FI112501B - Heveiiniä sitovat monoklonaaliset vasta-aineet - Google Patents

Description

> 112501

HEVEIINIÄ SITOVAT MONOKLONAALISET VASTA-AINEET

Keksinnön ala 5 Tämä keksintö koskee vasta-aineiden muokkausteknologiaa. Tarkemmin sanoen esillä oleva keksintö koskee ihmisen IgE-vasta-aineita ja niiden johdannaisia, jotka sitovat allergeenistä heveiiniä korkealla affiniteetilla ja spesifisyydellä. Esillä oleva keksintö koskee myös menetelmiä tällaisten heveiiniä sitovien monoklonaalisten vasta-aineiden 10 valmistamiseksi ja muokkaamiseksi ja menetelmiä näiden vasta-aineiden ja niiden johdannaisten käyttämiseksi immunodiagnostiikan alalla, mahdollistaen allergeenisen heveiinin kvalitatiivisen ja kvantitatiivisen määrittämisen biologisissa ja raaka-ainenäytteissä, sekä immunoterapiassa, mahdollistaen allergeenisen heveiinin estämisen allergisissa potilaissa.

15

Keksinnön tausta

Maailmanlaajuisesti lähes 20 % väestöstä kärsii allergiasta. Tämän seurauksena se on yhä vakavampi terveysongelma. Allergia on yliherkkyysreaktio ilmassa, muassa tai vedessä :.: · 20 olevia aineita vastaan, jotka ovat normaalisti harmittomia (Corry ja Kheradmand, 1999).

:.: : Uusi ja vieras tekijä laukaisee allergisen reaktion, joka tähtää tämän tekijän hävittämiseen · · ·' kehosta. IgE-välitteisissä allergisissa reaktioissa, joita myös kutsutaan välittömiksi tai tyypin I yliherkkyysreaktioiksi, kehon joutuessa ensimmäisen kerran alttiiksi vieraalle aineelle, allergeenille, IgE:tä kantavat B-solut alkavat tuottaa liukoisia IgE-molekyylejä · 25 jotka sitten sitoutuvat korkea-affmiteettisiin IgE-reseptoreihin, joita on läsnä laajan solujen valikoiman pinnalla, lähinnä syöttösolujen. Jos sama vieras aine kohdataan jälleen, tapahtuu reseptoriin sitoutuneiden IgE-molekyylien ristisitoutuminen allergeenin toimesta, . . mikä johtaa soluaktivaatioon ja sitä seuraavaan toksisten tuotteiden kuten histamiinien k · vapautumiseen, mikä tuo esiin allergisen reaktion merkit ja oireet.

’·*· 30 ; _; Lateksiallergia on vakava lääketieteellinen ongelma kasvavin potilasluvuin (Slater, 1994, •; ‘, Turjanmaa et ai., 1996). Lateksi on monimutkainen intrasellulaarinen tuote, maitomainen ’... · mahla, jota kumipuun, Hevea brasiliensis, maitiaissolut tuottavat ja jota käytetään : monenlaisissa jokapäiväisissä tavaroissa, esim. käsineiden, ilmapallojen ja kondomien 2 112501 tuotantoon, ja lääketieteellisten välineiden valmistuksessa. Lateksiallergia on vakava ongelma etenkin terveydenhoito työntekijöillä, kumiteollisuuden työntekijöillä ja potilailla, jotka ovat läpikäyneet useita kirurgisia toimenpiteitä. Lateksiallergian on myös raportoitu olevan yhteydessä siitepölyallergioihin ja ruoka-allergioihin (Neljä Gujuluva, 1998).

5 Ristireagoivuus lateksi- ja ruoka-allergeenien välillä on osoitettu latex- hedelmäsyndroomaksi, joka saattaisi olla heveiinin kaltaisten proteiinidomeenien tai vastaavien epitooppien seurausta (Brehler et ai., 1997, Chen et ai, 1998, Mikkola et ai., 1998). Monia lateksin proteiineja on tunnistettu allergeeneiksi (Breiteneder ja Scheiner, 1998). Eräs tärkeistä lateksiallergeeneista on heveiini, joka on esimerkiksi useiden kitiiniä 10 sisältävien sienten estämiseen osallistuva puolustusproteiini (Lee et ai, 1991, Alenius et ai., 1996, Chen et ai., 1997). Heveiini on pieni kitiiniä sitova proteiini, jossa on 43 aminohappoa ja neljä disulfidisidosta. Sen kolmiulotteinen rakenne on määritetty röntgendiffraktiolla jaNMRdla (Rodriguez-Romero et ai., 1991; Andersen et ai, 1993).

15 IgE-vasta-aineet tunnistavat nimenomaisesti allergeenisia epitooppeja, jotka olisivat hyödyllisiä klinikoilla tai immunodiagnostiikassa kompleksisten materiaalien allergeenipitoisuuksien havaitsemiseen ja määrittämiseen. Lisäksi allergeeniset epitoopit eroavat yleensä proteiinien immunogeenisistä epitoopeista. Tämä tosiasia on haitannut allergeenisia epitooppeja spesifisesti sitomaan kykenevien monoklonaalisten vasta-:.: 20 aineiden tuottamista tavanomaisin menetelmin kuten hybridoomatekniikalla. Äskettäin on i : · osoitettu, että allergeenispesifisten IgE-vasta-aineiden kehittäminen on mahdollista ’ · ·' faaginäyttötekniikalla (engl. phage display, Steinberger et ai., 1996). Tämä metodologia antaa uusia työkaluja allergeenispesifisten rekombinanttivasta-aineiden tuottamista varten, joita voidaan tuottaa tasalaatuisina kliinisiin ja diagnostisiin sovelluksiin.

25

Keksinnön yhteenveto . Kuvaamme tässä hakemuksessa ihmisen IgE-vasta-ainefragmenttien kehittämisen ja karakterisoinnin, jotka fragmentit sitovat allergeenistä heveiiniä affiniteetilla ja 30 spesifisyydellä, jotka ovat riittävän suuret niiden käyttämiseksi reagensseina biologisissa ;,; näytteissä olevan heveiinin kvalitatiiviseen ja kvantitatiiviseen mittaamiseen suunnitelluissa immunomäärityksissä ja allergisten potilaiden immunoterapiassa. Esillä ’ · · ‘ oleva keksintö kuvaa erityisesti heveiinille spesifisten ihmisen IgE-vasta-aineiden 3 112501 valikoinnin faaginäyttötekniikalla, ja E. colissa tuotettujen muokattujen vasta-ainefragmenttien sitoutumisominaisuuksien karakterisoinnin.

Keksintö antaa näin ollen käyttöön uusia reagensseja erilaisiin immunomääritys-5 menettelyihin sekä ihmisen immunoterapiaan. Keksintö mahdollistaa myös näiden laadultaan tasaisten spesifisten reagenssien taatun jatkuvan saannin, poistaen polyklonaalisten vasta-aineiden luontaisen erien välisen vaihtelun. Nämä edulliset vaikutukset mahdollistavat uusien, spesifisten ja taloudellisten, laadultaan tasaisten immunodiagnostisten määritysten valmistuksen.

10

Esillä olevan keksinnön eräs spesifinen tarkoitus on niin muodoin antaa käyttöön monoklonaalisia ihmisen IgE-vasta-aineita, niiden fragmentteja, tai tällaisten vasta-aineiden muita johdannaisia, jotka sitovat heveiiniä affiniteetilla ja spesifisyydellä, jotka ovat riittävän suuret mahdollistamaan biologisissa näytteissä olevan heveiinin 15 kvalitatiivisen ja kvantitatiivisen mittaamisen, sekä niiden käytön immunoterapiassa. Esillä olevan keksinnön mukaisilla monovalenteilla vasta-aineilla on spesifinen sitoutuminen allergeeniseen heveiiniin.

Eräs toinen esillä olevan keksinnön tarkoitus on antaa käyttöön cDNA-klooneja, jotka 20 koodaavat heveiinispesifisiä vasta-aineketjuja, sekä konstrukteja ja menetelmiä tällaisten ’;; / kloonien ilmentämiseksi heveiiniä sitovien vasta-aineiden, niiden fragmenttien tai tällaisten vasta-aineiden muiden johdannaisten tuottamiseksi.

. . Tämän keksinnön lisätarkoituksena on saada aikaan menetelmiä tällaisten heveiiniä 25 sitovien vasta-aineiden, niiden fragmenttien tai tällaisten vasta-aineiden muiden johdannaisten, tai niiden yhdistelmien käyttämiseksi heveiinin kvalitatiiviseksi ja kvantitatiiviseksi määrittämiseksi biologisissa näytteissä. Lisäksi tämä keksintö antaa , ·. : käyttöön heveiiniä sitovia vasta-aineita, niiden fragmentteja tai tällaisten vasta-aineiden , ' · muita johdannaisia, tai niiden yhdistelmiä immunoterapiaa varten allergisissa potilaissa.

30 .! Esillä olevan keksinnön muut tavoitteet, piirteet ja edut tulevat ilmeisiksi seuraavista • ’ · piirroksista ja yksityiskohtaisesta kuvauksesta. Tulisi kuitenkin ymmärtää, että '; ·;' yksityiskohtainen kuvaus ja spesifiset esimerkit, vaikkakin ne osoittavat keksinnön ' edullisia suoritusmuotoja, esitetään vain kuvaustarkoituksessa, koska erilaiset muutokset ja 4 112501 modifikaatiot keksinnön hengessä ja piirissä tulevat ilmeisiksi alan ammattilaisille tästä yksityiskohtaisesta kuvauksesta.

Piirrosten lyhyt kuvaus 5

Konstruktien kuvat eivät ole mittakaavassa.

Kuvio 1 on kaavamainen esitys intaktista ihmisen IgE-alaluokan vasta-aineesta, Fab-fragmentista ja yhden ketjun vasta-aineesta (scFv). Antigeeniä sitova kohta on osoitettu 10 kolmiolla.

Kuvio 2 esittää panning-menetelmää kaavamaisesti.

Kuvio 3 on kaavamainen esitys scFv-faagikirjastojen rakentamiseen käytetystä scFv-15 faaginäyttövektorista.

Kuvio 4 esittää 1A4- jalC2-vasta-aineiden raskaan ketjun variaabelin alueen päätellyn aminohapposekvenssin. Komplementaarisuuden määräävät alueet (Complementarity Determining Regions, (CDRt)) on alleviivattu. Numerointi on Kabat’n mukainen (Kabat et 20 ai., 1991).

Kuvio 5 esittää 1A4- jal C2-vasta-aineiden kevyen ketjun variaabelin alueen päätellyn aminohapposekvenssin. CDRt on alleviivattu. Numerointi on Kabaf n mukainen (Kabat et ai, 1991).

25

Kuvio 6a esittää käyrää, joka on saatu 1A4 Fab-fragmentin kompetitiivisella ELISAlla ihmisen IgGl-alatyypin kanssa, jonka sitoutuminen heveiiniin on estetty lateksin polypeptidillä.

30 Kuvio 6b esittää käyrää, joka on saatu 1C2 Fab-fragmentin kompetitiivisella ELISAlla ihmisen IgGl-alatyypin kanssa, jonka sitoutuminen heveiiniin on estetty lateksin · polypeptidillä.

5 112501

Kuvio 7 esittää kompetitiivisen ELISAn tuloksen. 1A4 Fab-fragmenttien sitoutuminen ihmisen IgGl-alatyypin kanssa heveiiniin estyy heveiinin allergeenisillä epitoopeilla (6-meerija 13-meeri).

5 Lyhenteet cDNA komplementaarinen deoksiribonukleiinihappo CDR komplementaarisuuden määräävä alue DNA deoksiribonukleiinihappo 10 E. coli Escherichia coli ELISA entsyymisidottu immunosorbent-määritys

Fab spesifisesti antigeeniä sitova fragmentti

Fd raskaan ketjun variaabeli ja ensimmäinen muuttumaton domeeni

Fv spesifisesti antigeeniä sitovan vasta-aineen variaabelit alueet 15 GFP vihreä fluoresoiva proteiini

IgE immunoglobuliini E

mRNA lähettiribonukleiinihappo NMR ydinmagneettinen resonanssi PCR polymeraasiketjureaktio ;", 20 RNA ribonukleiinihappo scFv yksiketj uinen vasta-aine supE bakteerikannan, jossa on glutamiini-insertoituva amber-suppressori-tRNA, genotyyppi

Vh raskaan ketjun variaabeli alue 25 Vl kevyen ketjun variaabeli alue

Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus

Seuraavat määritelmät annetaan eräille tässä yksityiskohtaisessa selvityksessä käytetyille . · ’ · ’ 30 termeille. Termejä "immunoglobuliini", "raskas ketju", "kevyt ketju" ja "Fab" käytetään samalla tavalla kuin eurooppapatenttihakemuksessa nro 0125023.

; Termiä "vasta-aine" eri kieliopillisissa muodoissaan käytetään tässä kollektiivisena substantiivina, joka tarkoittaa immunoglobuliinimolekyylien populaatiota ja/tai . 112201 ο immunoglobuliinimolekyylien immunologisesti aktiivisia osia, so. molekyylejä, jotka sisältävät antigeeniä sitovan kohdan tai paratoopin.

"Antigeeniä sitova kohta", "paratooppi", on vasta-ainemolekyylin rakenteellinen osa, joka 5 spesifisesti sitoo antigeeniä.

Tyypillisiä vasta-aineita ovat ne immunoglobuliinin osat, jotka sisältävät paratoopin, mukaan luettuina nimillä Fab ja Fv tunnetut osat.

10 "Fab" (antigeeniä spesifisesti sitova fragmentti), vasta-aineiden osa voidaan valmistaa papaiinin proteolyyttisellä reaktiolla olennaisesti intakteihin vasta-aineisiin menetelmillä, jotka ovat tunnettuja. Katso esimerkiksi US-patentti nro 4 342 566. Fab-fragmentteja voidaan myös valmistaa rekombinanttimenetelmillä, jotka ovat alan ammattilaisten tuntemia. Katso esimerkiksi US-patentti 4 949 778.

15

Termiä "domeeni" käytetään kuvaamaan proteiinin toisista riippumattomasti laskostuvaa osaa. Luonnollisissa proteiineissa olevien domeenirajojen yleiset rakenteelliset määritelmät esitetään viitteessä Argos, 1988.

;'' t 20 Termiä "variaabeli domeeni" tai "Fv" käytetään kuvaamaan immunoglobuliinimolekyylin ' ”. niitä alueita, jotka ovat vastuussa antigeenin tai hapteenin sitomisesta. Nämä koostuvat tavallisesti immunoglobuliinimolekyylin raskaan ja kevyen ketjun N-terminusten noin 100 ensimmäisestä aminohaposta.

25 Termiä "yksiketjuinen vasta-aine" (scFv) käytetään määrittelemään molekyyli, jossa vasta-aineen raskaan ja kevyen ketjun variaabelit domeenit liittyvät yhteen linkkeripeptidin välityksellä yhdestä mRNA-molekyylistä syntetisoidun jatkuvan aminohappoketjun muodostamiseksi (transkripti).

. V 30 Termiä "linkkeri" tai "linkkeripeptidi" käytetään kuvaamaan aminohapposekvenssiä, joka t · · · on vierekkäisten domeenien välissä luonnollisessa tai muokatussa proteiinissa.

; ·; "Heveiiniä sitova vasta-aine" on vasta-aine, joka spesifisesti tunnistaa heveiinin ja sitoutuu siihen variaabelien domeeniensa välittämän vuorovaikutuksen johdosta.

7 112501

Esimerkkeinä tällaisista keksinnön piiriin kuuluvien vasta-aineiden fragmenteista ilmaisemme tässä lA4:n ja lC2:n scFv-fragmentit, kuten kuvioissa 4 ja 5 esitetään.

Eräässä edullisessa suoritusmuodossa esillä oleva keksintö saa näin ollen aikaan heveiiniä 5 sitovien vasta-aineiden johdannaisia, esim. Fab-fragmentteja tai scFv-fragmentteja. Hakemuksesta tulee ymmärrettäväksi, että vaihtoehtoisesti voidaan käyttää CDR-sekvenssien mutanttiversioita tai täydellisiä Vl- ja Vn-sekvenssejä, joissa on yksi tai useampi konservatiivinen substituutio, joka ei olennaisesti vaikuta sitomiskykyyn.

10 Keksinnön mukaiset vasta-aineet ja vasta-ainejohdannaiset voidaan leimata immunomäärityksessä käyttämistä varten, esim. heveiinin määrittämiseksi kvalitatiivisesti tai kvantitatiivisesti biologisista näytteistä. Näitä tarkoituksia varten mikä tahansa vasta-aineleimaukseen tavanomaisesti käytettävä leimatyyppi on hyväksyttävä.

15 Keksinnön mukaiset vasta-aineet ja vasta-ainejohdannaiset voidaan leimata immunoterapiassa käyttämistä varten, esim. allergeenisen heveiinin estämiseksi allergisissa potilaissa. Mikä tahansa vasta-aineleimaukseen tavanomaisesti käytettävä farmaseuttisesti hyväksyttävä leima on sopiva näitä tarkoituksia varten.

: . 20 Eräässä toisessa aspektissa esillä oleva keksintö antaa käyttöön keksinnön mukaista vasta- . · · ·. ainetta tai vasta-ainejohdannaista koodaavia DNA-molekyylejä, ja tällaisten DNAiden fragmentteja, jotka koodaavat VL- ja/tai VH-alueen CDRiä. Tällainen DNA voidaan kloonata vektoriin, tarkemmin sanoen esimerkiksi ilmentämisvektoriin, joka kykenee ‘ · ohjaamaan keksinnön mukaisten vasta-ainejohdannaisten, tai vähintään yhden vasta- 25 aineketjun tai yhden vasta-aineketjun osan ilmentymistä.

Keksinnön lisäaspektissa saadaan aikaan isäntäsoluja, valittuna bakteerisoluista, hiivasoluista, sienisoluista, hyönteissoluista, kasvisoluista ja nisäkässoluista, jotka sisältävät keksinnön mukaisen DNA-molekyylin, mukaan luettuna keksinnön mukaista 30 vasta-ainetta tai vasta-ainejohdannaista ilmentämään kykenevät isäntäsolut. Näin ollen keksinnön mukaisia vasta-ainejohdannaisia voidaan valmistaa viljelemällä keksinnön ..' mukaisia isäntäsoluja, jotka ilmentävät vaadittu(j)a vasta-aineketjuQa, ja joko ottamalla ’ haluttu proteiini suoraan talteen tai, mikäli tarpeen, ottamalla aluksi talteen ja yhdistämällä yksittäiset ketjut.

8 ' 112 Γ? 1

Edellä mainitut scFv-fragmentit saatiin ihmisen IgE-scFv-faagikirjaston biopanning-menetelmällä käyttäen allergeenista rekombinanttiheveiiniä. Ihmisen IgE-scFv-faagikirjasto rakennettiin lateksiallergisen potilaan lymfosyyteistä eristetyistä mRNAista.

5 Raskaan ja kevyen ketjun cDNAiden variaabeli alue syntetisoitiin käyttämällä ihmisen IgE-spesifisiä alukkeita Fd cDNAille ja ihmisen kappa (k) ja lambda (λ) -kevytketjuille käyttämällä ihmisen k-ja λ-ketjuille spesifisiä alukkeita. Kevyiden ja raskaiden ketjujen variaabelit alueet monistettiin PCR:n avulla käyttäen ihmisen k-ja λ-ketjuille spesifisiä alukkeita Vk-ja νλ-cDNAille ja ihmisen IgE-spesifisiä alukkeita VH-cDNAille, 10 vastaavassa järjestyksessä. Ihmisen IgE-scFv-kirjasto rakennettiin kloonaamalla variaabelin alueen cDNAt scFv-faaginäyttövektoriin käyttäen PCR-alukkeisiin tehtyjä restriktiokohtia.

Ihmisen IgE-scFv-kirjasto valikoitiin faaginäytöllä panning-menettelyä käyttäen. Ihmisen 15 IgE-scFv-kirjasto seulottiin biotinyloidulla allergeenisellä rekombinanttiheveiinillä liuoksessa ja sitoutujat pyydystettiin streptavidiinille. Faagit eluoitiin 100 mM HCklla (pH 2,2), mitä seurasi välittömästä tapahtuva neutralointi 2 M Tris-liuoksella. Faagieluaatti monistettiin E. coli -soluissa. Viiden biopanning-kierroksen jälkeen tuotettiin liukoisia Fv-fragmentteja eristetyistä faageista. Valikoitujen scFv-fragmenttien sitoutumisspesifisyys 20 analysoitiin ELISAlla. Useita heveiinispesifisiä scFv-fragmentteja saatiin.

Kuten tässä kuvataan, on faaginäyttötekniikka tehokas ja käyttökelpoinen lähestymistapa kehittää ihmisen rekombinantti-IgE-antiheveiinivasta-aineita diagnostisiin ja hoidollisiin käyttökohteisiin.

25

Vaikka yksi tuloksekas selektiostrategia keksinnön mukaisten vasta-ainefragmenttien saamiseksi on kuvattu, tulevat lukuisat muunnelmat, joilla keksinnön mukaisia vasta-aine fragmentteja voidaan saada, olemaan ilmeisiä alan ammattilaisille. Saattaa osoittautua mahdolliseksi valikoida keksinnön mukaisia scFv-fragmentteja suoraan scFv-fragmentin 30 tai sen johdannaisten faagi-tai mikrobinäyttökirjastosta. Faagi tai mikrobisolu, joka esittelee keksinnön mukaisen scFv-fragmentin tai muun vasta-ainefragmentin fuusioproteiinina pintaproteiinin kanssa, edustaa vielä erästä keksinnön lisäaspektia.

11') η Π 1 n I *-. - 1 ' ί

Samalla kun keksinnön mukaisten vasta-aineiden ja vasta-ainejohdannaisten ilmentäminen mikrobissa tarjoaa keinon tuottaa tehokkaasti ja taloudellisesti laadultaan tasaisia erittäin spesifisiä reagensseja, jotka soveltuvat käytettäväksi immunodiagnostisissa määrityksissä ja immunoterapiassa, voi vaihtoehtoisesti osoittautua mahdolliseksi tuottaa tällaista 5 reagenssia tai ainakin osaa siitä synteettisesti. Tavanomaisia geneettisen muokkauksen tekniikoita soveltamalla voidaan alunperin saatuja keksinnön mukaisia vasta-ainefragmentteja muuttaa, esim. liittää uusia sekvenssejä, sitoutumisominaisuuksia olennaisesti muuttamatta. Tällaisia tekniikoita voidaan hyödyntää uusien heveiiniä sitovien hybridiproteiinien tuottamiseksi, jotka säilyttävät sekä affiniteetin että spesifisyyden 10 heveiinille tässä edellä esitetyllä tavalla.

Heveiiniä sitovien ihmisen rekombinanttivasta-aineiden kehittäminen ja karakterisointi ja niiden käyttökelpoisuus immunomäärityksissä kuvataan nyt yksityiskohtaisemmin seuraavissa esimerkeissä.

15 ESIMERKKI 1

REKOMBINANTTINEN HEVEIINISPESIFINEN scFv-FRAGMENTTI FAAGINÄYTTÖSELEKTIOLLA

; :': 20 : : ’. Tässä esimerkissä ihmisen IgE-scFv-kiijasto rakennettiin ja selektoitiin allergeenisellä ; : heveiinillä sellaisten scFv-fragmenttien eristämiseksi, joilla on affiniteettia ja spesifisyyttä : heveiiniin. Ihmisen IgE-scFv-faagikiqaston rakentaminen tehtiin epäsuorasti rakentamalla • ensin IgE Fab-κ- ja Fab^-kiijastot ja sitten tiettyjä kirjaston DNAita käytettiin raskaiden ’. . ‘ 25 ja kevyiden ketjujen variaabelien domeenien monistukseen PCRrllä.

I. Ihmisen IgE-scFv-faagikirjastojen rakentaminen

100 ml hepariinikäsiteltyä verta otettiin lateksiallergisesta potilaasta. Lymfosyytit 30 eristettiin Ig-Prime-pakkauksen (Novagen) menetelmän mukaisesti. 10 ml:aa verta kohden . . lisättiin 30 ml lyysauspuskuria (155 mM NH4CI, 10 mM NH4HCO3, 0,1 mM EDTA, pH

'· ·' 7,4) ja inkuboitiin jäissä 15 min ajoittain ravistellen. Kun oli sentrifugoitu 450 g:ssä 10 : _: min, kerättiin lymfosyytit, so. valkosolunappi. Nappi pestiin kahdesti lyysauspuskurilla ja : ’ : viimeisen sentrifugoinnin jälkeen lymfosyyttinappi suspendoitiin uudelleen D-liuokseen.

10 112501

Lymfosyytti-RNAt eristettiin käyttäen Promegan RNAgents Total RNA Isolation -pakkausta valmistajan protokollan mukaisesti. Ensimmäisen juosteen cDNA-synteesi toteutettiin käyttämällä Promegan Reverse Transcription -järjestelmäpakkausta. Fd-fragmentin cDNAn ja kevyen ketjun cDNAiden synteesiin käytettiin epsilon (ε) -ketjun 5 (Cal ja Ce2) vakioalueen alukkeita ja kappa- (CkI) ja lambda- (Ckl) -ketjun aluketta, vastaavassa järjestyksessä. Ihmisen IgE-Fd-alueen ja kevyiden ketjujen cDNA-synteesiä ja PCR-monistuksia varten käytetyt alukkeet esitetään taulukossa I ja taulukossa II.

PCR-monistukset toteutettiin kahdessa vaiheessa: primaarinen PCR Fd- ja kevyiden 10 ketjujen monistamiseksi cDNA-templaateista ja sekundaarinen PCR restriktiokohtien lisäämiseksi primaarisen PCR:n jälkeen saatujen DNA-fragmenttien 5'-päähän. Ensin monistettiin Fd-alue PCR:llä käyttäen raskaiden ketjujen variaabelille alueelle (VHla-VH7a) spesifisiä alukkeita ja CslNotl-aluketta. Sen mukaisesti kappa-ja lambda-kevytketjut monistettiin käyttäen spesifisiä alukkeita kevyiden ketjujen variaabelille 15 alueelle (VKla-VK6b ja Vkla-VklO) ja CslNotl-aluketta, vastaavassa järjestyksessä. Alukkeet sekundaarista PCR:ää varten olivat CkI ja νκ/λΐ ja Cs2 Fd-aluetta varten, CU ja νκ/λΐ kappa-kevytketjua varten ja Ckl ja Cic/λΐ lambda-kevytketjua varten.

Primaarinen PCR-monistus tehtiin seuraavissa olosuhteissa: 1 sykli 3 min 93 °C:ssa ,· denaturaatiota varten, 7 sykliä 1 min 93 °C:ssa, 30 s 63 °C:ssa ja 50 s 58 °C:ssa jäähdytystä , .· 20 varten ja 1 min 72 °C:ssa pidennytä varten, 23 sykliä 1 min 93 °C:ssa, 30 s 63 °C:ssa ja 1 . · · ·. min 72 °C:ssa, mitä seurasi 1 sykli 10 min 72 °C:ssa. Sekundaarista PCR:aa varten ... monistuksen olosuhteet olivat seuraavat: 1 sykli 3 min 95 °C:ssa denaturaatiota varten, 25 ...^ sykliä 1,5 min 94 °C:ssa, 1 min 65 °C:ssa jäähdytystä varten ja 1,5 min 72 °C:ssa pidennystä varten, mitä seurasi 1 sykli 10 min 72 °C:ssa. Monistetut DNA-fragmentit 25 puhdistettiin primaarisen ja sekundaarisen PCR:n välillä ja sekundaarisen PCR:n jälkeen.

Eri vasta-ainefragmenttien lopulliset PCR-tuotteet yhdistettiin ja hajotettiin * · _' C tarkoituksenmukaisilla restriktioentsyymeillä. Hajotetut DNA-fragmentit, jotka koodasivat

IgE:n Fd-aluetta ja k- ja λ-kevytketjuja, liitettiin fagemidivektoriin ja transformoitiin E.

: : 30 coli XL-1 Blue -soluihin 106 riippumattoman kloonin Fab-κ-ja Fab-k-kirjastojen ‘ 1_ · saamiseksi. Mahdollisten ongelmien välttämiseksi Fab-fragmenttien ilmentymisessä » · faagipartikkelin pinnalla rakennettiin vasta-ainekirjasto scFv-muodossa. Fagemidi-DNAita ;'·· eri kirjastoista eristettiin ja käytettiin templaatti-DNAina ihmisen IgE-kevyt- ja ihmisen » 112501 raskasketjujen variaabeleiden alueiden monistamiseksi ihmisen IgE:n scFv-κ-ja scFv-λ-kirjastojen rakentamiseksi.

Raskaan ketjun variaabelin alueen PCR-monistus toteutettiin käyttäen ihmisen VH-5 spesifisiä alukkeita (VH1-VH4 ja VH1 A). Kevyiden ketjujen variaabelin alueen monistaminen tehtiin käyttämällä seuraavia alukepareja: Vk1-Vk7, Vk2-Vk8, Vk3-Vk9, Vk4-Vk10, Vk5-Vk1 1 ja Vk6-Vk1 1 ihmisen kappaketjulle ja νλ1-νλ8, νλ2-νλ9, νλ3-VX9, νλ4*νλ9, V15-VX10, νλόΎλΙΟ ja νλ7-νλ10 ihmisen lambdaketjulle (katso taulukot lilja IV). Monistetut DNA-fragmentit puhdistettiin ja hajotettiin niiden 10 liittämiseksi scFv-faaginäyttövektoriin (kuvio 3). Ligaatioseokset transformoitiin E. coli XL-1 Blue -soluihin, mikä johti ihmisen IgE:n scFv-κ-ja scFv-k-kirjasioihin noin 105 riippumattomalla kloonilla.

II. Ihmisen scFv-kirjastojen selektio 15

Ihmisen scFv-κ- ja scFv-Ä-kirjastot selektoitiin faaginäyttötekniikalla (McCafferty et ai., 1990, Barbas et ai, 1991). Heveiiniä sitovien vasta-ainefragmenttien eristämiseksi bakteriofaagin pinnalla esitellyt ihmisen IgE:n scFv-κ-ja scFv-X-kirjastot yhdistettiin ja ’’panning” suoritettiin käyttäen affiniteettipanning-menetelmää (kuvio 2). Ensin ;''. 20 faagipoolien annettiin reagoida joko biotinyloidun, immunoreaktiivisen heveiinin tai ‘biotinyloidun kontrolliproteiinin (tausta) kanssa 1,5 h ajan. Sen jälkeen faagipoolit siirrettiin biotiinia sitovalla streptavidiinilla päällystettyihin mikrotiitterilevyn kuoppiin. 30 minuutin inkubaation jälkeen kuopat pestiin 3 kertaa PBS:lla ja sitoutujat eluoitiin • ·, happamalla puskurilla (100 mM HC1, pH 2,2), ja neutraloitiin välittömästi 2 M Tris- 25 liuoksella. Seuraavaa pännäyskierrosta varten faagipoolit monistettiin infektoimalla E. coli XL-1 Blue -soluja. Viisi panningkierrosta suoritettiin.

•, · III. Heveiinin sitojien karakterisointi

30 Viimeisen panningsyklin jälkeen scFv-faaginäyttö-DNA eristettiin ja transformoitiin E. coli HB2151 (supK) -soluihin liukoisten scFv-fragmenttien ilmentämiseksi. ScFv-,;.' sekvenssin ja faagin geenin III sekvenssin välillä scFv-faaginäyttövektori sisältää TAG

7 ‘ amber-stopkodonin, joka transloidaan glutamaatiksi E. coli -kannoissa, joilla on supif -

A A i"\ ’ '"' i A

12 ! I Z. -J Z i genotyyppi, mutta stopkodoniksi E. coli -kannoissa, joiden genotyyppi on supK. Kuusikymmentäkaksi eri kloonia kasvatettiin pienessä mittakaavassa liukoisten scFv-fragmenttien tuottamiseksi alustavaa karakterisointia varten. Kloonit analysoitiin ELISA-testillä käyttäen heveiinillä päällystettyjä kuoppia heveiinispesifisten sitoutujien 5 keräämiseksi ja kontrolliproteiinikuoppia epäspesifisen sitoutumisen havaitsemiseksi (tuloksia ei esitetä). Klooneista useimmat sitoutuivat heveiiniin korkealla affiniteetilla. Yhdeksäntoista lupaavimmista klooneista sekvensoitiin (Sanger et ai., 1977) ja niistä kaksi valittiin lisäkarakterisointia varten (kuviot 4 ja 5).

10 ESIMERKKI 2

HEVEIINIÄ SITOVAA SPESIFISYYTTÄ OMAA VIEN IHMISEN Fab-FRAGMENTTIEN KLOONAAMINEN JA KARAKTERISOINTI

15 Tässä esimerkissä ihmisen IgE:n scFv:t, joilla oli heveiiniä sitovaa spesifisyyttä, muunnettiin ihmisen Fab-fragmenteiksi, IgGl-alatyyppi. Tunnettujen vaikeuksien vuoksi multimeerien muodostamisessa scFv-vasta-ainekirjastosta saadut 1A4-ja lC2-scFv:t kloonattiin ja ilmennettiin bakteerissa Fab-fragmentteina (Holliger et ai., 1993, Desplancq et ai, 1994). Tuloksena olevat vasta-ainefragmentit karakterisoitiin lisäksi 20 kompetitiivisella ELISAlla.

k . ‘ I. Heveiiniä sitovaa spesifisyyttä omaavien ihmisen Fab-fragmenttien kloonaaminen

Fd-alueet monistettiin päällekkäisellä PCR:llä. PCR:ää varten käytetyt alukkeet esitetään 25 taulukossa V.

Tuloksena olevat Fd-alueen ja kevyiden ketjujen cDNAt kloonattiin bakteeri- ilmentämisvektoriin pKKtac ja transformoitiin sitten E. coli RV308 -kantaan. Liukoiset ; ' · Fab-fragmentit, jotka nimettiin 1 A4G:ksi ja lC2G:ksi, valmistettiin ja Fab-fragmentit ; , 30 puhdistettiin mukaan liitetyllä C-terminaalisella heksahistidinyylileimalla Sepharose- v. pylväässä immobilisoidulla nikkelillä olennaisen puhtaaksi (tuloksia ei esitetä).

* » >1 η n r Γ Λ 13 · ' ; ' ' II. Ihmisen Fab-fragmenttien karakterisointi

Puhdistetun lA4G:nja lC2G:n karakterisointi suoritettiin kompetitiivisella ELISAlla. Ensin näytteiden, 1A4G ja 1C2G, kanssa inkuboitiin kasvavia määriä lateksipolypeptidejä, 5 jotka oli eristetty lateksisista tutkimuskäsineistä Aleniuksen ja työtovereiden (1996) mukaan, ja sitten reaktioseokset lisättiin allergeenisella GFP-heveiini-fuusioproteiinilla päällystettyihin mikrotiitterilevyn kuoppiin. Lateksipolypeptidien preparaatin on analysoitu sisältävän runsaasti lateksiallergeenista aktiivisuutta (tuloksia ei esitetä). Kuvio 6 esittää kompetitiivisen ELISAn tuloksen. lA4G:n (kuvio 6a) ja lC2G:n (kuvio 6b) sitoutuminen 10 heveiiniin voitiin estää lisäämällä suurenevia määriä natiivia heveiiniä.

IgE-vasta-aineet sitoutuvat spesifisesti allergeenisiin epitooppeihin. 1A4G-vasta-aineen sitoutumisspesifisyyden tutkimiseksi yksityiskohtaisemmin suoritettiin kompetitiivinen ELISA allergeeniset epitoopit sisältävien peptidien kanssa (kuvio 7). Banerjee ja työtoverit 15 (1997) ovat tutkineet heveiinin allergeeniset epitoopit, ja he löysivät kaksi potentiaalista allergeenista epitooppia, 6-meerinja 13-meerin. Kompetitiivisessa ELISAssa lA4G:n sitoutuminen immobilisoituun heveiiniin estyi käyttämällä allergeenisten epitooppien peptidejä. Nämä erilaisissa kompetitiivisissä ELISA-analyyseissä saadut tulokset osoittavat, että vasta-ainekirjastosta eristetyt vasta-aineet voivat sitoutua spesifisesti ; j 20 rekombinanttiheveiiniin ja myöskin naiiviin heveiiniin. Alustavat tulokset lisäksi osoittavat, että lA4G-vasta-aine sitoutuu spesifisesti heveiinin allergeenisiin ... ·’ epitooppeihin.

' ‘ Hakemuksen perusasiakirja pohjautuu englanninkieliseen hakemusasiakirjaan, jota on ' · · * 25 korjattu 17.5.2002 seuraavasti: Taulukkoon I ja sekvenssilistaukseen on lisätty aluke- sekvenssi CslNotl: 5’-GAATGGTGCGGCCGCGCTGAAGGTTTTGTTGTCG -3’(SEQ IDNO:91). Sivun 10 riveille 13, 15, 16 ja 17 on tehty seuraavat korjaukset: I rivi 13: ilmaisu ”Csl- ja Ca2-alukkeita” on muutettu ilmaisuksi ’’CelNotl-aluketta” * ' rivi 15: ilmaisu ”CKl:a ja CXl:a” on muutettu ilmaisuksi ’’CalNotl-aluketta” ';' 30 rivit 16-17: termit VH1A, Cal, VkIA, CkA,1 ja νλΙΑ on vastaavassa järjestyksessä muutettu termeiksi CkI, Υκ/λΐ, Ck 1, Υκ/λΐ ja 0,1.

14 112501 TAULUKKO I: Ihmisen IgE:n Fd-alueen cDNA-synteesiin ja PCR-monistukseen käytetyt alukkeet.

Cal: 5'- GCTGAAGGTTTTGTTGTCGACCCAGTC -3' 5 Ce2: 5'- CACGGTGGGCGGGGTGAAGTCCC -3’

CeNotI: 5’- GAATGGTGCGGCCGCGCTGAAGGTTTTGTTGTCG-3’ VH la: 5'- ATGGCCGCAGCTCAGGTKCAGCTGGTGCAG -3’ VH ib: 5'- ATGGCCGCAGCTCAGGTCCAGCTTGTGCAG -3' VH le: 5'- ATGGCCGCAGCTSAGGTCCAGCTGGTACAG -3' 10 VH Id: 5'- ATGGCCGCAGCTCARATGCAGCTGGTGCAG -3' VH2a: 5'- ATGGCCGCAGCTCAGATCACCTTGAAGGAG -3' VH2b: 5’- ATGGCCGCAGCTCAGGTCACCTTGARGGAG -3’ VH3a: 5’- ATGGCCGCAGCTGARGTGCAGCTGGTGGAG -3’ VH3b: 5’- ATGGCCGCAGCTCAGGTGCAGCTGGTGGAG -3' 15 VH3c: 5’- ATGGCCGCAGCTGAGGTGCAGCTGTTGGAG -3’ VH4a: 5'- ATGGCCGCAGCTCAGSTGCAGCTGCAGGAG -3' VH4b: 5'- ATGGCCGCAGCTCAGGTGCAGCTACAGCAG -3’ VH5a: 5’- AT GGCCGC AGCT G ARGT GC AGCT GGTGC AG -3’ VH6a: 5’- AT GGCCGC AGCT C AGGTAC AGCT GC AGC AG -3’ ; ·:. 20 VH7a: 5’- ATGGCCGCAGCTCAGGTSCAGCTGGTGCAA -3’ ;;:. VHlA: 5’- TTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGCAGCT -3’ I · 1 19”. : < 15 1 - - ' ’ ' TAULUKKO II: Ihmisen kappa-ja lambda-kctjujen cDNA-synteesiin ja PCR-monistukseen käytetyt alukkeet.

CkI: 5'- AGGTAGGGCGCGCCTTAACACTCTCCCCTGTTGAAGC -3' 5 Vk la: 5'- ATGGCAGCGGCTRACATCCAGATGACCCAG -3’

Vk Ib: 5'- ATGGCAGCGGCTGMCATCCAGTTGACCCAG -3'

VkIc: 5'- ATGGCAGCGGCTGCCATCCRGATGACCCAG -3'

Vk Id: 5'- ATGGC AGCGGCTGTC ATCTGG AT GACCC AG -3' VK2a: 5'- AT GGC AGCGGCT G AT ATTGT G ATGACCC AG -3' 10 VK2b: 5'- AT GGC AGCGGCT G ATRTTGT G AT G ACTC AG -3' VK3a: 5'- ATGGCAGCGGCTGAAATTGTGTTGACRCAG -3' VK3b: 5'- AT GGC AGCGGCT G AA AT AGT G AT G ACGC AG -3'

Vk3c: 5'- AT GGC AGCGGCT G AAATT GT A AT G AC AC AG -3' VK4a: 5’- ATGGCAGCGGCTGACATCGTGATGACCCAG -3' 15 VK5a: 5'- ATGGCAGCGGCTGAAACGACACTCACGCAG -3' VK6a: 5’- ATGGCAGCGGCTGAAATTGTGCTGACTCAG -3’ VKÖb: 5'- AT GGC AGCGGCT G AT GTT GT G AT GAC AC AG -3’

Vk/λΐ: 5’- TT GTT ATTGCT AGCTGCACAACCAGCAATGGC AGCGGCT -3’ . . Ολί: 5'- AGGTAGGGCGCGCCTTATGAACATTCYGYAGGGGC -3' ;'V 20 VXla: 5'- ATGGCAGCGGCTCAGTGTGTGCTGACTCAG -3' !:: ! νλ^: 5'- ATGGCAGCGGCTCAGTCTGTGYTGACGCAG -3' .: VXlc: 5'- ATGGCAGCGGCTCAGTCTGTCGTGACGCAG-3’ • · · · i νλ2 : 5'- ATGGCAGCGGCTCAGTCTGCCCTGACTCAG -3' VX3a: 5'- ATGGCAGCGGCTTCCTATGWGCT G ACT C AG -3’ 25 VX3b: 5’- ATGGCAGCGGCTTCCTATGAGCTGACACAG -3' VA3c: 5’- ATGGCAGCGGCTTCTTCTGAGCTGACTCAG -3' VX3d: 5'- AT GGC AGCGGCTTCCT ATG AGCT GATGC AG -3’ ';,: VX4 : 5'- ATGGCAGCGGCTCAGCYTGTGCTGACTCAA -3' ’ ’: *. νλ5 : 5'- ATGGCAGCGGCTCAGSCTGTGCTGACTCAG -3' :;;; 30 νλό : 5'- ATGGCAGCGGCTAATTTTATGCTGACTCAG -3' VX7 : 5'- ATGGCAGCGGCTCAGRCTGTGGTGACTCAG -3' : : Υλ8 : 5'- ATGGCAGCGGCTCAGACTGTGGTGACCCAG -3’ η λ r γ- /' 16 ! I ; ί Υλ4/9: 5'- ATGGCAGCGGCTCWGCCTGTGCTGACTCAG -3' Υλ 10: 5'- ATGGCAGCGGCTCAGGCAGGGCTGACTCAG -3' 5 TAULUKKO III: Ihmisen raskaan ketjun variaabelien alueiden PCR-monistukseen käytetyt alukkeet.

VH1: 5'- ATTTACTCGAGTGAGGAGACGGTGACCAGGGTGCC -3' 10 VH2: 5'- ATTT ACTCGAGT GAAG AG ACGGT GACC ATT GTCCC -3’ VH3: 5'- ATTTACTCGAGTGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCC -3' VH4: 5’- ATTTACTCGAGTGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCC -3’ VH IA: 5’- TTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGCAGCT -3' 112501 17 TAULUKKO IV: Ihmisen kevyiden ketjujen variaabelien alueiden PCR-monistukseen käytetyt alukkeet.

VkI: 5’- TTATAGAGCTCGACATCCAGATGACCCAGTCTCC -3' 5 Vk2: 5’- TTATAGAGCTCGATGTTGTGATGACTCAGTCTCC -3’

Vk3: 5’- TTATAGAGCTCGAAATTGTGTTGACGCAGTCTCC -3’

Vk4: 5'- TTATAGAGCTCGACATCGTGATGACCCAGTCTCC -3'

Vk5: 5'- TT AT AG AGCTCG A A ACG AC ACT C ACGC AGT CTCC -3’

Vk6: 5’- TTATAGAGCTCGAAATTGTGCTGACTCAGTCTCC -3' 10 Vk7: 5'- TATAAGCGGCCGCACGTTTGATTTCCACCTTGGTCCC -3'

Vk8: 5’- TATAAGCGGCCGCACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCC -3'

Vk9: 5'- TATAAGCGGCCGCACGTTTGATATCCACTTTGGTCCC -3'

VkIO: 5'- TATAAGCGGCCGCACGTTTGATCTCCACCTTGGTCCC -3'

VkI 1: 5'- TATAAGCGGCCGCACGTTTAATCTCCAGTCGTGTCCC -3' 15 νλΐ: 5'- ATTTAGAGCTCCAGTCTGTGTTGACGCAGCCGCC -3' VX2: 5'- ATTTAGAGCTCCAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGC -3' VL3: 5’- ATTTAGAGCTCTCCTATGTGCTGACTCAGCCACC -3' νλ4: 5’- ATTTAGAGCTCTCTTCTGAGCTGACTCAGGACCC -3' νλ5: 5’- ATTTAGAGCTCCACGTTATACTGACTCAACCGCC -3' 20 VX6: 5'- ATTTAGAGCTCCAGGCTGTGCTCACTCAGCCGTC -3' ’ : . VX7: 5'- ATTT AG AGCT C AATTTT AT GCT G ACT C AGCCCC A -3' : ·. VX8: 5'- ATATTGCGGCCGCACCTAGGACGGTGACCTTGGTCCC -3' VL9: 5'- ATATTGCGGCCGCACCTAGGACGGTCAGCTTGGTCCC -3’ νλΙΟ: 5'- ATATTGCGGCCGCACCTAAAACGGTGAGCTGGGTCCC -3’ 112::01 18 TAULUKKO V: Ihmisen Fd-alueiden, IgE-ja IgGl-alatyyppi, PCR-monistukscen käytetyt alukkeet.

5 5'υε: 5'-GCTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACACAGAGCCCATCCG-3' 3Όε: 5'-GCATTGCATTGCGGCCGCTTAATGGTGATGGTGATGATGGCTGAAGGT TTT GTT GTCGACCC-3 ’ 5'Cy: 5'-GGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCC-3' 3'Cy: 5'-TTTAGTTTATGCGGCCGCTTAATGGTGATGATGATGGTGACAAGATTTG 10 GGCTCTGC-3' 5Ύε: 5,-TTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGCAGCT-3' 3Ύε: 5'-TGAGGAGACGGTGACC-3' 5'Ck: S'-GGGACACGACTGGAGATTAAAACTGTGGCTGCACCATCTGTCG' 3'Ck: 5’-AGGTAGGGCGCGCCTTAACACTCTCCCCTGTTGAAGC-3' 15 5'Vk: 5'-ATGGCAGCGGCTGAAACGACACTCACGCAG-3' and 5 '-TTGTT ATT GCT AGCT GC AC A ACC AGC A AT GGCAGCGGCT-3' 3'Vk: 5'-TTTAATCTCCAGTCGTGTCCC-3’.

t 5 19 112 j n i

Viitteet

Alenius, H., Kalkkinen, N., Reunala, T., Turjanmaa, K., and Palosuo, T. (1996) J.

Immunol. 156, 1618-1625.

Andersen, N.H., Cao, B., Rodriguez-Romero, A., and Arreguin, B. (1993) Biochemistry 32, 1407-1422.

Argos, P. (1988) Protein Engineering, 2, 101-113.

10

Banerjee, B., Wang, X., Kelly, K.J., Fink, J.N., Sussman, G.L., and Kurup, V.P. (1997) L Immunol. 159, 5724-5732.

Barbas III, C.F., Kang, A.S., Lemer, R.A., and Benkovic, S.J. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 15 U.S.A. 88, 7978-7982.

Brehler, R., Theissen, U., Mohr, C., and Luger, T. (1997) Allergy 52, 404-410.

Breiteneder, H, and Scheiner, O. (1998) Int. Arch, Allergy Immunol. 116, 83-92.

20

Chen, Z., Posch, A., Lohaus, C., Raulf-Heimsoth, M., Meyer, H.E., and Baur, X. (1997) L Allergy Clin. Immunol. 99, 402-409.

Chen, Z., Posch, A., Cremer, R., Raulf-Heimsoth, M., and Baur, X. (1998) J. Allergy Clin. 25 Immunol. 102, 476-481.

Corry, D.B., and Kheradmand, F. (1999) Nature 402, B18-B23.

Desplancq, D., King, D.J., Lawson, A.D.G., and Mountain, A. (1994) Protein Eng. 7, ; 30 1027-1033.

: Holliger, P., Prospero, T., and Winter, G. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A, 90, 6444- 6448.

35 Rabat, E.A., Wu, T.T., Reid-Miller, M., Perry, H.M., and Gottesman, K.S. (1991)

Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Dept, of Health and Human ' ’ Services, Bethesda, MD.

Lee, H-i, Broekaert, W.F., and Raikhel, N.V. (1991) J. Biol. Chem. 266, 15944-15948.

40

McCafferty, J., Griffiths, A.D., Winter, G., and Chiswell, F.J. (1990) Nature 348, 552-554.

Mikkola, J.H., Alenius, H., Kalkkinen, N., Turjanmaa, K., Palosuo, T., and Reunala, T. 619983 J. Allergy Clin. Immunol. 102, 1005-1012.

45

Nel, A, and Gujuluva, C. (1998) Ann. Allergy Asthma Immunol. 81, 388-398.

Rodriguez-Romero, A., Ravichandran, K.G., and Soriano-Garcia, M. (1991) FEBS Lett. 291,307-309.

50 20 112A1

Sanger, F., Nicklen, S., and Coulson, A.R. (1977) Proc. Natl Acad. Sei. U.S.A, 74, 5463-5467.

Slater, J.E. (1994) J. Allergy Clin. Immunol. 94, 139-149.

5

Steinberger, P., Kraft, D., and Valenta, R. (1996) J. Biol. Chem, 271, 10967-10972.

Turjanmaa, K., Alenius, H., Mäkinen-Kiljunen, S., Reunala, T, and Palosuo, T. (1996) Allergy 51. 593-602.

»

Claims (20)

1. 21 112501
2. 1. Monoklonaalinen vasta-aine, jolla on sitoutumisspesifisyyttä allergeeniseen heveiiniin, sen funktionaalinen fragmentti tai sen funktionaalinen johdannainen, tunnettu siitä, että se on IgE-alaluokan vasta-aine.
3. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen monoklonaalinen vasta-aine, tunnettu siitä, että fragmentti on scFv-fragmentti tai Fab-fragmentti.
4. 3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen monoklonaalinen vasta-aine, tunnettu siitä, että fragmentti on scFv-fragmentti 1A4 tai 1C2.
5. 4. Eristetty DNA-molekyyli tai sen fragmentti, tunnettu siitä, että se koodaa jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukaista monoklonaalista vasta-ainetta tai sen johdannaista, tai vähintään yhtä mainitun vasta-aineen tai vasta-ainejohdannaisen vasta-aineketjua.
6. 5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen eristetty DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että vasta-aineketju on Vl- ja/tai Vn-alueen CDR.
7. 6. Patenttivaatimuksen 4 mukainen eristetty DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että se on : kloonattuna vektoriin.
8. 7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen eristetty DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että mainittu vektori on ilmentämisvektori, joka kykenee ilmentämään jonkin patenttivaatimuksista 1 -3 mukaisia vasta-aineita sekä niiden fragmentteja ja johdannaisia.
9. 8. Isäntäsolu, tunnettu siitä, että se sisältää jonkin patenttivaatimuksista 4-7 mukaisen DNA:n. : 9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että se kykenee ilmentämään jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukaista monoklonaalista vasta-ainetta tai 22 11/5 01 sen fragmenttia tai johdannaista tai vähintään yhtä mainitun vasta-aineen tai vasta-ainej ohdannaisen vasta-aineketj ua.
10. 10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että vasta-aineketju on jonkin patenttivaatimuksista 2-3 mukainen scFv-fragmentti.
11. 11. Menetelmä jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukaisen monoklonaalisen vasta-aineen tai sen fragmentin tai johdannaisen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että - viljellään patenttivaatimuksen 9 mukaista isäntäsolua, joka kykenee ilmentämään vähintään yhtä vaadituista vasta-aineketjuista, ja - otetaan talteen mainittu vasta-aine, fragmentti tai johdannainen.
12. 12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu lisäksi siitä, että - komponenttiketjut yhdistetään talteenottovaiheen jälkeen, - yhdistetyt komponenttiketjut tuodaan toiseen isäntäsoluun, ja - otetaan talteen mainitut yhdistetyt komponenttiketjut.
13. 13. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu lisäksi siitä, että se sisältää '; mainitun vasta-aineen tai vasta-ainejohdannaisen leimaus vaiheen.
14. 14. Menetelmä jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukaisen monoklonaalisen vasta-aineen tai sen fragmentin tai johdannaisen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että » - tuotetaan synteettisesti ainakin osa mainitusta vasta-aineesta tai vasta-ainej ohdannaisesta.
15. 15. Faagi tai mikrobisolu, tunnettu siitä, että se esittelee patenttivaatimuksen 2 tai 3 mukaista vasta-ainefragmenttia osana fuusioproteiinia, jonka vasta-ainefragmentti muodostaa yhdessä pintaproteiinin kanssa.
16. 16. Menetelmä patenttivaatimuksen 2 tai 3 mukaisen vasta-ainefragmentin selektoimiseksi, tunnettu siitä, että mainittu vasta-ainefragmentti selektoidaan vasta- 112201 ainefragmenttien näyttökirjastosta, joka sisältää patenttivaatimuksen 15 mukaisen faagin tai solun.
17. 17. Menetelmä heveiinin määrittämiseksi näytteessä, tunnettu siitä, että - saadaan mainittu näyte, ja - määritetään heveiini käyttämällä jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukaista monoklonaalista vasta-ainetta tai sen fragmenttia tai johdannaista.
18. 18. Testivälinepakkaus, tunnettu siitä, että se sisältää jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukaisen vasta-aineen tai sen fragmentin tai johdannaisen vasta-aineen kuljettamiseen ja varastoimiseen sopivassa astiassa.
19. 19. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen monoklonaalinen vasta-aine tai sen fragmentti tai johdannainen käytettäväksi immunodiagnostiikassa.
20. 112 G 01