CN115558027B - 一种核酸酶的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种核酸酶的单克隆抗体及其应用，提供了一种鼠源粘质沙雷氏菌胞外核酸酶的单克隆抗体McAb‑A1H1H9B3或者McAb‑C1H4D4A2及产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞系，该单克隆抗体能够识别并特异性结合所述粘质沙雷氏菌胞外核酸酶。不仅可以用于制备SMNU核酸酶含量检测的试剂盒，还可以用于封闭SMNU核酸酶活性位点、阻断生物制品中引入的外源SMNU核酸酶的消化活性。其中，SMNU核酸酶定量检测试剂盒完善了试剂盒的各组分，各组分及试剂盒整体性能的稳定性都很高，37℃放置6天后，各组分回收率大于95%，有利于完善生物制品SMNU核酸酶残留检测标准，从而提高生物制品的安全性。

Description

一种核酸酶的单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及粘质沙雷氏菌胞外核酸酶的单克隆抗体、分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞系以及所述的抗体的应用，具体应用涉及到粘质沙雷氏菌胞外核酸酶含量的检测，尤其是涉及一种粘质沙雷氏菌胞外核酸酶含量的检测方法及一种用于粘质沙雷氏菌胞外核酸酶含量检测的试剂盒。

背景技术

核酸酶属于一类能够将核酸中的磷酸二酯键切断的水解酶，其中，粘质沙雷氏菌胞外核酸酶（Serratia marcescens Nuclease, SMNU，以下简称SMNU核酸酶）是一种糖类非特异性内切酶，该蛋白是30 kDa亚基的二聚体，带有两个必需的二硫键。SMNU核酸酶可在一系列宽泛的操作条件下，高效攻击和降解所有形式的DNA和RNA（单链、双链、线性、环状以及超螺旋），可将样品中的核酸完全消化为长度为3至5个碱基的5′-单磷酸末端寡核苷酸。由于SMNU核酸酶对核酸的高效水解，该酶已广泛运用于各个领域，其在生物工业中最主要的作用是外源核酸的去除。

在治疗用重组生物制品中，外源核酸的残留量已成为一个重要指标，与产品的生物安全性直接相关。利用核酸酶降解外源核酸的同时，引入的外源核酸酶在生物制品中的去除及其残留检测也得到各国的高度关注。如中国药典2020年版三部规定，以细胞基质生产的生物制剂的DNA残留量不能超过100 pg/剂，以细菌或真菌基质生产的疫苗的DNA残留量不能超过10 ng/剂（即10 ng/mL）；美国FDA发布的指导原则中指出，生物制品中的外源DNA残留限度为100 pg/剂，对于大剂量生物制品，根据其残留DNA来源及给药途径，DNA残留量可放宽至10 ng/剂；欧洲药典通则规定的生物制品残留DNA限度大多为不超过10 ng/剂。因此生物制品生产企业质控人员需要检测成品中的外源DNA片段残留量，提高生物制品的安全性。

目前，对于核酸酶残留检测的研究，一方面集中在基于荧光探针的检测方案，在无核酸酶的样品中，探针可以稳定存在，不会产生荧光信号的增强；含有核酸酶残留的样品中，核酸酶可将荧光标记的DNA探针切割，从而产生逐渐增强的荧光信号。然而，荧光探针的检测灵敏度一般为ng/mL级，检测灵敏度差异较大，且不同的荧光探针及荧光形式对检测方法的影响较大，在试剂保存及检测过程中还存在荧光淬灭的可能，从而影响检测结果。另一方面，核酸酶残留检测的研究还集中在免疫吸附ELISA的检测方案，利用样品中存在的核酸酶能与包被的核酸酶抗体形成“包被抗体-抗原”复合物，检测样品中存在的核酸酶。然而ELISA检测由于其方法本身的限制，会出现检测抗体的非特异性交叉反应，以及由于生物制品本身蛋白浓度差异造成的亲和吸附差异，导致测量准确性存在差异。目前，中国境内没有任何的SMNU核酸酶的相关检测试剂盒获批上市，因此，对于用来检测SMNU核酸酶活性、制备SMNU核酸酶含量检测的试剂盒及简单低成本高灵敏度的检测方法存在着市场需求。

此外，生物制品制备过程中还存在通过引入SMNU核酸酶来降解外源核酸的情况，但是新引入的SMNU核酸酶也会在生物制品中导致残留。然而目前还没有很好的小分子化合物或蛋白抑制剂能够抑制SMNU核酸酶的活性，特别是在DNA扩增相关蛋白纯化过程中残留的SMNU核酸酶还有可能消化模板及扩增片段，从而导致DNA扩增能力降低、特异性差。

发明内容

本发明的目的在于至少部分地克服现有技术的缺陷，提供了2株杂交瘤细胞系、对应分泌得到2种单克隆抗体。

本发明的目的还在于填补了国内SMNU核酸酶的空白，提供了一种SMNU核酸酶含量的检测方法和用于SMNU核酸酶含量检测的试剂盒。

本发明的目的还在于提高了外源SMNU核酸酶在生物制品中的安全性，提供了2种可以用于封闭SMNU核酸酶活性位点、阻断外源SMNU核酸酶消化活性的单克隆抗体。

为达到上述目的或目的之一，本发明提供了如下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种单克隆抗体，为鼠源粘质沙雷氏菌胞外核酸酶的单克隆抗体，能够识别并特异性结合粘质沙雷氏菌胞外核酸酶；该单克隆抗体是由杂交瘤细胞系A1H1H9B3或者杂交瘤细胞系C1H4D4A2产生的单克隆抗体，其中，杂交瘤细胞系A1H1H9B3或者杂交瘤细胞系C1H4D4A2对应产生的单克隆抗体分别为McAb-A1H1H9B3和McAb-C1H4D4A2。

第二方面，本发明提供了一种杂交瘤细胞系，产生单克隆抗体McAb-A1H1H9B3的杂交瘤细胞系A1H1H9B3的保藏号为CGMCC No.45308，产生单克隆抗体McAb-C1H4D4A2的杂交瘤细胞系C1H4D4A2的保藏号为CGMCC No.45309，保藏单位均为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址均为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类命名均为鼠抗粘质沙雷氏菌胞外核酸酶单克隆抗体杂交瘤细胞系，保藏日期均为2022年9月21日。

第三方面，本发明提供了一种粘质沙雷氏菌胞外核酸酶含量的检测方法，酶标抗体和包被抗体由单克隆抗体McAb-A1H1H9B3或者McAb-C1H4D4A2制备而成，用于检测粘质沙雷氏菌胞外核酸酶的含量；其中，由单克隆抗体McAb-A1H1H9B3或者McAb-C1H4D4A2制备而成的酶标抗体和包被抗体能够同时识别并特异性结合粘质沙雷氏菌胞外核酸酶；该检测方法不属于疾病的诊断和/或治疗方法。

优选地，采用酶联免疫双抗体夹心法进行定量检测，酶标板上的包被抗体包括单克隆抗体McAb-A1H1H9B3或者McAb-C1H4D4A2，酶标抗体包括辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体McAb-A1H1H9B3或者McAb-C1H4D4A2；检测步骤为：

1）加入样品，酶标板上的包被抗体与样品中粘质沙雷氏菌胞外核酸酶识别并特异性结合后形成“包被抗体-抗原”复合物；

2）用洗涤液清洗，洗去酶标板上不能与包被抗体特异性结合的物质；

3）加入酶标抗体，于35~40℃反应40~50 min，识别并特异性结合后形成“包被抗体-抗原-酶标抗体”复合物；

4）用洗涤液清洗，洗去酶标板上尚未特异性结合的酶标抗体；

5）加入显色剂，于35~40℃反应10~20 min，酶标板上含有“包被抗体-抗原-酶标抗体”复合物的酶标孔与显色剂反应先变为蓝色；再加入终止液终止，蓝色酶标孔变色为黄色；

6）酶标仪自动扫描并输出检测结果。

在一个优选实施例中，步骤3）中反应的温度例如可以是35℃、35.5℃、36℃、36.5℃、37℃、37.5℃、38℃、38.5℃、39℃、39.5℃或40℃等。

在一个优选实施例中，步骤3）中反应的时间例如可以是40 min、41 min、42 min、43 min、44 min、45 min、46 min、47 min、48 min、49 min或50 min等。

在一个优选实施例中，步骤5）中反应的温度例如可以是35℃、35.5℃、36℃、36.5℃、37℃、37.5℃、38℃、38.5℃、39℃、39.5℃或40℃等。

在一个优选实施例中，步骤5）中反应的时间例如可以是10 min、11 min、12 min、13 min、14 min、15 min、16 min、17 min、18 min、19 min或20 min等。

优选地，酶标抗体由单克隆抗体McAb-A1H1H9B3制备而成，浓度为0.5~2 µg/mL，例如可以是0.5 µg/mL、0.8 µg/mL、1 µg/mL、1.2 µg/mL、1.4 µg/mL、1.6 µg/mL、1.8 µg/mL或2 µg/mL等；包被抗体由单克隆抗体McAb-C1H4D4A2制备而成，浓度为2~5 µg/mL，例如可以是2 µg/mL、2.5 µg/mL、3 µg/mL、3.5 µg/mL、4 µg/mL、4.5 µg/mL或5 µg/mL等。

第四方面，本发明提供一种用于粘质沙雷氏菌胞外核酸酶含量检测的试剂盒，含有酶标抗体和包被抗体，其中，酶标抗体和包被抗体均由单克隆抗体McAb-A1H1H9B3或者McAb-C1H4D4A2制备而成，并且酶标抗体和包被抗体能够同时识别并特异性结合粘质沙雷氏菌胞外核酸酶。

优选地，用于粘质沙雷氏菌胞外核酸酶含量检测的试剂盒还包括酶标板、酶标试剂、样品稀释液、定量标准品、浓缩洗涤液、显色剂和终止液；包被抗体被固定在酶标板上，酶标抗体包括辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体McAb-A1H1H9B3或者McAb-C1H4D4A2，并包含在酶标试剂中，其中显色剂包括显色剂A液、显色剂B液。

优选地，用于粘质沙雷氏菌胞外核酸酶含量检测的试剂盒采用双抗体夹心定量检测方法，对粘质沙雷氏菌胞外核酸酶的定量检测范围为0.08～2.56 ng/mL，例如可以是0.08 ng/mL、0.1 ng/mL、0.3 ng/mL、0.6 ng/mL、1 ng/mL、1.3 ng/mL、1.6 ng/mL、2 ng/mL、2.3 ng/mL或2.56 ng/mL等。

第五方面，本发明提供了一种单克隆抗体的应用，单克隆抗体为McAb-A1H1H9B3或者McAb-C1H4D4A2，被应用于与粘质沙雷氏菌胞外核酸酶特异性结合后封闭粘质沙雷氏菌胞外核酸酶的活性。

优选地，应用于与粘质沙雷氏菌胞外核酸酶特异性结合后封闭粘质沙雷氏菌胞外核酸酶的活性时，特异性结合的作用条件为35~40℃孵育8~15 min。

在一个优选实施例中，孵育的温度例如可以是35℃、35.5℃、36℃、36.5℃、37℃、37.5℃、38℃、38.5℃、39℃、39.5℃或40℃等。

在一个优选实施例中，孵育的时间例如可以是8 min、8.5 min、9 min、9.5 min、10min、10.5 min、11 min、11.5 min、12 min、12.5 min、13 min、13.5 min、14 min、14.5 min或15 min等。

第六方面，本发明提供了一种单克隆抗体或杂交瘤细胞系在制备粘质沙雷氏菌胞外核酸酶含量检测的试剂盒中的应用，其中，单克隆抗体为McAb-A1H1H9B3或者McAb-C1H4D4A2、杂交瘤细胞系为A1H1H9B3或者C1H4D4A2。

本发明的有益效果：

本发明使用商品化的重组核酸酶免疫Balb/c小鼠后，通过筛选和2轮克隆化得到阳性的4株杂交瘤细胞，将4株杂交瘤细胞扩大培养后接种致敏的Balb/c小鼠腹腔，收获腹水经过纯化后初步得到了4种单克隆抗体（以下简称单抗）。用于SMNU核酸酶含量检测的试剂盒，在构建和优化筛选过程中，得到了McAb-A1H1H9B3和McAb-C1H4D4A2分别作为酶标抗体和包被抗体制备来源的最优配对组合。其中，采用双抗体夹心法建立的SMNU核酸酶定量检测试剂盒的检测范围为0.08～2.56 ng/mL，最小定量限度为0.08 ng/mL，且稳定性好、特异性和抗干扰能力强，与现有的科研试剂相比，检测范围相对较广。由于目前国内尚没有SMNU核酸酶含量检测的相关试剂盒获批上市，本产品能够填补国内SMNU核酸酶检测市场的空白，完善生物制品SMNU核酸酶残留检测标准，从而提高生物制品的安全性。

此外，本发明优化筛选得到的2种单抗McAb-A1H1H9B3和McAb-C1H4D4A2，无论各自单独作用，还是联合作用，都能够特异性地封闭核酸酶的活性位点，从而有效阻断SMNU核酸酶的消化活性，有利于降低生物制品中残留核酸酶的潜在危害。

对于SMNU核酸酶残留检测还主要基于荧光探针和免疫吸附ELISA，其中，基于荧光探针的检测方案，其检测灵敏度最多为ng/mL级，检测灵敏度差异较大，且不同的荧光探针及荧光形式对检测方法的影响较大，在试剂保存及检测过程中还存在荧光淬灭的可能，影响检测结果。而基于传统免疫吸附ELISA的方法，测量准确性差异较大，主要原因在于检测抗体的非特异性交叉反应和待检样品（比如生物制品本身成分复杂的情况下）中大量蛋白的干扰，造成了ELISA的特异性吸附差异。而本发明筛选得到的2种单抗McAb-A1H1H9B3和McAb-C1H4D4A2特异性强，通过性能评价可见其对生物制品的常见原料以及辅料（比如：明胶水解物、MEM培养液等）均没有非特异性结合反应，因而建立的SMNU核酸酶含量检测试剂盒的灵敏度、重复性、精密度、准确性和稳定性均很高。此外，在检测复杂样品中的SMNU核酸酶残量时，无交叉反应，特异性强，抗干扰能力良好。

本发明优选采用双抗体夹心法定量检测SMNU核酸酶的含量，优化得到了酶标抗体和包被抗体的最佳配对组合、酶标抗体和包被抗体的最佳使用浓度和用量、样品与包被抗体的最佳反应条件等；此外，还将市售的核酸酶Benzonase®稀释120000倍后作为核酸酶定量标准品，制备的标准曲线，线性R²>0.99，变异系数（CV）均<10%，因此，本发明所得SMNU核酸酶定量检测试剂盒，不仅能够定量检测样品的浓度，而且具有灵敏度高、检测范围广的优势。

本发明优化筛选得到的2种单抗McAb-A1H1H9B3和McAb-C1H4D4A2，不仅可以用于制备SMNU核酸酶含量检测的试剂盒，还可以用于封闭SMNU核酸酶活性位点、阻断外源SMNU核酸酶的消化活性；不仅有利于完善生物制品中SMNU核酸酶的检测标准，还有利于提高引入外源SMNU核酸酶的生物制品的安全性。

本发明优化筛选得到的SMNU核酸酶定量检测试剂盒，优化完善了试剂盒各组分，且该SMNU核酸酶定量检测试剂盒的各组分及试剂盒整体性能的稳定性高，35~40℃热加速5~7天后，各组分回收率大于95%。

附图说明

图1为SMNU核酸酶单克隆抗体的SDS-PAGE分析图，其中，1为McAb-C1H4D4A4，2为McAb-A1H1H9B3，3为McAb-C1H4D4A2，4为McAb-A1H1H9F2，M为蛋白Marker；

图2为SMNU核酸酶定量检测试剂盒的构建流程图；

图3为SMNU核酸酶定量检测试剂盒的标准曲线图；

图4为2种SMNU核酸酶单抗对SMNU核酸酶的活性封闭实验的电泳图；其中：1为对照，即未经SMNU核酸酶消化的底物；2为底物被SMNU核酸酶消化后的产物；3为底物被SMNU核酸酶与2种单抗（McAb-A1H1H9B3+McAb-C1H4D4A2）混合后消化的产物；4为底物被SMNU核酸酶与单抗1（McAb-A1H1H9B3）混合后消化的产物；5为底物被SMNU核酸酶与单抗2（McAb-C1H4D4A2）混合后消化的产物；6为2种单抗（McAb-A1H1H9B3+McAb-C1H4D4A2）直接与底物混合孵育后的产物；7为单抗1（McAb-A1H1H9B3）直接与底物混合孵育后的产物；8为单抗2（McAb-C1H4D4A2）直接与底物混合孵育后的产物；mk为10 kb DNA marker。

具体实施方式

下面结合附图详细描述本发明的示例性的实施例，其中相同或相似的表示相同的概念，比如定量PCR=QPCR，单克隆抗体=单抗，含量检测可以是定量检测、半定量检测或者定性检测等。

在下面的详细描述中，为便于解释，阐述了许多具体的细节以提供对本披露实施例的全面理解。在下面的详细描述中，为便于解释，阐述了许多具体的细节以提供对本披露实施例的全面理解。下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。

下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。其中，雄性Balb/c小鼠（18～22 g）购自中国食品药品检定研究院；重组SMNU核酸酶购自MERCK MILLIPORE公司（Benzonase®endonuclease，货号1.01697.0001），该SMNU核酸酶纯度（purity grade I）为≥99%；弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂购自SIGMA；RPMI-1640培养基购自GIBCO；SP2/0骨髓瘤细胞原始来源为ATCC；MabSelect™ Protein A填料购自GE公司（货号：17519901）；羊抗鼠IgG-HRP（辣根过氧化物酶Horseradish Peroxidase，简称HRP）为北京万泰生物药业股份有限公司自制，具体制备方法参见表1；紫外可见分光光度计TU-1901购自北京普析通用仪器有限责任公司；离心机购自Thermo Fisher。然而明显地，一个或多个实施例在没有这些具体细节的情况下也可以被实施，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。

表1 羊抗鼠IgG-HRP制备方法

下述实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。本发明实施的应用对象来源于待检测的生物制品，属于无生命的样本；所述检测的直接目的，是为了保证待检测的生物制品的安全性，从而有利于完善生物制品的质量控制标准，不存在获得疾病的诊断结果或健康状况的过程。因此，本发明不属于疾病的诊断方法，符合《专利法》对专利保护客体的基本要求。

本发明提供了一组分泌SMNU核酸酶单克隆抗体的杂交瘤细胞系、对应分泌的单克隆抗体及其应用，下面描述一下本发明的具体实施例，具体内容如下：

实施例1、单克隆抗体的制备

本发明通过制备、筛选得到了4株杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株能分泌对应的SMNU核酸酶的单克隆抗体，具体制备流程如下：

制备杂交瘤细胞株：

在制备杂交瘤细胞株的过程中，包括动物免疫、细胞融合和细胞筛选3个主要步骤：

1）动物免疫

根据制定的动物免疫方案，选择雄性Balb/c小鼠（18～22 g）为免疫动物，免疫原为重组核酸酶（Benzonase® endonuclease, purity grade I，≥99%），免疫程序如下表2所示：

表2 小鼠免疫程序

根据表2所示免疫程序，具体免疫操作如下：

初次免疫：取10只Balb/c雄性小鼠同时进行免疫，免疫剂量为30 µg/只，取重组SMNU核酸酶稀释到300 μg/mL，取出1 mL与1 mL弗氏完全佐剂充分乳化混合，免疫体积为0.2 mL/只，免疫途径为小鼠皮下多点注射。

第二次免疫：2周后进行第二次免疫，免疫剂量为30 µg/只，取重组SMNU核酸酶稀释到300 μg/mL，取出1 mL与1 mL弗氏不完全佐剂充分乳化混合，免疫体积为0.2 mL/只，免疫途径为小鼠皮下多点注射。

第三次免疫：第二次免疫2周后进行第三次免疫，免疫剂量为30 µg/只，取重组SMNU核酸酶稀释到300 μg/mL，取出1 mL与1 mL弗氏不完全佐剂充分乳化混合，免疫体积为0.2 mL/只，免疫途径为小鼠皮下多点注射。

免疫应答的效价检测：第三次免疫2周后经眼球后静脉丛采血，利用间接ELISA法检测抗体效价，选择效价达到1:7000000的1只小鼠用于后续的冲击免疫。

冲击免疫：免疫剂量为30 µg/只，取重组SMNU核酸酶稀释到300 μg/mL，免疫体积为0.1 mL/只，免疫途径为小鼠尾静脉注射，3～4天进行后续的细胞融合。

2）细胞融合

培养SP2/0骨髓瘤细胞：融合前1周复苏SP2/0细胞，按照1:4的比例传代扩大培养，培养基为RPMI-1640，至少传代3次后，观察细胞状态。选取生长状态良好（活细胞数>95%）的SP2/0骨髓瘤细胞，用弯头滴管将细胞从瓶壁轻轻吹下，收集于50 mL离心管，1000 rpm离心10 min，洗涤2次。采用台盼蓝对骨髓瘤细胞进行计数，取2×10⁷个骨髓瘤细胞备用。

培养饲养细胞：融合前1天取健康Balb/c小鼠1只，收集小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，铺板于96孔细胞板，37℃、5% CO₂培养箱内培养备用。培养基为400 mL的RPMI-1640中添加100 mL的胎牛血清、10 mL的HAT（50×）和5 mL的3%谷氨酰胺溶液。

分离脾细胞：冲击免疫3～4天后脱臼处死小鼠，无菌操作取出脾脏，剥去周围结缔组织，置于已盛有10 mL RPMI-1640基础培养基的平皿中，用弯头镊子挤压脾脏，使脾细胞进入平皿中的不完全培养基。用吸管吹打数次，制成单细胞悬液，1000 rpm离心10 min后用PBST（含0.1%吐温20的磷酸盐缓冲液，pH 7.4）重悬洗涤，如此离心、洗涤重复2次。用台盼蓝对洗涤后的脾细胞进行计数，取1×10⁸个脾细胞备用。

细胞融合：将1×10⁸个脾细胞与2×10⁷个SP2/0骨髓瘤细胞（数量比例为脾细胞:SP2/0=5:1）置于一支50 mL融合管中充分混匀，离心收集细胞，将上清尽量吸净，以免影响聚乙二醇1500（PEG1500）的浓度。转动离心管，沿管壁缓慢加入1 mL预热至37℃的50%PEG1500（pH 8.0），操作时间控制在1 min左右（优选时间为45 s），静置90 s，然后加入1 mL的RPMI-1640培养基终止PEG1500作用。最后每隔2 min分别加入2 mL、3 mL、4 mL、5 mL和10mL的RPMI-1640培养基稀释PEG1500，加入RPMI-1640培养基的体积共计为1+2+3+4+5+10=25mL，1000 rpm离心5 min收集细胞，加入HAT培养基重悬细胞，将融合细胞以100 µL/孔接种于铺有饲养细胞的96孔细胞板，继续培养10～14天。

3）细胞筛选

制备筛选用SMNU核酸酶抗体检测板：将重组SMNU核酸酶用0.05 M CB缓冲液（碳酸盐缓冲液，pH 9.6）稀释至4 µg/mL，以100 µL/孔加入96孔酶标板中，37℃孵育2 h后，在2～8℃下包被过夜。次日，用PBST洗板1次后拍干，加入封闭液，体积为200 µL/孔，37℃孵育2h，弃封闭液后拍干备用。

阳性杂交瘤细胞的筛选：细胞融合后继续培养10～14天之后，利用上述SMNU核酸酶抗体检测板采用间接ELISA法，进行融合后杂交瘤细胞的筛选，筛选出能分泌抗体的阳性杂交瘤细胞，具体步骤如下：吸取96孔细胞板中的细胞培养上清液，将吸取的细胞培养上清液以100 µL/孔加入到制备好的SMNU核酸酶抗体检测板中的对应孔内，于37℃水浴1 h；用PBST洗板后拍干，如此重复5次后，再以100 µL/孔加入羊抗鼠IgG-HRP（按1:8000稀释），于37℃水浴45 min；最后用PBST洗板后拍干，如此重复5次后，加入显色底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB），于37℃避光显色15 min后，加入50 µL终止液（2 M硫酸），即可测定OD_450/630吸光度。以OD_450/630吸光度≥2.0为标准，筛选出的阳性孔见表3。

表3 阳性杂交瘤细胞的筛选结果

第一次筛选出现阳性的孔中，其中的抗体可能来源于2个或多个杂交瘤细胞，因此它们所分泌的抗体是不同质的。为了得到完全同质的单克隆抗体，继续对阳性孔的杂交瘤细胞进行克隆化。

杂交瘤细胞的克隆化：根据上述筛选方法，将首次筛选出的阳性孔中的杂交瘤细胞，利用有限稀释法进行3次克隆化筛选，获得4株杂交瘤细胞株，分别命名为C1H4D4A4、A1H1H9F2、A1H1H9B3和C1H4D4A2。

由于A1H1H9B3和C1H4D4A2配对的检测灵敏度较好，最终选择杂交瘤细胞株A1H1H9B3和C1H4D4A2进行保藏，对应的保藏号分别为：CGMCC No.45308和CGMCC No.45309，均保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编为100101，保藏日期为2022年9月21日。这2株交瘤细胞系后续还会根据需要进行扩大培养，并适时地冻存保种。

制备腹水单抗：

将上述克隆化筛选获得的4株杂交瘤细胞株，分别按照约1×10⁶～1×10⁷个cell/只、且0.5~1 mL/只的注射量接种至已完成石蜡致敏的Balb/c小鼠腹腔中，每株杂交瘤细胞株接种小鼠2只，进行扩大培养，接种7~10天后取腹部隆起的小鼠，抽取腹水。McAb-C1H4D4A4共收集约10 mL腹水、McAb-A1H1H9F2共收集约8 mL腹水、McAb-A1H1H9B3共收集约8 mL腹水、McAb-C1H4D4A2共收集约7.5 mL腹水，即为SMNU核酸酶的腹水单抗，分别记为：McAb-C1H4D4A4、McAb-A1H1H9F2、McAb-A1H1H9B3和McAb-C1H4D4A2，即得扩大生产的单克隆抗体。

实施例2、单克隆抗体的纯化和鉴定

单克隆抗体的纯化：

将得到的上述腹水单抗进行纯化。首先，用饱和硫酸铵（pH 7.8，2 M）进行粗纯：边搅拌边滴加等体积的饱和硫酸铵进行盐析沉淀，再加入10 mM磷酸盐缓冲液复溶，使腹水单抗的沉淀物稀释3～5倍。其次，使用Mabselect Protein A亲和纯化法进行精纯：分别用结合缓冲液（终浓度为0.05 M Tris和0.5 M NaCl）和洗脱缓冲液（pH 3.0，终浓度为0.05 M甘氨酸和0.5 M NaCl）先后处理亲和柱，再用10 mM磷酸盐缓冲液平衡至中性。再加入用10 mM磷酸盐缓冲液复溶后的腹水单抗，上样结束后，再用10 mM磷酸盐缓冲液清洗柱子至流穿液OD₂₈₀值回归基线，然后用洗脱缓冲液进行洗脱，收集整个洗脱峰的溶液，得到McAb-C1H4D4A4洗脱液约8.5 mL、McAb-A1H1H9F2洗脱液约10 mL、McAb-A1H1H9B3洗脱液约12 mL和McAb-C1H4D4A2洗脱液约5.5 mL。

单克隆抗体的纯度鉴定：

利用SDS-PAGE电泳鉴定本发明4种SMNU核酸酶的单克隆抗体的纯度，结果如图1所示，所获得的4种SMNU核酸酶的单克隆抗体解链后轻链的大小约26 kD，解链后重链的大小约50 kD，条带清晰可见，纯度较高（90%以上）。

实施例3、单克隆抗体的应用

SMNU核酸酶含量检测试剂盒的构建：

SMNU核酸酶定量检测试剂盒的构建过程如图2所示，具体描述如下：

第一，单抗的标记：对筛选出的4种单抗：McAb-C1H4D4A4、McAb-A1H1H9F2、McAb-A1H1H9B3和McAb-C1H4D4A2，分别用辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase，HRP）进行标记，分别记为McAb-C1H4D4A4-HRP、McAb-A1H1H9F2-HRP、McAb-A1H1H9B3-HRP和McAb-C1H4D4A2-HRP，作为酶标抗体；同时还将筛选出的4种单抗，再分别用0.05 M CB缓冲液（碳酸盐缓冲液，pH 9.6）稀释至4 µg/mL，制备为包被抗体，并以100 µL/孔的用量固定至96孔酶标板；用制备好的4份酶标抗体和被包被抗体固定完成的4块酶标板，进行后续优化筛选。

第二，参考上述筛选用SMNU核酸酶抗体检测板的反应条件，将分别含4种单抗的4份酶标抗体和被包被抗体固定的4块酶标板两两间进行交叉配对检测，确认特异性最佳的配对为：McAb-C1H4D4A2对McAb-A1H1H9B3-HRP，即将McAb-C1H4D4A2制备为包被抗体、McAb-A1H1H9B3制备为酶标抗体，二者配对检测灵敏度最高。

第三，优化ELISA试验中的浓度条件：包括包被抗体浓度、酶标抗体浓度等条件，确定最终包被抗体（含单抗McAb-C1H4D4A2的碳酸盐缓冲液）的浓度和包被用量为4 µg/mL，100 µL/孔；确定最终酶标抗体McAb-A1H1H9B3-HRP的浓度和用量为1 µg/mL，100 μL/孔。

第四，标准品制备：将核酸酶（Benzonase® endonuclease）按照2倍的倍比进行系列稀释，稀释120000倍后浓度为0.41 mg/mL，作为SMNU核酸酶的定量标准品，以浓度与对应的检测OD值作标准曲线，从而可以根据标准曲线定量检测出样品中的SMNU核酸酶的含量。

第五，确定试剂盒的组分：根据上述优化筛选得到的单克隆抗体组合的过程，即可得到SMNU核酸酶定量检测试剂盒（双抗体夹心法）在检测过程中所必需的主要组成成分，如下表4所示：

表4 SMNU核酸酶定量检测试剂盒的主要组成成分

最后，试剂盒性能的评价：对试剂盒进行全面的性能验证，图3为SMNU核酸酶定量检测试剂盒的标准曲线图，图中的直线代表核酸酶浓度和对应检测OD值的拟合线性。标准曲线显示：试剂盒的线性良好，R²>0.99；定量范围为0.08～2.56 ng/mL，最小定量限度为0.08 ng/mL；其他性能评价内容详见下文验证结果。

优化筛选得到SMNU核酸酶定量检测试剂盒的检测流程，该试剂盒的检测流程最终为：加入待检样品，于37℃反应1 h，酶标板上的包被抗体与样品中的SMNU核酸酶识别并特异性结合形成“包被抗体-抗原”复合物，洗去酶标板上尚未与包被抗体结合的物质；加入酶标抗体（McAb-A1H1H9B3-HRP），于37℃反应45 min，酶标抗体将与“包被抗体-抗原”复合物结合形成“包被抗体-抗原-酶标抗体”复合物；再次洗板后加入显色剂，37℃反应15 min，复合物上连接的HRP催化显色剂反应，阳性孔生成蓝色产物，终止后阳性孔为黄色。

SMNU核酸酶定量检测试剂盒的性能评价：

重复性、精密度和准确性：

取SMNU核酸酶定量检测试剂盒中的定量标准品（0.41 mg/mL），用样品稀释液稀释至高（1.6 ng/mL）、中（0.7 ng/mL）、低（0.3 ng/mL）3个不同浓度，每一浓度的样品通过同一次实验内的8次重复测定精密度，通过3次平行实验测定精密度，对系统的稳定性进行评价考核，要求CV均<10%，准确性>85%，结果如下表5所示，变异系数≤5%，准确性>87%，表明该试剂盒的检测结果具有很好的重复性、精密度和准确性，符合要求。

表5 SMNU核酸酶定量检测试剂盒的重复性、精密度和准确性评价

稳定性：

将SMNU核酸酶定量检测试剂盒于37℃放置6天后，分别与置于2~8℃存放的试剂盒对比，主要对比检测试剂盒中定量标准品、酶标板、酶标试剂这3种主要组分的稳定性，以回收率表示，计算公式为：回收率=检测值÷对照试剂检测值×100%，对比试剂盒主要组分的稳定性。结果表明SMNU核酸酶定量检测试剂盒的定量标准品、酶标板、酶标试剂的稳定性均合格，结果见表6所示，37℃放置6天后，各组分回收率至少大于94%，证明该SMNU核酸酶定量检测试剂盒的各组分及整个试剂盒检测的稳定性较高。

表6 SMNU核酸酶定量检测试剂盒的稳定性评价

特异性：

利用该SMNU核酸酶定量检测试剂盒，检测几种常见生物制品的原料、辅料的组分，检测结果见表7所示：使用试剂盒对明胶水解物、人血白蛋白、MEM培养液等复杂样品中的核酸酶残留进行检测时，均没有发生非特异性交叉反应，试剂盒特异性强，抗干扰性良好。

表7 SMNU核酸酶定量检测试剂盒的特异性评价

抗干扰性：

供试品选用2批溶瘤病毒单次收获物，按照《中华人民共和国药典》三部附录的规定，制备溶液I（供试品与稀释液按照1:1的体积比混合）、溶液Ⅱ（供试品和0.682 ng/mL的核酸酶按照1:1的体积比混合），将0.682 ng/mL的核酸酶稀释2倍后作为对照品。利用该SMNU核酸酶定量检测试剂盒所建立的ELISA方法，定量检测对照品，共重复10孔，统计定量结果的95%置信区间；测定2批供试品制备的溶液Ⅰ、溶液Ⅱ中的SMNU核酸酶的含量，溶液Ⅱ的定量结果减去溶液Ⅰ的定量结果所得差值应在对照品定量结果的95%置信区间内；从而验证2批供试品对本方法检测的干扰，结果见下表8和表9所示。

表8 对照品定量检测结果的95%置信区间

表9 试剂盒对2批溶瘤病毒单次收获物的检测结果

在无干扰物（供试品）存在时，SMNU核酸酶定量检测结果的95%置信区间如表8所示；有干扰物（供试品）存在时，2批供试品的溶液Ⅱ的定量结果与溶液Ⅰ的定量结果的差值在对照品定量结果的95%置信区间内，上述结果表明供试品对本试剂盒的检测结果无显著影响，该SMNU核酸酶定量检测试剂盒具有良好的抗干扰能力。

临床前预实验：

通过上述性能评价得知该SMNU核酸酶定量检测试剂盒的实验内和实验间精密性变异系数（CV）均<10%、定量准确性的活性回收率均>85%、与生物制品常见的辅料无非特异反应且抗干扰能力强。

但是，由于国内尚无同类的SMNU核酸酶含量检测试剂盒的产品获批上市，因此选择了2款第三方科研试剂（无注册文号）作为初步评价该SMNU核酸酶定量检测试剂盒的临床预实验的对比试剂，主要对比了本试剂盒（考核试剂）与对比试剂的检测方法、定量范围和检测下限，具体对比结果如下表10所示。

表10试剂盒性能对比

实施例4、SMNU核酸酶活性封闭效果验证

将SMNU核酸酶与本发明优化筛选到的2种单抗（McAb-A1H1H9B3和McAb-C1H4D4A2）中的任意1种或2种混合后室温孵育10 min，然后加入底物于37℃孵育30 min，其中底物为质粒，同时设置2种单抗（McAb-A1H1H9B3和McAb-C1H4D4A2）中的任意1种或2种直接与底物孵育的对照组。孵育后进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果详见图4。图4可见只有底物被SMNU核酸酶消化后的产物在凝胶电泳中未出现核酸条带，单抗1、单抗2无论是单独作用还是混合后作用，均因为与SMNU核酸酶的特异性结合，从而阻断SMNU核酸酶对底物的消化活性，且2种单抗（McAb-A1H1H9B3和McAb-C1H4D4A2）也由于无法直接同底物特异性结合，电泳结果依然明显可见底物对应的核酸条带。因此2种单抗直接与底物孵育、2种单抗与SMNU核酸酶混合后再与底物孵育、与未经核酸酶消化的底物对照的电泳结果相近，即证明2种SMNU核酸酶的单抗（McAb-A1H1H9B3和McAb-C1H4D4A2）能够特异性地封闭SMNU核酸酶的活性位点，且不会与样本中其他组分发生非特异性结合，从而可以用于特异性阻断或抑制样品中残留的核酸酶活性，且对SMNU核酸酶活性的封闭效率高，安全性高。

本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，使得本领域技术人员将会容易理解。但是根据已经公开的所有描述，可以对那些细节进行不同的修饰或替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (8)

1.一种粘质沙雷氏菌胞外核酸酶含量的检测方法，其特征在于，酶标抗体由单克隆抗体McAb-A1H1H9B3制备而成，包被抗体由单克隆抗体McAb-C1H4D4A2制备而成，用于检测粘质沙雷氏菌胞外核酸酶的含量；其中，所述酶标抗体和所述包被抗体能够同时识别并特异性结合所述粘质沙雷氏菌胞外核酸酶；

其中，所述单克隆抗体McAb-A1H1H9B3的杂交瘤细胞系A1H1H9B3的保藏编号为CGMCCNo.45308，所述单克隆抗体McAb-C1H4D4A2的杂交瘤细胞系C1H4D4A2的保藏编号为CGMCCNo.45309，保藏地址均为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期均为2022年9月21日；

所述检测方法不属于疾病的诊断和/或治疗方法。

2.根据权利要求1所述的粘质沙雷氏菌胞外核酸酶含量的检测方法，其特征在于，采用酶联免疫双抗体夹心法进行定量检测，所述酶标抗体包括辣根过氧化物酶标记的所述单克隆抗体McAb-A1H1H9B3；检测步骤为：

1）加入样品，酶标板上的所述包被抗体与样品中所述粘质沙雷氏菌胞外核酸酶识别并特异性结合后形成“包被抗体-抗原”复合物；

2）用洗涤液清洗，洗去酶标板上不能与所述包被抗体特异性结合的物质；

3）加入所述酶标抗体，于35～40℃反应40～50 min，识别并特异性结合后形成“包被抗体-抗原-酶标抗体”复合物；

4）用洗涤液清洗，洗去酶标板上尚未特异性结合的所述酶标抗体；

5）加入显色剂，于35～40℃反应10～20 min，酶标板上含有“包被抗体-抗原-酶标抗体”复合物的酶标孔与显色剂反应先变为蓝色；再加入终止液终止，蓝色酶标孔变色为黄色；

6）酶标仪自动扫描并输出检测结果。

3.根据权利要求1所述的粘质沙雷氏菌胞外核酸酶含量的检测方法，其特征在于，所述酶标抗体的浓度为0.5～2 µg/mL；所述包被抗体的浓度为2～5 µg/mL。

4.一种用于粘质沙雷氏菌胞外核酸酶含量检测的试剂盒，其特征在于，含有酶标抗体和包被抗体，其中，酶标抗体由单克隆抗体McAb-A1H1H9B3制备而成，包被抗体由单克隆抗体McAb-C1H4D4A2制备而成，并且所述酶标抗体和所述包被抗体能够同时识别并特异性结合所述粘质沙雷氏菌胞外核酸酶；

其中，所述单克隆抗体McAb-A1H1H9B3的杂交瘤细胞系A1H1H9B3的保藏编号为CGMCCNo.45308，所述单克隆抗体McAb-C1H4D4A2的杂交瘤细胞系C1H4D4A2的保藏编号为CGMCCNo.45309，保藏地址均为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期均为2022年9月21日。

5.根据权利要求4所述的用于粘质沙雷氏菌胞外核酸酶含量检测的试剂盒，其特征在于，还包括酶标板、酶标试剂、样品稀释液、定量标准品、浓缩洗涤液、显色剂和终止液；所述包被抗体被固定在所述酶标板上，所述酶标抗体包括辣根过氧化物酶标记的所述单克隆抗体McAb-A1H1H9B3，并包含在所述酶标试剂中。

6.根据权利要求4所述的用于粘质沙雷氏菌胞外核酸酶含量检测的试剂盒，其特征在于，采用双抗体夹心定量检测方法，对粘质沙雷氏菌胞外核酸酶的定量检测范围为0.08～2.56 ng/mL。

7.权利要求1-3任一项中所述的粘质沙雷氏菌胞外核酸酶含量的检测方法，在制备粘质沙雷氏菌胞外核酸酶含量检测的试剂盒中的应用。

8.权利要求1-3任一项中所述的粘质沙雷氏菌胞外核酸酶含量的检测方法或权利要求4-6任一项中所述的用于粘质沙雷氏菌胞外核酸酶含量检测的试剂盒，在粘质沙雷氏菌胞外核酸酶含量检测中的应用。

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