CN117777285A - 靶向胰腺多肽的纳米抗体、编码序列及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物工程技术领域，特别是涉及靶向胰腺多肽的纳米抗体、编码序列及其应用。本发明提供的纳米抗体是以胰腺多肽为免疫抗原对羊驼进行免疫后，通过建库淘选得到的单域抗体，能够特异性结合血清中胰腺多肽，能以ELISA的方法检测鸡、羊和人血清中的胰腺多肽。

Description

靶向胰腺多肽的纳米抗体、编码序列及其应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，特别是涉及靶向胰腺多肽的纳米抗体、编码序列及其应用。

背景技术

骆驼科动物(羊驼、骆驼)和软骨鱼体内的一种天然缺失重链且具有生物活性的特异性抗体称为单域抗体，单域抗体的抗原结合位点(VHH)具有独立的抗原识别能力，独立表达的VHH又被称为纳米抗体。与传统的四联体抗体相比，单域抗体的主要特点有：分子量小，结构简单，理化性质稳定等。纳米抗体得优良特性使其在多种方面具有优势：在抗体进入机体方面纳米抗体能够穿过动物机体内的一些保护性的屏障进入发病部位发挥作用，如血脑屏障、血睾屏障等；在抗原抗体结合方面能够结合一些隐蔽的抗原表位，特别适用于比较难得到抗体的靶点，如GPCR、离子通道和酶活中心等；在降低生产成本方面纳米抗体结构简单易于体外表达，同时体外表达不易产生包涵体，生产工艺简单；同时纳米抗体的分子量小，结构简单，更有利于进行基因改造，纳米抗体人源化修饰等特性。

胰腺多肽(Pancreatic Polypeptide，PP)是从胰腺中纯化胰岛素时发现的副产品，哺乳动物的胰腺多肽功能区是由36个氨基酸组成的线性肽，其结构保守，在哺乳动物中只有1～2个氨基酸的差异。在正常胰腺中，外于其外围区的郞格罕斯岛的F细胞分泌胰腺多肽，是神经肽Y(NPY)家族成员。胰腺多肽作为生物标记物之一，对辅助性诊断胰腺神经内分泌肿瘤具有重要意义。但目前缺乏对胰腺多肽特异性好的单域抗体。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了靶向胰腺多肽的纳米抗体、编码序列及其应用。本发明提供的纳米抗体是一种利用羊驼筛选得到的单域抗体对胰腺多肽抗原具有较好的特异性。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了靶向胰腺多肽的纳米抗体，氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明提供了上述技术方案所述纳米抗体的编码序列，所述编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。

本发明提供了一种含有上述技术方案所述编码序列的表达载体。

优选的，所述表达载体的原始载体包括pET28a载体。

本发明提供了一种含有上述技术方案所述表达载体的工程菌。

优选的，所述工程菌的原始菌株包括大肠杆菌(Escherichia coli)。

优选的，所述大肠杆菌包括大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明提供了上述技术方案所述的纳米抗体或上述技术方案所述的编码序列或上述技术方案所述的表达载体或上述技术方案所述的工程菌在制备检测胰腺多肽的产品中的应用。

优选的，所述产品包括利用ELISA法检测的试剂或试剂盒。

有益效果：

本发明提供了靶向胰腺多肽的纳米抗体，氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。本发明提供的纳米抗体是以胰腺多肽为免疫抗原对羊驼进行免疫后，通过建库淘选得到的单域抗体，能够特异性结合血清中胰腺多肽，能以ELISA的方法检测鸡、羊和人血清中的胰腺多肽。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为实施例1中步骤(c)的SDS-PAGE鉴定结果；

图2为实施例1中步骤(d)纯化后样品的SDS-PAGE鉴定结果；

图3为实施例1中步骤(d)酶切后样品的SDS-PAGE鉴定结果；

图4为第一轮PCR-VHH凝胶电泳图；

图5为第二轮PCR-VHH电泳图；

图6为平板检测胰腺多肽纳米文库库容结果；

图7为平板检测胰腺多肽纳米文库丰度结果；

图8为PCR检测胰腺多肽文库插入率结果；

图9为SDS-PAGE检测纯化的胰腺多肽纳米抗体结果；

图10为三种胰腺多肽的纳米抗体的ELISA检测结果；

图11为Western Blot法检测纯化的胰腺多肽纳米抗体结果；

图12为ELISA法检测动物和人血清中胰腺多肽含量结果。

具体实施方式

本发明提供了靶向胰腺多肽的纳米抗体，氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明提供了上述技术方案所述纳米抗体的编码序列，所述编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，具体如下：5'-GAGTCTGGAGGGGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGAAGGCCCTTCAGTATCTATGCCATGGGCTGGTACCGCCAGGCGCCAGGGAAGCAGCGCGAGTTGGTTGCAGCTATTACTAGTGGTGGGAGCACAAACTATGCAGACTCCGTGAAGGGTCGATTTACGATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACATGGTGTATCTGCAAATGGACAGCCTGAAACCCGAGGACACGGCCGTCTATTACTGTAATGCAGACCCCCCCTTAGGAGATACCGACTATGACGACTATGCGTACTGGGGCCAGGGGACCGACGTCACCGTCTCCTCA-3'。

本发明提供了一种含有上述技术方案所述编码序列的表达载体。在本发明中，所述表达载体的原始载体优选包括pET28a载体；所述编码序列优选位于pET28a载体的BamHⅠ和SalⅠ酶切位点之间。构建所述表达载体时，所述编码序列的制备方法优选包括人工合成或PCR扩增；所述PCR扩增时的引物优选如SEQ ID No.8和SEQ ID No.9所示；所述PCR扩增优选包括人工合成的编码序列或实施例中测序结果正确的克隆株的甘油菌。

本发明提供了一种含有上述技术方案所述表达载体的工程菌。在本发明中，所述工程菌的原始菌株优选包括大肠杆菌；所述大肠杆菌优选包括大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明提供了上述技术方案所述的纳米抗体或上述技术方案所述的编码序列或上述技术方案所述的表达载体或上述技术方案所述的工程菌在制备检测胰腺多肽的产品中的应用。在本发明中，所述产品优选包括利用ELISA法检测的试剂或试剂盒。本发明提供的胰腺多肽纳米抗体具有与动物和人血清中胰腺多肽的结合性，且灵敏度和亲和性好。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的靶向胰腺多肽的纳米抗体、编码序列及其应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

免疫抗原的制备：

(1)根据NCBI数据库下载胰腺多肽对应的核苷酸序列(GeneBank登陆号：NM_001319209.2)，将胰腺多肽序列插入到带有融合标签N-His-Sumo的质粒pSumo-Mut中，获得pSumo-Mut-胰腺多肽重组质粒；所述胰腺多肽序列如SEQ ID NO.15所示，具体为5'-GCTCCCCTAGAACCAGTATATCCTGGAGATAACGCGACCCCGGAACAAATGGCACAGTATGCGGCGGACCTGCGTCGTTACATCAATATGTTGACCCGTCCGCGCTACGGCAAGCGCCACAAAGAAGATACGCTCGCGTTCAGCGAGTGGGGTAGCCCACATGCTGCCGTTCCGCGTGAGCTGTCCCCGCTGGACTAA-3'；所述胰腺多肽序列位于质粒pSumo-Mut的His-Sumo标签的ggc碱基之后。

(2)将pSumo-Mut-胰腺多肽重组质粒和pSumo-Mut质粒分别转化入BL21(DE3)菌株并获得相应的胰腺多肽表达菌株进行诱导表达和蛋白的纯化，具体方法为：

(a)将转化后涂板后的菌液进行过夜培养，次日挑取培养板上的单克隆菌落过夜培养；将过夜培养的菌液进行保菌，得到甘油菌。

(b)按照1：1000体积比将甘油菌接种于含Kana(终浓度为50ng/μl)抗性的TB培养基中，37℃振荡培养过夜；第二天将过夜培养的菌液按照1：100体积比转接到1L新鲜的TB培养基中，37℃，200rpm振荡培养至OD₆₀₀＝0.8，加入终浓度为0.2mM IPTG，15℃，120rpm过夜诱导，同时设置未诱导的对照组。

(c)收集过夜诱导的菌液，7000×g离心10min获得菌体；用PBS重悬洗涤两次后使用超声破碎仪进行破碎(300W，30min)；20000×g，4℃离心1h。收集离心后上清，取小部分进行SDS-PAGE鉴定，结果见图1，其中，M：蛋白质分子质量标准，1：pSumo-mut诱导(空载)，2：未诱导，3：诱导后，4：诱导破碎后上清，5：诱导破碎后沉淀；其余放-80℃保存备用。

(d)将获得的上清液通过预装镍柱进行亲和层析纯化，纯化后的样品进行SDS-PAGE鉴定蛋白纯度及浓度，结果见图2，其中，M：蛋白质分子质量标准，1：破碎后处理样品，2：样品通过镍柱后流出的液体，3～5：洗脱液。将纯化好的蛋白通过酶切(Sumo蛋白酶)将标签切掉，随后再次通过镍柱检测标签是否切除成功，结果见图3，其中，M：蛋白质分子质量标准，1：酶切前蛋白，2：酶切后蛋白，3：酶切后与Ni-IDA填料孵育后流出液。将酶切后的蛋白作为免疫抗原进行后续文库的构建。

实施例2

羊驼源抗胰腺多肽纳米抗体文库，构建方法如下：

1、将实施例1制备的免疫抗原与佐剂按体积比为1：1配制，将得到的配制物乳化后按200μg/次分点皮下免疫羊驼四次，每次间隔两周，除第一次免疫所用佐剂为完全弗氏佐剂外，其他次免疫所用佐剂为不完全弗氏佐剂；

2、第4次免疫后1周采集50ml羊驼抗凝血液，分离得到淋巴细胞(2.04×10⁸个)，提取淋巴细胞总RNA，将所述RNA反转录为cDNA，具体方法如下：

将5μg总RNA、1μl Random6 Primer、1μl Oligo(dT)₁₈Primer、1μl dNTP Mix和7μlddH₂O混合后在65℃下处理5min，将得到的处理物在冰上静置5min，将静置物与4μl 5×PrimeScript II buffer、0.5μl RNase inhibiter、1μl Primer Scrip II ReverseTranscriptase和4.5μl ddH₂O混合后，依次40℃处理40min和70℃处理15min，得到cDNA；

3、以步骤2所述cDNA为模板，利用Call001-F和Call002-R引物进行第一轮PCR扩增，其中Call001-F对应羊驼抗体的Leader区，Call002-R对应于羊驼抗体的第二恒定区(CH2)，可分别对常规抗体(900bp)及重链抗体(700bp)的leader区及CH2区域进行PCR扩增；反转录产物分成30个反应，引物序列如下：

Call001-F：5'-GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG-3'，SEQ ID No.1；

Call001-R：5'-GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC-3'，SEQ ID No.2；

所述PCR扩增的反应体系为：2μl cDNA、浓度为10umol/μl的Call001-F1μl、浓度为10umol/μl的Call001-R 1μl、25μl Taq Green PCR Mix(康为世纪)和21μl ddH₂O；反应程序为：95℃5min；95℃30s，53℃30s，72℃40s，30个循环；72℃5min；

4、琼脂糖凝胶电泳分析第一轮PCR反应产物主要包含传统抗体(900bp)和重链抗体(700bp)的两种扩增产物(见图4)，紫外灯下切胶回收700bp的核酸，胶回收试剂盒(康为世纪)回收纯化700bp的核酸片段，1μl胶回收产物与pMD-19T载体相连，得到连接产物；连接体系为：pMD-19T载体1μl，胶回收产物1μl，Solution I 5μl，ddH₂O补足至10μl；反应条件为：4℃反应过夜；

5、将连接产物与DH5α感受态细胞混匀，冰上孵育25min，42℃精确热激90s，冰上孵育4min，加入400μl的LB培养基37℃、200rpm孵育40min，50μl转化后的菌液均匀的涂布到含有氨苄青霉素(AMP，终浓度为100μg/mL)的LB固体培养基表面，培养板倒置，37℃过夜培养；次日挑取20个单克隆菌落接种到5ml含有AMP抗性的LB液体培养基过夜培养后测定其碱基序列；

6、根据测序结果，在羊驼单域抗体(VHH结构域)的两端恒定区FR1、FR4区域分别设计建库用的第二轮PCR引物VHH2-F和VHH2-R，共做24个PCR反应，引物序列如下：

VHH2-F：5'-TTTCTATTACTAGGCCCAGCCGGCCGAGTCTGGAGGRRGC TTGGTGCA-3'，SEQ IDNo.3；

VHH2-R：5'-AAACCGTTGGCCATAATGGCCTGAGGAGACGRTGACSTS GGTC-3'，SEQ IDNo.4；

第二轮PCR的反应体系为：浓度为800μg/μl的700bp扩增产物6μl、浓度为10μmol/μl的VHH2-F 2μl、浓度为10μmol/μl的VHH2-R 2μl、Taq Green PCR Mix 25μl和ddH₂O 15μl；反应程序为：95℃5min；95℃30s，56℃30s，72℃30s，30个循环；72℃5min；

7、取2μl第2轮PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测(见图5)并使用核酸纯化试剂盒说明书进行纯化，扩增产物(VHH片段)大小为400bp左右，条带单一，大小与预期相符；

8、将步骤7得到的扩增产物和pCANTAB5e载体(北京宝科维食安生物技术有限公司)分别进行二轮酶切以消除空载率，反应所用酶为Sfi I(Thermo)；第一轮VHH和载体都做20个反应的酶切，反应条件：50℃水浴酶切1h；PCR产物纯化试剂盒纯化VHH体系；载体酶切体系先进行琼脂糖纯化，然后采用胶回收试剂盒纯化；一轮酶切后的纯化产物再度50℃水浴、酶切1h，两种产物再度纯化；

9、酶切产物连接及纯化：两轮酶切纯化后的VHH片段和载体pCANTAB5e进行连接，连接采用T4连接酶(Thermo)，反应体系为：VHH片段1μg、pCANTAB5e载体3μg、T4 DNA Ligase10μl、10×Buffer 20μl，ddH₂O补充至200μl；反应体系瞬时涡旋，4℃反应过夜。次日按说明书进行连接产物的纯化；

10、胰腺多肽纳米抗体文库的构建及特性鉴定：将纯化后的pCANTAB5e-VHH连接产物(总体积100μl)加入刚制备的新鲜TG1电转化感受态细胞，吹打混匀，冰浴10min；在电压1.8KV，电阻200Ω，电容25μF，时间5ms的条件下，在电转仪中进行转化后，将电转杯中点击后的TG1细胞转移至50ml无菌离心管中，37℃振荡孵育1h；孵育过的菌液5000g离心5min，弃净上清，重新加入8ml新鲜的SOC培养基重悬沉淀；取100μl菌液梯度稀释后涂布到16个2×YTAG的固体培养板(90mm)测定库容，每个梯度两个平板，共做8个梯度平板，剩余菌液涂布到30个2×YTAG固体培养板(150mm平板)，25℃静置培养箱培养过夜；次日待培养板菌落长好后，39个150mm的平板中每个平板加入5ml的2×YT液体培养基清洗菌落收集清洗液；5000g、4℃、离心12min，加入含15％甘油的2×YT液体培养基90ml重悬沉淀，分管密封后即为制备的初级文库菌，命名为胰腺多肽纳米抗体文库，取100μl初级文库菌用于测定文库丰度，其余分装冻存于-70℃；

11、文库库容的测定：100μl电转后的菌液梯度稀释，稀释度从10^-1～10^-8；每个稀释度各取100μl涂布2个2×YTAG固体培养板，25℃培养过夜；次日对梯度板的菌落进行统计，计算库容，结果见图6，其中10^-6稀释平板上有3个单克隆菌落，库容为3÷(100×10^-6)×30×10³＝9×10⁸个；

12、文库丰度的测定：取100μl初级文库菌液进行梯度稀释，稀释度从10^-4～10^-10；每个稀释度各取100μl菌液涂布2个2×YTAG固体培养板，25℃培养过夜；次日对梯度板的菌落进行统计(图7)，计算文库丰度，文库的丰度为50÷(100×10^-10)×10³＝5×10¹²个/ml；

13、文库VHH片段插入率及插入多样性的测定：待文库库容大小测定后，从测定库容的固体培养板中随机挑取60个单克隆菌落接种于1ml 2×YTAG培养基，37℃振荡培养过夜；次日，对60个克隆进行菌液PCR鉴定，并将剩余的菌液送测序公司进行测序；分析PCR鉴定结果及测序结果，计算VHH片段的插入率及插入的多样性。

60个菌液PCR样品中均符合VHH片段长度(图8)，60个测序样品只有2个克隆测序结果不合格，并非VHH片段，测序合格的样品序列NCBI分析发现其都是VHH序列，因此可计算文库VHH片段的插入率为100％，序列的多样性为97％。软件分析58个样品序列对应的氨基酸序列，分析其结构，可见胰腺多肽纳米抗体文库分为分区明显的恒定区及可变区域，以上均说明本发明构建的胰腺多肽纳米抗体文库是一个特性很好的免疫文库，适合用于特异性纳米抗体的筛选。

实施例3

将实施例2制备的胰腺多肽纳米抗体文库进行第一轮淘洗，得到胰腺多肽-VHH1，分装冻存于-70℃。

淘洗时用50mM碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液作为包被缓冲液，包被浓度20μg/ml，包被体积2ml，以胰腺多肽包被免疫管。

淘洗方法如下：

1)将500μl实施例2制备的胰腺多肽纳米抗体文库接种于100ml 2×YTAG培养基，37℃200rmp振荡培养1小时至OD₆₀₀为0.4；

2)加入KM13辅助噬菌体，100ml菌液加100μl KM13辅助噬菌体，37℃静置感染30分钟，而后振荡培养30分钟；

3)4000×g离心10分钟，去除培养基上清，用100ml 2×YTAK培养基重悬菌体沉淀，30℃200rmp振荡培养过夜；

4)次日上午11000×g，4℃离心过夜培养菌液10分钟，将上清转至新的离心瓶并加入20ml PEG/NaCl溶液，混匀冰浴70分钟；

5)11000×g，4℃离心30分钟，弃上清，而后再次离心2分钟，彻底吸尽上清；

6)使用2.6ml PBS缓冲液重悬沉淀，而后将其分装于2个1.5ml离心管中，11600×g离心10分钟；

7)回收上清，命名为ZJ-胰腺多肽-VHH1，取100μl待用于滴度测定，剩余同1.6mlMPBS溶液混合，室温共孵育1h，得到混合液(MPBS溶液处理过的噬菌体上清)，待用。

包被蛋白处理：

(1)包被蛋白次日，将免疫管内的液体倒出，使用PBS缓冲液洗管3次。

(2)在每管中加满MPBS，室温封闭2h后使用PBS缓冲液洗管3次。

(3)在免疫管中加入2ml上述步骤7)得到的混合液，室温孵育2h后使用PBST溶液洗管10次，而后用PBS缓冲液洗管10次。

(4)在每管中加入2ml 100mM TEA溶液，室温轻摇15min洗脱结合的噬菌体，而后加入2ml Tris-HCl溶液中和。

(5)将洗脱的噬菌体(命名为XT-胰腺多肽-VHH1)转至50ml离心管，并加入16mlOD₆₀₀为0.4的TG1菌液，37℃水浴30分钟，使洗脱的噬菌体感染TG1菌液，并在免疫管内加入4ml的OD₆₀₀为0.4的TG1菌液进行感染，最后合并，总共24ml的体积。

(6)取100μl菌液待用于滴度测定，剩余菌液于4000g离心10min。

(7)使用1ml 2×YT培养基重悬菌体沉淀，将重悬后的菌液涂布于5个2×YTAG固体培养板(150mm平板)，置于30℃孵箱培养过夜。

(8)次日用2×YT培养基收集平板上长出的菌落，加入60％的甘油至终浓度为15％，其即为一级文库菌，命名为胰腺多肽-VHH1，分装冻存于-70℃。

测定拯救噬菌体滴度：ZJ-胰腺多肽-VHH1进行梯度稀释，稀释度从10^-7～10^-13；每个稀释度取10μl噬菌体感染190μl OD₆₀₀为0.4的TG1菌液；每个稀释度取100μl菌液涂布2×YTAG固体培养板，置于30℃培养箱培养过夜；对测定板上的菌落计数，计算ZJ-胰腺多肽-VHH1滴度(记为ZJ)。

测定洗脱噬菌体滴度：将XT-胰腺多肽-VHH1进行梯度稀释，稀释度从10^-1～10^-5；每个稀释度取100μl菌液涂布2×YTAG固体培养板，置于30℃培养箱培养过夜；对测定板上的菌落计数，计算XT-胰腺多肽-VHH1滴度(记为XT)；进而计算第一轮淘洗的输入输出比ZJ/XT。

在一轮淘洗的基础上，依次进行二至四轮淘洗：胰腺多肽包被浓度分别为10μg/ml、5μg/ml、5μg/ml；拯救噬菌体滴度测定稀释度分别为10^-7～10^-12、10^-8～10^-11、10^-8～10^-11；洗脱噬菌体滴度测定稀释度分别为10^-1～10^-6、10^-1～10^-6、10^-1～10^-6；洗脱的噬菌体用Tris-HCl溶液(1M，pH值为7.4)中和后，取200μl噬菌体感染800μl OD₆₀₀为0.4的TG1菌液(取100μl进行梯度稀释，剩余的进行保菌)，而后做10^-3～10^-6共4个稀释度，每个稀释度涂布3个2×YTAG固体培养板(150mm平板)，每板100μl菌液，置于30℃培养过夜；对培养板菌落计数，计算滴度，并将培养板标记为平板，置于4℃冰箱待用。

特异性纳米抗体的筛选：

单克隆噬菌体上清的制备：从平板各挑取192个单克隆菌株分别接种到2块96孔深孔培养板中，每孔均含200μl 2×YTAG培养基，培养板分别标记为PP-1、PP-2，于30℃振荡培养。8h后，从每孔中吸取20μl菌液接种于180μl2×YTAG培养基，于37℃振荡培养，原平板的剩余菌液中则加入60μl 60％的甘油至终浓度为15％，冻存于-80℃。转接平板振荡培养1h后，在每孔中加入20μl KM13和YTAG混合(60μl KM13+12ml 2×YTAG)辅助噬菌体，37℃静置感染30min，而后37℃振荡培养40min。1800×g离心深孔板10min，弃上清并在每孔中加入400μl 2×YTAK培养基重悬沉淀，30℃振荡培养过夜。次日，最大转速2020xg离心20分钟，从各孔中吸250μl噬菌体上清转移至新的深孔板中，并在每孔中加入250μl封闭液(含3％BSA的PBS缓冲溶液)常温共孵育1小时，待用于间接ELISA检测。

特异性单克隆噬菌体的鉴定：

通过间接ELISA试验检测噬菌体上清同胰腺多肽的反应性，具体方法如下：使用胰腺多肽包被96孔酶标板，包被浓度为2μg/ml，每孔100μl，置于4℃过夜。次日弃孔内包被液体(Solarbio，C1050)，在每孔中加入100μl封闭液(3％BSA+PBS)于37℃封闭1h。弃孔内封闭液，在每孔分别中加入100μl封闭液处理过的四轮筛选得到的噬菌体上清作为一抗，37℃孵育1h。用PBST洗液洗板12次。在每孔中加入100μl二抗(HRP-M13 Antibody，稀释度1：10000)，37℃孵育1h。用PBST洗液洗板12次。在每孔中加入100μl显色底物(TMB显色液，Solarbio，PR1200)，避光反应5～15min，而后在每孔中加入100μl终止液(Solarbio，C1050)终止反应。将96孔酶标板置于读板机上读取OD₄₅₀吸收值。对ELISA结果进行分析并确定阳性孔号。同时设置PBS为阴性对照。

通过间接ELISA方法检测192个单克隆对应的噬菌体上清同胰腺多肽的反应性，根据间接ELISA试验的结果挑选出了20个单克隆，这些单克隆均同胰腺多肽有较好的反应性，结果见表1。

表1胰腺多肽单克隆ELISA筛选结果(OD₄₅₀吸收值)

将20个单克隆的培养菌液送测序公司测序，经测序并预测(合并重复)的氨基酸序列为：

Nb1胰腺多肽纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，具体为：ESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRPFSIYAMGWYRQAPGKQRELVAAITSGGST NYADSVKGRFTISRDNAKNMVYLQMDSLKPEDTAVYYCNADPPLGDTDYDD YAYWGQGTDVTVSS；

Nb2胰腺多肽纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，具体为：ESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFTFDEYVIGWFRQAPGKEREGISCISSSDGIAY YADSVSGRFTISTDIAKSTVYLQMDSLKPEDTAVYYCAKDRGMWGGYDYWG QGTEVTVSS；

Nb3胰腺多肽纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，具体为：SLVQPGGSLRLSCTASDFALQDQTIGYFRQIPGKEREGVSCISTREQSTYYADS VKGRFTIGRDNANNAVYLQMNSLKPEDSAVYYCAADLSGGCRSWHRPSVRY GMDYWGKGTHVIVSS。

实施例4

胰腺多肽纳米抗体活性和亲和性

原核表达重组质粒的构建：将实施例3中测序结果正确的克隆株的甘油菌接种5ml2×YTAG培养基培养，并利用质粒小量提取试剂盒提取质粒作为原核表达的模板质粒(也可以利用人工合成的核苷酸序列作为模板)。之后设计用于原核表达的引物，并在引物的5'端和3'端分别引入BamHⅠ和SalⅠ酶切位点。利用设计的引物扩增纳米抗体VHH序列，并通过上述酶切位点将其连接入pET28a原核表达载体，构建纳米抗体原核表达重组质粒以进行纳米抗体的胰腺多肽特异性鉴定。

原核表达的引物：

Nb1-F：5'-CGGATCCGAGTCTGGAGGGGGCTTGG-3'，SEQ ID No.8；

Nb1-R：5'-GCGTCGACTGAGGAGACGGTGACGTCG-3'，SEQ ID No.9；

Nb2-F：5'-CGGATCC GAGTCTGGAGGAGGCTTGGT-3'，SEQ ID No.10；

Nb2-R：5'-GCGTCGACTGAGGAGACGGTGACCTCG-3'，SEQ ID No.11；

Nb3-F：5'-CGGATCCGAGTCTGGAGGAGGCTTGGT-3'，SEQ ID No.12；

Nb3-R：5'-GCGTCGACTGAGGAGACGATGACGTGGG-3'，SEQ IDNo.13。

筛选步骤如下：将重组质粒和pET28a空载转化入BL21(DE3)菌株并获得相应的纳米抗体表达菌株。而后对纳米抗体进行诱导表达，具体方法为：

将转化后涂板后的菌液进行过夜培养，次日挑取培养板上的单克隆菌落过夜培养。将次日培养的菌液进行甘油保菌。

第二天吸取50μl菌液接种5ml Kan⁺抗性的LB培养基，各接种2管，37℃振荡培养至OD₆₀₀为0.6；在其中1管菌液中加入IPTG诱导(终浓度0.8mM)，另1管不加IPTG做为未诱导对照，15℃振荡培养过夜；同时做BL21(DE3)空菌株对照，空菌株对照培养使用无抗性的LB培养基。

纳米抗体的SDS-PAGE鉴定，具体方法为：

分别吸取1ml诱导培养、未诱导培养的菌液于1.5ml离心管，13000rpm离心2min；弃上清，使用PBS缓冲液洗涤菌体沉淀2次；用20μl PBS缓冲液重悬菌体沉淀，而后加入5μl 5×蛋白上样缓冲液，并于沸水中煮样5分钟。用15％的聚丙烯酰胺凝胶对样品进行电泳。待电泳结束后，用考马斯亮蓝染液染胶1h，而后用脱色液进行脱色，结果见图9。由图9可知，在咪唑浓度为75nM时，目的蛋白成功被洗脱，并收集得到的蛋白条带单一表明纯度较高，可用于后续实验。

具有抗胰腺多肽中和活性的纳米抗体的筛选：分别将实施例3筛选出的Nb1、Nb2、Nb3的纳米抗体对应甘油菌株接种于5ml Kan⁺抗性的LB培养基，37℃振荡培养10h后转接到500ml Kan⁺抗性的LB培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀为0.6时加入IPTG(终浓度0.8mM)诱导表达，15℃振荡培养过夜。次日，对上述3株甘油菌表达的3种纳米抗体进行纯化。

纯化产物的鉴定：将胰腺多肽蛋白按照2μg/ml浓度进行包被，100μL/孔，同时以包被液为空白对照，置于4℃过夜。次日，弃去孔内包被液体，每孔加入100μL封闭液(3％BSA)于37℃封闭1h。弃去孔内封闭液，在每孔中分别加入PBS稀释的Nb1、Nb2、Nb3，并以PBS作为阴性对照，37℃孵育1h。用PBST洗液洗板10次，在每孔加入100μL His标签抗体(1：15000)，37℃1h。用PBST洗板10次，在每孔中加入100μLTMB单组份显色液，避光反应10min。而后再加入100μL/孔ELISA终止液终止反应。随后用酶标仪检测OD₄₅₀nm值，最终以P(阳性)/N(阴性)≥2.1为阳性。结果见图10。

由图10可知，亲和性最好的胰腺多肽纳米抗体为Nb1，并对该抗体用WesternBlotting法进行His标签鉴定：经SDS-PAGE电泳后，转到NC膜，直接用His二抗进行标记，经显影术显示抗体，结果见图11。由图11可知，出现His阳性印迹条带，且分子量大小约为17kDa，符合纳米抗体大小。

胰腺多肽纳米抗体的应用：通过ELISA包被不同鸡、羊和人血清，以纯化得到的胰腺多肽纳米抗体Nb1作为一抗，His标签抗体(购自康为世纪，货号CW0285)作为二抗进行标记显色，显示血清中胰腺多肽，具体方法如下：

将鸡血清、羊血清和人血清与ELISA包被液按照1：1的比例进行包被，100μL/孔，同时以包被液为空白对照，置于4℃过夜。

次日，弃去孔内包被液体，每孔加入100μL封闭液(3％BSA)于37℃封闭1h。弃去孔内封闭液，在每孔中分别加入PBS稀释的Nb1，以PBS作为阴性对照，37℃孵育1h。用PBST洗液洗板10次，在每孔加入100μL His标签抗体(1：15000)，37℃1h。用PBST洗板10次，在每孔中加入100μL TMB单组份显色液，避光反应10min。而后再加入100μL/孔ELISA终止液终止反应。随后用酶标仪检测OD₄₅₀nm值，最终以P(阳性)/N(阴性)≥2.1为阳性。结果见图12。

通过ELISA检测，发现在待检测鸡血清、羊血清和人血清中均有胰腺多肽阳性反应，说明纯化得到的该胰腺多肽纳米抗体可用于血清中胰腺多肽的检测。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (9)

1.靶向胰腺多肽的纳米抗体，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

2.权利要求1所述纳米抗体的编码序列，其特征在于，所述编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。

3.一种含有权利要求2所述编码序列的表达载体。

4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体的原始载体包括pET28a载体。

5.一种含有权利要求3或4所述表达载体的工程菌。

6.根据权利要求5所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌的原始菌株包括大肠杆菌(Escherichia coli)。

7.根据权利要求6所述的工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌包括大肠杆菌BL21(DE3)。

8.权利要求1所述的纳米抗体或权利要求2所述的编码序列或权利要求3或4所述的表达载体或权利要求5～7任一项所述的工程菌在制备检测胰腺多肽的产品中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述产品包括利用ELISA法检测的试剂或试剂盒。