JP2005500826A - ヘベイン結合性モノクローナル抗体 - Google Patents
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Abstract
本発明は抗体工学技術に関する。更に詳細には、本発明は、アレルゲン性ヘベインに対して高い親和性と特異性をもって結合する、ヒトＩｇＥ抗体及びその誘導体に関する。また、本発明は、上記のヘベイン結合性モノクローナル抗体を作製したり改変したりするための方法、並びにこのような抗体やその誘導体を免疫学的診断の分野で使用するための方法を提供する。本発明によって、生物学的サンプル及び原料サンプル中のアレルゲン性ヘベインの定性的及び定量的測定と共に、免疫学的治療も可能となり、その結果、アレルギー患者におけるアレルゲン性ヘベインの活性阻害が可能となる。
Description
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗体工学技術に関する。更に詳細には、本発明は、アレルゲン性ヘベインに対して高い親和性と特異性をもって結合する、ヒトＩｇＥ抗体及びその誘導体に関する。また、本発明は、上記のヘベイン結合性モノクローナル抗体を作製したり改変したりするための方法、並びにこのような抗体やその誘導体を免疫学的診断の分野で使用するための方法を提供する。本発明によって、生物学的サンプル及び原料サンプル中のアレルゲン性ヘベインの定性的及び定量的測定と共に、免疫学的治療も可能となり、その結果、アレルギー患者におけるアレルゲン性ヘベインの活性阻害が可能となる。
【背景技術】
【０００２】
世界の人口のおよそ２０％がアレルギーに苦しんでいる。このため、アレルギーは深刻さの増している健康問題である。アレルギーとは、空気、食物又は水に存在する通常は害のない物質に対する過敏反応である（Corry and Kheradmand, 1999）。新規な外来の異質物が、それを体内から排除することを目的とする反応、つまりアレルギー反応を引き起こす。即時型又はＩ型過敏反応とも呼ばれるＩｇＥ仲介アレルギー反応においては、生体が外来物質であるアレルゲンに初めて曝された時に、ＩｇＥ産生Ｂ細胞が可溶性ＩｇＥ分子の産生を始める。そして可溶性ＩｇＥ分子は、種々の細胞、最も重要なものとしてはマスト細胞の表面に存在する高親和性ＩｇＥレセプターに結合する。生体が同じ外来物質に再び遭遇すると、レセプター結合ＩｇＥ分子とアレルゲンとの交差結合が生じ、その結果、細胞が活性化されて、アレルギー反応の徴候及び症状を誘発する毒性物質であるヒスタミンなどが放出される。
【０００３】
ラテックスアレルギーは患者数が増加している深刻な医療問題である(Slater, 1994; Turjanmaa et al., 1996)。ラテックスは複合細胞内産物であり、ゴムの木であるHevea brasiliensisの乳細胞によって産生される乳液である。ラテックスは、例えば手袋、風船及びコンドームといった種々の日用品並びに医療用品の製造に用いられている。ラテックスアレルギーは特に医療関係従事者、ゴム工業就労者及び数回の外科的処置を受けた患者の間で深刻な問題となっている。ラテックスアレルギーは、花粉アレルギー及び食物アレルギーとの関連が報告されている(Nel and Gujuluva, 1998)。ラテックスアレルゲンと食物アレルゲンの交差反応性は、ラテックス−果物症候群として確立されており、これはヘベイン様タンパク質ドメイン又は類似のエピトープの反応性が原因であると考えられる(Brehler et al., 1997; Chen et al., 1998; Mikkola et al., 1998)。多くのラテックスタンパク質はアレルゲンとして同定されている(Breiteneder and Scheiner, 1998)。主要なラテックスアレルゲンの一つはヘベインであり、ヘベインは、例えば数種のキチン含有真菌の感染抑制に関与する防御タンパク質である(Lee et al., 1991; Alenius et al., 1996; Chen et al., 1997)。ヘベインは４３個のアミノ酸からなり、４個のジスルフィド結合を有する小さなキチン結合性タンパク質である。その三次元構造はＸ線解析及びＮＭＲによって決定されている(Rodriguez-Romero et al., 1991; Andersen et al., 1993)。
【０００４】
ＩｇＥ抗体はアレルゲン性エピトープを特異的に認識するので、臨床又は免疫学的診断において複合材料のアレルゲン濃度を検出及び決定するために有用である。さらに、アレルゲン性エピトープは、通常、タンパク質の免疫原性エピトープとは異なる。このことは、ハイブリドーマ技術などの従来の方法による、アレルゲン性エピトープに特異的な結合を示すモノクローナル抗体の産生の妨げとなっている。アレルゲン特異的ＩｇＥ抗体の開発がファージディスプレイ法によって可能なことが最近報告示されている(Steinberger et al., 1996)。この方法は、臨床及び診断に使用するためのアレルゲン特異的組み換え抗体を一定の質を保持しながら産生するための新たな手段を提供する。
【０００５】
発明の概要
本発明においては、イムノアッセイや免疫学的治療のための試薬として用いることのできる、ヒトＩｇＥ抗体フラグメントの開発及び特徴づけを開示する。本発明のヒトＩｇＥ抗体フラグメントは、生物学的試料中のヘベインを定性的及び定量的に測定するために設計したイムノアッセイ用の試薬及びアレルギー患者の免疫学的治療に用いるのに十分な高い親和性及び特異性を有する。具体的には、本発明は、ヘベインに特異的なヒトＩｇＥ抗体のファージディスプレイ法による選択、及びE. coliを用いて産生した、改変された抗体断片の結合特性の特徴づけについて開示する。
【０００６】
従って、本発明は、種々のイムノアッセイ法及びヒトの免疫学的治療に使用するための新規な試薬を提供する。また、本発明によって、均一な品質を保持する上記の特異的な試薬を継続的に供給することが保証され、ポリクローナル抗血清に固有のバッチ間の品質のばらつきという問題を排除した。これらの有用な効果によって、本発明は、均一な品質の、新規であり、特異的であり且つ経済的な免疫学的診断方法の製造を可能にする。
【０００７】
上記から明かなように、本発明の特定の目的の一つは、ヒトＩｇＥモノクローナル抗体、その機能的フラグメント又はそれらの誘導体（以下、屡々、「モノクローナル抗体、その機能的フラグメント又はそれらの誘導体」をまとめて「ヘベイン結合性物質」と称する）であって、生物学的サンプル中のヘベインの定性的及び定量的測定に使用するのに十分な高いヘベイン親和性及び特異性を有するものを提供する。さらに本発明は、免疫学的治療に使用することを特徴とする、上記のヘベイン結合性物質も提供する。本発明のモノクローナル抗体はアレルゲン性ヘベインに特異的な結合性を示す。
【０００８】
本発明の他の目的の一つは、ヘベイン特異的抗体鎖をコードするｃＤＮＡクローンのみならず、該クローンを発現させてヘベイン結合性物質を産生するための構築物や方法を提供することである。
【０００９】
本発明の更なる目的の一つは、モノクローナル抗体、その機能的フラグメント又はそれらの誘導体を単独又は組み合わせて用いることで、生物学的サンプル中のヘベインを定性的及び定量的に測定する方法を提供することである。更に、本発明は、アレルギー患者の免疫学的治療に使用するためのモノクローナル抗体、その機能的フラグメント又はそれらの誘導体およびそれらを組み合わせて得られるヘベイン結合性物質を提供する。
【００１０】
本発明の諸目的、諸特徴及び諸利益は、添付の図面及び詳細な説明の記載から明らかになる。しかしながら、以下の詳細な説明及び実施例は本発明の好ましい態様を示すものの、あくまでもそれを例示しているに過ぎず、本発明の精神及び発明の範囲内で行われる種々の変更及び改良は、以下の詳細な説明より当業者には明らかであることを理解されたい。
【００１１】
【００１２】
発明の詳細の説明
本願明細書で使用した用語の一部について、その定義を提供する。「免疫グロブリン」、「Ｈ鎖」、「Ｌ鎖」及び「Ｆａｂ」は欧州特許願第０１２５０２３号と同様に使用した。
【００１３】
本願明細書において使用した種々の活用形の「抗体」という用語は集合名詞であり、免疫グロブリン分子及び／又は免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部位、即ち抗原結合部位又はパラトープ、の総称である。
【００１４】
「抗原結合性部位」又は「パラトープ」とは、抗体分子において、抗原に特異的に結合する構造上の部位である。
【００１５】
抗体の例としては、免疫グロブリン分子の一部分であってパラトープを含む部分、例えばＦａｂやＦｖが挙げられる。
【００１６】
「Ｆａｂ」（特異的抗原結合性を有するフラグメント）とは、公知の方法によって実質的に完全な抗体をパパインによるタンパク質分解に付すことで得られる抗体の一部分である。例えば、米国特許第４，３４２，５６６号を参照されたい。Ｆａｂフラグメントは遺伝子組換え法によって産生することもでき、このような方法は当業者にはよく知られている。例えば、米国特許第４，９４９，７７８号を参照されたい。
【００１７】
「ドメイン」は、タンパク質の独立した折りたたみ部分を意味する。天然のタンパク質におけるドメイン間の境界に関する一般的な構造上の定義については、Argos, 1988を参照されたい。
【００１８】
「可変ドメイン」又は「Ｆｖ」とは、免疫グロブリン分子中に存在し、抗原又はハプテンの結合を担う領域をである。通常この領域は、免疫グロブリン分子のＬ鎖及びＨ鎖のそれぞれのＮ末端から数えて約１００個のアミノ酸からなる領域である。
【００１９】
「一本鎖抗体」（ｓｃＦｖ）とは、抗体のＨ鎖及びＬ鎖のそれぞれの可変ドメインがリンカーペプチドを介して結合した連続したアミノ酸鎖であって、一本のｍＲＮＡ分子（転写物）から合成されたものである。
【００２０】
「リンカー」又は「リンカーペプチド」とは、天然又は工学的に作られたタンパク質中の隣接する２つのドメインの間に存在するアミノ酸配列である。
【００２１】
「ヘベイン結合性抗体」とは、抗体の可変領域が仲介する相互作用によってヘベインを特異的に認識して結合する抗体である。
【００２２】
上記抗体の機能的フラグメントであって、本発明の範囲に属するものの例として、ｓｃＦｖフラグメントである１Ａ４及び１Ｃ２を図４及び図５に開示した。本発明の一つの好ましい態様においては、ヘベイン結合性抗体の誘導体、例えばＦａｂフラグメントやｓｃＦｖフラグメント、を提供する。更に他の誘導体としては、ＣＤＲ配列又は完全なＶL及びＶH配列の変異型であって、結合力に実質的に影響を与えない１つ以上の同類置換(conservative substitutions)を有するものを用いることもできる。
【００２３】
イムノアッセイ、例えば生物学的サンプル中のヘベインを定性的又は定量的な検出、に使用する本発明のヘベイン結合性物質を標識してもよい。この目的のためには、従来から抗体の標識に用いられているいかなる種類の標識も用いることができる。
【００２４】
免疫学的治療、例えばアレルギー患者のアレルゲン性ヘベインの結合阻害、に使用するためにも、本発明のヘベイン結合性物質を標識してもよい。この目的のためには、薬学的に許容され、従来から抗体の標識に用いられている標識が適当である。
【００２５】
本発明の他の一つの態様においては、ヘベイン結合性物質をコードするＤＮＡであるか、該ＤＮＡの断片であって、ＶL及び／又はＶH領域の相補性決定部（ＣＤＲ）をコードするＤＮＡ断片である、ＤＮＡ分子を提供する。本発明のＤＮＡ分子はベクター、具体的には、例えば、本発明の抗体の誘導体、少なくとも１つの抗体鎖又は抗体鎖の一部を発現可能なベクター、にクローニングされていてもよい。
【００２６】
本発明の更なる一つの態様においては、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞及び哺乳類細胞からなる群より選ばれる細胞であって、本発明のＤＮＡ分子を含み、本発明のヘベイン結合性物質を発現することが可能な宿主細胞を提供する。したがって、本発明の抗体誘導体は、少なくとも１種の抗体鎖を発現しうる本発明の宿主細胞を培養し、そして宿主細胞の産生した目的タンパク質を回収することで製造するか、必要であれば、タンパク質を回収した後に、更に該タンパク質の抗体鎖を構成する複数のドメインを包含するドメイン複合体を調製することによって製造することもできる。
【００２７】
上記のｓｃＦｖフラグメントは、アレルゲン性組換えヘベインを用いてヒトＩｇＥ ｓｃＦｖファージライブラリーのバイオパニング（biopanning）によって得たものである。ヒトＩｇＥ ｓｃＦｖファージライブラリーは、ラテックスアレルギー患者のリンパ球から単離したｍＲＮＡから構築したものである。Ｌ鎖及びＨ鎖の可変領域のｃＤＮＡは、Ｆｄ ｃＤＮＡ用のヒトＩｇＥに特異的なプライマーを用いて合成し、ヒトＬ鎖のカッパ（κ）鎖及びラムダ（λ）鎖はヒトκ鎖及びλ鎖に特異的なプライマーを用いて合成した。Ｌ鎖及びＨ鎖の可変領域は、ＶκとＶλ ｃＤＮＡ用のヒトκ鎖特異的プライマーとλ鎖特異的プライマー及びＶH ｃＤＮＡ用のヒトＩｇＥ特異的プライマーを用いてそれぞれＰＣＲによって増幅した。これらのＰＣＲプライマーに導入しておいた制限部位を利用して、ｓｃＦｖファージディスプレイベクターに可変領域のｃＤＮＡをクローニングし、ヒトＩｇＥ ｓｃＦｖライブラリーを構築した。
【００２８】
パニング法を利用したファージディスプレイによってヒトＩｇＥ ｓｃＦｖライブラリーを選択した。ヒトＩｇＥ ｓｃＦｖファージライブラリーのスクリーニングを溶液中のビオチン化したアレルゲン性組換えヘベインで行い、結合物をストレプトアビジン上に捕捉した。ファージの溶出を１００ｍＭ ＨＣｌ（ｐＨ２．２）で行い、次いで２Ｍトリス溶液で直ちに中和した。ファージ溶出液をE. coli細胞で増幅した。バイオパニングを５ラウンド繰り返した後、単離したファージから可溶性のｓｃＦｖフラグメントを調製した。選択したｓｃＦｖフラグメントの結合特異性をＥＬＩＳＡで検出した。数種のヘベイン特異的ｓｃＦｖフラグメントクローンを得た。
【００２９】
本願明細書に記載したように、ファージディスプレイ法は、診断及び治療に適用するためのヒトＩｇＥ組換え抗ヘベイン抗体を開発するための有効かつ簡便な方法である。
【００３０】
本発明の抗体フラグメントを得るために有効な選択方法の一つを記載したが、本発明の抗体フラグメントを得ることが可能な多数の応用方法も当業者には明らかとなる。ｓｃＦｖフラグメント又はその誘導体のファージディスプレイライブラリー又は微生物ディスプレイライブラリーから本発明のｓｃＦｖフラグメントを直接選択することが可能であることは明らかなはずである。本発明のｓｃＦｖフラグメント又は他の抗体フラグメントを表面タンパク質との融合タンパク質として提示するファージ又は微生物細胞は、本発明の更なる態様の一つである。
【００３１】
微生物細胞による本発明のヘベイン結合性物質の発現は、免疫診断アッセイ及び免疫学的治療に適した均一な品質の高特異性試薬を効率よく且つ経済的に製造するための手段を提供する一方で、このような試薬又はその少なくとも一部が合成可能であることを示している。従来の遺伝子工学的手法を適用することにより、初めに得られた本発明の抗体フラグメントをその結合特性を実質的に変えることなく改変する（例えば、新たな配列を連結する）ことができる。このような手法は、上記で定義したヘベインに対する親和性及び特異性の両方を保持する新規なヘベイン結合性ハイブリッドタンパク質の製造にも用いることができる。
【００３２】
ヒトヘベイン結合性組換え抗体の開発及び特徴づけ、並びにイムノアッセイにおけるその有用性について、以下の実施例において詳細に説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
実施例１
ファージディスプレイ選択法による組換えヘベイン特異的ｓｃＦｖフラグメントの調製
本実施例においては、ヘベインに対する親和性及び特異性を有するｓｃＦｖフラグメントを単離するために、ヒトＩｇＥ ｓｃＦｖライブラリーを構築し、アレルゲン性ヘベインによる選択を行った。ＩｇＥ Ｆａｂ−κライブラリー及びＩｇＥ Ｆａｂ−λライブラリーを初めに構築することによってヒトＩｇＥファージライブラリーを間接的に構築し、その後、特定のライブラリーのＤＮＡを用いてＨ鎖及びＬ鎖の可変ドメインをコードするＤＮＡをＰＣＲで増幅した。
【００３４】
Ｉ．ヒトＩｇＥ ｓｃＦｖファージライブラリーの構築
ヘパリンを加えた血液１００ｍｌをラテックスアレルギー患者から得た。リンパ球をIg-Prime Kit Protocol（Novagen社製）に従って次の手順で単離した。血液１０ｍｌあたり３０ｍｌの溶解緩衝液（１５５ｍＭのＮＨ4Ｃｌ、１０ｍＭのＮＨ4ＨＣＯ3、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ＝７．４）を加え、時々振とうさせながら氷上で１５分間インキュベートした。４５０ｇで１０分間遠心分離した後、リンパ球、即ち白血球ペレット、を回収した。回収したペレットを溶解緩衝液で２回洗浄し、最後の遠心分離の後に得られたリンパ球ペレットをＤ−溶液（D-solution）に再懸濁した。リンパ球ＲＮＡをPromega社のRNAgents Total RNA Isolation kitを用いて製造者のマニュアルに従って単離した。初めのｃＤＮＡ合成はPromega社のReverse Transcription system kitを用いて行った。ＦｄフラグメントｃＤＮＡ及びＬ鎖ｃＤＮＡの合成には、イプシロン（ε）鎖の定常領域のプライマー（Ｃε１及びＣε２）、並びにカッパ鎖のプライマー（Ｃκ１）とラムダ鎖のプライマー（Ｃλ１）をそれぞれ用いた。ヒトＩｇＥ Ｆｄ領域及びＬ鎖のｃＤＮＡ合成及びＰＣＲ増幅に用いたプライマーを表１及び表２に示す。
【００３５】
ＰＣＲ増幅は２段階、具体的にはｃＤＮＡテンプレートからＦｄ鎖及びＬ鎖を増幅するための一次ＰＣＲと、一次ＰＣＲで得たＤＮＡフラグメントの５'末端に制限部位を加えるための二次ＰＣＲで行った。まず、Ｈ鎖の可変領域に特異的なプライマー（ＶＨ１ａ−ＶＨ７ａ）及びＣε１ＮｏｔＩプライマーを用いてＦｄ領域をＰＣＲで増幅した。次に、Ｌ鎖であるκ鎖及びλ鎖をＬ鎖の可変領域に特異的なプライマー（それぞれＶκ１ａ−Ｖκ６ｂとＶλ１ａ−Ｖλ１０）及びＣε１ＮｏｔＩプライマーを用いて増幅した。二次ＰＣＲでは、Ｆｄ領域のＰＣＲ増幅にはＣκ１、Ｖκ／λ１及びＣε２プライマーを用い、κ鎖のＰＣＲ増幅にはＶκ／λ１及びＣλ１プライマーを用い、λ鎖のＰＣＲ増幅にはＶλ１Ａ及びＣκ／λ１プライマーを用いた。一次ＰＣＲは以下の条件で行った：９３℃で３分間の変性を１サイクル；９３℃で１分間、６３℃で３０秒及び５８℃で５０秒のアニーリング、次いで７２℃で１分間の伸長を７サイクル；９３℃で１分間、６３℃で３０秒及び７２℃で１分間を２３サイクル；最後に７２℃で１０分間を１サイクル。二次ＰＣＲは以下の条件で行った：９５℃で３分間の変性を１サイクル；９４℃で１．５分間、６５℃で１分間のアニーリング、次いで７２℃で１．５分間の伸長を２５サイクル；及び７２℃で１０分間を１サイクル。一次ＰＣＲと二次ＰＣＲの間、及び二次ＰＣＲの後には、増幅したＤＮＡフラグメントを精製した。
【００３６】
種々の抗体フラグメントのＤＮＡからなる最終ＰＣＲ産物を集め、適切な制限酵素で消化した。消化したＤＮＡフラグメントであり、ＩｇＥ Ｆｄ領域やκ鎖やλ鎖をコードするＤＮＡフラグメントをファージミドベクターに連結し、そのファージミドベクターでE. coliＸＬ−１ Ｂｌｕｅを形質転換して１０6個の独立したクローンからなるＦａｂ−κライブラリー及びＦａｂ−λライブラリーを得た。ファージ粒子上のＦａｂフラグメントの発現に関わる問題を防止するために、ｓｃＦｖ形式の抗体ライブラリーを構築した。ヒトＩｇＥ ｓｃＦｖ−κ及びｓｃＦｖ−λライブラリーを構築するために種々のライブラリーからファージミドＤＮＡを単離して、ヒトＩｇＥ Ｈ鎖及びヒトＩｇＥ Ｌ鎖の可変領域を増幅するための鋳型ＤＮＡとして用いた。
【００３７】
Ｈ鎖の可変領域のＰＣＲ増幅をヒトＶH特異的プライマー（ＶＨ１−ＶＨ４及びＶＨ１Ａ）を用いて行った。Ｌ鎖の可変領域の増幅を以下のプライマーペアを用いて行った：ヒトκ鎖の増幅にはＶκ１−Ｖκ７，Ｖκ２−Ｖκ８，Ｖκ３−Ｖκ９，Ｖκ４−Ｖκ１０，Ｖκ５−Ｖκ１１及びＶκ６−Ｖκ１１を用い、ヒトλ鎖の増幅にはＶλ１−Ｖλ８，Ｖλ２−Ｖλ９，Ｖλ３−Ｖλ９，Ｖλ４−Ｖλ９，Ｖλ５−Ｖλ１０，Ｖλ６−Ｖλ１０及びＶλ７−Ｖλ１０を用いた（表３及び表４参照）。ｓｃＦｖファージディスプレイベクター（図３）に連結するために、増幅したＤＮＡフラグメントを精製し消化した。連結用混合物でE. coliＸＬ−１ Ｂｌｕｅを形質転換し、約１０5個の独立したクローンからなるヒトＩｇＥ ｓｃＦｖ−κライブラリー及びｓｃＦｖ−λライブラリーを得た。
【００３８】
ＩＩ．ヒトｓｃＦｖライブラリーの選択
ヒトｓｃＦｖ−κライブラリー及びｓｃＦｖ−λライブラリーをファージディスプレイ法(McCafferty et al., 1990; Barbas et al., 1991)により選択した。ヘベイン結合性抗体フラグメントを単離するために、バクテリオファージの表面に提示されたヒトＩｇＥ ｓｃＦｖ−κライブラリー及びｓｃＦｖ−λライブラリーを集め、親和性パニング法（affinity panning procedure）（図２）を用いてパニングを行った。はじめにファージプールをビオチン化した免疫反応性のヘベイン又はビオチン化したコントロールタンパク質（バックグラウンド）と１．５時間反応させた。その後、ファージプールをビオチン結合性ストレプトアビジンでコートしたマイクロタイタープレートのウェルに移した。３０分間インキュベートした後、ウェルを３回ＰＢＳで洗浄し、結合物を酸性緩衝液（１００ｍＭ ＨＣｌ、ｐＨ２．２）で溶出し、２Ｍトリス溶液で直ちに中和した。続くパニングラウンドのために、溶出したファージプールをE. coliＸＬ−１ Ｂｌｕｅに感染させて増幅した。パニングは５ラウンド行った。
【００３９】
ＩＩＩ．ヘベイン結合性物質の特徴づけ
最後のパニングサイクル終了後、可溶性ｓｃＦｖフラグメントを発現させるために、ｓｃＦｖファージディスプレイＤＮＡを単離し、単離したＤＮＡでE. coliＨＢ２１５１(supE - )の形質転換を行った。ｓｃＦｖファージディスプレイベクターは、そのｓｃＦｖ配列とファージ遺伝子ＩＩＩ配列との間に、supE + 遺伝子型のE. coli株ではグルタミン酸に翻訳され、supE - 遺伝子型のE. coli株では終止コドンに翻訳されるＴＡＧアンバー終止コドンを含む。６２個の独立したクローンの小規模培養を実施し、予備的な特徴づけに用いる可溶性ｓｃＦｖフラグメントを製造した。クローンは、ヘベイン特異的結合性物質物を捕捉するためのヘベインでコートしたウェルと非特異的な結合を検出するためのコントロールタンパク質でコートしたウェルを用いたＥＬＩＳＡで分析した（データは示さない）。ほとんどのクローンは高い親和性でヘベインに結合した。最も見込みのあるクローンのうち１９個の配列を決定し(Sanger et al., 1977)、そのうちの２個のクローンを更なる特徴づけのために選択した（図４及び５）。
【００４０】
実施例２
ヘベイン結合特異性を有するヒトＦａｂフラグメントのクローニング及び特徴づけ
本実施例においては、ヘベイン結合特異性を有するヒトＩｇＥ ｓｃＦｖをＩｇＧ１サブタイプに属するヒトＦａｂフラグメントに変換した。多量体の形成が難しいことが知られていることから、ｓｃＦｖ抗体ライブラリーから得られたｓｃＦｖフラグメントの１Ａ４ ｓｃＦｖ及び１Ｃ２ ｓｃＦｖをクローニングし、細菌にＦａｂフラグメントとして発現させた(Holliger et al., 1993; Desplancq et al., 1994)。得られた抗体フラグメントの更なる特徴づけを競合的ＥＬＩＳＡ法で行った。
【００４１】
Ｉ．ヘベイン結合特異性を有するヒトＦａｂフラグメントのクローニング
Ｆｄ領域をオーバーラッピングＰＣＲ(overlapping PCR)で増幅した。ＰＣＲに用いたプライマーを表５に示す。
【００４２】
上記で得られたＦｄ領域ｃＤＮＡ及びＬ鎖ｃＤＮＡをバクテリアの発現ベクターであるｐＫＫｔａｃにクローニングし、E. coliＲＶ３０８を形質転換した。１Ａ４Ｇ及び１Ｃ２Ｇと命名した可溶性Ｆａｂフラグメントが産生され、これらのＦａｂフラグメントはそのＣ末端に導入したヘキサヒスチジニルタグを用いてニッケルを固定したセファロースカラムで実質的に純粋になるまで精製した（データは示さない）。
【００４３】
ＩＩ.ヒトＦａｂフラグメントの特徴づけ
精製した１Ａ４Ｇ及び１Ｃ２Ｇの特徴づけを競合的ＥＬＩＳＡ法によって行った。始めに、ラテックスポリペプチド濃度の増加する系列を用いてサンプル（１Ａ４Ｇ及び１Ｃ２Ｇ）とラテックスポリペプチドをインキュベートした。ラテックスポリペプチドはラテックス製の実験用手袋からAleniusと共同研究者ら(1996)に従って単離したものを使用した。インキュベートした反応混合物をアレルゲン性ＧＦＰ−ヘベイン融合タンパク質でコートしたマイクロタイタプレートのウェルに添加した。使用したラテックスポリペプチドの調製物は高いラテックスアレルギー活性を有していた（データは示さない）。図６は競合的ＥＬＩＳＡの結果を示す。ヘベインに対する１Ａ４Ｇの結合（図６ａ）及び１Ｃ２Ｇの結合（図６ｂ）は、天然ヘベインの添加量が増加することで阻害することができた。
【００４４】
ＩｇＥ抗体はアレルゲン性エピトープに特異的に結合する。１Ａ４Ｇ抗体の結合特性を更に詳細に検討するために、アレルゲン性エピトープを包含するペプチドとの競合的ＥＬＩＳＡを行った（図７）。Banerjeeと共同研究者ら(1997)はヘベインのアレルゲン性エピトープについて研究し、重要なアレルゲン性エピトープであると考えられる２つのペプチド、６量体と１３量体、を見出した。競合的ＥＬＩＳＡにおいて、固定したヘベインに対する１Ａ４Ｇの結合はアレルゲン性エピトープであるペプチドによって阻害された。異なる競合的ＥＬＩＳＡで得られたこれらの結果は、抗体ライブラリーから単離された抗体が天然ヘベインと同様に組換えヘベインに特異的に結合しうることを示す。更に、予備実験の結果は、１Ａ４Ｇ抗体がヘベインのアレルゲン性エピトープに特異的に結合することを示す。
【００４５】
【表１】
【００４６】
【表２】
【００４７】
【表３】
【００４８】
【表４】
【００４９】
【表５】
【００５０】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】図１は、完全なヒトＩｇＥサブクラス抗体、Ｆａｂフラグメント及び１本鎖抗体（ｓｃＦｖ）の該略図であり、抗原結合部位は三角形で示す。以下、構造を示す図面はいずれも実寸ではない。
【図２】図２は、パニング法の概略図である。
【図３】図３は、ｓｃＦｖファージライブラリーの構築に使用したｓｃＦｖファージディスプレイベクターの概略図である。
【図４】図４は、１Ａ４抗体及び１Ｃ２抗体のＨ鎖の可変領域の推定されるアミノ酸配列である。相補的決定部（ＣＤＲ）を下線で示した。アミノ酸番号はKabat (Kabat et al., 1991)のものに準じた。
【図５】図５は、１Ａ４抗体及び１Ｃ２抗体のＬ鎖の可変領域の推定されるアミノ酸配列である。相補的決定部（ＣＤＲ）を下線で示した。アミノ酸番号はKabat (Kabat et al., 1991)のものに準じた。
【図６ａ】図６ａは、ヒトＩｇＧ１サブタイプに属する１Ａ４Ｆａｂフラグメントの競合的ＥＬＩＳＡで得られた曲線であり、ラテックスポリペプチドによるヘベイン結合阻害を示す。
【図６ｂ】図６ｂは、ヒトＩｇＧ１サブタイプに属する１Ｃ２Ｆａｂフラグメントの競合的ＥＬＩＳＡで得られた曲線であり、ラテックスポリペプチドによるヘベイン結合阻害を示す。
【図７】図７は、競合的ＥＬＩＳＡの結果であって、ヒトＩｇＧ１サブタイプに属する１Ａ４Ｆａｂフラグメントの有するヘベイン結合性は、ヘベインのアレルゲン性エピトープ(６量体と１３量体)により阻害されることを示す。
【配列表フリーテキスト】
【００５２】
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配列番号８４ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号８５ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号８７ 配列中の３１〜３７番アミノ酸、５２〜６７番アミノ酸及び１０１〜１１７番アミノ酸はＣＤＲである。
配列番号８８ 配列中の３１〜３７番アミノ酸、５２〜６７番アミノ酸及び１０１〜１１９番アミノ酸はＣＤＲである。
配列番号８９ 配列中の２４〜３５番アミノ酸、５１〜５７番アミノ酸及び９０〜９８番アミノ酸はＣＤＲである。
配列番号９０ 配列中の２４〜３４番アミノ酸、５０〜５６番アミノ酸及び８９〜９７番アミノ酸はＣＤＲである。
配列番号９１ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
【０００１】
本発明は抗体工学技術に関する。更に詳細には、本発明は、アレルゲン性ヘベインに対して高い親和性と特異性をもって結合する、ヒトＩｇＥ抗体及びその誘導体に関する。また、本発明は、上記のヘベイン結合性モノクローナル抗体を作製したり改変したりするための方法、並びにこのような抗体やその誘導体を免疫学的診断の分野で使用するための方法を提供する。本発明によって、生物学的サンプル及び原料サンプル中のアレルゲン性ヘベインの定性的及び定量的測定と共に、免疫学的治療も可能となり、その結果、アレルギー患者におけるアレルゲン性ヘベインの活性阻害が可能となる。
【背景技術】
【０００２】
世界の人口のおよそ２０％がアレルギーに苦しんでいる。このため、アレルギーは深刻さの増している健康問題である。アレルギーとは、空気、食物又は水に存在する通常は害のない物質に対する過敏反応である（Corry and Kheradmand, 1999）。新規な外来の異質物が、それを体内から排除することを目的とする反応、つまりアレルギー反応を引き起こす。即時型又はＩ型過敏反応とも呼ばれるＩｇＥ仲介アレルギー反応においては、生体が外来物質であるアレルゲンに初めて曝された時に、ＩｇＥ産生Ｂ細胞が可溶性ＩｇＥ分子の産生を始める。そして可溶性ＩｇＥ分子は、種々の細胞、最も重要なものとしてはマスト細胞の表面に存在する高親和性ＩｇＥレセプターに結合する。生体が同じ外来物質に再び遭遇すると、レセプター結合ＩｇＥ分子とアレルゲンとの交差結合が生じ、その結果、細胞が活性化されて、アレルギー反応の徴候及び症状を誘発する毒性物質であるヒスタミンなどが放出される。
【０００３】
ラテックスアレルギーは患者数が増加している深刻な医療問題である(Slater, 1994; Turjanmaa et al., 1996)。ラテックスは複合細胞内産物であり、ゴムの木であるHevea brasiliensisの乳細胞によって産生される乳液である。ラテックスは、例えば手袋、風船及びコンドームといった種々の日用品並びに医療用品の製造に用いられている。ラテックスアレルギーは特に医療関係従事者、ゴム工業就労者及び数回の外科的処置を受けた患者の間で深刻な問題となっている。ラテックスアレルギーは、花粉アレルギー及び食物アレルギーとの関連が報告されている(Nel and Gujuluva, 1998)。ラテックスアレルゲンと食物アレルゲンの交差反応性は、ラテックス−果物症候群として確立されており、これはヘベイン様タンパク質ドメイン又は類似のエピトープの反応性が原因であると考えられる(Brehler et al., 1997; Chen et al., 1998; Mikkola et al., 1998)。多くのラテックスタンパク質はアレルゲンとして同定されている(Breiteneder and Scheiner, 1998)。主要なラテックスアレルゲンの一つはヘベインであり、ヘベインは、例えば数種のキチン含有真菌の感染抑制に関与する防御タンパク質である(Lee et al., 1991; Alenius et al., 1996; Chen et al., 1997)。ヘベインは４３個のアミノ酸からなり、４個のジスルフィド結合を有する小さなキチン結合性タンパク質である。その三次元構造はＸ線解析及びＮＭＲによって決定されている(Rodriguez-Romero et al., 1991; Andersen et al., 1993)。
【０００４】
ＩｇＥ抗体はアレルゲン性エピトープを特異的に認識するので、臨床又は免疫学的診断において複合材料のアレルゲン濃度を検出及び決定するために有用である。さらに、アレルゲン性エピトープは、通常、タンパク質の免疫原性エピトープとは異なる。このことは、ハイブリドーマ技術などの従来の方法による、アレルゲン性エピトープに特異的な結合を示すモノクローナル抗体の産生の妨げとなっている。アレルゲン特異的ＩｇＥ抗体の開発がファージディスプレイ法によって可能なことが最近報告示されている(Steinberger et al., 1996)。この方法は、臨床及び診断に使用するためのアレルゲン特異的組み換え抗体を一定の質を保持しながら産生するための新たな手段を提供する。
【０００５】
発明の概要
本発明においては、イムノアッセイや免疫学的治療のための試薬として用いることのできる、ヒトＩｇＥ抗体フラグメントの開発及び特徴づけを開示する。本発明のヒトＩｇＥ抗体フラグメントは、生物学的試料中のヘベインを定性的及び定量的に測定するために設計したイムノアッセイ用の試薬及びアレルギー患者の免疫学的治療に用いるのに十分な高い親和性及び特異性を有する。具体的には、本発明は、ヘベインに特異的なヒトＩｇＥ抗体のファージディスプレイ法による選択、及びE. coliを用いて産生した、改変された抗体断片の結合特性の特徴づけについて開示する。
【０００６】
従って、本発明は、種々のイムノアッセイ法及びヒトの免疫学的治療に使用するための新規な試薬を提供する。また、本発明によって、均一な品質を保持する上記の特異的な試薬を継続的に供給することが保証され、ポリクローナル抗血清に固有のバッチ間の品質のばらつきという問題を排除した。これらの有用な効果によって、本発明は、均一な品質の、新規であり、特異的であり且つ経済的な免疫学的診断方法の製造を可能にする。
【０００７】
上記から明かなように、本発明の特定の目的の一つは、ヒトＩｇＥモノクローナル抗体、その機能的フラグメント又はそれらの誘導体（以下、屡々、「モノクローナル抗体、その機能的フラグメント又はそれらの誘導体」をまとめて「ヘベイン結合性物質」と称する）であって、生物学的サンプル中のヘベインの定性的及び定量的測定に使用するのに十分な高いヘベイン親和性及び特異性を有するものを提供する。さらに本発明は、免疫学的治療に使用することを特徴とする、上記のヘベイン結合性物質も提供する。本発明のモノクローナル抗体はアレルゲン性ヘベインに特異的な結合性を示す。
【０００８】
本発明の他の目的の一つは、ヘベイン特異的抗体鎖をコードするｃＤＮＡクローンのみならず、該クローンを発現させてヘベイン結合性物質を産生するための構築物や方法を提供することである。
【０００９】
本発明の更なる目的の一つは、モノクローナル抗体、その機能的フラグメント又はそれらの誘導体を単独又は組み合わせて用いることで、生物学的サンプル中のヘベインを定性的及び定量的に測定する方法を提供することである。更に、本発明は、アレルギー患者の免疫学的治療に使用するためのモノクローナル抗体、その機能的フラグメント又はそれらの誘導体およびそれらを組み合わせて得られるヘベイン結合性物質を提供する。
【００１０】
本発明の諸目的、諸特徴及び諸利益は、添付の図面及び詳細な説明の記載から明らかになる。しかしながら、以下の詳細な説明及び実施例は本発明の好ましい態様を示すものの、あくまでもそれを例示しているに過ぎず、本発明の精神及び発明の範囲内で行われる種々の変更及び改良は、以下の詳細な説明より当業者には明らかであることを理解されたい。
【００１１】
発明の詳細の説明
本願明細書で使用した用語の一部について、その定義を提供する。「免疫グロブリン」、「Ｈ鎖」、「Ｌ鎖」及び「Ｆａｂ」は欧州特許願第０１２５０２３号と同様に使用した。
【００１３】
本願明細書において使用した種々の活用形の「抗体」という用語は集合名詞であり、免疫グロブリン分子及び／又は免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部位、即ち抗原結合部位又はパラトープ、の総称である。
【００１４】
「抗原結合性部位」又は「パラトープ」とは、抗体分子において、抗原に特異的に結合する構造上の部位である。
【００１５】
抗体の例としては、免疫グロブリン分子の一部分であってパラトープを含む部分、例えばＦａｂやＦｖが挙げられる。
【００１６】
「Ｆａｂ」（特異的抗原結合性を有するフラグメント）とは、公知の方法によって実質的に完全な抗体をパパインによるタンパク質分解に付すことで得られる抗体の一部分である。例えば、米国特許第４，３４２，５６６号を参照されたい。Ｆａｂフラグメントは遺伝子組換え法によって産生することもでき、このような方法は当業者にはよく知られている。例えば、米国特許第４，９４９，７７８号を参照されたい。
【００１７】
「ドメイン」は、タンパク質の独立した折りたたみ部分を意味する。天然のタンパク質におけるドメイン間の境界に関する一般的な構造上の定義については、Argos, 1988を参照されたい。
【００１８】
「可変ドメイン」又は「Ｆｖ」とは、免疫グロブリン分子中に存在し、抗原又はハプテンの結合を担う領域をである。通常この領域は、免疫グロブリン分子のＬ鎖及びＨ鎖のそれぞれのＮ末端から数えて約１００個のアミノ酸からなる領域である。
【００１９】
「一本鎖抗体」（ｓｃＦｖ）とは、抗体のＨ鎖及びＬ鎖のそれぞれの可変ドメインがリンカーペプチドを介して結合した連続したアミノ酸鎖であって、一本のｍＲＮＡ分子（転写物）から合成されたものである。
【００２０】
「リンカー」又は「リンカーペプチド」とは、天然又は工学的に作られたタンパク質中の隣接する２つのドメインの間に存在するアミノ酸配列である。
【００２１】
「ヘベイン結合性抗体」とは、抗体の可変領域が仲介する相互作用によってヘベインを特異的に認識して結合する抗体である。
【００２２】
上記抗体の機能的フラグメントであって、本発明の範囲に属するものの例として、ｓｃＦｖフラグメントである１Ａ４及び１Ｃ２を図４及び図５に開示した。本発明の一つの好ましい態様においては、ヘベイン結合性抗体の誘導体、例えばＦａｂフラグメントやｓｃＦｖフラグメント、を提供する。更に他の誘導体としては、ＣＤＲ配列又は完全なＶL及びＶH配列の変異型であって、結合力に実質的に影響を与えない１つ以上の同類置換(conservative substitutions)を有するものを用いることもできる。
【００２３】
イムノアッセイ、例えば生物学的サンプル中のヘベインを定性的又は定量的な検出、に使用する本発明のヘベイン結合性物質を標識してもよい。この目的のためには、従来から抗体の標識に用いられているいかなる種類の標識も用いることができる。
【００２４】
免疫学的治療、例えばアレルギー患者のアレルゲン性ヘベインの結合阻害、に使用するためにも、本発明のヘベイン結合性物質を標識してもよい。この目的のためには、薬学的に許容され、従来から抗体の標識に用いられている標識が適当である。
【００２５】
本発明の他の一つの態様においては、ヘベイン結合性物質をコードするＤＮＡであるか、該ＤＮＡの断片であって、ＶL及び／又はＶH領域の相補性決定部（ＣＤＲ）をコードするＤＮＡ断片である、ＤＮＡ分子を提供する。本発明のＤＮＡ分子はベクター、具体的には、例えば、本発明の抗体の誘導体、少なくとも１つの抗体鎖又は抗体鎖の一部を発現可能なベクター、にクローニングされていてもよい。
【００２６】
本発明の更なる一つの態様においては、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞及び哺乳類細胞からなる群より選ばれる細胞であって、本発明のＤＮＡ分子を含み、本発明のヘベイン結合性物質を発現することが可能な宿主細胞を提供する。したがって、本発明の抗体誘導体は、少なくとも１種の抗体鎖を発現しうる本発明の宿主細胞を培養し、そして宿主細胞の産生した目的タンパク質を回収することで製造するか、必要であれば、タンパク質を回収した後に、更に該タンパク質の抗体鎖を構成する複数のドメインを包含するドメイン複合体を調製することによって製造することもできる。
【００２７】
上記のｓｃＦｖフラグメントは、アレルゲン性組換えヘベインを用いてヒトＩｇＥ ｓｃＦｖファージライブラリーのバイオパニング（biopanning）によって得たものである。ヒトＩｇＥ ｓｃＦｖファージライブラリーは、ラテックスアレルギー患者のリンパ球から単離したｍＲＮＡから構築したものである。Ｌ鎖及びＨ鎖の可変領域のｃＤＮＡは、Ｆｄ ｃＤＮＡ用のヒトＩｇＥに特異的なプライマーを用いて合成し、ヒトＬ鎖のカッパ（κ）鎖及びラムダ（λ）鎖はヒトκ鎖及びλ鎖に特異的なプライマーを用いて合成した。Ｌ鎖及びＨ鎖の可変領域は、ＶκとＶλ ｃＤＮＡ用のヒトκ鎖特異的プライマーとλ鎖特異的プライマー及びＶH ｃＤＮＡ用のヒトＩｇＥ特異的プライマーを用いてそれぞれＰＣＲによって増幅した。これらのＰＣＲプライマーに導入しておいた制限部位を利用して、ｓｃＦｖファージディスプレイベクターに可変領域のｃＤＮＡをクローニングし、ヒトＩｇＥ ｓｃＦｖライブラリーを構築した。
【００２８】
パニング法を利用したファージディスプレイによってヒトＩｇＥ ｓｃＦｖライブラリーを選択した。ヒトＩｇＥ ｓｃＦｖファージライブラリーのスクリーニングを溶液中のビオチン化したアレルゲン性組換えヘベインで行い、結合物をストレプトアビジン上に捕捉した。ファージの溶出を１００ｍＭ ＨＣｌ（ｐＨ２．２）で行い、次いで２Ｍトリス溶液で直ちに中和した。ファージ溶出液をE. coli細胞で増幅した。バイオパニングを５ラウンド繰り返した後、単離したファージから可溶性のｓｃＦｖフラグメントを調製した。選択したｓｃＦｖフラグメントの結合特異性をＥＬＩＳＡで検出した。数種のヘベイン特異的ｓｃＦｖフラグメントクローンを得た。
【００２９】
本願明細書に記載したように、ファージディスプレイ法は、診断及び治療に適用するためのヒトＩｇＥ組換え抗ヘベイン抗体を開発するための有効かつ簡便な方法である。
【００３０】
本発明の抗体フラグメントを得るために有効な選択方法の一つを記載したが、本発明の抗体フラグメントを得ることが可能な多数の応用方法も当業者には明らかとなる。ｓｃＦｖフラグメント又はその誘導体のファージディスプレイライブラリー又は微生物ディスプレイライブラリーから本発明のｓｃＦｖフラグメントを直接選択することが可能であることは明らかなはずである。本発明のｓｃＦｖフラグメント又は他の抗体フラグメントを表面タンパク質との融合タンパク質として提示するファージ又は微生物細胞は、本発明の更なる態様の一つである。
【００３１】
微生物細胞による本発明のヘベイン結合性物質の発現は、免疫診断アッセイ及び免疫学的治療に適した均一な品質の高特異性試薬を効率よく且つ経済的に製造するための手段を提供する一方で、このような試薬又はその少なくとも一部が合成可能であることを示している。従来の遺伝子工学的手法を適用することにより、初めに得られた本発明の抗体フラグメントをその結合特性を実質的に変えることなく改変する（例えば、新たな配列を連結する）ことができる。このような手法は、上記で定義したヘベインに対する親和性及び特異性の両方を保持する新規なヘベイン結合性ハイブリッドタンパク質の製造にも用いることができる。
【００３２】
ヒトヘベイン結合性組換え抗体の開発及び特徴づけ、並びにイムノアッセイにおけるその有用性について、以下の実施例において詳細に説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
実施例１
ファージディスプレイ選択法による組換えヘベイン特異的ｓｃＦｖフラグメントの調製
本実施例においては、ヘベインに対する親和性及び特異性を有するｓｃＦｖフラグメントを単離するために、ヒトＩｇＥ ｓｃＦｖライブラリーを構築し、アレルゲン性ヘベインによる選択を行った。ＩｇＥ Ｆａｂ−κライブラリー及びＩｇＥ Ｆａｂ−λライブラリーを初めに構築することによってヒトＩｇＥファージライブラリーを間接的に構築し、その後、特定のライブラリーのＤＮＡを用いてＨ鎖及びＬ鎖の可変ドメインをコードするＤＮＡをＰＣＲで増幅した。
【００３４】
Ｉ．ヒトＩｇＥ ｓｃＦｖファージライブラリーの構築
ヘパリンを加えた血液１００ｍｌをラテックスアレルギー患者から得た。リンパ球をIg-Prime Kit Protocol（Novagen社製）に従って次の手順で単離した。血液１０ｍｌあたり３０ｍｌの溶解緩衝液（１５５ｍＭのＮＨ4Ｃｌ、１０ｍＭのＮＨ4ＨＣＯ3、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ＝７．４）を加え、時々振とうさせながら氷上で１５分間インキュベートした。４５０ｇで１０分間遠心分離した後、リンパ球、即ち白血球ペレット、を回収した。回収したペレットを溶解緩衝液で２回洗浄し、最後の遠心分離の後に得られたリンパ球ペレットをＤ−溶液（D-solution）に再懸濁した。リンパ球ＲＮＡをPromega社のRNAgents Total RNA Isolation kitを用いて製造者のマニュアルに従って単離した。初めのｃＤＮＡ合成はPromega社のReverse Transcription system kitを用いて行った。ＦｄフラグメントｃＤＮＡ及びＬ鎖ｃＤＮＡの合成には、イプシロン（ε）鎖の定常領域のプライマー（Ｃε１及びＣε２）、並びにカッパ鎖のプライマー（Ｃκ１）とラムダ鎖のプライマー（Ｃλ１）をそれぞれ用いた。ヒトＩｇＥ Ｆｄ領域及びＬ鎖のｃＤＮＡ合成及びＰＣＲ増幅に用いたプライマーを表１及び表２に示す。
【００３５】
ＰＣＲ増幅は２段階、具体的にはｃＤＮＡテンプレートからＦｄ鎖及びＬ鎖を増幅するための一次ＰＣＲと、一次ＰＣＲで得たＤＮＡフラグメントの５'末端に制限部位を加えるための二次ＰＣＲで行った。まず、Ｈ鎖の可変領域に特異的なプライマー（ＶＨ１ａ−ＶＨ７ａ）及びＣε１ＮｏｔＩプライマーを用いてＦｄ領域をＰＣＲで増幅した。次に、Ｌ鎖であるκ鎖及びλ鎖をＬ鎖の可変領域に特異的なプライマー（それぞれＶκ１ａ−Ｖκ６ｂとＶλ１ａ−Ｖλ１０）及びＣε１ＮｏｔＩプライマーを用いて増幅した。二次ＰＣＲでは、Ｆｄ領域のＰＣＲ増幅にはＣκ１、Ｖκ／λ１及びＣε２プライマーを用い、κ鎖のＰＣＲ増幅にはＶκ／λ１及びＣλ１プライマーを用い、λ鎖のＰＣＲ増幅にはＶλ１Ａ及びＣκ／λ１プライマーを用いた。一次ＰＣＲは以下の条件で行った：９３℃で３分間の変性を１サイクル；９３℃で１分間、６３℃で３０秒及び５８℃で５０秒のアニーリング、次いで７２℃で１分間の伸長を７サイクル；９３℃で１分間、６３℃で３０秒及び７２℃で１分間を２３サイクル；最後に７２℃で１０分間を１サイクル。二次ＰＣＲは以下の条件で行った：９５℃で３分間の変性を１サイクル；９４℃で１．５分間、６５℃で１分間のアニーリング、次いで７２℃で１．５分間の伸長を２５サイクル；及び７２℃で１０分間を１サイクル。一次ＰＣＲと二次ＰＣＲの間、及び二次ＰＣＲの後には、増幅したＤＮＡフラグメントを精製した。
【００３６】
種々の抗体フラグメントのＤＮＡからなる最終ＰＣＲ産物を集め、適切な制限酵素で消化した。消化したＤＮＡフラグメントであり、ＩｇＥ Ｆｄ領域やκ鎖やλ鎖をコードするＤＮＡフラグメントをファージミドベクターに連結し、そのファージミドベクターでE. coliＸＬ−１ Ｂｌｕｅを形質転換して１０6個の独立したクローンからなるＦａｂ−κライブラリー及びＦａｂ−λライブラリーを得た。ファージ粒子上のＦａｂフラグメントの発現に関わる問題を防止するために、ｓｃＦｖ形式の抗体ライブラリーを構築した。ヒトＩｇＥ ｓｃＦｖ−κ及びｓｃＦｖ−λライブラリーを構築するために種々のライブラリーからファージミドＤＮＡを単離して、ヒトＩｇＥ Ｈ鎖及びヒトＩｇＥ Ｌ鎖の可変領域を増幅するための鋳型ＤＮＡとして用いた。
【００３７】
Ｈ鎖の可変領域のＰＣＲ増幅をヒトＶH特異的プライマー（ＶＨ１−ＶＨ４及びＶＨ１Ａ）を用いて行った。Ｌ鎖の可変領域の増幅を以下のプライマーペアを用いて行った：ヒトκ鎖の増幅にはＶκ１−Ｖκ７，Ｖκ２−Ｖκ８，Ｖκ３−Ｖκ９，Ｖκ４−Ｖκ１０，Ｖκ５−Ｖκ１１及びＶκ６−Ｖκ１１を用い、ヒトλ鎖の増幅にはＶλ１−Ｖλ８，Ｖλ２−Ｖλ９，Ｖλ３−Ｖλ９，Ｖλ４−Ｖλ９，Ｖλ５−Ｖλ１０，Ｖλ６−Ｖλ１０及びＶλ７−Ｖλ１０を用いた（表３及び表４参照）。ｓｃＦｖファージディスプレイベクター（図３）に連結するために、増幅したＤＮＡフラグメントを精製し消化した。連結用混合物でE. coliＸＬ−１ Ｂｌｕｅを形質転換し、約１０5個の独立したクローンからなるヒトＩｇＥ ｓｃＦｖ−κライブラリー及びｓｃＦｖ−λライブラリーを得た。
【００３８】
ＩＩ．ヒトｓｃＦｖライブラリーの選択
ヒトｓｃＦｖ−κライブラリー及びｓｃＦｖ−λライブラリーをファージディスプレイ法(McCafferty et al., 1990; Barbas et al., 1991)により選択した。ヘベイン結合性抗体フラグメントを単離するために、バクテリオファージの表面に提示されたヒトＩｇＥ ｓｃＦｖ−κライブラリー及びｓｃＦｖ−λライブラリーを集め、親和性パニング法（affinity panning procedure）（図２）を用いてパニングを行った。はじめにファージプールをビオチン化した免疫反応性のヘベイン又はビオチン化したコントロールタンパク質（バックグラウンド）と１．５時間反応させた。その後、ファージプールをビオチン結合性ストレプトアビジンでコートしたマイクロタイタープレートのウェルに移した。３０分間インキュベートした後、ウェルを３回ＰＢＳで洗浄し、結合物を酸性緩衝液（１００ｍＭ ＨＣｌ、ｐＨ２．２）で溶出し、２Ｍトリス溶液で直ちに中和した。続くパニングラウンドのために、溶出したファージプールをE. coliＸＬ−１ Ｂｌｕｅに感染させて増幅した。パニングは５ラウンド行った。
【００３９】
ＩＩＩ．ヘベイン結合性物質の特徴づけ
最後のパニングサイクル終了後、可溶性ｓｃＦｖフラグメントを発現させるために、ｓｃＦｖファージディスプレイＤＮＡを単離し、単離したＤＮＡでE. coliＨＢ２１５１(supE - )の形質転換を行った。ｓｃＦｖファージディスプレイベクターは、そのｓｃＦｖ配列とファージ遺伝子ＩＩＩ配列との間に、supE + 遺伝子型のE. coli株ではグルタミン酸に翻訳され、supE - 遺伝子型のE. coli株では終止コドンに翻訳されるＴＡＧアンバー終止コドンを含む。６２個の独立したクローンの小規模培養を実施し、予備的な特徴づけに用いる可溶性ｓｃＦｖフラグメントを製造した。クローンは、ヘベイン特異的結合性物質物を捕捉するためのヘベインでコートしたウェルと非特異的な結合を検出するためのコントロールタンパク質でコートしたウェルを用いたＥＬＩＳＡで分析した（データは示さない）。ほとんどのクローンは高い親和性でヘベインに結合した。最も見込みのあるクローンのうち１９個の配列を決定し(Sanger et al., 1977)、そのうちの２個のクローンを更なる特徴づけのために選択した（図４及び５）。
【００４０】
実施例２
ヘベイン結合特異性を有するヒトＦａｂフラグメントのクローニング及び特徴づけ
本実施例においては、ヘベイン結合特異性を有するヒトＩｇＥ ｓｃＦｖをＩｇＧ１サブタイプに属するヒトＦａｂフラグメントに変換した。多量体の形成が難しいことが知られていることから、ｓｃＦｖ抗体ライブラリーから得られたｓｃＦｖフラグメントの１Ａ４ ｓｃＦｖ及び１Ｃ２ ｓｃＦｖをクローニングし、細菌にＦａｂフラグメントとして発現させた(Holliger et al., 1993; Desplancq et al., 1994)。得られた抗体フラグメントの更なる特徴づけを競合的ＥＬＩＳＡ法で行った。
【００４１】
Ｉ．ヘベイン結合特異性を有するヒトＦａｂフラグメントのクローニング
Ｆｄ領域をオーバーラッピングＰＣＲ(overlapping PCR)で増幅した。ＰＣＲに用いたプライマーを表５に示す。
【００４２】
上記で得られたＦｄ領域ｃＤＮＡ及びＬ鎖ｃＤＮＡをバクテリアの発現ベクターであるｐＫＫｔａｃにクローニングし、E. coliＲＶ３０８を形質転換した。１Ａ４Ｇ及び１Ｃ２Ｇと命名した可溶性Ｆａｂフラグメントが産生され、これらのＦａｂフラグメントはそのＣ末端に導入したヘキサヒスチジニルタグを用いてニッケルを固定したセファロースカラムで実質的に純粋になるまで精製した（データは示さない）。
【００４３】
ＩＩ.ヒトＦａｂフラグメントの特徴づけ
精製した１Ａ４Ｇ及び１Ｃ２Ｇの特徴づけを競合的ＥＬＩＳＡ法によって行った。始めに、ラテックスポリペプチド濃度の増加する系列を用いてサンプル（１Ａ４Ｇ及び１Ｃ２Ｇ）とラテックスポリペプチドをインキュベートした。ラテックスポリペプチドはラテックス製の実験用手袋からAleniusと共同研究者ら(1996)に従って単離したものを使用した。インキュベートした反応混合物をアレルゲン性ＧＦＰ−ヘベイン融合タンパク質でコートしたマイクロタイタプレートのウェルに添加した。使用したラテックスポリペプチドの調製物は高いラテックスアレルギー活性を有していた（データは示さない）。図６は競合的ＥＬＩＳＡの結果を示す。ヘベインに対する１Ａ４Ｇの結合（図６ａ）及び１Ｃ２Ｇの結合（図６ｂ）は、天然ヘベインの添加量が増加することで阻害することができた。
【００４４】
ＩｇＥ抗体はアレルゲン性エピトープに特異的に結合する。１Ａ４Ｇ抗体の結合特性を更に詳細に検討するために、アレルゲン性エピトープを包含するペプチドとの競合的ＥＬＩＳＡを行った（図７）。Banerjeeと共同研究者ら(1997)はヘベインのアレルゲン性エピトープについて研究し、重要なアレルゲン性エピトープであると考えられる２つのペプチド、６量体と１３量体、を見出した。競合的ＥＬＩＳＡにおいて、固定したヘベインに対する１Ａ４Ｇの結合はアレルゲン性エピトープであるペプチドによって阻害された。異なる競合的ＥＬＩＳＡで得られたこれらの結果は、抗体ライブラリーから単離された抗体が天然ヘベインと同様に組換えヘベインに特異的に結合しうることを示す。更に、予備実験の結果は、１Ａ４Ｇ抗体がヘベインのアレルゲン性エピトープに特異的に結合することを示す。
【００４５】
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【表５】
参考文献
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Turjanmaa, K., Alenius, H., Makinen-Kiljunen, S., Reunala, T, and Palosuo, T. (1996) Allergy 51, 593-602.
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】図１は、完全なヒトＩｇＥサブクラス抗体、Ｆａｂフラグメント及び１本鎖抗体（ｓｃＦｖ）の該略図であり、抗原結合部位は三角形で示す。以下、構造を示す図面はいずれも実寸ではない。
【図２】図２は、パニング法の概略図である。
【図３】図３は、ｓｃＦｖファージライブラリーの構築に使用したｓｃＦｖファージディスプレイベクターの概略図である。
【図４】図４は、１Ａ４抗体及び１Ｃ２抗体のＨ鎖の可変領域の推定されるアミノ酸配列である。相補的決定部（ＣＤＲ）を下線で示した。アミノ酸番号はKabat (Kabat et al., 1991)のものに準じた。
【図５】図５は、１Ａ４抗体及び１Ｃ２抗体のＬ鎖の可変領域の推定されるアミノ酸配列である。相補的決定部（ＣＤＲ）を下線で示した。アミノ酸番号はKabat (Kabat et al., 1991)のものに準じた。
【図６ａ】図６ａは、ヒトＩｇＧ１サブタイプに属する１Ａ４Ｆａｂフラグメントの競合的ＥＬＩＳＡで得られた曲線であり、ラテックスポリペプチドによるヘベイン結合阻害を示す。
【図６ｂ】図６ｂは、ヒトＩｇＧ１サブタイプに属する１Ｃ２Ｆａｂフラグメントの競合的ＥＬＩＳＡで得られた曲線であり、ラテックスポリペプチドによるヘベイン結合阻害を示す。
【図７】図７は、競合的ＥＬＩＳＡの結果であって、ヒトＩｇＧ１サブタイプに属する１Ａ４Ｆａｂフラグメントの有するヘベイン結合性は、ヘベインのアレルゲン性エピトープ(６量体と１３量体)により阻害されることを示す。
【配列表フリーテキスト】
【００５２】
配列番号１ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号５ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号６ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号７ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号８ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号９ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１０ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１１ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１２ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１３ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１４ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１５ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１６ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１７ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１８ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１９ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２０ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２１ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２２ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２３ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２４ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２５ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２６ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２７ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２８ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２９ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３０ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３１ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３２ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３３ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３４ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３５ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３６ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３７ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３８ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３９ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４０ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４１ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４２ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４３ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
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配列番号４７ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４８ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４９ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号５０ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号５１ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号５２ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号５３ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号５４ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号５５ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号５６ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号５７ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号５８ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号５９ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号６０ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号６１ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号６２ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号６３ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号６４ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号６５ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号６６ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号６７ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号６８ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号６９ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号７０ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号７１ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号７２ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号７３ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号７４ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号７５ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号７６ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号７７ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号７８ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号７９ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号８０ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号８１ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号８２ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号８３ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号８４ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号８５ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号８７ 配列中の３１〜３７番アミノ酸、５２〜６７番アミノ酸及び１０１〜１１７番アミノ酸はＣＤＲである。
配列番号８８ 配列中の３１〜３７番アミノ酸、５２〜６７番アミノ酸及び１０１〜１１９番アミノ酸はＣＤＲである。
配列番号８９ 配列中の２４〜３５番アミノ酸、５１〜５７番アミノ酸及び９０〜９８番アミノ酸はＣＤＲである。
配列番号９０ 配列中の２４〜３４番アミノ酸、５０〜５６番アミノ酸及び８９〜９７番アミノ酸はＣＤＲである。
配列番号９１ 人工的な塩基配列の記載: オリゴヌクレオチドプライマー
Claims (21)
- 抗体又はその誘導体からなる物質であって、該抗体はアレルゲン性ヘベインに結合特異性を有するモノクローナル抗体又はその機能的フラグメントと定義される、ヘベイン結合性物質。
- 該機能的フラグメントがｓｃＦｖフラグメント又はＦａｂフラグメントであることを特徴とする、請求項１に記載のヘベイン結合性物質。
- 該ｓｃＦｖフラグメント又はＦａｂフラグメントが、ＩｇＥサブクラスに属する抗体から誘導されたものであることを特徴とする、請求項２に記載のモノクローナル抗体。
- 該ｓｃＦｖフラグメントが１Ａ４又は１Ｃ２であることを特徴とする、請求項２に記載のヘベイン結合性物質。
- 請求項１〜４のいずれかのヘベイン結合性物質をコードするＤＮＡであるか、該ＤＮＡの断片であって、該ヘベイン結合性物質に含まれる抗体鎖の少なくとも１種をコードするＤＮＡ断片である、単離されたＤＮＡ分子。
- 該抗体鎖が、ＶL及び／又はＶH領域の相補性決定部（ＣＤＲ）であることを特徴とする、請求項５に記載の単離されたＤＮＡ分子。
- ベクターにクローニングしてなることを特徴とする、請求項５に記載の単離されたＤＮＡ分子。
- 該ベクターが、請求項１〜４のいずれかのヘベイン結合性物質を発現可能なベクターであることを特徴とする、請求項７に記載の単離されたＤＮＡ分子。
- 請求項５〜８のいずれかのＤＮＡ分子を含む宿主細胞。
- 請求項１〜４のいずれかに記載のヘベイン結合性物質、又は該物質に含まれる抗体鎖の少なくとも１種を発現することが可能な、請求項９に記載の宿主細胞。
- 該抗体鎖が、請求項２〜４のいずれかで定義されたｓｃＦｖフラグメントであることを特徴とする、請求項１０に記載の宿主細胞。
- 請求項１〜４のいずれかのヘベイン結合性物質の製造方法であって、
少なくとも１種の抗体鎖を発現しうる請求項９の宿主細胞を培養し、そして
該細胞の産生したヘベイン結合性物質を回収する
ことを包含する方法。 - 以下の工程を更に包含することを特徴とする、請求項１２に記載の製造方法。
該ヘベイン結合性物質を回収した後、該ヘベイン結合性物質の抗体鎖を構成する複数のドメインを包含するドメイン複合体を調製する工程、
調製したドメイン複合体を二次宿主細胞に導入する工程、及び
ドメイン複合体を回収する工程。 - 更に、回収したヘベイン結合性物質を標識する工程を包含する、請求項１２に記載の製造方法。
- 請求項１〜４のいずれかのヘベイン結合性物質の製造方法であって、該ヘベイン結合性物質の少なくとも一部を合成することを特徴とする製造方法。
- 請求項２〜４のいずれかのヘベイン結合性物質を、表面タンパク質との融合タンパク質として提示するファージ又は微生物細胞。
- ヘベイン結合性物質を提示する請求項１６のファージ又は細胞からなるディスプレイライブラリーから、請求項２〜４のいずれかのヘベイン結合性物質を選択する方法。
- サンプル中のヘベインを検出する方法であって、
サンプルを提供し、そして
請求項１〜４のいずれかのヘベイン結合性物質を用いてヘベインを検出する
ことを包含する方法。 - 運搬及び保管に適した容器に入れられた、請求項１〜４のいずれかのヘベイン結合性物質を包含する試験キット。
- 免疫学的診断に使用することを特徴とする、請求項１〜４のいずれかのヘベイン結合性物質。
- 免疫学的治療に使用することを特徴とする、請求項１〜４のいずれかのヘベイン結合性物質。
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