JPS61502632A - モノクロ−ナル抗体およびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 モノクローナル抗体およびその用途 本発明は、モノクローナル抗体およびその用途に関する。

発明の背景 シゲラ属（Ｓ　ｈｉｇｅｌ　ｌａ）は、チンセル・マイクロバイオロジイ（Ｚ　 ｉｎｓｓｅｒＭ　ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇＹ）、１７版、７３９−７４１に、主に ヒトに体する病原体として記載されているが、時折、他の動物からも単離されて いる。シゲラ属はエシェリキア（Ｅ　５ｃｈｅｒｉｃｈｉａｅ）族に分類されて おり、それは、シゲラ・ジセンテリア（Ｓ　ｈｉｇｅｌｌａ　ｄｙｓｅｎｔｅｒ ｉａｅ）、シゲラ・フレキセネリ（ＳｈｉｇｅｌｌＨｆｌｅｘｎｅｒｉ）、シゲ ラ・ボイデイ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ　ｂｏｙｄｉ＋）およびシゲラ・ソネイ（Ｓｈ ｉｇｅｌｌａ　５ｏｎｎｅｔ）の４種から成っている。この種族の分類は血清学 的および生化学的反応に基づいている。

シゲラ種は、抗原構造上、極めて特異的に区別される。一般に、すべてのンゲラ はＯ抗原をもっているが、Ｋ抗原を有するのはその内の数個にすぎない。シゲラ は、４つの主要Ｏ抗原群（ＡｌＢｌＣ，およびＤと呼称）に大別することができ 、これらは、それぞれ、Ｓ、ジセンテリア、Ｓ、フレキセネリ、Ｓ、ボイデイお よびＳ、ソネイに対応する。これらの各主要群、あるいは主要種は、その０抗原 に基づき、型に細分類される。

これらの亜群は、アラビア数字を用いて表わされる。現在、Ｓ、ジセンテリアに ついては１０ＳＳ、フレキセネリについては６、Ｓ、ボイデイについては１５、 そしてＳ、ソネイについては１個の血清学上の型（タイプ）が、それぞれ示され ている。おびただしい数のグラム陰性菌があり、さらに、シゲラの如き生物に適 用可能な血清学的な群分類、または血清学的な型分類のシステムが広範囲に存在 していることが、ある感染症を疫学的に規定する作業を困難にしている。しかし ながら、抗原−抗体反応における極端な特異性は、他の表現型基準に基づいては 識別し得ない細菌種の株間の差違を認識することを可能ならしめるものである。

４種はすべて細菌性赤痢を引き起こし得るが、疾患の重篤度、死亡率、および単 離される頻度は各種毎に異なっている。

この属のメンバーは、特に、ヒトの腸疾患、細菌性赤痢の病原体とされる。細菌 性下痢は腸からの体液損失を招来し、多くの場合、脱水症状を引き起こし、時に は死に至ることもあり、通常、重篤な症状を呈することが多い。

下痢の外にも、シゲラ属は血流感染であるグラム陰性性敗血症の原因になること が知られている。これは近代医療センターで見られる主要な感染症疾患の１つで ある。これは一過性で自己限定性である場合もあるが、重篤なグラム陰性性の敗 血症は緊急医療を必要とするものである・。

現在のシゲラ感染症の治療および診断は、感染した場所によって異なる。アメリ カおよびヨーロッパでは、年間、何百万例もの細菌性下痢が発現していると見積 もられているか、その内、数百万例が医師にかかるか、病院に入院しているにす ぎない。成人における疾患は自己限定性であるため、大多数の人々は治療をめな い。今日、治療を望む人々に対する、下痢の細菌学的診断は、糞便培養法によっ て行なわれている。これらの方法は、通常、病院で行なわれており、遅く、１〜 ３日間を要する。この間に治療を受けている患者は、出費と、不適切な治療の危 険性にさらされていることになる。その反面、この間に治療を受けていない弘音 は、検査が終結し、治療が開始されるまでの間に症状が悪化するかもしれないと いう危険にさらされている。

現在、グラム陰性性敗血症の検査は、血液および尿の培養を作成したり、場合に より、その他の手段によって行われている。血液培養検査は、費用がかかるばか りでなく、煩わしいものである。この検査は、結果が出るまで１日かかり、数日 かかることも多い。ヒトの血液は性質が複雑であり、多数の検査試薬と非特異的 に反応する傾向があるので熟練した検査技術が必要である。

従って、下痢またはグラム陰性性敗血症において、シゲラ属を極めて正確に検出 する現在の方法は、高価につく多数の熟練技術者と労働時間を費し、結果を出す のに１日、あるいは数日もかかることが多いという点で満足できるものではない 。

モノクローナル抗体の製造は、ケーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）およびミルンユタイン （Ｍ　１ｌｓｔｅｉｎ）によって初めて報告された、今ではよく知られている手 段である［ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｅｕｒ。

Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　）　６（１９７５）２９２１゜ハイブリドーマを作成す る一般的な技術、およびその結果得られるモノクローナル抗体についてはよく知 られてい°るが、特定の抗原に対する特異的モノクローナル抗体を製造すること は、主として特定のハイブリドーマ番作成するのに必要なバリエーションおよび 特異性の程度のために、難しいことであることがわかっている。

良乳ｑ！祢 本発明は、シゲラ属の抗原および／または微生物が試料中に存在するかどうかを 正確に、かつ迅速に診断するために使用される新規なモノクローナル抗体を提供 するものである。

簡潔に述べると、本発明はンゲラ属の抗原、特にシゲラ・ジセンテリアのＯＡＩ 、ＯＡ２、ＯＡ３、ＯＡ４、ＯＡ５、ＯＡ６、ＯＡ７、ＯＡ８、ＯＡ９および０ ＡＩＯ抗原、シゲラ・フレキセネリのＯＢＩ、ＯＨ２、ＯＨ２、ＯＨ２、ＯＨ２ およびＯＢ６抗原、シゲラ・ボイデイのＯＣＬ　ＯＣ２、ＯＣ３、ＯＣ４、ＯＣ ５、ＯＣ６、ＯＣ７、ＯＣ８、ＯＣ９，０ＣＩＯ，ＯＣＩ　Ｌ　ＯＣ［２，０Ｃ １３，０Ｃ１４およびＯＣ！５抗原、シゲラ・ソネイのＯＤＩ抗原、侵入性抗原 ｌおよび２、付着抗原！および２、エントロトキシンｌおよび２、に特異的なモ ノクローナル抗体、およびシゲラ属に属するいずれかの菌種の抗原と広く交叉反 応するモノクローナル抗体に関するものである。

本発明はまた、シゲラ属、あるいはその特定の菌種、の上記の抗原の１つに対す るモノクローナル抗体であって、適当な標識（ラベル）と結合した、シゲラ属の 抗原の存在を診断するために使用される標識されたモノクローナル抗体を提供す るものである。この標識は、例えば放射性同位元素、酵素、蛍光性化合物、化学 的発光性化合物、生物的発光性化合物、強磁性の原子または粒子などとすること ができる。

本発明はまた、適当な免疫検定法により、標識されたモノクローナル抗体を検体 と接触させることからなる、検体中のシゲラ属抗原または微生物の存在を診断す る方法を提供するものである。

更に、本発明はシゲラ属の抗原に対するモノクローナル抗体と担体または希釈剤 を含有している治療用組成物、およびある種のシゲラ属の抗原に対する少なくと も１種の標識されたモノクローナル抗体を含有しているキットを提供するもので ある。

詳細な説明 本発明に係る抗体は、特定のシゲラ属の抗原で免疫した哺乳動物の膵臓細胞を、 適当な骨髄腫セルライン、好ましくはＮ５Ｏ（非クローン化）、Ｐ３Ｎ５ｌ−Ａ ｇ　４／１またはＳｐ　２１０Ａｇ　１４と融合させることにより製造される。

得られた生産物を標準的なＨＡＴ（ヒボキサンチン、アミノプテリンおよびチミ ジン）培地中で培養する。特定のモノクローナル抗体をスクリーニングテストす るには、以下に記述する免疫検定技術を利用する。

免疫される膵臓細胞は、霊長動物、ヒト、げっ肉類（例えばマウス、ラット、ウ サギなど）、牛、羊、犬などのもの゛であってよいが、本発明では、マウスのも のについて述べることにする。まず、選択した特定のシゲラ抗原をマウスに注射 し、通常約１１週間かけて免疫する。常套の検定法により、マウスが抗原に対し て十分な抗体を産生じたことがわかったら、適当なシゲラ抗原をブースター注射 し、マウスを殺して免疫された膵臓を摘出する。次いで、この免疫された膵臓細 胞と適当な骨髄腫セルラインを使って融合を行なうことができる。

特定のシゲラ抗原が存在すると正の反応を示す抗体を産生ずる融合細胞を取り出 し、標準的な方法でクローンする。クローンから得たモノクローナル抗体を標準 的な抗原に対して試験し、特定のシゲラ抗原に対する特異性を有するか否かを調 べる。特定のシゲラ抗原またはシゲラ種に対して特異的であるモノクローナル抗 体を選択し、適当な標識と結合させる。

標識のための、そしてその後の大量生産に必要な十分量の抗体はくパッチ式また は連続的組織培養、あるいはマウスの様な哺乳動物でのインビボでの培養などの 既知の方法で生産される。

モノクローナル抗体は、先に例示した様な各種の標識剤で標識することができる 。本発明では、酵素で標識したモノクローナル抗体を使用する例について述べる 。標識剤として使用される酵素の例としては、アルカリホスファターゼ、グルコ ースオキシダーゼ、ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼおよびウレアーゼなど が挙げられる。

酵素との結合は、スタフィロコッカル・プロティンＡ法、グルタルアルデヒド法 、ベンゾキノン法または過ヨウ素酸法などの既知の方法で行なうことができる。

標識されたモノクローナル抗体ができたら、通常の各種の免疫検定法の１つを使 って試験を行なう。選択すべき特定の方法は、モノクローナル抗体および選択し た標識により異なる。現在のところ、廉価であること、試薬が安定であり、安全 であり、感度の良いこと、および操作が簡単であることから酵素免疫検定が好ま しい。１つの例は酵素−結合免疫吸着検定（Ｅ　Ｉ　Ａ）である。ＥＩＡは、デ ザインが放射分析と類似している固相検定法である。しかしＥＩＡでは、免疫グ ロブリンマーカーとして放射活性同位元素の代りに、酵素を使用する。

蛍光免疫検定は、抗原または抗体を蛍光プローブで標識することに基づいている 。標識されていない抗原および特異抗体を、蛍光で標識した同一の抗原と混合す る。標識された抗原と標識されていない抗原の両者が抗体の結合サイトを競い合 う。抗体に結合した標識化抗原の量は、非標識化抗原の濃度に依存し、従って、 その濃度の測定値を表わす。この特定のタイプの蛍光免疫検定の例には、酵素− 結合蛍光免疫検定の様な不均一系、基質−標識化蛍光免疫検定の様な均−系があ る。最も適切な蛍光プローブであって、最も広く使用されているものの１つはフ ルオレセインである。フルオレセインは、散乱がかなり干渉されやすいことがあ るが、特定の検定に使用されるプローブの最適の蛍光メーターを使用することに より感度を上げることができ、散乱の効果を最小限にすることができる。

蛍光分極（ボーラリゼーション）においては、標識された試料が分極光により励 起するので、放射光の分極の程度を測定する。抗原が抗体に結合すると、そのロ ーテーションが低下し、分極の程度が増大する。しかし現時点では、その感度は マイクロモル／リットルの範囲に限定されており、生物学的試料中の抗原につい ては、上限がナノモル／リットルの範囲である。

発光は、電子が高エネルギー状態から基底状態に転移することにより、原子や分 子によって光が放射されることである。化学的発光および生物学的発光の両者に 於いて、化学反応の自由エネルギーにより、電子励起状態の中間体や生成物を生 成するのに必要なエネルギーが与えられる。

次いで衰微して基底状態に戻る時に光が放射される。生物学的発光は、生物系に みられる化学的発光の特別の形態に与えられた名称であり、ここでは、触媒作用 を有するタンパク質または酵素、例えばルシフェラーゼが発光反応の効率を増大 させる。最もよく知られた化学的発光物質はルミノールである。

本発明の１つの目的は、特定のシゲラ抗原またはシゲラ種に対する１種またはそ れ以上のモノクローナル抗体、および薬理学的に許容し得る担体または希釈剤を 含有する治療用組成物を提供するものである。この様な組成物は、なんらかのシ グラ症に苦しんでいるヒトおよび／または動物を治療するのに使用することがで き、治療に有効な量が使用される。

この量は、処置を受けるヒトおよび感染の程度に応じて著しく変わる。

各種検体中に抗原、抗原類またはシゲラ種が存在するかどうかを診断するために 使用される診断用キットに、１種またはそれ以上のモノクローナル抗体を組み合 せて入れてもよい。シゲラ属めみを同定し得る広い交叉反応性のモノクローナル 抗体を使ってもよく、また、他の細菌属あるいはシゲラ種および／または他の細 菌を同定することができる抗体を含んでいるキットの一部として用いることもで きる。

過去に於いては、検体の望ましくない交叉反応（例えば糞便と抗血清）のために 、迅速なキットを開発することは困難であった。モノクローナル抗体を使用する ことによって、この様な問題が解決され、診断用の非常に特異的な、そして迅速 な試験ができる様になった。例えば、ひどい下痢や下痢性疾患が起る頻度は非常 に高く、この様なキットの市場の大きさを予想することが困難であるが、「当日 」検査は、少なくとも糞便培養と同じ頻度で使用されると期待できる。開発途上 国では、下痢の頻度が高く、また重篤であり、その他の関連する病気もあるので 、この様な検査は大いに利用されるものと思われる。

者から採取した血液試料中にシゲラの抗原および／またはシゲラ種、およびその 他のグラム陰性細菌を同定するために、この様な抗原や微生物に対する、コンジ ュゲートあるいは標識化したモノクローナル抗体をキットにして使用することが できる。モノクローナル検査法は、従来の検査法より正確さが高いという点で、 従来法より進んだ方法である。「当日」に結果が出るので患者にとって好都合で あり、早い、正確な診断の結果、治療を改善でき、かつ、検査を管理するのに必 要な労働時間や人件費を減少させる。

このキットは単独で販売されてもよいし、あるいはまた、シゲラの菌種や血清型 を検出するために、関連検査室に売り込まれる、相客性のある免疫検定試薬類の 包括的な商品の１部に含ませてもよい。

本発明の好ましい態様の１つは、特定のシゲラ抗原またはシゲラ種に対する少な くとも１種の標識されたモノクローナル抗体と、適当な染色剤、対比染色剤また は試薬を含んでいる診断用キットである。その他のキットとしては、シゲラ抗原 の少なくとら１種の対照試料および／または特定の試料中の特定のシゲラ微生物 の存在を検出する交叉反応性の標識されたモノクローナル抗体を含んでいるキッ トがある。

ンゲラ属の抗原の存在を検出するモノクローナル診断法は、水源、食物源および 食品加工操作を定期的に検査するのにも使うこと力（できる。

この様に、本発明は、標準的な抗原の存在を調べるための標識したモノクローナ ル抗体の使用について記載しているが、本発明は、尿、血液、糞便、水およびミ ルクなどの検体が特定のシゲラ抗原を含んでＬ）るｈＸどうかを堺べることによ り、抗原の存在を診断するという多くの応用面を持っている。更に詳しくいうと 、本発明は公衆の衛生および安全の診断補助に利用することができ、水や食品の 様な検体の汚染の有無につし）て検査することができる。

以下に実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、これらの実施例は例示を 目的とするものであって、本発明を制限するためのものでは　′ない。

本発明のモノクロ・−ナル抗体は、ケーラーとミルシュタイン（前掲）の方法に 従って調製した。

実施例に於いて、 ＡＰＩ＝アナリテイカル・プロファイル・インデックス［エールスト（Ａｙｅｒ ｓｔ）研究所リファレンス］Ｄ　Ｍ　Ｅ　Ｍ　＝デュルベツコの改良イーグル培 地ＥＣ９−ウシ給仕血清 ％’ｒ＝ｔｃｍ光路長で測定したワクチン濃度ＰＢＳ＝燐酸緩衝生理食塩水 抗原ＯＣＩを持ったシゲラ・ボイデイをナショナル・コレクション・オブ・タイ プ・カルチャーから得（ＮＣＴＣ受は入れ番号９７３１）、標準的な標準タイプ 血清に対して検査してそのタイプを確認した。より詳しく述べると、親液物質（ リオファイル）からシゲラ・ボイデイを除き、血液寒天上で増殖させ、適当な抗 血清を用いて、通常の生化学試験（ＡＰＩ）および凝集試験により検査し、その 同一性および純度を確認した。

次いで細胞をＤＭＥＭに移し、増殖させ、収穫して抗原供給源として使用した。

微生物をフェノール食塩水に入れて遠心をくり返すこと１こより洗浄し、フェノ ール食塩水に再懸濁した。

ｌ−魁皇Δ人囮 調製した抗原を６匹のＢａ１ｂ／ｃマウスに注射した。上記の如く調製し、煮沸 して死滅させたシゲラ・ボイデイＯＣＩワクチンのＬＤＩＯを、１週間１回、３ 週間腹腔内に注射しく８０％Ｔワクチン０．０５ｍ１）、次いで１週問おきに１ 回、計６回、全部で１１週間静脈注射した。最後の注射から約６日日にマウスか ら採血し、血清を検査して抗体を検定した。この血清の力価測定に使用した常套 の方法は、酵素−結合免疫吸着検定法であった。このやり方でマウスが抗体産生 を示したので（通常、正の力価が少なくともｔｏ、ｏｏｏ）、融合供与動物とし て１匹を選び、膵臓切除の３日前に静脈からブースタ注射した（８０％Ｔワクチ ン）。

旦−員朧員企 選択された供与マウスを殺し、７０％のエチルアルコールに浸漬して表面滅菌し た。次いで、膵臓を摘出し、３０％のＦｅ５を加えたＤＭＥＭ約２．５　ｍｆｔ に浸漬した。次ぎに、全ての細胞が膜から離れるまでＬＯＸホモジナイズ管で膵 臓を穏やかにホモジナイズした後、細胞を３％ＦＣＳ　ＤＭＥＭＳ　ｍｌ中で洗 浄した。次いで、細胞残骸を沈殿させて、膵臓細胞懸濁液を１０１＋＋、９の遠 沈管に入れた。次ぎにこの残骸を３％ＦＣ９ＤＭＥＭ５　ｍｌ中で再び洗浄した 。その後、３％ＦＣ８ＤＭＥＭに入れて懸濁液を５０ａ＋児にした。

使用した骨髄腫セルラインは、ＭＲＣラボラトリ−・オブ・モレキュラー〇バイ オロジー（ＭＲＣＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｒ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌ ｏｇｙ）、ケンブリッジ、イングランドから入手したＮ５Ｏ（非クローン化）で ある。

骨髄腫細胞は、対数増殖期にあり、速く分裂していたものである。各セルライン を、３％ＦＣＳを含有している組織培養培地ＤＭＥＭで洗浄した。

次いで、相当量の骨髄腫細胞を取り出すと同時に膵臓細胞を取り出しく室温、６ ００９で７分間）、得られた各ペレットを個別に３％ＦＣ８ＤＭＥＭｌｏｍ、ｉ に再懸濁した。骨髄腫細胞を数えるために懸濁液０．１ｍｌをＩ　ｍｌ、に希釈 し、位相差顕微鏡の付いた血球計算器を使用した。

膵臓細胞を数えるために、懸濁液０．　１　ｍｉ、をメチルバイオレット−クエ ン酸溶液で１’ｍｆｌに希釈し、血球計算器および光学顕微鏡を使用して染色さ れている細胞核を数えた。

次ぎに、膵臓細胞１０’個を骨髄腫細胞５Ｘ１０’個に混合し、この混合物を、 グルコースに富む血清不含のＤＭＥＭで洗浄して遠心し、液体を全て除去した。

得られた細胞ペレットを３７℃の水浴に入れた。１分間で、５０％（Ｖ／　Ｖ） のへベス（Ｈｅｐｅｓ）含有生理的食塩水中ボリエチレングリコール１５００（ ＰＥＧ）溶液（ｐＨ約７．５）Ｉ　ｒａｇを加え、この混合物を約１．５分間穏 やかに攪拌する。次いで、血清不含の組織培養培地ＤＭＥＭＩＯＪを徐々に加え 、次に、この培養培地を加えて５０ｍ１にし、遠心して上滑を全て除去した後、 細胞ペレットを１８重量％のＦｅ２を含有しているＤＭＥＭ１０ｍ４に再懸濁し た。

混合物１０μｋを標準マルチウェル組織培養プレートの４８０ウエルそれぞれに 入れた。各ウェルは、標準ＨＡＴ培地（ヒボキサンチン、アミノプテリンおよび チミジン）ｌ。ＯＪおよび５Ｘ１０’マクロフアージ／ウエルの濃度でＢ　ａ　 ｌ　ｂ　／　ｃマクロファージの支持細胞層を含んでいる。

ウェルを静置し、温度約１００％、９％のＣＯｒ−空気中、３７℃で培養した。

ウェルは、５〜１０日後に通常の倒立顕微鏡法を使用して増殖を調べた。ドロ害 ＨＡ　Ｔ培地で増殖が起こっているウェルにおいて、下記の通常の酵素免疫検定 スクリーニング法を使用して特定のモノクロナール抗体に対するスクリーニング テストを行なった。融合の約１０〜１．１日後、少なくと６１ｇのウェルにノゲ ラ・ボイデイＯＣＩ抗原に対する子分な抗体が産生された。

Ｄ、クローニング ツゲラ・ボイデイＯＣＩ抗原に対する抗体を産生じたウェルから細胞を取り出し 、標準寒天法および制限希釈法を使用してクローン化した。

寒天法では、等容量の２＠強度のＤ　Ｍ　Ｅ　Ｍ　、および添加剤を含んでいる 滅菌した再蒸留水中の１，２％寒天で新たに調製した保存溶液を４５°Ｃに維持 した。次ぎに、この溶液（ＩＯＪ）を１０ｃｍのペトリ皿に入れて基底層を形成 させた。等容量の寒天および１８％のＦｅ２−ＤＭＥＭに入れた細胞を基底層の 上に平らに積層した。細胞を７〜９％のＣＯ，。

９５％のＲＨ下、３７℃で約１０日間増殖させた。生育し得る分離したコロニー を寒天表面から取って、１８％のＦｅ２−ＤＭＥＭを入れた９６−ウェル微量滴 定トレイの内６０ウェルに入れた。更に増殖させた後、上滑を、特異抗体につい て、標準酵素免疫吸着検定によって検定した。

制限希釈法では、１８％のＦ　Ｃ−Ｄ　Ｍ　Ｅ　Ｍ　−”　Ｂ　ａ克り／ｃのマ ウスマクロファージで細、抱吐濁液を希釈して、９６−ウェル微量滴定プレート に１細胞／ウエルおよび１／２細胞／ウエルとなる様にしＬ０プレートを、半融 合になるまで９５％ＲＨ１７〜９％ＣＯ１下、３７℃で７〜１４日間インキュベ ートした。次いで、上清を特異抗体に対して標準酵素免疫吸着検定法で検定した 。

Ｅ、モノクローナルの選別 クローンからのモノクローナル抗体を、免疫に於いて調製されたンゲラ・ボイデ イＮＣＴＣ９７３１への結合、お上びノゲラ種や、別の抗原を存している類似し た属の試験バッテリーにおける特異性について標準的な方法でスクリーニングし た。具体的には、〇−血清型微生物の代表的な選択菌、即ちンユードモナス（Ｐ 　ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、クレブシェラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、セラティ ア（Ｓ　ｅｒｒａｔｉａ）およびエンテロバクタ−（Ｅ　ｎｔｅｒｏｂａｃｔｅ ｒ）を含んでいる微量滴定プレートのグリッドを調製し、煮沸した後、母細胞の 〇−血清型グループの特異性を調べるためのテンプレートとして使用した。前記 のＢＩＡ免疫検定法を使用した。

Ｆ、抗体産生 Ｂａ１ｂ／Ｃマウスに、少なくとも７日間、プリスタンでプライミン・グ装置し 、モノクローナル抗体−産生性セルラインの細胞１０７を腹腔内注射した。腹水 によって浮腫を起こしながらも生存しているマウスから腹水を採取した。この液 体を１２００９で約１０分間遠心し、細胞を捨てて抗体に富む腹水を集め、−２ ０°Ｃで保存した。

上で述べた様に、抗体の存在とそのレベルを調べるために液体を滴定し、精製し た。精製は、プロティンＡ−セファロース法に従い、腹水的１０ｘＣをガラス・ ウールでＩ過し、３０．０００９で１０分間遠心することにより行った。次いで 、腹水を、その２倍量の冷リン酸緩衝液（０，１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ８， ２）で希釈した。この希釈された腹水を、予めリン酸緩衝液で平衡化されたプロ ティンＡ−セファロースの２ｘＱカラムに適用した。このカラムをリン酸緩衝液 ４０ｙＱで洗浄した。モノクローナル抗体をクエン酸緩衝液（０，１Ｍクエン酸 ナトリウム、ｐＨ３、５）で溶離して十分量の１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ９，０） に入れて直ちにｐＨを約７．５に上げた。コノ溶出液を４℃でＰＢＳ（１）Ｈ７ ，４，２Ｘ１０００酎）で透析した後、−２０℃で保存した。

Ｇ、酵素−モノクローナル結合 次いで、前記のようにして調製およびスクリーニングされたシゲラ・ボイデイ　 ＯＣＩ抗原に対して特異的なモノクローナル抗体を、適当な酵素（この場合は、 高度に精製されたアルカリ性ホスファターゼ）に、ｌ工程グルタルアルデヒド法 を用いて結合させた。モノクローナル抗体をアルカリ性ホスファターゼ［シグマ タイプ■−Ｔ　（Ｓ　ｉｇｍａ　Ｔ　Ｙｐｅ　■−Ｔ）］と共に、ＰＢＳ（ｐＨ ７，４）２ｘ　１０００ｙｒ（ｌに対１．．、＋４℃でａＫした。

透析後、ＰＢＳで容量を２　、５　ｘ（ｌにし、グルタルアルデヒドのＰＢＳ中 ２０％溶液２５μＱを加えた。このコンノユゲーション混合物を、室温で１．５ 時間放置した。その後、予めＰＢＳで平衡化されたファルマシアＰＤ−１０（セ ファデックスＧ−２５Ｍ）カラムでゲルｒ遇することにより、グルタルアルデヒ ドを除去した。コンジュゲートをＰＢＳ３．５ｆｆＱで溶離し、次いで、＋４℃ において、トリス緩衝液（５０ｍＭトリス、１ｍＭ塩化マグネシウム（ｐＨ８， ０）＋０．０２％アジ化ナトリウム）２×２０００＋ｄに対して透析した。透析 されたコンジュゲートに、ＩＺＩ　０容量のトリス緩衝液中、ｌＯ％ＢＳＡを加 えた。次に、コンジュゲートを０．２２．ＩＺＩのメンプラン・フィルターで滅 菌Ｉ過し、滅菌されたコハク色のバイヤルに入れ、＋４℃で保存した。

Ｈ，モノクローナル抗体コンジュゲート試験試験には酵素免疫検定法を使用した 。この検定法は、標準ポリビニルクロリド微量滴定トレーのウェルを抗原で被覆 した後、モノクローナル抗体酵素コンジュゲートを加え、次いで、酵素基質、パ ラー二トロフェノールフォスフェ〜トを加えることからなる。

この試験で、このモノクローナル抗体は、シゲラ・ボイディの。ｃ１抗原に対し て特異的であることがわかった。このモノクローナル抗体を試験した結果、Ｉｇ Ｇ　３クラスに属することもわかった。

必要であれば、抗体が抗原に結合する特異的なエビトビゾク部位も調へることが できる。尿、血液、糞便１．水または乳のような診断用検体か抗原を含んでいる かどうかを調べるために、同し酵素免疫検定法を使用することもてきる。この場 合、まず抗体をプレートに結合させる。

実施例２−１１ この１０の例においては、以下の点を除いて、実施例１の方法に従い、ノゲラ属 の様々な抗原のためのモノクローナル抗体・コンジュゲートを調製した。

実施例２〜７では、ＯＣ４、ＯＣ６、ＯＣ７，０ＣＩＯおよび０℃１１（２回） の各抗原を有するノゲラ・ボイデイ、実施例８てはＯＢｌ抗原を存するンゲラ・ フレキセネリ、実施例９および１０ではＯＡＩおよび０Ａ１０抗原を有するノゲ ラ・ノセンテリア、そして実施例１１ではＯＤ１抗原を有するンゲラ・ソネイを 用いた。これらは、いずれもＮＣＴＣから入手された。その寄託番号は、それぞ れ９３３０．９３３２．９３３３．９３５７．９３２１．タイトル３．４８３７ ．９３５１および９７７４てあった。

実施例２．４．６．７．８および１１における動物の免疫工程では、Ｂａ１ｂ／ Ｃマウスに、調製した抗原（８０％Ｔワクチン０．０５ｚｆりを腹腔内接種し、 さらに、６週間後に静注して追加免疫（ブースター）を行った。

マウスが免疫抗原に関して適当に高められた力価を示した時点で、これらのマウ スを、融合のための膵臓細胞の供給源として用いた。

実施例３における動物の免疫化工程においては、用ｉ０．０５Ｒｆ！の８０％Ｔ ワクチンを毎週１回、３週間腹腔内注射して投与し、次いで、実施例１と同様に して調製した、煮沸し、殺したシゲラ・ボイデイＯＣ６実施例５における動物の 免疫化工程においては、用ｉ０．５Ｒρの８０％Ｔワクチンを毎週１回、３週間 腹腔内注射して投与し、次いで、実施例Ｉと同様にして調製した、煮沸し、殺し たＳ、ボイデイを毎週１回、２週間静注し、計５週間かけてマウスを免疫した。

実施例９における動物の免疫化工程においては、用１０．０５ｘｆ２の８０％Ｔ ワクチンを週１回、３週間腹腔内注射し、次いで煮沸し、殺したンゲラ・ジセン テリアを週１回、３週間静注して投与した後、隔週毎に４同腹腔内注射し、計１ ４週間かけてマウスを免疫した。

実施例２．３および５〜１０における抗原の調製工程では、微生物を煮沸すると 共に、フェノール食塩水で洗浄した。実施例４およびｌ！では、微生物を煮沸し 、食塩水で洗浄した。実施例Ｉｔでは、フェノール食塩水に再懸濁した。

細胞融合工程において、実施例２．８およびＩＯでは、６Ｘ１０’個、実施例５ では７ＸＩＯ’個、そして実施例６および７ではｌＸｌ０’個の骨髄腫細胞を用 いた。実施例２では１．５ｘｌＯ’個、そして実施例６および７では１．２ｘｌ Ｏ’個の膵臓細胞を用いた。

クローニングエ捏において、実施例２および６〜１０では、寒天法のみ、実施例 ３および５では、制限希釈法および寒天法、そして、実施例４および１１では、 制限希釈法（２回）を採用した。

モノクローナルの選択工程ではノゲラと大腸菌を常時使用し、シュードモナス（ Ｐ　ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）を実施例３および７以外の゛全実施例に、クレブノ エラ（Ｋ　１ｅｂｓ　ｉｅｌ　ｌａ）を実施例２．３．７および８以外の全実施 例に、サルモネラ（Ｓ　ａｌｍｏｎｅｌｌａ）を実施例４以外の全実施例に用い 、そしてセラティア（Ｓ　ｅｒｒａｔ　ｉａ）を実施例２のみに用いた。

実施例３．４および１１における抗体産生工程では、モノクローナル抗体産生性 セルラインを組織浴培地中で増殖させた。中期一対数増殖期まで増殖させるため にｌＯ％ＦＣ８−ＤＭＥＭを容ｆｆ１ｌｃで用い、次いで、培養を過増殖させ、 抗体の産生を最高にした。次に、培養物を１２００９で約１０分間遠心した。細 胞を捨て、抗体に富む上清を集めた。

実施例３および４における抗体精製工程では、ＳＰ−セファデックス法で上清を 処理した。培養上清１０．に００５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４，５）ＩＣ と、予めＯ，１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５、０）で平衡化されたＳＰ−セ ファデックス４０１Ｑを加えた。この懸濁液を＋４℃で１時間攪拌した。ＳＰ− セファデックスを沈降させ、上清をデカントした。

ＳＰ−セフアゾマクスをカラムに充填し、０　、１　Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５，０ ）６０ＲＱで洗浄し、同じ緩衝液６０ｘｆｆ＋ＩＭ塩化ナトリウムで溶離した。

この溶出液を＋４℃で攪拌し、等容量の飽和硫酸アンモニウムをゆっくり加えた 。上清を更に３０分間攪拌した後、Ｉ　Ｏ，０００ｇで１０分間遠心して沈澱を 収穫した。この沈澱を最少量の冷すン酸塩／ＥＤＴＡ緩衝液（２０ｍＭリン酸ナ トリウム、１０ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ７，５）＋ｏ、ｏ　２％アジ化ナトリウム） に溶かした。透析され、再溶解された沈澱を３０．０００９で１０分間遠心し、 予めリン酸塩／Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ緩衝液で平衡化されたＤＥＡＥ−セルロースのＩ ｏＩ（ｌカラムに適用した。リン酸塩／ＥＤＴＡ緩衝液でモノクローナル抗体を 溶離した。

実施例６．８および１０における抗体精製工程は、硫酸アンモニウム沈ｊｌｉ） ／ＤＥＡＥ−セルロース法を用いて行われた。腹水液をガラス・ウールでＩ過し 、３０．０００９で１０分間遠心した。次いで、腹水を＋４℃で攪拌し、等容量 の冷飽和硫酸アンモニウムをゆっくり加えた。添加終了後、さらに３０分間、混 合物を攪拌した。１０．０００９で１０分間遠心して沈澱を収穫した。沈澱を最 少容量の冷すン酸塩／ＥＤＴＡ緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、Ｉ　ＯｍＭ 　ＥＤＴＡ（ｐＨ７，５）＋０．０２％アジ化ナトリウム）に溶かした。この溶 液を＋４℃において、同じ緩衝液（２Ｘ１０００ｚＱ）に対して透析した。透析 され、再溶解された沈澱を３０，０００９で１０分間遠心し、予めリン酸塩／Ｅ 　Ｄ　Ｔ　Ａ緩衝液で平衡化されたＤＥＡＥ−セルロースのｌ０ｙＱカラムに適 用した。リン酸塩／ＥＤＴＡ緩衝液でモノクローナル抗体を溶離した。

実施例１１における抗体精製工程では、上ｉｆｆをプロティンＡ−セファロース 法に適用した。培養上／１１ＦＩ　Ｑに対し、ｌ　０Ｍトリス緩衝液（ｐｌ−１ ８。

２）Ｉ００７１０を加えた。このトリス緩衝化上清を予め０１Ｍトリス緩衝液（ ｐＨ８，２）で平衡化されたプロティンＡ−セファロースのｌａｃカラムに、流 速１ｍｃ／分で適用した。次いで、このカラムを０　、１　Ｍ　トリス緩衝液４ ０ｘＱて洗浄した。モノクローナル抗体を、クエン酸緩衝液（０，１Ｍクエン酸 ナトリウム、ｐＨ３，５）によって充分量のＩＭ）リス緩衝液（ｐＨ９，０）中 に溶離し、直ちにｐＨを約７５まで上げた。溶出液を４℃においてＰ　Ｂ　Ｓ　 （ｐＨ７、４）中で透析し、−２０℃で保存した。

実施例３．５．６．８および１１における抗体コンジュゲーション工程には、ベ ンゾキノン法を採用した。アルカリ性ホスファターゼ（ングマタイプ■−Ｔ）２ ４ｉｙを、０．２５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６０）２　ｘ　５００ｘＱ に対して＋４℃で透析した。バラ−ベンゾキノン１８１９を温ＡＲエタノール０ 　、６　ｍＱに溶解し、透析したアルカリ性ホスファターゼに加えた。このベン ゾキノン／アルカリ性ホスファターゼ混合物を暗所、室温で１時間放置した。そ の後、予め０１５Ｍ塩化ナトリウムで平衡化されたファルマンア（Ｐｈａｒｍａ ｃｉａ）Ｐ　Ｄ　−１０（セファデックスＧ−，２５Ｍ）カラムでゲルＩ過する ことにより、未反応のベンゾキノンおよび反応副生成物を除去し、緩衝液を交換 した。この様にして調製されたベンゾキノノー活性化アルカリ性ホスファターゼ は、抗体１，５゜のコンジュゲーノヨンを６回行うのに充分であった。モノクロ ーナル抗体をＯ，１５Ｍ塩化ナトリウム２Ｘ５００ｉＱに対して＋４℃で透析し た。

透析された抗体をベンゾキノンー活性化アルカリ性ホスファターゼＦ３ｙｇに加 え、直ちに、十分量の１Ｍ重炭酸す°トリウムを加えて終濃度を０゜１　Ｍにし た。このコンノユゲーンヨン混合物を＋４℃で暗所に４８時間装いた。次いで、 十分量のりシンを加え、終濃度をＯ，ＩＭにした。暗所、室温で２時間放置した 後、このコンジュゲートをＰＢＳ十０．０２％アジ化ナトリウム２ＸＩ００ｆ） ＋Ｑに対して＋４℃で透析した。等容量のグリセリンを加えた。コンジュゲート を０．２２μ肩のメンプラン・フィルターで滅菌Ｉ過し、滅菌されたコハク色の バイヤルに入れ、＋４℃で保存した。

コンジュゲート試験の結果は、各場合において適当な特異性を有することを示し ていた。モノクローナル抗体についても試験を行い、それらは、ＩｇＧ２ａ（実 施例２．５および６）、１ｇＧ３（実施例３．９、！０および１１）、ｒｇＧｌ （実施例４および７）並びにＴｇＭ（実施例８）に分類されることが分かった。

実施例１２ ンゲラ属の多数のまたは全ての種の抗原と広く交叉反応をするモノクローナル抗 体を調製するに当たり、ナショナル・コレクション・才ブ・タイプ・カルヂャー ズから入手した別のンゲラを使用することを除いては、実施例Ｉと同じ方法を使 用することかできる。

本発明方法を用いる試験方法は、以下の利点によって現在の試験法よりら優れて いる。（１）精度が高い＋　（ｉｉ）即日、１．２時間以内に結果が（ひられる ：　（ｉｉｉ）検査室での操作を管理するために必要な熟練した研究者の数を減 少さＵ゛ることかでき、労働コストが下がる：（ｉｖ）試験に関して使用される 労働時間および空間を減少さ仕ることができ、総経費を下げることになる：（Ｖ ）迅速かつ正確な診断に基づいたより良い治療を行うことができる。

本発明は、特定の好ましい態様について述べたものであるが、本発明の範囲をこ こに挙げた特定の形に限定するものではなく、むしろ添付の特許請求の範囲に定 義された本発明の思想および範囲に含まれる変法、改良法および均等法を包含す るものである。

国際調査報告 ｌｅ１ｍ＠ｋＡＩＩａｅｓｈａ＋ｎｓＨ＠、ＰＣＴ／ＧＦＩ８５１００２９６Ａ ＮＮＥＸ　Ｔｏ　ｒＰＬＬ＋　ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ　５ＩＪＪＣＨＲＥ ＰＯＲτＯムｖ

Claims (81)

【特許請求の範囲】
1. １．シゲラの抗原またはシゲラ種に特異的なモノクローナル抗体。
2. ２．シゲラ・ジセンテリアのＯＡ１抗原に特異的な第１項に記載の抗体。
3. ３．シゲラ・ジセンテリアのＯＡ２抗原に特異的な第１項に記載の抗体。
4. ４．シゲラ・ジセンテリアのＯＡ３抗原に特異的な第１項に記載の抗体。
5. ５．シゲラ・ジセンテリアのＯＡ４抗原に特異的な第１項に記載の抗体。
6. ６．シゲラ・ジセンテリアのＯＡ５抗原に特異的な第１項に記載の抗体。
7. ７．シゲラ・ジセンテリアのＯＡ６抗原に特異的な第１項に記載の抗体。
8. ８．シゲラ・ジセンテリアのＯＡ７抗原に特異的な第１項に記載の抗体。
9. ９．シゲラ・ジセンテリアのＯＡ８抗原に特異的な第１項に記載の抗体。
10. １０．シゲラ・ジセンテリアのＯＡ９抗原に特異的な第１項に記載の抗体。
11. １１．シゲラ・ジセンテリアのＯＡ１０抗原に特異的な第１項に記載の抗体。
12. １２．シゲラ・フレキセネリのＯＢ１抗原に特異的な第１項に記載の抗体。
13. １３．シゲラ・フレキセネリのＯＢ２抗原に特異的な第１項に記載の抗体。
14. １４．シゲラ・フレキセネリのＯＢ３抗原に特異的な第１項に記載の抗体。
15. １５．シゲラ・フレキセネリのＯＢ４抗原に特異的な第１項に記載の抗体。
16. １６．シゲラ・フレキセネリのＯＢ５抗原に特異的な第１項に記載の抗体。
17. １７．シゲラ・フレキセネリのＯＢ６抗原に特異的な第１項に記載の抗体。
18. １８．シゲラ・ボイデイのＯＣ１抗原に特異的な第１項に記載の抗体。
19. １９．シゲラ・ボイデイのＯＣ２抗原に特異的な第１項に記載の抗体。
20. ２０．シゲラ・ボイデイのＯＣ３抗原に特異的な第１項に記載の抗体。
21. ２１．シゲラ・ボイデイのＯＣ４抗原に特異的な第１項に記載の抗体。
22. ２２．シゲラ・ボイデイのＯＣ５抗原に特異的な第１項に記載の抗体。
23. ２３．シゲラ・ボイデイのＯＣ６抗原に特異的な第１項に記載の抗体。
24. ２４．シゲラ・ボイデイのＯＣ７抗原に特異的な第１項に記載の抗体。
25. ２５．シゲラ・ボイデイのＯＣ８抗原に特異的な第１項に記載の抗体。
26. ２６．シゲラ・ボイデイのＯＣ９抗原に特異的な第１項に記載の抗体。
27. ２７．シゲラ・ボイデイのＯＣ１０抗原に特異的な第１項に記載の抗体。
28. ２８．シゲラ・ボイデイのＯＣ１１抗原に特異的な第１項に記載の抗体。
29. ２９．シゲラ・ボイデイのＯＣ１２抗原に特異的な第１項に記載の抗体。
30. ３０．シゲラ・ボイデイのＯＣ１３抗原に特異的な第１項に記載の抗体。
31. ３１．シゲラ・ボイデイのＯＣ１４抗原に特異的な第１項に記載の抗体。
32. ３２．シゲラ・ボイデイのＯＣ１５抗原に特異的な第１項に記載の抗体。
33. ３３．シゲラ・ソネイのＯＤ１抗原に特異的な第１項に記載の抗体。
34. ３４．シゲラの侵入性１抗原に特異的な第１項に記載の抗体。
35. ３５．シゲラの侵入性２抗原に特異的な第１項に記載の抗体。
36. ３６．シゲラのエンテロトキシン１に特異的な第１項に記載の抗体。
37. ３７．シゲラのエンテロトキシン２に特異的な第１項に記載の抗体。
38. ３８．シゲラの付着抗原１に特異的な第１項に記載の抗体。
39. ３９．シゲラの付着抗原２に特異的な第１項に記載の抗体。
40. ４０．シゲラ属の全ての種の抗原と広く交又反応するモノクローナル抗体。
41. ４１．実質的に第１項〜第４０項のモノクローナル抗体と適当な標識剤からなる 標識されたモノクローナル抗体。
42. ４２．標識剤が放射活性同位元素、酵素、蛍光性化合物、生物的発光性化合物、 化学的発光性化合物、または強磁性の原子または粒子から選ばれる群の１つであ る第４１項に記載の標識されたモノクローナル抗体。
43. ４３．標識剤がモノクローナル抗体とコンジュゲートし得るものであり、かつ、 酵素−結合免疫検定法に使用し得るものである第４２項に記載の標識されたモノ クローナル抗体。
44. ４４．該酵素がアルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、ガラクトシ ダーゼまたはペルオキシダーゼである第４３項に記載の標識されたモノクローナ ル抗体。
45. ４５．該標識剤が免疫−蛍光免疫検定法、蛍光免疫検定法、酵素蛍光免疫検定、 蛍光分極免疫検定、光子計数免疫検定などに使用し得る蛍光性化合物またはプロ ーブである第４２項に記載の標識されたモノクローナル抗体。
46. ４６．該蛍光性化合物またはプローブがフルオレセインである第４５項に記載の 標識されたモノクローナル抗体。
47. ４７．該標識剤が発光免疫検定または酵素−結合発光免疫検定に使用し得る化学 的発光性化合物である第４２項に記載の標識されたモノクローナル抗体。
48. ４８．化学的発光性化合物がルミノールまたはルミノール誘導体である第４７項 に記載の標識されたモノクローナル抗体。
49. ４９．該標識剤が適当な生物学的発光免疫検定に使用し得る生物的発光性化合物 である第４２項に記載の標識されたモノクローナル抗体。
50. ５０．生物的発光性化合物がルシフェラーゼまたはルシフェラーゼ誘導体である 第４９項に記載の標識されたモノクローナル抗体。
51. ５１．検体の少なくとも１部を、第４１項に記載の標識されたモノクローナル抗 体と、該標識剤に適した免疫検定法で接触させることからなる、該検体中のシゲ ラ抗原の存在を診断する方法。
52. ５２．適当に標識された免疫検定法が、免疫−蛍光免疫検定、蛍光免疫検定、免 疫−電子顕微鏡法、放射性検定法、酵素−結合免疫検定法、蛍光分極法、光子− 計数生物学的発光法または化学的発光免疫検定法から選ばれる第５１項に記載の 方法。
53. ５３．該標識剤が、酵素−結合免疫検定法に使用し得る酵素である第５２項に記 載の方法。
54. ５４．該酵素がアルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、ガラクトシ ダーゼまたはペルオキシダーゼから選ばれる第５３項記載の方法。
55. ５５．該標識剤が免疫−蛍光免疫検定法、蛍光免疫検定法、酵素蛍光免疫検定、 蛍光分極免疫検定、光子−計数免疫検定などに使用し得る蛍光性化合物またはプ ローブである第５２項に記載の方法。
56. ５６．該蛍光性化合物またはプローブがフルオレセインである第５５項に記載の 方法。
57. ５７．該標識剤が発光免疫検定または酵素−結合発光免疫検定に使用し得る化学 的発光性化合物である第５２項に記載の方法。
58. ５８．該化学的発光性化合物がルミノールまたはルミノール誘導体である第５７ 項に記載の方法。
59. ５９．該標識剤が生物学的発光免疫検定または酵素−結合生物学的免疫検定に使 用し得る生物的発光性化合物である第５２項に記載の方法。
60. ６０．該生物的発光性化合物がルシフェラーゼまたはルシフェラーゼ誘導体であ る第５９項に記載の方法。
61. ６１．第１項〜第４０項の１種またはそれ以上のモノクローナル抗体と薬学的に 許容し得る担体または希釈剤を含有する治療用組成物。
62. ６２．第４１項の１種またはそれ以上の標識されたモノクローナル抗体と薬学的 に許容し得る担体または希釈剤を含有する治療用組成物。
63. ６３．第１項〜第４０項のモノクローナル抗体の有効量を投与することからなる シゲラ症の治療方法。
64. ６４．第１項〜第４０項の少なくとも１種のモノクローナル抗体を含有する、診 断用検体中のシゲラの抗原またはシゲラ種の存在を診断するためのキット。
65. ６５．該少なくとも１種の抗体が標識されている第６４項記載のキット。
66. ６６．該少なくとも１種のモノクローナル抗体が蛍光性化合物で標識されている 第６５項記載のキット。
67. ６７．該少なくとも１種のモノクローナル抗体が酵素で標識されている第６５項 記載のキット。
68. ６８．該少なくとも１種のモノクローナル抗体が放射活性同位元素、化学的発光 性化合物、生物的発光性化合物、強磁性の原子または粒子からなる群の１つで標 識されている第６５項記載のキット。
69. ６９．対照として少なくとも１種の既知のシゲラ抗原を更に含有してなる第６５ 、第６６、第６７および第６８項に記載のキット。
70. ７０．シゲラ・ジセンテリア、シゲラ・フレキセネリ、シゲラ・ボイデイおよび シゲラ・ソネイの既知の抗原を含有している第６５、第６６、第６７、第６８お よび第６９項に記載のキット。
71. ７１．シゲラ・ジセンテリアのＯＡ１、ＯＡ２、ＯＡ３、ＯＡ４、ＯＡ５、ＯＡ ６、ＯＡ７、ＯＡ８、ＯＡ９またはＯＡ１０抗原を含有している第６５、６６、 ６７、６８および６９項に記載のキット。
72. ７２．シゲラ・フレキセネリのＯＢ１、ＯＢ２、ＯＢ３、ＯＢ４、ＯＢ５または ＯＢ６抗原を含有している第６５、６６、６７、６８および６９項に記載のキッ ト。
73. ７３．シゲラ・ボイデイのＯＣ１、ＯＣ２、ＯＣ３、ＯＣ４、ＯＣ５、ＯＣ６、 ＯＣ７、ＯＣ８、ＯＣ９、ＯＣ１０、ＯＣ１１、ＯＣ１２、ＯＣ１３、ＯＣ１４ またはＯＣ１５抗原を含有している第６５、６６、６７、６８および６９項に記 載のキット。
74. ７４．シゲラ・ソネイのＯＤ１抗原を含有している第６５、６６、６７、６８お よび６９項に記載のキット。
75. ７５．シゲラの侵入性抗原１を含有している第６５、６６、６７、６８および６ ９項に記載のキット。
76. ７６．シゲラのエンテロトキシン１および２を含有している第６５、６６、６７ 、６８および６９項に記載のキット。
77. ７７．シゲラの付着抗原１および２を含有している第６５、６６、６７、６８お よび６９項に記載のキット。
78. ７８．第１項〜第４０項の少なくとも１種のモノクローナル抗体と対照を含んで なる、診断用検体中のシゲラの抗原またはシゲラ種の存在を診断するためのキッ ト。
79. ７９．該少なくとも１種の抗原が標識されており、該対照が少なくとも１種の既 知のシゲラ抗原である第７８項に記載のキット。
80. ８０．第１項〜第４０項の少なくとも１種のモノクローナル抗体を含んでなる、 グラム陰性細菌感染の存在を診断するためのキット。
81. ８１．該少なくとも１種のモノクローナル抗体が標識されている第８０項に記載 のキット。