EA002543B1

EA002543B1 - Антитела против рецептора интерферона-альфа/бета

Info

Publication number: EA002543B1
Application number: EA199800968A
Authority: EA
Inventors: Даниела Новик; Менахем Рубинштейн
Original assignee: Йеда Рисерч Энд Дивелопмент Ко. Лтд.
Priority date: 1996-05-01
Filing date: 1997-04-29
Publication date: 2002-06-27
Also published as: DE69736835T2; CN1198929C; AU719995B2; IL118096A0; CN1220699A; US6136309A; CA2253239A1; PT927252E; EP0927252A1; HK1019339A1; ATE342981T1; BR9709202A; NO985050L; IL126835A; UA76396C2; JP4308322B2; DK0927252T3; KR20040075105A; EP1739177A1; NO324206B1

Abstract

Обеспечены антитела против лиганд-связывающего компонента рецептора интерферона-α/β, которые способны избирательно модулировать активность различных интерферонов I типа.

Description

Настоящее изобретение относится к антителам против лиганд-связывающего компонента рецептора интерферона-α/β, которые способны избирательно модулировать активность различных интерферонов I типа.

В публикации ЕР № 588177 описан растворимый рецептор ΙΕΝ-α, обладающий молекулярной массой приблизительно 40000, который был идентифицирован путем поперечного сшивания с ¹²⁵Ι-ΙΕΝ-α2 и иммунопреципитации с анти-ΙΕΝ-α моноклональными антителами. Будучи получено из сыворотки, данное вещество обладало молекулярной массой 50 кДа. В ней также описан указанный выше ΙΕΝ-αсвязывающий белок массой 40000 Да (здесь далее ΙΕΝΆΒ-ΒΡ или ΙΕΝΆΒ-ΒΡΙΙ), полученный из мочи в гомогенном состоянии и обладающий последовательностью, которая отлична от таковой любого другого известного белка. ΙΕΝΆΒΒΡ связывается с и блокирует активность множества подтипов ΙΕΝ-α, равно как и ΙΕΝ-β.

В публикации ЕР № 676413 описаны клонирование и секвенирование двух молекул кДНК, кодирующих предшественники ΙΕΝΆΒΒΡ. Обе молекулы, возможно, являются продуктами одного гена, например, в результате альтернативного сплайсинга. Также описана продукция двух рекомбинантных белков, обозначаемых как ΙΕΝΑΒ-ΒΡΙ и ΙΕΝΑΒ-ΒΡΙΙ, в клетках млекопитающих и других организмов-хозяев. Также описаны поликлональные и моноклональные антитела против ΙΕΝΑΒ-ΒΡ и применимые для блокирования рецептора ΙΕΝ для иммунологических анализов и иммунологической очистки ΙΕΝΑΒ-ΒΡΙ и ΙΕΝΑΒ-ΒΡΙΙ.

В настоящем изобретении описаны две группы нейтрализующих антител, индуцированных против ΙΕΝΑΒ-ΒΡΙΙ, которые связываются с рецептором интерферона Ι типа на человеческих клетках. Антитела одной группы способны блокировать активность различных подтипов интерферона-α в человеческих клетках без влияния на активность интерферона-β. Таким образом, указанные антитела одной группы способны ингибировать нежелательные эффекты ΙΕΝ-α при очень небольшом воздействии на активность ΙΕΝ-β.

Предпосылки изобретения

Интерфероны Ι типа (ΙΕΝ) (ΙΕΝ-α, ΙΕΝ-β и ΙΕΝ-ω) составляют семейство структурно родственных цитокинов, обычно определяемых по их способности обеспечивать сопротивляемость вирусным инфекциям. Сообщалось о множестве других биологических активностей ΙΕΝ Ι типа, включая ингибирование клеточной пролиферации, индукции антигенов МНС Ι класса и некоторые другие иммунорегуляторные активности (1). ΙΕΝ-α и ΙΕΝ-β являются применимыми для лечения некоторых вирусных заболеваний, включая гепатит С (2, 3) и обыкновенных боро давок (4, 5), равно как и определенных злокачественных опухолей, таких как лейкозный ретикулоэндотелиоз (6), хронический миелолейкоз (7) и саркома Капоши (8).

ΙΕΝ-α определяли в образцах сыворотки различных пациентов, страдающих аутоиммунными заболеваниями, такими как системная красная волчанка (9), равно как и пациентов, страдающих ВИЧ-инфекцией (10). ΙΕΝ-α вовлечен в процесс развития юношеского диабета (11). Далее, было показано, что в некоторых случаях терапия при помощи ΙΕΝ-α приводит к нежелательным побочным эффектам, включая лихорадку и неврологические расстройства (12). Следовательно, существуют патологические состояния, при которых нейтрализация активности ΙΕΝ-α может являться желательной для пациента.

Как и в случае других цитокинов, ΙΕΝ-α оказывает свои биологические эффекты посредством связывания с рецептором на поверхности клетки, который является специфичным для всех подтипов ΙΕΝ-α, равно как и ΙΕΝ-β (13). Человеческий рецептор ΙΕΝ-α (ΙΕΝΑΚ) идентифицировали и клонировали на клетках ИаиЛ (14). Клонированный рецептор состоит из одного трансмембранного домена, внеклеточного и внутриклеточного доменов. Будучи экспрессирован на мышиных клетках, данный рецептор определяет реактивность по отношению к человеческому ΙΕΝ-αΒ, но незначительно определяет реактивность по отношению к другим видам ΙΕΝ-α и ΙΕΝ-β, указывая на то, что в формирование ответа на ΙΕΝ-β и на различные виды ΙΕΝα могут быть вовлечены дополнительные компоненты.

Некоторые другие исследования указывают на то, что в процесс связывания ΙΕΝ-α и ΙΕΝβ вовлечены дополнительные компоненты или субъединицы рецептора (15-17). Однако, сообщалось, что в процесс связывания всех видов ΙΕΝ-α и ΙΕΝ-β (18) вовлечен ранее описанный рецептор (14). Действительно, недавно был идентифицирован и клонирован второй рецепторный компонент, так называемый рецептор ΙΕΝ-α/β (публикация ЕР № 676413 и ссылка 19). Авторами настоящей заявки было продемонстрировано, что рецептор ΙΕΝ-α/β, внеклеточный домен которого обладает той же последовательностью, что и ΙΕΝΑΒ-ΒΡΙ, представляет собой основной лиганд-связывающий компонент рецептора интерферона Ι типа. Более того, рецептор интерферона-α/β и ΙΕΝΑΚ проявляют кооперативность связывания лиганда и образуют тройной комплекс с интерферонами Ι типа на клеточной поверхности (20).

Моноклональные антитела, направленные против ΙΕΝΑΚ и способные блокировать активность интерферонов Ι типа неизбирательным образом были описаны ранее (21). Было описано другое моноклональное антитело против не3 идентифицированного рецеторного компонента. Данное антитело блокировало активность интерферонов I типа неизбирательным образом (22).

Суть изобретения

Настоящее изобретение обеспечивает моноклональные антитела против рецептора ΙΕΝα/β, который представляет собой обычный рецептор ΙΕΝ-α и ΙΕΝ-β. Данные антитела связываются с некоторыми формами рецептора, которые либо экспрессируются на человеческих клетках, либо существуют в виде растворимых форм ΙΕΝΑΒ-ΒΡΙ и ΙΕΝΑΒ-ΒΡΙΙ. Были выработаны два типа нейтрализующих моноклональных антител. Высокий титр антител одного типа наблюдается при применении для блокирования противовирусной активности как ΙΕΝ-α, так и ΙΕΝ-β. Высокий блокирующий титр антител второго типа неожиданно наблюдается только в связи с противовирусной активностью ΙΕΝ-α при очень низком титре, связанном с активностью ΙΕΝ-β. Таким образом, неожиданный второй тип моноклональных антител может быть применен в определенном интервале концентраций для избирательного блокирования активности ΙΕΝ-α, тогда как активность ΙΕΝ-β изменяться не будет.

Настоящее изобретение также обеспечивает гуманизированные моноклональные антитела против рецептора ΙΕΝ-α/β, экспрессированного на человеческих клетках, ΙΕΝΑΒ-ΒΡΙ и ΙΕΝΑΒΒΡΙΙ. Гуманизированные моноклональные антитела представляют собой гибридные молекулы мышиных и человеческих антител, в которых вариабельные домены происходят из мышиных антител, тогда как постоянные домены происходят из человеческих антител.

Настоящее изобретение также обеспечивает молекулы ДНК, кодирующие моноклональные антитела и гуманизированные моноклональные антитела против рецептора ΙΕΝ-α/β, ΙΕΝΑΒ-ΒΡΙ и ΙΕΝΕΒ-ΒΡΙΙ.

Данное изобретение далее обеспечивает реплицируемые экспрессирующие векторы, содержащие указанные молекулы ДНК, трансформированные ими организмы-хозяева и белки, продуцируемые такими трансформированными организмами-хозяевами. Термин молекулы ДНК включает в себя геномную ДНК, кДНК, синтетическую ДНК и их комбинации.

Данное изобретение также относится к молекулам ДНК, которые гибридизуются в строго определенных условиях с указанными выше молекулами ДНК и кодируют последовательность белков, обладающих такой же биологической активностью, что и моноклональные антитела и гуманизированные моноклональные антитела против рецептора ΙΕΝ-α/β, ΙΕΝΑΒ-ΒΡΙ и ΙΕΝΑΒ-ΒΡΙΙ.

Настоящее изобретение также обеспечивает способы получения клеток-хозяев, способных продуцировать функциональные моноклональные антитела и гуманизированные моноклональные антитела против рецептора ΙΕΝ-α/β, ΙΕΝΑΒ-ΒΡΙ и ΙΕΝΑΒ-ΒΡΙΙ.

Моноклональные антитела по настоящему изобретению ингибируют биологическую активность человеческого интерферона-α в человеческих клетках без воздействия на биологическую активность человеческого интерферона-β. Биологическую активность определяли путем количественной оценки ингибирующего эффекта антитела при тестировании методом анализа ингибирования цитопатического эффекта с применением человеческих клеток νΙ8Η и вируса везикулярного стоматита.

Подробное описание изобретения

В соответствии с заявкой на патент Израиля № 106591, ΙΕΝ-α/β-связывающий белок, обладающий молекулярной массой 40000 кДа, (ΙΕΝΑΒ-ΒΡ) выделяли из обычной мочи в две хроматографические стадии. Неочищенные белки мочи наносили на колонку, состоящую из ΙΕΝ-α2, пришитого к агарозе. Колонку промывали в целях удаления неинтересующих белков, а связанные белки затем смывали при низких значениях рН. Смытые белки затем разрешали с помощью ЖХВР с разделением по размеру (размероспецифичной ЖХВР) с выходом нескольких белковых фракций, одна из которых характеризовалась своей способностью специфично взаимодействовать с ¹²⁵Ι-ΙΕΝ-α2 и блокировать противовирусную активность ΙΕΝ-α и ΙΕΝ-β. Данный белок был далее охарактеризован с помощью анализа Ν-концевой микропоследовательности. Полученную последовательность сравнили и нашли отличной от таковой известного рецептора ΙΕΝΆΚ. (14). Она также отличалась от таковой любого другого известного белка, и она не кодировалась ни одной из известных последовательностей ДНК, что определяли путем ее сравнения с вводами банков данных δ^ίδδρτοΐ и СеиеЬаик с применением программы Ε;·ΐ5ΐΆ (23).

Гомогенные препараты ΙΕΝΑΒ-ΒΡ, выделенного из мочи, применяли в качестве иммуногена для получения антител.

Подразумевается, что термин антитело включает в себя поликлональные антитела, моноклональные антитела (МАТ), химерные антитела, антиидиотипические (анти-И) антитела к антителам, которые могут быть помечены в растворимой или связанной формах, равно как и их активные участки, полученные в соответствии с любой известной методикой, такой как, но не ограничиваясь, ферментативное расщепление, пептидный синтез или рекомбинантные методики.

Поликлональные антитела представляют собой гетерогенные популяции молекул антител, полученные из сыворотки животных, иммунизированных антигеном. Моноклональное антитело содержит, по существу, гомогенную популяцию антител, специфичных к антигенам, причем данная популяция содержит, по существу, идентичные эпитопсвязывающие сайты. МАТ могут быть получены в соответствии с методиками, известными специалистам в данной области. Смотри, например, КоЫет апб Мбк!еш, Ыа!иге 256:495-497 (1975); Патент США № 4376110; АикиЬе1 е! а1., ебк., Ситтеп! Рго!осо1к ίη Мо1еси1аг Вю1оду, Стеепе РиЬбкЫпд Аккос. апб \УПеу 1п!еткс1епсе, Ν.Υ., (1987-1996); Наг1оте апб Ьапе, Ап!1Ьоб1ек: А ЬаЬота!оту Мапиа1, Со1б 8ртшд НагЬог ЬаЬота!оту (1988); и СоШдап е! а1., ебк., Ситтеп! Рго!осо1к ш 1ттипо1оду, Сгеепе РиЬбкЫпд Аккос. апб \УПеу 1п!егкаепсе, Ν.Υ., (1992-1996), причем содержание данных ссылок приводится здесь целиком в качестве ссылки. Такие антитела могут являться иммуноглобулинами любого класса, включая 1дС, 1дМ, 1дЕ, 1дА, С1ЬЬ и любой их подкласс. Гибридома, продуцирующая МАТ по настоящему изобретению, может быть выращена ш убто, ш кйи или ш У1уо. Продукция более высоких титров МАТ ш У1уо или 1п кйи делает данные методики предпочтительным в настоящее время способом продукции.

Химерные антитела представляют собой молекулы, различные части которых происходят от животных разных видов, как, например, молекулы, содержащие вариабельный участок, происходящий из мышиного МАТ, и постоянный участок человеческого иммуноглобулина. Химерные антитела исходно применяли для снижения иммуногенности в применении и для повышения объема продукции, например, если мышиные МАТ продуцируются гибридомами с более высоким выходом, но с более высокой иммуногенностью у людей, такие как человеческие/мышиные, применяют химерные МАТ. Химерные антитела и способы их продукции известны в данной области (СаЬШу е! а1., Ргос. N311. Асаб. δα. И8А 81:3273-3277 (1984); Моткоп е! а1., Ргос. №11. Асаб. δα. И8А 81:6851-6855 (1984); Воийаппе е! а1., №1Шге 312:643-646 (1984); СаЬб1у е! а1., заявка на Европейский патент 125023 (опубликованная 14 ноября 1984 года); №иЬетдет е! а1., №1Шге 314:268-270 (1985); ТашдисЫ е! а1., заявка на Европейский патент 171496 (опубликованная 19 февраля 1985 года); Моткоп е! а1., заявка на Европейский патент 173494 (опубликованная 5 марта 1986 г.); №иЬетдет е! а1., заявка по РСТ XVО 8601533 (опубликованная 13 марта 1986 г.); Кибо е! а1., заявка на Европейский патент 184187 (опубликованная 11 июня 1986 г.); Моткоп е! а1., заявка на Европейский патент 173494 (опубликованная 5 марта 1986 г.); 8айадап е! а1., 1. 1ттипо1. 137:1066-1074 (1986); КоЫпкоп е! а1., публикация Международного патента, νθ 9702671 (опубликованная 7 мая 1987 г.); Ь1и е! а1., Ргос. Ν3!1. Асаб. δα. И8А 84:3439-3443 (1987); 8ип е! а1., Ргос. №!1. Асаб. δοΐ. И8А 84:214-218 (1987);

Вейет е! а1., 8аепсе 240:1041-1043 (1988); и

Наг1оте апб Ьапе, АпбЬоб1ек: А ЬаЬота!оту Мапиа1, кирга). Данные ссылки включены сюда целиком в качестве ссылки.

Антиидиотипическое (анти-1б) антитело представляет собой антитело, которое распознает специфичные детерминанты, как правило, ассоциированные с антигенсвязывающим сайтом антитела. Анти-1б антитело может быть получено путем иммунизации животного одинакового вида и генотипа как источника МАТ (например, линии мышей) МАТ, на которое получают анти-1б. В организме иммунизированного животного будут происходить распознавание и ответ на идиотипические детерминанты иммунизирующего антитела в виде выработки антител на данные идиотипические детерминанты (анти-1б антитело). См., например, патент США № 4699880, который включен здесь целиком в качестве ссылки.

Анти-1б антитело может быть также применено в качестве иммуногена для индукции иммунного ответа еще в одном животном с получением так называемого анти-анти-1б антитела. Анти-1б антитело может обладать идентичными эпитопами с исходным МАТ, которое индуцировало выработку анти-1б. Таким образом, с помощью применения антител к идиотипическим детерминантам МАТ можно идентифицировать другие клоны, экспрессирующие антитела идентичной специфичности.

Соответственно, МАТ, выработанные против IРNАВ-ВРI, IРNАВ-ВРII и родственных белков по настоящему изобретению, могут быть применены для индукции анти-1б антител в подходящих животных, таких как мыши ВАЬВ/с. Спленоциты таких иммунизированных мышей применяют для создания анти-1б гибридом, секретирующих анти-1б МАТ. Далее, анти1б МАТ могут быть прикреплены к носителю, такому как гемоцианин 1<еу1ю1е бтре! (КЕН), и применены для иммунизации дополнительных мышей ВАЬВ/с. Сыворотка данных мышей будет содержать анти-1б антитела, которые обладают параметрами связывания исходных МАТ, специфичных к IРNАВ-ВРI или IРNАВ-ВРII.

Таким образом, анти-1б МАТ содержат собственные идиотипические эпитопы, или идиотопы, структурно сходные с эпитопом, подвергающимся оценке, таким как IРNАВ-ВРI или 1^АВ-ВРП.

Также подразумевается, что термин антитело включает как интактные молекулы, так и их активные участки, такие как, например, РаЬ и Р(аЬ')₂, которые способны связывать антиген. РаЬ- и Р(аЬ')₂-фрагменты не содержат Рсфрагмента интактного антитела, быстрее выводятся из циркуляции и могут в меньшем объеме осуществлять неспецифическое связывание с тканями по сравнению с интактным антителом (№аЫ е! а1., 1. Νυε1. Меб. 24:316-325 (1983)).

Было бы чрезвычайно полезно, если бы БаЬ- и Б(аЬ')₂- и другие фрагменты антител, применимые по настоящему изобретению, могли быть применены для избирательного блокирования биологической активности ΙΡΝ-α в соответствии с методиками, описанными здесь для интактных молекул антител. Такие фрагменты обычно получают путем протеолитического расщепления, применяя ферменты, такие как папаин (для получения БаЬ-фрагментов) или пепсин (для получения Р(аЬ')₂-фрагментов).

Об антителе говорят, что оно способно связывать молекулу, если оно способно специфично взаимодействовать с молекулой, посредством чего молекула связывается с антителом. Подразумевается, что термин эпитоп относится к той части любой молекулы, способной к связыванию с антителом, которая также может быть распознана данным антителом. Эпитопы или антигенные детерминанты обычно состоят из химически активных поверхностных группировок молекул, таких как аминокислоты или боковые цепи сахаров, и обладают специфичными трехмерными структурными характеристиками, равно как и специфичными зарядовыми характеристиками.

Антиген представляет собой молекулу или часть молекулы, способную к связыванию с антителом, которое к тому же способно индуцировать ответ иммунной системы животного в виде продуцирования антитела, способного связываться с эпитопом данного антигена. Антиген может содержать один или несколько эпитопов. Подразумевается, что специфичная реакция, относящаяся к указанному выше, указывает на то, что антиген будет высоко избирательно взаимодействовать с соответствующим ему антителом и не будет взаимодействовать с множеством других антител, выработка которых может быть индуцирована другими антигенами.

Антитела, включая фрагменты антител, применимые по настоящему изобретению, могут быть применены для блокирования биологической активности подтипов ΙΡΝ-α с оказанием незначительного влияния на активность интеферона-β.

Настоящее изобретение также обеспечивает молекулы ДНК, кодирующие последовательность любого из антител по настоящему изобретению, которые определены выше, реплицируемые экспрессирующие векторы, содержащие любые из таких молекул ДНК, клетки-хозяева, трансформированные любыми из таких экспрессирующих векторов, включая прокариотические и эукариотические клетки-хозяева.

Данное изобретение далее относится к активным мутеинам и активным участкам указанных антител и к гибридным белкам, состоящим из антител дикого типа, или их активных мутеинов или их активных участков, конденсированных с другим полипептидом или белком и проявляющих сходную способность блокировать биологическую активность ΙΡΝ I типа.

ДНК, кодирующую последовательности указанных антител, их активных участков, мутеинов или гибридных белков, и оперативно пришитые регуляторные сигналы транскрипции и трансляции, вносят в эукариотические векторы, которые способны интегрировать последовательность желаемого гена в хромосому клетки-хозяина. В целях выбора клеток, которые устойчиво интегрируют внесенную ДНК в свои хромосомы, применяют один или несколько маркеров, которые позволяют выбирать клеткихозяева, которые содержат экспрессирующий вектор. Маркер может обеспечить прототрофность для ауксотрофного хозяина, невосприимчивость к биоцидам, например, к антибиотикам, или невосприимчивость к тяжелым металлам, таким как медь, или тому подобное. Избранный маркерный ген может быть либо непосредственно пришит к последовательностям ДНК генов, подлежащих экспрессии, или введен в ту же клетку по методу котрансфекции. Дополнительные элементы могут также быть необходимыми для оптимального синтеза одноцепочечной мРНК Ьшбшд рто1еш. Данные элементы могут включать в себя сплайсинг-сигналы, равно как и промоторы, энхансеры транскрипции и сигналы терминации (24).

В целях экспрессии указанных антител, их активных участков или производных молекула ДНК, подлежащая введению в выбранные клетки, предпочтительно, будет включена в плазмиду или вирусный вектор, способный к автономной репликации в хозяин-реципиент.

Представляющие важность факторы в выборе конкретной плазмиды или вирусного вектора включают в себя простоту, с которой клетки-реципиенты, которые содержат вектор, могут быть распознаны и выделены из тех клетокреципиентов, которые не содержат вектор; число копий вектора, которое желательно внести в определенного хозяина; и является ли желаемым переносить вектор между клеткамихозяевами различных видов. Предпочтительные прокариотические векторы включают плазмиды, такие как реплицируемые в Е. сой, например, рВК.322, Со1Е1, р8С101, рАСУС 184 и т.д. (25); плазмиды ВасШик, такие как рС194, рС221, рТ127 и т.д. (26); плазмиды 81гср1отусс5. включая рШ01 (27), бактериофаги 81тер1отусе5, такие как 1С31 (28) и плазмиды Ркеиботоиак (29, 30).

Предпочтительные эукариотические плазмиды включают ВРУ, вирус коровьей оспы, 8У40, 2-микронное кольцо и т.д. или их производные. Такие плазмиды хорошо известны в данной области (31-35).

Как только вектор или последовательность

ДНК, содержащую мотив(ы), подготавливают к экспрессии, экспрессирующий вектор может быть введен в подходящую клетку-хозяин по9 средством любого из множества методов, таких как трансформация, трансфекция, липофекция, конъюгация, слияние протопластов, электропорирование, кальцийфосфатная преципитация, прямая микроинъекция и т.д.

Клетки-хозяева, применимые по данному изобретению, могут являться либо прокариотическими, либо эукариотическими. Предпочтительные прокариотические хозяева включают бактерии, такие как Е. сой, ВасШик, 8!гер!отусек, Ркеиботопак, 8а1тоие11а, 8еггайа и т.д. Наиболее предпочтительным прокариотическим хозяином является Е. сой. Особенно интересующие бактериальные хозяева включают штамм 294 Е. сой К12 (АТСС 31446), Е. сой Х1776 (АТСС 31537), Е. сой №3110 (Ε-, λ^-, прототрофная (АТСС 27325)) и другие энтеробактерии, такие как 8а1тоие11а ТурЫтигшт или 8еггайа тагсексепк и различные виды Ркеиботопак. В таких условиях белок находится в негликозилированном состоянии. Прокариотический хозяин должен быть совместим с последовательностью репликона и контрольной последовательностью в экспрессирующей плазмиде.

Предпочтительными эукариотическими хозяевами являются клетки млекопитающих, например, человеческие, обезьяньи, мышиные клетки и яйцеклетки китайского хомячка (СНО), поскольку они обеспечивают посттрансляционные модификации белковых молекул, включая адекватное упорядочивание, адекватное образование дисульфидных связей, равно как и гликозилирование по адекватным сайтам. Также посттрансляционные модификации пептидов, включая гликозилирование большим количеством остатков маннозы, могут проводить клетки дрожжей и клетки насекомых. Существует ряд стратегий экспрессии рекомбинантной ДНК, где применяются высокопродуктивные промоторные последовательности и большое количество копий плазмид, которые могут быть применены для получения желаемых белков в дрожжевых клетках и в клетках насекомых. В дрожжевых клетках происходит распознавание лидерных последовательностей клонированных продуктов генов млекопитающего и секреция пептидов, несущих лидерные последовательности. После внесения вектора клетки-хозяева культивируют в селективной среде, которая направляет рост векторсодержащих клеток. Экспрессия клонируемой(ых) последовательности(ей) генов приводит к продукции указанных антител, гибридных белков или мутеинов или их активных участков. Экспрессированные антитела затем выделяют и очищают в соответствии с любой традиционной методикой, включая экстракцию, осаждение, хроматографию, электрофорез и тому подобное, или по методу аффинной хроматографии.

Как здесь используется, термин мутеины относится к аналогам указанных антител, в которых один или несколько аминокислотных остатков указанных антител или их активных участков замещены различными аминокислотными остатками или удалены, или один или несколько аминокислотных остатков добавлены к исходной последовательности указанных антител, без существенного изменения активности полученных продуктов по сравнению с антителами дикого типа или их активными участками. Данные мутеины получают в соответствии с известными методиками синтеза и/или сайт-специфического мутагенеза или в соответствии с любой другой методикой, подходящей для данных целей.

Любой такой мутеин обладает последовательностью аминокислот, существенно дублирующей таковую указанных антител с тем, чтобы обладать активностью, по существу, идентичной таковой указанных антител или их активных участков. Одна группа указанных антител способна блокировать противовирусную активность человеческого ΙΕΝ-α2 и человеческого ΙΕΝ-β. Другая группа указанных антител способна блокировать противовирусную активность человеческого ΙΕΝ-α2, тогда как активность человеческого ΙΕΝ-β остается, по большей части, неизменной. Таким образом, с помощью постановки традиционных экспериментов, заключающихся в подвергании такого мутеина, например, обычному анализу противовирусной активности, может быть определено, обладает ли любой данный мутеин той же активностью, что и указанное антитело, поскольку мутеин, который блокирует эффект любого вида интерферона I типа, в достаточной мере сохраняет активность указанных антител и, таким образом, обладает, по крайней мере, одним из описанных применений указанных антител и, таким образом, обладает активностью, по существу, идентичной таковой указанных антител.

В предпочтительном осуществлении любой такой мутеин обладает идентичностью или гомологией с последовательностью одного из указанных антител, составляющей, по крайней мере, 40%. Более предпочтительно, он обладает идентичностью или гомологией с ней, составляющей, по крайней мере, 50%, по крайней мере, 60%, по крайней мере, 70%, по крайней мере, 80%, или, более предпочтительно, по крайней мере, 90%.

Мутеины указанных антител или их активных участков, которые могут быть применены по настоящему изобретению, или кодирующая их последовательность нуклеиновая кислота, включают ограниченный набор существенно соответствующих друг другу последовательностей, как, например, замещающие пептиды или полинуклеотиды, которые могут быть традиционно получены специалистом в данной области без постановки каких-либо обширных экспериментов, основываясь на учениях и руководствах, представленных здесь. Подробное описание белковой химии и структуры см. в 801111/,

С.Е. е! а1., Рппс1р1ек о! Рто!еш 81гис!иге, 8рппдег-Уег1ад, № а Уотк, 1978; и СгеЦЫоп Т.Е., Рто!ешк: 8!гис!иге апб Мо1еси1аг РторетИек, ГС.Н. Бтеетап & Со., 8ап Бгапаксо, 1983, которые включены здесь в качестве ссылки. Представление замен в нуклеотидных последовательностях, таких как предпочтения кодонов, см. в АикиЬе1 е! а1., кирга, в §§ А.1.1-А.1.24, и 8атЬтоок е! а1., кирга, в приложениях С и Ό.

Предпочтительными изменениями мутеинов по настоящему изобретению являются таковые, известные как консервативные замены. Консервативные аминокислотные замены в указанных антителах, полипептидах или белках или их активных участках могут включать в себя синонимичные аминокислоты в пределах группы, которая обладает существенно сходными физико-химическими свойствами, так что при замене между членами группы биологическая функция молекулы сохранится, СгаШйат. 8с1епсе, Уо1. 185, рр. 862-864 (1). Понятно, что вставки и делеции аминокислот также могут быть выполнены и в указанных выше последовательностях без какого-либо изменения их функции, особенно, если вставки и делеции затрагивают лишь несколько аминокислот, например, до тридцати, и более предпочтительно, до десяти, и если не удалены или не замещены аминокислоты, которые обладают принципиальным значением для образования функциональной конформации, например, цистеиновые остатки, АпПпек, Ртшс1р1ек Т1а! Сомегп Т1е Ео1бшд о! Рто!еш Сйашк, 8с1епсе, Уо1. 181, рр. 223-230 (1973). Белки и мутеины, полученные в результате таких делеций и/или вставок входят в сферу настоящего изобретения.

Предпочтительно, синонимичные аминокислотные группы представляют собой таковые, определенные в табл. 1. Более предпочтительно, синонимичные аминокислотные группы представляют собой таковые, определенные в табл. 2; и наиболее предпочтительно, синонимичные аминокислотные группы представляют собой таковые, определенные в табл. 3.

Таблица 1. Предпочтительные группы синонимичных аминокислот.

Аминокислота	Синонимичная группа
8ег	8ег, ТЬг, О1у, Акп
Ага	Ага, О1п, Ьук, О1и, Н1к
Ьеи	11е, Р11е, Туг, Ме!, Уа1, Ьеи
Рго	О1у, А1а, ТЪг, Рго
ΊΊ1Γ	Рго, 8ег, А1а, О1у, Н1к, О1п, ТЪг
А1а	О1у, Т11Г, Рго, А1а
Уа1	Ме!, Туг, Р11е, 11е, Ьеи, Уа1
О1у	А1а, Т11Г, Рго, 8ег, О1у
11е	Ме!, Туг, Р1е, Уа1, Ьеи, 11е
Р1е	Тгр, Ме!, Туг, 11е, Уа1, Ьеи, Р1е
Туг	Тгр, Ме!, Р1е, 11е, Уа1, Реи, Туг
Сук	8ег, Т11Г, Сук
И18	О1и, Ьук, О1п, Т11Г, Ага, Н1к
О1п	О1и, Ьук, Акп, Н1к, Т11Г, Ага, С1п
Акп	О1п, Акр, 8ег, Акп
1.У8	О1и, О1п, Н1к, Ага, Цук
Акр	О1и, Акп, Акр

О1и	Акр, Ьук, Акп, О1п, Н1к, Ага, О1и
Ме!	Р1е, 11е, Уа1, Ьеи, Ме!
Тгр	Тгр

Таблица 2. Более предпочтительные группы синонимичных аминокислот.

Аминокислота	Синонимичная группа
8ег	8ег
Ага	Н1к, Ьук, Ага
Реп	Ьеи, 11е, Р1е, Ме!
Рго	А1а, Рго
ТЪг	ТЪг
А1а	Рго, А1а
Уа1	Уа1, Ме!, 11е
О1у	О1у
11е	11е, Ме!, Р1е, Уа1, Ьеи
Р1е	Ме!, Туг, 11е, Ьеи, Р1е
Туг	Р1е, Туг
Сук	Сук, 8ег
Н1к	Н1к, О1п, Ага
О1п	О1и, О1п, Ык
Акп	Акр, Акп
Цук	Цук, Ага
Акр	Акр, Акп
О1и	О1и, О1п
Ме!	Ме!, Р1е, 11е, Уа1, Ьеи
Тгр	Тгр

Таблица 3. Наиболее предпочтительные группы синонимичных аминокислот

Аминокислота	Синонимичная группа
8ег	8ег
Ага	Ага
Реп	Ьеи, 11е, Ме!
Рго	Рго
ТЪг	ТЬг
А1а	А1а
Уа1	Уа1
О1у	О1у
11е	11е, Ме!, Ьеи
Р1е	Р1е
Туг	Туг
Сук	Сук, 8ег
Н1к	Н1к
О1п	О1п
Акп	Акп
Цук	Цук
Акр	Акр
О1и	О1и
Ме!	Ме!, 11е, Ьеи
Тгр	Ме!

Примеры выполнения замен аминокислот в белках, которые могут быть применены для получения мутеинов указанных антител или их активных участков для применения по настоящему изобретению, включают любые известные стадии методики, такие как представленные в патентах США РЕ33653, 4959314, 4588585 и 4737462, выданных Магк е! а1.; 5116943, выданном Ко111к е! а1.; 4965195, выданном Ыатеи е! а1.; 4879111, выданном Сйопд е! а1.; и 5017691, выданном Ьее е! а1.; и лизин-замещенных белках, представленных в патенте США № 4904584 (81ΐΗ\ν е! а1.).

В другом предпочтительном осуществлении настоящего изобретения любой мутеин указанных антител или их активных участков обладает аминокислотной последовательностью, существенно соответствующей таковой указанных антител. Подразумевается, что термин существенно соответствующий охватывает белки с минимальными изменениями, внесенными в структуру природного белка, которые не влияют на основные характеристики природных белков, особенно когда речь идет об их способности полностью или избирательно блокировать активность ΙΡΝ-α и ΙΕΝ-β. Тип изменений, которые как правило, считают подпадающими под определение существенно соответствующий, представляет собой изменения, которые являются результатом применения традиционных методик мутагенеза ДНК, кодирующей последовательности данных антител, приводящего к возникновению нескольких минимальных модификаций, и скрининга на предмет желаемой активности обсуждавшимся выше способом.

Мутеины по настоящему изобретению включают белки, кодируемые нуклеиновой кислотой, такой как ДНК или РНК, которую гибридизуют с ДНК или РНК, которая кодирует последовательность указанных антител по настоящему изобретению, в строго определенных условиях. Данное изобретение также включает такую нуклеиновую кислоту, которая также применима в качестве зонда для идентификации и очистки желаемой нуклеиновой кислоты. Кроме того, такая нуклеиновая кислота будет представлять собой главную кандидатуру на определение, кодирует ли она последовательность полипептида, который сохраняет функциональную активность указанных антител по настоящему изобретению. Термин строго определенные условия относится к условиям гибридизации и последующей промывки, которые специалисты в данной области обычно называют строгими. Смотри АикиЬе1 е! а1., Сиггеп! Рго!осо1к ίη Мо1еси1аг Вю1оду, кирга, 1п1еткс1епсе, ΝΥ, §§ 6.3 и 6.4 (1987, 1992) и ЗатЬгоок е! а1., кирга. Без какого-либо ограничения примеры строго определенных условий включают в себя условия промывки при температуре на 12-20°С ниже рассчитанной для исследуемого гибрида Т_пл, например, в 2*88С и 0,5% 8Ό8 в течение 5 мин, 2*88С и 0,1% 8Ό8 в течение 15 мин; 0,1*88С и 0,5% 8Ό8 при 37°С в течение 30-60 мин и затем 0,1*88С и 0,5% 8Ό8 при 68°С в течение 30-60 мин. Специалистам в данной области понятно, что строго определенные условия также зависят от длины последовательностей ДНК, олигонуклеотидных зондов (таких как длиной в 10-40 оснований) или смешанных олигонуклеотидных зондов. При применении смешанных зондов предпочтительным является использование вместо 88С хлорида тетраметиламмония (ТМАС). Смотри АикиЬе1, кирга.

Термин гибридный белок относится к полипептиду, содержащему указанные антитела или их активные участки или их мутеины, конденсированному с другим белком, который, например, обладает продолжительным временем циркуляции в жидкостях организма. Указанные антитела или их активные участки могут быть гибридизованы с другим белком, полипептидом и т. п.

Термин соли здесь относится как к солям карбоксильных групп, так и к солям добавления кислот аминогрупп указанных антител, их активных участков, мутеинов или их гибридных белков. Соли карбоксильной группы могут образовываться известным в данной области образом и включают в себя неорганические соли, например, соли натрия, кальция, аммония, железа (III) или цинка и т.п., и соли органических оснований, как, например, соли, образованные с аминами, такими как триэтаноламин, аргинин или лизин, пиперидин, прокаин и т. п. Соли добавления кислот включают в себя, например, соли минеральных кислот, таких как например, соляная кислота или серная кислота, и соли органических кислот, таких как, например, уксусная кислота или щавелевая кислота. Разумеется, любые такие соли должны обладать существенно сходной активностью с таковой указанных антител или их активных участков.

Термин функциональные производные, как здесь используется, охватывает производные указанных антител или их активных участков и их мутеинов и гибридных белков, которые могут быть получены из функциональных групп, которые присутствуют в качестве боковых цепей остатков или Ν- или С-концевых групп, известными в данной области способами, и функциональные производные включаются в область данного изобретения, поскольку они остаются фармацевтически применимыми, т. е. они не нарушают активность белка, которая существенно сходна с активностью указанных антител, и не придают токсичных свойств содержащим их композициям. Данные композиции могут, например, содержать полиэтиленгликолевые боковые цепи, которые способны маскировать антигенные сайты и продлевать время циркуляции указанных антител или их активных участков в жидкостях организма. Другие производные включают алифатические эфиры карбоксильных групп, амиды карбоксильных групп, образованные путем реакции с аммиаком или с первичными или вторичными аминами, Νацильные производные свободных аминогрупп аминокислотных остатков, образованные с ацильными радикалами (например, алканоильные или карбоциклические ароильные группы), или О-ацильные производные свободных гидроксильных групп (например, таковых серильных и треонильных остатков), образованные с ацильными радикалами.

Под активными участками указанных антител, мутеинов и гибридных белков в настоящем изобретении имеются в виду любой фрагмент или предшественники полипептидной цепи указанных антител, самих по себе или совместно с ассоциированными молекулами или присоединенными к ним остатками, например, углеводными или фосфатными остатками, или агрегаты любого из указанных выше антител при условии, что указанный участок обладает существенно сходной активностью с таковой указанных антител.

Настоящее изобретение далее относится к фармацевтическим композициям, содержащим фармацевтически приемлемый носитель и указанное антитело по данному изобретению или их активные мутеины, гибридные белки и их соли, функциональные производные или их активные участки.

Фармацевтические композиции по данному изобретению получают для введения путем смешивания указанных антител или их производных с физиологически приемлемыми носителями, и/или стабилизаторами, и/или наполнителями и готовят в дозированной форме, например, путем лиофилизации в дозировочных сосудах. Способ введения может представлять собой любой из общепринятых способов введения подобных средств и будет зависеть от подвергающегося лечению состояния, например, внутривенно, внутримышечно, подкожно, с помощью местной инъекции или местного нанесения, или путем непрерывной инфузии и т.д. Количество вводимого активного соединения будет зависеть от способа введения, подвергающегося лечению заболевания и состояния пациента. При местной инъекции, например, требуется меньшее количество белка на массу тела, чем требуется при внутривенной инфузии.

Указанные антитела применимы для модулирования или блокирования биологической активности различных подтипов ΙΕΝ-α, например, при сахарном диабете I типа, различных аутоиммунных заболеваниях, отторжении трансплантата, ВИЧ-инфекции и сходных заболеваниях, при которых имеет место нарушенная экспрессия ΙΕΝ-α, т.е. указанные антитела могут быть применены при любом состоянии, при котором избыток ΙΕΝ-α эндогенно продуцируется или вводится извне.

Соответственно, указанные антитела, гуманизированные антитела, их активные участки, мутеины, гибридные белки и их соли, функциональные производные и их активные участки предназначены для лечения аутоиммунных заболеваний, других воспалительных состояний в организме млекопитающих, для лечения токсических состояний, вызванных введением интерферона-альфа или интерферона-бета, юношеского диабета, системной красной волчанки и ВИЧ-инфекции.

Теперь данное изобретение будет проиллюстрировано следующими неограничивающими примерами:

Пример 1. Иммунизация мышей ΙΕΝΑΒ-ΒΡ и слияние с миеломными клетками.

Сначала самкам мышей Ва1Ь/С (в возрасте 3 месяцев) вводили 2 мкг очищенного ΙΕΝΑΒΒΡ в эмульсии на основе полного адъюванта Фройнда, а через три недели подкожно в неполном адъюванте Фройнда. Пять дополнительных инъекций вводили с 10-суточным интервалом подкожно в ФБР. Сыворотки данных мышей имели титр связывания 1:100000, что определяли по методу ΙδΚΙΑ (смотри ниже). Антисыворотки блокировали противовирусную активность как ΙΕΝ-α, так и ΙΕΝ-β, что определяли в соответствии со следующей процедурой.

Предварительно образованные монослои человеческих клеток ^Ι8Η в 96-луночных планшетах инкубировали в течение 2 ч при 37°С с двукратными разведениями антисыворотки (или моноклональных антител). Затем во все лунки добавляли ΙΕΝ-α2 или ΙΕΝ-β (в конечной концентрации 10 ЕД/мл; калибровано относительно стандартов ΝΙΗ) и далее планшеты инкубировали в течение 4 ч. Затем клетки заражали вирусом везикулярного стоматита (У8У) и инкубировали в течение ночи до тех пор, пока в контрольных лунках, не содержащих ΙΕΝ, не отмечался полный цитопатический эффект. За нейтрализующий титр антител в лунках, проявляющих 50% ЦПД, приняли 9 единиц/мл. Следовательно, 1 блокирующая единица/мл представляет собой концентрацию антител, необходимую для блокирования активности 1 ЕД/мл ΙΕΝ в данных условиях анализа. Сыворотка иммунизированных мышей имела нейтрализующий титр 120000 ЕД/мл как по ΙΕΝ-α2, так и по ΙΕΝ-β.

Окончательные повторные иммунизации очищенным ΙΕΝΑΒ-ΒΡ проводили внутрибрюшинно за 4 и за 3 суток до слияния. Слияние проводили, применяя в качестве участников слияния миеломную клеточную линию Ν8Ο/1 и лимфоциты, полученные как из селезенки, так и из лимфатических узлов иммунизированной мыши. Слитые клетки распределяли по 96луночным планшетам и гибридомы отбирали в ΌΜΕΜ, содержащей ΗΑΤ и 15% лошадиную сыворотку.

Пример 2. Скрининг гибридом и характеризация моноклональных антител.

Скрининг гибридом, продуцирующих анти-ΙΕΝΑΒ-ΒΡ моноклональные антитела, проводили следующим образом. Супернатанты гибридом тестировали на предмет наличия антиΙΕΝΑΒ-ΒΡ антител по методу инвертированного твердофазного радиоиммунного анализа (ΙδΒΙΑ) следующим образом. Планшеты для микротитрования, изготовленные из ПВХ, (Όνηαίοοίι БаЬогаЮг1С5, А1ехадбпа, УА) покрывали афинными очищенными козьими анти-мышиными сывороточными Г(аЬ)₂ антителами (1аек8ои ЬаЬ§, И8А) (10 мкг/мл, 100 мкл/лунка). После инкубации при 4°С в течение ночи планшеты промывали дважды ФБР, содержащим БСА (0,5%) и Ттеееи 20 (0,05%) и блокировали в промывающем растворе в течение, по крайней мере, 2 ч при 37°С. Добавляли культуральные супернатанты гибридом (100 мкл/лунка) и планшеты инкубировали в течение 4 ч при 37°С. Планшеты промывали 3 раза промывным раствором, и добавляли для дальнейшей инкубации ¹²⁵Ι-ΙΡΝΑΒ-ΒΡ (100 мкл, 105 срт) в течение 16 ч при 4°С. Планшеты промывали 3 раза и отдельные лунки выделяли и анализировали с помощью гамма-счетчика. Образцы, в которых подсчет давал результат, по крайней мере, в 5 раз превышающий значение, полученное на отрицательном контроле, расценивали как давшие положительный результат (таблица 4). Все положительные клоны отбирали и субклонировали. Отдельные субклоны вводили мышам Ва1Ь/С, у которых с помощью ргМапе стимулировали выработку асцитической жидкости. Иммуноглобулины выделяли из асцитической жидкости путем осаждения сульфатом аммония (50% насыщения). Изотипы антител определяли с применением коммерчески доступного набора для ЕЫ8А (Атегайат, ИК).

Различные моноклональные антитела, равно как и супернатанты гибридом, концентрированные супернатанты гибридом, асцитическая жидкость или иммуноглобулины из асцитической жидкости далее тестировали на предмет их способности блокировать рецептор и препятствовать противовирусной активности ΙΡΝ-α2 и ΙΡΝ-β, как описано выше применительно к сыворотке иммунизированных мышей. Результаты приведены в табл. 4. Таким образом, было обнаружено, что моноклональные антитела 16.3, 53.2 и 392.1 блокируют противовирусную активность как ΙΡΝ-α2, так и ΙΡΝ-β в сравнимых титрах, тогда как было неожиданно обнаружено, что титр моноклональных антител 35.9, 51.44 и 234.14 против ΙΡΝ-α2 значительно выше, чем их титр против ΙΡΝ-β. Таким образом, моноклональные антитела 35.9, 51.44 и 234.14 могут быть применены в определенном интервале концентраций для избирательного блокирования активности ΙΡΝ-α, тогда как активность ΙΡΝ-β затронута не будет.

Таблица 4. Характеризация моноклональных антител против рецептора ΙΡΝ-α/β (ΙΡΝΑΒ-ΒΡ).

Антитело	ΙδΚΙΑ (число импульсов в минуту)	Нейтрализующий титр ΙΡΝα2 (ЕД/мл)	Нейтрализующий титр ΙΡΝβ (ЕД/мл)	Класс Ιβ
16.3 Супернатант гибридомы	39103	> 5120	НО	Ι§Ο1
16.3 Асцитическая жидкость¹	НО²	60000	60000	Ι§Ο1
35.9 Супернатант гибридомы	33100	1280	150	Ι§Ο1
35.9 Асцитиче- ская жидкость	НО	60000	15000	Ι§Ο1
51.44 Супернатант гибридомы	6345	1000	< 75	!§О2а

51.44 Κ (5 мг/мл)	НО	15000	< 2500	Ιβ62η
53.2 Супернатант гибридомы	26737	2000	НО	Ι§Ο1
53.2 Асцитическая жидкость	НО	120000	70000	Ι§Ο1
117.7 Супернатант гибридомы	38945	2000	НО	Ι§Ο1
117.7 Ιη (10 мг/мл)	НО	28800000	2000000
234.14 Супернатант гибридомы	21812	> 5120	< 200	ЦО2а
234.14 Ιπ (10 г/мл)	НО	1440000	23000	[аС2а
392.1 Супернатант гибридомы	34390	2400	НО	Ι§Ο1
392.1 Асцитическая жидкость	НО	160000	70000	Ι§Ο1

¹ Приблизительно 5 мг/мл Ι§.

² Не определялась.

Пример 3. Применение моноклональных антител для постановки на ΙΡΝΑΒ-ΒΡΙΙ теста ЕЫ8А.

Планшеты для микротитрования (Эупа1есй или Мах18ОгЬ, ЬШпс) покрывали анти-ΙΡΝΑΒΒΡ моноклональными антителами в течение ночи при 4°С. Данное нанесение первого покрытия может быть выполнено с применением любого моноклонального антитела № 46.10 (1д фракция, 120 мкл/лунка, 10 мкг/мл в ФБР). Моноклональное антитело № 46.10 описано в публикации ЕР № 676413.

Альтернативно, для нанесения первого покрытия может быть применено моноклональное антитело № 117.7. Планшеты промывали ФБР, содержащим БСА (0,5%), Ттеееп 20 (0,05%) и ΝαΝ₃ (0,02%) (Блокирующий раствор) и блокировали в том же растворе в течение ночи при 37°С. Тестируемые образцы подвергали серийному двукратному разведению (начиная с 1:4) в Блокирующем растворе, содержащем 0,1% ΝΡ40 и 0,65М №1С1 и добавляли в лунки (100 мкл/лунка) на 4 ч при 37°С. Планшеты затем промывали 3 раза ФБР, содержащим 0,05% Ттеееи 20 (ФБР/Ттеееи) с последующим добавлением биотинилированного моноклонального антитела № 234.14 (1:1000 в Блокирующем растворе, но без ΝαΝ₃ 100 мкл/лунка) для дальнейшей инкубации в течение ночи при 4°С. Планшеты промывали 3 раза ФБР/Ттеееи (100 мкл/лунка) и в течение 2 ч при комнатной температуре добавляли конъюгат стрептавидинпероксидаза хрена (1аск8оп ЬаЬк, 1:10000 в ФБР/Ттеееи, 100 мкл/лунка). Планшеты промывали 3 раза ФБР/Ттеееи, и после добавления в каждую лунку 100 мкл свежеприготовленного раствора АБТС (2,2'-азино-бис(3-этилбензтиазолин-6-сульфоновой кислоты), 81дта, 10 мг; 6,4 мл Н₂О; 2,2 мл 0,2М Ыа₂НРО₄, 1,4 мл 0,2М лимонной кислоты; 1 мкл Н₂О₂) в качестве субстрата развивалась окраска. Окраска развивается в течение 30 мин, и реакция может быть остановлена путем добавления 100 мкл/лунка 0,2М лимонной кислоты. Данные с планшетов были считаны автоматическим ЕЬКА-ридером при 405 нм, делая поправку на неспецифическое считывание при 630 нм. Нижний предел определения в данном анализе составлял 30 пг/мл.

Предшествующее описание конкретных осуществлений выявляет общую природу данного изобретения, так что другие могут, применяя данные знания, с легкостью модифицировать и/или приспосабливать такие конкретные осуществления для различных приложений без отдаления от основополагающей концепции, и, таким образом, такие приспособления и модификации должны и предназначены для того, чтобы быть охвачены значением и кругом эквивалентов описанных осуществлений. Следует понимать, что фразеология и терминология, применяемая здесь, служит цели описания, а не ограничения.

Гидридомы 46.10, 117.7 и 234.14 были положены на хранение в Раз!еиг ΙηδΙίΙιιΙ (СХСМ) под номерами хранения 1-1697, 1-1698 и 1-1699, соответственно, 23 апреля 1996 года.

Ссылки

1. Тау1ог, ЬЬ., е! а1., Кесеп! ргодгезз ίη ίη(егГегоп гезеагсй:то1еси1аг тесйашзтз о! геди1аΙίοη. асйоп апб У1гиз сйситуепбоп. У1гиз Кезеагсй. 15:1-26, 1990.

2. В1зсед11е, А.М., е! а1., КесотЬшап! ш!егГегоп а1рйа !йегару Гог сйгошс йераййз С. А гапбош1/еб, боиЫе-Ыпб, р1асеЬо-соп!го11еб 1па1. Хеи Епд. 1. Меб., 321: 1506-1510. 1989.

3. МсЭоппеИ, У.М., е! а1., Аси!е йераййз С 1пГес!юп: шктГегоп йпа11у зиссеебз, Саз!гоеп!его1оду (И8), 103: 1359-1360, 1992.

4. Рйебшап-Ктеп, А.Е., е! а1., Ха!ига1 ш!егГегоп а1рйа Гог !геа!теп! оГ сопбу1ота!а асиш1па!а. 1. Ат. Меб. Аззп., 259: 533-538, 1988.

5. Ма1пз, 1., е! а1., 1п!егГегоп: сиггеп! апб 1и!иге с11шса1 изез ш шГесйоиз б1зеазе ргасйсе, 1п!. 1. 8!иб. А^8, 3:4-9, 1992.

6. Вегтап, Е., е! а1., 'Чпабепсе оГ гезропзе апб 1опд !егт Го11ои ир ш райеп!з ийй йа1гу се11 1еикет1а !геа!еб ийй гесотЬшап! ш!егГегоп А1рйа-2а, В1ооб, 75: 839-845, 1990.

7. Та1рах, М., е! а1., С1шка1 шуезйдайоп оГ йитап а1рйа ш!егГегоп ш сйгопк туе1одепоиз 1еикет1а, В1ооб, 69: 1280-1288, 1987.

8. Эе Уй, К., е! а1., С1шка1 апб У1го1од1са1 еГГес!з оГ кдй-бозе гесотЫпап!-ш!егГегоп-а ш б1ззет1па!еб АЮ8-ге1а1еб КарозГз загсота, Ьапсе!, 2: 1214-1222, 1988.

9. Кйрре1, 1.Н., е! а1., 8егит а1рйа ш!егГегоп апб 1утрйосу!е шс1изюпз ш зуз!етк 1ириз егу!йета!озиз, Аппа1з оГ !йе Кйеитайс О1зеазез, 44:104-108, 1985.

10. Ьаи, А.8., е! а1., Кеди1айоп оГ !итог песгоз1з Гас!ог гесер!ог ехргеззюп Ьу ас1б-1аЫ1е ш!егГегоп-а1рйа Ггот ΛΙΩ8 зега, АЮ8 Кез Нит. Кейоуйизез. 7: 545-552, 1991.

11. 8!еиай, Т.А., 'Тпбисйоп оГ !уре I б1аЬе!ез Ьу ш!егГегоп-а ш !гапздеп1с тке, 8с1епсе, 260: 1942-1946, 1993.

12. Тзауапз, Ν., е! а1., Тгеа!теп! оГ гепа1 се11 сагсшота ийй езса1айпд бозез оГ а1рйа ш!егГегоп, Сйето!йегару (8ийхег1апб), 39: 361366, 1993.

13. Вгапка, А.А., е! а1., Еу1бепсе !йа! !урез I апб II йИегГегопз йауе бйГегеп! гесер!огз, Ха!иге, 294: 768-770, 1981.

14. и хе, С., е! а1., Сепейс !гапзГег оГ а Гипсйопа1 йитап ш!егГегоп а гесер!ог ш!о тоизе се11з: с1ошпд апб ехргеззюп оГ йз сЭХА, Се11. 60: 225-234, 1990.

15. Со1атоп1с1, О.К., е! а1., Сйагаскйхайоп оГ !йгее топос1опа1 апйЬоб1ез 1йа! гесодшхе !йе ш!егГегоп-а2 гесер!ог, Ргос. Ха!1. Асаб. 8сГ И8А. 87:7230-7234, 1990.

16. Р1а!ашаз, Ь.С., е! а1., Ехргеззюп оГ !йе ШХ- гесер!ог ш йа1гу се11 1еикет1а, Вгй. 1. Наета!о1оду, 82: 541-546, 1992.

17. Со1атш1с1, О.К., е! а1., ’йбепбйсайоп оГ а поуе1 зиЬипй оГ !йе !уре I ШктГегоп гесер!ог ксайхеб !о йитап сйготозоте 21, 1. Вю1. Сйет., 268:10895-10899, 1993.

18. Вепой, Р., е! а1., А топос1опа1 апйЬобу !о гесотЫпап! йитап ШХ-а гесер!ог 1пй1Ьйз Ью1одк асйуйу оГ зеуега1 зрескз оГ йитап ШХ-а ШХ-β апб ШХ-отеда, ПшшипоГ, 150:707-716, 1993.

19. Хоукк, Ό., е! а1., Тйе Нитап ШктГегоп /иЬи гесер!ог: Сйатаскйхайоп апб то1еси1аг с1ошпд, Се11, 77: 391-400, 1994.

20. Сойеп, В., е! а1., Шдапб-Шбисеб аззос1айоп оГ !йе Туре I ШктГегоп гесер!ог сотропеп!з, Мо1ес. Се11. Вю1., 15: 4208-4214, 1995.

21. Вепой, Р., е! а1., А Мопос1опа1 АпйЬобу !о КесотЬШап! Нитап ШХ-а1рйа Кесер!ог Iηй^Ь^!з Вю1одк Асйуйу оГ 8еуега1 8рес1ез оГ Нитап ШХ-а1рйа, ШХ-Ье!а, апб ШХ-отеда Ое!есйоп оГ Не!егодепейу оГ !йе Се11и1аг ТуреН ШХ Кесер!ог, 1. Iтшиηο1., 150(3): 707-716, 1993.

22. Со1атоп1с1, О.К., е! а1., ШепйГкайоп оГ а Хоуе1 8иЬиш! оГ !йе Туре-! ШктГегоп Кесер!ог йосайхеб !о Нитап Сйготозоте-21, 1. Вю1. Сйет., 268(15): 10895-10899, 1993.

23. Реагзоп, У.Е., е! а1., йпргоиеб !оо1з Гог Ью1одка1 зедиепсе сотрапзоп, Ргос. Хай. Асаб. 8сГ И8А, 85: 2444-2448, 1988.

24. Окауата, Н., е! а1., А сЭХА с1ошпд уес!ог 1йа! регтйз ехргеззюп оГ сЭХА шзейз Ш таттайап се11з, Мо1. Се11. Вю1., 3: 280-289, 1983.

25. Машайз, е! а1., Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога!огу Мапиа1, Со1б 8рйпд НагЬог ЬаЬота!огу, Хеи Уогк, 1982.

26. Сгусхап, Т., Тйе Мо1еси1аг Вю1оду оГ !йе Вас1Ш, Асабетк Ргезз, ХУ (1982), рр. 307329.

27. Кепба11, К.1. е! а1., 1. Вас!ейо1., 169: 4177-4183, 1987.

28. Сйа!ег, К.Е., е! а1., ш 81х1й Ш!егпайопа1 8утрозшт оп Асйпотусе!а1ез Вю1оду, Акабетгат Катбо, Вибарез!, Нипдагу (1986), рр. 45-54.

29. 1ойп, ТЕ., е! а1., (1986) Реу. 1п1ес1. Όίκ., 8: 693-704.

30. Иак1, К., (1978) 1рп. 1. Вас!епо1., 33: 729-742.

31. Во!к!е1п, Ό., е! а1., (1982) М1ат1 \Ут1. 8утр., 19:265-274.

32. Вгоасй, 1.Р., ίη ТНе Мо1еси1аг Вю1оду о! !Не УеаЧ 8ассйаготусек: ЫГе Сус1е апб 1пйегйапсе, Со1б 8рппд НагЬог БаЬогаЮгу. Со1б 8ргшд НагЬог, ΝΥ, рр. 445-470, 1981.

33. Вгоасй, 1.Р., (1982) Се11, 28:203-204.

34. Во11оп, Ό.Ρ., е! а1, (1980) 1.С1т. Нета!о1. Опсо1., 10: 39-48.

35. Машайк, Т., ίη Се11 Вю1оду: А Сотргейепкгуе Тгеабке, Уо1. 3: Сепе Ехргеккюп, Асабетю Ргекк, ΝΥ, рр. 563-608, 1980.

36. МтгикЫта, 8., е! а1., рЕЕ-ВО8, а ротеегГи1 таттаБап ехргеккюп уес!ог, ШсШс Ас1б Рек., 18: 5322-5328, 1990.

37. Вугп, Р.А., е! а1., №11иге (Ьопбоп), 344: 667-670, 1990.

38. Егойтап, М.А., е! а1., Ргос. №!1. Асаб. 8с1. И8А, 85: 8998-9002,1988.

39. Сгайат, Е.Ь., е! а1., У1го1оду, 52: 456467, 1973.

40. Мипкоп, Р.1., е! а1., Апа1. Вюсйет., 107: 220-239, 1980.

Claims

1. Антитело, способное связываться с рецептором ΙΕΝ-α/β и обеспечивающее более высокий антивирусный блокирующий титр против

ΙΕΝ-α, чем против ΙΕΝ-β, отличающееся тем, что оно не является поликлональным антителом, или его ЕаЬ-фрагменты.

2. Антитело по п. 1, отличающееся тем, что оно представляет собой моноклональное антитело.

3. Антитело по п. 1, отличающееся тем, что оно представляет собой химерное антитело.

4. Антитело по п. 1, отличающееся тем, что оно представляет собой гуманизированное антитело.

5. Антитело по п. 1, отличающееся тем, что оно представляет собой моноклональное антитело 234.14 (Ι-1699) или 117.7 (Ι-1698).

6. Гибридома, которая продуцирует моноклональное антитело 117.7 (Ι-1698).

7. Гибридома, которая продуцирует моноклональное антитело 234.14 (Ι-1699).

8. Фармацевтическая композиция, включающая моноклональное антитело 117.7 (Ι-1698) или 234.14 (Ι-1699).

9. Способ блокирования биологической активности ΙΕΝ-α, включающий введение пациенту эффективного количества композиции по п.8.

10. Набор для тестирования ΙΕΝΆΕ-ΕΡΙ или ШЫАВ-ВРП методом ЕЫ8А, включающий моноклональные антитела 117.7 (Ι-1698) и 234.14 (Ι-1699).