JPS61502628A - モノクロ−ナル抗体およびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 モノクローナル抗体およびその用途 本発明は、モノクローナル抗体およびその用途に関する。

発明の背景 プロビデンシア属（Ｐ　ｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）は、チンセル・マイクロバイオ ロジー　（Ｚ、　１ｎｓｓｅｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、１７版、７３２ 頁に記載されている。この微生物は、しばしば病院での尿路、血液、気道および 創傷感染症に関係している。プロビデンシア・ストゥアルティ（Ｐ　ｒｏｖｉｄ ｅｎｃｉａ　Ｓ　ｔｕａｒｔｉｌ）およびＰ　レットゲリ（Ｐ　、　ｒｅｔｔｇ ｅｒｉ）はＰ、アルカリファシェンス（Ｐａｌｃａｌｉｆａｃｉｅｎｓ）よりも 頻繁に分離されている株である。ある研究所では、Ｐ、ストウアルティが火傷感 染症を引き起こす原因であるシュードモナス・アエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍ ｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）に取って換わるものであると報告している。

Ｐ、レットゲリは尿路感染症の流行に関係していた。Ｐ、ストゥアルティおよび Ｐ、レットゲリ分離菌のほとんどは、多数の抗菌剤に対して抵抗性である。治療 は、個々の分離菌の感受性に依存している。

プロビデンシア属の種は上の様に分類される。抗原抗体反応が極めて特異的な反 応であるので、これにより、その他の表現型の基準に基いて区別できない、細菌 種の株間の差違を認識することができた。

プロビデンシア属は、血流感染であるグラム陰性性敗血症の原因となることが知 られている。これは、現代の医療センターで見られる主な感染症疾也の１つであ る。これは、一過性で自己限定性であることもあるが、重篤なグラム陰性性の敗 血症は、緊急医療を必要とするものである。

現在、グラム陰性性敗血症の検査は、血液および尿の培養を作成した費用がかか るばかりでなく、煩わしいものである。この検査は、結果が出るまで１日かかり 、数日かかることも多い。ヒトの血液は性質が複雑であり、多数の検査試薬と非 特異的に反応する傾向があるので熟練した検査技術が必要である。

現在、尿路感染症に於いて、−次スクリーニングとして微生物の存在を調べる顕 微鏡検査が行われている。この顕微鏡検査は、グラム陰性菌どうしを区別するこ とはできない。従って、二次検査として、尿試料から分離した微生物を同定する ために尿培養を行なう。診断が遅れ、治療の開、始が遅れると、重篤な合併症を 引き起こすことになりかねない。

従って、尿路感染症またはグラム陰性性敗血症において、プロビデンシア属を極 めて正確に検出する現在の方法は、高価につく多数の熟練技術者と労働時間を費 し、結果を出すのに１日、あるいは数日もかかる。ことが多いという点で満足で きるものではない。

モノクローナル抗体の製造は、ケーラー（Ｋ、ｏｈｌｅｒ）およびミルシュタイ ン（Ｍ　１ｌｓｔｅｉｎ）によって初めて報告された、今ではよ（知られている 手段である［ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｅｕｒ。

Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　）　６（１９７５）２９２　］。ハハイブリドマを作成 する一般的な技術、およびその結果得られるモノクローナル抗体についてはよく 知られているが、特定の抗原に対する特異的モノクローナル抗体を製造すること は、主として特定のハイブリドーマを作成するのに必要なバリエーションおよび 特異性の程度のために、難しいことであることがわ本発明は、プロビデンシア属 の抗原および／または微生物が試料中に存在するかどうかを正確に、かつ迅速に 診断するために使用される新規なモノクローナル抗体を提供するものである。

簡潔に述べると、本発明はプロビデンシア属の抗原、特にプロビデンシア・スト ウアルティの抗原、プロビデンシア・レットゲリの抗原およびプロビデンシア・ アルカリファシェンスの抗原に特異的体モノクローナル抗体、およびプロビデン シア属に属するいずれかの菌種の抗原と広く交叉反応するモノクローナル抗体に 関するものである。

本発明はまた、プロビデンシア属、あるいはその特定の菌種、の上記の抗原の１ つに対するモノクローナル抗体であって、適当な標識（ラベル）と結合した、プ ロビデンシア属の抗原の存在を診断するために使用される標識されたモノクロー ナル抗体を提供するものである。この標識は、例えば放射性同位元素、酵素、蛍 光性化合物、化学的発光性化合物、生物的発光性化合物、強磁性の原子または粒 子などとすることができる。

本発明はまた、適当な免疫検定法により、標識されたモノクローナル抗体を検体 と接触させることからなる、検体中°のプロビデンシア属抗原または微生物の存 在を診断する方法を提供するものである。

更に、本発明はプロビデンシア属の抗原に対するモノクローナル抗体と担体また は希釈剤を含有している治療用組成物、およびある種のプロビデンシア属の抗原 に対する少なくとも１種の標識されたモノクローナル抗体を含有しているキット を提供するものである。

詳細な説明 本発明に係る抗体は、特定のプロビデンシア属の抗原で免疫した哺乳動物の膵臓 細胞を、適当な骨髄腫セルライン、好ましくはＮ５Ｏ（非クローン化）、Ｐ３Ｎ ５　ｌ−Ａｇ　４／１またはＳｐ　２１０Ａｇ　１４と融合させることにより製 造される。得られた生産物を標準的なＨＡＴ（ヒボキサンチン、アミノプテリン およびチミジン）培地中で培養する。特定のモノクローナル抗体をスクリーニン グテストするには、以下に記述する免疫検定技術を利用する。

免疫される膵臓細胞は、霊長動物、ヒト、げつ歯頚（例えばマウス、ラット、ウ サギなと）、牛、羊、犬などのものであってよいが、本発明では、マウスのもの について述べることにする。まず、選択した特定のプロビデンシア抗原をマウス に注射し、通常約１１ａ間かけて免疫する。

常套の検定法により、マウスが抗原に対して十分な抗体を産生じたことがわかっ たら、適当なプロビデンシア抗原をブースター注射し、マウスを殺して免疫され た評臓を摘出する。次いで、この免疫された詳臓細胞と適当な骨髄腫セルライン を使って融合を行なうことができる。

特定のプロビデンシア抗原が存在すると正の反応を示す抗体を産生ずる融合細胞 を取り出し、標準的な方法でクローンする。クローンから得たモノクローナル抗 体を標準的な抗原に対して試験し、特定のプロビデンシア抗原に対する特異性を 有するか否かを調べる。特定のプロビデンシア廣原またはプロビデンシア種に対 して特異的であるモノクローナル抗体を選択し、適当な標識と結合させる。

標識のための、そしてその後の大量生産に必要な十分量の抗体は、バッチ式また は連続的組織培養、あるいはマウスの様な哺乳動物でのインビボでの培養などの 既知の方法で生産される。

モノクローナル抗体は、先に例示した様な各種の標識剤で標識することができる 。本発明では、酵素で標識したモノクローナル抗体を使用する例について述べる 。標識剤として使用される酵素の例としては、アルカリホスファターゼ、グルコ ースオキシダーゼ、ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼおよびウレアーゼなど が挙げられる。

酵素との結合は、スタフィロコブカル・プロティンＡ法、グルタルアルデヒド法 、ベンゾキノン法または過ヨウ素酸法などの既知の方法で行なうことができる。

標識されたモノクローナル抗体ができたら、通常の各種の免疫検定法の１つを使 っ゛て試験を行なう。選択すべき特定の方法は、モノクローナル抗体および選択 した標識により異なる。現在のところ、廉価であること、試薬が安定であり、安 全であり、感度の良いこと、および操作が簡単であることから酵素免疫検定が好 ましい。１つの例は酵素−結合免疫吸着検定（ＥＩＡ）である。ＥＩＡは、デザ インが放射分析と類似している固相検定法である。しかしＥＩＡでは、免疫グロ ブリンマーカーとして放射活性同位元素の代りに、酵素を使用する。

蛍光免疫検定は、抗原または抗体を蛍光プローブで標識することに基づいている 。標識されていない抗原および特異抗体を、蛍光で標識した同一の抗原と混合す る。標識された抗原と標識されていない抗原の両者が抗体の結合サイトを競い合 う。抗体に結合した標識化抗原の量は、非標識化抗原の濃度に依存し、従って、 その濃度の測定値を表わす。この特定のタイプの蛍光免疫検定の例には、酵素− 結合蛍光免疫検定の様な不均一系、基質−標識化蛍光免疫検定の様な均−系があ る。最も適切な蛍光プローブであって、最も広く使用されているものの１つはフ ルオレセインである。フルオレセインは、散乱がかなり干渉されやすいことがあ るが、特定の検定に使用されるプローブの最適の蛍光メーターを使用することに より感度を上げることができ、散乱の効果を最小限にすることができる。

蛍光分極（ボーラリゼーション）においては、標識された試料が分極光により励 起するので、放射光の分極の程度を測定する。抗原が抗体に結合すると、そのロ ーテーションが低下し、分極の程度が増大する。しかし現時点では、その感度は マイクロモル／リットルの範囲に限定されており、生物学的試料中の抗原につい ては、上限がナノモル／リットルの範囲である。

発光は、電子が高エネルギー状態から基底状態に転移することにより、原子や分 子によって光が放射されることである。化学的発光および生物学的発光の両者に 於いて、化学反応の自由エネルギーにより、電子励起状態の中間体や生成物を生 成するのに必要なエネルギーが与えられる。

次いで衰微して基底状態に戻る時に光が放射される。生物学的発光は、生物系に みられる化学的発光の特別の形態に与えられた名称であり、ここでは、触媒作用 を有するタンパク質または酵素、例えばルシフェラーゼが発光反応の効率を増大 させる。最もよく知られた化学的発光物質はルミノールである。

本発明の１つの目的は、特定のプロビデンシア抗原またはプロビデンシア種に対 する１種またはそれ以上のモノクローナル抗体、および薬理学的に許容し得る担 体または希釈剤を含宵する治療用組成物を提供するものである。この様な組成物 は、なんらかのプロビデンシア感染に苦しんでいるヒトおよび／または動物を治 療するのに使用することができ、治療に有効な量が使用される。この量は、゛処 置を受けるヒトおよび感染の程度に応じて著しく変わる。

各種検体中に抗原、抗原類またはプロビデンシア種が存在するかどうかを診断す るために使用される診断用キットに、１種またはそれ以上のモノクローナル抗体 を組み合せて入れてもよい。プロビデンシア属のみを同定し得る広い交叉反応性 のモノクローナル抗体を使ってもよく、また、他の細菌属あるいはプロビデンシ ア種および／または他の細菌を同定することができる抗体を含んでいるキットの 一部として用いることもできる。

過去に於いては、検体の望ましくない交叉反応（例えば尿と抗血清）のために、 迅速なキットを開発することは困難であった。モノクローナル抗体を使用するこ とによって、この様な問題が解決され、診断用の非常に特異的な、そして迅速な 試験ができる様になった。例えば、ひどい下痢や下痢性疾患が起る頻度は非常に 高く、この様なキットの市場の大きさを予想することが困難であるが、「肩口」 検査は、少なくとも糞便・培養と同じ頻度で使用されると期待できる。開発途上 国では、下痢の頻度が高く、また重篤てあり、その他の関連する病気らあるので 、この様な検査は大いに１１１用されるらのと思われる。

更に、キットは尿中のグラム陰性細菌を迅速に検査するために、病理検査室で使 用されることらあろうし、外来患者にも使用されろ。また、プロビデンシアまた はその他のグラム陰性性敗血症の診断のために、弘者から採取した血液試料中に プロビデンシアの抗原および／またはプロビデンシア環、およびその他のグラム 陰性細菌を同定するために、この様な抗原や微生物に対する、コンジュゲートあ るいは標識化したモノクローナル抗体をキットにして使用することができる。モ ノクローナル検査法は、従来の検査法より正確さが高いという点で、従来法より 進んだ方法である。「当日」に結果が出るので患者にとって好都合であり、早い 、正確な診断の結果、治療を改善でき、かつ、検査を管理するのに必要な労働時 間や人件費を減少させる。

このキットは単独で販売されてもよいし、あるいはまた、プロビデンシアの菌種 や血清型を検出するために、関連検査室に売り込まれる、相客性のある免疫検定 試薬類の包括的な商品の１部に含ませてもよい。

本発明の好ましい態様の１つは、特定のプロビデンシア抗原またはプロビデンシ ア環に対する少なくとも１種の標識されたモノクローナル抗体と、適当な染色剤 、対比染色剤または試薬を含んでいる診断用キットである。その他のキットとし ては、プロビデンシア抗原の少なくとも１種の対照試料および／または特定の試 料中の特定のプロビデンシア微生物の存在を検出する交叉反応性の標識されたモ ノクローナル抗体を含んでいるキットがある。

プロビデンシア属の抗原の存在を検出するモノクローナル診断法は、水源、食物 源および食品加工操作を定期的に検査するのにも使うことができる。この様に、 本発明は、標準的な抗原の存在を調べるための標識したモノクローナル抗体の使 用について記載しているが、本発明は、尿、血液、糞便、水およびミルクなどの 検体が特定のプロビデンシア抗原を含んでいるかどうかを調べることにより、抗 原の存在を診断するという多くの応用面を持っている。更に詳しくいうと、本発 明は公衆の衛生および安全の診断補助に利用することができ、水や食品の様な検 体の汚染の有無について検査することができる。

以下に実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、これらの実施例は例示を 目的とするものであって、本発明を制限するためのものではない。

本発明のモノクローナル抗体は、ケーラーとミルシュタイン（前掲）の方法に従 って調製した。

実施例に於いて、 ＡＰＩ＝アナリテイカル・プロファイル・インデックス［エールスト（Ａｙｅｒ ｓｔ）研究所リファレンス］Ｄ　Ｍ　Ｅ　Ｍ　＝デュルベツコの改良イーグル培 地ＥＣ３＝ウノ胎仔血清 ％Ｔ＝Ｉｃｍ光路長で測定したワクチン濃度ＰＢＳ＝燐酸緩衝生理食塩水 プロビデンシア・ストウアルティをナショナル・コレクション・オブ・タイプ・ カルチャーから得（ＮＣＴＣ受は入れ番号１０３１８）、標準的な標準タイプ血 清に対して検査してそのタイプを確認した。より詳しく述べると、親液物質（リ オファイル）から抗原を除き、血液寒天上で増殖させ、適当な抗血清を用いて、 通常の生化学試験（ＡＰＩ）および凝集試験により検査し、その同一性および純 度を確認した。次いで細胞をＤをホルモール食塩水に入れて遠心をくり返すこと により洗浄し、ホルモール食塩水に再懸濁した。

旦−卆璽旦免策 調製した抗原を６匹のＢａ１ｂ／ｃマウスに注射した。上記の如く調製し、煮沸 して死滅させたプロビデンシア・ストゥアルティ（８０％Ｔ）を、ｉ週間に１回 、３週間腹腔内に注射しく８０％Ｔワクチン０．０５ｍｊり、次いで１週間に５ 回、３週間静脈注射した。最後の注射から約６８目にマウスを採血し、血清を検 査して抗体を検定した。この血清の力価測定に使用した常套の方法は、酵素−結 合免疫吸着検定法であった。このやり方でマウスが抗体産生を示したので（通常 、正の力価が少なくとも１ｏ、ｏｏｏ）、融合供与動物として１匹を選び、膵臓 切除の３日前に静脈からブースタ注射した（８０％ワクチン０．０５ｍ１２）。

ニー雛腹紋企 選択された供与マウスを殺し、７０％のエチルアルコールに浸漬して表面滅菌し た。次いで、膵臓を摘出し、３０％のＥＣ９を加えたＤＭＥＭ約２．５　ｍｉ、 に浸漬した。次ぎに、全ての細胞が膜から離れるまでＬＵＸホモジナイズ管で膵 臓を穏やかにホモジナイズした後、細胞を３％ＦＣＳ　ＤＭＥＭ５　ｌｌ１ｆｔ 中で洗浄した。次いで、細胞残骸を沈殿させて、膵臓細胞懸濁液をＩＯＪの遠沈 管に入れた。次ぎにこの残骸を３％ＦＣＳ　ＤＭＥＭ５　ｍｌ中で再び洗浄した 。その後、３％ＥＣ９ＤＭＥＭに入れて懸濁液を５０＋ｎｉにした。

使用した骨髄腫セルラインは、ＭＲＣラボラトリ−・オブ・モレキュラー惨バイ オロジー（ＭＲＣＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｒ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌ ｏｇｙ）、ケンブリッジ、イングランドから入手したＮ５Ｏ（非クローン化）で ある。骨髄腫細胞は、対数増殖期にあり、速く分裂していたものである。各セル ラインを、３％ＦＣＳを含有し二いる組織培養培地ＤＭＥＭで洗浄した。

次いで、相当量の骨髄腫細胞を取り出すと同時に膵臓細胞を取り出し（室温、６ ００９で７分間）、得られた各ペレットを個別に３％ＦＣ９ＤＭＥＭＩ　Ｏｍｉ に再吐濁した。骨髄腫細胞を数えるために懸濁液０．１ｍＲ，をｌ　ｍｌに希釈 し、位相差顕微鏡の付いた血球計算器を使用した。

膵臓細胞を数えるために、＠濁液０．Ｉ　Ｊをメチルバイオレット−クエン酸溶 液でＩ　ｎ４に希釈し、血球計算器および光学顕微鏡を使用して染色されている 細胞核を数えた。

次ぎに、膵臓細胞１０’個を骨髄腫細胞２Ｘ１０７個に混合し、この混合物を、 グルコースに富む血清不含のＤＭＥＭで洗浄して遠心し、液体を全て除去した。

得られた細胞ペレットを３７℃の水浴に入れた。１分間で、５０％（ｗ／ｖ）の ヘペス（Ｈｅｐｅｓ）含有生理的食塩水中ポリエチレングリコール１５００（Ｐ ＥＧ）溶液（ｐＨ約７．５）１　ｍｌを加え、この混合物を約１５分間穏やかに 攪拌する。次いで、血清不含の組織培養培地ＤＭＥＭＩＯＪ、を徐々に加え、次 に、この培養培地を加えて５０ｍｆｌにし、遠心して上清を全て除去した後、細 胞ペレットを１８重量％のＦＣＳを含有しているＤＭＥＭＩＯｍｊ！に再懸濁し た。

混合物１０μ克を標準マルチウェル組織培養プレートの９６０ウエルそれぞれに 入れた。各ウェルは、標準ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよび チミジン）１．０　Ｊおよび５Ｘ１０’マクロフアージ／ウエルの濃度でＢａ１ ｂ／Ｃマクロフアージの支持細胞層を含んでいる。

ウェルを静置し、湿度約１００％、９％のＣ０７−空気中、３７°Ｃで培養した 。ウェルは、５〜ｌＯ日後に通常の倒立顕微鏡法を使用して増殖を調べた。阻害 ＨＡ　Ｔ培地で増殖が起こっているウェルにおいて、下記の通常の酵素免疫検定 スクリーニング法を使用して特定のモノクロナール抗体に対するスクリーニング テストを行なった。融合の約１０〜１４日後、少なくとも１個のウェルに抗原に 対する十分な抗体が産生された。

Ｄ、クローニング 抗原に対する抗体を産生じたウェルから細胞を取り出し、標準寒天法を使用して クローン化した。

寒天法では、等容量の２倍強度のＤＭＥＭ、および添加剤を含んでいる滅菌した 再蒸留水中の１．２％寒天で新たに調製した保存溶液を４５℃に維持した。次ぎ に、この溶液（１０ｍ＋４）を１０ｃｍのベトリ皿に入れて基底層を形成させた 。等容量の寒天および１８％のＦＣＳ−ＤＭＥＭに入れた細胞を基底層の上に平 らに積層した。細胞を７〜９％のＣＯ３，９，５％のＲＨ下、３７℃で約ｌＯ日 間増殖させた。生育し得る分離したコロニーを寒天表面から取って、１８％のＦ ＣＳ−ＤＭＥＭを入れた９６−ウェル微量滴定トレイの内６０ウェルに入れた。

更に増殖させた後、上清を、特異抗体について、標準酵素免疫吸着検定によって 検定した。

Ｅ、モノクローナルの選別 クローンからのモノクローナル抗体を、免疫に於いて調製された抗原への結合、 およびプロビデンシア種や、別の抗原を有している類似した属の試験バッテリー における特異性について標準的な方法でスクリーニングした。具体的には、〇− 血清型微生物の代表的な選択菌、即ちプロビデンンア（Ｐ　ｒｏｖｉｄｅｎｃｉ ａ）、シュードモナス（ｐ　ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、プロテウス（ｐｒｏｔｅ ｕｓ）、大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）、セラティア（Ｓ　ｅｒｒａｔ　ｉａ）およ びエンテロバクタ−（Ｅ　ｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）を含んでいる微ｊ１滴定プ レートのグリッドを調製し、煮沸した後、母細胞の〇−血清型グループの特異性 を調べるための、テンプレートとして使用した。前記のＥＩＡ免疫検定法を使用 した。

Ｂａ１ｂ／ｃマウスを、少なくとも７日間プリスタン（Ｐ　ｒｊｓｔａｎｅ）で 処置し、モノクローナル抗体産生セルラインの細胞１０’個を腹腔内に注射した 。このマウスが体液で膨満し、それでもなお生存している時に、腹水症体液を採 取する。この体液を１２００ｇで約１０分間遠心し、細胞を除去し、抗体に富む 腹水を集め、−２０℃で貯蔵した。前記のようにして、体液を滴定して抗体の存 在および量を測定し、精製した。精製は、硫酸アンモニウム沈澱／ＤＥＡＥ−セ ルロース法を使用して行なう。腹水症体液をガラスウールでシ濾過し、３０，０ ００ｇで１０分間遠心した。

次いで、腹水を４℃で攪拌し、等容量の冷却飽和硫酸アンモニウムを徐々に加え た。添加終了後、混合物をさらに３０分間攪拌した。ＩＯ２０００ｇで１０分間 遠心して沈澱を集めた。この沈澱を最少量の冷却リン酸塩／ＥＤＴＡ緩衝液［２ ０ｍＭリン酸ナトリウム、ｌｏｍＭのＥ　Ｄ　Ｔ　Ａ　（ｐＨ７，５）、＋０． ０２％アジ化ナトリウム］１こ溶解した。この溶液を、同一の緩衝液２ＸＩＯ０ ０ｍＱに対して、４℃で透析した。透析し、再溶解した沈澱をｓｏ、ＯｏＯｇで １０分間遠心し、予めリン酸／Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ緩衝液で平衡化しておいた１０ｍ １２のＤＥＡＥ−セルロースカラムにかけた。

モノクローナル抗体は、リン酸／ＥＤＴＡ緩衝液で溶出させた。

Ｇ、　素−モツクローナル結合 次に、前記の如く調製し、選別した抗原に対して特異的なモノクローナル抗体を 、一段階グルタルアルデヒド法を使って、適当な酵素（ここでは、高純度のアル カリホスファターゼ）に結合させた。モノクローナル抗体をアルカリホスファタ ーゼ（シグマ　タイプ■−Ｔ）と共に、ＰＢＳ（ｐＨ７，４）２ｘ１０００ｍＱ に対して、４℃で透析した。透析後、ＰＢＳで容量を２．５１にし、ＰＢＳにグ ルタルアルデヒドを２０％溶解した溶液２５μＱを加えた。このコンジュゲーシ ョン混合物を、室温で１゜５時間放置した。この後、グルタルアルデヒドを、予 めＰＢＳで平衡化しておいたファーマシアＰＤ−１０（セファデックスＧ−２５ Ｍ）カラムでゲルＹ過して除去した。このコンジュゲート体をＰＢＳ３．５ｍ１ ２で溶出１５、次いでトリス緩衝液［５０ｍＭ　トリス、１ｍＭ塩化マゲネンウ ム（ｐＨ８、０）、＋　０　、０２％アジ化ナトリウム１２Ｘ２０００ｍＱに対 して、４℃で透析乙た。この透析コンツユゲート体に、トリス緩衝液にＢ　Ｓ　 Ａを１０％溶解した溶液、Ｉ／１０容量を加えた。次いで、このコンツユゲート 体を、０２２μｍメンブランフィルタ−で滅菌シ戸遇し、滅菌した褐色バイアル に入れ、４°Ｃで貯蔵した。

１１、モノクローナル抗体コンジュゲート試験試験には酵素免疫検定法を使用し た。この検定法は、標準ポリヒニルクロリド＠Ｍ滴定トレーのウェルを抗原で被 覆した後、モノクローナル抗体酵素コンツユゲートを加え、次いで、酵素基質、 パラーニトロフェノールフ十スフエートを加えることからなる。

この試験で、２ｇのモノクローナル抗体か、プロビデンシア・ストゥアルティの 抗原に対して特異的であることがわかった。これらのモノクローナル抗体を試験 した結果、１ｇＧ３および１ｇＭクラスに属することられかった。

必要であれば、抗体が抗原に結合する特異的なエビトビツク部位も調べることが できる。尿、血液、糞便、水または乳のような診断用検体が抗原を含んでいるか どうかを調べるために、同じ酵素免疫検定法を使用することもてきる。この場合 、まず抗体をプレートに結合させる。

プロビデンシア属の種々の抗原のモノクローナル抗体コンジュゲート体の調製に 当たり、以下の相違点を除いては、実施例１と同じ方法を各実施例に使用した。

実施例２の動物を免疫する工程においては、静脈内注射後、マウスを１ケ月間放 置し、次いで、８０％Ｔワクチン０．０５ｍρを再接種した。

実施例３の動物を免疫する工程においては、煮沸して死滅させた細胞を、１週間 に１回、３週間腹腔内に注射し、次いで１週間に１回、４週間静脈内注射した。

実施ρＪ２では、プロビデンシア・アルカリファンエンス（ＮＣＴＣｌｏ　２８ ６）を使用し、実施例３では、プロビデンシア・レットゲリ（ＮＣＴＣ７４７５ ）を使用した。

細胞融合の工程においては、実施例２では８ＸＩＯ’個、実施例３では５ＸＩ０ ７個の骨髄種細胞を使用した。４８０ウエルを両実施例で使用した。

実施例３のクローニング工程においては、制限希釈法を使用した。すなわち、こ の方法で、１８％ＦＣ−ＤＭＥＭ＋Ｂａ１ｂ／ｃマウスマク０ファージに懸濁さ せた細胞液の希釈を行ない、９６−ウェル微量滴定プレートにおいて、■細胞／ ウェルおよび半細胞／ウェルとなるようにした。

半融合になるまで、このプレートを、３７℃、９５％ＲＨ，７−９％ＧＯ７で７ −１４日間インキュベートした。次いで、この上澄液について、標学的な酵素免 疫吸着検定によって、特異的な抗体を検定した。

モノクローナル還別工程では、エンテロバクタ−およびプロビデンシアを、実施 例２に、プロテウスを実施例３に使用した。

実施例２の抗体コンジュゲーション工程では、ベンゾキノン法を使用した。アル カリホスファターゼ（シグマ　タイプ■−Ｔ）２４ｍｇを、０２５Ｍリン酸ナト リウム緩衝液（＋）Ｈ６，Ｏ）２ｘ５００ｍＣに対して、４℃で透析した。パラ −ベンゾキノン１８ｍｇを、温ＡＲエタノール０　、６　ｍ＆に溶解し、透析し たアルカリホスファターゼに加えた。このベンゾキノン／アルカリホスファター ゼ混合物を、室温の暗所で１時間放置した。

次に、予め０．１５Ｍ塩化ナトリウムで平衡化しておいた、ファーマシアＰＤ− １０（セファデックスＧ−２５Ｍ）カラムでゲルｙ過して、未反応のベンゾキノ ンおよび反応副生成物を除去し、緩衝液を交換した。このようにして得た、ベン ゾキノン活性化したアルカリ缶スファターゼは、１．５Ｄの抗体コンジュゲーシ ヨンを６回行なうのに十分であった。モノクローナル抗体を、Ｏ，１５Ｍ塩化ナ トリウム２Ｘ５００ｍＱに対して、４℃で透析した。透析した抗体を、ベンゾキ ノン活性化したアルカリホスファターゼ８Ｎに加え、直ちに十分量の１Ｍ重炭酸 すトリウムを加え、最終濃度０．１Ｍにした。このコンジュゲーノヨン混合物を 、４℃の暗所で４８時冊放置した。次に、十分量の１Ｍリジンを加え、最終濃度 を０．１Ｍにした。室温の暗所で２時間放置した後、このコンジュゲート体を、 ＰＢＳ＋０．０２％アジ化ナトリウム２ｘｌＯＯＯｍ１２に対して、４℃で透析 した。コンジュゲート体を、０．２２μｍメンブランフィルタ−で滅菌濾過し、 滅菌した褐色バイアルに入れ、４°Ｃで貯蔵した。

コンジュゲート試験は、実施例２について、適当な特異性を示した。

また、モノクローナル抗体についても試験を行ない、ＩｇＧ１クラスのものであ ることがわかった。

実施例４ プロビデンシア属の多数のまたは全ての種の抗原と広く交叉反応をするモノクロ ーナル抗体を調製するに当たり、ナショナル・コレクション・オブ・タイプ・カ ルチャーズから入手した別の抗原を使用することを除いては、実施例１と同じ方 法を使用することができる。

本発明方法を用いる試験方法は、以下の利点によって現在の試験法よりも優れて いる＝（ｉ）精度が高い；　（ｉｔ）即日、ｌ、２時間以内に結果が得られる； 　（ｉｉｉ）検査室での操作を管理するために必要な熟練した研究者の数を減少 させることができ、労働コストが下がる；（ｉｖ）試験に関して使用される労働 時間および空間を減少させることができ、総経費を下げることになる＝（■）迅 速かつ正確な診断に基づいたより良い治療を行うことができる。

本発明は、特定の好ましい態様について述べたものであるが、本発明の範囲をこ こに挙げた特定の形に限定するものではなく、むしろ添付の特許請求の範囲に定 義されｆこ本発明の思想および範囲に含まれる変法、改良法および均等法を包含 するしのである。

国際調査報告 ＡＮＮＥＸ　Ｔｏ　τ＆、ｒＮτＥＲｍＴＩＯＮＭ、５ＥＡＲ四ＲＥＰＯＲτｏ ｈｒＮＴＥＲＮＡＴｒＯＮＡＬ　ＡＰｐＬＺＣＡτＩＯＮ　Ｎｏ、　ＰＣＴ／Ｃ Ｂ　８５１００２９１　（ＳＡ　１００７０）ＥＰ−Ａ−０１０１０３９２２１ ０２／８４　Ｊ？−Ａ−５９０２９６２２１６１０２／８４

Claims (42)

【特許請求の範囲】
1. １．プロビデンシアの抗原またはプロビデンシア種に特異的なモノクローナル抗 体。
2. ２．プロビデンシア・ストゥアルティの抗原または抗原群に特異的な第１項に記 載の抗体。
3. ３．プロビデンシア・レットゲリの抗原または抗原群に特異的な第１項に記載の 抗体。
4. ４．プロビデンシア・アルカリファシエンスの抗原または抗原群に特異的な第１ 項に記載の抗体。
5. ５．プロビデンシア属の全ての種の抗原と広く交又反応するモノクローナル抗体 。
6. ６．実質的に第１項〜第５項のモノクローナル抗体と適当な標識剤からなる標識 されたモノクローナル抗体。
7. ７．標識剤が放射活性同位元素、酵素、蛍光性化合物、生物的発光性化合物、化 学的発光性化合物、または強磁性の原子または粒子から選ばれる群の１つである 第６項に記載の標識されたモノクローナル抗体。
8. ８．標識剤がモノクローナル抗体とコンジュゲートし得るものであり、かつ、酵 素−結合免疫検定法に使用し得るものである第７項に記載の標識されたモノクロ ーナル抗体。
9. ９．該酵素がアルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、ガラクトシダ ーゼまたはペルオキシダーゼである第８項に記載の標識されたモノクローナル抗 体。
10. １０．該標識剤が免疫−蛍光免疫検定法、蛍光免疫検定法、酵素蛍光免疫検定、 蛍光分極免疫検定、光子計数免疫検定などに使用し得る蛍光性化合物またはプロ ーブである第７項に記載の標識されたモノクローナル抗体。
11. １１．該蛍光性化合物またはプローブがフルオレセインである第１０項に記載の 標識されたモノクローナル抗体。
12. １２．該標識剤が発光免疫検定または酵素−結合発光免疫検定に使用し得る化学 的発光性化合物である第７項に記載の標識されたモノクローナル抗体。
13. １３．化学的発光性化合物がルミノールまたはルミノール誘導体である第１２項 に記載の標識されたモノクローナル抗体。
14. １４．該標識剤が適当な生物学的発光免疫検定に使用し得る生物的発光性化合物 である第７項に記載の標識されたモノクローナル抗体。
15. １５．生物的発光性化合物がルシフェラーゼまたはルシフェラーゼ誘導体である 第１４項に記載の標識されたモノクローナル抗体。
16. １６．検体の少なくとも１部を、第６項に記載の標識されたモノクローナル抗体 と、該標識剤に適した免疫検定法で接触させることからなる、該検体中のプロビ デンシア抗原の存在を診断する方法。
17. １７．適当に標識された免疫検定法が、免疫−蛍光免疫検定、蛍光免疫検定、免 疫−電子顕微鏡法、放射性検定法、酵素−結合免疫検定法、蛍光分極法、光子− 計数生物学的発光法または化学的発光免疫検定法から選ばれる第１６項に記載の 方法。
18. １８．該標識剤が、酵素−結合免疫検定法に使用し得る酵素である第１７項に記 載の方法。
19. １９．該酵素がアルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、ガラクトシ ダーゼまたはペルオキシダーゼから選ばれる第１８項記載の方法。
20. ２０．該標識剤が免疫−蛍光免疫検定法、蛍光免疫検定法、酵素蛍光免疫検定、 蛍光分極免疫検定、光子−計数免疫検定などに使用し得る蛍光性化合物またはプ ローブである第１７項に記載の方法。
21. ２１．該蛍光性化合物またはプローブがフルオレセインである第２０項に記載の 方法。
22. ２２．該標識剤が発光免疫検定または酵素−結合発光免疫検定に使用し得る化学 的発光性化合物である第１７項に記載の方法。
23. ２３．該化学的発光性化合物がルミノールまたはルミノール誘導体である第２２ 項に記載の方法。
24. ２４．該標識剤が生物学的発光免疫検定または酵素−結合生物学的免疫検定に使 用し得る生物的発光性化合物である第１７項に記載の方法。
25. ２５．該生物的発光性化合物がルシフェラーゼまたはルシフェラーゼ誘導体であ る第２４項に記載の方法。
26. ２６．第１項〜第５項の１種またはそれ以上の標識されたモノクローナル抗体と 薬学的に許容し得る担体または希釈剤を含有する治療用組成物。
27. ２７．第６項の１種またはそれ以上の標識されたモノクローナル抗体と薬学的に 許容し得る担体または希釈剤を含有する治療用組成物。
28. ２８．第１項〜第５項のモノクローナル抗体の有効量を投与することからなるプ ロビデンシア感染症の治療方法。
29. ２９．第１項〜第５項の少なくとも１種のモノクローナル抗体を含有する、診断 用検体中のプロビデンシアの抗原またはプロビデンシア種の存在を診断するため のキット。
30. ３０．該少なくとも１種の抗体が標識されている第２９項記載のキット。
31. ３１．該少なくとも１種のモノクローナル抗体が蛍光性化合物で標識されている 第３０項記載のキット。
32. ３２．該少なくとも１種のモノクローナル抗体が酵素で標識されている第３０項 記載のキット。
33. ３３．該少なくとも１種のモノクローナル抗体が放射活性同位元素、化学的発光 性化合物、生物的発光性化合物、強磁性の原子または粒子からなる群の１つで標 識されている第３０項記載のキット。
34. ３４．対照として少なくともｌ種の既知のプロビデンシア抗原を更に含有してな る第３０、第３１、第３２および第３３項に記載のキット。
35. ３５．プロビデンシア・ストゥアルティ、プロビデンシア・レットゲリおよびプ ロビデンシア・アルカリファシエンスの既知の抗原を含有している第３０、第３ １、第３２、第３３および第３４項に記載のキット。
36. ３６．プロビデンシア・ストゥアルティを含有している第３０、第３１、第３２ 、第３３および第３４項に記載のキット。
37. ３７．プロビデンシァ・レットゲリの抗原を含有している第３０、第３１、第３ ２、第３３および第３４項に記載のキット。
38. ３８．プロビデンシア・アルカリファシエンスの抗原を含有している第３０、第 ３１、第３２、第３３および第３４項に記載のキット。
39. ３９．第１項〜第５項の少なくとも１種のモノクローナル抗体と対照を含んでな る、診断用検体中のプロビデンシアの抗原またはプロビデンシア種の存在を診断 するためのキット。
40. ４０．該少なくとも１種の抗原が標識されており、該対照が少なくとも１種の既 知のプロビデンシア抗原である第３９項に記載のキット。
41. ４１．第１項〜第５項の少なくとも１種のモノクローナル抗体を含んでなる、グ ラム陰性細菌感染の存在を診断するためのキット。
42. ４２．該少なくとも１種のモノクローナル抗体が標識されている第４１項に記載 のキット。