CN101565465B - 一种抗刚地弓形虫表面抗原1人源抗体Fab片段及其编码基因 - Google Patents

Abstract

本发明属生物技术领域，涉及一种抗刚地弓形虫表面抗原1(SAG1)人源抗体Fab片段及其编码基因和用途。本发明通过构建抗刚地弓形虫人源免疫球蛋白基因文库并经ELISA、稀释凝血酶原时间、测序分析等从库中筛选到抗刚地弓形虫SAG1人源抗体Fab片段，经表达纯化及鉴定，证实所述的人源抗体Fab片段能够特异性识别弓形虫速殖子重组SAG1并与之具有较高的亲和力，与弓形虫速殖子特异性识别。本发明的人源抗体Fab片段，无Fc段，在发挥抑制弓形虫入侵宿主细胞作用的同时，不会激活补体和引起人体免疫反应等病理损害，应用于人体安全可靠。可制备防治弓形虫病的抗体药物或抗体靶向药物。

Description

一种抗刚地弓形虫表面抗原1人源抗体Fab片段及其编码基因

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及抗刚地弓形虫抗原抗体，具体涉及一种抗刚地弓形虫表面抗原1(SAG1)人源抗体Fab片段及其编码基因和用途。

背景技术

刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)简称弓形虫，属于顶复门、真球虫目、弓形虫科，是一种世界性分布的专性细胞内寄生的机会性致病原虫，可引起人兽共患的弓形虫病(toxoplasmosis)。免疫缺损者(如恶性肿瘤、器官移植和应用免疫抑制剂患者，以及免疫缺陷者)感染弓形虫后，导致脑膜炎、肝炎、肺炎等严重的全身性弓形虫病，甚至死亡。由于弓形虫病是艾滋病患者的最重要并发症之一，近些年来随着艾滋病感染率的升高，弓形虫病发病率也不断增高。据调查，30％-40％的艾滋病患者伴有弓形虫病，弓形虫脑炎已成为艾滋病患者死亡的重要原因之一。研究显示，初孕妇女感染弓形虫后，可以经胎盘垂直传播给胎儿，导致流产，畸胎或死胎。受感染的新生儿往往患有先天性弓形虫病而出现各种畸形及智力发育不全等症状，严重影响优生优育。

目前临床上治疗弓形虫病仍以传统的磺胺嘧啶、乙胺嘧啶和叶酸的联合用药为主，虽然具有一定的疗效，但疗程过长，往往由于其抑制骨髓、损害肝脏、易出皮疹等严重副作用而被迫停止用药。尤其是弓形虫脑炎、先天性弓形虫病以及免疫缺陷病人不能耐受长期化疗，而停药后复发率高，根治效果差。

由于弓形虫为专性细胞内寄生原虫，因而阻断其对宿主细胞的粘附和入侵，从而可以控制其感染的发生和发展，这是被动免疫作用防治弓形虫的有效机制之一。SAG1作为弓形虫速殖子表膜表面的主要抗原之一，是迄今研究最多的弓形虫表膜蛋白。研究显示，SAG1主要分布于弓形虫速殖子表膜、速殖子内以及纳虫空泡的管状结构中，仅占弓形虫体总蛋白的3％～5％，却可抑制患者血清中50％的抗体活性，说明SAG1含量虽然少，却是速殖子的主要抗原成分，是诱导宿主免疫应答的主要靶抗原，其能够诱导机体产生IgG、IgM、IgE、IgA及SIgA多种抗体。抗SAG1抗体在体外具有抑制弓形虫速殖子感染宿主细胞及杀虫作用，在体内也具有保护作用，并可诱导机体产生一些细胞因子，如γ-干扰素、白细胞介素等。Mineo等用灭活的抗SAG1的鼠血清和抗SAG1单克隆抗体的Fab片段进行抗体中和抑制试验，结果显示抗SAG1血清和单克隆抗体都可抑制87％的弓形虫强毒株RH株入侵人体成纤维细胞，对弓形虫弱毒株PTg也有60％作用，而对于SAG1缺陷株仅有10-20％的抑制效果。同时研究发现两株抗SAG1抗体6A8和JS能够抑制弓形虫的生长，其抑制生长作用随着抗体浓度的增加而增强。在体外，抗SAG1 IgG还可以与人体血清中的C3补体相结合，从而激活人体血清中的补体系统，溶解弓形虫速殖子，导致虫体死亡。因此，抗刚地弓形虫SAG1人源抗体Fab片段，即可成为弓形虫病治疗的抗体靶向药物，也可以预防弓形虫感染的抗体药物。

目前，研究实践所得到的抗SAG1多克隆抗体和单克隆抗体多为鼠源抗体或兔源抗体。鼠源抗体和兔源抗体由于具有免疫源性，在应用于人体可引起机体针对异种蛋白的免疫反应，产生人抗鼠抗体或人抗兔抗体，既影响疗效，又可诱发过敏反应，因而难以应用于临床。虽然可以通过抗体工程技术，对其进行人源化改造，但技术过程繁杂，耗时耗力，短期难以取得成效；转基因动物亦有价格昂贵、产量受限等问题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种抗刚地弓形虫SAG1人源抗体Fab片段及其编码基因。

本发明所述的人源Fab抗体选自抗刚地弓形虫人源免疫球蛋白基因文库。

本发明提供了下述能编码识别刚地弓形虫SAG1人源Fab片段及其编码基因，然而产生本发明的基因序列的方法不受特别的限制。

(1)抗刚地弓形虫SAG1人源抗体Fab片段的轻链(L链)可变区(V区)和恒定区(C区)；

(2)抗刚地弓形虫SAG1人源抗体Fab片段的重链(H链)可变区(V区)和恒定区1(C区1)。

所述的L链含有如SEQ1列出的氨基酸序列。编码所述的L链的氨基酸序列的DNA如下：

SEQ 1：L链基因

      D  I  V  M    T  Q  S  P  S  T   L  S  A  S   V  G  D   R  V  T

1    GACATCGTGA TGACCCAGTC TCCTTCCACC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CAGAGTCACC

      I  T  C  R    A  S  Q  A  I  E   D  D  L  D   W  Y  Q   Q  K  P

61   ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GGCCATTGAA GATGATTTAG ACTGGTATCA GCAGAAACCA

      G  K  A  P    K  R  L  V  Y  G   A  S  N  L   Q  R  G   V  P  S

121  GGTAAAGCCC CTAAGCGCCT GGTTTATGGT GCATCCAACT TGCAAAGAGG GGTCCCGTCA

      R  F  S  G    S  G  S  G  T  E   F  T  L  T   I  S  S   L  Q  P

181  AGATTCAGTG GTAGTGGATC AGGGACCGAG TTCACTCTCA CAATCAGTAG CCTGCAGCCT

      E  D  F  A    T  Y  Y  C  L  Q   H  H  S  Y   P  W  T   F  G  Q

241  GAAGATTTTG CAACATATTA CTGTCTACAA CATCATTCTT ACCCGTGGAC GTTCGGCCAA

      G  T  R  V    D  I  K  R  T  V   A  A  P  S   V  F  I   F  P  P

301  GGGACCAGGG TGGACATCAA ACGAACTGTG GCTGCACCAT CTGTCTTCAT CTTCCCGCCA

      S  D  E  Q    L  K  S  G  T  A   S  V  V  C   L  L  N   N  F  Y

361  TCTGATGAGC AGTTGAAATC TGGAACTGCC TCTGTTGTGT GCCTGCTGAA TAACTTCTAT

      P  R  E  A    K  V  Q   W  K  V  D  N  A  L   Q  S  G   N  S  Q

421  CCCAGAGAGG CCAAAGTACA GTGGAAGGTG GATAACGCCC TCCAATCGGG TAACTCCCAG

      E  S  V  T    E  Q  D  S  K  D   S  T  Y  S   L  S  S   T  L  T

481  GAGAGTGTCA CAGAGCAGGA CAGCAAGGAC AGCACCTACA GCCTCAGCAG CACCCTGACG

      L  S  K  A    D  Y  E  K  H  K   L  Y  A  C   E  V  T   H  Q  G

541  CTGAGCAAAG CAGACTACGA GAAACACAAA CTCTACGCCT GCGAAGTCAC CCATCAGGGC

      L  S  S  P    V  T  K  S  F  N   R  G  E  C

601  CTGAGCTCGC CCGTCACAAA GAGCTTCAAC AGGGGAGAGT GT

所述的H链含有如SEQ 3列出的氨基酸序列。编码所述的H链的氨基酸序列的DNA如下：

SEQ 3：H链基因

      M  A  E  V   K  L  L   E  S  G   G  G  L  V   Q  P  G   G  S  L

1    ATGGCCGAGG TGAAGCTTCT CGAGTCTGGG GGAGGCTTGG TACAGCCTGG GGGGTCCCTG

      R  L  S  C   A  A  S   G  F  T   F  S  S  Y   A  M  S   W  V  R

61   AGACTCTCCT GTGCAGCCTC CGGATTCACC TTTAGCAGCT ATGCCATGAG CTGGGTCCGC

      Q  A  P  G   K  G  L   E  W  V   S  V  I  Y   S  G  G   S  S  T

121  CAGGCTCCAG GGAAGGGGCT GGAGTGGGTC TCAGTTATTT ATAGCGGTGG TAGTAGCACA

      Y  Y  A  D   S  V  K   G  R  F   T  I  S  R   D  N  S   K  N  T

181  TACTATGCAG ACTCCGTGAA GGGCCGGTTC ACCATCTCCA GAGATAATTC CAAGAACACG

      L  Y  L  Q   M  N  S   L  R  A   E  D  T  A   V  Y  Y   C  A  K

241  CTGTATCTGC AAATGAACAG CCTGAGAGCC GAGGACACGG CCGTATATTA CTGTGCGAAA

      T  K  D  N   W  N  F   Y  F  D   Y  W  G  Q   G  T  L   V  T  V

301  ACGAAAGA TAACTGGAACTT CTACTTTGAC TACTGGGGCC AGGGAACCCT GGTCACCGTC

      S  S  A  S   T  K  G   P  S  V   F  P  L  A   P  S  S   K  S  T

361  TCCTCAGCCT CCACCAAGGG CCCATCGGTC TTCCCCCTGG CACCCTCCTC CAAGAGCACC

      S  G  G  T   A  A  L   G  C  L   V  K  D  Y   F  P  E   P  V  T

421  TCTGGGGGCA CAGCGGCCCT GGGCTGCCTG GTCAAGGACT ACTTCCCCGA ACCGGTGACG

      V  S  W  N   S  G  A   L  T  S   G  V  H  T   F  P  A   V  L  Q

481  GTGTCGTGGA ACTCAGGCGC CCTGACCAGC GGCGTGCACA CCTTCCCGGC TGTCCTACAG

      S  S  G  L   Y  S  L   S  S  V   V  T  V  P   S  S  S   L  G  T

541  TCCTCAGGAC TCTACTCCCT CAGCAGCGTG GTGACCGTGC CCTCCAGCAG CTTGGGCACC

      Q  T  Y  I   C  N  V   N  H  K   P  S  N  T   K  V  D   K  K  I

601  CAGACCTACA TCTGCAACGT GAATCACAAG CCCAGCAACA CCAAGGTGGA CAAGGAAAATT

      V  P  R  D

661  GTGCCCAGGG AT

所列的SEQ 1和SEQ 3的序列中，用下划线标记的序列是框架区FR(framework region，FR)序列，斜体序列是互补决定区(complementaritydetermining region，CDR)序列。

含有编码本发明的抗刚地弓形虫SAG1人源抗体Fab片段基因的质粒载体构成了本发明的一个部分。

本发明提供了一种质粒载体，含有编码所述的重链V区的DNA和所述的轻链V区的DNA，它能插入编码本发明的抗刚地弓形虫SAG1人源抗体Fab片段的基因。本发明的质粒不受特别限制，优选pFab-His2。

表达本发明的抗刚地弓形虫SAG1人源抗体Fab片段的宿主细胞构成了本发明的一个部分。

本发明提供了一种大肠杆菌JM109感受态细胞为宿主细胞，它能表达本发明的抗刚地弓形虫SAG1人源抗体Fab片段。本发明的宿主细胞不受特别的限制。

本发明通过构建抗刚地弓形虫人源免疫球蛋白基因文库并经过克隆印迹法、ELISA、间接免疫荧光实验(IFA)、测序分析等从所述抗刚地弓形虫人源免疫球蛋白基因文库中筛选得到具有抗凝活性的抗刚地弓形虫SAG1人源抗体Fab片段，命名为Tox1403L-11H，而后进行了大量的表达纯化及进一步的鉴定。

在本发明的实施中，筛选能表达抗刚地弓形虫SAG1人源抗体Fab片段的质粒载体的方法不受特别的限制，可通过例如免疫印迹、ELISA等进行选择。

本发明的实施中，纯化抗刚地弓形虫SAG1人源抗体Fab片段的方法不受特别的限制，但首选是通过表达蛋白上携带的6×His Tag经Ni-NTA柱纯化。

本发明所制备的单克隆抗体鉴定的方法不受特别限制，如聚丙烯酰胺凝胶电泳、Western blotting等。

本发明的另一个目的在于提供含有上述的Fab片段为活性成分的药物组合物。

本发明的进一步目的是提供上述人源Fab抗体的用途。

所述的抗体Fab片段可用于制备防治弓形虫病的抗体药物和抗体靶向药物。

与鼠源抗弓形虫SAG1抗体相比较，本发明的抗刚地弓形虫SAG1人源抗体Fab片段能够特异性识别弓形虫速殖子重组表面抗原1(SAG1)并有与之具有较高的亲和力，同时可以与弓形虫速殖子特异性识别。如能进一步证实弓形虫速殖子表面抗原1(SAG1)的高亲和力可以抑制弓形虫速殖子对宿主细胞的粘附和入侵，从而阻断弓形虫感染，则对弓形虫病的治疗和预防具有重要的应用价值。

动物源性单克隆抗体制备技术虽已普及，但应用于人体时可引起人抗异源性抗体发应，虽可通过抗体人源化技术得以改进，但过程繁杂，耗时耗力，短期难以取得成效。本发明利用抗体库技术，在体外制备具有高亲和力的完全人源性工程抗体，获得抗刚地弓形虫SAG1人源抗体Fab片段，由于无Fc段，在发挥抑制弓形虫入侵宿主细胞作用的同时，不会激活补体和引起人体免疫反应等病理损害，应用于人体安全可靠。

附图说明

图1质粒载体pFab1-His2。

图2荧光显微镜下观察阳性克隆Tox1403L-11H与弓形虫速殖子的IFA结果。

图3阳性克隆Tox1403L-11H轻链可变区CDR、FR划分。

图4阳性克隆Tox1403L-11H重链可变区CDR、FR划分。

图5阳性克隆Tox1403L-11H表达产物提纯后10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，

其中，M.Precision Plus Protein Standard；1.镍离子亲和层析纯化Fab片段。图6Fab片段重、轻链片段的Western Blot检测，

其中，M.Precision Plus Protein Standard；1.考马思亮蓝染色；2.HRP标记His-probe反应；3：HRP标记抗人IgG Fab抗体反应；4：HRP标记抗人κchain抗体反应。

具体实施方式

下面通过实施例更具体的说明本发明。

实施例1.构建抗体库

采用弓形虫脑炎患者的外周抗凝血5ml，以Ficoll-Paque(Pharmacia，Uppsala，Sweden)分离淋巴细胞，以试剂盒(QIAGEN GmbH，Hilden，Germany)提取总RNA。将总RNA用Gene-Amp RNA PCR试剂盒(Perkin-Elmer Cetus，Norwalk，Conn)以Oligo(dT)16逆转录成cDNA，并以人IgG轻重链可变区保守序列的上、下游引物(Invitrogen)(表1)进行免疫球蛋白γ、κ、λ链基因的PCR扩增。PCR产物经试剂盒(QIAGEN GmbH，Hilden，Germany)提纯后，分别以AscI和NheI(NEWENGLAND BioLabs)双酶切κ链和λ链产物。酶切后的κ链和λ链产物与人免疫球蛋白Fab表达载体pFab-His2(图1)连接，随后电转入大肠杆菌JM109(Takara，中国大连)中，构成轻链库。分别以SfiI和NotI(NEW ENGLAND BioLabs)对轻链库及γ链PCR产物进行酶切修饰，连接反应后，电转导入大肠杆菌JM109中，构成3×10⁶的非依赖性克隆滴度的抗体库。

表1是人IgG轻重链可变区保守序列的上下游引物序列。

表1

κ轻链5′端引物
	Nhe IVK1：CCGCTAGCGMCATYCAGWTGACCCAGTCTCCVK2a：CCGCTAGCGATRTTGTGATGACYCAGWCTCCVK3a：CCGCTAGCGAAATTGTGWTGACGCAGTCTCCVK4：CCGCTAGCGACATCGWGHTGACCCAGTCTCC
κ轻链3′端引物：
	Asc IVKC：TTGGCGCGCCACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTT
λ轻链5′端引物
	Nhe IVL1a：CCGCTAGCCAGTCTGYSCTGACTCAGCCWVL1b：CCGCTAGCCAGTCTGTGYTGACGCAGCCGVL2a：CCGCTAGCMACKTTATAYTGACTCAACCGVL2b：CCGCTAGCCAGACTGTGGTAACYCAGGAGVL3a：CCGCTAGCTCCTATGWGCTGACTCAGCCAVL3b：CCGCTAGCTCTTCTGAGCTGACTCAGGAC
λ轻链3′端引物
	Asc IVLC：TTGGCGCGCCTGAAMATKCTGTAGSGGCCACTGT
γ重链5’端引物
	Sfi IVH1a：AAGGCCCAACCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGVH1b：AAGGCCCAACCGGCCATGGCCCAGRTYCAGCTGGTGCAGTCTGGVH2a：AAGGCCCAACCGGCCATGGCCCAGSTRCAGCTGCAGSAGTCRGGVH3a：AAGGCCCAACCGGCCATGGCCSARGTGCAGKTGGTGGAGTCTGGVH3b：AAGGCCCAACCGGCCATGGCCCCAGTGTGAGGTGCAGCTGGTGGVH4c：AAGGCCCAACCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTACAGSAGTGGGG
γ重链3’端引物
	Not IFDG1：CCGCGGCCGCTGTGTGAGTTTTGTCACAAGATTTFDG2：CCGCGGCCGCTTTGCGCTCAACTGTCTTGTCCACFDG3：CCGCGGCCGCTGTGTGAGTTGTGTCACCAAGTGGFDG4：CCGCGGCCGCTGGGGGACCATATTTGGACTCAAC

其中：引物方向为5’至3’，下划线部分表示酶切位点，符号M代表核苷酸A或C；Y代表C或T；W代表A或T；R代表A或G；H代表A或C或T；S代表C或G；K代表T或G。

实施列2弓形虫速殖子表面抗原1(SAG1)的重组表达

SAG1是诱导宿主免疫反应的主要靶抗原，其具有高度免疫原活性及免疫保护性。全长的SAG1蛋白由319个氨基酸组成，分子量约为30kDa。研究证实SAG1蛋白的N端信号肽和C端疏水性序列不具有抗原性。本发明首先合成编码SAG1蛋白所需的cDNA，通过PCR扩增183～870位碱基间的基因片段(氨基酸位点为61～289)。该基因片段经过Nde I和Xho I酶切纯化后，与pET19b(Novagen)载体相连接，转化入大肠杆菌JM109中，将获得的阳性克隆进行序列分析，将正确序列的质粒转入表达宿主菌BL21star(DE3)plysS感受态细胞(Novagen)，经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)(上海生工)诱导表达，提取包涵体蛋白，并进行蛋白复性(根据Novagen的包涵体蛋白提纯方法)，其分子量为28.9kDa。以提纯的重组蛋白0.5μg/100μl包被酶标板，检测重组蛋白的特异性和敏感性。当稀释度为1∶400时，病人血清反应的OD₄₉₀值为1.035±0.002，而正常对照为0.240±0.003。提示该重组抗原可以用于抗刚地弓形虫免疫球蛋白抗体库的筛选。

实施例3.抗刚地弓形虫人免疫球蛋白G的筛选

取3×10⁶的非依赖性克隆滴度的抗体库DNA 10ng，转化100μl JM109大肠杆菌，将菌液涂布在Luria broth(10g sodii chloridum，10g tryptone，5g yeast extract/L，PH 7)平板(含氨苄青霉素50μg/ml)上，37℃培养7小时，待克隆(约5×10³个克隆/90mm直径平板)直径为0.3mm左右时，以直径为82mm硝酸纤维素膜(Armacia/Pharmacia)覆于平板上，待克隆完全转移至膜上，将膜置于含1.0mMIPTG的LB平板上，30℃诱导表达6小时，而后用溶菌酶、DNA酶和牛血清白蛋白(100mM Tris-HCl[pH 7]，150mM NaCl，5mM MgCl₂，1.5％BSA，1mg ofDNase，40mg lysozyme/ml)对膜进行溶菌。经洗涤除去膜上残留的细菌碎片等，以牛血清白蛋白(BSA)封闭，与400μg纯化的重组蛋白反应，随后分别与阳性血清、辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗人IgG Fc抗体(ICN Pharmaceuticals，Aurora，Ohio)反应，显色(HRP-1000，Konica Co，Tokyo，Japan)。每次以4～8张膜进行筛选，在膜上发现深染的克隆都作为阳性克隆，此为克隆印迹法。或从抗体库中取10ng DNA，转化100μlJM109大肠杆菌，挑取转化所得的每3个单个克隆至2ml含氨苄青霉素的super broth培养基(30g tryptone，20g yeast extract，10g 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid[MOPS]/L，pH 7)中，待OD₆₀₀为0.6～0.8时加入IPTG，使其最终浓度为0.1mM，30℃诱导表达10～12小时，14000rpm 2分钟离心收集细菌，细菌沉淀中加入100μl含1mM PMSF(苯甲基磺酰氟)的PBS，悬浮细菌，4℃进行超声粉碎，而后14000rpm离心10分钟，取上清液，加入包被有0.5μg重组SAG1蛋白/孔的酶标板上，进行酶联免疫反应，以HRP标记的抗人IgGFab(ICN Pharmaceuticals，Aurora，Ohio)为二抗，以邻苯二胺(o-phenylenediamin，OPD)显色。每块酶标板上均加入阳性血清为阳性对照，一旦OD₄₉₀读数高于一定数值即为阳性。

将克隆印迹法或ELISA筛选所得的阳性克隆挑入25ml含氨苄青霉素的的SB培养液中，37℃培养至OD₆₀₀为0.6～0.8时，加入IPTG，使其最终浓度为0.1mM，30℃诱导表达10～12小时，14000rpm 2分钟离心收集细菌，细菌沉淀中加入500μl含1mM PMSF的PBS，悬浮细菌，4℃进行超声粉碎，而后14000rpm离心10分钟，取上清液，加入每孔包被有0.5μg重组SAG1蛋白或其他无关蛋白如重组溶组织内阿米巴150kDa表面蛋白等的酶标板上，进行酶联免疫反应，以HRP标记的抗人IgG Fab为二抗，显色。当重组SAG1蛋白与其他无关蛋白的OD₄₉₀读数有显著性差别时，即将该克隆的细菌混悬液与刚地弓形虫速殖子抗原片进行间接免疫荧光反应，当细胞出现特异性荧光反应，即为阳性克隆。

累计筛选约6×10⁵个克隆，获得1个阳性克隆Tox1403L-11H与刚地弓形虫速殖子呈明显的特异性结合反应(图2)。

实施例4.抗刚地弓形虫速殖子SAG1抗体Fab片段Tox1403L-11H的特性分析

取阳性克隆Tox1403L-11H的质粒，分别以AscI-NdeI和SfiI-NotI限制性内切酶酶切，获得轻链和重链基因，再与经酶切修饰的测序载体CV-2和CV-1连接，转化大肠杆菌JM109，分别提取含轻链或重链基因的质粒DNA，以M13Reverse引物(5′-GGATAACAATTTCACACAGG-3′)，进行测序，测序工作由Invitrogen公司完成。并以VectorNTI 10软件推算氨基酸序列(序列2，4)，以IgBlast进行同源性分析(表2)，并根据Kabat系统对阳性克隆Tox1403L-11H的轻链可变区和重链可变区的CDR、FR进行划分(图3，4)。

表2是阳性克隆Tox1403L-11H基因序列的同源性比较。

表2

由于Fab抗体含有6个His-Tag，且重链与His相连，故选用His结合树脂(Novagen，Madison，Wis.)进行提纯。阳性克隆Tox1403L-11H进行大量培养和诱导表达后，收集细菌，进行溶菌和超声粉碎，离心取上清液进行纯化。以1M咪唑溶出纯化的Fab片段，以DC ProteinAssay(BioRad)测定蛋白含量，并通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测其纯度(图5)。同时以Westernblot检测Fab抗体重轻链的完整性(图6)。纯化的抗体以Biocore3000(BiocoreAB，Uppsala Sweden)检测其亲和力，以纯化的重组抗原SAG1蛋白包被后，分别以浓度为2.5μg/ml，1.25μg/ml，0.625μg/ml，0.3125μg/ml的Fab抗体片段与其进行反应，以BIAevalution3.1软件求出结合率(KA)和解离率(KD)分别为9.0×10⁷(1/M)和2.01×10^-8(M)。

结果显示，该Fab抗体与刚地弓形虫速殖子重组SAG1蛋白具有较高的亲和力。提示Fab抗体可抑制弓形虫速殖子对宿主细胞的粘附和入侵，从而阻断弓形虫感染。所述的Fab抗体可制备治疗和预防弓形虫病的药物。

SEQUENCE LISTING

SEQUENCE LISTING

<110>复旦大学

<120>一种人源抗刚地弓形虫表面抗原1(SAG1)抗体Fab片段与用途

<130>

<160>4

<170>Patentln version 3.5

<210>1

<211>642

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(642)

<400>1

gac atc gtg atg acc cag tct cct tcc acc ctg tct gca tct gta gga     48

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1           5              10             15

gac aga gtc acc atc act tgc cgg gca agt cag gcc att gaa gat gat     96

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ala Ile Glu Asp Asp

        20              25              30

tta gac tgg tat cag cag aaa cca ggt aaa gcc cct aag cgc ctg gtt    144

Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Val

     35             40             45

tat ggt gca tcc aac ttg caa aga ggg gtc ccg tca aga ttc agt ggt    192

Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Gln Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

   50             55             60

agt gga tca ggg acc gag ttc act ctc aca atc agt agc ctg cag cct    240

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65             70             75              80

gaa gat ttt gca aca tat tac tgt cta caa cat cat tct tac ccg tgg    288

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His His Ser Tyr Pro Trp

          85              90             95

acg ttc ggc caa ggg acc agg gtg gac atc aaa cga act gtg gct gca    336

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Val Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

        100             105             110

cca tct gtc ttc atc ttc ccg cca tct gat gag cag ttg aaa tct gga    384

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

     115             120             125

act gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg aat aac ttc tat ccc aga gag gcc    432

                            SEQUENCE LISTING

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

   130             135            140

aaa gta cag tgg aag gtg gat aac gcc ctc caa tcg ggt aac tcc cag    480

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145             150            155            160

gag agt gtc aca gag cag gac agc aag gac agc acc tac agc ctc agc

528

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

            165           170            175

agc acc ctg acg ctg agc aaa gca gac tac gag aaa cac aaa ctc tac

576

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Leu Tyr

         180            185             190

gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg agc tcg ccc gtc aca aag agc

624

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

     195             200             205

ttc aac agg gga gag tgt                                  642

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

  210

<210>2

<211>214

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>2

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1           5              10             15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ala Ile Glu Asp Asp

        20              25             30

Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Val

     35             40             45

Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Gln Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

   50             55             60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65             70             75              80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His His Ser Tyr Pro Trp

          85              90             95

                             SEQUENCE LISTING

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Val Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

        100             105             110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

     115              120            125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

   130             135            140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145             150           155             160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

             165          170            175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Leu Tyr

         180             185           190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

     195             200                 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

  210

<210>3

<211>672

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(7)..(672)

<400>3

atggcc gag gtg aag ctt ctc gag tct ggg gga ggc ttg gta cag cct    48

    Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

    1           5             10

ggg ggg tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tcc gga ttc acc ttt agc   96

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser

15             20            25              30

agc tat gcc atg agc tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggg ctg gag

144

Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

                              SEQUENCE LISTING

            35              40              45

tgg gtc tca gtt att tat agc ggt ggt agt agc aca tac tat gca gac    192

Trp Val Ser Val Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp

         50              55              60

tcc gtg aag ggc cgg ttc acc atc tcc aga gat aat tcc aag aac acg    240

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr

     65              70              75

ctg tat ctg caa atg aac agc ctg aga gcc gag gac acg gcc gta tat    288

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

  80             85             90

tac tgt gcg aaa acg aaa gat aac tgg aac ttc tac ttt gac tac tgg    336

Tyr Cys Ala Lys Thr Lys Asp Asn Trp Asn Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp

95             100            105           110

ggc cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tca gcc tcc acc aag ggc cca

384

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

           115             120              125

tcg gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag agc acc tct ggg ggc aca    432

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

         130            135            140

gcg gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa ccg gtg acg    480

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

      145            150            155

gtg tcg tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc ggc gtg cac acc ttc ccg    528

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

  160             165             170

gct gtc cta cag tcc tca gga ctc tac tcc ctc agc agc gtg gtg acc    576

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

175             180            185             190

gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc tac atc tgc aac gtg aat    624

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

            195            200             205

cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag aaa att gtg ccc agg gat

672

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp

        210             215            220

<210>4

<211>222

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>4

                           SEQUENCE LISTING

Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1           5             10             15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

        20            25              30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

     35              40             45

Ser Val Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

  50               55             60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65            70              75             80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

          85             90             95

Ala Lys Thr Lys Asp Asn Trp Asn Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

        100            105            110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

      115            120             125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

  130            135             140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145           150             155            160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

          165             170             175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

        180            185             190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

     195             200              205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp

  210             215            220

Claims (10)

1.一种抗刚地弓形虫表面抗原1人源抗体Fab片段，包括重链和轻链，其特征是，所述的轻链包括可变区和恒定区，其氨基酸序列由核苷酸序列1所编码；所述的重链包括可变区和恒定区，其氨基酸序列由核苷酸序列3所编码；所述的抗刚地弓形虫表面抗原1人源抗体Fab片段选自抗刚地弓形虫人源免疫球蛋白基因文库。

2.按权利要求1所述的抗刚地弓形虫表面抗原1人源抗体Fab片段，其特征是所述的轻链的氨基酸序列为序列2。

3.按权利要求1所述的抗刚地弓形虫表面抗原1人源抗体Fab片段，其特征是所述的重链的氨基酸序列为序列4。

4.一种表达载体，其特征是含有编码权利要求2所述的轻链的DNA和编码权利要求3所述的重链的DNA。

5.按权利要求4，其中所述的表达载体是一种质粒，选自pFab-His2。

6.一种含有权利要求4所述的表达载体的宿主细胞。

7.基于权利要求6，所述的宿主细胞是大肠杆菌、酵母或真核细胞。

8.基于权利要求7，所述的宿主细胞是大肠杆菌JM109。

9.一种药物组合物，其特征是含有权利要求1的Fab片段。

10.权利要求1的抗刚地弓形虫表面抗原1人源抗体Fab片段在制备防治弓形虫病的抗体药物或抗体靶向药物中的用途。

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