JPH07506727A

JPH07506727A - 凝集アッセイ用試薬

Info

Publication number: JPH07506727A
Application number: JP6500012A
Authority: JP
Inventors: リレイ、グレン・ジョージ; ハドソン、ピーター・ジョン; ヒルヤード、カーメル・ジュディス
Original assignee: アジェン・リミテッド
Priority date: 1992-05-22
Filing date: 1993-05-19
Publication date: 1995-07-27
Also published as: ZA933552B; EP0646173A4; EP0646173A1; WO1993024630A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】凝集アッセイ用試薬本発明は、凝集アッセイ、とりわけ全血凝集アッセイに使用するための試薬に関する。本発明はまた、該試薬を用いた、試料中の抗原、抗体または他の分析対象物を検出するための方法、および該試薬を含むキットにも関する。本発明は、このアッセイのための基本的試薬を産生させるための大腸菌中での組換えＤＮＡ法の使用を記載する。

この出願は、オーストラリア暫定特許出願第ＰＬ２５５１　（その全開示内容が参照のため本明細書中に引用される）に基づく優先権を主張する。

発明の背景イムノアッセイおよび類似の特異的結合アッセイは、いまや非常によく知られており、種々の生物医学や他の分野で広範囲に用いられている。最も一般に用いられているイムノアッセイでは、放射性同位体や酵素を含む複雑な検出系が利用されており、アッセイ手順が冗長で入り組んでおり高価な装置を必要とするという欠点を有している。ラジオイムノアッセイではさらに、同位体によってもたらされる放射能の危険性という欠点を有する。別法として、検出剤として赤血球またはラテックス粒子を用いた凝集イムノアッセイが提唱されている。イムノアッセイおよび凝集イムノアッセイは、本発明者らの国際特許出願筒Ｗ○９１１０４４９２　（発明の名称＝「凝集アッセイ」）に記載されている。とりわけ、本発明者らの米国特許第４，８９４．３４７号および第５．０８６．００２号には、全血試料に使用すべく設計された凝集イムノアッセイが記載されており、その際、内生赤血球が指示粒子として使用され、また、分析対象物結合性分子かまたは分析対象物類似体のいずれかに結合した赤血球結合性分子からなる凝集試薬が用いられている。非特異的凝集は、該赤血球結合性分子がグリコホリンなどのような豊富なよ（分散した赤血球膜構成物を認識する場合には回避できる。ＷＯ９１１０４４９２には、感度が改善された自己凝集アッセイが記載されている。米国特許第４．８９４，３４７号および国際特許出願筒ＷＯ９１１０４４９２号の全開示内容もまた参照のために本明細書中に引用される。

従来のイムノアッセイ、およびある種の凝集アッセイでは血清または血漿を単離することが必要であり、このことが今度は、通常、電力および特別の装置を必要とし、その結果、野外条件または遠隔地もしくは低開発地域での使用を非常に困難なものにする。それゆえ、全血を利用することが可能で、精巧な装置の利用を最小限に抑えることのできる試験システムを使用可能であることが非常に望まれる。野外条件下で使用するための試験システムは、安定で、迅速で、信頼性があり、かつ特異的であることが必要であり、陽性結果と陰性結果との明確な境界を与えることが必要である。費用削減のためには、そのようなシステムは最小数の試薬を必要とすべきであり、またそれら試薬自体も製造が容易なものでなけれハナラナイ。米１特許第４．８９４．３４７号およびＷＯ９１１０４４９２号に記載されたシステム（Ｓ　ｉｍｐｌｉＲＥ　Ｄ、　ＭｉｃｒｏＲＥ　ＤおよびＶｅｔＲＥ　Ｄテスト（アジエン・リミッテッドの商標）として市場に出ている）は、困難な条件下での簡便性および使用の容易さという要件を満足し、最小限の装置を必要とする。しかしながら、試薬を製造するのが高価である。

これらイムノアッセイに使用するため、２つの主要なタイプの試薬、すなわち、抗原−抗体構築物および２特異的抗体構築物が望まれている。現在製造されている抗原−抗体試薬は、たとえば、赤血球表面上に存在するグリコホリンＡに結合することができる抗体のＦａｂ断片に化学的に結合させた、ＨＩＶウィルス（ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２）の免疫優性（ｉｍｍｕｎｏｄｏ＋ａｉｎａｎｔ）部分からの抗原性ペプチドを利用する。他の抗原−抗体タイプの試薬では、免疫優性なペプチドよりもむしろ一層大きなタンパク質、たとえばＢ型肝炎表面抗原を利用する。

２特異的抗体およびＡｂ−ペプチド結合体は、現在、抗体の化学的および酵素的処理を含む一連の工程によって製造されている；これらは、ヒンジ領域でジスルフィド結合により連結された、特異性の異なる２つのＦａｂ分子からなる。得られた２特異的なＦ（ａｂ）ｚ分子は、指示試薬（赤血球など）および血液試料中の循環抗原の両方と反応する。

抗体（Ａｂｓ）および抗体断片は、哺乳動物細胞を用い（オイ（Ｏｉ、Ｖ、Ｔ、）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、１９８３８０８２５〜８２９）　、または細菌を用いて（ボス（Ｂｏｓｓ、Ｍ、Ａ、）ら、Ｊ　、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、１９８４１２３７９１〜３８０６およびボスらによる米国特許第４．８１６．３９７号。

カビリー（Ｃａｂｉｌｌｙ、Ｓ、）　、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　１９８４旦１３２７３〜３２７７およびジェネンテクおよびシティ −・オブ・ホープ（Ｃｉｔｙｏｆ　Ｈｏｐｅ）によるヨーロッパ特許第１２５，０２３号）、組換えＤＮＡ法により製造することができる（ウィンター（Ｗｉｎｔｅｒ）およびミルスティン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）、Ｎａｔｕｒｅ１１９９１　３４９　２９３　ニラドナー（Ｌ　ａｄｎｅｒ）らによる米国特許第４゜９４６．７７８号；クリエイティブ・バイオモレキュールズ（ＣｒｅａｔｉｖｅＢ　ｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、　Ｉ　ｎｃ、　）によるオーストラリア特許第６１２，３７０号）。Ｆａｂ領域において、２つの１１（Ｈ鎖およびＬ鎖）の組み合わせにより、該分子の末端に６つの可変表面ループが提供される。外部ドメイン（Ｆ　ｖ）におけるこれらループは相補性決定部位（ＣＤＲｓ）と呼ばれ、その抗原標的への該Ａｂの結合の特異性を提供する。

結合性の機能は抗体分子の可変ドメインに局在しており、Ｈ鎖およびＬ鎖の両方のアミノ末端側に位置している。可変領域は、天然の抗体分子からタンパク質加水分解された後でさえも非共有結合的に会合されたままであり（Ｖ、Ｖ、二量体（Ｆｖ領領域称する）として）、抗原認識能および結合能のほとんどを保持している（たとえば、インバー（Ｉ　ｎｂａｒ）ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ　Ｓ　Ａ、　］２７１０；ン＋ロン（５ｈａｒｏｎ）およびギポル（Ｇｉｖｏｌ）　、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、１９７６ＤＮＡ法を用いた定常領域を実質的に含まない２−鎖Ｆｖの製造法が、米国特許第４．６４２．３３４号および対応公開明細書ＥＰ−０８８，９９４号に開示されている。

本発明者らは、いまや、組換えＤＮＡ法を用いることにより、米国特許第４゜８９４．３４７号およびＷＯ９１１０４４９２号に記載されたアッセイの適用性を有意に改善および広げることが可能であることを見いだした。これら文献は、一方が赤血球に結合し他方が分析対象物に結合する２特異的抗体Ｆ（ａｂ）＊断片か、または特定のペプチドに結合した赤血球結合性抗体のＦａｂ断片のいずれかの適用を教示している。これら試薬は、まず精製マウス抗体を酵素で消化してＦｃ領域を除き、ついでＦａｂに還元し、ブロックし、結合させることによって、一連の工程で製造される。このプロセスにおける各段階、一層重要なことには全バイオプロセスは、遺伝子工学により製造した試薬の使用により簡単にすることができる。たとえば、オリゴヌクレオチド合成により、分析対象物特異性を構成する種々のＣ末端ペプチドテールをコードする遺伝子断片を提供することができる。

赤血球結合性分子は、充分な親和性を有することを条件として、完全なＦａｂよりもむしろＦｖ断片であってよい。別法として、−末鎖５ＣＦＶ％または一層小さなドメイン構造物を製造することができ、これらは生成物の安定性および収率にとって有利である。これら試薬に対する別の改善としては、マウス定常ドメインを除去して特異性を増大させ可溶性特性を改善することが挙げられる。本発明者らは、第二の抗原−認識ドメインかまたは抗原性領域のいずれかとともに抗体可変領域ドメインを含む２官能性組換えタンパク質を製造することができた。

抗体断片の産生に利用できる発現系としては、大腸菌および他の原核生物、酵母、バクロウィルスベクターおよび哺乳動物細胞が挙げられる。本発明者らは、いまや抗ノイラミニダーゼ抗体のＶ　Ｉｌ／　Ｖ　Ｌ／　Ｓ　ＣＦ　ｖドメインを非常に高レベルで発現させることを可能とする新規大腸菌分泌ベクターを開発した（パワー（Ｐ　ｏｖｅｒ）ら、Ｇｅｎｅ　１９９２　１１３　９５〜９９）、高レベルのＡｂ−ドメイン製造に関連して、下流プロセシング（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ　ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）を取り扱った＠多くの変性／再生処理（ｒｅｇｉｍｅｓ）を試験し、精製およびフンホメーション評価を助けるために、発現された抗体ドメイン中に分子［旗（ｆｌａｇｓ）　Ｊを導入した。

タンパク質のコンホメーションおよび結合親和性のための現在の物理学的試験としては、ＥＬＩＳＡ、蛍光消光、円二色性、脱気（ａｉｒｆｕｇｅ）遠心分離、およびビオセンサーの適用が挙げられる。

本発明者らは、驚くべきことに、ＩｇＧ分子中に通常存在する支持的分子構造の７５％を除去した後でも、ＩｇＧ　Ｆａｂアームの最極端にある相補性決定基の活性が保持されることを見いだした。抗原−結合性ドメインの親和性も有意の影響を受けないし、支持的分子構造の除去は該分子の安定性も減少させないように思われる。

抗体の可変領域ドメインの組換え生物中での合成は、大きな組換えタンパク質を使用した構築物（その多くは通常、固相アッセイのための不溶性分子として製造されている）などのような、他の仕方では製造することが不可能な試薬の製造を可能にする潜在性を有している。しばしば、一つの抗原は感染宿主において単一の免疫優性反応を生じず、循環している抗体を検出するには一つの抗原からの幾つかのエピトープが必要である。そのような場合、Ａｂまたは断片を有する組換え構築物としての幾つかのペプチドは、複数のＦａｂ−ペプチド結合体の必要性を回避する。複数の結合体の使用には、Ｆａｂ定常領域の相互作用の結果としての非特異的な凝集を回避するために大量のブロック試薬が必要である。それゆえ、組換え宿主中で２官能性分子を発現できることは、試薬（他の仕方では複雑な化学合成および別のブロック試薬を必要とする）の製造コストを劇的に減少させるものである。

発明の要約本発明は、組換えＤＮＡ法によって製造された一連の試薬を利用したアッセイを提供するものであり、該アッセイは、生物学的流体、とりわけ血液中の薬物、ホルモン、ステロイド、抗体および他の分子の検出に有用である。このアッセイおよびこれら試薬のための技術を教示するものであり、高感度アッセイ、および大腸菌中、または当業者に知られた他の発現系で一本鎖抗体分子を含む組換え抗体分子としての基本的試薬を製造するための手段を提供する。

本発明の一つの態様によれば、粒子結合性抗体または抗体断片（ＰＢＭ）、および分析対象物結合性残基または分子（ＡＢＭ）からなる２官能性組換えタンパク質が提供される。

分析対象物は、抗原または抗体であってよい。好ましくは、粒子結合性抗体または抗体断片は、赤血球結合性抗体または抗体断片（ＥＢＭ）である。

好ましくは、ＡＢＭは、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２のｅｎｖ　ｇｐ４１タンパク質の免疫優性領域からの抗原性ペプチド、およびｇａｇタンパク質の一つ、およびＢ型肝炎表面抗原の表面抗原からの免疫優性領域よりなる群から選ばれたものである。特定のＡＢＭは、分析対象物の特異性を構成するペプチドをコードする（たとえば、合成オリゴヌクレオチドからの）遺伝子断片からの発現により製造することができる。

別の態様において、ＡＢＭは、Ｂ型肝炎表面抗原、Ｄ−二量体およびイヌ心糸状虫抗原よりなる群から選ばれた抗原に対して向けられた抗体の一本鎖Ｆｖ領域である。

好ましくは、ＥＢＭは、抗赤血球抗体、一層好ましくは抗グリコホリン抗体の一本鎖Ｆｖ領域である。

構築物中に一本鎖Ｆｖ領域を使用することは、該抗体の定常領域がほぼ完全に除去され、その結果、最終アッセイにおいて異好性抗体による妨害の機会が一層少なくなるという利点を提供し、ブロック抗体を使用しない場合がそうであるように、完全な試薬の製造が一層有効となる。

本発明者らは、ＥＢＭとの関係におけるＡＢＭの方向性（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）が、最終生成物の感度および特異性にとって重要であることを見いだした。

特に好ましい態様において、ＥＢＭは、ハイブリドーマ細胞株Ｇ２６．４．ＩＣ３／８６（米国特許第４，８９４，３４７号およびＷＯ９１１０４４９２号に記載されている）により産生された抗グリコホリンＡモノクローナル抗体の一本鎖Ｆｖドメインである。この細胞株の試料は、１９８８年９月７日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（２０８５２，メリーランド、ロックビル、パークローン・ドライブ、１２３０１）にブダペスト条約下に寄託してあり、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ９８９３が与えられている。

本発明の第二の側面において、分析対象物結合性残基に機能的に連結した粒子結合性残基を単一の転写単位としてコードするＤＮＡ配列、並びに該配列を含む発現ベクターおよび宿主細胞が提供される。

本発明の第三の側面は、本発明の組換えタンパク質を利用したアッセイ法およびキットを提供する。

抗体のＦｖ領領域使用するのが好ましいが、本発明はその範囲内に、抗体のＦａｖ、Ｆ（ａｂ）ｔ、またはＶＨ断片の使用を包含することが明らかに理解されるべきである。

宿主細胞は、当業者によって組換え生物中での発現に現在用いられているものであればいかなるものであってもよく、大腸菌が好ましい。しかしながら、他の細菌、酵母または昆虫、哺乳動物または植物細胞などの他の宿主を用いることができることが明らかに理解されるであろう。本明細書に記載する大腸菌発現ベクターは、診断試験によって必要とされる独特の特性を有するプロテアーゼ耐性の「テール（ｔａｉｌｓ）　Ｊを設計しであるという点においてとりわけ新規である。本発明者らは、誘発処理（ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｒｅｇｉ＋ｏｅ）および高収率産生のための発酵条件を最適化した。

赤血球結合性活性および特定の分析対象物結合性活性の両方をコードするＤＮＡは、該２官能性試薬の遺伝子の複製および発現を可能とするＤＮＡ要素上に位置していてよい。このＤＮＡ要素は、適当な宿主中での複製および発現を可能とするプラスミドまたは等価なりＮＡ要素であってよい。

特定の分析対象物結合性活性を有する２官能性試薬の部分は、複製連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、または等温（ｉｓｏｔｈｅｒ＋ａ）増幅などのような、ＤＮＡの増幅のために当該技術分野で知られている標準法のいずれかにより細胞および組織から製造したＤＮＡによってコードされていてよい。

組換え２官能性試薬の使用により、以下の利点が得られる：１、現在の製造手順の簡単化ニジスルフィド結合による化学結合を必要としない。

２官能性融合タンパク質は一重鎮ポリペプチドとして製造される。

２、広範囲の分析対象物結合性分子のうちのいかなる２つをも、２官能性−重鎖ポリペプチド中に導入することができる。

３、ＤＮＡの変異により、修飾した２官能性−末鎖ポリペプチドを製造する操作が容易である。

４、ハツト毎の変動がない。

５、宿主細胞からの発現により、大量の可溶性ポリペプチドが製造された。

６、同定、単離および精製が容易である。

製造するのに高価でない。

７．２官能性試薬の範囲が増加している。

８、ハイブリドーマからの高レベルのタンパク質の産生に依存しない。

９、組換えＤＮＡ法は無限の変更が可能である。

発明の詳細な記載この発明の凝集アッセイにおいて、赤血球結合性抗体をコードするクローン化ＤＮＡに由来する組換え試薬が提供され、該抗体は、遺伝子操作の結果として、結合部分の結合特性を実質的に変化させることな（特定の分析対象物結合性分子の遺伝子または遺伝子断片によってコードされる分析対象物結合性分子に融合している。この試薬は、分析対象物の不在下で内生赤血球とともにインキュベートした場合、凝集しない。

本発明を以下の実施例（限定されるものでない）および図面を参照して詳細に記載する。図面中：図１は、クローンガン７１．１．１　ａに由来するＩｇＧ　（ＩＣ３／８６）ガンマ鎮の配列を図示する。ＩＣ３／８６　ＩｇＧガンマ−１，１，１ａのヌクレオチド配列およびそれから導かれるアミノ酸配列（成熟配列を太字および１文字コードで示す）を示す：図２は、ＰＣＲ増幅およびクローンに４ＡＣ１／２によって得られたＩｇＧ（ＩＣ３／８６）カッパ鎖の配列を図示する。成熟ＩＣ３／８６　１ｇＧカッパ鎮（配列は、クローンに４ＡＣ１／Ｃ２から決定したものと複製連鎖反応によってｍＲＮＡから直接増幅した遺伝子から決定したものとの混成である）のヌクレオチド配列およびそれから導かれるアミノ酸配列（太字および１文字コードで示す）を示す。

図３は、Ｉ　Ｃ３／８６ガンマおよびカッパ遺伝子可変ドメインの増幅および発現ベクターｐＰＯＷ中での５ｃＦｖの構築の方法を図示する。種々の抗体断片を増幅するのに用いるＰＣＲプライマー−鋳型の組合せを示す。

図４は、増幅および発現ベクターｐＨＦＡ中へのＩＣ３／８６　５ｃＦｖのクローニングの方法を図示する。種々の抗体断片を増幅するのに用いるＰＣＲプライマー−鋳型の組合せを示す。

図５は、発現ベクターｐＨＦＡＩＡＣ中にＦＬＡＧおよびＨＩＶ免疫優性ペプチドエピトープを有する５ｃＦｖの増幅およびクローニングの方法を図示する。種々の抗体断片を増幅するのに用いるＰＣＲプライマー−鋳型の組合せを示す。

図６は、適切なりローニング部位を有するＩＣ３／８６　５ｃＦｖ　（図３．４および５に記載）の構築および発現に使用するためのベクターｐＰＯＷ、ｐＨＦＡおよびｐ　ＨＦ　Ａ　ａＡｅを図示する。Ａｍｐ’：アンピシリン耐性遺伝子、Ｃｏ１Ｅ１またはＯｒｉ；大腸菌複製起点Ｍ１３０ＲＩ　；Ｍ１３ファージ複製起点、遺伝子３；遺伝子３フア一ジ表面タンパク質遺伝子、Ａｍｂｅｒ；アンバー終止コドン、（ＴＡＧ）　ｆＤ：転写ターミネータ−１ｐｌａｃＺ；　ＩａｃＺプロモーター、ｃ１８５７；ラムダ熱不安定リプレッサー遺伝子、Ｐ、およびＰｌ；ラムダファージ右および左プロモーター、ＦＬＡＧ：Ｍ２抗ｆｌａｇ１ｇＧによって認識されるエピトープの遺伝子、およびｐｅｌＢ；ペクチン酸リアーゼシグナル配列の遺伝子。

図７は、ＰＣＲ反応によって生成され、該反応中に連結されるかまたは組換えＤＮＡ法によって付加されるペプチドエピトープのタンパク質配列を図示する。

図８は、ＥＬＩ　ＳＡアッセイにおける組換えタンパク質の活性を図示する。

抗グリコホリンＡモノクローナル抗体ＩＣ３／８６をモデル抗体として選択した。ＩＣ３／８６　ＩｇＧをコードする遺伝子を大腸菌宿主中にクローニングし、該抗体のヌクレオチド配列を決定した。該抗体の可変ドメインを種々の発現ベクター中に一緒にクローニングして一本鎖Ｆｖドメイン（ｓｃＦｖ）を生成できるようにするため、合成オリゴヌクレオチドブライマーを設計した。５ｃＦｖ分子のＣ末端に種々のペプチドエピトープを付加した。

実施例１該抗体をコードする遺伝子の断片を同定し、これら断片にリンカ−およびペプチドエピトープを付加して一本鎖の抗体に基づ（試薬を形成するために複製連鎖反応を利用する方法を採用した。

（ａ）モノクローナル細胞株（Ｉ　Ｃ３／８６）からメツセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を調製した。該細胞株は、ＲＢＣに高親和性で結合するが自己凝集は起こさない抗赤血球ＴｇＧを産生じた。

このｍＲＮＡから、−末鎖および二本鎖相補的ＤＮＡ　（それぞれ、ＳＳ−およびｄｓ−ｃＤＮＡ）を合成した。ｄｓ−ｃＤＮＡをラムダ−ｇｔｌｏアーム中にクローニングし、ファージライブラリーとしてパッケージングした。Ｈ鎖りローンガンｖ−Ｍ／１．１　（タイラー（Ｔｙｌｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、１９ｇｔｌｏライブラリーのスクリーニングのためにｄｓ−ＤＮＡ挿入を探索した。

陽性クローンを増幅し、陽性の挿入ｃＤＮＡをｐＵｃ１８中にサブクローニングした。その結果、はぼ完全長のガンマクローン（ガンマ−１，１，１ａ）が同定され、そのヌクレオチド配列を決定し、これからタンパク質配列を導き出した（図１）。可変ドメインの３′末端および完全な定常ドメインをコードする部分的なカッパクローン（カッパー４ＡＣ１）の配列を同様にして決定した。

ＩＣ３／８６カツパＬｅａの５゛末端のヌクレオチド配列を決定するため、以下の方法を採用した。まず、完全ＩＣ３／８６　１ｇについて混合Ｎ末端配列（下記参照）をアブライドバイオンステムズシークエンサーで決定した。

混合配列Ｄ／Ｅ　Ｉ／Ｖ　Ｖ／ＲＭ／Ｌ　Ｓ／Ｌ　Ｑ／Ｅ　Ｓ／Ｓ　Ｐ／Ｇ　Ｓ／Ｇ（自動シークエンサー）上記混合アミノ酸配列および以下のガンマＨ鎖クローンから導いた配列：ガンマｌｌ　Ｅ　Ｖ　ＲＬ　Ｌ　Ｅ　Ｓ　Ｇ　Ｇ　（クローン１．１．１　ａ）から、カッパＬ鎮の可変ドメインのＮ末端（ｇｔｌｏライブラリークローン中には存在しない）を以下の通り決定した。

カッパ鎖　ＤＩＶＭＳＱＳＰＳ（差異から導いた）。

上記カッパ鎖のＮ末端の配列から、ＩｇＧ遺伝子中に認められる共通の慣用トリブレットコード（以下の表１中のオリゴヌクレオチドＮ９６０を参照）を適用することにより５’Ｌ鎖可変領域の近似物（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｉｏｎ）を編集した。ついで、このＬ鎖可変領域遺伝子を重複する（ｒｅｄｕｎｄａｎｔ）順（センス）プライマーＮ９６０および逆（アンチセンス）プライマーＮ８５２　（表１を参照）を用いてＰＣＲにより増幅させた（チアング（Ｃｈｉａｎｇ）ら、Ｂ　１ｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、　１９８９ユ３６０〜３６６に記載されているように、ヌクレオチド３３７から開始される力・ソバ定常領域に基づいていた（図２参照））。この増幅反応によって単一の生成物が得られ、このものは、クローニングおよび配列決定したときに、がソ／（Ｌ鎖と一致し重複カッパクローンに４ＡＣ１と３°末端が同一のコード配列を示した。

ＰＣＲおよびｇｔｌｏライブラリーに由来する配列によって、図２に示す配列の編集（ｃｏｍｐｉｌａｔｉｏｎ）が可能となった。

表１順（センス）オリゴヌクレオチド・Ｎ　９０７　ＣＧＧ　ＣＴＣＧＣＧ　ＣＡＧ　ＧＴＧ　ＡＧＧ　ＣＴＴ　Ｃ？’ ＣＮ　９６０　ＣＣＣＧＣＣＡＧＡ　ＣＧＴ／（：　ＧＡＴ／ＣＡＴＴ／ＣＧＴＧ／Ｃ入ＴＧＮ　９７８　ＣＣＣＡＣＧ　ＧＴＣＡＣＣＧ’ｌ”ＣＧＣＣＴＣＣＧＧＴ　ＣＧ’Ｊ’　ＣＧ’！’　（Ｊ’ｌ’’［入ＧＧ入ＣＡｈＣＣ入ＧＧＴＮ　９７９　ＴＣＡ　ＧＱＡ　ＧＱＡ　ＧＧＡ　ＧＧＴ　ＴＣＧ　ＧＧＴ　ＧＧＴ　ＧＧＴ　ＧＧＴ　ＴＣＧＮ１２３）　ｍ　ＡＡＡ　ＧＣＧ　ＧＣＣＣＡＧ　ＣＣＧ　ＧＣＣＡ’ｌ’Ｇ　ＧＣＣＧＡＧ　ＧＴＧＮ１４７９　ＴＣＴ　ＧＧＡ　ＧＧＴ　ＧＧＣＣＣＧ　ＧＴＡ　ＣＡＡ　ＣＣＴ　ＧＧＡ　ＧＧｋ　ＴＣＴＣ？Ｇ　ＡＡＡ　ＣＴＣＴＣＣ１ｒｉ６１７　人ＴＧ　ＧＣＧ　α＾ＧＧＴＧ　入ＧＧ　ＣＴＴ　ＣＴ’ｊ’　ＣＡＧ　ＴＣ’Ｔ　ＧＱ入ＧＧＴＨｕｆｉユ５’　ＣＡＴ　ＧＣＣＡＴＯＡＣＴ　ＣＧＣＧＧＣＣＣＡ　ＧＣＣＧＧＣＣＡＴ　ＧＧＣＣ（Ｃ７０）λＧＧ？　（Ｃ７０）（λ／Ｃ）λ　＋入／Ｇ）ＣＴ　ＧＣＡ　Ｇ（Ｃ／Ｇｌ入ＧＴＣ（入／ ’Ｉ’ｌＧＧ逆相補的オリゴヌクレオチドＭ　８５２　ＣＣＧＡＡ　’ＰｔＣＧＡＴ　ＧＧＡ　？ＡＣＡＧ’！”ｊ’ＧＧ　’ｆｆ１ｃ　入ＧＣλＩＣ入ＧＣ（ＩＣＧＮ　９０８　（ａＣＧＯｃＣＡＧ　ＣＡＴ　ＡＣＧ　ＧＣＣＧＧＣ（２０１ＱＡＣＧＧ’ｌ”　ｌａｃｗ　９０９　ＧＣＡ　ＧＣＣＣＣＡ　ＱＡＴ　ＧＣＣｃＡＧ　ＣＡＧ　ＣＴＧ　ＣＴＣＡＴＣ’ＷｘＣＡＧ　ＷＡ　ＡＣＧ　ＴＴＣ（Ｊ、ＣＧＧＣＣＡＧ　Ｇ入’！’　ＡＣＧＭ　９ｕ　ＧＡＣＧＧＣｃＡＧ　（ａ？　入ＣＧ　ＣＣａ　’ｒ’ｍ　ＡＡＴ　ＣＴＣｃａａ　ｃｍＮ　９７６　ＧＧＧ　ａＡＡ　？Ｅ’Ｃ？ｒＡ　ＡＧＡ　ＣＧＣλＴＴ　ＣＣＡ　ＣＧＧ　ＱＡＣＣａＣＣＧＴ　ＧＧＴ　ＧＣＡ　ＧＡＴｈｎ２９４　ＣａＣＧＧＣＣＡＧ　ＱＡ’！’　ＡＣＧ　ＴＴＴ　ＡＴＣＡＴＣＡ’Ｌ’ＣＡ［［１２９６ＱＡＣＣＧＣＣＧＴ　ＯＧＴ　ＧＣＡ　（２ＡＴ　ＣＡＧ　ＴＴＴ　ＧＣＣＡＧＡ　ＧＣＡＧＣＣＣＣＡ　ＣＡＴ　ＧＣＣＮ１６４５　ＡＡ入入入入ＣＣＧ　ＣＧＧ　ＧＡＡ　ＴＴＣ’！？Ａ　Ａ（ＪＬ　ＣＧＣＡ？！’　ＣＣｍ６４６　）ＪＡ　１１ｋ　ＣＣＧ　ＣＧＧ　ＣＡＡ　ＴＴＣ費Ａ　ＡＣＡ　ＣＡＣＣＴＧ　ＴＯ以下のＮＶＫＦＯＲＮＯＴ”等モル混合物α＾Ｇ　’Ｉ’ＣＡ　ＴＴＣＴＧＣＧＧＣＣＣＣＣＣＧ　？！’Ｔ　ＣＡＴ　ＴＴＣＣＡＧ　ＣＴＴ　ＧＧＴ　ＧＣＣＱＡ、Ｇ　’Ｉ’ＣＡ　？ｌ’ＣＴＧＣＧＧＣＩＪＣＣＣＧ　ＴＴＴ　Ｔ入Ｔ　？ＪＩＣＣＡＧ　ＣＴＴ　ＧＧＴ　ＣＣＣＱＡＧ　ＴＣＡ　ＴＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＧ　’！？Ｔ　τ入Ｔ　ＴＴＣＣＡＡ　ＣＴＴ　ＴＧＴ　ＣＣＣ（ａＧ　’！’ＣＡ　ＴＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＧ　’ｆｆＴ　（ＪＧ　ＣＴＣＣＡＧ　ＣＴＴ　ＧＧＴ　ＣＣＣプライマーは５゛→３゛である（左から右へ）。順（センス）オリゴヌクレオチドは発現されたタンパク質断片のアミノ酸配列を翻訳するが、一方、逆プライマーは逆転写しくｒｅｖｅｒｓｅｄ）　、相補する（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｅｄ）必要がある。

ａ、　ｂ　ｒＭａｋｉｎｇ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｉｎ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ａｎｄ　ｏｎ　ｐｈａｇｅＪ　、ＥＭＢＯＰｒａｃｔｉｃａ■ Ｃｏｕｒｓｅ　Ｍａｎｕａｌ、Ｉ　ＲＢＭ、ポメンア、イタリア（ｂ）・−重鎖抗体断片（ｓ　ｃ　Ｆ　ｖ）をＩ　Ｃ３／８６分子から以下のようにして構築した。

（ｉ）Ｈ鎖可変ドメインの増幅およびクローニング。

１　クローニングのための遺伝子の増幅および該遺伝子におけるＤＮＡ配列の合成を複製連鎖反応（ＰＣＲ）の適用により以下のようにし７て行った。典型的な反応液（１００］容）には、１〜１００ｇの鋳型ＤＮＡ、１〜２Ｕの熱安定ＤＮＡポリメラーゼ、５１の混合ＡＳＣ，ＧおよびＴデオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ溶液）（各塩基の濃度は２ｍＭ）、５］の各末端プライマー（各１０ピコモル）、および使用する場合には、１　ｌの内部プライマー（０，０５〜０１ピコモル）、最終濃度１〜５ｍＭのＭ　ｇ　”、選択した特定のポリメラーゼに適しこ反応緩衝液（製造業者により提供された）、および１００　ｌまでの水が含まれていた。これら反応物を混合し、パラフィン油（ングマ・／くイオケミカルズ）を重層し、熱サークラー（コーベット・リサーチ（Ｃｏｒｂｅｔｔ　Ｒ，ｅｓｅａｒｃｈ）、オーストラリア）中で２５〜３０サイクルに供した。図３．４および５における各実施例の一般的方法は、９３℃での変性工程（通常、１分間）、５０〜６５℃で１分間のアニーリング工程および７２℃で２分間の伸長工程からなっていた。

アニーリング温度は、最終生成物を得るために必要に応じて調節した。

２　オリゴヌクレオチドブライマー（表１）を合成して、Ｈ＃ｎｃＤＮＡクローンガンマ−１，１，１ａから可変ドメイン（■ゎ）を増幅させ、図３Ａに記載するように、５゛末端にＴｈａｉ制限部位（Ｎ９０７）および３′末端にＢｓｔＥ２−ベブチドエピトープーＥｃｏＲ１配列（Ｎ９０８／Ｎ９０９／Ｎ１２９６／Ｎ９７６）を付加した。生成物をＴｈａｉおよびＥｃｏＲｌで消化し、Ｍｓ　ｃ　１／Ｅ　ｃ　ｏ　Ｒ，１で消化した発現ベクターｐＰＯＷ（パワーら、Ｇｅｎｅ、、１９９２１１３　９５〜９９）（図６Ａ）中にクローニングし、大腸菌株ＴＧ−１中に形質転換した（ギプソン（Ｇｉｂｓｏｎ　Ｔ、　Ｊ、）　、１９８４、ｒ　Ｓ　ｔｕｄｉｅｓ　ｏｎ　ｔｈｅＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ　ｖｉｒｕｓ　ｇｅｎｏｍｅＪ　、博士論文、ケンブリッジユニバーシティ−、イングランド）。

３　形質転換した大腸菌をＶｈ遺伝子断片を有するプラスミドの存在についてスクリーニングし、選択したクローン（以下、ｐＰＯＷ１ｃ３Ｖｈ＋＋＋ｖ＋と称する）を配列決定してクローニング法の完全性をチェックした。これらクローンは、ＰＬ２５５１中でｐＰ１ｃ３Ｖｈとして同定される。

（ｉｉ）　Ｌ鎖可変ドメインの増幅およびクローニング並びに混成−重鎖抗体（ｓｃＦｖ）試薬の構築１、オリゴヌクレオチドブライマーを合成し゛Ｃ１同時に増幅しく上記ｉ　（１）と同様にして）、クローニングしたＬ鎖遺伝子にＰＣＲ増幅反応中に、図３Ｂに記載するように、５゛末端においてＢｓｔＥ２部位およびリンカ−をコードする配列（アミノ酸配列−（ＧＧＧＧＳ）ｓ　）を付加しくＮ９７８／Ｎ９７９）、３′末端においてペプチドエピトーブーＥｃｏＲ１配列を付加した（Ｎ９１１／Ｎ９０９／Ｎ１２９６／Ｎ９７６）。

２、図３Ｂに記載するＶＩ生成物をＢｓｔＥ２およびＥｃｏＲｌで消化し、ＢｓｔＥ２／ＥｃｏＲ１で消化したプラスミド構築物、上記ｐＰＯＷ１ｃ３ｓｃＶｈ　ＮＩＶＩ　（図３Ａ）中にクローニングした。

３、形質転換した大腸菌（ＴＧＩ）をＶｈおよびｖ１配列の存在についてスクリーニングし、選択したクローン（以下、ｐＰＯＷＩＣ３ｓＣＦＶ＋ｕｖ＋と称する（図３０））を部分的に配列決定してクローニング手順の完全性についてチェックした。これらクローンはＰＬ２５５１中でｐＰＩＣ３ｓｃＦｖとして同定される。

４、オリゴヌクレオチドＮ５ｆｉ１５およびＮＶＫＦＯＲＮＯＴ　（表１）を用い、ｐＰＯＷ１ｃ３ｓｃＦｖＨ＋ｖｌ中の５ｃＦｖ遺伝子構築物の各５′末端および３°末端に５ｆｉｌおよびＮｏｔｌ制限部位を付加した（ＰＣＲ増幅によって）（図４参照）−この増幅において、ｇｐ４１　ＨＩＶＩエピトープは除去された。

ＰＣＲ生成物をこれら制限酵素で消化し、同様に制限処理したベクターｐＨＦＡ　（図６Ｂ参照）（別のオクタペプチドＦＬＡＧタグ（ｔａｇ）を含む）中にクローニングした（図７Ａ）−ｐＨＦＡはベクターｐＨＥＮの親ベクターである（フーゲンブーム（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ）ら、１９９１）。ついで、この構築物を大腸菌株ＨＢ２１５１　（ヌクレオチド配列ＴＡＧ　（アンバー変異）が終止コドンとして認識される株）中に移した。ｐＨＦＡ１ｃ３ｓｃＦＶｐＬＡｃと称するクローンをハイブリダイゼーションによって同定し、配列決定し、Ｍ２−抗ＦＬＡＧ抗体（ＩＢＩ　Ｃｏｒｐ、、米国）との反応性によって認められるように５ｃＦｖ−ペプチド融合物の発現について試験した。

５、ＨＩＶｌおよびＨＩＶ２ｍビトーブ（図７Ｂおよび７Ｃ）を５ｃＦｖの後に付加してプラスミド構築物ｐＨＦＡｉａｅｌＣ３ＳＣＦＶｒＬＡｃ７ｈ＋ｖ１およびｐＨＦＡＩＡｃ　Ｉ　Ｃ３Ｓ　ＣＦ　Ｖ　ｖＬＡｃｙｓ＋ｖｚを得た（それぞれ、図５Ａおよび５Ｂ）、この手順において、ＦＬＡＧエピトープおよび別のＨＩＶエピトープをＰＣＲ増幅によって上記（ｉｉ）　４に記載したｐＨＦＡ中の５ｃＦｖ遺伝子に付加した。ｐＨＦＡ構築物中に導入したｖｈ遺伝子の配列変化を天然のものに戻し、該遺伝子の５°末端に隣接するＢａｍＨ１制限部位を類オリゴヌクレオチドＮ１４７９、Ｎ１６１７およびＮ１２３７を用いて除去した。ｐＨＦＡ中の５ｃＦｖ遺伝子構築が終わるＦＬＡＧ配列の３°末端に、オリゴヌクレオチドＮ１２９４、Ｎ９０９、Ｎ１２９６、Ｎ９７６およびＮ１６４５が、ＨＩＶｌｆｆ−ピトープ、ＥｃｏＲｌおよびＳａｃ２ｇ位を導入した。同様の仕方で、ＨＩＶ２エピトープおよび制限部位が３゛オリゴヌクレオチドＮ１２９７、Ｎ１３１１、Ｎ１３１０およびＮ１６４６（表１）を用いて付加された。５ｆｉｌおよび５ａｃ２で制限処理したＰＣＲ生成物を、同様に制限処理したベクターｐ　ＨＦ　ＡｓＡｃ　（図６Ｃ）（１）ＨＦＡの誘導体）中にクローニングした。この手順において、該ベクター中のＦＬＡＧ配列を欠失させ、該ＰＣＲ構築物のＦＬＡＧ配列と置換したが、この置換は５ｃＦｖとＨＩＶエピトープとの間で行ったーサプレッサーおよび非サプレッサー細胞株において翻訳がＨＩＶエピトープの後で終止するようにＴＡＡ終止コドンを含ませた。

（ｃ）組換え５ｃＦｖの発現組換え大腸菌を１０ｍ１の２Ｘ−ＹＴ培地（１１当たり１０ｇの酵母エキス、１５ｇのトリプトン、５ｇのＮａＣＩ）中、ｐＰＯＷ構築物の場合は３０℃にて、ｐＨＦＡ構築物の場合は３７℃にて一夜増殖させた。−夜の培養液を１００ｍ１の新たな培地（ｐＨＦＡ構築物の場合は０．１％グルコースを含めた）中に０．０５のＯＤ６゜。まで希釈し、中間一対数期まで増殖させた（ＯＤｓｏｏ　０．５〜０．９）。

イソプロピルー−Ｄ−チオガラクトピラノシド（［’ＴＧ；シグマ１５５０２）を１ｍＭの濃度に添加してｐＨＦＡプラスミドの培養を誘発し、必要により３０ ℃で増殖を続けた。

ｐＰＯＷの培養の誘発は、培地の温度を４２℃に１５分間上昇させることによって行い、その後インキュベーションを３７℃にて２〜４時間続けた。

各場合における大腸菌のペリプラズム腔および培養上澄み液中の組換えタンパク質レベルをＥＬＩ　ＳＡ、５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルのウェスタンプロット、および以下に記載する凝集アッセイによりアッセイした。

（ｉ）ウェスタン分析ペリプラズムタンパク質の単離を、上記大腸菌を２５％ｗ／ｖ　ンヨ糖／１０ｍＭ　ｈリス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）および１６ｍＭ　ＥＤＴＡ中に懸濁することによって行った。ついで、細胞を遠心分離により回収し、水冷水中に再懸濁した。

粒状物質および可溶性フラクションを５ＤＳ−ＰＡＧＥついでウェスタンプロットによって分析した。活性な発現は、みかけのＭ、３０Ｋｄの生成物の存在によって評価した。Ｃ末端ＦＬＡＧペプチド（ｓｃＦｖ構築物中に含まれる）に向けられたマウス抗体（Ｍ２抗ＦＬＡＧ抗体）またはＨＩＶエピトープ（ｓｃＦｖ構築物中に含まれる）に向けられたマウス抗体（ＩＢｌまたは２Ｂ４）をこの分析における主要な抗体として用い、ヤギ抗マウスＩｇＧに結合した西洋ワサビペルオキシダーゼで通常の仕方で検出した。

（ｉｉ）　ＥＬ　Ｉ　ＳＡアッセイ大腸菌培養液からの上澄み液および精製５ｃＦｖ試薬をＥＬＩＳＡによりアッセイした。このアッセイは以下のようにして行った。

１、「ヌクロン（Ｎｕｃｌｏｎ）　ＪプレートをＰＢＳ中のヒトグリコホリン− Ａ（シグマ）（１０ｇ／ｍｌを１００　１）で−夜コーティングした。

２、プレートウェルをＰＢＳで３回洗浄した。

３、ＰＢＳ中の２％　（Ｗ／Ｖ）脱脂乳（２００＋）’ｔ’２時間ブロックする。

４、ＰＢＳで３回洗浄。

５、ＰＢＳ中の１０％（Ｗ／Ｖ）脱脂乳（２０＋）およびＰＢＳ中の培養液または精製抗体（８０］）を加え、２０℃にて２０分間インキュベートする。

６、ＰＢＳｌｏ、０５％　（Ｖ／Ｖ））ウィーン−２０で３回洗浄スル。

７、ＰＢＳで３回洗浄する。

８、ＰＢＳ／２％（Ｗ／Ｖ）脱脂粉乳中の抗−タグ抗体（２ｇ／ｍ１を１００１）を加え、２０℃で６０分間インキュベートする。

９．６および７の工程を繰り返す。

１０、ＰＢＳ／２％　（Ｗ／Ｖ）　脱脂粉乳中のＨＲＰ−ヤギ抗マウスＩ　ｇＧ抗体（１〜２ｇ／ｍｌを１００　１）を加え、２０℃で６０分間インキュベートする。

１１、工程６および７と同様にして洗浄する。

１２、活性ＡＢＴＳ溶液（以下参照）（１００１）を加え、２０℃で３０分間発色させる。

１３　フッ化ナトリウム（３，２ｇ／Ｉを５０１）を加えて反応停止させ、４０５ｎｍにおいて読み取る。

ＡＢＴＳ　（２，２アジノジ（３−エチル）ベンズチアゾリン硫酸）溶液（２５ｎｇ、／ｍｌ）＋　０．２５ｇ　、ＡＢＴＳｌｏｍｌ　Ｈ，○ 暗いビン中に４℃で貯蔵し、使用に際してはクエン酸緩衝液中に１＝５０に希釈する。

クエン酸緩衝液０．１Ｍ　ｐＨ４：　２．５８ｇ　クエン酸２．１８ｇ　Ｎａ２ＨＰＯ４蒸留水で２００ｍ１とし、ｐＨを４に調節する。

活性化ＡＢＴＳ　：希釈ＡＢＴＳ溶液（１０ｍｌ）に３０％過酸化水素（１０１）を添加する。

（ｉｉｉ）凝集アッセイ培養単離物または上澄み液（ｓｃＦｖを含有する）（１０〜５００　１）のアリコートを全血（１０］）と混合した（１００　１を越える容量の場合は、混合物を１５分分間中かに混合し、感作した細胞を遠心分離により回収し、ＰＢＳ中に再懸濁した）。同時に、５ｃＦｖのＣ末端エピトープに向けられた第二の抗体（２５ｇ／ｍｌ　２０　］）を加え、混合物をプラスチック棒でしばらくの間撹拌した。組換え５ｃＦｖのレベルを、２分間にわたる凝集の速度および程度によって陰性および陽性コントロールに対して評価した。

ＨＩＶＩおよびＨＩＶ２ウィルスタイプからの表面タンパク質ｇｐ４１のエピトープを、ｇｐ１２０表面タンパク質またはｐ２４コアタンパク質からのエピトープと組み合わせることができ、または５ｃＦｖ構築物中のＭ２−ＦＬＡＧエピトープと置換し、またはｓｃＦｖ−Ｍ２　ＦＬＡＧ構築物に付加することができ、それによって、赤血球および患者血清中に存在するかもしれない血清抗体に結合することができる種々の２官能性試薬が製造される。Ｍ２−ＦＬＡＧ、ＨＩＶＩおよびＨＩＶ２エピトープの配列は、図７に示しである。

実施例１に記載する条件下で培養したとき、宿主細胞は５ｃＦｖ抗体タンパク質を発現し、発現されたタンパク質は宿主細胞膜を通ってペリプラズム腔中および培養上澄み液に運搬された。

実施例５組換え５ｃＦｖ抗体の活性および特異性組換えＩＣ３／８６　５ｃＦｖ−ＦＬＡＧは、架橋残基としてＭ２−ＦＬＡＧエピトープに対して向けられたモノクローナル抗体（Ｉ　Ｂ　Ｉ　Ｃｏｒｐ１米国）を用１’ｆ：、７−／　セイｌ：おいて、従来技術のＳ　ｉｍｐｌｉＲＥ　Ｄアッセイ（ＨＩＶ−１ｇｐ４１免疫優性エピトープとＩＣ３／８６　Ｆａｂとの合成によって製造された結合体を試薬として用い、抗体ＩＢ１／１１４が知られた陽性試料として用いられた）によって示された活性と比肩し得る活性でもって赤血球を有効に凝集させる。

ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２配列を有する構築物もまた、アッセイにおいてそれぞれのモノクローナル抗体ＩＢＩまたは２Ａ６および２Ｂ４（それぞれ、ＨＩＶｌおよびＨＩＶ２に対するもの）を用いた場合に凝集を媒介するのに有効であった。

５ｃＦｖ抗体は、ＥＬＩ　ＳＡアッセイによって判断されるようにＦａｂに匹敵する親和性でグリコホリンＡを認識する。これらの結果は図８に図示しである。

実施例７ｒｆｌａｇＪペプチドを有するＨＩＶ−１ペプチドに連結した抗ヒト赤血球−末鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖｆ　］ａｇＨＩＶ−１）を、２９のＨＩＶ−１の確認された血清陽性試料および２２の血清陰性試料を用いて試験した。これら試料はすべて凝集試験において正しく同定され、これら結果は、化学的に構築したＦａｂ− ペプチド結合体を用いて得られた結果と一致した。同様に、ｓｃＦｖｆｌａｇＨＩＶ−２についても、１８の確認された血清陽性試料；２２の血清陰性試料を用いて試験したところ、すべての試料が正しく検出され、この場合も化学的構築物を用いて得られた結果と一致していた。これら結果を表２にまとめて示す。

表２ＨＩＶ−１血清陽性　ＨＩＶ−１／２血清陰性ｓｃＦｖｆｌａｇＨＩＶ−１１００％（２９／２９）　１００％（２２／２２）化学的ＨＩＶ−１１００％（２９／２９）　１００％（２２／２２）ＨＩＶ−２血清陽性　ＨＩＶ−１／２血清陰性ｓｃＦｖｆｌａｇＨＩＶ−２１００％（１８／１８）　１００％（２２／２２）化学的ＨＩＶ−２１００％（１８／１８）　１００％（２２／２２）実施例８Ｂ型肝炎表面抗原結合性断片をＨＩＶ−結合性ペプチドの代わりに置換することができ、それによって異なる分析対象物、この場合はＢ型肝炎に結合する能力を有する２官能性試薬を製造でき、そうすることによって赤血球を凝集させることができる。

本明細書に引用する文献を以下の頁に掲げる。

本発明は、その一般的な観点において、上記で特別に詳細に記載した内容に限定されるものでないことは明らかに理解されるであろう。

文献１、ウィンター（Ｑ、　Ｗｉｎｔｅｒ）およびミルスティン（Ｃ，Ｍｉｌｓｔｅｒｉｎ）　、Ｎａｔｕｒｅ。

５、リーチマン（Ｌ、　Ｒ１ｅｃｔ＋ｍａｎｎ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、　１９８８　３３２　２３２６、ハストン（Ｊ　、　）（ｕｓｔｏｎ）ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ　Ｓ　Ａ、　１９８８１９、チューリップ（Ｂ、　Ｔｕｌｉｐ）ら、コールドスプリングハーバ−シンポジウム、１９９０２領マツ力フアーテイ（Ｊ、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、　１９９０　３４旦２１、フーゲンブーム（Ｈ，Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏ＋ｍ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、２２、ハドソン（Ｐ、Ｈｕｄｓｏｎ）　、Ｔｏｄａｙ’ｓ　Ｌｉｆｅ　５ｃｉｅｎｃｅ、　１９９０　２　（５）２３、パワー（Ｂ、　Ｐｏｗｅｒ）ら、Ｇｅｎｅ、１９９２　１１３　９５〜９９２４、タイラー（Ｔｙｌｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、１９８２７旦２００８〜２０１２２５、アダハス（Ａｄａｍｓ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　１９８０　１９２７１１〜２６、シアング（Ｃｈｉａｎｇ）ら、Ｂ　１ｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、　１９８９ヱ３６０〜３６６２７、パワーら、Ｇｅｎｅ、１９９２　１１３　９５〜９９２８、ギプソン（Ｇｉｂｓｏｎ　Ｔ、　Ｊ、）゛、１９８４、ｒ　５ｔｕｄｉｅｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ　ｖｉｒｕｓ　ｇｅｎｏｍｅＪ　、博士論文、ケンブリッジュニノく−シティ、イングランド２９、ｒＭａｋｉｎｇ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｉｎ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ａｎｄ　ｏｎ　ｐｈａｇｅＪ　、ＥＭＢＯプラクティカル・コース・マニュアル、ＩＲＢＭ、ボメジア、イタリア五胆１１ＬコΔユ五虹四■赳ム騙匡λ Ｅ匹匹玉 −」Ｖｂ　−■　酊査１わユ五１ＡＦｉｇ、５ａ −「Ｖｈ　Ｌｉ１１ｋＶｌ　ｎｘｈ　ｗｒｙ−ｚＦｉｇ、５ｂわユ匹１ｊＦｉｇ−６ａＦｉｇ、６ｂＦｉｇ、６ｃ旦認ユ１ＦＴＡＧＴｍ　１−ピトー７９Ｎｌ２−　Ｄ　Ｙ　Ｋ　Ｄ　Ｄ　Ｄ　Ｄ　Ｋ　−ＣＣ００ＨＦｉ、７ａｇｐ４１　（Ｈ工ｖ−１）Ｎ′ｈ２−　ＲＩ　Ｌ　Ａ　Ｖ　Ｅ　ＲＹ　Ｌ　Ｋ　Ｄ　Ｑ　Ｑ　Ｌ　Ｌ　Ｇ　Ｉ　Ｗ−Ｇ　（：、　Ｓ　Ｇ　Ｋ　Ｌ　Ｉ　ＣＴ　Ｔ　Ａ　Ｖ　Ｐ　Ｗ　Ｎ　Ａ　Ｓ　−ＣＣ００ＨＦｉ、７ｂｇｐ３５　（ＭｒＶ−２）Ｎｌ２−　ＲＶ　Ｔ　Ａ　Ｉ　Ｅ　Ｋ　Ｙ　Ｌ　Ｑ　Ｄ　Ｑ　Ａ　ＲＬ　Ｎ　Ｓ　Ｗ−Ｇ　ＣＡ　Ｆ　ＲＱ　Ｖ　Ｃ−ＣＣ００ＨＦｉ、７ｃわユ凹１１１−１国力Ｍ１ｍ疼−ロ昧市Ｎ。

国際調査報告　ＰＣｒｌＡＵ？３ｆ６０！２ｊ国際調査報告　ｆｃｒ７ＡＵ９３ＩＤｏツＦｏ＋ｗ１℃Ｔ、ＩＳＡ／２１０　Ｌｏｎｎｙｎｕａｍａ　ｏｆ　ｗｅｍｗｌ　ｉ式％Ｉｕｌｙ　１９９２１５ｏｐｂｋｅ国際調査報告　ＰＣＴＩ＾υ ９３１■ｍＦｏｒｎ＋　ＰＣｒｎＳＡ７）産声−１−ｙ　””囃にＪｕ１７１９９２１　ａｅｐｂｋｅフロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｎ　１／２１　８８２８−４ＢＣ１２Ｐ　２１１００　Ｃ９２８２−４８ＧＯＩＮ　３３１５３１　Ａ　７０５５−２Ｊ／／（Ｃ１２Ｐ　２１１００Ｃ１２Ｒ１：１９）（８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、　ＭＲ，ＮＥ、ＳＮ。

ＴＤ、ＴＧ）、ＡＴ、ＡＵ、ＢＢ、ＢＧ、ＢＲ，ＣＡ。

ＣＨ，ＣＺ、　ＤＥ、　ＤＫ、　ＥＳ、　ＦＩ、　ＧＢ、　ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ，ＫＺ、ＬＫ、ＬＵ、ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、ＮＬ、Ｎｏ、ＮＺ、ＰＬ、ＰＴ、ＲＯ，ＲＵ、ＳＤ。

ＳＥ、ＳＫ、ＵＡ、ＵＳ、ＶＮＦＩ（７２）発明者　ヒルヤード、カーメル・シュディスオーストラリア国４０６４、クイーンズランド、パブイントン、ガリバー・ストリート２１番

Claims

【特許請求の範囲】

１．粒子結合性抗体または抗体断片（ＰＢＭ）、および分析対象物結合性残基または分子（ＡＢＭ）からなる２官能性組換えタンパク質。
２．該粒子結合性抗体または抗体断片が赤血球結合性抗体または抗体断片（ＥＢＭ）である請求項１に記載の２官能性組換えタンパク質。
３．該ＡＢＭがＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２のｅｎｖタンパク質の免疫優性領域からの抗原性ペプチド、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２のｇａｇタンパク質、およびＢ型肝炎表面抗原の免疫優性領域よりなる群から選ばれたものである、請求項１または請求項２に記載の２官能性組換えタンパク質。
４．該ＡＢＭが、Ｂ型肝炎表面抗原、Ｄ−二量体およびイヌ糸状虫抗原よりなる群から選ばれた抗原に対して向けられた抗体の一本鎖Ｆｖ領域である、請求項１または請求項２に記載の２官能性組換えタンパク質。
５．該ＥＢＭが抗赤血球抗体の一本鎖Ｆｖ領域である上記いずれかの請求項に記載の２官能性組換えタンパク質。
６．該抗赤血球抗体が抗グリコホリン抗体である請求項５に記載の２官能性組換えタンパク質。
７．該ＥＢＭがハイブリドーマＧ２６．４．１Ｃ３／８６（ＡＴＣＣ番号ＨＢ９８９３）によって産生された抗グリコホリンＡ抗体の一本鎖Ｆｖドメインである請求項６に記載の２官能性組換えタンパク質。
８．単一の転写単位として、分析対象物結合性残基または分子（ＡＢＭ）に機能的に連結した粒子結合性抗体または抗体断片（ＰＢＭ）をコードするＤＮＡ配列。
９．請求項８に記載のＤＮＡ配列を含む発現ベクター。
１０．請求項８に記載のＤＮＡ配列を含む宿主細胞。
１１．大腸菌である請求項８に記載の宿主細胞。
１２．請求項８に記載のＤＮＡ配列を含む、複製および発現し得るＤＮＡ要素。
１３．プラスミドである請求項１２に記載のＤＮＡ要素。
１４．検出剤として請求項１から７のいずれかに記載の２官能性組換えタンパク質を含む、分析対象物の検出のための特異的結合アッセイ。
１５．イムノアッセイである請求項１４に記載の特異的結合アッセイ。
１６．凝集イムノアッセイである請求項１４に記載の特異的結合アッセイ。
１７．請求項１４から１６のいずれかに記載の特異的結合アッセイに使用すべく適合された試薬のキット。
１８．請求項８に記載のＤＮＡ配列を利用する工程を含む、請求項１から７のいずれかに記載の２官能性組換えタンパク質の調製法。
１９．（ａ）粒子に特異的な抗体の相補性決定部位をコードするＤＮＡ配列を調製し：（ｂ）分析対象物結合性タンパク質をコードするＤＮＡ配列を調製し；（ｃ）転写および翻訳調節遺伝子の制御下に工程（ａ）で得たＤＮＡ配列と工程（ｂ）で得たＤＮＡ配列を機能的に連結し；（ｄ）工程（ｃ）の生成物を宿主生物中に移し；（ｅ）該宿主生物に該ＤＮＡ配列を発現させ；ついで（ｆ）該タンパク質を回収することを特徴とする、請求項１に記載の２官能性組換えタンパク質の調製法。
２０．該粒子に特異的な抗体が抗赤血球抗体である請求項１９に記載の方法。
２１．該抗赤血球抗体が抗グリコホリン抗体である請求項２０に記載の方法。
２２．該分析対象物結合性タンパク質がＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２のｅｎｖタンパク質の免疫優性領域からの抗原性ペプチド、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２のｇａｇタンパク質、およびＢ型肝炎表面抗原の免疫優性領域よりなる群から選ばれたものである、請求項１９から２１のいずれかに記載の方法。
２３．該分析対象物結合性タンパク質が、Ｂ型肝炎表面抗原、Ｄ−二量体およびイヌ糸状虫抗原よりなる群から選ばれた抗原に対して特異的な抗体である、請求項１９から２１のいずれかに記載の方法。