JPS62500174A - モノクロ−ナル抗体およびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 モノクローナル抗体およびその用途 本発明は、モノクローナル抗体およびその用途に関シュードモナス（Ｐｓｅｕｄ ｏｍｏｎａｓ　）は自然界に、広範囲にわたって存在する細菌であって、どんな 病院にも環境汚染性の菌として存在しており、そこで、感染に対する防御力が様 々である患者に感染する。その様な患者には、火傷患者、がん患者、または基礎 的な代謝性疾患を有する患者、並びに種々の、体間口部にチューブまたはライン を挿入されている患者が含まれる。

ソニートモナス感染症以外の治療に抗生物質を使用することにより、シュードモ ナス感染症を発現することも多い。火傷およびがんセンターでは、全感染症の３ ０％もがシュードモナスによって引き起こされている。

ヒトでの疾患に最も＠繁に関連しているンユードモナス種は、シュードモナス・ アエルギノーザ（緑膿菌、Ｐ、　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）であり、この菌は、チ ンセル・マイクロバイオロジイ（Ｚｉｎｓｅｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　） 　１７版、７６１〜５頁に記載されている。ある病院では、病院感染の１０〜２ ０％がこの生物によって引き起こされている。この菌は、膵嚢胞性線維症患者の 主要な病原菌として、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏ−ｃ ｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　）にとって代わり、しばしば、新生物疾患４者や重 篤な火傷を負った患者から単離されている。ソニートモナス・アエルギノーザに よる、ヒトでの疾患発現の機構は未だ理解されていない。

シュードモナス種の分類がなされている。最も一般的なシュードモナス種として 知られている菌には、シュードモナ７．−セパシア（Ｐｓｅｕｄｍｏｎａｓ　ｃ ｅｐａｃｉａ　）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ ｓｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ　）　、ソニートモナス・スタッフエリ（Ｐｓｅｕｄ ｏｍｏｎａｓ　５ｔｕｔｚｅｒｉ　）、シュードモナス・マルトフイリア（Ｐｓ ｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ　）およびシュードモナス・アエ ルギノーザが含まれる。シュードモナスの血清型（七ロタイピング）は、医学分 野の科学者間で一定していない。本明細書では、リウ・システム（Ｌｉｕ　ｓｙ ｓｔｅｍ）　（Ｐ、Ｖ、リウ（Ｐ、Ｖ、　Ｌｉｕ　）によって定義され、ソニー トモナス・アエルギ／−ザを、１８の血清型に亜鈴類しているシステム］を適用 した。さらに、’７　ニー　トモナス・アエルギノーザは、外毒素を産生ずるこ とが知られており、それらの多くは、その毒性の強さが充分に定義されていない 物質、即ち、Ｌｐｓ、プロテアーゼ類およびホスホリパーゼ、並びにその他のエ キソトキンンＡおよび外酢素として知られている物質である。抗原抗体反応は極 めて特異的であるため、他の表現型判断基準に基づいては識別し得ない様な菌種 の株間における相違を認識することが可能となった。

シュードモナス属は、血流感染であるグラム陰性性敗血症の原因となることが知 られている。これは、現代の医療センターで見られる主な感染症疾患の１つであ る。これは、一過性で自己限定性であることもあるが、重篤なグラム陰性性の敗 血症は、緊急医療を必要とするものである。

シュードモナス属は尿路感染症の原因菌であることも知られている。尿路感染症 の経過中にグラム−陰性性敗血症が発現することもあり、これは、しばしば、致 死的である。

現在、グラム陰性性敗血症の検査は、血液および尿の培養を作成したり、場合に より、その他の手段によって行われている。血液培養検査は、費用がかかるばか りでなく、煩わしいものである。この検査は、結果が出るまで１日かかり、数日 かかることも多い。ヒトの血液は性質が複雑であり、多数の検査試薬と非特異的 に反応する傾向があるので熟練した検査技術が必要である。

現在、尿路感染症に於いて、−次スクリーニングとして微生物の存在を調べる顕 微鏡検査が行われている。

この顕微鏡検査では、グラム陰性菌どうしを区別することはできない。従って、 二次検査として、尿試料から分離した微生物を同定するために尿培養を行なう。

診断か遅れ、治療の開始が遅れると、重篤な合併症を引き起こすことになりかね ない。

従って、尿路感染症またはグラム陰性性敗血症において、シュードモナス属を極 めて正確に検出する現在の方法は、高価につく多数の熟練技術者と労働時間を賀 し、結果を出すのに１日、あるいは数日もかかることが多いという点で満足でき るものではない。

モノクローナル抗体の製造は、ケーラー（Ｋｏｈｌｌｅｒ）およびミルシュタイ ン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）　ｌこよって初めて報告された、今ではよく知られてい る手段である〔ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｅｕｒ。

Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　）　６　（１９７５）　２９２　：ｌ　、ハイブリド ーマを作成する一般的な技術、およびその結果得られるモノクローナル抗体につ いてはよく知られているが、特定の抗原に対する特異的モノクローナル抗体を製 造することは、主として特定のハイブリドーマを作成するのに必要なバリエーシ ョンおよび特異性の程度のために、難しいことであることがわかっている。

発明の要約 本発明は、シュードモナス属の抗原および／または微生物が試料中に存在するか どうかを正確に、かつ迅速に診断するために使用される新規なモノクローナル抗 体を提供するものである。

簡潔に述べると、本発明はシュードモナス属の抗原、特にシュードモナス・セパ シアの抗原または種、シュードモナス・フルオレッセンスの抗原または種、シュ ードモナス°スタツツエリの抗原または種、シュードモナス・マルトフイリアの 抗原または種、ソニートモナス・アエルギノーザ１，２，３，４，５，６，７， ８．９゜１０．１１，１２，１３．１４．１５’：１６，１７　および１８の抗 原および種、並びにシュードモナス・アエルギノーザによって産生され得る外毒 素類（上記定義に従う）、例えば、外毒素Ａ、および外酵素に特異的なモノクロ ーナル抗体、およびシュードモナス属に属するいずれかの菌種（実質上、全菌種 ）の抗原と広く交叉反応するモノクローナル抗体に関するものである。

本発明はまた、シュードモナス属、あるいはその特定の菌種、の上記の抗原の１ つに対するモノクローナル抗体であって、適当な標識（ラベル）と結合した、シ ュードモナス属の抗原の存在を診断するために使用される標識されたモノクロー ナル抗体を提供するものである。この標識は、例えば放射性同位元素、酵素、螢 光性化合物、化学的発光針化合物、生物的発光性化合物、強磁性の原子または粒 子などとすることができる。

本発明はまた、適当な免疫検定法により、標識されたモノクローナル抗体を検体 と接触させることからなる、検体中のソニートモナス属抗原または微生物の存在 を診断する方法を提供するものである。

更に、本発明はシュードモナス属の抗原に対するモノクローナル抗体と担体また は希釈剤を含有している治療用組成物、およびある種のシュードモナス属の抗原 に対する少なくとも１種の標識されたモノクローナル抗体を含有しているキット を提供するものである。

詳細な説明 本発明に係る抗体は、特定のンユードモナス属の抗原で免疫した哺乳動物の膵臓 細胞を、適当な骨髄腫セルライン、好ましくはＮＳＯ（非クローン化）、Ｐ３Ｎ ＳＬ−Ａｇ４／１またはＳｐ　２１０Ａｇ　１４と融合させることにより製造さ れる。得られた生産物を標準的なＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミ７プテリンおよ びチミジン）培地中で培養する。特定のモノクローナル抗体をスクリーニングテ ストするには、以下に記述する免疫検定技術を利用する。

免疫される膵臓細胞は、霊長動物、ヒト、げつ歯頚（例えばマウス、ラット、ウ サギなど）、牛、羊、犬などのものであってよいが、本発明では、マウスのもの （こついて述べることにする。まず、選択した特定のソニートモナス抗原をマウ スに注射し、通常約１１週間かけて免疫する。常套の検定法により、マウスが抗 原１こ対して十分な抗体を産生じたことがわかったら、適当なシュードモナス抗 原をブースター注射し、マウスを殺して免疫された膵臓を摘出する。次いて、こ の免疫された膵臓細胞と適当な骨髄腫セルラインを使って融合を行なうことがで きる。

特定のシュードモナス抗原が存在すると正の反応を示す抗体を産生ずる融合細胞 を取り出し、標準的な方法でクローンする。クローンから得たモノクローナル抗 体を標準的な抗原に対して試験し、特定のシュードモナス抗原に対する特異性を 有するか否かを調へる。

特定のシュードモナス抗原またはシュードモナス種に対して特異的であるモノク ローナル抗体を選択し、適当な標識と結合させる。

標識のための、そしてその後の大量生産に必要な十分量の抗体は、バッチ式また は連続的組織培養、あるいはマウスの様な哺乳動物でのインビボ培養などの既知 の方法で生産される。

モノクローナル抗体は、先に例示した様な各種の標識剤で標識することができる 。本発明では、酵素で標識したモノクローナル抗体を使用する例について述べる 。標識剤として使用される酵素の例としては、アルカリホスファターゼ、グルコ ースオキシダーゼ、ガラクトシダーゼ、ベルオキシダーゼおよびウレアーゼなど が挙げられる。

酵素との結合は、スタフイロコツカル・プロティンＡ法、グルタルアルデヒド法 、ベンゾ牛ノン法または過ヨウ素酸法などの既知の方法で行なうことができる。

標識された毛７クローナル抗体ができたら、通常の各種の免疫検定法の１つを使 って試験を行なう。選択すべき特定の方法は、モノクローナル抗体および選択し た標識により異なる。現在のところ、廉価であること、試薬が安定であり、安全 であり、感度の良いこと、および操作が簡単であることから酵素免疫検定が好ま しい。１つの例は酵素−結合免疫吸着検定（ＥＩＡ）である。ＥＩＡは、デザイ ンが放射分析と類似している固相検定法である。しかしＥＩＡでは、免疫グロブ リンマーカーとして放射活性同位元素の代りに、酵素を使用する。

螢光免疫検定は、抗原または抗体を螢光プローブで標識することに基づいている 。標識されていない抗原および特異抗体を、螢光で標識した同一の抗原と混合す る。標識された抗原と標識されていない抗原の両者が抗体の結合サイトを競い合 う。抗体に結合した標識化抗原の量は、非標識化抗原の濃度に依存し、従って、 その濃度の測定値を表わす。この特定のタイプの螢光免疫検定の例には、酵素− 結合螢光免疫検定の様な不均一系、基質−標識化螢光免疫検定の様な均一系があ る。最も適切な螢光プローブであって、最も広く使用されているものの１つはフ ルオレセインである。フルオレセインは、散乱でかなり干渉されやすいことがあ るが、特定の検定１こ使用されるプローブ１こ最適の螢光メーターを使用するこ とにより感度を上げることができ、散乱の影響を最小限にすることができる。

螢光分極（ポーラリゼーション）においては、標識された試料が分極光１こより 励起するので、放射光の分極の程度を測定する。抗原が抗体に結合すると、その ローテーションが低下し、分極の程度が増大する。しかし現時点では、その感度 はマイクロモル／リットルの範囲に限定されており、生物学的試料中の抗原につ いては、上限がナノモル／リットルの範囲である。

発光は、電子が高エネルギー状態から基底状態に転移することにより、原子や分 子によって光が放射されることである。化学的発光および生物学的発光の両者に 於いて、化学反応の自由エネルギーにより、電子励起状態の中間体や生成物を生 成するのに必要なエネルギーが与えられる。次いで衰微して基底状態に戻る時に 光が放射される。生物学的発光は、生物系にみられ４る化学的発光の特別の形態 に与えられた名称であり、ここでは、触媒作用を有するタンパク質または酵素、 例えばルンフエラーゼが発光反応の効率を増大させる。

最もよく知られた化学的発光物質はルミノールである。

本発明の１つの目的は、特定のシュードモナス抗原またはシュードモナス種に対 する１種またはそれ以上のモノクローナル抗体、および薬理学的に許容し得る担 体または希釈剤を含有する治療用組成物を提供するものである。この様な組成物 は、なんらかのシュードモナス感染に苦しんでいるヒトおよび／または動物を治 療するのに使用することができ、治療に有効な址が使用される。この瀘は、処置 を受けるヒトおよび感染の程度に応じて著しく変わる。

各種検体中に抗原、抗原類またはシュードモナス種か存在するかどうかを診断す るために使用される診断用キットに、１種またはそれ以上のモノクローナル抗体 を組み合せて入れてもよい。シュードモナス属のみを同定し得る広い交叉反応性 のモノクローナル抗体を使ってもよく、また、他の細菌風あるいはシュードモナ ス種および／または他の細菌を同定することができる抗体を含んでいるキットの 一部として用いることもできる。

過去に於いては、検体の望ましくない交叉反応（例えば尿と抗血清）のために、 迅速なキットを開発することは困難であった。モノクローナル抗体を使用するこ とによって、この様な問題が解決され、診断用の非常に特異的な、そして迅速な 試験ができる様になった。

例えば、ひどい下痢や下痢性疾患が起る頻度は非常に高く、この様なキットの市 場の大きさを予想することが困難であるが、「当日」検査は、少なくとも糞便培 養と同じ頻度で使用されると期待できる。開発途上国では、下痢の頻度が高く、 また重篤であり、その他の関連する病気もあるので、この様な検査は大いに利用 されるものと思われる。

更に、キットは尿中のグラム陰性細菌を迅速に検査するために、病理検査室で使 用されることもあろうし、外来患者にも使用される。また、ンユードモナスまた はその他のグラム陰性性敗血症の診断のために、患者から採取した血液試料中に ンユードモナスの抗原および／またはシュードモナス種、およびその他のグラム 陰性細菌を同定するために、この様な抗原や微生物に対する、フンシュゲートあ るいは標識化したモノクローナル抗体をキットにして使用することができる。モ ノクローナル検査法は、従来の検査法より正確さが高いという点で、従来法より 進んだ方法である。「当日」に結果が出るので患者にとって好都合であり、早い 、正確な診断の結果、治療を改善でき、かつ、検査を管理するのに必要な労働時 間や人件費を減少させる。

このキットは単独で販売されてもよいし、あるいはまた、シュードモナスの菌種 や血清型を検出するために、関連検査室に売り込まれる、相容性のある免疫検定 試薬類の包括的な商品の１部に含ませてもよい。

本発明の好ましい態様の１つは、特定のシュードモナス抗原またはシュードモナ ス種に対する少なくとも１種の標識されたモノクローナル抗体と、適当な染色剤 、対比染色剤または試薬を含んでいる診断用キットである。その他のキットとし ては、シュードモナス抗原の少なくとも１種の対照試料および／または特定の試 料中の特定の７ユードモナス微生物の存在を検出する交叉反応性の標識されたモ ノクローナル抗体を含んでいるキットがある。

シュードモナス属の抗原の存在を検出するモノクローナル診断法は、水源、食物 供給源および食品加工操作を定期的に検査するのにも使うことができる。この様 に、本発明は、標準的な抗原の存在を調べるだめの標識したモノクローナル抗体 の使用について記載しているが、本発明は、尿、血液、糞便、水およびミルクな どの検体が特定の７ユードモナス抗原を含んでいるかどうかを調べることにより 、抗原の存在を診断するという多くの応用面を持っている。更に詳しくいうと、 本発明は公衆の衛生および安全の診断補助に利用することができ、水や食品の様 な検体の汚染の有無について検査することができる。

以下に実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、これらの実施例は例示を 目的とするものであって、本発明を制限するためのものではない。

本発明のモノクローナル抗体は、ケーラーとミルシュタイン（前掲）の方法に従 って調製した。

実施例に於いて、 ＡＰＩ＝アナリテイカル・プロファイル・インデックス〔エールスト（Ａｙｅｒ ｓｔ）研究所リファレンス〕 Ｄ　Ｍ　Ｅ　Ｍ　＝デュルベツコの改良イーグル培地ＥＣ５＝ウシ胎仔血清 ％Ｔ　＝　ｌ　ｃｒｓ光路長で測定したワクチン濃度ＰＢＳ＝燐酸緩衝生理食塩 水 ＴＳＢ＝トリプトファン・ソイ・ブロスｉｐ＝腹腔内 ｉｖ−静脈内 ｉｍ−筋肉内 ＣＦＡ＝完全フロインドアシュパント ンニードモナス・フルオレッセンスをナショナル・コレクション・オブ・タイプ ・カルチャーから得（ＮＣＴＣ受は入れ番号１００３８）、微生物同定のための 標準的な生化学的手段により検査してその同一性を確認した（ＡＰＩ像を利用） 。親液物質（リオファイル）からソニートモナス・フルオレッセンスを除き、血 液寒天上で増殖させ、ＡＰＩにより検査し、その同一性および純度を確認した。

次いで細菌をＴＳＢに移して増殖させ、収穫して抗原供給源として使用した。

微生物を煮沸し、ホルモール食塩水に入れて遠心をくり返すことにより洗浄し、 １％ホルモール食塩水に再＠濁した。

Ｂ、動物の免疫 調製した抗原をＢａ１ｂ／ｃ　マウスに注射した。動物に、１週間に１回、３週 間腹腔内に注射しく８０％Ｔワクチン０，０５屑ｌ）、次いで１．４．１．４× ２および３週間の間隔をあけて、８回、静脈注射した。最後の注射から約６日日 にマウスを採血し、血清を検査して抗体を検定した。この血清の力価測定に使用 した常套の方法は、酵素−結合免疫吸着検定法であった。このやり方でマウスが 抗体産生を示した（通常、正の力価が少なくとも１０，０００）時点で、融合供 与動物として１匹を選び、膵臓切除の３日前に静脈からブースタ注射した（８０ ％丁ワクチン０．０５　ｄ　）。

Ｃ１細胞融合 ブースター処置の３日後に、常法通り、免疫マウスから牌細胞を収穫した。まず 、選択した供与マウスを殺し、７０％のエチルアルコールに浸漬して表面滅菌し た。次いで、膵臓を摘出し、３％のＦｅ２を加えたＤＭＥＭ約２．５　ａｇに浸 漬した。次ぎに、全ての細胞が膜から離れるまでＬＵＸホモジナイズ管で膵臓を 穏やかにホモジナイズした後、細胞を３％ＦＣ３−ＤＭＥＭ５　ｍｅ中で洗浄し た。次いで、細胞残骸を沈殿させて、膵臓細胞懸濁液をｌＱｍ／の遠沈管に入れ た。次ぎにこの残骸を３％Ｆ　ＣＳ　−ＤＭＥＭ　５　ｄ中で再び洗浄した。

その後、３％ＦＣ８−ＤＭＥＭに入れて懸濁液を５０ゴにした。

使用した骨髄腫セルラインは、Ｍ　ＲＣラボラトリ−・オブ・モレキュラー・バ イオロジー（ＭＲＣＬａｂｏ−ｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉ ｏｌｏｇｙ　）、ケンブリッジ、イングランドから入手したＮ５Ｏ（非クローン 化）である。骨髄腫細胞は、対数増殖期にあり、速く分裂していたものである。

各セルラインを、３％ＦＣ５を含有している組織培養培地ＤＭＥＭで洗浄した。

次いで、相当量の骨髄腫細胞を遠沈すると同時に膵臓細胞を遠沈させ（室温、６ ００ｇで７分間）、得られた各ペレットを個別に３％ＦＣ５−ＤＭＥＭＩＯｒｘ ｌに再懸濁した。骨髄腫細胞を数えるために懸濁液Ｑ、　ｌ　ｍｅを１＃ＩＣに 希釈し、位相差顕微鏡の付いた血球計算器を使用した。膵臓細胞を数えるために 、懸濁液Ｑ、　ｌ　ｍｅをメチルバイオレット−クエン酸溶液でｌ　ｍｅに希釈 し、血球計算器および光学顕微鏡を使用して染色されている細胞核を数えた。

次ぎｌこ、膵臓細胞１０８個を骨髄腫細胞６Ｘ１０７個に混合し、この混合物を 、グルコースに富む血清不含のＤＭＥＭで洗浄して遠心し、液体を全て除去した 。得られた細胞ペレットを３７℃の水浴に入れた。５０％（Ｗ／ｖ）のヘペス（ Ｈｅｐｅｓ　）含有生理的食塩水中ポリエチレングリコール１５００（ＰＥＧ） 溶液（ｐＨ約７．５）１ゴを加え、この混合物を約１，５分間穏やかに撹拌する 。

次いで、血清不含の組織培養培地ＤＭＥＭＩ　Ｏａｔを徐々に加え、次に、この 培養培地を加えて５０ｍにし、遠心して上滑を全て除去した後、細胞ペレットを １８重量％のＦｅ２を含有しているＤＭＥＭｌｏｄに再懸濁した。

混合物１０μｅを標準マルチウェル組織培養プレートの４８０ウエルそれぞれに 入れた。各ウェルは、標準ＨＡ　Ｔ　培地（ヒポキサンチン、アミノプテリンお よびチミジン）１．０Ｒｔおよび５Ｘ１０４マクロフアージ／ウエルの濃度でＢ ａ１ｂ／ｃマクロフアージの支持細胞層を含んでいる。

ウェルを静置し、温度約１００％、９％のＣＯ３−空気中、３７℃で培養した。

ウェルは、約５〜１０日後に通常の倒立顕微鏡法を使用して増殖を調べた。阻害 ＨＡ　Ｔ　培地で増殖か起こっているウェルにおいて、下記の通常の酵素免疫検 定スクリーニング法を使用して特定のモノクローナル抗体に対するスクリーニン グテストを行なった。融合の約１０〜１４日後、少なくとも１個のウェルに、ソ ニートモナス・フルオレッセンスに対する十分な抗体が産生された。

ソニートモナス・フルオレッセンスに対する抗体全産生じたウェルから細胞を取 り出し、標準寒天法を使用してクローン化した。寒天法では、等容量の２倍強度 のＤＭＥＭ、および添加剤を含んでいる滅菌した再蒸留水中の１．２％寒天で新 たに調製した保存溶液を４５℃に維持した。次ぎに、この溶液（ｌＱａｉ／）を １０口のペトリ皿に入れて基底層を形成させた。等容量の寒天および１８％のＦ ｅ２−ＤＭＥＭに入れた細胞を基底層の上に平らに積層した。細胞を７〜９兎の ＣＯ２，９５％のＲＨ下、３７℃で約１０日間増殖させた。生育し得る分離した コロニーを寒天表面から取って、１８％のＦｅ２−ＤＭＥ’Ｍを入れた９６−ウ ェル微量滴定トレイの内６０ウェルに入れた。更に増殖させた後、上清を、特異 抗体について、標準酵素免疫吸着検定によって検定した。

酵素免疫検定法により、クローン１こよる抗体の産生クローンからのモノクロー ナル抗体ヲ、免疫番コ於イＴ　調’Ａ　サれたソニートモナス・フルオレッセン ス（ＮＣＴＣ１００３８）との結合、およびソニートモナス・フルオレッセンス 棟や、別の抗原を有している近縁の属の試験バッテリーにおける特異性について 標準的な方法でスクリーニングした。具体的には、シュードモナス生物の代表的 な選択菌を含んでいる微鼠滴定プレートのグリッドを調製し、煮沸した後、母集 団の特異性を調べるためのテンプレートとして使用した。前記のＥＩＡ免疫検定 法を使用した。

このモノクローナルは適当な特異性を宵しくＮＣＴＣ１００３８に対し）、他の シュードモナス属や、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌ　ｉ　）、シグマ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ 　）、＋１−　／ｋｚ　モネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　）、プロテラ７．　（ ＰｒｏＬｅｕｓ　）　、プロビデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ　）　および セラチア（５ｅｒｒａｔｉａ　）　ニ対しては陰性であった。

Ｂａｒｂ／ｃマウスを、少なくとも７日間プリスタン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ　）で 処置し、モノクローナル抗体産生セルラインの細胞１０７個を腹腔内に注射した 。このマウスが体液で膨満し、それでもなお生存している時に、腹水症体液を採 取した。この体液を１２００ｇで約１０分間遠心し、細胞を除去し、抗体に富む 腹水を集め、−２０℃で貯蔵した。

硫酸アンモニウム／ＤＥＡＥ法により、精製した。硫酸アンモニウム／ＤＥＡＥ 法では、腹水症体液１０ｍ１をガラスウールで濾過し、３０．ＯＱＯｇで１０分 間遠心した。次いで、腹水を４℃で撹拌し、等容ｂ１の冷却飽和硫酸アンモニウ ムを徐々に加えた。添加終了後、混合物をさらに３０分間撹拌した。１０，００ ０ｇで１０分間遠心して沈澱を集めた。この沈澱を最少量の冷却リン酸塩／ＥＤ ＴＡ緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、１０ｍＭ　（７）　Ｅ　ＤＴＡ　（ｐ Ｈ７，５）、＋−０，０２％アシ化ナトリウム〕に溶解した。この溶液を、同一 の緩衝液２Ｘ１０００ｊＩｌに対して、４℃で透析した。透析し、再溶解した沈 澱を３０，０００ｇで１０分間遠心し、予めリン酸／′ＥＤＴＡ緩衝液で平衡化 しておいた１０！ｌｔのＤＥＡＥ−セルロースカラムにかけた。モノクローナル 抗体を、リン酸／ＥＤＴＡ緩衝液で溶離した。

次に、前記の如く調製した、ソニートモナス・フルオレッセンス抗原１こ対して 特異的なモノクローナル抗体を、一段階グルタルアルデヒド法を使って、適当な 酵素（ここでは、高純度のアルカリホスファターゼ）に結合させた。モノクロー ナル抗体をアルカリホスファターゼ（シグマ　タイプ■−Ｔ）と共に、ＰＢＳ　 （ｐＥ（７，４）２Ｘ１０００ｆｆｉ／に対して、４℃で透析した。透析後、Ｐ ＢＳで容量を２．５肩ｌにし、ｌ）　Ｂ　Ｓ中、グルタルアルデヒドの２０％俗 液２５μｅを加えた。このコンジュゲーション混合物を、室温で１，５時間放置 した。

この後、グルタルアルデヒドを、予めＰＢＳて平衡化しておいたファーマシアＰ Ｄ−１０（セファデックスＧ−２５Ｍ）カラムでゲル濾過して除去した。このコ ンジュゲート体をＰ　Ｂ　Ｓ　３．５　ｍｌで溶離し、次いでトリス緩衝液（５ ０ｍＭ　トリス、１ｍＭ塩化マグネシウム（ｐＨ８，０）、七０．０２％アジ化 ナトリウム：］　２Ｘ２０００ｍｌに対して、４℃で透析した。この透析コンジ ュゲート体に、トリス緩衝液ｌこＢＳＡを１０％溶解した溶液、１／１０容１４ を加えた。次いで、このコンジュゲート体を、０．２２μｍメンブランフィルタ −で滅菌濾過し、滅菌した褐色バイアルに入れ、４℃で貯蔵した。

試験には酵素免疫検定法を使用した。この検定法は、標準ポリビニルクロリド（ ｒ＞ｖｃ）微ｆｉｔ　７ｍ定トレーのウェルを抗原で被覆した後、モノクローナ ル抗体酵素コンジュゲートを加え、次いて、酵素基質、パラ−ニトロフェニルフ ォスフェートを加えることからなる。

こノ試験で、モノクローナル抗体が、シュードモナス・フルオレッセンスの抗原 Ｅこ対して特異的であることかわかった。これらのモノクローナル抗体を試験し た結果、ＩｇＧ□クラスに属することがわかった。

必要であれば、抗体が抗原に結合する特異的なエピトープ部位も調べることがで きる。尿、血液、糞便、水または乳のような診断用検体が抗原を含んでいるかと うかを調べるために、同じ酵素免疫検定法を使用することもできる。この場合、 まず抗体をプレートに結ソニートモナス属の種々の抗原のモノクローナル抗体お よびコンジュゲート体の調製に当たり、以下の相違点を除いては、実施例１と同 じ方法を１３の各実施例に使用した。

実施例２における抗原はンユードモナス・スタッツエ！ＪＮＣＴＣ１０４７５、 実施例３Ｉこおける抗原はソユードモナスパフルトフィリアＮＣＴＣ１０２５７ 、実施例４における抗原はンユードモナス・セパシアＮＣＴＣ１０７４３、そし て実施例５〜１３における抗原はンユードモナス・アエロギ不スの血清型１　（ ＮＣＴＣ１１４４０）、３　（ＮＣＴＣ１１４４２）、４　（ＮＣＴＣ１１４４ ３）、５　（ＮＣＴＣ１１４４４）、５ｄＣパブリツク・ヘルス・ラボラトリイ ・サービス・タイプ（Ｐｕｂｌｉｃ　ＨｅａｌｔｈＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　５ｅ ｒｖｉｃｅ　Ｔｙｐｅ　）　５　ｄ　〕、６（ＮＣＴＣ１１４４６）、８　（Ｎ Ｃ’ｌ’Ｃ１１４４７）、９　（１’ＪｃＴｃ１１４４８　）および１１（ＰＡ １０３　）である。実施例１４では、実施例６と同一の抗原（ＮＣＴＣ１１４４ ２）を用いた。

実施例４の抗原長造工程では、増殖培地に血液寒天を用い、蒸留水音波処理を用 いた。実施例９における増殖培地はＤＭＥＭであり、フェノール食塩水に懸濁す る前に生物を煮沸し、食塩水中で洗浄した。実施例１３においては、ＴＳＢ中で 増殖させた後、上清を取り、タンパク質画分を分離した。

実施例２における動物の免疫化工程においては、数字で示した週間隔をあけて、 次の順序で、注入を行った。１ｐ−１−ｉｐ　−２−１ｐ−１−ｉ　ｖ　−４− ｉ　ｖ−１−ｉ　ｖ　−４−ｉｖ　−２−ｉ　ｖ　−２−ｉ　ｖ　−８’Ｐｏ実 施例３における順序は１ｐ−２−ｉｐ　−２−ｉｐ−１−ｉｖ−４−ｉｖ　−１ −ｉｖ−２−４ｖ−４−ｉｖ−２−ｉｖであった。実施例４における順序は、ｉ ｍ（ＣＦＡ中）−１５ｉｖ（ホルモル食塩水中）であった。実施例５における順 序は、１ｐ−２−ｉｐ−２−ｉｐ−１−ｉｖ　−４−ｉｖ　−２−ｉｖ−２−ｉ ｖ−２−ｉｖ　−”１−ｉｖ−２０−ｉｖであった。

実施例６および１４における順序は、ｉｐ　−２−ｉｐ−２−ｉｐ　−１−ｉｖ 　−４−ｉｖ−１−ｉｖ　−２−ｉｖ　−２−ｉｖ−２−ｉｖ　−２−ｉｖ　で あった。実施例７における順序は、１ｐ−１−ｉｐ−１−ｉｐ−１−ｉｖ　−４ −ｉｖ　−２−ｉｖ　−２−ｉｖ　−２−ｉｖ−２−ｉｖ−４−ｉｖ　であった 。実施例９における順序はｉｍ（ＣＦＡ中）　−３−ｉｐ　−２−ｉｖであった 。実施例１０における順序は、１ｐ−２−ｉｐ　−０２−ｉｐ−１−ｉｖ−４− ｉｖ　−２−ｉｖ−２−ｉｖ−２０−ｉｖであった。実施例１１における順序は 、１ｐ−２−ｉｐ　−２−１ｐ−１−ｉｖ　−４−ｉ　ｖ　−’ｌ　−ｉ　Ｖ　 −２−１ｖ−２−ｉ　Ｖ　−２−ｉ　ｖ−２０−１ｐ−１−ｉｐであった。実施 例１２における順序は、’Ｐ−２−１ｐ−２−ｉ　ｐ−１−ｉｖ　−４−１ｖ− １−ｉ　Ｖ−２−ｉ　ｖ−２−ｉ　Ｖ　−２−ｉ　ｖ−２−ｉ　ｖ　−７−１ｖ −２−ｉｖであった。実施例１３における順序は、ｉｍ−１−ｉｍ−１−ｉｍ− １−ｉｍ　であった。

細胞融合の工程では、実施例４，５，９，１０．１１　および１３ｉこおいては ５Ｘ１０７の骨髄腫細胞を用いた。

実施例３において用いた牌細胞の数は９．４　Ｘ　１０７てあった。

実施例３，４，５，６，９，１０，１１．１３および１４においては、寒天法の 代りに（実施例３．６　および１４）、あるいは寒天法に加えて制限希釈法を使 用した。

スナワチ、制限希釈法テ、１３　％　ＦＣ−ＤＭＥＭ＋Ｂａ１ｈ／Ｃマウスマク ロファージに懸濁させた細胞液の希釈を行ない、９６−ウェル微量滴定プレート において、１細胞／ウエルおよび半細胞／ウェルとなるようにした。

半融合になるまで、このプレートを、３７℃、９７％ＲＨ，７−９％Ｃ０２で７ −１４日間インキュベートした。次いで、この上澄液について、標準的な酵素免 疫吸着検定によって、特異抗体を検定した。

実施例１０，１１．１３（実施例１で示した方法に加えて）、および１４におけ る抗体産生工程は、モノクローナル抗体産生−セルラインの細胞をバッチ組織培 養中で増殖させることにより、行った。増殖を中間一対数増殖相に支持するため にＤＭＥＭ−ＩＱ％ＦＣ５を用いて容置をｉ６＋こした後、過剰増殖させて抗体 の産生を最大にした。次いて培養物を１２００，５ｉ’で約１０分間遠心（２、 細胞を捨て、抗体に富む上清を集めた。

実施例２，３，６．７　および１４における抗体精製工程には、プロティンＡ− セファロース法を用いた。腹水をカラスウールで濾過し、３０，０００ｇで１０ 分間遠心した。次いで、腹水を、２倍容聞２の冷りん酸緩衝液（０，１Ｍりん酸 ナトリウム、ＰＨ８，２）で希釈した。この希釈腹水を、予めりん酸緩衝液で平 衡化しておいたプロティンＡセファロースの’ｌ　ｄカラムに適用した。

このカラムをりん酸緩衝液４ＱｍＪで洗浄した。モノクローナル抗体をクエン酸 緩衝液（０，１Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ３，５）を用いて充分量のＩＭ）リ ス・バッファー（ｐＨ９，ｏ　）中に溶離し、即座（こｐＨを約７．５に上げた 。溶出液を４℃においてＰ　Ｂ　Ｓ　、　ｐＨ７，４中で透析し、−２０℃で保 存した。

実施例１０（実施例１の方法に加えて）および１４（実施例１の方法、及び上記 のプロティンノル−セファロース法に加えて）では、以下の方法で抗体の精製を 行った。

培養上清１１にｏ、　０５　Ｍ酢酸すｌ−ＩＪウム緩衝液、ｐＨ，４，５（１５ ）と０．１　Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐ）Ｉ　５．０　テｔめ平衡化しておい たＳ　Ｉ）−セファデックス４０ｄを加えた。この（１ｎ１蜀液を七４℃て１時 間撹拌した。ＳＰ−七ファデックスを静置し、上清をデカントした。このＳＰ− セファデックスをカラムに充填し、０．１Ｍ酢ｔＲ緩衝液ＰＩ（５，０（６ｏｍ ｅ）で洗浄し、同一緩衝液＋−１Ｍ塩化ナトリウム６０　ｍｌで溶離した。溶出 液を４℃で撹拌し、飽和硫酸アンモニウム等容量を徐々に加えた。

この懸濁液をさらに３０分間撹拌した後、１０．ＯＯＪ＋で１０分間遠心して沈 殿を集めた。この沈殿を最小容置の冷りん酸／ＥＤＴＡ緩衝液（２０ｍＭ硫酸ナ トリウム、１０　ｍＭ　Ｅ　１）ＴＡ　ｐＨ７，５＋−０，０２％　アジ化ナト リウム）に溶かした。透析し、再溶解した沈殿を３０．０００ｇで１０分間遠心 し、りん酸／Ｅｌ）ＴＡ緩衝液で予め平衡化しておいたＤＥＡＥ　−セルロース の１０ｍｅカラムに適用した。りん酸／ＥＤＴＡ緩衝液でモノクローナル抗体を 溶離した。

実施例１３では、以下の方法に従って抗体を精製した。

培養上ｉ　１１　ｊｃ　１．ＯＭ　ｌ−ＩＪ　ス緩衝ＨｐＨ８，２（Ｌｏｏｍ） を加えた。このトリス緩衝化上清を、０、Ｉ　Ｍ　ｌ−ＩＪス緩衝液ｐＨｓ、　 ２で予め平衡化しておいたプロティンＡ−セファロースのｌ　ｍｅカラムに、流 速ＩＨ１１／分で適用した。

次いで、このカラムを０．１　Ｍ　）　ＩＪス緩衝液４０　ｍｌで洗浄した。ク エン酸緩衝液（０，ＩＭクエン酸ナトリウムｐ）−１３，５）を用い、充分量（ ７）ＩＭ）リス緩衝液ｐＨ９，０中４℃において透析し、−２０℃で保存した。

実施例２および１０の抗体コンジュゲーソヨン工程でハ、ヘンゾキノン法を使用 した。アルカリホスファターゼ（ノクマタイプＶＩ［−Ｔ）２４屑＆を、０．２ ５　Ｍりん酸ナトリウム緩衝液（ＰＩ−（６，０）　２　Ｘ　５００ａ＋ｅに対 して、４℃で透析した。パラ−ベンゾキノン１８■ヲ、温ＡＲｘ　タ／　−ル０ ．６　ｍｌに溶解し、透析したアルカリホスファターゼに加えた。このベンゾキ ノン／アルカリホスファターゼ混合物を、室温の暗所で１時間放置した。

次に、予め０．１５Ｍ塩化ナトリウムで平衡化しておいた、ファーマソアＰＤ− ＩＱ（セファデックスＧ−２５Ｍ）カラムでゲル濾過して、未反応のベンゾキノ ンおよび反応副生成物を除去し、緩衝液を交換した。このようにして得た、ベン ゾキノン活性化したアルカリホスファターゼは、１．５Ｕ９の抗体コンシュ）ｆ 　−’ｙヨンヲ６回行なうのに十分であった。モノクローナル抗体ヲ、０、１５ 　Ｍ塩化ナトリウム２　Ｘ　５００　ｘｒｌに対して、４℃で透析した。透析し た抗体を、ベンゾキノン活性化したアルカリホスファターゼ４〜に加え、直ぢに 十分量の１Ｍ重炭酸すｌ−ＩＪウムを加え、最終濃度Ｑ、ｌ　Ｍにした。

このコンジュゲーンヨン混合物を、４℃の暗所で４８時間放置した。次に、十分 量のＩ　Ｍ　Ｕジンを加え、最終濃度を０．１　Ｍにした。室温の暗所で２時間 放置した後、このコンジュゲート体を、ＰＢＳ→−０，０２％アジ化ナトリウム ２×１０１００Ｏ’に対して、４℃で透析した。

等容量のグリセリンを加えた。コンジュゲ−１・体を、０４２２μｍメンブラン フィルタ−で滅菌濾過し、滅菌した褐色バイアルに入れ、４℃で貯蔵した。

れぞれ、適切な特異性を示した。これらのモノクローナルは他のンユードモナス 属には陰性であり、大腸菌（Ｅ、ｃｏ１ｉ１実施例２．６．７および１３）、サ ルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　、実施例２，６．７および１３）、ンゲラ（ Ｓｈｉｇｅｌｌａ、実施例２，６および７）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ　、 実施例２，３，５．６，７．１０および１２）、プロピデンジ７　（Ｐｒｏｖｉ ｄｅｎｃｉａ　、実施例２，３．６．７゜ＩＯおよび１２）、セラチア（５ｅｒ ｒａｔｉａ　、実施例２゜３，７，１０．１２および１３）、ゴンテロバクタ− （Ｆ、ｎｔｃｒｏｂａｃｃｅｒ　、実施例３）、ヘモフィラス（［（ａｃｍｏｐ ｈｉｌｕｓ　。

実７＋Ｔｌｊ例４）およびクレブノ−ラ（Ｋｌｅｂｓｉｃ！Ｉａ　、実施例６お よび７）１こ対し、ても陰性てあ′つた。実ｙＬ例１４のモノクローナルは、シ ュードモナス・ｒエルギノ″〜ザと交差反応性であったか、他の生物（こ対して は陰に■てあった。

ＩｇＧ２ａ（実施例２　、７　、１０および１３）、１ｇＧ３（実施例３，４． ６および１１）、ＩｇＭ（実施例５および８）、ＩｇＧ２ｂ（実施例９およｒ、 Ｆ　１．４　）およびＩｇＧ］（実施例１ニジ）等のサブクラスが見出さｔｔた 。

シュードモナス属の各種と広く交叉反応をするモノクローナル抗体を調製するｌ こ当たり、実施例１（！：同じ方法を使用ｊまた。

本発明方法を用いる試験方法は、以下の利点によって現在の試験法よりも優れて いる：（１）精度が高い；（１１）即日、１．２時間以内に結果が得られる；　 ｌｊｉ＋）検査室での操作を管理するために必要な熟練した研究者の数を減少さ せる４とができ、労働コストが下がる；（ＩＶ、ｌ試験（こ関して使用される労 働時間および空間を減少さぜるζ−とがてき、総経費を下けることになる；（Ｖ ）迅速かつ正確ｆＹ診断に基ついたより良い治療を行うことができる。

不発１す」６ま、特定の好ま１−い態様についで述へたものであるか、本発明の ；匝囲をζ、こに卒りた特定の形に限定するものではなく、むしろ添付の特許請 求の範囲に定義された本発明の思想および範囲に含まれる変法改良法および均等 法を邑含するものである。。

国際Ｕ４丘報告 Ｍ１ｍｍｌｌ＠ｍ　ＡｌＮ１ｅ□、１．、。ＰＣＴ／ＧＢ　ａｓ１００４０９＄ ＡＩｊｒｖ１．１＋０１−＾峠１−ζ峠いトｃｏＰｃＴ／ＧＢ８Ｓ１０ｏ４ｏ９ 二二ＮＥ：／Ｔｏ：二Ｅ三Ｔｊ、ｌＴ二ｐ、ｐ１．ニア：ｑＢ、４二Ｌ３三；Ｈ ｑＨＲＥＰこ只τｃｘ

Claims (54)

【特許請求の範囲】
1. １．シユードモナスの抗原またはシユードモナス種に特異的なモノクローナル抗 体。
2. ２．シユードモナス・セパシアの抗原または種に特異的な第１項に記載の抗体。
3. ３．シユードモナス・フルオレツセンスの抗原または種に特異的な第１項に記載 の抗体。
4. ４．シユードモナス・スタツツエリの抗原または種に特異的な第１項に記載の抗 体。
5. ５．シユードモナス・マルトフイリアの抗原または種に特異的な第１項に記載の 抗体。
6. ６．シユードモナス・アエルギノーザの抗原または種に特異的な第１項に記載の 抗体。
7. ７．シユードモナス・アエルギノーザ１，２，３，４，５，６，７，８，９，１ ０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７または１８の抗原または種に特 異的な第１項に記載の抗体。
8. ８．シユードモナスによつて産生される外毒素に特異的な第１項に記載の抗体。
9. ９．シユードモナス・アエルギノーザによつて産生される外毒素Ａに特異的な第 ８項に記載の抗体。
10. １０．シユードモナス・アエルギノーザによつて産生される外酵素に特異的な第 １項に記載の抗体。
11. １１．シユードモナス属の全ての種の抗原と広く交叉反応するモノクローナル抗 体。
12. １２．実質的に第１項〜第１１項のモノクローナル抗体と適当な標識剤からなる 標識されたモノクローナル抗体。
13. １３．標識剤が放射活性同位元素、酵素、螢光性化合物、生物的発光性化合物、 化学的発光性化合物、または強磁性の原子または粒子から選ばれる群の１つであ る第１２項に記載の標識されたモノクローナル抗体。
14. １４．酵素がモノクローナル抗体とコンジユゲートし得る酵素であり、かつ、酵 素一結合免疫検定法に使用し得るものである第１３項に記載の標識されたモノク ローナル抗体。
15. １５．該酵素がアルカリホスフアターゼ、グルコースオキシダーゼ、ガラクトシ ダーゼまたはペルオキシダーゼである第１４項に記載の標識されたモノクローナ ル抗体。
16. １６．該標識剤が免疫一螢光免疫検定法、螢光免疫検定法、酵素螢光免疫検定、 螢光分極免疫検定、光子計数免疫検定などに使用し得る螢光性化合物またはプロ ーブである第１３項に記載の標識されたモノクローナル抗体。
17. １７．該螢光性化合物またはプローブがフルオレセインである第１６項に記載の 標識されたモノクローナル抗体。
18. １８．該標識剤が発光免疫検定または酵素一結合発光免疫検定に使用し得る化学 的発光性化合物である第１３項に記載の標識されたモノクローナル抗体。
19. １９．化学的発光性化合物がルミノールまたはルミノール誘導体である第１８項 に記載の標識されたモノクローナル抗体。
20. ２０．該標識剤が適当な生物学的発光免疫検定に使用し得る生物的発光性化合物 である第１３項に記載の標識されたモノクローナル抗体。
21. ２１．生物的発光性化合物がルシフエラーゼまたはルシフエラーゼ誘導体である 第２０項に記載の標識されたモノクローナル抗体。
22. ２２．検体の少なくとも１部を、第１２項に記載の標識されたモノクローナル抗 体と、該標識剤に適した免疫検定法で接触させることからなる、該検体中のシユ ードモナス抗原の存在を診断する方法。
23. ２３．適当に標識された免疫検定法が、免疫一螢光免疫検定、螢光免疫検定、免 疫一電子顕微鏡法、放射性検定法、酵素一結合免疫検定法、螢光分極法、光子一 計数生物学的発光法または化学的発光免疫検定法から選ばれる第２２項に記載の 方法。
24. ２４．該標識剤が、酵素一結合免疫検定法に使用し得る酵素である第２３項に記 載の方法。
25. ２５．該酵素がアルカリホスフアターゼ、グルコースオキシダーゼ、ガラクトシ ダーゼまたはペルオキシダーゼから選ばれる第２４項記載の方法。
26. ２６．該標識剤が免疫一螢光免疫検定法、螢光免疫検定法、酵素螢光免疫検定、 螢光分極免疫検定、光子一計数免疫検定などに使用し得る螢光性化合物またはプ ローブである第２３項に記載の方法。
27. ２７．該螢光性化合物またはプローブがフルオレセインである第２６項に記載の 方法。
28. ２８．該標識剤が発光免疫検定または酵素一結合発光免疫検定に使用し得る化学 的発光性化合物である第２３項に記載の方法。
29. ２９．該化学的発光性化合物がルミノールまたはルミノール誘導体である第２８ 項に記載の方法。
30. ３０．該標識剤が生物学的発光免疫検定または酵素一結合生物学的免疫検定に使 用し得る生物的発光性化合物である第２３項に記載の方法。
31. ３１．該生物的発光性化合物がルシフエラーゼまたはルシフエラーゼ誘導体であ る第３０項に記載の方法。
32. ３２．第１項〜第１１項の１種またはそれ以上の標識されたモノクローナル抗体 と薬学的に許容し得る担体または希釈剤を含有する治療用組成物。
33. ３３．第１２項の１種またはそれ以上の標識されたモノクローナル抗体と薬学的 に許容し得る担体または希釈剤を含有する治療用組成物。
34. ３４．第１項〜第１１項のモノクローナル抗体の有効量を投与することからなる シユードモナス感染症の治療方法。
35. ３５．第１項〜第１１項の少なくとも１種のモノクローナル抗体を含有する、診 断用検体中のシユードモナスの抗原またはシユードモナス種の存在を診断するた めのキツト。
36. ３６．該少なくとも１種の抗体が標識されている第３５項記載のキツト。
37. ３７．該少なくとも１種の抗体が螢光性化合物で標識されている第３６項記載の キツト。
38. ３８．該少なくとも１種のモノクローナル抗体が酵素で標識されている第３６項 記載のキツト。
39. ３９．該少なくとも１種のモノクローナル抗体が放射活性同位元素、化学的発光 性化合物、生物的発光性化合物、強磁性の原子または粒子からなる群の１つで標 識されている第３６項記載のキツト。
40. ４０．対照として少なくとも１種の既知のシユードモナス抗原を更に含有してな る第３６、第３７、第３８および第３９項に記載のキツト。
41. ４１．シユードモナス・セパシア、シユードモナス・フルオレツセンス、シユー ドモナス・スタツツエリ、シユードモナス・マルトフイリアおよびシユードモナ ス・アエルギノーザ１〜１８（両端を含む）の既知の抗原を含有している第３６ 、第３７、第３８、第３９および第４０項に記載のキツト。
42. ４２．シユードモナス・セパシアを含有している第３６、第３７、第３８、第３ ９および第４０項に記載のキツト。
43. ４３．シユードモナス・フルオレツセンスの抗原を含有している第３６、第３７ 、第３８、第３９および第４０項に記載のキツト。
44. ４４．シユードモナス・スタツツエリの抗原を含有している第３６、第３７、第 ３８、第３９および第４０項に記載のキツト。
45. ４５．シユードモナス・マルトフイリアの抗原を含有している第３６、第３７、 第３８、第３９および第４０項に記載のキツト。
46. ４６．シユードモナス・アエルギノーザの抗原を含有している第３６、第３７、 第３８、第３９および第４０項に記載のキツト。
47. ４７．シユードモナス・アエルギノーザ１〜１８（両端を含む）の抗原を含む第 ３６、第３７、第３８、第３９および第４０項に記載のキツト。
48. ４８．シユードモナスの外毒素を含有している第３６、第３７、第３８、第３９ および第４０項に記載のキツト。
49. ４９．外毒素がシユードモナス・アエルギノーザから産生される外毒素Ａである 第４８項に記載のキツト。
50. ５０．外毒素がシユードモナス・アエルギノーザから産生される外酵素である第 ４８項に記載のキツト。
51. ５１．第１項〜第１１項の少なくとも１種のモノクローナル抗体と対照とを含ん でなる、診断用検体中のシユードモナスの抗原またはシユードモナス種の存在を 診断するためのキツト。
52. ５２．該少なくとも１種の抗原が標識されており、該対照が少なくとも１種の既 知のシユードモナス抗原である第５１項に記載のキツト。
53. ５３．第１項〜第１１項の少なくとも１種のモノクローナル抗体を含んでなる、 グラム陰性細菌感染の存在を診断するためのキツト。
54. ５４．該少なくとも１種のモノクローナル抗体が標識されている第５３項に記載 のキツト。