JPS6046461A - 微生物定量用試薬 - Google Patents
微生物定量用試薬Info
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- JPS6046461A JPS6046461A JP58155602A JP15560283A JPS6046461A JP S6046461 A JPS6046461 A JP S6046461A JP 58155602 A JP58155602 A JP 58155602A JP 15560283 A JP15560283 A JP 15560283A JP S6046461 A JPS6046461 A JP S6046461A
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- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
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- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は微生物定量用試薬に関する。更に詳細には、少
なくとも次の成分を含むことを特徴とする微生物定量用
試薬に関する。
なくとも次の成分を含むことを特徴とする微生物定量用
試薬に関する。
（旬 定量ずべき微生物中のある株から調製した抗体
（ｔｌ） 該微生物中で該抗体とは十分結合するが、他
の株と該抗体との結合を阻害しない株の菌体成分を不溶
化したもの （ハ） 該抗体に対する標識された抗体細菌、放線菌、
糸吠菌のような微生物は食品の腐敗、動植物の病気の原
因となることが多く、その腐敗度又は感染度を知るため
に微生物を定量することは重要である。従来から１）菌
の集落数を肉眼で数える方法、２）微生物が存在するこ
とによるインピーダンス、若しくはｐｌ＋の変化又は消
費酸素量２発生二酸化炭素量。
の株と該抗体との結合を阻害しない株の菌体成分を不溶
化したもの （ハ） 該抗体に対する標識された抗体細菌、放線菌、
糸吠菌のような微生物は食品の腐敗、動植物の病気の原
因となることが多く、その腐敗度又は感染度を知るため
に微生物を定量することは重要である。従来から１）菌
の集落数を肉眼で数える方法、２）微生物が存在するこ
とによるインピーダンス、若しくはｐｌ＋の変化又は消
費酸素量２発生二酸化炭素量。
発生代西物量若しくは生産酵素量から定量する方法が行
われているが、１）、２１法とも他の菌の増殖を押える
手段を施してから行わなければならないこと、準備に非
常に手間がかかり、しかも少なくとも２４時間培養を行
って菌を増殖させてからでないと感度が低くて測定がで
きず、迅速に結果を得ることができないという欠点を有
している。又、最近は抗原抗体反応を用いて微生物を定
量することが試みられている。
われているが、１）、２１法とも他の菌の増殖を押える
手段を施してから行わなければならないこと、準備に非
常に手間がかかり、しかも少なくとも２４時間培養を行
って菌を増殖させてからでないと感度が低くて測定がで
きず、迅速に結果を得ることができないという欠点を有
している。又、最近は抗原抗体反応を用いて微生物を定
量することが試みられている。
例えば、 ５ａｒａｆｉａｎらはリン菌をウサギリン菌
抗体とポリスチレン球で不溶化したマウスリン菌抗体と
で一！ｌ／ドイノヂして定量しており（＋。
抗体とポリスチレン球で不溶化したマウスリン菌抗体と
で一！ｌ／ドイノヂして定量しており（＋。
Ｍｅｄ、Ｍ＋ｃｒｏｂｉｏ１．１５． ５４１〜５５０
（＋９８２）） 、Ｄｏｄｄらは大腸菌の鞭毛から調製
した抗体に対して不溶化した該鞭毛とサンプルを競合さ
せて大腸菌を定量している（ Ｉｎｆｅｃｔ、 １ｍｍ
ｕｎ、 ３８．７［ｉ４〜７７３（１９８２））。これ
らの方法は採取したサンプルをそのまま定量することが
でき、しかも感度が高いという利点を存している。しか
し菌に対する抗体を調製するのに用いた菌株は非常に高
感度に定量できるが、他の菌株はほとんど定量できず、
例えば食品中の大腸菌数を定量する場合のように大腸菌
であればどの菌株も総括的に定量したいとき不便であっ
た。
（＋９８２）） 、Ｄｏｄｄらは大腸菌の鞭毛から調製
した抗体に対して不溶化した該鞭毛とサンプルを競合さ
せて大腸菌を定量している（ Ｉｎｆｅｃｔ、 １ｍｍ
ｕｎ、 ３８．７［ｉ４〜７７３（１９８２））。これ
らの方法は採取したサンプルをそのまま定量することが
でき、しかも感度が高いという利点を存している。しか
し菌に対する抗体を調製するのに用いた菌株は非常に高
感度に定量できるが、他の菌株はほとんど定量できず、
例えば食品中の大腸菌数を定量する場合のように大腸菌
であればどの菌株も総括的に定量したいとき不便であっ
た。
本発明者は上記欠点を解消した抗原抗体反応による微生
物の定量につき研究を進めたところ、ある特定の菌株し
か定量できないのは、抗体を調製するのに用いる菌株と
不溶化する抗体を調製するのに用いる菌株（又は不溶化
する菌株）が同一であるためではないかと考えるに至っ
た。
物の定量につき研究を進めたところ、ある特定の菌株し
か定量できないのは、抗体を調製するのに用いる菌株と
不溶化する抗体を調製するのに用いる菌株（又は不溶化
する菌株）が同一であるためではないかと考えるに至っ
た。
従来の競合法やサンドイツチ法にこの点を応用すれば本
試薬でなくとも所期の目的にかなうように思われる。即
ち、例えば、イネいもち病菌のある株から調製した抗体
に対して、酵素標識した別の株とイネいもち病菌含有被
検体とを競合反応させ、Ｂ／Ｆ分離を行い、いずれかの
相の酵素活性を測定するか又はイネいもち病菌のある株
から調製し酵素標識した抗体と別の株から調製し不溶化
した抗体で被検体中のイネいもち病菌をサンドイツチし
その酵素活性を測定することによりイネいもち病菌の非
特異的な定量が可能であるように思われる。しかし現実
には、前者は被検体中の菌が抗体にあまり結合しなくな
るため、後者はブランク値が高くなるために実用に供し
得ない。前述の５ａｒａｒ ｉａｎの方法及びＤｏｄｄ
の方法に適用しても同様である。
試薬でなくとも所期の目的にかなうように思われる。即
ち、例えば、イネいもち病菌のある株から調製した抗体
に対して、酵素標識した別の株とイネいもち病菌含有被
検体とを競合反応させ、Ｂ／Ｆ分離を行い、いずれかの
相の酵素活性を測定するか又はイネいもち病菌のある株
から調製し酵素標識した抗体と別の株から調製し不溶化
した抗体で被検体中のイネいもち病菌をサンドイツチし
その酵素活性を測定することによりイネいもち病菌の非
特異的な定量が可能であるように思われる。しかし現実
には、前者は被検体中の菌が抗体にあまり結合しなくな
るため、後者はブランク値が高くなるために実用に供し
得ない。前述の５ａｒａｒ ｉａｎの方法及びＤｏｄｄ
の方法に適用しても同様である。
どの知見をもとに本発明者は更に研究を進め、本発明を
完成した。
完成した。
本発明は微生物定量用試薬に関する。更に詳細には、少
なくとも次の成分を含むことを特徴とする微生物定量用
試薬に関する。
なくとも次の成分を含むことを特徴とする微生物定量用
試薬に関する。
（イ）定量ずべき微生物中のある株から調製した抗体
（１１） 該微生物中で該抗体とは十分結合するが、他
の株と該抗体との結合を阻害しない株の菌体成分を不溶
化したもの （八）該抗体に対する標識された抗体 本試薬を使って微生物を定量するには、次のように行う
。即ち、定量ずべき微生物を含んだ被検体に過剰かつ既
知量の（イ）の抗体を加え抗原抗体反応を行わせる。更
に（１１＞の不溶化抗原を加え、被検体中の抗原（＝微
生物）と反応しなかった余りの抗体と反応させる。該抗
体−（１１）複合物を分離し、これに（ハ）の該抗体に
対するｖ３識された抗体を加える。洗１芋後、標識活性
を測定することに上り固相中の抗体量がわかり、それか
ら液相中の抗体量がわかるので、被検体中の微生物量が
定量できる。
の株と該抗体との結合を阻害しない株の菌体成分を不溶
化したもの （八）該抗体に対する標識された抗体 本試薬を使って微生物を定量するには、次のように行う
。即ち、定量ずべき微生物を含んだ被検体に過剰かつ既
知量の（イ）の抗体を加え抗原抗体反応を行わせる。更
に（１１＞の不溶化抗原を加え、被検体中の抗原（＝微
生物）と反応しなかった余りの抗体と反応させる。該抗
体−（１１）複合物を分離し、これに（ハ）の該抗体に
対するｖ３識された抗体を加える。洗１芋後、標識活性
を測定することに上り固相中の抗体量がわかり、それか
ら液相中の抗体量がわかるので、被検体中の微生物量が
定量できる。
本試薬は成分（イ）〜（八）以外に必要に応じて、検量
線作成用の標準微生物含有溶液、標識活性測定用試薬（
標識が酵素である場合には、例えば、基質、基質溶解液
、酵素反応停止液等）、緩衝化剤等から構成される。
線作成用の標準微生物含有溶液、標識活性測定用試薬（
標識が酵素である場合には、例えば、基質、基質溶解液
、酵素反応停止液等）、緩衝化剤等から構成される。
成分（イ）は培養した菌体を破砕して得た細胞壁等の菌
体成分を適当なアジュバントと混合してウサギ、モルモ
ット、ヤギ、羊等の動物の皮下又は筋肉内に投与し血清
を採取し公知の処理をなすことによって得られる。使用
する菌株は定量ずべき微生物中の株ならば何でもよい。
体成分を適当なアジュバントと混合してウサギ、モルモ
ット、ヤギ、羊等の動物の皮下又は筋肉内に投与し血清
を採取し公知の処理をなすことによって得られる。使用
する菌株は定量ずべき微生物中の株ならば何でもよい。
成分（υ）は定量ずべき微生物中で成分（イ）の抗体と
は十分結合するが、他の株と該抗体との結合を阻害しな
い株を培養し、菌体壱破砕して得た細胞壁等の菌体成分
を天然の不溶性多結類。
は十分結合するが、他の株と該抗体との結合を阻害しな
い株を培養し、菌体壱破砕して得た細胞壁等の菌体成分
を天然の不溶性多結類。
化学処理したデキストランゲル、寒天ゲル、プラスデッ
クビーズ、アクリルアミドゲル、ガラスピーズ、微細金
属粉末１合成ゴムデユープ等の不溶性担体に結合させて
得られる。菌株そのものを不溶化したものは他の微生物
と結合する恐れがあり好ましくない。結合剤としては、
不ｌＲ性（１１体の種類に応じて、細胞壁のアミｙ Ｍ
と不溶性担体のアミ７基との間を化学的に結合するグル
タルアルデヒド、トルエンジイソシアネート、ジハロゲ
ン化ニトロベンゼン及び細胞壁のアＥ ／ｊＡ！：不溶
性担体のヂオールノ、（との間を架（ａできるマレイミ
ド誘導体（例えば、Ｎ−（γ−マレイミドブチル」−ト
シ）ザクシンイミド）等が用いられる。
クビーズ、アクリルアミドゲル、ガラスピーズ、微細金
属粉末１合成ゴムデユープ等の不溶性担体に結合させて
得られる。菌株そのものを不溶化したものは他の微生物
と結合する恐れがあり好ましくない。結合剤としては、
不ｌＲ性（１１体の種類に応じて、細胞壁のアミｙ Ｍ
と不溶性担体のアミ７基との間を化学的に結合するグル
タルアルデヒド、トルエンジイソシアネート、ジハロゲ
ン化ニトロベンゼン及び細胞壁のアＥ ／ｊＡ！：不溶
性担体のヂオールノ、（との間を架（ａできるマレイミ
ド誘導体（例えば、Ｎ−（γ−マレイミドブチル」−ト
シ）ザクシンイミド）等が用いられる。
成分（ハ）は、成分（イ）を調製した動物のγ−グロブ
リン（ＩｇＧ）に対する抗体（以下「第２抗体」という
）を直当に標識することによって製造される。標識には
、酵素、放射性同位元素。
リン（ＩｇＧ）に対する抗体（以下「第２抗体」という
）を直当に標識することによって製造される。標識には
、酵素、放射性同位元素。
蛍光体、スピ・／化合物等が用いられる。酵素標識第２
抗体ならば第２抗体と酵素とを、既に説明した細胞壁と
不溶性担体との結合の場合と同様にして結合せしめるこ
とによって製造される。適当な酵素としては、β−ガラ
クトシダーゼ、パーオキシダーゼ、リパーゼ、アルカリ
ホスファターゼ、グルコース−６−ホスフエードプヒド
ロゲリーーゼ等がある。
抗体ならば第２抗体と酵素とを、既に説明した細胞壁と
不溶性担体との結合の場合と同様にして結合せしめるこ
とによって製造される。適当な酵素としては、β−ガラ
クトシダーゼ、パーオキシダーゼ、リパーゼ、アルカリ
ホスファターゼ、グルコース−６−ホスフエードプヒド
ロゲリーーゼ等がある。
本発明の試朶は、被検体を培養せずにすぐ定量できると
いう利点を保ちつつ、今までの抗原抗体反応を利用した
方法のように特異性か高ずぎである菌の中で特定の株し
か定量できないという欠点を解消した６のであり、例え
ば、大腸菌のような細菌、ジャガイモそうかｈ’ｊ菌の
ような放線菌、イネいもち病菌のような糸状菌の測定等
に大きな威力を発揮するものである。
いう利点を保ちつつ、今までの抗原抗体反応を利用した
方法のように特異性か高ずぎである菌の中で特定の株し
か定量できないという欠点を解消した６のであり、例え
ば、大腸菌のような細菌、ジャガイモそうかｈ’ｊ菌の
ような放線菌、イネいもち病菌のような糸状菌の測定等
に大きな威力を発揮するものである。
本発明を更に詳細に説明するため、以下に実施例を示す
が、勿論、本発明はこれらに限定されるものではない。
が、勿論、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１ ジＹガイそそうか病菌Ｏｂａｗａ株抗血清の
調製 （ｉ）細胞壁の調製 ジャガイモそうか病菌（以下［そうか病菌ｊと略す）
Ｏｂａｍａ株を、Ｋ２ＩＩＰＯａ Ｏ，Ｉｇ 、アスパ
ラギンＯ，Ｉｇ、 グルコース２ｇ、ポテト１５％抽出
液４０−１を含む培地２００ｍ１に植菌し、７日間振盪
培養し、菌体を濾過して集め精製水で２回洗浄したのち
凍結乾燥して乾燥菌体１ｇを得る。これを０．０２Ｍ食
塩含佇９／酸緩衝液１００ｍ１に懸濁し、水冷しながら
超音波破砕ｉ（米国プランシン ソニフィア Ｗ２Ｂ５
型；１３０Ｗ ）に１５分間がける。２２０Ｏｒｐｍｌ
Ｏ分間遠心分離して沈殿を集め精製水５１で２回洗浄す
る。凍結乾燥し０．１ｇをｉｔ）、４℃で保存する。
調製 （ｉ）細胞壁の調製 ジャガイモそうか病菌（以下［そうか病菌ｊと略す）
Ｏｂａｍａ株を、Ｋ２ＩＩＰＯａ Ｏ，Ｉｇ 、アスパ
ラギンＯ，Ｉｇ、 グルコース２ｇ、ポテト１５％抽出
液４０−１を含む培地２００ｍ１に植菌し、７日間振盪
培養し、菌体を濾過して集め精製水で２回洗浄したのち
凍結乾燥して乾燥菌体１ｇを得る。これを０．０２Ｍ食
塩含佇９／酸緩衝液１００ｍ１に懸濁し、水冷しながら
超音波破砕ｉ（米国プランシン ソニフィア Ｗ２Ｂ５
型；１３０Ｗ ）に１５分間がける。２２０Ｏｒｐｍｌ
Ｏ分間遠心分離して沈殿を集め精製水５１で２回洗浄す
る。凍結乾燥し０．１ｇをｉｔ）、４℃で保存する。
（目）免疫
０．５Ｈ（Ｄ１９Ｊ胞壁を０．９％ＮａＣＩ ０．５ｍ
ｌに懸濁し、そこにフロイツトの不完全アジュバント０
．５１を加えてエマルジＪン化したものをウサギの皮下
及び筋肉内に注射する。その後２週間毎に４回注射を行
い、最終注射の１ｏ日後に採血する。
ｌに懸濁し、そこにフロイツトの不完全アジュバント０
．５１を加えてエマルジＪン化したものをウサギの皮下
及び筋肉内に注射する。その後２週間毎に４回注射を行
い、最終注射の１ｏ日後に採血する。
実施例２ 大腸菌１（１２株抗血清の調製（＋＞細胞壁
の調製 大腸菌に１２ｅ４．をブイヨン培地（米国ディフコ社製
） ２０００ｍ１に植菌し、−夜振盪培養し、菌株を２
００００Ｘ ｇ、 ３０分間遠心分ｎｔ Ｌ テ集め、
０．１５Ｍ食塩含イ１リン酸緩衝液で２回洗１多し、凍
結乾燥し、乾燥菌体２ｇを得る。これを０．０２Ｍ食塩
含イｊ゛リン酸緩衝液ｊ００１に懸濁し、水冷しながら
超音波破砕機（同上）に１０分間かける。２００００：
’ｌｒ、３０分間遠心分離して沈殿を集め精製水２０１
で２回洗浄する。凍結乾燥し０．１ｇを得、４°Ｃで保
存する。
の調製 大腸菌に１２ｅ４．をブイヨン培地（米国ディフコ社製
） ２０００ｍ１に植菌し、−夜振盪培養し、菌株を２
００００Ｘ ｇ、 ３０分間遠心分ｎｔ Ｌ テ集め、
０．１５Ｍ食塩含イ１リン酸緩衝液で２回洗１多し、凍
結乾燥し、乾燥菌体２ｇを得る。これを０．０２Ｍ食塩
含イｊ゛リン酸緩衝液ｊ００１に懸濁し、水冷しながら
超音波破砕機（同上）に１０分間かける。２００００：
’ｌｒ、３０分間遠心分離して沈殿を集め精製水２０１
で２回洗浄する。凍結乾燥し０．１ｇを得、４°Ｃで保
存する。
（ｉＤ免疫
実施例１の（ｉｉ）と同様にして該株抗血清を得た。
実施例３ イネいもち病菌００１ Ｋｙｕ ８２−０５
八株抗血ｉ？ｔの調製 （ｉ）細胞壁の調製 菌株をイネいもち病菌００１ Ｋｙｕ ８２−０５八株
、培地をＫＨｚＰＯ４０，１ｇ １ ＫｚＨＰＯ＋Ｏ，
Ｉｇ ％ ＭｇＳＯ４０、Ｉｇ、 ＣａＣｌ２０．０２
ｇ、グルコース４ｇ、酵母抽出物１ｇを含む培地とする
以外は実施例１の（＋＞と同様にして該株の細胞壁を得
た。
八株抗血ｉ？ｔの調製 （ｉ）細胞壁の調製 菌株をイネいもち病菌００１ Ｋｙｕ ８２−０５八株
、培地をＫＨｚＰＯ４０，１ｇ １ ＫｚＨＰＯ＋Ｏ，
Ｉｇ ％ ＭｇＳＯ４０、Ｉｇ、 ＣａＣｌ２０．０２
ｇ、グルコース４ｇ、酵母抽出物１ｇを含む培地とする
以外は実施例１の（＋＞と同様にして該株の細胞壁を得
た。
（目）免疫
実施例■の（ｉｉ）と同様にして該株抗血ｌ−１を得た
。
。
実施例４ 不溶化抗原の調製
界面活性剤５ＣＡＴ−２０Ｘ（第−工業製薬製）で洗浄
したアミノダイラーク■シリンダー（積水化学製；以下
ｒＡＩ）Ｊと略ず）を１％グルタルアルデＩｌ＋’にＩ
”！ｆ １ｆｉｌ Ｎ ６１１．．０ 、０１ ％ 食
Ｊｌｔ Ｑ イ１’ Ｑ ン１１１ ｋＡ１＋ｉ １ｆ
ｆｌ （ｐＨ７，０）で洗浄する。このアルデヒドＪＪ
Ｎ ）Ω人ＡＤ１００個をそうか病菌Ａｉｎｏ株、大腸
菌Ｎｏ、４５株又はイネいもち病菌０３１ Ｉｎｃ ７
２株の細胞壁（それぞれ実施例１の（＋）にをじて調製
）１００μｇを０．０２Ｍ食塩含イｆリン酸緩衝液１０
ｍ１に懸濁した液に浸漬し、室温で０．５時間、４℃で
２時間振盪し、０．０１Ｍ ＩうＩ）ＴＡ−（１，３％
ｌｌ５Ａ含有０．０ＣＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）（
以下１１ｕｆｆｅｒＡという）で２回洗浄し、Ｄｕｆｒ
ｅｒＡ ’ｌ’ ４℃で保存する。
したアミノダイラーク■シリンダー（積水化学製；以下
ｒＡＩ）Ｊと略ず）を１％グルタルアルデＩｌ＋’にＩ
”！ｆ １ｆｉｌ Ｎ ６１１．．０ 、０１ ％ 食
Ｊｌｔ Ｑ イ１’ Ｑ ン１１１ ｋＡ１＋ｉ １ｆ
ｆｌ （ｐＨ７，０）で洗浄する。このアルデヒドＪＪ
Ｎ ）Ω人ＡＤ１００個をそうか病菌Ａｉｎｏ株、大腸
菌Ｎｏ、４５株又はイネいもち病菌０３１ Ｉｎｃ ７
２株の細胞壁（それぞれ実施例１の（＋）にをじて調製
）１００μｇを０．０２Ｍ食塩含イｆリン酸緩衝液１０
ｍ１に懸濁した液に浸漬し、室温で０．５時間、４℃で
２時間振盪し、０．０１Ｍ ＩうＩ）ＴＡ−（１，３％
ｌｌ５Ａ含有０．０ＣＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）（
以下１１ｕｆｆｅｒＡという）で２回洗浄し、Ｄｕｆｒ
ｅｒＡ ’ｌ’ ４℃で保存する。
実施例５ 酵素標識第２抗体のＮ、を製杭ウザギＩｇＧ
ヤギ血清（米国マイルス社製）５１に０．１Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ７、ｏ）５ｍｌを加え水冷下で飽和硫安溶液
ＩＯＣを加え２０分間撹拌した後、１２０００Ｘ ｇ、
１０分間遠心分離し沈殿を集める。この操作を更に２
回くり返した後の沈殿物を０．１Ｍ Ｕ ７酸緩衝液（
ｐＨ７，０）５１ニ溶解Ｌ ０．９％ＮａＣ＋ −０，
０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０＞２０００ｍ ｌに対
し４℃２４時間透析し抗つ慢ギＩｇＧヤギ血ｔｉ’ｆ１
ｇＧ画分を得た。該ｉｉ！ｉ分６−１を０．１Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ０，０）ｆｇｌに溶解した溶液にＮ−（γ
−マレイミドブチルオキシ）ザクシ／イミドＩ■ｇ／ｍ
ｌテトラハイドロフラン溶液０．５１を加えて混合し室
温で３０分間撹拌する。この反応液５０７１１を、β−
ガラクトシダーゼ５００μｇを０．１Ｍリン酸緩衝液（
ｐｌＩＯ，０月璽１に溶解した溶液に添加し、３０分間
撹拌する。この反応液を０．ＩＭ ＮａＣｌ −１ｍＭ
ＭｇＣ１２−０，３％１３ＳＡ−０，Ｊ％Ｎ ａ Ｎ
３含「０ 、０２ Ｍリン酸緩衝液（ｐｌ＋ ７．０＞
（以下＋１ｕｒｆｅｒＩｌという）で平衡化したセファ
ロース６Ｂカラム（スウェーデ／ ファルマシア社製）
（φ２ｃ＊Ｘ ３８ｃ麹）に添加し１ｌｕｒｆｅｒ１３
で溶出する。３ｍｌずつ分画し、各フラクションの酵素
活性を＾＋ｋａｗａ Ｔ 、らの方法（Ｅｎｄｏｃｒｉ
ｎｏｌｏｇｙ、１０５．１〜Ｇ（１９７９＞）により１
、′Ｊへ、酵素活性のピークフシクショ／をとり、β−
ガラクトシダーゼ標識第２抗体を得る。
ヤギ血清（米国マイルス社製）５１に０．１Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ７、ｏ）５ｍｌを加え水冷下で飽和硫安溶液
ＩＯＣを加え２０分間撹拌した後、１２０００Ｘ ｇ、
１０分間遠心分離し沈殿を集める。この操作を更に２
回くり返した後の沈殿物を０．１Ｍ Ｕ ７酸緩衝液（
ｐＨ７，０）５１ニ溶解Ｌ ０．９％ＮａＣ＋ −０，
０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０＞２０００ｍ ｌに対
し４℃２４時間透析し抗つ慢ギＩｇＧヤギ血ｔｉ’ｆ１
ｇＧ画分を得た。該ｉｉ！ｉ分６−１を０．１Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ０，０）ｆｇｌに溶解した溶液にＮ−（γ
−マレイミドブチルオキシ）ザクシ／イミドＩ■ｇ／ｍ
ｌテトラハイドロフラン溶液０．５１を加えて混合し室
温で３０分間撹拌する。この反応液５０７１１を、β−
ガラクトシダーゼ５００μｇを０．１Ｍリン酸緩衝液（
ｐｌＩＯ，０月璽１に溶解した溶液に添加し、３０分間
撹拌する。この反応液を０．ＩＭ ＮａＣｌ −１ｍＭ
ＭｇＣ１２−０，３％１３ＳＡ−０，Ｊ％Ｎ ａ Ｎ
３含「０ 、０２ Ｍリン酸緩衝液（ｐｌ＋ ７．０＞
（以下＋１ｕｒｆｅｒＩｌという）で平衡化したセファ
ロース６Ｂカラム（スウェーデ／ ファルマシア社製）
（φ２ｃ＊Ｘ ３８ｃ麹）に添加し１ｌｕｒｆｅｒ１３
で溶出する。３ｍｌずつ分画し、各フラクションの酵素
活性を＾＋ｋａｗａ Ｔ 、らの方法（Ｅｎｄｏｃｒｉ
ｎｏｌｏｇｙ、１０５．１〜Ｇ（１９７９＞）により１
、′Ｊへ、酵素活性のピークフシクショ／をとり、β−
ガラクトシダーゼ標識第２抗体を得る。
実施例６ 微生物含有被検体の定量
イネいもち病菌を含む被検体１００μｍに、実施例３で
調製した抗血清をＤｕｆｒｅｒＡで２００００倍に希釈
したものの１００μｍを加え室温で一夜反応させる。実
施例４で調製した不溶化抗原を過剰に加え２５℃１時Ｉ
ｆｆ 振ｆｆｌする。Ｄｕｒｆｅｒｌｌ ｆｇｌで２回
洗庁後、実施例５で調製したβ−ガラクトシダーゼ（２
０ｏμＵ；ｔＵは１分間に基質１μｍｏｌを加水分解す
る量）標識第２抗体０．１を加え３０’″ｃ４時間振盪
する。、Ｂｕｆｆｅｒ１月腸１で２回浣腸１．０．１ｍ
Ｍの７−β−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ−４−メヂ
ルクマリン１５０μｉを加え、３０’Ｃ３０分間、イン
キユベートシ、酵素反応を行わせる。試験管に反応停止
液０．２Ｍグリシン−ＮａＯＩＩ緩衝液（Ｐｌｌｌｏ、
３） ２．５ｍｌを加え、酵素反応を停止する。酵素反
応によって生成した７−ハイドロキシ−４−メヂルクマ
リンの蛍光強度を蛍光比色計で測定する。
調製した抗血清をＤｕｆｒｅｒＡで２００００倍に希釈
したものの１００μｍを加え室温で一夜反応させる。実
施例４で調製した不溶化抗原を過剰に加え２５℃１時Ｉ
ｆｆ 振ｆｆｌする。Ｄｕｒｆｅｒｌｌ ｆｇｌで２回
洗庁後、実施例５で調製したβ−ガラクトシダーゼ（２
０ｏμＵ；ｔＵは１分間に基質１μｍｏｌを加水分解す
る量）標識第２抗体０．１を加え３０’″ｃ４時間振盪
する。、Ｂｕｆｆｅｒ１月腸１で２回浣腸１．０．１ｍ
Ｍの７−β−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ−４−メヂ
ルクマリン１５０μｉを加え、３０’Ｃ３０分間、イン
キユベートシ、酵素反応を行わせる。試験管に反応停止
液０．２Ｍグリシン−ＮａＯＩＩ緩衝液（Ｐｌｌｌｏ、
３） ２．５ｍｌを加え、酵素反応を停止する。酵素反
応によって生成した７−ハイドロキシ−４−メヂルクマ
リンの蛍光強度を蛍光比色計で測定する。
片対数グラフの縦軸に１３ ／ １３ ｏ％をとり横軸
にイネいもち病菌０度（ｎｇ／Ｔｕｂｅ）を七ってプロ
ットし標準曲線を作成する。試験管あたり１ｍｇ〜１０
０口ｇのイネいもち病菌の測定が可能である。
にイネいもち病菌０度（ｎｇ／Ｔｕｂｅ）を七ってプロ
ットし標準曲線を作成する。試験管あたり１ｍｇ〜１０
０口ｇのイネいもち病菌の測定が可能である。
同様にして大腸菌、そうか病菌の２ｍを行。
た。
イネいもち病菌００１ Ｋｙｕ ８２−０５八体から調
製した抗体と不溶化した同様を用い、実施例６に準じて
定量を行ったところ、同様しか定量できなかった。そこ
でい６ち病菌中から０３７ Ｋｅｎ ００−１９株を選
び、これを不溶化したものを用いると第１表のような交
差反応性を示した。表中段も交差反応性の弱い０３１１
ｎｅ ７２株を不溶化したものを用いた結果を第２表に
示す。
製した抗体と不溶化した同様を用い、実施例６に準じて
定量を行ったところ、同様しか定量できなかった。そこ
でい６ち病菌中から０３７ Ｋｅｎ ００−１９株を選
び、これを不溶化したものを用いると第１表のような交
差反応性を示した。表中段も交差反応性の弱い０３１１
ｎｅ ７２株を不溶化したものを用いた結果を第２表に
示す。
！−−＝１ ’−Ｆ’ 余 白ン
第１表
株 交差反応性（％）
００１ Ｋｙｕ ８２−０５＾ １２１．７００３ Ｋ
ｅｎ ５４−２０ ２１．８００７ Ｋ１Ｌａ Ｉ ３
４．（ｉ ０３１１ｔ＋ｅ ７２ ９．２ ０３７にｅｎ ＧＯ−１９１００，０ ０４７Ｆ＋３７−５７ ４０Ｊｌ１ １０１ Ｉｎｃ １６８ ？４．２ １０２ＳＫｙｕ ７７−０７＾ ５２．３１３７Ｋｅｎ
′５３−３３ １４．８ＪＯ３Ｓ Ｋｙｕ ７！１−
ＩＵＯＡ ８８．５（以下☆自） 第２表 株 交差反応性（％） ００１ Ｋｙｕ ８２−０５Ａ １００．０００３ Ｋ
ｅｎ ５４−２０ ４１．３００７ Ｋ１Ｌａ ｌ ２
３．０ ０３１ ｊｎｅ ７２ ４１．３ ０３７ Ｋｅｎ ＧＯ−１９２３３，１０４７１’ｔｉ
７−５７ ３８０．０ １０１１ｎｅ １０８ ３３９．３ １０２ｓ Ｋｙｕ ７７−０７八 １００．０１３７
にｅｎ ５３−３３ １２０．７＋０３Ｓ Ｋｙｕ ７
９−ＩＧＯＡ ３２４．８大腸菌ＫＩ２ ＜０．０００
１ そうか病菌Ｏｂａ＊＋ａ 、 ０．０４そうか病菌Ｉｆ
ｉｇａｓｈ １ｈａｒａ Ｏ，０３第１表と第２表と
を比較すると、第２表では容体の反応性が向上し、００
１ Ｋｙｕ ８２−０５＾株以外の株も十分定量できる
ことがわかる。又、第２表から他の微生物は定量されな
いことがわかる。
ｅｎ ５４−２０ ２１．８００７ Ｋ１Ｌａ Ｉ ３
４．（ｉ ０３１１ｔ＋ｅ ７２ ９．２ ０３７にｅｎ ＧＯ−１９１００，０ ０４７Ｆ＋３７−５７ ４０Ｊｌ１ １０１ Ｉｎｃ １６８ ？４．２ １０２ＳＫｙｕ ７７−０７＾ ５２．３１３７Ｋｅｎ
′５３−３３ １４．８ＪＯ３Ｓ Ｋｙｕ ７！１−
ＩＵＯＡ ８８．５（以下☆自） 第２表 株 交差反応性（％） ００１ Ｋｙｕ ８２−０５Ａ １００．０００３ Ｋ
ｅｎ ５４−２０ ４１．３００７ Ｋ１Ｌａ ｌ ２
３．０ ０３１ ｊｎｅ ７２ ４１．３ ０３７ Ｋｅｎ ＧＯ−１９２３３，１０４７１’ｔｉ
７−５７ ３８０．０ １０１１ｎｅ １０８ ３３９．３ １０２ｓ Ｋｙｕ ７７−０７八 １００．０１３７
にｅｎ ５３−３３ １２０．７＋０３Ｓ Ｋｙｕ ７
９−ＩＧＯＡ ３２４．８大腸菌ＫＩ２ ＜０．０００
１ そうか病菌Ｏｂａ＊＋ａ 、 ０．０４そうか病菌Ｉｆ
ｉｇａｓｈ １ｈａｒａ Ｏ，０３第１表と第２表と
を比較すると、第２表では容体の反応性が向上し、００
１ Ｋｙｕ ８２−０５＾株以外の株も十分定量できる
ことがわかる。又、第２表から他の微生物は定量されな
いことがわかる。
イネいもち病菌を含んだ被検体をくり返し５回向時期測
定及び−日毎に５日間測定してめた平均値及び標準偏差
値等を第３表に示す。
定及び−日毎に５日間測定してめた平均値及び標準偏差
値等を第３表に示す。
（以下仝自）
第３表
口内変動 １ １．０１±０．０５ １０１．０ ５．
０ ５３ ２．９ｔｉ±０．１２ ９８．７ ４．１
５１０ １０．４４±０．７４ １０４．４ ７．１
５３０ ３２．９０±３．４４ １０９．７ １０．５
５１００１０４．８±５．４０ １０４．８ ５．２
５日差変動 １ １．０１±０．１５ １０１．０
１４．９ ５３ ３．１３±０．２３ １０４．３ ７
．３ ５１０ １０．２９−１：０．５４ １０２ＪＩ
５．２ ５３０ ２Ｂ、９±１．９７ ９６．２ Ｇ
、８ ５１００１０４．９±７．４４ １０４．９ ７
．１ ５第３表から、本発明試薬は口内変動及び日差変
動が少なく、かつ正確に定量できることがわかる。
０ ５３ ２．９ｔｉ±０．１２ ９８．７ ４．１
５１０ １０．４４±０．７４ １０４．４ ７．１
５３０ ３２．９０±３．４４ １０９．７ １０．５
５１００１０４．８±５．４０ １０４．８ ５．２
５日差変動 １ １．０１±０．１５ １０１．０
１４．９ ５３ ３．１３±０．２３ １０４．３ ７
．３ ５１０ １０．２９−１：０．５４ １０２ＪＩ
５．２ ５３０ ２Ｂ、９±１．９７ ９６．２ Ｇ
、８ ５１００１０４．９±７．４４ １０４．９ ７
．１ ５第３表から、本発明試薬は口内変動及び日差変
動が少なく、かつ正確に定量できることがわかる。
図は本発明試薬を用いて作成したイネいもち病菌の標準
曲線である。 特許出願人 大日本製薬株式会社 代 理 人 小 島 −晃
曲線である。 特許出願人 大日本製薬株式会社 代 理 人 小 島 −晃
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 少な（とも次の成分を含むことを特徴とず ５る微生物
定量用試薬 （イ）定量ずべき微生物中のある株から調製した抗体 （１１） 該微生物中で該抗体とは十分結合するが、他
の株と該抗体との結合を阻害しない株の菌体成分を不溶
化したもの （ハ）該抗体に対する標識された抗体
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58155602A JPS6046461A (ja) | 1983-08-24 | 1983-08-24 | 微生物定量用試薬 |
| EP84305727A EP0135378B1 (en) | 1983-08-24 | 1984-08-22 | Reagent for quantitative determination of microorganisms |
| DE8484305727T DE3469226D1 (en) | 1983-08-24 | 1984-08-22 | Reagent for quantitative determination of microorganisms |
| US06/643,281 US4693968A (en) | 1983-08-24 | 1984-08-22 | Agent for quantitative determination of microorganisms |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58155602A JPS6046461A (ja) | 1983-08-24 | 1983-08-24 | 微生物定量用試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6046461A true JPS6046461A (ja) | 1985-03-13 |
| JPH0510627B2 JPH0510627B2 (ja) | 1993-02-10 |
Family
ID=15609608
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58155602A Granted JPS6046461A (ja) | 1983-08-24 | 1983-08-24 | 微生物定量用試薬 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4693968A (ja) |
| EP (1) | EP0135378B1 (ja) |
| JP (1) | JPS6046461A (ja) |
| DE (1) | DE3469226D1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01143956A (ja) * | 1987-11-30 | 1989-06-06 | Nitsusui Seiyaku Kk | 細菌全菌に対する抗体を利用した細菌の簡易迅速かつ高感度検査法 |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0349037A1 (en) * | 1988-06-27 | 1990-01-03 | Akzo Nobel N.V. | Method for detection of antibodies or antigens in a test fluid |
| JPH0363571A (ja) * | 1989-08-02 | 1991-03-19 | Chisso Corp | 大腸菌群の検査キット |
| US5789183A (en) * | 1992-08-14 | 1998-08-04 | University Of Arkansas | Serological detection and identification of rice blast |
| US5455176A (en) * | 1994-03-14 | 1995-10-03 | University De Montreal | Microbial contamination test device |
| US5558996A (en) * | 1994-07-01 | 1996-09-24 | Strategic Diagnostics Inc. | Fungus extraction method, kit, and extraction solution |
| US6235487B1 (en) | 1995-11-03 | 2001-05-22 | Stephen Holland | Method of diagnosing Crohn's disease |
-
1983
- 1983-08-24 JP JP58155602A patent/JPS6046461A/ja active Granted
-
1984
- 1984-08-22 US US06/643,281 patent/US4693968A/en not_active Expired - Fee Related
- 1984-08-22 DE DE8484305727T patent/DE3469226D1/de not_active Expired
- 1984-08-22 EP EP84305727A patent/EP0135378B1/en not_active Expired
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01143956A (ja) * | 1987-11-30 | 1989-06-06 | Nitsusui Seiyaku Kk | 細菌全菌に対する抗体を利用した細菌の簡易迅速かつ高感度検査法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US4693968A (en) | 1987-09-15 |
| EP0135378B1 (en) | 1988-02-03 |
| JPH0510627B2 (ja) | 1993-02-10 |
| EP0135378A1 (en) | 1985-03-27 |
| DE3469226D1 (en) | 1988-03-10 |
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