JPS62500173A - モノクロ−ナル抗体およびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 モノクローナル抗体およびその用途 本発明は、モノクローナル抗体およびその用途に関エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒ ｉｃｈｉａ）　ｆｉはいくつかに分類されている。最も良く知られている種は大 腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ、以下Ｅ、コリというつであり、本発明をこのＥ６コリを例 にとって説明する。Ｅ、コリは、チンセル・マイクロバイオロジー（Ｚｉｎｓｓ ｅｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ入　１７版、７３４〜５頁に記載されている。

本明細書中、標識０１〜０１５９で定義されるＥ、コリの菌体抗原、Ｋ１−に９ ９で表わされる莢膜抗原、Ｈ１〜Ｈ４２で表わされる鞭毛抗原、腸毒素〔すなわ ち、熱不安定性（ＬＴ）、熱安定性（ＳＴ）およびベロ（ｖｅｒｏ）毒素コ、結 合抗原（２つの主要な群、１および２に分類されるつ、Ｅ、コリによって産生さ れる内素毒、およびベロ細胞を攻撃するベロ毒素が存在する。

Ｅ、コリは日和見腸内細菌（ある種の細菌株は原発性の腸疾患および腸性感染の 原因となりつる〕の中で独特の位置を占めている。ざらにＥ、コリは、特に分子 生物学の分野で、他のすべての微生物に比べ、より多くの実験的研究の対象にさ れている。

Ｅ、コリは、ヒトにおける尿路感染の最も一般的な原因である。また、これがグ ラム陰性性敗血症の最も多い原因であり、肺炎、挫傷および髄液から分離されて いる。Ｅ、コリは新生児髄膜炎の主な原因であるが、それ以上の年令に達したヒ トにはめったに見られない。

Ｅ、コリ髄膜炎の死亡率は、新生児においては４０〜８０チであり、生存者の大 多数はその後の神経または発育異常を有する。この疾患におけるＥ、コリの侵入 力は、莢膜抗原ｘ−１によっているようである。Ｅ、コリの腸疾患は、腸毒素の 産生、または腸粘膜のシゲラ様の浸透のいずれか１こよって仲介されるようであ る。この毒素は、腸の空腸および回腸部に体液滞留を引き起すが、一方、腸粘膜 浸透を引き起こすＥ、コリは主として結腸に存在する。

現在行なわれているＥ、コリ感染の治療および診断は、感染場所によって変化す る。アメリカ合衆国およびヨーロッパにおいては、毎年極めて多数の細菌性下痢 が発生し、その内の数百万人が医者に診てもらうか病院に入院すると概算されて いる。成人の疾患は、自己限定性であるため、はとんどの人は治療をめない。治 療分求めた人の、下痢の細菌診断は、現在糞便培養法によって為されている。こ の方法は普通病院でのみ行なわれており、時間がかかり、１〜３日必要とするも のである。この時間の間に治療が為されたなら、患者は適当でない治療の多替在 的危険および出費にさらされることになる。しかし治療が為されないなら、患者 は、試験結果および治療の開始を待つ間、症状悪化の危険にさらされることにな る。

現在、グラム陰性性敗血症の検査は、血液および尿の培養を作成したり、場合に より、その他の手段によって行われている。血液培養検査は、費用がかかるばか りです＜、煩わしいものである。この検査は、結果が出るまで１日かかり、数日 かかることも多い。ヒトの血液は性質が複雑であり、多数の検査試薬と非特異的 に反応する傾向があるので熟練した検査技術が必要である。

現在、尿路感染症に於いて、−次スクリーニングとして微生物の存在を調べる顕 微鏡検査が行われている。

この顕微鏡検査は、グラム陰性菌どうしを区別することはできない。従って、二 次検査として、尿試料から分離した微生物を同定するために尿培養を行なう。診 断が遅れ、治療の開始が遅れると、重篤な合併症を引き起こすことになりかねな い。

従って、尿路感染症またはグラム陰性性敗血症において、Ｅ、コリを極めて正確 ｌこ検出する現在の方法は、高価につく多数の熟練技術者と労働時間を費し、結 果を出すのに１日、あるいは数日もかかることが多いという点で満足できるもの ではない。

モノクローナル抗体の製造は、ケーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）およびミルシュタイン （ＭｉｌｓＬｅｉｎ）によって初めて報告された、今ではよく知られている手段 である〔ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｅｕ　ｒ　、　Ｊ　 ＋’　Ｉｍｍ−ｕｎｏｌ、）６　（１９７５）　２９２　］。ハハイブリドマを 作成する一般的な技術、およびその結果得られるモノクローナル抗体については よく知られているが、特定の抗原に対する特異的モノクローナル抗体を製造する ことは、主として特定のハイブリドーマを作成するのに必要なバリエーションお よび特異性の程度のために、難しいことであることがわかっている。

発明の要約 本発明は、Ｅ、コリの抗原および／または微生物が試料中に存在するかどうかを 正確に、かつ迅速に診断するために使用される新規なモノクローナル抗体を提供 するものである。

簡潔に述べると、本発明はＥ、コリの抗原、特にＥ、コリ種またはその抗原、Ｅ 、コリの０１〜０１５９（包括的な）抗原または抗原群、Ｅ、コリのに１〜に９ ９（包括的ｔつ抗原または抗原群、Ｅ、コリのＨ１〜Ｈ４２（包括的な〕抗原群 、Ｅ、コリの結合抗原１および２、Ｅ。

コリの腸毒素ＬＴ１、Ｅ、コリの腸毒素ＳＴＩおよびＳｒ１．Ｅ、コリの内毒素 に特異的なモノクローナル抗体、およびＥ、コリ属に属するいずれかの菌種（ま たは、実質的にすべての菌種〕の抗原と広（交叉反応するモノクローナル抗体に 関するものである。

本発明はまた、エシェリヒア属、あるいはその特定の菌種、の上記の抗原の１つ に対するモノクローナル抗体であって、適当な標識（ラベル〕と結合した、エシ ェリヒア属の抗原の存在を診断するために使用される標識されたモノクローナル 抗体を提供するものである。この標識は、例えば放射性同位元素、酵素、螢光性 化合物、化学的発光性化合物、生物的発光性化合物、強磁性の原子または粒子な どとすることができる。

本発明はまた、適当な免疫検定法により、標識されたモノクローナル抗体を検体 と接触させることからなる、検体中のエシェリヒア属抗原または微生物の存在を 診断する方法を提供するものである。

更に、本発明はエシェリヒア属の抗原に対するモノクローナル抗体と担体または 希沢剤を含有している治療用組成物、およびある種のエシェリヒア属の抗原に対 する少なくとも１種の標識されたモノクローナル抗体を含有しているキラ）％提 供するものである。

免疫した哺乳動物の肝臓細胞を、適当な骨髄腫セルライン、好ましくはＮ５Ｏ（ 非クローン化〕、Ｐ３Ｎ５１−Ａｇ４／１またはＳ　ｐ　２　／　ＯＡ　ｇ　１ ４と融合させることにより製造される。得られた生産物を標準的なＨＡＴ（ヒボ キサンチン、アミノプテリンおよびチミジンコ培地中で培養する。特定のモノク ローナル抗体をスクリーニングテストするには、以下に記述する免疫検定技術を 利用する。

免疫される肝臓細胞は、霊長動物、ヒト、げつ歯頚（例えばマウス、ラット、ウ サギなど）、牛、羊、犬などのものであってよいが、本発明では、マウスのもの について述べることにするうまず、選択し１こ特定のエシェリヒア抗原をマウス に注射し、１ことえば約１１週間かけて免疫する。常套の検定法により、マウス が抗原に対して十分な抗体分産生じたことがわかったら、適当なエシェリヒア抗 原をブースター注射し、マウスを殺して免疫された肝臓を摘出する。次いで、こ の免疫された肝臓細胞と適当な骨髄腫セルラインを使って融合を行なうことがで きる。

特定のエシェリヒア抗原が存在すると正の反応を示す抗体を産生ずる融合細胞を 取り出し、標準的な方法でクローンする。クローンから得たモノクローナル抗体 を標準的な抗原に対して試験し、特定のエシェリヒア抗原に対する特異性を有す るか否かを調べる。特定のエシェリヒア抗原またはエシェリヒア種に対して特異 的であるモノクローナル抗体を選択し、適当な標識と結合させる。

標識のための、そしてその後の大曾生産に必要な十分量の抗体は、パッチ式また は連続的組識培養、あるいはマウスの様す哺乳動物でのインビボでの培養などの 既知の方法で生産される。

モノクローナル抗体は、先に例示した様な各種の標識剤で標識することができる 。本発明では、酵素で標識したモノクローナル抗体を使用する例について述べる 。標識剤として使用される酵素の例としては、アルカリホスファターゼ、グルコ ースオキシダーゼ、ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼおよびウレアーゼなど が挙げられる。

酵素との結合は、スタフイロコツカル・プロティンＡ法、グルタルアルデヒド法 、ベンゾキノン法または過ヨウ素酸法などの既知の方法で行なうことができる。

標識されたモノクローナル抗体ができたら、通常の各種の免疫検定法の１つを使 って試験を行なう。選択すべき特定の方法は、モノクローナル抗体および選択し た標識により異なる。現在のところ、廉価であること、試薬が安定であり、安全 であり、感度の良いこと、および操作が簡単であることから酵素免疫検定が好ま しい。１つの例は酵素−結合免疫吸着検定（ＥＩＡ、）である。ＥＩＡは、デザ インが放射分析と類似している固相検定法である。しかしＥＩＡでは、免疫グロ ブリンマーカーとして放射活性同位元素の代りに、酵素を使用する。

螢光免疫検定は、抗原または抗体を螢光プローブで標識することに基づいている 。標識されていない抗原および特異抗体を、螢光で標識した同一の抗原と混合す る。標識された抗原と標識されていない抗原の両者が抗体の結合サイトを競い合 う。抗体に結合した標識化抗原の量は、非標識化抗原の濃度に依存し、従って、 その濃度の測定値を表わす。この特定のタイプの螢光免疫検定の例には、酵素− 結合螢光免疫検定の様な不均一系、基質−標識化螢光免疫検定の様な均−系があ る。最も適切な螢光プローブであって、最も広く使用されているものの１つはフ ルオレセインである。フルオレセインは、散乱がかなり干渉されやすいことがあ るが、特定の検定に使用されるプローブの最適の螢光メーターを使用することに より感度を上げることができ、散乱の効果を最小限にすることができる。

螢光分極（ボーラリゼーション）においては、標識された試料が分極光により励 起するので、放射光の分極の程度を測定する。抗原が抗体に結合すると、そのロ ーテーションが低下し、分極の程度が増大する。しかし現時点では、その感度は マイクロモル／リットルの範囲に限定されており、生物学的試料中の抗原につい ては、上限がナノモル／リットルの範囲である。

発光は、電子が高エネルギー状態から基底状態に転移することにより、原子や分 子によって光が放射されることである。化学的発光および生物学的発光の両者に 於いて、化学反応の自由エネルギーにより、電子励起状態の中間体や生成物を生 成するのに必要なエネルギーが与えられる。次いで衰微して基底状態に戻る時に 光が放射される。生物学的発光は、生物系にみられる化学的発光の特別の形態に 与えられた名称であり、ここでは、触媒作用を有するタンパク質または酵素、例 えばルシフェラーゼが発光反応の効率を増大させる。

最もよ（知られた化学的発光物質はルミノールである。

本発明の１つの目的は、特定のエシェリヒア抗原またはエシェリヒア種に対する １種またはそれ以上のモノクローナル抗体、および薬理学的に許容し得る担体ま たは希釈剤を含有する治療用組成物を提供するものである。この様な組成物は、 ？、（んらかのエシェリヒア感染に苦しんでいるヒトおよび／または動物を治療 するのに使用することができ、治療に有効な量が使用される。この量は、処置を 受けるヒトおよび感染の程度に応じて著しく変わる。

各種検体中に抗原、抗原類またはエシェリヒア種が存在するかどうかを診断する ために使用される診断用キットに、１種またはそれ以上のモノクローナル抗体を 組み合せて入れてもよい。エシェリヒア属のみを同定し得る広い交叉反応性のモ ノクローナル抗体を使ってもよく、また、他の細菌風あるいはエシェリヒア種お よび／または他の細菌を同定することができる抗体を含んでいるキットの一部と して用いることもできる。

過去に於いては、検体の望ましくない交叉反応（例えば尿と抗血清沖ために、迅 速なキットを開発することは困難であった。モノクローナル抗体を使用すること によって、この様な問題が解決され、診断用の非常に特異的な、そして迅速な試 験ができる様になった。

例えば、ひどい下痢や下痢性疾患が起る頻度は非常に高く、この様なキットの市 場の大きさを予想することが困難であるが、「当日」検査は、少なくとも糞便培 養と同じ頻度で使用されると期待できる。開発途上国では、下痢の頻度が高く、 また重篤であり゛、その他の関連する病気もあるので、この檄な検査は大いに利 用されるものと思われる。

更）こ、キットは尿中のグラム陰性細菌を迅速（こ検査するために、病理検査室 で使用されることもあろうし、外来患者にも使用される。また、エシェリヒアま たはその他のグラム陰性性敗血症の診断のために、患者から採取した血液試料中 にエシェリヒアの抗原および／またはエシェリヒア種、およびその池のグラム陰 性細菌を同定するために、この様な抗原や微生物に対する、コンジュゲートある いは標識化したモノクローナル抗体をキットにして使用することができる。モノ クローナル検査法は、従来の検査法より正確さが高いという点で、従来法より進 んだ方法である。「当日」に結果が出るので患者にとって好都合であり、早い、 正確な診断の結果、治療を改善でき、かつ、検査を管理するのに必要な労働時間 や人件費を減少させる。

このキットは単独で販売されてもよいし、あるいはまた、エシェリヒアの菌種や 血清型を検出するために、関連検査室に売り込まれる、相容性のある免疫検定試 薬類の包括的な商品の１部に含ませてもよい。

本発明の好ましい態様の１つは、特定のエシェリヒア抗原またはエシェリヒア種 に対する少なくとも１種の標識されたモノクローナル抗体と、適当な染色剤、対 比染色剤または試薬を含んでいる診断用キットである。その他のキットとしては 、エシェリヒア抗原の少なくとも１種の対照試料および／または特定の試料中の 特定のエシェリヒア微生物の存在を検出する交叉反応性の標識されたモノクロー ナル抗体を含んでいるキットがある。

エシェリヒア属の抗原の存在を検出するモノクローナル診断法は、水源、食物源 および食品加工操作を定期的に検査するのにも使うことができる。この様に、本 発明は、標準的な抗原の存在を調べるための標識したモノクローナル抗体の使用 について記載しているが、本発明は、尿、血液、糞便、水およびミルクなどの検 体が特定のエシェリヒア抗原を含んでいるかどうか調べることにより、抗原の存 在を診断するという多くの応用面を持っている。更に詳しくいうと、本発明は公 衆の衛生および安全の診断補助に利用することができ、水や食品の様な検体の汚 染の有無について検査することができる。

以下に実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、これらの実施例は例示そ 目的とするものであって、本発明を制限するためのものではない。

本発明のモノクローナル抗体は、ケーラーとミルシュタイン（前掲〕の方法に従 って調製した。

実施例に於いて、 ＡＰＩ＝アナリテイカル・プロファイル・インデックス〔エールスト（Ａｙｅｒ ｓｔｍ究所リファレンスすＤＭＥＭ＝デュルベツコの改良イーグル培地ＦＣ５＝ ウシ胎仔血清 ％Ｔ　＝　１　ａｍ光路長で測定したワクチン濃度ＰＢ５＝燐酸緩衝生理食塩水 ５ＳＩ＝ステイテンセラム・インスチチュート、コペンハーゲン（Ｓｔａｔｅｎ ｉｅｒｕｍ　Ｉｎ５ｔ　ｉ　ｃｕｔ　、　Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ）ＰＨＬＳ＝パ ブリック・ヘルス・ラボラトリ−・サービス（Ｐｕｂｌｉｃ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｙ　！５ｅｒｖｉｃすＣＶＩ、−セントラル・ベタリナリー・ ラボラトリ−（Ｃｅｎｔｒａｌ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ）ｉｍ＝筋肉内 ｉｐ＝腹腔内 ｉｖ＝静脈内 ＴＳＩ３＝トリプトン大豆ブロス ＣＦＡ＝完全７０インドアジュバント 実施例１ ０８抗原を有するエシェリヒア・コリをナショナル・コレクション・オブ・タイ プ・カルチャーからｉ′、）　ｃＮＣＴＣ受は入れ番号９００８）、標準的な生 化学的微生物同定法によって検査してその同一性を（ＡＰ　Ｉプロファイルを用 いて）確認した。Ｒ液物質（リオファイル〕からエシェリヒア・コリを除き、血 液寒天上で増殖させ、ＡＰＩにより検査し、その同一性および純度分確認した。

この細：λ’；、ｐＴＳＢｉこ移し、増殖させ。

収獲した。微生物を煮沸し、食塩水中で遠心をくり返すことにより洗浄し、ホル モル食塩水に再・辞濁した。

Ｂ、動物の免疫 調製した抗原を５週間にわたって（５匹のＢａ１ｂ／Ｃマウスに注射した。この マウスに１週間に１回、３週間腹腔内注射しく０．１ｍＪ８０％Ｔワクチン）、 次いて上記の如く調製し、煮沸して死滅させたエシェリヒア・コリ０８抗原のＩ −ＤＩＯを、３回静脈内注射した（それぞれ、１週間の休止期間の後に）。

最後の注射から約６白目にマウスを°採血し、血清を検査して抗体を検定した。

この血清の力価測定に使用した常套の方法は、酵素−結合免疫吸着検定法であっ た。

このやり方でマウスが抗体産生を示したので（通常、正の力価が少なくとも１０ ，０００）、融合供与動物として１匹を選び、肝臓切除の３日前に静脈からブー スタ注射した（８０チワクチン０．０２ｍｅ）。

Ｃ０細胞融合 免疫マ・クスの肝臓細胞を、常法により、ブースタの３日後に収獲した。始めに 、選択された供与マウスを殺し、７０％のエチルアルコールに浸漬して表面滅菌 した。次いで、肝臓を摘出し、３０チのＦＣ５を加えたＤＭＥＭ約２．５　ｍｌ に浸漬した１、全ての細胞が膜から離れるまでＬ　（Ｊ　Ｘホモジナイズ管で肝 臓を穏やかにホモジナイズした後、細胞を３チドＣＳ　ＤＭＥＭ　５　、ｇ中で 洗浄した。次いで、細胞残骸分沈殿させて、肝臓細胞懸濁液を１０ゴの遠沈管に 入れた。次ぎにこの残骸を３チＦ　ＣＳ　ＤＭＥＭ５．ｅ中で再び洗浄した。そ の後、３％ＦＣ５ＤＭＥＭ　に入れて懸濁液を５０　ｍ、ｌ！にした。

使用した骨髄腫セルラインは、Ｍ　ＲＣラボラトリ−・オブーモＬ／キュ５−− 　バイオロジー（ＭＲＣＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏ ｌｏｇｙ）、ケンブリッジ、イングランドから入手したＮ５Ｏ（非クローン化） である。骨髄１旗細胞は、対数増殖期にあり、速く分裂していたものである。各 セルラインを、３％ＦＣ５を含有している組織培養培地ＤＭＥＭで洗浄した。

次いで、相当量の骨髄、腫細胞を遠心すると同時に肝臓細胞を遠心しく室温、６ ００ｇで７分間）、得られた各ペレットを個別に３チＦＣ５ＤＭＥＭ　１０ｍｅ に再懸濁した。骨髄１重細胞を数えるために懸濁液０．１　ｍｌ！を１　ｍｌに 希釈し、位相差顕微鏡の付いた血球計算器を使用した。肝臓細胞を数えるために 、懸濁液０．１ゴをメチルバイオレット−クエン酸溶液で１ｍｅに希釈し、血球 計算器および光学顕微鏡を使用して染色されている細胞核を数えた。

次ぎに、肝臓細胞１０８個を骨髄腫細胞５Ｘ１０’個に混合し、この混合物を、 グルコースに富む血清不含のＤ　Ｍ　Ｅ　Ｍで洗浄して遠心し、液体を全て除去 した。得られた細胞ペレットを３７℃の水浴に入れた。５０（ｗ／ｖ　）のヘペ ス（Ｈｅｐｅり含有生理的食塩水中ポリエチレングリコール１５００　（ＰＥＧ ）溶液（ｐｉ（約７．５）１ｒｕｇを加え、この混合物を約１．５分間穏やかに 撹拌した。

次いで、血清不含の組織培養培地ＤＭＥＭ１０ｍ６を徐々に加え、次に、この培 養培地を加えて５０ｍｅにし、遠心して上清を全て除去した後、細胞ペレットを １８重量％のＦ’　Ｃ：　Ｓを含有しているＤＭＥＭｌｏｍｅに再懸濁した。

混合物１０μｅを標準マルチウェル組織培養プレートの４８０ウエルそれぞれに 入れた。各ウェルは、標準ＨＡＴ培地（ヒボキサンチン、アミノプテリンおよび チミジン）　１．０　ｍｌおよび５Ｘ１０’マクロフアージ／ウエルの濃度でＢ ａ１ｂ／ｃ　マクロファージの支持細胞層を含んでいる。

ウェルを静置し、温度約１００％、９チのＣＯ３−空気中、３７℃で培養した。

ウェルは、５〜１０日後に通常の倒立顕微鏡法を使用して増殖を調べた。阻害Ｈ ＡＴ培地で増殖が起こっているウェルにおいて、下記の通常の酵素免疫検定スク リーニング法を使用して特定のモノクロナール抗体に対するスクリーニングテス トを行なった。融合の約１０〜１４日後、少なくとも１個のウェルにエシェリヒ ア・コリ０８抗原に対する十分な抗体が産生きれた。

Ｄ、クローニング エシェリヒア・コリ０８抗原に対する抗体を産生じたこれらのウェルから、細胞 を取り出し、希釈培養法によりクローンした。制限希釈法においては、１８％Ｆ 　ＣＳ　−Ｄ　Ｍ　Ｅ　Ｍ　＋Ｂａ１ｂ／ｃ　７ウス・マ久０ファージ中の細胞 懸濁液の希釈を、９６−ウェル微量滴定プレート中、１細胞／ウエルおよび生細 胞／ウェルになるよう１こ行ｆｓった。このプレートを、半面生長になるまで、 ３７℃、９５％ＲＨ，７〜９チＣＯ２の条件下で７〜１４日間インキュベートし た。次いで、この上澄液を、標準酵素免疫吸着検定により、特異抗体について検 定した。

酵素免疫検定法によってクローンを検定して抗体産生を確認し、正のクローンを 標準寒天法を使用して再クローンした。寒天法では、等容量の２倍強度のＤＭＥ Ｍ、および添加剤を含んでいる滅菌した再蒸留水中の１．２％寒天で新たに調製 した保存溶液を４５℃に維持した。次ぎｊこ、この溶液（１０ｍｇ）を１０口の ペトリ皿に入れて基底層を形成させた。等容量の寒天および１８％のＦｅ２−Ｄ ＭＥＭに入れた細胞を基底層の上に平らに積層した。細胞を７〜９％のＣ０２， ９，５％のＲＨ下、３７℃で約１０日間増殖させた。生育し得る分離したコロニ ーを寒天表面から取って、１８％のＦ　ＣＳ　−Ｄ　Ｍ　Ｅ　Ｍを入れた９６− ウェル微量滴定トレイの内６０ウェルに入れた。更に増殖させた後、上清を、特 異抗体（こついて、標準酵素免疫吸着検定にょっクローンからのモノクローナル 抗体を、免疫に於いて調製されたエシェリヒア・コリＮＣＴＣ９００８への結合 、およびエシェリヒア・コリや、別の抗原を有している類似した種の試、＠バッ テリーにおける特異性について標準的な方法でスクリーニングした。具体的には 、代表的な選択菌を含んでいる微量滴定プレートのグリッドを調製し、煮沸した 後、母集団の特異性を調べるためのテンプレートとして使用した。前記のＥＩＡ 免疫検定法を使用した。

このモノクローナルは適当な特異性（０８抗原に対して）￥：有しており、他の Ｅ、コリ、シグマ、サルモネラおよびセラティアについては陰性であった。

Ｆ、抗体産生および精製 Ｂａ１ｂ／ｃ　マウスを、少なくとも７日間プリスタン（Ｐｒｉｓｔａｎりで処 置し、次いでモノクローナル抗体産生セルラインの細胞１０７個を注射した。こ のマウスが体液で膨満し、それでもなお生存している時に、腹水症体液を採取す る。この体液を１２００ｇで約１０分間遠心し、細胞を除去し、抗体に富む腹水 を集め、−２０℃で貯蔵した。

精製のために、腹水症体液をガラスウールで濾過し、３０．０００　ｇで１０分 間遠心した。次いで、腹水を４℃で撹拌し、等容量の冷却飽和硫酸アンモニウム を徐々に加えた。添加終了後、混合物をさらに３０分間撹拌し１こ。１０，００ ０　ｇで１０分間遠心して沈澱を集めた。この沈澱を最少量の冷却リン酸塩／　 Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ緩衝液［：２ＱｍＭリン酸ナトリウム、１０ｍＭのＥ　ＤＴＡ（ ｐＨ７，５）、＋０．０２％アジ化ナトリウム］に溶解した。この溶液を、同一 の緩衝液２Ｘ１０００ｍ／に対して、４℃で透析した。透析し、再溶解した沈澱 を３０、ｏｏｏｇで１０分間遠心し、予めリン酸／ＥＤＴＡ緩衝液で平衡化して おいた１０ｍｇのＤＥＡＥ−セルロースカラムにかけた。モノクローナル抗体は 、リン酸／ＥＤＴＡ緩衝液で溶出させた。

Ｇ、酵素−モノクローナル結合 前記の如く調製した、エシェリヒア・コリ０８抗原に対して特異的なモノクロー ナル抗体を、酵素（すなわち、高純度のアルカリホスファターゼ）に結合させ１ こ。モノクローナル抗体ヲアルカリホスファターゼ（シグマ　タイプＶＩＩ　− Ｔ　）と共に、リン酸塩緩衝食塩水（ＰＲ５％ｐＨ７，４）　２ＸＩ　ＯＯＯａ ｔ！に対して、４℃で透析した。透析後、ＰＢＳで容量を２．５　ｒｎｅにし、 ＰＢＳにグルタルアルデヒドを２０％溶解した溶液２５μｌを加えた。このコン ジュゲーション混合物を、室温で１．５時間放置した。この後、グルタルアルデ ヒドヲ、予めＰＢＳで平衡化しておいたファーマンアＰＤ−１０（セファデック スＣ，−９５Ｍ、ｌカラムでゲル濾過して除去した。このコンジュゲート体ＢＰ Ｂ５３．５ｍｌで溶出した。次いでこのコンジュゲート体をトリス緩衝液［：　 ５０　ｍＭ　）リス、１ｍＭ塩化マグネシウム（Ｐ１］８．０）、＋〇、　０２ チアジ化ナトリウム３２Ｘ２０００ｍｌに対して、４℃で透析した。この透析コ ンジュゲート体に、トリス緩衝液にＢＳＡを１０％溶解した溶液、１／１０　容 量を加えた。次いで、このフンシュゲート体を、０．２２μｍメンブランフィル タ−で滅菌濾過し、滅菌した褐色バイアルに入れ、４℃で貯蔵した。

Ｈ，モノクローナル抗体コンジュゲート試験試験には酵素免疫検定法を使用した 。この検定法は、標準ポリビニルクロリドＣ−ＰＶＣ）微：Ｅｋ滴定トレーのウ ェルを抗原で被覆した後、モノクローナル抗体酵素コンジュゲートを加え、次い で、酵素基質、パラ−ニトロフェノールフォスフェートを加えることからなる。

この試験で、モノクローナル抗体が、エシェリヒア・コリの０８抗原に対して特 異的であることがわかった。このモノクローナル抗体を試験した結果、ＩｇＧｚ ｂ　クラスに属することもわかった。

必要であれば、抗体が抗原に結合する特異的なエビトビツク部位も調べることが できる。尿、血液、糞便、水または乳のような診断用検体が抗原を含んでいるか どうかを調べるためｆこ、同じ酵素免疫検定法を使用することもできる。この場 合、まず抗体をプレートに結合させる。

実施例２および４２ エシェリヒア・コリ属の種々の抗原のモノクローナル抗体およびフンシュゲート 体の調製に当たり、以下の相違点を除いては、実施例１と同じ方法を４１実施例 のそれぞれに使用した。

抗原それぞれの供給源および株〔抗原の番号を（）内１ｍ　示Ｌ／　ｆニー　３ 　ハ、ＮＣＴＣ９００１（０１）、ＮＣＴＣ１１１００（０２）、ＮＣＴＣ９０ ０４（０４）、ＮＣＴＣ９００５（０５）、ＮＣＴＣ１１１０５（０６）、ＮＣ ＴＣ９００７（０７）、ＮＣＴＣ９００３（０３）、ＳＳＩ　Ａ３４ａ　（０９ ）、ＮＣＴＣ９０１０（０１０）、ＮＣＴＣ９０１１（０１１，１，ＮＣＴＣ９ ０１３（０１３）、ＮＣＴＣ９０１４（Ａ１４）、ＮＣＴＣ９０１５（０１５） 、′ＮＣＴＣ９０１７（０１７）、ＰＨＬＳ　Ｅ２０６９７１０　（０１８）、 ＮＣＴＣ９０２０（０２０）、ＮＣＴＣ９０２１（０２１）、ＮＣＴＣ１０２４ ９（０２５）、ＮＣＴＣ９０２７（０２７）、ＮＣＴＣ９０２８Ｃ０２８）、５ ５１６１８１−６６　（０７３）、ＮＣＴＣ９０７８（０７８）、ＣＶＬ　Ｂ４ １（０１０１）、ＰＨＬＳ　Ｅ４８２１０　（０１３６）、ＰＨＬＳ　Ｅ２７０ ４８１０　（０１４９Ｊ、Ｐｉ−ＩＬＳ　１１．４９３１０／ａ　（０１５２） 、ＰＨＬＳ　Ｅ１４９２０１０／ａ　（０１５３）、ＮＣＴＣ１０９６４（０１ ５７）、ＬＰＳ　０１７　内毒素、ダブリンからのｃｓｌ　（Ｄｕｂｌｉｎ、コ ロニー化因子１）、ダブリンからのＣ５２（コロニー化因子２〕、ダブリンから のＣ５３（コロニー化因子３）、ＮＣＴＣ１１１００（［（１）　、ＮＣＴＣ１ １１００（Ｋ２）、Ｓ　Ｓ　Ｉ　Ｓｕ　６５／４２　（Ｋ１２）、ＳＳＩ　Ｓｕ 　４３４４−４１　（Ｋ１３）、／　ヒバツク（Ｎｏｂｉｖａｃ、　Ｋ８８　） 　、ＣＶＬ　Ｋ９９−Ｂ４１（Ｋ９９）、フィンケルシュタインからのＬ　Ｔ　 （Ｄｒ　、Ｒｉ　ｃｈ−ａｒｄ　Ａ、　Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ、ヒト由来の外 毒素〕、フィンケルシュタインからのＬＴ（ヒト由来の不安定な外毒素〕、およ びフィンケルシュタインからのＰ−ＬＴ（豚由来の不安定な外毒素〕であった。

抗原調製工程においては、実施例２．７．８．９．１１．１５．１６，１９，２ ０．２２．２４．２５．２６．２７．２ｇ、３４．３５．３６．３７および３９ では、増殖培地はＤＭＥＭであった。実施例４．７．９．１０，２２，２４．３ ６および３９　では微生物を食塩水中で洗浄した。実施例１４．１８および２１ では、食塩水での洗浄を、実施例１６．１９および２５では、フェノール食塩水 での洗浄および煮沸を、そして実施例１７ではホルモル食塩水での洗浄および煮 沸を用いた。

実施例２．８　、１４．１５．１６．１９．２０．２５．２６．２７．２８．３ ４および３５では、フェノール食塩水中に再懸濁した。実施例３０．３１．３２ ．３３．３７．４０，４１および４２で用いた抗原は、純品で供給されたもので あった。

さらに２５週間（実施例２および３９）、１６週間（実施例４）、２０週間（実 施例８）、３週間（実施例３２および３４）、または８週間（実施例３５）の後 に、さらにｉｖ注射を追加することにより、実施例１の動物免疫過程を変えた。

実施例１６．２５．２６．２７および２８では、肝臓内調製を使用した。その他 、注射と休止期間（週単位で）は以下のようであった。すｆｊ　ｂぢ、実施例３ での順序は１ｐ−１−ｉｐ−１−ｉｐ−２−ｉｖ−２−ｉｖ　−５−ｉｖ　−４ −ｉｖ−２−ｉｖ−２−ｉｖ−２−ｉｖ　−２−ｉｖ　−２−ｉｖであり、実施 例６で（７）ＩＩ（序は、ｉ　ｐ−１−ｉｐ−１−ｉ　ｐ−１−ｉ　ｖ　−１− ｉ　Ｖ−８−ｉ　ｖ−２−ｉｖ　−１−ｉｖ　であり、実施例７での順序は、ｉ ｍ（ＣＦＡ中）−５−ｉｖ（ＰＨ３中）であり、実施例９での順序は、１ｐ−１ −ｉｐ−１−ｉｐ　−１−ｉｖ−２−ｉｖ　−１−ｉｖ−３日−ｉｖであり、実 施例１０での順序は、ｉｐ　−１−ｉｐ−２−ｉｐ−１−ｉ　ｖ−１−ｉ　ｖ− １−ｉｖ−１２−ｉｖ−２−ｉｖ　であり、実施例１１での順序は、ｉｍ　（Ｃ ＦＡ中ノー９−ｉｖ（ＰＢＳ中〕であり、実施例１４での順序は、１ｐ−１−ｉ Ｐ　−１−ｉｐ−１−ｉｖ−１−ｉｖ−４−ｉｖであり、実施例１５および１９ での順序は、ｉｍ　（ＣＦＡ中）−５−ｉｖ　（ＰＢＳ中〕であり、実施例１７ での順序は、１ｐ−１−ｉｐ　−１−ｉｐ−１−ｉｖ−１−ｉｖ−２−ｉｖであ り、実施例２１での順序は、１ｐ−１−ｉｐ−１−ｉｐ−１−ｉｖ−１−ｉ　ｖ −２−ｉ　Ｖ−２−ｉ　ｖ−１−３ｖ−１−ｉ　ｖ−２−ｉ　ｖ　であり、実施 例２３での順序は、１ｐ−１−ｉｐ−１−５ｐ−１−ｉｖ　−４−ｉｖ−１−ｉ ｖ−３−ｉｖ−ｉｐ　−２−ｉｐ−２−ｉｐ　−１−ｉｖ　−１−ｉｖ−１−ｉ ｖ　−７−ｉｖ　−１−ｉｖであり、実施例３０での順序は　ｉｐ　−１−ｉｐ −１−ｉｐ　−１−ｉｖ　−１−ｉｖ　であり、実施例３１ての順序は、ｉｍ　 （ＣＦ　Ａ　）−３−ｉｐ　（ＰＢＳ中〕−３−ｉｐ　（ＰＨ３中）−４−ｉｖ 　であり、実施例３２および３３での順序は、ｉｍ　（ＣＦ　Ａ中）−４−ｉｖ 　であり、実施例３６および３７ての順序は、ｉｐ　−２−ｉｐ　−１−ｉｐ　 −］−］１ｖ−１−ｉｖ−１−ｉｖ−１−ｉであり、実施例３８での順序は、１ ｐ＝１−ｉｐ−１−Ｉｐ＋−２−ＩＶ　１１ｐであり、実施例４０および４１で の順序は、１ｐ−１−ｉｐ　１　ｊＰ　２−ｉｖ　−４−ｉｖ　であり、実施例 ４２での順序は、１ｐ−１−ｉｐ　−１−ｉｐ−１，−１ｖ−’１−ｉｖ　−１ −ｉ　ｖ−３−４ｖ　であった。

細胞融合工程においては、実施例３．８．９．２０．２２．２３．２４．３３． ３４．３５．４０．４１および４２では６×１０７個の、実施例６では１０７個 の、実施例２１では３×１０７個の・そして実施例３０では７Ｘ１０７個の骨髄 １）重細胞を使用した。実施例３では２Ｘ１０”個の、実施例１７．２２．３４ および３５では１．４Ｘ１０’個の、実施例２４．４０および４１では１．５Ｘ １０”個の、実施例３０では５．４Ｘ１０’個の、そして実施例４２では１．４ ４Ｘ１０”個の肝臓細胞を使用した。

クローニング工程においては、実施例３．５．２１．２３および３０では標準寒 天法を単独で使用した。実施例１２．１４．１７．１８．２９．４０および４１ では、制限希釈法と寒天法の両方を使用した。

実施例７．８．９．１０．１１．１３．１６．１８．１９．２５．２６．２７（ 実施例１の方法に加えて）、２８．３４．３５．３６および３８の抗体調製工程 では次の方法を使用した。

モノクローナル抗体を産生ずるセルラインの細胞をバッチ式組織培養で増殖させ た。ＤＭＥＭ−１０％ＦＣＳを使用して、１１！容量になるまで、中間対数相で 増殖を維持した。次いでこの培養物を過増殖させて抗体の産生分最大にした。次 いでこの培養物を１２００ｙで約１０分間遠心し、細胞を除き、抗体に富む上澄 液を集めた。

実施例３．４．５．１２．１４．１７．２０．２３．２５．４０および４１の抗 体精製工程では、腹水液をガラス・ウールで濾過し、３０，０００ｇ　で１０分 間遠心した。次いでこの腹水液を、２倍容量の冷リン酸塩緩衝ｉ（０，１Ｍリン 酸ナトリウム、ｐＨ８，２）で希釈した。希釈した腹水液を、リン酸緩衝液で予 め平衡化したプロティンＡ−セファロースのカラム（２ｒｔｔｌ　）に入れた。

このカラムをリン酸塩緩衝液４０　ｍｌで洗浄した。

直ちにｐＨを約７．５に上げるために、クエン酸緩衝液ｃ　ｏ、　ｉ　Ｍクエン 酸ナトリウム、ＰＨ３，５）を用いて、十分量のＩ　Ｍ　）　ＩＪス緩衝液（ｐ Ｈ９，０）中にモノクローナル抗体を溶出した。溶出液をＰＢＳ　（ｐＨ７，４ ）中、４℃で透析し、−２０℃で保存した。

実施例１の方法に加えて、実施例８の抗体精製を次のように行なった。

培養上清１１！に０．０５Ｍ酢酸す）　ＩＪウム緩衝り、（ＰＨ４，５，ｌｌｔ ！と、予め０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（田５．０）で平衡化されたＳＰ−セ ファデックス４０ｍ１ｆ加えた。この懸濁液を＋４℃で１時間撹拌した。ＳＰ− セファデツクスを沈降させ、上清をデカントした。

ＳＰ−セファデックスをカラムに充填し、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｉ（５，０）　 ６０ｍｌで洗浄し、同じ緩衝液６０ｍ１＋ＩＭ塩化ナトリウムで溶離した。この 溶出液を＋４℃で撹拌し、等容量の飽和硫酸アンモニウムをゆっくり加えた。こ の懸濁液を更に３０分間撹拌した後、１０．０００ｇで１０分間遠心して沈澱を 収穫した。この沈澱を最少量の冷すン酸塩／ＥＤＴＡ緩衝液（２０ｍＭリン酸ナ トリウム、ｌ　Ｑ　ｍＭＥ　ＤＴＡ　（ｐｉ（７，５）＋０１０２チアジ化ナト リウム〕に溶かした。透析され、再溶解された沈澱を３０，０００ｇで１０分間 遠心し、予めリン酸塩／ＥＤＴＡ緩衝液で平衡化されたＤＥＡＥ−セルロースの １０ｍ１カラムに適用した。リン酸塩／ＥＤＴＡ緩衝液でモノクローナル抗体を 溶離した。

実施例９．１３．２５．３４．３５．３６および３８の抗体精製工程は、次のよ うにして行なった。

培養液の上澄′ｔｉ、ＩＩ！に１．ＯＭ）リス緩衝液（田８．２）１００ｍ／を 加えた。このトリス緩衝化上清を予め０．１Ｍ　）　ＩＪス緩衝液（−ＰＨ８， ２）で平衡化されたプロティンＡ−セファロースの１　ｒｒｔｅカラムに、流速 １ｍｌ！／分で適用した。次いで、このカラムをｏ、　Ｉ　Ｍ　）　Ｕス緩衝液 ４０　ｒｕｇで洗浄シた。モノクローナル抗体を、クエン酸緩衝液（０，１Ｍク エン酸ナトリウム、ｍ３．５）によって充分量の１Ｍトリス緩衝液（ＰＩ（９， ０）中に溶離し、直ちにｐＨを約７．５まで上げた。溶出液を４℃においてＰＢ 　Ｓ　（ｐＨ７，４）中で透析し、−２０℃で保存した。

実施例１０．１６．２６および２８の抗体精製工程は、次のようにして行なった 。

組織培養物の上澄液５００　ｍｅを、アミコア　（Ａｍｉｃｏｎ）ＸＭａｏｏ限 外濾過メンプランで約５０ｍ１まで濃縮した。この濃縮液を、０．９％塩化す） 　ＩＪウムで５００ｍＪまで希釈し、約５０ｒｕｌまで再濃縮した。この濃縮液 を＋４℃で撹拌し、等容量の飽和硫酸アンモニウムを徐々に加えた。この懸濁液 をさらに３０分間撹拌した。

次いて沈澱を１０，０００！ｉ’　で１０分間遠心して集めた。

この沈澱を最少量の冷トリス／酢酸緩衝液（０，Ｉ　Ｍ　トリス／酢酸＋０．０ ２％アジ化ナトリウム、Ｉｆ′（７，５）に溶解し、同じ緩衝液２Ｘ１０００ｍ Ｊに対し、４℃で透析した。再溶解し、透析した沈澱を３０，０００グで３０分 間遠心し、０．４５／７１１メンブランフィルタ−で濾過シ、ＴＳ　Ｋ　Ｇ−３ ０００ＳＷゲル濾過カラム（２１５朋×３００朋〕にかけた。モノクローナル抗 体をトリス／酢酸緩衝液で溶出し、真空透析により濃縮した。

実施例２１．２７および２９の抗体精製工程は、次のようにして行なった。

腹水液をガラス・ウールで濾過し、３０．０００５”ｔ’　１０分間遠心した。

次いでこの腹水液を、９倍容量の冷ＰＢＳで希釈し、−４℃で撹拌した。同容量 の冷飽和硫酸アンモニウムを徐々に添加した。添加終了後、混合物を更に３０分 間撹拌した。沈澱を、１０，０００ｆで１０分間遠心して集めた。この沈澱を最 少量の冷トリス−酢酸緩衝ｌ（０，１Ｍ）リス、ｐＨ７，５、氷酢酸＋０．０２ チアジ化ナトリウム付加つに溶解した。この溶液を、同じ緩衝液２　Ｘ　１００ ０ｍ／に対し、４℃で透析した。透析し、再溶解した沈澱（５，４ｍ１）を３０ ，０ＯＯｆ　で２０分間遠心し、０．４５μｍメンブランフィルタ−で濾過した 。ｐ液の１部（１，０ｍ１）を、トリス−酢酸緩衝液中で予め平衡化させ一１＠ Ｔ　Ｓ　Ｋ　Ｇ−３０００ＳＷゲル濾過カラム（２１，５ｍｍＸ　３００順）に 入れた。モノクローナル抗体をトリス−酢酸緩衝液中に溶出させた。

実施例１Ｏ１１７，２１，２５，２６，２８，３４および４２　の抗体コンジュ ゲーションは、ベンゾキノン法を使用シた。アルカリホスファターゼ（シグマ　 タイプＶＵ−Ｔ）２４”ｉを、０．２５Ｍリン酸す）リウム緩衝液（ｐＨ５，０ ）　２　Ｘ　５００　ｍｅに対して、４℃で透析した。

パラ−ベンゾキノン１８ｑを、湛ＡＲエタノール０．６ｄに溶解し、透析したア ルカリホスファターゼに加えた。このベンゾキノン／アルカリホスファターゼ混 合物を、室温の暗所で１時間放置した。次に、予め０，１５Ｍ塩化ナトリウムで 平衡化しておいた、ファーマシアＰＤ−ＩＱ（セファデックス０　２５Ｍ）カラ ムでゲル濾過して、未反応のベンゾキノンおよび反応副生成物を除去し、緩衝液 を交換した。このようにして得た、ベンゾキノン活性化したアルカリホスファタ ーゼは、１．５■の抗体コンジュゲーションを６回行なうのに十分であった。モ ノクローナル抗体を、０．１５Ｍ塩化ナトリウム２　Ｘ　５００　ｍｌに対して 、４℃で透析した。

透析した抗体を、ベンゾキノン活性化したアルカリホスファターゼ４ｒｒＩｇに 加え、直ちに十分量の１Ｍ重炭酸す）　ＩＪウムを加え、最終濃度０．１Ｍにし た。このコンジュゲーション混合物を、４℃の暗所で４８時間放置した。次に、 十分量のＩ　Ｍ　ＩＪリジン加え、最終濃度を０．１Ｍにした。室温の暗所で２ 時間放置した後、このコンジュゲート体を、ＰＢＳ＋０．０２％アジ化ナトリウ ム２Ｘ１０００ｍＡ’に対して、４℃で透析した。等量のグリセロールを加えた 。コンジュゲート体を、０．２２μｍメンブランフィルタ−で滅菌濾過し、滅菌 した褐色バイアルに入れ、４℃で貯蔵した。

少なくとも選択において、モノクローナルは適当な特異性を示し、確かめ得る所 では、他のＥ、コリについては陰性であった。実施例３のモノクローナルは０２ 抗原を有するＮＣＴＣ９００２と１１１００の両方に特異的であり、実施例６の モノクローナルはＥ、コリ０６（ＮＣＴ　Ｃ１１１０５，９００６）に特異的で あり、実施例２０のモノクローナルは０２７抗原を有するＥ、コリ株９０２７と Ｅ　１８５３５の両方に特異的であり、実施例２９のモノクローナルは０１５７ 抗原を有するＥ、コリ株１０９６４とＥ３２１５７１０の両方に特異的であり、 実施例３２のモノクローナルはｃｓ２抗原、ｃｌｇｔ、２０１　７４８３４３３ ４ｆを有するＥ、コリ株に特異的であり、実施例３３のモノクローナルはＥ、コ リ株Ｃ９２１６−１，２０１７４，８３４２１２勢、　３４３３４ｆ（これらは 、丁べてＣ５３抗原を有する〕に特異的であり、実施例３４のモノクローナルは Ｅ、コリ株ＮＣＴＣ１１１００，９００６，９０２２および１０４３０（これら は、すべてＨ１抗原を有する〕に特異的であり、実施例３８のモノクローナルは Ｅ、コリに８８のすべてのサブユニットに対して強い反応を示し、実施例４０の モノクローナルはヒトおよび琢由来のＥ、コリネ安定内毒素に特異的であり（そ して、おそらくタンパクのび一サブユニットを認識する〕、および実施例４１の モノクローナルはおそらくヒト由来のＥ、コリＬＴのβ−サブユニットに特異的 である。

実施例３．４．５．６．８．９．１Ｏ１１２，１３，１４，１６，１７，１８， ２０，２１，２２，２３，２５，２６，２９，３０，３２，３４，３８，３９， ３９，４０，４１、および４２のモノクローナルは、クレブシェラ、シュードモ ナス、エンテロバクチル、シグマおよびサルモネラについて陰性反応が得られた （ただし、実施例１０．１６．３４および４１ではクレブシェラに対して、実施 例１０．１６．２３および３９ではシュードモナスに対して、実施例４．１３． ２０．２５．３０．３４．３９および４１ではエンテロバクチルに対して、実施 例３および２０ではシゲラに対して、そして実施例３ではサルモネラに対して試 験をしていない〕。

さらに、実施例８、ユ４．１８．２３．２９および３８のモノクローナルはセラ ティア（こついて、実施例８のモノクローナルはカンピロバクチル（Ｃａｍｐｙ ｌｏｂａｃｔｅｒ）について、実施例２０および２１のモノクローナルはストレ プトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｎｃｃｕｓ）にライて、実施例３０および４１ のモノクローナルはシトロバクチル（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）について、そし て実施例４０．４１および４２のモノクローナルはコレラ毒素について陰性であ った。

サブクラスは、実施例２．１０．１６．１８．２１．２６．２７．２８および２ ９についてはＩｇＭ、実施例３．４．５．９．１１．１２．１３．１４．１９． ２０．２３．３０および３６についてはＩｇＧ３．実施例６．１９．２４．３５ および３８についてはＩｇＧ２ａ、そして実施例８．１７．２２．３２．３９． ４０．４１および４２　についてはＩｇＧ１であった。実施例７および３７のモ ノクローナルはタンパクＡＩＣついて陽性であり、サブクラスＩｇＧ２ａ、Ｉｇ Ｇ２ｂまたはＩｇＧ３を示した。

実施例４３ 実施例１の一般的方法を、エシェリヒア属の抗原と広く交叉反応をするモノクロ ーナル抗体の調製に使用する。

本発明方法を用いる試験方法は、以下の利点によって現在の試験法よりも優れて いる：（ｉ）精度が高０；回即日、１．２時間以内に結果が得られる；（ｉｉり 検査室での操作を管理するために必要な熟練した研究者の数を減少させることが でき、労働コストが下がる；（ｉり試験に関して使用される労働時間および空間 を減少させることができ、総経費を下げることになる；（■）迅速かつ正確な診 断に基づいたより良い治療を行うことができる。

本発明は、特定の好ましい態様について述べたものであるが、本発明の範囲をこ こに挙げた特定の形に限定するものではなく、むしろ添付の特許請求の範囲に定 義された本発明の思想および範囲に含まれる変法、改良法および均等法を包含す るものである。

国際調査報告 １崗陶匈−＾””−’−”＝　ＰＣＴ／ＧＢ　８５１００４０１１ｌｎｍｍ１１ ６Ｒａｌ　Ａｌｆｉｌｌ（Ｉｌｌ＠、Ｎ、、ＰＣＴ／ＧＢ　８５１００４０Ｂｈ ＋＋ｓ＝ｘ　：ｏ　ＴＩ（＝　ｒ＞ｒｒ＝ｉＮ；τ工０ＲＡＬ　Ｓ三、”１ＲＣ ＨＲＥＰＣＲＴ　ＯＮ

Claims (54)

【特許請求の範囲】
1. １．エシエリヒアの抗原またはエシエリヒア種に特異的なモノクローナル抗体。
2. ２．エシエリヒア・コリ種またはその抗原に特異的な第１項に記載の抗体。
3. ３．エシエリヒア・コリの０１〜０１５９（包括的な）抗原または抗原群に特異 的な第１項に記載の抗体。
4. ４．エシエリヒア・コリの０８抗原に特異的な第１項に記載の抗体。
5. ５．エシエリヒア・コリのＫ１−Ｋ９９（包括的な）抗原または抗原群に特異的 な第１項に記載の抗体。
6. ６．エシエリヒア・コリのＨ１〜Ｈ４２（包括的な）抗原または抗原群に特異的 な第１項に記載の抗体。
7. ７．エシエリヒア・コリの腸毒素に特異的な第１項に記載の抗体。
8. ８．エシエリヒア・コリの熱不安定性（ＬＴ）腸毒素に特異的な第１項に記載の 抗体。
9. ９．エシエリヒア・コリの熱不安定性ＬＴ１腸毒素に特異的な第１項に記載の抗 体。
10. １０．エシエリヒア・コリの熱不安定性ＬＴ２腸毒素に特異的な第１項に記載の 抗体。
11. １１．エシエリヒア・コリの熱安定性（ＳＴ）腸毒素に特異的な第１項に記載の 抗体。
12. １２．エシエリヒア・コリの熱安定性ＳＴ１腸毒素に特異的な第１項に記載の抗 体。
13. １３．エシエリヒア・コリの熱安定性ＳＴ２腸毒素に特異的な第１項に記載の抗 体。
14. １４．エシエリヒア・コリの内毒素に特異的な第１項に記載の抗体。
15. １５．エシエリヒア・コリの内毒素上の１またはそれ以上のエピトープ部位に特 異的な第１項に記載の抗体。
16. １６．エシエリヒア・コリの結合抗原に特異的な第１項に記載の抗体。
17. １７．エシエリヒア・コリの結合抗原１に特異的な第１項に記載の抗体。
18. １８．エシエリヒア・コリの結合抗原２に特異的な第１項に記載の抗体。
19. １９．エシエリヒア属の全ての種の抗原と広く交叉反応するモノクローナル抗体 。
20. ２０．実質的に第１項〜第１９項のモノクローナル抗体と適当な標識剤からなる 標識されたモノクローナル抗体。
21. ２１．標識剤が放射活性同位元素、酵素、螢光性化合物、生物的発光性化合物、 化学的発光性化合物、または強磁性の原子または粒子から選ばれる群の１つであ る第２０項に記載の標識されたモノクローナル抗体。
22. ２２．標識剤がモノクローナル抗体とコンジユゲートし得るものであり、かつ、 酵素一結合免疫検定法に使用し得るものである第２１項に記載の標識されたモノ クローナル抗体。
23. ２３．該酵素がアルカリホスフアターゼ、グルコースオキシダーゼ、ガラクトシ ダーゼまたはペルオキシダーゼである第２２項に記載の標識されたモノクローナ ル抗体。
24. ２４．該標識剤が免疫一螢光免疫検定法、螢光免疫検定法、酵素螢光免疫検定、 螢光分極免疫検定、光子計数免疫検定などに使用し得る螢光性化合物またはプロ ーブである第２１項に記載の標識されたモノクローナル抗体。
25. ２５．該螢光性化合物またはプローブがフルオレセインである第２４項に記載の 標識されたモノクローナル抗体。
26. ２６．該標識剤が発光免疫検定または酵素ー結合発光免疫検定に使用し得る化学 的発光性化合物である第２１項に記載の標識されたモノクローナル抗体。
27. ２７．化学的発光性化合物がルミノールまたはルミノール誘導体である第２６項 に記載の標識されたモノクローナル抗体。
28. ２８．該標識剤が適当な生物学的発光免疫検定に使用し得る生物的発光性化合物 である第２１項に記載の標識されたモノクローナル抗体。
29. ２９．生物的発光性化合物がルシフエラーゼまたはルシフエラーゼ誘導体である 第２８項に記載の標識されたモノクローナル抗体。
30. ３０．検体の少なくとも１部を、第２０項に記載の標識されたモノクローナル抗 体と、該標識剤に適した免疫検定法で接触させることからなる、該検体中のエシ エリヒア抗原の存在を診断する方法。
31. ３１．適当に標識された免疫検定法が、免疫一螢光免疫検定、螢光免疫検定、免 疫一電子顕微鏡法、放射性検定法、酵素一結合免疫検定法、螢光分極法、光子一 計数生物学的発光法または化学的発光免疫検定法から選ばれる第３０項に記載の 方法。
32. ３２．該標識剤が、酵素一結合免疫検定法に使用し得る酵素である第３１項に記 載の方法。
33. ３３．該酵素がアルカリホスフアターゼ、グルコースオキシダーゼ、ガラクトシ ダーゼまたはペルオキシダーゼから選ばれる第３２項記載の方法。
34. ３４．該標識剤が免疫一螢光免疫検定法、螢光免疫検定法、酵素螢光免疫検定、 螢光分極免疫検定、光子一計数免疫検定などに使用し得る螢光性化合物またはプ ローブである第３１項に記載の方法。
35. ３５．該螢光性化合物またはプローブがフルオレセインである第３４項に記載の 方法。
36. ３６．該標識剤が発光免疫検定または酵素一結合発光免疫検定に使用し得る化学 的発光性化合物である第３１項に記載の方法。
37. ３７．該化学的発光性化合物がルミノールまたはルミノール誘導体である第３６ 項に記載の方法。
38. ３８．該標識剤が生物学的発光免疫検定または酵素一結合生物学的免疫検定に使 用し得る生物的発光性化合物である第３１項に記載の方法。
39. ３９．該生物的発光性化合物がルシフエラーゼまたはルシフエラーゼ誘導体であ る第３８項に記載の方法。
40. ４０．第１項〜第１９項の１種またはそれ以上のモノクローナル抗体と薬学的に 許容し得る担体または希釈剤を含有する治療用組成物。
41. ４１．第２０項の１種またはそれ以上の標識されたモノクローナル抗体と薬学的 に許容し得る担体または希釈剤を含有する治療用組成物。
42. ４２．第１項〜第１９項のモノクローナル抗体の有効量を投与することからなる エシエリヒア感染症の治療方法。
43. ４３．第１項〜第１９項の少なくとも１種のモノクローナル抗体を含有する、診 断用検体中のエシエリヒアの抗原またはエシエリヒア種の存在を診断するための キツト。
44. ４４．該少なくとも１種の抗体が標識されている第４３項記載のキツト。
45. ４５．該少なくとも１種のモノクローナル抗体が螢光性化合物で標識されている 第４４項記載のキツト。
46. ４６．該少なくとも１種のモノクローナル抗体が酵素で標識されている第４４項 記載のキツト。
47. ４７．該少なくとも１種のモノクローナル抗体が放射活性同位元素、化学的発光 性化合物、生物的発光性化合物、強磁性の原子または粒子からなる群の１つで標 識されている第４４項記載のキツト。
48. ４８．対照として少なくとも１種の既知のエシエリヒア抗原を更に含有してなる 第４４、第４５、第４６および第４７項に記載のキツト。
49. ４９．エシエリヒアの既知抗原それぞれを含有している第４４、第４５、第４６ 、第４７および第４８項に記載のキツト。
50. ５０．エシエリヒア・コリの抗原または抗原群を含有している第４４、第４５、 第４６、第４７および第４８項に記載のキツト。
51. ５１．第１項〜第１９項の少なくとも１種のモノクローナル抗体と対照を含んで なる、診断用検体中のエシエリヒアの抗原またはエシエリヒア種の存在を診断す るためのキツト。
52. ５２．該少なくとも１種の抗原が標識されており、該対照が少なくとも１種の既 知のエシエリヒア抗原である第５１項に記載のキツト。
53. ５３．第１項〜第１９項の少なくとも１種のモノクローナル抗体を含んでなる、 グラム陰性細菌感染の存在を診断するためのキツト。
54. ５４．該少なくとも１種のモノクローナル抗体が標識されている第５３項に記載 のキツト。