JPH11266884A

JPH11266884A - 複合体特異的抗体、その製造方法及び使用

Info

Publication number: JPH11266884A
Application number: JP10376651A
Authority: JP
Inventors: Gregory P Dr Winter; ピー．ウィンターグレゴリー; Walter C Mahoney; シー．マハニーウォルター; Jaymie R Dr Sawyer; アール．ソウヤージェイミー
Original assignee: Boehringer Mannheim Corp
Current assignee: Roche Diagnostics Corp
Priority date: 1997-12-03
Filing date: 1998-12-03
Publication date: 1999-10-05
Also published as: EP0934953A2; CA2253633A1

Abstract

(57)【要約】【課題】従来の抗体の殆どは遊離のＰＳＡ及び複合化
したＰＳＡを区別するものではなく、ＰＳＡ−ＡＣＴ複
合体に特異的な抗体は得られていない。【解決手段】抗原複合体に対するモノクローナル抗体
を調製するためにナイーブな抗体ライブラリーを利用す
る方法を提供する。特に、ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体（抗キ
モトリプシンに複合化した前立腺特異抗原）に対し、そ
の複合体の遊離のサブユニットに対するのとは異なり、
特異性を示す抗体を製造する方法を提供する。これらの
方法により製造された抗体を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、抗原複合体に対し
て特異的な抗体を製造する方法に関する。本発明はま
た、前立腺特異抗原／抗キモトリプシン（ＰＳＡ−ＡＣ
Ｔ）複合体に特異的な抗体の製造方法、及びそのような
複合体特異的抗体の使用に関する。

【０００２】

【従来の技術】前立腺特異抗原（ＰＳＡ）は、主にヒト
前立腺中で発現されるカリクレイン様セリンプロテアー
ゼである。これはヒト精液中のゲル形成タンパク質のタ
ンパク質分解を担っている。前立腺癌は男性にとって肺
癌に次いで二番目に致死率の高い癌であるので、一定の
年代の男性についての早期発見のための何らかの種類の
スクリーニングが提案されなければならないと考えられ
る。スクリーニング試験としてＰＳＡを使用できること
は、ＹａｎｇＰｒｏｓＣｈｅｃｋポリクローナルアッ
セイ（Ｓｔａｍｅｙら、（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ７
４：１６６５）により測定して、癌血清の不存在下で
は、ＢＰＨ組織（前立腺の良性過形成）１グラムあたり
ＰＳＡが約０．３ｎｇ／ｍｌ上昇するが、前立腺癌は癌
１グラムあたり血清ＰＳＡを約３．５ｎｇ／ｍｌ上昇さ
せるという観察に基づいている。従って、感度の高い正
確なＰＳＡアッセイの開発は公衆に利益をもたらす。

【０００３】ＰＳＡの血清濃度の測定は、前立腺癌を有
する患者を監視するのに広く使用されているが、ＰＳＡ
血清濃度の上昇は良性の前立腺過形成（ＢＰＨ）におい
て、及び前立腺の手術による外傷の二次的症候にも報告
されている。血流中では、ＰＳＡのタンパク質分解活性
は、α−１−アンチキモトリプシン（ＡＣＴ）、タンパ
ク質−Ｃ阻害剤（ＰＣＩ）、α−２−マクログロブリン
（ＡＭＧ）、インター−α−トリプシンインヒビター阻
害剤等の数種類の細胞外血清プロテアーゼ阻害剤、及び
妊娠領域タンパク質（ＰＺＰ）と不可逆的な複合体が形
成されることにより阻害される（Ｚｈｏｕら、（１９９
３）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３９／１２：２４８３−２４
９１；ＣｈｒｉｓｔｅｎｓｓｏｎＡ．ら、（１９９
０）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９４：７５５−７
６３；Ｓｔｅｎｍａｎら、（１９９１）Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．５１：２２２−２２６）。血液中の主要なＰＳ
Ａ阻害剤は、血清中のＰＳＡの正常な濃度より過剰な濃
度で存在する肝臓由来のＡＣＴ及びＡＭＧである。

【０００４】血清中のＰＳＡの優勢な免疫検出形態はＡ
ＣＴと複合化しているが（Ｌｉｌｊａら、（１９９１）
Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３７：１６１８−１６２５；Ｓｔ
ｅｎｍａｎＵＨら、（１９９１）ＣａｎｃｅｒＲｅ
ｓ．５１：２２２−２２６）、大過剰の阻害剤の存在に
かかわらず、ＰＳＡは遊離の非複合化形態でも存在す
る。Ｓｔａｍｅｙら（（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ７
４：１６６５）によれば、前立腺癌患者の血清中で４種
の異なる商業的なアッセイ（下記に挙げる）により認識
される全てのＰＳＡの平均で８８〜９８％がＡＣＴに複
合化しているが、ＢＰＨにおいては、９０〜９５キロダ
ルトンの複合化形態は全ＰＳＡの約７３〜８４％を示
す。

【０００５】抗ＰＳＡ抗体が記載されている（例えば、
ＳｔｅｎｍａｎＵＨら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５
１：２２２−２２６（１９９１）；ＬｉｌｊａＨ．
ら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３７：１６１８−２５（１９
９１）；ＬｅｉｎｏｎｅｎＪ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅ
ｍ．３９：２０９８−２１０３（１９９３）；Ｃｈｒｉ
ｓｔｅｎｓｓｏｎＡ．Ｊ．Ｕｒｏｌ．１５０：１００
−５（１９９３）；Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎら、（１９９
５）Ｃｌｉｎ，Ｃｈｅｍ．４１／１０：１４８０−１４
８８を参照）。ＰＳＡは大きい分子ではないが（分子量
３４，０００ダルトン）、多数のエピトープが見られ
る。市販品として利用できる抗ＰＳＡ抗体の殆どのもの
は、遊離のＰＳＡ分子に対して製造されたものであっ
た。ＡＣＴに結合したとき、ＰＳＡ分子上の一定の部位
がブロックされ得るので、遊離のＰＳＡに特異的なアッ
セイを設定することを意図するのではない場合は、これ
らの部位に対して反応する抗体を選択しないことが重要
である。ＰＳＡの為の市販のアッセイとしては、Ｈｙｂ
ｒｉｔｅｃｈ（ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）からのＨｙ
ｂｒｉｔｅｃｈＴａｎｄｅｍ−Ｅ及びＴａｎｄｅｍ−
ＲＰＳＡアッセイキット、ＹａｎｇＰｒｏｓＣｈｅ
ｃｋ（ＹａｎｇＬａｂｓ，Ｂｅｌｌｅｖｕｅ，Ｗ
Ａ）、ＡｂｂｏｔｔＩＭｘ（Ａｂｂｏｔｔｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ，ＡｂｂｏｔｔＰａｒｋ，ＩＬ）及
びＣｉｂａ−Ｃｏｒｎｉｎｇ自動化化学ルミネセンスシ
ステムＰＳＡ（Ｃｉｂａ−Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｅａｓｔ
Ｗａｌｐｏｌｅ，ＭＡ）が挙げられる。現在使用されて
いる多くのＰＳＡキットの主要な問題の１つは、使用さ
れる抗ＰＳＡ抗体に関するものである。これらのキット
で使用される抗ＰＳＡ抗体は、ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体及
び遊離のＰＳＡの両者についてのアフィニティにおいて
互いに異なるだけではなく、それらの抗体はまたこれら
の２種の形態のＰＳＡと異なるアフィニティで反応し得
る。これらの種々の市販のアッセイはＰＳＡ測定におい
て不一致を示すことが報告されている（Ｚｈｏｕら、
（１９９３）；Ｓｔａｍｅｙら、（１９９４）Ｃａｎｃ
ｅｒ７４：１６６５）。例えば、Ｓｔａｍｅｙら、
（（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ７４：１６６２−１６６
６）によれば、Ｃｉｂａ−ＣｏｒｎｉｎｇＡＣＳアッ
セイは、遊離ＰＳＡについてＨｙｂｒｉｔｅｃｈアッセ
イよりも４倍高い値を示した。市販の試験システム間の
ＰＳＡ測定のこれらの不一致は、試薬抗体によるＰＳＡ
の多数の形態の認識が異なることによるとされた（Ｚｈ
ｏｕら、１９９３）。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】既存の市販のアッセイ
は一般に、遊離ＰＳＡ抗原に対する抗体を使用して遊離
のＰＳＡを捕獲し、その後ＡＣＴ特異抗体を添加して捕
獲されたＰＳＡのどれだけがＡＣＴに複合化しているか
を調べようとするものである。このアッセイフォーマッ
トは複合化していないＰＳＡを洗い流すことができな
い。現在のアッセイは、抗ＡＣＴ抗体の添加に先立ち、
中間の洗浄ステップを必要とする。これは、アッセイを
完了するのに必要な時間をさらに付加し、装置からのス
ループットを減少させる。中間の洗浄を実施することが
できない装置もあり、連続的なサンドイッチＥＬＩＳＡ
は容易には行えない。

【０００７】これまでに記載された抗体の殆どのものは
ＰＳＡ部分を認識して結合し、遊離のＰＳＡ及び複合化
したＰＳＡを区別しない。例えば、Ｗｕら（（１９９
５）ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＬａｂ
ｏｒａｔｏｒｙＡｎａｌｙｓｉｓ９：２５２−２６
０）は種々の市販のモノクローナル抗ＰＳＡ抗体を試験
し、それらが遊離のＰＳＡ及びＰＳＡ−ＡＣＴ複合体の
両者に結合することを見出した。これらの抗体は全ＰＳ
Ａのアッセイには役立ち得るが、ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体
のみの量を測定するためには適当でない。Ｌｉｌｊａら
は、米国特許第５，５０１，９８３号において、遊離Ｐ
ＳＡ及びＰＳＡ複合体を測定する非競合的なイムノアッ
セイを記載している。抗ＰＳＡモノクローナル抗体は、
Ｂａｌｂ／ｃマウスをＰＳＡで免疫化してハイブリドー
マを製造する従来法によって製造されたものである。エ
ピトープ特異性により特徴づけられる３種のモノクロー
ナル抗体のうち、１種のみが遊離ＰＳＡ及びＰＳＡ−Ａ
ＣＴの両者を認識した。以前に記載された抗ＰＳＡ複合
体抗体は複合体中のＡＣＴを認識するが、特にＰＳＡ／
ＡＣＴ複合体に特異的ではない。ＡＣＴはカテプシンＧ
（Ｈｅｉｄｔｍａｎｎ及びＨａｖｅｍａｎｎ（１９９
３）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３９：８６９−８７４）、キ
モトリプシン及びＤＮＡとも複合体を形成する。従っ
て、そのようなＰＳＡ−ＡＣＴ複合体非特異的抗体を使
用するＰＳＡアッセイにおいては、他の種類のＡＣＴ複
合体が血漿中に存在し得ることから、増加した吸光度の
読取りをＰＳＡ−ＡＣＴのみのせいにすることはできな
い。Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎらは、５種のＰＳＡ−ＡＣＴ
アッセイにおいて重大な困難が観察され、これらはいず
れも血清中のＰＳＡ−ＡＣＴの濃度をひどく過大評価
し、そしてＰＳＡ濃度が低い程、これに比例してそのよ
うな傾向を示すものであり、これはＡＣＴあるいはカテ
プシンＧ複合化ＡＣＴの固相に対する非特異的吸着によ
るものであったことを報告している（Ｐｅｔｔｅｒｓｓ
ｏｎら、（１９９５）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４１／１
０：１４８０−１４８８）。Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎは、
ＰＳＡ−ＡＣＴの測定における非特異的で可変的な干渉
は、特に臨床上重要な〈１０μｇ／ｍｌのＰＳＡ濃度で
ＢＰＨと前立腺癌との識別能を害することになるであろ
うことを認めている。遊離及び複合化した形態の両方に
反応するさらに別のＰＳＡ抗体は両形態と等モルでの結
合を示さず、すなわち抗体は、（Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ
ら、（１９９５）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４１／１０：１
４８６において抗体２Ｅ９により例示されるように）Ｐ
ＳＡの異なる形態について異なるアフィニティを有し従
って異なるＰＳＡの形態の正確な測定が得られない可能
性がある。大部分のＰＳＡがＡＣＴと複合化している血
清中でＰＳＡを測定する場合、ポリクローナル抗体を使
用するアッセイはシグナルを失うことが見出されている
（Ｓｔａｍｅｙ，Ｔ．ら（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ７
４：１６６２−１６６６参照）。

【０００８】ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体に特異的に指向する
抗体を生成するこれまでの試みを妨げていた別の因子
は、ＰＳＡ−ＡＣＴが抗原として使用されるアッセイ条
件である。今まで、ＰＳＡ／ＡＣＴ複合体に対する抗体
を生成する試みは、ｐＨ７．４のＰＢＳバッファー中で
室温での抗体スクリーニングアッセイの種々の段階にお
いてＰＳＡ／ＡＣＴ複合体を使用することに依存しよう
とするものであった。これらの条件は、ｉｎｖｉｔｒ
ｏでのＰＳＡ−ＡＣＴ複合体の安定性には好ましいもの
ではない（Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎら、（１９９５）Ｃｌ
ｉｎ．Ｃｈｅｍ４１／１０：１４８０−１４８８）。本
発明は、先行技術の限界を克服し、得るのが困難な複合
体特異的抗体を単離するための手段を提供するものであ
る。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明は、２以上のサブ
ユニットを含む抗原複合体に特異的な抗体を得るための
方法を提供する。抗原複合体が第一のサブユニットと第
二のサブユニットを含む１つの態様においては、前記方
法は以下ａ）〜ｆ）：ａ）組換複製ベクター粒子により提示された抗体のライ
ブラリーを作成し、ｂ）ライブラリーを複合体と接触させ、複合体に結合す
るベクター粒子を回収することにより、抗原複合体のみ
に特異的な抗体を提示するベクター粒子をライブラリー
から選択し、ｃ）ライブラリーを第一のサブユニットと接触させ、非
結合粒子を回収することにより、第一のサブユニットの
みに特異的な抗体を提示するベクター粒子をライブラリ
ーから除去し、ｄ）ライブラリーを第二のサブユニットと接触させ、非
結合粒子を回収することにより、第二のサブユニットの
みに特異的な抗体を提示するベクター粒子をライブラリ
ーから除去し、ｅ）段階ｂ）、ｃ）及びｄ）に従って処理した後に、ラ
イブラリー中に存在する粒子をクローンとして複製し、ｆ）複合体には結合するが、第一あるいは第二のサブユ
ニットのみには結合しない抗体を発現する、段階ｅ）の
後に得られた複製粒子のクローンを選択する、の段階を
含む。段階ｄ）の後に残ったライブラリーは、さらにベ
クター粒子を抗原複合体と接触させ、複合体と結合する
ベクター粒子を回収することにより、複合体のみに特異
的な抗体を提示するベクター粒子について濃縮すること
ができる。

【００１０】組換え複製ベクター粒子は、ライブラリー
発現及びポリペプチド提示に適した任意のベクター粒子
／生物とすることができる。ある態様においては、ベク
ター粒子は糸状ファージである。上記方法において使用
される抗体ライブラリーは、大きいＶ領域レパートリー
を有し、少なくとも１０^８個のメンバーにより提示され
るナイーブ抗体ライブラリーであることが好ましい。

【００１１】抗体は、インタクトな抗体あるいは任意の
形態の抗体断片としてライブラリーにより提示されるも
のとすることができる。１つの態様においては、ライブ
ラリーによって提示される抗体は、単鎖可変領域（ｓｃ
Ｆｖ）である。段階ｆ）における抗体に結合する複合体
を発現する複製粒子クローンの選択と単離の後に、選択
された粒子により提示される重鎖及び軽鎖可変領域はさ
らに、別のポリペプチド鎖上に発現させ、再度組み合わ
せてて複合体に結合する可変領域を形成することができ
る。抗原複合体は、ｉｎｖｉｔｒｏでの複合体の安定
性に好都合な条件下で製造し、ライブラリーと接触する
ことが好ましい。

【００１２】本発明の１つの具体的な形態は、前記の態
様に従って複合体に対する抗体を得る方法であって、第
一のサブユニットが前立腺特異抗原であり、第二のサブ
ユニットが抗キモトリプシンであり、すなわち複合体が
ＰＳＡ−ＡＣＴである前記方法である。この特定の方法
においては、抗体ライブラリーは、好ましくはナイーブ
なヒト抗体ライブラリーである。ＰＳＡ−ＡＣＴ抗原複
合体に対する抗体を単離するために、複合体は好ましく
は４℃及びｐＨ６．０で調製しライブラリーと接触さ
せる。

【００１３】また、前記方法によって調製された抗体も
本発明により提供される。１つの態様においては、抗原
複合体に特異的な抗体を発現し提示するために選択され
たベクター粒子から重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子を単離
し、抗体誘導体を組換えにより製造するのに使用する。
ベクター粒子から単離したＶＨ及びＶＬ遺伝子を発現す
る抗体誘導体は、Ｆａｂ断片、インタクトな抗体、融合
抗体及びキメラ抗体からなる群から選択された形態の抗
体とすることができる。

【００１４】前記の方法により製造される特定の複合体
特異的抗体は、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）と抗キモトリ
プシン（ＡＣＴ）間に形成された複合体に、ＰＳＡある
いはＡＣＴ単独に対するアフィニティの少くとも１０倍
高いアフィニティで結合する抗体である。好ましくは、
前記抗体はＰＳＡあるいはＡＣＴ単独に対するアフィニ
ティの少なくとも１０^３倍高いアフィニティでＰＳＡ−
ＡＣＴ複合体に結合する。他の好ましい態様において
は、ＰＳＡ−ＡＣＴに特異的な抗体は、他のセリンプロ
テアーゼ及びＡＣＴ、特にキモトリプシンとＡＣＴ間の
複合体に対するアフィニティよりも少なくとも１０倍高
いアフィニティで複合体に結合する。

【００１５】本発明は、ＰＳＡ−ＡＣＴに対するヒトｓ
ｃＦｖ抗体を提供する。別の態様においては、ＰＳＡ−
ＡＣＴ抗体の重鎖及び軽鎖可変領域が、別のポリペプチ
ド鎖上に存在する。本発明は、特に以下のＰＳＡ−ＡＣ
Ｔ抗体：ＩＴＡ２（配列番号２に示したアミノ酸配列に
より特定される）、ＩＴＡ３（配列番号５により特定さ
れる）、ＩＴＡ７（配列番号８により特定される）、Ｂ
ＩＯＡ８（配列番号１１により特定される）、及びＢＩ
ＯＣ７（配列番号１４により特定される）を提供する。
また、重鎖及び軽鎖可変領域あるいは相補性決定領域
（ＣＤＲ）が以下の抗体、ＩＴＡ２、ＩＴＡ３、ＩＴＡ
７、ＢＩＯＡ８あるいはＢＩＯＣ７の１つから誘導され
たＰＳＡ−ＡＣＴ抗体も本発明により提供される。

【００１６】本発明のさらに別の形態は、サンプル中の
ＰＳＡ及びＡＣＴ間の複合体の存在またはその量を測定
するために、ＰＳＡあるいはＡＣＴ単独に対するアフィ
ニティの少くとも１０倍高いアフィニティでＰＳＡ−Ａ
ＣＴ複合体に結合する上記の抗体を使用する方法であ
る。該方法は、ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体が前記抗体に結合
できる条件下で抗体とサンプルを含む反応混合物を調製
し、反応混合物中で抗体に結合したＰＳＡまたはＡＣＴ
の存在または量を測定することを含む。例えば血清サン
プルのような患者から得られたサンプル中のＰＳＡ及び
ＡＣＴ間の複合体の量を測定するこの方法は、患者にお
ける前立腺の良性及び悪性の状態を区別する方法に適用
することができ、その場合複合体の量は状態の非悪性度
に関連付けられる。別の態様においては、患者における
前立腺の良性及び悪性の状態を区別する方法が提供さ
れ、該方法においては患者から得たサンプル中の全ＰＳ
Ａ量を測定し、そのサンプル中のＰＳＡ及びＡＣＴ間の
複合体の量を前記態様に従って測定し、全ＰＳＡに対す
る複合体の比率を状態の非悪性度と関連付ける。

【００１７】

【発明の実施の形態】参考文献本発明の実施には、特に明記しない限り、当分野の通常
の技術の範囲内である分子生物学等の慣用の技術を使用
する。そのような技術は文献中に充分に説明されてい
る。例えば、分子クローニング：実験室マニュアル，
（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ
ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐ
ｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）；分子
生物学における現在のプロトコル（Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ
ら編、１９８７及び改定版）；必須分子生物学（Ｔ．Ｂ
ｒｏｗｎ編、ＩＲＬＰｒｅｓｓ１９９１）；遺伝子
発現技術（Ｇｏｅｄｄｅｌ編、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒ
ｅｓｓ１９９１）；真核生物遺伝子のクローニング及
び分析法（Ａ．Ｂｏｔｈｗｅｌｌら編、Ｂａｒｔｌｅｔ
ｔＰｕｂｌ．１９９０）；遺伝子伝達及び発現（Ｍ．
Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，ＳｔｏｃｋｔｏｎＰｒｅｓｓ１
９９０）；組換えＤＮＡ方法論ＩＩ（Ｒ．Ｗｕ編、Ａｃ
ａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ１９９５）；ＰＣＲ：実用
的なアプローチ（Ｍ．ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら、ＩＲＬ
ＰｒｅｓｓａｔＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔ
ｙＰｒｅｓｓ１９９１）；生化学者のための細胞培
養（Ｒ．Ａｄａｍｓ編、ＥｌｓｅｖｉｅｒＳｃｉｅｎ
ｃｅＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ１９９０）；哺乳動物細
胞のための遺伝子伝達ベクター（Ｊ．Ｍｉｌｌｅｒ＆
Ｍ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７）；哺乳動物細胞のバイ
オテクノロジー（Ｍ．Ｂｕｔｌｅｒ編、１９９１）；動
物細胞培養（Ｊ．Ｐｏｌｌａｒｄら編、ＨｕｍａｎａＰ
ｒｅｓｓ１９９０）；動物細胞培養（Ｒ．Ｆｒｅｓｈ
ｎｅｙ編、ＩＲＬＰｒｅｓｓ１９８７）；フローサイ
トメトリー及びソーティング（Ｍ．Ｍｅｌａｍｅｄら
編、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ１９９０）；シリーズ酵素
学における方法（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉ
ｎｃ．）；免疫細胞化学における技術，Ｂｕｌｌｏｃｋ
＆Ｐ．Ｐｅｔｒｕｓｚ編、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒ
ｅｓｓ１９８２，１９８３，１９８５，１９８９）；実
験免疫学のハンドブック，（Ｄ．Ｗｅｉｒ＆Ｃ．Ｂ
ｌａｃｋｗｅｌｌ編）；細胞及び分子免疫学（Ａ．Ａｂ
ｂａｓら、Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ．Ｃｏ．１９９
１，１９９４）；免疫学における現在のプロトコル
（Ｊ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、１９９１）；及びシリーズ
免疫学の年間総説；シリーズ免疫学の進歩；オリゴヌク
レオチド合成（Ｍ．Ｇａｉｔ編、１９８４）等を参照。

【００１８】本発明の方法において使用し得る、ヒト抗
体についてのファージ及びファージミド提示ライブラリ
ーの製造、合成抗体、コドン突然変異誘発、単鎖Ｆｖ設
計及び生産等について記載するその他の文献としては、
抗体エンジニアリング、第２版（Ｃ．Ｂｏｒｒｅｂａｅ
ｃｋ編、ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅ
ｓｓ，１９９５）：Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄら、（１９９
１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７；
Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ＡＤら、（１９９３）ＥＭＢＯ
Ｊ．１２：７２５；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ａ．Ｄ．ら、
（１９９４）ＥＭＢＯＪ．１３：３２４５−３４６０
等がある。種々のイムノアッセイフォーマットのプロト
コールを示した別の文献としては、イムノアッセイ
（Ｅ．Ｐ．Ｄｉａｍａｎｄｉｓ及びＴ．Ｋ．Ｃｈｒｉｓ
ｔｏｐｏｕｌｏｓ編、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉ
ｎｃ．，１９９６）がある。

【００１９】上記の項に引用した参考文献は、本発明の
実施において使用される技術をこれらの引用文献が教示
する範囲において、参考としてここに組み入れる。さら
に本出願において引用された特許、発行された出願及び
その他の刊行物等のその他の参考文献も参考としてここ
に組み入れる。

【００２０】定義本発明の「複合体」あるいは「抗原複合体」は、共有結
合によりあるいは非共有結合的に結合した少なくとも２
のサブユニットからなる。ＰＳＡ／ＡＣＴは、２つのサ
ブユニット、ＰＳＡ及びＡＣＴからなる例示的な複合体
として本明細書で記載するが、３以上のサブユニットを
含む複合体も本発明の方法に包含される。複合体及び複
合体を形成するサブユニットは、分子の大きさ、構造あ
るいは組成的特徴により制限されない。抗原複合体の
「サブユニット」は、タンパク質、ペプチド、脂質、
糖、共因子、ホルモン、毒素、医薬、あるいは植物もし
くは動物ソースからの任意の化合物とすることができ
る。サブユニットは、任意の形態で相互に作用するか結
合して複合体を形成できるものである。

【００２１】ｉｎｖｉｔｒｏでの精製抗原複合体の安
定性に影響を与える条件としては、温度、ｐＨ、バッフ
ァーの種類、塩条件、各サブユニットの濃度、共因子及
びプロテアーゼ阻害剤の存在等がある。本発明の複合体
特異的抗体を単離する方法においては、抗原複合体をｉ
ｎｖｉｔｒｏで使用する場合（例えば抗体ライブラリ
ー選択及びスクリーニングアッセイにおいて）は、アッ
セイの他の成分の安定性に悪影響を及ぼすことなく複合
体の安定性に適し、またはこれを最大にするような条件
下に置くことが好ましい。例えば、ＰＳＡ−ＡＣＴ複合
体に対する抗体を製造する特定の例においては、抗原複
合体のｉｎｖｉｔｒｏでの安定性に適し、しかもアッ
セイにおけるファージ粒子の安定性と機能に適合するｐ
Ｈと温度の条件に抗原複合体を維持する。抗原複合体
は、少なくとも選択とスクリーニングアッセイのそれぞ
れの間ｉｎｖｉｔｒｏで安定であることが好ましい。
複合体の安定性に好適な条件は抗原によって変化する
が、例えば種々のパラメーターを一つずつ、そして組合
せて体系的に変化させ、複合体の量を経時的に測定する
ことにより当業者により容易に決定することができる。

【００２２】本出願を通じて使用される用語「抗体」
は、インタクトな抗体分子のみならず、所望の結合特異
性を有する少なくとも１の可変領域あるいは部分を含む
任意の分子をも包含するものとして定義される。可変領
域は、典型的にはＶ_Ｈ−Ｖ_Ｌ対を含むが、その代わりに
抗体あるいはＴ細胞受容体からの可変鎖の他の組合せか
ら構成されるものでもよい。結合特異性が保持される限
り、可変領域断片、天然もしくは合成の変異体、融合分
子、キメラ、モザイク、及びヒト化変異体が包含され
る。可変領域は、限定するものではないが、インタクト
な抗体分子及び抗体断片（例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）
_２、Ｆｄ及びＦｖ及びその他の抗原結合断片）を含む任
意の適当な形態で提示される。特に好ましい構築物の例
として、単一のＶ_Ｈ−Ｖ_Ｌ対がフレキシブルなペプチド
リンカー配列により結合され、ポリペプチドが単一の可
変領域の三次元コンフォメーションに折り畳まれるよう
な形態で単一のポリペプチドを形成する単鎖可変領域ポ
リペプチド（ｓｃＦｖ）、及び二つのＶ_Ｈ−Ｖ_Ｌ部位を
有するポリペプチドダイマーであるジアボディが挙げら
れる。「ｓｃＦｖ」及び「ｓＦｖ」はいずれも単鎖可変
領域ポリペプチドをいい、本明細書では互換的に使用さ
れる。キメラ抗体は、ヒトＣ領域に結合した異なる種
（最も多くの場合超歯類）からの免疫グロブリンＶ領域
からなる。モザイク抗体は、ヒト化Ｖ領域（通常ヒト骨
格上にグラフトされた齧歯類ＣＤＲ）及びヒトＣ領域か
らなる。抗体融合分子は、典型的には抗体の標的抗原複
合体への結合を阻害しない部位で非抗体物質に融合した
抗体の前記の形態の任意のものを含む。非抗体物質は、
エピトープ標識（例えば、ｃ−ｍｙｃペプチド、インフ
ルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ））、結合対の
メンバー（例えばアビジン）、酵素（例えば西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラ
クトシダーゼ）、切断可能な配列（例えばホスファチジ
ルイノシトール−グリカンあるいはＰＩＧ配列）のよう
な標識、あるいはその他の任意の適した物質とすること
ができる。これらの種々の形態の抗体の構築について
は、例えば、抗体エンジニアリング、第２版（Ｃ．Ｂｏ
ｒｒｅｂａｅｃｋ編、ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉ
ｔｙＰｒｅｓｓ，１９９５）及びイムノアッセイ
（Ｅ．Ｐ．Ｄｉａｍａｎｄｉｓ及びＴ．Ｋ．Ｃｈｒｉｓ
ｔｏｐｏｕｌｏｓ編、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉ
ｎｃ．，１９９６）を参照。

【００２３】「ナイーブな」抗体ライブラリーは、単一
の免疫原に対する抗体が優勢でない哺乳動物から生成さ
れたライブラリーである。ナイーブな抗体ライブラリー
は、自己反応性Ｂ細胞クローンの欠失につながる、免疫
グロブリンレパートリーに対する選択圧力と体細胞突然
変異を排除あるいは最小限にするように調製される。抗
体ライブラリーは、抗原により特異的に免疫化あるいは
チャレンジされていない哺乳動物から製造された場合に
「ナイーブな」ライブラリーとみなされる。抗体ライブ
ラリーは十分に大きくて多様なＶ領域レパートリーを含
むことが好ましい。Ｖ領域レパートリーは、少なくとも
１０^７個の異なるメンバー、より好ましくは少なくとも
１０^８個、さらに好ましくは少なくとも１０^１０個のメ
ンバーを含む。

【００２４】本明細書で使用する「組換え複製粒子」
は、ファージ、細菌、酵母、昆虫細胞、あるいは哺乳動
物細胞とすることができる。好ましくは、組換え複製粒
子は、Ｍ１３あるいはｆｄファージのような糸状ファー
ジである。ベクターが糸状ファージである場合、抗体断
片は、ファージのマイナーコートタンパク質（遺伝子Ｉ
ＩＩタンパク質）あるいはメジャーコートタンパク質に
融合することができる。「ファージミド」は、ファージ
複製起点を有するプラスミドである。

【００２５】好ましい態様の詳細な説明本発明は、２以上のサブユニットからなる抗原複合体に
特異的な抗体を得る方法を提供する。該方法は、大きい
ナイーブ抗体ライブラリーのスクリーニング、また複合
体の安定性に適した条件下での種々のスクリーニング段
階における抗原複合体の使用による。大きいナイーブ抗
体レパートリーで開始することにより、動物の免疫化あ
るいは免疫化動物から得た抗体ライブラリーを使用する
通常の方法を使用すると得るのが困難な抗体が単離され
る確率がこの方法により高められる。特にこの方法によ
って、「自己抗原」及び小胞体内腔の抗原に対する抗体
を得ることに関連する問題が解決される。動物は通常自
己抗原に対する抗体を生成せず、その自己抗原を動物に
ワクチンとして接種してもクローン欠失及び自己免疫寛
容につながるアネルギーのために通常はその抗原に特異
的な抗体を生成しない。

【００２６】本発明の方法は、ＰＳＡ／ＡＣＴあるいは
トロンビン／抗トロンビンのような酵素／酵素阻害剤複
合体を含む任意の抗原複合体に特異的な抗体を生成する
のに使用することができる。ある態様においては、本発
明の方法は、サブユニットとして前立腺特異抗原（ＰＳ
Ａ）及び抗キモトリプシン（ＡＣＴ）からなる複合体に
特異的な抗体を生成するのに使用される。本明細書にお
いてはこの複合体をＰＳＡ−ＡＣＴまたはＰＳＡ／ＡＣ
Ｔと略記する。

【００２７】また、本明細書に開示する方法により調製
された抗原複合体に対する抗体が提供される。複合体特
異的抗体は、例えば、イムノアッセイ、診断、免疫療
法、アフィニティクロマトグラフィー、抗原複合体スク
リーニングあるいは検出、単離及び精製等において多く
の用途を有する。

【００２８】２つのサブユニットを含む例示的な抗原複
合体においては、前記方法は以下の、ａ）組換複製ベクター粒子により提示された抗体のライ
ブラリーを作成し、ｂ）ライブラリーを複合体と接触させ、複合体に結合す
るベクター粒子を回収することにより、抗原複合体のみ
に特異的な抗体を提示するベクター粒子をライブラリー
から選択し、ｃ）ライブラリーを第一のサブユニットと接触させ、非
結合粒子を回収することにより、第一のサブユニットの
みに特異的な抗体を提示するベクター粒子をライブラリ
ーから除去し、ｄ）ライブラリーを第二のサブユニットと接触させ、非
結合粒子を回収することにより、第二のサブユニットの
みに特異的な抗体を提示するベクター粒子をライブラリ
ーから除去し、ｅ）段階ｂ）、ｃ）及びｄ）に従って処理した後に、ラ
イブラリー中に存在する粒子をクローンとして複製し、ｆ）複合体には結合するが、第一あるいは第二のサブユ
ニットのみには結合しない抗体を発現する、段階ｅ）の
後に得られた複製粒子のクローンを選択する、段階を含
む。

【００２９】免疫化されていないドナーからの大きいヒ
ト抗体ライブラリー（ナイーブライブラリー）の構築に
ついては、本明細書の実施例１及びＧｒｉｆｆｉｔｈ
ｓ，Ａ．Ｄ．ら、（１９９４）ＥＭＢＯＪ，１３：３
２４５−３２６０，Ｖａｕｇｈａｎ，Ｔ．Ｊ．ら、（１
９９６）ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１
４（３）：３０９−３１４、及びＷＯ９３／１１２３６
（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら）を参照。これらはいずれも参
考としてここに組み入れる。ナイーブなライブラリーは
免疫化されていない哺乳動物から調製される。ヒト免疫
グロブリンのＶＨ及びＶＬ遺伝子の多様なライブラリー
は、免疫グロブリン遺伝子のポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ
ＣＲ）増幅を使用して非免疫化ドナーの末梢血リンパ球
（ＰＢＬ）から製造するのが最も便利である。好ましく
は、ライブラリーは少なくとも２の非免疫化個体、より
好ましくは少なくとも２０のドナー、さらに好ましくは
５０以上のドナーからの免疫グロブリン配列プールから
調製される。プールに寄与するドナーの数をより大きく
すると、Ｖ領域遺伝子の提示と抗原特異性がより大きく
なる。

【００３０】Ｈ鎖及びＬ鎖、またはＦａｂあるいはｓｃ
Ｆｖのような抗体断片の非常に多様な合成レパートリー
は、例えば細菌におけるレパートリーの組換えによるＶ
遺伝子セグメントのバンクから完全にｉｎｖｉｔｒｏ
で生成できる。ある態様においては、ライブラリーによ
り提示された抗体は単鎖可変領域断片すなわちｓｃＦｖ
である。ｓｃＦｖ断片をコードする遺伝子を生成するた
め、ＰＣＲ及び糸状ファージのような複製ベクター粒子
の表面上の提示についてクローン化した組合せライブラ
リーを使用して、ＶＨ及びＶＬ遺伝子をランダムに組み
合わせることができる。例えば生殖細胞系Ｖ領域のｉｎ
ｖｉｔｒｏでの再配列及びＶＨ及びＶＬのランダムな
組合せによって、作成された合成ライブラリーは抗原結
合レパートリーの多様性をさらに高める。ＣＤＲループ
のランダム配列も作成できる。合成抗体、ｓｃＦｖ、ヒ
ト化抗体の製造方法及びコドンに基づいた突然変異誘発
による抗体結合部位の操作方法は当分野において記載さ
れており、例えば抗体エンジニアリング，Ｂｏｒｒｅｂ
ａｅｃｋＣ．（編）１９９５，Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ
ら、１９９４、上出、Ｍａｒｋｓら、１９９１、上出を
参照。

【００３１】配列において非常に多様なＶ領域レパート
リーを有する「大きな」抗体ライブラリーを使用するこ
とが望ましい。ライブラリーは好ましくは少なくとも１
０^７個、より好ましくは少なくとも１０^８個、さらに好
ましくは１０^１０個以上の異なるメンバーを提示するも
のとする。

【００３２】抗体ライブラリーは、任意の種、但し好ま
しくは齧歯動物、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、
ウシ、ヒト等の哺乳動物からの免疫グロブリン遺伝子を
使用して構築することができる。複合体特異的抗体につ
いて、血清またはその他のヒトの体液のようなヒトサン
プルを含む診断的使用が予定される場合は、抗体は、ヒ
トサンプルの他の成分と望ましくない種間交差反応性を
最小限にするようにヒトあるいはヒト化抗体であること
が好ましい。そのような場合、ヒトまたはヒト化抗体ラ
イブラリーをスクリーニングすることが好ましい。同様
に、ヒト、ヒト化あるいはキメラヒト抗体ライブラリー
を使用して、ヒトにおける治療的用途が予定される複合
体抗体を単離することが好ましい。あるいは、スクリー
ニングの際に複合体特異的抗体をコードすることが判明
した非ヒト抗体ライブラリーからの免疫グロブリン遺伝
子をベクター粒子から単離し、ヒト化、キメラあるいは
モザイクである第二世代の誘導体を製造するのに使用す
ることができる。

【００３３】ＰＳＡ−ＡＣＴに対する抗体を単離するた
めに本明細書で使用するＧｒｉｆｆｉｎ．１ｓｃＦｖ
ファージミドライブラリーは、ランダムなＶＨ−ＶＬ２
量体の生殖細胞系重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子から作成
されるライブラリーであり、約１０^１３個の組合せのレ
パートリーを生成する。Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ａ．Ｄ．
ら、（１９９４）ＥＭＢＯＪ．１３：３２４５−３２
６０に記載されたライブラリーからのＶ領域をｓｃＦｖ
にサブクローン化し、組み込んでＧｒｉｆｆｉｎ．１
ｓｃＦｖライブラリーを作成した。

【００３４】抗体ライブラリースクリーニング及び選択
戦略複合体特異的抗体のスクリーニングと単離の一般的なス
キームを以下に記載する。実施例は、この方法をさらに
詳細に記載するものである。ここでは便宜的に、例とし
てファージ提示ライブラリーを使用する抗体ライブラリ
ーを記載する。しかし、抗体ライブラリーはファージ上
に提示されなければならないことはなく、その他の適当
なポリペプチド提示系を使用して提示できることは理解
されなければならない。

【００３５】ナイーブな抗体ライブラリーを、抗原複合
体に結合する抗体についてスクリーニングする。スクリ
ーニング戦略は、ａ）複合体特異的抗体について選択す
るための正の選択、及びｂ）複合体を構成する遊離のサ
ブユニットに対する抗体を除去するための負の選択すな
わち「減算」の両者の組合せを使用する。選択は最初に
正の選択を行い、その後負の選択を行うことが好まし
い。減算の回の後、再度正の選択を行うのが好ましい
が、任意である。選択の各種類を数回行うことが推奨さ
れ、好ましくは少なくとも２〜３回行う。選択の各回に
おいてパンニング（ｐａｎｎｉｎｇ）と増幅（増殖）を
行う。ファージライブラリーの場合は、抗原複合体に結
合する正に選択されたファージを溶出し、ファージを細
菌宿主においてクローンとして増幅する。選択と増殖を
繰り返すことにより、少数の抗原結合物が選択される。

【００３６】パンニング及び増幅段階は当分野で知られ
たものであり、下記の実施例中で例示する。選択は固
相、可溶相、あるいは両者の組合せにおいて行うことが
できる。選択工程を実施するのに適した固相マトリック
スとしては、試験管（例えば免疫チューブ）及びプラス
チックプレートが挙げられる。抗原複合体の製造は各抗
原の化学的、物理的、及び生物学的特性により異なる。
複合体は、一般的には、スクリーニング及びイムノアッ
セイの条件と適合する溶液中で、ｉｎｖｉｔｒｏでの
複合体の安定性に適した条件下で製造される。

【００３７】正に選択されたベクター粒子の単離と抗体
配列選択工程の最後に、抗原複合体に結合する抗体の発現に
ついて選択されたベクター粒子を、粒子を増殖させるこ
とにより複製する。その後所望の特異性を有する抗体を
コードする配列をベクター粒子から単離し、抗体あるい
は抗体断片の抗原結合能を保持する細菌、真核生物細胞
あるいはその他の適した発現系中に可溶性抗体として発
現させるためにサブクローン化する。例えば、ファージ
ミドクローンから単離された抗体配列を使用して細菌を
形質転換し、細菌ペリプラスム中で可溶性抗体を生成す
ることができる。可溶性抗体はその後、抗原複合体に対
する特異的結合について試験する。

【００３８】配列決定を行い、複合体特異的抗体、特に
Ｖ領域をコードする配列を分析することができる。選択
されたベクター粒子によって提示されるＶＨ及びＶＬを
別のポリペプチド鎖上に発現させ、再び組み合わせて複
合体に結合するＶ領域を形成することができる。単離さ
れた配列はさらに部位指向性突然変異誘発及び／または
その他の組換え技術により配列を修飾して、抗体の結合
アフィニティを改善し、突然変異（例えばアンバー変
異）を修正し、抗体の誘導体を生成して特定の用途のた
めの抗体を特別にあつらえることができる。例えば、Ｆ
ａｂ、Ｆｄ、ｓｃＦｖ抗体断片、インタクトな抗体、融
合、キメラ、モザイク、あるいはヒト化抗体を、選択さ
れたベクター粒子から単離された抗体配列からさらに生
成することができる。

【００３９】ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体特異的抗体の製造ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体に対する抗体を製造する本発明の
方法においてベクター提示技術を使用することにより、
動物免疫に伴う多くの問題が回避される。合成ヒト単鎖
Ｆｖ断片のライブラリー（Ｇｒｉｆｆｉｎ．１ｓｃＦ
ｖファージミドライブラリー）を、免疫チューブ上に被
覆した固相ＰＳＡ／ＡＣＴ複合体、さらにビオチン化Ｐ
ＳＡ／ＡＣＴ複合体（リシン残基あるいは炭水化物を介
してビオチン化した）及びストレプトアビジン被覆磁気
粒子を使用して選択した。各選択戦略は、ＰＳＡまたは
ＡＣＴのみに結合するファージの選択されたライブラリ
ーを枯渇させることを使用するものであった。さらに選
択は特に、ｉｎｖｉｔｒｏでのＰＳＡ／ＡＣＴ複合体
の安定性に適した４℃及びｐＨ６で実施した。スクリ
ーニングにおいてこれらの大きいナイーブな抗体ライブ
ラリーを使用すること及びｉｎｖｉｔｒｏで４℃及び
ｐＨ６においてＰＳＡ−ＡＣＴ複合体を使用すること
は、別の物質に複合化したＡＣＴと交差反応しないＰＳ
Ａ／ＡＣＴ抗体の本発明の単離を可能とするために大き
な役割を果たしたものと思われる。

【００４０】ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体は、３５℃未満、好
ましくは４℃で、そして６．０〜７．４のｐＨ、好まし
くは６．０のｐＨで好ましく製造され、貯蔵され、使用
される。また、１００〜１０００倍モル過剰の天然の
（ｎａｔｉｖｅ）ＡＣＴを添加することにより複合体の
安定性が高められ得るが、本発明方法において必要であ
るという訳ではない。本発明のＰＳＡ−ＡＣＴ複合体特
異的抗体を単離する方法においては、マイクロタイター
プレート及びチューブの被覆、インキュベーション、及
び洗浄段階を含む全てのスクリーニング段階を４℃及び
ｐＨ６で行った。本発明の方法において使用されるＰ
ＳＡ及びＡＣＴは、例えばＣｈｒｉｓｔｅｎｓｓｏｎ
Ａ．ら、（１９９０）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１
９４：７５５−７６３に記載されるように製造すること
ができる。

【００４１】本発明は、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）と抗
キモトリプシン（ＡＣＴ）間に形成された複合体に結合
する抗体であってＰＳＡ及びＡＣＴ単独に対しては結合
を全くあるいは有意には示さない抗体を提供する。好ま
しい態様においては、抗体はヒト抗体あるいはヒトＶ領
域配列を含むものである。

【００４２】好ましくは、前記抗体は、ＰＳＡまたはＡ
ＣＴ単独に対するアフィニティよりも少なくとも５倍、
好ましくは１０〜１０^２倍、さらに好ましくは少なくと
も１０^３倍高いアフィニティで複合体に結合するもので
ある。ある態様においては、抗体はＰＳＡまたはＡＣＴ
単独に対するアフィニティよりも少なくとも１０倍高い
アフィニティでＰＳＡ−ＡＣＴに結合する。別の態様に
おいては、抗体は別のセリンプロテアーゼとＡＣＴとの
複合体に対するアフィニティよりも少なくとも１０倍高
いアフィニティで前記複合体に結合する。特定の態様に
おいては、抗体はキモトリプシンとＡＣＴとの複合体
（ＣＴ−ＡＣＴ）に対するアフィニティよりも少なくと
も１０倍高いアフィニティでＰＳＡ−ＡＣＴに結合す
る。高アフィニティの、好ましくは１０ｎＭ未満の複
合体抗体が望ましい。

【００４３】以下のＰＳＡ−ＡＣＴに対する抗体、ＩＴ
Ａ２、ＩＴＡ３、ＩＴＡ７、ＢＩＯＡ８及びＢＩＯＣ７
は、前記方法を使用して選択されたファージ粒子から得
たものである。これらのｓｃＦｖ抗体のそれぞれのヌク
レオチド及びアミノ酸配列（ＶＨ−リンカー−ＶＬ）は
下記の配列表に、ＩＴＡ２（配列番号１〜３）、ＩＴＡ
３（配列番号４〜６）、ＩＴＡ７（配列番号７〜９）、
ＢＩＯＡ８（配列番号１０〜１２）、及びＢＩＯＣ７
（配列番号１３〜１５）として示す。各抗体についての
配列は、ＤＮＡヌクレオチド配列、アミノ酸配列及びＤ
ＮＡ相補鎖配列の順で示す。

【００４４】ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体に対する抗体の用途本発明の方法によって製造されたＰＳＡ／ＡＣＴ複合体
に対する抗体は、特に診断用途において、サンプル中の
ＰＳＡ／ＡＣＴ複合体の存在及び量を測定する用途を有
する。ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体特異的抗体が利用できるこ
とにより、対象の抗原のみを捕獲することができ、患者
サンプル中のＰＳＡ−ＡＣＴ複合体を測定するためのよ
り正確で、感度が高く、より迅速な診断アッセイの開発
が可能になる。

【００４５】診断を受ける個体は、ＰＳＡ／ＡＣＴのレ
ベルが正常、良性あるいは非疾患状態におけるものより
も上昇している疾患状態に罹患していることが疑われる
患者とすることができる。アメリカ癌協会及びアメリカ
泌尿器協会の両方が、５０才を越える全ての男性が、初
期の前立腺癌を検出するため、ＤＲＥ及び血清ＰＳＡ試
験からなる毎年の検査を受けることを推奨している。Ｐ
ＳＡの血清濃度を測定することは、前立腺腫瘍の早期検
出（スクリーニング）、及び前立腺癌を有する患者の管
理、例えば放射線療法及び化学療法の間に患者を監視し
て、前立腺切除術の成功を調べること、転移を発見する
ことに有用であり、手術後非常に早期に癌の再発を検出
することを可能とする。化学療法の後に前立腺癌からの
回復を監視するためには、治療の前及び治療中の様々な
時点及び治療後に血清ＰＳＡレベルを知ることが有用で
ある。前立腺癌に関する男性のスクリーニングについて
は、直腸指診と併せてＰＳＡレベルの毎年の測定を行う
ことにより前立腺癌の早期検出の割合を改善することが
好ましい。

【００４６】本発明のＰＳＡ−ＡＣＴ抗体を使用するＰ
ＳＡ診断アッセイは、０〜２０ｎｇ／ｍｌのレベル間の
ような低濃度範囲並びに４μｇ／ｍｌまで、さらにそれ
以上のＰＳＡ濃度でＰＳＡ−ＡＣＴを検出する感度を一
般に有する。

【００４７】このように本発明は、本発明の方法により
製造されたＰＳＡ−ＡＣＴ複合体特異的抗体を使用す
る、サンプル中のＰＳＡ及びＡＣＴ間の複合体の存在ま
たは量を測定するための方法を提供する。該方法は、前
記抗体及びサンプルを含む反応混合物をＰＳＡ−ＡＣＴ
複合体が抗体に結合することができる条件下で調製し、
反応混合物中の抗体に結合したＰＳＡまたはＡＣＴの存
在または量を測定することを含む。サンプルは、典型的
には、体液、可溶化組織サンプルのような液体サンプル
であるが、これに限定されるものではない。体液の例と
しては、血清、血漿、精漿、精液等が挙げられるが、こ
れらに限定されるものではない。

【００４８】ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体の測定を行うのに適
したイムノアッセイ（競合的なもの及び非競合的なも
の）の種々の形態が当業者によく知られており、例えば
Ｄｉａｍａｎｄｉｓら、（１９９６），Ｉｍｍｕｎｏａ
ｓｓａｙ、上出に記載されている。好ましいアッセイ
は、低いバックグラウンド、一貫した再現可能な結果を
与え、効率的で実施が容易なものである。好ましくはア
ッセイはサンドイッチ形式のＥＬＩＳＡアッセイで、自
動化あるいは半自動化できるものである。本発明の抗体
を使用するＰＳＡ−ＡＣＴ複合体のアッセイの好ましい
方法は、ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍＣ
ｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手できる、自動化されたＥ
ＬＥＣＳＹＳ（登録商標）イムノアッセイシステムを使
用するものである。Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）イムノ
アッセイシステムは電気化学発光（ＥＣＬ）検出に基づ
き、ルテニウム（ＩＩ）−トリス（ビピリジル）複合体
をＥＣＬ標識として使用するものである。簡単に説明す
ると、この系は以下の原理により働く。常磁性微粒子を
ストレプトアビジンで被覆する。ビオチン標識された抗
体とルテニウム標識された抗体（本発明のＰＳＡアッセ
イにおいては、これらの標識抗体は抗ＰＳＡ抗体であ
る）をサンプル被検体、例えばＰＳＡ−ＡＣＴとインキ
ュベートする。免疫複合体は、高いビオチン結合能を有
するストレプトアビジン被覆微粒子により捕獲される。
ＥＣＬ測定セルの内部で、結合した免疫複合体を有する
微粒子は電極上に均一に堆積し、非結合成分はインキュ
ベートの後に一回の洗浄段階により洗い流される。電極
に電圧を印加し、その間、ＥＣＬ標識は光として測定で
きる光子を放出し、これにより結合サンプル被検体を定
量する。ＥＣＬ反応が終了すると、磁気微粒子は電極表
面から放出され、洗い流される。電極表面を完全に清浄
にすればセルは次の測定に使用できる。イムノアッセイ
は自動化及びコンピューター化し、Ｅｌｅｃｓｙｓ１
０１０またはより大きい能力の２０１０システム機上で
行うことができる。この系は、殆どのＥｌｅｃｓｙｓ
（登録商標）イムノアッセイのインキュベーション時間
がわずかに９〜１８分であり、患者の診断について迅速
な結果を与える。このＥｌｅｃｓｙｓ（登録商標）シス
テムは現在、甲状腺機能亢進及び甲状腺機能低下のスク
リーニングにおける甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）の血
清濃度、ｈＣＧ不妊症アッセイ、及び急性心筋虚血症を
有する患者における危険を調べる際のトロポニンＴ及び
ＣＫ−ＭＢ（ＣＡＲＤＩＡＣＴ（登録商標）アッセイ）
の測定において臨床的に使用されている。

【００４９】ＰＳＡ−ＡＣＴ診断アッセイは、上記した
ようにＰＳＡ−ＡＣＴ抗体のビオチン標識及びルテニウ
ム標識されたものを使用した非競合的なサンドイッチア
ッセイとしてＥｌｅｃｓｙｓ（登録商標）システムにお
いて行うことができる。測定されたＥＣＬ光シグナルの
量は、結合した患者のＰＳＡ−ＡＣＴの量に直接関連付
けられる。あるいは、患者サンプルからのＰＳＡ−ＡＣ
Ｔを、固定された抗複合体抗体上の抗体結合部位につい
てＥＣＬ標識ＰＳＡ−ＡＣＴと競合させることにより、
アッセイを競合的なフォーマットで行うことができる。
競合的なフォーマットにおいては、測定されたＥＣＬシ
グナルはＰＳＡ−ＡＣＴの量と逆比例する関係にある。

【００５０】本発明のＰＳＡ−ＡＣＴ抗体は、ｐＨ
６．０及びｐＨ７．４でＰＳＡ−ＡＣＴに結合すること
ができる。複合体抗体は、必要に応じて各種の標識及び
酵素マーカーに結合させ、検出を容易にし、抗体が結合
した抗原を定量することが可能となる。抗体を種々の標
識に結合させる方法は当分野で知られている。

【００５１】前記の態様に従って患者から得られたサン
プル中のＰＳＡ及びＡＣＴ間の複合体の量を測定し、そ
の複合体の量を状態の非悪性度と関連付けることによっ
て、患者における前立腺の良性と悪性の状態を区別する
方法に本発明のＰＳＡ−ＡＣＴ抗体を使用できる。ある
いは、患者サンプル中の全ＰＳＡの量とＰＳＡ−ＡＣＴ
複合体の量を測定し、複合体の全ＰＳＡに対する比率を
決定する。全ＰＳＡ量を測定するためには、アッセイで
１種以上のＰＳＡ抗体を使用することができる。患者か
ら得るサンプルは、典型的には血清である。ＰＳＡ−Ａ
ＣＴ複合体に対して特異的な本発明の抗体及び遊離ＰＳ
Ａのみを検出する既存の抗体が利用できることにより、
遊離ＰＳＡ、ＡＣＴ複合ＰＳＡ及び全ＰＳＡのこれらの
値を容易に決定することができる。そしてこれらの値
を、参照範囲あるいはカリブレーター（ｃａｌｉｂｒａ
ｔｏｒ）と比較して悪性あるいは非悪性の診断を行い、
前立腺疾患の進行を調べることができる。

【００５２】ＰＳＡは、前立腺癌が存在しない場合、年
齢及び腺の大きさに従って増加する（Ｂａｂａｉａｎ
ＲＪら、（１９９２）Ｊ．Ｕｒｏｌ．１４７：８３７−
８４０）。従って、カリブレーターあるいはＰＳＡ−Ａ
ＣＴ参照範囲を確立して血清ＰＳＡ測定の疾患状態に対
するより正確な相関関係を与えることは有用である。Ｐ
ＳＡ−ＡＣＴと遊離のものについての年齢に特異的な参
照値により、前立腺癌の診断の感度と特異性が向上す
る。これらの参照値は、連続的なものであるか、年齢間
隔が非常に接近している場合、最も有用なものとなる。
年齢に特異的な参照範囲は、前立腺癌の臨床的証拠を示
さない４０〜８０才の年齢の群のランダムに選択された
健康な男性について確立されたものであることが好まし
い。また、ＰＳＡ−ＡＣＴ参照値は前立腺癌の大きさの
増加に基づいて設定してもよい。ＰＳＡの「正常な」レ
ベルは４．０ｎｇ／ｍｌとみなされるが、このレベルは
血清ＰＳＡレベルの年齢差を考慮していない。従って、
本発明の方法により測定されたＰＳＡ−ＡＣＴの量ある
いは複合体の全ＰＳＡに対する比率の値は、有意な解釈
をするために参照値と比較する。

【００５３】最後に、患者の血清サンプル中の少くとも
ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体を定量するために、本発明のＰＳ
Ａ−ＡＣＴ複合体抗体を、それのみ、あるいは遊離のＰ
ＳＡに対する１種以上の抗体と組み合わせて含む、前立
腺癌のための診断アッセイキットが提供される。

【００５４】

【実施例】［実施例１］実施例１は、ＰＳＡ−ＡＣＴ複
合体に特異的なｓｃＦｖ抗体のスクリーニング及び単離
について記載する。

【００５５】戦略：抗キモトリプシンに複合化した前立
腺特異抗原（ＰＳＡ−ＡＣＴ）の検出により前立腺癌診
断のための感度の高いフォーマットが提供され得る。前
記複合体は温度及びｐＨに対する感受性を有するので、
複合体特異的抗体の同定において動物の免疫化よりファ
ージ提示ライブラリーを使用することがより生産的であ
る。また、ファージ提示法により、複合体特異的プール
からのいずれかのサブユニットに結合する断片の減算が
可能となる。複合化ＰＳＡに対して特異的であることに
加えて、これらの抗体は、ＰＳＡに複合化し、キモトリ
プシンのような他のセリンプロテアーゼには複合化して
いない場合にのみＡＣＴを認識する必要がある。ここで
は２種の異なるスクリーニング方法を使用して抗ＰＳＡ
−ＡＣＴ結合ｓＦｖを単離した。

【００５６】材料：遊離のＰＳＡ及びＰＳＡ／ＡＣＴ複
合体は、ＳｃｒｉｐｐｓＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
（ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）から得た。遊離のＡＣＴ
は、ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＩｎｇｅｌｈｅｉｍＢｉ
ｏｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｈｅｉｄｌｅｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍ
ａｎｙ）及びＳｅｒｖａ（ＣｒｅｓｃｅｎｔＣｈｅｍ
ｉｃａｌＣｏ．，（販売者）Ｈａｕｐｐａｕｇｅ，Ｎ
Ｙ）から購入した。ファージ増幅及び増殖は、大腸菌サ
プレッサー株ＴＧ−１（Ｋ１２，Δ（ｌａｃ−ｐｒ
ｏ），ｓｕｐＥ，ｔｈｉ，ｈｓｄＤ５／Ｆ’ｔｒａＤ
３６，ｐｒｏＡ^＋Ｂ^＋，ｌａｃＩ^ｑ，ｌａｃＺＤ
ＭＩ５）（Ｇｉｂｓｏｎ，Ｔ．Ｊ．（１９８４）博士論
文、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣａｍｂｒｉｄｇ
ｅ，ＵＫ）で行った。ｓＦｖの生成は、ＴＧ−１及び非
サプレッサー株ＨＢ２１５１（Ｋ１２．ａｒａ，Δ（ｌ
ａｃ−ｐｒｏ），ｔｈｉ／Ｆ’ｐｒｏＡ^＋Ｂ^＋，ｌａ
ｃＩ^ｑ，ｌａｃＺΔＭ１５）（Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ
ら、（１９８５）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ
ｅａｒｃｈ．１３：４４３１−４４４３）において行っ
た。ファージレスキューは、ヘルパーファージＭ１３
ＫＯ７（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて行った。全ての
細胞増殖に２ＸＴＹ培地（１６ｇトリプトン、１０ｇ酵
母エキス及び５ｇＮａＣｌ／リットル）を使用した。
全ての結合反応は、本明細書でＡＢ−６と称する酢酸バ
ッファー（１０ｍＭＮａＯＡＣ，１５０ｍＭＮ
ａＣｌ，ｐＨ６．０）中で４℃で行った。選択のため
のインキュベートは特に記載しない限り上下ターンテー
ブル上で行った。

【００５７】１．１Ｇｒｉｆｆｎ．１抗体ライブラリ
ーの構築本明細書でＧｒｉｆｆｎ．１ｓｃＦｖファージミドラ
イブラリーと称する大きいナイーブなヒトファージ提示
ｓＦｖライブラリーを、ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体に特異的
に結合する抗体断片を単離するために使用した。どのよ
うな理論、モデルまたはメカニズムにも拘束されようと
するものではないが、可能性のあるエピトープはこの複
合体についてのみ存在する配座エピトープ（ｃｏｎｆｏ
ｒｍａｔｉｏｎａｌｅｐｉｔｏｐｅ）であろう。

【００５８】Ｇｒｉｆｆｎ．１ライブラリーは、ｌｏｘ
ライブラリーベクター（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ＡＤら、
（１９９４）Ｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆｈｉｇｈａ
ｆｆｉｎｉｔｙｈｕｍａｎａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ
ｄｉｒｅｃｔｌｙｆｒｏｍｌａｒｇｅｓｙｎｔｈｅ
ｔｉｃｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ，ＥＭＢＯＪ，１
３，３２４５−３２６０）からの重鎖及び軽鎖可変領域
をファージミドベクターｐＨＥＮ２中に再クローン化す
ることにより構築されたｓｃＦｖファージミドライブラ
リーである（ＭａｒｋｓＪＤら、（１９９１）Ｂｙｐ
ａｓｓｉｎｇｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ．Ｈｕｍａｎ
ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｆｒｏｍＶ−ｇｅｎｅｌｉ
ｂｒａｒｉｅｓｄｉｓｐｌａｙｅｄｏｎｐｈａｇ
ｅ，ＪＭｏｌＢｉｏｌ，２２２：５８１−９７）（図
５参照）。

【００５９】カッパ及びラムダ軽鎖可変領域は、プライ
マー：５’ＧＡＧＴＣＡＴＴＣＴＣＧＡＣＴＴＧＣＧＧ
ＣＣＧＣＡＣＧＴＴＴＧＡＴＴＴＣＣＡＳＣＴＴＧＧＴ
ＣＣＣ（配列番号１６）または５’ＧＡＧＴＣＡＴＴＣ
ＴＣＧＡＣＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＣＴＡＧＧＡＣＧ
ＧＴＣＡＧＣＴＴＧＧＴＣＣＣ（配列番号１７）及びＦ
ｄＰＣＲｂａｃｋ：５’ＧＣＧＡＴＧＧＴＴＧＴＴＧＴ
ＣＡＴＴＧＴＣＧＧＣ（配列番号１８）を使用してｆｄ
ＤＯＧ−２ｌｏｘＶｋ及びＶＬファージ構築物からＰＣ
Ｒ増幅した。

【００６０】ＰＣＲ断片を精製し、ＡｐａＬ１及びＮｏ
ｔ１で消化した。その後ゲル精製した断片をベクターｐ
ＨＥＮ２にいくつかのアリコートで連結させた。そして
ＤＮＡを連結混合物から精製し、水に再懸濁し、大腸菌
ＴＧ１にエレクトロポレーションにより導入した。それ
ぞれ３．５ｘ１０^７及び１．６７ｘ１０^７のＶｋ−ｐＨ
ＥＮ２またはＶＬ−ｐＨＥＮ２ライブラリーのプールを
得た。

【００６１】重鎖可変領域は、プライマー：ＬＭＢ３
（５’ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡ
Ｃ）（配列番号１９）及びＣＨ１．ＬＩＢＳＥＱ（５’
ＧＧＴＧＣＴＣＴＴＧＧＡＧＧＡＧＧＧＴＧＣ）（配列
番号２０）を使用してｐＵＣ１９−２ｌｏｘＶＨベクタ
ーからＰＣＲ増幅した。

【００６２】ＰＣＲ断片を精製し、Ｓｆｉ１またはＮｃ
ｏ１及びＸｈｏ１で消化した。その後ゲル精製した断片
をベクターＶｋ−ｐＨＥＮ２またはＶＬ−ｐＨＥＮ２に
連結させた。ＤＮＡを連結混合物から精製し、水に再懸
濁し、これを用いて大腸菌ＴＧ１への数百回のエレクト
ロポレーションを行って、２ｘ１０^９の全ライブラリー
サイズを得た。

【００６３】ｓｃＦｖ断片は、タグとしてＣ末端に融合
した小ｃ−ｍｙｃペプチドを含み（図５参照）、西洋ワ
サビ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合させた抗−ｃ
−ｍｙｃモノクローナル抗体を使用した可溶性ｓｃＦｖ
断片の検出を容易なものとしている。

【００６４】１．２選択戦略１．２Ａ免疫チューブでの固相選択免疫チューブのパンニング（ｐａｎｎｎｉｎｇ）、ファ
ージ提示選択の標準的方法はＭａｒｋｓら（１９９１）
に記載されたようにして行ったが、但し、インキュベー
トは４℃で行い、ＰＢＳの代わりに酢酸バッファーＡＢ
−６（１０ｍＭＮａＯＡＣ，１５０ｍＭＮａＣ
ｌ，ｐＨ６．０）を使用した。Ｇｒｉｆｆｉｎ．１ラ
イブラリーからの１ｘ１０^１３のファージから開始し、
２５μｇ／ｍｌＰＳＡ／ＡＣＴ（ＡＢ−６中）で一晩
被覆したＮｕｎｃＭａｘｙｓｏｒｂＩｍｍｕｎｏ試
験管（Ｆｉｓｈｅｒ）上で二回のパンニングを行い、そ
の後２％粉乳／ＡＢ−６（ＭＰ／ＡＢ−６）で少くとも
１時間ブロックした。選択されたファージをＴＧ−１に
おいて増幅し、ヘルパーファージＭ１３ＫＯ７（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ）でレスキューし、ファージ粒子をＰＥ
Ｇ−沈降により精製した（下記のファージ調製の項を参
照）。

【００６５】複合体特異的エピトープではなくＰＳＡま
たはＡＣＴに結合したファージを除去するため、選択に
先立ち、「ファージ減算」を含めてさらに２回のパンニ
ングを行った。２つの免疫チューブを５０μｇ／ｍｌの
ＡＣＴ（ＰＳＡ／ＡＣＴを含まない）で一晩被覆し、２
つを２５μｇ／ｍｌの遊離ＰＳＡで、１つを２５μｇ／
ｍｌのＰＳＡ／ＡＣＴで被覆した。２回目の選択で得た
ファージ（１ｘ１０^１３）を最初のＡＣＴ被覆免疫チュ
ーブに加え、３０分間ローターで回転させ、その後２番
目のＡＣＴ−被覆チューブに移してさらに３０分間ロー
ターで回転させ、その後３０分間静置した。溶液中に残
るファージをＰＳＡ−被覆チューブに移し、３０分間ロ
ーターで回転させ、２番目のＡＣＴ−被覆チューブに６
０分間入れた（３０分間ローターで回転、３０分間静
置）。最後に、ファージをＰＳＡ／ＡＣＴ被覆チューブ
に添加し、６０分インキュベートした（３０分間ロータ
ーで回転、３０分間静置）。その後、ＰＳＡ／ＡＣＴチ
ューブを前と同様に洗浄し、ファージをＴＥＡ（１００
ｍＭのトリエチルアミン）で溶出し、中和し、ＴＧ１で
増幅した。

【００６６】（後にＰＳＡがプラスチックによく付着し
なかったことが判った場合は、この材料について、次項
に記載するように５０ｎＭのビオチン化ＰＳＡ及び５
００μｌのストレプトアビジンビーズを使用して２回の
可溶性減算を行い、続いて再度、ＰＳＡ／ＡＣＴ被覆さ
れた免疫チューブで正の選択を全部で６回行った。）

【００６７】１．２Ｂ．ビオチン化材料での選択プラスチックへの付着が、存在し得る複合体特異的エピ
トープを不明確にしてしまうのに十分な程度にＰＳＡ／
ＡＣＴを改変してしまう可能性があるので、可溶性相に
おける選択を含ませることとし、この選択においてはフ
ァージライブラリーをビオチン化−ＰＳＡ／ＡＣＴ（Ｂ
ｉｏ−ＰＳＡ／ＡＣＴ）とインキュベートし、結合物質
を磁気ストレプトアビジン被覆粒子上に回収した（Ｈａ
ｗｋｉｎｓ，Ｒ．Ｅ．ら、（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂ
ｉｏｌ．２２６：８８９−８９６）。２種のＰＳＡ／Ａ
ＣＴビオチン化を行ったが、一つは１：３の使用（ｃｈ
ａｌｌｅｎｇｅ）割合でＮＨ_２−基を介するものであり
（ＰＳＡ−ＡＣＴ−ＢＩ（ＸＯＳｕ））、他方は１：２
５０の使用割合で炭水化物基を介するものであり（ＰＳ
Ａ−ＡＣＴ（ｏｘ）−Ｂｉ（ＨＺ））、これらは選択に
おいてそれぞれ５０ｎＭのプールとして使用した。プー
ルしたビオチン化物質により３回の可溶性相選択を行っ
た。

【００６８】最初の回では、ライブラリー（１ｘ１０
^１３ファージ）を５ｍｌのＭＰ／ＡＢ−６中の１００
ｎＭＢｉｏ−ＰＳＡ／ＡＣＴと共に４℃で回転させな
がら１時間インキュベートした。Ｂｉｏ−ＰＳＡ／ＡＣ
Ｔに結合したファージを、予め２％ＭＰ／ＡＢ−６で
ブロックしておいた１．５ｍｌのストレプトアビジン磁
気ダイナビーズＭ−２８０（Ｄｙｎａｌ，ＯｓｌｏＮ
ｏｒｗａｙ）上に１５分間集めた。ビーズをＡＢ−６で
１５回洗浄し、３回毎に洗浄液に２％粉乳を含めた。ビ
ースからファージを１ｍｌの１００ｍＭＴＥＡで溶出
し（室温で１０分間回転）、０．５ｍｌのトリス−ＨＣ
ｌ（ｐＨ７．４）で中和した。ビーズはまた０．５ｍｌ
のトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）でも中和し、０．７５
ｍｌの溶出されたファージとともに９ｍｌのＴＧ−１細
菌を感染させるのに使用した。２回目の選択物は３００
μｌのアビジン磁気ビーズ（ＣＰＧ，Ｌｉｎｃｏｌｎ
Ｐａｒｋ，Ｎ．Ｊ．）上に回収し、選択にストレプトア
ビジン結合物が持ち込まれることを回避した。３回目は
３００μｌのストレプトアビジン磁気ビーズ上に回収し
た。

【００６９】いずれかのサブユニットに結合したファー
ジ提示ｓＦｖの減算を可能とするために、遊離のＰＳＡ
及び遊離のＡＣＴを、やはり炭水化物及びＮＨ_２基の両
方でそれぞれビオチン化し（ＰＳＡ−Ｂｉ（ＸＯＳ
ｕ）、ＰＳＡ−Ｂｉ（ＨＺ）、ＡＣＴ−ＢＩ（ＸＯＳ
ｕ）及びＡＣＴ−ＢＩ（ＨＺ））、それぞれ５０ｎＭの
反応混合物として使用した。その後の選択の減算の回に
おいては、ファージを最初に５ｍｌのＭＰ／ＡＢ−６中
の１００ｎＭｂｉｏ−ＰＳＡと４℃で１時間インキュ
ベートし、結合ファージを２ｘ０．５ｍｌストレプトア
ビジン磁気ビース上に回収し（１５分間）、捨てた。そ
の後残ったファージに１００ｎＭｂｉｏ−ＡＣＴを加
え、４℃で１時間インキュベートした。結合したファー
ジを２ｘ０．５ｍｌストレプトアビジン磁気ビースで再
度除去し、捨てた。残ったファージをｂｉｏ−ＡＣＴ／
ＰＳＡに結合させ（１００ｎＭ、１時間、４℃）、スト
レプトアビジンビース上に集め、溶出し、増幅した。Ｐ
ＳＡとＡＣＴの順序は減算の二回目の回においては交代
させた。

【００７０】１．３選択されたレパートリーのスクリ
ーニング選択の各回の後、ＰＢＳの代わりにＡＢ−６バッファー
を使用したことを除いてＧｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ａ．Ｄ．
ら、（１９９４）ＥＭＢＯＪ．１３：３２４５−３２
６０に記載されたようにして、ライブラリーからのファ
ージ混合物をポリクローナルファージＥＬＩＳＡによっ
てスクリーニングした。Ｆａｌｃｏｎ９３１２の９６−
ウェルＦｌｅｘマイクロアッセイプレートをＡＢ−６中
の１０μｇ／ｍｌのＰＳＡ／ＡＣＴ、遊離ＰＳＡまたは
遊離ＡＣＴで一晩被覆した。結合ファージをＨＲＰ／抗
−ｍ１３結合体（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）で検出した。

【００７１】選択の種々の回の後のファージ提示抗体の
多様性を、コロニーＰＣＲ（Ｇｕｓｓｏｗ，Ｄ．＆Ｃ
ｌａｃｋｓｏｎ．（１９８９）Ｔ．ＮｕｃｌｅｉｃＡ
ｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ．１７：４０００）、その
後のＢＳＴＮＩ消化及びゲル上での分析によって判定
した。

【００７２】１．４クローンのスクリーニング及び配
列決定。選択されたレパートリーからの単一のアンピシリン（ａ
ｍｐ）耐性コロニーを、ＰＳＡ／ＡＣＴ結合ファージ
（Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．ら、（１９９１）Ｎａｔｕｒ
ｅ３５２：６２４−６２８；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，
Ａ．Ｄ．ら、（１９９４）ＥＭＢＯＪ．１３：３２４
５−３２６０）または可溶性ｓＦｖ（Ｍａｒｋｓ，Ｊ．
Ｄ．ら、（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：
５８１−５９７）の産生についてスクリーニングした。
Ｉｍｍｕｌｏｎ４Ｐｌａｔｅｓ（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）
を５〜１０μｇ／ｍｌの抗原で被覆した。ファージ結合
をポリクローナルファージでの場合と同様に検出した。
ｓＦｖの結合は、Ｃ−末端Ｍｙｃペプチドタグ（Ｍｕｎ
ｒｏＳ．及びＰｅｌｈａｍ，Ｈ．Ｒ．Ｂ．，（１９８
６）Ｃｅｌｌ．４６：２９１−３００）を認識するＨＲ
Ｐ−結合マウスｍＡＢ９Ｅ１０（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ）により検出した。ＰＳＡ結合をア
ッセイするために、Ｃｏｓｔａｒ３５９０の高結合マ
イクロタイタープレートを２〜５μｇ／ｍｌの抗原で被
覆した。ＰＳＡ／ＡＣＴ、ＡＣＴ及びＰＳＡに結合する
ファージＥＬＩＳＡ結合についてクローンを比較した。

【００７３】抗原の奇形の可能性を説明するため、免疫
プレートをＰＳＡ／ＡＣＴで被覆することに加えて、ｒ
ｅａｃｔｉ−結合ストレプトアビジン被覆ポリスチレン
マイクロタイタープレート（Ｐｉｅｒｃｅ）及びｂｉｏ
−ＰＳＡ／ＡＣＴまたはｂｉｏ−Ｆａｂの反応混合物を
使用してＥＬＩＳＡをファージ及び可溶性ｓＦｖの両方
について行い、複合体を捕獲した。プレートを合計で１
０μｇ／ｍｌ（各誘導体の５μｇ／ｍｌ）のＢｉｏ−Ｐ
ＳＡ／ＡＣＴまたはｂｉｏ−ＡＣＴまたはＢｉｏ−ＰＳ
Ａのいずれかで一晩被覆した。プレートは５μｇ／ｍｌ
のｂｉｏ−Ｆａｂの混合物でも被覆した。その後、非修
飾ＰＳＡ／ＡＣＴを１μｇ／ｍｌで加え、インキュベー
トを少くとも９０分間継続した。ファージまたは可溶性
ｓＦｖは先に記載したように検出した。

【００７４】クローンはＰＣＲ（Ｇｕｓｓｏｗ，Ｄ．及
びＣｌａｃｋｓｏｎ．（１９８９）Ｔ．Ｎｕｃｌｅｉｃ
ＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ．１７：４０００）に
よりスクリーニングし、制限酵素ＢＳＴＮ１（制限消化
パターンが分析されている）によりフィンガープリント
して種々のクローンを同定した（Ｃｌａｃｋｓｏｎ，
Ｔ．ら、（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ．３５２：６２４−
６２８）。プライマーＬＭＢ３及びＦｄＳｅｑを使用し
てＭａｒｋｓ，Ｊ．Ｄら、（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂ
ｉｏｌ．２２２：５８１−５９７に記載されたようにし
て挿入物を増幅した。種々の制限消化パターンを有する
クローンの例を選択し、配列決定した。配列決定用鋳型
は、Ｑｉａｇｅｎプラスミドｍｉｄｉキットにより調製
し、ＡＢＩＰｒｉｓｍＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ
ＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＲｅａｄｙＲ
ｅａｃｔｉｏｎＫｉｔを使用してａｍｐｌｉｔａｑ
ＦＳ（ＡＢＩ／ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で配列決定
した。

【００７５】１．５ファージの調製選択されたクローンの大規模のファージの調製を本質的
にライブラリーレスキューと同様に行った。１２ｍｌの
２ＸＴＹ／１００μｇ／ｍｌＡｍｐ／１％．グルコー
スに各クローンを接種し、培養物を３７℃でＯＤ６００
＝０．５〜０．７まで増殖させ、ヘルパーファージを加
えた。振盪せずに３７℃で３０分置いた後、感染細胞を
ペレット化し（３０００ｇで１０分間）、１００μｇ／
ｍｌＡｍｐ及び２５μｇ／ｍｌカナマイシンを含む５
０ｍｌ２ＸＴＹ中に再懸濁した。ファージを３０℃で
一晩増殖させた。４０ｍｌの一晩培養物を３３００ｇで
３０分間遠心分離し、上清に１／５容量のＰＥＧ／Ｎａ
Ｃｌ（２０％ＰＥＧ６０００，２．５ＭＮａＣｌ）
を加え、混合し、氷上に少くとも１時間置いた。その後
ファージを３，３００ｇで３０分間ペレット化し、上清
を取り除き、ペレットを２ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁し
た。エッペンドルフマイクロ遠心機で最高速度での１０
分間の遠心分離により残っている細菌の破片の大部分を
除去した。

【００７６】１．６ｓＦｖ発現及び精製選択されたクローンからプラスミドＤＮＡを調製し（Ｑ
ｉａｇｅｎキット）、非サプレッサー株ＨＢ２１５１に
形質転換した。ＴＧ−１またはＨＢ２１５１中の個々の
クローンを使用して２ＸＴＹ／Ａｍｐ／０．１％グルコ
ース中の５００ｍｌの培養物を接種した。対数期の途中
で、可溶性ｓＦｖの発現を１ｍＭＩＰＴＧで一晩３０
℃で誘導した（ｌａｃＺプロモーターの制御下のｓＦ
ｖ）。Ｓａｗｙｅｒ，Ｊ．Ｒ．及びＢｌａｔｔｎｅｒ，
Ｆ．Ｒ．，（１９９１）ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅ
ｅｒｉｎｇ４：９４７−９５３の方法に従い、リゾチ
ームは使用せずに、冷却浸透圧ショックにより５ｍｌの
細胞から、ＩＰＴＧ誘導後の可溶性ｓＦｖを含むと考え
られる細胞周辺（ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ）フラクショ
ンを調製した。ＨＩＳでタグ付けしたｓＦｖをＮＴＡ−
Ａｇａｒｏｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）上で精製した。

【００７７】［結果］予想されたように、両方のスクリ
ーニング戦略から得たポリクローナルファージは選択の
各回を経るに従ってＰＳＡ／ＡＣＴに対する増加したＥ
ＬＩＳＡ結合を示した。ＡＣＴのみへの結合は、減算の
後では、より低いＥＬＩＳＡシグナルを示すようであっ
た。ＰＳＡ結合は検出されなかった。

【００７８】各クローンからのファージを、３種類のＥ
ＬＩＳＡ（すなわち、免疫プレート上に固定されたＰＳ
Ａ／ＡＣＴ、ストレプトアビジン被覆プレート上のビオ
チン化ＰＳＡ／ＡＣＴ、及びビオチン化Ｆａｂにより提
示されたＰＳＡ／ＡＣＴを使用するもの）に、方法にお
いて記載したように使用した。一般に、多くのクローン
がうまく機能した。可溶相からの候補は免疫プレート上
でうまくアッセイされ、一方、免疫チューブで選択され
たファージは、ストレプトアビジン−ビオチン提示物質
あるいはｂｉｏ−Ｆａｂ提示抗原を同様に結合した。

【００７９】その後、有望な候補を比較ＥＬＩＳＡに使
用し、これにおいてはファージをＰＳＡ／ＡＣＴ、ＡＣ
Ｔ及びＰＳＡに対する結合についてアッセイした。ＡＣ
ＴよりもＰＳＡ／ＡＣＴに対して少くとも４倍より大き
い結合を示したクローンについてさらに分析した。

【００８０】抗ＰＳＡビオチン化ＦａｂによってもＰＳ
Ａ結合が見られなかった場合は、ＰＳＡの固定化につい
て調べた。このアッセイについてはＣｏｓｔａｒプレー
トのみが適当であるようである。プラスチック上にＰＳ
Ａを固定するという問題のため、免疫チューブ選択レパ
ートリーからのＰＳＡ結合物の可溶性減算を２回さらに
行った。

【００８１】各クローンをさらに分析した。ＥＬＩＳＡ
シグナル強度及び複合体特異性（ＰＳＡ／ＡＣＴ対ＡＣ
Ｔ）を増幅挿入物のＢＳＴＮ１フィンガープリント（制
限消化パターン）と比較し、候補の範囲を狭めた。免疫
チューブ選択（ＩＴ）、（３種のフィンガープリントパ
ターンを示す）からの４つの候補、及び可溶相選択（Ｂ
ＩＯ）（２つのフィンガープリントパターン）からの４
つを最初に特性付けした。配列分析の後、５つのクロー
ン（表１参照）をさらに特性付けした。同じフィンガー
プリントを有するクローンは全て同じ配列を有してい
た。配列データも、各選択により種々のヒトサブクラス
からＶ領域が得られたことを実証した（表１）。

【００８２】

【表１】選択された各単鎖抗体の完全配列をＫａｂａｔ（”Ｓｅ
ｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍ
ｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ”）に挙げら
れたヒト可変領域重鎖配列及び軽鎖配列と比較して、フ
ァージ提示抗体断片の選択されたプールにいくつの異な
るサブクラスが示されるかを判定した。

【００８３】５つのクローンのそれぞれについてさらに
大規模なスケールのファージ調製（５０ｍｌ）を行っ
た。これらを希釈試験において使用し、候補のそれぞれ
の結合プロフィールを確認した。図１は、ストレプトア
ビジン被覆プレート上に提示されたｂｉｏ−ＰＳＡ／Ａ
ＣＴとｂｉｏ−ＡＣＴに対するファージの結合を示す棒
グラフである。５μｇ／ｍｌのビオチン化ＰＳＡ／ＡＣ
Ｔ及びビオチン化ＡＣＴを、ｒｅａｃｔｉ−結合ストレ
プトアビジン被覆ポリスチレンマイクロタイタープレー
ト（Ｐｉｅｒｃｅ）の分離された半分の上にそれぞれ固
定した。各ファージ調製物（６ｘ１０^１０〜１ｘ１０
^１１ファージ／ｍｌ）を三倍連続希釈し、プレートの各
半分に加えた。ファージは少くとも９０分間結合させ
た。プレートを洗浄し、ファージを抗ｍ１３−ＨＲＰ結
合体とＡＢＴＳ基質で検出した。シグナル（吸光度）は
４０５ｎｍで読み取った。各ファージの調製物につい
て、全部で４種の希釈物（未希釈のものと３種の三倍連
続希釈物）を図１に示す（図１〜４に示したアッセイの
各々において、結合シグナル（吸光度）は４０５ｎｍで
読み取り、全部で４種の希釈物（未希釈のものと３種の
三倍連続希釈物）が示されている）。図１の結果は、Ｐ
ＳＡ／ＡＣＴに対する結合がＡＣＴに対する結合よりも
有意に高いことを示している。

【００８４】さらに、ＣｏｓｔａｒＨｉｇｈＢｉｎ
ｄｉｎｇＥ．Ｉ．Ａ．Ｐｌａｔｅ上で遊離のＰＳＡに
対する結合についてファージをアッセイした（図２）。
図２は、ＰＳＡ／ＡＣＴとＰＳＡに対するファージの結
合を示す。ＣｏｓｔａｒＨｉｇｈＢｉｎｄｉｎｇ
Ｅ．Ｉ．Ａ．プレートは、該プレートの片面をＰＳＡ／
ＡＣＴで一晩被覆し、該プレートの他方の面をＰＳＡ
で、各抗原２．５μｇ／ｍｌにて被覆した。各ファージ
調製物（６ｘ１０^１０〜１ｘ１０^１１ファージ／ｍｌ）
を三倍連続希釈し、プレートの各面に加えた。ファージ
は少くとも９０分間結合させた。プレートを洗浄し、フ
ァージを抗ｍ１３−ＨＲＰ結合体（１：５０００）とＡ
ＢＴＳ基質で検出した。ＰＳＡ固定化についての対照と
して、２種のビオチン化抗−ＰＳＡＦａｂ（ビオチ
ン．ＭＡＢ〈ＰＳＡ〉Ｍ１０−Ｆａｂ及びビオチン．Ｍ
ＡＢ〈ＰＳＡ〉ＰＲ１−Ｆａｂ）の混合物を１：１５０
から開始する連続希釈において使用した。Ｂｉｏ−Ｆａ
ｂ結合は、ストレプトアビジン−ＨＲＰ結合体（Ｐｉｅ
ｒｃｅ）（１：４０００）で検出した。

【００８５】ＰＳＡの固定化を確認するため、ＰＳＡ及
びＰＳＡ／ＡＣＴの両者に結合する２種のビオチン化抗
−ＰＳＡＦａｂ（ビオチン．ＭＡＢ〈ＰＳＡ〉Ｍ１０
−Ｆａｂ及びビオチン．ＭＡＢ〈ＰＳＡ〉ＰＲ１−Ｆａ
ｂ）の混合物を対照として使用した。Ｆａｂ結合は、ス
トレプトアビジン−ＨＲＰ結合体で検出した。両方のＦ
ａｂは高い親和性で複合体に結合することが知られてい
るが、データは明らかにＰＳＡ結合がＦａｂ混合物で検
出可能であり、選択したクローンが低い交差反応性を示
すことを示した。

【００８６】ｓＦｖ発現のＩＰＴＧ誘導の後、各候補ク
ローンから細胞周辺フラクションを調製し、比較ＥＬＩ
ＳＡに使用した。図３は、ＰＳＡ／ＡＣＴとＡＣＴに対
するｓＦｖ結合を示す棒グラフである。Ｉｍｍｕｌｏｎ
４Ｆｌａｔ−ＢｏｔｔｏｍＩｍｍｕｎｏａｓｓａ
ｙプレートの１／２の上に５μｇ／ｍｌの各抗原を固定
した。６０〜１４０μｇ／ｍｌでのｓＦｖ調製物を三倍
連続希釈し、プレートの各半分に加えた。ｓＦｖ結合
は、抗−Ｃｍｙｃ９Ｅ１０−ＨＲＰ結合体とＡＢＴＳ
基質で検出した。図３のデータから、予想どおりに、さ
れるように複合体特異的結合が抽出物を希釈するに従っ
て減少し、一方ＡＣＴ結合はかなり一貫したバックグラ
ウンドレベルを示すようであることが示された。それに
加えて、免疫チューブ選択から単離された候補（ＩＴＡ
２及びＩＴＡ３）はストレプトアビジンプレート上に提
示されたビオチン化抗原を認識し、その他の選択からの
候補は固定されたＰＳＡ／ＡＣＴに結合することが判
る。

【００８７】遊離のサブユニット（ＰＳＡまたはＡＣ
Ｔ）上に存在しないエピトープを認識する選択された複
合体特異的ファージ提示抗体を入手したので、各抗体に
ついて、ＰＡＳ／ＡＣＴと、他のセリンプロテアーゼ
（特にキモトリプシン）に複合化したＡＣＴとを区別す
る能力についてアッセイした。キモトリプシン−ＡＣＴ
（ＣＴ／ＡＣＴ）は、ＣＴ／ＡＣＴと交差反応するＭＡ
ｂ〈ＰＳＡ−ＡＣＴ〉Ｍ−４．６．３７４−ＩＧＧ（対
照として）とともにＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈ
ｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙから入手した。単鎖発現を選択
したクローンにおいて誘導した。ＮＴＡ−樹脂上での精
製の後、ｓＦｖを競合的ＥＬＩＳＡにおいても使用し
た。ｓＦｖ調製物の希釈物（６０〜１４０μｇ／ｍｌ）
を、ＰＳＡ／ＡＣＴ及びＣＴ／ＡＣＴに対する結合につ
いてｉｍｍｕｌｏｎプレート上で比較した（図４）。こ
のアッセイにおいては（図４）、各抗原（ＰＳＡ／ＡＣ
ＴまたはＣＴ／ＡＣＴ（キモトリプシン−抗キモトリプ
シン））の５μｇ／ｍｌをＩｍｍｕｌｏｎ４Ｆｌａ
ｔ−ＢｏｔｔｏｍＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙプレートの
１／２の上に固定した。６０〜１４０μｇ／ｍｌのｓＦ
ｖ調製物を三倍連続希釈し、プレートの各部分に加え
た。ｓＦｖ結合は抗−ｃ−ｍｙｃ９Ｅ１０−ＨＲＰ結
合体とＡＢＴＳ基質とで検出した。クローンはＰＳＡ／
ＡＣＴに対して高度に特異的な結合を示した。交差反応
性の低いレベルは、対照抗体によって示されたものと同
様であった。

【００８８】最後に、単離された抗体断片は、ｐＨ７．
４でＰＳＡ／ＡＣＴを結合することができる。結果は、
ＰＳＡ／ＡＣＴ複合体に対する抗体の単離にファージ提
示抗体法が成功裏に使用されることを示している。ＰＳ
ＡあるいはＡＣＴだけに結合するファージの選択ライブ
ラリーを枯渇させるのに使用した戦略は有効であった。
ファージ上に提示された抗体断片とペリプラスム中に可
溶性ｓＦｖとして発現された抗体断片は同じ複合体特異
性を示した。プラスチックへの付着は、アッセイに致命
的なようにはＰＳＡ／ＡＣＴ複合体を変化させることは
ないようである。全ての選択されたｓＦｖ候補は、ポリ
スチレン上に固定されたＰＳＡ／ＡＣＴ、ストレプトア
ビジン上に提示されたビオチン化ＰＳＡ／ＡＣＴ、ある
いは明らかに非オーバーラップエピトープに結合するは
ずの非複合体特異的Ｆａｂにより提示される非修飾ＰＳ
Ａ／ＡＣＴに結合する。

【００８９】［実施例２］サブクローニングと突然変異誘発一般に、単鎖抗体は安定性のレベル及び凝集する傾向に
おいて異なっている。選択されたｓＦｖからの可変領域
を、より大きい免疫グロブリン（ＩＧ）誘導体の発現の
ためにベクターにサブクローン化する。本発明において
単離されたｓＦｖクローンをＦａｂ断片または無傷の免
疫グロブリンへと変換できるベクターは、そのようなも
のがアッセイフォーマットに必要であるならば利用可能
である。免疫グロブリン誘導体の融合タンパク質は、当
分野において知られた方法を使用して容易に調製するこ
とができる。配列決定によりＩＴＡ７クローンが内部ア
ンバー変異を有することが判った。これらの抗体断片の
発現を最大にするために、これらのアンバーコドンは指
向的な突然変異誘発により修復される。

【００９０】［実施例３］結合の特性化エピトープマッピングを行い、本発明の抗ＰＳＡ／ＡＣ
Ｔ抗体を、従来記載の複合体結合を示す他の抗体と比較
して、いくつの非オーバーラップ複合体特異的エピトー
プが本発明のクローンパネルにより同定されるかを見
る。エピトープマッピングは、競合的イムノアッセイに
より、すなわち例えばＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（Ｅ．
Ｐ．Ｄｉａｍａｎｄｉｓ及びＴ．Ｋ．Ｃｈｒｉｓｔｏｐ
ｏｕｌｏｓ編、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎ
ｃ．，１９９６）、２３１−２３２及び５４９ページに
記載されているように行う。

【００９１】ファージにより平衡及び動力学的離脱速度
が成功裏に測定されている（Ｈａｗｋｉｎｓ，Ｒ．
Ｅ．，ら、（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２
６：８８９−８９６）。各ｓＦｖの精製モノマーについ
ての表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ）によりアフ
ィニティの研究を行う。また、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ分析
に平衡透析を使用することができる。これらの方法は記
載されている。

【００９２】［実施例４］機能的アッセイ本発明のＰＳＡ／ＡＣＴ複合体抗体を、患者サンプル中
のＰＳＡ／ＡＣＴ複合体を検出する能力について、例え
ばＥＬＩＳＡにより分析する。イムノアッセイのための
種々の可能性のある形態が当分野において記載されてい
る。Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）システムイムノアッセ
イの原理は前記した。Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）シス
テムを使用する診断イムノアッセイの１つのフォーマッ
トにおいては、ＰＳＡ−ＡＣＴ抗体を磁気粒子上に固定
する。測定対象のＰＳＡ−ＡＣＴを含む患者サンプル
を、抗体被覆磁気粒子に加える。さらに標識ＰＳＡ−Ａ
ＣＴ複合体を加えて、抗体結合部位に対して患者ＰＳＡ
−ＡＣＴと競合させる。インキュベートの後、サンプル
を洗浄済みの測定セルに移し、前に記載したようにＰＳ
Ａ−ＡＣＴ複合体の量を測定する。結合複合体の濃度／
量は、測定された光の出力に逆比例する。結果を現在市
販されているアッセイと比較する。

【配列表】

【配列表フリーテキスト】

配列番号１：ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体配列番号２：ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体配列番号３：ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体配列番号４：ＰＳＡ＝ＡＣＴ複合体配列番号５：ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体配列番号６：ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体配列番号７：ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体配列番号７：ＮはＴである配列番号８：ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体配列番号９：ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体配列番号１０：ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体配列番号１１：ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体配列番号１２：ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体配列番号１３：ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体配列番号１４：ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体配列番号１５：ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体配列番号１６：ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体配列番号１７：ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体配列番号１８：ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体配列番号１９：ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体配列番号２０：ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体配列番号２１：ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体配列番号２２：ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体配列番号２３：ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体配列番号２４：ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体配列番号２５：ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体配列番号２６：ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、実施例１に記載した、ストレプトアビ
ジン被覆プレート上に提示されたｂｉｏ−ＰＳＡ／ＡＣ
Ｔ及びｂｉｏ−ＡＣＴに対するファージ結合を示す棒グ
ラフである。

【図２】図２は、実施例１に記載した、ＰＳＡ／ＡＣＴ
及びＰＳＡに対するファージ結合を示す棒グラフであ
る。

【図３】図３は、実施例１に記載した、ＰＳＡ／ＡＣＴ
及びＡＣＴに対するｓＦｖ結合を示す棒グラフである。

【図４】図４は、実施例１に記載した、ＰＳＡ／ＡＣＴ
及びＣＴ／ＡＣＴに対するｓＦｖ結合を示す棒グラフで
ある。

【図５】図５は、実施例１に記載した、Ｇｒｉｆｆｉ
ｎ．１ライブラリーのｓｃＦｖ断片を構築するのに使用
したファージミドベクターｐＨＥＮ２の構造を示す。

【図６】図６は、ＬＭＢ３からｆｄＳｅｑ１部位まで
のｐＨＥＮ２ファージミドベクター内の関連配列を示す
（ＤＮＡ：配列番号２１、アミノ酸配列：配列番号２２
〜２６）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ウォルターシー．マハニーアメリカ合衆国 94510−2523 カリフォルニア州，ベネシア，ウェストエイチストリート 794 (72)発明者ジェイミーアール．ソウヤーアメリカ合衆国 85224 アリゾナ州，チャンドラー，ウェストテンプル 2715

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】第一のサブユニットと第二のサブユニッ
トを含む抗原複合体に対して特異的な抗体を得る方法で
あって、以下ａ）〜ｆ）：ａ）組換え複製ベクター粒子により提示された抗体のラ
イブラリーを作成し、ｂ）ライブラリーを複合体と接触させ、複合体に結合す
るベクター粒子を回収することにより、抗原複合体のみ
に特異的な抗体を提示するベクター粒子をライブラリー
から選択し、ｃ）ライブラリーを第一のサブユニットと接触させ、非
結合粒子を回収することにより、第一のサブユニットの
みに特異的な抗体を提示するベクター粒子をライブラリ
ーから除去し、ｄ）ライブラリーを第二のサブユニットと接触させ、非
結合粒子を回収することにより、第二のサブユニットの
みに特異的な抗体を提示するベクター粒子をライブラリ
ーから除去し、ｅ）段階ｂ）、ｃ）及びｄ）に従って処理した後に、ラ
イブラリー中に存在する粒子をクローンとして複製し、ｆ）複合体には結合するが、第一あるいは第二のサブユ
ニットのみには結合しない抗体を提示する、段階ｅ）の
後に得られた複製粒子のクローンを選択する、段階を含
む方法。
【請求項２】抗体のライブラリーがナイーブなライブ
ラリーである請求項１に記載の方法。
【請求項３】抗体のライブラリーが、少なくとも１０
^８個のメンバーの免疫グロブリンＶ領域レパートリーを
含む請求項２に記載の方法。
【請求項４】ライブラリーにより提示される抗体が単
鎖可変領域である請求項１に記載の方法。
【請求項５】ベクター粒子を複合体と接触させ、複合
体と結合するベクター粒子を回収することにより、複合
体のみに特異的な抗体を提示するベクター粒子につい
て、段階ｆ）の後に残ったライブラリーを濃縮すること
をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項６】段階ｄ）で選択された粒子により提示さ
れた重鎖及び軽鎖可変領域を別のポリペプチド鎖上に発
現させ、再度組み合わせて複合体に結合する可変領域を
形成する段階をさらに含む請求項４に記載の方法。
【請求項７】ｉｎｖｉｔｒｏでの複合体の安定性に
好適な条件下で抗原複合体を調製し、ライブラリーと接
触させる請求項１に記載の方法。
【請求項８】組換え複製ベクター粒子が糸状ファージ
である請求項１に記載の方法。
【請求項９】第一のサブユニットが前立腺特異抗原で
あり、第二のサブユニットが抗キモトリプシンである請
求項１に記載の方法。
【請求項１０】抗体のライブラリーがナイーブなヒト
抗体ライブラリーである請求項９に記載の方法。
【請求項１１】４℃及びｐＨ６．０で抗原複合体を
調製し、ライブラリーと接触させる請求項９に記載の方
法。
【請求項１２】ＰＳＡ−ＡＣＴに結合する、請求項１
に記載の方法により製造された抗体。
【請求項１３】請求項１の段階ｆ）において選択され
た粒子から単離された重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子を発
現するように組換えにより製造された抗体であって、Ｐ
ＳＡ−ＡＣＴに結合する抗体。
【請求項１４】Ｆａｂ断片、インタクトな抗体、融合
抗体及びキメラ抗体からなる抗体の群から選択される請
求項１３に記載の抗体。
【請求項１５】前立腺特異抗原（ＰＳＡ）あるいは抗
キモトリプシン（ＡＣＴ）単独に対するアフィニティよ
りも少なくとも１０倍高いアフィニティでＰＳＡ及びＡ
ＣＴ間に形成された複合体に結合する抗体。
【請求項１６】ＰＳＡあるいはＡＣＴ単独に対するア
フィニティよりも少なくとも１０^３倍高いアフィニティ
で複合体に結合する請求項１５に記載の抗体。
【請求項１７】他のセリンプロテアーゼ及びＡＣＴ間
の複合体に対するアフィニティよりも少なくとも１０倍
高いアフィニティで複合体に結合する請求項１５に記載
の抗体。
【請求項１８】キモトリプシン及びＡＣＴ間の複合体
に対するアフィニティよりも少なくとも１０倍高いアフ
ィニティで複合体に結合する請求項１５に記載の抗体。
【請求項１９】ヒト抗体である請求項１５に記載の抗
体。
【請求項２０】単鎖可変領域である請求項１５に記載
の抗体。
【請求項２１】重鎖及び軽鎖可変領域が別のポリペプ
チド鎖上に存在する請求項１５に記載の抗体。
【請求項２２】ＩＴＡ２、ＩＴＡ３、ＩＴＡ７、ＢＩ
ＯＡ８、及びＢＩＯＣ７からなる抗体の群から選択され
た抗体の重鎖及び軽鎖可変領域を有する請求項１５に記
載の抗体。
【請求項２３】ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体に対する結合に
おいて請求項１５に記載の抗体と競合する請求項１５に
記載の抗体。
【請求項２４】ＩＴＡ２、ＩＴＡ３、ＩＴＡ７、ＢＩ
ＯＡ８、及びＢＩＯＣ７からなる抗体の群から選択され
た抗体の重鎖及び軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を有す
る請求項１５に記載の抗体。
【請求項２５】選択された抗体が、配列番号２のアミ
ノ酸配列を有するＩＴＡ２である請求項１５に記載の抗
体。
【請求項２６】選択された抗体が、配列番号５のアミ
ノ酸配列を有するＩＴＡ３である請求項１５に記載の抗
体。
【請求項２７】選択された抗体が、配列番号８のアミ
ノ酸配列を有するＩＴＡ７である請求項１５に記載の抗
体。
【請求項２８】選択された抗体が、配列番号１１のア
ミノ酸配列を有するＢＩＯＡ８である請求項１５に記載
の抗体。
【請求項２９】選択された抗体が、配列番号１４のア
ミノ酸配列を有するＢＩＯＣ７である請求項１５に記載
の抗体。
【請求項３０】サンプル中のＰＳＡ及びＡＣＴ間の複
合体の存在またはその量を測定するための請求項１５に
記載の抗体を使用する方法であって、ＰＳＡ−ＡＣＴ複
合体が抗体に結合できる条件下で該抗体とサンプルを含
む反応混合物を調製し、反応混合物中で抗体に結合した
ＰＳＡまたはＡＣＴの存在またはその量を測定すること
を含む方法。
【請求項３１】患者における前立腺の良性及び悪性の
状態を区別する方法であって、患者から得たサンプル中
のＰＳＡ及びＡＣＴ間の複合体の量を請求項３０に記載
の方法により測定し、該複合体の量を状態の非悪性度と
関連付けることを含む方法。
【請求項３２】サンプルが血清サンプルである請求項
３１に記載の方法。
【請求項３３】患者における前立腺の良性及び悪性の
状態を区別する方法であって、患者から得たサンプル中
の全ＰＳＡ量を測定し、そのサンプル中のＰＳＡ及びＡ
ＣＴ間の複合体の量を請求項３０に記載の方法により測
定し、全ＰＳＡに対する複合体の比率を状態の非悪性度
と関連付けることを含む方法。