JPS62500587A - モノクロ−ナル抗体およびその用途 - Google Patents
モノクロ−ナル抗体およびその用途Info
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- JPS62500587A JPS62500587A JP50456985A JP50456985A JPS62500587A JP S62500587 A JPS62500587 A JP S62500587A JP 50456985 A JP50456985 A JP 50456985A JP 50456985 A JP50456985 A JP 50456985A JP S62500587 A JPS62500587 A JP S62500587A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
モノクローナル抗体およびその用途
発明の背景
分析および診断の分野で最近関心を集めているのは、尿、血液、水、ミルク等の
標本中に抗原や種が存在しているか否かを調べるのにモノクローナル抗体を使用
することである。
より詳細に述べると、標本中にバチルス(Bacillus)が存在するか否か
を手早く診断するのに、バチルスの抗原やバチルス種に特異的なモノクローナル
抗体を使用するのが好ましい。
バチルス種は何種類かに分類されている。ある環境に於いて疾患の原因となるこ
とが確認されている代表的なものを挙げると、バチルス・セレウス(B aci
llus cereus)、バチルス・メガテリウム(B acillus m
egaterium)、バチルス・サチリス(Bacillus 5ubtil
is)、バチルス・アントラシス(B acillus anthracis)
およびバチルス・リケニホルミス(Bacillus licheniform
is)などである。
バチルス・セレウスを例にとって、バチルスについて詳述する。
バチルス・セレウスの胞子は、米の摂取に伴なって特別の形の食物前を引き起こ
すことが知られている。この胞子は、熱および通常の料理過程での破壊に抵抗を
示す。レストランに於て、米をふっくらとさせておく為にほんの少し高い温度で
保存すると、バチルスの胞子は発芽し、重篤な胃腸の不調、吐き気、嘔吐、下痢
の原因となる毒素を産生ずる。この毒素は、摂取後数時間で生じる。バチルス・
セレウスは、4種の毒素、即ちセレオリジン、下痢性毒素、((k吐性毒素、お
よび腸毒素(エンテロトキンン)を産生することが知られている。バチルス・サ
チリスはスブチリシン毒素をつくり、バチルス・アントラシスはアントラシス毒
素を産生する。
食物の毒素汚染を検出する現在の方法は、かなりやっかいな方法を使っている。
従って、食品工業および公衆衛生工業に於ける迅速な診断法は、より簡単な、よ
り迅速な試験法であれば著しく広がるであろう。モノクローナル抗体は、バチル
スの抗原またはバチルスの毒素の抗原に特異的に結合し得るので、診断と治療の
為の多くの機会が与えられる。この様な特異性は、適切な、そして正確な分析お
よび/または診断に非常に重要な要件であり、特に、迅速な治療を必要とする疾
病の診断に特に重要な要件である。
抗原性物質の存在を調べる為に、アイソトープを使用した、あるいは使用しない
各種の免疫検定法が、モノクローナル抗体との関連で用いられている。現在、モ
ノクローナル抗体について最も普及している方法は、凝集、免疫蛍光、化学発光
または蛍光免疫検定、免疫電子顕微鏡、放射分析系、放射免疫検定、および酵素
−結合免疫検定である。その他の方法として、動物発光、蛍光偏光、および光子
計数免疫検定がある。
酵素−結合免疫検定法(EIA)を使用する場合、この検定法で機能し得る酵素
、例えばアルカリホスファターゼを、モノクローナル抗体と結合、またはコンジ
ュゲートさせる必要がある。
この酵素−結合モノクローナル抗体を、既知の酵素−結合免疫吸着検定法に使用
し、抗原性物質の存在を調べることができる。
特定の抗原を同定したら、その感染微生物の血清型を決めることかでき、素早く
、そして効率的に疾病を治癒するための適切な治療を開始することができる。
モノクローナル抗体の製造は、ケーラー(Kohler)およびミルシュタイン
(Milstein)によって初めて報告された、今ではよく知られている手段
である〔ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー(Eur、J、Imm
unol、)6,292(1975))、ハイブリドーマを作成する一般的な技
術、およびその結果得られるモノクローナル抗体についてはよく知られているが
、特定の抗原に対する特異的モノクローナル抗体を製造することは、主として特
定のハイブリドーマを作成するのに必要なバリエーションおよび特異性の程度の
ために、難しいことであることがわかっている。
発明の要約
本発明は、バチルスの抗原および/または微生物が試料中に存在するかどうかを
正確に、かつ迅速に診断するために使用される新規なモノクローナル抗体を提供
するものである。
簡潔(こ述べると、本発明はバチルスの抗原または種、特にバチルス・セレウス
の抗原または種、バチルス・メガテリウム、バチルス・サチリス、バチルス・ア
ンドランスの抗原または種、バチルス・セレウス、バチルス・メガテリウム、バ
チルス・サチリス、およびバチルス・アントラシスの毒素の抗原または抗原群に
特異的なモノクローナル抗体、およびバチルスに属するいずれかの菌種の抗原と
広く交叉反応するモノクローナル抗体に関するものである。
本発明はまた、バチルス、あるいはその特定の菌種、またはその毒素の上記の抗
原のlっに対するモノクローナル抗体であって、適当な標識(ラベル)と結合し
た、バチルスの抗原の存在を診断するために使用される標識されたモノクローナ
ル抗体を提供するものである。この標識は、例えば放射性同位元素、酵素、蛍光
性化合物、化学的発光性化合物、生物的発光性化合物、強磁性の原子または粒子
などとすることができる。
本発明はまた、適当な免疫検定法により、標識されたモノクローナル抗体を検体
と接触させることからなる、検体中のバチルス抗原または微生物、または毒素の
存在を診断する方法を提供するものである。
更に、本発明はバチルス属の抗原または毒素に対するモノクローナル抗体と担体
または希釈剤を含有している治療用組成物、およびある種のバチルスの抗京また
は)か素に対する少なくとも1種の標識されたモノクローナル抗体を含有してい
るキットを提供するしのである。
詳細な説明
本発明に係る抗体は、特定のバチルスの抗原で免疫した哺乳動物の牌臓細胞を、
適当な骨髄腫セルライン、好ましくはN S O(非クローン化)、P3NSL
−Ag 4/1またはSp210Ag14と融りさせることにより製造される
。得られた生産物を標準的なHAT(ヒボキサンチン、アミノプテリンおよびチ
ミジン)培地中で培養ずろ。特)ドのモノクローナル抗体をスクリーニングテス
トするには、以下に記述ず・;免疫検定技術を利用する。
免疫される膵臓細胞は、霊長動物、ヒト、げっ温順(例えばマウス、ラット、ウ
サギなど)、牛、羊、犬などのものであってよいが、本発明では、マウスのもの
について述べることにする。まず、通常約11週間の間選択した特定のバチルス
抗原をマウスに注射する。
常套の検定法により、マウスが抗原に対して十分な抗体を産生じたことがわかっ
たら、適当なバチルス抗原をブースター注射し、マウスを殺して免疫された膵臓
を摘出する。次いで、この免疫された牌臓細胞と適当な骨髄腫セルラインを使っ
て融合を行なうことができる。
特定のバチルス抗原が存在すると正の反応を示す抗体を産生ずる融合細胞を取り
出し、標準的な方法でクローンする。クローンから得たモノクローナル抗体を標
準的な抗原に対して試験し、特定のバチルス抗原に対する特異性を有するか否か
を調べる。特定のバチルス抗原、バチルス種または毒素に対して特異的であるモ
ノクローナル抗体を選択し、適当な標識と結合させる。
標識のための、そしてその後の大量生産に必要な十分量の抗体は、バッチ式また
は連続的組織培養、あるいはマウスの様な哺乳動物でのインビボでの培養などの
既知の方法で生産される。
モノクローナル抗体は、各種の標識剤、例えば酵素、蛍光化合物、発光化合物、
放射活性化合物、強磁性ラベルなどで標識することがでJキろ。本発明では、酵
素で標識したモノクローナル抗体を使用する例について述べろ。標識剤として使
用される酵素の例としては、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ
、ガラクトシダーゼ、ベルオキシダーゼおよびウレアーゼなどが挙げられる。
酵素との結合は、メタフィロコツカルプロティンA法、グルタルアルデヒド法、
ベンゾキノン法または過ヨウ素酸法などの通常の既知の方法のいずれかで行なう
ことができる。
標識されたモノクローナル抗体ができたら、通常の各種の免疫検定法の1つを使
って試験を行なう。選択すべき特定の方法は、モノクローナル抗体および選択し
た標識により異なる。現在のところ、廉価であること、試薬が安定であり、安全
であり、感度の良いこと、および操作が簡単であることから酵素免疫検定が好ま
しい。1つの例は酵素−結合免疫吸着検定(EIA、)である。EIAは、デザ
インが放射分析と類似している固相検定法である。しかしEIAでは、免疫グロ
ブリンマーカーとして放射活性同位元素の代わりに、酵素を使用する。
蛍光免疫検定は、抗原または抗体を蛍光プローブで標識することに基づいている
。標識されていない抗原および特異抗体を、蛍光で標識した同一の抗原と混合す
る。標識された抗原と標識されていない抗原の両者が抗体の結合サイトを競い合
う。抗体に結合した標識化抗原の量は、非標識化抗原の濃度に依存し、従って、
その濃度の測定値を表わす。この特定のタイプの蛍光免疫検定の例には、醇素−
結合蛍光免疫検定の様な不均一系、基質−標識化蛍光免疫検定の様な均一系があ
る。最も適切な蛍光プローブであって、最も広く使用されているものの1つはフ
ルオレセインである。フルオレセインは、散乱がかなり干渉されやすいことがあ
るが、特定の検定に使用されるプローブの最適の蛍光メーターを使用することに
より感度を上げることができ、散乱の効果を最小限にすることができる。
蛍光分極(ボーラリゼーション)においては、標識された試料が分極光により励
起するので、放射光の分極の程度を測定する。抗原が抗体に結合すると、そのロ
ーテーションが低下し、分極の程度が増大する。蛍光分極は簡単、迅速、正確で
ある。しかし現時点では、その感度はマイクロモル/リットルの範囲に限定され
ており、生物学的試料中の抗原については、上限がナノモル/リットルの範囲で
ある。
発光は、電子が高エネルギー状態から基底状態に転移することにより、原子や分
子によって光か放射されることである。化学的発光および生物学的発光の両者に
於いて、化学反応の自由エネルギーにより、電子励起状態の中間体や生成物を生
成するのに必要なエネルギーが与えられる。次いで衰微して基底状態に戻る時に
光が放射される。生物学的発光は、生物系にみられる化学的発光の特別の形態に
与えられた名称であり、ここでは、触媒作用を有するタンパク質または酵素、例
えばルシフェラーゼが発光反応の効率を増大させる。
最もよく知られた化学的発光物質はルミノールである。
本発明の1つの目的は、特定のバチルス抗原、バチルス種または毒素に対する1
種またはそれ以上のモノクローナル抗体、および薬理学的に許容し得る担体また
は希釈剤を含有する治療用組成物を提供するものである。この様な組成物は、な
んらかのバチルス感染に苦しんでいるヒトおよび/または動物を治療するのに使
用することができ、治療に有効な量が使用される。この量は、処置を受けるヒト
および感染の程度に応じて著しく変わる。
各種検体中にバチルスの抗原、バチルス種または毒素が存在するかどうかを診断
するために使用される診断用キットに、1種またはそれ以上のモノクローナル抗
体を組み合せることができる。例えば、レストランで実施される公衆衛生分析、
食品工業での食品の取り扱いに於けるバチルス・セレウス毒素の検出に、または
急性胃腸症状の患者の緊急治療に於ける緊急診断用として、限られた技術しか必
要としない迅速診断法が使用されることがある。バチルス属のみを同定し得る広
い交叉反応性のモノクローナル抗体を使ってもよく、また、他の細菌属あるいは
バチルス種および/または他の毒素類を同定することができる抗体を含んでいる
キットの一部として用いること乙できる。
過去に於いては、検体と抗血清との望ましくない交叉反応のために、迅速なキッ
トを開発することは困難であった。モノクローナル抗体を使用することによって
、この様な問題が解決され、診断用の非常に特異的な、そして迅速な試験ができ
る様になった。迅速で正確なギフトは現在の試験法にとって代わり、あるいは普
及し、正確な抗体を使った早期の直接治療を可能とするであろう。多数の抗生物
質や高価なそして危険な抗生物質を避けることは、患者の、そして病院の節約と
なろう。更に、キットは外来患者に使用することができる。現在、即日結果が得
られる迅速試験がないので、治療の開始が遅れることがあり、患者がもっと重篤
な症状を呈するに至ったり、病気の但者にもっと費用のかかる治療を施す必要が
生じたりすることがある。1〜2時間以内に結果の出る試験があれば、患者にと
って非常に都合の良いものとなろう。
このキットは単独で販売されてもよいし、あるいはまた、バチルスの菌種や血清
型を検出するため?こ、関連検査室に売り込まれる、相容性のある免疫検定試薬
類の包括的な商品の1部に含ませてもよい。
本発明の好ましい態様の1つは、特定のバチルス抗原、毒素または種に対する少
なくとも1種の標識されたモノクローナル抗体と、適当な染色剤、対比染色剤ま
たは試薬を含んでいる診断用キットである。その池のキットとしては、バチルス
抗原の少なくとも1種の対照試料および/または特定の試料中の特定のバチルス
微生物または毒素の存在を検出する交叉反応性の標識されたモノクローナル抗体
を含んでいるキットがある。このキットで検出される特定の抗原は、バチルス・
セレウス、バチルス・メガテリウム、バチルス・サチリス、バチルス・アントラ
シスの抗原、バチルス・セレウス、バチルス・メガテリウム、バチルス・サチリ
スおよびバチルス・アントラシスの毒素の抗原および抗原群が挙げられる。
バチルスの抗原の存在を検出するモノクローナル診断法は、水源、食物源および
食品加工操作を定期的に検査するのにも使うことができる。この様に、本発明は
、漂阜的な抗原の存在を調べるための漂識したモノクローナル抗体の使用につい
て記載しているが、本発明は、尿、血液、糞便、水およびミルクなどの検体が特
定のバチルス抗原を含んでいるかどうかを調べることにより、抗原の存在を診断
するという多くの応用面を持っている。更に詳しくいうと、本発明は公衆の衛生
および安全の診断補助に利用することができ、水や食品の様な検体の汚染の有無
について検査することができる。
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、これらの実施例は例示を
目的とするものであって、本発明を制限するためのものではない。
実施例に於いて、
API−アナリテイカル・プロファイル・インデックス〔エールスト(A ye
rst)研究所リファレンス〕DMEM−デュルベッコの改良イーグル培地EC
9−ウシ胎仔血清
PBS=燐酸緩衝生理食塩水
%T=1cm光路長で測定したワクチン濃度本発明のモノクローナル抗体は、ケ
ーラーとミルシュタイン(ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロノー、6
292(1975))の方法に従って調製した。
抗原(バチルス・セレウス)を得(試料はナショナル・コレクション・オブ・タ
イプ・カルチャーから得られる)、標準的な微生物同定の為の生化学的手法を用
いて同定する(APIプロファイルを使用)。親液物質(リオファイル)からこ
の抗原を除き、血液寒天上で増殖させ、APIで検査してその同定を行ない、純
度を確認する。
次いで細菌をDMEMに移して増殖させる。インキュベーションした後、この細
胞を1時間100℃に保ち、遠心して収穫し、食塩水に入れて3回洗浄し、1%
ホルモール食塩水に再懸濁する。
B、動物の免疫
調製した抗原をBa1b/cマウスに注射する。上記の如く調製したワクチンを
腹腔内および/または静脈内に注射する(80%Tワク ゛チン0.05iQ)
。最後の注射から約6白目にマウスから採血し、血lrYを検査して抗体を検定
する。この血清の力価測定に使用する常套の方法は、酵素−結合免疫吸着検定法
である。このやり方でマウスが抗体産生を示したら(通常、正の力価が少なくと
610,000)、融合供与動物として1匹を選び、膵臓切除の3日前に静脈か
らブースタ注射する(80%ワクチンQ、02ffiC)。
旦−■賎径
常法により、ブースタ注射の3日後に免疫マウスから膵臓細胞をとり出す。まず
、選択された供与マウスを殺し、70%のエチルアルコールに浸漬して表面滅菌
する。次いで、膵臓を摘出し、30%のFe2を加えたD M E M約2.5
xQに浸漬する。次に、全ての細胞が膜から離れるまでLUXホモジナイズ管で
膵臓を穏やかにホモジナイズした後、細胞を3%FC9DMEM5.*C中で洗
浄する。
次いで、細胞残骸を沈澱させて、膵臓細胞¥!濁液をIOmQの遠沈管に入れる
。次にこの残骸を3%PCS DMEM5iC中で再び洗浄する。その後、3%
FC6DMEMに入れてPJE3液を50iρにする。
使用した骨髄腫(ミエローマ)セルラインは、MRCラボラトリ−・オブ・モレ
キュラー・バイオロジー(M RCL aboratory ofMolecu
lar B iology)、ケンブリッジ、イングランドから人手したN5O
(非クローン化)である。骨髄腫細胞は、対数増殖期にあり、速く分裂していた
しのである。各セルラインを、組織培養培地として、3%FC3を含有している
DMEMで洗浄する。
次いで、相当量の骨髄腫細胞を取り出すと同時に膵臓細胞を取り出しく室温、6
009で7分間)、得られた各ベレツトを個別に3%FC6DMEMlomQに
再懸濁する。骨髄腫細胞を数えるために@fA液0.1xCを1靜に希釈し、位
相差顕微鏡の付いた血球計算器を使用する。膵臓細胞を数えるために、@濁液0
.1mQをメチルバイオレット−クエン酸溶液でIxCに希釈し、血球計算器お
よび光学顕微鏡を使用して染色されている細胞核を数える。
次に、膵臓細胞と骨髄腫細胞を混合し、この混合物を、グルコースに富む血清不
含のD M E Mで洗浄して遠心し、液体を全て除去する。得らねに!I]胞
ベレットを37°Cの水浴に入れる。50 (w/ v)のヘベス(Hepes
)倉荷生理的食塩水中ポリエチレングリコール1500(PEG)溶液(pl−
(約7.5)1吋を加え、この混合物を約1.5分Ii4]穏やかに撹拌ずろ。
次いで、血清不含の組織培養培地D M E M 10mQを徐々に加え、次に
、この培養培地を加えて50iρにし、遠心して上清を全て除去した後、細胞ペ
レットを18重量%のFCSを含有しているDMEivilOmf7に再懸濁す
る。
混合物10μρを標準マルチウェル組織培養プレートの672ウエルそれぞれに
入れる。各ウェルは、標準HA T培地(ヒボキサンチン、アミノプテリンおよ
びチミジン)1,01(2および5X10’マクロフア・−)/ウェルの濃度で
Ba1h/eマクロフアージの支持細胞層を含んでいる。
ウェルを静置し、温度約100%、9%のC○、−空気中、37°Cで培養する
。ウェルは、5〜10日後に通常の倒立顕微鏡法を使用1.て増殖を調べる。阻
害D A T培地で増殖が起こっているウェルにおいて、下記の通常の酵素免疫
検定スクリーニング法を使用して特定のモノクローナル抗体に対するスクリーニ
ングテストを行なう。
融合の約10〜14日後、少なくとも1gのウェルに抗原に対する十分な抗体が
産生される。
■〕、クローニング
抗1京に対する抗体を産生じたウェルから細胞を取り出し、標準寒天法または希
釈法を使用してクローン化する。
クローンを酵素免疫検定し、抗体産生を調べてもよい。
旦」スゲ旦二址」肌
クローンからのモノクローナル抗体を、免疫に於て調製された抗原への結合、お
よび種々の抗原を持っているクラスの試験バッテリーにお(プる特異性について
標準的な方法でスクリーニングする。具体的には、微生物の代表的な選択菌を含
んでいる微量滴定プレートのグリッドを調製し、煮沸した後、母集団の特異性を
調べるためのテンブレー1・とじて使用する6前記のEIA免疫検定法を使用し
て(1)F3alb/cマウス(6匹)をブリスタンでプライム(初回抗原刺激
)(2、次いで抗原に特異的なモノクローナル抗体の細胞107個を復原力に注
射Wる。適当な時期に達1.たら、即ち、このマウスか体漬で膨満17、それで
t、なお生存している時に、腹水症体液を採取する。この体液を1200gで約
10分間遠心し、細胞を除去し、抗体に富む腹水を集めろ。この液体を面記の如
く滴定し、抗体の存在およびその濃度をきめ、精製する。
プロティンA−セファロース法で精製を行なう。詳しく述べると、腹水をガラス
ウールで濾過し、30,0009で10分間遠心する。
次いでこの腹水を、その2倍容贋のリン酸緩衝e、(0,1Mリン酸ナトリウム
)で希釈する。この希釈した腹水を、予めリン酸緩衝液で!缶化しておいたプロ
ティンA−セファロースの21カラムに入れる。カラムを407AQのリン酸緩
衝液で洗浄11、モノクローナル抗体をクエン酸援衝液(0,1Mクエン酸ナト
リウム、I)H3,5)で溶離し、十分量のIM)リス緩衝液(pH9,0)に
入れて直ちにl)Hを約75に北げる。この溶出液を、+4℃で2X 1000
MQPBSで透析する。
(2)バチルス・セレウスに特異的なモノクローナル抗体産生糸の細胞を、バッ
チ組織培養で増殖させる。lO%FCSを添加してDMEMを使って(IC容量
まで)、中対数期での増殖を支持する。培養を過増殖させ、最大値の抗体を産生
させる。次いで培養を1200gで約10分間遠心する。細胞7/細胞残骸を捨
て、抗原に富んだ」1清を集める。
前記した如くして液を滴定し、抗体の存在を確認して濃度を決め、バッチ式イオ
ン交換クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム沈澱法およびカラムイオン交換(
あるいはプロティンA−セファロースであってもよい)クロマトグラフィーを組
み合せて精製する。
更に詳しく述べると、培養」1清IQに、0.05M酢酸ナトリウム緩衝液(p
H4,5)I(!、および予め0.1M酢酸ナトリウム緩衝液(pH5,0)中
で平衡化しておいたSP−セファデックス40mQを加える。この懸濁液を、4
−4℃で1時間撹拌する。SP−セファデックスを沈降させ、−上清をデカント
する。このSP−セファデツクスをカラムにつめ、0.1M酢酸緩衝液(pf4
5 、0)60pσで洗浄し、同じ緩衝液+1M塩化ナトリウム60順で溶離す
る。溶出液を+4℃で撹拌し、同容量の飽和硫酸アンモニウムをゆっくりと加え
ろ。このpH液を更に30分間撹拌する。次いで10,0009で10分間遠心
して沈澱を集める。この沈澱を最少量の冷リン酸/ED ’1’ A緩衝液(2
0mMリン酸ナトリウム、l OmMEDTA、pH7゜5、+002%アジ化
ナトリウム)(DEAE−セルロースプロマトグラフィーの場合)、またはリン
酸緩衝液(0,1Mリン酸ナトリウム、pH8,2+0.02%アジ化ナトリウ
ム)(プロティンA−セファロースクロマトグラフィーの場合)に溶解する。溶
解した沈澱を2X100Oni2の溶解緩衝液に対して+4℃で透析し、既述し
た要領で適当なりロマトグラフィーを行なう。
G、n1g二二ムクローナル結合
上で調製した、抗原に対して特異的なモノクローナル抗体を酵素、即ち高純度の
アルカリホスファターゼと結合させる。1段階グルタルアルデヒド法またはベン
ゾキノン・コンジュゲート法を用いる。
1段階グルタルアルデヒド法では、モノクローナル抗体3zy(約1順の溶液中
)をアルカリホスファターゼ(シグマ タイプ■−T)をg(イ、PBS(pH
7,4)I Oo 0uill:対して2回、4℃で透析する。透析の後、容量
をPBSで2.5m&にし、PBS中の20%グルタルアルデヒド溶液25μρ
を加える。このコンシュゲージクン混合物を室温で1.5時間放置する。次いで
、グルタルアルデヒドを、予めPBSで平衡化しておいた、ファーマシアPH−
10(セファデックス(,25M)カラムでゲル濾過して除去する。このコンジ
ュゲート体をPBS3.5x(lで溶出し、次いでこのコンジュゲート体をトリ
ス緩衝液(50mMトリス、1mM塩化マグネシウム(pH8,0)、+0.0
2%アジ化ナトリウム)2X2000+(!に対して、4℃で透析する。この透
析コンジュゲート体に、トリス緩衝液の10%BSA溶液を1/10容量加える
。次いで、このフンシュゲート体を、0.22μmのメンブランフィルタ−で滅
菌濾過し、滅菌した褐色バイアルに入れ、4℃で保存する。
実施例Iの方法に従い、バチルス・セレウスの下痢毒素に対するモノクローナル
抗体を生産する。抗原は脳心臓浸出(1%グルコース)により調製し、上raを
2遇する。
実施例3
実施例1の一般的方法に従い、バチルス属の全ての種の抗原と広く交叉反応する
モノクローナル抗体を製造する。
本発明方法を用いる試験方法は、以下の利点によって現在の試験法よりし優れて
いる−(1)精度か高い;(ii)即日、1.2時間以内に結果が得られる;
(iii )検査室での操作を管理するために必要な熟練した研究者の数を減少
させることかでき、労働コストが下がる;(iv)試験に関して使用される労働
時間および空間を減少させることができ、総経費を下げることになる;(V)迅
速かつ正確な診断に基づいたより良い治療を行うことができる。
本発明は、特定の好ましい態様について述べたものであるが、本発明の範囲をこ
こに挙げた特定の形に限定するものではなく、むしろ添付の特許請求の範囲に定
義された本発明の思想および範囲に含まれる変法、改良法および均等法を包含す
るしのである。
国際調査報告
++11*me1.AII Ae、1fllleF II。 PCT/GB 8
51004741MmNn。1□。。アユ、、、、、 PCT/GB 8510
0474ANNEX To TklE INTERNAT工0NAL 5EAR
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07/e4 CA−A−119046116107/85
Claims (57)
- 1.バチルスの抗原またはバチルス種に特異的なモノクローナル抗体。
- 2.バチルス・セレウスの抗原または抗原群に特異的な第1項に記載の抗体。
- 3.バチルス・セレウス毒素の抗原または抗原群に特異的な第1項に記載の抗体 。
- 4.バチルス・セレウスの毒素セレオリシンの抗原または抗原群に特異的な第1 項に記載の抗体。
- 5.バチルス・セレウスの下痢性毒素の抗原または抗原群に特異的な第1項に記 載の抗体。
- 6.バチルス・セレウスの催吐性毒素の抗原または抗原群に特異的な第1項に記 載の抗体。
- 7.バチルス・セレウスのエンテロトキシンの抗原または抗原群に特異的な第1 項に記載の抗体。
- 8.バチルス・サチリスの抗原または抗原群に特異的な第1項に記載の抗体。
- 9.バチルス・サチリスの毒素の抗原または抗原群に特異的な第1項に記載の抗 体。
- 10.バチルス・サチリスのスブチリシン毒素の抗原または抗原群に特異的な第 1項に記載の抗体。
- 11.バチルス・メガテリウムの抗原または抗原群に特異的な第1項に記載の抗 体。
- 12.バチルス・アントラシスの抗原または抗原群に特異的な第1項に記載の抗 体。
- 13.バチルス・アントラシスの毒素の抗原または抗原群に特異的な第1項に記 載の抗体。
- 14.バチルス属の全ての種の抗原と広く交叉反応するモノクローナル抗体。
- 15.実質的に第1項〜第14項のいずれかに記載のモノクローナル抗体と適当 な標識剤からなる標識されたモノクローナル抗体。
- 16.標識剤が放射活性同位元素、酵素、蛍光性化合物、生物的発光性化合物、 化学的発光性化合物、または強磁性の原子または粒子から選ばれる群の1っであ る第15項に記載の標識されたモノクローナル抗体。
- 17.標識剤がモノクローナル抗体とコンジュゲートし得るものであり、かつ、 酵素−結合免疫検定法に使用し得るものである第16項に記載の標識されたモノ クローナル抗体。
- 18.該酵素がアルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、ガラクトシ ダーゼまたはペルオキシダーゼである第17項に記載の標識されたモノクローナ ル抗体。
- 19.該標識剤が免疫−蛍光免疫検定法、蛍光免疫検定法、酵素蛍光免疫検定、 蛍光分極免疫検定、光子計数免疫検定などに使用し得る蛍光性化合物またはプロ ーブである第16項に記載の標識されたモノクローナル抗体。
- 20.該蛍光性化合物またはプローブがフルオレセインである第19項に記載の 標識されたモノクローナル抗体。
- 21.該標識剤が発光免疫検定または酵素−結合発光免疫検定に使用し得る化学 的発光性化合物である第16項に記載の標識されたモノクローナル抗体。
- 22.化学的発光性化合物がルミノールまたはルミノール誘導体である第21項 に記載の標識されたモノクローナル抗体。
- 23.該標識剤が適当な生物学的発光免疫検定に使用し得る生物的発光性化合物 である第16項に記載の標識されたモノクローナル抗体。
- 24.生物的発光性化合物がルシフエラーゼまたはルシフエラーゼ誘導体である 第23項に記載の標識されたモノクローナル抗体。
- 25.検体の少なくとも1部を、第15項に記載の標識されたモノクローナル抗 体と、該標識剤に適した免疫検定法で接触させることからなる、該検体中のバチ ルス抗原の存在を診断する方法。
- 26.適当に標識された免疫検定法が、免疫−蛍光免疫検定、蛍光免疫検定、免 疫−電子顕微鏡法、放射性検定法、酵素−結合免疫検定法、蛍光分極法、光子− 計数生物学的発光法または化学的発光免疫検定法から選ばれる第25項に記載の 方法。
- 27.該標識剤が、酵素−結合免疫検定法に使用し得る酵素である第26項に記 載の方法。
- 28.該酵素がアルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、ガラクトシ ダーゼまたはペルオキシダーゼから選ばれる第27項記載の方法。
- 29.該標識剤が免疫−蛍光免疫検定法、蛍光免疫検定法、酵素蛍光免疫検定、 蛍光分極免疫検定、光子−計数免疫検定などに使用し得る蛍光性化合物またはプ ローブである第26項に記載の方法。
- 30.該蛍光性化合物またはプローブがフルオレセインである第29項に記載の 方法。
- 31.該標識剤が発光免疫検定または酵素−結合発光免疫検定に使用し得る化学 的発光性化合物である第26項に記載の方法。
- 32.該化学的発光性化合物がルミノールまたはルミノール誘導体である第31 項に記載の方法。
- 33.該標識剤が生物学的発光免疫検定または酵素−結合生物学的免疫検定に使 用し得る生物学的発光性化合物である第26項に記載の方法。
- 34.該生物的発光性化合物がルシフエラーゼまたはルシフエラーゼ誘導体であ る第33項に記載の方法。
- 35.第1項〜第14項の1種またはそれ以上の標識されたモノクローナル抗体 と薬学的に許容し得る担体または希釈剤を含有する治療用組成物。
- 36.第15項の1種またはそれ以上の標識されたモノクローナル抗体と薬学的 に許容し得る担体または希釈剤を含有する治療用組成物。
- 37.第1項〜第14項のモノクローナル抗体の有効量を投与することからなる バチルス感染症の治療方法。
- 38.第1項〜第14項の少なくとも1種のモノクローナル抗体を含有する、診 断用検体中のバチルスの抗原またはバチルス種の存在を診断するためのキット。
- 39.該少なくとも1種の抗体が標識されている第38項記載のキット。
- 40.該少なくとも1種のモノクローナル抗体が蛍光性化合物で標識されている 第39項記載のキット。
- 41.該少なくとも1種のモノクローナル抗体が酵素で標識されている第39項 記載のキット。
- 42.該少なくとも1種のモノクローナル抗体が放射活性同位元素、化学的発光 性化合物、生物的発光性化合物、強磁性の原子または粒子からなる群の1つで標 識されている第39項記載のキット。
- 43.対照として少なくとも1種の既知のバチルス抗原を更に含有してなる第3 9、40、41および42項のいずれかに記載のキット。
- 44.バチルス・セレウス、バチルス・メガテリウム、バチルス・サチリスおよ びバチルス・アントラシスの既知の抗原を含有している第39、40、41、4 2および43項のいずれかに記載のキット。
- 45.バチルス・セレウス、バチルス・サチリス、バチルス・メガテリウムおよ びバチルス・アントラシスの毒素の抗原を含有している第39、40、41、4 2および43項のいずれかに記載のキット。
- 46.バチルス・セレウスの抗原を含有している第39、40、41、42およ び43項のいずれかに記載のキット。
- 47.バチルス・サチリスの抗原を含有している第39、40、41、42およ び43項のいずれかに記載のキット。
- 48.バチルス・メガテリウムの抗原を含有している第39、40、41、42 および43項のいずれかに記載のキット。
- 49.バチルス・アントラシスの抗原を含有している第39、40、41、42 および43項のいずれかに記載のキット。
- 50.バチルス・セレウスの毒素の抗原を含有している第39、40、41、4 2および43項のいずれかに記載のキット。
- 51.バチルス・サチリスの毒素の抗原を含有している第39、40、41、4 2および43項のいずれかに記載のキット。
- 52.バチルス・メガテリウムの毒素の抗原を含有している第39、40、41 、42および43項のいずれかに記載のキット。
- 53.バチルス・アントラシスの毒素の抗原を含有している第39、40、41 、42および43項のいずれかに記載のキット。
- 54.第1項〜第14項の少なくとも1種のモノクローナル抗体と対照を含んで なる、診断用検体中のバチルスの抗原またはバチルス種の存在を診断するための キット。
- 55.該少なくとも1種の抗原が標識されており、該対照が少なくとも1種の既 知のバチルス抗原である第54項に記載のキット。
- 56.第1項〜第14項の少なくとも1種のモノクローナル抗体を含んでなる、 バチルスの感染の存在を診断するためのキット。
- 57.該少なくとも1種のモノクローナル抗体が標識されている第56項に記載 のキット。
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