するが
遺伝コードの縮重のために同じ可変部アミノ酸をコード化する合成遺伝子を生成
することができる。ヌンドヌクレアーゼ消化から生じ、FRコード化配列な含む
フラグメントを非天然CDRコード化配列配列結して、抗原結合特異性の変化し
た合成可変領域遺伝子を製造することができる。次に、的えば定常部アミノ酸ま
たは生物活性分子なコード化する付加的なヌクレオチド配列な遺伝子配列に連結
して、二憔能蛋白質ヲ製造することができる。
これらの合成りNAの表現は原核系と真核系の両方において適当なベクターによ
る形質転換によって実現する。大腸菌(E。
coliJその他の微生物ホストでは、合成遺伝子を融合蛋白質として表現させ
℃、次に切断する。真核生物での表現は、CDR/FR部分アミノ酸と2次域能
な明確にするアミノ酸をコード化するDNA配列の骨髄腫その他の種類の細胞ラ
インへの形質転換により℃達成される。この方法によって、ハイブリッドFv部
分と、生合成結合部位を含めた種々な生物活性蛋白質とな有する完全なハイブリ
ッド抗体分子を製造することができる。細菌中に表現させた融合蛋白質では、単
離した融合体を次に蛋白分解的に切断することによつ℃遊離BABSを得、これ
な再生し℃完全な生合成ハイブリッド抗#−結合部位を得ることができる。
今までは、H鎖とL鎖部分を切断して、免疫グロブリンの可変部と定常部な分離
して完全なFvを得ることが、商業的用途ではない特定の場合を除いて不可能で
あった。しかし、不発明によるBABS製造方法の1つは免疫グロブリンのH鎖
とL鎖をコード化するDNA+i再設計し、任意にその特異性を変えるかまたは
そのFRIヒト化し%H鎖とL鎖の両方の可変部と定常部との間に切断部位と「
ヒンジ領域」とを挿入することである。このよっなキメラ抗体をトランスフエフ
トーマ(trans−feCtOmaJ 等において製造し、次に予め選択した
エンドペプチダーゼを用い℃切断することができる。
ヒンジ領域は、所定の固有切断部位における所定切断剤による効果的切断な促進
するために役立つアミノ酸配列である。これはポリペプチドな適当な環境内で切
断剤によっ℃処理する場合に特に切断部位における切断を促進するように、設計
される。
ヒンジ領域は多くの種々な形をとりつる。この設計には、融合蛋白質領域の切断
部位に適当な極性を与えるアミノ酸残基(及びこれらなコード化するDNAフラ
グメントノの選択、電荷分布及び切断が行われる水性環境内で切断部位をポリペ
プチド内に存在しつる他の可能な切断部位に優先して切断剤に暴露させる及び/
または切断反応の動力学を改良する立体化学が関係する。特定の場合に、ヒンジ
領域のアミノ酸を選択し、それらの既知の性質に基づいて配列として組合せて、
融合ポリペプチド配列を表現させ、テストし、精製のために変化させる。
ヒンジ領域はシスティン乞含まない。このことは蛋白質にその三次構造なとらせ
、蛋白質を分子内ジスルフィド結合によってこの構造に維持するような条件下で
の切断反応の実施を可能にする。
このような条件下では、標的蛋白質内に存在すると考えられる切断部位へのプロ
テアーゼの接近が明害されることが判明した。ヒンジ領域は1つ以上のプロリン
残基な含むアミノ酸配列から成る。このことは実質的にしわのない分子セグメン
トの形成す可能にする。アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、リシン、
セリン及びスレオニン残基はイオン相互作用な最大にし、ヒンジ領域含有成分を
水溶性にするような普及び/または配列で存在する。
切断部位はFvポリペプチド鎖に直接隣接し、Fv中の鎖のアミノ酸構造に存在
する配列を除いた1個のアミノ酸またはアミノ酸配列を含むことが好ましい。切
断部位は特定の切断剤によって固有にまたは優先的に切断されるように設計する
のが好ましい。エンドヌクレアーゼが好ましいが、非酵素的(化学的ノ切断剤を
用いることができる。例えば臭化シアン、希酸、トリプシン、黄色ブドウ球菌(
5taphylococcus aureus )、V−8プロテアーゼ、プロ
リン後切断酵素、血液凝固第Xa因子、エンテロキナーゼ及びレニンのような、
多くの有用な切断剤は特定切断部位を認識し、優先的または排他的に切断する。
現在好ましい切断剤はv−8プロテアーゼである。現在好ましく・切断部位はG
ln残基である。他の有用な酵素は例えば第Xa因子(Ile−Gzn−Gty
−Arg) または工7テoキf−ゼ(Asp−Asp−Asp−Asp−Ly
s)のように、多重残基を切断部位として認識する。この選択的切断アプローチ
の原理は、切断可能なリンカ−または選択的に切断可能なリンカ−もしくはスペ
ーサーが望ましい本発明の多機能構造体のリンカ−及びスペーサーの配列の設計
に利用することかできる。
H鎖及びL鎖ネズミ抗ジゴキシンモノクローナル26−10(第4A図、第4B
図)からのFRなネズミ抗リソチームモノクローナルglp−4H鎖(第3図上
列1)とL鎖からのCDRと同じDNR上でコード化し℃、vH(第4C図)と
■L(第4D図)領域を形成する、これらの領域は共にリソチームに対して特異
的な生合成抗体結合部位を明確にする。モノクローナルgtp−4のH鎖とL鎖
の両方からのネズミCDRttヒト骨髄腫抗KNEWMのH鎖とL鎖(第4E図
、第4F図)からのFRと共に同じDNA上でコード化した。生成した種間キメ
ラ抗体結合領域はそのヒトFRのためにヒトにおける低い免疫原性と、そのネズ
ミCDHのためのリソチームに対する特異性とな有した。
ヒ)H鎖FRへのCDR挿入を容易にし、生成したキメラアミノ酸配列の経験的
精製を容易にするために、合成りNAを設計した。このDNAは第、5図に示す
。
合成二機能FB結合部位蛋白質もDNAレベルで設計し、表現し、精製し、再生
し、これが特異的に所定の抗原(ジゴキシンノ及びFCと結合することを示した
。この構造体の詳縞な1次構造を第6図に示す;こ03次構造は第2B図に図示
する。
上記その他の実験の詳細と、本発明の基礎となる付加的な設計原理を下記に示す
。
遺伝子設計と表現
既知の可変部DNA配列を与えて、抗体分子からの天然または天然に近いFRと
CDRアミノ酸配列配列−ド化する合成vLとvH遺伝子を設計して、それぞれ
をFR−CDR及びCDR−FR境界にできるだけ接近して配置された固有制限
部位において分離した。または、特定動物種からの抗体分子のFBに類似したま
たは等しい天然FR配列なコード化する遺伝子を設計し、計画的に配置された制
限部位を含む[ダミーJ CDF!配列によってそれぞれを分離した。これらの
DNAでは天然または[ダミーJCDR配列な切断し、特定結合部位な明確にす
るCDRアミノ酸をコード化する配列で置換することができるので、これらのD
NAはBABS製造の出発吻質として役立つ。この代りに、第1抗体分子からの
天然または天然に近いFR配列と、第2抗体分子からのCDR配列な設計して、
直接合成することができる。上記vHと■7配列のいずれかをアミノ酸鎖すなわ
ち鎖のC末端と結合させるリンカ−を介し℃直接結合させることができる。
これらの遺伝子を合成して、例えば抗体定常部、酵素または毒素、または融合ポ
リペプチドの分泌または細胞内安定性を助成するリーダーペプチドをコード化す
る付加的なりNA配列を用いて、または用いずにクローン化することができる。
次に、遺伝子を適当なホスト細胞内に直接表限するかまたは表現する前に、FR
、CDRまたは「ダミーJCDR配列と新しい配列との交換によってさらに処理
することができる。この操作は遺伝子内のFR−CDR境界またはCDR−FR
境界に形成することのできる制限部位の存在によって容易になる。
第3図はキメラvHの設計の一般的アプローチを説明する;DNAレベルでの具
体的設計の詳細は1G4A図〜第4E図に示す。第3図のライン1と2はそれぞ
れの4FR配列と30DR配列を含む、ネズミモノクローナルgtp−4(抗す
ソチームノ及び26−10(抗ジゴキシンノのH鎖可変部アミノ酸配列を示す。
ライン3は26−1oFRとgzp4cDRな含むキメラ■ヨの配列な示す。図
示したように、ライン3のハイブリッド蛋白質はライン2の天然蛋白質に同じで
ある、但し1]配列TFTNYYIHWLKが配列IFTDFYMNWVRK代
’); 2JEWIGWIYPGNGNTKYNENFKGがDYIGYISP
YSGVTGYNQKFKGiC代’); 3JRYTHYYFがG55GNK
WANに代り;4ノAIJ″−CDR−2を超えた第6アミノ酸としてのVに代
った。これらの変化は26−10VHの特異性’1gtp−4の特異性を模倣す
るように変えた結果である。26−10の比較的保護されたフレーム領域内での
At&からVatへの単一アミノ酸置換は、CDR[ji換によって特異性な変
えるために行った高可変部外でのアミノ酸置換の例である。第3図の配列3の下
方には、CDR−FR境界に配置された、キメラVH(第4A〜4E図参照〕を
コード化するDNA内の制限部位を示す。
第3図のライン4と5は、他の構造体を表す。ライン4はヒト抗体NEWMの全
長vHである。このヒト抗体はライン5に示したようにCDR置換によってリソ
チームに対して特異性にすることができる。従って、例えばgtp−4からのセ
グメントTFTNYYIHWLKをNEWM17)TFSNDYYTWVRとi
t換し、その他のCDRを図示したように置換する。これにより℃、特異性な決
定するネズミ配列を含むヒト・フレーム配列から成るvHが生ずる。
本明細嘗の開示に照らし、任意の抗体を配列決定することにより、またはその配
列を文献で調べることにより、当菓者は任意のフレーム−ワーク領域な含む所望
の特異性な持つBABSな製造することが可能である。第3図に示したようなア
ミノ酸配列を比較するダイヤグラムは、所望の相補性を決定するために、どの特
定のアミノ酸を置換すべきかを示唆するために重要である。発現された配列は結
合に関して検査し、そしてアミノ酸配列データの傾向の観察および/またはコン
ピューターモデル技術に基づいて、比較的に一定の領域(conserved
region)の選択されたアミノ酸な交換することにより、修飾できる。
アミノ酸配列はDNAレベルで決定され、そしてDNAの操作は容易に行われる
ために、v■およびVLのデザインには、相当の柔軟性がある。
例えば、三つのCDHの各々に隣接する特異的制限酵素部位を含むネズミのVH
およびVL26−10のDNA配列は、逆転写および制限酵素部位調査の組み合
わせを行う、市販のコンピュータープログラム(コンビュジーン社のRv、ex
e)の助けによりデザインされた。VHおよびVL26−10ポリペプチドの既
知アミノ酸配列を入力し、該プログラムによってこれらのペプチドをコードする
全ての可能なりNA配列および全ての可能な制限酵素部位を分析した。このプロ
グラムは、さらに、選択する宿主発現倣生物がE、coli であるときは、こ
の微生物が好むコドンのみを用いて、ペプチドをコードするDNA配列を選択す
ることが出来る。第4図Aおよび第4図Bはプログラムからの出刃結果の例を示
すものである。合成遺伝子の核酸配列および相当てるアミノ酸が示されている。
制限酵素開裂部位もまた示されている。これらの合成遺伝子のCDRI数ノには
下線が付しである。
合@26−10VHオヨびVL ハ三つノc D Rノ各々K[i!する制限酵
素部位の一方もしくは両方が、ユニーク部位であるようにデザインされている。
6塩基部位(Bsm1またはBspMlに認識されるようなもの〕が好ましいが
、6塩基部位が不可能である時は、4もしくは5塩基部位が用られる。これらの
部位がそのままではユニークでないときは、必要なアミノ酸配列を変化させるこ
となく、遺伝子の中に出現する他の同じ部位を削除して、該遺伝子内でユニーク
部位とする。好ましい開裂部位は、一旦開裂された時、フレームワーク内でCD
Hの境界の直ぐ外側で粘着末端な持つフラグメンIf生じるものである。しかし
ながら、FR−CDR境界は絶対的なものではないこと、そしてまた、FRのア
ミノ酸配列は制限酵素部位を許さないことなどから、上記の理想的部位が不可能
であることが多い。そのようなときは、予期さnた境界からより遠い隣接部位を
FB中で選択する。
第5図は合成りNAのヌクレオチドおよび相当するアミノ酸配列(標準的1文字
記号で示す)な示て;この配列は、−膜構造:
R1−FRl−X、−FB2−X2−FB3−X3−FB4−R2(式中、R□
およびR2はベクター中に連結されるべき制限酵素処理部位であり、X X お
よびX3はCDR挿入のためにl ・ 2
都合のよい制限酵素部位を提供する機能をもつDNA配列である。ノ
で表されるマスターフレームワーク遺伝子を含む。この特定のDNAはネズミF
R配列およびこのFHの境界に隣接し’1:6−塩基の制限酵素部位を有し、所
望モノクローナルからのCDHなコードするヌクレオチド配列が容易に挿入でき
る。制限エンドヌクレアーゼ消化部位は、その略号で示されており;CDR置換
に選択される酵素は、下線で強調されている。この遺伝子な次の制限エンドヌク
レアーゼで消化すると、所望特異性の天然もしくは合成CDRと容易に適合しそ
して連結することができる3′および5′末端な生じる;KpnJ−オよびBs
tXlがCDR1の連結に、XbalおよびDralがCDR2の連結に、そし
て13ssH[がおよびC1alがCDR3の連結に使用される。
オリゴヌクレオチド合成
上記のようにしてデザインされた合成遺伝子およびDNAフラグメントは、化学
合成されたオリゴヌクレオチドの組立により、好ましくは製造される。バイオサ
ーチ(Biosearch )DNAモデル8600合成装置で15−10 C
lmarのオリゴヌクレオチドが合成され、トリス−ホウ酸−EDTA緩衝液(
TBE)でのポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGEJで精製される。この
DNA?:次いでゲルから電気的に浸出させる。オーバーラツプするオリゴマー
’kT4ポリヌクレオチドキナーゼでホスホリル化し、連結し℃より大きいブロ
ックとし、これもまた、PAGEで精製することができる。
合成オリゴヌクレオチドのクローニング長いオリゴヌクレオチドのブロックもし
くはペアーを適当な、例えばpUCクローニングベクターを用い(、E、C01
iヘクローン化することができる。先ず、このベクターをジングルストランド変
異形成によって、残存6塩基変異部位を削除することができる。例えば、VHは
、次の制限酵素部位にまたがる5イ固の初期ブロックとして合成し、pUCへク
ローニングすることができる=1.EC0R1から第−Narle位;2.第−
NarlからXbal ; 3.Xbalから5all ; 4.5allから
Ncol ; 5.NcolからBamHl 0 これらのクローン化−y−y
グメントナ続い℃単離し、数回の3−フラグメント連結およびクローニングステ
ップでpUCgプラスミド中に組み立℃ることが出来る。PAGEで選択された
所望連結物を、次いで標準的手順で例えばE、coliのJMs3株内に形質転
換し、LBアンピシリン+Xgalプレートにブレーティングすることができる
。この遺伝子配列は、サンガー(Sanger)のジデオキシ法でM14内にク
ローニングもしくはサブクローニングした後、スーパーコイルシーフェンシング
(supercoil sequ−enCingJによっ℃確認することが可能
である。
VHもしくはVb当たり、3個のCDR(またはその代わりに4個のFR)な置
換することが可能である。簡単な場合は、この置換はそれぞれの遺伝子を含むシ
ャトルpUCプラスミドを、各CDRまたはFRに隣接する二つのユニークな制
限酵素部位で切断し、切り出された配列を除去し、そしてこのベクターを所望の
CDRもしくはFRをコードする天然核酸配列もしくは合成オリゴヌクレオチド
と連結することにより達成される。
この3b分法は全CDR置換のためには3回、そして全FR置換のためには4回
線り返す必要がある。その代わりに、適当なFRで分離されている二つの連続的
CDRをコードする合成ヌクレオチドな、相当するCDRおよびFRが開裂によ
り除去されている遺伝子を含むpUCまたは他のプラスミドに連結させることも
出来る。この方法は、CDRおよび/またはFR交換遺伝子操作された遺伝子は
、適当な原核宿主、例えば種々のE、C01i株および真核宿主、例えばチャイ
ニーズハムスターの卵巣細胞、ネズミミエローマ、およびヒトミエローマ/トラ
ンスフエフトーマ細胞の中で発現させることが可能である。
例えば、遺伝子なE、coli中で発現させるべきときは、最初に発現ベクター
中にクローニングすることができる。このためには、遺伝子操作された遺伝子を
プロモーター配列、例えばtrpもしくはtaCおよびリーダーペプチドをコー
ドする遺伝子の下流に位置させる。得られる発現融合蛋白質は、細胞の原形質内
の屈折体(refractile bodies)に蓄積され、この細胞をフレ
ンチプレス(French pressJ または音波処理で破壊して収穫する
ことができる。この屈折体を溶液化し、多くの他の組換え蛋白質について既に確
立され℃いる方法で発現された蛋白質を折り畳み、また開裂する。
もし、遺伝子操作された遺伝子を、免疫グロブリンのための慣用的発現系である
ミエローマ細胞で発現させようとするならば、該遺伝子な最初に、例えばIgプ
ロモーター、分泌シグナル、免疫グロブリンエンハンサ−類、および種々のイン
トロンを営む発現ベクター内に挿入する。そのようなプラスミドは、定常領域の
全部もしくは一部をコードする配列を含ませ、重鎖もしくは軽鎖の完全部分を発
現させるようにしても艮い。この遺伝子のミエローマへの形質転換は、既に確立
されたエレクトロボV−V!7(electroporation)またはプロ
トプラスト融合方法で行われる。こうし℃形質転換された細胞はVLもしくはV
Hフラグメント、VL2もしくはVH2ホモダイマー、v′L−■Hヘテロダイ
マー、vH−vTJモジくハvTJ−VH−重鎖ポリペプチド、完全重鎮もしく
は軽鎖免疫グロブリンチェーンまたはそれらの一部を発現することが可能であり
、それらの各々は、前記説明されたように、他の機能(例えば細胞男性)を有す
る蛋白質領域に種々の様相で結合している。
重鎖の可変領域(もしくは可変領域および定常領域)9f含むベクターな、軽鎖
の可変領域(もしくは可変領域および定常領域)を含む類似のベクターとともに
共形質転換して、非共有結合的に会合した結合部位(もしくは完全抗体分子J’
r発現させることも可能である。
以下の実施例により、−重鎖結合部位な製造する具体例を、その結合特性を評価
するために採用した方法とともに開示する。
それに続いて、二つの機能領域を有する蛋白質の造成を開示する。最後に本発明
すff1J示する他のターゲット化蓋白質のシリ−ズな開示する。
l CDR又換および発現の実施例
第4図Aおよび第4図已に示した、ネズミのvHおよびvL26−10をコード
する合成遺伝子は、ソフトウェアプログラムであるコンビュジーン(compu
gene)の助けによって、該蛋白質の既知アミノ酸配列からデザインされた。
これらの遺伝子は、天然アミノ酸配列をコードするものではあるが、前記CDH
の置換を可能にするために、CDR(複数)なコードする核酸配列に隣接する非
天然のそし℃しばしばユニークな制限酵素部位をも含んでいる。
大きい合成オリゴマーの3′末端および5′末端の両者は、6−塩基制限酵素部
位を遺伝子およびpUCベクター内に含むようにデザインされた。さらにまた、
合成遺伝子内の制限部位(組み立てのために適するがpUCのクローニングのた
めのものではない)は、pUC内の適合部位(matching 5ites
)で「ヘルパー」クローニング部位により延長された。
合成DNAのクローニングおよびその後の遺伝子の組み立ては、遺伝子にそった
複数のユニーク制限酵素部位の間隔を置くことにより可能である。このことによ
り、任意の位置でのカセットミュータジェネシス(Ca5sette muta
genesis) による訂正および修飾が可能となる。その中には、異なる発
現ベクターへ適合させるために必要な5′末端もしくは3′末端の近辺の変更が
ある。例えば、PSt1部位なVl(遺伝子の5′末端近辺に位置させる。この
部位と発現プラスミドの制限部位の間に合成リンカ−(複数〕を容易に結合する
ことが出来る。これらの遺伝子は、バイオサーチモデル8600DNA合成装置
を用いて、各オリゴヌクレオチドを上記のように組み立てることにより合成され
た。これらの遺伝子はE、coliの形質転換のためにベクターpUcgに連結
された。
合成VH遺伝子から次の制限エンドヌクレアーゼの対にょっ℃消化することによ
り、特定のCDR&U裂させることができる二CDH□につい℃はHpHlおよ
びBstM;CDR2KついてはXbalおよびDraI;そしてCDR3につ
いてはBan口およびBan1. 一つのCDHの除去の後、もしこの制限処理
された遺伝子の3′および5′末端と新たなCDRが相補的−重鎖DNA配列を
含んでいる時は、所望の特異性を持つ該新たなCDRをその場で直接連結するこ
とができる。
本実施例においては、ネズミVH26−10およびVI、26−10の各々の三
つのCDRを、glp−4の相当するCDRで置換した。このキメラVHおよび
VL遺伝子は、26−10のFR(複数)およびglp−4のCDR(複数)を
コードするが、そのヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列は第4図Cお
よび第4図りに示されている。制限エンドヌクレアーゼ開裂部位は、標準的記号
で示した。CDR配列はさらなるCDRII換に有用なものとして選択される制
限エンドヌクレアーゼとともに下線で示した。
これらの遺伝子はシャトルプラスミドpUC8にクローン化された。クローニン
グの後にユニークな制限部位を保持させるために、VH一様遺伝子は該プラスミ
ドのEcoRl およびHindlもしくはBamH1部位に挿入した。
この遺伝子によりE、coliの直接発現も可能である。その代わりに、この遺
伝子の前にリーダー配列すlilいて、この融合遺伝子を宿主遺伝子(その発現
はそれぞれのオペレーターとリプレッサーの相互作用により調節される)に組み
込んで、E。
coli中で融合産物として発現させることもできる。蛋白質は最小培地での飢
餓状態によりおよび化学誘発剤により誘発することができる。VH−VL生合成
26−10遺伝子はtprおよびtacプロモーターの後ろの融合蛋白質として
発現された。
目的とする遺伝子転写産物は、次いでこの融合蛋白質のリーダーから、例えば、
ブロムシアン分解、トリプシン消化、緩和な酸による開裂、および/または第X
a因子プロテアーゼでの消化により切り離すことができる。従って、緩和な酸開
裂の部位を持つリーダーペプチドをコードする合成遺伝子を宮むシャトルプラス
ミドで、その中に合成りABS遺伝子な挿入しておいたものな、この目的のため
に使用した。さらに、このプラスミド中に、宿主細胞のペリプラズム(peri
plasm)内に、加工された目的蛋白質を分泌させるためのシグナルペプチド
をコードする合成りNA配列を、組み込んでもよい。
遺伝子産物を収穫しそして場合により融合ペプチドから遊離させたのち、その抗
体結合部位としての活性およびそのglp−4(リゾチームノエピトープに対す
る特異性を、確立された免疫学的技法、例えば、アフィニティークロマトグラフ
ィーおよびラジオイムノアッセイにより調べる。抗体の結合部位の正しい三次元
構造をえるための蛋白質の正しい折り畳みは、その活性のために必須の要件であ
る。この折り畳みは、天然に免疫グロブリン蛋白質を発現するミエローマ細胞の
ような宿主内では自然に生じる。その代わりに、細菌内での発現のためには、蛋
白質は封入体を形成し、これな収穫の後にその正しいコンホメーションを取らせ
かつその活性型に変侠するために、特定の溶媒条件での一連の処理が必要である
(91えは、Hochmanら、(1976J 、Biochem、、15:2
706−2710Jによれば、8M尿素、0.1M)リス−HCL 、 pH9
カラ20倍希KL、0.15MNaC4,0,01Mす7にナトリウム、p)(
7,4とする)。
第4図Eおよび第4図Fは、NEWMからのヒ)FR(複数)およびglp−4
からのネズミCDR1?、+を含むキメラVHおよびVl、(7)DNAおよび
アミノ酸配列を示す。CDRおよびさらなるCDR1t換もしくは経験的に決定
された修飾のために選ばれる制限し位には、下線を施した。
これらの造成物はマスターフレームワーク遺伝子をも構成し、この場合はそのフ
レームワークはヒトのフレームワーク配列である。そのフレームワークは、適当
なCDRk換により任意の特異性のBABSI造成するために使用できる。
他の特異性の結合り位も、本明細書に開示された方法な用りで、デザインされた
。その飼には、次のものが含まれる:ヒトNEWM抗体からのFRおよびネズミ
26−=10からのCDRを持つもの(第9図Aハネズミ26−10のFRおよ
びG−ループ(loop)C;DRを持つもの(第9図BハネズミPOPC−3
15のFRおよびCDRを持つ4の(第9図CJ、 抗−ヒト癌胎児抗原モノク
ローナル抗体のFBおよびCDRを持つもの(第9図DJおよび抗−CEA抗体
のVL17)FRおよびCDR1,2,3およびVa のFRおよびCDR1,
31=+y−1=yサス免疫グロブリン遺伝子のCDR2とともにもつもの(第
9図IgGZa、にモノクローナル抗体26−10のジゴキシン結合部位はマジ
zy) −ハ7タ (Muagett−HunjerJおよび同僚により分析さ
れた(未発表〕。26−IQv領域配列は、26−10HおよびL鎖mRNA転
写物のアミノ酸配列分析およびDNA配列分析の両者から決定された(D、バン
カ(Panka〕、J、N、およびM、N、M、、未発表テータノ。
この26−10抗体は高いジゴキシン結合親和性CK、=5.4X109M”〕
l示し、そして充分に決定された特異性プロファイルな有するので、その構造な
模倣した生合成結合部位との比較の基準(ベースラインノとなる。
蛋白質のデザイン:
26−10のFabフラグメントの結晶構造解析で決定された原子配位は、プル
ヴクハーペン・データ・バンク(Brook−haven Data Bank
Jから入手した。 得られたもとのFabフラグメント内でのVv領領域三次元
構造の検討により、慮して、このギャップを橋渡しするために15残基のリンカ
−を選択した。このり/カーは二次構造の傾向が小さく領域の折り畳みす明害し
ないようにデザインされた。即ち、この15残基配列(Gly−Gly−Gly
−Gly−8er)、は、VBカルボキシ−およびVzアミノ−末端な結合する
ために選択された。
15残基以下または15残基以上な持つ一本鎖結合部位の結合の検討で、VLか
らVnな分離すべき必要距離の重要性が証明された;例えば、cGly4−8e
r)よ !Jンカーは結合活性を示さず、そして(C1y4−3er)、リンカ
−は(Gl/4−8er)、リンカ−に比較して非常に低い活性しか示さなかっ
た。
遺伝子合成
合成結合す位遺伝子の744塩基配列のデザインな、しばしばE、coliで使
用されるコドンを選択して、26−10のFv蛋白質配列からめた。この代表的
合成遺伝子のモデルは、前記のとおり、第8図に示されている。Trpプロモー
ター−オペレーター、修飾Trp LK リーダーベプチ)−(M L E )
(その配列は第1O図Aに示され℃いる)、およびVHをコードする合成遺伝子
は、大部分前記のようにし”(UBした。VHをコードする遺伝子は、46個の
化学合成オリゴヌクレオチドから組み立てた(全て15塩基の長さだが但し粘着
クローニング末端な含む末端の7ラグメントは13ないし19塩基の長さである
〕。8ないし151固のオーバーラツプするオリゴヌクレオチドを、クローニン
グに適する制限部位(Narl、Xbal。
5a11、Sac口、5aCIJで切断した二本鎖DNAK、酵素な用い℃連結
し、8%ゲル上でPAGEにより精製し、pUCにクロー二/グし、これをポリ
リンカーに付加的クローニング部位な持つように修飾した。クローン化されたセ
グメントは、このpUCクローニングベクター中で連結して、工程を踏んでVH
を模倣する完全遺伝子へと組み立てた。
26−10VLを模倣する遺伝子は、自動DNA合成装置(モデル6500.バ
イオサーチ、サンラフ7エロ、CA;モデル380A、アプライドφバイオシス
テムズ、フォスターシティ−、CAJでXaaされた、33ないし88塩基対の
長い合成ポリヌクレオチド12本から組み立℃た。5本の個々の二本鎖セグメン
トは、遺伝子中の6−塩基制限部位(Aatl、BstE[、ppnl、Hin
dl、BgluおよびPstl)にまたがる長い合成オリゴヌクレオチドの対か
ら製造された。一つのケースでは、4本の長いオーバーラツプするストランドを
組み合わせてクローン化した。組み立て用制限部位としてpUCポリリンカーに
存在しない、例えばAatlおよびBstE[lで区切られた遺伝子フラグメン
トについては、クローニングを可能にするために、その制限部位の側にEcoR
lおよびBamH1末端を加えた。
(C1y−Gly−Gly−Gly−3er)、をコードするVHおよびVLの
間のリンカ−は、5aC1およびAat[1部位におよぶ二つの長い合成オリゴ
ヌクレオチド(54および62塩基の長さ;後者はEC0RIクローニング末端
を持つ〕からクローニングされた。完全−不鎖結合部位遺伝子をVH,VL、お
よびリンカ−遺伝子から組み立て、EcoRIおよびPst 1制限部位な側部
に持つ、アスパルチル−プロリル−VH−<リンカ−>−VLに相当する造成物
す製造した。
Trpプロモーター−オペレーターは、その5sp1部位から出発して、12本
のオーバーラツプする15塩基のオリゴマーから組み立て、そしてM L E
IJ−グー遺伝子は、24本のオーバーラツプする15塩基オリゴマーから組み
立てた。これらなりローニング部泣を側部にもつ組み立て部位のストラテジーを
用いてpUC内に組み立てた。最終的発現プラスミドは、5Sp1.EC0RI
およびPSt1gQCMxo図B参照ノを用いて3成分連結により、1)BR3
22ベクター内で造成した。中間体DNAフラグメントおよび組み立てらねた遺
伝子はジデオキシ法で配列決定した。
一本鎖蛋白質は、融合蛋白質とじ℃発現された。M L K IJ −グー遺伝
子(第10図AJはE、coli(1)trp LE配列に由来し、そして合成
trpプロモーターおよびオペレーターの調節下に発現される。この発現プラス
ミドでE、coliの JM83株を形質転換し、蛋白質の発現をM9最小培地
中で、インドールアクリル酸(10μg−/mA)な添加し℃細胞比変A600
=1において誘発した。融合蛋白質の高い発現レベルは、不溶性蛋白質顆粒とし
ての該蛋白質の蓄積をもたらし、これは細胞ペーストから回収された(第11図
、レーン1)。
融合蛋白質の開裂:
結合部位蛋白質からのM L E IJ−グーの除去は、該リーダーと結合部位
配列の間に存在させたAsp−Proペプチド結合な酸で開裂することにより行
った。融合蛋白質な含む蛋白質顆粒な洗浄し、6Mグアニジ7−HC1+10%
酢酸pH2,5で37℃に”C96時間インキュベートして開裂した。この反応
は10倍過剰量のエタノールを添加して一20℃で一夜インキュベートして沈澱
させて停止し、遠心分離し、さらに精製が必要となるまで(第11図、レーン2
J−20℃で保存した。
酸で開裂された結合部位は、開裂な受けずにのこった融合蛋白質からDEAEセ
ルロースクロマトグラフィーで分離した。
開裂混合物から得られた沈澱な、6Mグアニジン−HC1+0.2Mトリス−H
C/=、pH8,2+0.1M 2−メルカプトエタノールニ再度溶解し、6M
尿素+2.6mMトリX−HC/=、pH75+1mMEDTAに対し℃充分に
透析した。2−メルカプトエタノールを最終濃度0.1Mとなるように添加し、
この溶液を室温で2時間インキュベートし、そして6MM累+2.5 mM )
+JX−HCt+1mM EDTA、pH7,sで緩衝化した2、5X45m
のDEAEセルロースカラム(ワットマン DEs2)に導入した。開裂されな
かった融合蛋白質は、DE52カラムに弱く吸着し、結合蛋白質の溶離に対して
遅れて溶離した。カラムへの導入および尿素緩衝液での洗浄後に最初に溶離した
蛋白質フラクションは、BABS蛋白質を含み未開列6合蛋白質は含まれていな
かった。融合蛋白質が幾分混在する後方のフラクションはプールし%DEs 2
で再度クロマトグラフィーし、回収された一本鎖結合蛋白質は他の純化蛋白質と
もに一つのプールとし℃まとめた(第11図、レーン3)。
26−10結合部位模倣物を次のようにして折り畳んだ:6M尿素+2.5mM
)すx−HCit+1mMEDTA中に置イタ前記DE52ブールを、p)1
sに調整し、0.IMの2−メルカプトエタノールで37℃で90分還元した。
この反応物を少なくとも100倍に、0.01M酢酸ナトリウム、pH5,5で
希釈してlOμ9−/mlより低い濃度とし、アセテート緩衝液に対して4℃で
2日間透析した。
アフィニティークロマトグラフィー:
活a結合蛋白質の精製をアフィニティークロマトグラフィーで、4℃におけるウ
ワバインーアミンーセファロースカラムを用いて行った。折り畳み蛋白質の希釈
溶液な、一対の直列カラムに直接導入した。カラムは各々0.OIMのアセテ−
1m液、p)1s、sで平衡化した伎脂3mlが充填されたものである。カラム
をそ4ぞれ充分量のアセテート緩′@液で洗浄し、さらにこの緩衝液に溶かした
IMNaCj、20mMウワバイン、 および3Mチ。オシアン化カリウム各々
5miで連続し℃洗浄し、これら各洗浄の間にアセテート緩衝液での洗浄を挾ん
だ。ジゴキシン結合活性が依然として溶離液中に存在していたので、溶離液をプ
ールし、限外f過(アミコン(AmiCOn J社; PM l am、200
m1m縮装置〕で20倍に巖縮し、再度アフィニティーカラムに導入し、そして
上記のようにし℃溶離した。280nmの吸光度が大きいフラクションなプール
してPBSAまたは上記アセテート緩衝液に対して透析した。DEs 2プール
およびクワバイン−セファロ−スプール中の蛋白質量は、0.01Mアセテート
緩衝液に対して透析したのち、アミノ酸分析で定量した。その結果な第1表に示
す。
第1表
を当たり mg 前工程に 融合蛋白質工程 湿重量 蛋白質 対する に対す
る開裂収率 相対収率
細飽12.Ofi’ l 440.0m9?Lペースト
融合蛋白質 2.35’ 480.0In?’°b100.0% 100.0%
顆粒
酸開裂/ 144.0ダ 38.0f338.0’DE52プール
ウワバイン 18.1ダ 12.6d4.7゜aローリ−(Lowry)の蛋白
質分析により決定す吸光度の測定により決定
Cアミノ酸分析により決定
ら溶離されたBABS蛋白質の量から計算e収率%はモル量により計算した
遺伝子および蛋白質の配列分析
完全遺伝子を、サンガー(sangerJのジデオキシ法で両方向から配列決定
したところ、遺伝子が正しく組み立てられていることが確認された。蛋白質配列
もまた蛋白質配列分析で確認した。自動化エドマン分解は、完全蛋白質(残基1
−40Jおよび二つの主要CNBrフラグメント(残基108−129および1
40−159Jについて、モデル120八オンライン・フェニルチオヒダントイ
ン−アミノ酸分析Th’に具備したモデル470A気相配列決定装置(アプライ
ド・パイ、オシステムズ社、フォスターシティ−、CAノを用いて実施した。5
DS−PAGEで分画されこのゲル片から水で溶離された均一な結合蛋白質を、
1%トリフルオロ酢酸−アセトニトリル(1:IJ中の過剰量の20,000倍
CNBrで、暗所に”C25℃で12時間処理した。得られたフラグメントを、
5DS−PAGEで分離し、電気泳動的にイ7モビo:/膜(Immob 1I
on membrane)(ミリボア社、ペッドフォード、MA)に移行させ、
ここから染色されたバンドを切り出し℃、配列決定した。
ラジオイムノアッセイで評価した。マイクロタイタープレートのウェルなアフィ
ニティー法で精製したヤギ抗−ネズミFabフラグメント(ICNイムノバイオ
ロジカルズ社(Immun。
Biologicals )、リスル(Lis t16 ) 、 I L J
17)PBSA中の10μf/rILtの溶液で4℃で一夜コーティングした。
プレートを洗浄し、PBSA中の1%ウマ皿清でブロックし、PBSAもしくは
0.OIM酢酸ナトリウムpHs、s中に26−10FabまたはBABSfj
!:含む溶液(50μt) yウェルに加えて、室温で2ないし3時間インキュ
ベートした。未結合の抗体フラグメントをウェルから洗浄したのち、25μtの
連続希釈された強心グリコシドCPBSA中10−4ないし10−11 Mノを
添加した。試験に用いた強心グリコシドには、ジゴキシン、ジギトキシン、ジゴ
キシゲニン、ジギトキシゲニン、シトキシン、ウワバインおよびアセチル−スト
ロファンチジン(acetylstrophanthidinJが含まれる。1
25ニージゴキシン(25μL 、50,0OOCp”sケンブリッジ・ダイア
グノスティックス社(Cambridge Diagnostics)、ビレリ
カ(Billerica)、MA) を各ウェルに添加したのち、ブレートナー
夜4℃でインキュベートし、洗浄しそして計測した。
阻害曲線を第12図に示した。各ジゴキシン類縁体に対する相対親和性は、50
%阻害な示す各類縁体の濃度を50%圀害な与えるジゴキシン(またはジゴキシ
ン類縁体の濃度で割ってめた。BABSにおいては、26−1oFabにおい℃
観察されるよりもグリコシド濃度を低下させる阻止曲線の置換が存在する;何故
なら、26−10Fabよりも活性の劣るBABSがプレートに結合したからで
ある。0.01M酢酸ナトリウム。
pH5,5中のBABSへ0.25M尿素を添加すると、プレート上のヤギ抗−
ネズミFabコーティングに対し℃、より活性なsFvが結合した。このことが
、BABS阻害曲線を高グリコシド礎度側へ、26−10Fabの位置へ近すけ
だが、アセテート緩衝液のみの甲で得られたsFvの曲線の相対位置は保持され
た理由である。125I−ジゴキシン結合の50%韻害を与えるインヒビターの
正常化濃度で表した結果な第2表に示す。
第2表
26−10 正常化
抗体成分 グリ=+シ)” D DG DODOGA−8G QFab ジゴキ
シ7 1.0 1.2 0.9 1.0 1.3 9.6 15ジゴキシゲニン
0.9 1.0 0.8 0.9 1.1 8.1 13BABS ジー!*
シy 1.0 7.3 2.0 2.6 5.9 62 150ジゴキシゲニン
0.1 1.0 0.3 0.4 0.8 8.5 21DG ニ ジゴキシ
ゲニン
DO= ジギトキシン
DOG : ジギトキシゲニン
A−3: アセチル―ストロファンチジンG = ギトキシン
0 = ウワバイン
親和性の決定
平衡結合の検討により結合定数(2LSSOCiatiOn C0n−5tan
t)を測定した。免疫沈降実験におい又は、100ptの3H−ジゴキシンにュ
ー・イングランド・ヌクレアー(New Englar+d Nuclear)
、 ビレリカ(B111eriCaJ。
MA)を連続的濃度(10−7Mないし1o −11M)で、一定濃度の26−
10FabまたはBABS100μ/、に添加した。
室温で2ないし3時間インキュベートしたのち、ネズミFabフラグメントに対
するヤギ抗体(ICN イムノバイオロジカルズ社)100μt、家兎抗−ヤギ
IgGCICN イムノバイオロジカルズ社 ノのIgGフラクション50μt
、およびプロティンA−セファロース(シグマ社)の10%懸濁液50μtff
添加して蛋白質を沈澱させた。4℃で2時間の後、グラスファイバーFJ器(バ
キューム・フィルトレージョン・マスホール)−(Vacuum Viltra
tion ManifoldJ 、ミリボア社、ペッドフォード、MA、)で減
圧濾過により、結合抗原および遊離抗原を分離した。次にフィルターの円盤を5
mlのシンチレーション液中でモデル1500)リーカープ・リフイド争’/7
チV ’/−57−7f ライザー(Tri−Carb Liqu−1d 5c
intillation Analyzer)(バラカート社(Packard
J 、Xターリング(Sterling)、VAJ Kよつ℃計測した。結合定
数、Ko 、は、マスアクション(massactionJを基礎とした非−線
型カーブにフィツトするプログラムであるLIGANDI用いて、未変換の放射
性リガンド結合デーp (untransformed radiolig?L
ndbinding clata)のスキャッチャード分析によって計算した。
Ko値(複数)は、第13図AにおいてBABSにそしてi13図已においてF
abに対して示したシップスプロット(sips plotsJおよび結合等温
曲!fi(bindingiS○thermJからも計算した。結合等温曲線の
ためにはデータを、未結合ジゴキシンの一度の対数に対する結合したジゴキシン
の濃度なプロットし、解離定数を50%飽和におけるリガンド濃度から推定した
。これらの結合データはまた、横軸は同一とし縦軸な下記定義のlog r/(
n−rJ としたシップスプロットとして直線的にもプロットした(挿入ゲラフ
ッ。平均固有結合定数(Koノは次の変形7711式(39ノから計算しt、ニ
ー: Log(r/n−r)−a logc−a 1ogKO(こ、:でrは未
結合ジゴキシン濃度がCのときに抗体1モルあたり結合したジゴキシンのモルに
等しく、nは抗体結合部位の飽和時に結合したジゴキシンのモル数に等しく、そ
してaは平均固有結合定数KOを中心とする結合定数の分布を表す不均一性のイ
ンデックスである)。このデータの最小二乗線型回帰分析の結果、得られた各ラ
インの相関係数はBABSにおい℃は0.96そしてFabにおいては0.99
であった。計算された結合定数の要約を第3表に示す。
第3表
データの 結合定数(KO)
分析法 KO(BABSJ 、M−” Ko(Fab〕、M−IX’Pヤツチ
(3,2±0.9JX107 (1,9±0.2JXIO8ヤードプロツト
シー7プス 2.6XIO71,8X108プロツト
等温結合 5.2XIO73,3XIO曲線
前記−末鎖結合部位をコードする杉酸配列な、第二の活性領域として機能させる
ために、リーダーとしてのプロティンAのFBフラグメントなコードする配列と
融合させた。スペーサーとして、FBフラグメントの最終11アミノ酸からなる
天然アミノ酸なAsp−Pro希酸開裂部位に結合して使用した。
FBのFB結合領域は、ヘリックス構造を持つ直前の43アミノ酸からなる(第
2図B参照]。
遺伝子フラグメントは、バイオサーチDNAモデル8600合成装#な用い℃前
記のようにして合成した。合成オリゴヌクレオチドを前記の確立された方法に従
って、E、C01iに形質転換したpUC8ベクターを用いてクローン化した。
次いで、第6図A図に示した完全融合遺伝子を、E、coli中で発現させた。
音波処理して封入体を遠心分離で集め、6Mの塩酸グアニジy(GuHC4)、
0.2M )リス、O,1M2−メルカプトエタノール(BME)、pH8,2
に溶解した。この溶液中で蛋白質を室温で一伎変性し還元した。この封入体から
分子蓋分iクロマトグラフィーで融合蛋白質を精製した。セファロース4Bカラ
ム(1,5X80o++Jは、5M GuHC6および0.01MNa0Ac
、 pH4,75tj!:溶媒として行った。蛋白質溶液を0.5−1.0 m
lの量で室温でカラムに導入した。フラクションを集め、冷却エタノールで沈澱
した。これらのフラクションQSDSゲルで泳動し、總換え蛋白質(約34.0
OODJに富んだフラクションなプールした。この精製は、有意な蛋白分解の問
題なしに封入#に純化する簡単な菓一工程を提供する。
折り畳み(refolding]のために、 蛋白質を100ゴの同じGuHC
j−1Jス−BME溶液に対して透析溶液を2日間かげて0.5sMGuHcz
、0.01M )すX、0.01MBMEで11倍に希釈した。透析袋をQ、
OIMNaCjに移して蛋白質な充分に透析してから、RIAにより、1251
−標識ジゴキシンの結合アッセイを行った。この折り畳み工程を簡単にするため
に、水で迅速に布状してc、uHcz a度を1.1Mに低下させ、その後リン
酸緩衝食塩水(0,1sM NaC6・0.05Mリン酸カリウム、pH7−0
−03% N a N 3含WJKに対して透析し、12時間以内にGuHC6
k全て除去することもできる。両タイプの生産物ともに、第7図Aに示すとおり
結合活性を示した。
三機能性の証明
FB+J−グーおよび融合されたBABSを持つこの蛋白質は、三機能性である
; BABSは抗原に結合することが出来、そしてFBは免疫グロブリンのFc
領域に結合することが出来る。
この二重性且つ同時の活性を証明するために、数種のラジオイムノアッセイな行
った。
結合部位の特性はマジェットーハンターら、J、ImmunOl。
(1982〕 、129 :1165−1172 ; Mo1ec、Immun
ol。
(1985)、22:477−488により開発されたアッセイ法の変法で試験
し、固相サンドイッチアッセイとしてマイクロタイタープレート上で行った。ヤ
ギ抗−ネズミFab抗血清(gAmFa+)ノ を第一抗体として用い、これを
最初にプレートのウェルにコートして、結合データを得た。これらの抗血清は大
部分フレームワーク領域に存在するように見えるエピトープを認識するポリクロ
ーナル抗血清である。続いて、検定サンプルをコートしたウェルに添加し、gA
mFab(これは適当な抗原部位な示す成分に結合する)と共にインキュベート
した。
未結合蛋白質を全て洗浄し去り、ウェルを1251 dig BSAまたはl’
25 ■6 ig−リジンとしての125ニー標識(放射性ヨード化ノジゴキシ
ン複金物に暴露した。
データを第7図Aにプロットした。この図には、コントロールとして元の26−
10抗体を含めた、希釈曲線実験結果が示されている。部位は、徐々に折り畳ん
だ一本鎖蛋白質+11および迅速に希釈し迅速に折り畳んだ一本鎖蛋白質(2)
を含め、最初のストック溶液から調製された一連の希釈な用いて前記の125ニ
−dig−BSAで探索された。3つの希釈曲線の全てが平行な示し、このこと
はBABS分子上のgAmFab結合領域がオーセンティックな26−10抗体
のFvQものと実質的に同一であること、即ち、両皆白質に関して表面エピトー
プが同じであるらしいことを示唆した。
これらのアッセイの感度は、Fvのジゴキシンに対する結合親和性が少なくとも
lO6に相違ない程度のものであった。ジゴキシン結合の実験データは、10
ないし10 M の範囲の結合定数を与えた。元の26−10抗体は5.4 X
l o9M−1の親和性な有する。阻害アッセイもまた、I−aig−リジン
の結合を示し、未標識ジゴキシン、ジゴキシン結合、ジギトキシゲニン、ギトキ
シン、アセチルストロフアンチジン、オよびウワバインにより、元の26−1o
Fabと略平行して阻害された。このことは生合成蛋白質の特異性かもとのモノ
クローナルと実質的に等しいことを示唆した。
第二のタイプのアッセイにおいて、ジゴキシン−BSAを用いて、マイクロタイ
タープレートをコートした。再生したBABS (FB−BABS)をコートし
たプレートに添加し、活性な結合部位を持つ分子のみがプレートに付着できるよ
うにした。
プレート上に結合したFB−BABSに1251−標識家兎Ig(。
(放射性リガンドノを混合した。結合した放射能活性はIgGとBABSのFB
領領域の相互作用を反映し、この結合の特異性は第7−8に示されているように
、増加量のFB、プロティアA、家兎Ig(1,、IgG2a、およびIgG1
により結合が阻害されることにより証明される。
オーセンティツタな結合を証明するために、次の成分な試験した:未標識ホ兎I
gGおよびIgG2aモノクローナル抗体(これはBABSのFB領領域競合的
に結合する〕;およびプロティンAおよびFB(これは放射性リガンドに競合的
に結合する)。第7−8に示すとおり、これらの成分は予想どおり完全に放射性
リガンドの結合fr:阻害することが認められた。IgG1サブクラスのモノク
ローナル抗体は予測どおりFBに弱くしか結合せず、約34%の放射性リガンド
を結合から阻害したに止まった。これらのデータは、BABS領域およびFB領
領域独立の活性を有することな示役した。
本発明に従っ℃造成され、E、coli および他の宿主細胞で上記のようにし
℃発現できる他のBABS含有蛋白質は、図面に記載され℃いる。これらの蛋白
質は二官能性もしくは多官能性である。各造成物はスペーサー配列な介して、酵
素、リセプター、毒素または成長因子のような生物学的活性エフェクター蛋白質
をコードするアミノ酸からなるエフェクター分子に結合した一本QBABSI含
んでいる。図面に示されているそのような造成物のある例では、上皮性成長因子
(第1511i%AJ、ストレプトアビジン(第15図B)、腫瘍壊死因子(T
NF)(第15図a)、カルモジュリン(第15図D)、血小板由来成長因子C
B−PDGFJ(第15図E)、リシンA(第1511i、インターロイキン2
(第1511iおよびFBダイマー(第15図H)を含む蛋白質が挙げられる。
上記各々は後続成分(トレーラーノとして用いられ、BamHI制限部位で規定
されるDNAによりコードされるスペーサー(Gly−3er−Gly〕y介し
て、予め選択されたBABSに結合され℃いる。もし必要なら、そのBamHI
i位を開いてBam1(I粘着天端な持つ任意の長さのオリゴヌクレオチドな挿
入することににより、このスペーサーに付加的アミノeV加えて、造成物に経験
的修飾を加え又もよい。各遺伝子はまた適当な発現ベクターへの挿入を助けるた
めに、Ps t li位で終了してもよい。
EGFおよびPDGFi成物のBABSk、例えば、フィブリンに特異的なもの
として、EGFまたはPDGFff:創傷部位に配給することも可能である。T
NFおよびリシンAl7)BABSは、腫瘍抗原、例えばCEAに特異的で、癌
の治療に有用な造成物な提供するであろう。カルモジュリンの造成物は放射活性
イオンおよび他の金属イオンに結合する。そのBABSは例えば、フィブリンも
しくは膿瘍抗原に特異的であり、血栓もしくは腫瘍の存在を突き止める造映剤と
して使用可能でろろう。
ストレプトアビジン造成物は非常に藁い親和性でビオチンに結合する。ビオチン
は造映の目的のために、離れた距離から構出できるイオンで標識できる。その代
わりに、ビオチンなアフィニティーマトリックスもしくは固体支持体に固定化す
ることもできる。次いで、BABS−ストレプトアビジン蛋白質な、アフィニテ
ィークロマトグラフィーもしくは固相イムノアッセイのために、このマトリック
スもしくは支持体に結合することが可能である。インターロイキン−2造成物は
、例えば、T−細胞表面抗原に特異的なりABSに結合することが可能である。
FB−FBダイマーはFCに結合し、そしてBABSとイムノアッセイもしくは
アフィニティー精製工程にお(・て、固定化免疫グロブリンを介して同相に結合
して用いることができろう第14図はエフェクターセグメントtリーダーとして
有する多機能蛋白質を飼1示する。この多機能蛋白質は、選択されたBABSK
AST)−Proジペプチドを介してC末端で結合したFB−FBダイマーから
なる。この蛋白質は、ある意味で≠15図Hの造成物と非常に類似の機能ヲ待つ
。ダイマ一部分が免疫グロブリンのFCi分に強く結合する。従つ℃、このタイ
プの造amはアフィニティークロマトグラフィー、固相イムノアッセイ、ならび
に治療分野で免疫グロブリンと他のエピトープの結合が望まれる場合に用いるこ
とが可能でおる。
上の説明から、本発明が特定のタイプのBABSおよびエフェクター蛋白質の結
合に限定されるものでないことは明らかでおろう。従って、他の態様も請求の範
囲に含まれる。
浄書(内容に変更なし)
浄書(内容に変更なし)
1−1も、@巴
rlCT+、@f)
#R・1
FIG、6A−1
序言f′内容に変更なし)
浄書(内容に変更なし)
最太毫占心77勺ソト の 7゜
m 浄書(内容に変更なし)
■
AflIllr
44.4− −
F%G、11
FIG、9C
浄書(内容に変更なし)
浄書(内容に変更なし)
LOG 床4!14′シ“丁ヘシンJL長 IllノFIG、13A
LOG太績合ゾ丁ヘソン濃戻 IMノ
FIG、13B
X二n工
(BABS)−
(BABS)−
(BxBs)−
Bad工 5naBエ
フ0 80 90 1oo Llo 120190 200 210 220
2]0 240コ10 コ20 :130 340 350 360Pst工
(BABS)−
PSt工
(BABS)−
Baコニ Bgl工 Bsm
NFLVWPPCVEVQRC5GCCNNtX工
CGTλ入CGTTCλ入TGTCG入CCGλCτCλ入GτCOλGCτG
CGτCCGG丁CC入λGτCCCCλ入入入τCEIVRKXP 工 FK
XATVTLEDHLSnaB工
(BAES)−
C1a工
(BABS)−
RMLTFKFYMPKXA置KHLQBa1m Xba工
GSETTFMCEYADETATIVEFLNRW工TFCQSエエ5TLT
會
Pst工
F:1(,1,15cj1
(BABS)−
x:n工
平成 元年11月2日
特許庁長官 吉 1)文 毅 殿
1、事件の表示
PCT/US88101737
名 称 クリエイティブ・パイオマリキュールズ・インコーホレーテッド
4、代理人
住 所 東京都千代田区大手町二丁目2番1号新大手町ビル 206区
5、補正命令の日付 平成 1年10月 3日 [有]送日)6、補正の対象
7、補正の内容
別紙の通り(尚、(3) (4)の書面の内容には変更なし)国際調査報告
paT/us88101737
CanCer、tumor、treaセment。
Claims (48)
- 1.予め選択された抗原決定部位に結合することが出来、そして、該予め選択さ れた抗原決定部位に結合可能な免疫グロブリン分子の可変領域の配列の少なくと も一部分にホモロガスである少なくとも一つの蛋白質領域からなる、生合成され た抗体結合部位;および該結合部位に結合したペプチド、および哺乳類内での生 物学的活性に適するコンホメーション、イオンを封鎖することのできるアミノ酸 配列および固体支持体に選択的に結合することのできるアミノ酸配列を有する、 エフェクター蛋白質類からなる群から選択されたポリペプチド;からなる組換え DNA技術に由来する単一遺伝子から発現される一本鎖多機能生合成蛋白質。
- 2.結合部位がポリペプチドリンカーにペプチド結合で結合した少なくとも二つ の領域を有する、請求項1記載の蛋白質。
- 3.前記二つの領域が天然免疫グロブリンのVHおよびVLに似せたものである 請求項2記載の蛋白質。
- 4.前記各領域のアミノ酸配列がFRのセットの間に挿入されたCDRのセット からなり、該CDRおよびFRの各々は、予め選択された抗原決定部位に結合す ることの出来る免疫グロブリン分子の可変領域のCDRおよびFRの少なくとも 一部分にそれぞれホモロガスである、請求項2記載の蛋白質。
- 5.前記領域の少なくとも一つが、第一免疫グロブリンのCDRの部分にホモロ ガスなCDRのセットおよび第二の異なる免疫グロブリンのFRの部分にホモロ ガスなFRのセットからなる、請求項4記載の蛋白質。
- 6.ポリペプチドリンカーが、少なくとも40オングストロームの長さで、親水 性である、請求項2記載の蛋白質。
- 7.ポリペプチドリンカーが、水性溶液中で無構造なコンフィギュレーションを 一緒になって帯びる複数のアミノ酸からなる、請求項2記載の蛋白質。
- 8.ポリペプチドリンカーがシステインを含まない、請求項2記載の蛋白質。
- 9.ポリペプチドリンカーが複数のグリシンまたはアラニン残基からなる、請求 項2記載の蛋白質。
- 10.ポリペプチドリンカーが、一つのアミノ酸配列の複数の連続コピーからな る、請求項2記載の蛋白質。
- 11.ポリペプチドリンカーが、部位特異的開裂剤で認識される一つもしくは一 対のアミノ酸配列からなる、請求項2記載の蛋白質。
- 12.前記抗体結合部位が抗原決定基に、免疫グロブリン分子の結合特異性と少 なくとも実質的に同一の特異性で結合する、請求項4記載の蛋白質。
- 13.抗体結合部位が抗原決定基に少なくとも約106M−1の親和性で結合す る、請求項4記載の蛋白質。
- 14.抗体結合部位が抗原決定基に、免疫グロブリンの結合親和性に比べて約二 桁より劣ることがない親和性で結合する、請求項4記載の蛋白質。
- 15.前記抗体結合部位および前記ポリペプチドの間に挿入されたポリペプチド スペーサーをさらに有する、請求項1記載の蛋白質。
- 16.ポリペプチドスペーサーが、選択的開裂可能なアミノ酸からなる、請求項 15記載の蛋白質。
- 17.スペーサーが親水性である、請求項15記載の蛋白質。
- 18.スペーサーが、水性溶液中で一緒になって無構造なポリペプチドコンフィ ギュレーションを帯びる複数のアミノ酸からなる、請求項15記載の蛋白質。
- 19.スペーサーがシスティンを含まない、請求項15記載の蛋白質。
- 20.スペーサーが複数のグリシンまたはアラニン残基を有する、請求項15記 載の蛋白質。
- 21.スペーサーか一つのアミノ酸配列の複数の連続コピーからなる、請求項1 5記載の蛋白質。
- 22.エフェクター蛋白質が、酵素、毒素、リセブター、結合部位、生合成抗体 結合部位、成長因子、細胞分化因子、リンホカイン、サイトカイン、ホルモンま たは抗一代謝物質である、請求項1記載の蛋白質。
- 23.イオン封鎖する能力のある配列が、カルモジュリン、メタロチオネイン、 それらのフラグメント、またはグルタミン酸、アスパラギン酸、リジンまたはア ルギニンの少なくとも一つに富むアミノ酸配列である、請求項1記載の蛋白質。
- 24.固体支持体に選択的に結合可能なポリペプチド配列が、陽性もしくは陰性 に帯電したアミノ酸配列、システイン含有アミノ酸配列、ストレプトァビジン、 またはプロテインAのフラグメントである、請求項1記載の蛋白質。
- 25.生合成された抗体結合部位を複数有する、請求項1記載の蛋白質。
- 26.さらに別の生物機能領域を有する、請求項1記載の蛋白質。
- 27.請求項1記載の蛋白質をコードするDNA。
- 28.請求項27記載のDNAを宿し、該DNAを発現することの出来る宿主細 胞。
- 29.ポリペプチドリンカーにより結合された少なくとも二つのポリペプチド領 域(該ポリペプチド領域の各々のアミノ酸配列は複数のFRのセットの間に挿入 された複数のCDRのセットを含み、該CDRおよびFRの各々は免疫グロブリ ン分子のCDRおよびFRの少なくとも一部分とホモロガスである)を含む一本 鎖からなり、 上記領域の少なくとも一つは、第一免疫グロブリンのCDRアミノ酸配列の部分 とホモロガスなCDRアミノ酸配列のセットおよび第二の別の免疫グロブリン分 子のFR配列の部分とホモロガスなFRアミノ酸配列のセットを含み、上記ポリ ペプチド領域は一緒になって、予め選択された抗原に対する特異性を有するハイ ブリッド合成結合部位を規定する、組換え技術に由来するDNAからの発現で生 合成された結合蛋白質。
- 30.前記の領域がヒト免疫グロブリンのFRの部分にホモロガスなFRを含む 、請求項29記載の結合蛋白質。
- 31.ポリペプチド領域が生物学的に活性なアミノ酸配列に結合したペプチドで ある、請求項29記載の結合蛋白質。
- 32.さらに、放射活性原子を結合して有する、請求項29記載の結合蛋白質。
- 33.請求項32記載の結合蛋白質をコードするDNA。
- 34.請求項33記載のDNAを宿し、かつこれを発現することのできる宿主細 胞。
- 35.ポリペプチドリンカーにより結合された少なくとも二つのポリペプチド領 域(該ポリペプチド領域の各々のアミノ酸配列は複数のFRのセットの間に挿入 された複数のCDRのセットを含み、該CDRおよびFRの各々は免疫グロブリ ン分子のCDRおよびFRの少なくとも一部分とホモロガスである)を含む一本 鎖からなり、 上記ポリペプチドリンカーは、下記結合蛋白質が結合に適するコンホメーション を帯びたときに、該領域の一つのC末端および該領域の他方のN末端の間にまた がるに充分な長さのポリペプチドを規定するペプチド結合した複数のアミノ酸で あって、かつ水性溶液中で一緒になって無構造なポリペプチドコンフィギュレー ションを帯びる複数の親水性アミノ酸からなり、下記結合蛋白質は、水性溶液に 暴露された時FRのセットによって正しいコンホメーションに保持されるCDR のセットの全体的三次元構造によって決定される予め選択された抗原部位に結合 することができることを特徴とする、組換え技術に由来するDNAからの発現で 生合成された結合蛋白質。
- 36.結合蛋白質が水性溶液中で予め選択された抗原に結合するために適するコ ンホメーションに置かれたときに、ポリペプチドリンカーが少なくとも約40Å の長さである、請求項35記載の結合蛋白質。
- 37.ポリペプチドリンカーが複数のグリシンもしくはアラニン残基を有する、 請求項35記載の結合蛋白質。
- 38.リンカーが、一つのアミノ酸配列の複数の連続コピーを有する、請求項3 5記載の結合蛋白質。
- 39.リンカーが、(Gly−Gly−Gly−Gly−Ser)3からなる、 請求項35記載の結合蛋白質。
- 40.ポリペプチド領域の少なくとも一つが、第一免疫グロブリン中のCDRの 部分とホモロガスなCDRのセットおよび第二の別のヒト免疫グロブリンのFR の部分とホモロガスなFRのセットを有する、請求項35記載の結合蛋白質。
- 41.ポリペプチド領域の少なくとも一つが生物学的に活性なアミノ酸配列にペ プチド結合している、請求項35記載の結合蛋白質。
- 42.ポリペプチド鎖に放射活性原子がさらに含まれる、請求項35記載の結合 蛋白質。
- 43.各ポリペプチド領域のアミノ酸配列が、FRのセットの間に挿入されたC DRのセット(該CDRおよびFRは免疫グロブリン分子からのCDRおよびF Rの部分と少なくともホモロガスである)を有する少なくとも二つのポリペプチ ド領域がポリペプチドリンカーにより結合された一本鎖ポリペプチド鎖からなり 、 水性溶液中に置かれた時に該FRのセットにより正しいコンホメーションに保持 されるCDRのセットの全体的三次元構造によって決定される予め選択された抗 原決定基と結合する能力を有し、その結合特異性が、該ホモロガスCDRを有す る免疫グロブリン分子の結合特異性と少なくとも実質的に同一である、組換え技 術で誘導されたDNAからの発現で生合成された結合蛋白質。
- 44.各ポリペプチド領域のアミノ酸配列が、FRのセットの間に挿入されたG DRのセット(該CDRおよびFRは免疫クロプリン分子からのCDRおよびF Rの部分と少なくともホモロガスである)を有する少なくとも二つのポリペプチ ド領域がポリペプチドリンカーにより結合された一本鎖ポリペプチド鎖からなり 、 水性溶液中に置かれた時に該FRのセットにより正しいコンホメーションに保持 されるCDRのセットの全体的三次元構造によって決定される予め選択された抗 原決定基と結合する能力を有し、その結合特異性が少なくとも約106M−1で ある、組換え技術で誘導されたDNAからの発現で生合成された結合蛋白質。
- 45.結合親和性が少なくとも約108M−1である、請求項43または44記 載の結合蛋白質。
- 46.結合親和性が、ホモロガスCDRを含む免疫グロブリンの結合親和性に比 べて、2桁以上は劣らない、請求項43または44項記載の結合蛋白質。
- 47.ポリペプチド領域の少なくとも一つが生物学的に活性なアミノ酸配列にペ プチド結合している、請求項43または44項記載の結合蛋白質。
- 48.ポリペプチド鎖に結合した放射活性原子をさらに有する請求項43または 44項記載の結合蛋白質。
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