CN108503707B - 一种抗弓形虫sag1的纳米抗体及其编码基因和应用 - Google Patents

一种抗弓形虫sag1的纳米抗体及其编码基因和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗弓形虫SAG1的纳米抗体及其编码基因和应用，纳米抗体的VHH链氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。所述纳米抗体包括两条VHH链。本发明抗弓形虫SAG1纳米抗体由弓形虫SAG1抗原免疫骆驼后获得抗SAG1纳米抗体库，然后从该纳米抗体库中筛选获得的性能较好的一个，具有高度水溶性和构象稳定性，较强的抗原亲合力和优良的组织穿透能力，并且与SAG1抗原具有较高的亲和性，亲和常数KD值为1.66nM，能够高效检测弓形虫，可用于制备弓形虫检测试剂盒。

Description

一种抗弓形虫SAG1的纳米抗体及其编码基因和应用
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，特别是涉及一种抗弓形虫表面抗原SAG1的纳米抗体及其编码基因和应用。
背景技术
弓形虫病是一种由刚地弓形虫(Toxoplasma gondii，T.gondii)引起的人畜共患性原虫病。弓形虫通过胎盘传给胎儿主要发生在母体急性感染阶段，一旦其侵入胎盘，则95％的胎儿不能幸免，直接影响胎儿发育、严重致畸甚至死亡，可使孕妇流产、死产和早产，同时增加妊娠的合并症。先天性弓形虫病患儿临床表现较为典型，一般具有脑积水或小脑畸形、脑钙化灶、脉络膜视网膜炎以及智障、痉挛、麻痹等精神运动障碍四大特征。胎儿受染率在妊娠早、中、晚期分别为17％、25％和65％，当感染出现在第8-24周时，胎儿受损最为严重。随着现代饮食习惯的改变和家养宠物的增多，我国弓形虫病的感染率呈逐年上升趋势。2006-2012年的调查数据显示：上海、长春和大庆三大城市正常健康人群感染率超过11％，由此推算总感染人数约1.4亿。在感染率较高的法国、美国、波兰等欧美国家，对育龄妇女和孕妇有强制性的监测法规，并取得了较好的预防先天性弓形虫病的效果。在我国，弓形虫的感染检测也已列为孕妇优生五项(TORCH)指标之一。
弓形虫病的临床诊断病例判断需要合并临床症状与流行病史，同时符合病原学分离阳性、核酸阳性或循环抗原(Circulating antigen，CAg)阳性中的任一条。传统的直接镜检，动物接种等病原学检查方法费时费力、检出率低，易漏检。以弓形虫基因组中SAG1、B1和529bp重复序列等为靶基因建立的PCR和环媒介导恒温扩增等核酸快速检测技术，具有灵敏度高的优点，对于弓形虫感染的早期诊断具有重要意义，但分子诊断技术容易形成气溶胶污染，加上目前国内大多数实验室不能严格分区，存在一定的假阳性。循环抗原检测能反映感染虫荷，是早期、现症感染和疗效考核的指标。然而，目前经国家食品药品监督管理总局批准的弓形虫病检测试剂只包含IgG和IgM抗体的检测。仅抗体水平测定不能全面反映弓形虫感染情况，极可能造成一部分现症患者的漏诊。CAg阳性可作为急性、现症感染的参考依据；IgM抗体阳性具有早期诊断价值；IgG抗体阳性可诊断为既往感染，三联联合检测试剂能达到判断病程的目的，然而，由于一般个体内CAg的含量较低，尤其在感染2周后，CAg含量快速下降至低水平。对于轻度和慢性患者，常规CAg检测方法检出率低，无法满足需求。
目前，已知的弓形虫CAg主要分为膜抗原、增强侵入宿主细胞的因子、速殖子的排泄分泌抗原三类。表面膜抗原1(surface antigen 1，SAG1)能够刺激宿主细胞引起抗速殖子的高免反应，有利于包囊形成及虫体的持续感染。SAG1具有特异的免疫反应性，能被弓形虫病病人血清所识别，用其制作的诊断试剂盒诊断弓形虫感染有较高的敏感性和特异性，是弓形虫病诊断和疫苗研究的重要靶分子。骆驼体内存在一种天然轻链缺失的功能性重链抗体(Heavy chain antibodies，HCAb)，克隆该重链抗体的可变区得到最小的抗原结合片段，即纳米抗体(Nanobody，Nb)。纳米抗体的最大优势在于它的体积小。其分子量只有15KDa，不足传统抗体(160KDa)的十分之一。Nb较普通抗体还具有高度水溶性和构象稳定性，较强的抗原亲合力和优良的组织穿透能力，容易体外表达和人源化改造修饰等优点，Nb的以上特性使其在诊断检测领域展现出广阔的应用前景。
发明内容
本发明针对现有技术中的不足，提供了一种抗弓形虫SAG1的纳米抗体及其编码基因和应用，该纳米抗体与弓形虫SAG1具有很高的亲和性，可以用于制备弓形虫检测试剂盒。
一种抗弓形虫SAG1纳米抗体的VHH链，包括三个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示、CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
所示的VHH链，氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
本发明又提供了一种抗弓形虫SAG1的纳米抗体，包括两条所述的VHH链。
本发明又提供了编码所述VHH链，或者所述纳米抗体的基因。
所述的基因，核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
本发明还提供了一种重组表达载体，包含所述的基因。
本发明还提供了一种基因工程细胞，由宿主细胞中导入所述的重组表达载体而得。
所述宿主细胞为大肠杆菌、酵母菌或CHO细胞。
本发明还提供了所述的纳米抗体在制备弓形虫检测试剂盒中的应用。
本发明抗弓形虫SAG1纳米抗体由弓形虫SAG1抗原免疫骆驼后获得抗SAG1纳米抗体库，然后从该纳米抗体库中筛选获得的性能较好的一个，具有高度水溶性和构象稳定性，较强的抗原亲合力和优良的组织穿透能力，并且与SAG1抗原具有较高的亲和性，亲和常数KD值为1.66nM，能够高效检测弓形虫，可用于制备弓形虫检测试剂盒。
附图说明
图1为弓形虫SAG1蛋白重组表达纯化后SDS-PAGE电泳检测结果图。
图2为菌落PCR检测结果图，其中泳道M为标准DNA Marker DL2000，泳道1～20分别代表20个菌落。
图3为8个抗SAG1纳米抗体氨基酸序列进化树分析结果图。
图4为1号克隆株抗SAG1纳米抗体原核表达重组载体的质粒图谱。
图5为1号克隆株抗SAG1纳米抗体原核表达及纯化电泳检测结果图。
图6为亲和性分析结果图。
具体实施方式
实施例1
重组SAG1蛋白，步骤如下：
(1)Trizol法提取获得弓形虫cDNA，根据NCBI上弓形虫SAG1基因序列(GenBank号：HM776940.1)设计PCR扩增引物；
(2)PCR扩增得到片段大小为780bp的SAG1目的基因片段，构建SAG1-pET28a重组载体；
(3)SAG1-pET28a重组载体通过热激法转化感受态细胞BL21，37℃IPTG诱导，表达重组蛋白，收集菌体，超声破碎后，经Ni-NTA镍株纯化，SDS-PAGE验证重组SAG1蛋白获得表达(图1)。
实施例2
构建弓形虫特异性纳米抗体库，步骤如下：
(1)纯化获得弓形虫重组SAG1蛋白(表面膜抗原)，然后用1mg与弗氏佐剂等体积混合，免疫一只骆驼(双峰驼(Camelus bactrianus)，实验在内蒙古赤峰进行，时间为2015年5月)，每周一次，共免疫4次，刺激B细胞表达抗原特异性的纳米抗体；
(2)4次免疫结束后，提取100ml骆驼外周血淋巴细胞并提取总RNA；
(3)反转录合成cDNA并利用巢式PCR(Nest PCR)，扩增得到重链可变区基因VHH；
(4)采用限制性内切酶对Nest PCR的扩增产物和噬菌粒载体pHEN 4进行双酶切，将纯化后的酶切产物按优化后的VHH插入子片段与载体分子摩尔比3∶1进行连接、电转化感受态细胞TG1中，构建弓形虫SAG1纳米抗体文库并测定库容，经平板计数测得所构建的文库库容(living bacteria number)大小为3.6×109。
表1
阳性率 文库库容 滴度(pfu/ml)
18/20 3.6×10<sup>9</sup> 1.99×10<sup>13</sup>
从文库菌落计数的平板上随机挑取20个单菌落，进行菌落PCR鉴定VHH基因的插入率。菌落PCR结果如图2所示，实验组中18个单菌落扩增出了500-750bp的条带，阳性率90％，由此可知，实际的库容为3.24×109。应用双层琼脂平板法，通过噬菌斑计数算得所构建纳米抗体文库的滴度为1.99×1013pfu/ml。
实施例3
特异性纳米抗体的淘选。步骤如下：
(1)将溶解在100mM NaHCO3、pH 8.2的30μg弓形虫重组SAG1蛋白包被在NUNC酶标板上，4℃放置过夜；
(2)第二天加入100μl质量浓度为3％的牛奶，室温封闭2h；
(3)2h后，加入100μl 2×1011pfu含有上述纳米抗体文库的辅助噬菌体，室温作用1h；
(4)第一轮淘选用0.05％PBS+Tween-20洗10遍/第二轮20-25遍，除掉非特异性结合的噬菌体；
(5)用100mM TEA(triethylamine)将与弓形虫重组SAG1蛋白特异结合的噬菌体解离下，并感染处于对数生长期的大肠杆菌TG1，37℃培养1h，产生并纯化噬菌体用于下一轮的淘选，逐步得到富集，结果如表2所示。
表2
淘选轮数 SAG1浓度(μg/mL) 起始数量(pfu) 淘选数量(pfu) 富集度
1 30 2.50×10<sup>11</sup> 6.40×10<sup>5</sup> 3.91×10<sup>5</sup>
2-阳性 20 2.40×10<sup>11</sup> 6.40×10<sup>7</sup> 3.75×10<sup>3</sup>
2-阴性 0 3.00×10<sup>10</sup> 8.60×10<sup>2</sup> 3.49×10<sup>9</sup>
实施例4
用噬菌体的酶联免疫方法(ELISA)筛选特异性单个阳性克隆，步骤如下：
(1)从上述淘选后含有噬菌体的细胞培养皿中，挑选96个单个菌落并接种于含有100μg/ml的氨苄青霉素的TB培养基中，生长到对数期后，加终浓度1mM的IPTG，28℃培养过夜。
(2)利用渗透法获得粗提抗体，并将抗体转移到经抗原包被的ELISA板中，室温下放置1小时；
(3)用PBST洗去未结合的抗体，加入mouse anti-His antibody(鼠抗His标签抗体，R&D system)，室温下放置1小时；
(4)用PBST洗去未结合的抗体，加入anti-mouse alkaline phosphataseconjugate(羊抗鼠AP标记抗体，sigma)。
(5)用PBST洗去未结合的抗体，加入碱性磷酸酶显色液，在酶标仪上450nm波长读取吸收值。
(6)当样品孔OD值大于对照孔OD值2.1倍以上时，判断为阳性克隆孔。
(7)将阳性克隆孔的菌转摇在含有100μg/ml的氨苄青霉素的TB培养基，提取质粒进行测序。
根据测序结果，应用Vector
Figure BDA0001605690550000051
11.5(Invitrogen，USA)和
Figure BDA0001605690550000052
软件分析各个克隆株，把CDR1、CDR2和CDR3序列相同的株视为同一克隆株，而序列不同的视为不同克隆株。
抗SAG1阳性克隆的基因序列翻译成氨基酸序列，对氨基酸序列进行序列比对，对阳性克隆的基因序列和氨基酸序列进行比对和进化树的分析，确定各个阳性克隆之间在关键位点氨基酸组成上的差异，从而初步确定阳性克隆针对的表位异同(图3)。
表3
克隆 包被SAG1-m 未包被
SAG1-1 2.944 0.100
SAG1-2 2.764 0.096
SAG1-5 2.916 0.105
SAG1-7 2.792 0.138
SAG1-14 2.885 0.099
SAG1-15 2.940 0.102
SAG1-38 2.881 0.101
SAG1-40 2.865 0.091
根据噬菌体ELISA结果显示随机挑选的40个阳性克隆中1、2、5、7、14、15、38、40号克隆株对抗原识别较好，其中1号克隆株最佳，数据如表3所示，1号克隆株抗SAG1纳米抗体的基因序列如SEQ ID No.5所示，纳米抗体的VHH链的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，每个纳米抗体分子有两条VHH链，VHH链的氨基酸序列，由4个框架区FR和3个互补决定区CDR组成，所述框架区FR包括SEQ ID No.6所示的FR1，SEQ ID No.7所示的FR2，SEQ ID No.8所示的FR3，SEQ ID No.9所示的FR4；所述互补决定区CDR包括SEQ ID No.1所示的CDR1，SEQ IDNo.2所示的CDR2，SEQ ID No.3所示的CDR3。
实施例5
抗弓形虫SAG1纳米抗体(1号克隆株)的原核表达，步骤如下：
1、克隆
(1)引物设计
以得到的纳米抗体基因序列设计引物，引物的具体序列如表4所示。
表4
引物 序列(5’-3’)
VHH-F CCC<u>aagctt</u>ATGAAATACCTATTGCCTACGGC(下划线为Hind III酶切位点)
VHH-R ATTT<u>gcggccgc</u>ATGATGATGATGATGGTGCAGGT(下划线为Not I酶切位点)
(2)扩增
以上述得到的抗弓形虫SAG1纳米抗体阳性克隆(1号克隆株)为模板，以VHH-F和VHH-R引物扩增得到纳米抗体目的片段为500bp基因序列，反应程序为：95℃5min；95℃50s，64℃45s，72℃1min；72℃10min。用凝胶回收试剂盒对目的片段进行纯化和回收，连接克隆载体pMD19T-simple后送测序公司进行测序。
(3)双酶切目的片段(带有测序正确的片段的pMD19T-simple质粒)和pET32a原核表达载体，连接目的片段和线性化pET32a载体，构建获得VHH-pET32a重组载体(图4)。
2、转化
(1)取在-70℃保存的感受态细胞BL21，置于冰上溶解，在超净工作台中，加入重组载体，混匀后，冰浴25min；
(2)在提前预热至42℃的水浴锅中水浴45s后，迅速冰浴2min；
(3)在超净工作台中加入1ml无抗性的LB液体培养基，在温度为37℃的摇床上震荡培养1h；
(4)5000rpm离心5min；弃去上层清液，吹打悬浮菌液，并涂布于带有Amp抗性的LB平板上，37℃培养过夜；
3、培养表达
(1)将测序正确的阳性菌落扩大培养，以1∶100的浓度接种于200ml含有Amp+的液体LB培养基中，在37℃摇床上震荡培养；
(2)菌液培养至OD600为0.6时，取出1ml菌液标记为0h。在200ml培养液中按1∶100的比例加入100mM IPTG，继续培养；
(3)每隔2h，从200ml菌液中取出1ml，连续取4次，并依次标记为2、4、6、8；
(4)12000rpm离心1min弃去上清，加入15μl 1×SDS上样缓冲液，样品吹打均匀沸水浴10min，冰浴2min，12000rpm离心5min，保存于-20℃。
4、表达检测
(1)配制分离胶为12％和浓缩胶为5％的SDS-PAGE电泳凝胶；
(2)在电泳槽中加入1×的电泳缓冲液，将配置好的凝胶放入电泳槽，加入样品和蛋白Marker。初始电压为80V，当上层浓缩胶将样品压至一条直线时，将电压调至120V，当溴酚蓝染料迁移至凝胶底部时，停止电泳；
(3)取出凝胶置于玻璃平皿中，加入没过凝胶的考马斯亮蓝染色液，在转速为70rpm的摇床上染色1～2h；
(4)弃去考马斯亮蓝染色液，加入脱色液在摇床上脱色；
(5)将脱色完成的蛋白凝胶置于凝胶成像仪下观察蛋白表达情况，并拍照。
结果如图5所示，泳道1为纯化前的结果，泳道2表示纯化后的结果，箭头所指显示目的蛋白获得了表达。
实施例6
实施例5所得1号克隆株对应纳米抗体的亲和性分析。
(1)将SAG1重组抗原用PBS稀释至3μg/mL，将APS传感器末端置于PBS液中润湿10min以上，在ForteBio Octet Red生物分子互作仪中以baseline(PBST)，Loading(生物素化的抗原)，baseline(PBS-T)的程序将SAG1重组抗原过夜固化于APS传感器上。
(2)将待测的纳米抗体重组表达用PBS蛋白稀释至浓度为6.25nM，12.5nM，25nM，50nM，100nM。
(3)将待测样品200μL和空白对照只含缓冲液(pH7.4的SD buffer(0.1％BSA、0.05％TWEEN 20、溶于pH7.4 10mM PBS))置于检测96孔板中，用ForteBio Octet Red生物分子互作仪对待检样品进行检测。检测程序为：baseline(PBS-T，60s)，Association(待测样品，180s)，disassociation(PBS-T，300s)。
(4)利用Octet数据分析软件CFR Part 11Version 6.x对得到的数据(图6)进行分析，经过数据拟合后得到纳米抗体的结合常数Kon值、解离常数Kdis值以及亲和常数KD值。
表5
Figure BDA0001605690550000071
结果如表5所示，数值中的E表示科学计数法，比如1.66E-09表示1.66×10-9，一号克隆株抗SAG1纳米抗体与弓形虫SAG1抗原的亲和常数KD值为1.66nM。
序列表
<110> 浙江省医学科学院
<120> 一种抗弓形虫SAG1的纳米抗体及其编码基因和应用
<160> 11
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<212> PRT
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<211> 12
<212> PRT
<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)
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Gly Pro Asp Arg Pro Ala Arg Cys Gln Tyr Asp Val
1 5 10
<210> 4
<211> 120
<212> PRT
<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)
<400> 4
His Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Thr Ser Asn Asn Asn
20 25 30
Cys Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Pro Glu Gly Val
35 40 45
Ala Gly Ile Asp Ser Glu Gly Thr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
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<212> DNA
<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)
<400> 5
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tcctgtacag cctctggata caccagcaat aacaactgca tggcctggta ccgccaggct 120
ccgggaaaag agcccgaggg ggtcgccggt attgatagtg aagggaccac aaggtacgca 180
gactccgtga agggccgatt caccatctcc aaagacaacg ccaagaacac tctgtatctt 240
caaatgaaca gcctgaaacc tgaggacacg ggcatgtact actgtggggc aggaccggat 300
cggccggcac ggtgtcagta tgacgtctgg ggccagggga cccaggtcac cgtctcctca 360
<210> 6
<211> 23
<212> PRT
<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)
<400> 6
His Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Thr
20
<210> 7
<211> 14
<212> PRT
<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)
<400> 7
Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Pro Glu Gly Val Ala
1 5 10
<210> 8
<211> 32
<212> PRT
<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)
<400> 8
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Met Tyr Tyr Cys Gly Ala
20 25 30
<210> 9
<211> 11
<212> PRT
<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)
<400> 9
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 10
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 10
cccaagctta tgaaatacct attgcctacg gc 32
<210> 11
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 11
atttgcggcc gcatgatgat gatgatggtg caggt 35

Claims (9)

1.一种抗弓形虫SAG1的纳米抗体的VHH链，包括三个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，其特征在于，CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
2.如权利要求1所述的VHH链，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
3.一种抗弓形虫SAG1的纳米抗体，其特征在于，包括两条如权利要求2所述的VHH链。
4.一种基因，其特征在于，编码如权利要求1或2所述VHH链，或者编码如权利要求3所述纳米抗体。
5.如权利要求4所述的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
6.一种重组表达载体，其特征在于，包含如权利要求5所述的基因。
7.一种基因工程细胞，其特征在于，由宿主细胞中导入如权利要求6所述的重组表达载体而得。
8.如权利要求7所述的基因工程细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌、酵母菌或CHO细胞。
9.如权利要求3所述的纳米抗体在制备弓形虫检测试剂盒中的应用。
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