JPS61502631A - モノクロ−ナル抗体およびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 モノクローナル抗体およびその用途 本発明は、モノクローナル抗体およびその用途に関する。

発明の背景 セラティア属（Ｓ　ｅｒｒａｔｉａ）は、チンセル・マイクロバイオロジー（Ｚ ｉｎｓｓｅｒ　Ｍ　ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、１７版、７３０−１に記載され ている。かって、セラティア属の微生物は無害な非病原菌であると考えられてお り、病院内の気流パターンを調べるのに使用されたことがある。しかしこれらの 微生物は、院内感染の主要な原因物質として急速に浮かび上がって来つつある。

はとんど全てのセラティア感染症が基礎疾徂と関係しており、患者の生理学的パ ターン、免疫抑制治療、または機械的操作を変えている。自然界に於いては、セ ラティアは土壌、水、植物および動物に存在している。この微生物は昆虫から分 離されることが多く、ある種の昆虫の病気の原因となることもある。

セラティア種は何種類かに分類されており、一般によく知られているセラティア には、セラティア−マルセッセンス（Ｓ　ｅｒｒａｔｉａ　Ｍａｒｃｅｓｃｅｎ ｓ）、セラティア・リクエファンエンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｌ１ｑｕｅｆａｃ ｉｅｎｓ）およびセラティア・ルビダニ（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｒｕｂｉｄａｅ） が含まれる。抗原−抗体反応は極めて特異的であるので、これにより、その他の 表現型の基準に基づいて区別することができない上記した様な細菌種の株間の違 いを認識することができた。

Ｓ　マルセッセンスは、多くのセラティア属の内で最らよく分離される株であり 、肺炎、敗血症、尿路感染症および創傷感染症を含む種々の院内流行病に関係し ている。

セラティアは血流感染病であるグラム陰性性敗血症を引き起すことが知られてい る。これは現代の医療センターで見られる主要な感染症疾Ｗの１つである。これ は一過性で自己限定性であることもあるが、重篤なグラム陰性性の敗血症は緊急 医療を必要とするものである。

現在、グラム陰性性敗血症の検査は、血液および尿の培養を作成したり、場合に より、その他の手段によって行われている。血液培養検査は、費用がかかるばか りでなく、煩わしいものである。この検査は、結果が出るまで１日かかり、数日 かかることも多い。ヒトの血液は性質が複雑であり、多数の検査試薬と非特異的 に反応する傾向があるので熟練した検査技術が必要である。

現在、尿路感染症に於いて、−次スクリーニングとして微生物の存在を調べる顕 微鏡検査が行われている。この顕微鏡検査は、グラム陰性菌どうしを区別するこ とはできない。従って、二次検査として、尿試料から分離した微生物を同定する ために尿培養を行なう。診断が遅れ、治療の開始か遅れると、重篤な合併症を引 き起こすことになりかねない。

従って、尿路感染症またはグラム陰性性敗血症において、セラティア属を極めて 正確に検出する現在の方法は、高価につく多数の熟練技術者と労働時間を費し、 結果を出すのに１日、あるいは数日もかかることが多いという点で満足できるも のではない。

モノクローナル抗体の製造は、ケーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）およびミルシュタイン （Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）によって初めて報告された、今ではよく知られている手段 である［ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｅ　ｕｒＪ、Ｉｍｍ ｕｎｏｌ、　）　６（１９７５）２９２　］。ハハイブリドマを作成する一般的 な技術、およびその結果得られるモノクローナル抗体についてはよく知られてい るが、特定の抗原に対する特異的モノクローナル抗体を製造することは、主とし て特定のハイブリドーマを作成するのに必要なバするかどうかを正確に、かつ迅 速に診断するために使用される新規なモノクローナル抗体を提供するものである 。

簡潔に述べると、本発明はセラティア属の抗原、特にセラティア・マルセッセン ス、セラティア・リクエファシエンスおよびセラティア・ルビダニの抗原に特異 的なモノクローナル抗体、およびセラティア属に属するいずれかの菌種の抗原と 広く交叉反応するモノクローナル抗体に関するものである。

本発明はまた、セラティア属、あるいはその特定の菌種、の上記の抗原の１：） に対するモノクローナル抗体であって、適当な標識（ラベル）と結合した、セラ ティア属の抗原の存在を診断するために使用される標識されたモノクローナル抗 体を提供するものである。この標識は、例えば放射性同位元素、酵素、蛍光性化 合物、化学的発光性化合物、生物的発光性化合物、強磁性の原子または粒子など とすることができる。

本発明はまた、適当な免疫検定法により、標識されたモノクローナル抗体を検体 と接触させることからなる、検体中のセラティア属抗原または微生物の存在を診 断する方法を提供するものである。

更に、本発明はセラティア属の抗原に対するモノクローナル抗体と担体または希 釈剤を含有している治療用組成物、およびある種のセラティア属の抗原に対する 少なくとも１種の標識されたモノクローナル抗体を含有しているキットを提供す るものである。−詳細な説明 本発明に係る抗体は、特定のセラティア属の抗原で免疫した哺乳動物の脛臓細胞 を、適当な骨髄腫セルライン、好ましくはＮ５Ｏ（非クローン化）、Ｐ３Ｎ５１ −Ａｇ　４／Ｉまた＋；ｔｓｐ　２１０Ａｇ　１４と融合サセることにより製造 される。得られた生産物を標準的なＨＡ、　Ｔ　（ヒボキサンチン、アミノプテ リンおよびチミジン）培地中で培養する。特定のモノクローナル抗体をスクリー ニングテストするには、以下に記述する免疫検定技術をＴ＋１１用する。

免疫される膵臓細胞は、霊長動物、ヒト、げつ肉類（例えばマウス、ラット、ウ サギなど）、牛′、羊、犬などのものであってよいが、本発明では、マウスのも のについて述べることにする。まず、選択した特定のセラティア抗原をマウスに 注射し、通常約１１週間かけて免疫する。常套の検定法により、マウスが抗原に 対して十分な抗体を産生じたことがわかったら、適当なセラティア抗原をブース ター注射し、マウスを殺して免疫された膵臓を摘出する。次いで、この免疫され た膵臓細胞と適当な骨髄腫セルラインを使って融合を行なうことができる。

特定のセラティア抗原が存在すると正の反応を示す抗体を産生ずる融合細胞を取 り出し、標準的な方法でクローンする。クローンから得たモノクローナル抗体を 標準的な抗原に対して試験し、特定のセラティア抗原に対する特異性をを有する か否かを調べる。特定のセラティア抗原またはセラティア種に対して特異的であ るモノクローナル抗体を選択し、適当な標識と結合させる。

標識のための、そしてその後の大量生産に必要な十分量の抗体は、パッチ式また は連続的組織培養、あるいはマウスの様な哺乳動物でのインビボでの培養などの 既知の方法で生産される。

モノクローナル抗体は、先に例示した様な各種の標識剤で標識することができろ 。本発明では、酵素で標識したモノクローナル抗体を使用する例について述べる 。標識剤として使用される酵素の例としては、アルカリホスファターゼ、グルコ ースオキシダーゼ、ガラクトノダーゼ、ペルオキシダーゼおよびウレアーゼなど が挙げられる。

酵素との結合は、スタフィロコブカル・プロディンＡ法、グルタルアルデヒド法 、ベンゾキノン法または過ヨウ素酸法などの既知の方法で行なうことができる。

標識されたモノクローナル抗体ができたら、通常の各種の免疫検定法の１つを使 って試験を行なう。選択すべき特定の方法は、モノクローナル抗体および選択し た標識により異なる。現在のところ、廉価であること、試薬が安定であり、安全 であり、感度の良いこと、および操作が簡単であることから酵素免疫検定が好ま しい。１つの例は酵素−結合免疫吸着検定（Ｅ　Ｉ　Ａ）である。ＥＩＡは、デ ザインが放射分析と類似している固相検定法である。しかしＥＴＡでは、免疫グ ロブリンマーカーとして放射活性同位元素の代りに、酵素を使用する。

蛍光免疫検定は、抗原または抗体を蛍光プローブで標識することに基づいている 。標識されていない抗原および特異抗体を、蛍光で標識した同一の抗原と混合す る。標識された抗原と標識されていない抗原の両者が抗体の結合サイトを競い合 う。抗体に結合した標識化抗原の量は、非標識化抗原の濃度に依存し、従って、 その濃度の測定値を表わす。この特定のタイプの蛍光免疫検定の例には、酵素− 結合蛍光免疫検定の様な不均一系、基質−標識化蛍光免疫検定の様な均−系があ る。最も適切な蛍光プローブであって、最も広く使用されているものの１つはフ ルオレセインである。フルオレセインは、散乱がかなり干渉されやすいことがあ るが、特定の検定に使用されるプローブの最適の蛍光メーターを使用することに より感度を上げることができ、散乱の効果を最小限にすることができる。

蛍光分極（ボーラリゼーション）においては、標識された試料が分極光により励 起するので、放射光の分極の程度を測定する。抗原が抗体に結合すると、そのロ ーテーションが低下し、分極の程度が増大する。しかし現時点では、その感度は マイクロモル／リットルの範囲に限定されており、生物学的試料中の抗原につい ては、上限がナノモル／リットルの範囲である。

発光は、電子が高エネルギー状態から基底状態に転移することにより、原子や分 子によって光が放射されることである。化学的発光および生物学的発光の両者に 於いて、化学反応の自由エネルギーにより、電子励起状態の中間体や生成物を生 成するのに必要なエネルギーが与えられる。

次いで衰微して基底状株に戻る時に光が放射される。生物学的発光は、生物系に みられる化学的発光の特別の形態に与えられた名称であり、ここでは、触媒作用 を有するタンパク質または酵素、例えばルシフェラーゼが発光反応の効率を増大 させる。最もよく知られた化学的発光物質はルミノールである。

本発明の１つの目的は、特定のセラティア感染またはセラティア種に対する１種 またはそれ以上のモノクローナル抗体、および薬理学的に許容し得る担体または 希釈剤を含宵する治療用組成物を提供するものである。この様な組成物は、なん らかのセラティア感染に苦しんでいるヒトおよび／または動物を治療するのに使 用することができ、治療に有効な量が使用される。この量は、処置を受けるヒト および感染の程度に応じて著しく変わる。

各種検体中に抗原、抗原類またはセラティア種が存在するかどうかを診断するた めに使用される診断用キットに、１種またはそれ以上のモノクローナル抗体を組 み合せて入れてもよい。セラティア属のみを同定し得る広い交叉反応性のモノク ローナル抗体を使ってもよく、また、池の細菌属あるいはセラティア種および／ または他の細菌を同定することができる抗体を含んでいるキットの一部として用 いることもできる。

過去に於いては、検体の望ましくない交叉反応（例えば尿と抗血清）のために、 迅速なキットを開発することは困難であった。モノクロ−カル抗体を使用するこ とによって、この様な問題が解決され、診断用の非常に特異的な、そして迅速な 試験ができる様になった。例えば、この様なキットは尿中のグラム陰性細菌を迅 速に検査するために、病理検査室で使用されることらあろうし、外来患者にら使 用される。

また、セラティアまたはその他のグラム陰性性敗血症の診断のために、小者から 採取した血液試料中にセラティアの抗原および／またはセラティア種、およびそ の他のグラム陰性細菌を同定するために、この様な抗原や微生物に対する、コン ジュゲートあるいは標識化したモノクローナル抗体をキットにして使用すること ができる。モノクローナル検査法は、従来の検査法より正確さが高いという点で 、従来法より進んだ方法である。「当日」に結果が出るので患者にとって好都合 であり、早い、正確な診断の結果、治療を改善でき、かっ、検査を管理するのに 必要な労働時間や人件費を減少させる。

このキットは単独で販売されてもよいし、あるいはまた、セラティアの菌種や血 清型を検出するために、関連検査室に売り込まれる、相客性のある免疫検定試薬 類の包括的な商品の１部に含ませてもよい。

本発明の好ましい態様の１つは、特定のセラティア抗原またはセラティア種に対 する少なくとも１種の標識されたモノクローナル抗体と、適当な染色剤、対比染 色剤または試薬を含んでいる診断用キットである。その他のキットとしては、セ ラティア抗原の少なくとも１種の対照試料および／または特定の試料中の特定の セラティア微生物の存在を検出する交叉反応性の標識されたモノクローナル抗体 を含んでいるキットがある。

セラティア属の抗原の存在を検出するモノクローナル診断法は、水源、食物源お よび食品加工操作を定期的に検査するのにら使うことができる。

この様に、本発明は、標準的な抗原の存在を調べるための標識したモノクローナ ル抗体の使用について記載しているが、本発明は、尿、血液、糞便、水およびミ ルクなどの検体が特定のセラティア抗原を含んでいるかどうかを調べることによ り、抗原の存在を診断するという多くの応用面を持っている。更に詳しくいうと 、本発明は公衆の衛生および安全の診断補助に利用することができ、水や食品の 様な検体の汚染の存無について検査することができる。

以下に実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、これらの実施例は例示を 目的とするものであって、本発明を制限するためのものではない。

本発明のモノクローナル抗体は、ケーラーとミルンユタイン（萌掲）の方法に従 って調製した。

実施例に於いて、 ＡＰＩ＝アナリテイカル・プロファイル・インデックス［エールスト（Ａ　ｙｅ ｒｓｔ）研究所リファレンス］ＤＭＥＭ＝デュルベッコの改良イーグル培地ＥＣ ９＝ウシ胎仔血清 ％Ｔ＝Ｉｃｍ光路長で測定したワクチン濃度ＰＢＳ＝燐酸緩衝生理食塩水 セラティア・マルセッセンスをナショナル・コレクション・オプ・タイプ・カル チャーから得（ＮＣＴＣ受は入れ番号１０２１＋）、標準的な標準タイプ血清に 対して検査してそのタイプを確認した。より詳しく述べると、親液物質（リオフ ァイル）から抗原を除き、血液寒天上で増殖させ、適当な抗血清を用いて、通常 の生化学試験（ＡＰＩ’）および凝集試験により検査し、その同一性および純度 を確認した。次いで細胞をＤＭＥＭに移し、増殖させ、収穫して抗原供給源とし て使用した。微生物を６０℃で３０分間加熱し、次いでホルモール食塩水に入れ て遠心をくり返すことにより洗浄し、ホルモール食塩水に再懸濁した。

旦−藝艷Δ灸袋 調製した抗原を６匹のＢａ１ｂ／ｃマウスに注射した。上記の如く調製し、煮沸 して死滅させたセラティア・マルセッセンスを、１週間に１回、３週間腹腔内に 注射した（８０％Ｔワクチン０．０５１）（合計６週間）。

最後の注射から約６日月にマウスから採血し、血清を検査して抗体を検定した。

この血清の力価測定に使用した常套の方法は、酵素−結合免疫吸着検定法であっ た。このやり方でマウスが抗体産生を示したので（通常、正の力価が少なくとも １０．０００）、融合供与動物として１匹を選び、膵臓切除の３８航に静脈から ブースター注射した（８０％ワクチン０．０２ｍ、２）。

Ｃ０細胞融合 選択された供与マウスを殺し、７０％のエチルアルコールに浸漬して表面滅菌し た。次いで、膵臓を摘出し、３０％のＦｃｓを加えたＤＭＥＭ約２．５　ｍｆｌ に浸漬した。次ぎに、全ての細胞が膜から離れるまでＬＵＸホモジナイズ管で膵 臓を穏やかにホモジナイズした後、細胞を３％ＦＣ９ＤＭＥＭ５　＋＋＋ｊ２． 中で洗浄した。次いで、細胞残骸を沈殿させて、膵臓細胞懸濁液を１０ｍ４の遠 沈管に入れた。次ぎにこの残骸を３％ＦＣＳ　ＤＭＥＭ５　ｌｌ１ｊｌ中で再び 洗浄シタ。ソノ後、３％ＦＣ９ＤＭＥＭに入れて懸濁液を５０ａ＋１にした。

使用した骨髄腫セルラインは、ＭＲＣラボラトリ−・オブ・モレキュラー・バイ オロジー（ＭＲＣＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌ ｏｇｙ）、ケンブリッジ、イングランドから入手したＮ５Ｏ（非クローン化）で ある。

骨髄腫細胞は、対数増殖期にあり、速く分裂していたものである。各セルライン を、３％ＦＣ３を含有している組織培養培地ＤＭＥＭで洗浄した。

次いで、相当量の骨髄腫細胞を取り出すと同時に膵臓細胞を取り出しく室温、６ ００ｇで７分間）、得られた各ベレットを個別に３％Ｆｃｓ　ＤＭＥＭｌ　Ｏ＋ 児に再＠濁した。骨髄腫細胞を数えるために懸濁液０１ｍ１．をＩ　ｍｆｌに希 釈し、位相差顕微鏡の付いた血球計算器を使用した。

禅味細胞を数えるために、懸箭液０．１ｍｊｌをメチルバイオレット−クエン酸 溶液でＩ　ｍＪｌに希釈し、血球計算器および光学顕微鏡を使用して染色されて いる細胞核を数えた。

次ぎに、禅味細胞１０”個を骨髄腫細胞６Ｘ１０’個に混合し、この混合物を、 グルコースに富む血清不含のＤＭＥＭで洗浄して遠心し、液体を全て除去した。

得られた細胞ペレットを３７℃の水浴に入れた。１分間で、５０％（ｗ／　ｖ） のヘベス（Ｈｅｐｅｓ）含有生理的食塩水中ポリエチレングリコールＩ　５００ （ＰＥＧ）溶液（ｐＨ約７．５）１　ｍｌを加え、この混合物を約１．５分間穏 やかに攪拌する。次いで、血清不含の組織培養培地ＤＭＥＭＩＯＪを徐々に加え 、次に、この培養培地を加えて５０ｍａｌにし、遠心して上清を全て除去した後 、細胞ペレットを１８重量％のＦＣ９を含有しているＤＭＥＭＩ　Ｏｍ４に再懸 濁した。

混合物１０μ児を標準マルチウェル組織培養プレートの４８０ウエルそれぞれに 入れた。各ウェルは、標準ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよび チミジン）１．０　ｍａｌおよび５Ｘ１０’マクロフアージ／ウエルの濃度でＢ ａ児ｂりｃマクロファージの支持細胞層を含んでいる。

ウェルを静置し、湿度的１００％、９％のｃｏ、−空気中、３７℃で培養した。

ウェルは、５〜ｌＯ日後に通常の倒立顕微鏡法を使用して増殖を調べた。阻害Ｈ ＡＴ培地で増殖が起こっているウェルにおいて、下記の通常の酵素免疫検定スク リーニング法を使用して特定のモノクロナール抗体に対するスクリーニングテス トを行なった。融合の約１０〜１４日後、少なくとも１個のウェルに抗原に対す る十分な抗体が産生された。

Ｄ、クローニング 抗原に対する抗体を産生じたウェルから細胞を取り出し、標準寒天法（２回）お よび制限希釈法を使用してクローン化した。

寒天法では、等容量の２倍強度のＤＭＥＭ、および添加剤を含んでいる滅菌した 再蒸留水中の１，２％寒天で新たに調製した保存溶液を４５℃に維持した。次ぎ に、この溶液（１０ｍＬ）をＬｏａｍのペトリ皿に入れて基底層を形成させた。

等容量の寒天および１８％のＦＣ９−ＤＭＥＭに入れた細胞を基底層の上に平ら に積層した。細胞を７〜９％のＣＯｌ、９．５％のＲＨ下、３７℃で約ｌＯ日間 増殖させた。生育し得る分離したコロニーを寒天表面から取って、１８％のＦＣ ９−ＤＭＥＭを入れた９６−ウェル微量滴定トレイの内６０ウェルに入れた。更 に増殖させた後、上清を、特異抗体について、標準酵素免疫吸着検定によって検 定した。

制限希釈法では、１８％のＦＣ−ＤＭＥＭ＋Ｂａ、２ｂ／ｃのマウスマクロファ ージで細胞懸濁液を希釈して、９６−ウェル微量滴定プレートに１細胞／ウエル および１／２細胞／ウエルとなる様にした。プレートを、半融合になるまで９５ ％ＲＨ，７〜９％ＣＯ，下、３７℃で７〜１４日間インキュベートした。次いで 、上滑を特異抗体に対して標準酵素免疫吸着検定法で検定した。

Ｅ、モノクローナルの選別 クローンからのモノクローナル抗体を、免疫に於いて調製された抗原への結合、 およびセラティア種や、別の抗原を有している類似した属の試験バッテリーにお ける特異性について標準的な方法でスクリーニングした。具体的には、〇−血清 型微生物の代表的な選択菌、即ちプロテウス（Ｐ　ｒｏｔｅｕｓ）およびエンテ ロバクタ−（Ｅ　ｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）を含んでいる微量滴定プレートのグ リッドを調製し、煮沸した後、母細胞の〇−血清型グループの特異性を調べるた めのテンプレートとじて使用した。前記のＥＩＡ免疫検定法を使用した。セラテ ィア・マルセッセンスＮＣＴＣＩ０２１１株およびＮＣＴＣ２８４７株の２株に ついて反応があった。

Ｆ、抗体産生 モノクローナル抗体−産生セルラインの細胞をパッチ式組織培養で増殖させた。

対数期の中間相で増殖させるために１０％のＦＣ９−ＤＭＥＭをＩｉ、容量まで 使用し、次いで、最大量の抗体が産生される様に培養物を過増殖させた。次ぎに 、培養物を＋　２００９で約１０分間遠心して細胞を除いた後、抗体に富んだ上 清を集めた。

この液体を、抗体の存在および濃度を調べるために前記のように滴定した後、精 製した。精製は、培養上清ｌｆｌに１．０Ｍ）リス緩衝液（ｐＨ８、２）１００ 　ｍｆｌを加えることからなるプロティンＡ−セファロース法で、上清を使用す ることによって行なちた。トリスで緩衝された上滑を、予め０．１Ｍトリス緩衝 液（ｐＨ８，２）で平衡化された１ＩＩｌｉ、のプロティンＡ−セファロースカ ラムに１　ｍＪｌ１分の流速で流した。次いで、カラムを０．１Ｍトリス緩衝液 ４０ｍｆｌで洗浄した。モノクローナル抗体をクエン酸緩衝液（０，１Ｍクエン 酸ナトリウム、ｐＨ３，５）で溶離して十分量の１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ９，０ ）に入れ、直ちにＩ）Ｈを約７゜゛　５に上げた。この溶出液を４℃でＰＢＳ（ ＋）Ｈ７，４）で透析した後、−２０℃で保存した。

Ｇ、酵素−モノクローナル結合 次ぎに、前記のようにして調製およびスクリーンされたセラティア・マルセッセ ンス抗原に対して特異的なモノクローナル抗体を、適当な酵素、即ちこの場合は 高度に精製されたアルカリフォスファターゼに結合させる。これは、ペンゾキノ ンコンジュゲーション法によって行なう。

アルカリ７オス７７ターゼ（シグマタイプＶｌｌ　−Ｔ　（Ｓ　ｉｇｍａ　Ｔ　 ｙｐｅ　Ｍｌ　１−Ｔ））２４ｍｇを、０．２５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐ Ｈ６，０）２ｘ５００ｍ、Ｍに対して＋４℃で透析した。パラ−ベンゾキノン１ ８ｍｇを６ＡＡＲエタノール０．６Ｊ、に溶解し、透析されたアルカリフォスフ ァターゼに加えた。このベンゾキノン／アルカリフォスファターゼ混合物を暗所 、室温で１時間放置した。その後、予めＯ，１５Ｍの塩化ナトリウムで平衡化さ れたファルマンア（Ｐ　ｈａｒｍａｃｉａ）　Ｐ　Ｄ　−１０（セファデックス Ｇ−２５Ｍ）カラムでゲルシ濾過することによって未反応のベンゾキノンおよび 反応副生成物を除去し、緩衝液を交換した。このようにして調製されたベンゾキ ノン−活性化アルカリフォスファターゼは、抗体１５ｍｇのコンジュゲートを６ 回行なうのに十分である。モノクローナル抗体を、０．１５Ｍ塩化ナトリウム２ Ｘ５００ｍ、Ｊに対して＋４℃で透析した。透析された抗体をベンゾキノン−活 性化アルカリフォスファターゼ８Ｂに加え、直ちに十分量の１Ｍ重炭酸ナトリウ ムを加えて終濃度０゜ＩＭにした。このコンノユゲーノヨン混合物を暗所、＋４ ℃で４８時間放置した。次ぎに、十分量のＩＭリシノを加えて終濃度０．１Ｍに した。

暗所、室温で２時間放置後、このコンジュゲートをＰＢＳ＋０．０２％アジ化ナ トリウム２ＸＩ０００ｍｆ！、に対して＋４℃で透析した。等容量のグリセロー ルを加えた。コンジュゲートを０．２２μｍメンプラン・フィルターで滅菌デ過 し、滅菌されたコハク色のバイヤルに入れ、＋４℃で保存した。

Ｈ，モノクローナル抗体コンジュゲート試験試験には酵素免疫検定法を使用した 。この検定法は、標準ポリビニルクロリド微量滴定トレーのウェルを抗原で被覆 した後、モノクローナル抗体酵素コンジュゲートを加え、次いで、酵素基質、パ ラ−ニトロフェノールフォスフェートを加えることからなる。

この試験で、このモノクローナル抗体は、セラティア・マルセッセンス抗原に対 して特異的であることがわかった。このモノクローナル抗体を試験した結果、１ ｇＧ３クラスに属することもわかった。

必要であれば、抗体が抗原に結合する特異的ｄエビトビツク部位ら調べることが できる。尿、血液、糞便、水または乳のような診断用検体が抗原を含んでいるか どうかを調べるために、同じ酵素免疫検定法を使用することもできる。この場合 、まず抗体をプレートに結合させる。

実施例２ 実施例１の方法に従って、しかし別法で動物を免疫し、クローニングに於いて希 釈法を使わず、別法で抗体の産生および抗体の精製を行なうことにより、ＩｇＧ ２ａクラスのモノクローナル抗体を得た。モノクローナル抗体の選別に於ける被 検微生物はエンテロバクタ−（Ｅ　ｎｔａｒｏｂａｃｔｏｒ）およびプロテウス （Ｐ　ｒｏｔｅｕｓ）であった。セラティア・マルセブセンスの２株、セラティ ア−ｖリノルブラ（Ｓ　ｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｉｎｏｒｕｂｒａ）の１株およ びエルビニア・ヘルビコーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ　ｈｅｒｂｉｃｏｌａ）［エンテ ロバクタ−・アグロメランス（Ｅ　ｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ａｇｇｌｏｍｅｒ ａｎｓ）］が反応した。

免疫においては、Ｂａ１ｂ／ｃマウスに調製した抗原（８０％Ｔワクチン、０． ０５１１＋のを腹腔内にワクチン投与し、６遇間後に静脈内へブースター投与し た。マウスが、免疫用抗原に対して適当な高力価を示した後、融合のための胛臓 細胞源として使用した。

抗体の生産に於いては、Ｂａ１ｂ／ｃマウスを、少なくとも７日間、プリスタン で処置（プライム）し、モノクローナル抗体産生セルラインＩＯ細胞を注射した 。マウスが体液でふくれ上がり、しかしまだ生きている間に腹水症体液をとり出 した。この液体を１２００９で約ＩＯ分間遠心分離し、細胞を捨て、抗体に富ん だ腹水液を一２０℃で貯蔵した。

抗体の精製は、プロティンＡ−セファロース法で行なった。腹水液をガラスウー ルで濾過し、３０．００Ｏｒで１０分間遠心した。この腹水液を、その２倍容量 の冷リン酸緩衝液（０，１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ８゜２）で希釈した。この 希釈した腹水液を、リン酸緩衝液で予め平衡化しておいた２、ｘＱのプロティン Ａ−セファロースカラムに入れ、カラムをリン酸緩衝液４０１１２で洗浄した。

モノクローナル抗体を、十分量のＩＭ）リス緩衝液（ｐＨ９，０）中へ、クエン 酸緩衝液（０，１Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ３，５）で溶出し、直ちにＩＩＩ Ｈを約７．５に上げる様にした。

溶出液をリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７，４）中、４℃で透析し、−２０℃で保存し た。

実施例３お上び４ 実施例１と同じ方法により、セラティア・リクエファシエンス、ＮＣＴＣ１０８ ６１およびセラティア・マリノルブラ、ＮＣＴＣ１０９１２の抗原に特異的なモ ノクローナル抗体を調製した。

実施例３の動物免疫ステップに於いては、毎週１回、腹腔内注射を３週間行ない 、次いで週１回静脈注射を３週間行ない、更に１か月後に１回静脈注射し、４か 月後に１回静脈注射した。融合ステップでは、５Ｘ１０７の骨髄腫細胞を使用し た。

実施例４の動物免疫ステップでは、毎週１同腹腔内注射を６週間行ない、１か月 後に静脈注射を行なった。

実施例５ セラティア属の多数のまたは全ての種の抗原と広く交叉反応をするモノクローナ ル抗体を調製するに当たり、ナショナル・コレクション・オブ・タイプ・カルチ ャーズから入手した別のセラティアを使用することを除いては、実施例１と同じ 方法を使用することができる。

本発明方法を用いる試験方法は、以下の利点によって現在の試験法よりも優れて いる。（ｉ）精度が高い；　（ｉｉ）即日、１．２時間以内に結果が得られる； 　（ｉｉｉ）検査室での操作を管理するために必要な熟練した研究者の数を減少 させることができ、労働コストが下がる：（ｉｖ）試験に関して使用される労働 時間および空間を減少させることができ、総経費を下げることになる；（Ｖ）迅 速かつ正確な診断に基づいたより良い治療を行うことができる。

本発明は、特定の好まｔ７い態様について述へたらのであるが、本発明の範囲を ここに挙げた特定の形に限定するしのではなく、むしろ添付の特許請求の範囲に 定義された本発明の思想および範囲に含まれる変法、改良法および均等法を包含 するものである。

国際調を報告 に◇圧Ｘ　Ｔｏ　’＝ｆｆ　ＩＮτＥＲ）ＩＡＴ工０ＮＡｒ、５ＺＡＲＣＦ！　 ＲＥＰＯＲτ０ＮＩＮＴＬＬＮＡＴ工０ＮＡＬ　ＡＰＰＬ工ＣＡＴｒＯＮ　Ｎｏ 、　？ＣＴ／ＧＢ　１３５１００２９４　（ＳＡ　１００７３ＮＥ：Ｐ−Ａ−０ １０５７１４１１１１０４／８４　ＡＵ−Ａ−１９６４８８３０Ｓ１０４／８４

Claims (42)

【特許請求の範囲】
1. １．セラティアの抗原またはセラティア種に特異的なモノクローナル抗体。
2. ２．セラティア・マルセッセンスの抗原または抗原群に特異的な第１項に記載の 抗体。
3. ３．セラティア・リクエファシエンスの抗原または抗原群に特異的な第１項に記 載の抗体。
4. ４．セラティア・ルビダエの抗原または抗原群に特異的な第１項に記載の抗体。
5. ５．セラティア属の全ての種の抗原と広く交又反応するモノクローナル抗体。
6. ６．実質的に第１項〜第５項のモノクローナル抗体と適当な標識剤からなる標識 されたモノクローナル抗体。
7. ７．標識剤が放射活性同位元素、酵素、蛍光性化合物、生物的発光性化合物、化 学的発光性化合物、または強磁性の原子または粒子から選ばれる群の１つである 第６項に記載の標識されたモノクローナル抗体。
8. ８．標識剤がモノクローナル抗体とコンジュゲートし得るものであり、かつ、酵 素−結合免疫検定法に使用し得るものである第７項に記載の標識されたモノクロ ーナル抗体。
9. ９．該酵素がアルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、ガラクトシダ ーゼまたはペルオキシダーゼである第８項に記載の標識されたモノクローナル抗 体。
10. １０．該標識剤が免疫−蛍光免疫検定法、蛍光免疫検定法、酵素蛍光免疫検定、 蛍光分極免疫検定、光子計数免疫検定などに使用し得る蛍光性化合物またはプロ ーブである第７項に記載の標識されたモノクローナル抗体。
11. １１．該蛍光性化合物またはプローブがフルオレセインである第１０項に記載の 標識されたモノクローナル抗体。
12. １２．該標識剤が発光免疫検定または酵素−結合発光免疫検定に使用し得る化学 的発光性化合物である第７項に記載の標識されたモノクローナル抗体。
13. １３．化学的発光性化合物がルミノールまたはルミノール誘導体である第１２項 に記載の標識されたモノクローナル抗体。
14. １４．該標識剤が適当な生物学的発光免疫検定に使用し得る生物的発光性化合物 である第７項に記載の標識されたモノクローナル抗体。
15. １５．生物的発光性化合物がルシフェラーゼまたはルシフェラーゼ誘導体である 第１４項に記載の標識されたモノクローナル抗体。
16. １６．検体の少なくとも１部を、第６項に記載の標識されたモノクローナル抗体 と、該標識剤に適した免疫検定法で接触させることからなる、該検体中のセラテ ィア抗原の存在を診断する方法。
17. １７．適当に標識された免疫検定法が、免疫−蛍光免疫検定、蛍光免疫検定、免 疫−電子顕微鏡法、放射性検定法、酵素−結合免疫検定法、蛍光分極法、光子− 計数生物学的発光法または化学的発光免疫検定法から選ばれる第１６項に記載の 方法。
18. １８．該標識剤が、酵素−結合免疫検定法に使用し得る酵素である第１７項に記 載の方法。
19. １９．該酵素がアルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、ガラクトシ ダーゼまたはペルオキシダーゼから選ばれる第１８項記載の方法。
20. ２０．該標識剤が免疫−蛍光免疫検定法、蛍光免疫検定法、酸素蛍光免疫検定、 蛍光分極免疫検定、光子−計数免疫検定などに使用し得る蛍光性化合物またはプ ローブである第１７項に記載の方法。
21. ２１．該蛍光性化合物またはプローブがフルオレセインである第２０項に記載の 方法。
22. ２２．該標識剤が発光免疫検定または酵素−結合発光免疫検定に使用し得る化学 的発光性化合物である第１７項に記載の方法。
23. ２３．該化学的発光性化合物がルミノールまたはルミノール誘導体である第２２ 項に記載の方法。
24. ２４．該標識剤が生物学的発光免疫検定または酵素−結合生物学的免疫検定に使 用し得る生物的発光性化合物である第１７項に記載の方法。
25. ２５．該生物的発光性化合物がルシフェラーゼまたはルシフェラーゼ誘導体であ る第２４項に記載の方法。
26. ２６．第１項〜第５項の１種またはそれ以上の標識されたモノクローナル抗体と 薬学的に許容し得る担体または希釈剤を含有する治療用組成物。
27. ２７．第６項の１種またはそれ以上の標識されたモノクローナル抗体と薬学的に 許容し得る担体または希釈剤を含有する治療用組成物。
28. ２８．第１項〜第５項のモノクローナル抗体の有効量を投与することからなるセ ラティア感染症の治療方法。
29. ２９．第１項〜第５項の少なくとも１種のモノクローナル抗体を含有する、診断 用検体中のセラティアの抗原またはセラティア種の存在を診断するためのキット 。
30. ３０．該少なくとも１種の抗体が標識されている第２９項記載のキット。
31. ３１．該少なくとも１種のモノクローナル抗体が蛍光性化合物で標識されている 第３０項記載のキット。
32. ３２．該少なくとも１種のモノクローナル抗体が酵素で標識されている第３０項 記載のキット。
33. ３３．該少なくとも１種のモノクローナル抗体が放射活性同位元素、化学的発光 性化合物、生物的発光性化合物、強磁性の原子または粒子からなる群の１つで標 識されている第３０項記載のキット。
34. ３４．対照として少なくとも１種の既知のセラティア抗原を更に含有してなる第 ３０、第３１、第３２および第３３項に記載のキット。
35. ３５．セラティア・マルセッセンス、セラティア・リクエファシエンスおよびセ ラティア・ルビダエの既知の抗原を含有している第３０、第３１、第３２、第３ ３および第３４項に記載のキット。
36. ３６．セラティア・マルセッセンスの抗原を含有している第３０、第３１、第３ ２、第３３および第３４項に記載のキット。
37. ３７．セラティア・リクエファシエンスの抗原を含有している第３０、第３１、 第３２、第３３および第３４項に記載のキット。
38. ３８．セラティア・ルビダエの既知の抗原を含有している第３０、第３１、第３ ２、第３３および第３４項に記載のキット。
39. ３９．第１項〜第５項の少なくとも１種のモノクローナル抗体と対照を含んでな る、診断用検体中のセラティアの抗原またはセラティア種の存在を診断するため のキット。
40. ４０．該少なくとも１種の抗原が標識されており、該対照が少なくとも１種の既 知のセラティア抗原である第３９項に記載のキット。
41. ４１．第１項〜第５項の少なくとも１種のモノクローナル抗体を含んでなる、グ ラム陰性細菌感染の存在を診断するためのキット。
42. ４２．該少なくとも１種のモノクローナル抗体が標識されている第４１項に記載 のキット。